CN112105625A - 核苷酸前体、核苷酸类似物以及含其的寡聚化合物 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及可掺入寡核苷酸中的新型核苷酸前体和核苷酸类似物，所述寡核苷酸包括双链寡核苷酸，诸如siRNA。含这些类似物的寡核苷酸具有出色的生物学活性，例如，增加的体外稳定性和改善的体内功效，特别是作用时长。改善的寡核苷酸可用于沉默(例如减少或消除)靶基因的表达。在特定的实施方案中，本发明涵盖有待在双链RNA(dsRNA)以及尤其siRNA中包含的特定的核苷酸类似物，其可以与所关注的信使RNA(mRNA)杂交，从而减少或阻断所关注的靶基因的表达。本发明化合物具有通式(I)，其中Ra、Rb、Rc和Rd各自独立地为H或(C1‑C6)烷基，且B为杂环核碱基。

Description

核苷酸前体、核苷酸类似物以及含其的寡聚化合物
技术领域
本公开涉及用小干扰RNA(siRNA)的靶向基因沉默领域，更具体地涉及用于siRNA的核苷酸前体和类似物。
背景技术
使用合成的寡核苷酸来控制特定基因的表达的概念可追溯到1970年代末，当时首次证明了使用短的合成的寡核苷酸进行靶向基因沉默(Stephenson等人，1978，Proc NatlAcad Sci USA，75:285-288)。Stephenson的发现之后，阐明了用于调控基因表达的RNA干扰途径以及siRNA在该过程中的作用，极大地扩展了科学家对真核细胞中的转录后基因表达控制的认识。
合成的寡核苷酸包括单链寡核苷酸，诸如反义寡核苷酸(“ASO”)、antimiR和antagomiR，以及双链寡核苷酸，诸如siRNA。ASO和siRNA都通过Watson-Crick碱基配对结合靶RNA，但它们的作用机理不同。在反义技术中，ASO与目标RNA形成DNA-RNA双链体，并通过阻断机制抑制mRNA转译，或导致靶向的RNA的RNase H依赖性降解。在RNA干扰技术中，siRNA与RNA诱导的沉默复合物(“RISC”)结合，其中一根链(“过客链”或“有义链”)被置换，且剩下的链(“引导链”或“反义链”)与RISC协作以结合互补RNA(目标RNA)；一旦结合后，目标RNA在RISC中被RNA核酸内切酶Argonaute(AGO)裂解，然后被RNA核酸外切酶进一步降解。
开发包括siRNA在内的寡核苷酸治疗剂的最大障碍包括(i)化合物稳定性差，(ii)向靶细胞的体内递送效率低，以及(iii)诸如“脱靶”基因沉默和意外的免疫刺激等副作用。为了解决这些障碍的一些，研究已经尝试了各种寡核苷酸化学修饰。这些修饰可分为三类，即(i)糖修饰，(ii)核苷酸间键修饰和(iii)核碱基修饰。
糖基的化学修饰包括在核糖环的2’-碳原子或2'-羟基处的修饰。2’-OMe(甲氧基)核苷酸类似物是使用最广泛的修饰之一。还已经使用了2’-F(氟)核苷酸和2’-O-甲氧基乙基核苷酸。尽管大多数糖改变位于2’-位，但也已报道了在其它位置的诸如4’-位的修饰(Leydler等人，1995，Antisense Res Dev，5:161-174)。
糖基的其它化学修饰包括连接核苷中的核糖支架的2’-氧和4’-碳，从而形成所谓的锁核酸(“LNA”)。LNA也被称为双环核酸，并且已显示具有增加的RNA结合亲和力(Koshin等人，1998，Tetrahedron，54:3607-3630；Prakash等人，2011，Chem.Biodivers，8:1616-1641)，导致所得双链寡核苷酸的解链温度显著提高。但是，长于8个核苷酸的经过LNA完全修饰的寡聚物趋于聚集。与LNA修饰的刚性性质形成对比，还开发了高度柔性的未锁核酸(“UNA”)修饰用于应用于寡核苷酸治疗剂。UNA核苷没有核糖的C2’-C3’键。由于其开放链结构，UNA在构象上不受限制，已被用于调节寡核苷酸的柔性(Mangos等人，2003，J Am ChemSoc，125:654-661)。在某些情况下，UNA插入物的每个插入物可使双链解链温度(Tm)降低5℃-10℃。此外，UNA插入物可促进RISC选择反义链，且UNA对siRNA引导链的种子区的修饰可减少脱靶事件(Vaish等人，2011，Nucleic Acids Res，39:1823-1832)。Bramsen等人已报道含UNA和LNA的siRNA(2010，Nucleic Acids Research，38(17):5761-5773)。
此外，还已经开发了扩展的糖环系统并将其应用于基因沉默技术。这样的系统包括六元的吗啉代环系统，其中核苷的核糖部分被吗啉环替代。通过吗啉亚基的氮原子，基于吗啉代的核苷在含有它们的寡核苷酸内形成核苷酸间键。基于磷酸二酰胺吗啉代的寡核苷酸(“PMO”)已被用于反义技术(Corey等人，2001，Genome Biology，2(5):reviews 1015.1-1015；Partridge等人，1996，Antisense Nucleic Acid Drug Dev，6:169-175)。然而，由于与互补RNA的结合亲和力低，反义PMO需要相对长，例如25个碱基长度(Corey等人,同上)。美国专利5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,698,685；和美国专利公开US2016US/0186174中也公开了吗啉代亚基的实例。
通过用更稳定的部分替代3’-5’磷酸二酯键，还可对核苷酸间键进行化学修饰，以降低对核酸酶降解的敏感性。广泛使用的修饰是用硫代磷酸酯键部分或完全替代磷酸二酯骨架，其中使用硫原子代替氧原子。使核酸具有增加生物稳定性的另一种骨架修饰是硼烷磷酸酯(boranophosphate)键。在硼烷磷酸酯寡核苷酸中，非桥连的磷酸二酯氧被等电子硼烷(-BH3)部分替代。
然而，大多数前述的诸如硫代磷酸酯的磷酸二酯修饰在核苷酸间键中产生手性磷，导致所得的寡核苷酸的非对映异构体混合物。由于每个修饰的磷酸二酯键的非对映异构体寡核苷酸的数目可以加倍，因此，随着修饰的磷酸二酯键的数目的增加，所得非对映异构体的数目呈指数增加。各个非对映异构体可表现出不同程度的核酸酶抗性和与靶mRNA的不同杂交特性。此外，非对映异构体混合物的提纯和化学分析是复杂的。因此，在某些情况下，可期望避免使用诸如硫代磷酸酯的磷酸二酯修饰和所得的非对映异构体寡核苷酸混合物。
RNA干扰技术中的其它重大挑战是siRNA的靶向递送和细胞摄取。细胞膜是带负电荷的磷脂的双层结构，并且是也带负电荷的siRNA的进入屏障。一些小组已使用N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)将附着于其的siRNA靶向肝细胞，其表达结合GalNAc的脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)，并且可将ASGPR结合的siRNA-GalNAc缀合物通过内吞进行内化(参见，例如，Nair等人，2014，J Am Chem Soc，136:16958-16961)。
尽管RNA干扰技术已取得进展，但在该领域仍需要具有稳定性和向其靶细胞递送改善的siRNA寡核苷酸。
发明内容
本申请公开式(I)的化合物
Figure BDA0002760977440000031
其中：
-B为杂环核碱基；
-P1和P2各自独立地为H、反应性磷基团或保护基团；
-Y为O、NH、NR1或N-C(＝O)-R1，其中R1为：
·(C1-C20)烷基基团，其任选地被一个或多个选自以下的基团取代：卤素原子、(C1-C6)烷基基团、(C3-C8)环烷基基团、(C3-C14)杂环、(C6-C14)芳基基团、(C5-C14)杂芳基基团、-O-Z1、-N(Z1)(Z2)、-S-Z1、-CN、-C(＝J)-O-Z1、-O-C(＝J)-Z1、-C(＝J)-N(Z1)(Z2)和-N(Z1)-C(＝J)-Z2，其中
J为O或S，
Z1和Z2各自独立地为H、(C1-C6)烷基基团，其任选地被一个或多个选自以下的基团取代：卤素原子和(C1-C6)烷基基团，
·(C3-C8)环烷基基团，其任选地被一个或多个选自以下的基团取代：卤素原子和(C1-C6)烷基基团，或
·基团-[C(＝O)]m-R2-(O-CH2-CH2)p-R3，其中：
m为整数，取值0或1,
p为整数，其范围为0至10，
R2为(C1-C20)亚烷基基团，其任选地被(C1-C6)烷基基团、-O-Z3、-N(Z3)(Z4)、-S-Z3、-CN、-C(＝K)-O-Z3、-O-C(＝K)-Z3、C(＝K)-N(Z3)(Z4)和N(Z3)-C(＝K)-Z4取代，其中
K为O或S，
Z3和Z4各自独立地为H、(C1-C6)烷基基团，其任选地被一个或多个选自以下的基团取代：卤素原子和(C1-C6)烷基基团，
和
R3选自氢原子、(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷氧基基团、(C3-C8)环烷基基团、(C3-C14)杂环、(C6-C14)芳基基团或(C5-C14)杂芳基基团，或
R3为细胞靶向部分，
-X1和X2各自独立地为氢原子、-(C1-C6)烷基基团，和
-Ra、Rb、Rc和Rd各自独立地为H或(C1-C6)烷基基团。
在式(I)的化合物的一些实施方案中，Y为NR1，其中R1为任选取代的(C1-C20)烷基基团，且P1、P2、Ra、Rb、Rc、Rd、X1、X2和B如对于通式(I)所定义。
在式(I)的化合物的一些实施方案中，Y为NR1，其中R1为未取代的(C1-C16)烷基基团，其包括选自甲基、异丙基、丁基、辛基、十六烷基的烷基基团，且P1、P2、Ra、Rb、Rc、Rd、X1、X2和B具有如对于通式(I)所定义的相同的含义。
在式(I)的化合物的一些实施方案中，Y为NR1，其中R1为(C3-C8)环烷基基团，其任选地被一个或多个选自以下的基团取代：卤素原子和(C1-C6)烷基基团，且P1、P2、Ra、Rb、Rc、Rd、X1、X2和B具有如对于通式(I)所定义的相同的含义。
在式(I)的化合物的一些实施方案中，Y为NR1，其中R1为环己基基团，且P1、P2、Ra、Rb、Rc、Rd、X1、X2和B具有如对于通式(I)所定义的相同的含义。
在式(I)的化合物的一些实施方案中，Y为NR1，其中R1为(C1-C20)烷基基团，其被(C6-C14)芳基基团取代，且P1、P2、Ra、Rb、Rc、Rd、X1、X2和B具有如对于通式(I)所定义的相同的含义。
在式(I)的化合物的一些实施方案中，Y为NR1，其中R1为(C1-C20)烷基基团，其被苯基基团取代，且P1、P2、Ra、Rb、Rc、Rd、X1、X2和B具有如对于通式(I)所定义的相同的含义。
在式(I)的化合物的一些实施方案中，Y为NR1，其中R1为甲基基团，其被苯基基团取代，且P1、P2、Ra、Rb、Rc、Rd、X1、X2和B具有如对于通式(I)所定义的相同的含义。
在式(I)的化合物的一些实施方案中，Y为N-C(＝O)-R1，其中R1为任选取代的(C1-C20)烷基基团，且P1、P2、Ra、Rb、Rc、Rd、X1、X2和B具有如对于通式(I)所定义的相同的含义。
在式(I)的化合物的一些实施方案中，Y为N-C(＝O)-R1，其中R1选自甲基和十五烷基，且P1、P2、Ra、Rb、Rc、Rd、X1、X2和B具有如对于通式(I)所定义的相同的含义。
在式(I)的化合物的一些进一步的实施方案中，Y为NR1且R1为基团-[C(＝O)]m-R2-(O-CH2-CH2)p-R3，其中
m为整数，取值0或1，
p为整数，其范围为0至10，
R2为(C1-C20)亚烷基基团，其任选地被(C1-C6)烷基基团、-O-Z3、-N(Z3)(Z4)、-S-Z3、-CN、-C(＝K)-O-Z3、-O-C(＝K)-Z3、-C(＝K)-N(Z3)(Z4)、-N(Z3)-C(＝K)-Z4取代，其中
K为O或S，
Z3和Z4各自独立地为H、(C1-C6)烷基基团，其任选地被一个或多个选自以下的基团取代：卤素原子和(C1-C6)烷基基团，
和
R3为细胞靶向部分，
-X1和X2各自独立地为氢原子、(C1-C6)烷基基团，和
-Ra、Rb、Rc和Rd各自独立地为H或(C1-C6)烷基基团。
在式(I)的化合物的这些进一步的实施方案的一些中，R1为基团-[C(＝O)]m-R2-(O-CH2-CH2)p-R3，m为0，p为0，R3为细胞靶向部分，B、P1、P2、Ra、Rb、Rc、Rd、X1、X2和R2如式(I)的化合物的通用定义中。
在式(I)的化合物的这些进一步的实施方案的一些中，R2为亚乙基基团，p为0，且X1和X2均为氢原子。
在式(I)的化合物的这些进一步的实施方案的一些中，R2为亚戊基基团，且X1和X2均为氢原子。
在式(I)的化合物的这些进一步的实施方案的一些中，R2为(C12)亚烷基基团，且X3和X4均为氢原子。
在式(I)的化合物的这些进一步的实施方案的一些中，R1为基团-[C(＝O)]m-R2-(O-CH2-CH2)p-R3，m为0，p选自整数1、2、3和4，R3为细胞靶向部分，且B、P1、P2、Ra、Rb、Rc、Rd、X1、X2和R2如式(I)的化合物的通用定义中。
在式(I)的化合物的这些进一步的实施方案的一些中，R2为亚乙基基团，p为1，且X1和X2均为氢原子。
在式(I)的化合物的这些进一步的实施方案的一些中，R2为亚乙基基团，p为2，且X1和X2均为氢原子。
在式(I)的化合物的这些进一步的实施方案的一些中，R2为亚乙基基团，p为3，且X1和X2均为氢原子。
在式(I)的化合物的这些进一步的实施方案的一些中，R2为亚乙基基团，p为4，且X1和X2均为氢原子。
在式(I)的化合物的这些进一步的实施方案的一些中，m为1，p为0，R3为细胞靶向部分，且R2、B、P1、P2、Ra、Rb、Rc、Rd、X1、X2如式(I)的化合物的通用定义中。
在式(I)的化合物的这些进一步的实施方案的一些中，R2为亚丁基，X1和X2均表示氢原子，且B、P1、P2、Ra、Rb、Rc和Rd如对于通式(I)所定义。
在式(I)的化合物的这些进一步的实施方案的一些中，R2为(C11)亚烷基，X1和X2均表示氢原子，且B、P1、P2、Ra、Rb、Rc和Rd如对于通式(I)所定义。
在式(I)的化合物的这些进一步的实施方案的一些中，R2为亚甲基，X1和X2均表示氢原子，且B、P1、P2、Ra、Rb、Rc和Rd如对于通式(I)所定义。
在式(I)的化合物的这些进一步的实施方案的一些中，m为1，p选自整数1和2，R3为细胞靶向部分，R2、B、P1、P2、Ra、Rb、Rc、Rd、X1、X2如式(I)的化合物的通用定义中。
在式(I)的化合物的这些进一步的实施方案的一些中，R2为亚甲基基团，p为2，R3为细胞靶向部分，B、P1、P2、Ra、Rb、Rc、Rd、X1、X2如对于通式(I)所定义。
在式(I)的化合物的这些进一步的实施方案的一些中，R2为亚甲基基团，p为1，R3为细胞靶向部分，B、P1、P2、Ra、Rb、Rc、Rd、X1、X2如对于通式(I)所定义。
在式(I)的化合物的这些进一步的实施方案的一些中，R3为式(III)的化合物：
Figure BDA0002760977440000071
其中A1、A2和A3为O-C(＝O)-R4，
其中R4为(C1-C6)-烷基或(C6-C10)-芳基基团；
A4为O-C(＝O)-R4或NHC(＝O)-R5，R4如上文所定义，且R5为任选地被卤素原子取代的(C1-C6)-烷基基团。
在式(I)的化合物的这些进一步的实施方案的一些中，R3为式(III)的化合物，其中A1、A2和A3为O-C(＝O)-R4，其中R4为(C1-C6)-烷基或(C6-C10)-芳基基团；
A4为O-C(＝O)-R4或NHC(＝O)-R5，其中R4如上所定义且R5为任选地被卤素原子取代的(C1-C6)-烷基基团。
在式(I)的化合物的这些进一步的实施方案的一些中，R3为式(III)的化合物，其中A1、A2和A3为O-C(＝O)-R4，其中R4为甲基基团，A4为O-C(＝O)-R4或NHC(＝O)-R5，其中R4和R5各自为甲基基团。
在式(I)的化合物的一些实施方案中，B任选地被保护，且选自嘧啶、取代的嘧啶、嘌呤和取代的嘌呤。
在式(I)的化合物的一些实施方案中，P1或P2之一为O-4,4’-二甲氧基三苯甲基基团且P1和P2中的另一者为H、反应性磷基团或保护基团，且Y、B、Ra、Rb、Rc和Rd如式(I)中所定义。
在式(I)的化合物的一些实施方案中，P1和P2之一为2-氰基乙基-N,N-二异丙基亚磷酰胺基团，且P1和P2中的另一者为保护基团，且Y、B、Ra、Rb、Rc和Rd如式(I)中所定义。
在式(I)的化合物的一些实施方案中，P1和P2之一为2-氰基乙基-N,N-二异丙基亚磷酰胺基团，且P1和P2中的另一者为O-4,4’-二甲氧基三苯甲基基团，且Y、B、Ra、Rb、Rc和Rd如式(I)中所定义。
本发明还涉及寡核苷酸，其包含一个或多个式(II)的核苷酸：
Figure BDA0002760977440000081
其中：
-B为杂环核碱基；
-L1和L2之一为连接所述式(II)的化合物至所述寡聚化合物的核苷间连接基团，且L1和L2中的另一者为H、保护基团、磷部分或连接所述式(II)的化合物至所述寡聚化合物的核苷间连接基团，
-Y为O、NH、NR1或N-C(＝O)-R1，其中R1为：
·(C1-C20)烷基基团，其任选地被一个或多个选自以下的基团取代：卤素原子、(C1-C6)烷基基团、(C3-C8)环烷基基团、(C3-C14)杂环、(C6-C14)芳基基团、(C5-C14)杂芳基基团、-O-Z1、-N(Z1)(Z2)、-S-Z1、-CN、-C(＝J)-O-Z1、-O-C(＝J)-Z1、-C(＝J)-N(Z1)(Z2)和-N(Z1)-C(＝J)-Z2，其中
J为O或S，
Z1和Z2各自独立地为H、(C1-C6)烷基基团，其任选地被一个或多个选自以下的基团取代：卤素原子和(C1-C6)烷基基团，
·(C3-C8)环烷基基团，其任选地被一个或多个选自以下的基团取代：卤素原子和(C1-C6)烷基基团，或
·基团-[C(＝O)]m-R2-(O-CH2-CH2)p-R3，其中
m为整数，取值0或1，
p为整数，其范围为0至10，
R2为(C1-C20)亚烷基基团，其任选地被(C1-C6)烷基基团、-O-Z3、-N(Z3)(Z4)、-S-Z3、-CN、-C(＝K)-O-Z3、-O-C(＝K)-Z3、-C(＝K)-N(Z3)(Z4)和-N(Z3)-C(＝K)-Z4取代，其中
K为O或S，
Z3和Z4各自独立地为H、(C1-C6)烷基基团，其任选地被一个或多个选自以下的基团取代：卤素原子和(C1-C6)烷基基团，
和
R3选自氢原子、(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷氧基基团、(C3-C8)环烷基基团、(C3-C14)杂环、(C6-C14)芳基基团或(C5-C14)杂芳基基团，或R3为细胞靶向部分，
-X1和X2各自独立地为氢原子、(C1-C6)烷基基团，和
-Ra、Rb、Rc和Rd各自独立地为H或(C1-C6)烷基基团，
或其药学上可接受的盐。
在所述寡核苷酸的一些实施方案中，在一个或多个式(II)的化合物中，Y为NR1，R1为未取代的(C1-C20)烷基基团，且L1、L2、Ra、Rb、Rc、Rd、X1、X2 R2、R3和B具有如对于所述通式(II)所定义的相同的含义，或其药学上可接受的盐。
在所述寡核苷酸的一些实施方案中，在一个或多个式(II)的化合物中，Y为NR1，R1为未取代的(C1-C16)烷基基团，其包括选自甲基、异丙基、丁基、辛基、十六烷基的烷基基团，且L1、L2、Ra、Rb、Rc、Rd、X1、X2、R2、R3和B具有如式(II)中所定义的相同的含义，或其药学上可接受的盐。
在所述寡核苷酸的一些实施方案中，在一个或多个式(II)的化合物中，Y为NR1，R1为(C3-C8)环烷基基团，其任选地被一个或多个选自以下的基团取代：卤素原子和(C1-C6)烷基基团，且L1、L2、Ra、Rb、Rc、Rd、X1、X2、R2、R3和B具有如式(II)中所定义的相同的含义，或其药学上可接受的盐。
在所述寡核苷酸的一些实施方案中，在一个或多个式(II)的化合物中，Y为NR1，R1为环己基基团，且L1、L2、Ra、Rb、Rc、Rd、X1、X2、R2、R3和B具有如式(II)中所定义的相同的含义，或其药学上可接受的盐。
在所述寡核苷酸的一些实施方案中，在一个或多个式(II)的化合物中，Y为NR1，R1为被(C6-C14)芳基基团取代的(C1-C20)烷基基团，且L1、L2、Ra、Rb、Rc、Rd、X1、X2、R2、R3和B具有如式(II)中所定义的相同的含义，或其药学上可接受的盐。
在所述寡核苷酸的一些实施方案中，在一个或多个式(II)的化合物中，Y为NR1，R1为被苯基基团取代的甲基基团，且L1、L2、Ra、Rb、Rc、Rd、X1、X2、R2、R3和B具有如式(II)中所定义的相同的含义，或其药学上可接受的盐。
在所述寡核苷酸的一些实施方案中，在一个或多个式(II)的化合物中，Y为N-C(＝O)-R1，R1为任选取代的(C1-C20)烷基基团，且L1、L2、Ra、Rb、Rc、Rd、X1、X2、R2、R3和B具有如式(II)中所定义的相同的含义，或其药学上可接受的盐。
在所述寡核苷酸的一些实施方案中，在一个或多个式(II)的化合物中，Y为N-C(＝O)-R1，R1选自甲基和十五烷基，且L1、L2、Ra、Rb、Rc、Rd、X1、X2、R2、R3和B具有如式(II)中所定义的相同的含义，或其药学上可接受的盐。
在所述寡核苷酸的一些实施方案中，在一个或多个式(II)的化合物中，B选自嘧啶、取代的嘧啶、嘌呤和取代的嘌呤，或其药学上可接受的盐。
在所述寡核苷酸的一些实施方案中，在一个或多个式(II)的化合物中，所述核苷间连接基团独立地选自磷酸二酯、磷酸三酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、烷基-膦酸酯和氨基磷酸酯骨架连接基团。
在一些实施方案中，所述寡核苷酸包含2至10个式(II)的化合物。
在一些实施方案中，所述寡核苷酸包含一个或多个靶向核苷酸。
在所述寡核苷酸的一些实施方案中，在一个或多个式(II)的化合物中，R3具有式(III)：
Figure BDA0002760977440000111
其中A1、A2和A3为OHA4为OH或NHC(＝O)-R5，R5为任选地被卤素原子取代的(C1-C6)-烷基基团。
在所述寡核苷酸的一些实施方案中，在一个或多个式(II)的化合物中，R3为N-乙酰基-半乳糖胺。
本发明还涉及双链寡核苷酸，其包含一个或多个本公开所述的式(II)的化合物，或其药学上可接受的盐。
本发明还涉及siRNA，其包含一个或多个本公开所述的式(II)的化合物，或其药学上可接受的盐。
本公开还涉及用于得到本文指定的核苷酸前体、核苷酸类似物和单链或双链寡核苷酸的方法。
附图说明
图1：具有lT3、lT3b、lT1和lT1b突出端的siRNA 58至79的体外敲低
纵坐标：相对于对照siRNA，转染的HepG2细胞中AHA-1表达的百分比
横坐标：siRNA-编号，浓度
图2：具有或不具有其它胆固醇替代的具有lT3和lT3b突出端的siRNA 29至55的体外敲低
纵坐标：相对于对照，转染的HepG2细胞中AHA-1表达的百分数
横坐标：siRNA-编号
图3a和3b：如在X轴标签上所示，在物质皮下给药之前/之后血液采样时间点的相对TTR蛋白血清水平
纵坐标：相对于给药前的TTR血清水平+/-SEM
横坐标：皮下给药后的天数
图4：如在X轴标签上所示，在物质皮下给药之后的48h，研究记录的肝脏中的相对TTR mRNA表达水平
纵坐标：肝脏中的TTR mRNA相对表达+/-SD
横坐标：siRNA-编号，剂量
图5：如在X轴标签上所示，在物质皮下给药之后48h，研究记录的TTR蛋白血清水平
纵坐标：表达为ng/ml的血清TTR浓度+/-SD
横坐标：siRNA-编号，剂量
图6a和6b：如在X轴标签上所示，在物质皮下给药之后的血液采样时间点的相对TTR蛋白血清水平
纵坐标：相对于给药前的TTR血清水平+/-SEM
横坐标：皮下给药后的天数
图7：如在X轴标签上所示，在物质皮下给药之后的48h，研究记录的肝脏中的相对TTR mRNA表达水平
纵坐标：肝脏中的TTR mRNA相对表达+/-SD
横坐标：siRNA-编号，剂量
图8：如在X轴标签上所示，在物质皮下给药之后48h，研究记录的TTR蛋白血清水平
纵坐标：表达为ng/ml的血清TTR浓度+/-SD
横坐标：siRNA-编号，剂量
图9a和9b：如图标所示，在物质皮下给药之后的血液采样时间点的相对TTR蛋白血清水平
纵坐标：相对于给药前的TTR血清水平+/-SEM
横坐标：皮下给药后的天数
图10：如在X轴标签上所示，在物质皮下给药之后的48h，研究记录的肝脏中的相对TTR mRNA表达水平
纵坐标：肝脏中的TTR mRNA相对表达+/-SD
横坐标：siRNA-编号，剂量
图11：如在X轴标签上所示，在物质皮下给药之后48h，研究记录的TTR蛋白血清水平
纵坐标：表达为ng/ml的血清TTR浓度+/-SD
横坐标：siRNA-编号，剂量
图12a和12b：如图标所示，在物质皮下给药之后的血液采样时间点的相对TTR蛋白血清水平
纵坐标：相对于给药前的TTR血清水平+/-SEM
横坐标：皮下给药后的天数
图13：如在X轴标签上所示，在物质皮下给药之后的48h，研究记录的肝脏中的相对TTR mRNA表达水平
纵坐标：肝脏中的TTR mRNA相对表达+/-SD
横坐标：siRNA-编号，剂量
图14：如在X轴标签上所示，在物质皮下给药之后48h，研究记录的TTR蛋白血清水平
纵坐标：表达为ng/ml的血清TTR浓度+/-SD
横坐标：siRNA-编号，剂量
具体实施方式
本公开提供可掺入寡核苷酸中的新型核苷酸类似物，所述寡核苷酸包括双链寡核苷酸，诸如siRNA。含这些类似物的寡核苷酸具有出色的生物学活性，例如，改善的体外稳定性和体内作用时长。改善的寡核苷酸可用于沉默(例如减少或消除)靶基因的表达。在特定的实施方案中，本发明涵盖有待在双链RNA(dsRNA)以及尤其siRNA中所包含的特定的核苷酸类似物，其可以与所关注的信使RNA(mRNA)杂交，从而减少或阻断所关注的靶基因的表达。
在一些实施方案中，本发明提供了核苷酸类似物，其中核糖环被六元杂环取代。如下面进一步详细描述的，六元杂环基团可为二噁烷或吗啉代环。当杂环基团是吗啉代环时，氮原子是取代的或未取代的。在一些实施方案中，六元杂环基团可被线性或环状基团和/或靶向部分取代。
定义
本说明书中使用的术语通常具有本领域的普通含义。某些术语在下文或本公开的其它地方讨论，以提供描述当前公开主题的产品和方法的其它指导。
以下定义适用于本公开的上下文：
如本说明书和所附权利要求书中所使用的，除非内容另外明确指出，否则单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”包括复数个指示物。
如本文所用，术语“约”是指本技术领域的技术人员容易知道的各个值的通常误差范围。本文中对“约”值或参数的提及包括(并描述)针对该值或参数本身的实施方案。在一些实施方案中，术语“约”是指给定值的±10％。然而，只要所涉及的值是指不可分割的对象，例如核苷酸或其它对象，其一旦被细分就会失去其身份，则“约”是指不可分割对象的±1。
应当理解，本文描述的本公开的方面和实施方案包括“具有”方面和实施方案，“包含”方面和实施方案，“由方面和实施方案组成”和“基本上由方面和实施方案组成”。词语“具有(have)”和“包含(comprise)”，或诸如“具有(has或having)”或“包含(comprises或comprising)”的变体应理解为意指包括所述要素(例如，物质的组成或方法步骤)，但不排除其它任何元素。术语“由...组成”意指包括所述要素，但不包括任何其它要素。术语“基本上由……组成”意指包括所述要素，并且可能包括其它要素，其中其它要素实质上不影响本发明的基本和新颖特征。
除非另有说明，否则“烷基”是指可为直链或支链的、在链中具有1至20个(例如，1-5、1-10或1-15个)碳原子的脂族烃基。“支链的”是指一个或多个诸如甲基、乙基或丙基的烷基基团连接至线性烷基链上。示例性的直链或支链的烷基基团包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、正戊基、3-戊基、辛基、壬基和癸基。
“环烷基”是指如上定义的环状饱和烷基基团。实例为但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基。
“烷氧基”定义为-OR基团，其中R是如上定义的烷基基团，其包括环烷基基团。实例为但不限于甲氧基、乙氧基、1-丙氧基、2-丙氧基、丁氧基和戊氧基。
“卤素原子”是指氟、氯、溴或碘原子。在一些实施方案中，可优选氟或氯原子。
除非另有说明，否则“芳基”是指具有6至14个碳原子、例如6至10个碳原子的芳族单环或多环烃环体系。示例性的芳基基团包括苯基和萘基基团。
“杂环”或“杂环的”是指包含至少一个选自氧、氮、硒、磷和硫的杂原子的饱和的、部分不饱和的或不饱和的碳环基团。所述氮、硒、磷或硫可任选地被氧化，而氮可任选地被季铵化。例如，该杂环可为稳定的环，其中至少一个环成员为杂原子。在一些实施方案中，该杂环可具有3至14个成员，例如5至7个或5至10个成员，并可具有1个、2个或多个环(即单环、双环或多环)。在特定的实施方案中，所述杂原子为氧、氮和硫。杂原子的数量可例如从1至3变化。在The Handbook of Chemistry and Physics，76th Edition，CRC Press，Inc.，1995-1996，pppp.2-25至2-26(其公开内容通过引用并入本文)中也公开了适合的杂环。在一些实施方案中，杂环为非芳族杂环，其包括但不限于吡咯烷基、吡唑烷基、咪唑烷基、环氧乙烷基、四氢呋喃基、二氧杂戊环基、四氢吡喃基、二噁烷基、二氧杂戊环基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基、吡喃基、咪唑啉基、吡咯啉基、吡唑啉基、噻唑烷基、四氢硫代吡喃基、二噻烷基、硫代吗啉基、二氢-吡喃基、四氢吡喃基、二氢吡喃基、四氢吡啶基、二氢吡啶基、四氢嘧啶基(tetrahydropyrinidinyl)、二氢硫代吡喃基和氮杂环庚烷基，以及与苯基基团缩合产生的稠合体系。
“杂芳基”是指具有5至14个(例如，5至7或5至10个)成员的芳族杂环，且可为单环、双环或多环。杂原子的数目通常可从1至3个杂原子变化，例如选自N和O。杂芳基基团的实例包括吡咯基、吡啶基、吡唑基、噻吩基、嘧啶基、吡嗪基、四唑基、吲哚基、喹啉基、嘌呤基、咪唑基、噻吩基、噻唑基、苯并噻唑基、呋喃基、苯并呋喃基、1,2,4-噻二唑基、噁二唑、异噻唑基、三唑基、四唑基、异喹啉基、苯并噻吩基、异苯并呋喃基、吡唑基、咔唑基、苯并咪唑基、异噁唑基和吡啶基-N-氧化物，以及与苯基基团缩合产生的稠合体系。在特定的实施方案中，杂芳基是包含一个或多个杂原子，例如选自N和O的1-3个杂原子的5或6元杂芳基。“烷基”、“环烷基”、“烯基”、“炔基”、“芳基”、“杂芳基”和“杂环基”也指通过去除两个氢原子而形成的相应的“亚烷基”、“亚环烷基”、“亚烯基”、“亚炔基”、“亚芳基”、“杂亚芳基”和“杂亚环基”。
术语“杂环核碱基”是指当核碱基掺入聚合物结构中时，能够与互补的核碱基或核碱基类似物(即核碱基的衍生物)配对形成Watson-Crick型氢键和堆积相互作用的任何含氮的杂环部分。
除非另有说明，否则根据本公开，术语“杂环核碱基”在本文中是指可连接到任选取代的二噁烷环上或任选取代的吗啉代环上的任选取代的含氮杂环基团。在一些实施方案中，可从任选取代的嘌呤-碱基或任选取代的嘧啶-碱基中选择杂环核碱基。术语“嘌呤-碱基”在本文中以如本领域技术人员所理解的其普通含义使用，并且包括其互变异构体。类似地，术语“嘧啶-碱基”在本文中以如本领域技术人员所理解的其普通含义使用，并且包括其互变异构体。任选取代的嘌呤-碱基的非限制性列表包括嘌呤、腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤、别黄嘌呤、7-烷基鸟嘌呤(例如，7-甲基鸟嘌呤)、可可碱、咖啡因、尿酸和异鸟嘌呤。嘧啶-碱基的实例包括但不限于胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、5,6-二氢尿嘧啶和5-烷基胞嘧啶(例如，5-甲基胞嘧啶)。杂环核碱基的其它非限制性实例包括二氨基嘌呤，8-氧代-N6烷基腺嘌呤(例如，8-氧代-N6甲基腺嘌呤)、7-脱氮黄嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、N4,N4-桥亚乙基胞嘧啶(ethanocytosin)、N6,N6-桥亚乙基(ethano)-2,6-二氨基嘌呤、5-卤代尿嘧啶(例如，5-氟尿嘧啶和5-溴尿嘧啶)、假异胞嘧啶、异胞嘧啶、异鸟嘌呤、1,2,4-三唑-3-甲酰胺和美国专利号5,432,272和7,125,855中描述的其它杂环核碱基，所述美国专利通过引用并入本文，公开了额外的杂环碱基。在一些实施方案中，可用胺或烯醇保护基团取代杂环核碱基。
如本文所用，术语“保护基团”是指被添加到分子中以防止分子中现有基团进行不期望的化学反应的任何原子或原子团。“保护基团”可为本领域已知的不稳定的化学部分，其用于保护反应性基团，例如羟基、氨基和硫醇基团，以防止在化学合成过程中发生不期望的或不合时宜的反应。保护基团通常在其它反应性位点的反应期间选择性地和/或正交地用于保护位点，然后可以被去除以留下未受保护的基团保持原样或可用于进一步的反应。
保护基团部分的实例描述于T.W.Greene和P.G.M.Wuts的Protective Groups inOrganic Synthesis，3.Ed.John Wiley&Sons，1999和J.F.W.McOmie，Protective Groupsin Organic Chemistry Plenum Press，1973中，出于公开适合的保护基团的有限目的，通过引用将其均并入本文。可以这样的方式选择保护基团部分，使得它们对某些反应条件稳定，且使用本领域已知的方法在方便的阶段容易去除。
保护基团的非限制性列表包括苄基；取代的苄基；烷基羰基和烷氧基羰基(例如，叔丁氧基羰基(BOC)、乙酰基或异丁酰基)；芳基烷基羰基和芳基烷氧基羰基(例如，苄基氧基羰基)；取代的甲基醚(例如甲氧基甲基醚)；取代的乙醚；取代的苄基醚；四氢吡喃基醚；甲硅烷基(例如，三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、三-异丙基甲硅烷基氧基甲基、[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基或叔丁基二苯基甲硅烷基)；酯类(例如苯甲酸酯)；碳酸酯类(例如碳酸甲氧基甲基酯)；磺酸酯类(例如甲苯磺酸酯或甲磺酸酯)；非环缩酮(例如二甲基乙缩醛)；环缩酮(例如，1,3-二噁烷、1,3-二氧戊环以及本文所述的那些)；非环乙缩醛；环乙缩醛(例如，本文所述的那些)；非环半缩醛；环半缩醛；环二硫缩酮(例如，1,3-二噻烷或1,3-二硫戊环)；原酸酯(例如，本文所述的那些)以及三芳基甲基基团(例如，三苯甲基；单甲氧基三苯甲基(MMTr)；4,4′-二甲氧基三苯甲基(DMTr)；4,4′,4″-三甲氧基三苯甲基(TMTr)；以及本文所述的那些)。
优选的保护基团选自乙酰基(Ac)、苯甲酰基(Bzl)、异丁酰基(iBu)、苯基乙酰基、二甲氧基三苯甲基(DMT)、甲氧基三苯甲基(MMT)、三苯基甲基(Trt)、N,N-二甲基甲脒和2-氰基乙基(CE)。
除非另有说明，否则任何保护基、氨基酸和其它化合物的缩写均与它们的常用用法、公认的缩写或IUPAC-IUB生物化学命名委员会一致(参见，Biochem.11:942-944(1972))。
如本文所用，术语“固体载体”(也称为树脂)是指在合成过程中与寡核苷酸结合的不溶性颗粒，其通常直径为50-200μm。已使用多种类型的固体载体，但是已证明受控孔玻璃(CPG)和聚苯乙烯(高度交联的聚苯乙烯微珠)特别有用。受控孔玻璃是刚性的，不会膨胀，具有深孔(孔径在500至
Figure BDA0002760977440000171
之间)，可在其中进行寡核苷酸合成。用于常规寡核苷酸合成的固体载体是可商购的，在CPG固体载体的情况下，通常每克树脂负载20-40μmol的核苷。聚苯乙烯基固体载体显示出更高的负载量，每克树脂高达300μmol。具有已经附接的标准核苷酸的固体载体材料是可商购的，氨基-官能化的CPG和聚苯乙烯材料用于合成非商业性的构造单元，如将稍后显示的本文所述的构造单元。除了已经附接第一核苷酸构造单元的固体载体之外，可使用可商购的通用固体固体载体，这将在本公开中稍后描述。
如下文所定义，术语“核糖核苷酸”或“核苷酸”包括如下文进一步详述的天然存在的或修饰的核苷酸，或替代性的替代部分。修饰的核苷酸是非天然存在的核苷酸，并且在本文中也称为“核苷酸类似物”。本领域普通技术人员将理解的是，核苷酸中的鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、尿嘧啶或胸腺嘧啶可被其它部分替代，而基本上不改变包含带有这种替代部分的核苷酸的寡核苷酸的碱基配对特性。例如，但不限于，包含肌苷作为碱基的核苷酸可以与包含腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶的核苷酸碱基配对。因此，在本公开的核苷酸序列中，含有尿嘧啶、鸟嘌呤或腺嘌呤的核苷酸可被含有例如肌苷的核苷酸替代。包括包含这种替代部分的序列作为本公开的实施方案。
如本文所用，“细胞靶向部分”是指确保siRNA传递增加的分子基团，其涵盖(i)siRNA与所选靶受体(例如靶蛋白)结合的特异性增加，包括siRNA与表达所选靶受体的细胞结合的特异性增加；(ii)靶细胞对siRNA的摄取增加；和/或(iii)一旦siRNA进入靶细胞后，对siRNA进行适当处理的能力增强，诸如增加siRNA在细胞内的释放，例如，通过促进siRNA从转运囊泡到细胞质的转运。因此，细胞靶向部分用于导向和/或递送寡核苷酸至特定的细胞、组织、器官等。核苷酸、核苷酸类似物或寡核苷酸中包含的细胞靶向部分赋予所述核苷酸、核苷酸类似物或寡核苷酸特征，使得所述核苷酸、核苷酸类似物或寡核苷酸相对于非靶向的细胞类型被靶向的细胞类型优先识别、结合、内化、加工、激活等。例如，内皮细胞对肽细胞靶向部分Arg-Gly-Asp(RGD)具有较高的亲和力；癌细胞和肾细胞优先与具有叶酸部分的化合物相互作用；免疫细胞对甘露糖具有亲和力；而心肌细胞对肽WLSEAGPVVTVRALRGTGSW(SEQ ID NO:118)具有亲和力(参见，例如，Biomaterials ZV-8081-8087，2010)。其它细胞靶向/递送部分是本领域已知的。因此，包含细胞靶向部分的化合物优先与靶向的细胞类型相互作用并被其吸收。
细胞靶向部分涵盖细胞靶向肽基团和细胞靶向非肽基团。
如本文所用，“靶细胞”或“靶向的细胞”是指目标细胞。这些细胞可以在体外、体内、生物体的组织或器官中发现。该生物体可为动物，优选为哺乳动物，更优选为人类，最优选为人类患者。
如本文所用，术语“TTR”是指运甲状腺素蛋白基因或蛋白质。如本文所用，术语“TTR”包括人TTR，其氨基酸和核苷酸序列可在例如EMBL数据库中找到，其登录号为CR456908；小鼠TTR，其氨基酸和核苷酸序列可在例如GenBank数据库中找到，其登录号为AAH24702。TTR mRNA序列的其它实例可容易地在例如GenBank中获得。
如本文所用，术语“AHA-1”指AHSA1基因或蛋白质。如本文所用，术语“AHA-1”包括人AHSA-1，其氨基酸和核苷酸序列可在例如EMBL数据库中找到，其登录号为AK300766。
如本文所用，“靶序列”是指在靶基因或其部分的RNA转录物中发现的连续核苷酸序列，所述RNA转录物包括mRNA，其为初级转录产物的RNA加工的产物。
如本文所用，且除非另有说明，否则术语“互补”在用于描述与第二核苷酸序列(例如，寡核苷酸)有关的第一核苷酸序列(例如，寡核苷酸)时，如本领域普通技术人员将理解的，指第一核苷酸序列在一定条件下与第二核苷酸序列杂交并形成双链体结构的能力。这包括在第一或第二核苷酸序列的整个长度上第一核苷酸序列与第二核苷酸序列的碱基配对。此类序列在本文中可被称为相对于彼此“完全互补”。在本文中，第一序列相对于第二序列被称为“基本上互补”的情况下，这两个序列可为完全互补的，或者它们可以具有70％或更高的核苷酸同一性，同时保留在与它们的最终靶标最相关的条件下杂交的能力。然而，当两种寡核苷酸被设计成在杂交时形成一个或多个单链突出端时，就确定互补性而言，此类突出端不应视为错配(mismatch)。例如，双链RNA(dsRNA)，其包括21个核苷酸的长度的第一寡核苷酸和23个核苷酸的长度的第二寡核苷酸，其中第二寡核苷酸包含与第一寡核苷酸完全互补的21个核苷酸的序列，出于本公开的目的，所述双链RNA可仍被称为“完全互补”。只要满足上述关于其杂交能力的要求，“互补”序列还可包括非Watson-Crick碱基对和/或由非天然和修饰的核苷酸形成的碱基对，或完全由非Watson-Crick碱基对和/或由非天然和修饰的核苷酸形成的碱基对形成。关于在dsRNA的有义链与反义链之间、或在dsRNA的反义链与靶序列之间的碱基配对，如从其所用的上下文中将理解的，可使用术语“互补的”、“完全互补的”和“基本上互补的”。如本文所用，与mRNA的“至少一部分基本互补”的多核苷酸是指与目标mRNA的连续部分基本互补的多核苷酸。如本文所用，术语“双链RNA”或“dsRNA”是指核糖核酸分子的复合物，其具有包含两个反平行且基本互补的(如上文所定义的)核酸链的双链体结构。形成双链体结构的两条链可为一个较大RNA分子的不同部分，它们也可为单独的RNA分子。在单独的RNA分子的情况下，此类dsRNA在文献中可称为短干扰RNA(siRNA)。在两条链是一个较大分子的部分，并因此通过在形成双链体结构的第一条链的3’-末端和第二条链的5’-末端之间的不间断的核苷酸链连接的情况下，连接RNA链被称为“发夹环”(hairpin loop)、“短发夹RNA”(short hairpin RNA)或“shRNA”。在两条链通过不同于在形成双链体结构的第一条链的3’-末端与第二条链的5’-末端之间的不间断的核苷酸链的方式共价连接的情况下，该连接结构称为“接头”。RNA链可具有相同或不同数目的核苷酸。碱基对的最大数目是dsRNA最短链中的寡核苷酸的数目减去双链体中存在的任何突出端。除双链体结构外，dsRNA还可包含一个或多个核苷酸突出端。另外，如本文所用，术语“dsRNA”可包括对核糖核苷酸的化学修饰，包括在多个核苷酸上的实质性修饰，并包括本文公开的或本领域已知的所有类型的修饰。出于本公开的目的，用于siRNA类型分子中的任何此类修饰均涵盖于“dsRNA”中。在一些实施方案中，dsRNA中的核苷酸间键可被修饰，例如，如本文所述被修饰。
在本公开的范围内，两个核酸序列之间的“同一性百分比”意指在最佳比对后获得的两个待比较序列之间相同核苷酸残基的百分比，该百分比纯粹是统计学的，且两个序列之间的差异沿其长度随机分布。传统上，两个核酸序列的比较是通过对序列进行最佳比对后进行比较来进行的，所述比较能够通过片段或通过使用“比对窗口”来进行。除了手动比较外，还可以借助Smith和Waterman(1981)的局部同源性算法，借助Neddleman和Wunsch(1970)的局部同源性算法，借助Pearson和Lipman(1988)的相似性搜索方法，或借助使用这些算法的计算机软件(Wisconsin Genetics Software Package，Genetics ComputerGroup，575Science Dr.，Madison，WI中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，或通过比较软件BLAST NR或BLAST P)进行用于比较的序列的最佳比对。
两个核酸序列之间的同一性百分比通过比较两个最佳比对的序列来确定，其中待比较的核酸序列与参考序列相比可具有添加或缺失，以在两个序列之间进行最佳比对。同一性百分比通过以下计算：通过确定两个序列之间、优选两个完整序列之间的核苷酸残基相同的位置数目，将相同位置的数目除以比对窗口中的位置总数，然后将结果乘以100，以获取两个序列之间的同一性百分比。
如本文所期望的，与参考序列具有至少70％核苷酸同一性的核苷酸序列涵盖与所述参考序列具有至少71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％的核苷酸同一性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，dsRNA包含修饰的核糖核苷，其包括脱氧核糖核苷，包括，例如，脱氧核糖核苷突出端、dsRNA的双链部分内的一个或多个脱氧核糖核苷等。然而，不言而喻的是，在任何情况下，术语“dsRNA”都不涵盖双链DNA分子。
如本文所用，术语“核苷酸突出端”是指当dsRNA的第一条链的3’-末端延伸超过第二条链的5’-末端时，未配对核苷酸或从dsRNA的双链体结构突出的核苷酸，反之亦然。“钝的”或“平端”(“Blunt”或“blunt-end”)意指在dsRNA的该末端没有未配对的核苷酸，即没有核苷酸突出端。“平端”dsRNA是在其整个长度上为双链dsRNA，即，在分子的任一端没有核苷酸突出端。为了清楚起见，在确定dsRNA具有突出端还是为平端时，不考虑与dsRNA链的3’-末端和/或5’-末端缀合的化学帽或非核苷酸化学部分。
如本文所用，dsRNA中的术语“反义链”是指含有与靶序列基本互补的序列的dsRNA链。dsRNA中的另一条链是“有义链”。
如本文所用，术语“引入细胞中”意指如本领域普通技术人员所理解的促进向细胞内的摄取或吸收。dsRNA的吸收或摄取可通过未受协助的扩散或活性细胞过程或通过辅助剂或装置发生。该术语的含义不限于体外细胞；dsRNA也可以“引入细胞中”，其中细胞是活生物体的一部分。在这种情况下，引入细胞中将包括递送至生物体。例如，对于体内递送，可将dsRNA注射至组织部位或全身给药。体内递送也可通过β-葡聚糖递送系统介导(参见，例如，Tesz，G.J.等人，2011，Biochem J.436(2):351-62)。体外引入细胞中包括本领域已知的方法，诸如电穿孔和脂质转染。其它方法在下文中描述或为本领域已知。
如本文中所定义，术语“抑制表达”或“抑制……的表达”在其涉及靶基因的情况下，是指至少部分抑制靶基因的表达，其表现为从靶基因转录的mRNA的数量减少。如本文所用，术语“抑制”与“减少”、“沉默”、“下调”、“压制”、“敲低(knock-down)”和其它类似术语互换使用，并包括任何抑制水平。抑制的程度通常用[(((对照细胞中的mRNA)-(处理过的细胞中的mRNA))/(对照细胞中的mRNA))·100％表示。或者，抑制的程度可以根据与靶基因转录功能性连接的参数的减少来给出，例如，由细胞分泌的靶基因编码的蛋白质的量，或表现出某种表型例如细胞凋亡的细胞的数目。原则上，可以通过组成型或基因组工程并且通过任何适当的测定方法，在表达靶标的任何细胞中确定靶基因的沉默。然而，当需要参考以确定给定的dsRNA是否在某种程度上抑制抑制靶基因的表达并因此被本公开所涵盖时，以下实施例中提供的测定应作为此类参考。
如本文所用，在靶基因表达的上下文中，术语“治疗”(“treat”、“treatment”)等是指减轻或缓解由靶基因表达介导的病理过程。在本公开的上下文中，在涉及下文所述的任何其它病况(由靶标表达介导的病理过程除外)的情况下，术语“治疗”等是指减轻或缓解与这种病况有关的一种或多种症状。
如本文所用，关于疾病或病症的术语“预防”或“延缓疾病的进展”(及其语法变体)涉及疾病的预防性治疗，例如在怀疑患有该疾病或处于发展这种疾病的危险中的个体中。预防可包括但不限于预防或延迟疾病的发作或进展和/或将疾病的一种或多种症状维持在所需或亚病理水平。
如本文所用，术语“治疗有效量”和“预防有效量”是指在治疗、预防或管理由靶基因表达介导的病理过程或由靶基因表达的介导的病理过程的明显症状中提供治疗益处的量。治疗有效的具体量可以由普通医师容易地确定，并且可取决于因素，所述因素为例如由靶基因表达介导的病理过程的类型和阶段、患者的病史和年龄以及抑制由靶基因介导的生物过程的其它治疗剂的给药。
如本文所用，术语“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于家养动物(例如，牛、羊、猫、狗和马)、灵长类动物(例如，人类和非人类灵长类动物，例如猴子)、兔和啮齿动物(例如，小鼠和大鼠)。在一些实施方案中，个体或受试者为人。
术语“核苷间键”、“核苷间连接基团”、“核苷酸间键”或“核苷酸间连接基团”在本文中可互换使用，是指两个核苷(即，杂环碱基部分和糖部分)单元之间的任何接头或键，如本领域已知的，包括但不限于，磷酸酯、磷酸酯的类似物、硫代磷酸酯、膦酸酯、胍鎓、羟基胺、羟基肼基、酰胺、氨基甲酸酯、烷基和取代的烷基键。两个核苷之间、两个核苷类似物之间或在核苷和核苷类似物之间的键可涉及“核苷间连接基团”。
核苷间键构成核酸分子的骨架。核苷间连接基团是指连接核酸分子中包含的两个相邻核苷残基的化学基团，其包括(i)连接两个相邻核苷残基的化学基团，(ii)连接核苷残基与相邻的核苷类似物残基的化学基团，以及(iii)连接第一核苷类似物残基与第二核苷类似物残基的化学基团，这些核苷类似物残基可相同或不同。核苷类似物残基涵盖本文公开的式(II)的化合物。一方面，本发明的siNA分子的核苷酸可以通过第一核苷酸的糖部分的3'-碳和第二核苷酸的糖部分的5'-碳之间的键(本文称为3'核苷间键)与相邻的核苷酸连接。如本文所用，3′-5′核苷间键是指连接两个相邻核苷单元的核苷间键，其中该键位于第一核苷的糖部分的3'-碳与第二核苷的糖部分的5'-碳之间。在另一方面，本发明的siNA分子的核苷酸(包括核苷酸类似物)可以通过第一核苷酸的糖部分的2'-碳与第二核苷酸的糖部分的5'-碳之间的键(本文称为2'核苷间键)与相邻的核苷酸(包括核苷酸类似物)连接。如本文所用，2′-5′核苷间键是指连接两个相邻核苷单元的核苷间键，其中该键位于第一核苷的糖部分的2'碳与第二核苷的糖部分的5'-碳之间。
如本文所用，术语“核苷间连接基团”涵盖含磷和不含磷的核苷间连接基团。
在一些实施方案中，含磷的核苷间连接基团涵盖磷酸二酯、硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基以及其它烷基膦酸酯(包括3'-亚烷基膦酸酯、5'-亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯)、亚膦酸酯、氨基磷酸酯(包括3'-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯)、硫羰基氨基磷酸酯、硫羰基烷基膦酸酯、硫羰基烷基磷酸三酯、硒代磷酸酯和具有正常的3'-5'键的硼烷磷酸酯及其2’-5'连接类似物。
教导上述含磷的核苷间键的制备的代表性美国专利包括美国专利3,687,808；4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,196；5,188,897；5,264,423；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,306；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361；5,194,599；5,565,555；5,527,899；5,721,218；5,672,697和5,625,050，其中每个通过引用并入本文。
在一个实施方案中，非磷酸二酯骨架键选自硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、烷基-膦酸酯和氨基磷酸酯骨架连接基团。
在一个实施方案中，含磷的核苷间连接基团涵盖磷酸二酯、磷酸三酯和硫代磷酸酯。
在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸包含一个或多个不包含磷原子的核苷间连接基团。此类寡核苷酸包括但不限于由短链烷基或环烷基核苷间连接基团、混合杂原子和烷基或环烷基核苷间连接基团，或一个或多个短链杂原子或杂环核苷间连接基团形成的那些。这些包括具有以下的那些：硅氧烷骨架；硫化物、亚砜和砜骨架；甲乙酰基(formacetyl)和硫代甲乙酰基(thioformacetyl)骨架；亚甲基甲乙酰基和硫代甲乙酰基骨架；核糖乙酰基骨架；含烯烃的骨架；氨基磺酸酯骨架；亚甲基亚氨基和亚甲基肼基骨架；磺酸酯和磺酰胺骨架；酰胺骨架；以及其它具有混合的N、O、S和CH2组成部分的那些。教导上述不含磷的核苷间连接基团的制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,264,562；5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5,541,307；5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,610,289；5,602,240；5,608,046；5,610,289；5,618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437；5,792,608；5,646,269和5,677,439，其中每个通过引用并入本文。
在一个实施方案中，本发明的寡核苷酸包含一个或多个非离子的中性核苷间连接基团。中性核苷间连接基团涵盖非离子连接基团，其包含硅氧烷(二烷基硅氧烷)、羧酸酯、甲酰胺、硫化物、磺酸酯和酰胺(例如，参见：Carbohydrate Modifications in AntisenseResearch；Y.S.Sanghvi and P.D.Cook Eds.ACS Symposium Series 580；第3和4章，(pp.40-65))。另外的中性核苷间连接基团涵盖包含混合的N、O、S和CH2组成部分的非离子键。
式(I)的化合物
本发明涉及通式(I)的化合物：
Figure BDA0002760977440000241
其中：
-B为杂环核碱基；
-P1和P2各自独立地为H、反应性磷基团或保护基团；
-Y为O、NH、NR1或N-C(＝O)-R1，其中R1为：
·(C1-C20)烷基基团，其任选地未取代或被一个或多个选自以下的基团取代：卤素原子、(C1-C6)烷基基团、(C3-C8)环烷基基团、(C3-C14)杂环、(C6-C14)芳基基团、(C5-C14)杂芳基基团-O-Z1、-N(Z1)(Z2)、-S-Z1、-CN、-C(＝J)-O-Z1、-O-C(＝J)-Z1、-C(＝J)-N(Z1)(Z2)和-N(Z1)-C(＝J)-Z2，其中
J为O或S，
Z1和Z2各自独立地为H、(C1-C6)烷基基团，其任选地被一个或多个选自以下的基团取代：卤素原子和(C1-C6)烷基基团，
·(C3-C8)环烷基基团，其任选地被一个或多个选自以下的基团取代：卤素原子和(C1-C6)烷基基团，或
·基团-[C(＝O)]m-R2-(O-CH2-CH2)p-R3，其中
m为整数，取值0或1，
p为整数，其范围为0至10，
R2为(C1-C20)亚烷基基团，其任选地被(C1-C6)烷基基团、-O-Z3、-N(Z3)(Z4)、-S-Z3、-CN、-C(＝K)-O-Z3、-O-C(＝K)-Z3、-C(＝K)-N(Z3)(Z4)、-N(Z3)-C(＝K)-Z4取代，其中
K为O或S，
Z3和Z4各自独立地为H、(C1-C6)烷基基团，其任选地被一个或多个选自以下的基团取代：卤素原子和(C1-C6)烷基基团，
和
R3选自氢原子、(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷氧基基团、(C3-C8)环烷基基团、(C3-C14)杂环、(C6-C14)芳基基团或(C5-C14)杂芳基基团，或
R3为细胞靶向部分，
-X1和X2各自独立地为氢原子、-(C1-C6)烷基基团，和
-Ra、Rb、Rc和Rd各自独立地为H或(C1-C6)烷基基团。
为了本公开的目的，式(I)的化合物被术语“核苷酸前体”涵盖。为了本公开的目的，式(I)的化合物，其中基团R3存在，并意指细胞靶向部分被术语“靶向的核苷酸前体”涵盖。
如本文所公开的式(I)和(II)的化合物涵盖其立体异构体，包括其(2S,6R)立体异构体和其(2R,6R)立体异构体，如在下式中具体描述的，下式指定式(I)和(II)的化合物的位置编号和手性中心：
Figure BDA0002760977440000261
如本文实施例所示，当掺入寡核苷酸中时，使式(I)的化合物的(2S,6R)立体异构体和式(I)的化合物的(2R,6R)立体异构体具有相同的产生siRNA的能力，从而很好地抑制靶mRNA。
如上所述，发明人已经构思了包含二噁烷环或吗啉代环的式(I)的特定核苷酸前体，其可用作合成基因沉默寡核苷酸的构造单元，特别是用于合成siRNA。
因此，在本文中可以称为“二噁烷类似物”的式(I)的化合物的一些实施方案中，Y为O。本公开中此类核苷酸前体的实施方案称为pre-lB1，其中B如式(I)中所定义，例如当B由胸苷基基团组成时，则为pre-lT1。
在本文中可以称为“吗啉代类似物”的式(I)的化合物的其它实施方案中，Y为NH、NR1或NC(＝O)R1。
在式(I)的吗啉代类似物中，优选将氮原子进行官能化，以改善所得的含有吗啉代类似物的寡核苷酸以及特别是所得的含有吗啉代类似物的siRNA的性质。
在式(I)的化合物的一些实施方案中，这些化合物是本公开的吗啉代类似物，其不包含细胞靶向部分。根据这些实施方案，基团R3当存在时，不代表细胞靶向部分。
因此，在式(I)的吗啉代类似物的一些优选的实施方案中，Y为NH、NR1或N-C(＝O)-R1，且R1如对于通式(I)所定义。
在一些实施方案中，其中Y为NR1，R1为：
·(C1-C20)烷基基团，其任选地被一个或多个选自以下的基团取代：卤素原子、(C1-C6)烷基基团、(C3-C8)环烷基基团、(C3-C14)杂环、(C6-C14)芳基基团、(C5-C14)杂芳基基团、-O-Z1、-N(Z1)(Z2)、-S-Z1、-CN、-C(＝J)-O-Z1、-O-C(＝J)-Z1、-C(＝J)-N(Z1)(Z2)和-N(Z1)-C(＝J)-Z2，其中
J为O或S，和
Z1和Z2各自独立地为H、(C1-C6)烷基基团，其任选地被一个或多个选自以下的基团取代：卤素原子和(C1-C6)烷基基团，或
·(C3-C8)环烷基基团，其任选地被一个或多个选自以下的基团取代：卤素原子和(C1-C6)烷基基团，
·基团-[C(＝O)]m-R2-(O-CH2-CH2)p-R3，其中
m为整数，取值0或1
p为整数，其范围为0至10
R2为(C1-C20)亚烷基基团，其任选地被(C1-C6)烷基基团、-O-Z3、-N(Z3)(Z4)、-S-Z3、-CN、-C(＝K)-O-Z3、-O-C(＝K)-Z3、-C(＝K)-N(Z3)(Z4)、-N(Z3)-C(＝K)-Z4取代，其中
K为O或S，
Z3和Z4各自独立地为H、(C1-C6)烷基基团，其任选地被一个或多个选自以下的基团取代：卤素原子和(C1-C6)烷基基团，
和
R3选自氢原子、(C1-C6)-烷基、(C1-C6)-烷氧基、(C3-C8)环烷基基团、(C3-C14)杂环、(C6-C14)芳基基团或(C5-C14)杂芳基基团，
X1和X2各自独立地为氢原子、(C1-C6)烷基基团
Ra、Rb、Rc和Rd各自独立地为H或(C1-C6)烷基基团。
如本文中所预期，(C1-C20)烷基基团，其可为未取代的烷基基团或取代的烷基基团，包括C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19和C20烷基基团。
如本文中所预期，(C1-C6)烷基基团，其可为未取代的烷基基团或取代的烷基基团，包括C1、C2、C3、C4、C5和C6烷基基团。
如本文中所预期，(C3-C8)环烷基基团，其可为未取代的环烷基基团或取代的环烷基基团，包括C3、C4、C5、C6、C7和C8环烷基基团。
如本文中所预期，(C3-C14)杂环，其可为未取代的或取代的杂环，包括C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13和C14杂环。
如本文中所预期，(C6-C14)芳基基团，其可为未取代的芳基基团或取代的芳基基团，包括C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13和C14芳基基团。
如本文中所预期，(C5-C14)杂芳基基团，其可为未取代的杂芳基基团或取代的杂芳基基团，包括C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13和C14杂芳基基团。
在式(I)的化合物的一些实施方案中，其中Y为NR1，R1为任选取代的(C1-C20)烷基基团，且P1、P2、Ra、Rb、Rc、Rd、X1、X2和B如对于通式(I)所定义。
在这些实施方案的一些中，其中Y为NR1，R1为未取代的(C1-C20)烷基基团。
在实施方案的一些中，其中Y为NR1，R1为未取代的(C1-C16)烷基基团，其包括选自甲基、异丙基、丁基、辛基、十六烷基的烷基基团，且P1、P2、Ra、Rb、Rc、Rd、X1、X2和B具有如对于通式(I)所定义的相同的含义。
在一些实施方案中，其中Y为NR1，R1为甲基基团，Ra、Rb、Rc、Rd、X1和X2为氢原子，且P1和P2如对于通式(I)所定义。本公开中此类核苷酸前体的实施方案被称为pre-lB2，其中B具有与通式(I)中相同的定义；例如，当B由胸苷基基团组成时，本公开中此类核苷酸前体的实施方案被称为pre-lT2。
在一些实施方案中，其中Y为NR1，R1为异丙基基团，Ra、Rb、Rc、Rd、X1和X2为氢原子，且P1和P2如对于通式(I)所定义。本公开中此类核苷酸前体的实施方案被称为pre-lB3，其中B具有与通式(I)中相同的定义；例如，本公开中此类核苷酸前体的实施方案被称为pre-lT3，其中B由胸苷基基团组成；被称为pre-lU3，其中B由尿嘧啶基团组成；当B由鸟嘌呤基(guanyl)基团组成时被称为pre-lG3；被称为pre-lC3，其中B由胞嘧啶基(cytosyl)组成；被称为pre-lA3，其中B由腺嘌呤基(adenyl)基团组成。
在一些实施方案中，其中Y为NR1，R1为丁基基团，Ra、Rb、Rc、Rd、X1和X2为氢原子，且P1和P2如对于通式(I)所定义。本公开中此类核苷酸前体的实施方案被称为pre-lB6，其中B具有与通式(I)中相同的定义；例如，本公开中此类核苷酸前体的实施方案被称为pre-lT6，其中B由胸苷基基团组成。
在一些实施方案中，其中Y为NR1，R1为辛基基团，Ra、Rb、Rc、Rd、X1和X2为氢原子，且P1和P2如对于通式(I)所定义。本公开中此类核苷酸前体的实施方案被称为pre-lB7，其中B具有与通式(I)中相同的定义；例如，本公开中此类核苷酸前体的实施方案被称为pre-lT7，其中B由胸苷基基团组成。
在一些实施方案中，其中Y为NR1，R1为线性C16-烷基基团，Ra、Rb、Rc、Rd、X1和X2为氢原子，且P1和P2如对于通式(I)所定义。本公开中此类核苷酸前体的实施方案被称为pre-lB8，其中B具有与通式(I)中相同的定义；例如，本公开中此类核苷酸前体的实施方案被称为pre-lT8，其中B由胸苷基基团组成。
在式(I)的化合物的进一步的实施方案中，其中Y为NR1，R1为(C1-C20)烷基基团，其如通式(I)中所定义被取代，其包括如通式(I)中所定义被取代的C1、C2或C3烷基基团。
在这些进一步的实施方案的一些中，R1为(C1-C20)烷基基团，其被一个或多个选自以下的基团取代：卤素原子、(C1-C6)烷基基团、(C3-C8)环烷基基团、(C3-C14)杂环、(C6-C14)芳基基团和(C5-C14)杂芳基基团，且P1、P2、Ra、Rb、Rc、Rd、X1、X2和B具有如对于通式(I)所定义的相同的含义。
在这些进一步的实施方案的一些中，R1为(C1-C20)烷基基团，其被(C6-C14)芳基基团取代，且P1、P2、Ra、Rb、Rc、Rd、X1、X2和B具有如对于通式(I)所定义的相同的含义。
在式(I)的化合物的一些实施方案中，其中Y为NR1，R1为(C1-C20)烷基基团，其被(C6-C14)芳基基团取代。这些实施方案涵盖式(I)的化合物，其中Y为NR1，R1为被芳基基团取代的亚甲基基团。这些实施方案还涵盖式(I)的化合物，其中Y为NR1，R1为(C1-C20)烷基基团，其被苯基基团取代。
在式(I)的化合物的一些实施方案中，其中Y为NR1，R1为甲基基团，其被未取代的苯基基团取代，Ra、Rb、Rc、Rd、X1和X2各自为氢原子，且P1和P2如通式(I)中所定义。本公开中此类核苷酸前体的实施方案被称为pre-lB5，其中B具有与通式(I)中相同的定义；例如，本公开中此类核苷酸前体的实施方案被称为pre-lT5，其中B由胸苷基基团组成。
在式(I)的化合物的进一步的实施方案中，其中Y为NR1，R1为(C3-C8)环烷基基团，其任选地被一个或多个选自以下的基团取代：卤素原子和(C1-C6)烷基基团，且P1、P2、Ra、Rb、Rc、Rd、X1、X2和B具有如对于通式(I)所定义的相同的含义。
在式(I)的化合物的这些进一步的实施方案的一些中，其中Y为NR1，R1为环己基。
在式(I)的化合物的这些进一步的实施方案的一些中，其中Y为NR1，R1为未取代的环己基，Ra、Rb、Rc、Rd、X1、X2各自为氢原子，且P1和P2如对于通式(I)所定义。
本公开中此类核苷酸前体的实施方案被称为pre-lB4，其中B具有与通式(I)中相同的定义；例如，本公开中此类核苷酸前体的实施方案被称为pre-lT4，其中B由胸苷基基团组成。
在式(I)的吗啉代类似物的一些其它实施方案中，Y为N-C(＝O)-R1，其中R1为(C1-C20)烷基基团，其中任选地被一个或多个选自以下的基团取代：卤素原子、(C1-C6)烷基基团、(C3-C8)环烷基基团、(C3-C14)杂环、(C6-C14)芳基基团、(C5-C14)杂芳基基团-O-Z1、-N(Z1)(Z2)、-S-Z1、-CN、-C(＝J)-O-Z1、-O-C(＝J)-Z1、-C(＝J)-N(Z1)(Z2)、-N(Z1)-C(＝J)-Z2，其中
J为O或S，
Z1和Z2各自独立地为H、(C1-C6)烷基基团，其任选地被一个或多个选自以下的基团取代：卤素原子和(C1-C6)烷基基团，和
R1为(C3-C8)环烷基基团，其任选地被一个或多个选自以下的基团取代：卤素原子或(C1-C6)烷基基团，和
P1、P2、Ra、Rb、Rc、Rd、X1、X2和B具有如对于通式(I)所定义的相同的含义。
在实施方案的一些中，其中Y为N-C(＝O)-R1，R1为任选取代的(C1-C20)烷基基团，其包括任选取代的(C1-C15)烷基基团，且P1、P2、Ra、Rb、Rc、Rd、X1、X2和B具有如对于通式(I)所定义的相同的含义。
根据这些实施方案中的一些，其中Y为N-C(＝O)-R1，R1选自甲基和十五烷基基团，且P1、P2、Ra、Rb、Rc、Rd、X1、X2和B具有如对于通式(I)所定义的相同的含义。
这些实施方案涵盖式(I)的化合物，其中Y为N-C(＝O)-R1，R1为甲基基团，Ra、Rb、Rc、Rd、X1、X2各自表示氢原子，且B、P1和P2如通式(I)中所定义。
本公开中此类核苷酸前体的实施方案被称为pre-lB9，其中B具有与通式(I)中相同的定义；例如，本公开中此类核苷酸类似物的实施方案被称为pre-lT9，其中B由胸苷基基团组成。这些实施方案还涵盖式(I)的化合物，其中Y为N-C(＝O)-R1，R1为十五烷基基团，Ra、Rb、Rc、Rd、X1、X2各自表示氢原子，且B、P1和P2如通式(I)中所定义。本公开中此类核苷酸前体的实施方案被称为pre-lB10，其中B具有与通式(I)中相同的定义；例如，本公开中此类核苷酸前体的实施方案被称为pre-lT10，其中B由胸苷基基团组成。
在式(I)的化合物中，B为杂环核碱基部分。如本文所用，术语“杂环核碱基”是指任选取代的含氮杂环，其与二噁烷环或吗啉代环共价连接。在一些实施方案中，杂环核碱基可选自任选取代的嘌呤-碱基和任选取代的嘧啶-碱基。术语“嘌呤-碱基”在此如本领域技术人员所理解的普通含义使用，并包括其互变异构体。类似地，术语“嘧啶-碱基”在此如本领域技术人员所理解的普通含义使用，并包括其互变异构体。任选取代的嘌呤-碱基的非限制性列表包括嘌呤、腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤、别黄嘌呤、7-烷基鸟嘌呤(例如7-甲基鸟嘌呤)、可可碱、咖啡因、尿酸和异鸟嘌呤。嘧啶-碱基的实例包括但不限于胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、5,6-二氢尿嘧啶和5-烷基胞嘧啶(例如，5-甲基胞嘧啶)。其它杂环碱基的非限制性实例包括二氨基嘌呤、8-氧代-N6烷基腺嘌呤(例如，8-氧代-N6甲基腺嘌呤)、7-脱氮黄嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、N4,N4-桥亚乙基胞嘧啶、N<6>,N<6>-桥亚乙基-2,6-二氨基嘌呤、5-卤代尿嘧啶(例如，5-氟尿嘧啶和5-溴尿嘧啶)、假异胞嘧啶、异胞嘧啶、异鸟嘌呤、1,2,4-三唑-3-甲酰胺以及描述于美国专利号US 5,432,272和US 7,125,855中的其它杂环碱基，为了公开额外的杂环碱基的有限目的，通过引用将所述美国专利并入本文。在一些实施方案中，杂环碱基可任选地被胺或烯醇保护基团取代。在一些实施方案中，B选自嘧啶、取代的嘧啶、嘌呤和取代的嘌呤，其氨基基团(当存在时)任选地被保护基团保护。
在优选的实施方案中，B选自腺嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、鸟嘌呤和胞嘧啶(即腺嘌呤基、胸腺嘧啶基、尿嘧啶基、鸟嘌呤基和胞嘧啶基)。腺嘌呤、鸟嘌呤和胞嘧啶任选地被胺保护基团保护。胺保护基团涵盖酰基基团，例如苯甲酰基、苯基乙酰基和异丁酰基保护基团，或甲脒保护基团，例如N,N-二甲基-甲脒。
如已提及的，在式(I)的化合物中，基团P1和P2各自独立地为氢原子、反应性磷基团或保护基团。
如本文所用，“反应性磷基团”是指包含在核苷酸单元中或核苷酸类似物单元中的含磷基团，其可以通过亲核攻击反应，与包含在另一个分子中、尤其是另一个核苷酸单元中或另一个核苷酸类似物中的羟基或胺基反应。通常，这样的反应产生将所述第一核苷酸单元或所述第一核苷酸类似物单元与所述第二核苷酸单元或所述第二核苷酸类似物单元连接的酯型核苷间键。
在一些实施方案中，反应性磷基团可选自亚磷酰胺，H-膦酸酯，烷基-膦酸酯，磷酸酯或磷酸酯模拟物，包括但不限于：天然磷酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硼烷磷酸酯、硼烷硫代磷酸酯、膦酸酯、卤素取代的膦酸酯和磷酸酯、氨基磷酸酯、磷酸二酯、磷酸三酯、硫代磷酸二酯、硫代磷酸三酯、二磷酸酯和三磷酸酯。保护基团涵盖羟基、胺和亚磷酰胺保护基团，其可选自乙酰基(Ac)、苯甲酰基(Bzl)、苄基(Bn)、异丁酰基(iBu)、苯基乙酰基、苄基氧基甲基乙缩醛(BOM)、β-甲氧基乙氧基甲基醚(MEM)、甲氧基甲基醚(MOM)、对-甲氧基苄基醚(PMB)、甲基硫代甲基醚、新戊酰基(Piv)、四氢吡喃基(THP)、三苯基甲基(Trt)、甲氧基三苯甲基[(4-甲氧基苯基)二苯基甲基](MMT)、二甲氧基三苯甲基、[双-(4-甲氧基苯基)苯基甲基(DMT)、三甲基甲硅烷基醚(TMS)、叔丁基二甲基甲硅烷基醚(TBDMS)、三-异-丙基甲硅烷基氧基甲基醚(TOM)、三-异丙基甲硅烷基醚(TIPS)、甲基醚、乙氧基乙醚(EE)N,N-二甲基甲脒和2-氰基乙基(CE)。
在式(I)的化合物的一些实施方案中，其中Y、B、Ra、Rb、Rc、Rd、X1和X2如对于通式(I)所定义，P1或P2之一为O-4,4’-二甲氧基三苯甲基基团(DMT)且P1和P2中的另一者为H、反应性磷基团或保护基团。
在式(I)的化合物的一些实施方案中，其中Y、B、Ra、Rb、Rc、Rd、X1和X2如对于通式(I)所定义，P1和P2之一为2-氰基乙基-N,N-二异丙基亚磷酰胺基团，且P1和P2中的另一者为保护基团。
在式(I)的化合物的一些实施方案中，其中Y、B、Ra、Rb、Rc、Rd、X1和X2如对于通式(I)所定义，P1和P2之一为2-氰基乙基-N,N-二异丙基亚磷酰胺基团且P1和P2中的另一者为O-4,4’-二甲氧基三苯甲基基团。
进一步地，Ra、Rb、Rc和Rd各自独立地为H或(C1-C6)烷基基团，且优选地为H或未取代的(C1-C6)烷基基团。
如本文所用，(C1-C6)烷基基团涵盖选自C1、C2、C3、C4、C5和C6烷基基团的烷基基团。
在最优选的实施方案中，X1和X2均表示氢原子。
在最优选的实施方案中，Ra、Rb、Rc和Rd均表示氢原子。
包含靶向的核苷酸类似物的式(I)的化合物的实施方案
如本文先前所指定，本公开涵盖式(I)的化合物，其中：
-B为杂环核碱基；
-P1和P2各自独立地为H、反应性磷基团或保护基团；
-Y为NR1且R1为基团-[C(＝O)]m-R2-(O-CH2-CH2)p-R3，其中
m为整数，取值0或1，
p为整数，其范围为0至10，
R2为(C1-C20)亚烷基基团，其任选地被(C1-C6)烷基基团、-O-Z3、-N(Z3)(Z4)、-S-Z3、-CN、-C(＝K)-O-Z3、-O-C(＝K)-Z3、-C(＝K)-N(Z3)(Z4)、-N(Z3)-C(＝K)-Z4取代，其中
K为O或S，
Z3和Z4各自独立地为H、(C1-C6)烷基基团，其任选地被一个或多个选自以下的基团取代：卤素原子和(C1-C6)烷基基团，
和
R3为细胞靶向部分，
-X1和X2各自独立地为氢原子、(C1-C6)烷基基团，和
-Ra、Rb、Rc和Rd各自独立地为H或(C1-C6)烷基基团。
这些式(I)的化合物涵盖于在本公开中可称为“靶向的核苷酸前体”的更一般的化合物家族中。此类式(I)的化合物，其中基团R3存在并表示细胞靶向部分，在本公开中可称为“式(I)的靶向的核苷酸前体”或“靶向的核苷酸前体(I)”。
不包含表示细胞靶向部分的基团R3的式(I)的化合物不是靶向的核苷酸前体，并在本公开中称为“式(I)的非靶向的核苷酸前体”或“非靶向的核苷酸前体(I)”。
在式(I)的靶向的核苷酸前体的一些实施方案中，R1为基团-[C(＝O)]m-R2-(O-CH2-CH2)p-R3，m为0，p为0，R3为细胞靶向部分，B、P1、P2、Ra、Rb、Rc、Rd、X1、X2和R2如式(I)的化合物的通用定义中。在一些实施方案中，R2为亚乙基基团，且X1和X2均为氢原子。在这些实施方案的一些其它实施方案中，R2为亚戊基基团，且X1和X2均为氢原子。在一些实施方案中，R2为(C12)亚烷基，且X1和X2均为氢原子。
在式(I)的化合物的一些实施方案中，R1为基团-[C(＝O)]m-R2-(O-CH2-CH2)p-R3，m为0，p为选自1、2、3和4的整数，R3为细胞靶向部分，且B、P1、P2、Ra、Rb、Rc、Rd、X1、X2和R2如式(I)的化合物的通用定义中。在一些实施方案中，R2为亚乙基基团，p为1，且X1和X2均为氢原子。在一些实施方案中，R2为亚乙基基团，p为2，且X1和X2均为氢原子。在一些实施方案中，R2为亚乙基基团，p为3，且X1和X2均为氢原子。在一些实施方案中，R2为亚乙基基团，p为4，且X1和X2均为氢原子。
在式(I)的化合物的一些实施方案中，R1为基团-[C(＝O)]m-R2-(O-CH2-CH2)p-R3，m为1，p为0，R3为细胞靶向部分，且R2、B、P1、P2、Ra、Rb、Rc、Rd、X1、X2如式(I)的化合物的通用定义中。在这些实施方案的一些中，R2为亚丁基，X1和X2各自表示氢原子，且B、P1、P2、Ra、Rb、Rc和Rd如对于通式(I)所定义。在这些实施方案的一些进一步实施方案中，R2为(C11)亚烷基，X1和X2均表示氢原子，且B、P1、P2、Ra、Rb、Rc和Rd如对于通式(I)所定义)。在这些实施方案的一些更进一步实施方案中，R2为亚甲基，X1和X2均表示氢原子，且B、P1、P2、Ra、Rb、Rc和Rd如对于通式(I)所定义。
在式(I)的化合物的一些实施方案中，其中R1为基团-[C(＝O)]m-R2-(O-CH2-CH2)p-R3，m为1，p选自整数1和2，R3为细胞靶向部分，R2、B、P1、P2、Ra、Rb、Rc、Rd、X1、X2如式(I)的化合物的通用定义中。在这些实施方案的一些中，R2为亚甲基基团，p为2，R3为细胞靶向部分，B、P1、P2、Ra、Rb、Rc、Rd、X1、X2如对于通式(I)所定义。在这些实施方案的一些其它实施方案中，R2为亚甲基基团，p为1，R3为细胞靶向部分，B、P1、P2、Ra、Rb、Rc、Rd、X1、X2如对于通式(I)所定义。
在式(I)的化合物的一些实施方案中，Ra、Rb、Rc和Rd为氢原子。
通常，基团R3涵盖本领域已知的任何细胞靶向部分，包括本公开中指定的任何细胞靶向部分，其包括本公开中针对靶向的寡核苷酸的描述而指定的细胞靶向部分。
在式(I)的化合物的一些实施方案中，R3具有式(III)
Figure BDA0002760977440000351
其中
A1、A2和A3为OH或O-C(＝O)-R4，其中R4为(C1-C6)-烷基或(C6-C10)-芳基基团。
A4为OH、O-C(＝O)-R4，NHC(＝O)-R5，R4如上文所定义，且R5为任选地被卤素原子取代的(C1-C6)-烷基基团。
在一些优选的实施方案中，A1、A2和A3为O-C(＝O)-R4，其中R4为(C1-C6)-烷基或(C6-C10)-芳基基团。
在一些优选的实施方案中，A1、A2和A3为O-C(＝O)-R4，R4为甲基或苯基基团。
在一些优选的实施方案中，A1、A2和A3为O-C(＝O)-R4，且R4为甲基。
在一些优选的实施方案中，A4为O-C(＝O)-R4或NHC(＝O)-R5，其中R4为(C1-C6)烷基或(C6-C10)-芳基基团，且R5为任选地被卤素原子取代的(C1-C6)-烷基基团。
在一些优选的实施方案中，A1、A2和A3为O-C(＝O)-R4，其中R4为甲基，且A4为O-C(＝O)-R4或NHC(＝O)-R5，其中R4和R5各自为甲基。
在一些优选的实施方案中，R3为式(III-A)的3,4,6-三-O-乙酰基-D-N-乙酰基半乳糖胺：
Figure BDA0002760977440000352
本公开还涉及包含一个或多个核苷酸类似物的寡核苷酸，所述核苷酸类似物通过使用为本文指定的式(I)化合物的核苷酸类似物前体引入到寡核苷酸中。
如将在本公开的其它地方详细描述的，本发明进一步涉及包含一个或多个式(II)的化合物的单链和双链寡核苷酸，以及尤其siRNA。
修饰的寡核苷酸
本文公开的式(I)的化合物是核苷酸类似物构造单元，也称为“核苷酸前体”，其已被设想为寡聚化合物的单体单元，特别是作为寡核苷酸的单体单元，包括作为双链RNA(“dsRNA”)寡聚体的单体单元，且尤其是作为siRNA的单体单元。将本文在式(I)的化合物下描述的核苷酸前体掺入寡核苷酸中，产生寡核苷酸的相应单体单元，其在本文中被称为式(II)的化合物。
术语“寡聚化合物”和“寡核苷酸”在本文中可互换使用。
因此，本发明还涉及其中掺入了非靶向、靶向或非靶向和靶向的一个或多个式(I)的化合物的寡核苷酸，从而得到式(II)的化合物。
如将在本公开中进一步详细描述的，根据本发明的寡核苷酸可为单链形式或双链形式。
本发明涉及寡核苷酸，其包含一个或多个式(II)的化合物：
Figure BDA0002760977440000361
其中，对于每一式(II)的化合物，独立地：
-B为杂环核碱基；
-L1和L2之一为连接所述式(II)的化合物至所述寡聚化合物的核苷间连接基团，且L1和L2中的另一者为H、保护基团、磷部分或连接所述式(II)的化合物至所述寡聚化合物的核苷间连接基团
-Y为O、NH、NR1或N-C(＝O)-R1，其中R1为：
·(C1-C20)烷基基团，其任选地被一个或多个选自以下的基团取代：卤素原子、(C1-C6)烷基基团、(C3-C8)环烷基基团、(C3-C14)杂环、(C6-C14)芳基基团、(C5-C14)杂芳基基团、-O-Z1、-N(Z1)(Z2)、-S-Z1、-CN、-C(＝J)-O-Z1、-O-C(＝J)-Z1、-C(＝J)-N(Z1)(Z2)、-N(Z1)-C(＝J)-Z2，其中
J为O或S，
Z1和Z2各自独立地为H、(C1-C6)烷基基团，其任选地被一个或多个选自以下的基团取代：卤素原子和(C1-C6)烷基基团，
·(C3-C8)环烷基基团，其任选地被一个或多个选自以下的基团取代：卤素原子和(C1-C6)烷基基团，
·基团-[C(＝O)]m-R2-(O-CH2-CH2)p-R3，其中
m为整数，取值0或1，
p为整数，其范围为0至10，
R2为(C1-C20)亚烷基基团，其任选地被(C1-C6)烷基基团、-O-Z3、-N(Z3)(Z4)、-S-Z3、-CN、-C(＝K)-O-Z3、-O-C(＝K)-Z3、-C(＝K)-N(Z3)(Z4)和-N(Z3)-C(＝K)-Z4取代，其中
K为O或S，
Z3和Z4各自独立地为H、(C1-C6)烷基基团，其任选地被一个或多个选自以下的基团取代：卤素原子和(C1-C6)烷基基团，
和
R3选自氢原子、(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷氧基基团、(C3-C8)环烷基基团、(C3-C14)杂环、(C6-C14)芳基基团或(C5-C14)杂芳基基团，或
R3为细胞靶向部分，
-X1和X2各自独立地为氢原子、(C1-C6)烷基基团，和
-Ra、Rb、Rc和Rd各自独立地为H或(C1-C6)烷基基团，
或其药学上可接受的盐。
在如本文所述的寡核苷酸的一些优选的实施方案中，在式(II)的化合物中，Y为O。
在如本文所述的寡核苷酸的一些其它优选的实施方案中，在式(II)的化合物中，Y为NR1或N-C(＝O)-R1，且R1如对于通式(I)所定义。
在一些实施方案中，其中Y为NR1，R1为(C1-C20)烷基基团，其任选地被一个或多个选自以下的基团取代：卤素原子、(C1-C6)烷基基团、(C3-C8)环烷基基团、(C3-C14)杂环、(C6-C14)芳基基团、(C5-C14)杂芳基基团、-O-Z1、-N(Z1)(Z2)、-S-Z1、-CN、-C(＝J)-O-Z1、-O-C(＝J)-Z1、-C(＝J)-N(Z1)(Z2)、-N(Z1)-C(＝J)-Z2，其中
J为O或S，
Z1和Z2各自独立地为H、(C1-C6)烷基基团，其任选地被一个或多个选自以下的基团取代：卤素原子和(C1-C6)烷基基团，呈碱的形式或与酸的加成盐的形式。
在这些实施方案的一些中，其中Y为NR1，R1为未取代的(C1-C20)烷基基团，且L1、L2、Ra、Rb、Rc、Rd、X1、X2、R2、R3和B具有如对于所述通式(II)所定义的相同的含义，或其药学上可接受的盐。
在实施方案的一些中，其中Y为NR1，R1为未取代的(C1-C16)烷基基团，其包括选自甲基、异丙基、丁基、辛基、十六烷基的烷基基团，且L1、L2、Ra、Rb、Rc、Rd、X1、X2和B具有如对于通式(II)所定义的相同的含义。
在一些实施方案中，其中Y为NR1，R1为甲基基团，Ra、Rb、Rc、Rd、X1和X2为氢原子，且L1和L2如对于通式(II)所定义。
在一些实施方案中，其中Y为NR1，R1为异丙基基团，Ra、Rb、Rc、Rd、X1和X2为氢原子，且L1和L2如对于通式(II)所定义。
在一些实施方案中，其中Y为NR1，R1为被苯基基团取代的甲基基团，且L1、L2、Ra、Rb、Rc、Rd、X1、X2、R2、R3和B具有如对于所述通式(II)所定义的相同的含义，或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，其中Y为NR1，R1为丁基基团，Ra、Rb、Rc、Rd、X1和X2为氢原子，且L1和L2如对于通式(II)所定义。
在一些实施方案中，其中Y为NR1，R1为辛基基团，Ra、Rb、Rc、Rd、X1和X2为氢原子，且L1和L2如对于通式(II)所定义。
在一些实施方案中，其中Y为NR1，R1为线性C16烷基基团，Ra、Rb、Rc、Rd、X1和X2为氢原子，且L1和L2如对于通式(II)所定义。
在式(II)的化合物的进一步的实施方案中，其中Y为NR1，R1为(C1-C20)烷基基团，其如通式(II)中所定义被取代，其包括如通式(II)中所定义被取代的C1、C2或C3烷基基团。
在这些进一步的实施方案的一些中，R1为(C1-C20)烷基基团，其被一个或多个选自以下的基团取代：卤素原子、(C1-C6)烷基基团、(C3-C8)环烷基基团、(C3-C14)杂环、(C6-C14)芳基基团和(C5-C14)杂芳基基团。
在这些进一步的实施方案的一些中，R1为(C1-C20)烷基基团，其被(C6-C14)芳基基团取代，且L1、L2、Ra、Rb、Rc、Rd、X1、X2和B具有如对于所述通式(II)所定义的相同的含义。
在式(II)的化合物的一些实施方案中，其中Y为NR1，R1为(C1-C20)烷基基团，其被(C6-C14)芳基基团取代。这些实施方案涵盖式(II)的化合物，其中Y为NR1，R1为被芳基基团取代的亚甲基基团。这些实施方案还涵盖式(II)的化合物，其中Y为NR1，R1为(C1-C20)烷基基团，其被苯基基团取代。
在式(II)的化合物的一些实施方案中，其中Y为NR1，R1为甲基基团，其被未取代的苯基基团取代，Ra、Rb、Rc、Rd各自为氢原子，且L1和L2如通式(II)中所定义。
