KR20230022892A - 이중-가닥 sirna 유도체의 접합체 - Google Patents
이중-가닥 sirna 유도체의 접합체 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20230022892A KR20230022892A KR1020227046437A KR20227046437A KR20230022892A KR 20230022892 A KR20230022892 A KR 20230022892A KR 1020227046437 A KR1020227046437 A KR 1020227046437A KR 20227046437 A KR20227046437 A KR 20227046437A KR 20230022892 A KR20230022892 A KR 20230022892A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- seq
- modified
- antisense strand
- sense strand
- base
- Prior art date
Links
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 title claims abstract description 125
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims abstract description 60
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 38
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 claims abstract description 36
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 235
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 235
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 claims description 208
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 claims description 191
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 131
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 claims description 124
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 101
- 125000001153 fluoro group Chemical group F* 0.000 claims description 98
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 84
- 150000001875 compounds Chemical group 0.000 claims description 81
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 38
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 28
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 24
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 15
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 14
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 13
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 13
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N Propanedioic acid Natural products OC(=O)CC(O)=O OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N glycerol Substances OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- -1 bicarbonate radicals Chemical class 0.000 claims description 7
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 7
- VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N Fumaric acid Chemical compound OC(=O)\C=C\C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N 0.000 claims description 6
- AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N Methanesulfonic acid Chemical compound CS(O)(=O)=O AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N benzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1 WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N dimethylselenoniopropionate Natural products CCC(O)=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- KQNPFQTWMSNSAP-UHFFFAOYSA-N isobutyric acid Chemical compound CC(C)C(O)=O KQNPFQTWMSNSAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 claims description 6
- XNGIFLGASWRNHJ-UHFFFAOYSA-N phthalic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1C(O)=O XNGIFLGASWRNHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- TYFQFVWCELRYAO-UHFFFAOYSA-N suberic acid Chemical compound OC(=O)CCCCCCC(O)=O TYFQFVWCELRYAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- JOXIMZWYDAKGHI-UHFFFAOYSA-N toluene-4-sulfonic acid Chemical compound CC1=CC=C(S(O)(=O)=O)C=C1 JOXIMZWYDAKGHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- OVRNDRQMDRJTHS-KEWYIRBNSA-N N-acetyl-D-galactosamine Chemical group CC(=O)N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-KEWYIRBNSA-N 0.000 claims description 5
- 150000007522 mineralic acids Chemical group 0.000 claims description 5
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 claims description 4
- QBYIENPQHBMVBV-HFEGYEGKSA-N (2R)-2-hydroxy-2-phenylacetic acid Chemical compound O[C@@H](C(O)=O)c1ccccc1.O[C@@H](C(O)=O)c1ccccc1 QBYIENPQHBMVBV-HFEGYEGKSA-N 0.000 claims description 3
- BMYNFMYTOJXKLE-UHFFFAOYSA-N 3-azaniumyl-2-hydroxypropanoate Chemical compound NCC(O)C(O)=O BMYNFMYTOJXKLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 claims description 3
- 239000005711 Benzoic acid Substances 0.000 claims description 3
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N Dextrotartaric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N 0.000 claims description 3
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical group C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 claims description 3
- GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N Nitric acid Chemical compound O[N+]([O-])=O GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-L Phosphate ion(2-) Chemical compound OP([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 3
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- IWYDHOAUDWTVEP-UHFFFAOYSA-N R-2-phenyl-2-hydroxyacetic acid Natural products OC(=O)C(O)C1=CC=CC=C1 IWYDHOAUDWTVEP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N Succinic acid Natural products OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N Tartaric acid Natural products [H+].[H+].[O-]C(=O)C(O)C(O)C([O-])=O FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- SRSXLGNVWSONIS-UHFFFAOYSA-N benzenesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 SRSXLGNVWSONIS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229940092714 benzenesulfonic acid Drugs 0.000 claims description 3
- 235000010233 benzoic acid Nutrition 0.000 claims description 3
- KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N butanedioic acid Chemical compound O[14C](=O)CC[14C](O)=O KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N 0.000 claims description 3
- 239000011575 calcium Substances 0.000 claims description 3
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 claims description 3
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-N carbonic acid Chemical compound OC(O)=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-M dihydrogenphosphate Chemical compound OP(O)([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- 239000001530 fumaric acid Substances 0.000 claims description 3
- XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N hydrogen iodide Chemical compound I XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-M hydrogensulfate Chemical compound OS([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- 229940071870 hydroiodic acid Drugs 0.000 claims description 3
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 claims description 3
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 claims description 3
- 159000000003 magnesium salts Chemical class 0.000 claims description 3
- VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N maleic acid Chemical compound OC(=O)\C=C/C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N 0.000 claims description 3
- 239000011976 maleic acid Substances 0.000 claims description 3
- 229960002510 mandelic acid Drugs 0.000 claims description 3
- 229940098779 methanesulfonic acid Drugs 0.000 claims description 3
- 229910017604 nitric acid Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000011591 potassium Substances 0.000 claims description 3
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 235000019260 propionic acid Nutrition 0.000 claims description 3
- IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N quinbolone Chemical compound O([C@H]1CC[C@H]2[C@H]3[C@@H]([C@]4(C=CC(=O)C=C4CC3)C)CC[C@@]21C)C1=CCCC1 IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N 0.000 claims description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims description 3
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000011975 tartaric acid Substances 0.000 claims description 3
- 235000002906 tartaric acid Nutrition 0.000 claims description 3
- ISIJQEHRDSCQIU-UHFFFAOYSA-N tert-butyl 2,7-diazaspiro[4.5]decane-7-carboxylate Chemical compound C1N(C(=O)OC(C)(C)C)CCCC11CNCC1 ISIJQEHRDSCQIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 2
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 abstract description 70
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 11
- 239000000427 antigen Substances 0.000 abstract description 8
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 abstract description 8
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 abstract description 8
- 101710137302 Surface antigen S Proteins 0.000 abstract description 4
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 abstract description 4
- IWUCXVSUMQZMFG-AFCXAGJDSA-N Ribavirin Chemical class N1=C(C(=O)N)N=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 IWUCXVSUMQZMFG-AFCXAGJDSA-N 0.000 abstract description 2
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 89
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 65
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 57
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 55
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 48
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 41
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 39
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 33
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 33
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 26
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 26
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 25
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 24
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 24
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 24
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 24
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 23
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 22
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 21
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 20
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 19
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N Thiophosphoric acid Chemical class OP(O)(S)=O RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 13
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 13
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 13
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 12
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 12
- 208000000419 Chronic Hepatitis B Diseases 0.000 description 11
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 11
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 11
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 11
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 11
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 11
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 11
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 10
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 10
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 10
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 9
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 8
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 8
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 8
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 8
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- HBAQYPYDRFILMT-UHFFFAOYSA-N 8-[3-(1-cyclopropylpyrazol-4-yl)-1H-pyrazolo[4,3-d]pyrimidin-5-yl]-3-methyl-3,8-diazabicyclo[3.2.1]octan-2-one Chemical class C1(CC1)N1N=CC(=C1)C1=NNC2=C1N=C(N=C2)N1C2C(N(CC1CC2)C)=O HBAQYPYDRFILMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 7
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 7
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 7
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 7
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 7
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 7
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 7
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 7
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 7
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 7
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 7
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 6
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 6
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 description 6
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 6
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 6
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical class O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 5
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 5
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 5
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 5
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 5
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 5
- GONFBOIJNUKKST-UHFFFAOYSA-N 5-ethylsulfanyl-2h-tetrazole Chemical compound CCSC=1N=NNN=1 GONFBOIJNUKKST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 4
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000013461 design Methods 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 4
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 238000012207 quantitative assay Methods 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 3
- 239000012124 Opti-MEM Substances 0.000 description 3
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 3
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 3
- 229910004298 SiO 2 Inorganic materials 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 3
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 3
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 3
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 3
- 238000012054 celltiter-glo Methods 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 3
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 3
- 125000000548 ribosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 3
- IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N sincalide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C1=CC=C(OS(O)(=O)=O)C=C1 IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N 0.000 description 3
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 3
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 3
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 description 3
- OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N (2,4-dichlorophenyl) benzenesulfonate Chemical compound ClC1=CC(Cl)=CC=C1OS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GVZJRBAUSGYWJI-UHFFFAOYSA-N 2,5-bis(3-dodecylthiophen-2-yl)thiophene Chemical compound C1=CSC(C=2SC(=CC=2)C2=C(C=CS2)CCCCCCCCCCCC)=C1CCCCCCCCCCCC GVZJRBAUSGYWJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010059193 Acute hepatitis B Diseases 0.000 description 2
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 2
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BPYKTIZUTYGOLE-IFADSCNNSA-N Bilirubin Chemical compound N1C(=O)C(C)=C(C=C)\C1=C\C1=C(C)C(CCC(O)=O)=C(CC2=C(C(C)=C(\C=C/3C(=C(C=C)C(=O)N\3)C)N2)CCC(O)=O)N1 BPYKTIZUTYGOLE-IFADSCNNSA-N 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101800005151 Cholecystokinin-8 Proteins 0.000 description 2
- 102400000888 Cholecystokinin-8 Human genes 0.000 description 2
- YZCKVEUIGOORGS-OUBTZVSYSA-N Deuterium Chemical compound [2H] YZCKVEUIGOORGS-OUBTZVSYSA-N 0.000 description 2
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 2
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 2
- 241000701076 Macacine alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 2
- KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine Chemical compound CN(C)CCN(C)C KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- OFBQJSOFQDEBGM-UHFFFAOYSA-N Pentane Chemical compound CCCCC OFBQJSOFQDEBGM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M Propionate Chemical compound CCC([O-])=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-M Trifluoroacetate Chemical compound [O-]C(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 2
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 2
- KXKVLQRXCPHEJC-UHFFFAOYSA-N acetic acid trimethyl ester Natural products COC(C)=O KXKVLQRXCPHEJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 2
- 208000037628 acute hepatitis B virus infection Diseases 0.000 description 2
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 2
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 2
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 2
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 208000016350 chronic hepatitis B virus infection Diseases 0.000 description 2
- 230000007882 cirrhosis Effects 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 2
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 2
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 2
- 229910052805 deuterium Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000012065 filter cake Substances 0.000 description 2
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 2
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- IXCSERBJSXMMFS-UHFFFAOYSA-N hydrogen chloride Substances Cl.Cl IXCSERBJSXMMFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910000041 hydrogen chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 239000012442 inert solvent Substances 0.000 description 2
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 2
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 2
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BAZAXWOYCMUHIX-UHFFFAOYSA-M sodium perchlorate Chemical compound [Na+].[O-]Cl(=O)(=O)=O BAZAXWOYCMUHIX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229910001488 sodium perchlorate Inorganic materials 0.000 description 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 229940044616 toll-like receptor 7 agonist Drugs 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- FPIRBHDGWMWJEP-UHFFFAOYSA-N 1-hydroxy-7-azabenzotriazole Chemical compound C1=CN=C2N(O)N=NC2=C1 FPIRBHDGWMWJEP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FALRKNHUBBKYCC-UHFFFAOYSA-N 2-(chloromethyl)pyridine-3-carbonitrile Chemical compound ClCC1=NC=CC=C1C#N FALRKNHUBBKYCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013607 AAV vector Substances 0.000 description 1
- 241001164825 Adeno-associated virus - 8 Species 0.000 description 1
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000013 Ammonium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 108091036055 CccDNA Proteins 0.000 description 1
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 description 1
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N Galacturonsaeure Natural products O=CC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010019851 Hepatotoxicity Diseases 0.000 description 1
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 241000581650 Ivesia Species 0.000 description 1
- 239000012359 Methanesulfonyl chloride Substances 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-CBQIKETKSA-N N-Acetyl-D-Galactosamine Chemical group CC(=O)N[C@H]1[C@@H](O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-CBQIKETKSA-N 0.000 description 1
- MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N N-acetyl-D-galactosamine Natural products CC(=O)NC(C=O)C(O)C(O)C(O)CO MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010028851 Necrosis Diseases 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 108010087230 Sincalide Proteins 0.000 description 1
- KEAYESYHFKHZAL-UHFFFAOYSA-N Sodium Chemical compound [Na] KEAYESYHFKHZAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical class [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M Sodium bisulfite Chemical compound [Na+].OS([O-])=O DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- YZCKVEUIGOORGS-NJFSPNSNSA-N Tritium Chemical compound [3H] YZCKVEUIGOORGS-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- QSDSNNSKORVORL-UHFFFAOYSA-N acetic acid;silver Chemical compound [Ag].CC(O)=O QSDSNNSKORVORL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- WOZSCQDILHKSGG-UHFFFAOYSA-N adefovir depivoxil Chemical compound N1=CN=C2N(CCOCP(=O)(OCOC(=O)C(C)(C)C)OCOC(=O)C(C)(C)C)C=NC2=C1N WOZSCQDILHKSGG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003205 adefovir dipivoxil Drugs 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- IAJILQKETJEXLJ-QTBDOELSSA-N aldehydo-D-glucuronic acid Chemical compound O=C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-QTBDOELSSA-N 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N ammonia Natural products N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000012538 ammonium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011914 asymmetric synthesis Methods 0.000 description 1
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 239000012752 auxiliary agent Substances 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 1
- 150000004657 carbamic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 238000010609 cell counting kit-8 assay Methods 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 150000005829 chemical entities Chemical class 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000012069 chiral reagent Substances 0.000 description 1
- 125000001309 chloro group Chemical class Cl* 0.000 description 1
- DDYAZDRFUVZBMM-UHFFFAOYSA-N chloro-[chloro-di(propan-2-yl)silyl]oxy-di(propan-2-yl)silane Chemical compound CC(C)[Si](Cl)(C(C)C)O[Si](Cl)(C(C)C)C(C)C DDYAZDRFUVZBMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 229960005338 clevudine Drugs 0.000 description 1
- GBBJCSTXCAQSSJ-XQXXSGGOSA-N clevudine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1[C@H](F)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 GBBJCSTXCAQSSJ-XQXXSGGOSA-N 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 1
- HPNMFZURTQLUMO-UHFFFAOYSA-N diethylamine Chemical compound CCNCC HPNMFZURTQLUMO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 229960000980 entecavir Drugs 0.000 description 1
- YXPVEXCTPGULBZ-WQYNNSOESA-N entecavir hydrate Chemical compound O.C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](CO)C1=C YXPVEXCTPGULBZ-WQYNNSOESA-N 0.000 description 1
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 1
- 230000005182 global health Effects 0.000 description 1
- 229940097043 glucuronic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000304 hepatotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000007686 hepatotoxicity Effects 0.000 description 1
- 230000001553 hepatotropic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012456 homogeneous solution Substances 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- XMBWDFGMSWQBCA-YPZZEJLDSA-N iodane Chemical compound [125IH] XMBWDFGMSWQBCA-YPZZEJLDSA-N 0.000 description 1
- 229940044173 iodine-125 Drugs 0.000 description 1
- 230000000155 isotopic effect Effects 0.000 description 1
- 229960001627 lamivudine Drugs 0.000 description 1
- JTEGQNOMFQHVDC-NKWVEPMBSA-N lamivudine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1O[C@@H](CO)SC1 JTEGQNOMFQHVDC-NKWVEPMBSA-N 0.000 description 1
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 1
- 230000003908 liver function Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- QARBMVPHQWIHKH-UHFFFAOYSA-N methanesulfonyl chloride Chemical compound CS(Cl)(=O)=O QARBMVPHQWIHKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QMPFMODFBNEYJH-UHFFFAOYSA-N methyl 1h-1,2,4-triazole-5-carboxylate Chemical compound COC(=O)C1=NC=NN1 QMPFMODFBNEYJH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XKBGEWXEAPTVCK-UHFFFAOYSA-M methyltrioctylammonium chloride Chemical compound [Cl-].CCCCCCCC[N+](C)(CCCCCCCC)CCCCCCCC XKBGEWXEAPTVCK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009437 off-target effect Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 239000012286 potassium permanganate Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000003762 quantitative reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000010898 silica gel chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical group 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 239000012312 sodium hydride Substances 0.000 description 1
- 229910000104 sodium hydride Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000010267 sodium hydrogen sulphite Nutrition 0.000 description 1
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 239000008247 solid mixture Substances 0.000 description 1
- 239000010421 standard material Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 229940014800 succinic anhydride Drugs 0.000 description 1
- 229960005311 telbivudine Drugs 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-CSMHCCOUSA-N telbivudine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@H]1O[C@@H](CO)[C@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-CSMHCCOUSA-N 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 1
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- ILJSQTXMGCGYMG-UHFFFAOYSA-N triacetic acid Chemical compound CC(=O)CC(=O)CC(O)=O ILJSQTXMGCGYMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ITMCEJHCFYSIIV-UHFFFAOYSA-N triflic acid Chemical compound OS(=O)(=O)C(F)(F)F ITMCEJHCFYSIIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052722 tritium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
- A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
- C12N15/1131—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
- C12N2310/315—Phosphorothioates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
- C12N2310/321—2'-O-R Modification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/33—Chemical structure of the base
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
- C12N2310/343—Spatial arrangement of the modifications having patterns, e.g. ==--==--==--
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/35—Nature of the modification
- C12N2310/351—Conjugate
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2320/00—Applications; Uses
- C12N2320/30—Special therapeutic applications
- C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Oncology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
본 발명은 리바비린 유도체로 임베디드된 이중-가닥 siRNA 유도체, 이를 포함하는 접합체와 이의 염 및 이의 용도를 제공한다. 상기 제공되는 이중-가닥 siRNA 유도체, 이를 포함하는 접합체 및 이의 염은 B형 간염 바이러스 DNA, pgRNA, S 항원 및 E 항원과 같은 다수의 바이러스 표지자를 효과적으로 억제할 수 있는데, 이는 B형 간염 치료를 위한 효과적이고 실현가능한 방법을 제공한다.
Description
본 출원은 2020.06.11 출원된 CN202010529520.7; 2020.12.21 출원된 CN202011524835.9; 2020.06.10 출원된 CN202010524584.8; 2020.12.04 출원된 PCT/CN2020/133982; 2020.06.10 출원된 CN202010522407.6 및 2020.12.21 출원된 CN202011524307.3을 우선권으로 청구한다.
본 발명은 생의학 분야에 속하고, r'-임베디드 siRNA 유도체, 이중-가닥 siRNA 유도체, 이를 포함하는 접합체와 이의 염 및 이의 용도에 관련된 것으로, 상세하게는, 상기 용도는 바이러스성 B형 간염 치료용 약제를 제조하기 위한 용도이다.
B형 간염으로 약칭되는 바이러스성 B형 간염은 B형 간염 바이러스(hepatitis B virus; HBV)의 신체 감염으로 인한 질병이다. B형 간염 바이러스는 간친화성 바이러스이고, 간세포에 주로 존재하며 간세포를 손상시켜, 간세포의 염증, 괴사 및 섬유화를 일으킨다. 바이러스성 B형 간염은 급성 및 만성으로 분류된다. 급성 B형 간염은 성인에서 대부분 자가 면역 메커니즘에 의해 스스로 치유될 수 있다. 하지만, 만성 B형 간염(chronic hepatitis B; CHB)은 세계적인 보건 의료에 큰 도전이 되고 있으며, 만성 간질환, 간경화 및 간암(hepatic carcinoma; HCC)의 주요 원인이다(Edward J. G., et al., The oral toll-like receptor-7 agonist GS-9620 in patients with chronic hepatitis B virus infection. Journal of Hepatology (2015); 63: 320-328). 전 세계적으로 20억 명의 사람이 CHB 바이러스에 감염되는 것으로 추산되며, 그 중 3억 5천만 명 이상이 B형 간염으로 진행되고, 매년 거의 600,000명의 사람이 CHB의 합병증으로 사망한다(Edward J. G., et al., The oral toll-like receptor 7 agonist GS-9620 in patients with chronic hepatitis B virus infection. Journal of Hepatology (2015)). 중국은 B형 간염 발병률이 높은 지역으로, B형 간염 환자가 많아 피해가 크다. 데이터에 따르면, 현재 중국에서 B형 간염 바이러스에 감염된 환자는 약 9,300만 명이며, 약 2천만 명의 환자가 만성 B형 간염으로 진단되는데, 이 중 10-20%는 간경화로 진행될 수 있고, 1-5%는 간암으로 진행될 수 있다고 나타난다(Zhang Chunhong, Application of interferon in the treatment of hepatitis B. Guide of China Medicine (2013); 11: 475-476).
B형 간염의 기능적 완치의 핵심은 HBsAg(B형 간염 표면 항원)의 제거 및 표면 항체의 생산이다. HBsAg 정량화는 매우 중요한 생물학적 표지자이다. 만성적으로 감염된 환자들에서, HBsAg 감소 및 혈청전환은 거의 관측되지 않는데, 이는 현재 치료의 종말점이다.
시장에서 현재 승인된 anti-HBV 약물은 주로 면역조절인자(인터페론-α 및 폴리에틸렌 글리콜 인터페론-α-2α) 및 항바이러스성 치료 약물(라미부딘, 아데포비르 디피복실, 엔테카비르, 텔비부딘, 테노포비르, 클레부딘 등)이다. 이들 중에서, 항바이러스성 치료 약물은 핵산 약물에 속하고, 이의 작용 기작은 HBV DNA의 합성을 억제하는 것이지만, HBsAg 수준을 직접적으로 감소시킬 수는 없다. 확장된 치료에서, 핵산 약물은 자연적으로 관측되는 것과 유사한 HBsAg 제거율을 나타낸다(Janssen et al., Lancet (2005), 365, 123-129; Marcellin et al., N. Engl.J.Med. (2004), 351, 1206-1217; Buster et al., Hepatology (2007), 46, 388-394).
임상에서 HBsAg를 감소시키기 위한 치료법이 있지만, 치료 효과는 좋지 않다. 이에, HBV의 발생 및 복제, 특히 HBsAg 및 HBeAg (B형 간염 S 항원 및 E 항원)의 생산을 차단하기 위하여, 유전자 수준에서 바이러스의 유전자 발현을 침묵시킬 수 있다면, 바이러스 대사 및 바이러스에 의한 간세포의 감염을 근본적으로 감소시킬 수 있다. RNA 간섭(RNA interference; RNAi) 기작에 기반한, 작은 간섭 RNA(Small interfering RNA; siRNA)는 서열-특이적 방식으로 표적 유전자의 발현을 억제하거나 차단시킬 수 있고, mRNA의 단백질로의 번역에 있어 억제 효과를 수행할 수 있는데, 이로 인해 질병 치료 목적을 달성할 수 있다(WO2016077321, WO2018195165). B형 간염에 대한 가장 이상적인 치료 수단과 관련하여, 대사 안정성을 향상시키기 위한, siRNA의 안정화된 변형 및 표적 기관 및 세포에 대해 상응하는 보조 전달 시스템이 필요하지만, 현재 siRNA는 B형 간염 바이러스 S 항원 및 E 항원의 함량을 효과적으로 감소시킬 수 없다.
한편, siRNA는 특정 mRNA 단편과 부분적으로 상보적인 결합을 통해 mRNA에 해당하는 유전자의 발현을 조절하는 역할을 수행한다. 특히, siRNA의 안티센스 가닥의 5' 말단에서 발단(seed) 영역과 비-표적 유전자와의 상보적인 결합은 유전자 발현을 부분적으로 또는 완전히 침묵시키고, 이러한 현상은 생체 내(in vivo) 및 시험관 내(in vitro) siRNA의 오프-표적 효과의 주요 원인이다(Jackson et al., RNA (2006), 12, 1179-1187). B형 간염을 치료하기 위한 siRNAs는 임상 및 전임상 단계에서 모두 이러한 단점을 보인다(WO2020036862). 비록 뉴클레오티드의 몇몇 변형을 통해 오프-표적의 위험성이 감소될 수 있지만(Iribe et al., ACS Omega (2017), 2, 2055-2064; Janas et al., Nat. Commun . 2018, 9, 723-732), 침묵의 효율성도 또한 감소되고, 치료 안정성 범위도 여전히 개선되어야 한다.
본 발명은 리바비린 유도체로 임베디드된 이중-가닥 siRNA 유도체, 이를 포함하는 접합체와 이의 염 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 이중-가닥 siRNA 유도체, 이를 포함하는 접합체 및 이의 염은 B형 간염 바이러스 DNA, S 항원 및 E 항원과 같은 다수의 바이러스 표지자를 효과적으로 억제할 수 있고, 만성 B형 간염과 같은 B형 간염 치료(예를 들면, 기능적 완치)를 위한 효과적이고 실현가능한 수단을 제공한다.
이에, 제1의 양상에 있어서, 본 발명은 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하며, 상기 안티센스 가닥은 하기 r을 갖는 서열번호 2로 표시되는 서열에서 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드 잔기가 치환된 서열을 포함하는, 이중-가닥 siRNA 유도체를 제공하고,
상기 siRNA 유도체에서 상기 뉴클레오티드 및 상기 r은 각각 독립적으로 변형되거나 변형되지 않을 수 있다.
몇몇 실시예에 있어서, 상기 siRNA 유도체에서 상기 뉴클레오티드 및 r은 하나 또는 그 이상이 변형되는 반면, 다른 뉴클레오티드 및 r은 변형되지 않는다. 예를 들면, 상기 변형은 메톡시 변형, 플루오로 변형, 포스포로티오에이트 결합, (S)-글리세롤 핵산으로 뉴클레오티드 치환 등을 포함한다.
몇몇 실시예에 있어서, 상기 siRNA 유도체에서 상기 뉴클레오티드 및 r은 하나 또는 그 이상이 변형되는 반면, 다른 뉴클레오티드 및 r은 변형되지 않는다. 예를 들면, 상기 변형은 메톡시 변형, 플루오로 변형, 포스포로티오에이트 결합, (S)-글리세롤 핵산으로 뉴클레오티드 치환, (E)-비닐 포스페이트로 뉴클레오티드 치환 등을 포함한다.
몇몇 실시예에 있어서, 실질적으로, 상기 siRNA 유도체에서 상기 뉴클레오티드 및 r은 모두 변형된다. 몇몇 실시예에 있어서, 상기 siRNA 유도체에서 상기 뉴클레오티드 및 r은 모두 변형된다.