在式(II)的化合物的进一步的实施方案中，其中Y为NR1，R1为(C3-C8)环烷基基团，其任选地被一个或多个选自以下的基团取代：卤素原子和(C1-C6)烷基基团，且L1、L2、Ra、Rb、Rc、Rd、X1、X2和B具有如对于所述通式(II)所定义的相同的含义。
在式(II)的化合物的这些进一步的实施方案的一些中，其中Y为NR1，R1为环己基基团，且L1、L2、Ra、Rb、Rc、Rd、X1、X2、R2、R3和B具有如对于所述通式(II)所定义的相同的含义，或其药学上可接受的盐。
在式(II)的化合物的这些进一步的实施方案的一些中，其中Y为NR1，R1为未取代的环己基，Ra、Rb、Rc、Rd、X1、X2各自为氢原子，且L1和L2如对通式(II)所定义。
在式(II)的寡核苷酸的一些其它实施方案中，Y为N-C(＝O)-R1，其中R1为(C1-C20)烷基基团，R1选自甲基和十五烷基，且L1、L2、Ra、Rb、Rc、Rd、X1、X2、R2、R3和B具有如对于所述通式(II)所定义的相同的含义，或其药学上可接受的盐。
在式(II)的寡核苷酸的一些其它实施方案中，Y为N-C(＝O)-R1，其中R1为(C1-C20)烷基基团，其任选地被一个或多个选自以下的基团取代：卤素原子、(C1-C6)烷基基团、(C3-C8)环烷基基团、(C3-C14)杂环、(C6-C14)芳基基团、(C5-C14)杂芳基基团、-O-Z1、-N(Z1)(Z2)、-S-Z1、-CN、-C(＝J)-O-Z1、-O-C(＝J)-Z1、-C(＝J)-N(Z1)(Z2)和-N(Z1)-C(＝J)-Z2，其中
J为O或S，和
Z1和Z2各自独立地为H、(C1-C6)烷基基团，其任选地被一个或多个选自以下的基团取代：卤素原子和(C1-C6)烷基基团，和
L1、L2、Ra、Rb、Rc、Rd、X1、X2和B具有如对于通式(II)所定义的相同的含义。
在实施方案的一些中，其中Y为N-C(＝O)-R1，R1为任选取代的(C1-C20)烷基基团，其包括任选取代的(C1-C15)烷基基团，且L1、L2、Rb、Rc、Rd、X1、X2和B具有如对于通式(II)所定义的相同的含义。
在实施方案的一些中，其中Y为N-C(＝O)-R1，R1为未取代的(C1-C20)烷基基团，其包括未取代的(C1-C15)烷基基团，且L1、L2、Ra、Rb、Rc、Rd、X1、X2和B具有如对于通式(II)所定义的相同的含义。
根据这些实施方案中的一些，其中Y为N-C(＝O)-R1，R1选自甲基和十五烷基，且L1和L2和B具有如对于通式(II)所定义的相同的含义。这些实施方案涵盖式(II)的化合物，其中Y为N-C(＝O)-R1，R1为甲基基团，Ra、Rb、Rc、Rd、X1、X2各自表示氢原子，且B、L1和L2如通式(II)中所定义。这些实施方案还涵盖式(II)的化合物，其中Y为N-C(＝O)-R1，R1为十五烷基基团，Ra、Rb、Rc、Rd、X1、X2各自表示氢原子，且B、L1和L2如通式(II)中所定义。
式(II)的化合物可以游离碱或与酸形成的加成盐的形式存在。式(II)的化合物也可以其药学上可接受的盐形式存在，也属于本公开范围。
包含式(II)的靶向的核苷酸类似物的寡核苷酸的实施方案
如本文先前所指定，本公开还涵盖式(II)的化合物，其中：
-B为杂环核碱基；
-L1和L2之一为连接所述式(II)的化合物至所述寡聚化合物的核苷间连接基团，且L1和L2中的另一者为H、保护基团、磷部分或连接所述式(II)的化合物至所述寡聚化合物的核苷间连接基团；
-Y为NR1，且R1为基团-[C(＝O)]m-R2-(O-CH2-CH2)p-R3，其中
m为整数，取值0或1，
p为整数，其范围为0至10，
R2为(C1-C20)亚烷基基团，其任选地被(C1-C6)烷基基团、-O-Z3、-N(Z3)(Z4)、-S-Z3、-CN、-C(＝K)-O-Z3、-O-C(＝K)-Z3、-C(＝K)-N(Z3)(Z4)、-N(Z3)-C(＝K)-Z4取代，其中
K为O或S，
Z3和Z4各自独立地为H、(C1-C6)烷基基团，其任选地被一个或多个选自以下的基团取代：卤素原子和(C1-C6)烷基基团，
和
R3为细胞靶向部分，
-X1和X2各自独立地为氢原子、(C1-C6)烷基基团，和
-Ra、Rb、Rc和Rd各自独立地为H或(C1-C6)烷基基团，
其呈碱的形式或与酸的加成盐的形式。
这些式(II)的化合物涵盖于在本公开中可称为“靶向的核苷酸类似物”的更一般的化合物家族中。
在式(II)的靶向的核苷酸类似物的一些实施方案中，其中R1为基团-[C(＝O)]m-R2-(O-CH2-CH2)p-R3，m为0，p为0，R3为细胞靶向部分，B、P1、P2、Ra、Rb、Rc、Rd、X1、X2和R2如所述式(II)的化合物的通用定义中。
在一些实施方案中，R2为亚乙基基团，且X1和X2均为氢原子，B、P1、P2、Ra、Rb、Rc、Rd如所述式(II)的化合物的通用定义中。
在这些实施方案的一些其它实施方案中，R2为亚戊基基团，且X1和X2均为氢原子，B、P1、P2、Ra、Rb、Rc、Rd如所述式(II)的化合物的通用定义中。
在这些实施方案的一些其它实施方案中，R2为(C12)亚烷基基团，且X1和X2均为氢原子，B、P1、P2、Ra、Rb、Rc、Rd如所述式(II)的化合物的通用定义中。
在式(II)的化合物的一些实施方案中，其中R1为基团-[C(＝O)]m-R2-(O-CH2-CH2)p-R3，m为0，p选自整数1、2、3和4，R3为细胞靶向部分，且B、L1、L2、Ra、Rb、Rc、Rd、X1、X2和R2如所述式(II)的化合物的通用定义中。在这些实施方案的一些中，R2为亚乙基基团，p为1，且X1和X2均为氢原子。在这些实施方案的更进一步的实施方案中，R2为亚乙基基团，p为2，且X1和X2均为氢原子。在这些实施方案的更进一步的实施方案中，R2为亚乙基基团，p为3，且X1和X2均为氢原子。在这些实施方案的还其它实施方案中，R2为亚乙基基团，p为4，且X1和X2均为氢原子。
在式(II)的化合物的一些实施方案中，其中R1为基团-[C(＝O)]m-R2-(O-CH2-CH2)p-R3，m为1，p为0，R3为细胞靶向部分，且R2、B、L1、L2、Ra、Rb、Rc、Rd、X1、X2如所述式(II)的化合物的通用定义中。
在这些实施方案的一些中，R2为亚丁基，X1和X2均表示氢原子，且B、L1、L2、Ra、Rb、Rc和Rd如对于通式(II)所定义。
在这些实施方案的一些进一步实施方案中，R2为(C11)亚烷基，X1和X2均表示氢原子，且B、L1、L2、Ra、Rb、Rc和Rd如对于通式(II)所定义。
在这些实施方案的更进一步的一些实施方案中，R2为亚甲基，X1和X2均表示氢原子，且B、L1、L2、Ra、Rb、Rc和Rd如对于通式(II)所定义。
在式(II)的化合物的一些实施方案中，其中R1为基团-[C(＝O)]m-R2-(O-CH2-CH2)p-R3，m为1，p选自整数1和2，R3为细胞靶向部分，R2、B、L1、L2、Ra、Rb、Rc、Rd、X1、X2如所述式(II)的化合物的通用定义中。
在这些实施方案的一些中，R2为亚甲基基团，p为2，R3为细胞靶向部分，B、L1、L2、Ra、Rb、Rc、Rd、X1、X2如对于通式(II)所定义。
在这些实施方案的一些其它实施方案中，R2为亚甲基基团，p为1，R3为细胞靶向部分，B、L1、L2、Ra、Rb、Rc、Rd、X1、X2如对于通式(II)所定义。
通常，基团R3涵盖本领域已知的任何细胞靶向部分，包括本公开中指定的任何细胞靶向部分，其包括本公开中针对靶向的寡核苷酸的描述而指定的细胞靶向部分。
在式(II)的化合物的一些实施方案中，R3具有式(III)：
Figure BDA0002760977440000421
其中A1、A2和A3为OH，
A4为OH或NHC(＝O)-R5，其中R5为(C1-C6)烷基基团，其任选地被卤素原子取代。
在一些实施方案中，R3为式(III-B)的N-乙酰基-半乳糖胺：
Figure BDA0002760977440000431
根据本公开，提及"GalNAc"或"N-乙酰基半乳糖胺"均包括β-形式：2-(乙酰基氨基)-2-脱氧-β-D-吡喃半乳糖以及α-形式：2-(乙酰基氨基)-2-脱氧-α-D-吡喃半乳糖。在某些实施方案中，β-形式：2-(乙酰基氨基)-2-脱氧-β-D-吡喃半乳糖以及α-形式：2-(乙酰基氨基)-2-脱氧-α-D-吡喃半乳糖两者可互换使用。
在式(II)的寡核苷酸中，B为杂环核碱基部分。如本文所用，术语“杂环核碱基”是指任选取代的含氮杂环，其与二噁烷环或吗啉代环共价连接。在一些实施方案中，杂环核碱基可选自任选取代的嘌呤-碱基、任选取代的嘧啶-碱基。术语“嘌呤-碱基”在此如本领域技术人员所理解的普通含义使用，并包括其互变异构体。类似地，术语“嘧啶-碱基”在此如本领域技术人员所理解的普通含义使用，并包括其互变异构体。任选取代的嘌呤-碱基的非限制性列表包括嘌呤、腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤、别黄嘌呤、7-烷基鸟嘌呤(例如7-甲基鸟嘌呤)、可可碱、咖啡因、尿酸和异鸟嘌呤。嘧啶-碱基的实例包括但不限于胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、5,6-二氢尿嘧啶和5-烷基胞嘧啶(例如，5-甲基胞嘧啶)。其它杂环碱基的非限制性实例包括二氨基嘌呤、8-氧代-N6烷基腺嘌呤(例如，8-氧代-N6甲基腺嘌呤)、7-脱氮黄嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、N4,N4-桥亚乙基胞嘧啶、N<6>,N<6>-桥亚乙基--2,6-二氨基嘌呤、5-卤代尿嘧啶(例如，5-氟尿嘧啶和5-溴尿嘧啶)、假异胞嘧啶、异胞嘧啶、异鸟嘌呤、1,2,4-三唑-3-甲酰胺以及描述于美国专利号US 5,432,272和US 7,125,855中的其它杂环碱基，为了公开额外的杂环碱基，通过引用将所述美国专利并入本文。
在一些实施方案中，B选自嘧啶、取代的嘧啶、嘌呤和取代的嘌呤。
在优选的实施方案中，B选自腺嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、鸟嘌呤和胞嘧啶(即腺嘌呤基、胸腺嘧啶基、尿嘧啶基、鸟嘌呤基和胞嘧啶基)。
如已提及的，在式(II)的寡核苷酸中，L1和L2之中的一个基团为连接所述式(II)的化合物至所述寡聚化合物的核苷间连接基团，且L1和L2基团中的另一个基团为H、保护基团或连接所述式(II)的化合物至所述寡聚化合物的核苷间连接基团。
如在实施例中将显示的，式(I)的化合物，当被掺入与具有互补序列的第二寡核苷酸形成双链体的第一寡核苷酸中时，示出所得的含核苷酸类似物的寡核苷酸的Tm值显著降低。所得的双链体的Tm值随着式(II)化合物数量的增加而降低。说明性地，对于具有约74℃的Tm值的起始的21-mer寡核苷酸，对于在位于所得修饰的寡核苷酸内的各个位置上包含五个式(II)的化合物的所得修饰的寡核苷酸，Tm值可降低到低至约50℃。因此，当掺入包含二噁烷环的一个或多个式(I)的化合物或包含吗啉代环的一个或多个式(I)的化合物时，发生Tm值降低。然而，在大多数实施方案中，在所得siRNA的反义链与所需的靶序列杂交之前，这种降低的Tm值仍确保在RISC复合物中适合的双链体形成以及然后适合的双链体摄取。
本文的实施例表明，已掺入一个或多个式(I)的化合物的寡核苷酸允许产生具有确保有效抑制靶基因所需的稳定性的siRNA双链体结构。
极其出乎意料的是，这些实施例还表明，当式(II)的化合物通过常规的磷酸二酯键相互连接或与含有核糖的核苷酸连接时，获得包含一个或多个式(II)的化合物的siRNA双链体的高代谢稳定性。出乎意料地表明，当式(II)的化合物通过寡核苷酸内的常规磷酸二酯键连接，形成一条siRNA链时，与具有硫代磷酸酯连接的脱氧核糖核苷酸而非式(II)的化合物的相同siRNA相比，所得的siRNA双链体具有更高的抗核酸酶降解稳定性。对于其中在其有义链和反义链的突出端存在式(II)的化合物的siRNA的实施方案尤其显示出这种出乎意料的稳定性增加，包括其中在其有义链的3’-末端或5’-末端或两者，3’-末端和5’-末端突出端存在式(II)的化合物的siRNA。
当通过磷酸二酯键连接时，式(II)化合物的代谢稳定性的高增加是明显的技术优势，因为可以避免通过修饰的核苷酸间连接磷基团(诸如硫代磷酸酯)的稳定化。在此提醒，这种非常规的硫代磷酸酯会引入手性中心，从而导致生成的siRNA的不期望的非对映异构混合物。后者可能降低靶向序列的siRNA特异性，导致脱靶事件增加。本文还显示了具有一个或多个式(II)化合物的siRNA在体外具有良好的靶基因沉默活性，即使当siRNA在不存在任何转染剂的情况下被靶细胞内化时。如在实施例中公开的，式(II)的化合物的实施方案以在皮摩尔范围内的IC50值发挥靶基因沉默活性。
另外，本文描述的掺入具有附接至吗啉-氮(GalNAc残基)的靶向部分的一个或多个式(II)的化合物的双链寡核苷酸的实施例显示出向肝脏内的稳健递送，导致靶mRNA和相应蛋白水平的体内敲低。
出乎意料的是，当将式(II)的靶向的化合物和式(II)的非靶向的化合物结合在一个双链寡核苷酸内时，已展现出双链寡核苷酸(特别是体内作用时长)的体内行为的显著改善；这在其中有义链不包含任何硫代磷酸酯基团时也可显示。甚至在无硫代磷酸酯稳定化下在反义链中作为突出端的式(II)的非靶向的化合物的额外附接也显示了所得siRNA的稳健的体内功效。
在有义链、反义链或有义链和反义链两者中，特别是在有义链中已掺入一个或多个式(I)的化合物的SiRNA也发挥有效的体内靶基因沉默活性。靶基因沉默活性可以根据(i)其中存在的式(I)化合物的实施方案，(ii)其中存在的式(I)化合物的数量和(iii)式(I)的化合物在siRNA的有义链或反义链中的位置来控制。
重要的是，已掺入一个或多个式(II)的化合物的siRNA在显示那些siRNA发挥靶基因沉默作用的剂量范围内没有体内副作用。
出于说明的目的，并且不限制本公开，双链寡核苷酸在修饰的有义链和/或反义链上还可包含一个或多个核苷酸。
所述修饰可选自用核酸或碱基的类似物的取代或插入，以及碱基、糖或磷酸酯部分的化学修饰。所选择的修饰可以各自独立地选自3'-末端脱氧-胸腺嘧啶、2'-O-甲基、2'-脱氧修饰、2'-脱氧-氟、2'-氨基修饰、2'-烷基修饰、硫代磷酸酯修饰、氨基磷酸酯修饰、5'-硫代磷酸酯基修饰，5'-磷酸酯或5'-磷酸酯模拟修饰和胆甾醇基衍生物或十二烷酸双癸基酰胺基团修饰和/或修饰的核苷酸可为锁核苷酸、脱碱基核苷酸或包含非天然碱基的核苷酸中的任何一种。优选实施方案之一可为至少一种修饰为2'-O-甲基和/或至少一种修饰为2'-脱氧-氟。
如本文所用，修饰的寡核苷酸的其它实例可包括以下一种或多种：修饰，例如，一个或两个非连接磷酸酯氧和/或一个或多个连接磷酸酯氧的替代；磷酸酯部分的替代；天然碱基的修饰或替代；核糖-磷酸酯骨架的替代或修饰；RNA的3’-末端或5’-末端的修饰，例如，末端磷酸酯基团的去除、修饰或替代，或部分(例如，荧光标记的部分)与或RNA的3'-或5’-末端的缀合。
式(I)的化合物的合成方法
式(I)的化合物可以根据本文公开内容中所示的详细方法来制备。
本公开涉及制备式(I-A)的化合物的方法，其包括以下步骤：
a)氧化式(X)的化合物
Figure BDA0002760977440000461
其中B为杂环核碱基，且P1和P2各自独立地表示如本文通式(I)中所定义的保护基团
通过式(X)的化合物与诸如高碘酸钠(NalO4)的氧化剂进行反应，从而得到以下式(XI)的化合物：
Figure BDA0002760977440000462
和
b)使式(XI)的化合物在式(XII)的化合物存在下进行还原胺化的步骤R1-NH2(XII)
其中R1如在本文的通式(I)中所定义，
以得到式(I-A)的化合物：
Figure BDA0002760977440000463
其中B为杂环核碱基，且P1和P2各自独立地表示如通式(I)中所定义的保护基团。
本公开还涉及制备式(I-B)的化合物的方法，其包括以下步骤：
a)氧化式(X)的化合物
Figure BDA0002760977440000464
其中B为杂环核碱基，且P1和P2各自独立地表示如本文通式(I)中所定义的保护基团
通过式(X)的化合物与诸如高碘酸钠(NalO4)的氧化剂进行反应，从而得到以下式(XI)的化合物：
Figure BDA0002760977440000471
和
b)在胺的存在下，例如氨或二硼酸铵，使式(XI)的化合物进行还原胺化的步骤，以得到式(XIII)的化合物
Figure BDA0002760977440000472
c)将式(XIII)的化合物在式(XIV)的化合物的存在下进行酰胺偶联
R1-C(＝O)-OH(XIV)
其中R1如在本文的通式(I)中所定义，
以获得式(I-B)的化合物
Figure BDA0002760977440000473
其中B为杂环核碱基，且P1和P2各自独立地表示如通式(I)中所定义的保护基团，且R1如通式(I)中所定义。
d)将式(XIII)的化合物在醛或酮的存在下进行还原胺化，以得到式(I-A)的化合物
Figure BDA0002760977440000474
本公开还涉及制备式(I-C)的化合物的方法
Figure BDA0002760977440000481
其包括以下步骤：通过还原胺化使式(XV)的化合物
Figure BDA0002760977440000482
其中A1、A2、A3和A4如本文的式(III)或(III-A)中所定义，-Y-CHO通过所述还原胺化反应转移至-Y-CH2-，其等同于X，且X为式-(CH2-CH2-O)p-R2-的基团，其中p和R2如通式(I)中所定义，
与式(XIII)的化合物反应
Figure BDA0002760977440000483
其中P1、P2和B如本文的通式(I)中所定义，
，以得到式(I-C)的化合物
Figure BDA0002760977440000484
以上方法在本公开的方案2中进行说明。
本公开还涉及用于获得式(I-D)的化合物的方法
Figure BDA0002760977440000491
其包括以下步骤：
a)在肽偶联条件下，使式(XVI)的化合物
Figure BDA0002760977440000492
其中A1、A2、A3和A4如本文的式(III)或(III-A)中所定义，且X为式-(CH2-CH2-O)p-R2-的基团，其中p和R2如通式(I)中所定义，
与式(XIII)的化合物反应
Figure BDA0002760977440000493
其中P1、P2和B如本文的通式(I)中所定义，
以得到式(I-D)的化合物
以上方法在本公开的方案2中进行说明。
本公开进一步涉及制备式(I-E)的化合物的方法，其包括以下步骤：
a)还原式(XI)的化合物
Figure BDA0002760977440000501
其中P1、P2和B如通式(I)中所定义，从而获得式(XVII)的化合物
Figure BDA0002760977440000502
b)在磺酰化剂(例如对-甲苯-磺酰氯Ts-Cl、甲磺酰氯Ms-Cl)的存在下转移式(XVII)的化合物，从而获得式(XVIII)的化合物
Figure BDA0002760977440000503
其中Ts表示甲苯磺酰基基团，
c)使所述式(XVIII)的化合物经受碱性条件，从而获得式(I-E)的化合物
Figure BDA0002760977440000504
以上方法在本公开的方案3中进行说明。
本公开还涉及用于制备式(I-E)的化合物的替代方法，其包括以下步骤：
a)转移式(XVII)的化合物
Figure BDA0002760977440000505
在过量的磺酰化剂(例如对-甲苯-磺酰氯Ts-Cl、甲磺酰氯Ms-Cl)的存在下，从而获得式(XIX)的化合物
Figure BDA0002760977440000506
其中Ts表示甲苯磺酰基基团,
b)通过去除基团P1将式(XIX)的化合物去保护，以得到式(XX)的化合物
Figure BDA0002760977440000511
c)使所述式(XX)的化合物经受碱性条件，从而获得式(XXI)的化合物
Figure BDA0002760977440000512
和
d)用保护基团P1替代甲苯磺酰基基团，从而获得式(I-E)的化合物
Figure BDA0002760977440000513
以上方法在本公开的方案3中进行说明。
可以根据本文公开的以下方案1至8中所示的详细方法制备式(I)、(I-A)、(I-B)、(I-C)、(I-D)和(I-E)的化合物。
从可商购的核糖衍生物G1开始，可按照标准文献的方案，通过选择性的苄基化作用来区分两个伯OH-基团。对所得的苄基醚G2进行标准的保护基团修饰，得到完全受保护的核糖类似物G3，该核糖类似物G3可在核碱基B(例如T、U、CBzl、I、GiBu、ABzl)的存在下用作糖基供体，得到核苷衍生物G4(Tetrahedron，1998，54，3607-3630)。
Figure BDA0002760977440000521
方案1：合成式(I)的化合物，其中Y为N
起始于核苷类似物G4，通过标准程序对保护基团样式进行修饰，得到中间体G5，其中如通式(I)中所定义，正交保护基团P1和P2在核糖支架的C2’和C3’处的两个伯醇以及未保护的OH-基团上。G5-化合物中二羟基官能团的顺式取向允许使用NaIO4作为氧化剂对C2’和C3’之间的C-C键进行氧化裂解。可将所得的二醛分离为一水合物G6，通过与还原剂(如NaCNBH3)的还原胺化反应将其转化为所需的吗啉支架。使用胺底物，例如氨或二硼酸铵，在吗啉支架中产生带有游离NH-基团的吗啉中间体G7。在例如NaCNBH3的存在下，与相应的醛或酮进行第二次还原胺化反应，得到烷基化的吗啉G8，其中R1如通式(I)中所定义。另外，中间体G6可在适当的胺R1-NH2存在下进行还原胺化反应，其中R1如在通式(I)中定义，直接获得烷基化的吗啉G8。通过游离吗啉构造单元G7与相应的羧酸R1-COOH之间的标准肽偶联反应获得类似物酰化吗啉，从而得到酰胺中间体G9。
化合物G7、G8和G9由本公开所述的式(I)的化合物的实施方案组成。
与方案1中描述的用于形成通式(I)的化合物的合成类似，可以通过使用中间体G7作为胺还原剂进行还原胺化或肽偶联反应来制备本文所述的靶向的通式(I)的化合物。
使用全乙酰化的N-乙酰基半乳糖胺G11作为受保护的细胞靶向部分，以下方案2中描述了通式(I)的化合物的合成。
Figure BDA0002760977440000531
方案2：合成具有酰胺(G14)和胺(G15)附接、受保护的GalNAc作为细胞靶向部分和不同的X接头基团的通式(I)的化合物，其中X是由(G13)中的接头片段-Y-CHO生成的，并在还原胺化后转化为-Y-CH2-。
以下将X定义为基团-R2(OCH2-CH2)p-，其包含于基团-[C(＝O)]m-R2-(O-CH2-CH2)p-R3中，如通式(I)的化合物中所定义。
在标准糖基化条件下，用ω-羟基羧酸酯(HO-X-COOBn)处理全乙酰化的GalNAc衍生物G11，在酯裂解后，生成羧酸G12，其在肽偶联条件下、在吗啉衍生物G7存在下形成所需的酰胺G14。或者，在苄基醚裂解并氧化相应的醇之后，用ω-羟基苄基醚(HO-X-OBn)对G11进行糖基化，从而生成醛中间体G13。以吗啉G7作为胺成分进行还原胺化形成烷基化的吗啉G15。化合物G14和G15是本公开中所述的式(I)的化合物。
方案3中示出了在二噁烷系列中通式(I)的化合物(Y为O)的合成路线
Figure BDA0002760977440000541
方案3：通式(I)的化合物(其中Y为O)的合成路线
起始于已描述的顺式-二醇中间体G5及其氧化裂解为构造单元G6(参见方案1)，用还原剂例如硼氢化钠处理，得到二醇中间体G16，其在2’-和3’-C处带有两个伯OH-基团。在碱性条件下，在化学计量的磺酰化剂例如对甲苯磺酰氯的存在下，2’-OH-官能团可选择性地被甲苯磺酸化，形成单-甲苯磺酸酯G17。在碱性条件下，使用例如在MeOH中的NaOH或NaOMe水溶液中，G17在3’-C处被游离的OH-基团进行伯甲苯磺酸酯的亲核取代，从而形成了所需的二噁烷支架G18。
化合物G18由如本公开中所述的通式(I)的化合物组成。
或者，二醇中间体G16可用例如过量的对甲苯磺酰氯进行双磺酰化并增加反应时间，从而得到双-甲苯磺酸酯G19。在对一个正交保护基团P1或P2进行脱保护后，所得的伯醇G20在亲核取代作用下类似于G17(参见方案3)发生反应并形成所需的二噁烷支架G21。其余的甲苯磺酸酯可用苯甲酸钠替代，再次得到完全受保护的二噁烷支架G18，其在伯羟基基团上具有正交保护基团P1和P2。
Figure BDA0002760977440000551
方案4：式(I)的化合物(其中Y为O)的替代合成
最终将具有正交保护基团P1和P2的通式(I)(G8、G9、G14、G15和G18)的所述构造单元转化为相应的DMT保护的亚磷酰胺，使其用作自动化寡核苷酸合成中的核苷酸前体。
为此目的，通过标准的保护基团修饰，将完全受保护的通式(I)的化合物(G8、G9、G14、G15和G18)转化为单DMT保护的中间体G22。通过标准方案对G22-构造单元中的游离OH-基进行磷酸化，得到最终的DMT保护的亚磷酰胺G23，其作为用于自动化寡核苷酸合成的核苷酸前体。
Figure BDA0002760977440000552
方案5：合成最终的通式(I)和(V)的化合物的亚磷酰胺构造单元，用于自动化寡核苷酸合成
化合物G23为式(I)的化合物，其中基团P1为DMT保护基，且基团P2为由亚磷酰胺基团组成的反应性磷基。
取决于可获得中间体G22的保护基团修饰，可合成具有通用结构(I)的化合物的(2S,6R)和(2R,6R)非对映异构体。
Figure BDA0002760977440000561
方案6：通式(I)的化合物G23的非对映异构体结构
寡核苷酸单链3’-末端的起始核苷酸可通过用通用的固体载体材料(参见实验部分，寡核苷酸的合成)通过标准程序，与作为自动化合成中的第一核苷酸支架的相应的亚磷酰胺G23反应来制备。
或者，可如通用方案7中所示合成本文所述的通式(I)的化合物的固体载体材料。
Figure BDA0002760977440000562
方案7：合成通式(I)的化合物的最终CPG(受控孔玻璃)固体载体材料，用于自动化寡核苷酸合成
将醇G22用诸如琥珀酸酐的酰化剂酰化，得到相应的琥珀酸酯G24。游离的羧酸部分在肽偶联条件下与固体载体材料(CPG：受控孔玻璃)的游离氨基基团偶联，生成所需的固体载体G25，其可用作自动化寡核苷酸合成的起始材料。
与用于合成亚磷酰胺G23(参见方案6)的非对映选择性路线类似，可合成两种固体载体G25的非对映异构系列(参见方案8)。
Figure BDA0002760977440000571
方案8：化合物G25的非对映异构体结构
琥珀酸酯衍生物和通式(I)的化合物的固体载体材料也是本公开的主题，如通式(I’)中所定义：
Figure BDA0002760977440000572
其中T1和T2各自独立地为保护基团、-C(＝O)(CH2)r-COOH或-C(＝O)(CH2)r-C(＝O)NH-R7，其中R7表示固体载体材料，r为选自2、3和4的整数，且其中Y、B、X1、X2、Ra、Rb、Rc和Rd如通式(I)中所定义。
在一些实施方案中，T1和T2之一为-C(＝O)(CH2)r-COOH，且另一者为保护基团。
在一些实施方案中，T1和T2之一为-C(＝O)(CH2)rC(＝O)NH-R7，其中R7为CPG固体载体或聚苯乙烯固体载体，且T1和T2中的另一者为保护基团。
在一些实施方案中，r为2。
制备包含式(II)的化合物的寡核苷酸
可根据任何有用的技术，包括本文所述的方法，通过使用一个或多个式(I)的化合物作为要掺入最终的寡核苷酸增长链的选定位置的某些起始构造单元，来制备根据本发明使用的寡核苷酸，其在本文中也可以称为“修饰的寡核苷酸”，从而生成包含一个或多个式(II)的化合物的寡核苷酸，所述一个或多个式(II)的化合物位于最终的寡核苷酸的选定位置。
式(I)的化合物可如本公开所述合成。
本发明的修饰寡核苷酸可为带有或不带有突出端的双链，或包含至少一个双链部分。双链修饰的寡核苷酸可由其中包含第一核苷酸序列(例如有义核苷酸序列)和与第一核苷酸序列互补并与其杂交的第二核苷酸序列(例如反义核苷酸序列)的单个寡核苷酸链形成，且其中第二核苷酸序列也与靶RNA序列互补，寻求所述靶RNA序列的抑制。根据这些实施方案，第一核苷酸序列和第二核苷酸序列可在修饰的寡核苷酸内的分开的链上；或在同一链上，但由间隔子或适当长度的其它核苷酸序列隔开，以便一旦第一核苷酸序列与第二核苷酸序列杂交就形成发夹环。
在一些实施方案中，本发明的修饰的寡核苷酸是单链的，且可包含双链RNA例如siRNA的有义或反义链。
可使用本领域已知的方案化学合成本发明的寡核苷酸，例如包含一个或多个式(II)的化合物的寡核苷酸。参见，例如，Caruthers等人，1992，Methods in Enzymology，211:，3-19；Thompson等人，国际PCT公开号WO 99/54459；Wincott等人，1995，NucleicAcids Res.，23:2677-2684；Wincott等人，1997，Methods Mol.Bio.，74:59；Brennan等人，1998，Biotechnol Bioeng.，61:33-45；以及Brennan，美国专利6,001,311。寡核苷酸的合成利用了常见的核酸保护基团和偶联基团，例如在5’-末端的二甲氧基三苯甲基和在3’-末端的亚磷酰胺。在某些实施方案中，根据美国专利6,995,259；6,686,463；6,673,918；6,649,751；6,989,442；和7,205,399中描述的方法合成、脱保护和分析包含式(II)化合物的寡核苷酸。在非限制性合成实例中，在394Applied Biosystems，Inc./Thermo FischerScientific Inc.合成器上进行小规模合成。
或者，包含一个或多个式(II)化合物的寡核苷酸可分开合成，并在合成后结合在一起，例如通过连接(Moore等人，1992，Science 256:9923；Draper等人，国际PCT公开号WO93/23569；Shabarova等人，1991，Nucleic Acids Research 19:4247；Bellon等人，1997，Nucleosides&Nucleotides，16:951；Bellon等人，1997，Bioconjugate Chem.，8:204)，或通过在合成和/或脱保护后进行杂交。还可使用Scaringe等人的美国专利5,889,136；6,008,400；和6,111,086的教导，合成根据本公开所述的各种修饰的寡核苷酸。
双链RNA(dsRNA)
本发明的重要方面是提供式(I)的化合物，其允许制备包含一个或多个式(II)的化合物的修饰的寡核苷酸。修饰的寡核苷酸可用于产生双链寡核苷酸，例如与所选靶mRNA特异性杂交的siRNA。
考虑到(i)式(II)的寡聚化合物中包含的大多数核苷酸单体单元中的核糖部分，以及(ii)其中包含的核碱基的种类，式(II)的寡聚化合物可以称为“核糖核酸”或“RNA”。因此，本公开的某些方面涉及靶向目标mRNA的双链核糖核酸(dsRNA)分子。本发明的dsRNA可包含修饰的寡核苷酸，其包含一个或多个式(II)的化合物。
在一些实施方案中，dsRNA包含两条链，包含第一序列的有义链和包含第二序列的反义链，其中第一链和第二链足够互补以形成双链体结构。在一些实施方案中，有义链包含与反义链中的第二序列基本互补或完全互补的第一序列。在一些实施方案中，反义链中的第二序列与靶序列(例如从靶基因转录的mRNA的序列)基本互补或完全互补。
在一些实施方案中，dsRNA的有义链和反义链在两个分开的分子中。在一些实施方案中，双链体区在两个分开的分子的有义链中的第一序列与反义链中的第二序列之间形成。在一些实施方案中，dsRNA是siRNA。在一些实施方案中，这两个分开的分子彼此不共价连接。在一些实施方案中，这两个分开的分子彼此共价连接。在一些实施方案中，这两个分开的分子通过发夹环以外的方式彼此共价连接。在一些实施方案中，这两个分开的分子经由连接结构(在本文中称为“共价接头”)彼此共价连接。
在一些实施方案中，有义链和反义链各自的范围可为9-36个核苷酸的长度。例如，各条链可为12-30个核苷酸的长度、14-30个核苷酸的长度、15-30个核苷酸的长度、25-30个核苷酸的长度、27-30个核苷酸的长度、15-26个核苷酸的长度、15-23个核苷酸的长度、15-22个核苷酸的长度、15-21个核苷酸的长度、15-20个核苷酸的长度、15-19个核苷酸的长度、15-18个核苷酸的长度、15-17个核苷酸的长度、17-30个核苷酸的长度、17-23个核苷酸的长度、17-21个核苷酸的长度、17-19个核苷酸的长度、18-30个核苷酸的长度、18-26个核苷酸的长度、18-25个核苷酸的长度、18-23个核苷酸的长度、18-22个核苷酸的长度、18-21个核苷酸的长度、18-20个核苷酸的长度、19-30个核苷酸的长度、19-25个核苷酸的长度、19-24个核苷酸的长度、19-23个核苷酸的长度、19-22个核苷酸的长度、19-21个核苷酸的长度、19-20个核苷酸的长度、20-30个核苷酸的长度、20-26个核苷酸的长度、20-25个核苷酸的长度、20-24个核苷酸的长度、20-23个核苷酸的长度、20-22个核苷酸的长度、20-21个核苷酸的长度、21-30个核苷酸的长度、21-26个核苷酸的长度、21-25个核苷酸的长度、21-24个核苷酸的长度、21-23个核苷酸的长度或21-22个核苷酸的长度。在一些实施方案中，各条链大于或等于9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个核苷酸的长度。在一些实施方案中，各条链为小于或等于10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个核苷酸的长度。也就是说，每条链可以是上限为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36以及独立选择的下限为9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35的任何范围的核苷酸长度，其中下限小于上限。在一些实施方案中，各条链为9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个核苷酸的长度。在一些实施方案中，有义链和反义链为相同数目的核苷酸的长度。在一些实施方案中，有义链和反义链为不同数目的核苷酸的长度。
突出端
在一些实施方案中，本公开的dsRNA在有义链和反义链之一或两者的3’-末端、5’-末端或两个末端包含一个或多个突出端。在一些实施方案中，该一个或多个突出端通过突出端中较少数量的PS-基团改善稳定性。
在一些实施方案中，突出端包含一个或多个、两个或多个、三个或多个、四个或多个、五个或多个或六个或多个核苷酸。例如，突出端可包含1-8个核苷酸、2-8个核苷酸、3-8个核苷酸、4-8个核苷酸、5-8个核苷酸、1-5个核苷酸、2-5个核苷酸、3-5个核苷酸、4-5个核苷酸、1-4个核苷酸、2-4个核苷酸、3-4个核苷酸、1-3个核苷酸、2-3个核苷酸或1-2个核苷酸。在一些实施方案中，突出端为1、2、3、4、5或6个核苷酸的长度。
在一些实施方案中，本公开的突出端包含一个或多个核糖核苷酸。在一些实施方案中，本公开的突出端包含一个或多个脱氧核糖核苷酸。在一些实施方案中，突出端包含一个或多个胸腺嘧啶。在一些实施方案中，dsRNA包含位于反义链的3’-末端的突出端。在一些实施方案中，dsRNA包含位于反义链的5’-末端的平端。在一些实施方案中，dsRNA包含位于反义链的3’-末端的突出端和位于反义链的5’-末端的平端。在一些实施方案中，dsRNA包含位于有义链的3’-末端的突出端。在一些实施方案中，dsRNA包含位于有义链的5’-末端的平端。在一些实施方案中，dsRNA包含位于有义链的3’-末端的突出端和位于有义链的5’-末端的平端。在一些实施方案中，dsRNA包含均位于dsRNA的有义链和反义链的3’-末端的突出端。
在一些实施方案中，dsRNA包含位于反义链的5’-末端的突出端。在一些实施方案中，dsRNA包含位于反义链的3’-末端的平端。在一些实施方案中，dsRNA包含位于反义链的5’-末端的突出端和位于反义链的3’-末端的平端。在一些实施方案中，dsRNA包含位于有义链的5’-末端的突出端。在一些实施方案中，dsRNA包含位于有义链的3’-末端的平端。在一些实施方案中，dsRNA包含位于有义链的5’-末端的突出端和位于有义链的3’-末端的平端。在一些实施方案中，dsRNA包含位于dsRNA的两条链的突出端。
在一些实施方案中，突出端是有义链长于反义链的结果。在一些实施方案中，突出端是反义链长于有义链的结果。在一些实施方案中，突出端是相同长度的有义链和反义链交错的结果。在一些实施方案中，突出端与靶mRNA形成错配。在一些实施方案中，突出端与靶mRNA互补。
在一些实施方案中，本公开的dsRNA包含含有第一序列的有义链和含有第二序列的反义链，其中所述第一和第二序列基本上互补或互补的。在一些实施方案中，第一和第二序列基本上互补或互补，并形成dsRNA的双链体区。在一些实施方案中，dsRNA的双链体区的长度是9-36个核苷酸对。例如，双链体区可为12-30个核苷酸对的长度、14-30个核苷酸对的长度、15-30个核苷酸对的长度、15-26个核苷酸对的长度、15-23个核苷酸对的长度、15-22个核苷酸对的长度、15-21个核苷酸对的长度、15-20个核苷酸对的长度、15-19个核苷酸对的长度、15-18个核苷酸对的长度、15-17个核苷酸对的长度、17-30个核苷酸对的长度、27-30个核苷酸对的长度、17-23个核苷酸对的长度、17-21个核苷酸对的长度、17-19个核苷酸对的长度、18-30个核苷酸对的长度、18-26个核苷酸对的长度、18-25个核苷酸对的长度、18-24个核苷酸对的长度、18-23个核苷酸对的长度、18-22个核苷酸对的长度、18-21个核苷酸对的长度、18-20个核苷酸对的长度、19-30个核苷酸对的长度、19-25个核苷酸对的长度、19-24个核苷酸对的长度、19-23个核苷酸对的长度、19-22个核苷酸对的长度、19-21个核苷酸对的长度、19-20个核苷酸对的长度、20-30个核苷酸对的长度、20-26个核苷酸对的长度、20-25个核苷酸对的长度、20-24个核苷酸对的长度、20-23个核苷酸对的长度、20-22个核苷酸对的长度、20-21个核苷酸对的长度、21-30个核苷酸对的长度、21-26个核苷酸对的长度、21-25个核苷酸对的长度、21-24个核苷酸对的长度、21-23个核苷酸对的长度或21-22个核苷酸对的长度。在一些实施方案中，dsRNA的双链体区大于或等于9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个核苷酸对的长度。在一些实施方案中，dsRNA的双链体区小于或等于10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个核苷酸对的长度。也就是说，dsRNA的双链体区可以是上限为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36以及独立选择的下限为9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35的一系列核苷酸对的长度中的任何一个，其中下限小于上限。在一些实施方案中，所述双链体区为9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个核苷酸对的长度。若使用多于一个dsRNA，则每个dsRNA的双链体区可与一个或多个其它dsRNA的长度相同或不同。
在双链RNA(dsRNA)中式(II)的化合物的位置
如本文实施例所示，式(II)的核苷酸类似物可存在于双链寡核苷酸的每条链的各个位置，即存在于双链核糖核苷酸的每条链的各个位置。
式(II)的化合物，其中基团R3存在并表示细胞靶向部分，在本公开中可称为“式(II)的靶向的核苷酸类似物”或“靶向的核苷酸类似物(II)”。
不包含表示细胞靶向部分的基团R3的式(II)的化合物为非靶向的核苷酸类似物，并在本公开中将其称为“式(II)的非靶向的核苷酸类似物”或“非靶向的核苷酸类似物(II)”。
式(II)的非靶向的核苷酸类似物的位置
在特定的实施方案中，式(II)的核苷酸类似物位于dsRNA的核酸链的3’-末端、5’-末端或均位于3’-末端和5’-末端，诸如位于siRNA的核酸链的3’-末端或5’-末端。在这些特定实施方案的一些中，式(II)的核苷酸类似物只位于dsRNA的核酸链的3’-末端，诸如只位于siRNA的核酸链的3’-末端。
在这些特定实施方案的一些中，式(II)的核苷酸类似物位于siRNA的有义链的3’-末端。在一些其它的实施方案中，式(II)的核苷酸类似物位于siRNA的反义链的3’-末端。在还其它的实施方案中，式(II)的核苷酸类似物位于siRNA的有义链的3’-末端和siRNA的反义链的3’-末端。
在这些特定实施方案的一些中，式(II)的核苷酸类似物位于(i)siRNA的有义链的3’-末端和5’-末端，以及(ii)位于siRNA的反义链的3’-末端。
在一些实施方案中，2至10个(例如，2至5个)式(II)的核苷酸类似物存在于寡核苷酸中。如本文所用，2至10个式(II)的核苷酸类似物涵盖2、3、4、5、6、7、8、9和10个式(II)的核苷酸类似物。
式(II)的靶向的核苷酸类似物的位置
如本文实施例所示，式(II)的靶向的核苷酸类似物可存在于双链寡核苷酸的每条链的各个位置。例如，式(II)的靶向的核苷酸类似物位于核酸链的3’-末端或5’-末端，例如siRNA的核酸链的3’-末端或5’-末端。在这些实施方案的一些中，式(II)的靶向的核苷酸类似物位于siRNA的有义链的3’-末端或5’-末端。
在一些优选的实施方案中，式(II)的靶向的核苷酸类似物位于dsRNA的突出端，例如siRNA的突出端。例如，式(II)的靶向的核苷酸类似物位于siRNA的有义链的突出端，例如5’-突出端。
在一些实施方案中，2至10个(例如，2至5个)式(II)的靶向的核苷酸类似物存在于寡核苷酸中。如本文所用，2至10个式(II)的靶向的核苷酸类似物涵盖2、3、4、5、6、7、8、9和10个式(II)的靶向的核苷酸类似物。
靶向的寡核苷酸
根据本公开的靶向的寡核苷酸为包含至少式(II)的核苷酸类似物且进一步包含细胞靶向部分的寡核苷酸，所述细胞靶向部分包含于所述寡核苷酸中的靶向的核苷酸内。
在一些实施方案中，包含于根据本公开的靶向的寡核苷酸内的靶向的核苷酸具有式(II)的结构。因此，在一些实施方案中，根据本公开的靶向的寡核苷酸包含一个或多个式(II)的靶向的核苷酸类似物。
在一些其它实施方案中，包含于根据本公开的靶向的寡核苷酸中的靶向的核苷酸选自本领域已知的靶向的核苷酸。因此，在一些实施方案中，根据本公开的靶向的寡核苷酸包含一个或多个式(II)的非靶向的核苷酸类似物和一个或多个具有不同于式(II)的结构的靶向的核苷酸。
在还其它的实施方案中，靶向的寡核苷酸涵盖包含(i)一个或多个式(II)的非靶向的核苷酸类似物，以及(ii)一个或多个式(II)的靶向的核苷酸类似物的那些。
如本公开的其它地方所公开的，式(II)的非靶向的核苷酸类似物涵盖其中Y为O的实施方案、其中Y为NR1的实施方案、其中Y为NH的实施方案和其中Y为N-C(＝O)-R1的实施方案。非靶向的核苷酸尤其包括式(II)的核苷酸类似物，其中Y选自NR1和N-C(＝O)-R1，且其中R1为基团-[C(＝O)]m-R2-(O-CH2-CH2)p-R3，其中m、p和R2如对于通式(II)所公开定义的，且其中基团R3选自氢原子、(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷氧基基团、(C3-C8)环烷基基团、(C3-C14)杂环、(C6-C14)芳基基团和(C5-C14)杂芳基基团。
如本公开的其它地方所公开的，式(II)的靶向的核苷酸类似物具有基团R3作为细胞靶向部分。细胞靶向部分在本公开的其它地方公开。
在一些实施方案中，根据本公开的靶向的寡核苷酸为单链寡核苷酸。
在一些其它的实施方案中，根据本公开的靶向的寡核苷酸为双链寡核苷酸。
在根据本公开的靶向的寡核苷酸(为单链或双链寡核苷酸)的一些实施方案中，其寡核苷酸链包含一个或多个式(II)的靶向的核苷酸类似物，所述靶向的核苷酸类似物可位于所述寡核苷酸链内的各个位置，例如在其内部和/或在其3’-末端或5’-末端。
如本文所用，当(i)所述核苷酸类似物为位于所述3’-末端或5’-末端的核苷酸时，或当(ii)所述核苷酸类似物为包含在连续的核苷酸类似物的连续链中的核苷酸，所述核苷酸类似物具有位于所述寡核苷酸链的3’-末端或5’-末端的末端核苷酸时，核苷酸类似物定义为位于寡核苷酸链的3’-末端或5’-末端。
在根据本公开的靶向的寡核苷酸(为单链或双链寡核苷酸)的一些实施方案中，其寡核苷酸链包含一个或多个式(II)的靶向的核苷酸类似物，所述靶向的核苷酸类似物位于所述寡核苷酸链的3’-末端或5’-末端或位于两个末端。
在根据本公开的靶向的寡核苷酸(为单链或双链寡核苷酸)的一些实施方案中，其寡核苷酸链包含1至10个式(II)的靶向的核苷酸类似物，所述靶向的核苷酸类似物位于所述链的3’-末端或5’-末端，或位于所述链内的一个或多个其它位置。
在一些实施方案中，所述靶向的寡核苷酸进一步包含1至10个式(II)的非靶向的核苷酸类似物，所述非靶向的核苷酸类似物可位于所述寡核苷酸链内的各个位置，例如在其内部和/或在其3’-末端或5’-末端。
在根据本公开的靶向的寡核苷酸(为单链或双链寡核苷酸)的一些实施方案中，其寡核苷酸链包含(A)一个或多个式(II)的靶向的核苷酸类似物，所述靶向的核苷酸类似物位于所述寡核苷酸链的3’-末端或5’-末端或位于两个末端，和(B)一个或多个式(II)的非靶向的核苷酸类似物，所述非靶向的核苷酸类似物位于所述寡核苷酸链的3’-末端或5’-末端或位于两个末端，其中式(II)的靶向的核苷酸类似物和式(II)的非靶向的核苷酸类似物位于所述寡核苷酸链内的不同位置。
在根据本公开的靶向的寡核苷酸(为单链或双链寡核苷酸)的一些实施方案中，其寡核苷酸链包含1至10个式(II)的靶向的核苷酸类似物，所述靶向的核苷酸类似物位于所述链的3’-末端或5’-末端。在一些实施方案中，所述靶向的寡核苷酸进一步包含1至10个式(II)的非靶向的核苷酸类似物，其位于所述寡核苷酸链的相反末端。因此，根据这些实施方案，位于寡核苷酸链的所选末端的式(II)的靶向的核苷酸类似物的数量可为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。根据这些实施方案中的一些，若存在，位于寡核苷酸链的所选末端的式(II)的非靶向的核苷酸类似物的数量可为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
在特定的实施方案中，所述一个或多个式(II)的靶向的核苷酸类似物相互连接，从而形成这些位于寡核苷酸链的所选末端的靶向的核苷酸类似物的连续链。
在特定的实施方案中，所述一个或多个式(II)的靶向的核苷酸类似物位于靶向的寡核苷酸链的5’-末端，所述寡核苷酸为单链或双链寡核苷酸。在这些实施方案的一些中，5’-末端核苷酸为式(II)的靶向的核苷酸类似物。
在根据本公开的靶向的寡核苷酸(为单链或双链寡核苷酸)的一些实施方案中，其寡核苷酸链在其3’-末端或5’-末端、以及尤其在包含一个或多个式(II)的靶向的核苷酸类似物的末端的相反末端包含一个或多个式(II)的非靶向的核苷酸类似物。
在根据本公开的靶向的寡核苷酸(为单链或双链寡核苷酸)的一些实施方案中，其寡核苷酸链在3’-末端或在5’-末端包含1至10个式(II)的非靶向的核苷酸类似物，且优选地在其相反末端包含1至10个式(II)的非靶向的核苷酸类似物。因此，在这些实施方案中，位于寡核苷酸链的所选末端的式(II)的非靶向的核苷酸类似物的数量可为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。根据这些实施方案中的一些，若存在，位于寡核苷酸链的所选末端的式(II)的靶向的核苷酸类似物的数量可为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
在特定的实施方案中，所述一个或多个式(II)的非靶向的核苷酸类似物相互连接，从而形成这些位于寡核苷酸链的所选末端的非靶向的核苷酸类似物的连续链。
在特定的实施方案中，所述一个或多个式(II)的非靶向的核苷酸类似物位于靶向的寡核苷酸的寡核苷酸链的3’-末端。在进一步的实施方案中，3’-末端核苷酸为式(II)的靶向的核苷酸类似物。
因此，本公开涵盖单链靶向的寡核苷酸，其包含(i)一个或多个式(II)的靶向的核苷酸类似物，优选1至10个式(II)的靶向的核苷酸类似物，这些核苷酸类似物可在寡核苷酸链中连续并且位于所述单链靶向的寡核苷酸的5’-末端。在这些实施方案的一些中，所述单链靶向的寡核苷酸进一步包含(ii)一个或多个式(II)的非靶向的核苷酸类似物，例如1至10个式(II)的非靶向的核苷酸类似物，这些核苷酸类似物在寡核苷酸链中是连续的，并且位于所述单链靶向的寡核苷酸的3’-末端。
在本文的实施例中公开了单链靶向的寡核苷酸的说明，其包含(i)在其5’-末端的3个式(II)的靶向的核苷酸类似物，和(ii)在其3’-末端的2个式(II)的非靶向的核苷酸类似物。
本公开还涵盖双链寡核苷酸，其中(i)第一条链为靶向的寡核苷酸，其包含一个或多个式(II)的靶向的核苷酸类似物以及一个或多个式(II)的非靶向的核苷酸类似物，如上所述，且其中(ii)第二条链为另一个靶向的寡核苷酸，其包含一个或多个式(II)的靶向的核苷酸类似物以及一个或多个式(II)的非靶向的核苷酸类似物。
本公开进一步涵盖双链寡核苷酸，其中其至少一条链为如上所述的靶向的寡核苷酸，诸如靶向的寡核苷酸，其包含一个或多个式(II)的靶向的核苷酸类似物以及一个或多个式(II)的非靶向的核苷酸类似物，如上所述，以及(ii)第二条链为非靶向的寡核苷酸或靶向的寡核苷酸。
本公开进一步涵盖双链寡核苷酸，其中(i)第一条链为靶向的寡核苷酸，其包含一个或多个式(II)的靶向的核苷酸类似物以及一个或多个式(II)的非靶向的核苷酸类似物，如上所述，以及(ii)第二条链为非靶向的寡核苷酸，其包含一个或多个式(II)的非靶向的核苷酸类似物。
本公开还描述siRNA，其包含：
-有义链，其包含(i)一个或多个式(II)的靶向的核苷酸类似物，特别是1至10个位于其5’末端的式(II)的靶向的核苷酸类似物，以及(ii)一个或多个式(II)的非靶向的核苷酸类似物，特别是1至10个位于其3’末端的式(II)的非靶向的核苷酸类似物，和
-反义链，其为非靶向的寡核苷酸或靶向的寡核苷酸。
本公开还描述siRNA，其包含：
-有义链，其包含(i)一个或多个式(II)的靶向的核苷酸类似物，特别是1至10个位于其3’末端的式(II)的靶向的核苷酸类似物，和
-反义链，其不包含任何式(II)的核苷酸类似物。
本公开进一步描述siRNA，其包含：
-有义链，其包含(i)一个或多个式(II)的靶向的核苷酸类似物，特别是1至10个位于其5’末端的式(II)的靶向的核苷酸类似物，以及(ii)一个或多个式(II)的非靶向的核苷酸类似物，特别是1至10个位于其3’末端的式(II)的非靶向的核苷酸类似物，和
-反义链，其包含一个或多个式(II)的非靶向的核苷酸类似物，特别是1至10个位于其3’末端的式(II)的非靶向的核苷酸类似物。
本公开进一步描述siRNA，其包含：
-有义链，其包含(i)一个或多个式(II)的非靶向的核苷酸类似物，特别是1至10个位于其3’末端的式(II)的非靶向的核苷酸类似物，和
-反义链，其中所述反义链最优选不包含任何式(II)的非靶向或靶向的类似物。
本公开进一步描述siRNA，其包含：
-有义链，其包含(i)一个或多个式(II)的非靶向的核苷酸类似物，特别是1至10个位于其3’末端的式(II)的非靶向的核苷酸类似物，和
-反义链，其包含(i)一个或多个式(II)的非靶向的核苷酸类似物，特别是1至10个位于其3’末端的式(II)的非靶向的核苷酸类似物。
本公开进一步描述siRNA，其包含：
-有义链，其包含(i)一个或多个式(II)的非靶向的核苷酸类似物，特别是1至10个位于其3’末端的式(II)的非靶向的核苷酸类似物，以及(ii)和一个或多个式(II)的非靶向的核苷酸类似物，特别是1至10个位于其5’末端的式(II)的非靶向的核苷酸类似物
-反义链，其中所述反义链最优选不包含任何式(II)的非靶向或靶向的类似物。
本公开进一步描述siRNA，其包含：
-有义链，其包含(i)一个或多个式(II)的非靶向的核苷酸类似物，特别是1至10个位于其3’末端的式(II)的非靶向的核苷酸类似物，以及(ii)和一个或多个式(II)的非靶向的核苷酸类似物，特别是1至10个位于其5’末端的式(II)的非靶向的核苷酸类似物
-反义链，其包含(i)一个或多个式(II)的非靶向的核苷酸类似物，特别是1至10个位于其3’末端的式(II)的非靶向的核苷酸类似物。
本公开进一步描述siRNA，其包含：
-有义链，其中所述有义链最优选不包含任何式(II)的非靶向或靶向的类似物
-反义链，其包含(i)一个或多个式(II)的靶向的核苷酸类似物，特别是1至10个式(II)的非靶向的核苷酸类似物。
靶向的寡核苷酸的进一步实施方案
包含一个或多个式(II)的化合物的寡核苷酸，尤其是包含一个或多个式(II)的非靶向的核苷酸类似物的寡核苷酸，可进一步包含一个或多个修饰的核苷酸(“靶向的核苷酸”)，其允许将寡核苷酸靶向靶细胞或细胞受体蛋白。例如，寡核苷酸为双链的，其中一条或两条寡核苷酸链包含一个或多个式(II)的化合物，且其中一条或两条寡核苷酸链进一步包含一个或多个靶向的核苷酸。为了本公开的目的，此类双链寡核苷酸也可称为“dsRNA缀合物”。
靶向的核苷酸
在基于式(II)的靶向的寡核苷酸一些实施方案中，靶向配体(例如，细胞靶向部分)与吗啉代基团的氮原子直接且共价结合。在一些其它的实施方案中，所述配体通过接头基团与吗啉代基团的氮原子共价结合。举例而言，式(II)的靶向的核苷酸类似物可包含，例如式(II)的化合物，其中Y为NR1，且R1为基团-[C(＝O)]m-R2-(O-CH2-CH2)p-R3，且R3为细胞靶向部分，且其中B、L1、L2、m、p、R2、X1、X2、Ra、Rb、Rc和Rd如对于通式(II)所定义。
细胞靶向部分
本文的靶向的核苷酸可以与靶向特定细胞或组织的一种或多种配体连接。这种配体也称为“细胞靶向部分”。配体涵盖任何提高所得寡核苷酸(如siRNA)向细胞内递送的效率的分子基团，例如，通过改善特异性细胞靶向，改善寡核苷酸的细胞内在化和/或改善细胞内mRNA靶向。配体可选自受体特异性肽、受体特异性蛋白(例如，单克隆抗体或融合蛋白)和受体特异性小分子配体(例如，碳水化合物，例如GalNAc基团)。
配体可以是天然存在的，或者是重组的或合成的。例如，配体可为蛋白质、碳水化合物、脂多糖、脂质、合成聚合物、多胺、α螺旋肽、凝集素、维生素或辅因子。在一些实施方案中，配体是一种或多种染料、交联剂、多环芳族烃、肽缀合物(例如，RGD肽、触角足突变肽、Tat肽)、聚乙二醇(PEG)、酶、半抗原、运输/吸收促进剂、合成核糖核酸酶(例如，咪唑、联咪唑、组胺或咪唑簇)、人血清白蛋白(HSA)或LDL。
举例而言，配体可为一种或多种对共配体具有特异性亲和力的蛋白质、糖蛋白、肽或分子。此类配体可包括促甲状腺素、促黑激素、糖蛋白、表面活性剂蛋白A、粘蛋白碳水化合物、乳糖(例如，多价乳糖)、半乳糖(例如，多价半乳糖)、N-乙酰基-半乳糖胺(例如，多价N-乙酰基-半乳糖胺)、N-乙酰基-葡萄糖胺(例如，多价N-乙酰基-葡萄糖胺)、甘露糖(例如，多价甘露糖)、岩藻糖(例如，多价岩藻糖)、糖基化的聚氨基酸、转铁蛋白、双膦酸酯、聚谷氨酸酯、聚天冬氨酸酯、脂质、胆固醇、类固醇、胆汁酸、叶酸、维生素B12和生物素。
在一些实施方案中，细胞靶向部分是一种或多种染料、交联剂、多环芳族烃、肽缀合物(例如触角足突变肽、Tat肽)、聚乙二醇(PEG)、酶、半抗原、运输/吸收促进剂、合成核糖核酸酶(例如，咪唑、联咪唑、组胺或咪唑簇)、人血清白蛋白(HSA)或LDL。
在一些实施方案中，配体可为一种或多种胆固醇衍生物或亲脂性部分。任何亲脂性化合物可包括但不限于胆固醇或胆固醇衍生物；胆酸；维生素(例如叶酸、维生素A、维生素E(生育酚)、生物素、吡哆醛)；胆汁或脂肪酸缀合物，包括饱和和非饱和的(例如月桂酰基(C12)、肉豆蔻酰基(C14)和棕榈酰基(C16)、硬脂酰基(C18)和二十二烷基(C22)，石胆酸和/或石胆酸油胺缀合物(石胆酸油基，C43)；聚合物骨架或支架(例如PEG、三甘醇(TEG)、六甘醇(HEG)、聚(乳酸-乙醇酸共聚物)(PLGA)、聚(丙交酯-乙交酯共聚物)(PLG)、流体动力聚合物；类固醇(例如二氢睾酮)；萜烯(例如三萜烯)；阳离子脂质或肽；和/或脂质或基于脂质的分子。这种脂质或基于脂质的分子可以结合血清蛋白，例如人血清白蛋白(HSA)。基于脂质的配体可以用于调节(例如控制)缀合物物与靶组织的结合。例如，与HSA结合更强的脂质或基于脂质的配体更不可能被靶向至肾脏，因此也不太可能从体内清除。靶组织可为肝脏，包括肝脏的实质细胞。
聚氨基酸、转铁蛋白、细胞靶向配体或部分也可以是与特定细胞类型如肝细胞上的受体结合的抗体。示例性的细胞受体特异性单克隆抗体是由Xia等人(2009，Mol Pharm，63(3):747-751)；Cuellar等人(2015，Nucleic Acids Research，43(2):1189-1203)；
Figure BDA0002760977440000701
等人(2016，Nat Protocol，11(1):22-36)；Ibtejah等人(2017，Clin Immunol，176:122-130)；和Sugo等人(2016，J Control Release，237:1-13)公开的那些。
细胞靶向配体或部分还涵盖单价或多价(例如三价)GalNAc基团，例如Prakash等人(2015，Bioorg Med Chem Lett，25(19):4127-4130)；Zu等人(2016，Mol Ther-NucleicAcids，e317，doi:10.1038/mnta.2016.26)；Zimmermann等人(2017，Mol Ther，25(1):71-78)；Shemesh等人(2016，Mol Ther Nucleic Acids，5:e319-doi:10.1038/mnta.2016.31)；Huang等人(2016，Mol Ther-Nucleic Acids，6:116-132)；Rozema等人(2007，Proc NatlAcad Sci USA，104(32):12982-12987)；Rajeev等人(2015，Chembiochem，16(6):903-908)；以及Nair等人(2014，J Am Chem Soc，136(49):16958-16961)公开的那些。
制备修饰的dsRNA
本公开的dsRNA可以化学/物理连接至一个或多个配体、部分或缀合物。在一些实施方案中，dsRNA通过接头缀合/附接至一个或多个配体。可使用本领域已知的任何接头，例如，多价分支接头。将配体与dsRNA缀合可改变其分布，增强其细胞吸收和/或靶向特定组织和/或被一种或多种特定细胞类型(例如，肝细胞)摄取，和/或延长dsRNA剂的寿命。在一些实施方案中，将疏水配体与dsRNA缀合，以促进穿过细胞膜的直接渗透和/或被细胞(例如，肝细胞)摄取。
在dsRNA缀合物的一些实施方案中，一个或多个核苷酸可包含带有靶向部分的基团，例如一个或多个核苷酸包含带有靶向部分的基团，其中靶向部分可能通过连接基团共价连接至核苷酸骨架。根据这些实施方案，dsRNA的一个或多个核苷酸与包含靶向部分的带有靶向部分的基团缀合，并且其中所述靶向部分可以是增强组合物细胞内递送的配体(例如细胞穿透部分或试剂)。
本公开的配体-缀合的dsRNA和带有配体分子的序列特异性连接的核苷和核苷酸可通过本领域已知的任何方法来组装，包括例如通过利用标准核苷酸前体，或已经带有连接部分的核苷酸或核苷缀合前体，配体-核苷酸或已经带有配体分子的核苷缀合前体，或带有非核苷配体的构造单元，在适合的DNA合成器上进行组装。
可通过本领域已知的任何方法来合成本公开的配体-缀合的dsRNA，所述方法包括例如通过使用带有侧链反应性官能团的dsRNA，所述侧链反应性官能团例如从连接分子附接到dsRNA上衍生的。在一些实施方案中，该反应性寡核苷酸可直接与可商购的配体、合成的带有多种保护基团中的任一种的配体或具有附接至其上的连接部分的配体直接反应。在一些实施方案中，所述方法通过使用已经与配体适当地缀合并且可以进一步附接到固体载体材料上的核苷单体来促进配体-缀合的dsRNA的合成。在一些实施方案中，通过首先将单体构造单元经由氨基烷基基团共价附接到受控孔玻璃载体上来制备带有附接至dsRNA的3’-末端的芳烷基配体的dsRNA；然后，核苷酸通过标准固相合成技术键合至与固体载体结合的单体构造单元上。单体构造单元可为与固相合成相容的核苷或其它有机化合物。
组合物
本公开的某些方面涉及包含本文所述的dsRNA的组合物(例如，药物组合物)。在一些实施方案中，组合物(例如，药物组合物)还包含药学上可接受的载体。在一些实施方案中，所述组合物(例如，药物组合物)可用于治疗与靶向基因的表达或活性相关的疾病或病症。
基于递送方式配制本公开的组合物(例如，药物组合物)，包括例如配制用于通过肠道外递送至肝脏的组合物。
本公开的组合物(例如药物组合物)可以足以抑制靶向基因表达的剂量给药。在一些实施方案中，dsRNA的适合剂量在每kg接受者体重0.01mg至400mg的范围内。
本领域普通技术人员将理解，某些因素可影响有效治疗受试者所需的剂量和时机，所述因素包括但不限于疾病或病症的严重程度、先前的治疗、受试者的总体健康和/或年龄，以及存在一种或多种其它疾病。此外，用治疗有效量的药物组合物治疗受试者可以包括单一治疗或一系列治疗。如本文公开的，对于dsRNA的有效剂量和体内半衰期的估计可使用常规方法或基于使用适当动物模型的体内测试来进行。
本公开的dsRNA分子可配制在药学上可接受的载体或稀释剂中。药学上可接受的载体可以是液体或固体，并且可用考虑到的计划给药方式进行选择，以提供所需的体积、稠度以及其它相关的运输和化学性质。可使用任何已知的药学上可接受的载体或稀释剂，包括例如水、盐水溶液、粘合剂(例如聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)、填充剂(例如乳糖和其它糖、明胶或硫酸钙)，润滑剂(例如淀粉、聚乙二醇或乙酸钠)、崩解剂(例如淀粉或羧基乙酸淀粉钠)、钙盐(例如硫酸钙、氯化钙、磷酸钙等)和润湿剂(例如月桂基硫酸钠)。
可以将本公开的dsRNA分子配制成组合物(例如，药物组合物)，其含有与其它分子、分子结构或核酸混合物混合、包封、缀合或以其它方式缔合的dsRNA。例如，包含一种或多种如本文所述的dsRNA的组合物可包含其它治疗剂，例如其它降脂剂(例如他汀类)。在一些实施方案中，组合物(例如，药物组合物)还包含递送媒剂(如本文所述)。
载体(vector)和dsRNA递送
本公开的dsRNA可直接或间接递送。在一些实施方案中，通过向受试者给药包含dsRNA的组合物(例如，药物组合物)直接递送dsRNA。在一些实施方案中，通过给药一种或多种本文所述的载体间接递送dsRNA。
递送
本公开的dsRNA可以通过本领域已知的任何方法来递送，包括例如通过使递送核酸分子的方法适于与dsRNA一起使用来递送(参见，例如Akhtar，S.等人(1992)TrendsCell.Biol.2(5):139-144；WO 94/02595)或通过本领域已知的其它方法(参见例如Kanasty，R.等人(2013)Nature Materials 12:967-977；Wittrup，A.and Lieberman，J.(2015)Nature Reviews Genetics 16:543-552；Whitehead，K.等人(2009)Nature ReviewsDrug Discovery 8:129-138；Gary，D.等人(2007)121(1-2):64-73；Wang.J.等人(2010)AAPS J.12(4):492-503；Draz，M.等人(2014)Theranostics 4(9):872-892；Wan，C.等人(2013)Drug Deliv.And Transl.Res.4(1):74-83；Erdmann，V.A.and Barciszewski，J.(eds.)(2010)“RNA Technologies and Their Applications”，Springer-Verlag BerlinHeidelberg，DOI 10.1007/978-3-642-12168-5；Xu，C.and Wang，J.(2015)Asian Journalof Pharmaceutical Sciences 10(1):1-12)。
在一些实施方案中，本公开的dsRNA由包含dsRNA的递送媒剂递送。在一些实施方案中，递送媒剂是脂质体、脂质复合物、复合物或纳米颗粒。
脂质体制剂
脂质体是单层或多层囊泡，其具有由亲脂性材料和水性内部形成的膜。在一些实施方案中，脂质体是由两亲性脂质组成的囊泡，其排列成球形双层或双层。水性部分包含待递送的组合物。阳离子脂质体具有能够融合至细胞壁的优势。脂质体的优势包括，例如，从天然磷脂中获得的脂质体具有生物相容性和生物可降解性；脂质体可掺入各种水溶性和脂溶性药物；脂质体可以保护内部隔室中的包裹的药物免于代谢和降解(Rosoff，inPharmaceutical Dosage Forms，Lieberman，Rieger and Banker(Eds.)，1988，MarcelDekker，Inc.，New York，N.Y.，volume 1，p.245)。制备脂质体制剂的重要考虑因素是脂质表面电荷、囊泡大小和脂质体的水性体积。例如，工程化的阳离子脂质体和空间稳定的脂质体可用于递送dsRNA。参见，例如，Podesta等人(2009)Methods Enzymol.464，343-54；美国专利5,665,710。
核酸-脂质颗粒
在一些实施方案中，将本公开的dsRNA完全包封在脂质制剂中，例如形成核酸-脂质颗粒，例如SPLP、pSPLP或SNALP。如本文所用，术语“SNALP”是指稳定的核酸-脂质颗粒，包括SPLP。如本文所用，术语“SPLP”是指包含包裹在脂质囊泡中的质粒DNA的核酸-脂质颗粒。核酸-脂质颗粒，例如SNALP，通常含有阳离子脂质、非阳离子脂质、胆固醇和防止颗粒聚集并增加循环时间的脂质(例如，PEG-脂质缀合物)。SNALP和SPLP对全身应用很有用，因为它们在静脉内(i.v.)注射后表现出延长的循环寿命，并积聚在远端部位(例如，与给药部位物理分离的部位)。SPLP包括“pSPLP”，其包括如PCT公开号WO 00/03683中所述的包裹的缩合剂-核酸复合物。
在一些实施方案中，当存在于核酸-脂质颗粒中时，dsRNA在水溶液中对核酸酶降解具有抗性。核酸-脂质颗粒及其制备方法公开于例如美国专利号5,976,567；5,981,501；6,534,484；6,586,410；和6,815,432；；以及PCT公开号WO 96/40964中。
在一些实施方案中，核酸-脂质颗粒包含阳离子脂质。可使用本领域已知的任何阳离子脂质或其混合物。在一些实施方案中，核酸-脂质颗粒包含非阳离子脂质。可使用本领域已知的任何非阳离子脂质或其混合物。在一些实施方案中，核酸-脂质颗粒包含缀合的脂质(例如，以防止积聚)。可使用本领域已知的任何缀合的脂质。
其它制剂
为了成功地体内递送dsRNA分子，重要的考虑因素包括：(1)被递送的分子的生物学稳定性，(2)防止非特异性作用，以及(3)被递送的分子在靶组织中的积聚。dsRNA的非特异性作用可通过局部给药来最小化，例如通过直接注射或植入组织或局部给药该制剂。对于用于治疗疾病的全身给药dsRNA，可修饰dsRNA或使用药物递送系统递送dsRNA；这两种方法均起着防止核酸内切酶和核酸外切核酸酶的体内迅速降解dsRNA的作用。RNA或药物载体的修饰还可允许将dsRNA组合物靶向靶组织并避免不期望的脱靶效应。如上所述，dsRNA分子可通过化学缀合修饰为亲脂性基团，诸如胆固醇，以增强细胞摄取并防止降解。在一些实施方案中，使用药物递送系统递送dsRNA，所述递送系统例如纳米颗粒、树状分子、聚合物、脂质体或阳离子递送系统。带正电荷的阳离子递送系统促进dsRNA分子(带负电荷)的结合，并且还增强带负电荷的细胞膜上的相互作用，从而允许细胞有效吸收dsRNA。阳离子脂质、树状分子或聚合物可与dsRNA结合，或诱导形成包裹dsRNA的囊泡或胶束(参见，例如KimS.H.等人(2008)Journal of Controlled Release 129(2):107-116)。当全身给药时，囊泡或胶束的形成进一步防止了dsRNA的降解。阳离子-dsRNA复合物的制备和给药方法是本领域已知的。在一些实施方案中，dsRNA与环糊精形成复合物用于全身给药。
使用dsRNA的方法
本公开的某些方面涉及抑制哺乳动物中靶向基因表达的方法，其包括给药有效量的一种或多种本公开的dsRNA、一种或多种本公开的载体(vector)或本公开的组合物(例如，药物组合物)，所述组合物包含本公开的一种或多种dsRNA。本公开的某些方面涉及治疗和/或预防一种或多种靶基因介导的疾病或病症的方法，其包括给药一种或多种本公开的dsRNA和/或一种或多种本公开的载体和/或包含本公开的一种或多种dsRNA的组合物(例如药物组合物)。在一些实施方案中，下调受试者中靶基因的表达减轻受试者中靶基因介导的疾病或病症的一种或多种症状。
在一些实施方案中，与治疗前水平相比，治疗之后在受试者中靶基因的表达被抑制至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或约100％。在一些实施方案中，与治疗前水平相比，治疗之后靶基因的表达被抑制至少约1.1倍、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约4.5倍、至少约5倍、至少约5.5倍、至少约6倍、至少约6.5倍、至少约7倍、至少约7.5倍、至少约8倍、至少约8.5倍、至少约9倍、至少约9.5倍、至少约10倍、至少约25倍、至少约50倍、至少约75倍或至少约100倍。在一些实施方案中，在受试者的肝脏中抑制靶基因。
在一些实施方案中，受试者为人。在一些实施方案中，该受试者患有或已被诊断出靶基因介导的病症或疾病。在一些实施方案中，该受试者被怀疑患有靶基因介导的病症或疾病。在一些实施方案中，受试者处于发展靶基因介导的病症或疾病的危险中。
从本公开的内容可以理解，本文所述的dsRNA的主要特征在于存在于其中包含的一个或多个式(II)的核苷酸类似物，所述式(II)的核苷酸类似物具有其“糖样”基团的特定结构特征。通常构想如本文所述的dsRNA，用于靶向在目标靶核酸中包含的所选核酸序列。特别地，本文描述的由siRNA组成的dsRNA的实施方案包含与在目标靶核酸中包含的核酸序列特异性杂交的反义链。本文所述的dsRNA或组合物(例如，药物组合物)可用于治疗靶基因介导的病症或疾病。特别地，本文所述的dsRNA或组合物(例如，药物组合物)，尤其是包含一个或多个靶向的核苷酸类似物、尤其是一个或多个式(II)的靶向的核苷酸类似物的dsRNA，可用于治疗其中需要肝靶向的靶基因介导的病症或疾病。
本公开的某些方面还涉及将核酸递送至肝细胞的方法，其包括使肝细胞与本文所述的dsRNA接触。
本文所述的dsRNA或组合物(例如药物组合物)可通过本领域已知的任何方式给药，包括但不限于口服或肠胃外途径，包括静脉内、肌内、皮下、肺部、透皮和气道(气雾剂)给药。通常，当治疗患有高脂血症的哺乳动物时，通过肠胃外方式全身性地给药dsRNA分子。在一些实施方案中，dsRNA和/或组合物通过皮下给药来给药。在一些实施方案中，dsRNA和/或组合物通过静脉内给药来给药。在一些实施方案中，dsRNA和/或组合物通过肺部给药来给药。
当疾病状态的一个或多个参数有统计学显著改善，或未有原本预期的恶化或症状进展时，dsRNA的治疗或预防作用是明显的。例如，在可测量的疾病参数中至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或更多的有利变化可指示有效的治疗。对于给定的dsRNA或包含dsRNA的组合物的功效也可使用本领域已知的给定疾病或病症的实验动物模型来判断。当使用实验动物模型时，当观察到标志物或症状的统计学显著减少时，证实了治疗的功效。
试剂盒和制品
本公开的某些方面涉及一种制品或试剂盒，其包含一种或多种dsRNA、载体或组合物(例如，本文所述的可用于治疗和/或预防如上所述的靶基因介导的病症或疾病的药物组合物)。制品或试剂盒可进一步包含容器和在容器上或与容器相关的标签或包装说明书。适合的容器包括例如瓶、小瓶、注射器、IV溶液袋等。容器可由多种材料形成，例如玻璃或塑料。该容器可容纳组合物，该组合物本身或与另一种组合物结合使用有效治疗或预防疾病，并可具有无菌进入端口(例如容器可为静脉注射溶液袋或带有皮下注射针可刺穿的塞子的小瓶)。组合物中的至少一种活性剂是本文所述的dsRNA。标签或包装说明书指示该组合物用于治疗靶标介导的病症或疾病。此外，该制品或试剂盒可包括(a)其中装有组合物的第一容器，其中所述组合物包含本文所述的dsRNA；和(b)其中装有组合物的第二容器，其中所述组合物包含第二治疗剂。在本公开的该实施方案中的制品或试剂盒可进一步包含包装说明书，其指示所述组合物可用于治疗特定疾病。替代地或另外地，该制品或试剂盒还可包括第二(或第三)容器，该容器包含药学上可接受的缓冲液，例如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、Ringer溶液和右旋糖溶液。从商业和用户的角度来看，其还可包括其它材料，包括其它缓冲液、稀释剂、过滤器、针头和注射器。
在本说明书中，特别是在本文的实施例中，公开了核酸序列作为参考。出于专利事务的目的，相同的序列也以根据标准要求格式化的序列表的形式提供。若序列与标准序列表有任何差异，以本说明书中描述的序列为参考。
在不限制本公开的情况下，以下出于说明目的描述本公开的多个实施例。
实施例
所使用的缩写：
-AcOH：乙酸
-FA：甲酸
-ACN：乙腈
-DCM：二氯甲烷
-DMA：二甲基乙酰胺
-DCE：二氯乙烷
-DMF：二甲基甲酰胺
-DMSO：二甲基亚砜
-EtOAc：乙酸乙酯
-EtOH：乙醇
-Et2O：乙醚
-iPrOH：异丙醇
-THF：四氢呋喃
-MeOH：甲醇
-NMP：N-甲基-2-吡咯烷酮
-PE：石油醚
-Pyr：吡啶
-iPr：异丙基
-cHex：环己基
-MTB：甲基-叔丁基
-DIPEA：二异丙基乙胺
-DMAP：4-(二甲基氨基)-吡啶
-HBTU：(2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓-六氟磷酸盐)
-TBTU：O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓四氟硼酸盐
-DDTT：3-((N,N-二甲基-氨基亚甲基)氨基)-3H-1,2,4-二噻唑-5-硫酮
-NEt3：三乙胺
-NEM：N-乙基-吗啉
-BSA：N,O-双-三甲基甲硅烷基乙酰胺
-TMSOTf：三氟甲磺酸三甲基甲硅烷基酯
-Ts：对甲苯磺酰基
-Tf：三氟甲磺酰基
-三氟甲磺酸酯
-TFA：三氟乙酸
-DCA：二氯乙酸
-TEA：三乙基铵
-TIPS：三异丙基甲硅烷基
-TBDMS：叔丁基二甲基甲硅烷基
-DMT：4,4’-二甲氧基三苯甲基
-Bzl：苯甲酰基
-Bn：苄基
-BOM：苄基氧基甲基
-Ac：乙酰基
-iBu：异丁酰基
-Boc：叔丁基氧基羰基
-Fmoc：芴基甲基氧基羰基
-Fmoc-OSu：N-(9-芴基甲氧基羰基氧基)琥珀酰亚胺
-CE：氰基乙基
-CPG：受控孔玻璃
-T：胸腺嘧啶
-U：尿嘧啶
-C：胞嘧啶
-A：腺嘌呤
-G：鸟嘌呤
-I：次黄嘌呤次黄嘌呤
-TBOM：N-苄基氧基甲基-胸腺嘧啶
-UBOM：N-苄基氧基甲基-尿嘧啶
-UBzl：N-苯甲酰基-尿嘧啶
-CBzl：N-苯甲酰基-胞嘧啶
-ABzl：N-苯甲酰基-腺嘌呤
-GiBu：N-异丁酰基-鸟嘌呤
-GalNAc：D-N-乙酰基半乳糖胺
-FR：流速
-HPLC：高压液相色谱
-MS-TOF：质谱-飞行时间
-LC-MS：高压液相色谱-质谱
-Rt：保留时间
-RT：室温
-Hal：卤素
-ELSD：蒸发光散射检测器
-quant.：定量的
-sat.：饱和
-i.vac.：真空
-n.d.：未测定
-TLC：薄层色谱
-h：小时
-min：分钟
-Tm：解链温度
-r：核糖核苷酸
-d：脱氧-核糖核苷酸
-m：2’-OMe-核苷酸
-f：2’-脱氧-氟-核苷酸
--ss：有义链
-as：反义链
--ds：双链
-chol：胆固醇
-PO：磷酸二酯键
-*或PS：硫代磷酸酯键
-mpk：mg/kg
-M：摩尔
-#：编号，n°
-FBS：牛胎儿血清
-ATP：三磷酸腺苷
-pre-lB：前体核苷酸
-pre-lgB：靶向的前体核苷酸
-lB：核苷酸类似物
-lgB：靶向的核苷酸类似物
实施例
根据IUPAC规则已建立命名法。
A.合成式(I)的核苷酸类似物，其中X为N
除非另有说明，否则已使用以下LC-MS方法：
A：
柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18，1.7μm，2.1x50mm
洗脱液：(H2O+0.05％FA)/(ACN+0.035％FA)95:5(0min)至5:95(2min)至5:95(2.6min)至95:5(2.7min)至95:5(3.0min)，0.9ml/min 55℃。
B-1：
柱：Phenomenex Luna C18，3.0μm，2.0x10mm
洗脱液：(H2O+0.05％TFA)/ACN 93:7(0min)至5:95(1.20min)至5:95ACN(1.40min)至93:7(1.50min)；1.1ml/min，室温。
B-2：
柱：Phenomenex Luna C18，3.0μm，2.0x10mm
洗脱液：(H2O+0.05％TFA)/ACN 93:7(0min)至5:95(1.00min)至5:95ACN(1.45min)至93:7(1.50min)；1.1ml/min，室温。
B-3：
柱：Phenomenex Luna C18，3.0μm，2.0x10mm
洗脱液：(H2O+0.05％TFA)/ACN 20:80(0min)至5:95(0.60min)至5:95ACN(1.45min)至80:20(1.50min)；1.1ml/min，室温。
C：
柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18，1.7μm，2.1x50mm
洗脱液：(H2O+0.05％FA)/(ACN+0.035％FA)98:2(0min)至98:2(0.2min)至2:98(3.8min)至2:98(4.3min)至98:2(4.5min)，1.0ml/min，55℃。
D：
柱：Chromolith@Flash RP-18E 2x25mm
洗脱液：(H2O+0.0375％TFA)/(ACN+0.01875％TFA)95:5(0min)至5:95(0.80min)至5:95(1.20min)至95:5(1.21min)至95:5(1.55min)，1.5ml/min，50℃。
E：
柱：Kinetex EVO C18E 2.1x30mm，5μm
洗脱液：(H2O+0.0375％TFA)/(ACN+0.01875％TFA)95:5(0min)至5:95(0.80min)至5:95(1.20min)至95:5(1.21min)至95:5(1.55min)，1.5ml/min，50℃。
实施例A.1：
合成方案1
Figure BDA0002760977440000821
1a：乙酸[(2S,3S,4R,5R)-4-乙酰氧基-3-苄基氧基-2-(苄基氧基甲基)-5-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)四氢呋喃-2-基]甲基酯
在氩气气氛中，将42.5g(87.4mmol)的起始材料G3和22.3g(174.7mmol)胸腺嘧啶溶于500ml干燥ACN中。在添加106.6g(128.2ml，524.1mmol)BSA之后，将溶液在80℃搅拌1小时。在冷却溶液至50℃后，添加31.8g(25.9ml，141.5mmol)TMSOTf，并在80℃继续加热1小时。真空蒸发溶剂并将残余物溶于EtOAc，并用饱和NaHCO3溶液、H2O和饱和的NaCl溶液洗涤。在用MgSO4干燥后，将有机层蒸发并将粗产物用硅胶色谱提纯(正庚烷中10至100％乙酸乙酯)，得到所需的胸苷衍生物1a为无色泡沫(40.9g，84.7％)。
LCMS-方法A：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝1.82
电离方法：ES-：[M-H]-＝551.3
1H-NMR(CDCl3，400MHz)δ[ppm]：8.55(s，1H)7.51-7.17(m，12H)，6.23(d，J＝5.27Hz，1H)，5.44(t，J＝5.65Hz，1H)，4.72-4.35(m，6H)，4.19(d，J＝12.17Hz，1H)，3.79(d，J＝10.16Hz，1H)，3.53(d，J＝10.16Hz，1H)2.17-2.06(m，6H)，1.55(d，J＝0.75Hz，3H)。
1b：乙酸[(2S,3S,4R,5R)-4-乙酰氧基-3-苄基氧基-2-(苄基氧基甲基)-5-(2,4-二氧代嘧啶-1-基)-四氢呋喃-2-基]甲基酯
将10.0g(20.55mmol)的G3和3.49g(30.8mmol)尿嘧啶溶于200ml干燥ACN中。在添加20.09g(30.15ml，123.3mmol)BSA之后，将溶液在81℃搅拌1小时。在冷却溶液至0℃后，添加7.48g(6.10ml，33.3mmol)TMSOTf，并将混合物加热至65℃。当达到完全转化时，在该温度继续搅拌1小时。在室温，添加500ml饱和的NaHCO3溶液，并将混合物用500ml EtOAc萃取。将有机层分离，并用H2O和饱和的NaCl溶液洗涤。在用MgSO4干燥后，将粗产物在硅胶上提纯(正庚烷中20至100％EtOAc)，得到受保护的核苷类似物1b，82.3％产率(9.11g)，为无色泡沫。
LCMS-方法A：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝1.82
电离方法：ES+：[M+H]+＝539.1
1H-NMR(CDCl3，400MHz)δ[ppm]：8.97(s，1H)，7.66(d，J＝8.0Hz，1H)，7.38-7.35(m，10H)，6.19(d，J＝4.0Hz，1H)，5.38-5.30(m，2H)，4.63(d，J＝12.0Hz，1H)，4.46-4.41(m，5H)，4.19(d，J＝12.0Hz，1H)，3.79(d，J＝12.0Hz，1H)，3.51(d，J＝12.0Hz，1H)，2.12(s，3H)，2.07(s，3H)。
1c：乙酸[(2S,3S,4R,5R)-4-乙酰氧基-3-苄基氧基-2-(苄基氧基甲基)-5-[2-(2-甲基丙酰基-氨基)-6-氧代-1H-嘌呤-9-基]四氢呋喃-2-基]甲基酯
在15℃、在N2气氛中，向化合物G3(148.5g，0.30mol)的6.68l DCE溶液中添加N-异丁酰基-鸟嘌呤(135g，0.61mol)和BSA(311.85mL，1.2mol)。将混合物在85℃搅拌3小时。然后在85℃添加TMSOTf(183.4g，0.90mol)，并当TLC显示完全转化时继续搅拌3小时。将混合物冷却至室温，并倒入6.5l饱和的NaHCO3溶液中。将有机层分离，并将水相用5l DCM萃取两次。将有机层合并并经无水Na2SO4干燥，过滤并浓缩。将所得的粗产物通过制备型HPLC提纯(0.1％TFA/ACN),，得到化合物1c(128g，64％)为白色固体。
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：12.09(s,1H)，11.62(s，1H)，8.14(s，1H)，7.41-7.30(m，10H)，6.12(d，J＝6.4Hz，1H)，5.90(t，J1＝J2＝5.6Hz，1H)，4.71(d，J＝5.2Hz，1H)，4.63-4.55(m，4H)，4.34(d，J＝5.6Hz，1H)，4.23(d，J＝5.6Hz，1H)，3.71-3.66(m，2H)，3.18(d，J＝4.8Hz，1H)，2.76-2.51(m，1H)，2.05(s，3H)，1.99(s，3H)，1.20-1.12(s，6H)。
1d：乙酸[(2S,3S,4R,5R)-4-乙酰氧基-3-苄基氧基-2-(苄基氧基甲基)-5-(6-氧代-1H-嘌呤-9-基)-四氢呋喃-2-基]甲基酯
根据对于1c所述的方案，起始于10.0g(20.55mmol)G3和3.32g(23.66mmol)次黄嘌呤作为核碱基，合成标题化合物。在硅胶提纯(10至100％EtOAc/MeOH(9:1)，在正庚烷中)后，将标题化合物1d分离为无色泡沫(9.53g，81.1％)。
LCMS-方法A：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝1.73