몇몇 실시예에 있어서, 상기 이중-가닥 siRNA 유도체에서 상기 뉴클레오티드 및 r의 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 또는 그 이상이 변형된다. 몇몇 실시예에 있어서, 상기 이중-가닥 siRNA 유도체에서 상기 뉴클레오티드 및 r은 모두 변형된다.
몇몇 실시예에 있어서, 상기 서열번호 2는 5' 말단 및/또는 3' 말단에 돌출부(overhang)를 임의로 포함한다. 몇몇 실시예에 있어서, 상기 서열번호 2는 5' 말단 및/또는 3' 말단에 0, 1, 2, 3, 4 또는 5의 뉴클레오티드 돌출부(overhang)를 포함한다.
몇몇 실시예에 있어서, 상기 서열번호 2가 5' 말단 및/또는 3' 말단에 2개의 뉴클레오티드 돌출부(overhang)를 포함하면, 말단에서 3개의 뉴클레오티드 사이에 임의로 2개의 포스포로티오에이트가 결합되는데, 상기 3개의 뉴클레오티드 중 2개는 돌출부(overhang)이고, 다른 1개의 뉴클레오티드는 상기 돌출부(overhang)에 인접한 결합 뉴클레오티드이다. 몇몇 실시예에 있어서, 바람직하게는, 상기 돌출부(overhang)는 변형되거나 변형되지 않은 UU로부터 선택된다. 몇몇 실시예에 있어서, 바람직하게는, 상기 돌출부(overhang)는 uu로부터 선택된다. 몇몇 실시예에 있어서, 돌출부(overhang) uu 및 상기에 인접한 1개의 결합 뉴클레오티드 사이에 2개의 포스포로티오에이트가 결합된다.
몇몇 실시예에 있어서, 상기 서열번호 2는 3' 말단에 돌출부(overhang)를 포함하고, 바람직하게는, 상기 돌출부(overhang)는 변형되거나 변형되지 않은 UU로부터 선택된다. 몇몇 실시예에 있어서, 상기 서열번호 2는 3' 말단에 돌출부(overhang)를 포함하고, 바람직하게는, 상기 돌출부(overhang)는 uu로부터 선택된다. 몇몇 실시예에 있어서, 상기 서열번호 2는 3' 말단에 돌출부(overhang)를 포함하고, 돌출부(overhang) uu 및 상기에 인접한 1개의 결합 뉴클레오티드 사이에 2개의 포스포로티오에이트가 결합된다(e.g., c·u·u).
몇몇 실시예에 있어서, 상기 이중-가닥 siRNA 유도체에서 상기 안티센스 가닥은 r을 갖는 서열번호 2로 표시되는 서열에서 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드 잔기가 치환된 서열을 포함한다. 예를 들면, 상기 안티센스 가닥은 r을 갖는 서열번호 2로 표시되는 서열에서 하나의 뉴클레오티드 잔기가 치환된 서열을 포함한다.
몇몇 실시예에 있어서, 상기 이중-가닥 siRNA 유도체에서 상기 안티센스 가닥은 r을 갖는 서열번호 2로 표시되는 서열에서 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드 잔기가 치환된 서열을 포함한다. 예를 들면, 상기 안티센스 가닥은 r을 갖는 서열번호 2로 표시되는 서열에서 하나, 둘, 셋, 넷 또는 다섯의 뉴클레오티드 잔기가 치환된 서열을 포함한다.
몇몇 실시예에 있어서, 상기 이중-가닥 siRNA 유도체에서 상기 안티센스 가닥은 r을 갖는 서열번호 2로 표시되는 서열에서 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드 잔기가 치환된 서열을 포함하고, 상기 r의 치환은 서열번호 2의 임의의 위치에서 일어난다. 바람직하게는, 상기 r의 치환은 서열번호 2의 5' 말단의 위치 1 내지 21 또는 1 내지 19에서 일어난다. 예를 들면, 상기 r의 치환은 서열번호 2의 5' 말단의 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 21에서 일어난다. 바람직하게는, 상기 r의 치환은 서열번호 2의 5' 말단의 위치 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 11, 12, 16 또는 18에서 일어난다.
몇몇 실시예에 있어서, 상기 이중-가닥 siRNA 유도체에서 상기 안티센스 가닥은 서열번호 4 또는 서열번호 17, 서열번호 6 또는 서열번호 19, 서열번호 7 또는 서열번호 20, 서열번호 8 또는 서열번호 21, 서열번호 9 또는 서열번호 22, 서열번호 10 또는 서열번호 23, 서열번호 11 또는 서열번호 24, 서열번호 29 또는 서열번호 33, 서열번호 30 또는 서열번호 34, 서열번호 31 또는 서열번호 35 또는 서열번호 32 또는 서열번호 36으로 표시되는 서열을 포함하거나 구성한다. 몇몇 실시예에 있어서, 상기 서열은 메톡시 변형, 플루오로 변형, 포스포로티오에이트 결합, (S)-글리세롤 핵산으로 뉴클레오티드 치환 등과 같은 추가적인 뉴클레오티드 변형을 포함한다.
몇몇 실시예에 있어서, 상기 이중-가닥 siRNA 유도체에서 상기 안티센스 가닥은 서열번호 4 또는 서열번호 17, 서열번호 6 또는 서열번호 19, 서열번호 7 또는 서열번호 20, 서열번호 8 또는 서열번호 21, 서열번호 9 또는 서열번호 22, 서열번호 10 또는 서열번호 23, 서열번호 11 또는 서열번호 24, 서열번호 29 또는 서열번호 33, 서열번호 30 또는 서열번호 34, 서열번호 31 또는 서열번호 35, 서열번호 32 또는 서열번호 36, 서열번호 39 또는 서열번호 44, 서열번호 10 또는 서열번호 45, 서열번호 40 또는 서열번호 46, 서열번호 10 또는 서열번호 47, 또는 서열번호 10 또는 서열번호 48로 표시되는 서열을 포함하거나 구성한다. 몇몇 실시예에 있어서, 상기 서열은 메톡시 변형, 플루오로 변형, 포스포로티오에이트 결합, (S)-글리세롤 핵산으로 뉴클레오티드 치환 또는 (E)-비닐 포스페이트로 뉴클레오티드 치환 등과 같은 추가적인 뉴클레오티드 변형을 포함한다.
몇몇 실시예에 있어서, 상기 이중-가닥 siRNA 유도체에서 센스 가닥은 서열번호 1 또는 서열번호 28로 표시되는 서열을 포함하거나 구성한다.
몇몇 실시예에 있어서, 상기 이중-가닥 siRNA 유도체에서 센스 가닥은 r을 갖는 서열번호 1로 표시되는 서열에서 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드 잔기가 치환된 서열을 포함한다. 예를 들면, 상기 센스 가닥은 r을 갖는 서열번호 1로 표시되는 서열에서 하나의 뉴클레오티드 잔기가 치환된 서열을 포함한다.
몇몇 실시예에 있어서, 상기 이중-가닥 siRNA 유도체에서 센스 가닥은 r을 갖는 서열번호 1로 표시되는 서열에서 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드 잔기가 치환된 서열을 포함한다. 예를 들면, 상기 센스 가닥은 r을 갖는 서열번호 1로 표시되는 서열에서 1, 2, 3, 4 또는 5의 뉴클레오티드 잔기가 치환된 서열을 포함한다.
몇몇 실시예에 있어서, 상기 이중-가닥 siRNA 유도체에서 센스 가닥은 r을 갖는 서열번호 1로 표시되는 서열에서 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드 잔기가 치환된 서열을 포함하고, 상기 r의 치환은 서열번호 1의 5' 말단의 위치 1 내지 19에서 일어난다. 예를 들면, 상기 r의 치환은 서열번호 1의 5' 말단의 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 또는 19에서 일어난다. 바람직하게는, 상기 r의 치환은 서열번호 1의 5' 말단의 위치 2, 3, 7, 12, 15, 17 또는 19에서 일어난다.
몇몇 실시예에 있어서, 상기 이중-가닥 siRNA 유도체에서 센스 가닥은 서열번호 5 또는 서열번호 18, 서열번호 3 또는 서열번호 16, 서열번호 14 또는 서열번호 27, 서열번호 13 또는 서열번호 26 또는 서열번호 12 또는 서열번호 25로 표시되는 서열을 포함하거나 구성한다. 몇몇 실시예에 있어서, 상기 서열은 메톡시 변형, 플루오로 변형 또는 포스포로티오에이트 결합 등과 같은 추가적인 뉴클레오티드 변형을 포함한다.
몇몇 실시예에 있어서, 상기 이중-가닥 siRNA 유도체에서 센스 가닥은 서열번호 5 또는 서열번호 18, 서열번호 3 또는 서열번호 16, 서열번호 14 또는 서열번호 27, 서열번호 13 또는 서열번호 26, 서열번호 12 또는 서열번호 25, 서열번호 37 또는 서열번호 42, 또는 서열번호 38 또는 서열번호 43으로 표시되는 서열을 포함하거나 구성한다. 몇몇 실시예에 있어서, 상기 서열은 메톡시 변형, 플루오로 변형, 포스포로티오에이트 결합, (S)-글리세롤 핵산으로 뉴클레오티드 치환 또는 (E)-비닐 포스페이트로 뉴클레오티드 치환 등과 같은 추가적인 뉴클레오티드 변형을 포함한다.
몇몇 특정 실시예에 있어서, 상기 이중-가닥 siRNA 유도체에서 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 서열번호 2의 안티센스 가닥으로 표시되는 서열 세트(서열번호 2의 5' 말단의 위치 2에서 일어나는 r의 치환) 및 서열번호 1의 센스 가닥으로 표시되는 서열 세트(5' 말단의 위치 7에서 일어나는 r의 치환)과 같은, r을 갖는 서열에서 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드 잔기가 치환된 서열을 포함한다.
몇몇 실시예에 있어서, 상기 이중-가닥 siRNA 유도체는 하기 S18-S28 중 어느 하나로서:
S18: 상기 센스 가닥은 서열번호 1 또는 서열번호 28이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 4 또는 서열번호 17이며,
S19: 상기 센스 가닥은 서열번호 1 또는 서열번호 28이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 6 또는 서열번호 19이며,
S20: 상기 센스 가닥은 서열번호 1 또는 서열번호 28이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 7 또는 서열번호 20이며,
S21: 상기 센스 가닥은 서열번호 1 또는 서열번호 28이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 8 또는 서열번호 21이며,
S22: 상기 센스 가닥은 서열번호 1 또는 서열번호 28이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 9 또는 서열번호 22이며,
S23: 상기 센스 가닥은 서열번호 1 또는 서열번호 28이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 10 또는 서열번호 23이며,
S24: 상기 센스 가닥은 서열번호 1 또는 서열번호 28이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 11 또는 서열번호 24이며,
S25: 상기 센스 가닥은 서열번호 1 또는 서열번호 28이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 29 또는 서열번호 33이며,
S26: 상기 센스 가닥은 서열번호 1 또는 서열번호 28이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 30 또는 서열번호 34이며,
S27: 상기 센스 가닥은 서열번호 1 또는 서열번호 28이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 31 또는 서열번호 35이며,
S28: 상기 센스 가닥은 서열번호 1 또는 서열번호 28이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 32 또는 서열번호 36이다.
몇몇 실시예에 있어서, 상기 이중-가닥 siRNA 유도체는 하기 S1-S17 중 어느 하나로서:
S1: 상기 센스 가닥은 서열번호 3 또는 서열번호 16이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 4 또는 서열번호 17이며,
S2: 상기 센스 가닥은 서열번호 5 또는 서열번호 18이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 4 또는 서열번호 17이며,
S3: 상기 센스 가닥은 서열번호 3 또는 서열번호 16이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 6 또는 서열번호 19이며,
S4: 상기 센스 가닥은 서열번호 5 또는 서열번호 18이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 6 또는 서열번호 19이며,
S5: 상기 센스 가닥은 서열번호 3 또는 서열번호 16이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 7 또는 서열번호 20이며,
S6: 상기 센스 가닥은 서열번호 5 또는 서열번호 18이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 7 또는 서열번호 20이며,
S7: 상기 센스 가닥은 서열번호 3 또는 서열번호 16이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 8 또는 서열번호 21이며,
S8: 상기 센스 가닥은 서열번호 5 또는 서열번호 18이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 8 또는 서열번호 21이며,
S9: 상기 센스 가닥은 서열번호 3 또는 서열번호 16이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 9 또는 서열번호 22이며,
S10: 상기 센스 가닥은 서열번호 5 또는 서열번호 18이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 9 또는 서열번호 22이며,
S11: 상기 센스 가닥은 서열번호 3 또는 서열번호 16이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 10 또는 서열번호 23이며,
S12: 상기 센스 가닥은 서열번호 5 또는 서열번호 18이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 10 또는 서열번호 23이며,
S13: 상기 센스 가닥은 서열번호 3 또는 서열번호 16이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 11 또는 서열번호 24이며,
S14: 상기 센스 가닥은 서열번호 5 또는 서열번호 18이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 11 또는 서열번호 24이며,
S15: 상기 센스 가닥은 서열번호 12 또는 서열번호 25이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 4 또는 서열번호 17이며,
S16: 상기 센스 가닥은 서열번호 13 또는 서열번호 26이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 4 또는 서열번호 17이며,
S17: 상기 센스 가닥은 서열번호 14 또는 서열번호 27이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 4 또는 서열번호 17이다.