电离方法：ES+：[M+H]+＝563.3
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：12.42(s，1H)，8.22(s，1H)，8.01(s，1H)，7.25-7.39(m，10H)，6.21(d，J＝4.89Hz，1H)，5.90-5.97(m，1H)，4.78(d，J＝5.75Hz，1H)，4.45-4.61(m，4H)，4.32-4.41(m，1H)，4.17-4.25(m，1H)，3.59-3.74(m，2H)，2.04(m，3H)，1.98(m，3H)。
1e：乙酸[(2S,3S,4R,5R)-4-乙酰氧基-5-(6-苯甲酰氨基嘌呤-9-基)-3-苄基氧基-2-(苄基氧基甲基)-四氢呋喃-2-基]甲基酯
在室温，向化合物G3(164g，0.337mol)和N-苯甲酰基腺嘌呤(121g，0.506mol)在6.56l DCE的混合物中逐滴添加BSA(274g，1.348mol)并将混合物在90℃搅拌1.5小时。在40-50℃滴加TMSOTf(225g，1.011mol)之后，将混合物在90℃搅拌1小时。将混合物用15l饱和的NaHCO3溶液淬灭，并分离各层。将水层用3l EtOAc萃取2x，且合并的有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩。将粗产物通过快速色谱提纯(PE/EtOAc 1:2)，得到化合物1e作为异头物混合物(224.4g)，其为黄色油状物。将混合物通过两种反向快速色谱(中性)纯化，得到纯的化合物1e(75.5g，33.7％)为无色泡沫。
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.25(s，1H)，8.72(s，1H)，8.62(s，1H)，8.05(d，J＝7.40Hz，2H)，7.71-7.62(m，1H)，7.60-7.50(m，2H)，7.43-7.21(m，10H)，6.38(d，J＝4.77Hz，1H)，6.12(t，J＝5.33Hz，1H)，4.88(d，J＝5.77Hz，1H)，4.63(s，2H)，4.56-4.45(m，2H)，4.41(d，J＝11.92Hz，1H)，4.25(d，J＝11.80Hz，1H)，3.75-3.59(m，2H)，2.06(s，3H)，2.00(s，3H)。
2a：1-[(2R,3R,4S,5R)-4-苄基氧基-5-(苄基氧基甲基)-3-羟基-5-(羟基甲基)-四氢呋喃-2-基]-5-甲基-嘧啶-2,4-二酮
在0℃，向40.9g(74.0mmol)1a的500ml THF/EtOH(4:1)的溶液中添加221.9ml(443.8mmol)的NaOH水溶液(2N)。移除冰浴后，将混合物搅拌2小时以达到完全转化。在0℃通过添加2N HCl溶液使溶液至中性pH。真空浓缩溶剂并将剩余的水相用250ml的DCM萃取两次。将合并的有机层用MgSO4干燥并蒸发，得到34.8g(定量)的脱保护的产物2a，将其用于以下步骤，无需进一步提纯。
LCMS-方法A：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝1.64
电离方法：ES+：[M+H]+＝469.2
1H-NMR(CDCl3，400MHz)δ[ppm]：9.24-8.77(m，1H)，7.45(br s，1H)，7.41-7.30(m，8H)，7.27(br d，J＝7.78Hz，2H)，6.04(br d，J＝4.02Hz，1H)，4.86(br d，J＝11.67Hz，1H)，4.63-4.51(m，3H)，4.45-4.31(m，2H)，4.31-3.96(m，1H)，3.84(br d，J＝11.29Hz，1H)，3.76-3.64(m，2H)，3.58(d，J＝10.42Hz，1H)，2.96-2.62(m，1H)，1.63-1.51(m，3H)。
2b：1-[(2R,3R,4S,5R)-4-苄基氧基-5-(苄基氧基甲基)-3-羟基-5-(羟基甲基)-四氢呋喃-2-基]嘧啶-2,4-二酮
将9.10g(16.9mmol)的1b溶于240ml THF/EtOH(3:1)。在0℃，添加8.49ml(84.5mmol)的1M NaOH溶液并将溶液搅拌，使其达到室温。1小时后，添加柠檬酸直至达到pH7，并蒸发溶剂。将水性残余物用EtOAc萃取。将有机层分离并用饱和的NaCl溶液洗涤。在用MgSO4干燥后，除去溶剂，得到7.66g(99.7％)的粗产物为无色泡沫，将其使用无需进一步提纯。
LCMS-方法A：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝1.63
电离方法：ES+：[M+H]+＝455.1
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.29(s，1H)，7.69(d，J＝8.2Hz，1H)，7.27-7.41(m，10H)，5.88(d，J＝5.7Hz，1H)，5.57(d，J＝7.2Hz，1H)，5.37(d，J＝8.1Hz，1H)，4.98(t，J＝5.4Hz，1H)，4.80(d，J＝11.7Hz，1H)，4.46-4.58(m，3H)，4.27-4.37(m，1H)，4.00-4.14(m，1H)，3.50-3.69(m，4H)。
2c：N-[9-[(2R,3R,4S,5R)-4-苄基氧基-5-(苄基氧基甲基)-3-羟基-5-(羟基甲基)-四氢呋喃-2-基]-6-氧代-1H-嘌呤-2-基]-2-甲基-丙酰胺
在0℃，向化合物1c(72g，0.11mol)的1.7l THF/EtOH(4:1)溶液中逐滴添加1MNaOH溶液(443mL)。将溶液在0℃搅拌1小时以达到完全转化。通过添加1N HCl将pH调节至7并除去溶剂。将残余物溶于H2O(500mL)并用3x500ml DCM萃取。将有机层合并，经无水Na2SO4干燥并浓缩，得到化合物2c(113g，定量)为无色固体，将其用于下一步骤中，无需进一步提纯。
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：12.07(s,1H)，11.66(s，1H)，8.10(s，1H)，7.42-7.30(m，10H)，5.92(d，J＝6.8Hz，1H)，4.99(s，1H)，4.87-4.84(m，2H)，4.63(d，J＝15.6Hz，1H)，4.56(s，2H)，4.24(d，J＝4.8Hz，1H)，3.69-3.62(m，4H),2.76-2.73(m，1H)，1.13-1.04(m，7H)。
2d：9-[(2R,3R,4S,5R)-4-苄基氧基-5-(苄基氧基甲基)-3-羟基-5-(羟基甲基)-四氢呋喃-2-基]-1H-嘌呤-6-酮
根据对于2b所述的程序，将9.34g(16.65mmol)的1d脱保护，得到7.76g(97.4％)的标题化合物2d作为粗产物，将其使用无需额外提纯。
LCMS-方法A：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝1.53
电离方法：ES+：[M+H]+＝479.3
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)d[ppm]：8.16(s，1H)，7.97-8.04(m，1H)，7.27-7.41(m，10H)，5.97(d，J＝5.75Hz，1H)，5.75(s，1H)，5.03(br s，1H)，4.79-4.92(m，2H)，4.47-4.62(m，3H)，4.24-4.34(m，1H)，3.55-3.70(m，4H)。
2e：N-[9-[(2R,3R,4S,5R)-4-苄基氧基-5-(苄基氧基甲基)-3-羟基-5-(羟基甲基)-四氢呋喃-2-基]嘌呤-6-基]苯甲酰胺
根据对于2b所述的程序，将144g(216mmol)的1e脱保护，得到126g(定量，粗品)的标题化合物2e为无色泡沫，将其使用无需额外提纯。
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.23(s，1H)，8.73(s，1H)，8.59(s，1H)，8.05(br d，J＝7.46Hz，2H)，7.71-7.63(m，1H)，7.61-7.52(m，2H)，7.49-7.23(m，10H)，6.16(d，J＝5.75Hz，1H)，5.85(d，J＝7.46Hz，1H)，5.14-4.99(m，2H)，4.86(d，J＝11.86Hz，1H)，4.63(d，J＝11.74Hz，1H)，4.53(s，2H)，4.38(d，J＝5.14Hz，1H)，3.79-3.57(m，4H)。
3a：1-[(2R,3R,4S,5S)-4-苄基氧基-5-(苄基氧基甲基)-3-羟基-5-(三异丙基甲硅烷基氧基-甲基)四氢呋喃-2-基]-5-甲基-嘧啶-2,4-二酮
将34.7g(74.2mmol)的起始化合物2a和16.8g(244.7mmol)咪唑溶于300ml干燥DCM中。在室温，添加16.2g(18.0ml，81.6mmol)TIPS-氯化物的200ml DCM溶液，并将反应搅拌19小时。在用EtOH淬灭之后，蒸发溶剂并将残余物溶于EtOAc中。将有机溶液用H2O、1N HCl、H2O和饱和的NaHCO3溶液、然后饱和的NaCl溶液洗涤。在用MgSO4干燥后，除去溶剂并将粗产物(47.1g)通过硅胶色谱提纯(正庚烷中10至100％EtOAc)，得到所需的TIPS保护的产物3a为无色泡沫(37.5g，80.9％)。
LCMS-方法A：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝2.22
电离方法：ES+：[M+H]+＝625.3
1H-NMR(CDCl3，400MHz)δ[ppm]：8.52(s，1H)，7.35-7.13(m，11H)，5.88(d，J＝3.89Hz，1H)，4.72-4.63(m，1H)，4.60-4.51(m，1H)，4.46(s，2H)，4.34-4.26(m，1H)，4.22(d，J＝6.27Hz，1H)，3.90(d，J＝10.92Hz，1H)，3.77(d，J＝1.00Hz，2H)，3.63-3.51(m，2H)，1.52(d，J＝0.88Hz，3H)，1.12-0.90(m，21H)。
3b：1-[(2R,3R,4S,5S)-4-苄基氧基-5-(苄基氧基甲基)-3-羟基-5-(三异丙基甲硅烷基氧基-甲基)四氢呋喃-2-基]嘧啶-2,4-二酮
起始于7.66g(16.8mmol)的2b，根据对于3a所述的方案制备标题化合物，在硅胶色谱(正庚烷中20至80％EtOAc)后，得到8.69g(84.5％)的所需甲硅烷基化的产物3b。
LCMS-方法A：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝2.23
电离方法：ES+：[M+H]+＝611.2
1H-NMR(CDCl3，400MHz)δ[ppm]：9.04(s，1H)，7.63(d，J＝8.0Hz，1H)，7.37-7.34(m，8H)，7.26-7.24(m，2H)，5.96(d，J＝4.0Hz，1H)，5.37(d，J＝8.0Hz，1H)，4.77(d，J＝12.0Hz，1H)，4.62(d，J＝12.0Hz，1H)，4.49(s，2H)，4.26(d，J＝8.0Hz，1H)，3.83(dd，J＝8.0，10.0Hz，2H)，3.63(dd，J＝8.0，10.0Hz，2H)，1.15-1.04(m，21H)。
3c：N-[9-[(2R,3R,4S,5S)-4-苄基氧基-5-(苄基氧基甲基)-3-羟基-5-(三异丙基甲硅烷基氧基-甲基)四氢呋喃-2-基]-6-氧代-1H-嘌呤-2-基]-2-甲基-丙酰胺
在0℃、在N2气氛中，向化合物2c(75g，133mmol)的无水DCM(1568mL)溶液中添加咪唑(38g，559mmol)和TIPSCl(35.9g，186mmol)。在10至15℃搅拌12小时后，将溶液倒入冰水(2L)中，并用DCM(3x1.5l)萃取。将有机层合并，并用盐水(1l)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并浓缩。将残余物在硅胶上通过柱色谱提纯(PE/EtOAc 2:1至EtOAc)，得到65g(68％)的标题化合物3c为白色泡沫。
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：12.07(s,1H)，11.61(s，1H)，8.14(s，1H)，7.37-7.22(m，10H)，5.89(d，J＝6.8Hz，1H)，5.72(d，J＝5.6Hz，1H)，4.94-4.93(m，2H)，4.90-4.53(m，3H)，4.19(d，J＝4.4Hz，1H)，3.92-3.88(m，2H)，3.85-3.71(m，2H)，2.78-2.71(m，1H)，1.13-1.05(m，6H)，1.00-0.94(m，21H)。
3d：9-[(2R,3R,4S,5S)-4-苄基氧基-5-(苄基氧基甲基)-3-羟基-5-(三异丙基甲硅烷基氧基-甲基)四氢呋喃-2-基]-1H-嘌呤-6-酮
起始于7.75g(16.2mmol)的2d，根据对于3a所述的方案制备标题化合物，在硅胶色谱(0至100％EtOAc/MeOH(9:1)，在正庚烷中)后，得到8.60g(83.6％)的所需甲硅烷基化的产物3d。
LCMS-方法A：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝2.19
电离方法：ES+：[M+H]+＝635.5
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：12.38(br s，1H)，8.22(s，1H)，8.03(s，1H)，7.26-7.39(m，10H)，5.94(d，J＝6.85Hz，1H)，5.67(d，J＝6.48Hz，1H)，4.98-4.74(m，2H)，4.61-4.48(m，3H)，4.24(d，J＝4.89Hz，1H)，3.97-3.82(m，2H)，3.69(s，2H)，0.80-1.18(m，21H)。
3e：N-[9-[(2R,3R,4S,5S)-4-苄基氧基-5-(苄基氧基甲基)-3-羟基-5-(三异丙基甲硅烷基氧基-甲基)四氢呋喃-2-基]嘌呤-6-基]苯甲酰胺
在室温，向化合物2e(135g，0.232mol)和咪唑(47.4g，0.696mol)在1.35l DCM的混合物中添加TIPSCl(80.6g，0.418mol)的1.35l DCM溶液。将混合物搅拌24小时。在用400ml的EtOH淬灭后，将混合物用1.5l水洗涤。将水层用1l EtOAc萃取两次，且合并的有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩。将粗产物通过快速色谱提纯(PE/EtOAc 2:1)，得到甲硅烷基醚3e(145g，84.8％)为白色泡沫。
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.23(s，1H)，8.74(s，1H)，8.63(s，1H)，8.06(d，J＝7.28Hz，2H)，7.71-7.62(m，1H)，7.60-7.51(m，2H)，7.44-7.23(m，10H)，6.13(d，J＝6.78Hz，1H)，5.77(d，J＝6.40Hz，1H)，5.21-5.10(m，1H)，4.94(d，J＝11.92Hz，1H)，4.66-4.50(m，3H)，4.30(d，J＝4.77Hz，1H)，4.00-3.86(m，2H)，3.74(s，2H)，1.11-0.89(m，21H)。
4a：1-[(2R,3R,4S,5S)-3,4-二羟基-5-(羟基甲基)-5-(三异丙基甲硅烷基氧基甲基)-四氢呋喃-2-基]-5-甲基-嘧啶-2,4-二酮
在高压釜中，将13.4g(21.4mmol)的双-苄基醚3a的100ml EtOH溶液脱气并用氩气吹扫。在添加催化量的Pd(OH)2(20％在碳上)之后，将溶液置于4bar的H2气氛下1小时。将Pd-催化剂滤去，并将滤液蒸发，得到9.74g(定量)的所需脱苄基化的产物为无色泡沫。
LCMS-方法A：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝1.84
电离方法：ES+：[M+H]+＝445.3
1H-NMR(CDCl3，400MHz)δ[ppm]：8.85(s，1H)，7.25(d，J＝1.00Hz，1H)，5.58(d，J＝6.15Hz，1H)，4.71-4.61(m，1H)，4.51-4.44(m，1H)，4.02-3.95(m，1H)，3.94-3.89(m，1H)，3.88-3.77(m，3H)，3.76-3.67(m，1H)，3.22(br dd，J＝6.71，3.83Hz，1H)，1.93(d，J＝1.00Hz，3H)，1.00-1.24(m，21H)。
4b：1-[(2R,3R,4S,5S)-3,4-二羟基-5-(羟基甲基)-5-(三异丙基甲硅烷基氧基甲基)-四氢呋喃-2-基]嘧啶-2,4-二酮
起始于8.69g(14.2mmol)的3b，根据对于4a所述的方案制备标题化合物，得到6.21g(定量，粗品)的所需产物4b，其无需提纯而使用。
LCMS-方法A：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝1.78
电离方法：ES+：[M+H]+＝431.1
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.29(s，1H)，7.91(d，J＝8.0Hz，1H)，5.87(d，J＝8.0Hz，1H)，5.69(d，J＝8.0Hz，1H)，5.28(d，J＝8.0Hz，1H)，5.12(t，J＝4.0Hz，1H)，5.00(d，J＝4.0Hz，1H)，4.19(dd，J＝8.0，12.0Hz，1H)，4.05(t，J＝4.0Hz，2H)，3.81(dd，J＝8.0，12.0Hz，2H)，3.62(d，J＝4.0Hz，2H)，1.05-1.00(m，21H)。
4c：N-[9-[(2R,3R,4S,5S)-3,4-二羟基-5-(羟基甲基)-5-(三异丙基甲硅烷基氧基甲基)-四氢呋喃-2-基]-6-氧代-1H-嘌呤-2-基]-2-甲基-丙酰胺
在-70℃、在N2气氛中，向化合物3c(95g，0.132mol)的无水DCM(300mL)溶液中添加BCl3(921mL)。当TLC检测到完全转化时，将反应溶液在-75℃至-60℃搅拌2小时。向混合物中添加约200ml的NH3在MeOH中的饱和溶液。将pH调节至10-11并减压除去溶剂。将粗产物在硅胶上通过柱色谱提纯(PE/EtOAc 20:1至4:1)，得到脱苄基化的产物4c(51g，产率71.6％)为黄色固体。
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.86(s，2H)，8.27(s，1H)，5.83(d，J＝7.2Hz，1H)，5.42(s，1H)，5.06(s，2H)，4.64(s，1H)，4.17(d，J＝4.0Hz，1H)，3.89(d，J＝10.8Hz，1H)，3.79(d，J＝10.4Hz，1H)，3.67(s，2H)，2.80-2.73(m，1H),1.17-1.08(m，6H)，1.02-0.92(m，21H)。
4d：9-[(2R,3R,4S,5S)-3,4-二羟基-5-(羟基甲基)-5-(三异丙基甲硅烷基氧基甲基)-四氢呋喃-2-基]-1H-嘌呤-6-酮
将8.59g(13.53mmol)的起始化合物3d溶于200ml DCM。在冷却至-70℃至-50℃后，在15分钟内添加74.4ml(74.4mmol)的1M BCl3的甲苯溶液。在-70℃搅拌额外的15分钟后，除去冷却浴并在室温继续搅拌另外的30分钟。将反应溶液随后逐滴添加至180ml的7M NH3的MeOH溶液中。在搅拌20min后，将混合物蒸发并将残余物溶于100ml的DCM/iPrOH(4:1)中。在用饱和的NaHCO3溶液洗涤后，分离各层，并将水层用DCM/iPrOH(4:1)萃取3次。将合并的有机层用MgSO4干燥，过滤并蒸发。将粗产物通过硅胶色谱提纯(DCM中0至10％MeOH)，得到4.14g(67.3％)的标题化合物4d为无色泡沫。
LCMS-方法A：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝1.74
电离方法：ES-：[M-H]-＝453.4
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：12.38(m，1H)，8.33(s，1H)，8.07(s，1H)，5.87(d，J＝7.34Hz，1H)，5.37(d，J＝6.97Hz，1H)，5.01-5.14(m，2H)，4.64-4.76(m，1H)，4.15-4.20(m，1H)，3.81-3.93(m，2H)，3.65(d，J＝5.14Hz，2H)，0.94-1.14(m，21H)。
4e：N-[9-[(2R,3R,4S,5S)-3,4-二羟基-5-(羟基甲基)-5-(三异丙基甲硅烷基氧基甲基)-四氢呋喃-2-基]嘌呤-6-基]苯甲酰胺
在-70℃，向化合物3e(31g，42.0mmol)的620ml DCM的溶液中逐滴添加BCl3(252mL，0.252mol)。将混合物在-70℃、在N2中搅拌30分钟，并温热至15℃。在该温度搅拌另外的30分钟后，将反应混合物小心地倒入600ml 7M MeOH中的NH3，同时保持温度低于-20℃。蒸发后，将残余物溶于3l DCM/iPrOH(4:1)，并用1l水和饱和的NaHCO3溶液洗涤。将合并的水层用2x1l DCM/iPrOH(4:1)萃取，且合并的有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩。将残余物通过快速色谱提纯(PE/EtOAc 1:4)，得到化合物4e(16.9g，产率72.2％)为白色固体。
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.23(s，1H)，8.77(s，1H)，8.72(s，1H)，8.06(d，J＝7.28Hz，2H)，7.70-7.61(m，1H)，7.60-7.51(m，2H)，6.06(d，J＝7.53Hz，1H)，5.48(d，J＝6.90Hz，1H)，5.22-5.11(m，2H)，4.93-4.83(m，1H)，4.24(t，J＝4.77Hz，1H)，3.92(q，J＝10.67Hz，2H)，3.78-3.62(m，2H)，1.14-1.01(m，21H)。
5a：1-[(2R,6S)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-6-(三异丙基甲硅烷基氧基甲基)-1,4-二噁烷-2-基]-5-甲基-嘧啶-2,4-二酮
将2.93g(6.6mmol)的起始材料4a溶于120ml丙酮/H2O(4:1)中。添加1.69g(7.9mmol)NaIO4的50ml H2O溶液，并将混合物在室温搅拌1小时。将沉淀物滤去，并将滤液真空浓缩。将剩余的水溶液用200ml EtOAc萃取。在用H2O和饱和的NaCl溶液洗涤有机层后，将其用MgSO4干燥并减压除去溶剂，得到2.86g(94.1％)的所需产物为无色固体，将其使用无需进一步提纯。
LCMS-方法B-1：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝1.04
电离方法：ES+：[M+H-H2O]+＝443.2
5b：1-[(2R,6S)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-6-(三异丙基甲硅烷基氧基甲基)-1,4-二噁烷-2-基]嘧啶-2,4-二酮
起始于6.21g(14.4mmol)4b，按照4a中所述的方案制备标题化合物，得到6.38g(99％)的所需产物5b作为粗产物，将其使用无需额外提纯。
LCMS-方法B-1：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝1.00
电离方法：ES+：[M+H-H2O]+＝429.5
5c：N-[9-[(2R,6S)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-6-(三异丙基甲硅烷基氧基甲基)-1,4-二噁烷-2-基]-6-氧代-1H-嘌呤-2-基]-2-甲基-丙酰胺
在25℃，向化合物4c(25g，46mmol)在丙酮(485ml)和水(145ml)的混合溶剂中的溶液中添加NaIO4(13.9g，65mmol)的水(150ml)溶液，并将混合物搅拌12小时。真空蒸发溶剂后，将残余物溶于EtOAc(500ml)中，并用饱和的NaHCO3溶液(500ml)和盐水(500ml)洗涤。将有机层用Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩，得到粗制的5c(25.7g，定量)为白色固体，无需提纯将其使用。
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：12.05(br s，1H)，11.79(s，1H)，8.17(s，1H)，7.52(d，J＝5.62Hz，1H)，6.23(s，1H)，5.34(d，J＝5.62Hz，1H)，5.23(s，1H)，4.46(d，J＝9.54Hz，1H)，4.15-4.04(m，1H)，3.93(d，J＝9.78Hz，1H)，3.85(d，J＝10.03Hz，1H)，3.71(d，J＝10.03Hz，1H)，2.85-2.66(m，1H)，1.12(d，J＝6.85Hz，6H)，1.07-0.95(m，21H)。
5d：9-[(2R,6S)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-6-(三异丙基甲硅烷基氧基甲基)-1,4-二噁烷-2-基]-1H-嘌呤-6-酮
将4.14g(9.1mmol)的起始材料4d溶于120ml丙酮/H2O(4:1)中。添加2.63g(12.3mmol)NaIO4的50ml H2O溶液，并将混合物在室温搅拌18小时。将沉淀物滤去，并将滤液真空浓缩。向剩余的水溶液中添加100ml饱和的NaHCO3溶液，并将水层用100ml DCM/iPrOH(4:1)萃取两次。将有机层用MgSO4干燥并减压除去溶剂，得到4.27g(99.7％)的所需产物5d为无色泡沫，将其使用无需进一步提纯。
LCMS-方法A：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝1.82
电离方法：ES+：[M+H-H2O]+＝453.3
6a:1-[(2R,6S)-6-(羟基甲基)-6-(三异丙基甲硅烷基氧基甲基)吗啉-2-基]-5-甲基-嘧啶-2,4-二酮
在室温、在N2气氛中，向化合物5a(31g，67mmol)的无水MeOH(527ml)溶液中添加(NH4)2B2O7.4H2O(19.5g，74mmol)。将混合物搅拌2小时，然后添加AcOH(8.08g，134mmol)、
Figure BDA0002760977440000931
分子筛(62g)和NaBH3CN(8.44g，134mmol)。在N2气氛中，将混合物在室温搅拌12小时直至TLC显示起始材料的完全消耗。真空除去溶剂并将残余物溶于水(200ml)中，并用DCM(3x200ml)萃取。将合并的有机层用Na2SO4干燥并真空浓缩。将残余物在硅胶上通过柱色谱提纯(DCM/MeOH 50:1至10:1)，得到化合物6a(19.5g，67％)为无色固体。
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.27(br s，1H)，7.71-7.52(m，1H)，5.90-5.68(m，1H)，4.68-4.46(m，1H)，4.05-3.83(m，2H)，3.40(br d，J＝5.38Hz，2H)，2.83(br d，J＝9.78Hz，1H)，2.79-2.72(m，1H)，2.66(br d，J＝12.96Hz，2H),1.79(s，3H)，1.22-0.83(m，23H)。
6c：N-[9-[(2R,6S)-6-(羟基甲基)-6-(三异丙基甲硅烷基氧基甲基)吗啉-2-基]-6-氧代-1H-嘌呤-2-基]-2-甲基-丙酰胺
起始于25.7g(46.4mmol)的化合物5c，根据对于6a所述的方案合成标题化合物，得到所需的吗啉6c为无色固体(7.5g，30.6％)。
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.56(br s，1H)，8.13-8.25(m，1H)，5.67-5.81(m，2H)，4.56(br s，1H)，4.08(br d，J＝9.54Hz，1H)，3.83(br d，J＝9.29Hz，1H)，3.39-3.48(m，2H)，3.10(br d，J＝9.54Hz，1H)，2.65-2.93(m，4H)，1.12(br d，J＝6.60Hz，7H)，0.96-1.07(m，21H)。
7a：1-[(2R,6S)-6-(羟基甲基)-4-异丙基-6-(三异丙基甲硅烷基氧基甲基)吗啉-2-基]-5-甲基-嘧啶-2,4-二酮(从6a开始)
在室温、在N2气氛中，向化合物6a(19.5g，45.7mmol)的无水MeOH(390ml)溶液中添加
Figure BDA0002760977440000941
分子筛(39g)、丙酮(13.25g，228mmol)和NaBH3CN(14.4g，228mmol)。在搅拌2小时后，用AcOH(约2.0ml)将混合物调节至pH＝5至6，并当TLC检测到起始材料完全消耗时，继续搅拌12小时。真空除去溶剂并将残余物溶于水(500ml)。在用DCM(3x500ml)萃取后，将有机层合并，用Na2SO4干燥并真空浓缩。在通过硅胶色谱提纯(DCM/MeOH 50:1至10:1)后，获得标题化合物7a为无色固体(17g，81％)。
7a：1-[(2R,6S)-6-(羟基甲基)-4-异丙基-6-(三异丙基甲硅烷基氧基甲基)吗啉-2-基]-5-甲基-嘧啶-2,4-二酮(从5a开始)
将2.85g(6.2mmol)的起始化合物5a、1.26g(1.74ml，12.4mmol)NEt3、3.73g(3.56ml，61.9mmol)的AcOH和924mg(1.34ml，15.5mmol)的异丙基胺溶于60ml干燥MeOH中。在室温，添加1.64g(24.8mmol)的氰基硼氢化钠，并将溶液在60℃搅拌2小时。在冷却至室温后，将反应混合物倒入100ml饱和的NaHCO3溶液，并减压浓缩溶剂。将剩余的水相用EtOAc萃取，将其用饱和的NaHCO3溶液和饱和的NaCl溶液洗涤。在用MgSO4干燥后，蒸发溶剂并将粗产物(3.0g)通过硅胶色谱提纯(正庚烷中10至80％乙酸乙酯)，得到1.76g(60.7％)的所需吗啉7a为无色固体。
LCMS-方法A：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝1.80
电离方法：ES+：[M+H]+＝470.2
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.30(s，1H)，7.63(s，1H)，5.77(dd，J＝10.42，2.89Hz，1H)，4.61(t，J＝5.90Hz，1H)，4.00(d，J＝9.29Hz，1H)，3.74(d，J＝9.03Hz，1H)，3.53-3.41(m，2H)，2.83-2.63(m，3H)，2.26(br d，J＝11.29Hz，1H)，2.21-2.07(m，1H)，1.80(s，3H)，1.14-1.00(m，21H)，0.97(d，J＝6.53Hz，6H)。
7b：1-[(2R,6S)-6-(羟基甲基)-4-异丙基-6-(三异丙基甲硅烷基氧基甲基)吗啉-2-基]嘧啶-2,4-二酮(从5b开始)
在室温，向5b(6.38g，14.3mmol)的150ml MeOH溶液中添加8.62g(8.23ml，142.8mmol)AcOH、2.90g(3.98ml，28.6mmol)NEt3和2.13g(3.09ml，35.7mmol)异丙基胺。1小时后，添加3.78g(57.1mmol)氰基硼氢化钠并在室温继续搅拌1小时，然后在65℃搅拌另外的1小时。将混合物冷却至室温，并添加150ml饱和的NaHCO3溶液，并真空蒸发MeOH。将水溶液用350ml EtOAc萃取，并将有机层用饱和的NaHCO3溶液和饱和的NaCl溶液洗涤。在用MgSO4干燥后，除去溶剂并将粗产物通过硅胶色谱提纯(DCM中0至5％MeOH)，得到3.18g(48.9％)的标题化合物7b为无色固体。
LCMS-方法A：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝1.76
电离方法：ES+：[M+H]+＝456.4
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.32(b s，1H)，7.77(d，J＝8.07Hz，1H)，5.75(dd，J＝9.90，2.81Hz，1H)，5.61(d，J＝8.07Hz，1H)，4.62(t，J＝5.93Hz，1H)，3.99(d，J＝9.29Hz，1H)，3.74(d，J＝9.17Hz，1H)，3.45(dd，J＝10.33，6.05Hz，2H)，2.82(br d，J＝10.27Hz，1H)，2.64-2.77(m，2H)，2.24(d，J＝11.37Hz，1H)，2.03-2.13(m，1H)，1.00-1.10(m，21H)，0.96(m，6H)。
7c：N-[9-[(2R,6S)-6-(羟基甲基)-4-异丙基-6-(三异丙基甲硅烷基氧基甲基)吗啉-2-基]-6-氧代-1H-嘌呤-2-基]-2-甲基-丙酰胺(从6c开始)
起始于7.5g(14.0mmol)6c，根据对于7a(从6a开始)所述的方案合成标题化合物。在硅胶上最后提纯(PE/EtOAc 4:1至1:1)之后，将7c分离为无色固体(5.13g，63％)。
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：12.09(s，1H)，11.56(s，1H)，8.22(s，1H)，5.80(dd，J＝9.79，2.76Hz，1H)，4.60(t，J＝6.27Hz，1H)，4.09(d，J＝8.78Hz，1H)，3.71(d，J＝8.78Hz，1H)，3.48(d，J＝6.27Hz，2H)，2.98(br d，J＝10.04Hz，1H)，2.89-2.65(m，3H)，2.43(t，J＝10.42Hz，1H)，2.34(d，J＝11.29Hz，1H)，1.13(d，J＝6.78Hz，6H)，1.08-1.01(m，21H)，0.99(d，J＝6.27Hz，6H)。
7d：9-[(2R,6S)-6-(羟基甲基)-4-异丙基-6-(三异丙基甲硅烷基氧基甲基)吗啉-2-基]-1H-嘌呤-6-酮(从5d开始)
将4.27g(9.1mmol)的起始化合物5d溶于100ml MeOH。在添加1.84g(2.53ml，18.1mmol)NEt3、5.44g(5.19ml，90.6mmol)AcOH和808mg(1.17ml，13.6mmol)异丙基胺之后，将溶液在室温搅拌1小时。添加1.80g(27.2mmol)氰基硼氢化钠，并将反应在室温搅拌30分钟，并当检测到完全转化时，在60℃搅拌另外的30分钟。向反应混合物中添加100ml的饱和的NaHCO3溶液并蒸发MeOH。将剩余的水相用250ml EtOAc萃取。将有机层用饱和的NaHCO3溶液和饱和的NaCl溶液洗涤，用MgSO4干燥并蒸发。将粗产物通过硅胶色谱提纯(DCM中0至5％MeOH)，得到标题化合物7d为无色固体(2.68g，61.7％)。
LCMS-方法A：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝1.80
电离方法：ES+：[M+H]+＝480.4
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：12.35(br s，1H)，8.31(s，1H)，8.06(s，1H)，5.91(dd，J＝9.90，2.81Hz，1H)，4.57(t，J＝6.05Hz，1H)，4.11(d，J＝9.05Hz，1H)，3.77(d，J＝9.05Hz，1H)，3.40-3.50(m，2H)，2.94-3.02(m，1H)，2.67-2.87(m，2H)，2.54-2.63(m，1H)，2.33(d，J＝11.37Hz，1H)，0.97-1.11(m，27H)。
实施例A.2：
合成方案2
Figure BDA0002760977440000971
8：苯甲酸[(2S,6R)-6-(2,4-二氧代嘧啶-1-基)-4-异丙基-2-(三异丙基甲硅烷基氧基甲基)-吗啉-2-基]甲基酯
将6.00g(13.2mmol)的起始材料7b溶于80ml干燥吡啶中。在室温添加2.80g(2.32ml，19.75mmol)的苯甲酰氯，并将反应搅拌20小时以达到完全转化。蒸发溶剂后，将残余物溶于EtOAc，用2x100ml 10％柠檬酸溶液、H2O、饱和的NaHCO3溶液和饱和的NaCl溶液洗涤。将有机层用MgSO4干燥并蒸发，得到7.99g(定量)的标题化合物为无色泡沫，将其使用无需进一步提纯。
LCMS-方法A：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝2.23
电离方法：ES+：[M+H]+＝560.5
9：苯甲酸[(2S,6R)-6-(4-氨基-2-氧代-嘧啶-1-基)-4-异丙基-2-(三异丙基甲硅烷基氧基甲基)-吗啉-2-基]甲基酯
将起始化合物8(7.99g粗制，13.2mmol)溶于200ml干燥ACN中。在添加22.88g(31.4ml，223.8mmol)NEt3和11.13g(158.0mmol)的1H-1,2,4-三唑之后，将溶液冷却至0℃，并在剧烈搅拌下添加6.06g(3.68ml 39.5mmol)POCl3的50ml干燥ACN溶液。移除冰浴，并将溶液搅拌2小时。在减压下，蒸发约200ml的溶剂，并将剩余的溶液倒入500ml饱和的NaCHO3溶液/H2O(1:1)中。将水性混合物用150ml DCM萃取3次，并将合并的有机萃取物用MgSO4干燥。在蒸发溶剂后，将粗制的中间体(9.1g，黄色泡沫)溶于200ml ACN中，并添加100ml的氨水溶液(32％)。当达到完全转化时，将反应溶液在室温搅拌18小时。减压除去溶剂，并将100ml H2O添加至残余物中。用2x200ml DCM萃取，用MgSO4干燥有机相，并蒸发溶剂，得到7.65g(定量)的粗制化合物9，将其使用无需额外提纯。
LCMS-方法A：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝2.02
电离方法：ES-：[M-H]-＝557.4
10：苯甲酸[(2S,6R)-6-(4-苯甲酰氨基-2-氧代-嘧啶-1-基)-4-异丙基-2-(三异丙基甲硅烷基氧基-甲基)吗啉-2-基]甲基酯
将7.64g(13.2mmol)的起始化合物9溶于130ml干燥吡啶。在室温，添加2.90g(2.40ml，20.5mmol)苯甲酰氯并将溶液搅拌20小时，当达到完全转化时。在蒸发溶剂后，将残余物溶于EtOAc，用2x100ml 10％柠檬酸溶液、H2O、饱和的NaHOC3溶液和饱和的NaCl溶液洗涤。将有机层用MgSO4干燥并蒸发，得到8.88g的粗产物，通过硅胶色谱将其提纯(正庚烷中0至100％EtOAc)，得到6.69g(76.7％)的标题化合物(10)为淡黄色泡沫。
LCMS-方法A：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝2.29
电离方法：ES-：[M-H]-＝661.5
7f：N-[1-[(2R,6S)-6-(羟基甲基)-4-异丙基-6-(三异丙基甲硅烷基氧基甲基)吗啉-2-基]-2-氧代-嘧啶-4-基]苯甲酰胺
将3.63g(5.48mmol)的化合物10溶于45ml吡啶/EtOH(2:1)。在0℃，添加27.4ml(27.4mmol)的1M NaOH溶液。在0℃将溶液搅拌30分钟，并在室温搅拌另外的3小时，以达到完全转化。通过添加柠檬酸单水合物(约2.0g)将pH调节至约6。在35℃将有机溶剂除去并将水溶液用EtOAc萃取。将有机相用150ml 10％柠檬酸溶液、H2O、饱和的NaHCO3和饱和的NaCl溶液洗涤三次。在用MgSO4干燥后，蒸发溶剂。将所得的粗产物(2.73g，黄色泡沫)通过硅胶色谱提纯(正庚烷中10至70％EtOAc)，得到2.25g(73.4％)的标题化合物(7f)为淡黄色泡沫。
LCMS-方法A：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝1.89
电离方法：ES+：[M+H]+＝559.5
实施例A.3：
合成方案3
Figure BDA0002760977440001001
11：苯甲酸[(2S,6R)-4-异丙基-6-(6-氧代-1H-嘌呤-9-基)-2-(三异丙基甲硅烷基氧基甲基)吗啉-2-基]甲基酯
将2.68g(5.59mmol)的起始材料7d、2.53g(3.42ml，19.55mmol)DIPEA和0.34g(2.79mmol)DMAP溶于50ml干燥DCM中。在室温，添加1.18g(0.97ml，8.38mmol)苯甲酰氯，并将反应搅拌18小时以达到完全转化。在添加20ml MeOH之后，蒸发溶剂并将残余物溶于EtOAc，用2x100ml 10％柠檬酸溶液、饱和的NaHCO3溶液和饱和的NaCl溶液洗涤。将有机层相用MgSO4干燥并蒸发，得到3.47g(定量，粗品)的标题化合物(11)为无色泡沫，将其使用无需进一步提纯。
LCMS-方法A：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝2.18
电离方法：ES+：[M+H]+＝584.4
12：苯甲酸[(2S,6R)-6-(6-氯嘌呤-9-基)-4-异丙基-2-(三异丙基甲硅烷基氧基甲基)吗啉-2-基]甲基酯
将起始化合物11(2.86g粗品，4.90mmol)，N,N-二甲基苯胺(1.28g，1.34ml，10.53mmol)和四乙基氯化铵(1.24g，7.35mmol)溶于30ml干燥ACN中。在搅拌下，在室温添加1.70g(1.03ml，11.07mmol)POCl3，并将溶液回流3小时。在冷却至室温后，将混合物倒入150ml饱和的NaHCO3溶液中，并额外添加3.0g的固体NaHCO3。将反应搅拌30分钟，并用100mlDCM萃取。分离各层，并将水相用50ml DCM萃取两次。将合并的有机层用MgSO4干燥并蒸发。在硅胶上提纯(正庚烷中0至50％EtOAc)粗产物后，1.52g(51.4％)的标题化合物12可被分离为淡黄色泡沫。
LCMS-方法A：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝2.33
电离方法：ES+：[M+H]+＝602.4
13：苯甲酸[(2S,6R)-6-(6-苯甲酰氨基嘌呤-9-基)-4-异丙基-2-(三异丙基甲硅烷基氧基甲基)吗啉-2-基]甲基酯
将氯嘌呤12(1.54g，2.56mmol)、苯甲酰胺(646mg，3.84mmol)和Cs2CO3(1.25g，3.84mmol)溶于30ml二噁烷中。在添加Pd(OAc)2(43mg，191.8μmol)和xantphos(111mg，191.8μmol)之后，在100℃将反应溶液在氩气中搅拌1小时，以达到完全转化。将反应冷却至室温，并用50ml EtOAc稀释。将溶液过滤，并将滤液真空蒸发。将粗产物(2.48g)在硅胶上提纯(正庚烷中10至100％EtOAc)，得到1.29g(73.4％)的所需化合物13为无色泡沫。
LCMS-方法A：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝2.26
电离方法：ES+：[M+H]+＝687.6
7e：N-[9-[(2R,6S)-6-(羟基甲基)-4-异丙基-6-(三异丙基甲硅烷基氧基甲基)吗啉-2-基]嘌呤-6-基]苯甲酰胺
根据对于7f所述的方案将1.00g(1.46mmol)的苯甲酸酯13皂化。无需色谱提纯，731mg(86.2％，粗品)的标题化合物7e可被分离为淡黄色泡沫。
LCMS-方法A：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝1.97
电离方法：ES+：[M+H]+＝583.5
实施例A.4：
合成方案4
Figure BDA0002760977440001021
14a：1-[(2R,6S)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-4-异丙基-6-(三异丙基甲硅烷基氧基甲基)吗啉-2-基]-5-甲基-嘧啶-2,4-二酮
将810mg(1.7mmol)的伯醇7a和873mg(1.20ml，8.6mmol)NEt3溶于30ml DCM。在室温，添加716mg(2.1mmol)DMT-Cl，并将反应在室温搅拌2小时。在添加另一0.6当量的DMT-Cl并搅拌过夜之后，反应显示完全转化。将粗产物的溶液直接转移至二氧化硅柱并用正庚烷中0至65％EtOAc提纯，得到1.19g(89.0％)的所需产物(14a)为淡黄色泡沫。
LCMS-方法A：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝2.38
电离方法：ES+：[M+H]+＝772.5
14b：1-[(2R,6S)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-4-异丙基-6-(三异丙基甲硅烷基氧基甲基)吗啉-2-基]嘧啶-2,4-二酮
将1.00g(2.2mmol)7b和1.42g(1.92ml，11.0mmol)的DIPEA溶于30ml DCM。添加948mg(2.7mmol)DMT-氯化物，并将反应在室温搅拌过夜以达到完全转化。在添加Isolute吸附剂之后，除去有机溶剂并将固体材料在二氧化硅上提纯(用正庚烷+0.5％NEt3，正庚烷中0至75％EtOAc进行预处理)，得到1.61g(96.8％)的DMT保护的产物(14b)为淡黄色泡沫。
LCMS-方法A：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝2.34
电离方法：ES+：[M+H]+＝758.3
14c：N-[9-[(2R,6S)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-4-异丙基-6-(三异丙基甲硅烷基氧基甲基)吗啉-2-基]-6-氧代-1H-嘌呤-2-基]-2-甲基-丙酰胺
按照对于14a所述的方案使1.00g(1.77mmol)的起始化合物7c受保护。在硅胶上提纯(DCM中0至5％MeOH)后，将所需的产物(14c)分离为黄色泡沫(1.46g，94.8％)。
LCMS-方法C：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝3.66
电离方法：ES+：[M+H]+＝867.6
14e：N-[9-[(2R,6S)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-4-异丙基-6-(三异丙基甲硅烷基氧基甲基)吗啉-2-基]嘌呤-6-基]苯甲酰胺
将950mg(1.63mmol)的起始材料7e溶于10ml DCM/吡啶(1:1)中。在添加733mg(2.12mmol)DMT-Cl的20ml DCM溶液之后，将反应搅拌1.5小时，以达到完全转化。在蒸发溶剂后，将残余物溶于EtOAc中，并用H2O、2x10％柠檬酸溶液和饱和的NaHCO3溶液洗涤。在用MgSO4干燥后，除去溶剂并将粗产物在二氧化硅上提纯(用正庚烷+0.5％NEt3；正庚烷中0至50％EtOAc进行预处理)，得到1.20g(83.2％)的DMT-醚14e为无色泡沫。
LCMS-方法A：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝2.38
电离方法：ES-：[M-H]-＝883.5
14f：N-[1-[(2R,6S)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-4-异丙基-6-(三异丙基甲硅烷基氧基甲基)吗啉-2-基]-2-氧代-嘧啶-4-基]苯甲酰胺
按照对于14e所述的方案，在干燥吡啶中使2.25g(4.02mmol)的起始材料7f受保护。在二氧化硅上的最终色谱(用正庚烷+0.5％NEt3；正庚烷中0至80％EtOAc进行预处理)后，将3.35g(96.9％)的标题化合物(14f)分离为黄色泡沫。
LCMS-方法A：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝2.40
电离方法：ES+：[M+H]+＝861.6
15a:1-[(2R,6R)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(羟基甲基)-4-异丙基-吗啉-2-基]-5-甲基-嘧啶-2,4-二酮
将1.18g(1.5mmol)的TIPS保护的吗啉14a和6.74g(9.26ml，66.0mmol)三乙胺溶于30ml THF中。在室温，添加12.23g(12.4ml，73.6mmol)NEt3·3 HF，并将反应在65℃搅拌1小时。在室温静置过夜后，添加10ml NMP并将反应在65℃搅拌额外的14小时以达到完全转化。真空浓缩溶剂，并将剩余的NMP溶液添加至H2O/饱和的NaHCO3溶液混合物(1:2)中。将水溶液用EtOAc萃取，并将有机层用H2O和饱和的NaCl溶液洗涤三次。在用MgSO4干燥后，将粗产物通过硅胶色谱提纯(用正庚烷中1％NEt3，正庚烷中10至100％乙酸乙酯进行预处理)，得到645mg(68.8％)的去甲硅烷基化的产物15a为无色泡沫。
LCMS-方法A：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝1.67
电离方法：ES+：[M+H]+＝616.4
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.36(s，1H)，7.53-7.58(m，1H)，7.41(d，J＝7.34Hz，2H)，7.20-7.31(m，7H)，6.87(d，J＝8.80Hz，4H)，5.82(dd，J＝9.66，2.93Hz，1H)，4.61(br s，1H)，3.67-3.79(m，8H)，3.07(s，1H)，2.97-3.10(m，1H)，2.80(br d，J＝9.78Hz，1H)，2.63-2.76(m，2H)，2.17-2.31(m，2H)，1.69(s，3H)，0.95(d，J＝6.60Hz，6H)。
15b：1-[(2R,6R)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(羟基甲基)-4-异丙基-吗啉-2-基]嘧啶-2,4-二酮
将1.60g(2.1mmol)14b溶于20ml NMP中。在添加4.73g(6.50ml，46.3mmol)NEt3和8.41g(8.50ml，50.6mmol)NEt3·3 HF之后，在室温将混合物搅拌15小时，然后在65℃搅拌5小时。将混合物冷却至室温，然后添加250ml饱和的NaHCO3溶液和250ml H2O。在用250mlEtOAc萃取后，将有机层用H2O(2x)和饱和的NaCl溶液洗涤。将有机相用MgSO4干燥，并在二氧化硅上提纯(用正庚烷+0.5％NEt3，正庚烷中0至100％EtOAc进行预处理)，得到所需的醇15b为无色泡沫(1.16g，91.1％)。
LCMS-方法A：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝1.63
电离方法：ES+：[M+H]+＝602.3
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.36(br s，1H)，7.63(d，J＝8.07Hz，1H)，7.40(br d，J＝7.82Hz，2H)，7.20-7.33(m，7H)，6.88(d，J＝8.56Hz，4H)，5.81(br d，J＝7.34Hz，1H)，5.62(d，J＝8.07Hz，1H)，4.62(br s，1H)，3.78-3.95(m，1H)，3.68-3.76(m，7H)，3.11(d，J＝9.05Hz，1H)，2.96(br d，J＝9.05Hz，1H)，2.82(br d，J＝10.27Hz，1H)，2.60-2.76(m，2H)，2.10-2.22(m，2H)，0.94(d，J＝6.36Hz，6H)。
15c：N-[9-[(2R,6R)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(羟基甲基)-4-异丙基-吗啉-2-基]-6-氧代-1H-嘌呤-2-基]-2-甲基-丙酰胺
将1.44g(1.66mmol)的TIPS保护的醇14c溶于17ml THF。在添加1.27g(1.15ml，8.30mmol)的65％吡啶.HF溶液之后，将反应混合物在室温搅拌1小时。在剧烈搅拌下，添加0.9g NaHCO3和10ml H2O并继续搅拌2小时。除去THF并将水溶液用DCM/iPrOH(4:1)萃取10次。将合并的有机层用MgSO4干燥并蒸发，得到0.83g(70.1％，粗品)的15c，将其用于下一步骤中无需进一步提纯。
LCMS-方法C：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝2.11
电离方法：ES-：[M-H]-＝709.5
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：12.09(s，1H)，11.67(s，1H)，8.05(s，1H)，7.38(d，J＝7.34Hz，2H)，7.18-7.30(m，7H)，6.85(d，J＝8.80Hz，4H)，5.92(dd，J＝8.99，3.00Hz，1H)，4.64(t，J＝5.14Hz，1H)，3.71-3.84(m，8H)，2.90-3.08(m，3H)，2.55-2.83(m，4H)，2.31-2.47(m，1H)，1.12(dd，J＝6.79，3.36Hz，6H)，0.96(d，J＝6.48Hz，6H)。
15e：N-[9-[(2R,6R)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(羟基甲基)-4-异丙基-吗啉-2-基]嘌呤-6-基]苯甲酰胺
将1.20g(1.35mmol)的起始化合物14e和1.91g(2.63ml，18.90mmol)NEt3溶于20mlTHF。在添加3.59g(3.63ml，21.60mmol)NEt3·3HF之后，将溶液在65℃加热，然后添加另外的0.95g(1.32ml，9.45mmol)NEt3和1.80g(1.82ml，10.8mmol)NEt3·3HF。将反应混合物在65℃搅拌直至达到完全转化(约10h)。在冷却至室温后，将混合物倒入150ml H2O/饱和的NaHCO3溶液(1:1)中并搅拌30分钟。将水溶液用50DCM萃取3次，用MgSO4干燥并蒸发。在硅胶色谱(正庚烷中10至100％EtOAc)后，835mg(84.9％)的脱保护的产物15e分离为无色泡沫。
LCMS-方法A：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝1.74
电离方法：ES+：[M+H]+＝729.5
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.21(br s，1H)，8.74(s，1H)，8.54(s，1H)，8.04(d，J＝7.62Hz，2H)，7.62-7.67(m，1H)，7.52-7.58(m，2H)，7.37(d，J＝7.34Hz，2H)，7.15-7.29(m，7H)，6.82(d，J＝7.95Hz，4H)，6.16(dd，J＝9.17，2.93Hz，1H)，4.67(t，J＝5.20Hz，1H)，3.86-3.96(m，1H)，3.79(dd，J＝11.00，5.87Hz，1H)，3.69-3.73(m，6H)，3.01-3.15(m，2H)，2.90-2.99(m，2H)，2.68-2.84(m，2H)，2.40(m，1H)，1.00(d，J＝6.60Hz，6H)。
15f：N-[1-[(2R,6R)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(羟基甲基)-4-异丙基-吗啉-2-基]-2-氧代-嘧啶-4-基]苯甲酰胺
将3.35g(3.88mmol)的起始化合物14f用NEt3·3HF如对于15e所述进行处理。在70℃反应20小时后，实现完全转化。如对于15e的后处理和最终提纯，得到2.57g(93.7％)的标题化合物15f为无色泡沫。
LCMS-方法A：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝1.79
电离方法：ES+：[M+H]+＝705.4
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.28(br s，1H)，8.10(br d，J＝7.58Hz，1H)，8.00(d，J＝7.69Hz，2H)，7.58-7.67(m，1H)，7.51(t，J＝7.64Hz，2H)，7.21-7.43(m，10H)，6.89(d，J＝8.80Hz，4H)，5.93(dd，J＝9.41，2.69Hz，1H)，4.66(t，J＝5.26Hz，1H)，3.91(dd，J＝10.94，4.22Hz，1H)，3.71-3.77(m，7H)，3.19(d，J＝9.05Hz，1H)，2.92-3.06(m，2H)，2.65-2.79(m，2H)，2.18(d，J＝11.49Hz，1H)，2.07(t，J＝10.21Hz，1H)，0.95(d，J＝6.36Hz，6H)。
16a：3-[[(2S,6R)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-4-异丙基-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)吗啉-2-基]甲氧基-(二异丙基氨基)膦烷基]氧基-丙腈
在室温、在氩气气氛中，向624mg(1.0mmol)15a和401.0mg(513μl，3.0mmol)N,N-二异丙基乙胺的15ml干燥DCM溶液中添加370.9mg(349.6μl，1.5mmol)2-氰基乙基-N,N-二异丙基氯亚磷酰胺。在搅拌1小时后，将反应通过添加200μl正丁醇淬灭并继续搅拌10分钟。将反应溶液用H2O洗涤，并将水相用DCM萃取一次。在用MgSO4干燥有机层后，除去溶剂并将粗产物通过硅胶色谱提纯(用正庚烷中0.5％NEt3，正庚烷中10至100％甲基-叔丁基醚进行预处理)，得到668mg(80.8％)的所需亚磷酰胺(非对映异构体的混合物)16a为无色泡沫。
LCMS-方法B-2：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝0.82
电离方法：ES+：[M]+＝733.1(M-iPr2N+OH+H+)
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.37.11.36(2x s，1H)，7.60，7.56(2x s，1H)，7.41(m，2H)，7.20-7.32(m，7H)，6.83-6.90(m，4H)，5.88(m，1H)，3.84-4.05(m，2H)，3.74(s，6H)，3.54-3.73(m，2H)，3.40-3.54(m，2H)，3.14(m，1H)，2.95-3.05(m，1H)，2.57-2.84(m，5H)，2.15-2.37(m，2H)，1.76，1.73(2x s，3H)，0.93-1.14(m，18H)。31P-NMR(DMSO-d6，162MHz)δ[ppm]：148.1，147.6。
16b：3-[[(2S,6R)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(2,4-二氧代嘧啶-1-基)-4-异丙基-吗啉-2-基]甲氧基-(二异丙基氨基)膦烷基]氧基丙腈
按照对于16a所述的方案制备标题化合物。起始于1.95g(3.2mmol)的伯醇15b，在硅胶上提纯(用正庚烷+0.5％NEt3，正庚烷中0至80％EtOAc进行预处理)后，将1.70g(65.7％)的所需亚磷酰胺16b分离为无色泡沫。
LCMS-方法A：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝1.85
电离方法：ES+：[M]+＝719.2(M-iPr2N+OH+H+)
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.36(br s，1H)，7.67，7.63(2x d，J＝8.19Hz，1H)，7.35-7.44(m，2H)，7.20-7.32(m，7H)，6.84-6.89(m，4H)，5.81-5.89(m，1H)，5.67，5.63(2x d，J＝8.13Hz，1H)，3.89-4.08(m，2H)，3.73(s，6H)，3.54-3.72(m，2H)，3.41-3.54(m，2H)，3.16(d，J＝9.05Hz，1H)，2.96(t，J＝9.05Hz，1H)，2.84(br d，J＝10.15Hz，1H)，2.55-2.76(m，4H)，2.10-2.33(m，2H)，0.89-1.12(m，18H)。
31P-NMR(DMSO-d6，162MHz)δ[ppm]：148.3，147.6。
16c：N-[9-[(2R,6S)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-[[2-氰基乙氧基-(二异丙基氨基)膦烷基]氧基甲基]-4-异丙基-吗啉-2-基]-6-氧代-1H-嘌呤-2-基]-2-甲基-丙酰胺
将100mg(141μmol)的醇15c、0.2g分子筛
Figure BDA0002760977440001081
和12.7mg(70μmol)二异丙基铵盐四氮唑溶于2.5ml干燥DCM中。在氩气气氛中，添加42.8mg(45μl，138μmol)的2-氰基乙基-N,N,N’,N’-四异丙基亚磷酰二胺，并将溶液在室温搅拌2小时以达到完全转化。在添加饱和的NaHCO3溶液之后，分离有机相，并将水相用DCM萃取。将合并的有机层用饱和的NaCl溶液洗涤，用MgSO4干燥并蒸发。将粗产物在二氧化硅上提纯(用DCM+0.5％NEt3，DCM中0至10％MeOH进行预处理)，得到87mg(67.9％)的标题化合物(16c)为无色泡沫。
LCMS-方法C：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝2.50，2.52
电离方法：ES+：[M-iPr2N+OH+H]+＝828.3
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：12.08(br s，1H)，11.62(br s，1H)，8.09，8.04(2x s，1H)，7.33-7.40(m，2H)，7.18-7.29(m，7H)，6.81-6.87(m，4H)，5.91(m，1H)，3.93-4.07(m，2H)，3.73(s，6H)，3.54-3.72(m，2H)，3.39-3.50(m，2H)，3.11(m，1H)，2.92-3.07(m，2H)，2.54-2.81(m，6H)，2.26-2.38(m，1H)，0.94-1.16(m，18H)，0.83-0.91(m，6H)。
31P-NMR(DMSO-d6，162MHz)δ[ppm]：147.5，146.7。
16e：N-[9-[(2R,6S)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-[[2-氰基乙氧基-(二异丙基氨基)膦烷基]氧基甲基]-4-异丙基-吗啉-2-基]嘌呤-6-基]苯甲酰胺
将820mg(1.13mmol)的15e和584mg(3.38mmol)的二异丙基铵盐四氮唑溶于20ml的干燥DCM中。在氩气的气氛中，添加524mg(1.69mmol)的2-氰基乙基-N,N,N’,N’-四异丙基亚磷酰二胺，并将溶液在室温搅拌。在搅拌过夜后，添加50ml H2O，并分离各层。将水层用30mlDCM萃取一次，并将合并的有机相用MgSO4干燥。在蒸发溶剂后，将粗产物通过硅胶色谱提纯(用正庚烷+0.5％NEt3，正庚烷中0至100％MTB-乙醚/DCM(1:1)进行预处理)，得到913mg(87.3％)的标题化合物(16e)为无色固体。
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.19(s，1H)，8.76，8.74(2x s，1H)，8.61，8.59(2x s，1H)，8.04(d，J＝8.09Hz，2H)，7.64(t，J＝7.37Hz，1H)，7.51-7.60(m，2H)，7.37(m，2H)，7.16-7.28(m，7H)，6.77-6.84(m，4H)，6.19(m，1H)，3.98-4.15(m，2H)，3.71(2x s，6H)，3.56-3.69(m，2H)，3.41-3.56(m，2H)，3.03-3.17(m，2H)，2.89-3.01(m，2H)，2.74-2.88(m，2H)，2.70(t，J＝6.15Hz，1H)，2.59(m，1H)，2.36(m，1H)，0.92-1.18(m，18H)。
31P-NMR(DMSO-d6，162MHz)δ[ppm]：147.0，146.7。
16f：N-[1-[(2R,6S)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-[[2-氰基乙氧基-(二异丙基氨基)膦烷基]氧基甲基]-4-异丙基-吗啉-2-基]-2-氧代-嘧啶-4-基]苯甲酰胺
按照对于16e所述的方案，将550mg(0.78mmol)的伯醇15f亚磷酰化。在硅胶上色谱提纯(用正庚烷+0.5％NEt3，正庚烷中0至100％MTB-乙醚/DCM(1:1)进行预处理)后，将560mg(79.3％)16f分离为无色泡沫。
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.29(br s，1H)，8.12(2x d，J＝7.50Hz，1H)，7.98-8.04(m，2H)，7.63(t，J＝7.40Hz，1H)，7.48-7.55(m，2H)，7.36-7.45(m，3H)，7.21-7.35(m，7H)，6.88(2x d，J＝8.89，4H)，5.95，6.01(2x m，1H)，3.89-4.14(m，2H)，3.74，3.75(2x s，6H)，3.55-3.72(m，2H)，3.39-3.55(m，2H)，3.24(d，J＝8.85Hz，1H)，2.93-3.05(m，2H)，2.68-2.87(m，3H)，2.55-2.64(m，1H)，2.10-2.23(m，2H)，0.90-1.22(m，18H)。
31P-NMR(DMSO-d6，162MHz)δ[ppm]：147.4，146.7。
实施例A.5：
合成方案5
Figure BDA0002760977440001111
17a：苯甲酸[(2S,6R)-4-异丙基-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)-2-(三异丙基甲硅烷基氧基-甲基)吗啉-2-基]甲基酯
将810mg(1.7mmol)的游离醇7a溶于20ml DCM中。在添加1.14g(1.45ml，8.6mmol)DIPEA和294mg(243μl，2.1mmol)苯甲酰氯之后，将溶液在室温搅拌2小时。为了达到完全转化，添加另一0.2当量的苯甲酰氯，并继续搅拌18小时。将反应溶液直接转移至硅胶柱上，用正庚烷中0至65％EtOAc洗脱。获得726mg(73.3％)的苯甲酰化的产物17a为无色泡沫。
LCMS-方法A：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝2.29
电离方法：ES+：[M+H]+＝574.3
17b：苯甲酸[(2S,6R)-6-(3-苯甲酰基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)-4-异丙基-2-(三异丙基甲硅烷基氧基-甲基)吗啉-2-基]甲基酯
如17a中所述，将1.45g(3.18mmol)的伯醇7b用苯甲酰氯处理，得到单苄基化和二苄基化的产物的混合物。因此，将反应混合物蒸发并将粗产物溶于30ml吡啶中。在添加565mg(3.98mmol)的苯甲酰氯和催化量的DMAP之后，将反应溶液在室温搅拌4小时。在蒸发溶剂后，将残余物溶于EtOAc中，并用10％柠檬酸溶液和饱和的NaCl溶液洗涤。将有机层用MgSO4干燥并除去溶剂。最后在二氧化硅上色谱分离(正庚烷中0至35％EtOAc)，得到1.64g(77.8％)的二苯甲酰化的产物17b。
LCMS-方法C：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝3.67
电离方法：ES+：[M+H]+＝664.4
17c：苯甲酸[(2S,6R)-4-异丙基-6-[2-(2-甲基丙酰基氨基)-6-氧代-1H-嘌呤-9-基]-2-(三异丙基甲硅烷基氧基甲基)吗啉-2-基]甲基酯
将0.89g(1.58mmol)的起始化合物7c溶于30ml吡啶中。在添加246mg(203μl，1.73mmol)的苯甲酰氯之后，当检测到完全转化时，将反应溶液在室温搅拌过夜。真空除去溶剂并将残余物溶于EtOAc中。在用H2O洗涤后，将有机相分离，用MgSO4干燥并蒸发。最后在二氧化硅上提纯(DCM中0至5％MeOH)，得到标题化合物17c为无色泡沫(1.01g，95.4％)。
LCMS-方法C：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝3.28
电离方法：ES+：[M+H]+＝669.2
18a：苯甲酸[(2R,6R)-2-(羟基甲基)-4-异丙基-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)吗啉-2-基]甲基酯
将720mg(1.25mmol)17a的15ml THF溶液用1.34g(1.22ml，8.8mmol)吡啶-氟化氢处理。在室温搅拌1小时后，将反应混合物用饱和的NaHCO3溶液处理以达到pH 7.5。减压浓缩溶剂，并将水溶液用DCM萃取两次。将有机层用MgSO4干燥并除去溶剂。将粗产物用50ml的甲苯共蒸馏2次，并将剩余的残余物通过硅胶色谱提纯(正庚烷中0至100％EtOAc)，得到502mg(95.8％)的所需产物(18a)为无色泡沫。
LCMS-方法A：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝1.30
电离方法：ES+：[M+H]+＝418.2
18b：苯甲酸[(2R,6R)-6-(3-苯甲酰基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)-2-(羟基甲基)-4-异丙基-吗啉-2-基]甲基酯
根据对于18a所述的方案，将1.64g(2.47mmol)的甲硅烷基醚17b去甲硅烷基化，得到1.33g的所需产物18b作为粗产物，将其用于以下步骤中无需色谱提纯。
LCMS-方法C：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝1.81
电离方法：ES+：[M+H]+＝508.2
18c：苯甲酸[(2R,6R)-2-(羟基甲基)-4-异丙基-6-[2-(2-甲基丙酰基氨基)-6-氧代-1H-嘌呤-9-基]吗啉-2-基]甲基酯
将1.0g(1.49mmol)的17c溶于10ml DMF中。在添加1.53g(2.10ml，15.0mmol)NEt3和1.48g(1.49ml，9.0mmol)NEt3·3 HF之后，将反应溶液在90℃搅拌2小时。将混合物冷却至室温后，添加2.5g NaHCO3和10ml H2O，并将反应混合物搅拌2小时。真空蒸发溶剂，并将残余物溶于25ml DCM/iPrOH，并用H2O洗涤。将有机相分离，用MgSO4干燥并蒸发。将粗产物在二氧化硅上提纯(DCM中0至10％MeOH)，得到245mg(32.0％)的去甲硅烷基化的产物18c为无色泡沫。
LCMS-方法C：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝1.45
电离方法：ES+：[M+H]+＝513.1
18e：苯甲酸[(2R,6R)-6-(6-苯甲酰氨基嘌呤-9-基)-2-(羟基甲基)-4-异丙基-吗啉-2-基]甲基酯
根据对于18a所述的方案，将1.23g(1.79mmol)的甲硅烷基醚13脱保护，在硅胶色谱(正庚烷中0至100％EtOAc)后得到939mg(98.8％)的标题化合物(18e)。
LCMS-方法C：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝1.60
电离方法：ES-：[M-H]-＝529.3
18f：苯甲酸[(2R,6R)-6-(4-苯甲酰氨基-2-氧代-嘧啶-1-基)-2-(羟基甲基)-4-异丙基-吗啉-2-基]甲基酯
根据对于18a所述的方案，将3.63g(5.48mmol)的甲硅烷基醚10脱保护，在硅胶色谱(DCM中5％MeOH)后得到2.45(88.4％)的标题化合物(18f)。
LCMS-方法A：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝1.53
电离方法：ES+：[M+H]+＝507.3
19a：苯甲酸[(2R,6R)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-4-异丙基-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)吗啉-2-基]甲基酯
将497mg(1.2mmol)的起始化合物18a溶于15ml DCM中。在添加502mg(643μl，3.8mmol)DIPEA和659mg(1.90mmol)DMT-Cl之后，将反应溶液在室温搅拌2小时。将反应混合物真空蒸发并将粗产物在硅胶上提纯(正庚烷中0至100％EtOAc)。将DMT保护的产物19a分离为无色泡沫(779mg，90.9％)。LCMS-方法A：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝2.14
电离方法：ES+：[M+H]+＝720.4
19b：苯甲酸[(2R,6R)-6-(3-苯甲酰基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-4-异丙基-吗啉-2-基]甲基酯
将1.30g(2.41mmol)的伯醇18b和492mg(676μl，4.82mmol)NEt3溶于20ml DCM中。在添加925mg(2.65mmol)DMT-Cl之后，将反应在室温搅拌6小时，然后添加另外的925mg(2.65mmol)DMT-Cl。将反应搅拌72小时。在添加2.0ml正丙醇之后，将溶液搅拌10分钟。将混合物用H2O洗涤，并将有机层分离。在用MgSO4干燥后，真空除去溶剂。将粗产物通过硅胶色谱提纯(正庚烷中0至25％EtOAc)，得到1.74g(89.2％)的所需DMT-醚19b。
LCMS-方法C：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝3.25
电离方法：ES+：[M+H]+＝810.3
19c：苯甲酸[(2R,6R)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-4-异丙基-6-[2-(2-甲基丙酰基氨基)-6-氧代-1H-嘌呤-9-基]吗啉-2-基]甲基酯
将240mg(468μmol)的起始醇18c溶于5.0ml DCM中。在添加95.7mg(131.5μl，936μmol)NEt3和180mg(515μmol)DMT-Cl之后，将反应在室温搅拌3天，以达到完全转化。在添加2.0ml正丙醇之后，将溶液搅拌10分钟。将混合物用H2O洗涤，并将有机层分离。在用MgSO4干燥后，真空除去溶剂。将粗产物通过硅胶色谱提纯(正庚烷中0至25％EtOAc)，得到303mg(79.4％)的所需DMT-醚19c。
LCMS-方法C：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝2.93
电离方法：ES-：[M-H]-＝813.2
19e：苯甲酸[(2R,6R)-6-(6-苯甲酰氨基嘌呤-9-基)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-4-异丙基-吗啉-2-基]甲基酯
将934mg(1.76mmol)的起始材料18e溶于20ml DMC/吡啶(1:1)中。在添加974mg(2.82mmol)DMT-Cl之后，在室温将反应溶液搅拌17小时。真空除去溶剂并将残余物溶于EtOAc中，并用H2O、2x10％柠檬酸溶液、饱和的NaHCO3和NaCl溶液洗涤。将有机相用MgSO4干燥并蒸发。将所得的粗产物(1.77g)溶于20ml EtOAc/乙醚(1:2)。在添加40ml的正戊烷之后，离心出沉淀物并弃去上清液。另重复沉淀程序两次，得到所需的DMT-醚19e为无色固体。LCMS-方法C：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝3.07
电离方法：ES-：[M-H]-＝831.5
19f：苯甲酸[(2R,6R)-6-(4-苯甲酰氨基-2-氧代-嘧啶-1-基)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-4-异丙基-吗啉-2-基]甲基酯
将2.45g(4.84mmol)的18f溶于40ml吡啶中。在添加2.51g(7.26mmol)DMT-Cl之后，将反应混合物在室温搅拌4天。真空除去溶剂并将残余物溶于EtOAc中，并用H2O、2x10％柠檬酸溶液、饱和的NaHCO3溶液和NaCl溶液洗涤。将有机相用MgSO4干燥并蒸发。将粗产物在硅胶上提纯(用正庚烷+0.5％NEt3，正庚烷中0至100％EtOAc进行预处理)，得到3.69g(94.3％)的标题化合物19f为无色泡沫。
LCMS-方法A：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝2.14
电离方法：ES-：[M-H]-＝807.4
20a：1-[(2R,6S)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(羟基甲基)-4-异丙基-吗啉-2-基]-5-甲基-嘧啶-2,4-二酮
将苯甲酰基酯19a(775mg，1.1mmol)溶于20ml THF-甲醇(4:1)中。在室温，添加4.31ml(8.6mmol)的2N NaOH水溶液，并将反应搅拌90分钟。通过添加柠檬酸单水合物将pH调节到7至8，然后减压除去溶剂。将残余物溶于DCM和H2O中。分离有机层，并将水相用DCM萃取。将合并的有机相用MgSO4干燥并蒸发。将粗产物通过硅胶色谱提纯(正庚烷中5至100％EtOAc)，得到663mg(定量)的所需产物(20a)为无色泡沫。
LCMS-方法A：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝1.73
电离方法：ES+：[M+H]+＝616.3
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.29(s，1H)，7.60(d，J＝1.10Hz，1H)，7.39(d，J＝6.93Hz，2H)，7.19-7.33(m，7H)，6.88(d，J＝8.68Hz，4H)，5.60(dd，J＝9.96，2.87Hz，1H)，4.64(t，J＝5.93Hz，1H)，3.74(m，6H)，3.53-3.60(m，1H)，3.44-3.52(m，1H)，3.32-3.37(m，1H)，3.09(d，J＝8.56Hz，1H)，2.76(br d，J＝11.62Hz，1H)，2.61-2.72(m，2H)，2.37(d，J＝11.49Hz，1H)，2.10(t，J＝10.45Hz，1H)，1.78(s，3H)，0.84-0.96(m，6H)。
20b：1-[(2R,6S)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(羟基甲基)-4-异丙基-吗啉-2-基]嘧啶-2,4-二酮
将1.40g(1.73mmol)的起始化合物19b溶于80ml MeOH中。在室温，添加13.83ml(6.91mmol)的0.5M NaOMe的MeOH溶液，并将反应溶液搅拌2小时，以达到完全转化。在添加0.92g柠檬酸之后，除去溶剂。将残余物溶于H2O中，并将水性混合物用DCM/iPrOH(4:1)萃取3次。将合并的有机层用MgSO4干燥并蒸发，得到0.85g(81.2％，粗品)的所需化合物20b，将其用于以下步骤，无需进一步提纯。
LCMS-方法C：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝2.04
电离方法：ES+：[M+H]+＝602.2
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.31(s，1H)，7.75(d，J＝8.07Hz，1H)，7.39(d，J＝7.34Hz，2H)，7.10-7.33(m，8H)，6.88(d，J＝8.31Hz，4H)，5.55-5.64(m，2H)，4.66(t，J＝5.93Hz，1H)，3.74(s，6H)，3.57(dd，J＝11.31，6.79Hz，1H)，3.46(br dd，J＝11.25，5.14Hz，1H)，3.08(d，J＝8.56Hz，1H)，2.54-2.79(m，3H)，2.32-2.39(m，1H)，1.95-2.13(m，1H)，0.86-0.98(m，6H)。
20c：N-[9-[(2R,6S)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(羟基甲基)-4-异丙基-吗啉-2-基]-6-氧代-1H-嘌呤-2-基]-2-甲基-丙酰胺
将260mg(319μmol)的起始材料19c溶于10ml EtOH中。在添加1.0ml(1.0mmol)的1MNaOH溶液之后，将溶液在室温搅拌4小时以达到完全转化。将溶液用1M HCl中和，并真空除去溶剂。将残余物溶于H2O中，并用DCM萃取。将有机相分离，用MgSO4干燥并蒸发。最后在二氧化硅上提纯(DCM中0至10％MeOH)，得到114mg(50.3％)的所需醇20c为黄色固体。
LCMS-方法C：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝2.36
电离方法：ES-：[M-H]-＝709.3
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：12.08(s，1H)，11.52(s，1H)，8.20(s，1H)，7.35-7.43(m，2H)，7.20-7.33(m，7H)，6.83-6.92(m，4H)，5.56(dd，J＝9.60，2.75Hz，1H)，4.59-4.66(m，1H)，3.73(2x s，6H)，3.51-3.62(m，2H)，3.43-3.50(m，1H)，2.88-3.02(m，3H)，2.70-2.82(m，2H)，2.30-2.39(m，1H)，1.11(m，6H)，1.01(d，J＝6.48Hz，3H)，0.97(d，J＝6.48Hz，3H)。
20e：N-[9-[(2R,6S)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(羟基甲基)-4-异丙基-吗啉-2-基]嘌呤-6-基]苯甲酰胺
将起始化合物19e(1.27g，1.52mmol)溶于14ml EtOH/吡啶(1:1)中。在0℃，添加7.59ml(15.19mmol)的1M NaOH溶液，并将反应混合物在室温搅拌1.5小时。在通过添加柠檬酸单水合物(958mg)将pH调节至7后，添加70ml H2O和EtOAc。将有机层分离并用10％柠檬酸溶液(3次)、H2O、饱和的NaHCO3和NaCl溶液洗涤。在用MgSO4干燥后，将有机相蒸发，得到1.08g的粗产物为无色泡沫，将其溶于20ml EtOAc/乙醚(1:1)中。在添加40ml的正戊烷之后，离心出沉淀物并弃去上清液。另重复沉淀程序两次，得到964mg(87.1％)的标题化合物(20e)为无色泡沫。