몇몇 실시예에 있어서, 상기 이중-가닥 siRNA 유도체는 하기 S29-S35 중 어느 하나로서:
S29: 상기 센스 가닥은 서열번호 37 또는 서열번호 42이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 10 또는 서열번호 23이며,
S30: 상기 센스 가닥은 서열번호 38 또는 서열번호 43이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 10 또는 서열번호 23이며,
S31: 상기 센스 가닥은 서열번호 3 또는 서열번호 16이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 39 또는 서열번호 44이며,
S32: 상기 센스 가닥은 서열번호 3 또는 서열번호 16이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 10 또는 서열번호 45이며,
S33: 상기 센스 가닥은 서열번호 3 또는 서열번호 16이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 40 또는 서열번호 46이며,
S34: 상기 센스 가닥은 서열번호 3 또는 서열번호 16이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 10 또는 서열번호 47이며,
S35: 상기 센스 가닥은 서열번호 3 또는 서열번호 16이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 10 또는 서열번호 48이다.
몇몇 실시예에 있어서, 상기 이중-가닥 siRNA 유도체는 다음으로부터 선택된다: 상기 센스 가닥은 서열번호 3이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 4이며, 상기 센스 가닥은 서열번호 5이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 4이며, 상기 센스 가닥은 서열번호 3이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 6이며, 상기 센스 가닥은 서열번호 5이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 6이며, 상기 센스 가닥은 서열번호 3이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 7이며, 상기 센스 가닥은 서열번호 5이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 7이며, 상기 센스 가닥은 서열번호 3이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 8이며, 상기 센스 가닥은 서열번호 5이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 8이며, 상기 센스 가닥은 서열번호 3이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 9이며, 상기 센스 가닥은 서열번호 5이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 9이며, 상기 센스 가닥은 서열번호 3이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 10이며, 상기 센스 가닥은 서열번호 5이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 10이며, 상기 센스 가닥은 서열번호 3이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 11이며, 상기 센스 가닥은 서열번호 5이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 11이며, 상기 센스 가닥은 서열번호 12이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 4이며, 상기 센스 가닥은 서열번호 13이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 4이며, 상기 센스 가닥은 서열번호 14이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 4이며, 상기 센스 가닥은 서열번호 1이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 4이며, 상기 센스 가닥은 서열번호 1이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 6이며, 상기 센스 가닥은 서열번호 1이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 7이며, 상기 센스 가닥은 서열번호 1이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 8이며, 상기 센스 가닥은 서열번호 1이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 9이며, 상기 센스 가닥은 서열번호 1이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 10이며, 상기 센스 가닥은 서열번호 1이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 11이며, 상기 센스 가닥은 서열번호 1이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 29이며, 상기 센스 가닥은 서열번호 1이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 30이며, 상기 센스 가닥은 서열번호 1이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 31이며, 상기 센스 가닥은 서열번호 1이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 32이며, 상기 센스 가닥은 서열번호 37이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 10이며, 상기 센스 가닥은 서열번호 38이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 10이며, 상기 센스 가닥은 서열번호 3이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 39이며, 상기 센스 가닥은 서열번호 3이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 10이며, 상기 센스 가닥은 서열번호 3이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 40이며, 상기 이중-가닥 siRNA 유도체에서 상기 뉴클레오티드 및 r은 각각 독립적으로 변형되거나 변형되지 않는다.
몇몇 실시예에 있어서, 상기 이중-가닥 siRNA 유도체는 다음으로부터 선택된다:
상기 이중-가닥 siRNA 유도체에서 상기 뉴클레오티드 및 r은 각각 독립적으로 변형되거나 변형되지 않는다.
몇몇 실시예에 있어서, 상기 이중-가닥 siRNA 유도체는 다음으로부터 선택된다: 상기 센스 가닥은 서열번호 16이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 17이며, 상기 센스 가닥은 서열번호 18이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 17이며, 상기 센스 가닥은 서열번호 16이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 19이며, 상기 센스 가닥은 서열번호 18이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 19이며, 상기 센스 가닥은 서열번호 16이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 20이며, 상기 센스 가닥은 서열번호 18이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 20이며, 상기 센스 가닥은 서열번호 16이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 21이며, 상기 센스 가닥은 서열번호 18이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 21이며, 상기 센스 가닥은 서열번호 16이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 22이며, 상기 센스 가닥은 서열번호 18이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 22이며, 상기 센스 가닥은 서열번호 16이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 23이며, 상기 센스 가닥은 서열번호 18이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 23이며, 상기 센스 가닥은 서열번호 16이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 24이며, 상기 센스 가닥은 서열번호 18이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 24이며, 상기 센스 가닥은 서열번호 25이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 17이며, 상기 센스 가닥은 서열번호 26이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 17이며, 상기 센스 가닥은 서열번호 27이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 17이며, 상기 센스 가닥은 서열번호 28이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 17이며, 상기 센스 가닥은 서열번호 28이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 19이며, 상기 센스 가닥은 서열번호 28이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 20이며, 상기 센스 가닥은 서열번호 28이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 21이며, 상기 센스 가닥은 서열번호 28이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 22이며, 상기 센스 가닥은 서열번호 28이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 23이며, 상기 센스 가닥은 서열번호 28이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 24이며, 상기 센스 가닥은 서열번호 28이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 33이며, 상기 센스 가닥은 서열번호 28이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 34이며, 상기 센스 가닥은 서열번호 28이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 35이며, 상기 센스 가닥은 서열번호 28이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 36이며, 상기 센스 가닥은 서열번호 42이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 23이며, 상기 센스 가닥은 서열번호 43이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 23이며, 상기 센스 가닥은 서열번호 16이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 44이며, 상기 센스 가닥은 서열번호 16이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 45이며, 상기 센스 가닥은 서열번호 16이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 46이며, 상기 센스 가닥은 서열번호 16이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 47이며, 상기 센스 가닥은 서열번호 16이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 48이다.
몇몇 실시예에 있어서, 상기 이중-가닥 siRNA 유도체는 다음으로부터 선택된다:
제2의 양상에 있어서, 본 발명은 이중-가닥 siRNA 유도체의 접합체를 제공하는데, 이는 본 발명의 제1의 양상에 따른 이중-가닥 siRNA 유도체 및 상기 이중-가닥 siRNA 유도체에 접합된 약학적으로 허용가능한 접합체 그룹을 포함한다.
몇몇 실시예에 있어서, 상기 이중-가닥 siRNA 유도체의 접합체에서 상기 약학적으로 허용가능한 접합체 그룹은 1 내지 5의 GalNAc (N-아세틸갈락토사민) 그룹을 포함한다. 바람직하게는, 상기 약학적으로 허용가능한 접합체 그룹은 1, 2, 3, 4 또는 5의 GalNAc 그룹을 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 약학적으로 허용가능한 접합체 그룹은 3 또는 4의 GalNAc 그룹을 포함한다.
몇몇 실시예에 있어서, 상기 이중-가닥 siRNA 유도체의 접합체에서 상기 약학적으로 허용가능한 접합체 그룹은 하기 화합물 그룹 D를 포함한다.
몇몇 실시예에 있어서, 상기 이중-가닥 siRNA 유도체의 접합체에서 상기 약학적으로 허용가능한 접합체 그룹은 상기 이중-가닥 siRNA 유도체의 센스 가닥의 3' 말단에 결합된다.
몇몇 실시예에 있어서, 상기 이중-가닥 siRNA 유도체 또는 상기 이중-가닥 siRNA 유도체의 접합체의 포스포로티오에이트 부분은 (R)- 및 (S)-거울상 이성질체(enantiomers), 부분입체 이성질체(diastereoisomers) 및/또는 이들의 라세미(racemic) 혼합물을 포함한다.
몇몇 실시예에 있어서, 상기 이중-가닥 siRNA 유도체의 접합체는 다음으로부터 선택된다:
D는 상기의 기재와 같다.
제3의 양상에 있어서, 본 발명은 본 발명의 제1의 양상에 따른 이중-가닥 siRNA 유도체 또는 본 발명의 제2의 양상에 따른 이중-가닥 siRNA 유도체의 접합체의 염을 제공한다.
몇몇 실시예에 있어서, 상기에 언급된 염은 염기 부가염, 산 부가염 및 이들의 조합으로부터 선택된다.
몇몇 실시예에 있어서, 상기 염기 부가염은 나트륨, 칼륨, 칼슘, 암모늄, 유기 아민, 마그네슘 염 및 이들의 조합으로부터 선택되고, 상기 산 부가염은 무기산 유래 염, 유기산 유래 염 및 이들의 조합으로부터 선택된다.
몇몇 실시예에 있어서, 상기 무기산은 염산, 브롬화수소산, 질산, 탄산, 중탄산염 라디칼, 인산, 인산일수소, 인산이수소, 황산, 황산수소, 요오드화수소산, 아인산 및 이들의 조합으로부터 선택되며, 상기 유기산은 아세트산, 프로피온산, 이소부틸산, 말레산, 말론산, 벤조산, 석신산, 수베르산, 푸마르산, 락트산, 만델산, 프탈산, 벤젠설폰산, p-톨루엔설폰산, 시트르산, 타르타르산, 메탄설폰산 및 이들의 조합으로부터 선택된다.
제4의 양상에 있어서, 본 발명은 약학 조성물을 제공하는데, 이는 본 발명의 제1의 양상에 따른 이중-가닥 siRNA 유도체, 본 발명의 제2의 양상에 따른 이중-가닥 siRNA 유도체의 접합체 또는 본 발명의 제3의 양상에 따른 염; 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함한다.
제5의 양상에 있어서, 본 발명은 본 발명의 제1의 양상에 따른 이중-가닥 siRNA 유도체, 본 발명의 제2의 양상에 따른 이중-가닥 siRNA 유도체의 접합체, 본 발명의 제3의 양상에 따른 염 또는 본 발명의 제4의 양상에 따른 약학 조성물의 B형 간염 치료용 약제를 제조하기 위한 용도를 제공한다.
몇몇 실시예에 있어서, 본 발명은 본 발명의 제1의 양상에 따른 이중-가닥 siRNA 유도체, 본 발명의 제2의 양상에 따른 이중-가닥 siRNA 유도체의 접합체, 본 발명의 제3의 양상에 따른 염 또는 본 발명의 제4의 양상에 따른 약학 조성물을 제공하는데, 이는 개체에서 B형 간염을 치료하기 위해 사용된다.
제6의 양상에 있어서, 본 발명은 개체에서 바이러스성 B형 간염을 치료하는 방법을 제공하는데, 이는 본 발명의 제1의 양상에 따른 이중-가닥 siRNA 유도체, 본 발명의 제2의 양상에 따른 이중-가닥 siRNA 유도체의 접합체, 본 발명의 제3의 양상에 따른 염 또는 본 발명의 제4의 양상에 따른 약학 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다.
제7의 양상에 있어서, 본 발명은 개체에서 B형 간염을 치료하는데 사용하기 위한, 본 발명의 제1의 양상에 따른 이중-가닥 siRNA 유도체, 본 발명의 제2의 양상에 따른 이중-가닥 siRNA 유도체의 접합체, 본 발명의 제3의 양상에 따른 염 또는 본 발명의 제4의 양상에 따른 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 몇몇 실시예에 있어서, B형 간염은 급성 B형 간염, 만성 B형 간염 또는 B형 간염 바이러스 감염으로 인한 간경화 또는 간암과 같은 질병의 어떠한 단계일 수 있다. 몇몇 실시예에 있어서, 상기 B형 간염은 만성 B형 간염이다.
정의 및 용어
달리 명시되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 다음의 용어 및 구문은 다음과 같은 의미를 갖는 것으로 해석된다. 특별히 달리 정의되지 않는 한, 특정 용어 또는 구문은 불확실 또는 불명확한 것으로 간주되어서는 안되며, 해당 분야의 통상의 기술자가 이해하는 의미에 따라 해석되어야 한다. 본 명세서에서 상표명을 언급할 때, 이는 상응하는 상품 또는 활성 성분을 언급하는 것으로 해석된다.
본 발명에 있어서, 달리 명시되지 않는 한, 용어 "포함하다(comprise)", "포함하다(comprises)" 및 "포함하는(comprising)" 또는 이들의 동등물은 제한이 없는 표현으로서, 특정되지 않은 요소, 구성성분 또는 단계가 열거된 것 외에도 포함될 수 있음을 의미한다.
본 발명에 있어서, HBV 유전자는 Genbank Accession No. NC_003977.1의 DNA 서열을 갖는 유전자를 지칭한다. Genbank Accession No. NC_003977.1의 유전자는 HBV의 전체 게놈이다.
몇몇 실시예에 있어서, 이중-가닥 siRNA 유도체는 HBV의 X 오픈 리딩 프레임(X opening reading frame; X ORF)을 표적으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 이중-가닥 siRNA 유도체는 리보뉴클레익산 분자의 복합체를 지칭한다. 이는 이중-가닥 구조를 갖고, 2개의 역평행 및 실질적으로 상보적인 핵산 가닥을 포함하며, 표적 RNA에 대한 "센스" 및 "안티센스" 방향을 갖는다. 본 발명에 있어서, "상보적인"은 당해 기술분야에서 잘 알려진 의미를 갖는다. 즉, 이중-가닥 핵산 분자에서 한 가닥의 염기들은 다른 가닥의 염기들과 상보적인 방식으로 결합한다. 퓨린 염기 아데닌(adenine; A)은 피리미딘 염기 우라실(uracil; U)과 항상 결합하고; 퓨린 염기 구아닌(guanine; C)은 피리미딘 염기 시토신(cytosine; G)과 항상 결합한다. 각 염기쌍은 퓨린 및 피리미딘을 포함한다. 한 가닥 상의 아데닌은 다른 가닥 상의 우라실과 항상 결합하고, 구아닌은 시토신과 항상 결합하며, 상기 두 가닥은 서로 상보적으로 간주되고, 상기 가닥의 서열은 그의 상보적 가닥의 서열로부터 추정될 수 있다.
본 발명에 있어서, 달리 특정되지 않는 한, 대문자 C, G, U 및 A는 뉴클레오티드의 염기 조성물을 나타낸다. 소문자 c, g, u 및 a는 메톡시 변형을 가진 해당 대문자로 표시되는 뉴클레오티드를 나타내고; 밑줄 _은 플루오로 변형을 가진 대문자로 표시되는 뉴클레오티드를 나타내고; 중간 점 "·"은 중간 점 "·"의 왼쪽 및 오른쪽 측면에 인접한 2개의 뉴클레오티드 잔기 사이에 포스포로티오에이트 결합이 일어남을 나타내고; VP는 VP 글자의 오른쪽에 있는 하나의 뉴클레오티드가 (E)-비닐 포스페이트 변형된 뉴클레오티드라는 것을 나타낸다. 예를 들면, "a·g"는 a 및 g 잔기가 포스포로티오에이트 그룹에 의해 결합된다는 것을 나타낸다.
본 발명에서 언급된 뉴클레오티드의 "변형"은 메톡시 변형, 플루오로 변형, (E)-비닐 포스페이트 변형, 포스포로티오에이트 결합, (S)-글리세롤 핵산으로 뉴클레오티드 치환 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서 언급된 서열은 아래 표 1의 "추가 변형 서열"로 나열된 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에 기재된 플루오로-변형된 뉴클레오티드는 리보오스 그룹의 2'-하이드록실이 플루오로로 치환된 뉴클레오티드를 지칭하고, 메톡시-변형된 뉴클레오티드는 리보오스 그룹의 2'-하이드록실이 메톡시로 치환된 뉴클레오티드를 지칭한다.
본 발명에 기재된 (E)-비닐 포스페이트 변형된 뉴클레오티드는 다음의 구조적 유닛을 나타낸다:
상기에서 E는 
, 
, 
, 
및 
으로부터 선택되고;
X는 OCH3 및 F로부터 선택된다.
본 발명에 기재된 (S)-글리세롤 핵산 (Agn)은 다음의 구조적 유닛을 나타낸다:
(Agn) 및 다른 뉴클레오티드 잔기는 서로 포스페이트 또는 포스포로티오에이트에 의해 결합되어 있다. 예를 들면, "a·(Agn)"은 a 및 (Agn) 잔기가 포스포로티오에이트에 의해 결합되는 것을 나타내고, "a(Agn)"은 a 및 (Agn) 잔기가 포스페이트에 의해 결합되는 것을 나타낸다.
몇몇 실시예에 있어서, 상기 이중-가닥 siRNA 유도체는 센스 가닥 또는 r'-임베디드 센스 가닥 및 r'-임베디드 안티센스 가닥을 포함한다. 상기 센스 가닥, r'-임베디드 센스 가닥 및 r'-임베디드 안티센스 가닥은 각각 염기 구조 유닛으로 뉴클레오티드 그룹을 포함한다. 본 명세서에 자세히 기재되지 않아도, 뉴클레오티드 그룹이 포스페이트 그룹, 리보오스 그룹 및 염기를 포함한다는 점은 당해 기술분야에서 잘 알려져 있다.
본 발명에 기재된 r'-임베디드 서열은 적어도 하나의 뉴클레오티드 잔기가 r에 결합된 서열을 지칭하는데, 이는 r을 갖는 서열(e.g., 서열번호 2)에서 하나의 뉴클레오티드 잔기가 치환된 서열을 포함한다. 본 발명에 기재된 r'-임베디드 서열은 r'-임베디드 이중-가닥 siRNA, r'-임베디드 센스 가닥 및 r'-임베디드 안티센스 가닥을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들면, 5'-aGUrrA·C-3', 5'-rGgAAC-3' 및 5'-AG·UrAAcCuCr-3' 은 모두 r'-임베드먼트이다.
본 발명에 기재된 r'-임베디드 이중-가닥 siRNA는 적어도 하나의 뉴클레오티드 잔기가 r에 결합된 이중-가닥 siRNA를 지칭하는데, 이는 r을 갖는 이중-가닥 siRNA 서열에서 하나의 뉴클레오티드 잔기가 치환된 이중-가닥 siRNA를 포함한다. 본 발명에 기재된 r'-임베디드 센스 가닥은 적어도 하나의 뉴클레오티드 잔기가 r에 결합된 센스 가닥을 지칭하는데, 이는 r을 갖는 센스 가닥에서 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드 치환을 포함한다. 본 발명에 기재된 r'-임베디드 안티센스 가닥은 적어도 하나의 뉴클레오티드 잔기가 r에 결합된 안티센스 가닥을 지칭하는데, 이는 r을 갖는 안티센스 가닥에서 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드 치환을 포함한다.
본 발명에 기재된 r'는 
이다(여기에서, X는 SH 및 OH로부터 선택된다). 이는 천연 뉴클레오티드 염기의 유도체이고, 개시된 어떠한 천연 뉴클레오티드 염기와는 다르며, 상기 핵산 서열의 도입은 예상치 못한 활성을 가져온다.
본 발명에 기재된 r은 아래의 구조 유닛을 나타낸다.
r 및 다른 뉴클레오티드 잔기는 서로 포스페이트 또는 포스포로티오에이트에 의해 결합되어 있다. 예를 들면, "a·r"은 a 및 r 잔기가 포스포로티오에이트에 의해 결합되는 것을 나타내고, "ar"은 a 및 r 잔기가 포스페이트에 의해 결합되는 것을 나타낸다.
본 발명에 기재된 "다수의"는 2 또는 그 이상의 정수를 지칭하는데, 상기 siRNA 유도체의 이론적 상한까지인 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 이중-가닥 siRNA 유도체의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥은 RNA 이중 나선에 직접 포함되지 않은 비결합 돌출된 뉴클레오티드와 같은 "돌출부(overhang)"도 역시 포함할 수 있는데, 본 명세서에서 정의된 대로, 상기 RNA 이중 나선은 전형적으로 "센스 가닥" 및 "안티센스 가닥" 결합을 통해 형성된다. 상기 돌출부는 하나 또는 그 이상의 변형된 또는 변형되지 않은 U, T 및 A를 포함할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 2는 변형된 또는 변형되지 않은 UU 돌출부를 5' 및/또는 3' 말단에 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 이중-가닥 siRNA 유도체의 접합체는 이중-가닥 siRNA 유도체 및 약학적으로 허용가능한 접합체 그룹의 결합에 의해 형성되는 화합물이고, 상기 이중-가닥 siRNA 유도체 및 약학적으로 허용가능한 접합체 그룹은 공유 결합된다.
본 발명에 있어서, 상기 약학적으로 허용가능한 접합체 그룹은 상기 이중-가닥 siRNA 유도체의 센스 가닥 또는 r'-임베디드 센스 가닥의 3' 말단에 결합할 수 있다.
일반적으로, 약학적으로 허용가능한 접합체 그룹은 약학적으로 허용가능한 표적 분자 및 임의의 링커를 포함한다. 접합체 그룹, 링커 및 표적 분자의 예시적 형태는 WO2015006740A2에 개시된 것을 확인할 수 있다. 접합체 그룹의 예시는 L96 또는 화합물 그룹 D를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 명세서에서 달리 언급되지 않는 한, "접합된"은 각각 특정 기능을 갖는, 둘 또는 그 이상의 화학적 부분이 서로 공유 결합된 것을 의미하고; 따라서, "접합체"는 여러 화학적 부분들의 공유 결합에 의해 형성된 화합물을 지칭한다.
본 발명의 화합물은 특정 기하 이성질체 또는 입체 이성질체(stereoisomer)의 형태로 존재할 수 있다. 본 발명의 상기 모든 화합물은 (R)- 및 (S)-거울상 이성질체(enantiomers), 부분입체 이성질체(diastereoisomers) 및 라세미(racemic) 혼합물 및 상기 거울상 이성질체 또는 부분입체 이성질체 농축 혼합물과 같은 다른 혼합물을 포함하여 고려되는데, 이들 모두는 본 발명의 범위 내에 포함된다. 알킬과 같은 치환기는 추가적인 비대칭 탄소 원자를 가질 수 있다. 상기 모든 이성질체 및 이의 혼합물은 본 발명의 범위 내에 포함된다.
달리 언급되지 않는 한, 용어 "거울상 이성질체" 또는 "광학 이성질체"는 서로 거울상 이미지인 입체 이성질체를 지칭한다.
달리 언급되지 않는 한, 용어 "부분입체 이성질체"는 둘 또는 그 이상의 카이랄 중심을 갖는 분자이고, 서로 거울상 이미지가 아닌 입체 이성질체를 지칭한다.
달리 언급되지 않는 한, 입체 중심의 절대 배열은 웨지 실선 결합(
) 및 웨지 점선 결합(
)으로 나타내고, 입체 중심의 상대 배열은 스트레이트 실선 결합(
) 및 스트레이트 점선 결합(
)으로 나타낸다. 물결선(
)은 웨지 실선 결합(
) 또는 웨지 점선 결합(
)으로 나타내거나, 물결선(
)은 스트레이트 실선 결합(
) 및/또는 스트레이트 점선 결합(
)으로 나타낸다.
달리 언급되지 않는 한, 용어 "하나의 이성질체로 농축된", "이성질체 농축된", "하나의 거울상 이성질체로 농축된" 또는 "거울상 이성질체 농축된"은 상기 이성질체 또는 거울상 이성질체 중 하나의 함량이 100% 미만이고, 60% 이상이거나, 70% 이상이거나, 80% 이상이거나, 90% 이상이거나, 95% 이상이거나, 96% 이상이거나, 97% 이상이거나, 98% 이상이거나, 99% 이상이거나, 99.5% 이상이거나, 99.6% 이상이거나, 99.7% 이상이거나, 99.8% 이상이거나, 99.9% 이상인 것을 의미한다.
달리 언급되지 않는 한, 용어 "이성질체 초과율" 또는 "거울상 이성질체 초과율"은 2개의 이성질체 또는 거울상 이성질체의 상대적 백분율 간의 차이를 지칭한다. 예를 들면, 이성질체 또는 거울상 이성질체 중 하나의 함량이 90%이고, 다른 이성질체 또는 거울상 이성질체의 함량이 10%이면, 이성질체 또는 거울상 이성질체 초과율(ee 수치)는 80%이다.
광학적으로 활성화된 (R)- 및 (S)-이성질체 및 D 및 L 이성질체는 카이랄 합성 또는 카이랄 시약 또는 다른 통상적인 기술에 의해 제조될 수 있다. 본 발명의 특정 화합물의 거울상 이성질체는 카이랄 보조제를 사용한 비대칭 합성 또는 유도체화에 의해 제조될 수 있는데, 여기서 생성된 부분입체 이성질체 혼합물은 분리되었고, 보조제 그룹은 절단되어, 원하는 순수 거울상 이성질체가 제공된다. 한편, 상기 분자가 염기 기능성 그룹 (아미노) 또는 산 기능성 그룹 (카복실)을 포함하면, 화합물은 적절한 광학 활성 산 또는 염기와 반응하여 부분입체 이성질체의 염을 형성하는데, 이후 당해 기술분야의 통상적인 방법을 통해 부분입체 이성질체 분할에 적용한 다음 회수되어, 순수 거울상 이성질체가 제공된다. 또한, 거울상 이성질체 및 부분입체 이성질체는 카이랄 고정상을 사용하여 일반적으로 크로마토그래피를 통해 분리되는데, 임의로 화학적 유도체화와 조합된다(e.g., 아민으로부터 생성되는 카바메이트). 본 발명의 화합물은 화합물을 구성하는 하나 또는 그 이상의 원자에서 비정상적인 비율의 원자 동위원소를 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 화합물은 트리튬 (3H), 아이오다인-125 (125I) 또는 C-14 (14C)와 같은 방사성 동위원소로 표지될 수 있다. 다른 예를 들면, 수소는 중수소로 대체되어 중수소화된 약물을 형성할 수 있고, 중수소 및 탄소에 의해 형성된 결합은 일반적인 수소 및 탄소에 의해 형성된 것보다 더 단단하다. 비-중수소화된 약물과 비교하여, 중수소화된 약물은 독성 부작용이 감소되고, 안정성이 증가되며, 효율이 향상되고, 생물학적 반감기가 연장되는 등의 장점을 갖는다. 방사성이든 아니든, 본 발명의 화합물의 모든 동위원소 변형은 본 발명의 범위 내에 포함된다.