LCMS-方法C：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝2.42
电离方法：ES-：[M-H]-＝727.5
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.18(s，1H)，8.71(s，1H)，8.69(s，1H)，8.05(d，J＝7.34Hz，2H)，7.61-7.68(m，1H)，7.56(t，J＝7.58Hz，2H)，7.45(d，J＝7.46Hz，2H)，7.28-7.36(m，6H)，7.20-7.28(m，1H)，6.90(dd，J＝8.99，2.26Hz，4H)，5.89(dd，J＝9.84，2.63Hz，1H)，4.69(t，J＝5.99Hz，1H)，3.75(s，6H)，3.45-3.61(m，3H)，3.24-3.30(m，1H)，3.00(br d，J＝10.15Hz，1H)，2.85(br d，J＝11.62Hz，1H)，2.60-2.78(m，2H)，2.45-2.55(m，1H)，0.98(br d，J＝6.48Hz，3H)，0.95(br d，J＝6.48Hz，3H)。
20f：N-[1-[(2R,6S)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(羟基甲基)-4-异丙基-吗啉-2-基]-2-氧代-嘧啶-4-基]苯甲酰胺
根据对于20e所述的程序将3.68g(4.55mmol)19f皂化。将粗产物通过硅胶色谱提纯(正庚烷中20至100％EtOAc)，得到1.72g(53.5％)的20f为淡黄色泡沫。
LCMS-方法A：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝1.81
电离方法：ES-：[M-H]-＝703.3
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.24(s，1H)，8.29(d，J＝7.46Hz，1H)，8.01(d，J＝7.46Hz，2H)，7.62(t，J＝7.40Hz，1H)，7.51(t，J＝7.70Hz，2H)，7.20-7.41(m，10H)，6.88(dd，J＝8.99，2.38Hz，4H)，5.68(dd，J＝9.35，2.38Hz，1H)，4.71(t，J＝6.11Hz，1H)，3.74(s，6H)，3.58-3.69(m，1H)，3.48-3.58(m，1H)，3.35-3.43(m，1H)，3.11(d，J＝8.56Hz，1H)，2.79-2.95(m，2H)，2.66-2.76(m，1H)，2.39-2.47(m，1H)，1.91-2.00(m，1H)，0.96(d，J＝6.54Hz，3H)，0.94(d，J＝6.54Hz，3H)。
21a：3-[[(2R,6R)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-4-异丙基-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)吗啉-2-基]甲氧基-(二异丙基氨基)膦烷基]-氧基丙腈
按照对于16a的方案(方案4)，将764mg(1.2mmol)的起始材料20a转化为所需的亚磷酰胺21a。获得842mg(83.2％，非对映异构体的混合物)为无色泡沫。
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.34，11.32(2x s，1H)，7.59，7.54(2x d，J＝1.10Hz，1H)，7.36-7.43(m，2H)，7.20-7.34(m，7H)，6.89(m，4H)，5.59-5.75(m，1H)，3.44-3.95(m，6H)，3.74(s，6H)，3.36(m，1H)，3.22(m，1H)，2.60-2.85(m，5H)，2.36(m，1H)，2.18(m，1H)，1.78(2x d，J＝8.69Hz，3H)，0.83-1.17(m，18H)。
31P-NMR(DMSO-d6，162MHz)δ[ppm]：148.6，148.3。
21b：3-[[(2R,6R)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(2,4-二氧代嘧啶-1-基)-4-异丙基-吗啉-2-基]甲氧基-(二异丙基氨基)膦烷基]氧基丙腈
按照对于16b的方案，起始于1.36g(2.26mmol)的相应的醇20b，合成标题化合物21b。将1.09g(60.1％)的标题化合物分离为无色泡沫。
LCMS-方法B-1：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝0.80
电离方法：ES+：[M-NiPr2+OH+H]+＝718.3
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.32(br s，1H)，7.71，7.66(2x s，J＝8.13Hz，1H)，7.35-7.42(m，2H)，7.20-7.33(m，7H)，6.83-6.92(m，4H)，5.60-5.70(m，2H)，3.73(s，6H)，3.43-3.95(m，6H)，3.29-3.39(m，1H)，3.22(m，1H)，2.59-2.83(m，5H)，2.33(m，1H)，2.13(m，1H)，0.84-1.21(m，18H)。
31P-NMR(DMSO-d6，162MHz)δ[ppm]：148.5，148.3。
21c：N-[9-[(2R,6R)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-[[2-氰基乙氧基-(二异丙基氨基)膦烷基]氧基甲基]-4-异丙基-吗啉-2-基]-6-氧代-1H-嘌呤-2-基]-2-甲基-丙酰胺
根据对于合成16c所述的方案，在硅胶色谱(正庚烷中0至100％甲基-叔丁基醚，用正庚烷+1％NEt3将柱预处理)后，40mg(56μmol)的起始化合物20c得到23mg(44.9％)的所需亚磷酰胺21c。
LCMS-方法C：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝2.57
电离方法：ES+：[M-NiPr2+OH+H]+＝828.2
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.70-12.30(b s，1H)，11.53(b s，1H)，8.05(s，1H)，7.35-7.45(m，2H)，7.20-7.33(m，7H)，6.82-6.91(m，4H)，5.54-5.68(m，1H)，3.80-3.93(m，0.5H)，3.73，3.72(2x s，6H)，3.68-3.76(m，1.5H)，3.60-3.67(m，2H)，3.35-3.60(m，4H)，3.12(m，1H)，2.57-2.98(m，7H)，0.92-1.13(m，24H)。
31P-NMR(DMSO-d6，162MHz)δ[ppm]：147.6，147.4。
21e：N-[9-[(2R,6R)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-[[2-氰基乙氧基-(二异丙基氨基)膦烷基]氧基甲基]-4-异丙基-吗啉-2-基]嘌呤-6-基]苯甲酰胺
起始于950mg(1.30mmol)的20e，根据对于16e所述的方案(方案4)制备标题化合物，得到1.10g(91.0％)的21e为无色泡沫。
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.19(br s，1H)，8.73，8.71(2x s，1H)，8.63，8.59(2x s，1H)，8.04(d，J＝7.65Hz，2H)，7.64(t，J＝7.34Hz，1H)，7.55(t，J＝7.43Hz，2H)，7.44(d，J＝7.78Hz，2H)，7.21-7.35(m，7H)，6.86-6.93(m，4H)，5.89-5.99(m，1H)，3.80-4.15(m，1H)，3.74(s，6H)，3.63-3.72(m，2H)，3.31-3.60(m，5H)，3.01(br d，J＝10.79Hz，1H)，2.66-2.90(m，4H)，2.59-2.64(m，1H)，2.42-2.47(m，1H)，0.91-1.12(m，18H)。
31P-NMR(DMSO-d6，162MHz)δ[ppm]：147.6，147.5。
21f：N-[1-[(2R,6R)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-[[2-氰基乙氧基-(二异丙基氨基)膦烷基]氧基甲基]-4-异丙基-吗啉-2-基]-2-氧代-嘧啶-4-基]苯甲酰胺
起始于620mg(0.88mmol)的20f，根据对于16e所述的方案(方案4)制备标题化合物，得到681mg(85.5％)的21f为无色泡沫。
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.28(br s，1H)，8.12-8.23(2x d，J＝7.47Hz，1H)，8.01(d，J＝7.65Hz，2H)，7.58-7.67(m，1H)，7.51(t，J＝7.58Hz，2H)，7.35-7.42(m，3H)，7.20-7.35(m，7H)，6.83-6.93(m，4H)，5.71-5.80(2x dd，J＝9.49，2.54Hz，1H)，3.44-4.00(m，6H)，3.74(s，6H)，3.38(m，1H)，3.24-3.33(m，1H)，2.60-2.94(m，5H)，2.33-2.48(m，1H)，2.01-2.09(m，1H)，1.02-1.23(m，12H)，0.83-1.00(m，6H)。
31P-NMR(DMSO-d6，162MHz)δ[ppm]：147.5，147.4。
实施例A.6：
合成方案6
Figure BDA0002760977440001221
22a：1-[(2R,3R,4S,5S)-5-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-3,4-二羟基-5-(三异丙基甲硅烷基氧基甲基)四氢呋喃-2-基]-5-甲基-嘧啶-2,4-二酮
在室温、在N2气氛中，向23.7g(53.4mmol)的起始化合物4a的240ml无水吡啶溶液中添加23.13g(80mmol)DMT-Cl。在搅拌12小时后，真空除去溶剂并将残余物通过硅胶柱色谱提纯(PE/EtOAc 10:1至1:1)，得到16.3g，(41％)的所需DMT保护的产物(22a)为无色固体。
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.34(s，1H)，7.50(d，J＝0.75Hz，1H)，7.42-7.37(m，2H)，7.32(t，J＝7.53Hz，2H)，7.29-7.22(m，6H)，6.90(dd，J＝8.91，2.13Hz，4H)，5.89(d，J＝7.28Hz，1H)，5.45(d，J＝6.53Hz，1H)，5.15(d，J＝5.02Hz，1H)，4.48-4.39(m，1H)，4.31(t，J＝5.14Hz，1H)，3.86-3.80(m，1H)，3.74(s，6H)，1.28(s，3H)，0.98-0.83(m，22H)。
22b:1-[(2R,3R,4S,5S)-5-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-3,4-二羟基-5-(三异丙基甲硅烷基氧基甲基)四氢呋喃-2-基]嘧啶-2,4-二酮
在室温、在N2气氛中，向化合物4b(75g，174mmol)的750ml无水吡啶溶液中添加DMT-Cl(70.8g，209mmol)。将混合物搅拌12小时以达到完全转化。真空除去溶剂，将残余物用500ml的水稀释并用3x500ml EtOAc萃取。将有机层用盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩。将所得的粗产物通过快速色谱在硅胶上提纯(PE/EtOAc 1:1至EtOAc/MeOH20:1)，得到80g(62.6％)的22b为无色泡沫。
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.35(s，1H)，7.61(d，J＝8.28Hz，1H)，7.42-7.36(m，2H)，7.32(t，J＝7.65Hz，2H)，7.28-7.19(m，5H)，6.90(d，J＝8.03Hz，4H)，5.83(d，J＝6.53Hz，1H)，5.48(d，J＝6.02Hz，1H)，5.27(d，J＝8.03Hz，1H)，5.21(d，J＝5.27Hz，1H)，4.33-4.26(m，1H)，4.22(q，J＝6.02Hz，1H)，3.89-3.79(m，2H)，3.74(s，6H)，3.24(d，J＝10.04Hz，1H)，1.01-0.84(m，21H)。
22c：N-[9-[(2R,3R,4S,5S)-5-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-3,4-二羟基-5-(三异丙基甲硅烷基氧基甲基)四氢呋喃-2-基]-6-氧代-1H-嘌呤-2-基]-2-甲基-丙-酰胺
根据对于22b所述的方案，用吡啶中的DMT-Cl保护55.8g(103mmol)的4c，得到50.0g(57.4％)的22c为无色固体。
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：12.12(br s，1H)，11.67(br s，1H)，7.99-7.83(m，1H)，7.38(br d，J＝7.28Hz，2H)，7.32-7.13(m，8H)，6.84(dd，J＝8.78，2.26Hz，4H)，5.86(d，J＝7.03Hz，1H)，5.70-5.45(m，1H)，5.18(br s，1H)，4.73-4.62(m，1H)，4.25(br d，J＝4.77Hz，1H)，3.97(br d，J＝10.29Hz，1H)，3.84(br d，J＝10.29Hz，1H)，3.73(s，6H)，3.20(br d，J＝10.04Hz，1H)，2.76(dt，J＝13.61，6.87Hz，1H)，1.12(d，J＝6.78Hz，6H)，1.01-0.87(m，21H)。
22e：N-[9-[(2R,3R,4S,5S)-5-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-3,4-二羟基-5-(三异丙基甲硅烷基氧基甲基)四氢呋喃-2-基]嘌呤-6-基]苯甲酰胺
根据对于22b所述的方案，用吡啶中的DMT-Cl保护57.0g(102mmol)的4e，得到22e为无色固体(70.0％)。
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.22(s，1H)，8.68-8.58(m，1H)，8.49(s，1H)，8.05(d，J＝7.28Hz，2H)，7.70-7.60(m，1H)，7.59-7.50(m，2H)，7.43(d，J＝7.28Hz，2H)，7.33-7.17(m，7H)，6.86(dd，J＝8.91，1.38Hz，4H)，6.00(d，J＝7.28Hz，1H)，5.53(d，J＝6.78Hz，1H)，5.32(d，J＝4.89Hz，1H)，5.00-4.87(m，1H)，4.34(t，J＝4.89Hz，1H)，4.08-4.04(m，1H)，3.98(d，J＝10.79Hz，1H)，3.73(s，6H)，3.40(d，J＝9.54Hz，1H)，3.30(br d，J＝9.54Hz，1H)，1.12-0.93(m，21H)。
23a：1-[(2R,6S)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-3,5-二羟基-6-(三异丙基甲硅烷基氧基甲基)-1,4-二噁烷-2-基]-5-甲基-嘧啶-2,4-二酮
在室温，向12.6g(16.9mmol)起始材料22a的250ml丙酮/H2O(3:1)溶液中逐滴添加5.05g(23.6mmol)NaIO4的H2O(60ml)水溶液。将混合物搅拌12小时以达到完全转化，并倒入500ml冰水中。将混合物用500ml DCM萃取3次。将有机层合并，并用盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩，得到11.20g(87％)的所需产物23a为白色泡沫，将其用于下一步骤中，无需进一步提纯。
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.62-11.33(m，1H)，7.80-7.65(m，1H)，7.57-7.38(m，3H)，7.33-7.13(m，9H)，6.88-6.73(m，5H)，6.08-5.86(m，1H)，5.71-5.51(m，1H)，5.24-5.06(m，1H)，5.01-4.94(m，1H)，4.29-4.16(m，1H)，3.75-3.70(m，7H)，3.34-3.24(m，1H)，3.06-2.81(m，1H)，2.02-1.59(m，2H)，1.03(m，1H)，1.09-0.74(m，21H)。
23b：1-[(2R,6S)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-3,5-二羟基-6-(三异丙基甲硅烷基氧基甲基)-1,4-二噁烷-2-基]嘧啶-2,4-二酮
根据对于23a所述的方案，77.0g(105mmol)的二醇22b得到80g(定量，粗产物)的标题化合物23b为黄色固体。
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.67-11.36(m，1H)，7.87-7.77(m，1H)，7.76-7.67(m，1H)，7.55-7.41(m，2H)，7.39-7.20(m，8H)，6.94-6.81(m，4H)，5.94-5.87(m，1H)，5.78-5.63(m，1H)，5.59-5.51(m，1H)，5.25-5.08(m，1H)，5.07-4.99(m，1H)，4.32-4.20(m，1H)，3.82-3.70(m，6H)，3.34-3.26(m，1H)，3.15-3.04(m，1H)，2.95-2.86(m，1H)，1.14-0.81(m，22H)。
23c：N-[9-[(2R,6S)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-3,5-二羟基-6-(三异丙基甲硅烷基氧基甲基)-1,4-二噁烷-2-基]-6-氧代-1H-嘌呤-2-基]-2-甲基-丙酰胺
根据对于23a所述的方案，50.0g(59mmol)的二醇22c得到47g(96.1％，粗产物)的标题化合物23c为黄色固体。
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：12.25-12.06(m，1H)，11.78-11.55(m，1H)，8.19(d，J＝8.78Hz，1H)，7.44(br d，J＝7.28Hz，1H)，7.38(br d，J＝6.53Hz，1H)，7.34-7.14(m，10H)，6.99(d，J＝6.78Hz，1H)，6.90-6.71(m，5H)，6.05-5.98(m，1H)，5.74(d，J＝7.78Hz，1H)，5.61-5.53(m，1H)，5.48(q，J＝6.78Hz，1H)，5.24-5.17(m，1H)，5.06(d，J＝6.53Hz，1H)，4.35-4.22(m，1H)，3.83(br d，J＝11.54Hz，1H)，3.72(d，J＝3.26Hz，7H)，3.27(br d，J＝9.29Hz，1H)，3.29-3.23(m，1H)，3.12-3.04(m，1H)，2.91-2.75(m，1H)，1.22-0.76(m，29H)。
23e：N-[9-[(2R,6S)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-3,5-二羟基-6-(三异丙基甲硅烷基氧基甲基)-1,4-二噁烷-2-基]嘌呤-6-基]苯甲酰胺
根据对于23a所述的方案，78.0g(90.6mmol)的二醇22e得到75.2g(94.6％，粗产物)的标题化合物23e为白色固体。
MS(m/z)＝876.2[M+H]+
24a：1-[(2R,6S)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(三异丙基甲硅烷基氧基-甲基)吗啉-2-基]-5-甲基-嘧啶-2,4-二酮
在室温、在N2气氛中，向2.6g(3.4mmol)起始化合物23a的44ml无水MeOH的溶液中添加0.98g(3.7mmol)的(NH4)2B4O7.4H2O。将混合物搅拌2小时，然后添加0.45g(6.8mmol)的AcOH、5.0g
Figure BDA0002760977440001251
分子筛和0.47g(6.8mmol)NaBH3CN。在室温搅拌12小时后，TLC显示起始材料被完全消耗。真空除去溶剂，并将残余物通过硅胶色谱提纯(PE/EtOAc 4:1至1:1)，得到1.59g(64％)的所需吗啉24a为白色泡沫。
MS(m/z)＝752.5[M+Na]+
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.39(s，1H)，7.62(s，1H)，7.43(br d，J＝7.28Hz，2H)，7.33-7.23(m，8H)，6.84(d，J＝8.78Hz，5H)，5.86(br dd，J＝9.91，2.64Hz，1H)，5.89-5.81(m，1H)，4.13(br d，J＝9.54Hz，1H)，3.96(br d，J＝9.54Hz，1H)，3.72(d，J＝0.75Hz，6H)，3.06(br d，J＝9.29Hz，1H)，2.97(br d，J＝9.03Hz，1H)，2.93-2.78(m，2H)，2.76-2.57(m，3H)，1.76(s，3H)，0.98-0.87(m，22H)。
24b：1-[(2R,6S)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(三异丙基甲硅烷基氧基-甲基)吗啉-2-基]嘧啶-2,4-二酮
在25℃、在N2气氛中，向化合物23b(5.0g，6.7mmol)的85ml无水MeOH的溶液中添加(NH4)2B4O7.4H2O(1.93g，7.6mmol)。将混合物搅拌2小时，然后添加0.80g(13.4mmol)的AcOH、10g
Figure BDA0002760977440001261
分子筛和0.84g(13.4mmol)NaBH3CN。在搅拌12小时后，将混合物过滤，并将滤液真空浓缩。将残余物用冰水稀释并用50ml EtOAc萃取3次。将有机层合并，并用盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩。将粗产物在硅胶上通过柱色谱提纯(PE/EtOAc 10:1至1:1)，得到标题化合物24b为白色泡沫(94％)。
MS(m/z)＝738.5[M+H]+
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.44(br s，1H)，7.75(d，J＝8.07Hz，1H)，7.45(br d，J＝7.34Hz，2H)，7.37-7.20(m，7H)，6.89(d，J＝8.80Hz，4H)，5.88(br dd，J＝10.03，2.45Hz，1H)，5.73(d，J＝8.07Hz，1H)，4.17(br d，J＝9.78Hz，1H)，4.11-4.02(m，2H)，3.77(d，J＝0.73Hz，6H)，3.12(br d，J＝9.05Hz，1H)，3.02-2.83(m，3H)，2.70-2.58(m，2H)，1.06-0.90(m，21H)。
24c：N-[9-[(2R,6S)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(三异丙基甲硅烷基-氧基甲基)吗啉-2-基]-6-氧代-1H-嘌呤-2-基]-2-甲基-丙酰胺
根据对于24b所述的方案，将7.0g(8.2mmol)的起始材料23c转化为吗啉化合物24c，在硅胶色谱(PE/EtOAc 5:1至1:1)后将其分离为无色泡沫(73.2％)。MS(m/z)＝825.2[M+H]+
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：12.12(br s，1H)，11.59(s，1H)，8.15(s，1H)，7.40(br d，J＝7.03Hz，2H)，7.30-7.12(m，7H)，6.81(br d，J＝7.78Hz，4H)，5.83(dd，J＝9.66，3.14Hz，1H)，4.23(br d，J＝9.03Hz，1H)，3.92(br d，J＝9.03Hz，1H)，3.72(d，J＝2.76Hz，6H)，2.97-3.18(m，3H)，2.96-2.86(m，2H)，2.80(dt，J＝13.55，6.78Hz，1H)，2.67(br d，J＝12.05Hz，1H)，1.13(t，J＝6.15Hz，6H)，1.03-0.82(m，22H)。
24e：N-[9-[(2R,6S)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(三异丙基甲硅烷基-氧基甲基)吗啉-2-基]嘌呤-6-基]苯甲酰胺
根据对于24b所述的方案，将5.0g(5.7mmol)的起始材料23e转化为吗啉化合物24e，在硅胶色谱(PE/EtOAc 1:4)后将其分离为无色泡沫(73.4％)。MS(m/z)＝843.1[M+H]+
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.22(br s，1H)，8.75(s，1H)，8.66(s，1H)，8.05(d，J＝7.34Hz，2H)，7.70-7.62(m，1H)，7.60-7.51(m，2H)，7.38(br d，J＝6.97Hz，2H)，7.26-7.16(m，7H)，6.78(d，J＝8.93Hz，4H)，6.16(dd，J＝10.03，2.81Hz，1H)，4.26(d，J＝9.66Hz，1H)，4.10-3.98(m，1H)，3.71(d，J＝0.73Hz，6H)，3.28(br d，J＝10.64Hz，1H)，3.16(br d，J＝9.17Hz，1H)，3.06(br d，J＝9.17Hz，1H)，2.98-2.90(m，2H)，2.79(br d，J＝12.47Hz，1H)，1.10-0.82(m，21H)。
实施例A.7：
合成方案7
Figure BDA0002760977440001281
25：(2S,6R)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(2,4-二氧代-嘧啶-1-基)-2-(三异丙基甲硅烷基氧基甲基)吗啉-4-甲酸叔丁基酯
在室温向吗啉24b(50g，69.8mmol)和DIPEA(18g，139.7mol)在500ml DCM中的混合物中逐滴添加Boc2O(22.9g，104.8mol)。在搅拌24小时后，真空除去溶剂并将残余物通过柱色谱提纯(PE/EtOAc 1:1)，得到化合物25(60g，产率93％)为白色泡沫。
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：7.58(d，J＝8.0Hz，1H)，7.45(d，J＝7.2Hz，2H)，7.33-7.26(m，7H)，6.85-6.81(m，4H)，6.02-5.98(dd，J＝10.03.6Hz，1H)，5.77(d，J＝8.0Hz，1H)，4.24-4.11(m，2H)，3.99(d，J＝9.6Hz，1H)，3.80(s，1H)，3.75(m，1H)，3.28-3.20(m，2H)，3.08(d，J＝12.8Hz，1H)，2.69(t，J＝11.4Hz，1H)，1.48(m，9H)，1.03-0.95(m，21H)。
26：(2S,6R)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-[2-氧代-4-(1,2,4-三唑-1-基)嘧啶-1-基]-2-(三异丙基甲硅烷基氧基甲基)吗啉-4-甲酸叔丁基酯
在30℃，向1H-1,2,4-三唑(65g，0.94mol)在650ml ACN中的混合物中逐滴添加POCl3(49.79g，0.31mol)。在冷却至0℃后，逐滴添加DIPEA(198g，1.53mol)并继续在0℃搅拌30分钟。在相同的温度将起始材料25(32g，39.21mmol)一次性添加至混合物中，移去冰浴，并将反应在30℃搅拌3小时。将混合物倒入3l的EtOAc/水(1:2)的混合溶剂中。分离后，将有机层用500ml饱和的NaHCO3溶液和盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩，得到粗制化合物26(40g)为黄色油状物，将其用于下一步骤中，无需进一步提纯。MS(m/z)＝867.5[M+H]+
27：(2S,6R)-6-(4-苯甲酰氨基-2-氧代-嘧啶-1-基)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-2-(三异丙基甲硅烷基氧基甲基)吗啉-4-甲酸叔丁基酯
在0℃，向苯甲酰胺(38g，0.31mol)在380ml二噁烷中的混合物中一次性添加NaH(12.8g，0.31mol)。在30℃搅拌30分钟后，一次性添加三唑26(40g，39.21mmol，粗品)，并将混合物在30℃搅拌1小时。将反应用24l的饱和的NH4Cl溶液淬灭，并用3l EtOAc萃取。将有机层用2l水和盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩，得到54g的粗制化合物为黄色油状物。最后经硅胶色谱(PE/EtOAc 2:1)，得到20.4g(56.6％)的27为黄色泡沫。
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.31(br s，1H)，8.20(br d，J＝7.21Hz，1H)，8.01(br d，J＝7.46Hz，2H)，7.70-7.59(m，1H)，7.58-7.48(m，2H)，7.47-7.36(m，3H)，7.34-7.16(m，7H)，6.87(br d，J＝7.70Hz，4H)，5.96(br dd，J＝10.09，2.63Hz，1H)，4.12(br d，J＝11.25Hz，1H)，4.00-3.83(m，3H)，3.74(s，6H)，3.28-3.16(m，2H)，3.06(br d，J＝9.17Hz，2H)，1.55-1.32(m，9H)，1.11-0.80(m，21H)。
28：N-[1-[(2R,6S)-6-(羟基甲基)-6-(三异丙基甲硅烷基氧基甲基)吗啉-2-基]-2-氧代-嘧啶-4-基]苯甲酰胺
在0℃，向27(13.5g，14.70mmol)的93ml DCM溶液中逐滴添加31ml的TFA。将反应在30℃搅拌16小时。在用饱和的NaHCO3溶液中和至pH＝7-8后，将有机层分离，并将水相用100ml DCM萃取两次。将合并的有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩。将残余物通过柱色谱提纯(EtOAc/EtOH＝30:1)，得到28(2.7g，产率35.6％)为黄色泡沫，以及相应的三氟-乙酸酯为副产物(4.78g，53.1％)，将该副产物溶于186ml THF和62ml EtOH的混合溶剂中。在0℃，添加75.8ml的1M NaOH-水溶液。在搅拌2分钟后，将溶液用饱和柠檬酸溶液中和，用300ml H2O稀释，并用300ml EtOAc萃取。将有机层用盐水洗涤，用Na2SO4干燥并蒸发。通过硅胶色谱提纯(EtOAc/EtOH 30:1)，得到5.2g(68.5％)的28为白色固体。
MS(m/z)＝517.4[M+H+]+
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.26(br s，1H)，8.28(d，J＝7.53Hz，1H)，8.01(d，J＝7.28Hz，2H)，7.67-7.58(m，1H)，7.57-7.47(m，2H)，7.34(d，J＝7.40Hz，1H)，5.86(dd，J＝9.66，2.64Hz，1H)，4.64(br s，1H)，4.01-3.90(m，2H)，3.46(br s，2H)，3.05(dd，J＝11.98，2.57Hz，1H)，3.11-3.00(m，1H)，2.87-2.75(m，1H)，2.74-2.63(m，1H)，2.40-2.27(m，1H)，1.15-0.99(m，21H)。
29：(2S,6R)-6-(4-苯甲酰氨基-2-氧代-嘧啶-1-基)-2-(羟基甲基)-2-(三异丙基甲硅烷基氧基甲基)吗啉-4-甲酸9H-芴-9-基甲基酯
在0℃，向7.0g(13.55mmol)的吗啉28(13.55mmol)的70ml DMF溶液中分批添加5.5g(16.26mmol)的Fmoc-N-羟基琥珀酰亚胺酯。在搅拌16小时后，将溶液倒入100ml的水中并用30ml EtOAc萃取三次。将合并的有机层用盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩。最后，在二氧化硅上提纯(PE/EtOAc 1:2)，得到10.0g(定量)的化合物29，为黄色固体。
MS(m/z)＝739.4[M+H]+
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.26(br s，1H)，8.33(br s，1H)，8.02(br d，J＝7.46Hz，2H)，7.90(d，J＝7.58Hz，2H)，7.64(br t，J＝7.40Hz，3H)，7.57-7.49(m，2H)，7.48-7.40(m，3H)，7.39-7.30(m，2H)，6.11-5.79(m，1H)，4.98(t，J＝6.05Hz，1H)，4.52-4.12(m，4H)，3.89-3.69(m，2H)，3.54(br s，3H)，3.21-3.07(m，1H)，3.04-2.77(m，1H)，1.11-0.89(m，21H)。
30：(2S,6R)-6-(4-苯甲酰氨基-2-氧代-嘧啶-1-基)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-2-(三异丙基甲硅烷基氧基甲基)吗啉-4-甲酸9H-芴-9-基甲基酯
在25℃，向化合物29(13.9g，18.83mmol)的140ml吡啶溶液中添加12.75g(37.62mmol)DMT-Cl。将混合物在25℃搅拌16小时，以达到完全转化。蒸发溶剂后，将残余物溶于200ml EtOAc中，用100ml水和盐水洗涤。将有机相用Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩。将残余物通过柱色谱提纯(PE/EtOAc 1:1)，得到17.3g(88.1％)的化合物30为黄色泡沫。
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.32(br s，1H)，8.21(br s，1H)，8.02(br d，J＝7.58Hz，2H)，7.88(br s，2H)，7.76-7.60(m，3H)，7.59-7.50(m，2H)，7.42(br d，J＝7.21Hz，5H)，7.38-7.19(m，9H)，6.89(br d，J＝8.44Hz，4H)，6.19-5.85(m，1H)，4.28(br s，4H)，3.91(br d，J＝8.80Hz，2H)，3.75(s，6H)，3.23(br s，1H)，3.10(br d，J＝9.05Hz，3H)，1.06-0.78(m，21H)。
24f：N-[1-[(2R,6S)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(三异丙基甲硅烷基氧基甲基)吗啉-2-基]-2-氧代-嘧啶-4-基]苯甲酰胺
在室温，向8.4g(8.07mmol)的30的85ml DCM的溶液中添加17ml哌啶。在完全转化后(约20min)，将反应溶液用饱和的NH4Cl溶液洗涤。将水相用DCM萃取，并将合并的有机层用Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩。将粗产物通过柱色谱提纯(PE/EtOAc 1:4)，得到4.7g(71.2％)的标题化合物24f为白色泡沫。
MS(m/z)＝819.4[M+H]+
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.31(br s，1H)，8.18(d，J＝7.58Hz，1H)，8.01(br d，J＝7.34Hz，2H)，7.67-7.58(m，1H)，7.57-7.47(m，2H)，7.42(br d，J＝7.46Hz，3H)，7.34-7.15(m，7H)，6.86(br d，J＝8.56Hz，4H)，6.04-5.89(m，1H)，4.18(br d，J＝9.54Hz，1H)，4.07(br d，J＝9.54Hz，1H)，3.73(d，J＝1.34Hz，6H)，3.15(br d，J＝9.17Hz，1H)，3.05(br d，J＝10.15Hz，1H)，2.97(br d，J＝9.17Hz，1H)，2.88(br d，J＝12.47Hz，1H)，2.62(brd，J＝12.47Hz，1H)，2.46(br s，1H)，1.08-0.83(m，21H)。
实施例A.8：
合成方案8
Figure BDA0002760977440001321
用于制备化合物31a-31f的还原胺化反应的通用程序A
将1.0g(1.4mmol)的吗啉24a溶于25ml MeOH中，然后添加2.0g分子筛
Figure BDA0002760977440001322
560mg(769μl，5.5mmol)NEt3、827mg(789μl，13.7mmol)AcOH和1.0至3.0当量的相应的醛或酮。在搅拌15分钟后，分四份每30分钟添加344mg(5.5mmol)的氰基硼氢化钠，并将反应在室温搅拌6小时。在静置过夜后，将混合物过滤，并将滤液用25ml饱和的NaHCO3溶液稀释。蒸发MeOH，并将水相用50ml DCM/iPrOH(5:1)萃取。再一次过滤后，将有机相分离，用MgSO4干燥并蒸发。将所得的粗产物用于下一步骤中，无需进一步提纯。
31a：1-[(2R,6S)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-4-甲基-6-(三异丙基甲硅烷基氧基甲基)吗啉-2-基]-5-甲基-嘧啶-2,4-二酮
根据通用程序A，使用3.0当量的甲醛(37％水溶液)，将1.0g的标题化合物31a分离为粗产物，并无需进一步提纯而使用。
LCMS-方法A：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝2.29
电离方法：ES+：[M+H]+＝744.3
31b：1-[(2R,6S)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-4-丁基-6-(三异丙基甲硅烷基氧基甲基)吗啉-2-基]-5-甲基-嘧啶-2,4-二酮
根据通用程序A，使用2.0当量的丁醛，将1.19g的标题化合物31b分离为粗产物，并无需进一步提纯而使用。
LCMS-方法A：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝2.41
电离方法：ES+：[M+H]+＝786.7
31c：1-[(2R,6S)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-4-辛基-6-(三异丙基甲硅烷基氧基甲基)吗啉-2-基]-5-甲基-嘧啶-2,4-二酮
根据通用程序A，使用2.0当量的辛醛，将1.35g的标题化合物31c分离为粗产物，并无需进一步提纯而使用。
LCMS-方法A：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝2.66
电离方法：ES+：[M+H]+＝842.7
31d：1-[(2R,6S)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-4-十六烷基-6-(三异-丙基甲硅烷基氧基甲基)吗啉-2-基]-5-甲基-嘧啶-2,4-二酮
根据通用程序A，使用1.0当量的十六醛，将1.58g的标题化合物31d分离为粗产物，并无需进一步提纯而使用。
31e：1-[(2R,6S)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-4-环己基-6-(三异丙基甲硅烷基氧基甲基)吗啉-2-基]-5-甲基-嘧啶-2,4-二酮
根据通用程序A，使用1.25当量的环己酮，将1.14g的标题化合物31e分离为粗产物，并无需进一步提纯而使用。
LCMS-方法A：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝2.45
电离方法：ES+：[M+H]+＝812.5
31f：1-[(2R,6S)-4-苄基-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(三异丙基甲硅烷基氧基甲基)吗啉-2-基]-5-甲基-嘧啶-2,4-二酮
根据通用程序A，使用1.25当量的苯甲醛，将1.12g的标题化合物31f分离为粗产物，并无需进一步提纯而使用。
LCMS-方法A：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝2.37
电离方法：ES+：[M+H]+＝821.4
31g：1-[(2R,6S)-4-乙酰基-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(三异丙基甲硅烷基氧基甲基)吗啉-2-基]-5-甲基-嘧啶-2,4-二酮
1.0g(1.4mmol)的起始化合物24a溶于25ml DCM中。在添加103mg(99μl，1.7mmol)AcOH、779mg(2.1mmol)HBTU和903mg(1.19ml，6.9mmol)二异丙基-乙胺之后，将反应混合物在室温搅拌4小时，以达到完全转化。将反应溶液用25ml H2O洗涤，并将有机层分离。在用MgSO4干燥后，蒸发溶剂并将粗产物通过硅胶色谱提纯(DCM中0至5％MeOH)，得到1.06g(定量)的标题化合物31g。
LCMS-方法A：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝2.20
电离方法：ES-：[M-H]-＝770.2
31h：1-[(2R,6S)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-4-十六酰基-6-(三异丙基甲硅烷基氧基甲基)吗啉-2-基]-5-甲基-嘧啶-2,4-二酮
按照对于31g的方案，在硅胶色谱(DCM中0至20％MeOH)后，将1.0g(1.4mmol)的起始化合物24a和棕榈酸转化为1.14g(86％)的标题化合物31h。
用于去甲硅烷基化反应以制备化合物32a-32h的通用程序B
将粗产物31a-31h溶于12ml NMP中。在添加2.1g(2.9ml，20.6mmol)NEt3和1.14g(1.15ml，6.9mmol)NEt3·3HF之后，将反应混合物在90℃搅拌2小时。在冷却至室温后，将溶液倒入饱和的NaHCO3溶液中并用EtOAc萃取两次。将有机层用MgSO4干燥并蒸发。将残余物溶于乙腈/H2O并冻干。将所得的粗产物通过硅胶色谱提纯，得到所需的化合物32a-32h。
32a：1-[(2R,6R)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(羟基甲基)-4-甲基-吗啉-2-基]-5-甲基-嘧啶-2,4-二酮
根据通用程序B，起始于粗产物31a，最后硅胶提纯(DCM中0至5％MeOH)得到543mg(66.0％，2个步骤)的标题化合物32a。
LCMS-方法A：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝1.59
电离方法：ES+：[M+H]+＝588.3
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.37(s，1H)，7.52(s，1H)，7.40(d，J＝7.46Hz，2H)，7.19-7.32(m，7H)，6.87(d，J＝8.80Hz，4H)，5.85(dd，J＝9.78，2.93Hz，1H)，4.63(t，J＝5.32Hz，1H)，3.70-3.78(m，7H)，3.65(m，1H)，2.96-3.06(m，2H)，2.81(br d，J＝9.29Hz，1H)，2.63-2.74(m，1H)，2.21(s，3H)，2.06-2.16(m，1H)，1.97-2.04(m，1H)，1.67(s，3H)。
32b：1-[(2R,6R)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-4-丁基-6-(羟基-甲基)吗啉-2-基]-5-甲基-嘧啶-2,4-二酮
根据通用程序B，起始于粗产物31b，最后硅胶提纯(DCM中0至5％MeOH)得到753mg(85.5％，2个步骤)的标题化合物32b。
LCMS-方法A：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝1.75
电离方法：ES+：[M+H]+＝630.3
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.36(s，1H)，7.54(s，1H)，7.40(d，J＝7.46Hz，2H)，7.20-7.34(m，7H)，6.87(d，J＝8.68Hz，4H)，5.85(dd，J＝9.66，2.93Hz，1H)，4.62(t，J＝5.14Hz，1H)，3.70-3.78(m，7H)，3.65(m，1H)，2.96-3.09(m，2H)，2.86(br d，J＝9.05Hz，1H)，2.71-2.80(m，1H)，2.31(br t，J＝7.15Hz，2H)，1.99-2.22(m，2H)，1.67(s，3H)，1.20-1.45(m，4H)，0.88(m，3H)。
32c：1-[(2R,6R)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(羟基甲基)-4-辛基-吗啉-2-基]-5-甲基-嘧啶-2,4-二酮
根据通用程序B，起始于粗产物31c，最后硅胶提纯(0至5％DCM中的MeOH)得到751mg(78.2％，2个步骤)的标题化合物32c。
LCMS-方法A：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝1.99
电离方法：ES+：[M+H]+＝686.4
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.36(b s，1H)，7.54(s，1H)，7.40(d，J＝7.34Hz，2H)，7.19-7.34(m，7H)，6.87(d，J＝8.68Hz，4H)，5.84(dd，J＝9.72，2.87Hz，1H)，4.61(t，J＝5.14Hz，1H)，3.69-3.82(m，7H)，3.64(m，1H)，2.97-3.14(m，2H)，2.82-2.91(m，1H)，2.70-2.76(m，1H)，2.30(br t，J＝7.09Hz，2H)，1.98-2.21(m，2H)，1.67(s，3H)，1.33-1.46(m，2H)，1.26(m，10H)，0.81-0.92(m，3H)。
32d：1-[(2R,6R)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-4-十六烷基-6-(羟基甲基)吗啉-2-基]-5-甲基-嘧啶-2,4-二酮
根据通用程序B，起始于粗产物31d，最后硅胶提纯(DCM中0至5％MeOH)得到677mg(60.6％，2个步骤)的标题化合物32d。
LCMS-方法A：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝2.44
电离方法：ES+：[M+H]+＝798.5
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.36(s，1H)，7.54(s，1H)，7.40(d，J＝7.46Hz，2H)，7.18-7.34(m，7H)，6.86(m，4H)，5.84(m，1H)，4.61(m，1H)，3.69-3.80(m，7H)，3.64(m，1H)，2.97-3.07(m，2H)，2.85(br d，J＝8.80Hz，1H)，2.68-2.77(m，1H)，2.24-2.35(m，2H)，1.99-2.20(m，2H)，1.67(s，3H)，1.35-1.46(m，2H)，1.23(s，26H)，0.82-0.88(m，3H)。
32e：1-[(2R,6R)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-4-环己基-6-(羟基甲基)吗啉-2-基]-5-甲基-嘧啶-2,4-二酮
根据通用程序B，起始于粗产物31e，最后硅胶提纯(DCM中0至5％MeOH)得到701mg(76.4％，2个步骤)的标题化合物32e。
LCMS-方法A：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝1.75
电离方法：ES+：[M+H]+＝656.4
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.35(s，1H)，7.55(s，1H)，7.40(d，J＝7.46Hz，2H)，7.18-7.33(m，7H)，6.87(d，J＝8.93Hz，4H)，5.81(m，1H)，4.59(t，J＝5.20Hz，1H)，3.72-3.78(m，7H)，3.66(m，1H)，3.03(m，2H)，2.84(br d，J＝9.41Hz，1H)，2.66-2.73(m，1H)，2.23-2.39(m，3H)，1.64-1.78(m，4H)，1.68(s，3H)，0.99-1.27(m，6H)。
32f：1-[(2R,6R)-4-苄基-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(羟基-甲基)吗啉-2-基]-5-甲基-嘧啶-2,4-二酮
根据通用程序B，起始于粗产物31f，最后硅胶提纯(DCM中0至5％MeOH)得到591mg(63.6％，2个步骤)的标题化合物32f。
LCMS-方法A：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝1.94
电离方法：ES+：[M+H]+＝664.3
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.33(s，1H)，7.52(s，1H)，7.18-7.39(m，14H)，6.86(d，J＝8.80Hz，4H)，5.86(dd，J＝9.66，2.93Hz，1H)，4.62(t，J＝5.20Hz，1H)，3.83(dd，J＝10.94，4.46Hz，1H)，3.73(s，6H)，3.66(dd，J＝11.00，5.99Hz，1H)，3.47-3.61(m，2H)，3.01(s，2H)，2.72-2.84(m，2H)，2.22-2.31(m，1H)，2.14-2.21(m，1H)，1.66(s，3H)。
32g：1-[(2R,6R)-4-乙酰基-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(羟基-甲基)吗啉-2-基]-5-甲基-嘧啶-2,4-二酮
根据通用程序B，起始于粗产物31g，最后硅胶提纯(DCM中0至5％MeOH)得到600mg(69.6％，2个步骤)的标题化合物32g。
LCMS-方法A：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝1.77
电离方法：ES-：[M-H]-＝614.2
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.43(s，1H)，7.64(s，0.65H)，7.58(s，0.35H)，7.36-7.47(m，2H)，7.20-7.33(m，7H)，6.84-6.91(m，4H)，5.88(dd，J＝10.58，2.75Hz，0.35H)，5.74-5.80(m，0.65H)，5.00(t，J＝4.40Hz，0.65H)，4.63(t，J＝4.83Hz，0.35H)，4.39(br d，J＝10.88Hz，0.65H)，4.22(br d，J＝13.33Hz，0.35H)，3.89(m，0.35H)，3.74(s，6.65H)，3.42-3.65(m，2H)，3.35-3.41(m，1H)，3.00-3.12(m，2H)，2.83-2.98(m，1H)，2.03(m，3H)，1.73(s，3H)。
32h：1-[(2R,6R)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-4-十六酰基-6-(羟基甲基)吗啉-2-基]-5-甲基-嘧啶-2,4-二酮
根据通用程序B，起始于粗产物31h，最后硅胶提纯(DCM中0至5％MeOH)得到874mg(76.9％，2个步骤)的标题化合物32h。
LCMS-方法A：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝2.33
电离方法：ES+：[M+H]+＝304.3(DMT+)
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.42(br s，1H)，7.61，7.57(2x s，1H)，7.41(m，2H)，7.20-7.34(m，7H)，6.87(m，4H)，5.84(m，0.5H),，5.77(m，0.5H)，4.95(m，0.5H)，4.64(m，0.5H)，4.40(m，0.5H)，4.24(m，0.5H)，3.95(m，0.5H)，3.69-3.84(m，0.5H)，3.74(s，6H)，3.41-3.62(m，2H)，3.00-3.15(m，2H)，2.22-2.40(m，2H)，1.72(s，3H)，1.47(br s，2H)，1.23(br s，26H)，，0.82-0.90(m，3H)。
用于制备亚磷酰胺33a-33h的通用程序C
将起始材料32a-32h(1.0mmol)和二异丙基铵盐四氮唑(3.0mmol)溶于25ml干燥DCM。在添加2-氰基乙基N,N,N’,N’-四异丙基-亚磷酰二胺(1.5mmol)之后，在氩气气氛中、在室温搅拌溶液。在1.5小时后，将反应溶液用50ml H2O洗涤。分离各层，并将水相用DCM萃取。将合并的有机层用MgSO4干燥并蒸发。将粗产物通过硅胶色谱提纯(正庚烷中0至100％甲基-叔丁基醚，用正庚烷+1％NEt3将柱预处理)，得到最终的亚磷酰胺33a-33h。
33a：3-[[(2S,6R)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-4-甲基-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)吗啉-2-基]甲氧基-(二异丙基氨基)膦烷基]氧基-丙腈
根据通用程序C，将32a(540mg，0.92mmol)转化为标题化合物33a，将其分离为无色泡沫(568mg，78.5％)。
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.35(br s，1H)，7.54，7.52(2x s，1H)，7.35-7.44(m，2H)，7.20-7.32(m，7H)，6.86(d，J＝8.85Hz，4H)，5.90(m，1H)，4.02(m，1H)，3.79-3.92(m，1H)，3.73(s，6H)，3.39-3.64(m，4H)，2.98-3.12(m，2H)，2.66-2.84(m，3H)，2.53-2.64(m，1H)，2.23，2.21(2x s，3H)，1.99-2.18(m，2H)，1.72，1.69(2x s，3H)，0.91-1.12(m，12H)。
31P-NMR(DMSO-d6，162MHz)δ[ppm]：147.9，147.7。
33b：3-[[(2S,6R)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-4-丁基-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)吗啉-2-基]甲氧基-(二异丙基氨基)膦烷基]氧基-丙腈
根据通用程序C，将32b(750mg，0.98mmol)转化为标题化合物33b，将其分离为无色泡沫(569mg，70.2％)。
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.36(br s，1H)，7.57，7.54(2x s，1H)，7.35-7.44(m，2H)，7.20-7.32(m，7H)，6.86(d，J＝8.78Hz，4H)，5.90(m，1H)，3.83-4.01(m，2H)，3.73(s，6H)，3.53-3.64(m，2H)，3.39-3.52(m，2H)，3.06-3.15(m，1H)，2.96-3.05(m，1H)，2.73-2.90(m，2H)，2.63-2.70(m，1H)，2.59(m，1H)，2.24-2.48(m，2H)，1.99-2.19(m，2H)，1.73，1.70(2x s，3H)，1.27-1.42(m，4H)，0.95-1.18(m，12H)，0.87(m，3H)。
31P-NMR(DMSO-d6，162MHz)δ[ppm]：147.4，147.0。
33c：3-[[(2S,6R)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)-4-辛基-吗啉-2-基]甲氧基二异丙基氨基)膦烷基]氧基-丙腈
根据通用程序C，将32c(745mg，1.0mmol)转化为标题化合物33c，将其分离为无色泡沫(537mg，60.6％)。
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.37，11.36(2x s，1H)，7.56，7.53(2x s，1H)，7.40(m，2H)，7.20-7.31(m，7H)，6.86(d，J＝8.72Hz，4H)，5.89(m，1H)，3.75-4.02(m，2H)，3.73(s，6H)，3.53-3.63(m，2H)，3.41-3.52(m，2H)，3.10(m，1H)，2.95-3.05(m，1H)，2.73-2.89(m，2H)，2.52-2.69(m，2H)，2.23-2.41(m，2H)，1.98-2.18(m，2H)，1.73，1.70(2x s，3H)，1.14-1.49(m，12H)，0.96-1.11(m，12H)，0.85(m，3H)。
31P-NMR(DMSO-d6，162MHz)δ[ppm]：147.3，147.1。
33d：3-[[(2S,6R)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-4-十六烷基-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)吗啉-2-基]甲氧基-(二异丙基氨基)膦烷基]-氧基丙腈
根据通用程序C，将32d(675mg，0.77mmol)转化为标题化合物33d，将其分离为无色泡沫(608mg，79.1％)。
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.36(br s，1H)，7.56，7.53(2x s，1H)，7.37-7.42(m，2H)，7.19-7.31(m，7H)，6.86(d，J＝8.85Hz，4H)，5.89(m，1H)，3.82-4.02(m，2H)，3.73(s，6H)，3.53-3.63(m，2H)，3.39-3.52(m，2H)，3.07-3.13(m，1H)，2.95-3.05(m，1H)，2.71-2.90(m，2H)，2.62-2.68(m，1H)，2.58(m，1H)，2.23-2.39(m，2H)，1.96-2.18(m，2H)，1.73，1.70(2x s，3H)，1.13-1.45(m，28H)，0.96-1.13(m，12H)，0.82-0.88(m，3H)。
31P-NMR(DMSO-d6，162MHz)δ[ppm]：147.3，147.1。
33e：3-[[(2S,6R)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-4-环己基-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)吗啉-2-基]甲氧基-(二异丙基氨基)膦烷基]氧基-丙腈
根据通用程序C，将32e(695mg，0.86mmol)转化为标题化合物33e，将其分离为无色泡沫(560mg，76.2％)。
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.36，11.35(2x br s，1H)，7.57，7.54(2x s，1H)，7.37-7.43(m，2H)，7.21-7.31(m，7H)，6.86(d，J＝8.85Hz，4H)，5.86(m，1H)，3.87-4.02(m，2H)，3.73(s，6H)，3.53-3.65(m，2H)，3.40-3.52(m，2H)，3.12(m，1H)，3.00(m，1H)，2.79-2.88(m，1H)，2.64-2.77(m，2H)，2.54-2.63(m，1H)，2.23-2.41(m，3H)，1.64-1.73(s，7H)，0.91-1.25(m，18H)。
31P-NMR(DMSO-d6，162MHz)δ[ppm]：147.2，146.7。
33f：3-[[(2S,6R)-4-苄基-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)吗啉-2-基]甲氧基-(二异丙基氨基)膦烷基]氧基-丙腈
根据通用程序C，将32f(589mg，0.78mmol)转化为标题化合物33f，将其分离为无色泡沫(668mg，99.0％)。
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.34(s，1H)，7.54，7.53(2x s，1H)，7.19-7.39(m，14H)，6.80-6.89(m，4H)，5.92(m，1H)，4.10(dd，J＝9.94，7.56Hz，0.5H)，4.01(m，0.5H)，3.93(m，0.5H)，3.85(m，0.5H)，3.73(s，6H)，3.35-3.64(m，6H)，3.03-3.12(m，2H)，2.98(d，J＝9.10Hz，1H)，2.72-2.91(m，2H)，2.62-2.69(m，1H)，2.12-2.26(m，2H)，1.71，1.70(2x s，3H)，0.97-1.10(m，9H)，0.91(d，J＝6.71Hz，3H)。
31P-NMR(DMSO-d6，162MHz)δ[ppm]：147.2。
33g：3-[[(2S,6R)-4-乙酰基-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)吗啉-2-基]甲氧基-(二异丙基氨基)膦烷基]氧基-丙腈
根据通用程序C，将32g(598mg，0.89mmol)转化为标题化合物33g，将其分离为无色泡沫(728mg，定量)。粗产物的提纯是通过溶解在10ml叔丁基-甲基醚中，然后加入40ml正戊烷来完成的。将沉淀物离心分离，弃去上清液。另外将该洗涤程序重复两次。
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.41(br s，1H)，7.56-7.71(m，1H)，7.35-7.46(m，2H)，7.20-7.33(m，7H)，6.82-6.91(m，4H)，5.79-5.97(m，1H)，4.27-4.45(m，1H)，3.53-3.97(m，4H)，3.73(s，6H)，3.32-3.50(m，4H)，3.02-3.19(m，2H)，2.80-3.00(m，1H)，2.55-2.74(m，2H)，1.99-2.09(m，3H)，1.69-1.81(m，3H)，1.04-1.13(m，9H)，0.97-1.03(m，3H)。
31P-NMR(DMSO-d6，162MHz)δ[ppm]：147.9，146.9，146.8，146.5。
33h：3-[[(2S,6R)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-4-十六酰基-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)吗啉-2-基]甲氧基-(二异丙基氨基)膦烷基]氧基-丙腈
根据通用程序C，将32h(872mg，1.03mmol)转化为标题化合物33h，将其分离为无色泡沫(915mg，87.7％)。
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.42，11.40(2x s，1H)，7.55-7.71(m，1H)，7.40(m，2H)，7.18-7.34(m，7H)，6.82-6.91(m，4H)，5.73-5.99(m，1H)，4.27-4.50(m，1H)，3.98(m，0.5H)，3.75-3.85(m，1.5H)，3.73(s，6H)，3.53-3.65(m，2H)，3.37-3.52(m，2H)，3.02-3.25(m，2H)，2.82-3.00(m，1H)，2.67(m，1H)，2.58(m，1H)，2.21-2.48(m，2H)，1.69-1.80(m，3H)，1.49(br s，2H)，1.18-1.31(m，26H)，1.04-1.12(m，6H)，0.92-1.03(m，6H)，0.82-0.89(m，3H)。
31P-NMR(DMSO-d6，162MHz)δ[ppm]:147.7，147.3，147.2，146.7。
实施例A.9
合成方案9：
Figure BDA0002760977440001421
--------------------------------------
*：参见合成方案8
90b：1-[(2R,6S)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-4-环己基-6-(三异丙基甲硅烷基氧基甲基)吗啉-2-基]嘧啶-2,4-二酮
在25℃，向24b(25g，33mmol)、环己酮(16.1g，165mmol)和
Figure BDA0002760977440001431
MS(30g)在MeOH(450ml)的混合物中添加AcOH，以调节pH为5至6。在40℃搅拌1小时后，在40℃分批添加NaBH3CN(10.3g，165mmol)。继续搅拌12小时以达到完全转化。将混合物过滤，并将滤液真空浓缩。将残余物用EtOAc(1500ml)稀释，用H2O(2x500ml)和饱和的NaCl溶液(500ml)洗涤。将有机层用Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩。将残余物通过柱色谱提纯(PE/EtOAc 2:1)，得到28g(82％)的90b为无色泡沫。
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.42(br s，1H)，7.71(d，J＝8.1Hz，1H)，7.41(br d，J＝7.5Hz，2H)，7.31-7.19(m，7H)，6.85(d，J＝8.8Hz，4H)，5.82(br dd，J＝2.6，9.8Hz，1H)，5.73(d，J＝8.1Hz，1H)，4.14(br d，J＝8.9Hz，1H)，3.93(br d，J＝8.8Hz，1H)，3.74(d，J＝2.0Hz，6H)，3.13(br d，J＝9.4Hz，1H)，2.99-2.83(m，2H)，2.72(br d，J＝10.8Hz，1H)，2.31-2.17(m，3H)，1.78-1.48(m，5H)，1.32-1.09(m，6H)，1.01-0.83(m，21H)。
91b：1-[(2R,6R)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-4-环己基-6-(羟基甲基)吗啉-2-基]嘧啶-2,4-二酮
在室温，向化合物90b(28g，35.1mmol)的THF(280ml)溶液中添加NEt3(35g，351mmol)和NEt3·3 HF(56.3g，351mmol)。在70℃、在N2气氛中搅拌16小时后，通过TLC可检测到完全脱保护。将混合物真空浓缩并将残余物用EtOAc(500ml)稀释。将有机溶液用水(2x200 ml)和饱和的NaCl溶液(200ml)洗涤，用Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩。将粗产物通过柱色谱提纯(PE/EtOAc 1:2)，得到20g(88.8％)的标题化合物91b为无色泡沫。
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.41(br s，1H)，7.66(d，J＝8.1Hz，1H)，7.47-7.40(m，2H)，7.36-7.21(m，7H)，6.92(br d，J＝8.7Hz，4H)，5.84(br dd，J＝2.3，9.4Hz，1H)，5.65(br d，J＝7.9Hz，1H)，4.67(br s，1H)，3.88(br d，J＝10.9Hz，1H)，3.78(s，6H)，3.72(br d，J＝10.5Hz，1H)，3.15(br d，J＝9.0Hz，1H)，3.10-2.96(m，2H)，2.91(br d，J＝9.8Hz，1H)，2.73(br d，J＝11.5Hz，1H)，2.35-2.18(m，3H)，1.73(br s，4H)，1.32-1.10(m，9H)。
92b：3-[[(2S,6R)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-4-环己基-6-(2,4-二氧代嘧啶-1-基)吗啉-2-基]甲氧基-(二异丙基氨基)膦烷基]-氧基丙腈
在氩气气氛中，向91b(14g，22.4mmol)的DCM(150ml)溶液中添加DIPEA(11.5g，89.8mmol)和3-[氯-(二异丙基氨基)膦烷基]氧基丙腈(6.9g，29.2mmol)。将溶液在13℃搅拌0.5小时以达到完全转化。将反应混合物真空浓缩至约50ml的体积，并在二氧化硅上提纯(PE/EtOAc 2:1)，得到12.0g(65.5％)92b为无色泡沫。
LCMS-方法C：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝2.60
电离方法：ES+：[M+H-iPr2N+OH]+＝759.5
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)11.34(br s，1H)，7.59-7.69(2x d，J＝8.0Hz，1H)，7.35-7.44(m，2H)，7.20-7.32(m，7H)，6.87(m，4H)，5.84(m，1H)，5.59-5.68(2x d，J＝8.1Hz，1H)，3.99-4.09(m，1H)，3.93(m，1H)，3.73(s，6H)，3.54-3.68(m，2H)，3.40-3.53(m，2H)，3.16(br d，J＝8.9Hz，1H)，2.96(t，J＝9.5Hz，1H)，2.88(m，1H)，2.66-2.80(m，2H)，2.60(m，1H)，2.15-2.35(m，3H)，1.69(m，4H)，1.53(m，1H)，0.95-1.21(m，17H)。
31P-NMR(DMSO-d6，162MHz)δ[ppm]：147.4，146.7。
90c：N-[9-[(2R,6S)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-4-环己基-6-(三异丙基甲硅烷基氧基甲基)吗啉-2-基]-6-氧代-1H-嘌呤-2-基]-2-甲基-丙酰胺
按照对于合成90b所述的方案，在硅胶提纯(PE/EtOAc 1:1)后，35g(42.4mmol)的起始材料24c得到32g(64.7％)的所需产物90c为无色泡沫。
LCMS-方法D：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝1.18
电离方法：ES+：[M+H]+＝907.5
91c：N-[9-[(2R,6R)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-4-环己基-6-(羟基甲基)吗啉-2-基]-6-氧代-1H-嘌呤-2-基]-2-甲基-丙酰胺
按照对于合成91b所述的方案，在硅胶提纯(PE/EtOAc 1:2)后，32g(35.3mmol)的起始材料90c得到21g(79％)的所需产物91c为无色泡沫。
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：12.10(s，1H)，11.68(s，1H)，8.04(s，1H)，7.38(d，J＝7.3Hz，2H)，7.31-7.20(m，7H)，6.85(d，J＝8.7Hz，4H)，5.91(dd，J＝3.1，8.8Hz，1H)，4.63(t，J＝5.2Hz，1H)，3.87-3.78(m，1H)，3.74(s，7H)，3.06-2.94(m，3H)，2.84-2.65(m，3H)，2.43(d，J＝11.6Hz，1H)，2.37-2.28(m，1H)，2.37-2.28(m，1H)，1.72(br s，4H)，1.56(br d，J＝10.8Hz，1H)，1.27-1.02(m，13H)。
92c：N-[9-[(2R,6S)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-[[2-氰基乙氧基-(二异丙基氨基)膦烷基]氧基甲基]-4-环己基-吗啉-2-基]-6-氧代-1H-嘌呤-2-基]-2-甲基-丙酰胺
按照对于合成92b所述的方案，在室温的15分钟的反应时间和硅胶色谱(PE/EtOAc1:1)后，20g(26.6mmol)的起始材料91c得到20g(79％)的所需产物92c为无色泡沫。
LCMS-方法C：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝2.70，2.73
电离方法：ES+：[M+H-iPr2N+OH]+＝868.5
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)12.08(br s，1H)，11.63(br s，1H)，8.07，8.03(2x s，1H)，7.37(d，J＝8.2Hz，2H)，7.18-7.29(m，7H)，6.79-6.87(m，4H)，5.89(m，1H)，3.92-4.11(m，2H)，3.72-3.74(m，6H)，3.55-3.72(m，2H)，3.38-3.51(m，2H)，3.10(m，1H)，2.96-3.05(m，2H)，2.66-2.93(m，4H)，2.55-2.62(m，1H)，2.27-2.45(m，2H)，1.71(m，4H)，1.55(m，1H)，0.83-1.29(m，23H)。
31P-NMR(DMSO-d6，162MHz)δ[ppm]：147.5，146.7。
90e：N-[9-[(2R,6S)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-4-环己基-6-(三异丙基甲硅烷基氧基甲基)吗啉-2-基]嘌呤-6-基]苯甲酰胺
按照对于合成90b所述的方案，在硅胶提纯(PE/EtOAc 2:1)后，58g(68.8mmol)的起始材料24e得到49g(77％)的所需产物90e为无色泡沫。
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.21(br s，1H)，8.77(s，1H)，8.66(s，1H)，8.06(br d，J＝7.2Hz，2H)，7.68-7.61(m，1H)，7.60-7.52(m，2H)，7.38(dd，J＝1.6，7.8Hz，2H)，7.26-7.15(m，7H)，6.76(dd，J＝3.1，9.0Hz，4H)，6.16(dd，J＝3.1，9.7Hz，1H)，4.29(d，J＝9.0Hz，1H)，3.95(d，J＝8.8Hz，1H)，3.70(d，J＝1.0Hz，6H)，3.17-3.02(m，3H)，2.94(d，J＝9.3Hz，1H)，2.83(br d，J＝11.1Hz，1H)，2.36-2.30(m，1H)，1.82-1.70(m，4H)，1.55(brd，J＝11.2Hz，1H)，1.34-1.15(m，8H)，1.04-0.91(m，23H)。
91e：N-[9-[(2R,6R)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-4-环己基-6-(羟基甲基)吗啉-2-基]嘌呤-6-基]苯甲酰胺
按照对于合成91b所述的方案，在12小时的反应时间以及硅胶色谱(PE/EtOAc 1:2)后，49g(53.0mmol)的起始材料90e得到38g(88％)的所需产物91e为无色泡沫。
LCMS-方法D：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝0.94
电离方法：ES+：[M+H]+＝769.4
92e：N-[9-[(2R,6S)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-[[2-氰基乙氧基-(二异丙基氨基)膦烷基]氧基甲基]-4-环己基-吗啉-2-基]嘌呤-6-基]苯甲酰胺
按照对于合成92b所述的方案，在室温15分钟的反应时间以及硅胶色谱(PE/EtOAc1:1)后，22g(31.2mmol)的起始材料91e得到22.3g(80.5％)的所需产物92e为无色泡沫。
LCMS-方法C：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝2.78
电离方法：ES+：[M+H-iPr2N+OH]+＝886.6
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)11.18(s，1H)，8.75，8.73(2x s，1H)，8.59，8.57(2x s，1H)，8.04(d，J＝7.8Hz，2H)，7.64(t，J＝7.3Hz，1H)，7.55(t，J＝7.6Hz，2H)，7.37(m，2H)，7.17-7.27(m，7H)，6.77-6.84(m，4H)，6.18(m，1H)，3.97-4.17(m，2H)，3.71(m，6H)，3.56-3.71(m，2H)，3.43-3.56(m，2H)，2.92-3.15(m，4H)，2.78-2.91(m，1H)，2.70(t，J＝6.0Hz，1H)，2.55-2.62(m，1H)，2.31-2.47(m，2H)，1.74(m，4H)，1.55(m，1H)，0.90-1.29(m，17H)。
31P-NMR(DMSO-d6，162MHz)δ[ppm]：147.0，146.7。
实施例A.10
合成方案10：
Figure BDA0002760977440001471
93：1-[(2R,6S)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-4-环己基-6-(三异丙基甲硅烷基氧基甲基)吗啉-2-基]-4-(1,2,4-三唑-1-基)嘧啶-2-酮
在20℃，向1,2,4-三唑(41.5g，0.601mol)的ACN(415ml)的混合物中逐滴添加POCl3(30.58g，0.20mol)。在0℃，小心添加DIPEA(126g，0.977mol)，并在0℃继续搅拌5小时，然后一次性添加起始材料90b(20g，25.0mmol)。在20℃将溶液搅拌3小时，以达到完全转化。将反应混合物倒入EtOAc(500ml)和水(1l)中。将有机层分离，并将水相用EtOAc(2x200ml)萃取。将合并的有机相用饱和的NaHCO3溶液(500ml)和饱和的NaCl溶液(500ml)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩，得到标题化合物93(29g，粗品)为黄色泡沫，将其使用无需进一步提纯。
90f：N-[1-[(2R,6S)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-4-环己基-6-(三异丙基甲硅烷基氧基甲基)吗啉-2-基]-2-氧代-嘧啶-4-基]苯甲酰胺
在0℃，向苯甲酰胺(30.3g，0.251mol)的二噁烷(310ml)溶液中分批添加NaH(10g，251mmol)。在20℃搅拌30分钟后，添加三唑93(29g，粗产物25.0mmol)，并继续搅拌2小时以达到完全转化。将反应混合物倒入EtOAc(500ml)和饱和的NH4Cl溶液(8l)中。将水层分离并用EtOAc(2x500ml)萃取。将合并的有机相用水(2x500ml)和饱和的NaCl溶液(500ml)洗涤，经无水Na2SO4干燥并真空浓缩。将残余物通过柱色谱提纯(PE/EA 5:1)，得到90f(16g，70.8％)为黄色泡沫。
LCMS-方法E：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝1.16
电离方法：ES+：[M+H]+＝901.6
91f：N-[1-[(2R,6R)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-4-环己基-6-(羟基甲基)吗啉-2-基]-2-氧代-嘧啶-4-基]苯甲酰胺
按照对于合成91b所述的方案，在16小时的反应时间以及硅胶色谱(PE/EtOAc 1:1)后，40g(44.4mmol)的起始材料90f得到24g(72.7％)的所需产物91f为无色泡沫。
LCMS-方法E：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝0.92
电离方法：ES+：[M+H]+＝745.3
92f：N-[1-[(2R,6S)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-[[2-氰基乙氧基-(二异丙基氨基)膦烷基]氧基甲基]-4-环己基-吗啉-2-基]-2-氧代-嘧啶-4-基]苯甲酰胺
按照对于合成92b所述的方案，在室温15分钟的反应时间以及硅胶色谱(PE/EtOAc1:1)后，16g(22.8mmol)的起始材料91f得到17g(65.5％)的所需产物92f为无色泡沫。
LCMS-方法C：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝2.92
电离方法：ES+：[M+H-iPr2N+OH]+＝862.5
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)11.29，11.26(2x br s，1H)，8.14，8.09(2x br d，J＝7.6Hz，1H)，8.01(br d，J＝7.8Hz，2H)，7.63(m，1H)，7.51(t，J＝7.3Hz，2H)，7.35-7.45(m，3H)，7.21-7.34(m，7H)，6.88(m，4H)，5.96(m，1H)，3.94-4.15(m，2H)，3.74(s，6H)，3.55-3.69(m，2H)，3.41-3.53(m，2H)，3.19-3.28(m，1H)，2.95-3.08(m，2H)，2.66-2.92(m，2H)，2.52-2.64(m，1H)，2.32(m，1H)，2.13-2.28(m，2H)，1.70(m，4H)，1.54(m，1H)，0.91-1.27(m，17H).
31P-NMR(DMSO-d6，162MHz)δ[ppm]：147.5，146.7。
实施例A.11
合成方案11：
Figure BDA0002760977440001501
94a：1-[(2R,6S)-4-环己基-6-(羟基甲基)-6-(三异丙基甲硅烷基氧基甲基)-吗啉-2-基]-5-甲基-嘧啶-2,4-二酮
按照对于合成二噁烷类似物40e所述的方案，用二氯乙酸将5.09g(6.26mmol)的DMT-醚90a脱保护。在二氧化硅上色谱提纯(DCM中0至10％MeOH)后，将所需的产物94a分离为无色泡沫(3.07g，96.0％)。
LCMS-方法C：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝2.47
电离方法：ES+：[M+H]+＝510.3
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.29(s，1H)，7.61(s，1H)，5.75(dd，J＝9.9，2.7Hz，1H)，4.60(t，J＝6.0Hz，1H)，3.97(d，J＝9.3Hz，1H)，3.77(d，J＝9.3Hz，1H)，3.38-3.53(m，2H)，2.78(m，2H)，2.15-2.38(m，3H)，1.78(s，3H)，1.65-1.76(m，4H)，1.50-1.59(m，1H)，1.13-1.27(m，5H)，0.99-1.13(m，21H)。
95a：苯甲酸[(2S,6R)-4-环己基-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)-2-(三异-丙基甲硅烷基氧基甲基)吗啉-2-基]甲基酯
将3.05g(6.0mmol)的起始材料94a溶于60ml无水吡啶。在室温，添加1.06g(877.6μl，7.5mmol)苯甲酰氯和745.9mg(6.0mmol)DMAP，并将溶液搅拌4小时。在添加额外的212.0mg(175.5μl，1.5mmol)苯甲酰氯之后，当检测到完全转化时，将溶液搅拌过夜。真空除去溶剂并将残余物溶于EtOAc中。将溶液用5％柠檬酸溶液、饱和的NaHCO3溶液和饱和的NaCl溶液洗涤，用MgSO4干燥并蒸发。在二氧化硅上提纯(DCM中0至5％MeOH)，得到3.05g(83.0％)的苯甲酸酯95a为无色泡沫。
LCMS-方法C：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝3.57
电离方法：ES+：[M+H]+＝614.5
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.32(s，1H)，7.97-8.02(m，2H)，7.68(s，1H)，7.52-7.58(m，2H)，7.47-7.49(m，1H)，5.80(dd，J＝9.9，2.9Hz，1H)，4.40(d，J＝11.3Hz，1H)，4.31(d，J＝11.4Hz，1H)，4.17(d，J＝9.4Hz，1H)，3.95(d，J＝9.4Hz，1H)，2.95(br d，J＝11.5Hz，1H)，2.87(br d，J＝10.0Hz，1H)，2.44(br d，J＝11.4Hz，1H)，2.33(m，2H)，1.69-1.80(m，4H)，1.66(s，3H)，1.52-1.60(m，1H)，1.13-1.31(m，5H)，0.96-1.12(m，21H)。
96a：苯甲酸[(2R,6R)-4-环己基-2-(羟基甲基)-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)-吗啉-2-基]甲基酯
将3.0g(4.89mmol)的甲硅烷基醚95a溶于15ml DMF中。在添加7.49g(73.3mmol，10.29ml)NEt3和6.03g(36.7mmol，6.10ml)NEt3·3HF之后，将溶液在75℃搅拌2小时，以达到完全转化。将反应冷却至室温，并用100ml 5％-NaHCO3溶液洗涤。过滤后，将水溶液用DCM萃取。将有机层分离，用MgSO4干燥并蒸发。将粗产物通过硅胶色谱提纯(DCM中0至10％MeOH)，得到1.23g(55.0％)的所需脱保护的产物96a，其含有约20％的异构杂质，这是由于苯甲酰基酯迁移到游离OH-基团引起的。
LCMS-方法C：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝1.63
电离方法：ES+：[M+H]+＝458.4
97a：苯甲酸[(2R,6R)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-4-环-己基-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)吗啉-2-基]甲基酯
将2.05g(4.48mmol)的起始材料96a溶于40ml干燥吡啶中。在室温，逐滴添加1.64g(4.70mmol)DMT-Cl的10ml DCM溶液，并将反应溶液搅拌过夜。在添加5ml iPrOH之后，将反应溶液蒸发并将残余物溶于DCM中。将有机溶液用MgSO4干燥并蒸发。将所得的粗产物通过硅胶色谱提纯(DCM中0至10％MeOH)，然后第二次用HPLC提纯(柱：Chiralcel OZ-H/140，250x4.6mm，1.0ml/min，30℃；洗脱液：MeOH/EtOH 1:1)，得到1.05g(30.8％)的标题化合物97a为无色泡沫。
LCMS-方法C：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝3.17
电离方法：ES-：[M-H]-＝758.6
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.31(s，1H)，7.73-7.79(m，2H)，7.63-7.71(m，1H)，7.46-7.54(m，3H)，7.35(d，J＝7.1Hz，2H)，7.16-7.28(m，7H)，6.79(dd，J＝8.9，3.6Hz，4H)，5.65(dd，J＝9.9，2.9Hz，1H)，4.50(d，J＝11.3Hz，1H)，4.40(d，J＝11.1Hz，1H)，3.69(d，J＝1.59Hz，6H)，3.55(d，J＝8.6Hz，1H)，3.01(d，J＝11.4Hz，1H)，2.81(d，J＝9.9Hz，1H)，2.66-2.69(m，1H)，2.23-2.39(m，2H)，1.61-1.78(m，4H)，1.68(s，3H)，1.51-1.60(m，1H)，0.98-1.30(m，5H)。
98a：1-[(2R,6S)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-4-环己基-6-(羟基-甲基)吗啉-2-基]-5-甲基-嘧啶-2,4-二酮
将1.0g(1.32mmol)的苯甲酰基酯97a溶于12ml EtOH/吡啶(5:1)中。在0℃，添加6.58ml(13.16mmol)的2M NaOH溶液。移除冷却浴后，将反应溶液在室温搅拌1小时以达到完全转化。将溶液用50ml H2O稀释并用EtOAc萃取。将有机层分离并用10％柠檬酸溶液、5％NaHCO3溶液和饱和的NaCl溶液洗涤。在用MgSO4干燥并蒸发溶剂后，将粗产物在二氧化硅上提纯(正庚烷中0至50％EtOAc)，得到325mg(37.7％)的标题化合物98a为无色泡沫。
LCMS-方法C：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝2.33
电离方法：ES+：[M+H]+＝656.5
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.28(s，1H)，7.58(d，J＝1.0Hz，1H)，7.39(d，J＝7.5Hz，2H)，7.19-7.32(m，7H)，6.87(d，J＝8.8Hz，4H)，5.56(dd，J＝9.9，2.7Hz，1H)，4.65(t，J＝6.0Hz，1H)，3.73(s，6H)，3.58(dd，J＝11.4，6.9Hz，1H)，3.50(dd，J＝11.3，5.0Hz，1H)，3.35(d，J＝8.7Hz，1H)，3.10(d，J＝8.6Hz，1H)，2.68-2.83(m，2H)，2.42(d，J＝11.6Hz，1H)，2.22(m，1H)，2.14(t，J＝10.4Hz，1H)，1.78(s，3H)，1.58-1.71(m，4H)，1.53(br d，J＝12.2Hz，1H)，1.00-1.32(m，5H)。
99a：3-[[(2R,6R)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-4-环-己基-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)吗啉-2-基]甲氧基-(二异丙基氨基)-膦烷基]-氧基丙腈
将320mg(488μmol)的起始材料98a溶于6ml干燥DCM中。在氩气气氛中，添加44mg(244μmol)的iPr2NH-四唑和190mg(601μmol)的2-氰基乙基-N,N,N’,N’-四异丙基亚磷酰二胺，并将溶液在室温搅拌过夜。在添加50ml H2O和DCM之后，将有机层分离，用MgSO4干燥并蒸发。将粗产物通过硅胶色谱提纯(用正庚烷+1％NEt3，正庚烷中0至100％EtOAc进行预处理)，得到322mg(78.6％)的所需亚磷酰胺99a为无色泡沫。
LCMS-方法B-2：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝0.83
电离方法：ES+：[M+H-iPr2N+OH]+＝773.3
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.32，11.30(2x br s，1H)，7.57，7.52(2x d，J＝1.0Hz，1H)，7.38(m，2H)，7.19-7.32(m，7H)，6.84-6.91(m，4H)，5.68，5.59(2x m，1H)，3.89(m，0.5H)，3.59-3.78(m，3.5H)，3.73(s，6H)，3.46-3.57(m，2H)，3.35(m，1H)，3.22(m，1H)，2.66-2.84(m，4H)，2.40(m，1H)，2.17-2.28(m，2H)，1.78，1.76(2x s，3H)，1.56-1.72(m，4H)，1.47-1.56(m，1H)，1.00-1.31(m，17H)。31P-NMR(DMSO-d6，162MHz)δ[ppm]：147.6，147.5。
94e：N-[9-[(2R,6S)-4-环己基-6-(羟基甲基)-6-(三异丙基甲硅烷基氧基甲基)吗啉-2-基]嘌呤-6-基]苯甲酰胺
按照对于合成二噁烷类似物40e所述的方案，用二氯乙酸将2.18g(2.36mmol)的DMT-醚90e脱保护。在二氧化硅上色谱提纯(正庚烷中0至100％EtOAc)后，将所需的产物94e分离为无色泡沫(1.14g，77.5％)。
LCMS-方法C：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝2.94
电离方法：ES+：[M+H]+＝623.7
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.17(s，1H)，8.74(s，1H)，8.70(s，1H)，8.04(br d，J＝7.3Hz，2H)，7.65(m，1H)，7.55(t，J＝7.1Hz，2H)，6.10(m，1H)，4.60(m，1H)，4.14(m，1H)，3.88(m，1H)，3.45(br d，J＝6.2Hz，2H)，3.12(m，1H)，2.77-2.93(m，2H)，2.45(m，1H)，2.35(m，1H)，1.76(m，4H)，1.56(br d，J＝11.5Hz，1H)，1.16-1.33(m，4H)，0.99-1.15(m，22H)。
95e：苯甲酸[(2S,6R)-6-(6-苯甲酰氨基嘌呤-9-基)-4-环己基-2-(三异丙基甲硅烷基氧基甲基)-吗啉-2-基]甲基酯
将1.13g(1.8mmol)的起始材料94e溶于20ml干燥吡啶中。在室温，添加334.9mg(276.5μl，2.4mmol)苯甲酰氯和223.9mg(1.8mmol)DMAP，并将溶液搅拌3小时。在添加额外的103.0mg(85.1μl，0.7mmol)苯甲酰氯之后，将溶液搅拌直至达到完全转化。真空除去溶剂并将残余物溶于EtOAc中。将溶液用H2O、2x10％柠檬酸溶液、饱和的NaHCO3溶液和饱和的NaCl溶液洗涤，用MgSO4干燥并蒸发。在二氧化硅上提纯(正庚烷中0至100％EtOAc)，得到877mg(66.5％)的苯甲酸酯95e为无色泡沫。
LCMS-方法C：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝3.65
电离方法：ES+：[M+H]+＝727.8
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.15(m，1H)，8.71(s，1H)，8.61(s，1H)，8.02(d，J＝7.3Hz，2H)，7.92(d，J＝7.4Hz，2H)，7.59-7.69(m，2H)，7.48-7.58(m，4H)，6.15(m，1H)，4.24-4.40(m，3H)，3.99(m，1H)，3.17(m，1H)，2.98-3.10(m，2H)，2.60(m，1H)，2.42(m，1H)，1.70-1.90(m，4H)，1.57(br d，J＝12.1Hz，1H)，1.16-1.32(m，4H)，0.99-1.14(m，22H)。
96e：苯甲酸[(2R,6R)-6-(6-苯甲酰氨基嘌呤-9-基)-4-环己基-2-(羟基甲基)吗啉-2-基]甲基酯
根据对于45e所述的方案，将870mg(1.2mmol)的甲硅烷基醚95e脱保护。在色谱提纯后(正庚烷中0至100％EtOAc)，将96e分离为无色泡沫(616mg，90.2％)。
LCMS-方法C：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝1.90
电离方法：ES+：[M+H]+＝571.5
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.13(s，1H)，8.70(s，1H)，8.56(s，1H)，8.02(br d，J＝7.3Hz，2H)，7.93(m，2H)，7.65(m，2H)，7.48-7.59(m，4H)，6.16(dd，J＝8.7，3.0Hz，1H)，4.97(br s，1H)，4.21-4.38(m，2H)，3.89(br d，J＝10.5Hz，1H)，3.80(br d，J＝10.2Hz，1H)，3.15(m，1H)，3.05(m，1H)，2.93(br d，J＝11.6Hz，1H)，2.63(m，1H)，2.37-2.44(m，1H)，1.65-1.82(m，4H)，1.57(br d，J＝11.7Hz，1H)，1.13-1.32(m，4H)，1.01-1.13(m，1H)。
97e：苯甲酸[(2R,6R)-6-(6-苯甲酰氨基嘌呤-9-基)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-4-环己基-吗啉-2-基]甲基酯
将610mg(1.1mmol)的起始材料96e溶于30ml干燥吡啶中并蒸发。将该程序重复3次。随后将化合物溶于30ml干燥吡啶中，然后添加162.7mg(223.6μl，1.6mmol)NEt3和554.4mg(1.6mmol)DMT-Cl。当达到完全转化时将反应溶液在室温搅拌过夜。真空除去溶剂并将残余物溶于EtOAc中。在用H2O、10％-柠檬酸溶液(2x)、饱和的NaHCO3溶液和饱和的NaCl溶液洗涤后，将有机相用MgSO4干燥。蒸发溶剂并通过硅胶色谱提纯(正庚烷中0至100％EtOAc)，得到807mg(86.5％)的DMT-醚97e为无色泡沫。
LCMS-方法C：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝3.26
电离方法：ES+：[M+H]+＝873.8
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.17(br s，1H)，8.69(s，1H)，8.60(s，1H)，8.02(m，2H)，7.73(m，2H)，7.64(m，2H)，7.54(m，2H)，7.47(m，2H)，7.39(m，2H)，7.18-7.28(m，7H)，6.75-6.84(m，4H)，5.95(dd，J＝9.4，2.9Hz，1H)，4.44(m，2H)，3.65-3.72(m，7H)，3.44(m，1H)，3.02-3.14(m，2H)，2.94(br t，J＝10.3Hz，1H)，2.67(m，1H)，2.41(br d，J＝7.7Hz，1H)，1.66-1.83(m，4H)，1.57(br d，J＝11.62Hz，1H)，1.13-1.29(m，4H)，1.01-1.12(m，1H)。
98e：N-[9-[(2R,6S)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-4-环己基-6-(羟基甲基)吗啉-2-基]嘌呤-6-基]苯甲酰胺
按照对于化合物63e所述的方案，用2M NaOH溶液将800mg(0.9mmol)97e皂化。在色谱提纯(正庚烷中0至100％EtOAc)后，将634mg(90.0％)的所需化合物98e分离为无色泡沫。
LCMS-方法C：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝2.69
电离方法：ES-：[M-H]-＝767.5
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.18(br s，1H)，8.69(s，1H)，8.66(s，1H)，8.04(d，J＝7.7Hz，2H)，7.64(m，1H)，7.55(t，J＝7.6Hz，2H)，7.44(d，J＝7.5Hz，2H)，7.27-7.34(m，6H)，7.22(m，1H)，6.89(dd，J＝9.1，2.6Hz，4H)，5.84(dd，J＝9.9，2.7Hz，1H)，4.68(br t，J＝5.8Hz，1H)，3.74，3.73(2x s，6H)，3.47-3.63(m，3H)，3.28(m，1H)，3.03(br d，J＝9.9Hz，1H)，2.86(br d，J＝11.6Hz，1H)，2.72(t，J＝10.5Hz，1H)，2.53(m，1H)，2.24-2.34(m，1H)，1.61-1.73(m，4H)，1.54(br d，J＝11.4Hz，1H)，1.00-1.30(m，5H)。
99e：N-[9-[(2R,6R)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-[[2-氰基乙氧基-(二异丙基氨基)膦烷基]氧基甲基]-4-环己基-吗啉-2-基]嘌呤-6-基]-苯甲酰胺
根据对于43e所述的方案，将625mg(813μmol)的起始化合物98e亚磷酰化，得到710mg(90.1％)的所需亚磷酰胺99e为无色固体。
LCMS-方法B-3：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝0.63
电离方法：ES+：[M+H-iPr2N+OH-ABzl]+＝647.3
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.16(br s，1H)，8.72，8.70(2x s，1H)，8.60，8.57(2x s，1H)，8.04(d，J＝8.1Hz，2H)，7.63(m，1H)，7.55(m，2H)，7.44(m，2H)，7.20-7.36(m，7H)，6.85-6.94(m，4H)，5.83-5.95(m，1H)，3.83-3.95(m，1H)，3.74(s，6H)，3.34-3.73(m，7H)，3.00-3.11(m，2H)，2.76-2.92(m，2H)，2.71，2.62(2x m，2H)，2.23-2.39(m，1H)，1.59-1.77(m，4H)，1.47-1.58(m，1H)，0.99-1.30(m，14H)，0.90-0.97(m，3H)。
31P-NMR(DMSO-d6，162MHz)δ[ppm]：147.5，147.3。
B.合成式(I)的核苷酸类似物，其中X为O
实施例B.1：合成方案12
Figure BDA0002760977440001581
34a：3-(苄基氧基甲基)-1-[(2R,3R,4S,5S)-3,4-二羟基-5-(羟基甲基)-5-(三异丙基甲硅烷基氧基甲基)四氢呋喃-2-基]-5-甲基-嘧啶-2,4-二酮
在-30℃，向化合物4a(72.75g，0.164mmol)在728ml DMF中的混合物中添加44.6gBOM-Cl(0.285mol)和50g DBU(0.327mol)。将混合物在-15℃至-30℃搅拌3小时以达到完全转化。将混合物倒入饱和的NaHCO3溶液(2l)中，并用EtOAc(3x1l)萃取。合并的有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩。将残余物通过快速色谱提纯(DCM/MeOH 20:1)，得到62.7g(67.7％)的BOM保护的产物34a为黄色油状物。
1H-NMR(CDCl3，400MHz)δ[ppm]：8.67-8.55(m，4H)，7.70(tt，J＝7.64，1.77Hz，2H)，7.52-7.20(m，10H)，5.69-5.62(m，1H)，5.52-5.44(m，1H)，4.74-4.54(m，2H)，4.51-4.42(m，1H)，4.11-3.63(m，6H)，2.01-1.84(m，4H)，1.30-0.85(m，21H)。
34b：3-(苄基氧基甲基)-1-[(2R,3R,4S,5S)-3,4-二羟基-5-(羟基甲基)-5-(三异丙基甲硅烷基氧基甲基)四氢呋喃-2-基]嘧啶-2,4-二酮
根据对于34a所述的方案，在硅胶色谱(DCM/MeOH 20:1至10:1)后，24g(0.056mol)的起始化合物4b得到22.0g(71.7％)的34b为无色固体。
1H-NMR(CDCl3，400MHz)δ[ppm]：8.02(d，J＝8.0Hz，1H)，7.34-7.31(m，5H)，5.95(d，J＝8.0Hz，1H)，5.85(d，J＝8.0Hz，1H)，5.35-5.32(m，3H)，5.08(d，J＝4.0Hz，1H)，4.59(s，2H)，4.50(d，J＝4.0Hz，1H)，4.24-4.19(m，2H)，4.09(t，J＝4.0Hz，1H)，3.83(s，2H)，3.65(t，J＝4.0Hz，2H)，1.03-1.02(m，21H)。
35a：3-(苄基氧基甲基)-1-[(2R,3R,4S,5S)-5-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]-甲基]-3,4-二羟基-5-(三异丙基甲硅烷基氧基甲基)四氢呋喃-2-基]-5-甲基-嘧啶-2,4-二酮
将7.42g(13.1mmol)的起始材料34a与40ml吡啶共蒸馏2次，并溶于150ml DCM/吡啶(4:1)。在添加4.77g(13.8mmol)的DMT-Cl之后，将溶液在室温搅拌65小时。将溶液用水性柠檬酸溶液(10％)、然后H2O、饱和的NaHCO3和NaCl溶液洗涤两次。将有机相分离，用MgSO4干燥并通过硅胶色谱提纯(正庚烷中0至100％EtOAc),，得到8.50g(74.7％)的所需产物35a为无色泡沫。
LCMS-方法A：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝2.34
电离方法：ES+：[M+Na]+＝889.5
1H-NMR(CDCl3，400MHz)δ[ppm]：7.46-7.40(m，1H)，7.35-7.12(m，14H)，6.75(d，J＝7.91Hz，4H)，6.04(d，J＝5.52Hz，1H)，5.53-5.37(m，2H)，4.67-4.54(m，2H)，4.46-4.37(m，2H)，3.89(d，J＝10.29Hz，1H)，3.76-3.68(m，7H)，3.62(d，J＝10.16Hz，1H)，3.52(br d，J＝8.41Hz，1H)，3.40-3.33(m，1H)，3.17(d，J＝10.16Hz，1H)，1.44(s，3H)，1.05-0.85(m，21H)。
35b：3-(苄基氧基甲基)-1-[(2R,3R,4S,5S)-5-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]-甲基]-3,4-二羟基-5-(三异丙基甲硅烷基氧基甲基)四氢呋喃-2-基]嘧啶-2,4-二酮
在室温，向化合物34b(21.0g，38mmol)的230ml干燥DMF溶液中添加DIPEA(9.8g，76mmol)和DMT-Cl(15.4g，45.6mmol)。将反应溶液在N2气氛中搅拌4小时。在添加30ml EtOH之后，减压除去溶剂并将残余物在硅胶上通过柱色谱提纯(PE/EtOAc 10:1至1:1)，得到19.0g(58.5％)的35b为黄色泡沫。
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：7.72(d，J＝8.0Hz，1H)，6.90(d，J＝8.0Hz，4H)，7.39-7.24(m，14H)，5.89(d，J＝8.0Hz，1H)，3.51(d，J＝8.0Hz，1H)，5.37-5.24(m，4H)，4.58(s，2H)，4.34(t，J＝4.0Hz，1H)，4.24(dd，J＝12.0，8.0Hz，1H)，3.73(s，6H)，3.40(d，J＝12.0Hz，1H)，3.29(d，J＝12.0Hz，1H)，1.19-0.86(m，21H)。
35c：N-[9-[(2R,3R,4S,5S)-5-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-3,4-二羟基-5-(三异丙基甲硅烷基氧基甲基)四氢呋喃-2-基]-6-氧代-1H-嘌呤-2-基]-2-甲基-丙酰胺
在0℃、在N2气氛中，向4c(24g，44.5mmol)的314ml无水吡啶/DCM(1/4)溶液中添加DMT-Cl(18g，53.4mmol)。在15℃搅拌2小时后，将混合物倒入500ml冰水中，并用DCM(3x300ml)萃取。将合并的有机层用盐水洗涤(300ml)，经无水Na2SO4干燥并真空浓缩。将粗产物在硅胶上通过柱色谱提纯(DCM/MeOH 50:1至10:1)，得到37.4g(定量)的35c为黄色固体。
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：12.09(s,1H)，11.65(s,1H)，7.93(s，1H)，7.37-7.34(m，2H)，7.27(m，7H)，6.85-6.83(m，4H)，5.86(d，J＝7.2Hz，1H)，5.60(d，J＝6.8Hz，1H)，5.20(s，1H)，4.67-4.64(m，1H)，4.26-4.24(m，1H)，3.98-3.95(m，1H)，3.84(d，J＝10.4Hz，1H)，3.38-3.34(m，2H)，3.20-3.18(m，1H)，2.80-2.74(m，1H)，1.13-0.95(m，6H)，0.93-0.90(m，21H)。
36a：3-(苄基氧基甲基)-1-[(2R,6S)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-3,5-二羟基-6-(三异丙基甲硅烷基氧基甲基)-1,4-二噁烷-2-基]-5-甲基-嘧啶-2,4-二酮
在室温，向35a(20g，23.07mmol)的400ml丙酮/水(3:1)溶液中添加NaIO4(6.9g，32.29mmol)的100ml水溶液。在搅拌16小时后，真空除去溶剂并将残余物溶于EtOAc(300ml)中，并用饱和的NaHCO3(200ml)和盐水(200ml)洗涤。有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩，得到36a为黄色泡沫，将其用于下一步骤中无需进一步提纯。
LCMS-方法A：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝2.30，2.32(两种异构体)
电离方法：ES+：[M+Na]+＝905.5
36b：3-(苄基氧基甲基)-1-[(2R,6S)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-3,5-二羟基-6-(三异丙基甲硅烷基氧基甲基)-1,4-二噁烷-2-基]嘧啶-2,4-二酮
按照对于36a所述的方案，将20g(23.5mmol)的35b转化为标题化合物36b(18.6g，粗品)。
LCMS-方法A：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝2.23，2.25(两种异构体)
电离方法：ES+：[M+Na]+＝891.4
36c：N-[9-[(2R,6S)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-3,5-二羟基-6-(三异丙基甲硅烷基氧基甲基)-1,4-二噁烷-2-基]-6-氧代-1H-嘌呤-2-基]-2-甲基-丙酰胺
在0℃，向35c(30g，35.7mmol)的694ml丙酮/H2O(5:1)溶液中添加NaIO4(10.62g，50mmol)的240ml H2O溶液。在15℃搅拌12小时后，将混合物倒入200ml冰水中，并用DCM(3x200ml)萃取。将有机层合并，并用盐水洗涤(300ml)，经无水Na2SO4干燥并真空浓缩，得到36c(30g，粗品)为黄色泡沫，将其用于下一步骤中无需进一步提纯。
37a：3-(苄基氧基甲基)-1-[(1R)-1-[(1S)-1-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-1-(羟基甲基)-2-三异丙基甲硅烷基氧基-乙氧基]-2-羟基-乙基]-5-甲基-嘧啶-2,4-二酮
在室温，向化合物36a(粗产物，23.07mmol)的320ml EtOH溶液中分批添加NaBH4(1.05g，27.68mmol)。将混合物搅拌过夜并真空除去溶剂。将残余物溶于EtOAc(500ml)中，并用饱和的NaHCO3溶液(500ml)和盐水(500ml)洗涤。有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩。在柱色谱(DCM/MeOH20:1)后，将12.0g的37a(48％)分离为黄色泡沫。
LCMS-方法A：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝2.31
电离方法：ES+：[M+Na]+＝891.5
1H-NMR(CDCl3，400MHz)δ[ppm]：7.52-7.06(m，20H)，6.80-6.65(m，5H)，6.08(dd，J＝7.03，3.76Hz，1H)，5.44-5.25(m，1H)，4.64-4.46(m，2H)，3.85-3.63(m，12H)，3.60-3.40(m，2H)，3.35-3.22(m，2H)，2.95-2.66(m，2H)，1.80(s，3H)，1.51(s，3H)，1.03-0.81(m，23H)。
37b：3-(苄基氧基甲基)-1-[(1R)-1-[(1S)-1-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]-甲基]-1-(羟基甲基)-2-三异丙基甲硅烷基氧基-乙氧基]-2-羟基-乙基]嘧啶-2,4-二酮
在室温向15.35g(17.7mmol，粗品)36b的250ml EtOH溶液中添加818mg(21.2mmol)NaBH4。当检测到完全转化时，将反应搅拌16小时。真空除去溶剂并将残余物溶于EtOAc中。在将有机溶液用H2O、饱和的NaHCO3溶液和饱和的NaCl溶液洗涤后，将有机层用MgSO4干燥并蒸发，得到14.85g(98.3％)的37b为无色泡沫，将其使用无需进一步提纯。
LCMS-方法A：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝2.23
电离方法：ES+：[M]+＝303.2(DMT+)
37c：N-[9-[(1R)-1-[(1S)-1-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-1-(羟基-甲基)-2-三异丙基甲硅烷基氧基-乙氧基]-2-羟基-乙基]-6-氧代-1H-嘌呤-2-基]-2-甲基-丙酰胺
在15-20℃，向36c(30g，35mmol)的400ml无水EtOH溶液中添加NaBH4(1.6g，42mmol)。在搅拌4小时后，通过使用10％柠檬酸溶液(约25ml)将pH调节至7。真空浓缩溶剂，并将残余物在硅胶上通过柱色谱提纯(DCM/MeOH 20:1至10:1)，得到22.0g(74.5％)的37c为黄色固体。
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：12.06(s,1H)，11.71(s,1H)，8.04(s，1H)，7.37-7.28(m，3H)，7.26-7.19(m，11H)，6.87-6.83(m，4H)，6.09(d，J1＝5.6Hz，J2＝5.6Hz，1H)，5.22(d，J＝5.6Hz，1H)，4.75(d，J1＝4.8Hz，J2＝4.8Hz，1H)，3.85-3.84(m，2H)，3.74-3.70(m，9H)，3.68-3.49(m，2H)，3.14(m，1H)，2.99-2.81(m，1H)，1.15-1.12(m，6H)，0.80-0.79(m，21H)。
38a：4-甲基苯磺酸[(2R)-2-[3-(苄基氧基甲基)-5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基]-2-[(1S)-1-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-1-(羟基甲基)-2-三异丙基甲硅烷基氧基-乙氧基]乙基]酯
在15℃，向37a(10.8g，12.43mmol)、NEt3(3.14g，31.07mmol)和DMAP(1.52g，12.43mmol)的108ml DCM溶液中添加Ts-Cl(1.9g，9.94mmol)的54ml DCM溶液。将混合物搅拌2小时，然后添加另外的溶于5ml DCM的500mg Ts-Cl。在15℃搅拌另外的1小时后，将反应混合物用饱和的NaHCO3溶液(200ml)和盐水(200ml)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩。将残余物通过柱色谱提纯(PE/EtOAc 2:1)，得到38a(10g，78.7％)为黄色油状物。
1H-NMR(CDCl3，400MHz)δ[ppm]：7.74-7.43(m，2H)，7.34-7.00(m，18H)6.84-6.64(m，4H)，6.42-6.24(m，1H)，5.43-5.15(m，2H)，5.00-4.72(m，1H)，4.63-4.47(m，2H)，4.21-3.90(m，2H)，3.83-3.56(m，10H)，3.29-3.11(m，1H)，2.44-2.19(m，4H)，1.89-1.64(m，3H)，1.07-0.71(m，21H)。
38b：4-甲基苯磺酸[(2R)-2-[3-(苄基氧基甲基)-2,4-二氧代-嘧啶-1-基]-2-[(1S)-1-[[双(4-甲氧基-苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-1-(羟基甲基)-2-三异丙基甲硅烷基氧基-乙氧基]乙基]酯
按照对于38a的方案，通过使用1.2当量的Ts-Cl，将3.0g(3.5mmol)37b转化为38b。在硅胶上最后提纯(PE/EtOAc 10:1至2:1)之后，将2.0g(57％)的标题化合物(38b)分离为无色泡沫。
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：7.65-7.56(m，3H)，7.35-7.18(m，16H)，6.84-6.80(m，4H)，6.37-6.36(m，1H)，5.74(s，2H)，5.64(d，J＝12.0Hz，1H)，5.23-5.18(m，2H)，4.93-4.91(m，1H)，4.52(s，2H)，4.18-4.09(m，2H)，3.71(s，6H)，3.23-3.01(m，4H)，2.34(s，3H)，0.96-0.79(m，21H)。
38c：4-甲基苯磺酸[(2R)-2-[(1S)-1-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-1-(羟基甲基)-2-三异丙基甲硅烷基氧基-乙氧基]-2-[2-(2-甲基丙酰基氨基)-6-氧代-1H-嘌呤-9-基]乙基]酯
在0℃、在N2气氛中，向37c(31.5g，40.8mmol)的537ml无水DCM溶液中添加NEt3(10.3g，102mmol)和DMAP(4.98g，40.8mmol)。10分钟后，在0℃将Ts-Cl(9.3g，49mmol)添加至混合物中，并在15-20℃继续搅拌6小时。蒸发溶剂并将残余物通过柱色谱提纯(DCM/MeOH20:1至10:1)，得到38c(30g，73.7％)为黄色固体。
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：12.03(s,1H)，11.59(s,1H)，8.11(s，2H)，7.09(s，1H)，7.50-7.49(m，2H)，7.31-7.16(m，12H)，6.87-6.86(m，4H)，6.59-6.58(m，2H)，6.31(s，1H)，4.96(s，1H)，4.62(s，1H)，4.37(s，1H)，4.04(s，2H)，3.66-3.61(m，4H)，3.59-3.51(m，1H)，3.12-3.03(m，2H)，2.95(s，6H)，2.79-2.61(m，1H)，2.33(s，3H)，1.20-1.11(m，7H),0.86-0.79(m，21H)。
39a：3-(苄基氧基甲基)-1-[(2R,6S)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(三异丙基甲硅烷基氧基甲基)-1,4-二噁烷-2-基]-5-甲基-嘧啶-2,4-二酮
在15℃，向化合物38a(10.5g，10.26mmol)在343ml无水THF和343ml MeOH中的混合物中添加2M NaOH(74mL，147.47mmol)的溶液。当检测到完全转化时将混合物在65℃搅拌3小时。将混合物用水性柠檬酸(10％)中和并真空浓缩。将残余物溶于EtOAc(700ml)中，并用饱和的NaHCO3溶液(700ml)洗涤。有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩。将残余物通过柱色谱提纯(PE/EtOAc 5:1)，得到标题化合物39a(4.9g，49.1％)为黄色油状物。
MS(m/z)＝873.4(M+Na)
1H-NMR(CDCl3，400MHz)δ[ppm]：7.62-7.18(m，19H)，6.82(br d，J＝8.66Hz，4H)，6.10(dd，J＝10.04，3.39Hz，1H)，5.53(s，1H)，4.74(s，1H)，4.26-4.15(m，1H)，4.04-3.88(m，2H)，3.81(d，J＝1.00Hz，7H)，3.72-3.59(m，1H)，3.31-3.12(m，3H)，1.94-1.80(m，3H)，1.17-0.78(m，23H)。
39b：3-(苄基氧基甲基)-1-[(2R,6S)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(三异丙基甲硅烷基氧基甲基)-1,4-二噁烷-2-基]嘧啶-2,4-二酮
向化合物38b(1.0g，1.0mmol)的250ml MeOH溶液中添加NaOMe(2.5g，45.0mmol)。当TLC显示完全转化时，在50℃、在N2气氛中，将混合物加热3小时。减压除去溶剂并将残余物在硅胶上通过柱色谱提纯(PE/EtOAc 10:1至3:1)，得到39b(0.27g，33％)为白色泡沫。
1H-NMR(CDCl3，400MHz)δ[ppm]：7.54(d，J＝8.0Hz，1H)，7.39-7.37(m，2H)，7.35-7.30(m，6H)，7.28-7.26(m，3H)，7.24-7.22(m，1H)，6.85(d，J＝8.0Hz，4H)，6.05(dd，J＝12.0，4.0Hz，1H)，5.79(d，J＝12.0Hz，1H)，5.49(s，2H)，4.72(s，2H)，4.20(d，J＝8.0Hz，1H)，4.0(dd，J＝12.0，4.0Hz，1H)，3.94(d，J＝12.0Hz，1H)，3.86(d，J＝12.0Hz，1H)，3.79(s，6H)，3.56(d，J＝12.0Hz，1H)，3.22-3.12(m，3H)，1.10-0.95(m，21H)。
39c：2-氨基-9-[(2R,6S)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(三异丙基甲硅烷基氧基甲基)-1,4-二噁烷-2-基]-1H-嘌呤-6-酮
在15至20℃向化合物38c(28g，28mmol)的616ml MeOH溶液中逐滴添加151ml(758mmol)的5M NaOH。将混合物在60至70℃搅拌30分钟，以达到完全转化。将混合物冷却至0℃，并使用10％柠檬酸溶液(约200ml)将pH调节至7。在30℃浓缩溶剂，并将剩余的水相用DCM(3x500ml)萃取。将合并的有机层用盐水洗涤(500ml)，经无水Na2SO4干燥并浓缩。将粗产物通过柱色谱提纯(DCM/MeOH 20:1至10:1)，得到39c(18g，79％)为黄色固体。
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：10.71(m,1H)，7.91(m,1H)，7.41-7.40(m，2H)，7.27-7.20(m，12H)，6.82-6.50(m，6H)，6.50(s，1H)，5.88-5.85(m，1H)，4.17-4.14(m，1H)，3.96-3.89(m，1H)，3.80(m，2H)，3.74-3.72(m，10H)，3.69-3.61(m，1H)，3.10-3.08(m，1H)，2.41-2.58(m，1H)，0.94-0.91(m，21H)。
40a：1-[(2R,6R)-6-(羟基甲基)-6-(三异丙基甲硅烷基氧基甲基)-1,4-二噁烷-2-基]-5-甲基-嘧啶-2,4-二酮
向化合物39a(3.7g，4.35mmol)的55.5ml EtOAc溶液中添加Pd(OH)2/C(2g，20％在碳上以及50％在水中)和三氯乙酸(1.42g，8.70mmol)。将反应混合物在15℃、在H2(15psi)中搅拌1小时以达到完全转化。将混合物过滤，并将滤液真空浓缩，得到粗制的脱苄基化的和脱三苯甲基化的中间体，为黄色油状物，将其溶于90ml MeOH中。在15℃添加NEt3(1.14g，11.28mmol)之后，当检测到完全转化时将溶液搅拌过夜。真空除去溶剂并将残余物通过柱色谱提纯(DCM/MeOH 50:1)，得到950mg的标题化合物40a(51.0％)为白色泡沫。
MS(m/z)＝451.2(M+Na)
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：8.22(s，1H)，7.26-7.17(m，1H)，6.06-5.93(m，1H)，5.52(d，J＝8.16Hz，1H)，4.39-4.25(m，1H)，4.08(d，J＝11.92Hz，1H)，4.01-3.90(m，1H)，3.85(d，J＝9.29Hz，1H)，3.74(s，2H)，3.56-3.49(m，1H)，3.31(dd，J＝11.29，10.29Hz，1H)，2.32-2.10(m，1H)，2.02-1.89(m，3H)，1.32-0.96(m，17H)。
40b：1-[(2R,6R)-6-(羟基甲基)-6-(三异丙基甲硅烷基氧基甲基)-1,4-二噁烷-2-基]嘧啶-2,4-二酮
起始于9.5g(11.4mmol)的39b，根据对于40a所述的方案合成标题化合物40b。在硅胶上提纯(PE/EtOAc 10:1至1:1)后，将4.0g(86％)的40b分离为白色泡沫。
MS(m/z)＝415.0(M+H)
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：8.74(br.s.，1H)，7.47(d，J＝8.03Hz，1H)，6.02-5.97(m，1H)，5.85-5.78(m，1H)，5.50(br.s.，1H)，4.32-4.26(m，1H)，4.08(d，J＝12.05Hz，1H)，4.03-3.96(m，1H)，3.85(d，J＝9.29Hz，1H)，3.73(s，2H)，3.51(d，J＝12.05Hz，1H)，3.27(t，J＝10.67Hz，1H)，1.19-1.09(m，21H)。
41：1-[(2R,6S)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(三异丙基甲硅烷基氧基-甲基)-1,4-二噁烷-2-基]-5-甲基-嘧啶-2,4-二酮
将起始化合物40a(683mg，1.5mmol)溶于30ml干燥DCM中。在室温，添加753mg(1.03ml，7.4mmol)NEt3和616mg(1.8mmol)DMT-Cl，并当起始材料完全转化时，将反应搅拌16小时。将反应溶液蒸发并将粗产物通过硅胶色谱提纯(正庚烷中0至100％EtOAc)，得到990mg(91.0％)的DMT保护的产物41为淡黄色泡沫。
LCMS-方法A：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝2.31
电离方法：ES+：[M+Na]+＝753.4
42：1-[(2R,6S)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(羟基甲基)-1,4-二噁烷-2-基]-5-甲基-嘧啶-2,4-二酮
将985mg(1.35mmol)的起始材料41溶于40ml THF中。在添加5.95g(8.18ml，58.25mmol)NEt3和10.80g(10.92ml，65.0mmol)NEt3·3 HF之后，将反应在65℃搅拌直至检测到完全转化(约16h)。除去溶剂并将残余物倒入400ml H2O/饱和NaHCO3溶液(1:2)中。将水性混合物用DCM(2x50ml)萃取两次。将有机层用MgSO4干燥并蒸发，得到956mg的粗产物，将其在二氧化硅上提纯(用正庚烷中1％NEt3，正庚烷中10至100％EtOAc进行预处理)。将760mg(98.2％)的所需醇42分离为无色泡沫。
LCMS-方法A：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝1.86
电离方法：ES+：[M]+＝303.1(DMT+)
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.41(s，1H)，7.56-7.61(m，1H)，7.40(d，J＝7.34Hz，2H)，7.20-7.32(m，7H)，6.87(d，J＝8.56Hz，4H)，5.90(dd，J＝10.09，3.36Hz，1H)，4.79(t，J＝5.20Hz，1H)，3.70-3.85(m，10H)，3.62(d，J＝11.74Hz，1H)，3.49(t，J＝10.76Hz，1H)，2.97-3.12(m，2H)，1.70(s，3H)。
43a：3-[[(2S,6R)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)-1,4-二噁烷-2-基]甲氧基-(二异丙基氨基)膦烷基]氧基丙腈
将669mg(1.2mmol)的起始材料42和415mg(530μl，3.1mmol)DIPEA溶于10ml DCM中。在氩气的气氛中，在0℃，添加384mg(361μl，1.6mmol)2-氰基乙基-N,N-二异丙基氯亚磷酰胺，并将溶液搅拌1小时，使其达到室温。为了达到完全转化，添加0.5当量的DIPEA和2-氰基乙基-N,N-二异丙基氯亚磷酰胺，并将反应搅拌另外的2小时。在添加200μl正丁醇之后，将反应搅拌10分钟。将溶液用50ml的H2O洗涤。将水层分离并用50ml DCM萃取。将有机层用MgSO4干燥并蒸发。将残余物溶于30ml乙醚，并在-30℃滴加至100ml正戊烷中。将沉淀物过滤并真空干燥，得到723mg(80.1％)的所需产物为无色固体。
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.40(s，1H)，7.63，7.60(2x s，1H)，7.36-7.45(m，2H)，7.21-7.34(m，7H)，6.84-6.90(m，4H)，5.93-6.03(m，1H)，3.76-4.04(m，4H)，3.74(s，6H)，3.42-3.71(m，6H)，2.98-3.12(m，2H)，2.58-2.74(m，2H)，1.75，1.72(2x s，3H)，0.95-1.14(m，12H)。
31P-NMR(DMSO-d6，162MHz)δ[ppm]：148.8，148.7。
44：N-[9-[(2R,6S)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(三异丙基甲硅烷基-氧基甲基)-1,4-二噁烷-2-基]-6-氧代-1H-嘌呤-2-基]-2-甲基-丙酰胺
在0℃、在N2气氛中，向39c(14.18g，18.8mmol)的150ml无水吡啶溶液中添加TMSCl(15.22g，141mmol)。在室温搅拌2小时后，在0℃添加2-甲基丙酰氯(2.18g，20.6mmol)，并继续在室温搅拌2小时，以达到完全转化。在添加20ml EtOH之后，将混合物搅拌额外的10分钟。将溶液倒入冰水(500ml)中，并用DCM(3x500ml)萃取。将合并的有机层用10％水性柠檬酸(2x500ml)、饱和的NaHCO3溶液(300ml)和盐水(200ml)洗涤，经无水Na2SO4干燥并浓缩。将粗产物通过制备型HPLC提纯(0.1％FA/ACN)，得到9.5g(61.2％)的44为白色固体。
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：8.08(s，2H)，7.39-7.26(m，2H)，7.25-7.19(m，8H)，6.80(d，J＝8.0Hz，4H)，5.79(d，J＝1.6Hz，1H)，4.18-4.12(m，1H)，3.99-3.81(m，4H)，3.72(s，7H)，3.69(d，J＝10Hz，1H)，3.11(d，J＝11.2Hz，1H)，2.93(d，J＝10.4Hz，1H)，2.72(s，1H)，1.11-1.08(m，7H)，1.01-0.91(m，21H)。
45：N-[9-[(2R,6S)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(羟基甲基)-1,4-二噁烷-2-基]-6-氧代-1H-嘌呤-2-基]-2-甲基-丙酰胺
将1.33g(1.61mmol)的44溶于16ml DMF。在添加1.65g(2.26ml，16.1mmol)NEt3和1.32g(1.34ml，8.05mmol)NEt3·3HF之后，将溶液在90℃搅拌2小时。将反应混合物冷却至室温，然后添加2.5g NaHCO3和10ml H2O。在搅拌2小时后，将混合物蒸发并将残余物溶于25ml DCM/iPrOH(4:1)中，并在二氧化硅上提纯(DCM中0至10％MeOH)，得到0.83g(76.5％)的标题化合物45。
LCMS-方法C：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝2.33
电离方法：ES+：[M+H]+＝670.2
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：12.11(br s，1H)，11.66(s，1H)，8.11(s，1H)，7.37(d，J＝7.46Hz，2H)，7.18-7.29(m，7H)，6.84(dd，J＝8.93，2.69Hz，4H)，5.98(dd，J＝8.31，4.40Hz，1H)，4.81(t，J＝5.26Hz，1H)，3.90-4.02(m，2H)，3.67-3.86(m，4H)，3.72(s，6H)，3.04(d，J＝9.54Hz，1H)，2.96(m，1H)，2.75-2.81(m，1H)，1.11(t，J＝6.66Hz，6H)。
43c：N-[9-[(2R,6S)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-[[2-氰基乙氧基-(二异丙基氨基)膦烷基]氧基甲基]-1,4-二噁烷-2-基]-6-氧代-1H-嘌呤-2-基]-2-甲基-丙酰胺
将100mg(149μmol)的醇45、0.2g分子筛
Figure BDA0002760977440001691
和13.5mg(75μmol)的二异丙基铵盐四氮唑溶于2.5ml干燥DCM中。在氩气气氛中，添加45.5mg(48μl，146μmol)2-氰基乙基-N,N,N’,N’-四异丙基亚磷酰二胺，并将溶液在室温搅拌2小时，以达到完全转化。在添加饱和的NaHCO3溶液之后，将有机相分离，并将水相用DCM洗涤1次。将合并的有机层用饱和的NaCl溶液洗涤，用MgSO4干燥并蒸发。将粗产物在二氧化硅上提纯(用DCM+0.5％NEt3，DCM中0至10％MeOH进行预处理)，得到95mg(73.1％)的标题化合物(43c)为无色泡沫。
LCMS-方法C：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝2.34，2.36
电离方法：ES+：[M]+＝787.2(M-iPr2N+OH+H+)
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：12.09(br s，1H)，11.61，11.58(2x s，1H)，8.13，8.08(2x s，1H)，7.35(m，2H)，7.18-7.28(m，7H)，6.80-6.85(m，4H)，5.97(m，1H)，3.95-4.07(m，4H)，3.56-3.94(m，4H)，3.72(s，6H)，3.36-3.54(m，2H)，2.96-3.11(m，2H)，2.68-2.82(m，2H)，2.59(m，1H)，0.96-1.15(m，12H)，0.83-0.90(m，6H)。
31P-NMR(DMSO-d6，162MHz)δ[ppm]:148.1，147.9。
实施例B.2：
合成方案13
Figure BDA0002760977440001711
46：4-甲基苯磺酸[(2R)-2-[3-(苄基氧基甲基)-2,4-二氧代-嘧啶-1-基]-2-[(1S)-1-[[双(4-甲氧基-苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-1-(对-甲苯基磺酰基氧基甲基)-2-三异丙基甲硅烷基氧基-乙氧基]乙基]酯
将14.80g(17.31mmol)的起始材料37b溶于120ml干燥吡啶中。在室温，添加13.33g(69.23mmol)的Ts-Cl，并将反应在室温搅拌。23小时后，添加1.0g(8.2mmol)DMAP，并继续搅拌另外的24小时。添加额外的6.67g(34.62mmol)Ts-Cl，并将反应混合物搅拌48小时，以达到完全转化。除去溶剂并将残余物溶于EtOAc。将有机溶液用H2O、水性柠檬酸(10％)，饱和的NaHCO3溶液和盐水洗涤。经MgSO4干燥并蒸发溶剂，得到粗产物，将其在二氧化硅上提纯(用正庚烷+0.5％NEt3，正庚烷中20至50％EtOAc进行预处理)，得到12.0g(59.6％)的46为无色泡沫。
LCMS-方法A：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝2.33
电离方法：ES+：[M+Na]+＝1185.5
47：4-甲基苯磺酸[(2R)-2-[3-(苄基氧基甲基)-2,4-二氧代-嘧啶-1-基]-2-[(1S)-1-(羟基甲基)-1-(对-甲苯基磺酰基氧基甲基)-2-三异丙基甲硅烷基氧基-乙氧基]乙基]酯
将12.0g(10.31mmol)的46的240ml DCM溶液用26.87g(17.22ml，206.28mmol)DCA处理。将溶液在室温搅拌30分钟，以达到完全转化。将有机溶液用饱和的NaHCO3溶液洗涤，并分离各层。将水相用DCM洗涤两次，并将合并的有机层用MgSO4干燥。在蒸发溶剂后，将粗产物在二氧化硅上提纯(正庚烷中0至100EtOAc)，得到7.84g(88.3％)的标题化合物47为橙色油状物。
LCMS-方法A：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝2.19
电离方法：ES+：[M+H]+＝861.3
48：4-甲基苯磺酸[(2S,6R)-6-[3-(苄基氧基甲基)-2,4-二氧代-嘧啶-1-基]-2-(三异丙基甲硅烷基氧基-甲基)-1,4-二噁烷-2-基]甲基酯
将7.83g(9.09mmol)47溶于250ml干燥MeOH中。在添加22.11g(409.18mmol)甲醇钠之后，将溶液在50℃搅拌。2.5小时后，除去溶剂并将残余物溶于EtOAc。将有机溶液用H2O和盐水洗涤，用MgSO4干燥并蒸发。将粗产物在二氧化硅上提纯(正庚烷中20至100％乙基)，得到所需的二噁烷48为无色泡沫(3.84g，61.3％)。
LCMS-方法A：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝2.20
电离方法：ES+：[M+H]+＝689.3
49：苯甲酸[(2R,6R)-6-[3-(苄基氧基甲基)-2,4-二氧代-嘧啶-1-基]-2-(三异丙基甲硅烷基氧基-甲基)-1,4-二噁烷-2-基]甲基酯
将3.84g(5.57mmol)的起始化合物48溶于200ml DMF中。在添加2.03g(13.94mmol)苯甲酸钠之后，将溶液在150℃搅拌24小时，以达到完全转化。将反应混合物冷却至室温并真空除去溶剂。将残余物溶于EtOAc中，并用H2O和盐水洗涤2次。经MgSO4干燥并蒸发溶剂后，将粗产物在二氧化硅上提纯(正庚烷中0至100％EtOAc)，得到2.63g(73.8％)的49为无色泡沫。
LCMS-方法A：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝2.24
电离方法：ES+：[M+H]+＝639.3
50：苯甲酸[(2R,6R)-6-(2,4-二氧代嘧啶-1-基)-2-(三异丙基甲硅烷基氧基甲基)-1,4-二噁烷-2-基]甲基酯
在氩气气氛中，向2.62g(4.10mmol)49的65ml MeOH的溶液中添加144mg(0.21mmol)Pd(OH)2(20％在碳上)。在用H2将溶液吹扫后，将反应混合物在室温、在4bar的H2气氛中搅拌。1小时后，过滤催化剂，并将滤液减压蒸发。将粗产物(2.11g)溶于40ml的MeOH中，并添加3.63g(5.0ml，35.87mmol)NEt3。在室温将溶液搅拌30分钟，以达到完全转化。在使用水性柠檬酸(10％)调节pH至7后，除去溶剂并将残余物溶于EtOAc。在用水性柠檬酸(10％)和饱和的NaHCO3溶液洗涤后，将有机相用MgSO4干燥并蒸发，得到1.97g(99.3％，粗品)的50为无色泡沫。
LCMS-方法A：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝2.12
电离方法：ES+：[M+H]+＝519.3
51：苯甲酸[(2R,6R)-6-(2,4-二氧代嘧啶-1-基)-2-(羟基甲基)-1,4-二噁烷-2-基]甲基酯
将980mg(1.89mmol)的50溶于35ml干燥THF中。在室温，添加7.20g(6.55ml，47.24mmol)吡啶-HF(65％)，并将溶液搅拌1.5小时。在添加另外的7.20g吡啶-HF(65％)之后，当检测到完全转化时，继续搅拌5小时。在添加固体NaHCO3(约24g)之后，将反应搅拌1.5小时。滤去无机盐，并将滤液蒸发。将粗产物在二氧化硅上提纯(DCM中0至5％MeOH)，得到标题化合物51(494mg，72.2％)为无色泡沫。
LCMS-方法A：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝1.22
电离方法：ES+：[M+H]+＝363.1
52：苯甲酸[(2S,6R)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(2,4-二氧代嘧啶-1-基)-1,4-二噁烷-2-基]甲基酯
在室温，向490mg(1.35mmol)51的20ml DCM的溶液中添加874mg(1.18ml，6.76mmol)DIPEA和584mg(1.69mmol)DMT-Cl。在搅拌16小时后，蒸发溶液并将粗产物在二氧化硅上提纯(用正庚烷+0.5％NEt3，正庚烷中0至100％EtOAc进行预处理)，得到894mg(99.5％)的所需DMT-醚52为无色泡沫。
LCMS-方法A：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝1.96
电离方法：ES+：[M+Na]+＝687.2
53：1-[(2R,6S)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(羟基甲基)-1,4-二噁烷-2-基]嘧啶-2,4-二酮
将888mg(1.34mmol)52溶于20ml THF和5ml MeOH中。在0℃，添加6.68ml(13.36mmol)的2M NaOH溶液，并将溶液搅拌1小时，使其达到室温。在冷却至0℃后，添加12ml的水性柠檬酸溶液(10％)并将混合物用EtOAc萃取。将有机层分离并用饱和的NaHCO3溶液洗涤。在用MgSO4干燥后，除去溶剂。将粗产物在二氧化硅上提纯(用正庚烷+0.5％NEt3，正庚烷中0至100％(EtOAc+5％MeOH)进行预处理)，得到730mg(97.5％)的53为无色泡沫。
LCMS-方法A：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝1.78
电离方法：ES-：[M-H]-＝559.4
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.42(br s，1H)，7.67(d，J＝8.07Hz，1H)，7.39(d，J＝6.95Hz，2H)，7.19-7.33(m，7H)，6.85-6.90(m，4H)，5.89(dd，J＝10.03，3.18Hz，1H)，5.66(d，J＝8.07Hz，1H)，4.80(t，J＝5.26Hz，1H)，3.70-3.83(m，10H)，3.55(d，J＝11.62Hz，1H)，3.44(m，1H)，3.08(d，J＝9.41Hz，1H)，2.97(d，J＝9.41Hz，1H)。
43b：3-[[(2S,6R)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(2,4-二氧代嘧啶-1-基)-1,4-二噁烷-2-基]甲氧基-(二异丙基氨基)膦烷基]氧基丙腈
将725mg(1.29mmol)的起始化合物53和122mg(0.71mmol)的二异丙基铵盐四氮唑溶于20ml干燥DCM中。在氩气气氛中，在室温，添加429mg(452μl，1.43mmol)的2-氰基乙基N,N,N’,N’-四异丙基亚磷-酰二胺，并将溶液搅拌16小时。在添加另外的122mg(0.71mmol)二异丙基铵盐四氮唑和429mg(452μl，1.43mmol)的2-氰基乙基N,N,N’,N’-四异丙基亚磷酰二胺之后，继续搅拌2小时，以达到完全转化。除去溶剂并将残余物溶于EtOAc中，并用H2O和饱和的NaHCO3溶液洗涤。在用MgSO4干燥后，蒸发溶剂并将粗产物溶于25ml乙醚中。在搅拌下，将有机溶液滴入150ml正戊烷中。将沉淀物过滤，并在40℃真空干燥，得到751mg(76.3％)的标题化合物43b为无色固体。
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.39(br s，1H)，7.65-7.73(m，1H)，7.34-7.43(m，2H)，7.19-7.34(m，7H)，6.84-6.90(m，4H)，5.95(m，1H)，5.66(m，1H)，3.92-4.10(m，2H)，3.78-3.91(m，2H)，3.73(s，6H)，3.41-3.68(m，6H)，3.11(m，1H)，2.98(m，1H)，2.70(m，1H)，2.61(m，1H)，0.94-1.14(m，12H)。
31P-NMR(DMSO-d6，162MHz)δ[ppm]：148.9，148.7。
实施例B.3：
合成方案14
Figure BDA0002760977440001761
54：苯甲酸[(2S,6R)-6-(2,4-二氧代嘧啶-1-基)-2-(三异丙基甲硅烷基氧基甲基)-1,4-二噁烷-2-基]甲基酯
将2.66g(6.42mmol)的40b溶于35ml干燥吡啶中。在室温，逐滴添加1.37g(1.13ml，9.62mmol)苯甲酰氯，并将溶液搅拌16小时，以达到完全转化。真空除去溶剂并将残余物溶于EtOAc中。在用10％水性柠檬酸溶液(2x)、饱和的NaHCO3和NaCl溶液洗涤后，将有机层用MgSO4干燥并蒸发。将粗产物在二氧化硅上提纯(正庚烷中0至100％EtOAc)，得到2.0g(60.0％)的54为无色泡沫。
LCMS-方法C：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝3.02
电离方法：ES+：[M+H]+＝519.4
55：苯甲酸[(2S,6R)-6-(4-氨基-2-氧代-嘧啶-1-基)-2-(三异丙基甲硅烷基氧基甲基)-1,4-二噁烷-2-基]甲基酯
向1.99g(3.61mmol)54的干燥ACN溶液中添加6.28g(8.63ml，61.43mmol)的NEt3和3.06g(43.36mmol)的1H-1,2,4-三唑。将反应混合物冷却至0℃，并在剧烈搅拌下逐滴添加1.66g(1.01ml，10.84mmol)POCl3的15ml干燥ACN溶液。1小时后，真空除去溶剂，并向残余物中添加150ml的饱和的NaHCO3/H2O-混合物(1:1)。将水性混合物用DCM萃取3次，并将合并的有机层用MgSO4干燥。在蒸发溶剂后，将粗产物溶于50ml干燥ACN中，然后添加50ml的NH3-水溶液(32％)。在搅拌过夜后(17h)，将溶液浓缩并将剩余的水性混合物用DCM(2x100ml)萃取。将合并的有机层用MgSO4干燥。蒸发溶剂得到1.93g(定量，粗产物)55为淡黄色泡沫，将其使用无需进一步提纯。
LCMS-方法C：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝2.59
电离方法：ES+：[M+H]+＝518.4
56：苯甲酸[(2S,6R)-6-(4-苯甲酰氨基-2-氧代-嘧啶-1-基)-2-(三异丙基甲硅烷基氧基甲基)-1,4-二噁烷-2-基]甲基酯
将1.93g(3.72mmol)的55溶于30ml干燥吡啶。在室温，逐滴添加0.79g(0.66ml，5.59mmol)苯甲酰氯，并将溶液搅拌18小时，以达到完全转化。真空除去溶剂并将残余物溶于EtOAc中。在用10％水性柠檬酸溶液(2x)、饱和的NaHCO3和NaCl溶液洗涤后，将有机层用MgSO4干燥并蒸发。将粗产物在二氧化硅上提纯(正庚烷中0至100％EtOAc)，得到1.91g(82.5％)的56为无色泡沫。
LCMS-方法C：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝3.27
电离方法：ES+：[M+H]+＝622.5
57：N-[1-[(2R,6R)-6-(羟基甲基)-6-(三异丙基甲硅烷基氧基甲基)-1,4-二噁烷-2-基]-2-氧代-嘧啶-4-基]苯甲酰胺
将952mg(1.53mmol)56溶于20ml EtOH/吡啶(1:1)中。在0℃，添加9.19ml(9.19mmol)的1M NaOH溶液，并且当检测到完全转化时，将溶液在0℃搅拌3小时。使用柠檬酸-单水合物(约650mg，溶于15ml H2O)将pH调至6。蒸发有机溶剂后，将水层用EtOAc萃取。将有机相用水性柠檬酸(10％)、H2O和饱和的NaCl溶液洗涤。经MgSO4干燥并蒸发后，将粗产物在二氧化硅上提纯(正庚烷中0至100％EtOAc)，得到678mg(85.5％)的标题化合物57为无色泡沫。LCMS-方法C：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝2.72
电离方法：ES+：[M+H]+＝518.2
58：N-[1-[(2R,6S)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(三异丙基甲硅烷基氧基-甲基)-1,4-二噁烷-2-基]-2-氧代-嘧啶-4-基]苯甲酰胺
将673mg(1.30mmol)57溶于20ml DCM/吡啶(1:1)中。在室温添加719mg(2.08mmol)DMT-Cl之后，将溶液搅拌2小时。蒸发溶剂并将残余物溶于EtOAc中。在用2x水性柠檬酸(10％)和饱和的NaHCO3溶液洗涤后，将有机层用MgSO4干燥并真空浓缩。将粗产物在二氧化硅上提纯(用正庚烷+0.5％NEt3，正庚烷中0至70％EtOAc进行预处理)，得到975mg(91.5％)的DMT-醚58为淡黄色泡沫。
LCMS-方法C：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝3.61
电离方法：ES-：[M-H]-＝818.4
59：N-[1-[(2R,6S)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(羟基甲基)-1,4-二噁烷-2-基]-2-氧代-嘧啶-4-基]苯甲酰胺
将970mg(1.18mmol)58和1.68g(2.31ml，16.56mmol)NEt3溶于20ml THF中。在添加3.15g(3.18ml，18.93mmol)NEt3·3HF之后，将反应在65℃搅拌48小时，以达到完全转化。在冷却至室温后，将混合物倒入200ml饱和的NaHCO3溶液中，并搅拌1.5小时。在用2x 100mlDCM萃取后，将合并的有机层用MgSO4干燥并蒸发。最后在二氧化硅上提纯(正庚烷中0至100％EtOAc)，得到745mg(94.9％)的59为无色泡沫。
LCMS-方法C：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝2.61
电离方法：ES+：[M+H]+＝664.3
1H-NMR(DMSO-d6，600MHz)δ[ppm]：11.31(br s，1H)，8.13(br d，J＝7.15Hz，1H)，8.00(d，J＝7.66Hz，2H)，7.63(t，J＝7.38Hz，1H)，7.51(t，J＝7.79Hz，2H)，7.36-7.42(m，3H)，7.22-7.33(m，7H)，6.87-6.91(m，4H)，6.03(dd，J＝9.72，3.12Hz，1H)，4.84(t，J＝5.50Hz，1H)，3.94(dd，J＝11.19，3.12Hz，1H)，3.84-3.89(m，1H)，3.72-3.81(m，8H)，3.56(d，J＝11.92Hz，1H)，3.33-3.38(m，1H)，3.16(d，J＝9.35Hz，1H)，3.02(d，J＝9.17Hz，1H)。
43d：N-[1-[(2R,6S)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-[[2-氰基乙氧基-(二异丙基氨基)膦烷基]氧基甲基]-1,4-二噁烷-2-基]-2-氧代-嘧啶-4-基]苯甲酰胺
将715mg(1.08mmol)起始化合物59和559mg(3.23mmol)二异丙基铵盐四氮唑溶于20ml干燥DCM中。在氩气气氛中，在室温，添加502mg(529μl，1.62mmol)2-氰基乙基N,N,N’,N’-四异丙基亚磷-酰二胺，并将溶液搅拌16小时以达到完全转化。在添加40ml H2O之后，将有机层分离，并将水相用DCM萃取。将合并的有机层用MgSO4干燥并蒸发。将粗产物在二氧化硅上提纯(用正庚烷+1.0％NEt3，正庚烷中0至100％MTB-乙醚/DCM(1:1)进行预处理)，得到887mg的标题化合物43d为无色泡沫。
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.30(br s，1H)，8.15(2x d，J＝7.53Hz，1H)，8.00(m，2H)，7.63(m，1H)，7.51(m，2H)，7.20-7.44(m，10H)，6.89(br d，J＝8.72Hz，4H)，6.03-6.13(m，1H)，3.78-4.17(m，4H)，3.74(s，6H)，3.35-3.71(m，6H)，3.20(m，1H)，3.03(m，1H)，2.89(m，1H)，2.72(m，1H)，0.89-1.22(m，12H)。
31P-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：148.2，147.7。
实施例B.4：
合成方案15
Figure BDA0002760977440001801
60：苯甲酸[(2S,6R)-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)-2-(三异丙基甲硅烷基氧基甲基)-1,4-二噁烷-2-基]甲基酯
按照对于化合物54所述的方案，在二氧化硅上提纯(正庚烷中0至100％EtOAc)后，1.0g(2.33mmol)的40a得到1.24g(86.4％)的苯甲酰化的产物60为无色泡沫。
LCMS-方法C：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝3.10
电离方法：ES-：[M-H]-＝531.6
61a：苯甲酸[(2S,6R)-2-(羟基甲基)-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)-1,4-二噁烷-2-基]甲基酯
将1.07g(2.01mmol)的60溶于20ml THF中。在室温，添加1.53g(1.39ml，10.03mmol)吡啶-HF(65％)并将混合物搅拌18小时。在添加另外的3.06g(2.78ml，20.06mmol)吡啶-HF(65％)之后，当检测到完全转化时，将溶液在65℃搅拌5小时。将反应混合物倒入250ml饱和的NaHCO3溶液中。在搅拌1小时后，将混合物用DCM(3x50ml)萃取。将合并的有机层用MgSO4干燥并蒸发。将粗产物在二氧化硅上提纯(正庚烷中0至100％EtOAc)，得到680mg(90.0％)的61a为无色泡沫。
LCMS-方法C：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝1.46
电离方法：ES-：[M-H]-＝375.3
61d：苯甲酸[(2S,6R)-6-(4-苯甲酰氨基-2-氧代-嘧啶-1-基)-2-(羟基甲基)-1,4-二噁烷-2-基]甲基酯
按照对于化合物61a所述的方案，使用10.0当量的吡啶-HF、952mg(1.53mmol)的56得到471mg(66.1％)的61d，为无色泡沫。
LCMS-方法C：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝1.89
电离方法：ES+：[M+H]+＝466.1
62a：苯甲酸[(2R,6R)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)-1,4-二噁烷-2-基]甲基酯
将675mg(1.79mmol)61a溶于10ml DCM/吡啶(1:1)中。在添加806mg(2.33mmol)DMT-Cl的15ml DCM溶液后，将反应溶液在室温搅拌5.5小时，然后添加另外的403mg(1.17mmol)DMT-Cl。当检测到完全转化时，继续搅拌18小时。蒸发溶剂并将残余物溶于EtOAc中。在用水性柠檬酸(10％)和饱和的NaHCO3溶液洗涤2次后，将有机层用MgSO4干燥并真空浓缩。将粗产物在二氧化硅上提纯(用正庚烷+0.5％NEt3，正庚烷中0至100％EtOAc进行预处理)，得到1.15g(94.1％)的DMT-醚62a为无色泡沫。
LCMS-方法C：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝2.76
电离方法：ES-：[M-H]-＝677.3
62d：苯甲酸[(2R,6R)-6-(4-苯甲酰氨基-2-氧代-嘧啶-1-基)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-1,4-二噁烷-2-基]甲基酯
根据对于62a所述的方案，使467mg(1.00mmol)的起始化合物61d经DMT-保护，得到677mg(87.9％)的62d为无色泡沫。
LCMS-方法C：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝2.95
电离方法：ES-：[M-H]-＝766.4
63a：1-[(2R,6R)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(羟基甲基)-1,4-二噁烷-2-基]-5-甲基-嘧啶-2,4-二酮
将起始化合物62a(580mg，0.85mmol)溶于25ml THF/MeOH(4:1)中。在室温，添加4.27ml(8.55mmol)的2M NaOH溶液，并将反应搅拌30分钟。使用固体柠檬酸-单水合物和饱和的NaHCO3溶液将pH调至7。真空除去有机溶剂，并将水相用DCM(2x30ml)萃取。将合并的有机层用MgSO4干燥。蒸发后，得到481mg(98.0％，粗品)的标题化合物63a为无色固体，将其使用无需进一步提纯。
LCMS-方法A：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝1.82
电离方法：ES-：[M-H]-＝573.3
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.35(s，1H)，7.63(s，1H)，7.39(d，J＝7.34Hz，2H)，7.20-7.33(m，7H)，6.89(d，J＝8.31Hz，4H)，5.75(m，1H)，4.83(t，J＝5.81Hz，1H)，3.74(s，6H)，3.57-3.72(m，4H)，3.51-3.56(m，2H)，3.20-3.29(m，2H)，1.79(d，J＝0.86Hz，3H)。
63d：N-[1-[(2R,6R)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(羟基甲基)-1,4-二噁烷-2-基]-2-氧代-嘧啶-4-基]苯甲酰胺
将672mg(0.88mmol)62d溶于20ml EtOH/吡啶(1:1)中。在0℃，添加5.25ml(5.25mmol)的1M NaOH溶液，并将反应搅拌1小时。使用水性柠檬酸溶液将pH调至7。在添加200ml EtOAc和H2O之后，将有机相分离，并用水性柠檬酸溶液(10％)、H2O和NaCl溶液洗涤两次。在用MgSO4干燥并蒸发溶剂后，将粗产物在二氧化硅上提纯(用正庚烷+0.5％NEt3，正庚烷中0至100％EtOAc进行预处理)，得到555mg(95.5％)的标题化合物63d为无色泡沫。
LCMS-方法C：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝2.49
电离方法：ES-：[M-H]-＝662.3
1H-NMR(DMSO-d6，600MHz)δ[ppm]：11.28(br s，1H)，8.31(br d，J＝6.79Hz，1H)，8.00(d，J＝7.66Hz，2H)，7.63(t，J＝7.43Hz，1H)，7.52(t，J＝7.79Hz，2H)，7.39(m，3H)，7.21-7.33(m，7H)，6.87-6.91(m，4H)，5.80(dd，J＝9.81，3.21Hz，1H)，4.89(t，J＝5.96Hz，1H)，3.85(dd，J＝11.19，3.12Hz，1H)，3.79(m，1H)，3.74(s，6H)，3.64(d，J＝11.92Hz，1H)，3.59(m，2H)，3.26-3.30(m，2H)，3.20(t，J＝10.55Hz，1H)。
64a：3-[[(2R,6R)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)-1,4-二噁烷-2-基]甲氧基-(二异丙基氨基)膦烷基]氧基丙腈
根据对于43a所述的方案，将380mg(0.66mmol)的起始化合物63a转化为亚磷酰胺64a。从乙醚/正戊烷中沉淀后，将342mg(66.7％)的标题化合物(64a)分离为无色固体。
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.40，11.39(2x s，1H)，7.63，7.61(2x s，1H)，7.40(m，2H)，7.21-7.35(m，7H)，6.83-6.96(m，4H)，5.77-5.87(m，1H)，3.36-3.90(m，17H)，3.12-3.28(m，1H)，2.66-2.77(m，2H)，1.81-1.79(2x s，3H)，1.02-1.17(m，12H)。
31P-NMR(DMSO-d6，162MHz)δ[ppm]：148.5，148.1。
64d：N-[1-[(2R,6R)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-[[2-氰基乙氧基-(二异丙基氨基)膦烷基]氧基甲基]-1,4-二噁烷-2-基]-2-氧代-嘧啶-4-基]苯甲酰胺
根据对于43d所述的方案，将525mg(0.79mmol)的起始材料63d转化为亚磷酰胺64d。在二氧化硅上色谱提纯(用正庚烷+1.0％NEt3，正庚烷中0至100％MTB-乙醚/DCM(1:1)进行预处理)后，将620mg(90.7％)的标题化合物(64d)分离为无色泡沫。
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.31(br s，1H)，8.22(m，1H)，8.01(d，J＝7.59Hz，2H)，7.57-7.69(m，1H)，7.52(m，2H)，7.39(m，3H)，7.20-7.34(m，7H)，6.86-6.92(m，4H)，5.88(m，1H)，3.39-3.95(m，11H)，3.74(s，6H)，3.26-3.34(m，0.5H)，3.17-3.24(m，0.5H)，2.71-2.77(m，1H)，2.64-2.69(m，1H)，1.03-1.24(m，12H)。
31P-NMR(DMSO-d6，162MHz)δ[ppm]：147.5，147.3。
实施例B.5：
合成方案16
Figure BDA0002760977440001841
65：1-[(2R,6S)-6-(羟基甲基)-6-(三异丙基甲硅烷基氧基甲基)-1,4-二噁烷-2-基]嘧啶-2,4-二酮
将980mg(1.89mmol)的起始材料50溶于40ml THF/MeOH(4:1)中。在0℃，添加9.45ml(18.90mmol)的2M NaOH溶液，并将反应在0℃搅拌1小时。通过添加固体柠檬酸(约1.33g)将溶液调节至pH 7。真空除去有机溶剂，并将水性残余物用100ml EtOAc萃取。将有机层分离，并用饱和的NaHCO3溶液洗涤，并用MgSO4干燥。在蒸发溶剂后，将粗产物在二氧化硅上提纯(DCM中0至5％MeOH)，得到603mg(77.0％)65为无色泡沫。
LCMS-方法A：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝1.90
电离方法：ES+：[M+H]+＝415.3
66：1-[(2R,6R)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(三异丙基甲硅烷基氧基-甲基)-1,4-二噁烷-2-基]嘧啶-2,4-二酮
将597mg(1.44mmol)65和931mg(1.26ml，7.20mmol)DIPEA溶于20ml DCM中。在添加622mg(1.80mmol)DMT-Cl之后，将溶液在室温搅拌22小时，以达到完全转化。真空除去溶剂并将粗产物在二氧化硅上提纯(用正庚烷+0.5％NEt3，正庚烷中0至100％EtOAc进行预处理)，得到860mg(83.3％)的DMT-醚66为无色泡沫。
LCMS-方法A：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝2.25
电离方法：ES+：[M+Na]+＝739.4
67：1-[(2R,6R)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(羟基甲基)-1,4-二噁烷-2-基]嘧啶-2,4-二酮
将854mg(1.19mmol)66添至5.26g(7.23ml，51.49mmol)NEt3和9.55g(9.66ml，57.46mmol)NEt3·3 HF的17ml NMP溶液中。在65℃搅拌2小时后，将反应在室温静置过夜。将反应溶液倒入450ml H2O/饱和的NaHCO3溶液(1:1)中，并将溶液用2x 100ml EtOAc萃取。将合并的有机层用H2O和饱和的NaCl溶液洗涤。在用MgSO4干燥后，将粗产物在二氧化硅上提纯(用正庚烷+0.5％NEt3，正庚烷中10至100％EtOAc进行预处理)，得到666mg(99.7％)的标题化合物67为无色泡沫。
LCMS-方法A：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝1.76
电离方法：ES+：[M+Na]+＝583.3
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.37(s，1H)，7.79(d，J＝8.07Hz，1H)，7.35-7.45(m，2H)，7.20-7.33(m，7H)，6.89(2x d，J＝8.93，4H)，5.72(dd，J＝10.09，3.24Hz，1H)，5.62-5.68(m，1H)，4.84(t，J＝5.75Hz，1H)，3.74(s，6H)，3.71(m，2H)，3.47-3.63(m，3H)，3.14-3.30(m，3H)。
64b：3-[[(2R,6R)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(2,4-二氧代嘧啶-1-基)-1,4-二噁烷-2-基]甲氧基-(二异丙基氨基)膦烷基]氧基丙腈
将650mg(1.16mmol)的起始化合物67和110mg(0.64mmol)的二异丙基铵盐四氮唑溶于16ml干燥DCM中。在氩气气氛中、在室温，添加396mg(418μl，1.28mmol)2-氰基乙基N,N,N’,N’-四异丙基亚磷-酰二胺并将溶液搅拌16小时。除去溶剂并将残余物溶于EtOAc中，并用H2O和饱和的NaHCO3溶液洗涤。在用MgSO4干燥后，蒸发溶剂并将粗产物溶于15ml甲基-叔丁基醚中。在搅拌下，将有机溶液滴入120ml正戊烷中。将沉淀物过滤，并在40℃真空干燥，得到827mg(93.7％)的标题化合物64b为无色固体。
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.39(br s，1H)，7.74(m，1H)，7.35-7.44(m，2H)，7.18-7.35(m，7H)，6.84-6.92(m，4H)，5.73-5.86(m，1H)，5.67(m，1H)，3.54-3.89(m，7H)，3.74(s，6H)，3.35-3.53(m，4H)，3.12-3.28(m，1H)，2.62-2.76(m，2H)，1.02-1.16(m，12H)。31P-NMR(DMSO-d6，162MHz)δ[ppm]：148.5，148.1。
实施例B.6
合成方案17：
Figure BDA0002760977440001861
1g：乙酸[(2S,3S,4R,5R)-4-乙酰氧基-3-苄基氧基-2-(苄基氧基甲基)-5-(6-氯嘌呤-9-基)四氢呋喃-2-基]甲基酯
将12.60g(25.9mmol)的碳水化合物构造单元G3和6.19g(38.9mmol)6-氯-嘌呤溶于175ml干燥ACN中。在氩气气氛中、在0℃，添加12.07g(11.84ml，77.7mmol)DBU和23.26g(18.99ml，103.6mmol)TMSOTf。移除冰浴，并将反应在室温搅拌1小时，并当检测到完全转化时，在80℃搅拌另外小时。将溶液冷却至室温，并倒入500ml饱和的NaHCO3溶液中。在剧烈搅拌1小时后，将水溶液用300ml EtOAc萃取。将有机层分离并用饱和的NaHCO3溶液/H2O(1:1)和饱和的NaCl溶液洗涤，用MgSO4干燥并蒸发。将粗产物(15.78g)在硅胶上提纯(正庚烷中10至100％EtOAc)，得到12.31g(81.8％)的标题化合物1g为淡黄色泡沫。
LCMS-方法C：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝2.57
电离方法：ES-：[M-H+FA]-＝625.1
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：8.80(s，1H)，8.75(s，1H)，7.16-7.39(m，10H)，6.38(d，J＝4.2Hz，1H)，6.10(dd，J＝5.6，4.3Hz，1H)，4.86(d，J＝5.7Hz，1H)，4.54-4.68(m，2H)，4.37-4.47(m，3H)，4.24(d，J＝12.0Hz，1H)，3.69(d，J＝10.1Hz，1H)，3.60(d，J＝10.1Hz，1H)，2.05(s，3H)，1.99(s，3H)。
2g：(2R,3R,4S,5R)-2-(6-氨基嘌呤-9-基)-4-苄基氧基-5-(苄基氧基甲基)-5-(羟基-甲基)四氢呋喃-3-醇
将12.30g(21.2mmol)的氯嘌呤核糖核苷1g溶于40ml ACN中。在添加68.0g(77.2ml，1.40mol)氨水(35％)之后，将反应溶液转移至高压釜中，并在70℃加热18小时。将反应混合物蒸发并将水性残余物用150ml DCM/异丙醇(4:1)萃取3次。将有机层合并，用MgSO4干燥并蒸发，得到9.37g粗产物，将其从400ml ACN中重结晶，得到6.92g(68.5％)的腺苷类似物2g为无色固体。
LCMS-方法C：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝1.69
电离方法：ES+：[M+H]+＝477.9
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：8.22(s，1H)，8.12(s，1H)，7.24-7.42(m，12H)，6.01(d，J＝5.7Hz，1H)，5.72(d，J＝7.3Hz，1H)，5.01(br t，J＝5.1Hz，1H)，4.91-4.98(m，1H)，4.84(d，J＝11.9Hz，1H)，4.60(d，J＝11.7Hz，1H)，4.51(s，2H)，4.34(d，J＝5.3Hz，1H)，3.57-3.72(m，4H)。
2e：N-[9-[(2R,3R,4S,5R)-4-苄基氧基-5-(苄基氧基甲基)-3-羟基-5-(羟基甲基)-四氢呋喃-2-基]嘌呤-6-基]苯甲酰胺
在氩气气氛中，将6.91g(14.5mmol)的2g溶于100ml吡啶中。在室温，添加10.17g(8.41ml，72.4mmol)苯甲酰氯，并将反应搅拌1小时。真空除去溶剂并将残余物溶于H2O中，并用EtOAc萃取。将有机层分离并用1N HCl(2x250ml)、H2O(1x200ml)、饱和的NaHCO3溶液(2x200ml)和饱和的NaCl溶液(1x200ml)洗涤。在用MgSO4干燥后，除去溶剂并将粗产物(14.66g，黄色泡沫)溶于140ml吡啶/EtOH(1:1)中。在室温，添加108.5ml(217.1mmol)2NNaOH，并将反应混合物搅拌30分钟。在添加11ml AcOH之后，将反应溶液真空浓缩。将残余物用200ml H2O处理，并用200ml EtOAc萃取。将有机层用1N HCl(2x200ml)、H2O(1x200ml)和饱和的NaHCO3溶液(1x200ml)洗涤，用MgSO4干燥并蒸发。在二氧化硅上进行粗产物的提纯(9.0g)(正庚烷中20至100％MeOH/EtOAc(9:1))，得到7.25g(86.1％)的标题化合物2e为无色泡沫。
LCMS-方法C：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝2.12
电离方法：ES+：[M+H]+＝582.4
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.19(s，1H)，8.72(s，1H)，8.58(s，1H)，8.05(br d，J＝7.3Hz，2H)，7.64(br t，J＝7.3Hz，1H)，7.52-7.60(br t，2H)，7.25-7.44(m，10H)，6.15(d，J＝5.6Hz，1H)，5.82(d，J＝7.5Hz，1H)，4.99-5.08(m，2H)，4.86(d，J＝11.9Hz，1H)，4.62(d，J＝11.9Hz，1H)，4.52(s，2H)，4.38(d，J＝5.1Hz，1H)，3.59-3.74(m，4H)。
实施例B.7
合成方案18：
Figure BDA0002760977440001891
37e：N-[9-[(1R)-1-[(1S)-1-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-1-(羟基甲基)-2-三异丙基甲硅烷基氧基-乙氧基]-2-羟基-乙基]嘌呤-6-基]苯甲酰胺
将3.55g(4.1mmol)的起始材料23e溶于60ml乙醇中。在氩气气氛中，添加285.5mg(7.4mmol)硼氢化钠，并将混合物在室温搅拌2小时。在将反应混合物冷却至0℃后，添加50ml柠檬酸，然后添加饱和的NaHCO3溶液以达到pH 7。真空除去溶剂，并将水性残余物用H2O稀释并用EtOAc萃取。将有机层分离并用饱和的NaHCO3溶液和饱和的NaCl溶液洗涤。在用MgSO4干燥后，除去溶剂并将粗产物在二氧化硅上提纯(DCM中0至5％MeOH)，得到2.15g的所需二醇37e为淡黄色泡沫。
LCMS-方法C：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝3.21
电离方法：ES+：[M+H]+＝862.7
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.14(s，1H)，8.66(s，1H)，8.47(s，1H)，8.05(br d，J＝7.3Hz，2H)，7.61-7.67(m，1H)，7.51-7.60(m，2H)，7.36(d，J＝7.3Hz，2H)，7.27(br t，J＝7.6Hz，2H)，7.17-7.23(m，5H)，6.83(dd，J＝9.0，3.0Hz，4H)，6.43(t，J＝5.7Hz，1H)，5.17(t，J＝5.7Hz，1H)，4.63(t，J＝4.7Hz，1H)，3.76-3.99(m，2H)，3.55-3.76(m，10H)，3.17-3.26(m，1H)，3.05(d，J＝9.7Hz，1H)，0.78-1.02(m，21)。
38e：4-甲基-苯磺酸[(2R)-2-(6-苯甲酰氨基嘌呤-9-基)-2-[(1S)-1-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-1-(羟基甲基)-2-三异丙基甲硅烷基氧基-乙氧基]乙基]酯
将2.15g(2.5mmol)的二醇37e溶于60ml DCM中。在室温，添加891.4mg(1.22ml，8.7mmol)NEt3、503.8mg(2.6mmol)的对-甲苯磺酰氯和30.8mg(0.25mmol)DMAP，并将溶液搅拌0.5小时。在2小时和4小时后，在添加额外的167.9mg(0.9mmol)对-甲苯磺酰氯之后，将溶液搅拌另外的15小时，以达到完全转化。在添加150ml H2O之后，将有机层分离并用MgSO4干燥。除去溶剂和所得的粗产物(2.56g)38e，其无需进一步提纯使用。
LCMS-方法C：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝3.46
电离方法：ES-：[M-H]-＝1014.8
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.20(br s，1H)，8.53(s，1H)，8.43(s，1H)，8.04-8.10(m，2H)，7.62-7.70(m，1H)，7.54-7.60(m，2H)，7.43-7.48(m，2H)，7.12-7.35(m，11H)，6.77-6.86(m，4H)，6.58(m，1H)，4.80(m，1H)，4.59(m，1H)，4.35(m，1H)，3.73(s，3H)，3.72(s，3H)，3.50-3.67(m，4H)，3.21(m，1H)，3.09(m，1H)，2.35(s，3H)，0.82(br s，21H)。
39e：9-[(2R,6S)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(三异丙基甲硅烷基-氧基甲基)-1,4-二噁烷-2-基]嘌呤-6-胺
向2.45g(2.4mmol)的甲苯磺酸酯38e的50ml二噁烷溶液中添加36.16ml(72.3mmol)2M NaOH。在80℃搅拌2小时后，将反应混合物冷却至室温，并将有机溶剂蒸发。向水性残余物中添加250ml H2O和150ml DCM，随后添加4.5ml乙酸。将有机层分离并用饱和的NaHCO3溶液洗涤。在用MgSO4干燥后，除去溶剂并将粗产物在二氧化硅上提纯(在DCM中0至50％MeOH/EtOAc(1:1))，得到1.22g的二噁烷39e(68.6％)为淡黄色泡沫。
LCMS-方法C：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝3.41
电离方法：ES+：[M+H]+＝740.6
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：8.33(s，1H)，8.16(s，1H)，7.11-7.45(m，11H)，6.72-6.79(m，4H)，6.13(m，1H)，4.13-4.26(m，2H)，4.04(m，1H)，3.93(m，1H)，3.5(m，1H)，3.71(s，3H)，3.70(s，3H)，3.66(br d，J＝11.6Hz，1H)，3.06(d，J＝9.5Hz，1H)，2.92(d，J＝9.5Hz，1H)，0.88-0.95(m，21H)。
44e：N-[9-[(2R,6S)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(三异丙基甲硅烷基-氧基甲基)-1,4-二噁烷-2-基]嘌呤-6-基]苯甲酰胺
在氩气气氛中，将1.84g(2.5mmol)的二噁烷39e溶于30ml干燥吡啶中。在室温，添加1.05g(867μl，7.5mmol)苯甲酰氯，并将反应搅拌3小时。真空除去溶剂并将残余物溶于H2O中，并用EtOAc萃取。将有机层分离并用柠檬酸溶液(10％)(2x 100ml)、H2O(1x 100ml)和饱和的NaHCO3溶液(1x 100ml)洗涤。在用MgSO4干燥后，除去溶剂，并将粗产物(2.61g，黄色泡沫)溶于40ml吡啶/EtOH(1:1)中。在0℃，添加7.46ml(14.9mmol)2N NaOH，并将反应混合物搅拌30分钟。在添加864μl AcOH之后，将反应溶液真空浓缩。将残余物用100ml H2O处理，并用100ml EtOAc萃取。将有机层分离并用柠檬酸溶液(10％)(2x 100ml)、H2O(1x 100ml)、饱和的NaHCO3溶液(1x 100ml)和饱和的NaCl溶液(1x 100ml)洗涤，用MgSO4干燥并蒸发。在二氧化硅上进行粗产物的提纯(2.19g)(正庚烷中0至70％EtOAc)，得到1.72g(82.0％)的标题化合物44e为无色泡沫。
LCMS-方法C：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝3.56
电离方法：ES-：[M-H]-＝842.8
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.26(br s，1H)，8.77(s，1H)，8.68(s，1H)，8.05(m，2H)，7.64(br t，J＝7.3Hz，1H)，7.56(m，2H)，7.37(dd，J＝7.8，1.5Hz，2H)，7.13-7.28(m，7H)，6.76(dd，J＝8.9，1.7Hz，4H)，6.28(dd，J＝10.1，3.4Hz，1H)，4.20-4.36(m，2H)，4.12(m，1H)，3.84-3.99(m，2H)，3.64-3.75(m，7H)，3.06(m，1H)，2.96(m，1H)，0.88-1.06(m，21H)。
45e：N-[9-[(2R,6S)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(羟基甲基)-1,4-二噁烷-2-基]嘌呤-6-基]苯甲酰胺
将1.10g(1.3mmol)的甲硅烷基醚44e溶于20ml NMP中。在添加3.47g(3.50ml，20.9mmol)NEt3.HF和1.85g(2.54ml，18.2mmol)NEt3之后，将反应溶液在65℃搅拌18小时。在冷却至室温后，添加250ml饱和的NaHCO3溶液和150ml EtOAc，并将混合物搅拌30分钟。将有机层分离并用饱和的NaHCO3溶液洗涤，并用饱和的NaCl溶液洗涤两次。在用MgSO4干燥后，除去溶剂并将粗产物通过硅胶色谱提纯(用0.5％NEt3，正庚烷中0至100％EtOAc进行预处理)，得到852mg(95.1％)的45e为无色泡沫。
LCMS-方法C：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝2.43
电离方法：ES+：[M+H]+＝688.3
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.22(br s，1H)，8.75(s，1H)，8.59(s，1H)，8.04(d，J＝7.6Hz，2H)，7.64(t，J＝7.1Hz，1H)，7.55(t，J＝7.6Hz，2H)，7.38(d，J＝7.6Hz，2H)，7.14-7.32(m，7H)，6.80(m，4H)，6.26(dd，J＝9.8，3.3Hz，1H)，4.85(t，J＝5.4Hz，1H)，4.29(t，J＝10.6Hz，1H)，4.09(dd，J＝11.1，3.2Hz，1H)，3.73-3.90(m，4H)，3.72(s，3H)，3.71(s，3H)，3.03(m，1H)，2.95(m，1H)。
43e：N-[9-[(2R,6S)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-[[2-氰基乙氧基-(二异丙基氨基)膦烷基]氧基甲基]-1,4-二噁烷-2-基]嘌呤-6-基]苯甲酰胺
将848mg(1.2mmol)的起始材料45e和640mg(3.7mmol)二异丙基铵盐四氮唑溶于25ml干燥DCM中。在氩气气氛中，在室温，添加574.7mg(1.9mmol)的2-氰基乙基-N,N,N’,N’-四异丙基亚磷酰二胺。16小时后，添加50ml H2O。将有机层分离，并将水相用DCM萃取。将合并的有机层用MgSO4干燥并在35℃真空除去溶剂。将粗产物溶于10ml EtOAc/乙醚(1:1)中，并添加40ml正戊烷。通过离心收集沉淀物并弃去溶剂。重复沉淀程序3次，在Speedvac上干燥后得到991mg(90.5％)的所需产物43e为无色固体。
LCMS-方法B-3：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝0.61
电离方法：ES+：[M+H-iPr2N+OH]+＝805.3
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]11.21(br s，1H)，8.76，8.74(2x s，1H)，8.63，8.61(2x s，1H)，8.04(d，J＝7.3Hz，2H)，7.65(t，J＝7.3Hz，1H)，7.55(m，2H)，7.37(br d，J＝8.3Hz，2H)，7.14-7.30(m，7H)，6.75-6.86(m，4H)，6.30(m，1H)，4.27(m，1H)，3.85-4.17(m，4H)，3.61-3.80(m，9H)，3.49(m，2H)，3.08(m，1H)，2.98(dd，J＝9.1，7.1Hz，1H)，2.72(m，1H)，2.62(m，1H)，1.04-1.14(m，6H)，1.02(m，3H)，0.93(d，J＝6.8Hz，3H)。
31P-NMR(DMSO-d6，162MHz)δ[ppm]：147.7，147.6。
实施例B.8
合成方案19：
Figure BDA0002760977440001931
40c：N-[9-[(2R,6R)-6-(羟基甲基)-6-(三异丙基甲硅烷基氧基甲基)-1,4-二噁烷-2-基]-6-氧代-1H-嘌呤-2-基]-2-甲基-丙酰胺
在0℃、在N2气氛中，向DMT-醚44(9.5g，11.5mmol；参见合成方案12)的190ml无水DCM的溶液中逐滴添加DCAA(29.7g，230mmol)。在室温搅拌30分钟后，TLC显示完全转化。将混合物用饱和NaHCO3溶液(100ml)中和，并用DCM(3x200ml)萃取。将有机层合并，并用饱和的NaCl溶液(200ml)洗涤。在用无水Na2SO4干燥后，将有机溶液蒸发并将粗产物通过制备型HPLC提纯(ACN，0.1％FA)，得到9.5g(61.2％)的所需产物40c为白色固体。
LCMS-方法C：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝2.68
电离方法：ES+：[M+H]+＝524.4
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：12.10(br s，1H)，11.53(br s，1H)，8.21(s，1H)，5.88(dd，J＝9.8，3.3Hz，1H)，4.75(t，J＝6.0Hz，1H)，4.06(d，J＝9.5Hz，1H)，3.98(dd，J＝11.4，3.3Hz，1H)，3.86(d，J＝11.7Hz，1H)，3.74-3.83(m，2H)，3.61(d，J＝11.7Hz，1H)，3.46(d，J＝6.1Hz，2H)，2.79(m，1H)，1.00-1.16(m，27H)。
60c：苯甲酸[(2S,6R)-6-[2-(2-甲基丙酰基氨基)-6-氧代-1H-嘌呤-9-基]-2-(三异丙基甲硅烷基氧基-甲基)-1,4-二噁烷-2-基]甲基酯
将2.80g(5.35mmol)的起始材料40c溶于20ml干燥吡啶中。在添加949mg(784μl，6.68mmol)苯甲酰氯和667mg(5.35mmol)DMAP之后，将反应溶液在室温搅拌4小时。添加另外的189mg(157μl，1.37mmol)苯甲酰氯，并将反应搅拌过夜，以达到完全转化。真空除去溶剂，将残余物溶于EtOAc并用5％水性柠檬酸溶液、5％水性NaHCO3溶液和饱和的NaCl溶液洗涤。在用MgSO4干燥后，将有机层蒸发，并将粗产物在硅胶上提纯(DCM中0至10％MeOH)，得到3.33g(99.2％)的苯甲酰基酯60c为无色泡沫。
LCMS-方法C：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝3.06
电离方法：ES+：[M+H]+＝628.5
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.84(s，1H)，11.58(s，1H)，8.09(s，1H)，7.79-7.86(m，2H)，7.56-7.64(m，1H)，7.41-7.49(m，2H)，5.89(dd，J＝5.9Hz，3.4Hz，1H)，4.18-4.32(m，3H)，4.07(m，1H)，3.77-4.02(m，4H)，2.79(m，1H)，0.93-1.21(m，27H)。
61c：苯甲酸[(2S,6R)-2-(羟基甲基)-6-[2-(2-甲基丙酰基氨基)-6-氧代-1H-嘌呤-9-基]-1,4-二噁烷-2-基]甲基酯
将3.30g(5.26mmol)的甲硅烷基醚60c溶于33ml DMF中。在添加8.06g(78.9mmol，11.1ml)NEt3和6.49g(39.4mmol，6.56ml)NEt3·3HF之后，将溶液在75℃搅拌2小时，以达到完全转化。将反应冷却至室温，并用100ml 5％-NaHCO3溶液洗涤。过滤后，将水溶液用DCM萃取。将有机层分离，用MgSO4干燥并蒸发。将粗产物通过HPLC提纯(柱：Chiralcel OD-H/74，250x4.6mm，1.0ml/min，30℃；洗脱液：庚烷/EtOH 5:2)，得到1.20g(48.4％)的所需产物61c为无色固体。
LCMS-方法C：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝1.40
电离方法：ES+：[M+H]+＝472.3
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.89(s，1H)，11.67(s，1H)，8.08(s，1H)，7.87(d，J＝7.7Hz，2H)，7.62(t，J＝7.2Hz，1H)，7.47(t，J＝7.6Hz，2H)，5.92(dd，J＝6.6，3.3Hz，1H)，5.11(t，J＝5.7Hz，1H)，4.14-4.26(m，3H)，4.03(dd，J＝12.0，3.4Hz，1H)，3.90(d，J＝12.0Hz，1H)，3.79(d，J＝12.0Hz，1H)，3.70(m，2H)，2.79(spt，J＝6.8Hz，1H)，1.15(d，J＝6.9Hz，3H)，1.11(d，J＝6.7Hz，3H)。
62c：苯甲酸[(2R,6R)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-[2-(2-甲基丙酰基-氨基)-6-氧代-1H-嘌呤-9-基]-1,4-二噁烷-2-基]甲基酯
将1.20g(2.55mmol)的伯醇61c溶于25ml干燥吡啶中。添加647mg(6.36mmol，891μl)NEt3和1.78g(5.09mmol)DMT-Cl，并将溶液在室温搅拌1小时，然后在80℃搅拌4小时。在冷却至室温后，添加1ml MeOH，并将溶液用EtOAc稀释。将有机溶液用10％水性柠檬酸溶液和饱和的NaCl溶液洗涤。在有机相经MgSO4干燥后，蒸发溶剂，并将粗产物通过硅胶色谱提纯(DCM中0至5％MeOH)，得到1.97g(定量)的所需DMT-醚62c为淡黄色固体。
LCMS-方法C：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝2.75
电离方法：ES+：[M+H]+＝774.4
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.78(s，1H)，11.53(s，1H)，8.06(s，1H)，7.50-7.55(m，2H)，7.31-7.41(m，5H)，7.14-7.29(m，7H)，6.81(br d，J＝8.9Hz，2H)，6.77(d，J＝8.9Hz，2H)，5.72(m，1H)，4.19-4.35(m，3H)，4.01-4.11(m，3H)，3.66(s，3H)，3.63(s，3H)，3.34(d，J＝8.8Hz，1H)，3.16(d，J＝8.7Hz，1H)，2.75(m，1H)，1.13(d，J＝6.9Hz，3H)，1.08(d，J＝6.7Hz，3H)。
63c：N-[9-[(2R,6R)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(羟基甲基)-1,4-二噁烷-2-基]-6-氧代-1H-嘌呤-2-基]-2-甲基-丙酰胺
将1.97g(2.55mmol)的苯甲酰基酯62c溶于40ml EtOH/吡啶(3:1)中。在添加12.9ml(25.8mmol)的2M NaOH溶液之后，将混合物在室温搅拌30分钟，以达到完全转化。在用柠檬酸(固体)中和后，真空除去EtOH，并将残余物用50ml EtOAc和25ml H2O稀释。将沉淀物通过过滤除去，并从滤液中将有机层分离并用饱和的NaCl溶液洗涤。在用MgSO4干燥后，除去溶剂并将粗产物在二氧化硅上提纯(DCM中0至5％MeOH)，得到0.99g(58.0％)的标题化合物63c为无色泡沫。
LCMS-方法C：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝2.46
电离方法：ES+：[M+H]+＝670.4
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：12.10(s，1H)，11.52(s，1H)，8.19(s，1H)，7.20-7.42(m，9H)，6.85-6.93(m，4H)，5.62(dd，J＝9.7，3.3Hz，1H)，4.81(br t，1H)，3.91-3.99(m，2H)，3.74(s，3H)，3.73(s，3H)，3.65-3.76(m，1H)，3.41-3.59(m，4H)，3.15(d，J＝9.1Hz，1H)，2.77(m，1H)，1.13(m，6H)。
64c：N-[9-[(2R,6R)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-[[2-氰基乙氧基-(二异丙基氨基)膦烷基]氧基甲基]-1,4-二噁烷-2-基]-6-氧代-1H-嘌呤-2-基]-2-甲基-丙酰胺
将985mg(1.47mmol)的起始材料63c溶于30ml干燥DCM中。在氩气气氛中，添加133mg(735μmol)iPr2NH-四唑和571mg(1.84mmol，602μl)的2-氰基乙基-N,N,N’,N’-四异丙基亚磷酰二胺，并将溶液在室温搅拌过夜。在添加50ml H2O和DCM之后，将有机层分离，用MgSO4干燥并蒸发。将粗产物通过硅胶色谱提纯(用正庚烷+1％NEt3，正庚烷中0至100％EtOAc进行预处理)，得到1.07g(83.8％)的所需亚磷酰胺64c为无色泡沫。
LCMS-方法C：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝2.42
电离方法：ES+：[M+H-iPr2N+OH]+＝787.4
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：12.08(br s，1H)，11.55(br s，1H)，8.06，8.05(2x s，1H)，7.18-7.44(m，9H)，6.82-6.94(m，4H)，5.65(m，1H)，3.66-4.01(m，3H)，3.73(s，3H)，3.72(s，3H)，3.35-3.65(m，6H)，3.21-3.29(m，1H)，2.72-2.83(m，1H)，2.59-2.72(m，2H)，0.90-1.22(m，20H)。
31P-NMR(DMSO-d6，162MHz)δ[ppm]：147.7，147.3。
40e：N-[9-[(2R,6R)-6-(羟基甲基)-6-(三异丙基甲硅烷基氧基甲基)-1,4-二噁烷-2-基]嘌呤-6-基]苯甲酰胺
将615mg(729μmol)的DMT-醚44e溶于25ml DCM中。在添加949mg(608μl，7.3mmol)二氯乙酸之后，将反应混合物搅拌1分钟，以达到完全转化。将反应溶液用100ml饱和的NaHCO3溶液洗涤。将有机层分离，并将水相用35ml DCM萃取两次。将合并的有机萃取物用MgSO4干燥并蒸发。将粗产物通过硅胶色谱提纯(正庚烷中0至100％EtOAc)，得到302mg(76.5％)的所需产物40e为无色泡沫。
LCMS-方法C：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝2.70
电离方法：ES+：[M+H]+＝542.5
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.20(s，1H)，8.75(s，1H)，8.69(s，1H)，8.04(d，J＝7.5Hz，2H)，7.65(m，1H)，7.55(m，2H)，6.23(m，1H)，4.75(t，J＝6.1Hz，1H)，4.01-4.12(m，3H)，3.94(d，J＝9.9Hz，1H)，3.86(d，J＝11.9Hz，1H)，3.65(d，J＝11.7Hz，1H)，3.44(m，2H)，1.10-1.17(m，3H)，1.04-1.09(m，18H)。
60e：苯甲酸[(2S,6R)-6-[6-(二苯甲酰基氨基)嘌呤-9-基]-2-(三异丙基甲硅烷基氧基甲基)-1,4-二噁烷-2-基]甲基酯
在室温，向299mg(552μmol)的游离醇40e的10ml干燥吡啶溶液中添加94.0mg(77.7μl，662.3μmol)的苯甲酰氯。18小时后，浓缩溶剂至5ml的体积，并添加另外的94.0mg的苯甲酰氯。在室温另外60分钟后，添加额外的282mg苯甲酰氯，并将溶液搅拌过夜。除去溶剂并将残余物用H2O和EtOAc处理。将有机层分离，并用柠檬酸溶液(10％)、饱和的NaHCO3溶液和饱和的NaCl溶液洗涤两次。在用MgSO4干燥后，除去溶剂并将粗产物在二氧化硅上提纯(正庚烷中0至100％EtOAc)，得到405mg(97.8％)的60e为无色泡沫。
LCMS-方法C：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝3.49
电离方法：ES+：[M+H]+＝750.7
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：8.74(s，1H)，8.62(s，1H)，7.92-7.97(m，2H)，7.74-7.79(m，4H)，7.42-7.67(m，9H)，6.28(dd，J＝9.4，3.4Hz，1H)，4.22-4.35(m，4H)，4.16(m，1H)，4.01(m，2H)，3.78(m，1H)，1.06-1.14(m，3H)，0.97-1.05(m，18H)。
61e：苯甲酸[(2S,6R)-6-[6-(二苯甲酰基氨基)嘌呤-9-基]-2-(羟基甲基)-1,4-二噁烷-2-基]甲基酯
使用对于45e所述的方案，将402mg(536μmol)的甲硅烷基醚60e脱保护。在二氧化硅上色谱提纯(正庚烷中0至100％EtOAc)后，将194mg(61.0％)的所需产物61e分离为无色泡沫。
LCMS-方法C：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝2.22
电离方法：ES+：[M+H]+＝594.5
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：8.71(s，1H)，8.59(s，1H)，7.97(m，2H)，7.77(m，4H)，7.43-7.67(m，9H)，6.27(m，1H)，5.14(m，1H)，4.20-4.36(m，3H)，4.12(m，1H)，3.95(m，1H)，3.75-3.91(m，3H)。
62e：苯甲酸[(2R,6R)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-[6-(二苯甲酰基氨基)-嘌呤-9-基]-1,4-二噁烷-2-基]甲基酯
将190mg(320μmol)的起始材料61e溶于10ml干燥吡啶并蒸发。将该程序重复3次。然后将化合物溶于10ml干燥吡啶中，随后添加48.7mg(66.9μl，480μmol)NEt3和166mg(480μmol)DMT-Cl。在室温搅拌过夜后，添加另外的97.4mg NEt3和332mg DMT-Cl，并将溶液搅拌额外的18小时，以达到完全转化。真空除去溶剂并将残余物溶于EtOAc中。在用H2O、柠檬酸溶液(2x)、饱和的NaHCO3溶液和饱和的NaCl溶液洗涤后，将有机相用MgSO4干燥。蒸发溶剂并通过硅胶色谱提纯(正庚烷中0至100％EtOAc)，得到216mg(75.3％)的DMT-醚62e为淡黄色泡沫。
LCMS-方法C：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝3.17
电离方法：ES+：[M+H]+＝896.5
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)8.75(s，1H)，8.61(s，1H)，7.73-7.80(m，7H)，7.65(m，1H)，7.58(m，2H)，7.42-7.50(m，6H)，7.36-7.41(m，2H)，7.22-7.29(m，6H)，6.78-6.84(m，4H)，6.07(m，1H)，4.36(m，2H)，4.22(m，1H)，3.99-4.14(m，2H)，3.84(d，J＝11.9Hz，1H)，3.68(s，6H)，3.44-3.57(m，2H)。
63e：N-[9-[(2R,6R)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(羟基甲基)-1,4-二噁烷-2-基]嘌呤-6-基]苯甲酰胺
将起始材料62e(213mg，238μmol)溶于8ml EtOH/吡啶(3:1)中。在0℃添加1.19ml(2.4mmol)2M NaOH之后，在0℃将溶液搅拌10分钟，并在室温搅拌60分钟，以达到完全转化。添加166mg柠檬酸-单水合物，然后添加50ml H2O和50ml EtOAc。将有机层分离并用10％柠檬酸溶液(2x)、H2O、饱和的NaHCO3溶液和饱和的NaCl溶液洗涤。在用MgSO4干燥后，将粗产物在二氧化硅上提纯(在DCM中0至100％丙酮)，得到134mg(82.0％)的63e为无色泡沫。
LCMS-方法C：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝2.44
电离方法：ES+：[M+H]+＝688.4
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)11.21(br s，1H)，8.72(s，1H)，8.67(s，1H)，8.04(m，2H)，7.65(m，1H)，7.55(m，2H)，7.45(m，2H)，7.29-7.37(m，6H)，7.23(m，1H)，6.91(dd，J＝9.0，2.0Hz，4H)，6.01(m，1H)，4.84(t，J＝5.9Hz，1H)，3.94-4.02(m，2H)，3.83(m，1H)，3.74(s，6H)，3.68-3.73(m，1H)，3.49-3.55(m，2H)，3.38(m，2H)。
64e：N-[9-[(2R,6R)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-[[2-氰基乙氧基-(二异丙基氨基)膦烷基]氧基甲基]-1,4-二噁烷-2-基]嘌呤-6-基]苯甲酰胺
根据对于其立体异构体43e所述的方案，将131mg(190μmol)的起始化合物63e亚磷酰化，得到定量产率的所需的亚磷酰胺64e。
LCMS-方法B-3：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝0.61
电离方法：ES+：[M+H-iPr2N+OH]+＝805.3
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]11.20(br s，1H)，8.74，8.73(2x s，1H)，8.62，8.60(2x s，1H)，8.05(d，J＝7.4Hz，2H)，7.65(m，1H)，7.55(m，2H)，7.45(d，J＝7.3Hz，2H)，7.29-7.36(m，6H)，7.24(m，1H)，6.91(m，4H)，6.06(m，1H)，3.99-4.14(m，2H)，3.62-3.90(m，11H)，3.37-3.62(m，5H)，2.71(m，1H)，2.64(m，1H)，1.06-1.13(m，6H)，1.03(d，J＝6.7Hz，3H)，0.97(m，3H)。
31P-NMR(DMSO-d6，162MHz)δ[ppm]：147.7，147.6。
合成式(III)的靶向的核苷酸类似物
实施例C.1：
合成方案20
Figure BDA0002760977440002011
69：乙酸[(3aR,5R,6R,7R,7aR)-6,7-二乙酰氧基-2-甲基-5,6,7,7a-四氢-3aH-吡喃并[3,2-d]噁唑-5-基]甲基酯
在30℃，向20.0g(51.4mmol)D-半乳糖胺五乙酸盐(68)的200ml DCE溶液中逐滴添加17.1g(77.1mmol)TMSOTf。将混合物加热至50℃持续2小时。在室温静置过夜后，检测到完全转化。将混合物用NaHCO3(8.63g，102.8mmol)的1l水溶液淬灭，并用2x500ml DCM萃取。合并的有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩，得到19.0g的标题化合物69(粗品)，将其使用无需进一步提纯。
LCMS-方法A：
ELSD:Rt[min]＝0.90
电离方法：ES+：[M+H]+＝330.1
70g：12-苄基氧基十二烷-1-醇
将14.05g(68.76mmol)1,12-十二烷二醇溶于150ml干燥DMF中。在0℃，在30分钟内，以4份添加2.75g(68.76mmol)NaH(60％)。移除冰浴，并将溶液在室温搅拌3小时，然后在0℃添加10.0g(6.99ml，57.33mmol)苄基溴的50ml干燥DMF溶液。将反应在室温搅拌过夜。在添加另外的1.99g(49.8mmol)的NaH(60％)之后，继续搅拌4小时。将反应混合物倒入500ml冰水中，并用乙醚和EtOAc萃取。将有机层用饱和的NaCl溶液洗涤，用MgSO4干燥并蒸发。将粗产物在二氧化硅上提纯(正庚烷中0至60％EtOAc)，得到6.91g(41.2％)的标题化合物70g为白色固体。
LCMS-方法A：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝2.09
电离方法：ES+：[M+H]+＝293.3
用于制备化合物71a至71g的通用程序D
向噁唑啉69(1.0当量)的干燥DCE(200ml/50.0mmol)和醇70a-70g(1.10当量)溶液中添加分子筛
Figure BDA0002760977440002021
(20.0g)。在室温，逐滴添加TMSOTf(0.5当量)，并将溶液搅拌直至达到完全转化。将反应通过添加NaHCO3(2.0当量)的400ml H2O溶液淬灭。将有机相分离，并将水层用2x 100ml DCM萃取。将合并的有机萃取物用Na2SO4干燥并真空浓缩。将粗产物通过硅胶色谱提纯，得到糖苷71a至70g。
71a：乙酸[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-乙酰氨基-3,4-二乙酰氧基-6-(2-苄基氧基乙氧基)四氢吡喃-2-基]甲基酯
根据通用程序D，在硅胶色谱(PE/EtOAc 1:2)后，17.0g(51.37mmol)69和8.6g(56.56mmol)70a得到18.87g(76.4％)的标题化合物71a，为黄色油状物。
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：7.83(d，J＝9.29Hz，1H)，7.41-7.20(m，5H)，5.22(d，J＝3.30Hz，1H)，4.98(dd，J＝11.25，3.42Hz，1H)，4.58(d，J＝8.44Hz，1H)，4.52-4.43(m，2H)，4.03(s，2H)，3.96-3.80(m，2H)，3.69-3.49(m，3H)，2.12-2.08(m，3H)，1.99(s，3H)，1.89(s，3H)，1.74(s，3H)。
71b：乙酸[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-乙酰氨基-3,4-二乙酰氧基-6-[2-(2-苄基氧基乙氧基)乙氧基]-四氢吡喃-2-基]甲基酯
根据通用程序D，在硅胶色谱后，14.0g(42.5mmol)69和7.5g(38.2mmol)70b得到10.6g(48％)的标题化合物71b，为黄色油状物。
MS:电离方法：ES+：[M+H]+＝526.3
71c：乙酸[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-乙酰氨基-3,4-二乙酰氧基-6-[2-[2-(2-苄基氧基乙氧基)乙氧基]-乙氧基]四氢吡喃-2-基]甲基酯
根据通用程序D，在硅胶色谱后，16.0g(48.6mmol)69和14.0g(58.3mmol)70c得到15.6g(57％)的标题化合物71c，为无色油状物。
MS:电离方法：ES+：[M+H]+＝570.1
71d：乙酸[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-乙酰氨基-3,4-二乙酰氧基-6-[2-[2-[2-(2-苄基氧基乙氧基)-乙氧基]乙氧基]乙氧基]四氢吡喃-2-基]甲基酯
根据通用程序D，在硅胶色谱后19.0g(51.4mmol)69和17.5g(61.7mmol)70d得到10.0g(32％)的标题化合物71d，为无色油状物。
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：7.79(d，J＝9.3Hz，1H)，7.40-7.25(m，5H)，5.27-5.20(m，1H)，5.22(d，J＝3.3Hz，1H)，4.98(dd，J＝3.4，11.2Hz，1H)，4.49(s，2H)，4.08-3.99(m，3H)，3.94-3.75(m，2H)，3.62-3.43(m，16H)，2.15-2.07(m，3H)，2.00(s，3H)，1.90(s，3H)，1.78(s，3H)。
71e：乙酸[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-乙酰氨基-3,4-二乙酰氧基-6-[2-[2-[2-[2-(2-苄基氧基乙氧基)-乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]四氢吡喃-2-基]甲基酯
根据通用程序D，在硅胶色谱后，35.0g(64.2mmol，60％纯度)69和23.2g(70.6mmol)70e得到13.4g(32％)的标题化合物71e，为黄色油状物。1H-NMR(CDCl3，400MHz)δ[ppm]：7.44-7.29(m，5H)，6.63(d，J＝9.29Hz，1H)，5.33(d，J＝2.76Hz，1H)，5.01(dd，J＝11.17，3.39Hz，1H)，4.80(d，J＝8.66Hz，1H)，4.58(s，2H)，4.33-4.01(m，4H)，3.98-3.80(m，3H)，3.77-3.54(m，20H)，2.18-2.16(m，3H)1.99(s，6H)1.87(s，3H)。
71f：乙酸[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-乙酰氨基-3,4-二乙酰氧基-6-(5-苄基氧基戊氧基)四氢吡喃-2-基]甲基酯
根据通用程序D，在硅胶色谱(DCM中0至10％MeOH)后，1.69g(5.13mmol)69和1.10g(1.09ml，5.39mmol)70f得到2.60g(96.7％)的标题化合物71f为无色油状物。
1H-NMR(CDCl3，400MHz)δ[ppm]：7.36-7.28(m，6H)，5.24(d，J＝12.0Hz，1H)，5.37(d，J＝2.4Hz，1H)，5.34-5.31(m，1H)，4.71(d，J＝8.0Hz，1H)，4.51(s，2H)，4.17-4.14(m，2H)，3.93-3.90(m，3H)，3.50-3.47(m，3H)，2.15(s，3H)，2.06(s，3H)，1.92(s，3H)，1.68(s，3H)，1.66-1.61(m，4H)，1.48-1.44(m，2H)。
71g：乙酸[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-乙酰氨基-3,4-二乙酰氧基-6-(12-苄基氧基十二烷氧基)四氢吡喃-2-基]甲基酯
根据通用程序D，在硅胶色谱(EtOAc中10至100％DCM)后，4.16g(12.62mmol)69和4.43g(15.14mmol)70g得到5.69g(72.6％)的标题化合物71g，为淡黄色油状物。
LCMS-方法A：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝2.07
电离方法：ES+：[M+H]+＝622.4
用于制备化合物72a至72g的通用程序E
将苄基醚71a-g溶于THF(40mmol在370ml中)。在添加5g Pd/C(10％，含50％H2O)之后，将混合物在室温、在H2(15psi)气氛中搅拌，直至观察到完全脱苄基化。将混合物过滤，并将滤液真空蒸发。最后在二氧化硅上提纯得到所需的标题化合物72a-g。
72a：乙酸[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-乙酰氨基-3,4-二乙酰氧基-6-(2-羟基乙氧基)四氢吡喃-2-基]甲基酯
根据通用程序E，在二氧化硅上提纯(EtOAc/MeOH 10:1)后，18.87g(39.19mmol)71a得到11.6g(75.8％)72a为无色固体。
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：7.81(br d，J＝9.03Hz，1H)，5.22(br d，J＝2.38Hz，1H)，4.98(br dd，J＝10.98，2.57Hz，1H)，4.66-4.44(m，2H)，4.04(s，3H)，3.94-3.79(m，1H)，3.68(br d，J＝4.64Hz，1H)，3.49(br s，3H)，2.11(s，3H)，2.01(s，3H)，1.90(s，3H)，1.78(s，3H)。
72b：乙酸[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-乙酰氨基-3,4-二乙酰氧基-6-[2-(2-羟基乙氧基)乙氧基]-四氢吡喃-2-基]甲基酯
根据通用程序E，无需额外提纯，10.6g(20.1mmol)71b得到8.0g(92.0％)72b为无色油状物。
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：7.80(d，J＝9.2Hz，1H)，5.22(d，J＝3.3Hz，1H)，4.98(dd，J＝3.4，11.3Hz，1H)，4.64-4.53(m，2H)，4.11-4.00(m，3H)，3.94-3.83(m，1H)，3.82-3.73(m，1H)，3.61(dt，J＝3.2，7.1Hz，1H)，3.56-3.46(m，4H)，3.44-3.38(m，2H)，2.11(s，3H)，2.01(s，3H)，1.90(s，3H)，1.78(s，3H)。
72c：乙酸[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-乙酰氨基-3,4-二乙酰氧基-6-[2-[2-(2-羟基乙氧基)乙氧基]-乙氧基]四氢吡喃-2-基]甲基酯
根据通用程序E，在200ml EtOAc/THF(1:1)的混合溶剂中，将15.6g(27.4mmol)71c氢化，无需额外提纯，得到11.0g(84.6％)72c为无色油状物。
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：7.80(d，J＝9.2Hz，1H)，5.22(d，J＝3.3Hz，1H)，4.98(dd，J＝3.4，11.2Hz，1H)，4.62-4.52(m，2H)，4.09-4.00(m，4H)，3.89(td，J＝8.9，11.0Hz，1H)，3.82-3.74(m，1H)，3.63-3.56(m，1H)，3.55-3.46(m，8H)，3.45-3.39(m，2H)，2.11(s，3H)，2.01(s，3H)，1.91-1.88(m，3H)，1.78(s，3H)，1.18(t，J＝7.1Hz，1H)。
72d：乙酸[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-乙酰氨基-3,4-二乙酰氧基-6-[2-[2-[2-(2-羟基乙氧基)乙氧基]-乙氧基]乙氧基]四氢吡喃-2-基]甲基酯
根据通用程序E，将10.0g(16.3mmol)71d在100EtOAc中氢化，无需额外提纯，得到8.7g(93.0％)72d为无色油状物。
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：7.80(d，J＝9.2Hz，1H)，5.22(d，J＝3.3Hz，1H)，4.97(dd，J＝3.4，11.2Hz，1H)，4.62-4.53(m，2H)，4.09-3.98(m，4H)，3.89(td，J＝9.0，10.9Hz，1H)，3.82-3.75(m，1H)，3.63-3.56(m，1H)，3.55-3.46(m，12H)，3.42(d，J＝5.0Hz，2H)，2.11(s，3H)，2.00(s，3H)，1.92-1.87(m，3H)，1.78(s，3H)。
72e：乙酸[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-乙酰氨基-3,4-二乙酰氧基-6-[2-[2-[2-[2-(2-羟基乙氧基)乙氧基]-乙氧基]乙氧基]乙氧基]四氢吡喃-2-基]甲基酯
根据通用程序E，将12.4g(18.9mmol)71e在250EtOAc中氢化，最后在二氧化硅上提纯(DCM/MeOH 15:1)后，得到9.7g(83.9％)72e为黄色油状物。
1H-NMR(CDCl3，400MHz)δ[ppm]：6.96(br d，J＝9.29Hz，1H)，5.35-5.32(m，1H)，5.05(dd，J＝11.17，3.39Hz，1H)，5.09-5.02(m，1H)，4.74(d，J＝8.66Hz，1H)，4.27(dt，J＝11.04，8.97Hz，1H)，4.20-4.11(m，2H)，4.01-3.91(m，3H)，3.84-3.59(m，21H)，2.95(br s，2H)，2.17-2.15(m，3H)，2.05(s，3H)，2.01-1.98(m，6H)。
72f：乙酸[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-乙酰氨基-3,4-二乙酰氧基-6-(5-羟基戊氧基)四氢吡喃-2-基]甲基酯
在168mg(239μmol)Pd(OH)2/C(20％)的存在下，在室温、4bar H2气氛中，将2.50g(4.77mmol)71f氢化，直至达到完全转化。将反应混合物过滤，并将滤液蒸发，得到2.08g(定量，粗品)的标题化合物72f。
LCMS-方法A：
ELSD:Rt[min]＝1.15
电离方法：ES-：[M-H+甲酸]-＝478.2
72g：乙酸[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-乙酰氨基-3,4-二乙酰氧基-6-(12-羟基十二烷氧基)四氢吡喃-2-基]甲基酯
根据对于72f所述的方案，将5.69g(9.14mmol)的苄基醚71g氢化，得到4.79g(98.5％)的标题化合物72g为无色油状物，其结晶为白色针状物。
LCMS-方法A：
ELSD:Rt[min]＝1.72
电离方法：ES+：[M-H+]+＝532.3
73a：乙酸[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-乙酰氨基-3,4-二乙酰氧基-6-(2-氧代乙氧基)四氢吡喃-2-基]甲基酯
向0.75g(1.92mmol)的起始材料72a的10ml DCM溶液中添加6.77g(4.97ml，2.40mmol)的1,1,1-三乙酰氧基-1,1-二氢-1,2-苯碘酰-3(1H)-酮(戴斯-马丁高碘烷)。在将溶液在室温搅拌2小时后，除去溶剂并将残余物在二氧化硅上提纯(EtOAc/DCM 1:1至EtOAc/DCM/MeOH 5:5:2)，得到591mg(79.2％)的标题化合物73a。
LCMS-方法C：
ELSD Rt[min]＝0.86
电离方法：ES+：[M+H]+＝390.2
73b：乙酸[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-乙酰氨基-3,4-二乙酰氧基-6-[2-(2-氧代乙氧基)乙氧基]四氢吡喃-2-基]甲基酯
根据对于73a所述的方案，将1.0g(2.30mmol)的72b用8.12g(5.96ml，2.87mmol)的1,1,1-三乙酰氧基-1,1-二氢-1,2-苯碘酰-3(1H)-酮(戴斯-马丁高碘烷)氧化。最后在二氧化硅上提纯(EtOAc/DCM 1:1至EtOAc/DCM/MeOH5:5:2)，得到1.0g(定量)的标题化合物73b。
LCMS-方法B2：
MS TIC Rt[min]＝0.35
电离方法：ES+：[M+H]+＝434.1
73c：乙酸[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-乙酰氨基-3,4-二乙酰氧基-6-[2-[2-(2-氧代乙氧基)乙氧基]乙氧基]-四氢吡喃-2-基]甲基酯
将596mg(542μl，7.59mmol)DMSO溶于11ml干燥DCM中。在冷却至-60℃后，添加1.75ml(3.50mmol)的2M草酰氯的干燥DCM溶液，并继续搅拌10分钟，然后添加1.40g(2.92mmol)的醇72c的11ml干燥DCM溶液。在-60℃将混合物搅拌另外的10分钟，并添加2.97g(4.08ml，29.2mmol)NEt3。移除冷却浴，并使反应混合物达到室温。在完全转化后，将溶液用25ml DCM稀释，并用饱和的NaHCO3溶液洗涤。将有机层分离，用MgSO4干燥并除去溶剂，得到1.27g(91.1％，粗品)的所需醛(73c)为无色油状物，将其使用无需进一步提纯。
LCMS-方法B2：
ELSD Rt[min]＝1.66
电离方法：ES+：[M+H]+＝478.2
73d：乙酸[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-乙酰氨基-3,4-二乙酰氧基-6-[2-[2-[2-(2-氧代乙氧基)乙氧基]乙氧基]-乙氧基]四氢吡喃-2-基]甲基酯
根据对于73c所述的方案，将1.10g(2.10mmol)的醇72d氧化，得到0.99g(90.3％，粗品)的醛73d为无色油状物。
LCMS-方法C：
ELSD Rt[min]＝1.69
电离方法：ES+：[M+H]+＝522.2
73e：乙酸[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-乙酰氨基-3,4-二乙酰氧基-6-[2-[2-[2-[2-(2-氧代乙氧基)乙氧基]-乙氧基]乙氧基]乙氧基]四氢吡喃-2-基]甲基酯
根据对于73c所述的方案，将1.10g(1.94mmol)的醇72e氧化，得到1.10g(定量，粗品)的醛73e为无色油状物。
LCMS-方法A：
ELSD Rt[min]＝1.50
电离方法：ES+：[M+H]+＝566.4
73f：乙酸[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-乙酰氨基-3,4-二乙酰氧基-6-(5-氧代戊氧基)四氢吡喃-2-基]甲基酯
根据对于73c所述的方案，将2.05g(4.73mmol)的醇72f氧化，得到2.05g(定量，粗品)的醛73f为无色油状物。
LCMS-方法A：
ELSD Rt[min]＝1.19
电离方法：ES-：[M-H+甲酸]-＝476.2
73g：乙酸[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-乙酰氨基-3,4-二乙酰氧基-6-(12-氧代十二烷氧基)四氢吡喃-2-基]甲基酯
根据对于73c所述的方案，将2.20g(4.14mmol)的醇72g氧化，得到2.19g(99.9％，粗品)的醛73g为无色油状物。
LCMS-方法A：
ELSD Rt[min]＝1.79
电离方法：ES-：[M-H+甲酸]-＝574.3
用于合成化合物74a至74g的通用程序F
将1.0当量的起始醛73a至73e溶于MeOH(20ml/1.0mmol)中。在室温，添加5g分子筛
Figure BDA0002760977440002091
4.0当量的NEt3和10.0当量的AcOH，然后添加1.0当量的吗啉24a。将反应溶液搅拌15分钟，并在2小时内添加(分四份)4.0当量的氰基硼氢化钠。将反应在室温搅拌过夜以达到完全转化。将混合物过滤，并将滤液倒入50ml的饱和的NaHCO3溶液中。蒸发MeOH并将水性混合物用DCM萃取两次。将有机层用MgSO4干燥，真空除去溶剂并将粗产物通过硅胶色谱提纯，得到标题化合物74a至74g。
74a：乙酸[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-乙酰氨基-3,4-二乙酰氧基-6-[2-[(2S,6R)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)-2-(三异丙基甲硅烷基氧基-甲基)吗啉-4-基]乙氧基]四氢吡喃-2-基]甲基酯
根据通用程序F以及最后在二氧化硅上提纯(DCM中0至10％MeOH)，580mg(745μmol)的起始醛73a得到510mg(62.1％)的标题化合物74a为无色泡沫。
LCMS-方法C：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝3.30
电离方法：ES+：[M+H]+＝1104.0
74b：乙酸[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-乙酰氨基-3,4-二乙酰氧基-6-[2-[2-[(2S,6R)-2-[[双(4-甲氧基-苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)-2-(三异丙基-甲硅烷基氧基甲基)吗啉-4-基]乙氧基]乙氧基]四氢吡喃-2-基]甲基酯
根据通用程序F以及最后在二氧化硅上提纯(EtOAc/DCM 1:1至EtOAc/DCM/MeOH5:5:1)，500mg(577μmol)的起始醛73b得到352mg(53.2％)的标题化合物74b为无色泡沫。
LCMS-方法C：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝3.27
电离方法：ES+：[M+H]+＝1148.0
74c：乙酸[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-乙酰氨基-3,4-二乙酰氧基-6-[2-[2-[2-[(2S,6R)-2-[[双(4-甲氧基-苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)-2-(三异丙基甲硅烷基-氧基甲基)吗啉-4-基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]四氢吡喃-2-基]甲基酯
根据通用程序F以及最后在二氧化硅上提纯(DCM中0至10％MeOH)，900mg(1.88mmol)的起始醛73c得到1.34g(59.5％)的标题化合物74c为无色泡沫。
LCMS-方法C：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝3.29
电离方法：ES-：[M-H]-＝1189.9
74d：乙酸[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-乙酰氨基-3,4-二乙酰氧基-6-[2-[2-[2-[2-[(2S,6R)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)-2-(三异丙基甲硅烷基氧基甲基)吗啉-4-基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]四氢吡喃-2-基]甲基酯
根据通用程序F以及最后在二氧化硅上提纯(DCM中0至10％MeOH)，840mg(1.61mmol)的起始醛73d得到835mg(42.0％)的标题化合物74d为无色泡沫。
LCMS-方法C：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝3.30
电离方法：ES+：[M+H]+＝1235.8
74e：乙酸[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-乙酰氨基-3,4-二乙酰氧基-6-[2-[2-[2-[2-[2-[(2S,6R)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)-2-(三异丙基甲硅烷基氧基甲基)吗啉-4-基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]四氢吡喃-2-基]甲基酯
根据通用程序F以及最后在二氧化硅上提纯(DCM中0至10％MeOH)，1.09g(1.54mmol，纯度80％)的起始醛73e得到1.12g(56.8％)的标题化合物74e为无色泡沫。
LCMS-方法A：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝2.20
电离方法：ES+：[M+H]+＝1279.9
74f：乙酸[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-乙酰氨基-3,4-二乙酰氧基-6-[5-[(2S,6R)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)-2-(三异丙基甲硅烷基氧基-甲基)吗啉-4-基]戊氧基]四氢吡喃-2-基]甲基酯
根据通用程序F以及最后在二氧化硅上提纯(DCM中0至10％MeOH)，1.0g(2.32mmol)的起始醛73f得到2.18g(82.1％)的标题化合物74f，为无色泡沫。
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.44(s，1H)，7.84-7.77(m，1H)，7.62(s，1H)，7.42(d，J＝7.6Hz，2H)，7.33-7.18(m，8H)，6.84(d，J＝8.8Hz，4H)，5.88(dd，J＝2.4，10.0Hz，1H)，5.22(d，J＝3.6Hz，1H)，4.98(dd，J＝3.2，11.2Hz，1H)，4.52-4.47(m，1H)，4.11(d，J＝9.6Hz，1H)，4.07-3.97(m，4H)，3.93-3.83(m，2H)，3.80-3.65(m，8H)，3.47-3.38(m，1H)，3.11(d，J＝9.2Hz，1H)，2.97(d，J＝9.2Hz，1H)，2.90(d，J＝8.8Hz，1H)，2.79(d，J＝11.2Hz，1H)，2.29(t，J＝7.2Hz，2H)，2.14-2.04(m，5H)，2.02-1.95(m，3H)，1.90(s，3H)，1.82-1.73(m，6H)，1.57-1.22(m，6H)，1.01-0.83(m，21H)。
74g：乙酸[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-乙酰氨基-3,4-二乙酰氧基-6-[12-[(2S,6R)-2-[[双(4-甲氧基-苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)-2-(三异丙基-甲硅烷基氧基甲基)吗啉-4-基]十二烷氧基]四氢吡喃-2-基]甲基酯
根据通用程序F以及最后在二氧化硅上提纯(在正庚烷中0至100％MeOH/EtOAc(9:1))，2.19g(4.13mmol)的起始醛73g得到4.84g(94.3％)的标题化合物74g，为无色泡沫。
LCMS-方法B-2：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝1.14
电离方法：ES+：[(M+2H)/2]+＝622.5
用于合成化合物75a-g和81a-e的通用程序G
将1.0当量的TIPS保护的起始化合物74a-e(80a-e，参见方案22)溶于NMP(14ml/1.0mmol)中。在添加15.0当量的三乙胺和6.0当量的NEt3·3 HF之后，将反应混合物在90℃搅拌直至达到完全转化。在溶液冷却至室温后，添加饱和的NaHCO3溶液，并将混合物用EtOAc萃取3次。将合并的有机层用饱和的NaCl溶液洗涤，并用MgSO4干燥。在蒸发溶剂后，将粗产物在二氧化硅上提纯，得到脱保护的产物75a-g(81a-e，参见方案22)。
75a：乙酸[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-乙酰氨基-3,4-二乙酰氧基-6-[2-[(2R,6R)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-2-(羟基甲基)-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)吗啉-4-基]乙氧基]四氢吡喃-2-基]甲基酯
根据通用程序G，将850mg(770μmol)的TIPS-醚74a脱保护，在硅胶色谱(EtOAc/DCM1:1至EtOAc/DCM/MeOH 5:5:1)后，得到401mg(55.0％)的标题化合物75a。
LCMS-方法C：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝2.16
电离方法：ES+：[M+H]+＝947.8
1H-NMR(DMSO-d6，600MHz)δ[ppm]：11.37(s，1H)，7.78(d，J＝9.17Hz，1H)，7.53(s，1H)，7.40(d，J＝7.52Hz，2H)，7.18-7.32(m，7H)，6.87(d，J＝8.99Hz，4H)，5.85(dd，J＝9.90，3.12Hz，1H)，5.20(d，J＝3.48Hz，1H)，4.96(dd，J＝11.19，3.48Hz，1H)，4.57(t，J＝5.32Hz，1H)，4.52(d，J＝8.44Hz，1H)，3.99-4.06(m，3H)，3.79-3.91(m，2H)，3.72-3.76(m，7H)，3.66(dd，J＝11.10，5.78Hz，1H)，3.59(dt，J＝11.51，5.52Hz，1H)，3.00(s，2H)，2.90(br d，J＝9.35Hz，1H)，2.76(br d，J＝11.55Hz，1H)，2.51-2.60(m，2H)，2.25(d，J＝11.37Hz，1H)，2.17(t，J＝10.64Hz，1H)，2.04(m，3H)，1.97(m，3H)，1.88(s，3H)，1.70(s，3H)，1.69(s，3H)。
75b：乙酸[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-乙酰氨基-3,4-二乙酰氧基-6-[2-[2-[(2R,6R)-2-[[双(4-甲氧基-苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-2-(羟基甲基)-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)吗啉-4-基]乙氧基]乙氧基]四氢吡喃-2-基]甲基酯
根据通用程序G，将720mg(635μmol)的TIPS-醚74b脱保护，在硅胶色谱(EtOAc/DCM1:1至EtOAc/DCM/MeOH 5:5:1)后，得到527mg(83.7％)的标题化合物75b。
LCMS-方法C：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝2.12
电离方法：ES+：[M+H]+＝991.9
1H-NMR DMSO-d6，600MHz)δ[ppm]：11.36(s，1H)，7.79(d，J＝9.17Hz，1H)，7.55(s，1H)，7.40(d，J＝7.70Hz，2H)，7.21-7.31(m，7H)，6.87(d，J＝8.80Hz，4H)，5.85(br d，J＝7.34Hz，1H)，5.21(d，J＝3.30Hz，1H)，4.98(dd，J＝11.19，3.30Hz，1H)，4.61(br s，1H)，4.54(d，J＝8.62Hz，1H)，3.99-4.04(m，3H)，3.83-3.90(m，1H)，3.72-3.79(m，8H)，3.55-3.67(m，2H)，3.48-3.55(m，4H)，3.01(s，2H)，2.90(br d，J＝10.09Hz，1H)，2.80(br d，J＝12.10Hz，1H)，2.51-2.55(m，2H)，2.27(br d，J＝11.74Hz，1H)，2.15-2.21(m，1H)，2.09(s，3H)，1.98(s，3H)，1.89(s，3H)，1.76(s，3H)，1.67(s，3H)。
75c：乙酸[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-乙酰氨基-3,4-二乙酰氧基-6-[2-[2-[2-[(2R,6R)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-2-(羟基甲基)-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)吗啉-4-基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]四氢吡喃-2-基]甲基酯
根据通用程序G，将1.25g(1.05mmol)的TIPS-醚74c脱保护，在硅胶色谱(EtOAc/DCM 1:1至EtOAc/DCM/MeOH 5:5:1)后，得到630mg(58.0％)的标题化合物75c。
LCMS-方法C：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝2.11
电离方法：ES+：[M+H]+＝1035.6
1H-NMR(DMSO-d6，600MHz)δ[ppm]：11.36(s，1H)，7.77(d，J＝9.17Hz，1H)，7.55(s，1H)，7.40(d，J＝7.34Hz，2H)，7.20-7.31(m，7H)，6.87(d，J＝8.62Hz，4H)，5.85(dd，J＝9.72，3.12Hz，1H)，5.21(d，J＝3.48Hz，1H)，4.97(dd，J＝11.19，3.30Hz，1H)，4.60(t，J＝5.41Hz，1H)，4.54(d，J＝8.62Hz，1H)，4.00-4.06(m，3H)，3.84-3.91(m，1H)，3.71-3.77(m，8H)，3.59-3.67(m，1H)，3.42-3.57(m，9H)，3.01(s，2H)，2.92(br d，J＝9.54Hz，1H)，2.80(br d，J＝11.55Hz，1H)，2.51-2.56(m，2H)，2.27(d，J＝11.55Hz，1H)，2.17(t，J＝10.45Hz，1H)，2.10(s，3H)，1.99(s，3H)，1.89(s，3H)，1.76(m，3H)，1.67(m，3H)。
75d：乙酸[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-乙酰氨基-3,4-二乙酰氧基-6-[2-[2-[2-[2-[(2R,6R)-2-(羟基-甲基)-2-[[(4-羟基苯基)-(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)吗啉-4-基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]四氢吡喃-2-基]甲基酯
根据通用程序G，将780mg(631μmol)的TIPS-醚74d脱保护，在硅胶色谱(EtOAc/DCM1:1至EtOAc/DCM/MeOH 5:5:1)后，得到450mg(66.1％)的标题化合物75d。
LCMS-方法C：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝2.12
电离方法：ES+：[M+H]+＝1079.7
1H-NMR(DMSO-d6，600MHz)δ[ppm]：11.36(s，1H)，7.77(d，J＝9.17Hz，1H)，7.55(s，1H)，7.40(d，J＝7.34Hz，2H)，7.20-7.31(m，7H)，6.87(d，J＝8.80Hz，4H)，5.84(dd，J＝9.72，3.12Hz，1H)，5.21(d，J＝3.48Hz，1H)，4.97(dd，J＝11.28，3.39Hz，1H)，4.60(t，J＝5.32Hz，1H)，4.55(d，J＝8.44Hz，1H)，4.00-4.06(m，3H)，3.85-3.91(m，1H)，3.72-3.78(m，8H)，3.61-3.66(m，1H)，3.55-3.60(m，1H)，3.43-3.54(m，12H)，3.00(s，2H)，2.92(br d，J＝8.99Hz，1H)，2.81(br d，J＝11.19Hz，1H)，2.51-2.56(m，2H)，2.28(d，J＝11.74Hz，1H)，2.15-2.21(m，1H)，2.10(s，3H)，1.99(s，3H)，1.89(m，3H)，1.77(s，3H)，1.67(s，3H)。
75e：乙酸[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-乙酰氨基-3,4-二乙酰氧基-6-[2-[2-[2-[2-[2-[(2R,6R)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-2-(羟基甲基)-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)吗啉-4-基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]四氢吡喃-2-基]甲基酯
根据通用程序G，将1.10g(860μmol)的TIPS-醚74e脱保护，在硅胶色谱(DCM中0至5％MeOH)后，得到437mg(45.3％)的标题化合物75e。
LCMS-方法A：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝1.72
电离方法：ES-：[M-H]-＝1121.6