용어 "염"은 본 발명의 화합물의 염을 지칭하는데, 이는 본 발명에 의해 밝혀진 특정 치환기를 갖는 화합물 및 상대적으로 무독성인 산 또는 염기로부터 제조된다. 본 발명의 화합물이 상대적으로 산 기능성 그룹을 포함하면, 순수 용액 또는 적절한 불활성 용매에서 상기 화합물과 충분한 양의 염기를 접촉시킴으로써 염기 부가 염을 얻을 수 있다. 약학적으로 허용가능한 염기 부가 염은 나트륨, 칼륨, 칼슘, 암모늄, 유기 아민 또는 마그네슘 염 또는 유사 염을 포함한다. 본 발명의 화합물이 상대적으로 염기 기능성 그룹을 포함하면, 순수 용액 또는 적절한 불활성 용매에서 상기 화합물과 충분한 양의 산을 접촉시킴으로써 산 부가 염을 얻을 수 있다. 약학적으로 허용가능한 산 부가 염의 예시는 염산, 브롬화수소산, 질산, 탄산, 중탄산염 라디칼, 인산, 인산일수소, 인산이수소, 황산, 황산수소, 요오드화수소산 및 아인산 등과 같은 무기산 유래 염; 및 아세트산, 프로피온산, 이소부틸산, 말레산, 말론산, 벤조산, 석신산, 수베르산, 푸마르산, 락트산, 만델산, 프탈산, 벤젠설폰산, p-톨루엔설폰산, 시트르산, 타르타르산 및 메탄설폰산 등과 같은 유기산 유래 염을 포함한다. 또한, 아미노산 (e.g., 아르기닌)의 염 및 글루쿠론산 등과 같은 유기산의 염이 포함된다. 본 발명의 특정 화합물은 화합물이 염기 또는 산 부가 염 중 하나로 전환되도록 하는 염기 및 산 기능성 그룹 모두를 포함한다.
본 발명의 염은 통상적인 화학적 방법을 이용하여 산성 또는 염기성 그룹을 가진 모 화합물로부터 합성될 수 있다. 일반적으로, 상기 염은 다음의 방법에 의해 제조된다: 화합물의 유리산 또는 염기 형태를 물 또는 유기 용매 또는 이들의 혼합물에서 화학양론적 양의 적절한 염기 또는 산과 반응시킨다.
본 발명의 화합물은 당해 기술분야에서 잘 알려진 여러 합성 방법을 이용하여 제조될 수 있는데, 이는 아래 열거된 특정 실시예, 다른 화학적 합성 방법과의 조합에 의해 형성되는 실시예 및 당해 기술분야에서 잘 알려진 등가물을 포함한다. 바람직한 실시예는 본 발명의 예시를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용된 용매는 상업적으로 구할 수 있다.
달리 특정하지 않는 한, 본 발명에서 컬럼 크로마토그래피 및 예비적 박층 실리카 겔 크로마토그래피에 사용된 용매 비율은 부피비이다.
두문자 리스트
화합물은 당업계의 통상적인 명명 규칙에 따라 또는 ChemDraw® 소프트웨어를 사용하여 명명되고, 상업적으로 구할 수 있는 화합물에 대해서는 공급자의 카탈로그 명칭으로 제공된다.
도 1은 AAV/HBV 마우스의 혈장에서 HBsAg에 대한 WRG01의 효과를 나타낸다.
도 2는 AAV/HBV 마우스의 혈장에서 HBeAg에 대한 WRG01의 효과를 나타낸다.
도 3은 AAV/HBV 마우스의 혈장에서 HBV DNA에 대한 WRG01의 효과를 나타낸다.
도 4는 AAV/HBV 마우스의 혈장에서 HBV pgRNA에 대한 WRG01의 효과를 나타낸다.
도 5는 WRG01 투여에 따른 마우스의 체중 변화를 나타낸다.
도 6은 AAV/HBV 마우스의 혈장에서 HBsAg에 대한 WR007 및 WR012의 효과를 나타낸다.
도 7은 AAV/HBV 마우스의 혈장에서 HBeAg에 대한 WR007 및 WR012의 효과를 나타낸다.
도 8은 AAV/HBV 마우스의 혈장에서 HBV DNA에 대한 WR007 및 WR012의 효과를 나타낸다.
도 9는 AAV/HBV 마우스의 혈장에서 HBsAg에 대한 여러 용량의 WRG01의 효과를 나타낸다.
도 10은 마우스의 혈장, 간 및 신장에서 WRG01의 농도를 나타낸다.
도 2는 AAV/HBV 마우스의 혈장에서 HBeAg에 대한 WRG01의 효과를 나타낸다.
도 3은 AAV/HBV 마우스의 혈장에서 HBV DNA에 대한 WRG01의 효과를 나타낸다.
도 4는 AAV/HBV 마우스의 혈장에서 HBV pgRNA에 대한 WRG01의 효과를 나타낸다.
도 5는 WRG01 투여에 따른 마우스의 체중 변화를 나타낸다.
도 6은 AAV/HBV 마우스의 혈장에서 HBsAg에 대한 WR007 및 WR012의 효과를 나타낸다.
도 7은 AAV/HBV 마우스의 혈장에서 HBeAg에 대한 WR007 및 WR012의 효과를 나타낸다.
도 8은 AAV/HBV 마우스의 혈장에서 HBV DNA에 대한 WR007 및 WR012의 효과를 나타낸다.
도 9는 AAV/HBV 마우스의 혈장에서 HBsAg에 대한 여러 용량의 WRG01의 효과를 나타낸다.
도 10은 마우스의 혈장, 간 및 신장에서 WRG01의 농도를 나타낸다.
본 발명은 이하에서 구체적인 예를 들어 설명한다. 그러나, 이는 결코 본 발명의 범위를 불리하게 제한하는 것은 아니다. 본 발명의 화합물은 당업자에게 잘 알려진 다양한 합성 방법을 사용하여 제조될 수 있으며, 이하에 열거된 구체적인 실시예, 이들과 다른 화학적 합성 방법과의 조합에 의해 형성된 실시예 및 당업자에게 알려진 이들의 등가물을 포함한다. 바람직한 실시예들은 본 발명의 예시들을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 구체적인 실시예에 있어서, 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 다양한 변경 및 변형이 이루어질 수 있음은 당업자에게 명백할 것이다.
실시예
1:
포스포라미다이트
단량체의 합성
단계 A: 메틸 아세테이트(220mL)에 녹인 (2S,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미도-6-(아세톡시메틸)테트라히드로-2H-피란-2,4,5-트리일 트리아세테이트(즉, 화학식 1-1)(30g, 94.26mmol) 및 메틸 1,2,4-트리아졸-3-카르복실레이트(11.98g, 94.26mmol) 용액을 1bar의 압력 하에 90℃의 오일 배스에서 완전히 건조될 때까지 농축시켰다. 트리플루오로메탄설폰산(141.46mg, 0.94mmol)을 녹인 메틸 아세테이트(2mL) 용액을 상기 혼합물에 첨가하고 125℃의 오일 배스에서 30mbar의 압력으로 4시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 70℃로 냉각하고 에탄올(70mL)을 첨가하였다. 상기 혼합물을 70℃에서 균일한 용액이 형성될 때까지 교반한 후 교반을 중지하고 50℃로 냉각하였다. 침전물이 생성된 후 반응 용액을 방치하고 25℃까지 냉각시킨 후, 반응 용액을 0℃에서 16시간 동안 방치하였다. 반응 용액을 부흐너 깔대기를 통해 여과하고 여과 케이크를 에탄올 180mL(60mL × 3)로 헹구고 진공 건조하여 화학식 1-2를 얻었다. 1H-NMR(400MHz, CDCl3): δ 8.40(s, 1H), 6.04(d, J = 3.42Hz, 1H), 5.69-5.81(m, 1H), 5.54(t, J = 5.38Hz, 1H), 4.42-4.51(m, 2H), 4.16-4.30(m, 1H), 3.98(s, 3H), 2.05-2.18(m, 9H).
스텝 B: 화학식 1-2의 화합물(15g, 38.93mmol)과 트리에틸아민(4.14g, 40.87mmol)을 메탄올(100mL)에 녹이고 이 혼합물을 질소 하에 50℃에서 17시간 동안 교반하였다. 반응액을 감압 농축하여 화학식 1-3을 얻었다. 1H NMR(400MHz, CD3OD): δ 8.87(s, 1H), 5.93(d, J = 3.42Hz, 1H), 4.48(dd, J = 3.48, 4.83Hz, 1H), 4.33(t, J = 5.26Hz, 1H), 4.10-4.16(m, 1H), 3.95(s, 3H), 3.84(dd, J = 3.24, 12.29Hz, 1H), 3.70(dd, J = 4.46, 12.29Hz, 1H).
스텝 C: 화학식 1-3의 화합물(10g, 38.58mmol)을 피리딘(250mL)에 용해시키고 0℃에서 1,3-디클로로-1,1,3,3-테트라이소프로필디실록산(12.29g, 38.97mmol)을 한 방울씩 떨어뜨렸다. 혼합물을 서서히 25℃로 가열하고 16시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 감압 농축하고, 농축물을 에틸 아세테이트(250mL)에 현탁시켰다. 혼합물을 부흐너 깔때기를 통해 여과하였다. 여과액을 3M 염산 750mL(250mL × 3) 및 포화 염수 250mL(250mL × 1)로 세척하고 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 여과 후 감압 농축하여 조생성물을 얻었다. 조생성물을 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 석유 에테르/디클로로메탄/에틸 아세테이트 = 3/1/1)로 정제하여 화학식 1-4를 얻었다. 1H NMR(400MHz, CDCl3): δ 8.43(s, 1H), 5.95(s, 1H), 4.73(dd, J = 4.75, 8.00Hz, 1H), 4.41(d, J = 4.75Hz, 1H), 4.09-4.19(m, 2H), 3.94-4.03(m, 4H), 2.71-3.34(m, 1H), 1.01-1.15(m, 28H).
단계 D: N,N-디메틸포름아미드(50mL)에 화학식 1-4의 화합물(8.23g, 16.40mmol), 탄산칼륨(11.34g, 82.02mmol), 산화은(I)(19.01g, 82.02mmol)을 녹인 혼합 용액에 아이오도메탄(11.64g, 82.02mmol)을 첨가하고, 혼합물을 25℃에서 3시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 에틸 아세테이트(300mL)로 희석하고 부흐너 깔때기를 통해 여과하였다. 여과액을 티오황산나트륨 수용액 250mL(250mL × 1), 물 250mL(250mL × 1), 포화 염수 250mL(250mL × 1)로 세척하고 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 여과후 감압 농축하여 조생성물을 얻었다. 조생성물을 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 석유 에테르/에틸 아세테이트 = 5/1)로 정제하여 화학식 1-5를 얻었다. 1H NMR(400MHz, CDCl3): δ 8.58(s, 1H), 5.91(s, 1H), 4.46(dd, J = 4.22, 9.35Hz, 1H), 4.17-4.28(m, 2H), 3.96-4.06(m, 5H), 3.68(s, 3H), 0.99-1.13(m, 28H).
단계 E: 테트라하이드로퓨란(50mL)에 화학식 1-5(3.27g, 6.34mmol)을 녹인 화합물 용액에 트리에틸아민 트리하이드로플루오라이드(2.25g, 13.95mmol)를 0℃에서 한 방울씩 떨어뜨린 후 혼합물을 25℃까지 서서히 가열하여 16시간 동안 교반하였다. 이후 반응 용액을 감압 농축하여 조생성물을 얻었다. 조생성물을 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 디클로로메탄/메탄올 = 20/1)로 정제하여 화학식 1-6을 얻었다. 1H NMR(400MHz, CD3OD): δ 8.88(s, 1H), 6.04(d, J = 3.26Hz, 1H), 4.44(t, J = 5.33Hz, 1H), 4.20(dd, J = 3.33, 4.83Hz, 1H), 4.07-4.14(m, 1H), 3.96(s, 3H), 3.84(dd, J = 3.20, 12.36Hz, 1H), 3.69(dd, J = 4.39, 12.30Hz, 1H), 3.52(s, 3H).
단계 F: 피리딘(20mL)에 화학식 1-6(1.30g, 4.76mmol) 화합물을 녹인 용액에 4,4-디메톡시트리틸클로라이드(2.42g, 7.14mmol)를 0℃에서 첨가하고, 이 혼합물을 25℃에서 16시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 에틸 아세테이트(70mL)로 희석하고, 25℃에서 포화 중탄산나트륨 수용액(20mL)으로 켄칭한 다음, 물(40mL)로 희석하였다. 액체 분리 후, 유기상을 합하고, 물 60mL(60mL × 1) 및 포화 염수 60mL(60mL × 1)로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조시킨 후, 여과 후 감압농축하여 조생성물을 얻었다. 조생성물을 p-HPLC(분리 컬럼: Phenomenex luna C18(규격: 250mm × 50mm, 입자 크기: 10μm), 이동상: [물(10mM 중탄산암모늄)-아세토니트릴], 용출 구배: 35%-65%, 20분)에 의해 정제하여 화학식 1-7을 얻었다. 1H NMR(400MHz, CDCl3): δ 8.44(s, 1H), 7.38-7.45(m, 2H), 7.28-7.34(m, 5H), 7.18-7.27(m, 2H), 6.70-6.92(m, 4H), 5.97(d, J = 2.88Hz, 1H), 4.37-4.43(m, 1H), 4.33(dd, J = 2.88, 5.00Hz, 1H), 4.19-4.25(m, 1H), 3.98(s, 3H), 3.80(s, 6H), 3.58(s, 3H), 3.43-3.49(m, 1H), 3.33-3.40(m, 1H), 2.55(d, J = 6.88Hz, 1H). LCMS(ESI) m/z: 574.2 [M-H]-.
단계 G: 디클로로메탄(8mL)에 화학식 1-7(1.10 g, 1.91mmol) 화합물을 녹인 용액에 2-시아노에틸-N, N-디이소프로필클로로포스포라미드라이트(678.45mg, 2.87mmol) 및 N, N-디이소프로필에틸아민을 0℃에서 첨가하고, 20℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. 그 후, 반응 용액을 감압 농축하여 조생성물을 얻었다. 조생성물을 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 석유 에테르/에틸 아세테이트 = 50/1 에서 1/2)로 정제하여 화학식 1의 화합물을 얻었다. LCMS(ESI) m/z: 776.3 [M+H]+.
실시예
2: D01의 합성
단계 A: 디클로로메탄(250mL)에 11-도데신-1-ol(25g, 137.14mmol)과 트리에틸아민(16.65g, 164.56mmol)을 용해시키고, 0℃에서 메탄설포닐 클로라이드(18.85g, 164.56mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 0℃에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 물(400mL)로 희석하고 디클로로메탄 800mL(400mL × 2)로 추출하였다. 유기상을 혼합하여 물 400mL(200mL × 2)와 포화 염수로 세척하고 무수 황산나트륨 위에서 건조시키고, 여과 후 감압 농축하여 화학식 2-2를 얻었다.
단계 B: 화학식 2-3의 화합물(20g, 67.26mmol)을 N,N-디메틸포름아미드(200mL)에 용해시키고 수소화나트륨(60% 순도, 4.04g, 100.89mmol)을 0℃에서 첨가한 다음, 화학식 2-2의 화합물(19.27g, 73.99mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 25℃에서 16시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 물(1L)로 켄칭하고 디클로로메탄 1.6 L(800mL × 2)로 추출하였다. 유기상을 혼합하여 포화 염수 800mL(800mL1)로 세척하고 무수 황산나트륨 위에서 건조시키고, 여과 후 감압 농축하여 화학식 2-4를 얻었다. 1H NMR(400MHz, DMSO-d 6): δ 7.63-6.89(m, 10H), 5.64-5.52(m, 2H), 4.27-4.01(m, 2H), 3.98-3.77(m, 2H), 3.72-3.18(m, 4H), 2.23-2.14(m, 2H), 1.98-1.92(m, 1H), 1.54-1.23(m, 16H).
단계 C: 화학식 2-4의 화합물(48g, 103.98mmol)을 메탄올(870mL)에 용해시키고, 염화수소가 포함된 메탄올(4mol/L, 400mL, 1.6mol)을 첨가하였다. 상기 혼합물을 30℃에서 2시간 동안 교반하고, 반응 용액에 염화수소가 포함된 메탄올(4mol/L, 400mL, 1.6mol)을 첨가하였다. 이 후, 혼합물을 30℃에서 16시간 동안 교반하였다. 반응액을 감압 농축하고, 클로로포름 200mL(100mL×2)를 첨가했다. 백색 고체가 나타날 때까지 혼합물을 감압 농축하였다. 톨루엔(130mL) 및 석유 에테르(130mL)를 첨가하고, 혼합물을 15℃에서 16시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 부흐너 깔대기를 통해 여과하고, 여과 케이크를 모아 진공 하에서 건조시켜 백색 고체를 얻었다. 상기 백색 고체를 디클로로메탄(50mL)에 용해하고 수산화나트륨 수용액(50mL)(6.59 g, 164.66mmol)을 넣어 20℃에서 1시간 교반하였다. 반응 용액을 물(500mL)로 희석하고 디클로로메탄 1L(500mL × 2)로 추출하였다. 유기상을 혼합하고 무수 황산나트륨 위에서 건조시키고, 여과 후 감압 농축하여 화학식 2-5를 얻었다.
단계 D: 디메틸 설폭사이드(70mL)와 물(6mL)에 화학식 2-5(23 g, 80.58mmol)의 화합물과 수산화나트륨(322.31mg, 8.06mmol)을 넣은 혼합 용액에 터트-부틸 아크릴레이트(22.72 g, 177.28mmol)를 첨가하여 25℃에서 16시간 질소 하에서 교반하였다. 반응 용액을 물(500mL)로 희석하고 에틸 아세테이트 1L(500mL × 2)로 추출하였다. 유기상을 혼합하고 무수 황산 나트륨 위에서 건조시키고, 여과 후 감압 농축하여 조생성물을 제조하였다. 조생성물을 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 석유 에테르/에틸 아세테이트/에탄올(0.1% 암모니아수 함유) = 36/3/1 내지 16/3/1)로 정제하여 화학식 2-6을 얻었다. 1H NMR(400MHz, DMSO-d 6): δ 3.60-3.54(m, 4H), 3.32(br s, 5H), 3.15(s, 5H), 2.74-2.66(m, 1H), 2.40(t, J = 6.0Hz, 4H), 2.18-2.11(m, 2H), 1.58-1.38(m, 22H), 1.34-1.23(m, 12H).
단계 E: 화학식 2-6의 화합물(24.5g, 45.22mmol)이 포함된 디클로로메탄(250mL) 용액에 트리에틸아민(9.15g, 90.45mmol) 및 숙신산 무수물(6.79g, 67.83mmol)을 첨가하고, 20℃에서 16시간 동안 교반하였다. 반응 용액에 디클로로메탄(1L)과 염산(1 mol/L, 1L)을 첨가하고, 액체 분리 후 유기상을 무수 황산나트륨 위에서 건조시키고, 여과후 감압 농축하여 화학식 2-7을 얻었다. 1H NMR(400MHz, CDCl3): δ 6.49-6.37(m, 1H), 3.72(s, 2H), 3.70-3.57(m, 8H), 3.37(t, J = 6.7Hz, 2H), 2.69-2.51(m, 4H), 2.50-2.36(m, 4H), 2.22-2.13(m, 2H), 1.96-1.90(m, 1H), 1.57-1.47(m, 4H), 1.46-1.40(m, 18H), 1.40-1.31(m, 2H), 1.30-1.21(m, 10H).
단계 F: 화학식 2-7의 화합물(27.4g, 42.69mmol)을 포름산(140mL)에 녹이고 질소 하에서 20℃에서 16시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 감압 농축하고, 톨루엔 300mL(150mL×2)를 첨가한 후 다시 감압 농축하여 화학식 2-8을 얻었다. 1H NMR(400MHz, CDCl3): δ 9.79-9.22(m, 3H), 6.44-6.23(m, 1H), 3.88-3.43(m, 10H), 3.39-3.20(m, 2H), 2.77-2.31(m, 8H), 2.15-2.06(m, 2H), 1.87(t, J = 2.6Hz, 1H), 1.48-1.28(m, 6H), 1.26-1.12(m, 10H).
단계 G: 화학식 2-8(22.6 g, 42.67mmol)의 화합물, N,N-디이소프로필에틸아민(33.09 g, 256.03mmol) 및 O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N,N-테트라메틸루로늄 헥사플루오로포스페이트(51.92 g, 136.55mmol)을 N,N-디메틸포름아미드(250mL)에 용해시키고, 터트-부틸 N-(3-아미노프로필)카바메이트(29.74g, 170.69mmol)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 20℃에서 16시간 동안 교반하였다. 혼합물을 20℃에서 16시간 동안 교반하였다. 반응 용액에 디클로로메탄(1L)과 염산(1 mol/L, 1L)을 첨가하고, 액체 분리 후, 유기상을 물 1L(1L × 1), 탄산수소나트륨 수용액 1L(1L × 1), 포화 염수 1L(1L × 1)로 순차적으로 세척하고 무수 황산나트륨 위에서 건조시키고 여과 후 감압 농축하여 조생성물을 제조하였다. 조생성물을 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 석유 에테르/에틸 아세테이트/에탄올 = 40/3/1에서 10/3/1)로 정제하여 화학식 2-9를 얻었다. 1H NMR(400MHz, CDCl3): δ 7.22-6.79(m, 3H), 6.77-6.44(m, 1H), 5.45-5.00(m, 3H), 3.86-3.73(m, 2H), 3.72-3.63(m, 4H), 3.62-3.45(m, 4H), 3.41-3.32(m, 2H), 3.32-3.20(m, 6H), 3.19-3.03(m, 6H), 2.56-2.47(m, 4H), 2.47-2.39(m, 4H), 2.21-2.12(m, 2H), 1.95-1.90(m, 1H), 1.70-1.57(m, 6H), 1.56-1.47(m, 4H), 1.46-1.38(m, 29H), 1.30-1.25(m, 10H).
단계 H: 화학식 2-9의 화합물(15g, 15.03mmol)을 디클로로메탄(114mL)에 용해시키고 트리플루오로아세트산(38mL)을 첨가하였다. 혼합물을 20℃에서 16시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 감압 농축하고, 톨루엔/아세토니트릴=3/1의 혼합물 600mL(250mL×3)를 첨가했다. 상기 혼합물을 감압하에 농축하여 화학식 2-10(트리스(트리플루오로아세테이트))을 얻었다.
단계 I: 화학식 2-11의 화합물(22.15g, 49.50mmol), N,N-디이소프로필에틸아민(7.75g, 60.00mmol), 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸(6.12g, 45.00mmol) 및 O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N,N-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트(20.53g, 54.00mmol)를 N,N-디메틸포름아미드(90mL)에 용해하고, 상기 혼합물에 화학식 2-10(트리플루오로아세테이트, 15.6 g, 15.00mmol)의 화합물과 N, N-디이소프로필에틸아민(21.32 g, 165.00mmol)의 용액을 첨가하였다. 혼합물을 20℃에서 16시간 동안 교반하였다. 반응 용액에 디클로로메탄(1.2 L)과 염산(1 mol/L, 1L)을 첨가하고, 액체분리 후 유기상을 물 1L(1L × 1), 탄산수소나트륨 수용액 1L(1L × 1) 및 포화브라인 1L(1L × 1)으로 순차적으로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조시키고 여과한 후 감압 농축하여 조 생성물을 얻었다. 조생성물을 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 디클로로메탄/메탄올 = 100/1 내지 10/1 내지 디클로로메탄/에탄올 = 1/1)로 정제하여 화학식 2-12를 얻었다. 1H NMR(400MHz, DMSO-d 6): δ 7.87-7.66(m, 9H), 7.09(s, 1H), 5.21(d, J = 3.4Hz, 3H), 4.96(dd, J = 3.4, 11.3Hz, 3H), 4.48(d, J = 8.5Hz, 3H), 4.06-3.98(m, 9H), 3.91-3.82(m, 3H), 3.74-3.66(m, 3H), 3.58-3.46(m, 12H), 3.31(br s, 3H), 3.07-2.98(m, 12H), 2.71(t, J = 2.6Hz, 1H), 2.33-2.22(m, 8H), 2.16-2.12(m, 2H), 2.10(s, 9H), 2.04(br t, J = 7.1Hz, 6H), 1.99(s, 9H), 1.89(s, 9H), 1.81-1.74(m, 9H), 1.54-1.39(m, 22H), 1.32(br dd, J = 4.5, 6.7Hz, 2H), 1.24(s, 10H).
단계 J: 화학식 2-12(1.00 g, 0.50mmol)와 N-메틸-N, N, N-트리-n-옥틸암모늄 클로라이드(20.35mg, 50.35 μmol)의 화합물을 초산(2.7mL)과 n-펜탄(6.3mL)의 혼합물에 용해시키고, 물(9mL)에 과망간산칼륨(0.40g, 2.52mmol)을 넣은 용액을 0℃에서 혼합물에 한 방울씩 떨어뜨렸다. 혼합물을 0-15℃에서 2시간 동안 교반하였다. 반응물을 아황산수소나트륨(1.27g)으로 켄칭하고, 염산(2mol/L, 5mL) 및 물(30mL)을 첨가하였다. 혼합물을 클로로포름/이소프로판올(3/1) 혼합물 120mL(40mL 3)로 추출했다. 유기상을 합하여 무수황산나트륨으로 건조하고 여과 및 감압 농축한 후 톨루엔/아세토니트릴(1/1) 혼합물 180mL(30mL × 6)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 감압 농축하여 화학식 2-13을 얻었다. 1H NMR(400MHz, CD3OD): δ 5.34(d, J = 2.9Hz, 3H), 5.06(dd, J = 3.3, 11.2Hz, 3H), 4.56(d, J = 8.4Hz, 3H), 4.19-4.06(m, 9H), 4.04-3.98(m, 3H), 3.87(td, J = 5.7, 9.9Hz, 4H), 3.72-3.64(m, 9H), 3.57-3.50(m, 3H), 3.39(br t, J = 6.4Hz, 2H), 3.22(q, J = 6.4Hz, 12H), 2.51-2.40(m, 9H), 2.21(br t, J = 7.3Hz, 6H), 2.14(s, 9H), 2.03(s, 9H), 1.94(d, J = 7.9Hz, 18H), 1.72-1.57(m, 22H), 1.39(br s, 12H).