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.36(s，1H)，7.77(d，J＝9.17Hz，1H)，7.53-7.56(m，1H)，7.40(d，J＝7.34Hz，2H)，7.19-7.31(m，7H)，6.87(d，J＝8.93Hz，4H)，5.85(dd，J＝9.66，2.93Hz，1H)，5.21(d，J＝3.42Hz，1H)，4.97(dd，J＝11.25，3.42Hz，1H)，4.53-4.62(m，2H)，4.03(s，3H)，3.83-3.93(m，1H)，3.72-3.82(m，8H)，3.44-3.66(m，18H)，2.98-3.04(m，2H)，2.92(br d，J＝8.80Hz，1H)，2.77-2.86(m，1H)，2.52-2.57(m，2H)，2.25-2.32(m，1H)，2.18(br t，J＝10.51Hz，1H)，2.10(m，3H)，1.99(m，3H)，1.89(s，3H)，1.77(s，3H)，1.67(s，3H)。
75f：乙酸[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-乙酰氨基-3,4-二乙酰氧基-6-[5-[(2R,6R)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-2-(羟基甲基)-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)吗啉-4-基]戊氧基]四氢吡喃-2-基]甲基酯
根据通用程序G，将2.15g(1.88mmol)的TIPS-醚74f脱保护，在硅胶色谱(DCM中0至5％MeOH)后，得到1.21g(65.0％)的标题化合物75f。
LCMS-方法A：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝1.69
电离方法：ES+：[M+H]+＝989.5
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.36(s，1H)，7.79(d，J＝9.29Hz，1H)，7.51-7.58(m，1H)，7.40(d，J＝7.34Hz，2H)，7.19-7.32(m，7H)，6.87(d，J＝8.44Hz，4H)，5.84(dd，J＝9.90，2.93Hz，1H)，5.21(d，J＝3.42Hz，1H)，4.96(dd，J＝11.25，3.42Hz，1H)，4.58-4.65(m，1H)，4.48(d，J＝8.44Hz，1H)，3.98-4.06(m，3H)，3.80-3.94(m，1H)，3.63-3.78(m，9H)，3.34-3.45(m，1H)，2.97-3.08(m，2H)，2.87(br d，J＝9.05Hz，1H)，2.74(br d，J＝11.49Hz，1H)，2.24-2.33(m，2H)，2.01-2.17(m，5H)，1.98(s，3H)，1.89(s，3H)，1.76(s，3H)，1.67(s，3H)，1.35-1.54(m，4H)，1.23-1.35(m，2H)。
75g：乙酸[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-乙酰氨基-3,4-二乙酰氧基-6-[12-[(2R,6R)-2-[[双(4-甲氧基-苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-2-(羟基甲基)-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)吗啉-4-基]十二烷氧基]四氢吡喃-2-基]甲基酯
根据通用程序G，将4.83g(3.88mmol)的TIPS-醚74g脱保护，无需额外提纯，得到3.03g(71.7％)的标题化合物75g。
LCMS-方法A：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝1.89
电离方法：ES-：[M-H]-＝1085.5
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.36(s，1H)，7.79(d，J＝9.29Hz，1H)，7.54(s，1H)，7.40(d，J＝7.46Hz，2H)，7.19-7.32(m，7H)，6.87(d，J＝8.80Hz，4H)，5.84(dd，J＝9.72，2.87Hz，1H)，5.21(d，J＝3.30Hz，1H)，4.96(dd，J＝11.25，3.30Hz，1H)，4.61(t，J＝5.14Hz，1H)，4.48(d，J＝8.44Hz，1H)，3.98-4.07(m，3H)，3.82-3.91(m，1H)，3.61-3.78(m，9H)，3.35-3.44(m，1H)，2.96-3.08(m，2H)，2.86(br d，J＝9.17Hz，1H)，2.66-2.77(m，1H)，2.30(br t，J＝7.09Hz，2H)，2.01-2.16(m，5H)，1.99(s，3H)，1.89(m，3H)，1.76(m，3H)，1.67(m，3H)，1.36-1.48(m，4H)，1.20-1.31(br s，16H)。
用于合成化合物76a-g和82a-e的通用程序H
将1.0当量的起始醇75a-e(81a-e，参见方案22)和6.0当量的二异丙基铵盐四氮唑溶于干燥DCM(33ml/1.0mmol)中。在氩气气氛中，在室温，逐滴添加3.0当量的2-氰基乙基-N,N,N’,N’-四异丙基亚磷酰二胺，并将溶液搅拌直至达到完全转化。将反应用H2O(25ml)淬灭，并将有机层分离。将水相用DCM萃取，并将合并的有机萃取物用MgSO4干燥。在蒸发溶剂后，将粗产物溶于约10ml乙酸乙酯/乙醚(1:1)中，并添加40ml的正戊烷。将沉淀物离心分离(2分钟，10℃，4400upm)，倾出液体层。将沉淀物的提纯重复3次。在speedvac上干燥后，将标题化合物76a-g(82a-e，参见方案22)分离为无色固体。
76a：乙酸[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-乙酰氨基-3,4-二乙酰氧基-6-[2-[(2S,6R)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-2-[[2-氰基乙氧基-(二异丙基氨基)膦烷基]氧基甲基]-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)吗啉-4-基]乙氧基]四氢吡喃-2-基]甲基酯
根据通用程序H，将401mg(423μmol)的起始醇75a亚磷酰化，得到430mg(88.5％)的标题化合物76a。
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.35(br s，1H)，7.78(d，J＝9.03Hz，1H)，7.52，7.55(2x s，1H)，7.35-7.44(m，2H)，7.19-7.32(m，7H)，6.81-6.90(m，4H)，5.86-5.92(m，1H)，5.20(m，1H)，4.95(2x t，3.12Hz，1H)，4.50(m，1H)，3.96-4.08(m，4H)，3.77-3.93(m，3H)，3.73(s，6H)，3.38-3.67(m，5H)，2.87-3.11(m，3H)，2.72-2.83(m，1H)，2.52-2.70(m，4H)，2.13-2.36(m，2H)，1.93-2.04(m，6H)，1.85-1.91(m，3H)，1.67-1.76(m，6H)，0.94-1.13(m，12H)。
31P-NMR(DMSO-d6，162MHz)δ[ppm]：147.7，147.5。
76b：乙酸[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-乙酰氨基-3,4-二乙酰氧基-6-[2-[2-[(2S,6R)-2-[[双(4-甲氧基-苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-2-[[2-氰基乙氧基-(二异丙基氨基)膦烷基]氧基-甲基]-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)吗啉-4-基]乙氧基]乙氧基]四氢吡喃-2-基]甲基酯
根据通用程序H，将527mg(532μmol)的起始醇75b亚磷酰化，得到528mg(83.4％)的标题化合物76b。
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.35(br s，1H)，7.79(d，J＝9.16，1H)，7.55(2x s，1H)，7.35-7.43(m，2H)，7.19-7.32(m，7H)，6.82-6.90(m，4H)，5.84-5.93(m，1H)，5.21(m，1H)，4.98(m，1H)，4.54(m，1H)，3.95-4.09(m，5H)，3.71-3.92(m，3H)，3.73(s，6H)，3.39-3.64(m，9H)，2.96-3.12(m，2H)，2.77-2.96(m，2H)，2.63-2.73(m，1H)，2.52-2.63(m，2H)，2.16-2.35(m，2H)，2.09(s，3H)，1.98，1.99(2x s，3H)，1.89(s，3H)，1.76(s，3H)1.72，1.69(2x s，3H)，0.91-1.14(m，12H)。
31P-NMR(DMSO-d6，162MHz)δ[ppm]：147.6，147.4。
76c：乙酸[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-乙酰氨基-3,4-二乙酰氧基-6-[2-[2-[2-[(2S,6R)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-2-[[2-氰基乙氧基-(二异丙基氨基)-膦烷基]氧基甲基]-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)吗啉-4-基]乙氧基]-乙氧基]乙氧基]四氢吡喃-2-基]甲基酯
根据通用程序H，将630mg(609μmol)的起始醇75c亚磷酰化，得到698mg(92.8％)的标题化合物76c。
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.35(br s，1H)，7.76(m，1H)，7.56，7.53(2xs，1H)，7.39(m，2H)，7.19-7.33(m，7H)，6.82-6.91(m，4H)，5.84-5.93(m，1H)，5.21(m，1H)，4.97(m，1H)，4.55(m，1H)，3.96-4.09(m，4H)，3.70-3.91(m，4H)，3.73(s，6H)，3.40-3.63(m，13H)，2.98-3.08(m，2H)，2.79-2.96(m，2H)，2.64-2.73(m，1H)，2.52-2.62(m，2H)，2.17-2.34(m，2H)，2.10(s，3H)，1.99(m，3H)，1.89(m，3H)，1.78(m，3H)，1.72，1.70(2x s，3H)，0.91-1.25(m，12H)。
31P-NMR(DMSO-d6，162MHz)δ[ppm]：147.6，147.4。
76d：乙酸[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-乙酰氨基-3,4-二乙酰氧基-6-[2-[2-[2-[2-[(2S,6R)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-2-[[2-氰基乙氧基-(二异丙基氨基)-膦烷基]氧基甲基]-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)吗啉-4-基]乙氧基]-乙氧基]乙氧基]乙氧基]四氢吡喃-2-基]甲基酯
根据通用程序H，将450mg(417μmol)的起始醇75d亚磷酰化，得到460mg(86.2％)的标题化合物76d。
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：(br s，1H)，7.77(d，J＝9.22Hz，1H)，7.56，7.53(2x s，1H)，7.35-7.43(m，2H)，7.19-7.33(m，7H)，6.82-6.90(m，4H)，5.84-5.93(m，1H)，5.22(m，1H)，4.97(m，1H)，4.56(m，1H)，3.97-4.09(m，4H)，3.68-3.96(m，4H)，3.73(s，6H)，3.37-3.66(m，17H)，2.79-3.08(m，4H)，2.64-2.71(m，1H)，2.52-2.62(m，2H)，2.17-2.35(m，2H)，2.10(s，3H)，1.99(s，3H)，1.89(s，3H)，1.77(s，3H)，1.72，1.69(2x s，3H)，0.89-1.22(m，12H)。
31P-NMR(DMSO-d6，162MHz)δ[ppm]：147.6，147.4。
76e：乙酸[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-乙酰氨基-3,4-二乙酰氧基-6-[2-[2-[2-[2-[2-[(2S,6R)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-2-[[2-氰基乙氧基-(二异丙基氨基)-膦烷基]氧基甲基]-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)吗啉-4-基]乙氧基]-乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]四氢吡喃-2-基]甲基酯
根据通用程序H，将495mg(441μmol)的起始醇75e亚磷酰化，得到589mg(定量)的标题化合物76e。
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.35(br s，1H)，7.77(d，J＝9.16Hz，1H)，7.56，7.53(2x s，1H)，7.35-7.43(m，2H)，7.18-7.33(m，7H)，6.86(br d，J＝8.78Hz，4H)，5.84-5.93(m，1H)，5.22(dm，1H)，4.97(m，1H)，4.56(m，1H)，3.96-4.10(m，4H)，3.72-3.95(m，4H)，3.73(s，6H)，3.41-3.63(m，21H)，2.79-3.08(m，4H)，2.64-2.72(m，1H)，2.53-2.61(m，2H)，2.14-2.33(m，2H)，2.10(s，3H)，1.99(s，3H)，1.89(s，3H)，1.77(s，3H)，1.72，1.69(2x s，3H)，0.93-1.12(m，12H)。
31P-NMR(DMSO-d6，162MHz)δ[ppm]：147.6，147.4。
76f：乙酸[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-乙酰氨基-3,4-二乙酰氧基-6-[5-[(2S,6R)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-2-[[2-氰基乙氧基-(二异丙基氨基)膦烷基]氧基甲基]-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)吗啉-4-基]戊氧基]四氢吡喃-2-基]甲基酯
根据通用程序H，将1.17g(1.18mmol)的起始醇75f亚磷酰化，得到1.32g(94.1％)的标题化合物76f。
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.36(br s，1H)，7.78(2x d，J＝9.19，1H)，7.57，7.54(2x s，1H)，7.36-7.44(m，2H)，7.19-7.32(m，7H)，6.86(br d，J＝8.78Hz，4H)，5.89(m，1H)，5.21(m，1H)，4.96(m，1H)，4.48(m，1H)，3.94-4.09(m，4H)，3.81-3.93(m，2H)，3.66-3.75(m，1H)，3.73(s，6H)，3.53-3.66(m，2H)，3.37-3.51(m，3H)，3.07-3.13(m，1H)，2.95-3.05(m，1H)，2.84-2.92(m，1H)，2.77(m，1H)，2.63-2.71(m，1H)，2.52-2.62(m，1H)，2.23-2.39(m，2H)，2.02-2.16(m，2H)，2.10(s，3H)，1.99，1.98(2x s，3H)，1.89(s，3H)，1.76(s，3H)，1.73，1.70(2x s，3H)，1.35-1.56(m，4H)，1.22-1.33(m，2H)，0.93-1.13(m，12H)。
31P-NMR(DMSO-d6，162MHz)δ[ppm]：147.4，147.1。
76g：乙酸[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-乙酰氨基-3,4-二乙酰氧基-6-[12-[(2S,6R)-2-[[双(4-甲氧基-苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-2-[[2-氰基乙氧基-(二异丙基氨基)膦烷基]氧基-甲基]-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)吗啉-4-基]十二烷氧基]四氢吡喃-2-基]甲基酯
根据通用程序H，将1.52g(1.40mmol)的起始醇75g亚磷酰化，得到1.55g(86.3％)的标题化合物76g。
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.37(br s，1H)，7.80(d，J＝9.22Hz，1H)，7.57，7.54(2x s，1H)，7.36-7.45(m，2H)，7.20-7.32(m，7H)，6.86(d，J＝8.85Hz，4H)，5.86-5.93(m，1H)，5.22(m，1H)，4.97(m，1H)，4.49(m，1H)，3.82-4.09(m，6H)，3.74(s，6H)，3.65-3.72(m，1H)，3.54-3.64(m，2H)，3.36-3.52(m，3H)，3.06-3.14(m，1H)，2.96-3.06(m，1H)，2.73-2.91(m，2H)，2.64-2.71(m，1H)，2.53-2.61(m，1H)，2.20-2.39(m，2H)，2.03-2.16(m，2H)，2.11(s，3H)，1.99(s，3H)，1.90(s，3H),1.77(s，3H)，1.73，1.71(2x s，3H)，1.35-1.52(m，4H)，1.17-1.32(m，16H)，0.97-1.14(m，12H)。
31P-NMR(DMSO-d6，162MHz)δ[ppm]：147.3，147.1。
实施例C.2
合成方案21
C.2-a
Figure BDA0002760977440002211
C.2-b
Figure BDA0002760977440002212
C.2-c
Figure BDA0002760977440002213
78a：2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基乙酸苄基酯
向起始化合物68(16g，41.1mmol)和2-羟基乙酸苄基酯77a(13.6g，82.2mmol)在160ml DCE中的混合物中添加Sc(OTf)3(1.41g，2.88mmol)。将溶液在90℃搅拌16小时，以达到完全转化。将反应混合物倒入200ml饱和的NaHCO3中，并用3x100ml DCM萃取。将合并的有机相经无水Na2SO4干燥，过滤，并将滤液真空浓缩。将残余物通过柱色谱提纯(PE:EtOAc 1:1)，然后用反相快速色谱(中性)提纯，得到12.0g(60％)的标题化合物78a为黄色油状物。MS[M+H]+(m/z)＝496.0
79a：2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基乙酸
在25℃，向化合物78a(12g，24.2mmol)在150ml EtOAc中的混合物中添加Pd/C(3g，10％在碳上和50％的水含量)。在H2气氛(15psi)中，将混合物在室温搅拌12小时，直至达到完全转化。将混合物过滤，并将滤液真空浓缩，得到79a(9.2g，93％)为无色泡沫。
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：7.93(br d，J＝8.7Hz，1H)，5.22(d，J＝3.4Hz，1H)，5.01(dd，J＝3.3，11.1Hz，1H)，4.63(d，J＝8.5Hz，1H)，4.10(br d，J＝4.9Hz，2H)，4.05-3.99(m，3H)，3.94-3.85(m，2H)，2.14-2.10(m，3H)，2.02-1.99(m，3H)，1.89(s，3H)，1.79(s，3H)。
78c：2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基乙氧基]乙氧基]乙酸苄基酯
根据对于78a所述的方案化合物，14.6g(37.6mmol)的68和19.1g(75.2mmol)2-[2-(2-羟基乙氧基)乙氧基]乙酸苄基酯77c得到12.0g(54.8％)的标题化合物78c，为淡黄色油状物。
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：7.75(d，J＝9.17Hz，1H)，7.50-7.27(m，5H)，5.21(d，J＝3.30Hz，1H,)5.15(s，2H)，4.97(dd，J＝11.19，3.36Hz，1H)，4.57(d，J＝8.44Hz，1H)，4.19(s，2H)，4.04-4.00(m，3H)，3.88(dt，J＝10.97，8.94Hz，1H)，3.81-3.71(m，1H)，3.63-3.48(m，7H)，2.10(s，3H)，1.99(s，3H)，1.89(s，3H)，1.77(s，3H)。
79c:2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基乙氧基]乙氧基]乙酸
向苄基酯78c(12.0g，20.6mmol)的400ml EtOAc溶液中添加Pd/C(2g，10％在碳上和50％的水含量)。将混合物在H2气氛(15psi)中在室温搅拌12小时。将反应混合物过滤，并将滤液真空浓缩，得到8.5g(83.7％)79c，为无色油状物。
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：7.78(d，J＝9.17Hz，1H)，5.22(d，J＝3.42Hz，1H)，4.98(dd，J＝11.13，3.42Hz，1H)，4.59(d，J＝8.44Hz，1H)，4.10-3.98(m，5H)，3.89(dt，J＝11.00，8.93Hz，1H)，3.78(dt，J＝11.16，4.63Hz，1H)，3.65-3.46(m，7H)，2.11(s，3H)，2.01(s，3H)，1.90(s，3H)，1.78(s，3H)。
78b：2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基乙氧基]乙酸苄基酯
在25℃，向化合物77b(7.0g，21.2mmol)和噁唑啉69(6.7g，31.9mmol)在100ml DCE中的混合物中添加
Figure BDA0002760977440002221
分子筛(10g)。将混合物搅拌1.5小时，然后添加TMSOTf(2.3g，10.6mmol)。在室温搅拌12小时后，将反应溶液倒入200ml饱和的NaHCO3溶液中，并用3x100ml DCM萃取。将合并的有机相经无水Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩。将残余物通过反相快速色谱提纯，得到化合物78b(4.0g，36％)为黄色油状物。
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：7.68(d，J＝9.2Hz，1H)，7.29-7.16(m，5H)，5.12-5.05(m，1H)，5.02(s，2H)，4.89-4.79(m，1H)，4.43(d，J＝8.4Hz，1H)，4.06(d，J＝1.6Hz，2H)，3.92-3.85(m，3H)，3.81-3.64(m，2H)，3.55-3.41(m，3H)，1.97(s，3H)，1.87-1.84(m，3H)，1.78-1.74(m，3H)，1.65-1.57(m，3H)。
79b：2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基乙氧基]乙酸
在室温，向化合物78b(6.0g，11.1mmol)在100ml EtOAc中的混合物中添加Pd/C(0.6g，10％在碳上和50％的水含量)。在H2(15psi)中，将混合物搅拌12小时以达到完全转化。将反应混合物过滤，并将滤液真空浓缩，得到5.0g(96％)的标题化合物79b为白色泡沫。
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：7.83(d，J＝9.3Hz，1H)，5.22(d，J＝3.4Hz，1H)，4.97(dd，J＝3.4，11.2Hz，1H)，4.57(d，J＝8.6Hz，1H)，4.06-4.02(m，3H)，4.01(s，2H)，3.89(td，J＝8.9，11.1Hz，1H)，3.83-3.77(m，1H)，3.66-3.52(m，3H)，2.13-2.07(m，3H)，2.02-1.98(m，3H)，1.89(s，3H)，1.78(s，3H)。
78d：5-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基戊酸苄基酯
在15℃，向(D)-2-脱氧-2-氨基-半乳糖基-五乙酸酯68(387g，0.968mol)的4l DCE溶液中逐滴添加TMSOTf(322g，1.452mol)。将混合物在50℃加热1.5小时，然后在30℃搅拌过夜。将反应混合物倒入4l饱和的NaHCO3溶液中，并用1l DCM萃取两次。合并的有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩。将残余物溶于4l DCE，并在15℃添加5-羟基戊酸苄基酯77d(302g，1.452mol)和300g粉末状的分子筛
Figure BDA0002760977440002231
在搅拌1小时后，在15℃逐滴添加TMSOTf(107.4g，0.484mol)。将悬浮液在15℃搅拌过夜，以达到完全转化。将反应混合物倒入4l饱和的NaHCO3溶液中，过滤并用1l DCM萃取两次。将合并的有机层用Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩。将残余物通过柱色谱提纯(PE/EtOAc3:1)，得到所需的产物(240g，46％)为无色油状物。
1H-NMR(CDCl3，400MHz)δ[ppm]：7.47-7.30(m，5H)，5.74(br d，J＝8.5Hz，1H)，5.36(d，J＝2.8Hz，1H)，5.30-5.23(m，1H)，5.17-5.07(m，2H)，4.65(d，J＝8.4Hz，1H)，4.20-4.08(m，3H)，4.02-3.94(m，1H)，3.94-3.85(m，2H)，3.50(td，J＝6.1，9.9Hz，1H)，2.49-2.32(m，2H)，2.15(s，3H)，2.05(s，3H)，2.01(s，3H)，1.92(s，3H)，1.78-1.56(m，4H)。
79d：5-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基戊酸
向苄基酯78d(240g，0.447mol)的2.5l MeOH的溶液中添加Pd/C(24g，10％在碳上，50％水含量)。将混合物在15℃、在H2(15psi)中搅拌过夜。将反应混合物过滤，并将滤液真空浓缩，得到196g(97％)的79d为白色固体。
1H-NMR(CDCl3，400MHz)δ[ppm]：6.19(d，J＝8.8Hz，1H)，5.37(d，J＝3.1Hz，1H)，5.30(dd，J＝3.4，11.2Hz，1H)，4.69(d，J＝8.3Hz，1H)，4.16(m，1H)，3.98-3.92(m，2H)，3.57-3.48(m，2H)，2.40-2.30(m，2H)，2.18-2.15(s，3H)，2.06(s，3H)，2.02(s，3H)，1.99-1.94(s，3H)，1.76-1.59(m，4H)。
77e：12-羟基十二烷酸苄基酯
将5.0g(22.4mmol)的12-羟基十二烷酸溶于100ml DMF中。在添加4.5g(3.15ml，25.8mmol)苄基溴和3.37g(33.6mmol)碳酸氢钾之后，将混合物搅拌20小时。真空除去溶剂并将残余物溶于乙醚中。在用H2O洗涤后，将水相分离并用乙醚萃取。将合并的有机层用MgSO4干燥并通过硅胶色谱提纯(正庚烷中0至30％EtOAc)，得到5.70g(82.9％)的所需苄基酯。
LCMS-方法A：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝2.04
电离方法：ES+：[M+H]+＝307.2
78e：12-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基十二烷酸苄基酯
起始于2.20g(5.7mmol)68，根据对于78d所述的方案合成2.0g(55.9％)的标题化合物78e。在70℃搅拌4小时和在室温搅拌额外的16小时后，完成用77e的完全糖基化。最后的提纯在硅胶上进行，用正庚烷中0至100％EtOAc/DCM(1:1)洗脱。
LCMS-方法A：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝1.99
电离方法：ES+：[M+H]+＝636.5
79e：12-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基十二烷酸
将2.0g(3.2mmol)的苄基酯78e溶于20ml THF中。在添加167mg(157μmol)的Pd(10％在碳上)之后，将反应混合物用H2吹扫，并在4bar H2压力氢化。4小时后，滤去Pd-催化剂，并将滤液真空蒸发，将粗产物通过硅胶色谱提纯(DCM中0至20％MeOH，10％AcOH)，得到1.67g(97.3％)的羧酸79e。LCMS-方法A：
ELSD:Rt[min]＝1.68
电离方法：ES+：[M+H]+＝546.4
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.79(br s，1H)，7.67(d，J＝9.17Hz，1H)，5.08(d，J＝3.42Hz，1H)，4.83(dd，J＝11.25，3.42Hz，1H)，4.35(d，J＝8.44Hz，1H)，3.84-3.95(m，3H)，3.73(m，1H)，3.56(m，1H)，3.44-3.51(m，1H)，3.28(m，1H)，1.97(s，3H)，1.87(s，3H)，1.76(s，3H)，1.63(s，3H)，1.28-1.39(m，4H)，1.11(s，14H)。
实施例C.3：
合成方案22
Figure BDA0002760977440002261
用于合成化合物80a至80e的通用程序J
将羧酸(79a-e，1.0至1.2当量)和吗啉化合物24a(1.0当量)溶于DCM(20ml,/1.0mmol)中。在添加1.5当量的HBTU和3.0的当量的DIPEA之后，将反应在室温搅拌18小时，以达到完全转化。将反应溶液用饱和的NaCHO3溶液和饱和的NaCl溶液洗涤。将有机层用MgSO4干燥并蒸发溶剂。将粗产物的提纯在二氧化硅上进行，得到所需的酰胺为无色固体。
80a：乙酸[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-乙酰氨基-3,4-二乙酰氧基-6-[2-[(2S,6R)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)-2-(三异丙基甲硅烷基氧基-甲基)吗啉-4-基]-2-氧代-乙氧基]四氢吡喃-2-基]甲基酯
根据通用程序J，在二氧化硅上提纯(在DCM/EtOAc 1:1中0至10％DCM/EtOAc/MeOH10:10:1)后，400mg(986μmol，1.2当量)的羧酸79a得到530mg(57.7％)的标题化合物80a。
LCMS-方法C：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝3.15
电离方法：ES-：[M-H]-＝1115.9
80b：乙酸[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-乙酰氨基-3,4-二乙酰氧基-6-[2-[2-[(2S,6R)-2-[[双(4-甲氧基-苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)-2-(三异丙基-甲硅烷基氧基甲基)吗啉-4-基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]四氢吡喃-2-基]甲基酯
根据通用程序J，在二氧化硅上提纯(在DCM/EtOAc 1:1中0至10％DCM/EtOAc/MeOH10:10:1)后，406mg(904μmol，1.1当量)的羧酸79b得到590mg(61.8％)的标题化合物80b。
LCMS-方法C：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝3.16
电离方法：ES-：[M-H]-＝1160.0
80c：乙酸[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-乙酰氨基-3,4-二乙酰氧基-6-[2-[2-[2-[(2S,6R)-2-[[双(4-甲氧基-苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)-2-(三异丙基甲硅烷基-氧基甲基)吗啉-4-基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙氧基]四氢吡喃-2-基]甲基酯
根据通用程序J，在二氧化硅上提纯(在DCM/EtOAc 1:1中0至10％DCM/EtOAc/MeOH10:10:1)，406mg(822μmol，1.2当量)的羧酸79c得到413mg(50.0％)的标题化合物80c。
LCMS-方法C：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝3.17
电离方法：ES-：[M-H]-＝1204.0
80d：乙酸[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-乙酰氨基-3,4-二乙酰氧基-6-[5-[(2S,6R)-2-[[双(4-甲氧基-苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)-2-(三异丙基甲硅烷基-氧基甲基)吗啉-4-基]-5-氧代-戊氧基]四氢吡喃-2-基]甲基酯
根据通用程序J，在二氧化硅上提纯(DCM中0至5％MeOH)后，750mg(1.68mmol，1.0当量)的羧酸79d得到1.76g(90.6％)的标题化合物80d。
LCMS-方法A：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝2.16
电离方法：ES-：[M-H]-＝1157.5
80e：乙酸[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-乙酰氨基-3,4-二乙酰氧基-6-[12-[(2S,6R)-2-[[双(4-甲氧基-苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)-2-(三异丙基甲硅烷基-氧基甲基)吗啉-4-基]-12-氧代-十二烷氧基]四氢吡喃-2-基]甲基酯
根据通用程序J，在二氧化硅上提纯(DCM中0至5％MeOH)后，897mg(1.64mmol，1.2当量)的羧酸79e得到1.46g(84.5％)的标题化合物80e。
LCMS-方法A：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝2.25
电离方法：ES-：[M-H]-＝1255.6
81a：乙酸[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-乙酰氨基-3,4-二乙酰氧基-6-[2-[(2R,6R)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-2-(羟基甲基)-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)吗啉-4-基]-2-氧代-乙氧基]四氢吡喃-2-基]甲基酯
根据通用程序G(参见方案20)，将530mg(474μmol)的TIPS-醚80a脱保护，在硅胶色谱(在DCM/EtOAc 1:1中0至10％DCM/EtOAc/MeOH 5:5:1)后，得到380mg(83.4％)的标题化合物81a。
LCMS-方法C：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝2.29
电离方法：ES-：[M-H]-＝959.9
1H-NMR(DMSO-d6，600MHz)δ[ppm]：11.44(br s，1H)，7.83-7.88(m，0.4H)，7.78(brd，J＝9.17Hz，0.6H)，7.64(s，1H)，7.39-7.44(m，2H)，7.21-7.32(m，7H)，6.85-6.90(m，4H)，5.88-5.93(m，0.4H)，5.83(m，0.6H)，5.19-5.23(m，1H)，4.90-5.02(m，1.6H)，4.53-4.62(m，1.4H)，21 4.42(br d，J＝14.12Hz，0.6H)，4.32-4.39(m，1H)，4.20-4.31(m，1.4H)，3.81-4.07(m，6H)，3.72-3.79(m，7H)，3.47-3.65(m，2H)，2.99-3.11(m，2H)，2.88-2.97(m，1H)，2.10，2.04(2x s，3H)，1.99，1.97(2x s，3H)，1.88(s，3H)，1.73，1.72(m，6H)。
81b：乙酸[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-乙酰氨基-3,4-二乙酰氧基-6-[2-[2-[(2R,6R)-2-[[双(4-甲氧基-苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-2-(羟基甲基)-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)吗啉-4-基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]四氢吡喃-2-基]甲基酯
根据通用程序G(参见方案20)，将670mg(577μmol)的TIPS-醚80b脱保护，在硅胶色谱(在DCM/EtOAc 1:1中0至10％DCM/EtOAc/MeOH 5:5:1)后，得到504mg(86.9％)的标题化合物81b。
LCMS-方法C：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝2.30
电离方法：ES-：[M-H]-＝1003.9
1H-NMR(DMSO-d6，600MHz)δ[ppm]：11.42(br s，1H)，7.80(d，J＝9.35Hz，1H)，7.64，7.60(2x s，1H)，7.39-7.44(m，2H)，7.19-7.35(m，7H)，6.85-6.90(m，4H)，5.87-5.93(m，0.4H)，5.82(br d，J＝8.07Hz，0.6H)，5.21(br s，1H)，4.94-5.00(m，1.6H)，4.64-4.70(m，0.4H)，4.54-4.58(m，1H)，4.33-4.39(m，0.6H)，4.11-4.26(m，2.4H)，4.00-4.05(m，3.4H)，3.78-3.94(m，2.6H)，3.74(m，6H)，3.42-3.70(m，6H)，3.07-3.11(m，1H)，2.89-3.05(m，2H)，2.04-2.12(m，3H)，1.97-2.01(m，3H)，1.89(s，3H)，1.71-1.78(m，6H)。
81c：乙酸[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-乙酰氨基-3,4-二乙酰氧基-6-[2-[2-[2-[(2R,6R)-2-[[双(4-甲氧基-苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-2-(羟基甲基)-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)-吗啉-4-基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙氧基]四氢吡喃-2-基]甲基酯
根据通用程序G(参见方案20)，将410mg(340μmol)的TIPS-醚80c脱保护，在硅胶色谱(在DCM/EtOAc 1:1中0至10％DCM/EtOAc/MeOH 5:5:1)后，得到285mg(79.9％)的标题化合物81c。
LCMS-方法C：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝2.31
电离方法：ES-：[M-H]-＝1047.9
1H-NMR(DMSO-d6，600MHz)δ[ppm]：11.43(br s，1H)，7.76(m，1H)，7.57-7.65(m，1H)，7.42(m，2H)，7.21-7.32(m，7H)，6.85-6.90(m，4H)，5.88-5.94(m，0.4H)，5.82(m，0.6H)，5.21(m，1H)，4.94-4.99(m，1.6H)，4.63-4.69(m，0.4H)，4.57(m，1H)，4.36(m，0.6H)，4.16-4.26(m，2H)，4.09-4.15(m，0.4H)，3.99-4.05(m，3H)，3.85-3.92(m，2H)，3.69-3.79(m，8H)，3.45-3.62(m，9H)，3.06-3.10(m，1H)，2.88-3.06(m，2H)，2.10(s，3H)，1.99(s，3H)，1.88(s，3H)，1.76(br s，3H)，1.73(s，3H)。
81d：乙酸[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-乙酰氨基-3,4-二乙酰氧基-6-[5-[(2R,6R)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-2-(羟基甲基)-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)吗啉-4-基]-5-氧代-戊氧基]四氢吡喃-2-基]甲基酯
根据通用程序G(参见方案20)，将1.75g(1.51mmol)的TIPS-醚80d脱保护，在硅胶色谱(DCM中0至10％MeOH)后，得到1.17g(77.3％)的标题化合物81d。
LCMS-方法A：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝1.80
电离方法：ES-：[M-H]-＝1001.4
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.43(s，1H)，7.78(m，1H)，7.64，7.58(2x b s，1H)，7.41(m，2H)，7.20-7.33(m，7H)，6.88(m，4H)，5.85(m，0.4H)，5.77(m，0.6H)，5.21(m，1H)，4.92-5.01(m，1.6H)，4.61-4.67(m，0.4H)，4.45-4.52(m，1H)，4.37-4.45(m，0.6H)，4.21-4.29(m，0.4H)，3.67-4.07(m，12H)，3.32-3.64(m，4H)，2.81-3.14(m，3H)，2.27-2.38(m，2H)，2.06-2.12(m，3H)，1.96-2.01(m，3H)，1.89(m，3H)，1.76(m，3H)，1.72(m，3H)，1.49(br s，4H)。
81e：乙酸[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-乙酰氨基-3,4-二乙酰氧基-6-[12-[(2R,6R)-2-[[双(4-甲氧基-苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-2-(羟基甲基)-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)-吗啉-4-基]-12-氧代-十二烷氧基]四氢吡喃-2-基]甲基酯
根据通用程序G(参见方案20)，将1.45g(1.15mmol)的TIPS-醚80e脱保护，在硅胶色谱(DCM中0至5％MeOH)后，得到1.10g(86.6％)的标题化合物81e。
LCMS-方法A：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝1.96
电离方法：ES-：[M-H]-＝1099.6
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.42(br s，1H)，7.79(d，J＝9.29Hz，1H)，7.63，7.57(2x s，1H)，7.41(m，2H)，7.20-7.34(m，7H)，6.87(m，4H)，5.84(m，0.4H)，5.77(m，0.6H)，5.21(m，1H)，4.91-5.01(m，1.6H)，4.61-4.68(m，0.4H)，4.48(m，1H)，4.39(m，0.6H)，4.24(m，0.4H)，3.98-4.06(m，3H)，3.66-3.90(m，3H)，3.74(s，6H)，3.56(m，1H)，3.36-3.50(m，2H)，2.77-3.16(m，2H)，2.22-2.39(m，2H)，2.10(m，3H)，1.99(m，3H)，1.89(m，3H)，1.76(m，3H)，1.72(m，3H)，1.39-1.56(m，4H)，1.18-1.32(br s，16H)。
82a：乙酸[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-乙酰氨基-3,4-二乙酰氧基-6-[2-[(2S,6R)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-2-[[2-氰基乙氧基-(二异丙基氨基)膦烷基]氧基甲基]-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)吗啉-4-基]-2-氧代-乙氧基]四氢吡喃-2-基]甲基酯
根据通用程序H(参见方案20)，380mg(395μmol)的起始醇81a得到434mg(94.4％)的标题化合物82a。
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.41(b s，1H)，7.72-7.90(m，1H)，7.60-7.71(m，1H)，7.35-7.48(m，2H)，7.17-7.33(m，7H)，6.82-6.95(m，4H)，5.78-6.05(m，1H)，5.16-5.26(m，1H)，4.91-5.03(m，1H)，4.55-4.64(m，1H)，4.10-4.54(m，3H)，3.52-4.08(m，16H)，3.36-3.50(m，2H)，2.85-3.18(m，3H)，2.57-2.72(m，2H)，2.07(m，3H)，1.98(m，3H)，1.88(m，3H)，1.68-1.78(m，6H)，0.89-1.22(m，12H)。
31P-NMR(DMSO-d6，162MHz)δ[ppm]：148.2，147.1，146.8，146.3。
82b：乙酸[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-乙酰氨基-3,4-二乙酰氧基-6-[2-[2-[(2S,6R)-2-[[双(4-甲氧基-苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-2-[[2-氰基乙氧基-(二异丙基氨基)膦烷基]氧基-甲基]-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)吗啉-4-基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]四氢吡喃-2-基]甲基酯
根据通用程序H(参见方案20)，500mg(497μmol)的起始醇81b得到575mg(95.9％)的标题化合物82b。
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.40(br s，1H)，7.79(br d，J＝9.22Hz，1H)，7.63(m，1H)，7.40(br s，2H)，7.20-7.34(m，7H)，6.83-6.91(m，4H)，5.80-6.03(m，1H)，5.22(m，1H)，4.96(m，1H)，4.56(m，1H)，4.08-4.43(m，4H)，4.03(s，3H)，3.52-3.91(m，16H)，3.38-3.50(m，2H)，2.86-3.18(m，3H)，2.52-2.75(m，2H)，2.07(m，3H)，1.99(m，3H)，1.90(m，3H)，1.68-1.81(m，6H)，0.89-1.22(m，12H)。
31P-NMR(DMSO-d6，162MHz)δ[ppm]：148.2，147.2，147.13，147.06。
82c：乙酸[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-乙酰氨基-3,4-二乙酰氧基-6-[2-[2-[2-[(2S,6R)-2-[[双(4-甲氧基-苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-2-[[2-氰基乙氧基-(二异丙基氨基)膦烷基]氧基-甲基]-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)吗啉-4-基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]-乙氧基]四氢吡喃-2-基]甲基酯
根据通用程序H(参见方案20)，285mg(272μmol)的起始醇81c得到317mg(93.5％)的标题化合物82c。
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.40(br s，1H)，7.77(m，1H)，7.60-7.71(m，1H)，7.40(m，2H)，7.21-7.33(m，7H)，6.87(m，4H)，5.82-5.99(m，1H)，5.21(m，1H)，4.97(m，1H)，4.57(m，1H)，4.09-4.39(m，3H)，3.97-4.08(m，3H)，3.34-3.95(m，20H)，2.90-3.18(m，3H)，2.56-2.73(m，2H)，2.10(m，3H)，2.07(m，3H)，1.99(m，3H)，1.89(m，3H)，1.71-1.80(m，6H)，0.89-1.22(m，12H)。
31P-NMR(DMSO-d6，162MHz)δ[ppm]：148.1，147.3，147.2，147.0。
82d：乙酸[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-乙酰氨基-3,4-二乙酰氧基-6-[5-[(2S,6R)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-2-[[2-氰基乙氧基-(二异丙基氨基)膦烷基]氧基甲基]-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)吗啉-4-基]-5-氧代-戊氧基]四氢吡喃-2-基]甲基酯
根据通用程序H(参见方案20)，1.0g(997μmol)的起始醇81d得到1.19g(99.2％)的标题化合物82d。
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.41(br s，1H)，7.74-7.81(m，1H)，7.58-7.70(m，1H)，7.40(m，2H)，7.20-7.33(m，7H)，6.87(m，4H)，5.79-5.93(m，1H)，5.21(br s，1H)，4.96(m，1H)，4.31-4.52(m，2H)，3.96-4.08(m，4H)，3.53-3.94(m，6H)，3.73(s，6H)，3.34-3.50(m，4H)，3.02-3.19(m，1H)，2.83-3.01(m，1H)，2.56-2.74(m，2H)，2.52-2.54(m，1H)，2.26-2.43(m，2H)，2.10，2.08(2x s，3H)，1.99(s，3H)，1.89(m，3H)，1.71-1.79(m，6H)，1.41-1.69(m，4H)，0.89-1.12(m，12H)。
31P-NMR(DMSO-d6，162MHz)δ[ppm]：147.9，147.1，147.0，146.7。
82e：乙酸[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-乙酰氨基-3,4-二乙酰氧基-6-[12-[(2S,6R)-2-[[双(4-甲氧基-苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-2-[[2-氰基乙氧基-(二异丙基氨基)膦烷基]氧基-甲基]-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)吗啉-4-基]-12-氧代-十二烷氧基]四氢吡喃-2-基]甲基酯
根据通用程序H(参见方案20)，557mg(506μmol)的起始醇81e得到396mg(60.2％)的标题化合物82e。
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.35-11.48(m，1H)，7.76-7.84(m，1H)，7.56-7.70(m，1H)，7.33-7.45(m，2H)，7.21-7.33(m，7H)，6.87(m，4H)，5.77-5.96(m，1H)，5.21(m，1H)，4.93-5.01(m，1H)，4.31-4.51(m，2H)，3.94-4.11(m，4H)，3.53-3.92(m，4H)，3.73(m，6H)，3.33-3.49(m，3H)，3.03-3.21(m，2H)，2.83-2.99(m，1H)，2.62-2.72(m，1H)，2.21-2.48(m，2H)，2.10(m，3H)，1.99(m，3H)，1.89(m，3H)，1.71-1.82(m，6H)，1.45(br s，4H)，1.14-1.30(m，18H)，0.83-1.13(m，12H)。
31P-NMR(DMSO-d6，162MHz)δ[ppm]：147.7，147.3，147.2，146.7。
C.合成用于寡核苷酸合成的固体载体构造单元
合成方案23
D.1-a
Figure BDA0002760977440002331
D.1-b
Figure BDA0002760977440002341
用于制备琥珀酸酯83a-b和84a-b的通用程序K
将起始化合物(15a，42，20a，63a，1.0当量)、DIPEA(5.0当量)和DMAP(0.25当量)溶于无水DCM(20ml/1.0mmol)中。在添加5.0当量的琥珀酰酐后，将溶液在室温搅拌过夜(约16小时)，以达到完全转化。在添加H2O之后，将有机层分离，并用柠檬酸(10％)水溶液和饱和的NaHCO3溶液洗涤1次。在用MgSO4干燥后，将粗产物通过硅胶色谱提纯。收集产物级分，并添加1.0当量的NEt3。在真空蒸发溶剂后，将产物分离为无色泡沫(NEt3-盐)。
83a：4-[[(2S,6R)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-4-异丙基-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)吗啉-2-基]甲氧基]-4-氧代-丁酸(NEt3盐)
根据通用程序K，在二氧化硅上提纯(用DCM/NEt3 99.5:0.5，DCM中0至20％MeOH进行预处理)后，146mg(237μmol)的15a得到112mg(57.9％，NEt3-盐)的所需琥珀酸酯83a。
LCMS-方法A：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝1.85
电离方法：ES+：[M+H]+＝716.2
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.34(br s，1H)，7.57(s，1H)，7.20-7.39(m，9H)，6.88(dd，J＝8.99，2.75Hz，4H)，5.81(dd，J＝9.84，2.75Hz，1H)，4.57(d，J＝11.00Hz，1H)，4.32(d，J＝11.13Hz，1H)，3.73(s，6H)，3.08(d，J＝9.05Hz，1H)，2.95(d，J＝8.93Hz，1H)，2.76(m，3H)，2.40-2.48(m，6H)，2.22-2.37(m，6H)，1.74(s，3H)，0.76-0.97(m，15H)。
83b：4-[[(2S,6R)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)-1,4-二噁烷-2-基]甲氧基]-4-氧代-丁酸
根据通用程序K，75mg(131μmol)的42得到73mg(71.9％，部分NEt3-盐)的所需琥珀酸酯83b，将其用于下一步骤中无需额外提纯。
LCMS-方法A：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝1.85
电离方法：ES-：[M-H]-＝673.4
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.38(br s，1H)，7.58(s，1H)，7.20-7.38(m，9H)，6.88(dd，J＝8.93，3.06Hz，4H)，5.89(dd，J＝10.03，3.30Hz，1H)，4.62(d，J＝11.61Hz，1H)，4.33(d，J＝11.74Hz，1H)，3.76-3.92(m，2H)，3.73(s，6H)，3.51-3.63(m，2H)，3.03(d，J＝9.17Hz，1H)，2.95(d，J＝9.05Hz，1H)，2.58-2.68(m，2H)，2.31-2.41(m，2H)，1.73(s，3H)。
84a：4-[[(2R,6R)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-4-异丙基-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)吗啉-2-基]甲氧基]-4-氧代-丁酸(NEt3盐)
根据通用程序K，在二氧化硅上提纯(用DCM/NEt3 99.5:0.5，DCM中0至20％MeOH进行预处理)后，78mg(127μmol)的20a得到50mg(48.3％，NEt3-盐)的所需琥珀酸酯84a。
LCMS-方法A：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝1.86
电离方法：ES+：[M+H]+＝716.2
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.32(br s，1H)，7.54-7.58(m，1H)，7.20-7.39(m，9H)，6.89(d，J＝8.80Hz，4H)，5.64(dd，J＝10.03，2.93Hz，1H)，4.19(d，J＝11.25Hz，1H)，4.09(d，J＝11.13Hz，1H)，3.74(s，6H)，3.42(br d，J＝8.80Hz，2H)，3.15(m，1H)，2.86(br d，J＝11.37Hz，1H)，2.69-2.77(m，2H)，2.44(q，J＝7.13Hz，6H)，2.28-2.40(m，5H)，2.16-2.25(m，1H)，1.78(s，3H)，0.89-0.98(m，15H)。
84b：4-[[(2R,6R)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)-1,4-二噁烷-2-基]甲氧基]-4-氧代-丁酸
根据通用程序K，69mg(119μmol)的63a得到63mg(68.2％，部分NEt3-盐)的所需琥珀酸酯84b，将其用于下一步骤中无需额外提纯。
LCMS-方法A：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝1.82
电离方法：ES-：[M-H]-＝673.3
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ[ppm]：11.39(br s，1H)，7.62(s，1H)，7.20-7.39(m，9H)，6.90(d，J＝8.93Hz，4H)，5.78(dd，J＝10.21，3.36Hz，1H)，4.23(d，J＝11.25Hz，1H)，4.10(d，J＝11.25Hz，1H)，3.68-3.80(m，8H)，3.51-3.59(m，1H)，3.20-3.51(m，5H)，2.45-2.52(m，2H)，1.79(s，3H)。
用于制备CPG固体载体85a-b和86a-b的通用程序L
将CPG固体载体材料在35℃真空干燥2小时。将1.0当量的琥珀酸酯(83a，83b，84a，84b)、1.2当量的TBTU和1.2当量的N-乙基-吗啉的DMF(8ml，0.125mmol)溶液在室温搅拌1小时，并随后转移至含1.0当量CPG固体载体(30μmol/g游离氨基，
Figure BDA0002760977440002361
)的falcon管中。在用20ml DMF稀释后，在室温将混合物振荡24小时。将固体载体过滤，并用30ml MeOH(3x)、30ml丙酮(3x)和30ml乙醚(3x)洗涤。干燥后，将固体载体在falcon管中用15ml封端剂A(THF，2,6-二甲基吡啶，乙酸酐8:1:1v/v/v)和15ml封端剂B(N-甲基咪唑，THF 1:9v/v)处理1小时。如上过滤并洗涤后，在35℃将固体材料真空干燥2小时。通过光度法测定负载量。
85a：琥珀酸酯83a的CPG上的固体载体
根据通用程序L，将105mg(128.5μmol)的琥珀酸酯83a固定至4.28g CPG固体载体(30μmol/g游离胺)上。最后的负载量测定为30.1μmol/g固体载体85a(4.25g)。
85b：琥珀酸酯83b的CPG上的固体载体
根据通用程序L，将63mg(81μmol)的琥珀酸酯83b固定至2.32g CPG固体载体(30μmol/g游离胺)上。最后的负载量测定为32.8μmol/g固体载体85b(2.31g)。
86a：琥珀酸酯84a的CPG上的固体载体
根据通用程序L，将44mg(54μmol)的琥珀酸酯84a固定至1.80g CPG固体载体(30μmol/g游离胺)上。最后的负载量测定为30.4μmol/g固体载体86a(1.76g)。
86b：琥珀酸酯84b的CPG上的固体载体
根据通用程序L，将54mg(70μmol)的琥珀酸酯84b固定至1.99g CPG固体载体(30μmol/g游离胺)上。最后的负载量测定为36.1μmol/g固体载体86b(2.00g)。
实施例D.2：
合成方案24
Figure BDA0002760977440002371
用于合成琥珀酸酯87a-e的通用程序M
将起始化合物(75f，75g，75e，81d，81e，1.0当量)溶于无水DCM(120ml，1.0mmol)中。在添加2.0当量的琥珀酰酐和3.0当量的DMAP之后，将溶液在室温搅拌直至达到完全转化。添加柠檬酸(10％)的冷水溶液，并将有机相分离，用MgSO4干燥并蒸发。将粗产物溶于ACN/H2O(1:1)并冻干，得到粗产物为无色泡沫，将其使用无需进一步提纯。
87a：4-[[(2S,6R)-4-[5-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基戊基]-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)吗啉-2-基]甲氧基]-4-氧代-丁酸
根据通用程序M，50mg(51μmol)的75f得到54mg(98.1％，粗品)的所需琥珀酸酯87a。
LCMS-方法A：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝1.82
电离方法：ES+：[M+H]+＝1089.7
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)：12.19(br s，1H)，11.33(s，1H)，7.79(d，J＝9.17Hz，1H)，7.54(s，1H)，7.19-7.39(m，9H)，6.81-6.91(m，4H)，5.82(dd，J＝9.78，2.57Hz，1H)，5.21(d，J＝3.30Hz，1H)，4.96(dd，J＝11.25，3.30Hz，1H)，4.61(d，J＝11.25Hz，1H)，4.49(d，J＝8.44Hz，1H)，4.27(d，J＝11.49Hz，1H)，3.96-4.08(m，3H)，3.82-3.95(m，1H)，3.68-3.76(m，7H)，3.36-3.49(m，2H)，3.05(d，J＝8.80Hz，1H)，2.96(d，J＝8.93Hz，1H)，2.81-2.92(m，2H)，2.25-2.41(m，5H)，2.05-2.17(m，5H)，1.98(s，3H)，1.88(s，3H)，1.77(s，3H)，1.72(s，3H)，1.36-1.56(m，4H)，1.22-1.34(m，2H)。
87b：4-[[(2S,6R)-4-[12-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)-四氢吡喃-2-基]氧基十二烷基]-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)吗啉-2-基]甲氧基]-4-氧代-丁酸
根据通用程序M，50mg(46μmol)的75g得到55mg(99.8％，粗品)的所需琥珀酸酯87b。
LCMS-方法A：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝2.03
电离方法：ES+：[M+H]+＝1187.8
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)：12.20(br s，1H)，11.33(s，1H)，7.79(d，J＝9.29Hz，1H)，7.53(s，1H)，7.20-7.39(m，9H)，6.88(dd，J＝8.99，2.87Hz，4H)，5.81(dd，J＝9.78，2.69Hz，1H)，5.21(d，J＝3.30Hz，1H)，4.96(dd，J＝11.19，3.48Hz，1H)，4.60(d，J＝11.37Hz，1H)，4.48(d，J＝8.56Hz，1H)，4.26(d，J＝11.25Hz，1H)，3.97-4.06(m，3H)，3.82-3.91(m，1H)，3.66-3.75(m，7H)，3.37-3.45(m，2H)，3.04(br d，J＝8.80Hz，1H)，2.93-2.99(m，1H)，2.80-2.88(m，2H)，2.25-2.41(m，5H)，2.05-2.20(m，5H)，1.99(s，3H)，1.89(s，3H)，1.76(s，3H)，1.72(s，3H)，1.44(m，4H)，1.24(br s，16H)。
87c：4-[[(2S,6R)-4-[5-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基戊酰基]-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)吗啉-2-基]甲氧基]-4-氧代-丁酸
根据通用程序M，150mg(150μmol)的81d得到95mg(57.6％，粗品)的所需琥珀酸酯87c。
LCMS-方法A：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝1.78
电离方法：ES-：[M-H]-＝1101.4
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)：12.20(br s，1H)，11.37-11.43(m，1H)，7.74-7.81(m，1H)，7.58-7.65(m，1H)，7.18-7.42(m，9H)，6.90(m，4H)，5.75-5.92(m，1H)，5.21(m，1H)，4.96(m，1H)，4.50(m，1H)，4.07-4.46(m，3H)，4.02(s，3H)，3.81-3.99(m，2H)，3.74(s，7H)，3.36-3.49(m，2H)，3.15(m，1H)，2.93-3.08(m，2H)，2.31-2.43(m，8H)，2.10，2.07(2x s，3H)，1.99(s，3H)，1.89(s，3H)，1.72-1.79(m，6H)，1.51(br s，4H)。
87d：4-[[(2S,6R)-4-[12-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)-四氢吡喃-2-基]氧基十二烷酰基]-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)吗啉-2-基]甲氧基]-4-氧代-丁酸
根据通用程序M，150mg(150μmol)的81e得到102mg(62.3％，粗品)的所需琥珀酸酯87d。
LCMS-方法A：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝1.92
电离方法：ES-：[M-H]-＝1199.5
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)：12.17(br s，1H)，11.36-11.45(m，1H)，7.79(d，J＝9.17Hz，1H)，7.58-7.65(m，1H)，7.17-7.45(m，9H)，6.84-6.94(m，4H)，5.76-5.89(m，1H)，5.21(m，1H)，4.96(m，1H)，4.48(m，1H)，4.08-4.45(m，3H)，3.97-4.05(m，3H)，3.80-3.97(m，2H)，3.63-3.79(m，7H)，3.34-3.46(m，2H)，2.87-3.20(m，3H)，2.29-2.44(m，8H)，2.06-2.14(m，3H)，1.99(s，3H)，1.84-1.94(m，3H)，1.68-1.84(m，6H)，1.45(br s，4H)，1.24(br s，12H)。
87e:4-[[(2S,6R)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基-甲基)四氢吡喃-2-基]氧基乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙基]-2-[[双(4-甲氧基-苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)吗啉-2-基]-甲氧基]-4-氧代-丁酸
根据通用程序M，50mg(44.5μmol)的75e得到54mg(99.2％，粗品)的所需琥珀酸酯87e。
LCMS-方法A：
UV-波长[nm]＝220:Rt[min]＝1.81
电离方法：ES-：[M-H]-＝1221.7
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)：12.19(b s，1H)，11.33(s，1H)，7.77(d，J＝9.17Hz，1H)，7.54(s，1H)，7.20-7.39(m，9H)，6.88(dd，J＝8.93，3.18Hz，4H)，5.81(dd，J＝9.90，2.69Hz，1H)，5.21(d，J＝3.30Hz，1H)，4.97(dd，J＝11.25，3.42Hz，1H)，4.62(d，J＝11.49Hz，1H)，4.56(d，J＝8.56Hz，1H)，4.26(d，J＝11.49Hz，1H)，4.03(s，3H)，3.83-3.95(m，1H)，3.71-3.82(m，7H)，3.42-3.58(m，16H)，2.88-3.04(m，4H)，2.53-2.62(m，2H)，2.23-2.41(m，7H)，2.10(s，3H)，1.99(s，3H)，1.89(s，3H)，1.77(s，3H)，1.71(s，3H)。
用于制备CPG固体载体88a-e的通用程序N
将CPG固体载体材料在35℃真空干燥2小时。将1.0当量的琥珀酸酯(87a-e)、1.5当量的HBTU和5.0当量DIPEA的DMF(10ml/0.100mmol)溶液在室温搅拌10分钟，然后添加1.0当量CPG固体载体(30μmol/g游离氨基，
Figure BDA0002760977440002401
)。在室温将混合物振荡24小时。将固体载体过滤，并用20ml DCM、DCM/MeOH(10:1)和30ml乙醚洗涤两次。干燥后，将固体载体在falcon管中用15ml封端剂A(THF，2,6-二甲基吡啶，乙酸酐8:1:1v/v/v)和15ml封端剂B(N-甲基咪唑，THF 1:9v/v)处理1小时。如上过滤并洗涤后，将固体材料在35℃真空干燥2小时。通过光度法测定负载量。
88a：琥珀酸酯87a的CPG上的固体载体
根据通用程序N将50mg(46μmol)的琥珀酸酯87a固定至1.53g CPG固体载体(30μmol/g游离胺)上。最后的负载量测定为24.2μmol/g固体载体88a。
88b：琥珀酸酯87b的CPG上的固体载体
根据通用程序N将52mg(44μmol)的琥珀酸酯87b固定至1.45g CPG固体载体(30μmol/g游离胺)上。最后的负载量测定为22.3μmol/g固体载体88b。
88c：琥珀酸酯87c的CPG上的固体载体
根据通用程序N将90mg(82μmol)的琥珀酸酯87c固定至2.72g CPG固体载体(30μmol/g游离胺)上。最后的负载量测定为28.7μmol/g固体载体88c。
88d：琥珀酸酯87d的CPG上的固体载体
根据通用程序N将100mg(83μmol)的琥珀酸酯87d固定至2.76g CPG固体载体(30μmol/g游离胺)上。最后的负载量测定为32.0μmol/g固体载体88d。
88e：琥珀酸酯87e的CPG上的固体载体
根据通用程序N将55mg(45μmol)的琥珀酸酯87e固定至1.50g CPG固体载体(30μmol/g游离胺)上。最后的负载量测定为29.2μmol/g固体载体88e。
下表说明了根据本说明书的化合物的一些实例的化学结构；指出了与说明书和方案的对应关系，以及立体化学。表A示出了用于寡核苷酸合成的亚磷酰胺核苷酸类似物的一些实例。表B示出了用于寡核苷酸合成的核苷酸类似物的一些固体载体。
在(2S,6R)非对映异构体系列中，作为核苷酸前体的亚磷酰胺缩写为“pre-1”，核苷酸类似物缩写为“l”，然后是核碱基和一个数字，其指定在式(I)和(II)中的基团Y。为了区分两种立体化学，类似物(2R,6R)-非对映异构体用额外的“b”表示。对于固体载体，缩写“CPG-l”与如上所述的附加信息一起使用。靶向的核苷酸前体、靶向的核苷酸类似物和固体载体如上所述被缩写，但是用“1g”代替“1”。
表A
Figure BDA0002760977440002421
Figure BDA0002760977440002431
Figure BDA0002760977440002441
Figure BDA0002760977440002451
Figure BDA0002760977440002461
Figure BDA0002760977440002471
Figure BDA0002760977440002481
表B
Figure BDA0002760977440002482
Figure BDA0002760977440002491
合成包含核苷酸类似物和靶向的核苷酸及类似物的siRNA
寡核苷酸合成和siRNA制备
所有寡核苷酸均在ABI 394合成器上合成。将可商购的(Sigma Aldrich)具有标准保护基团的DNA-、RNA-、2’-OMe-RNA和2’-脱氧-F-RNA-亚磷酰胺，如5’-O-二甲氧基三苯甲基-胸苷-3’-O-(N,N-二异丙基-2-氰基乙基-亚磷酰胺、5’-O-二甲氧基三苯甲基-2’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-尿嘧啶-3’-O-(N,N-二异丙基-2-氰基乙基)-亚磷酰胺、5’-O-二甲氧基三苯甲基-2’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-N4-胞嘧啶核苷-3’-O-(N,N-二异丙基-2-氰基乙基)-亚磷酰胺、5’-O-二甲氧基三苯甲基-2’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-N6-苯甲酰基-腺苷-3’-O-(N,N-二异丙基-2-氰基乙基)-亚磷酰胺、5’-O-二甲氧基三苯甲基-2’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-N2-异丁酰基-鸟嘌呤核苷-3’-O-(N,N-二异丙基-2-氰基乙基)-亚磷酰胺、5’-O-二甲氧基三苯甲基-2’-O-甲基-尿嘧啶-3’-O-(N,N-二异丙基-2-氰基乙基)-亚磷酰胺、5’-O-二甲氧基三苯甲基-2’-O-甲基-N4-胞嘧啶核苷-3’-O-(N,N-二异丙基-2-氰基乙基)-亚磷酰胺、5’-O-二甲氧基三苯甲基-2’-O-甲基-N6-苯甲酰基-腺苷-3’-O-(N,N-二异丙基-2-氰基乙基)-亚磷酰胺、5’-O-二甲氧基三苯甲基-2’-O-甲基-N2-异丁酰基-鸟嘌呤核苷-3’-O-(N,N-二异丙基-2-氰基乙基)-亚磷酰胺、5’-O-二甲氧基三苯甲基-2’-脱氧-氟-尿嘧啶-3’-O-(N,N-二异丙基-2-氰基乙基)-亚磷酰胺、5’-O-二甲氧基三苯甲基-2’-脱氧-氟-N4-胞嘧啶核苷-3’-O-(N,N-二异丙基-2-氰基乙基)-亚磷酰胺、5’-O-二甲氧基三苯甲基-2’-脱氧-氟-N6-苯甲酰基-腺苷-3’-O-(N,N-二异丙基-2-氰基乙基)-亚磷酰胺和5’-O-二甲氧基三苯甲基-2’-脱氧-氟-N2-异丁酰基-鸟嘌呤核苷-3’-O-(N,N-二异丙基-2-氰基乙基)-亚磷酰胺，以及相应的固体载体材料(CPG-
Figure BDA0002760977440002501
负载量40μmol/g，ChemGenes)用于自动化寡核苷酸合成。对于3’-末端胆固醇缀合物，使用固体载体3'-胆固醇SynBaseTMCPG1000(Link Technologies)32μmol/g。
亚磷酰胺构造单元用作在乙腈中的0.1M溶液，并用5-(双-3,5-三氟甲基苯基)-1H-四唑(活化剂42，在乙腈中的0.25M，Sigma Aldrich)活化。200s的反应时间用于标准亚磷酰胺偶联反应。在表A中列出的此处描述的亚磷酰胺的情况下，施加300s的偶联时间。作为封端剂，使用THF中的乙酸酐(对于ABI为capA，Sigma Aldrich)和THF中的N-甲基咪唑(对于ABI为capB，Sigma Aldrich)。作为氧化剂，使用碘在THF/吡啶/水中(0.02M；ABI的氧化剂，Sigma Aldrich)。或者，用3-((N,N-二甲基-氨基亚甲基)氨基)-3H-1,2,4-二噻唑-5-硫酮(DDTT)在吡啶/乙腈(1:1)中的0.05M溶液实现PS-氧化。使用DCM中的二氯乙酸(二氯乙酸去保护溶液，Sigma Aldrich)完成DMT-保护基团的脱保护。用NH3(32％水溶液/乙醇，v/v3:1)实现从固体载体的最终裂解和脱保护(酰基和氰基乙基保护基团)。将用NMP/NEt3/NEt3·3 HF(3:1.5:2)进行处理施用于TBDMS脱保护。
在表B所示的固体载体材料或通用接头-固体载体(CPG-
Figure BDA0002760977440002503
负载量39μmol/g，AM Chemicals LLC)以及如表A所示的相应的亚磷酰胺上合成在3’-末端具有本文所述吗啉代或二噁烷构造单元的寡核苷酸。
通过HPLC分析粗产物，并通过离子交换或制备型HPLC方法进行单链的提纯。
离子交换:
Figure BDA0002760977440002502
净化器，(Thermo Fisher Scientific DNAPac PA200半制备型离子交换柱，8μm颗粒，宽度22mm x长度250mm)。
缓冲液A:1.50l H2O，2.107g NaClO4，438mg EDTA，1.818g TRIS，540.54g尿素，pH7.4。
缓冲液B:1.50l H2O，105.34g NaClO4，438mg EDTA，1.818g TRIS，540.54g尿素，pH7.4。
寡核苷酸的分离是通过沉淀实现的，该沉淀是通过加入4体积的乙醇并在-20℃储存诱导的。
制备型HPLC：Agilent 1100系列制备型HPLC，(Waters
Figure BDA0002760977440002511
BEH C18OBDTMPrep Column
Figure BDA0002760977440002512
5μm，10mm x 100mm)。洗脱液：乙酸三乙基铵(0.1M)在乙腈/水中。冻干后，将产物溶于1.0ml 2.5M NaCl溶液和4.0ml H2O中。沉淀后，通过加入20ml乙醇分离出相应的Na+盐，并在-20℃保存18小时。
通过LC/MS-TOF方法对单链进行最终分析。结果显示在表C中。
为了形成双链，将等摩尔量的有义链和反义链在1x PBS-缓冲液中混合，并加热至85℃持续10分钟，然后缓慢冷却至室温。siRNA双链的最终分析通过LC/MS-TOF方法完成。结果显示在表D中。
体外生物学测定的材料和方法
Tm-测定
在分光光度计(Jasco V-650)中，将1.0μM的siRNA在PBS缓冲液(1x PBS)中的溶液从20℃加热至90℃，加热速率为1℃/min。在260nm处测量吸收并相对于相应温度作图。达到90℃后，将溶液以1℃/min的相同速率冷却至20℃，并重复加热冷却循环。解链温度计算为两条加热曲线的拐点的平均值。
细胞和组织培养
将人HepG2细胞在37℃、5％CO2和95％RH下生长，并在补充有10％FBS的MEM培养基(ThermoFisher，目录号41090)中培养。
根据改编自Seglen，P.O.(1976):Preparation of Isolated Rat Liver Cells；Methods in Cell Biology，13:29-83的实验方案，在实验前，从雌性C57BL/6小鼠中新鲜分离出原代肝细胞。在补充有2mM谷氨酰胺(ThermoFisher，目录号25030)、100U/ml青霉素-链霉素(ThermoFisher，目录号15140)、1μg/ml地塞米松(Sigma，目录号D1756)、1x ITS溶液(ThermoFisher，目录号41400)和5％FBS的威廉姆斯E(Williams’E)培养基(ThermoFisher，目录号22551)中，在37℃、5％CO2和95％下，对分离的肝细胞进行3-5小时的铺板。铺板后，将培养基更换为除补充1％FBS外与铺板培养基相同的培养基。在48或72小时的温育期内，无需进行其它培养基更换。
根据制造商的使用说明，从三名健康供体的约16mL血液中分离人外周血单核细胞(PBMC)，这些血液收集在涂有肝素钠(BD，德国海德堡)的Vacutainer管中。
siRNA转染
为了在HepG2细胞中进行敲低实验，在胶原-I包被的96孔板(Corning，目录号356407)中使用20,000个细胞/孔。按照制造商的使用说明，在反向转染设置中，使用0.2μl/孔的Lipofectamine RNAiMAX转染试剂(ThermoFisher)以指定浓度的AHA-1siRNA转染细胞，并在不更换培养基的情况下温育48小时。通常，每个测试样品进行N＝4次技术重复。
对于人PBMC的转染，将100nM的siRNA在总体积为150μL的无血清RPMI培养基(ThermoFisher，目录号11875)中用0.3μL Lipofectamine2000/96孔(N＝2)反向转染至1x105 PBMC中24小时。
IC50测量
为了在原代新鲜小鼠肝细胞中进行IC50测量，将胶原-I包被的96孔板中的30,000个细胞在自由摄取条件下与siRNA一起温育48小时，siRNA浓度为1μM-1pM，使用10倍稀释步骤。通过应用Biostat-Speed统计计算工具计算每种siRNA的半数最大抑制浓度(IC50)。根据Ratkovsky和Reedy(1986)使用4参数逻辑模型获得结果。使用SAS v9.1.3软件中的Levenberg-Marquardt算法，通过非线性回归进行调整。
mRNA表达分析
siRNA转染或自由siRNA摄取后48小时，根据制造商的方案(包括程序期间的DNase步骤)，使用Promega的SV96总RNA分离系统(目录号Z3500)，收获细胞RNA。
对于cDNA合成，使用来自ThermoFisher的逆转录酶(Reverse Transcriptase)试剂盒(目录号N8080234)。使用总体积12μl中的1.2μl 10xRT缓冲液、2.64μl MgCl2(25mM)、2.4μl dNTPs(10mM)、0.6μl随机六聚体(50μM)、0.6μl Oligo(dT)16(50μM)、0.24μl RNase抑制剂(20U/μl)和0.3μl Multiscribe(50U/μl)进行cDNA合成。将样品在25℃温育10分钟，并在42℃温育60分钟。通过加热至95℃持续5分钟来终止反应。
分别使用ThermoFisher TaqMan Universal PCR Master Mix(目录号4305719)和TaqMan基因表达检测Hs00201602_m1和Mm00443267_m1，通过qPCR对人AHA-1和小鼠TTRmRNA水平进行定量。在以下PCR条件下，使用ABI Prism 7900技术重复进行PCR：在50℃2分钟，在95℃10分钟，在95℃15秒40个循环和在60℃1分钟。将PCR设置为单一PCR，其在一个反应中检测靶基因，并在第二个反应中检测用于标准化的管家基因(人/小鼠RPL37A)。在1xPCR反应混合物中，PCR反应的最终体积为12.5μl，使用的RPL37A引物的终浓度为50nM，探针的浓度为200nM。将ΔΔCt方法应用于计算靶转录物的相对表达水平。基于LV2或LV3非沉默siRNA对照序列的水平，通过标准化计算靶基因表达的百分比。
IFNα测定
对人PBMC上清液中的IFNα蛋白浓度进行如下定量：使用25μL细胞培养上清液用于应用基于MesoScale Discovery的技术的自建的电化学发光测定，并使用泛IFNα单克隆捕获抗体(MT1/3/5，Mabtech)来测量IFNα浓度。或者，基于MesoScale的U-PLEX平台并根据供应商的方案，应用人IFNα2a同种型特异性测定(目录号K151VHK)。
细胞毒性
在自由摄取条件下用30,000个新鲜小鼠肝细胞温育后72小时，通过测定每个样品中细胞活力/毒性的比率，测量小鼠TTR siRNA的细胞毒性。根据制造商的方案，使用CellTiter-Glo测定(Promega，目录号G7570)测定细胞内ATP含量，从而测量细胞活力。根据制造商的方案，使用LDH测定(Sigma，目录号11644793001)测量上清液中的细胞毒性。
核酸酶稳定性
测试了siRNA在50％小鼠血清中的核酸酶稳定性。为此目的，将160μL小鼠血清(Sigma，目录号M5905)在37℃温育0、8、24、32、48、56、72、80和96小时。在每个时间点，取出21μL反应液，并在65℃用23μL终止溶液淬灭(对于3,000μL终止溶液：1123μL组织和细胞裂解溶液(Epicentre，目录号MTC096H)，183μL 20mg/mL蛋白酶K(Sigma，目录号P2308)，1694μL水)30分钟。在于Waters 2695分离模块和2487双吸光度检测器上进行HPLC分析之前，向每个样品中添加33μL不含RNase的水。使用DNAPac PA200分析柱(Thermo Scientific，目录号063000)，通过HPLC分析50μL溶液，且梯度如下：
时间(min) 流速(mL/min) ％缓冲液A* ％缓冲液B**
0 1 75 25
20 1 35 65
*缓冲液A：20mM磷酸钠(Sigma，目录号342483)，pH 11；
**缓冲液B：20mM磷酸钠(Sigma，目录号342483)，1M溴化钠(Sigma，目录号02119)，pH 11。
实施例1：通过解链温度测量的示例性siRNA的稳定性
在靶向AHA-1(siRNA-1)的siRNA序列中，有义链的所有rU-核苷酸依次被iPr-吗啉-U核苷酸类似物lU3和lU3b替代。使用pre-lU3b作为亚磷酰胺构造单元，从有义链的3’-末端开始进行连续替代，得到修饰的有义链ss2(1lU3b)至ss6(5lU3b)，将其与未修饰的反义链as1一起退火，产生lU3b-修饰的双链siRNA-2至siRNA-6(表1-3)。使用pre-lU3作为核苷酸前体的类似物非对映异构体系列给出了相应的双链siRNA-9至siRNA13(表1-3)。
表1：有义链(5’→3’)
Figure BDA0002760977440002541
表2：反义链(5’→3’)
Figure BDA0002760977440002551
表3：针对某些siRNA测量的Tm值
Figure BDA0002760977440002552
根据本公开中指定的材料和方法测量siRNA的Tm值。未修饰的siRNA-1的解链温度在73.6℃测得。使用2’-OMe修饰的反义链获得预期的略升高的解链温度76.8℃(siRNA-7)。用lU3b-类似物替代第一rU-核苷酸导致Tm值的小幅下降。表3中的数据表明，每掺入另外的lU3b，解链温度进一步降低，导致其中掺入了5个lU3b-构造单元的siRNA-6的Tm值为50.2℃。将siRNA-6中的反义链改为2’-OMe类似物(siRNA-8)不会导致解链温度升高。
在吗啉的2位上具有相反立体化学的1U3-系列中，获得了相似的结果。表3中的数据显示，与将相等数量的lU3b-或lU3-构造单元掺入相应siRNA(siRNA-2和siRNA-9、siRNA-3和siRNA-10、siRNA-4和siRNA-11、siRNA-5和siRNA-12、siRNA-6和siRNA-13，以及siRNA-8和siRNA-14)的有义链的那些siRNA相比，两个系列的解链温度几乎相同。
这些结果表明，基于iPr-吗啉-U的构造单元lU3b和lU3导致与未修饰的对应物相比相应siRNA的解链温度降低。lU3b-或lU3-核苷酸数量的增加导致Tm值降低的增加。在吗啉-支架上的两个非对映异构体取向之间没有显著差异，从而导致了lU3b-和lU3-结构。
使用二噁烷系列中的尿苷类似物进行了类似的评估(表4-6)。根据荧光素酶序列，未修饰的siRNA(siRNA-15)的解链温度确定为74℃。在有义链(ss13)中，所有rU-核苷酸依次被替换为：
·lU1b-核苷酸，其导致在有义链中具有1至6个lU1b-构造单元(ss14至ss19)的双链siRNA-16至siRNA-21，或
·lU1-核苷酸，其导致在有义链中具有1至6个lU1-构造单元(ss20至ss25)的双链siRNA-22至siRNA-27。
表4：有义链(5’→3’)
Figure BDA0002760977440002561
表5：反义链(5’→3’)
Figure BDA0002760977440002571
表6：针对某些siRNA测量的Tm值
siRNA编号 有义链编号 反义链编号 lU1b的数量 lU1的数量 Tm[℃]
siRNA-15 ss13 as3 0 0 74.0
siRNA-16 ss14 as3 1 0 66.3
siRNA-17 ss15 as3 2 0 63.7
siRNA-18 ss16 as3 3 0 56.2
siRNA-19 ss17 as3 4 0 49.6
siRNA-20 ss18 as3 5 0 42.3
siRNA-21 ss19 as3 6 0 42.0
siRNA-22 ss20 as3 0 1 66.0
siRNA-23 ss21 as3 0 2 64.3
siRNA-24 ss22 as3 0 3 55.3
siRNA-25 ss23 as3 0 4 46.8
siRNA-26 ss24 as3 0 5 37.2
siRNA-27 ss25 as3 0 6 37.0
表6中的数据显示，随着有义链中基于二噁烷的核苷酸构造单元lU1b或lU1数量的增加，所得siRNA具有依次降低的相应的解链温度，在lU1b-系列中siRNA-21的值最低，而在lU1-修饰的siRNA中siRNA-27的值最低。
表3和表6中的结果表明，将iPr-吗啉-U-核苷酸或二噁烷-U-核苷酸(lU3b、lU3、lU1b和lU1)掺入siRNA有义链会导致双链稳定性下降，从而导致解链温度降低。iPr-吗啉-或二噁烷-U构造单元的数量越多，siRNA分子的Tm值和双链体稳定性越低。在两个系列(lU3b vs.lU3和lU1b vs.lU1)中，立体化学均无显著依赖性。
实施例2：示例性siRNA在时间上的稳定性
表7至10包含已使用的对照序列。
表7：有义链对照(5’→3’)
Figure BDA0002760977440002572
表8：反义链对照(5’→3’)
Figure BDA0002760977440002581
表9：具有dT-dT-突出端的对照-siRNA
siRNA编号 有义链编号 反义链编号 3‘-末端有义 3‘-末端反义
siRNA-7 ss7 as2 dT*dT dT*dT
siRNA-28 ss26 as2 dT-dT dT*dT
siRNA-56 ss26 as5 dT-dT dT-dT
iPr-吗啉-T-和二噁烷-T构造单元(pre-lT3、pre-lT3b、pre-lT1和pre-lT1b)的两种非对映异构体已作为突出端附接到AHA1序列中有义链的3'-和5’-末端以及反义链的3’-末端。单一有义和反义链序列分别在表10和11中列出。相应的siRNA示于表12中。作为对照siRNA，已使用标准的dT-PS-dT稳定分子(siRNA-7)。为了与PO连接的修饰的siRNA(表9)进行直接比较，已合成了具有部分或全部PO桥接突出端的类似物对照(siRNA-28和siRNA-56)。
已将修饰的siRNA(siRNA-58至siRNA-79)在小鼠血清中的稳定性与标准dT-PS-dT突出端(siRNA-7)以及部分PO桥接类似物siRNA-28和-56进行比较。稳定性由反义链的数量决定，其可在50％小鼠血清中温育24小时后通过HPLC方法检测到，并以0小时温育时初始量的％值列出。表13中列出了所得的反义链数量(％)。
表10：具有lT3-、lT3b-、lT1-和lT1b-突出端的有义链(5’→3’)
Figure BDA0002760977440002582
Figure BDA0002760977440002591
表11：具有lT3-、lT3b-、lT1-和lT1b-突出端的反义链(5’→3’)
Figure BDA0002760977440002592
表12：在ss和as具有吗啉-和二噁烷-突出端的siRNA
Figure BDA0002760977440002601
表13：稳定性：与0h值相比，24小时后检测到的反义链数量
Figure BDA0002760977440002602
Figure BDA0002760977440002611
如表13所示，在测试条件下，在对照siRNA中，只有具有2个硫代磷酸酯稳定化的dT-dT突出端的siRNA-7，在温育24小时后显示出大量的反义(15％)。在反义链(as2)中只有一个PS-基团的类似物分子siRNA-28和没有PS-基团的siRNA-56在选定的时间点都未显示出可检测到的反义链数量。
相反，所有ITIT修饰的siRNA(siRNA-58至-79)在24小时后均显示出大量的反义链。尽管在ITIT突出端(lT＝lT3、lT3b、lT1和lT1b)中没有额外的PS-稳定的情况下合成了IT修饰的双链，但这些数量与对照分子siRNA-7观察到的数量相当。此外，某些siRNA修饰的反义数量约为dT-PS-dT-稳定的对照化合物siRNA-7观察到的数量的两倍。实例是siRNA-61、-66和-72，它们在有义链和反义链上都具有双lT-突出端(lT3、lT3b和lT1)，并且在整个siRNA序列中没有任何PS-基团。此外，必须强调的是，经lT3稳定的分子siRNA-59和siRNA-62显示出乎意料的高稳定性，其中siRNA-59在有义链的3'-和5’-末端包含lT3-突出端和dT-PS-dT稳定的反义链(as2)，而siRNA-62具有相同的有义链，但额外地被在反义链(as10)的3'-末端的1T3-突出端稳定。在具有相应的lT3b-修饰的siRNA-67中实现类似的稳定化。
表13中的结果表明，用lT-lT-突出端(lT＝lT3、lT3b、lT1和不太明显的lT1b)替代标准dT-PS-dT(siRNA-7)3'-突出端导致siRNA的稳定性显著增加，在lT-突出端中没有其它PS-基团。通过在有义链的5’-末端也使用lT-lT-突出端，仍然可以实现化合物稳定性的额外提高。
如图1所示，除了在反义链的3’-末端具有单个lT-突出端(siRNA-60、-65、-71和-77)的那些化合物外，所有化合物在人HepG2细胞中仍然有效。所有带有lT1、lT1b、lT3-或lT3b-突出端的siRNA(siRNA29至siRNA55)均用IFNα-和细胞毒性测定进行了测试，且未显示出任何对免疫刺激或细胞活力的影响。
实施例3：用根据本公开的修饰的siRNA在体外抑制靶基因
已使用表14至18中包含的序列(用含有核苷酸类似物lT3和lT3b的突出端合成的AHA1-序列。
表14：有义链(5’→3’)
Figure BDA0002760977440002621
Figure BDA0002760977440002631
表15：反义链(5’→3’)
Figure BDA0002760977440002632
表16：具有含有核苷酸类似物的突出端的siRNA
Figure BDA0002760977440002633
表17：有义链(5’→3’)
Figure BDA0002760977440002641
表18：具有含有核苷酸类似物的突出端的siRNA
Figure BDA0002760977440002642
描述
基于AHA-1序列，使用pre-lT3-或pre-lT3b-核苷酸前体附接有义链的3‘-末端突出端。对于这两种核苷酸类似物，最高达8个lT3-或lT3b-核苷酸附接到有义链，在某些实施例中为具有其它胆固醇取代基的化合物(参见寡核苷酸合成一章)。这两个系列的合成有义链列于表14(含有lT3的3’-突出端)和表17(含有lT3b的3’-突出端)中。
将上述有义链与反义链as2和as4组合(参见表15)，得到相应的双链siRNA-29-siRNA-44(lT3-突出端，表16)和siRNA-45-siRNA-55(lT3b-突出端，表18)。
将所得的siRNA以5nM的浓度在人HepG2细胞中转染。48小时后测定AHA1-mRNA浓度。
如图2所示，AHA-1对照siRNA、siRNA-7和siRNA-28显示出相似的90％至95％的mRNA敲低。与这些分子相比，几乎所有具有lT3-或lT3b-修饰的siRNA仍显示令人满意的敲低行为，其抑制率>85％。只有那些具有as4作为反义链、在3’-末端具有额外的胆固醇取代基的siRNA显示出明显的抑制功效损失，而所有具有修饰的有义链的siRNA仍然表现出很高的体外敲低。出人意料的是，lT3-或lT3b-核苷酸的数量对相应的siRNA的抑制功效没有影响。甚至具有8个lT3-或lT3b-核苷酸作为3’-突出端的siRNA(siRNA-34和siRNA-48)也显示出对AHA1-mRNA的稳健下调。同样，在有义链的3’-突出端中额外的胆固醇取代基的附接没有显示出分子功效的显著变化。
所有具有lT3-或lT3b-突出端的siRNA(siRNA29至siRNA55)均用IFNα-和细胞毒性测定进行了测试，且未显示出对免疫刺激或细胞活力的影响。
实施例4：用根据本公开的修饰的siRNA在体内抑制靶基因表达
已使用表19至21中包含的序列
表19：具有lgT-突出端的有义链(5’→3’)
Figure BDA0002760977440002651
Figure BDA0002760977440002661
表20：反义链(5’→3’)
Figure BDA0002760977440002662
表21：具有lT-GalNAc-突出端的siRNA
siRNA-编号 ss-编号 as-编号
siRNA1-1 ss1-1 as1-1
siRNA1-2 ss1-2 as1-1
siRNA1-3 ss1-3 as1-1
siRNA1-4 ss1-4 as1-1
siRNA1-5 ss1-5 as1-1
siRNA1-6 ss1-6 as1-1
siRNA1-7 ss1-7 as1-1
siRNA1-8 ss1-8 as1-1
siRNA1-9 ss1-9 as1-1
siRNA1-10 ss1-10 as1-1
siRNA1-11 ss1-11 as1-1
siRNA1-12 ss1-12 as1-1
体内实施例4.1：
说明GalNAc-siRNA缀合物的体内活性，以及对用于GalNAc附接的不同siRNA构造单元对RNA干扰活性的影响的比较。
方法：
将C57BL/6N小鼠(雌性20-22g；Charles River，德国)用单剂量的2.5mpk的siRNA1-1至siRNA1-12或PBS(模拟对照)以n＝5的组进行皮下处理。所给药的化合物的顺序和化学组成列于表19至表21。如图1.1所示，在给药前和给药后抽取血样。通过可商购的ELISA测定(Alpco Diagnostics，目录号：41-PALMS-E01)从血清中定量siRNA靶TTR。
结果
从图3a/b可以看出，没有双PS-稳定的有义链3’-末端的siRNA(siRNA1-1、siRNA1-3、siRNA1-6和siRNA1-9)仅显示非常弱的敲低，并在大约2周内回到基线。
相反，在所有其余分子中，3个lgT-核苷酸(lgT＝lgT1、lgT2、lgT3、lgT4和lgT5)的附接导致TTR靶mRNA的稳健敲低，从而导致稳健地递送至肝细胞。相当出乎意料的是，lgT-siRNA-缀合物在它们的体内作用时长和接头单元之间显示出有趣的SAR，GalNAc-靶向配体通过该接头单元与lgT支架的吗啉氮原子附接。另外，可推断出lgT支架与有义链的附接位点之间的有趣关系(3’-vs.5’-末端)。
5'-末端附接比3'-末端缀合物有明显的优势。如图3a/b所示，例如lgT1和lgT3的5’-末端附接(siRNA1-5和siRNA1-8)比其3’-末端类似物(分别为siRNA1-7和siRNA1-10)显示出明显更长的作用时长。
另外，发现吗啉和GalNAc之间的较长接头比其较短的类似物表现更弱，例如具有C12-烷基-连接的lgT4-支架的siRNA1-11与lgT3-构造单元中具有C5-烷基接头的类似物siRNA1-8相比，显示出更短的作用时长。当两者都附接在有义链的5’-末端时，使用较短的lgT3-核苷酸类似物有明显的好处。
此外，在吗啉和GalNAc部分之间具有PEG型接头的、含有lgT5的siRNA1-4显示出非常有吸引力的体内功效和作用时长。
体内实施例4.2：
选自体内实施例4.1的化合物的剂量依赖性体内活性和急性毒性评估
方法
动物研究
将C57BL/6N小鼠(雌性20-22g；Charles River，德国)用单剂量的0.5、2.5或20mpk的siRNA或PBS(模拟对照)以n＝6(对于0.5和2.5mpk)或n＝4(对于20mpk)的组进行皮下处理。所给药的化合物的序列和化学组成参见表19至表21。处理后48小时将动物取下，抽取血液进行血液学分析、临床化学以及器官收获并称重。在scil Vet动物血液计数器上进行血细胞计数，并在Roche Cobas系统上进行临床化学分析。
研究后分析
通过可商购的ELISA测定(Alpco Diagnostics，目录号：41-PALMS-E01)从血清中定量siRNA靶TTR。
通过包括DNase消化的总RNA提取(RNAeasy Mini Kit，Qiagen)处理肝脏组织以进行RT-qPCR分析。在Oligo-dT和随机六聚体引发的cDNA合成后，通过在ABI Prism 7900系统上的qPCR对TTR(TaqMan测定ID Mm00443267_m1)和参考mRNA(Actb(TaqMan测定ID4352341E)、Gapdh(TaqMan测定ID 4308313))进行定量。应用ΔΔCt方法计算靶转录物的相对表达水平。
20mpk治疗组的右上肝叶、脾脏和肾脏(+PBS)经福尔马林固定，并在标准H&E染色后对于异常进行病理评估。
结果(参见图4和5)
在给药后48小时，所有测试的活性siRNA均以剂量依赖性的形式降低了蛋白质和mRNA水平。mRNA和蛋白质的降低以并行方式发生。在所测试的活性物质内，siRNA1-4、1-5和1-8之间没有观察到明显的差异，而siRNA1-10与这些前者相比，显示出稍微不那么显著功效，尤其是在0.5和2.5mpk的治疗剂量下。这与来自图4中所示的纵向研究的观察结果相符。
在标准血液学和肝/肾临床化学测定中未观察到任何治疗和剂量依赖性效应。同样，在取下时未观察到血清细胞因子的显著治疗依赖性改变以及对器官或体重的影响。所有偏差均在正常生理范围或正常动物间可变性内。肝脏、脾脏和肾脏的组织病理学无发现。
在原代小鼠肝细胞中化合物siRNA1-1至siRNA1-12的体外敲低结果总结于表22中：
表22：在原代小鼠肝细胞中siRNA1-1至1-12的IC50-数据
siRNA-编号 IC<sub>50</sub>(pM) I<sub>最大</sub>％
siRNA1-1 1160 96.5％
siRNA1-2 595 98.6％
siRNA1-3 468 97.9％
siRNA1-4 106 99.5％
siRNA1-5 74 100.2％
siRNA1-6 180 99.4％
siRNA1-7 31 99.9％
siRNA1-8 99 100.1％
siRNA1-9 194 99.1％
siRNA1-10 84 98.9％
siRNA1-11 1550 98.7％
siRNA1-12 1920 97.2％
所有具有lgT-突出端的siRNA(siRNA1-1至siRNA1-12)均用IFNα-和细胞毒性测定进行了测试，且未显示出对免疫刺激或细胞活力的影响。
实施例5：用根据本公开的修饰的siRNA在体内抑制靶基因表达
体内实施例5.1：
说明GalNAc-siRNA缀合物的体内活性，以及对不同的双链布局和组合对RNA干扰活性的影响的比较。
方法
将C57BL/6N小鼠(雌性20-22g；Charles River，德国)用单剂量的1mpk的GalNAc-siRNA(+2.5mpk对于siRNA1-8，用于与体内实施例1对比)或PBS(模拟对照)以n＝5的组进行皮下处理。所给药的化合物的顺序和化学组成列于表23至表25中。如图6所示，在给药前和给药后抽取血样。通过可商购的ELISA测定(Alpco Diagnostics，目录号：41-PALMS-E01)从血清中定量siRNA靶TTR。
表23:具有lgT-和lT-突出端的的有义链(5’→3’)
Figure BDA0002760977440002691
表24：具有lT-突出端的反义链(5’→3’)
Figure BDA0002760977440002692
Figure BDA0002760977440002701
表25：具有lgT-和lT-突出端的siRNA
siRNA-编号 ss-编号 as-编号 备注
siRNA2-0 ss2-0 as2-0 阴性对照
siRNA1-8 ss1-8 as1-1 阳性对照
siRNA2-2 ss2-2 as1-1
siRNA2-3 ss2-2 as2-2
siRNA2-4 ss2-3 as2-3
siRNA2-5 ss2-4 as1-1
siRNA2-6 ss2-4 as2-4
siRNA2-7 ss2-5 as2-5
siRNA2-8 ss2-6 as2-6
siRNA2-9 ss2-7 as2-7
siRNA2-10 ss2-8 as2-8
siRNA2-11 ss2-9 as2-4
siRNA2-12 ss2-10 as2-9
siRNA2-13 ss2-11 as2-4
结果
与仅具有在有义链的5’-末端的lgT3-突出端而在有义链或反义链的3’-末端没有其它lT突出端(lT＝lT1至lT9)的对照siRNA1-8相比，图6a/b示出，具有在有义链的3’-末端的lT3的额外附接的siRNA2-5显示出与使用在5’-末端或3’-末端没有任何PS基团的有义链的对照siRNA1-8相同的体内性能，其中siRNA1-8在3'-末端仍然有两个PS-基团。
用siRNA2-7可实现额外的进展，其具有在有义链的3’-末端和反义链的3’-末端的1T4-lT4-突出端，在反义链as2-5的lT4-附接位点再次减少两个PS-基团。siRNA2-7再次显示出与在有义链和反义链具有常见PS-稳定化模式的siRNA1-8相同的体内功效和作用时长。
体内实施例5.2：
对于选自体内实施例5.1的化合物，测定了剂量依赖性体内活性和急性毒性评估。
方法
动物研究
将C57BL/6N小鼠(雌性20-22g；Charles River，德国)用单剂量的0.5、2.5或25mpk的siRNA或PBS(模拟对照)以n＝6的组(对于0.5和2.5mpk)或n＝5(对于25mpk)皮下处理。所给药的化合物的序列和化学组成参见表23至表25。处理后48小时将动物取下，抽取血液进行血液学分析、临床化学以及器官收获并称重。在scil Vet动物血液计数器上进行血液学血计数，并在Roche Cobas系统上进行临床化学分析。
研究后分析
通过可商购的ELISA测定(Alpco Diagnostics，目录号：41-PALMS-E01)从血清中定量siRNA靶TTR。
通过包括DNase消化的总RNA提取(RNAeasy Mini Kit，Qiagen)处理肝脏组织以进行RT-qPCR分析。在Oligo-dT和随机六聚体引发的cDNA合成后，通过在ABI Prism 7900系统上的qPCR对TTR(TaqMan测定ID Mm00443267_m1)和参考mRNA(Actb(TaqMan测定ID4352341E)、Gapdh(TaqMan测定ID 4308313))进行定量。应用ΔΔCt方法计算靶转录物的相对表达水平。
25mpk治疗组的右上肝叶、脾脏和肾脏(+PBS)经福尔马林固定，并在标准H&E染色后对于异常进行病理评估。
结果(参见图7和8)
在给药后48小时，所有测试的siRNA均以剂量依赖性的形式降低了蛋白质和mRNA水平。mRNA和蛋白质的降低以并行方式发生。在测试的活性物质内，siRNA1-8和2-5之间没有观察到明显的差异，而siRNA2-7与这些前者相比，尤其是在0.5mpk和2.5mpk的治疗剂量下，显示出趋向于稍微不那么显著的功效。
在标准血液学和肝/肾临床化学测定中未观察到治疗剂量依赖性效应。同样，在取下时未观察到血清细胞因子的显著治疗依赖性改变以及对器官或体重的影响。所有偏差均在正常生理范围或正常动物间可变性内。肝脏和脾脏的组织病理学无发现。
对于化合物siRNA2-2至siRNA2-13在原代小鼠肝细胞中所得的体外敲低结果总结于表26中：
表26：在原代小鼠肝细胞中siRNA2-2至2-13的IC50-数据
siRNA-编号 IC<sub>50</sub>(pM) I<sub>最大</sub>％
siRNA1-8 24 98.8％
siRNA2-2 57 98.8％
siRNA2-3 170 97.3％
siRNA2-4 90 98.0％
siRNA2-5 39 98.7％
siRNA2-6 81 98.2％
siRNA2-7 177 97.4％
siRNA2-8 94 98.5％
siRNA2-9 136 97.3％
siRNA2-10 983 98.3％
siRNA2-11 4010 93.4％
siRNA2-12 220 97.0％
siRNA2-13 4010 99.1％
所有具有lgT-和lT-突出端的siRNA(siRNA1-8、siRNA2-2至siRNA2-13)均用IFNα-和细胞毒性测定进行了测试，且未显示出对免疫刺激或细胞活力的影响。
体外稳定性
如表27所示，通过lT-突出端的附接替代PS-稳定的有义或反义3’-末端，导致体外稳定性增加。
表27:
Figure BDA0002760977440002721
Figure BDA0002760977440002731
在表27中，“X”表示两条链之一的剩余量小于50％。
所有经lT修饰的siRNA均显示出与对照化合物siRNA1-8至少相同的32小时的稳定性。再次，在siRNA编号2-2至2-13中那些末端(其中附接lT-突出端)不包含任何额外的PS稳定化。将有义链的3’-末端修饰从PS-稳定化改为双IT3-突出端(siRNA2-5)，将稳定性从32小时显著提高至56小时。即使在两条链的3’-末端的lT4-突出端的附接也将siRNA2-7增加至48小时。
实施例6：用根据本公开的修饰的siRNA在体内抑制靶基因表达
表28：具有lgT-和lT-突出端的有义链(5’→3’)
Figure BDA0002760977440002732
表29：反义链(5’→3’)
Figure BDA0002760977440002733
Figure BDA0002760977440002741
表30：具有lgT-和lT-突出端的siRNA
siRNA-编号 ss-编号 as-编号 备注
siRNA2-0 ss2-0 as2-0 阴性对照
siRNA1-8 ss1-8 as1-1 阳性对照
siRNA3-1 ss3-1 as1-1 ＝siRNA1-4
siRNA3-2 ss3-2 as1-1
siRNA3-3 ss3-3 as1-1
siRNA3-4 ss3-4 as1-1
siRNA3-5 ss3-5 as1-1
siRNA3-6 ss3-6 as1-1
siRNA3-7 ss3-7 as1-1
siRNA3-8 ss3-8 as1-1
siRNA3-9 ss3-9 as1-1
siRNA3-10 ss3-10 as1-1
siRNA3-11 ss3-11 as1-1
体内实施例6.1：
说明PEG-GalNAc-siRNA缀合物的体内活性，并比较不同PEG-GalNAc构造单元对RNA干扰活性的影响。
方法
将C57BL/6N小鼠(雌性20-22g；Charles River，德国)用单剂量的5mpk的PEG-GalNAc-siRNA或PBS(模拟对照)以n＝6的组进行皮下处理。所给药的化合物的顺序和化学组成列于表28至表30中。如图9a/b所示，在给药前和给药后抽取血样。通过可商购的ELISA测定(Alpco Diagnostics，目录号：41-PALMS-E01)从血清中定量siRNA靶TTR。
结果(参见图9a/b)
再次，与类似物3’-末端对应物(siRNA3-1至siRNA3-5)相比，在5’-末端(siRNA3-6至siRNA3-10)的lgT构造单元(lgT＝lgT5、lgT6、lgT7、lgT8和lgT9)的附接具有明显的好处。与已经显示出TTR-mRNA明显敲低的含有lgT3的siRNA1-8相比，PEG型类似物siRNA3-7和siRNA3-8在第30天后显示出改善的作用时长。这是出乎意料的结果，因为lgT6和lgT7在吗啉-N和GalNAc部分之间包含更长的接头。连接单元的PEG结构似乎对相应siRNA的体内功效具有积极影响。
通过将在有义链的5’-末端(ss1-8)的lgT3-附接与在3’-末端(ss3-11)的额外lT4-lT4突出端结合，可以进一步改善作用时长。在有义链中没有任何残留的PS-基团时，相应的siRNA3-11在作用时长上显示出额外的改善，并且是上述体内研究中最有效的化合物。
这些结果清楚地表明，当吗啉-核苷酸类似物用作肝siRNA靶向的GalNAc取代的核苷酸类似物(lgTs)时，在体内显示出有益的特性。当这些三倍的lgT取代的siRNA被在同一有义链的3’-末端的双lT-突出端修饰时，可以获得额外的益处。所述第二种修饰导致作用时长明显改善(参见siRNA1-8vs.siRNA3-11)。
体内实施例6.2：
选自体内实施例6.1的化合物的剂量依赖性体内活性和急性毒性评估
方法
动物研究
将C57BL/6N小鼠(雌性20-22g；Charles River，德国)用单剂量的0.5、2.5或25mpk的siRNA或PBS(模拟对照)以n＝6(对于0.5和2.5mpk)或n＝5(对于25mpk)的组进行皮下处理。所给药的化合物的序列和化学组成参见表25至表27。处理后48小时将动物取下，抽取血液进行血液学分析、临床化学以及器官收获并称重。在scil Vet动物血液计数器上进行血液学血计数，并在Roche Cobas系统上进行临床化学分析。
研究后分析
通过可商购的ELISA测定(Alpco Diagnostics，目录号：41-PALMS-E01)从血清中定量siRNA靶TTR。
通过包括DNase消化的总RNA提取(RNAeasy Mini Kit，Qiagen)处理肝脏组织以进行RT-qPCR分析。在Oligo-dT和随机六聚体引发的cDNA合成后，通过在ABI Prism 7900系统上的qPCR对TTR(TaqMan测定ID Mm00443267_m1)和参考mRNA(Actb(TaqMan测定ID4352341E)、Gapdh(TaqMan测定ID 4308313))进行定量。应用ΔΔCt方法计算靶转录物的相对表达水平。
25mpk治疗组的右上肝叶、脾脏和肾脏(+PBS)经福尔马林固定，并在标准H&E染色后对于异常进行病理评估。
结果(参见图10和11)
在给药后48小时，所有测试的活性siRNA均以剂量依赖性的形式降低了蛋白质和mRNA水平。mRNA和蛋白质的降低以并行方式发生。在测试的活性物质内。在任何剂量下，蛋白质或mRNA水平均未观察到显著差异。
在原代小鼠肝细胞中，化合物siRNA3-1至siRNA3-11的体外敲低结果总结于表31中。
在标准血液学和肝/肾临床化学测定中未观察到治疗剂量依赖性效应。同样，在取下时未观察到血清细胞因子的显著治疗依赖性改变以及对器官或体重的影响。所有偏差均在正常生理范围或正常动物间可变性内。肝脏和脾脏的组织病理学无发现。
表31：在原代小鼠肝细胞中siRNA3-1至3-11的IC50-数据
siRNA-编号 IC<sub>50</sub>(pM) I<sub>最大</sub>％
siRNA1-8 48 99.4％
siRNA3-1 19 100.1％
siRNA3-2 17 100.0％
siRNA3-3 15 100.3％
siRNA3-4 24 99.9％
siRNA3-5 74 100.8％
siRNA3-6 14 100.4％
siRNA3-7 18 100.2％
siRNA3-8 10 100.2％
siRNA3-9 18 100.3％
siRNA3-10 56 99.8％
siRNA3-11 60 99.9％
所有具有lgT-或lgT-和lT-突出端的siRNA(siRNA1-8、siRNA3-1至siRNA3-11)均用IFNα-和细胞毒性测定进行了测试，且未显示出对免疫刺激或细胞活力的影响。
实施例7：用根据本公开的修饰的siRNA在体内抑制靶基因表达
体内实施例7.1：
表32：具有lgT-和lT-或lA-3’-末端的有义链(5’→3’)
Figure BDA0002760977440002761
Figure BDA0002760977440002771
表33：反义链(5’→3’)
Figure BDA0002760977440002772
表34：具有lgT-和lT-突出端的siRNA
siRNA-编号 ss-编号 as-编号 备注
siRNA2-0 ss2-0 as2-0 LV-2；阴性对照
siRNA4-1 ss4-1 as1-1 siRNA1-8；阳性对照
siRNA4-2 ss4-2 as1-1 siRNA3-11；阳性对照
siRNA4-3 ss4-3 as1-1
siRNA4-4 ss4-4 as1-1
siRNA4-5 ss4-5 as1-1
siRNA4-6 ss4-6 as1-1
siRNA4-7 ss4-7 as1-1
siRNA4-8 ss4-8 as1-1
siRNA4-9 ss4-9 as1-1
siRNA4-10 ss4-4 as2-5
siRNA4-11 ss4-1 as2-5
方法
将C57BL/6N小鼠(雌性20-22g；Charles River，德国)用单剂量的1mpk的siRNA或PBS(模拟对照)以n＝6的组进行皮下处理。所给药的化合物的顺序和化学组成列于表32至表34中。如图12a/b所示，在给药前和给药后抽取血样。通过可商购的ELISA测定(AlpcoDiagnostics，目录号：41-PALMS-E01)从血清中定量siRNA靶TTR。
表34中列出的siRNA缀合物的体内活性及其RNAi活性的比较
结果(参见图12a/12b)
比较两个阳性对照siRNA4-1和siRNA4-2，证实与初始的硫代磷酸酯稳定化相比，在有义链的3’-末端的lT4-lT4-突出端具有明显的优势。
通过在吗啉环与GalNAc-靶向部分之间使用PEG型接头，将siRNA4-1中的3个lgT3-构造单元交换为lgT6-或lgT7-类似物，仍可改善作用时长(参见siRNA4-3和siRNA4-4)。
出乎意料的是，siRNA4-4和siRNA4-5之间的比较表明，当有义链的lT4-lT4-3’-末端-稳定化在这些位置上具有额外的硫代磷酸酯基团时(参见ss4-5)，作用时长没有额外增加。
体内实施例7.2：
选自体内实施例7.1的化合物的剂量依赖性体内活性和急性毒性评估
方法
动物研究
将C57BL/6N小鼠(雌性20-22g；Charles River，德国)用单剂量的0.5、2.5或25mpk的siRNA或PBS(模拟对照)以n＝6(对于0.5和2.5mpk)或n＝5(对于25mpk)的组进行皮下处理。所给药的化合物的序列和化学组成参见表32至表34。处理后48小时将动物取下，抽取血液进行血液学分析、临床化学以及器官收获并称重。在scil Vet动物血液计数器上进行血液学血计数，并在Roche Cobas系统上进行临床化学分析。
研究后分析
通过可商购的ELISA测定(Alpco Diagnostics，目录号：41-PALMS-E01)从血清中定量siRNA靶TTR。
通过包括DNase消化的总RNA提取(RNAeasy Mini Kit，Qiagen)处理肝脏组织以进行RT-qPCR分析。在Oligo-dT和随机六聚体引发的cDNA合成后，通过在ABI Prism 7900系统上的qPCR对TTR(TaqMan测定ID Mm00443267_m1)和参考mRNA(Actb(TaqMan测定ID4352341E)、Gapdh(TaqMan测定ID 4308313))进行定量。应用ΔΔCt方法计算靶转录物的相对表达水平。
25mpk治疗组的右上肝叶、脾脏和肾脏(+PBS)经福尔马林固定，并在标准H&E染色后对于异常进行病理评估。
结果(参见图13和14)：
在给药后48小时，所有测试的活性siRNA均以剂量依赖性的形式降低了蛋白质和mRNA水平。mRNA和蛋白质的降低以并行方式发生。在测试的活性物质内，在任何剂量下，蛋白质或mRNA水平均未观察到显著差异。
在标准血液学和肝/肾临床化学测定中未观察到治疗剂量依赖性效应。同样，在取下时未观察到血清细胞因子的显著治疗依赖性改变以及对器官或体重的影响。所有偏差均在正常生理范围或正常动物间可变性内。肝脏和脾脏的组织病理学无发现。
在原代小鼠肝细胞中，化合物siRNA4-1至siRNA4-11的体外敲低结果总结于表35：
表35：在原代小鼠肝细胞中siRNA4-1至4-11的IC50-数据
Figure BDA0002760977440002791
与显示IC50值分别为160和558pM的阳性对照siRNA4-1(＝siRNA1-8)和siRNA4-2(＝siRNA3-11)相比，新的类似物siRNA4-3至siRNA4-11示出在相同范围内的体外功效，为111pM(siRNA4-6)至545pM(siRNA4-5)。所有带有lgT-或不带有lT-或lA突出端的siRNA(siRNA4-1至siRNA4-11)均用IFNα-和细胞毒性测定进行了测试，且未显示出对免疫刺激或细胞活力的影响。
根据收集的所有数据(体内和体外)，选择核苷酸类似物lgT7和lT4进行相应siRNA的肝靶向和3’-末端稳定化。
实施例8：本公开中描述的修饰的寡核苷酸的分析数据
8.1.单链寡核苷酸的分析结果
8.1.1.-有义链
表C
Figure BDA0002760977440002801
Figure BDA0002760977440002811
表D
Figure BDA0002760977440002812
Figure BDA0002760977440002821
Figure BDA0002760977440002831
8.1.2.反义链
Figure BDA0002760977440002832
Figure BDA0002760977440002841
8.2.双链寡核苷酸的分析结果
Figure BDA0002760977440002842
Figure BDA0002760977440002851
Figure BDA0002760977440002861
Figure BDA0002760977440002871
序列表
<110> 赛诺菲
<120> 核苷酸前体、核苷酸类似物以及含其的寡聚化合物
<130> PR82067
<150> EP18306497
<151> 2018-11-15
<150> EP18305239
<151> 2018-03-07
<160> 118
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ss1
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="20位的核苷酸和21位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="20位的核苷酸和21位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<400> 1
ggaugaagug gagauuagut t 21
<210> 2
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ss2
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> /注释="19位的U为lU3b核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="20位的核苷酸和21位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="20位的核苷酸和21位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<400> 2
ggaugaagug gagauuagut t 21
<210> 3
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ss3
<220>
<221> 变体
<222> 16
<223> /注释="16和19位的U为lU3b核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> /注释="16和19位的U为lU3b核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="20位的核苷酸和21位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="20位的核苷酸和21位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<400> 3
ggaugaagug gagauuagut t 21
<210> 4
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ss4
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> /注释="15、16和19位的U为lU3b核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 16
<223> /注释="15、16和19位的U为lU3b核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> /注释="15、16和19位的U为lU3b核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="20位的核苷酸和21位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="20位的核苷酸和21位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<400> 4
ggaugaagug gagauuagut t 21
<210> 5
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ss5
<220>
<221> 变体
<222> 9
<223> /注释="9、15、16和19位的U为lU3b核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> /注释="9、15、16和19位的U为lU3b核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 16
<223> /注释="9、15、16和19位的U为lU3b核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> /注释="9、15、16和19位的U为lU3b核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="20位的核苷酸和21位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="20位的核苷酸和21位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<400> 5
ggaugaagug gagauuagut t 21
<210> 6
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ss6
<220>
<221> 变体
<222> 4
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U为lU3b核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 9
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U为lU3b核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U为lU3b核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 16
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U为lU3b核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U为lU3b核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="20位的核苷酸和21位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="20位的核苷酸和21位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<400> 6
ggaugaagug gagauuagut t 21
<210> 7
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ss7
<220>
<221> 变体
<222> 4
<223> /注释="4、9、14、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 9
<223> /注释="4、9、14、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> /注释="4、9、14、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 16
<223> /注释="4、9、14、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> /注释="4、9、14、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="20位的核苷酸和21位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="20位的核苷酸和21位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<400> 7
ggaugaagug gagauuagut t 21
<210> 8
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ss8
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> /注释="19位的U为lU3核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="20位的核苷酸和21位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="20位的核苷酸和21位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<400> 8
ggaugaagug gagauuagut t 21
<210> 9
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ss9
<220>
<221> 变体
<222> 16
<223> /注释="16和19位的U为IU3核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> /注释="16和19位的U为IU3核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="20位的核苷酸和21位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="20位的核苷酸和21位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<400> 9
ggaugaagug gagauuagut t 21
<210> 10
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ss10
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> /注释="15、16和19位的U为IU3核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 16
<223> /注释="15、16和19位的U为IU3核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> /注释="15、16和19位的U为IU3核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="20位的核苷酸和21位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="20位的核苷酸和21位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<400> 10
ggaugaagug gagauuagut t 21
<210> 11
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ss11
<220>
<221> 变体
<222> 9
<223> /注释="9、15、16和19位的U为IU3核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> /注释="9、15、16和19位的U为IU3核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 16
<223> /注释="9、15、16和19位的U为IU3核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> /注释="9、15、16和19位的U为IU3核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="20位的核苷酸和21位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="20位的核苷酸和21位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<400> 11
ggaugaagug gagauuagut t 21
<210> 12
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ss12
<220>
<221> 变体
<222> 4
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U为IU3核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 9
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U为IU3核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U为IU3核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 16
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U为IU3核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U为IU3核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="20位的核苷酸和21位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="20位的核苷酸和21位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<400> 12
ggaugaagug gagauuagut t 21
<210> 13
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> as1
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="20位的核苷酸和21位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="20位的核苷酸和21位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<400> 13
acuaaucucc acuucaucct t 21
<210> 14
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> as2
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> /注释="3位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 10
<223> /注释="10和15位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> /注释="10和15位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="20位的核苷酸和21位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="20位的核苷酸和21位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<400> 14
acuaaucucc acuucaucct t 21
<210> 15
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ss13
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> /注释="1、5、7、14和17位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> /注释="2、3、8、12、15和16位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> /注释="2、3、8、12、15和16位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 5
<223> /注释="1、5、7、14和17位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 7
<223> /注释="1、5、7、14和17位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 8
<223> /注释="2、3、8、12、15和16位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 12
<223> /注释="2、3、8、12、15和16位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 14
<223> /注释="1、5、7、14和17位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> /注释="2、3、8、12、15和16位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 16
<223> /注释="2、3、8、12、15和16位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 17
<223> /注释="1、5、7、14和17位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> /注释="19位的核苷酸和20位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="19位的核苷酸和20位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="20位的核苷酸和21位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="20位的核苷酸和21位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<400> 15
cuuacgcuga guacuucgat t 21
<210> 16
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ss14
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> /注释="1、5、7、14和17位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> /注释="2、3、8、12和15位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> /注释="2、3、8、12和15位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 5
<223> /注释="1、5、7、14和17位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 7
<223> /注释="1、5、7、14和17位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 8
<223> /注释="2、3、8、12和15位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 12
<223> /注释="2、3、8、12和15位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 14
<223> /注释="1、5、7、14和17位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> /注释="2、3、8、12和15位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 16
<223> /注释="16位的U为lU1b核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 17
<223> /注释="1、5、7、14和17位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> /注释="19位的核苷酸和20位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="19位的核苷酸和20位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="20位的核苷酸和21位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="20位的核苷酸和21位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<400> 16
cuuacgcuga guacuucgat t 21
<210> 17
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ss15
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> /注释="1、5、7、14和17位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> /注释="2、3、8和12位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> /注释="2、3、8和12位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 5
<223> /注释="1、5、7、14和17位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 7
<223> /注释="1、5、7、14和17位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 8
<223> /注释="2、3、8和12位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 12
<223> /注释="2、3、8和12位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 14
<223> /注释="1、5、7、14和17位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> /注释="15和16位的U为lU1b核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 16
<223> /注释="15和16位的U为lU1b核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 17
<223> /注释="1、5、7、14和17位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> /注释="19位的核苷酸和20位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="19位的核苷酸和20位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="20位的核苷酸和21位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="20位的核苷酸和21位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<400> 17
cuuacgcuga guacuucgat t 21
<210> 18
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ss16
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> /注释="1、5、7、14和17位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> /注释="2、3和8位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> /注释="2、3和8位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 5
<223> /注释="1、5、7、14和17位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 7
<223> /注释="1、5、7、14和17位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 8
<223> /注释="2、3和8位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 12
<223> /注释="12和16位的U为lU1b核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 14
<223> /注释="1、5、7、14和17位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> /注释="12和16位的U为lU1b核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 16
<223> /注释="12和16位的U为lU1b核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 17
<223> /注释="1、5、7、14和17位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> /注释="19位的核苷酸和20位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="19位的核苷酸和20位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="20位的核苷酸和21位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="20位的核苷酸和21位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<400> 18
cuuacgcuga guacuucgat t 21
<210> 19
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ss17
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> /注释="1、5、7、14和17位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> /注释="2和3位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> /注释="2和3位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 5
<223> /注释="1、5、7、14和17位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 7
<223> /注释="1、5、7、14和17位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 8
<223> /注释="8、12、15和16位的U为lU1b核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 12
<223> /注释="8、12、15和16位的U为lU1b核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 14
<223> /注释="1、5、7、14和17位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> /注释="8、12、15和16位的U为lU1b核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 16
<223> /注释="8、12、15和16位的U为lU1b核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 17
<223> /注释="1、5、7、14和17位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> /注释="19位的核苷酸和20位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="19位的核苷酸和20位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="20位的核苷酸和21位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="20位的核苷酸和21位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<400> 19
cuuacgcuga guacuucgat t 21
<210> 20
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ss18
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> /注释="1、5、7、14和17位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> /注释="2位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> /注释="3、8、12、15和16位的U为lU1b核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 5
<223> /注释="1、5、7、14和17位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 7
<223> /注释="1、5、7、14和17位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 8
<223> /注释="3、8、12、15和16位的U为lU1b核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 12
<223> /注释="3、8、12、15和16位的U为lU1b核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 14
<223> /注释="1、5、7、14和17位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> /注释="3、8、12、15和16位的U为lU1b核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 16
<223> /注释="3、8、12、15和16位的U为lU1b核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 17
<223> /注释="1、5、7、14和17位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> /注释="19位的核苷酸和20位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="19位的核苷酸和20位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="20位的核苷酸和21位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="20位的核苷酸和21位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<400> 20
cuuacgcuga guacuucgat t 21
<210> 21
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ss19
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> /注释="1、5、7、14和17位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> /注释="2、3、8、12、15和16位的U为lU1b核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> /注释="2、3、8、12、15和16位的U为lU1b核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 5
<223> /注释="1、5、7、14和17位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 7
<223> /注释="1、5、7、14和17位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 8
<223> /注释="2、3、8、12、15和16位的U为lU1b核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 12
<223> /注释="2、3、8、12、15和16位的U为lU1b核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 14
<223> /注释="1、5、7、14和17位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> /注释="2、3、8、12、15和16位的U为lU1b核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 16
<223> /注释="2、3、8、12、15和16位的U为lU1b核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 17
<223> /注释="1、5、7、14和17位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> /注释="19位的核苷酸和20位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="19位的核苷酸和20位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="20位的核苷酸和21位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="20位的核苷酸和21位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<400> 21
cuuacgcuga guacuucgat t 21
<210> 22
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ss20
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> /注释="1、5、7、14和17位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> /注释="2、3、8、12和15位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> /注释="2、3、8、12和15位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 5
<223> /注释="1、5、7、14和17位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 7
<223> /注释="1、5、7、14和17位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 8
<223> /注释="2、3、8、12和15位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 12
<223> /注释="2、3、8、12和15位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 14
<223> /注释="1、5、7、14和17位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> /注释="2、3、8、12和15位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 16
<223> /注释="16位的U为lU1核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 17
<223> /注释="1、5、7、14和17位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> /注释="19位的核苷酸和20位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="19位的核苷酸和20位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="20位的核苷酸和21位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="20位的核苷酸和21位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<400> 22
cuuacgcuga guacuucgat t 21
<210> 23
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ss21
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> /注释="1、5、7、14和17位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> /注释="2、3、8和12位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> /注释="2、3、8和12位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 5
<223> /注释="1、5、7、14和17位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 7
<223> /注释="1、5、7、14和17位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 8
<223> /注释="2、3、8和12位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 12
<223> /注释="2、3、8和12位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 14
<223> /注释="1、5、7、14和17位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> /注释="15和16位的U为lU1核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 16
<223> /注释="15和16位的U为lU1核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 17
<223> /注释="1、5、7、14和17位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> /注释="19位的核苷酸和20位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="19位的核苷酸和20位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="20位的核苷酸和21位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="20位的核苷酸和21位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<400> 23
cuuacgcuga guacuucgat t 21
<210> 24
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ss22
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> /注释="1、5、7、14和17位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> /注释="2、3和8位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> /注释="2、3和8位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 5
<223> /注释="1、5、7、14和17位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 7
<223> /注释="1、5、7、14和17位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 8
<223> /注释="2、3和8位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 12
<223> /注释="12、15和16位的U为lU1核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 14
<223> /注释="1、5、7、14和17位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> /注释="12、15和16位的U为lU1核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 16
<223> /注释="12、15和16位的U为lU1核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 17
<223> /注释="1、5、7、14和17位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> /注释="19位的核苷酸和20位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="19位的核苷酸和20位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="20位的核苷酸和21位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="20位的核苷酸和21位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<400> 24
cuuacgcuga guacuucgat t 21
<210> 25
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ss23
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> /注释="1、5、7、14和17位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> /注释="2和3位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> /注释="2和3位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 5
<223> /注释="1、5、7、14和17位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 7
<223> /注释="1、5、7、14和17位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 8
<223> /注释="8、12、15和16位的U为lU1核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 12
<223> /注释="8、12、15和16位的U为lU1核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 14
<223> /注释="1、5、7、14和17位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> /注释="8、12、15和16位的U为lU1核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 16
<223> /注释="8、12、15和16位的U为lU1核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 17
<223> /注释="1、5、7、14和17位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> /注释="19位的核苷酸和20位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="19位的核苷酸和20位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="20位的核苷酸和21位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="20位的核苷酸和21位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<400> 25
cuuacgcuga guacuucgat t 21
<210> 26
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ss24
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> /注释="1、5、7、14和17位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> /注释="2位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> /注释="3、8、12、15和16位的U为lU1核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 5
<223> /注释="1、5、7、14和17位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 7
<223> /注释="1、5、7、14和17位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 8
<223> /注释="3、8、12、15和16位的U为lU1核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 12
<223> /注释="3、8、12、15和16位的U为lU1核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 14
<223> /注释="1、5、7、14和17位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> /注释="3、8、12、15和16位的U为lU1核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 16
<223> /注释="3、8、12、15和16位的U为lU1核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 17
<223> /注释="1、5、7、14和17位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> /注释="19位的核苷酸和20位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="19位的核苷酸和20位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="20位的核苷酸和21位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="20位的核苷酸和21位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<400> 26
cuuacgcuga guacuucgat t 21
<210> 27
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ss25
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> /注释="1、5、7、14和17位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> /注释="2、3、8、12、15和16位的U为iPr-吗啉-U
(2S,6R) (lU3)"
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> /注释="2、3、8、12、15和16位的U为iPr-吗啉-U
(2S,6R) (lU3)"
<220>
<221> 变体
<222> 5
<223> /注释="1、5、7、14和17位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 7
<223> /注释="1、5、7、14和17位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 8
<223> /注释="2、3、8、12、15和16位的U为iPr-吗啉-U
(2S,6R) (lU3)"
<220>
<221> 变体
<222> 12
<223> /注释="2、3、8、12、15和16位的U为iPr-吗啉-U
(2S,6R) (lU3)"
<220>
<221> 变体
<222> 14
<223> /注释="1、5、7、14和17位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> /注释="2、3、8、12、15和16位的U为iPr-吗啉-U
(2S,6R) (lU3)"
<220>
<221> 变体
<222> 16
<223> /注释="2、3、8、12、15和16位的U为iPr-吗啉-U
(2S,6R) (lU3)"
<220>
<221> 变体
<222> 17
<223> /注释="1、5、7、14和17位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> /注释="19位的核苷酸和20位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="19位的核苷酸和20位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="20位的核苷酸和21位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="20位的核苷酸和21位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<400> 27
cuuacgcuga guacuucgat t 21
<210> 28
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> as3
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="20位的核苷酸和21位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="20位的核苷酸和21位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<400> 28
ucgaaguacu cagcguaagt t 21
<210> 29
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ss26
<220>
<221> 变体
<222> 4
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 9
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 16
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<400> 29
ggaugaagug gagauuagut t 21
<210> 30
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> as5
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> /注释="3位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 10
<223> /注释="10和15位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> /注释="10和15位的C表示mC核苷酸类似物"
<400> 30
acuaaucucc acuucaucct t 21
<210> 31
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ss44
<220>
<221> 变体
<222> 4
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 9
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 16
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="20位的T为lT3核苷酸类似物"
<400> 31
ggaugaagug gagauuagut 20
<210> 32
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ss27
<220>
<221> 变体
<222> 4
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 9
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 16
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="20和21位的T为lT3核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="20和21位的T为lT3核苷酸类似物"
<400> 32
ggaugaagug gagauuagut t 21
<210> 33
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ss45
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> /注释="1、2、22和23位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> /注释="1、2、22和23位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 6
<223> /注释="6、11、17、18和21位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 11
<223> /注释="6、11、17、18和21位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 17
<223> /注释="6、11、17、18和21位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 18
<223> /注释="6、11、17、18和21位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="6、11、17、18和21位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 22
<223> /注释="1、2、22和23位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 23
<223> /注释="1、2、22和23位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<400> 33
ttggaugaag uggagauuag utt 23
<210> 34
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ss46
<220>
<221> 变体
<222> 4
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 9
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 16
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="20位的T为lT3b核苷酸类似物"
<400> 34
ggaugaagug gagauuagut 20
<210> 35
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 37
<220>
<221> 变体
<222> 4
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 9
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 16
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="20和21位的T为lT3b核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="20和21位的T为lT3b核苷酸类似物"
<400> 35
ggaugaagug gagauuagut t 21
<210> 36
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ss47
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> /注释="1、2、22和23位的T为lT3b核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> /注释="1、2、22和23位的T为lT3b核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 6
<223> /注释="6、11、17、18和21位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 11
<223> /注释="6、11、17、18和21位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 17
<223> /注释="6、11、17、18和21位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 18
<223> /注释="6、11、17、18和21位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="6、11、17、18和21位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 22
<223> /注释="1、2、22和23位的T为lT3b核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 23
<223> /注释="1、2、22和23位的T为lT3b核苷酸类似物"
<400> 36
ttggaugaag uggagauuag utt 23
<210> 37
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ss48
<220>
<221> 变体
<222> 4
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 9
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 16
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="20位的T为lT1核苷酸类似物"
<400> 37
ggaugaagug gagauuagut 20
<210> 38
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ss49
<220>
<221> 变体
<222> 4
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 9
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 16
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="20、21位的T为lT1核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="20、21位的T为lT1核苷酸类似物"
<400> 38
ggaugaagug gagauuagut t 21
<210> 39
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ss50
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> /注释="1、2、22和23位的T为lT1核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> /注释="1、2、22和23位的T为lT1核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 6
<223> /注释="6、11、17、18和21位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 11
<223> /注释="6、11、17、18和21位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 17
<223> /注释="6、11、17、18和21位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 18
<223> /注释="6、11、17、18和21位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="6、11、17、18和21位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 22
<223> /注释="1、2、22和23位的T为lT1核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 23
<223> /注释="1、2、22和23位的T为lT1核苷酸类似物"
<400> 39
ttggaugaag uggagauuag utt 23
<210> 40
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ss51
<220>
<221> 变体
<222> 4
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 9
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 16
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="20位的T为lT1b核苷酸类似物"
<400> 40
ggaugaagug gagauuagut 20
<210> 41
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ss52
<220>
<221> 变体
<222> 4
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 9
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 16
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="20和21位的T为lT1b核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="20和21位的T为lT1b核苷酸类似物"
<400> 41
ggaugaagug gagauuagut t 21
<210> 42
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ss53
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> /注释="1、2、22和23位的T为lT1b核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> /注释="1、2、22和23位的T为lT1b核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 6
<223> /注释="6、11、17、18和21位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 11
<223> /注释="6、11、17、18和21位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 17
<223> /注释="6、11、17、18和21位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 18
<223> /注释="6、11、17、18和21位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="6、11、17、18和21位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 22
<223> /注释="1、2、22和23位的T为lT1b核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 23
<223> /注释="1、2、22和23位的T为lT1b核苷酸类似物"
<400> 42
ttggaugaag uggagauuag utt 23
<210> 43
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> as6
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> /注释="3位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 10
<223> /注释="10和15位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> /注释="10和15位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="20位的T为lT3核苷酸类似物"
<400> 43
acuaaucucc acuucaucct 20
<210> 44
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> as7
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> /注释="3位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 10
<223> /注释="10和15位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> /注释="10和15位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="20位的T为lT3b核苷酸类似物"
<400> 44
acuaaucucc acuucaucct 20
<210> 45
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> as8
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> /注释="3位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 10
<223> /注释="10和15位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> /注释="10和15位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="20位的T为lT1核苷酸类似物"
<400> 45
acuaaucucc acuucaucct 20
<210> 46
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> as9
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> /注释="3位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 10
<223> /注释="10和15位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> /注释="10和15位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="20位的T为lT1b核苷酸类似物"
<400> 46
acuaaucucc acuucaucct 20
<210> 47
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> as10
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> /注释="3位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 10
<223> /注释="10和15位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> /注释="10和15位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="20和21位的T为lT3核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="20和21位的T为lT3核苷酸类似物"
<400> 47
acuaaucucc acuucaucct t 21
<210> 48
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> as11
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> /注释="3位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 10
<223> /注释="10和15位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> /注释="10和15位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="20和21位的T为lT3b核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="20和21位的T为lT3b核苷酸类似物"
<400> 48
acuaaucucc acuucaucct t 21
<210> 49
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> as12
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> /注释="3位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 10
<223> /注释="10和15位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> /注释="10和15位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="20和21位的T为lT1核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="20和21位的T为lT1核苷酸类似物"
<400> 49
acuaaucucc acuucaucct t 21
<210> 50
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> as13
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> /注释="3位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 10
<223> /注释="10和15位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> /注释="10和15位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="20和21位的T为lT1b核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="20和21位的T为lT1b核苷酸类似物"
<400> 50
acuaaucucc acuucaucct t 21
<210> 51
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ss28
<220>
<221> 变体
<222> 4
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 9
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 16
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="20、21、22和23位的T为lT3核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="20、21、22和23位的T为lT3核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 22
<223> /注释="20、21、22和23位的T为lT3核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 23
<223> /注释="20、21、22和23位的T为lT3核苷酸类似物"
<400> 51
ggaugaagug gagauuagut ttt 23
<210> 52
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ss29
<220>
<221> 变体
<222> 4
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 9
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 16
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="20、21、22、23和24位的T为lT3核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="20、21、22、23和24位的T为lT3核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 22
<223> /注释="20、21、22、23和24位的T为lT3核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 23
<223> /注释="20、21、22、23和24位的T为lT3核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 24
<223> /注释="20、21、22、23和24位的T为lT3核苷酸类似物"
<400> 52
ggaugaagug gagauuagut tttt 24
<210> 53
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ss30
<220>
<221> 变体
<222> 4
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 9
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 16
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="20、21、22、23、24和25位的T为lT3核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="20、21、22、23、24和25位的T为lT3核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 22
<223> /注释="20、21、22、23、24和25位的T为lT3核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 23
<223> /注释="20、21、22、23、24和25位的T为lT3核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 24
<223> /注释="20、21、22、23、24和25位的T为lT3核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 25
<223> /注释="20、21、22、23、24和25位的T为lT3核苷酸类似物"
<400> 53
ggaugaagug gagauuagut ttttt 25
<210> 54
<211> 26
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ss31
<220>
<221> 变体
<222> 4
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 9
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 16
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="20、21、22、23、24、25和26位的T为lT3核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="20、21、22、23、24、25和26位的T为lT3核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 22
<223> /注释="20、21、22、23、24、25和26位的T为lT3核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 23
<223> /注释="20、21、22、23、24、25和26位的T为lT3核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 24
<223> /注释="20、21、22、23、24、25和26位的T为lT3核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 25
<223> /注释="20、21、22、23、24、25和26位的T为lT3核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 26
<223> /注释="20、21、22、23、24、25和26位的T为lT3核苷酸类似物"
<400> 54
ggaugaagug gagauuagut tttttt 26
<210> 55
<211> 27
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ss32
<220>
<221> 变体
<222> 4
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 9
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 16
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="20、21、22、23、24、25、26和27位的T为lT3
核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="20、21、22、23、24、25、26和27位的T为lT3
核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 22
<223> /注释="20、21、22、23、24、25、26和27位的T为lT3
核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 23
<223> /注释="20、21、22、23、24、25、26和27位的T为lT3
核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 24
<223> /注释="20、21、22、23、24、25、26和27位的T为lT3
核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 25
<223> /注释="20、21、22、23、24、25、26和27位的T为lT3
核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 26
<223> /注释="20、21、22、23、24、25、26和27位的T为lT3
核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 27
<223> /注释="20、21、22、23、24、25、26和27位的T为lT3
核苷酸类似物"
<400> 55
ggaugaagug gagauuagut ttttttt 27
<210> 56
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ss33
<220>
<221> 变体
<222> 4
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 9
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 16
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="20位的T为lT3核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="21位的T为lT3核苷酸类似物，其具有
额外的胆固醇取代基"
<400> 56
ggaugaagug gagauuagut t 21
<210> 57
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ss34
<220>
<221> 变体
<222> 4
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 9
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 16
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="20、21和22位的T为lT3核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="20、21和22位的T为lT3核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 22
<223> /注释="20、21和22位的T为lT3核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 23
<223> /注释="23位的T为lT3核苷酸类似物，其具有
额外的胆固醇取代基"
<400> 57
ggaugaagug gagauuagut ttt 23
<210> 58
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ss35
<220>
<221> 变体
<222> 4
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 9
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 16
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="20、21、22、23和24位的T为lT3核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="20、21、22、23和24位的T为lT3核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 22
<223> /注释="20、21、22、23和24位的T为lT3核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 23
<223> /注释="20、21、22、23和24位的T为lT3核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 24
<223> /注释="20、21、22、23和24位的T为lT3核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 25
<223> /注释="25位的T为lT3核苷酸类似物，其具有
额外的胆固醇取代基"
<400> 58
ggaugaagug gagauuagut ttttt 25
<210> 59
<211> 27
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ss36
<220>
<221> 变体
<222> 4
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 9
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 16
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="20、21、22、23、24、25和26位的T为lT3核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="20、21、22、23、24、25和26位的T为lT3核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 22
<223> /注释="20、21、22、23、24、25和26位的T为lT3核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 23
<223> /注释="20、21、22、23、24、25和26位的T为lT3核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 24
<223> /注释="20、21、22、23、24、25和26位的T为lT3核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 25
<223> /注释="20、21、22、23、24、25和26位的T为lT3核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 26
<223> /注释="20、21、22、23、24、25和26位的T为lT3核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 27
<223> /注释="27位的T为lT3核苷酸类似物，其具有
额外的胆固醇取代基"
<400> 59
ggaugaagug gagauuagut ttttttt 27
<210> 60
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> as4
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> /注释="3位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 10
<223> /注释="10和15位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> /注释="10和15位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="20位的核苷酸和21位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="20位的核苷酸和21位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="21位的dT具有额外的胆固醇取代基"
<400> 60
acuaaucucc acuucaucct t 21
<210> 61
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ss38
<220>
<221> 变体
<222> 4
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 9
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 16
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="20、21、22和23位的T为lT3b核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="20、21、22和23位的T为lT3b核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 22
<223> /注释="20、21、22和23位的T为lT3b核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 23
<223> /注释="20、21、22和23位的T为lT3b核苷酸类似物"
<400> 61
ggaugaagug gagauuagut ttt 23
<210> 62
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ss39
<220>
<221> 变体
<222> 4
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 9
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 16
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="20、21、22、23、24和25位的T为lT3b核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="20、21、22、23、24和25位的T为lT3b核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 22
<223> /注释="20、21、22、23、24和25位的T为lT3b核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 23
<223> /注释="20、21、22、23、24和25位的T为lT3b核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 24
<223> /注释="20、21、22、23、24和25位的T为lT3b核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 25
<223> /注释="20、21、22、23、24和25位的T为lT3b核苷酸类似物"
<400> 62
ggaugaagug gagauuagut ttttt 25
<210> 63
<211> 27
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ss40
<220>
<221> 变体
<222> 4
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 9
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 16
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="20、21、22、23、24、25、26和27位的T为lT3b
核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="20、21、22、23、24、25、26和27位的T为lT3b
核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 22
<223> /注释="20、21、22、23、24、25、26和27位的T为lT3b
核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 23
<223> /注释="20、21、22、23、24、25、26和27位的T为lT3b
核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 24
<223> /注释="20、21、22、23、24、25、26和27位的T为lT3b
核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 25
<223> /注释="20、21、22、23、24、25、26和27位的T为lT3b
核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 26
<223> /注释="20、21、22、23、24、25、26和27位的T为lT3b
核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 27
<223> /注释="20、21、22、23、24、25、26和27位的T为lT3b
核苷酸类似物"
<400> 63
ggaugaagug gagauuagut ttttttt 27
<210> 64
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ss41
<220>
<221> 变体
<222> 4
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 9
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 16
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="20位的T为lT3b核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="21位的T为lT3b核苷酸类似物，其具有
额外的胆固醇取代基"
<400> 64
ggaugaagug gagauuagut t 21
<210> 65
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ss42
<220>
<221> 变体
<222> 4
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 9
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 16
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="20、21和22位的T为lT3b核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="20、21和22位的T为lT3b核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 22
<223> /注释="20、21和22位的T为lT3b核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 23
<223> /注释="23位的T为lT3b核苷酸类似物，其具有
额外的胆固醇取代基"
<400> 65
ggaugaagug gagauuagut ttt 23
<210> 66
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ss43
<220>
<221> 变体
<222> 4
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 9
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 16
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> /注释="4、9、15、16和19位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="20、21、22、23和24位的T为lT3b核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="20、21、22、23和24位的T为lT3b核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 22
<223> /注释="20、21、22、23和24位的T为lT3b核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 23
<223> /注释="20、21、22、23和24位的T为lT3b核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 24
<223> /注释="20、21、22、23和24位的T为lT3b核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 25
<223> /注释="25位的T为lT3b核苷酸类似物，其具有
额外的胆固醇取代基"
<400> 66
ggaugaagug gagauuagut ttttt 25
<210> 67
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ss1-1
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> /注释="1、2和3位的T为lgT2核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> /注释="1、2和3位的T为lgT2核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> /注释="1、2和3位的T为lgT2核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 4
<223> /注释="4和24位的A为fA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 5
<223> /注释="5、7、21和23位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 6
<223> /注释="6和13位的C为fC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 7
<223> /注释="5、7、21和23位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 8
<223> /注释="8、10和16位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 9
<223> /注释="9、11和15位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 10
<223> /注释="8、10和16位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 11
<223> /注释="9、11和15位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 12
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 13
<223> /注释="6和13位的C为fC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 14
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> /注释="9、11和15位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 16
<223> /注释="8、10和16位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 17
<223> /注释="17和19位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 18
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> /注释="17和19位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="5、7、21和23位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 22
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 23
<223> /注释="5、7、21和23位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 24
<223> /注释="4和24位的A为fA核苷酸类似物"
<400> 67
tttaacagug uucuugcucu auaa 24
<210> 68
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ss1-2
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> /注释="1位的核苷酸和2位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> /注释="1和21位的A为fA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> /注释="1位的核苷酸和2位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> /注释="2位的核苷酸和3位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> /注释="2、4、18和20位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> /注释="2位的核苷酸和3位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> /注释="3和10位的C为fC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 4
<223> /注释="2、4、18和20位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 5
<223> /注释="5、7和13位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 6
<223> /注释="6、8和12位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 7
<223> /注释="5、7和13位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 8
<223> /注释="6、8和12位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 9
<223> /注释="9、11、15、17和19位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 10
<223> /注释="3和10位的C为fC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 11
<223> /注释="9、11、15、17和19位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 12
<223> /注释="6、8和12位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 13
<223> /注释="5、7和13位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 14
<223> /注释="14和16位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> /注释="9、11、15、17和19位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 16
<223> /注释="14和16位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 17
<223> /注释="9、11、15、17和19位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 18
<223> /注释="2、4、18和20位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> /注释="9、11、15、17和19位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="2、4、18和20位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="1和21位的A为fA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 22
<223> /注释="22、23和24位的T为lgT2核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 23
<223> /注释="22、23和24位的T为lgT2核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 24
<223> /注释="22、23和24位的T为lgT2核苷酸类似物"
<400> 68
aacaguguuc uugcucuaua attt 24
<210> 69
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ss1-3
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> /注释="1、2和3位的T为lgT5核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> /注释="1、2和3位的T为lgT5核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> /注释="1、2和3位的T为lgT5核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 4
<223> /注释="4和24位的A为fA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 5
<223> /注释="5、7、21和23位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 6
<223> /注释="6和13位的C为fC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 7
<223> /注释="5、7、21和23位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 8
<223> /注释="8、10和16位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 9
<223> /注释="9、11和15位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 10
<223> /注释="8、10和16位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 11
<223> /注释="9、11和15位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 12
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 13
<223> /注释="6和13位的C为fC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 14
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> /注释="9、11和15位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 16
<223> /注释="8、10和16位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 17
<223> /注释="17和19位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 18
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> /注释="17和19位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="5、7、21和23位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 22
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 23
<223> /注释="5、7、21和23位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 24
<223> /注释="4和24位的A为fA核苷酸类似物"
<400> 69
tttaacagug uucuugcucu auaa 24
<210> 70
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ss1-4
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> /注释="1位的核苷酸和2位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> /注释="1和21位的A为fA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> /注释="1位的核苷酸和2位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> /注释="2位的核苷酸和3位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> /注释="2、4、18和20位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> /注释="2位的核苷酸和3位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> /注释="3和10位的C为fC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 4
<223> /注释="2、4、18和20位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 5
<223> /注释="5、7和13位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 6
<223> /注释="6、8和12位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 7
<223> /注释="5、7和13位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 8
<223> /注释="6、8和12位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 9
<223> /注释="9、11、15、17和19位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 10
<223> /注释="3和10位的C为fC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 11
<223> /注释="9、11、15、17和19位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 12
<223> /注释="6、8和12位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 13
<223> /注释="5、7和13位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 14
<223> /注释="14和16位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> /注释="9、11、15、17和19位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 16
<223> /注释="14和16位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 17
<223> /注释="9、11、15、17和19位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 18
<223> /注释="2、4、18和20位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> /注释="9、11、15、17和19位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="2、4、18和20位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="1和21位的A为fA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 22
<223> /注释="22、23和24位的T为lgT5核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 23
<223> /注释="22、23和24位的T为lgT5核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 24
<223> /注释="22、23和24位的T为lgT5核苷酸类似物"
<400> 70
aacaguguuc uugcucuaua attt 24
<210> 71
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ss1-5
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> /注释="1、2和3位的T为lgT1核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> /注释="1、2和3位的T为lgT1核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> /注释="1、2和3位的T为lgT1核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 4
<223> /注释="4和24位的A为fA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 5
<223> /注释="5、7、21和23位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 6
<223> /注释="6和13位的C为fC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 7
<223> /注释="5、7、21和23位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 8
<223> /注释="8、10和16位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 9
<223> /注释="9、11和15位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 10
<223> /注释="8、10和16位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 11
<223> /注释="9、11和15位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 12
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 13
<223> /注释="6和13位的C为fC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 14
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> /注释="9、11和15位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 16
<223> /注释="8、10和16位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 17
<223> /注释="17和19位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 18
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> /注释="17和19位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="5、7、21和23位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 22
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 22
<223> /注释="22位的核苷酸和23位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 23
<223> /注释="5、7、21和23位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 23
<223> /注释="22位的核苷酸和23位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 23
<223> /注释="23位的核苷酸和24位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 24
<223> /注释="4和24位的A为fA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 24
<223> /注释="23位的核苷酸和24位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<400> 71
tttaacagug uucuugcucu auaa 24
<210> 72
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ss1-6
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> /注释="1、2和3位的T为lgT1核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> /注释="1、2和3位的T为lgT1核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> /注释="1、2和3位的T为lgT1核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 4
<223> /注释="4和24位的A为fA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 5
<223> /注释="5、7、21和23位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 6
<223> /注释="6和13位的C为fC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 7
<223> /注释="5、7、21和23位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 8
<223> /注释="8、10和16位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 9
<223> /注释="9、11和15位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 10
<223> /注释="8、10和16位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 11
<223> /注释="9、11和15位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 12
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 13
<223> /注释="6和13位的C为fC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 14
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> /注释="9、11和15位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 16
<223> /注释="8、10和16位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 17
<223> /注释="17和19位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 18
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> /注释="17和19位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="5、7、21和23位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 22
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 23
<223> /注释="5、7、21和23位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 24
<223> /注释="4和24位的A为fA核苷酸类似物"
<400> 72
tttaacagug uucuugcucu auaa 24
<210> 73
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ss1-7
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> /注释="1位的核苷酸和2位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> /注释="1和21位的A为fA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> /注释="1位的核苷酸和2位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> /注释="2位的核苷酸和3位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> /注释="2、4、18和20位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> /注释="2位的核苷酸和3位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> /注释="3和10位的C为fC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 4
<223> /注释="2、4、18和20位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 5
<223> /注释="5、7和13位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 6
<223> /注释="6、8和12位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 7
<223> /注释="5、7和13位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 8
<223> /注释="6、8和12位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 9
<223> /注释="9、11、15、17和19位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 10
<223> /注释="3和10位的C为fC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 11
<223> /注释="9、11、15、17和19位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 12
<223> /注释="6、8和12位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 13
<223> /注释="5、7和13位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 14
<223> /注释="14和16位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> /注释="9、11、15、17和19位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 16
<223> /注释="14和16位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 17
<223> /注释="9、11、15、17和19位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 18
<223> /注释="2、4、18和20位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> /注释="9、11、15、17和19位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="2、4、18和20位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="1和21位的A为fA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 22
<223> /注释="22、23和24位的T为lgT1核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 23
<223> /注释="22、23和24位的T为lgT1核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 24
<223> /注释="22、23和24位的T为lgT1核苷酸类似物"
<400> 73
aacaguguuc uugcucuaua attt 24
<210> 74
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ss1_8
<220>
<221> 变体
<222> 1
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<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> /注释="1、2和3位的T为lgT3核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> /注释="1、2和3位的T为lgT3核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 4
<223> /注释="4和24位的A为fA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 5
<223> /注释="5、7、21和23位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 6
<223> /注释="6和13位的C为fC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 7
<223> /注释="5、7、21和23位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 8
<223> /注释="8、10和16位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 9
<223> /注释="9、11和15位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 10
<223> /注释="8、10和16位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 11
<223> /注释="9、11和15位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 12
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 13
<223> /注释="6和13位的C为fC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 14
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> /注释="9、11和15位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 16
<223> /注释="8、10和16位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 17
<223> /注释="17和19位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 18
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> /注释="17和19位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="5、7、21和23位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 22
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 22
<223> /注释="22位的核苷酸和23位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 23
<223> /注释="5、7、21和23位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 23
<223> /注释="22位的核苷酸和23位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 23
<223> /注释="23位的核苷酸和24位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 24
<223> /注释="4和24位的A为fA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 24
<223> /注释="23位的核苷酸和24位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<400> 74
tttaacagug uucuugcucu auaa 24
<210> 75
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ss1-9
<220>
<221> 变体
<222> 1
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<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> /注释="1、2和3位的T为lgT3核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> /注释="1、2和3位的T为lgT3核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 4
<223> /注释="4和24位的A为fA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 5
<223> /注释="5、7、21和23位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 6
<223> /注释="6和13位的C为fC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 7
<223> /注释="5、7、21和23位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 8
<223> /注释="8、10和16位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 9
<223> /注释="9、11和15位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 10
<223> /注释="8、10和16位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 11
<223> /注释="9、11和15位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 12
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 13
<223> /注释="6和13位的C为fC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 14
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> /注释="9、11和15位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 16
<223> /注释="8、10和16位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 17
<223> /注释="17和19位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 18
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> /注释="17和19位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="5、7、21和23位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 22
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 23
<223> /注释="5、7、21和23位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 24
<223> /注释="4和24位的A为fA核苷酸类似物"
<400> 75
tttaacagug uucuugcucu auaa 24
<210> 76
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ss1-10
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> /注释="1位的核苷酸和2位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> /注释="1和21位的A为fA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> /注释="1位的核苷酸和2位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> /注释="2位的核苷酸和3位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> /注释="2、4、18和20位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> /注释="2位的核苷酸和3位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> /注释="3和10位的C为fC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 4
<223> /注释="2、4、18和20位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 5
<223> /注释="5、7和13位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 6
<223> /注释="6、8和12位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 7
<223> /注释="5、7和13位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 8
<223> /注释="6、8和12位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 9
<223> /注释="9、11、15、17和19位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 10
<223> /注释="3和10位的C为fC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 11
<223> /注释="9、11、15、17和19位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 12
<223> /注释="6、8和12位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 13
<223> /注释="5、7和13位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 14
<223> /注释="14和16位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> /注释="9、11、15、17和19位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 16
<223> /注释="14和16位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 17
<223> /注释="9、11、15、17和19位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 18
<223> /注释="2、4、18和20位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> /注释="9、11、15、17和19位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="2、4、18和20位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="1和21位的A为fA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 22
<223> /注释="22、23和24位的T为lgT3核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 23
<223> /注释="22、23和24位的T为lgT3核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 24
<223> /注释="22、23和24位的T为lgT3核苷酸类似物"
<400> 76
aacaguguuc uugcucuaua attt 24
<210> 77
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ss1-11
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> /注释="1、2和3位的T为lgT4核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> /注释="1、2和3位的T为lgT4核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> /注释="1、2和3位的T为lgT4核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 4
<223> /注释="4和24位的A为fA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 5
<223> /注释="5、7、21和23位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 6
<223> /注释="6和13位的C为fC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 7
<223> /注释="5、7、21和23位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 8
<223> /注释="8、10和16位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 9
<223> /注释="9、11和15位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 10
<223> /注释="8、10和16位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 11
<223> /注释="9、11和15位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 12
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 13
<223> /注释="6和13位的C为fC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 14
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> /注释="9、11和15位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 16
<223> /注释="8、10和16位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 17
<223> /注释="17和19位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 18
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> /注释="17和19位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="5、7、21和23位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 22
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 22
<223> /注释="22位的核苷酸和23位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 23
<223> /注释="5、7、21和23位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 23
<223> /注释="22位的核苷酸和23位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 23
<223> /注释="23位的核苷酸和24位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 24
<223> /注释="4和24位的A为fA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 24
<223> /注释="23位的核苷酸和24位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<400> 77
tttaacagug uucuugcucu auaa 24
<210> 78
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ss1-12
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> /注释="1位的核苷酸和2位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> /注释="1和21位的A为fA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> /注释="1位的核苷酸和2位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> /注释="2位的核苷酸和3位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> /注释="2、4、18和20位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> /注释="2位的核苷酸和3位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> /注释="3和10位的C为fC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 4
<223> /注释="2、4、18和20位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 5
<223> /注释="5、7和13位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 6
<223> /注释="6、8和12位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 7
<223> /注释="5、7和13位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 8
<223> /注释="6、8和12位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 9
<223> /注释="9、11、15、17和19位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 10
<223> /注释="3和10位的C为fC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 11
<223> /注释="9、11、15、17和19位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 12
<223> /注释="6、8和12位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 13
<223> /注释="5、7和13位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 14
<223> /注释="14和16位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> /注释="9、11、15、17和19位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 16
<223> /注释="14和16位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 17
<223> /注释="9、11、15、17和19位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 18
<223> /注释="2、4、18和20位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> /注释="9、11、15、17和19位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="2、4、18和20位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="1和21位的A为fA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 22
<223> /注释="22、23和24位的T为lgT4核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 23
<223> /注释="22、23和24位的T为lgT4核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 24
<223> /注释="22、23和24位的T为lgT4核苷酸类似物"
<400> 78
aacaguguuc uugcucuaua attt 24
<210> 79
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> as1-1
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> /注释="1位的核苷酸和2位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> /注释="1、21、22和23位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> /注释="1位的核苷酸和2位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> /注释="2位的核苷酸和3位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> /注释="2、4、18和20位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> /注释="2位的核苷酸和3位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> /注释="3、5、7、11和13位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 4
<223> /注释="2、4、18和20位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 5
<223> /注释="3、5、7、11和13位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 6
<223> /注释="6和8位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 7
<223> /注释="3、5、7、11和13位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 8
<223> /注释="6和8位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 9
<223> /注释="9、15和17位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 10
<223> /注释="10、14和16位的A为fA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 11
<223> /注释="3、5、7、11和13位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 12
<223> /注释="12和19位的G表示mG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 13
<223> /注释="3、5、7、11和13位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 14
<223> /注释="10、14和16位的A为fA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> /注释="9、15和17位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 16
<223> /注释="10、14和16位的A为fA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 17
<223> /注释="9、15和17位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 18
<223> /注释="2、4、18和20位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> /注释="12和19位的G表示mG核苷酸类似物
(mG)"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="2、4、18和20位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="1、21、22和23位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="21位的核苷酸和22位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 22
<223> /注释="1、21、22和23位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 22
<223> /注释="21位的核苷酸和22位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 22
<223> /注释="22位的核苷酸和23位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 23
<223> /注释="1、21、22和23位的U表示
2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 23
<223> /注释="22位的核苷酸和23位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<400> 79
uuauagagca agaacacugu uuu 23
<210> 80
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ss2-0
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> /注释="1、2和3位的T为lgT3核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> /注释="1、2和3位的T为lgT3核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> /注释="1、2和3位的T为lgT3核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 4
<223> /注释="4位的A为fA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 5
<223> /注释="5和17位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 6
<223> /注释="6、10、14和18位的C为fC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 7
<223> /注释="7、11和19位的G表示mG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 8
<223> /注释="8、12、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 9
<223> /注释="9、13和21位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 10
<223> /注释="6、10、14和18位的C为fC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 11
<223> /注释="7、11和19位的G表示mG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 12
<223> /注释="8、12、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 13
<223> /注释="9、13和21位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 14
<223> /注释="6、10、14和18位的C为fC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> /注释="15位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 16
<223> /注释="16位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 17
<223> /注释="5和17位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 18
<223> /注释="6、10、14和18位的C为fC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> /注释="7、11和19位的G表示mG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="8、12、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="20位的核苷酸和21位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="9、13和21位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="20位的核苷酸和21位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="21位的核苷酸和22位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 22
<223> /注释="8、12、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 22
<223> /注释="21位的核苷酸和22位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<400> 80
tttaucguac guaccgucgu au 22
<210> 81
<211> 26
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ss2-2
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> /注释="1、2、3位的T为lgT3核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> /注释="1、2、3位的T为lgT3核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> /注释="1、2、3位的T为lgT3核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 4
<223> /注释="4和24位的A为fA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 5
<223> /注释="5、7、21和23位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 6
<223> /注释="6和13位的C为fC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 7
<223> /注释="5、7、21和23位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 8
<223> /注释="8、10和16位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 9
<223> /注释="9、11和15位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 10
<223> /注释="8、10和16位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 11
<223> /注释="9、11和15位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 12
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 13
<223> /注释="6和13位的C为fC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 14
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> /注释="9、11和15位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 16
<223> /注释="8、10和16位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 17
<223> /注释="17和19位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 18
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> /注释="17和19位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="5、7、21和23位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 22
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 23
<223> /注释="5、7、21和23位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 24
<223> /注释="4和24位的A为fA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 25
<223> /注释="25和26位的T为lT1核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 26
<223> /注释="25和26位的T为lT1核苷酸类似物"
<400> 81
tttaacagug uucuugcucu auaatt 26
<210> 82
<211> 26
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ss2-3
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> /注释="1、2和3位的T为lgT3核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> /注释="1、2和3位的T为lgT3核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> /注释="1、2和3位的T为lgT3核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 4
<223> /注释="4和24位的A为fA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 5
<223> /注释="5、7、21和23位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 6
<223> /注释="6和13位的C为fC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 7
<223> /注释="5、7、21和23位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 8
<223> /注释="8、10和16位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 9
<223> /注释="9、11和15位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 10
<223> /注释="8、10和16位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 11
<223> /注释="9、11和15位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 12
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 13
<223> /注释="6和13位的C为fC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 14
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> /注释="9、11和15位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 16
<223> /注释="8、10和16位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 17
<223> /注释="17和19位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 18
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> /注释="17和19位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="5、7、21和23位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 22
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 23
<223> /注释="5、7、21和23位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 24
<223> /注释="4和24位的A为fA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 25
<223> /注释="25和26位的T为lT2核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 26
<223> /注释="25和26位的T为lT2核苷酸类似物"
<400> 82
tttaacagug uucuugcucu auaatt 26
<210> 83
<211> 26
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ss2-4
<220>
<221> 变体
<222> 1
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<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> /注释="1、2和3位的T为lgT3核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> /注释="1、2和3位的T为lgT3核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 4
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<220>
<221> 变体
<222> 5
<223> /注释="5、7、21和23位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 6
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<220>
<221> 变体
<222> 7
<223> /注释="5、7、21和23位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 8
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<220>
<221> 变体
<222> 9
<223> /注释="9、11和15位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 10
<223> /注释="8、10和16位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 11
<223> /注释="9、11和15位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 12
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 13
<223> /注释="6和13位的C为fC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 14
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 15
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<220>
<221> 变体
<222> 16
<223> /注释="8、10和16位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
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<223> /注释="17和19位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 18
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> /注释="17和19位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 21
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<220>
<221> 变体
<222> 22
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<220>
<221> 变体
<222> 23
<223> /注释="5、7、21和23位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 24
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<220>
<221> 变体
<222> 25
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<220>
<221> 变体
<222> 26
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<400> 83
tttaacagug uucuugcucu auaatt 26
<210> 84
<211> 26
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ss2-5
<220>
<221> 变体
<222> 1
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<220>
<221> 变体
<222> 2
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<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> /注释="1、2和3位的T为lgT3核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 4
<223> /注释="4和24位的A为fA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 5
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<220>
<221> 变体
<222> 6
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<220>
<221> 变体
<222> 7
<223> /注释="5、7、21和23位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 8
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<220>
<221> 变体
<222> 9
<223> /注释="9、11和15位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 10
<223> /注释="8、10和16位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 11
<223> /注释="9、11和15位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 12
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<220>
<221> 变体
<222> 13
<223> /注释="6和13位的C为fC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 14
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> /注释="9、11和15位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 16
<223> /注释="8、10和16位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 17
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<220>
<221> 变体
<222> 18
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 19
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<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="5、7、21和23位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 22
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 23
<223> /注释="5、7、21和23位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 24
<223> /注释="4和24位的A为fA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 25
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<220>
<221> 变体
<222> 26
<223> /注释="25和26位的T为lT4核苷酸类似物"
<400> 84
tttaacagug uucuugcucu auaatt 26
<210> 85
<211> 26
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ss2-6
<220>
<221> 变体
<222> 1
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<220>
<221> 变体
<222> 2
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<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> /注释="1、2和3位的T为lgT3核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 4
<223> /注释="4和24位的A为fA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 5
<223> /注释="5、7、21和23位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 6
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<220>
<221> 变体
<222> 7
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<220>
<221> 变体
<222> 8
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<220>
<221> 变体
<222> 9
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<220>
<221> 变体
<222> 10
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<220>
<221> 变体
<222> 11
<223> /注释="9、11和15位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 12
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<220>
<221> 变体
<222> 13
<223> /注释="6和13位的C为fC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 14
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> /注释="9、11和15位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 16
<223> /注释="8、10和16位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 17
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<220>
<221> 变体
<222> 18
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> /注释="17和19位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 21
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<220>
<221> 变体
<222> 22
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 23
<223> /注释="5、7、21和23位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 24
<223> /注释="4和24位的A为fA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 25
<223> /注释="25和26位的T为lT5核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 26
<223> /注释="25和26位的T为lT5核苷酸类似物"
<400> 85
tttaacagug uucuugcucu auaatt 26
<210> 86
<211> 26
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ss2-7
<220>
<221> 变体
<222> 1
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<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> /注释="1、2和3位的T为lgT3核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> /注释="1、2和3位的T为lgT3核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 4
<223> /注释="4和24位的A为fA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 5
<223> /注释="5、7、21和23位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 6
<223> /注释="6和13位的C为fC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 7
<223> /注释="5、7、21和23位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 8
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<220>
<221> 变体
<222> 9
<223> /注释="9、11和15位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 10
<223> /注释="8、10和16位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 11
<223> /注释="9、11和15位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 12
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 13
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<220>
<221> 变体
<222> 14
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> /注释="9、11和15位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 16
<223> /注释="8、10和16位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 17
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<220>
<221> 变体
<222> 18
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> /注释="17和19位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="5、7、21和23位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 22
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 23
<223> /注释="5、7、21和23位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 24
<223> /注释="4和24位的A为fA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 25
<223> /注释="25和26位的T为lT6核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 26
<223> /注释="25和26位的T为lT6核苷酸类似物"
<400> 86
tttaacagug uucuugcucu auaatt 26
<210> 87
<211> 26
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ss2-8
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> /注释="1、2和3位的T为lgT3核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> /注释="1、2和3位的T为lgT3核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> /注释="1、2和3位的T为lgT3核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 4
<223> /注释="4和24位的A为fA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 5
<223> /注释="5、7、21和23位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 6
<223> /注释="6和13位的C为fC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 7
<223> /注释="5、7、21和23位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 8
<223> /注释="8、10和16位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 9
<223> /注释="9、11和15位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 10
<223> /注释="8、10和16位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 11
<223> /注释="9、11和15位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 12
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 13
<223> /注释="6和13位的C为fC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 14
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> /注释="9、11和15位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 16
<223> /注释="8、10和16位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 17
<223> /注释="17和19位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 18
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> /注释="17和19位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="5、7、21和23位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 22
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 23
<223> /注释="5、7、21和23位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 24
<223> /注释="4和24位的A为fA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 25
<223> /注释="25和26位的T为lT7核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 26
<223> /注释="25和26位的T为lT7核苷酸类似物"
<400> 87
tttaacagug uucuugcucu auaatt 26
<210> 88
<211> 26
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ss2-9
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> /注释="1、2和3位的T为lgT3核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> /注释="1、2和3位的T为lgT3核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> /注释="1、2和3位的T为lgT3核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 4
<223> /注释="4和24位的A为fA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 5
<223> /注释="5、7、21和23位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 6
<223> /注释="6和13位的C为fC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 7
<223> /注释="5、7、21和23位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 8
<223> /注释="8、10和16位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 9
<223> /注释="9、11和15位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 10
<223> /注释="8、10和16位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 11
<223> /注释="9、11和15位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 12
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 13
<223> /注释="6和13位的C为fC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 14
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> /注释="9、11和15位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 16
<223> /注释="8、10和16位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 17
<223> /注释="17和19位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 18
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> /注释="17和19位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="5、7、21和23位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 22
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 23
<223> /注释="5、7、21和23位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 24
<223> /注释="4和24位的A为fA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 25
<223> /注释="25和26位的T为lT8核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 26
<223> /注释="25和26位的T为lT8核苷酸类似物"
<400> 88
tttaacagug uucuugcucu auaatt 26
<210> 89
<211> 26
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ss2-10
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> /注释="1、2和3位的T为lgT3核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> /注释="1、2和3位的T为lgT3核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> /注释="1、2和3位的T为lgT3核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 4
<223> /注释="4和24位的A为fA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 5
<223> /注释="5、7、21和23位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 6
<223> /注释="6和13位的C为fC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 7
<223> /注释="5、7、21和23位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 8
<223> /注释="8、10和16位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 9
<223> /注释="9、11和15位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 10
<223> /注释="8、10和16位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 11
<223> /注释="9、11和15位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 12
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 13
<223> /注释="6和13位的C为fC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 14
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> /注释="9、11和15位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 16
<223> /注释="8、10和16位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 17
<223> /注释="17和19位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 18
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> /注释="17和19位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="5、7、21和23位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 22
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 23
<223> /注释="5、7、21和23位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 24
<223> /注释="4和24位的A为fA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 25
<223> /注释="25和26位的T为lT9核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 26
<223> /注释="25和26位的T为lT9核苷酸类似物"
<400> 89
tttaacagug uucuugcucu auaatt 26
<210> 90
<211> 26
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ss2-11
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> /注释="1、2和3位的T为lgT3核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> /注释="1、2和3位的T为lgT3核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> /注释="1、2和3位的T为lgT3核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 4
<223> /注释="4和24位的A为fA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 5
<223> /注释="5、7、21和23位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 6
<223> /注释="6和13位的C为fC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 7
<223> /注释="5、7、21和23位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 8
<223> /注释="8、10和16位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 9
<223> /注释="9、11和15位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 10
<223> /注释="8、10和16位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 11
<223> /注释="9、11和15位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 12
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 13
<223> /注释="6和13位的C为fC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 14
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> /注释="9、11和15位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 16
<223> /注释="8、10和16位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 17
<223> /注释="17和19位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 18
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> /注释="17和19位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="5、7、21和23位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 22
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 23
<223> /注释="5、7、21和23位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 24
<223> /注释="4和24位的A为fA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 25
<223> /注释="25和26位的T为lT10核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 26
<223> /注释="25和26位的T为lT10核苷酸类似物"
<400> 90
tttaacagug uucuugcucu auaatt 26
<210> 91
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> as2-0
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> /注释="1位的核苷酸和2位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> /注释="1、6和18位的A为fA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> /注释="1位的核苷酸和2位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> /注释="2位的核苷酸和3位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> /注释="2、10和14位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> /注释="2位的核苷酸和3位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> /注释="3、11和15位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 4
<223> /注释="4、12和16位的C为fC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 5
<223> /注释="5、9、13和17位的G表示mG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 6
<223> /注释="1、6和18位的A为fA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 7
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<220>
<221> 变体
<222> 8
<223> /注释="8位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 9
<223> /注释="5、9、13和17位的G表示mG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 10
<223> /注释="2、10和14位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 11
<223> /注释="3、11和15位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 12
<223> /注释="4、12和16位的C为fC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 13
<223> /注释="5、9、13和17位的G表示mG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 14
<223> /注释="2、10和14位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> /注释="3、11和15位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 16
<223> /注释="4、12和16位的C为fC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 17
<223> /注释="5、9、13和17位的G表示mG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 18
<223> /注释="1、6和18位的A为fA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> /注释="19位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> /注释="19位的核苷酸和20位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="19位的核苷酸和20位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="20位的核苷酸和21位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="20位的核苷酸和21位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<400> 91
auacgacggu acguacgaut t 21
<210> 92
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> as2-2
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> /注释="1位的核苷酸和2位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> /注释="1和21位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> /注释="1位的核苷酸和2位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> /注释="2位的核苷酸和3位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> /注释="2、4、18和20位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> /注释="2位的核苷酸和3位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> /注释="3、5、7、11和13位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 4
<223> /注释="2、4、18和20位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 5
<223> /注释="3、5、7、11和13位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 6
<223> /注释="6和8位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 7
<223> /注释="3、5、7、11和13位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 8
<223> /注释="6和8位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 9
<223> /注释="9、15和17位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 10
<223> /注释="10、14和16位的A为fA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 11
<223> /注释="3、5、7、11和13位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 12
<223> /注释="12和19位的G表示mG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 13
<223> /注释="3、5、7、11和13位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 14
<223> /注释="10、14和16位的A为fA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> /注释="9、15和17位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 16
<223> /注释="10、14和16位的A为fA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 17
<223> /注释="9、15和17位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 18
<223> /注释="2、4、18和20位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> /注释="12和19位的G表示mG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="2、4、18和20位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="1和21位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 22
<223> /注释="22和23位的T为lT1核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 23
<223> /注释="22和23位的T为lT1核苷酸类似物"
<400> 92
uuauagagca agaacacugu utt 23
<210> 93
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> as2-3
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> /注释="1位的核苷酸和2位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> /注释="1和21位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> /注释="1位的核苷酸和2位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> /注释="2位的核苷酸和3位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> /注释="2、4、18和20位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> /注释="2位的核苷酸和3位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> /注释="3、5、7、11和13位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 4
<223> /注释="2、4、18和20位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 5
<223> /注释="3、5、7、11和13位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 6
<223> /注释="6和8位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 7
<223> /注释="3、5、7、11和13位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 8
<223> /注释="6和8位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 9
<223> /注释="9、15和17位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 10
<223> /注释="10、14和16位的A为fA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 11
<223> /注释="3、5、7、11和13位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 12
<223> /注释="12和19位的G表示mG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 13
<223> /注释="3、5、7、11和13位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 14
<223> /注释="10、14和16位的A为fA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> /注释="9、15和17位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 16
<223> /注释="10、14和16位的A为fA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 17
<223> /注释="9、15和17位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 18
<223> /注释="2、4、18和20位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> /注释="12和19位的G表示mG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="2、4、18和20位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="1和21位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 22
<223> /注释="22和23位的T为lT2核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 23
<223> /注释="22和23位的T为lT2核苷酸类似物"
<400> 93
uuauagagca agaacacugu utt 23
<210> 94
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> as2-4
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> /注释="1位的核苷酸和2位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> /注释="1和21位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> /注释="1位的核苷酸和2位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> /注释="2位的核苷酸和3位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> /注释="2、4、18和20位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> /注释="2位的核苷酸和3位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> /注释="3、5、7、11和13位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 4
<223> /注释="2、4、18和20位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 5
<223> /注释="3、5、7、11和13位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 6
<223> /注释="6和8位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 7
<223> /注释="3、5、7、11和13位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 8
<223> /注释="6和8位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 9
<223> /注释="9、15和17位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 10
<223> /注释="10、14和16位的A为fA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 11
<223> /注释="3、5、7、11和13位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 12
<223> /注释="12和19位的G表示mG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 13
<223> /注释="3、5、7、11和13位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 14
<223> /注释="10、14和16位的A为fA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> /注释="9、15和17位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 16
<223> /注释="10、14和16位的A为fA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 17
<223> /注释="9、15和17位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 18
<223> /注释="2、4、18和20位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> /注释="12和19位的G表示mG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="2、4、18和20位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="1和21位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 22
<223> /注释="22和23位的T为lT3核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 23
<223> /注释="22和23位的T为lT3核苷酸类似物"
<400> 94
uuauagagca agaacacugu utt 23
<210> 95
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> as2-5
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> /注释="1位的核苷酸和2位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> /注释="1和21位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> /注释="1位的核苷酸和2位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> /注释="2位的核苷酸和3位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> /注释="2、4、18和20位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> /注释="2位的核苷酸和3位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> /注释="3、5、7、11和13位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 4
<223> /注释="2、4、18和20位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 5
<223> /注释="3、5、7、11和13位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 6
<223> /注释="6和8位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 7
<223> /注释="3、5、7、11和13位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 8
<223> /注释="6和8位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 9
<223> /注释="9、15和17位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 10
<223> /注释="10、14和16位的A为fA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 11
<223> /注释="3、5、7、11和13位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 12
<223> /注释="12和19位的G表示mG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 13
<223> /注释="3、5、7、11和13位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 14
<223> /注释="10、14和16位的A为fA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> /注释="9、15和17位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 16
<223> /注释="10、14和16位的A为fA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 17
<223> /注释="9、15和17位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 18
<223> /注释="2、4、18和20位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> /注释="12和19位的G表示mG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="2、4、18和20位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="1和21位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 22
<223> /注释="22和23位的T为lT4核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 23
<223> /注释="22和23位的T为lT4核苷酸类似物"
<400> 95
uuauagagca agaacacugu utt 23
<210> 96
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> as2-6
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> /注释="1位的核苷酸和2位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> /注释="1和21位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> /注释="1位的核苷酸和2位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> /注释="2位的核苷酸和3位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> /注释="2、4、18和20位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> /注释="2位的核苷酸和3位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> /注释="3、5、7、11和13位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 4
<223> /注释="2、4、18和20位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 5
<223> /注释="3、5、7、11和13位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 6
<223> /注释="6和8位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 7
<223> /注释="3、5、7、11和13位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 8
<223> /注释="6和8位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 9
<223> /注释="9、15和17位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 10
<223> /注释="10、14和16位的A为fA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 11
<223> /注释="3、5、7、11和13位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 12
<223> /注释="12和19位的G表示mG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 13
<223> /注释="3、5、7、11和13位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 14
<223> /注释="10、14和16位的A为fA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> /注释="9、15和17位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 16
<223> /注释="10、14和16位的A为fA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 17
<223> /注释="9、15和17位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 18
<223> /注释="2、4、18和20位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> /注释="12和19位的G表示mG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="2、4、18和20位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="1和21位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 22
<223> /注释="22和23位的T为lT5核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 23
<223> /注释="22和23位的T为lT5核苷酸类似物"
<400> 96
uuauagagca agaacacugu utt 23
<210> 97
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> as2-7
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> /注释="1位的核苷酸和2位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> /注释="1和21位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> /注释="1位的核苷酸和2位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> /注释="2位的核苷酸和3位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> /注释="2、4、18和20位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> /注释="2位的核苷酸和3位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> /注释="3、5、7、11和13位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 4
<223> /注释="2、4、18和20位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 5
<223> /注释="3、5、7、11和13位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 6
<223> /注释="6和8位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 7
<223> /注释="3、5、7、11和13位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 8
<223> /注释="6和8位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 9
<223> /注释="9、15和17位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 10
<223> /注释="10、14和16位的A为fA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 11
<223> /注释="3、5、7、11和13位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 12
<223> /注释="12和19位的G表示mG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 13
<223> /注释="3、5、7、11和13位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 14
<223> /注释="10、14和16位的A为fA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> /注释="9、15和17位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 16
<223> /注释="10、14和16位的A为fA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 17
<223> /注释="9、15和17位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 18
<223> /注释="2、4、18和20位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> /注释="12和19位的G表示mG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="2、4、18和20位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="1和21位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 22
<223> /注释="22和23位的T为lT6核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 23
<223> /注释="22和23位的T为lT6核苷酸类似物"
<400> 97
uuauagagca agaacacugu utt 23
<210> 98
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> as2-7
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> /注释="1位的核苷酸和2位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> /注释="1和21位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> /注释="1位的核苷酸和2位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> /注释="2位的核苷酸和3位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> /注释="2、4、18和20位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> /注释="2位的核苷酸和3位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> /注释="3、5、7、11和13位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 4
<223> /注释="2、4、18和20位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 5
<223> /注释="3、5、7、11和13位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 6
<223> /注释="6和8位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 7
<223> /注释="3、5、7、11和13位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 8
<223> /注释="6和8位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 9
<223> /注释="9、15和17位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 10
<223> /注释="10、14和16位的A为fA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 11
<223> /注释="3、5、7、11和13位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 12
<223> /注释="12和19位的G表示mG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 13
<223> /注释="3、5、7、11和13位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 14
<223> /注释="10、14和16位的A为fA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> /注释="9、15和17位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 16
<223> /注释="10、14和16位的A为fA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 17
<223> /注释="9、15和17位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 18
<223> /注释="2、4、18和20位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> /注释="12和19位的G表示mG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="2、4、18和20位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="1和21位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 22
<223> /注释="22和23位的T为lT7核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 23
<223> /注释="22和23位的T为lT7核苷酸类似物"
<400> 98
uuauagagca agaacacugu utt 23
<210> 99
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> as2-9
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> /注释="1位的核苷酸和2位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> /注释="1和21位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> /注释="1位的核苷酸和2位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> /注释="2位的核苷酸和3位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> /注释="2、4、18和20位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> /注释="2位的核苷酸和3位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> /注释="3、5、7、11和13位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 4
<223> /注释="2、4、18和20位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 5
<223> /注释="3、5、7、11和13位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 6
<223> /注释="6和8位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 7
<223> /注释="3、5、7、11和13位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 8
<223> /注释="6和8位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 9
<223> /注释="9、15和17位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 10
<223> /注释="10、14和16位的A为fA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 11
<223> /注释="3、5、7、11和13位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 12
<223> /注释="12和19位的G表示mG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 13
<223> /注释="3、5、7、11和13位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 14
<223> /注释="10、14和16位的A为fA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> /注释="9、15和17位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 16
<223> /注释="10、14和16位的A为fA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 17
<223> /注释="9、15和17位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 18
<223> /注释="2、4、18和20位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> /注释="12和19位的G表示mG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="2、4、18和20位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="1和21位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 22
<223> /注释="22和23位的T为lT9核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 23
<223> /注释="22和23位的T为lT9核苷酸类似物"
<400> 99
uuauagagca agaacacugu utt 23
<210> 100
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ss3-1
<220>
<221> 变体
<222> 1
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通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> /注释="1和21位的A为fA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> /注释="1位的核苷酸和2位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> /注释="2位的核苷酸和3位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 2
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<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> /注释="2位的核苷酸和3位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 3
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<220>
<221> 变体
<222> 4
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<220>
<221> 变体
<222> 5
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<220>
<221> 变体
<222> 6
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<220>
<221> 变体
<222> 7
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<220>
<221> 变体
<222> 8
<223> /注释="6、8和12位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 9
<223> /注释="9、11、15、17和19位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 10
<223> /注释="3和10位的C为fC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 11
<223> /注释="9、11、15、17和19位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 12
<223> /注释="6、8和12位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 13
<223> /注释="5、7和13位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 14
<223> /注释="14和16位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> /注释="9、11、15、17和19位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 16
<223> /注释="14和16位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 17
<223> /注释="9、11、15、17和19位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 18
<223> /注释="2、4、18和20位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> /注释="9、11、15、17和19位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="2、4、18和20位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="1和21位的A为fA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 22
<223> /注释="22、23和24位的T为lgT5核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 23
<223> /注释="22、23和24位的T为lgT5核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 24
<223> /注释="22、23和24位的T为lgT5核苷酸类似物"
<400> 100
aacaguguuc uugcucuaua attt 24
<210> 101
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ss3-2
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> /注释="1位的核苷酸和2位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> /注释="1和21位的A为fA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> /注释="1位的核苷酸和2位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> /注释="2位的核苷酸和3位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 2
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<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> /注释="2位的核苷酸和3位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 3
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<220>
<221> 变体
<222> 4
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<220>
<221> 变体
<222> 5
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<220>
<221> 变体
<222> 6
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<220>
<221> 变体
<222> 7
<223> /注释="5、7和13位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 8
<223> /注释="6、8和12位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 9
<223> /注释="9、11、15、17和19位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 10
<223> /注释="3和10位的C为fC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 11
<223> /注释="9、11、15、17和19位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 12
<223> /注释="6、8和12位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 13
<223> /注释="5、7和13位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 14
<223> /注释="14和16位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> /注释="9、11、15、17和19位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 16
<223> /注释="14和16位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 17
<223> /注释="9、11、15、17和19位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 18
<223> /注释="2、4、18和20位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> /注释="9、11、15、17和19位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="2、4、18和20位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="1和21位的A为fA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 22
<223> /注释="22、23和24位的T为lgT6核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 23
<223> /注释="22、23和24位的T为lgT6核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 24
<223> /注释="22、23和24位的T为lgT6核苷酸类似物"
<400> 101
aacaguguuc uugcucuaua attt 24
<210> 102
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ss3-3
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> /注释="1位的核苷酸和2位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> /注释="1和21位的A为fA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> /注释="1位的核苷酸和2位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> /注释="2位的核苷酸和3位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> /注释="2、4、18和20位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> /注释="2位的核苷酸和3位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> /注释="3和10位的C为fC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 4
<223> /注释="2、4、18和20位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 5
<223> /注释="5、7和13位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 6
<223> /注释="6、8和12位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 7
<223> /注释="5、7和13位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 8
<223> /注释="6、8和12位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 9
<223> /注释="9、11、15、17和19位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 10
<223> /注释="3和10位的C为fC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 11
<223> /注释="9、11、15、17和19位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 12
<223> /注释="6、8和12位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 13
<223> /注释="5、7和13位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 14
<223> /注释="14和16位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> /注释="9、11、15、17和19位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 16
<223> /注释="14和16位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 17
<223> /注释="9、11、15、17和19位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 18
<223> /注释="2、4、18和20位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> /注释="9、11、15、17和19位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="2、4、18和20位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="1和21位的A为fA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 22
<223> /注释="22、23和24位的T为lgT7核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 23
<223> /注释="22、23和24位的T为lgT7核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 24
<223> /注释="22、23和24位的T为lgT7核苷酸类似物"
<400> 102
aacaguguuc uugcucuaua attt 24
<210> 103
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ss3-4
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> /注释="1位的核苷酸和2位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> /注释="1和21位的A为fA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> /注释="1位的核苷酸和2位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> /注释="2位的核苷酸和3位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> /注释="2、4、18和20位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> /注释="2位的核苷酸和3位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> /注释="3和10位的C为fC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 4
<223> /注释="2、4、18和20位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 5
<223> /注释="5、7和13位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 6
<223> /注释="6、8和12位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 7
<223> /注释="5、7和13位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 8
<223> /注释="6、8和12位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 9
<223> /注释="9、11、15、17和19位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 10
<223> /注释="3和10位的C为fC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 11
<223> /注释="9、11、15、17和19位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 12
<223> /注释="6、8和12位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 13
<223> /注释="5、7和13位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 14
<223> /注释="14和16位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> /注释="9、11、15、17和19位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 16
<223> /注释="14和16位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 17
<223> /注释="9、11、15、17和19位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 18
<223> /注释="2、4、18和20位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> /注释="9、11、15、17和19位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="2、4、18和20位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="1和21位的A为fA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 22
<223> /注释="22、23和24位的T为lgT8核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 23
<223> /注释="22、23和24位的T为lgT8核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 24
<223> /注释="22、23和24位的T为lgT8核苷酸类似物"
<400> 103
aacaguguuc uugcucuaua attt 24
<210> 104
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ss3-5
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> /注释="1位的核苷酸和2位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> /注释="1和21位的A为fA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> /注释="1位的核苷酸和2位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> /注释="2位的核苷酸和3位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> /注释="2、4、18和20位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> /注释="2位的核苷酸和3位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> /注释="3和10位的C为fC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 4
<223> /注释="2、4、18和20位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 5
<223> /注释="5、7和13位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 6
<223> /注释="6、8和12位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 7
<223> /注释="5、7和13位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 8
<223> /注释="6、8和12位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 9
<223> /注释="9、11、15、17和19位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 10
<223> /注释="3和10位的C为fC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 11
<223> /注释="9、11、15、17和19位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 12
<223> /注释="6、8和12位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 13
<223> /注释="5、7和13位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 14
<223> /注释="14和16位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> /注释="9、11、15、17和19位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 16
<223> /注释="14和16位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 17
<223> /注释="9、11、15、17和19位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 18
<223> /注释="2、4、18和20位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> /注释="9、11、15、17和19位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="2、4、18和20位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="1和21位的A为fA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 22
<223> /注释="22、23和24位的T为lgT9核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 23
<223> /注释="22、23和24位的T为lgT9核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 24
<223> /注释="22、23和24位的T为lgT9核苷酸类似物"
<400> 104
aacaguguuc uugcucuaua attt 24
<210> 105
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ss3-6
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> /注释="1、2和3位的T为lgT5核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> /注释="1、2和3位的T为lgT5核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> /注释="1、2和3位的T为lgT5核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 4
<223> /注释="4和24位的A为fA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 5
<223> /注释="5、7、21和23位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 6
<223> /注释="6和13位的C为fC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 7
<223> /注释="5、7、21和23位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 8
<223> /注释="8、10和16位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 9
<223> /注释="9、11和15位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 10
<223> /注释="8、10和16位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 11
<223> /注释="9、11和15位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 12
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 13
<223> /注释="6和13位的C为fC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 14
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> /注释="9、11和15位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 16
<223> /注释="8、10和16位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 17
<223> /注释="17和19位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 18
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> /注释="17和19位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="5、7、21和23位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 22
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 22
<223> /注释="22位的核苷酸和23位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 23
<223> /注释="5、7、21和23位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 23
<223> /注释="22位的核苷酸和23位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 23
<223> /注释="23位的核苷酸和24位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 24
<223> /注释="4和24位的A为fA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 24
<223> /注释="23位的核苷酸和24位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<400> 105
tttaacagug uucuugcucu auaa 24
<210> 106
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ss3-7
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> /注释="1、2和3位的T为lgT6核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> /注释="1、2和3位的T为lgT6核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> /注释="1、2和3位的T为lgT6核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 4
<223> /注释="4和24位的A为fA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 5
<223> /注释="5、7、21和23位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 6
<223> /注释="6和13位的C为fC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 7
<223> /注释="5、7、21和23位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 8
<223> /注释="8、10和16位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 9
<223> /注释="9、11和15位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 10
<223> /注释="8、10和16位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 11
<223> /注释="9、11和15位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 12
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 13
<223> /注释="6和13位的C为fC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 14
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> /注释="9、11和15位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 16
<223> /注释="8、10和16位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 17
<223> /注释="17和19位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 18
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> /注释="17和19位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="5、7、21和23位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 22
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 22
<223> /注释="22位的核苷酸和23位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 23
<223> /注释="5、7、21和23位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 23
<223> /注释="22位的核苷酸和23位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 23
<223> /注释="23位的核苷酸和24位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 24
<223> /注释="4和24位的A为fA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 24
<223> /注释="23位的核苷酸和24位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<400> 106
tttaacagug uucuugcucu auaa 24
<210> 107
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ss3-8
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> /注释="1、2和3位的T为lgT7核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> /注释="1、2和3位的T为lgT7核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> /注释="1、2和3位的T为lgT7核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 4
<223> /注释="4和24位的A为fA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 5
<223> /注释="5、7、21和23位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 6
<223> /注释="6和13位的C为fC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 7
<223> /注释="5、7、21和23位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 8
<223> /注释="8、10和16位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 9
<223> /注释="9、11和15位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 10
<223> /注释="8、10和16位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 11
<223> /注释="9、11和15位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 12
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 13
<223> /注释="6和13位的C为fC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 14
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> /注释="9、11和15位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 16
<223> /注释="8、10和16位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 17
<223> /注释="17和19位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 18
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> /注释="17和19位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="5、7、21和23位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 22
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 22
<223> /注释="22位的核苷酸和23位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 23
<223> /注释="5、7、21和23位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 23
<223> /注释="22位的核苷酸和23位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 23
<223> /注释="23位的核苷酸和24位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 24
<223> /注释="4和24位的A为fA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 24
<223> /注释="23位的核苷酸和24位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<400> 107
tttaacagug uucuugcucu auaa 24
<210> 108
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ss3-9
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> /注释="1、2和3位的T为lgT8核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> /注释="1、2和3位的T为lgT8核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> /注释="1、2和3位的T为lgT8核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 4
<223> /注释="4和24位的A为fA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 5
<223> /注释="5、7、21和23位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 6
<223> /注释="6和13位的C为fC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 7
<223> /注释="5、7、21和23位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 8
<223> /注释="8、10和16位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 9
<223> /注释="9、11和15位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 10
<223> /注释="8、10和16位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 11
<223> /注释="9、11和15位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 12
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 13
<223> /注释="6和13位的C为fC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 14
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> /注释="9、11和15位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 16
<223> /注释="8、10和16位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 17
<223> /注释="17和19位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 18
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> /注释="17和19位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="5、7、21和23位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 22
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 22
<223> /注释="22位的核苷酸和23位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 23
<223> /注释="5、7、21和23位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 23
<223> /注释="22位的核苷酸和23位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 23
<223> /注释="23位的核苷酸和24位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 24
<223> /注释="4和24位的A为fA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 24
<223> /注释="23位的核苷酸和24位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<400> 108
tttaacagug uucuugcucu auaa 24
<210> 109
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ss3-10
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> /注释="1、2和3位的T为lgT9核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> /注释="1、2和3位的T为lgT9核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> /注释="1、2和3位的T为lgT9核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 4
<223> /注释="4和24位的A为fA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 5
<223> /注释="5、7、21和23位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 6
<223> /注释="6和13位的C为fC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 7
<223> /注释="5、7、21和23位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 8
<223> /注释="8、10和16位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 9
<223> /注释="9、11和15位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 10
<223> /注释="8、10和16位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 11
<223> /注释="9、11和15位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 12
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 13
<223> /注释="6和13位的C为fC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 14
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> /注释="9、11和15位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 16
<223> /注释="8、10和16位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 17
<223> /注释="17和19位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 18
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> /注释="17和19位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="5、7、21和23位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 22
<223> /注释="12、14、18、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 22
<223> /注释="22位的核苷酸和23位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 23
<223> /注释="5、7、21和23位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 23
<223> /注释="22位的核苷酸和23位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 23
<223> /注释="23位的核苷酸和24位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 24
<223> /注释="4和24位的A为fA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 24
<223> /注释="23位的核苷酸和24位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<400> 109
tttaacagug uucuugcucu auaa 24
<210> 110
<211> 26
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ss3-11
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> /注释="1、2和3位的T为lgT3核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> /注释="1、2和3位的T为lgT3核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> /注释="1、2和3位的T为lgT3核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 4
<223> /注释="4位的A为fA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 5
<223> /注释="5和17位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 6
<223> /注释="6、10、14和18位的C为fC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 7
<223> /注释="7、11和19位的G表示mG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 8
<223> /注释="8、12、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 9
<223> /注释="9、13和21位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 10
<223> /注释="6、10、14和18位的C为fC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 11
<223> /注释="7、11和19位的G表示mG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 12
<223> /注释="8、12、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 13
<223> /注释="9、13和21位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 14
<223> /注释="6、10、14和18位的C为fC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> /注释="15位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 16
<223> /注释="16位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 17
<223> /注释="5和17位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 18
<223> /注释="6、10、14和18位的C为fC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> /注释="7、11和19位的G表示mG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="8、12、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="9、13和21位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 22
<223> /注释="8、12、20和22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 23
<223> /注释="23位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 24
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<220>
<221> 变体
<222> 25
<223> /注释="25和26位的T为lT4核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 26
<223> /注释="25和26位的T为lT4核苷酸类似物"
<400> 110
tttaucguac guaccgucgu auaatt 26
<210> 111
<211> 26
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ss4-3
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> /注释="1位的T为lgT6核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> /注释="2位的T为lgT6核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> /注释="3位的T为lgT6核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 4
<223> /注释="4位的A为fA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 5
<223> /注释="5位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 6
<223> /注释="6位的C为fC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 7
<223> /注释="7位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 8
<223> /注释="8位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 9
<223> /注释="9位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 10
<223> /注释="10位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 11
<223> /注释="11位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 12
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<220>
<221> 变体
<222> 13
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<220>
<221> 变体
<222> 14
<223> /注释="14位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> /注释="15位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 16
<223> /注释="16位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 17
<223> /注释="17位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 18
<223> /注释="18位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> /注释="19位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="20位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="21位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 22
<223> /注释="22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 23
<223> /注释="23位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 24
<223> /注释="24位的A为fA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 25
<223> /注释="25位的T为lT4核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 26
<223> /注释="26位的T为lT4核苷酸类似物"
<400> 111
tttaacagug uucuugcucu auaatt 26
<210> 112
<211> 26
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ss4-4
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> /注释="1位的T为lgT7核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> /注释="2位的T为lgT7核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> /注释="3位的T为lgT7核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 4
<223> /注释="4位的A为fA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 5
<223> /注释="5位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 6
<223> /注释="6位的C为fC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 7
<223> /注释="7位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 8
<223> /注释="8位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 9
<223> /注释="9位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 10
<223> /注释="10位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 11
<223> /注释="11位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 12
<223> /注释="12位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 13
<223> /注释="13位的C为fC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 14
<223> /注释="14位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> /注释="15位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 16
<223> /注释="16位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 17
<223> /注释="17位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 18
<223> /注释="18位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> /注释="19位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="20位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="21位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 22
<223> /注释="22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 23
<223> /注释="23位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 24
<223> /注释="24位的A为fA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 25
<223> /注释="25位的T为lT4核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 26
<223> /注释="26位的T为lT4核苷酸类似物"
<400> 112
tttaacagug uucuugcucu auaatt 26
<210> 113
<211> 26
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ss4-5
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> /注释="1位的T为lgT7核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> /注释="2位的T为lgT3核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> /注释="3位的T为lgT3核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 4
<223> /注释="4位的A为fA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 5
<223> /注释="5位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 6
<223> /注释="6位的C为fC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 7
<223> /注释="7位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 8
<223> /注释="8位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 9
<223> /注释="9位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 10
<223> /注释="10位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 11
<223> /注释="11位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 12
<223> /注释="12位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 13
<223> /注释="13位的C为fC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 14
<223> /注释="14位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> /注释="15位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 16
<223> /注释="16位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 17
<223> /注释="17位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 18
<223> /注释="18位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> /注释="19位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="20位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="21位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 22
<223> /注释="22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 23
<223> /注释="23位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 24
<223> /注释="24位的A为fA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 24
<223> /注释="24位的核苷酸和25位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 25
<223> /注释="25位的T为lT4核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 25
<223> /注释="25位的核苷酸和26位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 26
<223> /注释="26位的T为lT4核苷酸类似物"
<400> 113
tttaacagug uucuugcucu auaatt 26
<210> 114
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ss4-6
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> /注释="1位的T为lgT7核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> /注释="2位的T为lgT7核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> /注释="3位的T为lgT7核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 4
<223> /注释="4位的A为fA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 5
<223> /注释="5位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 6
<223> /注释="6位的C为fC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 7
<223> /注释="7位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 8
<223> /注释="8位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 9
<223> /注释="9位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 10
<223> /注释="10位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 11
<223> /注释="11位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 12
<223> /注释="12位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 13
<223> /注释="13位的C为fC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 14
<223> /注释="14位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> /注释="15位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 16
<223> /注释="16位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 17
<223> /注释="17位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 18
<223> /注释="18位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> /注释="19位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="20位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="21位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 22
<223> /注释="22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 23
<223> /注释="23位的T为lT4核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 24
<223> /注释="24位的T为lT4核苷酸类似物"
<400> 114
tttaacagug uucuugcucu autt 24
<210> 115
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ss4-7
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> /注释="1位的T为lgT7核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> /注释="2位的T为lgT7核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> /注释="3位的T为lgT7核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 4
<223> /注释="4位的A为fA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 5
<223> /注释="5位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 6
<223> /注释="6位的C为fC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 7
<223> /注释="7位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 8
<223> /注释="8位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 9
<223> /注释="9位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 10
<223> /注释="10位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 11
<223> /注释="11位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 12
<223> /注释="12位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 13
<223> /注释="13位的C为fC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 14
<223> /注释="14位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> /注释="15位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 16
<223> /注释="16位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 17
<223> /注释="17位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 18
<223> /注释="18位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> /注释="19位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="20位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="21位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 22
<223> /注释="22位的核苷酸和23位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 22
<223> /注释="22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 23
<223> /注释="23位的核苷酸和24位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 23
<223> /注释="23位的T为lT4核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 24
<223> /注释="24位的T为lT4核苷酸类似物"
<400> 115
tttaacagug uucuugcucu autt 24
<210> 116
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ss4-8
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> /注释="1位的T为lgT7核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> /注释="2位的T为lgT7核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> /注释="3位的T为lgT7核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 4
<223> /注释="4位的A为fA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 5
<223> /注释="5位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 6
<223> /注释="6位的C为fC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 7
<223> /注释="7位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 8
<223> /map="8位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 9
<223> /注释="9位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 10
<223> /注释="10位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 11
<223> /注释="11位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 12
<223> /注释="12位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 13
<223> /注释="13位的C为fC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 14
<223> /注释="14位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> /注释="15位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 16
<223> /注释="16位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 17
<223> /注释="17位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 18
<223> /注释="18位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> /注释="19位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="20位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="21位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 22
<223> /注释="22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 23
<223> /注释="23位的A为lA4核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 24
<223> /注释="24位的A为lA4核苷酸类似物"
<400> 116
tttaacagug uucuugcucu auaa 24
<210> 117
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ss4-9
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> /注释="1位的T为lgT7核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> /注释="2位的T为lgT7核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> /注释="3位的T为lgT7核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 4
<223> /注释="4位的A为fA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 5
<223> /注释="5位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 6
<223> /注释="6位的C为fC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 7
<223> /注释="7位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 8
<223> /注释="8位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 9
<223> /注释="9位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 10
<223> /注释="10位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 11
<223> /注释="11位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 12
<223> /注释="12位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 13
<223> /注释="13位的C为fC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 14
<223> /注释="14位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> /注释="15位的U表示2’-O-甲基-尿嘧啶(mU)"
<220>
<221> 变体
<222> 16
<223> /注释="16位的G为fG核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 17
<223> /注释="17位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 18
<223> /注释="18位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> /注释="19位的C表示mC核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> /注释="20位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> /注释="21位的A表示mA核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 22
<223> /注释="22位的核苷酸和23位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 22
<223> /注释="22位的U为fU核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 23
<223> /注释="23位的核苷酸和24位的核苷酸
通过亚磷酰胺键连接"
<220>
<221> 变体
<222> 23
<223> /注释="23位的A为lA4核苷酸类似物"
<220>
<221> 变体
<222> 24
<223> /注释="24位的A为lA4核苷酸类似物"
<400> 117
tttaacagug uucuugcucu auaa 24
<210> 118
<211> 20
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223>在体内对心肌细胞具有高选择性的肽
<400> 118
Trp Leu Ser Glu Ala Gly Pro Val Val Thr Val Arg Ala Leu Arg Gly
1 5 10 15
Thr Gly Ser Trp
20

Claims (58)

1.式(I)的化合物：
Figure FDA0002760977430000011
其中：
-B为杂环核碱基；
-P1和P2各自独立地为H、反应性磷基团或保护基团；
-Y为O、NH、NR1或N-C(＝O)-R1，其中R1为：
·(C1-C20)烷基基团，其任选地被一个或多个选自以下的基团取代：卤素原子、(C1-C6)烷基基团、(C3-C8)环烷基基团、(C3-C14)杂环、(C6-C14)芳基基团、(C5-C14)杂芳基基团、-O-Z1、-N(Z1)(Z2)、-S-Z1、-CN、-C(＝J)-O-Z1、-O-C(＝J)-Z1、-C(＝J)-N(Z1)(Z2)和-N(Z1)-C(＝J)-Z2，其中
J为O或S，
Z1和Z2各自独立地为H、(C1-C6)烷基基团，其任选地被一个或多个选自以下的基团取代：卤素原子和(C1-C6)烷基基团，
·(C3-C8)环烷基基团，其任选地被一个或多个选自以下的基团取代：卤素原子和(C1-C6)烷基基团，或
·基团-[C(＝O)]m-R2-(O-CH2-CH2)p-R3，其中：
m为整数，取值0或1,
p为整数，其范围为0至10，
R2为(C1-C20)亚烷基基团，其任选地被(C1-C6)烷基基团、-O-Z3、-N(Z3)(Z4)、-S-Z3、-CN、-C(＝K)-O-Z3、-O-C(＝K)-Z3、-C(＝K)-N(Z3)(Z4)或-N(Z3)-C(＝K)-Z4取代，其中
K为O或S，
Z3和Z4各自独立地为H、(C1-C6)烷基基团，其任选地被一个或多个选自以下的基团取代：卤素原子和(C1-C6)烷基基团，
和
R3选自氢原子、(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷氧基基团、(C3-C8)环烷基基团、(C3-C14)杂环、(C6-C14)芳基基团和(C5-C14)杂芳基基团，
或
R3为细胞靶向部分，
-X1和X2各自独立地为氢原子、(C1-C6)烷基基团，和
-Ra、Rb、Rc和Rd各自独立地为H或(C1-C6)烷基基团。
2.根据权利要求1所述的式(I)的化合物，其中Y为NR1，且其中R1为任选取代的(C1-C20)烷基基团，且P1、P2、Ra、Rb、Rc、Rd、X1、X2和B如对于通式(I)所定义。
3.根据权利要求1所述的式(I)的化合物，其中Y为NR1，且其中R1为未取代的(C1-C16)烷基基团，其包括选自甲基、异丙基、丁基、辛基和十六烷基的烷基基团，且P1、P2、Ra、Rb、Rc、Rd、X1、X2和B具有如对于通式(I)所定义的相同的含义。
4.根据权利要求1所述的式(I)的化合物，其中Y为NR1，R1为(C3-C8)环烷基基团，其任选地被一个或多个选自以下的基团取代：卤素原子和(C1-C6)烷基基团，且P1、P2、Ra、Rb、Rc、Rd、X1、X2和B具有如对于通式(I)所定义的相同的含义。
5.根据权利要求1所述的式(I)的化合物，Y为NR1，其中R1为环己基基团，且P1、P2、Ra、Rb、Rc、Rd、X1、X2和B具有如对于通式(I)所定义的相同的含义。
6.根据权利要求1所述的式(I)的化合物，其中Y为NR1，且其中R1为(C1-C20)烷基基团，其被(C6-C14)芳基基团取代，且P1、P2、Ra、Rb、Rc、Rd、X1、X2和B具有如对于通式(I)所定义的相同的含义。
7.根据权利要求1所述的式(I)的化合物，其中Y为NR1，且其中R1为(C1-C20)烷基基团，其被苯基基团取代，且P1、P2、Ra、Rb、Rc、Rd、X1、X2和B具有如对于通式(I)所定义的相同的含义。
8.根据权利要求1所述的式(I)的化合物，其中Y为NR1，且其中R1为被苯基基团取代的甲基基团，且P1、P2、Ra、Rb、Rc、Rd、X1、X2和B具有如对于通式(I)所定义的相同的含义。
9.根据权利要求1所述的式(I)的化合物，其中Y为N-C(＝O)-R1，且其中R1为任选取代的(C1-C20)烷基基团，且P1、P2、Ra、Rb、Rc、Rd、X1、X2和B具有如对于通式(I)所定义的相同的含义。
10.根据权利要求1所述的式(I)的化合物，其中Y为N-C(＝O)-R1，且其中R1选自甲基和十五烷基，且P1、P2、Ra、Rb、Rc、Rd、X1、X2和B具有如对于通式(I)所定义的相同的含义。
11.根据权利要求1所述的式(I)的化合物，其中Y为NR1且R1为-[C(＝O)]m-R2-(O-CH2-CH2)p-R3，其中
m为整数，取值0或1，
p为整数，其范围为0至10，
R2为(C1-C20)亚烷基基团，其任选地被(C1-C6)烷基基团、-O-Z3、-N(Z3)(Z4)、-S-Z3、-CN、-C(＝K)-O-Z3、-O-C(＝K)-Z3、-C(＝K)-N(Z3)(Z4)、-N(Z3)-C(＝K)-Z4取代，其中
K为O或S，
Z3和Z4各自独立地为H、(C1-C6)烷基基团，其任选地被一个或多个选自以下的基团取代：卤素原子和(C1-C6)烷基基团，
和
R3为细胞靶向部分，
-X1和X2各自独立地为氢原子、(C1-C6)烷基基团，和
-Ra、Rb、Rc和Rd各自独立地为H或(C1-C6)烷基基团。
12.根据权利要求11所述的式(I)的化合物，其中R1为所述基团-[C(＝O)]m-R2-(O-CH2-CH2)p-R3，m为0，p为0，R3为细胞靶向部分，B、P1、P2、Ra、Rb、Rc、Rd、X1、X2和R2如式(I)的化合物的通用定义中。
13.根据权利要求11所述的式(I)的化合物，其中R2为亚乙基基团，p为0，且X1和X2均为氢原子。
14.根据权利要求11所述的式(I)的化合物，其中R2为亚戊基基团，且X1和X2均为氢原子。
15.根据权利要求11所述的式(I)的化合物，其中R2为(C12)亚烷基基团，且X1和X2均为氢原子。
16.根据权利要求11所述的式(I)的化合物，其中R1为所述基团-[C(＝O)]m-R2-(O-CH2-CH2)p-R3，m为0，p选自整数1、2、3和4，R3为细胞靶向部分，且B、P1、P2、Ra、Rb、Rc、Rd、X1、X2和R2如式(I)的化合物的通用定义中。
17.根据权利要求16所述的式(I)的化合物，其中R2为亚乙基基团，p为1，且X1和X2均为氢原子。
18.根据权利要求16所述的式(I)的化合物，其中R2为亚乙基基团，p为2，且X1和X2均为氢原子。
19.根据权利要求16所述的式(I)的化合物，其中R2为亚乙基基团，p为3，且X1和X2均为氢原子。
20.根据权利要求16所述的式(I)的化合物，其中R2为亚乙基基团，p为4，且X1和X2均为氢原子。
21.根据权利要求11所述的式(I)的化合物，其中m为1，p为0，R3为细胞靶向部分，且R2、B、P1、P2、Ra、Rb、Rc、Rd、X1、X2如式(I)的化合物的通用定义中。
22.根据权利要求21所述的式(I)的化合物，其中R2为亚丁基，X1和X2均表示氢原子，且B、P1、P2、Ra、Rb、Rc和Rd如对于通式(I)所定义。
23.根据权利要求21所述的式(I)的化合物，其中R2为(C11)亚烷基，X1和X2均表示氢原子，且B、P1、P2、Ra、Rb、Rc和Rd如对于通式(I)所定义。
24.根据权利要求21所述的式(I)的化合物，其中R2为亚甲基，X1和X2均表示氢原子，且B、P1、P2、Ra、Rb、Rc和Rd如对于通式(I)所定义。
25.根据权利要求11所述的式(I)的化合物，其中m为1，p选自整数1和2，R3为细胞靶向部分，且R2、B、P1、P2、Ra、Rb、Rc、Rd、X1、X2如式(I)的化合物的通用定义中。
26.根据权利要求11所述的式(I)的化合物，其中R2为亚甲基基团，p为2，R3为细胞靶向部分，且B、P1、P2、Ra、Rb、Rc、Rd、X1、X2如对于通式(I)所定义。
27.根据权利要求11所述的式(I)的化合物，其中R2为亚甲基基团，p为1，R3为细胞靶向部分，且B、P1、P2、Ra、Rb、Rc、Rd、X1、X2如对于通式(I)所定义。
28.根据权利要求11至27中任一项所述的式(I)的化合物，其中R3为式(III)的化合物：
Figure FDA0002760977430000051
其中A1、A2和A3为O-C(＝O)-R4，
其中R4为(C1-C6)烷基或(C6-C10)芳基基团；
A4为O-C(＝O)-R4或NHC(＝O)-R5，其中R4如上文所定义，且R5为(C1-C6)烷基基团，其任选地被卤素原子取代。
29.根据权利要求28所述的式(I)的化合物，
其中A1、A2和A3为O-C(＝O)-R4，其中R4为甲基基团，
A4为O-C(＝O)-R4、NHC(＝O)-R5，其中R4和R5各自为甲基基团。
30.根据权利要求28或29所述的式(I)的化合物，其中R3为3,4,6-三-O-乙酰基-D-N-乙酰基半乳糖胺。
31.根据前述权利要求中任一项所述的式(I)的化合物，其中B任选地被保护并选自嘧啶、取代的嘧啶、嘌呤和取代的嘌呤。
32.根据权利要求1至31中任一项所述的式(I)的化合物，其中P1或P2之一为O-4,4’-二甲氧基三苯甲基基团且P1和P2中的另一者为H、反应性磷基团或保护基团，且Y、B、X1、X2、Ra、Rb、Rc和Rd如权利要求1中所定义。
33.根据权利要求1至31中任一项所述的式(I)的化合物，其中P1和P2之一为2-氰基乙基-N,N-二异丙基亚磷酰胺基团，且P1和P2中的另一者为保护基团，且Y、B、X1、X2、Ra、Rb、Rc和Rd如权利要求1中所定义。
34.根据权利要求1至31中任一项所述的式(I)的化合物，其中P1和P2之一为2-氰基乙基-N,N-二异丙基亚磷酰胺基团且P1和P2中的另一者为O-4,4’-二甲氧基三苯甲基基团，且Y、B、X1、X2、Ra、Rb、Rc和Rd如权利要求1中所定义。
35.寡核苷酸，其包含一个或多个式(II)的化合物：
Figure FDA0002760977430000061
其中：
-B为杂环核碱基；
-L1和L2之一为连接所述式(II)的化合物至所述寡聚化合物的核苷间连接基团，且L1和L2中的另一者为H、保护基团、磷部分或连接所述式(II)的化合物至所述寡聚化合物的核苷间连接基团，
-Y为O、NH、NR1或N-C(＝O)-R1，其中R1为：
·(C1-C20)烷基基团，其任选地被一个或多个选自以下的基团取代：卤素原子、(C1-C6)烷基基团、(C3-C8)环烷基基团、(C3-C14)杂环、(C6-C14)芳基基团、(C5-C14)杂芳基基团、-O-Z1、-N(Z1)(Z2)、-S-Z1、-CN、-C(＝J)-O-Z1、-O-C(＝J)-Z1、-C(＝J)-N(Z1)(Z2)和-N(Z1)-C(＝J)-Z2，其中
J为O或S，
Z1和Z2各自独立地为H、(C1-C6)烷基基团，其任选地被一个或多个选自以下的基团取代：卤素原子和(C1-C6)烷基基团，
·(C3-C8)环烷基基团，其任选地被一个或多个选自以下的基团取代：卤素原子和(C1-C6)烷基基团，
·基团-[C(＝O)]m-R2-(O-CH2-CH2)p-R3，其中
m为整数，取值0或1，
p为整数，其范围为0至10，
R2为(C1-C20)亚烷基基团，其任选地被(C1-C6)烷基基团、-O-Z3、-N(Z3)(Z4)、-S-Z3、-CN、-C(＝K)-O-Z3、-O-C(＝K)-Z3、-C(＝K)-N(Z3)(Z4)或-N(Z3)-C(＝K)-Z4取代，其中
K为O或S，
Z3和Z4各自独立地为H、(C1-C6)烷基基团，其任选地被一个或多个选自以下的基团取代：卤素原子和(C1-C6)烷基基团，
和
R3选自氢原子、(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷氧基基团、(C3-C8)环烷基基团、(C3-C14)杂环、(C6-C14)芳基基团或(C5-C14)杂芳基基团，或R3为细胞靶向部分，
-X1和X2各自独立地为氢原子、(C1-C6)烷基基团，和
-Ra、Rb、Rc和Rd各自独立地为H或(C1-C6)烷基基团，
或其药学上可接受的盐。
36.根据权利要求35所述的寡核苷酸，其包含一个或多个式(II)的化合物，其中Y为NR1，R1为未取代的(C1-C20)烷基基团，且L1、L2、Ra、Rb、Rc、Rd、X1、X2、R2、R3和B具有如对于所述通式(II)所定义的相同的含义，或其药学上可接受的盐。
37.根据权利要求35所述的寡核苷酸，其包含一个或多个式(II)的化合物，其中Y为NR1，R1为未取代的(C1-C16)烷基基团，其包括选自甲基、异丙基、丁基、辛基、十六烷基的烷基基团，且L1、L2、Ra、Rb、Rc、Rd、X1、X2、R2、R3和B具有如权利要求35所定义的相同的含义，或其药学上可接受的盐。
38.根据权利要求35所述的寡核苷酸，其包含一个或多个式(II)的化合物，其中Y为NR1，R1为(C3-C8)环烷基基团，其任选地被一个或多个选自以下的基团取代：卤素原子和(C1-C6)烷基基团，且L1、L2、Ra、Rb、Rc、Rd、X1、X2、R2、R3和B具有如权利要求35所定义的相同的含义，或其药学上可接受的盐。
39.根据权利要求35所述的寡核苷酸，其包含一个或多个式(II)的化合物，其中Y为NR1，R1为环己基基团，且L1、L2、Ra、Rb、Rc、Rd、X1、X2、R2、R3和B具有如权利要求35所定义的相同的含义，或其药学上可接受的盐。
40.根据权利要求35所述的寡核苷酸，其包含一个或多个式(II)的化合物，其中Y为NR1，R1为被(C6-C14)芳基基团取代的(C1-C20)烷基基团，且L1、L2、Ra、Rb、Rc、Rd、X1、X2、R2、R3和B具有如权利要求35所定义的相同的含义，或其药学上可接受的盐。
41.根据权利要求35所述的寡核苷酸，其包含一个或多个式(II)的化合物，其中Y为NR1，R1为被苯基基团取代的甲基基团，且L1、L2、Ra、Rb、Rc、Rd、X1、X2、R2、R3和B具有如权利要求35所定义的相同的含义，或其药学上可接受的盐。
42.根据权利要求35所述的寡核苷酸，其包含一个或多个式(II)的化合物，其中Y为N-C(＝O)-R1，R1为任选取代的(C1-C20)烷基基团，且L1、L2、Ra、Rb、Rc、Rd、X1、X2、R2、R3和B具有如权利要求35所定义的相同的含义，或其药学上可接受的盐。
43.根据权利要求35所述的寡核苷酸，其包含一个或多个式(II)的化合物，其中Y为N-C(＝O)-R1，R1选自甲基和十五烷基，且L1、L2、Ra、Rb、Rc、Rd、X1、X2、R2、R3和B具有如权利要求35所定义的相同的含义，或其药学上可接受的盐。
44.根据权利要求35所述的寡核苷酸，其包含一个或多个式(II)的化合物，其中B选自嘧啶、取代的嘧啶、嘌呤和取代的嘌呤，或其药学上可接受的盐。
45.根据权利要求35所述的寡核苷酸，其包含一个或多个式(II)的化合物，其中所述核苷间连接基团独立地选自磷酸二酯、磷酸三酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、烷基-膦酸酯和氨基磷酸酯骨架连接基团，或其药学上可接受的盐。
46.根据权利要求35所述的寡核苷酸，其包含2至10个式(II)的化合物或其药学上可接受的盐。
47.根据权利要求35至46中任一项所述的寡核苷酸，其包含一个或多个靶向的核苷酸或其药学上可接受的盐。
48.根据权利要求35至47中任一项所述的寡核苷酸，其中R3具有式(III)：
Figure FDA0002760977430000081
其中A1、A2和A3为OH，
A4为OH或NHC(＝O)-R5，其中R5为(C1-C6)烷基基团，其任选地被卤素原子取代，或其药学上可接受的盐。
49.根据权利要求35至48中任一项所述的寡核苷酸，其中R3为N-乙酰基-半乳糖胺，或其药学上可接受的盐。
50.双链寡核苷酸，其包含一个或多个如权利要求35至49中任一项所定义的式(II)的化合物，或其药学上可接受的盐。
51.小干扰RNA(siRNA)，其包含一个或多个如权利要求35至49中任一项所定义的式(II)的化合物，或其药学上可接受的盐。
52.用于制备式(I-A)的化合物的方法，
Figure FDA0002760977430000091
其包括以下步骤：
a)氧化式(X)的化合物
Figure FDA0002760977430000092
其中B为杂环核碱基，且P1和P2各自独立地表示如根据权利要求1所述的通式(I)中所定义的保护基团，
通过式(X)的化合物与诸如高碘酸钠(NalO4)的氧化剂进行反应，从而得到以下式(XI)的化合物：
Figure FDA0002760977430000093
和
b)使式(XI)的化合物在式(XII)的化合物存在下进行还原胺化的步骤
R1-NH2(XII)
其中R1如在根据权利要求1所述的通式(I)中所定义，
以得到所述式(I-A)的化合物：
Figure FDA0002760977430000101
其中B为杂环核碱基，且P1和P2各自独立地表示如根据权利要求1所述的通式(I)中所定义的保护基团。
53.用于制备式(I-C)的化合物的方法：
Figure FDA0002760977430000102
其包括以下步骤：
a)通过还原胺化使式(XV)的化合物
Figure FDA0002760977430000103
其中，
-A1、A2和A3为OH或O-C(＝O)-R4，
其中R4为(C1-C6)烷基或(C6-C10)芳基基团；
-A4为OH、O-C(＝O)-R4或NHC(＝O)-R5，R4如上文所定义，且R5为(C1-C6)烷基基团，其任选地被卤素原子取代；
-Y-CHO通过所述还原胺化反应转移至-Y-CH2-，其等同于X，且X为式-(CH2-CH2-O)p-R2-的基团，其中p和R2如根据权利要求1所述的通式(I)中所定义，
与式(XIII)的化合物反应
Figure FDA0002760977430000111
其中P1、P2和B如根据权利要求1所述的通式(I)中所定义，
以得到所述式(I-C)的化合物
Figure FDA0002760977430000112
54.用于得到式(I-D)的化合物的方法
Figure FDA0002760977430000113
其包括在肽偶联条件下，使式(XVI)的化合物
Figure FDA0002760977430000114
其中
-A1、A2和A3为OH或O-C(＝O)-R4，
其中R4为(C1-C6)烷基或(C6-C10)芳基基团；
-A4为OH、O-C(＝O)-R4或NHC(＝O)-R5，R4如上文所定义，且R5为(C1-C6)烷基基团，其任选地被卤素原子取代，
-X为所述式-(CH2-CH2-O)p-R2-的基团，其中p和R2如根据权利要求1所述的通式(I)中所定义，
与式(XIII)的化合物反应的步骤
Figure FDA0002760977430000121
其中P1、P2和B如根据权利要求1所述的通式(I)中所定义，
以得到所述式(I-D)的化合物。
55.用于制备式(I-E)的化合物的方法,其包括以下步骤：
a)还原式(XI)的化合物
Figure FDA0002760977430000122
其中P1、P2和B如通式(I)中所定义，从而获得式(XVII)的化合物
Figure FDA0002760977430000123
b)在磺酰化剂的存在下(例如，对-甲苯-磺酰氯Ts-Cl、甲磺酰氯Ms-Cl)转移所述式(XVII)的化合物，从而获得式(XVIII)的化合物
Figure FDA0002760977430000124
其中Ts表示甲苯磺酰基基团，和
c)使所述式(XVIII)的化合物经受碱性条件，从而获得所述式(I-E)的化合物
Figure FDA0002760977430000131
56.用于制备式(I-E)的化合物的方法，其包括以下步骤：
a)在过量的磺酰化剂存在下，转移所述式(XVII)的化合物
Figure FDA0002760977430000132
其中P1、P2和B如根据权利要求1所述的通式(I)中所定义，以获得式(XIX)的化合物
Figure FDA0002760977430000133
其中Ts表示甲苯磺酰基基团，
b)通过去除基团P1将所述式(XIX)的化合物去保护，以得到式(XX)的化合物
Figure FDA0002760977430000134
c)使所述式(XX)的化合物经受碱性条件，从而获得式(XXI)的化合物
Figure FDA0002760977430000135
和
d)用保护基团P1替代所述甲苯磺酰基基团，从而获得所述式(I-E)的化合物
Figure FDA0002760977430000136
57.式(I’)的化合物：
(I’)
Figure FDA0002760977430000141
其中T1和T2各自独立地为保护基团、-C(＝O)(CH2)r-COOH或-C(＝O)(CH2)r-C(＝O)NH-R7，
其中R7表示固体载体材料，r为选自2、3和4的整数，
且其中Y、B、X1、X2、Ra、Rb、Rc和Rd如通式(I)中所定义。
58.根据权利要求57所述的式(I’)的化合物，其中T1和T2之一为C(＝O)(CH2)r-C(＝O)NH-R7，
其中R7为CPG固体载体或聚苯乙烯固体载体，
且T1和T2中的另一者为保护基团，且r为2。
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