단계 K: N,N-디이소프로필에틸아민(0.26g, 1.99mmol) 및 O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N,N-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트(0.23g, 0.60mmol)를 화학식 2-13(1.00g, 0.50mmol) 화합물이 들어간 N,N-디메틸포름아미드(10mL) 화합물 용액에 첨가하였다. 혼합물을 교반한 후, 화학식 2-14의 화합물(0.23g, 0.55mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 15℃에서 16시간 동안 교반하였다. 반응용액에 디클로로메탄(50mL)과 물(50mL)을 첨가하고, 액체분리 후 유기상을 포화탄산나트륨 수용액 50mL(50mL × 1), 물 50mL(50mL × 1), 포화염소 50mL(50mL × 1)로 순차적으로 세척하고 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 여과 후 감압 농축하여 조생성물을 얻었다. 조생성물을 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 디클로로메탄/메탄올(0.1% 트리에틸아민 함유) = 20/1 내지 10/1)로 정제하여 화학식 2-15를 얻었다. 1H NMR(400MHz, DMSO-d 6): δ 7.90-7.82(m, 6H), 7.78(br d, J = 4.8Hz, 3H), 7.40-7.26(m, 10H), 6.91(br dd, J = 3.1, 9.0Hz, 4H), 5.26(d, J = 3.4Hz, 3H), 5.03-4.99(m, 3H), 4.53(d, J = 8.4Hz, 3H), 4.43(br d, J = 3.8Hz, 1H), 4.23-4.14(m, 1H), 4.12-4.02(m, 9H), 3.92(td, J = 9.0, 11.0Hz, 3H), 3.78(s, 6H), 3.77-3.71(m, 3H), 3.66-3.51(m, 13H), 3.49-3.41(m, 4H), 3.11-3.01(m, 16H), 2.38-2.37(m, 1H), 2.32(br s, 9H), 2.14(s, 9H), 2.08(br t, J = 6.9Hz, 7H), 2.04(s, 9H), 1.93(s, 9H), 1.82(s, 9H), 1.57-1.46(m, 22H), 1.31-1.26(m, 12H).
단계 L: 트리에틸아민(67.24mg, 0.64mmol), 4-N, N-디메틸아미노피리딘(0.12g, 1.00mmol) 및 숙신산 무수물(83.13mg, 0.83mmol)을 화학식 2-15의 화합물이 들어있는 디클로로메탄(8mL) 용액에 순차적으로 첨가하였다. 혼합물을 10℃에서 16시간 동안 교반하였다. 반응용액에 디클로로메탄(50mL), 물(30mL), 포화 브라인(30mL)을 넣고 액체분리 후 물(30mL × 1)과 포화 브라인(30mL × 1) 30mL로 유기상을 순차적으로 세척한 후 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 여과한 후 감압 농축하여 조생성물을 얻었다. 조생성물을 p-HPLC(분리 컬럼: Waters Xbridge C18(규격: 150mm × 50mm, 입자 크기: 10μm), 이동상: [물(10mM 중탄산암모늄)-아세토니트릴], 용출 구배: 27% -57%, 11분)로 정제하여 실시예 2(화합물 D01)를 얻었다. 1H NMR(400MHz, DMSO-d 6): δ 7.96-7.69(m, 9H), 7.33-7.09(m, 10H), 6.90-6.78(m, 4H), 5.21(d, J = 3.3Hz, 3H), 4.97(dd, J = 3.3, 11.2Hz, 3H), 4.49(d, J = 8.4Hz, 3H), 4.06-3.97(m, 9H), 3.91-3.83(m, 3H), 3.79-3.66(m, 11H), 3.63-3.45(m, 18H), 3.02(br d, J = 4.6Hz, 14H), 2.46-2.37(m, 4H), 2.35-2.14(m, 12H), 2.10(s, 9H), 2.04(br t, J = 7.0Hz, 6H), 1.99(s, 9H), 1.88(s, 9H), 1.77(s, 9H), 1.57-1.37(m, 22H), 1.22(br s, 12H).
실시예
3: 이중-가닥
siRNA
유도체 또는 이의 접합체의 합성
D 함유 단일 가닥 올리고리보뉴클레오티드의 합성: 올리고리보뉴클레오티드의 합성은 포스포아미드(phosphoramidite) 고상 합성 기법에 따라 합성되었다. 합성은 제어된 다공성 유리(amino CPG, 500 Å)를 D01에 공유결합시켜 만든 고체 지지체에 수행하였다. 모든 2'-변형된 RNA 포스포르아미다이트 및 보조 시약은 시판되는 시약이었다. 모든 아미드는 무수 아세토니트릴에 용해시키고 분자체(molecular sieve)(3Å)를 첨가하였으며, 활성화제로 5-에틸티오-1H-테트라졸(ETT)을 사용하는 경우 결합 시간은 5분이었다. 포스포로티오에이트 결합은 무수 아세토니트릴/피리딘(v/v = 1/1)에 3-((디메틸아미노-메틸렌)아미노)-3H-1, 2, 4-디티아졸-3-티오네(DDTT)의 50 mM 용액을 사용하여 생성하였으며, 반응 시간은 3분이었다. 마지막으로 DMT 그룹을 제거한 후 서열을 합성하였다.
D-프리 단일가닥 올리고리보뉴클레오티드: 올리고리보뉴클레오티드의 합성은 포스포아미드라이트 고상 합성 기법에 따라 합성되었다. 합성은 범용 제어 다공성 유리 CPG(500 Å)에서 수행되었다. 모든 2'-변형된 RNA 포스포르아미다이트 및 보조 시약은 시판되는 시약이었다. 모든 아미드는 무수 아세토니트릴에 용해시키고 분자체(molecular sieve)(3Å)를 첨가하였으며, 활성화제로 5-에틸티오-1H-테트라졸(ETT)을 사용하는 경우 결합 시간은 5분이었다. 포스포로티오에이트 결합은 무수 3-((디메틸아미노-메틸렌)아미노)-3H-1, 2, 4-디티아졸-3-티오네(DDTT)가 포함된 아세토니트릴/피리딘(v/v = 1/1) 50 mM 용액을 사용하여 생성하였으며, 반응 시간은 3분이었다. 마지막으로 DMT 그룹을 제거한 후 서열을 합성하였다.
CPG에서 결합된 올리고머의 절단 및 탈보호: 고상 합성이 종료된 후, CPG로부터 올리고뉴클레오티드를 절단하지 않고 30분 동안 아세토니트릴 중 20% 디에틸아민 용액으로 처리하여 보호기를 제거하였다. 이어서, 건조된 CPG를 농축 암모니아수로 40℃에서 18시간 동안 처리하였다. 원심분리 후 상등액을 새 튜브로 옮기고 CPG를 암모니아수로 세척하였다. 혼합 용액이 농축되어 고체 혼합물이 생성되었다.
단일-가닥 올리고리보뉴클레오티드의 정제: HPLC에 의해 정제된 올리고머는 나노 음이온을 사용하여 교환되었다. 완충액 A는 10 mM 과염소산나트륨 용액, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.4로 아세토니트릴을 20% 함유하였으며, 완충액 B는 500 mM 과염소산나트륨, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.4로 아세토니트릴을 20% 함유하였다. 원하는 생성물을 분리하고 역상 C18 컬럼을 사용하여 탈염하였다.
siRNA 생산을 위한 단일-가닥 올리고리보뉴클레오티드의 어닐링: 어닐링될 단일 가닥 올리고리보뉴클레오티드는 멸균 RNase Free H2O(RNA 가수분해효소 없음)를 사용하여 200μM으로 제형화되었다. 어닐링 반응 시스템은 다음과 같이 설정되었다: 총 100 μL의 10 nmol 혼합 용액을 95℃의 수조에 10분 동안 두었다(100 nmol 이상의 경우 고온에서 20분이 필요함).→용액을 60℃ 수조에 빠르게 넣고 자연 냉각하였다.→어닐링 후 용액은 보관을 위해 고온에 두지 않았다. 상보적 가닥은 단일 가닥 올리고리보뉴클레오티드의 등몰 용액을 결합하여 형성되었다.
| 코어 서열 | r'-임베디드 서열 ** | 추가 수정된 서열 | |||||||||
|
서열
번호 |
센스
가닥 서열 (5'-3') |
서열
번호 |
안티센스
가닥 서열 (5'-3') |
서열
번호 |
센스
가닥 서열 (5'-3') *** |
서열
번호 |
안티센스
가닥 서열 (5'-3') |
서열
번호 |
센스
가닥 서열 (5'-3') *** |
서열
번호 |
안티센스
가닥 서열 (5'-3') |
| 1 | GUGUGCACUUCGCUUCACA | 2 | UGUGAAGCGAAGUGCACAC | 3 | GrGUGCACUUCGCUUCACAD* | 4 | UGUGArGCGAAGUGCACACUU | 16 | g·r·guGcACUucgcuucacaD* | 17 | u·G·ugargCGaaguGcAcac·u·u |
| 1 | GUGUGCACUUCGCUUCACA | 2 | UGUGAAGCGAAGUGCACAC | 5 | GUrUGCACUUCGCUUCACAD | 4 | UGUGArGCGAAGUGCACACUU | 18 | g·u·ruGcACUucgcuucacaD | 17 | u·G·ugargCGaaguGcAcac·u·u |
| 1 | GUGUGCACUUCGCUUCACA | 2 | UGUGAAGCGAAGUGCACAC | 3 | GrGUGCACUUCGCUUCACAD | 6 | UrUGAAGCGAAGUGCACACUU | 16 | g·r·guGcACUucgcuucacaD | 19 | u·r·ugaAgCGaaguGcAcac·u·u |
| 1 | GUGUGCACUUCGCUUCACA | 2 | UGUGAAGCGAAGUGCACAC | 5 | GUrUGCACUUCGCUUCACAD | 6 | UrUGAAGCGAAGUGCACACUU | 18 | g·u·ruGcACUucgcuucacaD | 19 | u·r·ugaAgCGaaguGcAcac·u·u |
| 1 | GUGUGCACUUCGCUUCACA | 2 | UGUGAAGCGAAGUGCACAC | 3 | GrGUGCACUUCGCUUCACAD | 7 | UGrGAAGCGAAGUGCACACUU | 16 | g·r·guGcACUucgcuucacaD | 20 | u·G·rgaAgCGaaguGcAcac·u·u |
| 1 | GUGUGCACUUCGCUUCACA | 2 | UGUGAAGCGAAGUGCACAC | 5 | GUrUGCACUUCGCUUCACAD | 7 | UGrGAAGCGAAGUGCACACUU | 18 | g·u·ruGcACUucgcuucacaD | 20 | u·G·rgaAgCGaaguGcAcac·u·u |
| 1 | GUGUGCACUUCGCUUCACA | 2 | UGUGAAGCGAAGUGCACAC | 3 | GrGUGCACUUCGCUUCACAD | 8 | UGUrAAGCGAAGUGCACACUU | 16 | g·r·guGcACUucgcuucacaD | 21 | u·G·uraAgCGaaguGcAcac·u·u |
| 1 | GUGUGCACUUCGCUUCACA | 2 | UGUGAAGCGAAGUGCACAC | 5 | GUrUGCACUUCGCUUCACAD | 8 | UGUrAAGCGAAGUGCACACUU | 18 | g·u·ruGcACUucgcuucacaD | 21 | u·G·uraAgCGaaguGcAcac·u·u |
| 1 | GUGUGCACUUCGCUUCACA | 2 | UGUGAAGCGAAGUGCACAC | 3 | GrGUGCACUUCGCUUCACAD | 9 | UGUGrAGCGAAGUGCACACUU | 16 | g·r·guGcACUucgcuucacaD | 22 | u·G·ugrAgCGaaguGcAcac·u·u |
| 1 | GUGUGCACUUCGCUUCACA | 2 | UGUGAAGCGAAGUGCACAC | 5 | GUrUGCACUUCGCUUCACAD | 9 | UGUGrAGCGAAGUGCACACUU | 18 | g·u·ruGcACUucgcuucacaD | 22 | u·G·ugrAgCGaaguGcAcac·u·u |
| 1 | GUGUGCACUUCGCUUCACA | 2 | UGUGAAGCGAAGUGCACAC | 3 | GrGUGCACUUCGCUUCACAD | 10 | UGUGAArCGAAGUGCACACUU | 16 | g·r·guGcACUucgcuucacaD | 23 | u·G·ugaArCGaaguGcAcac·u·u |
| 1 | GUGUGCACUUCGCUUCACA | 2 | UGUGAAGCGAAGUGCACAC | 5 | GUrUGCACUUCGCUUCACAD | 10 | UGUGAArCGAAGUGCACACUU | 18 | g·u·ruGcACUucgcuucacaD | 23 | u·G·ugaArCGaaguGcAcac·u·u |
| 1 | GUGUGCACUUCGCUUCACA | 2 | UGUGAAGCGAAGUGCACAC | 3 | GrGUGCACUUCGCUUCACAD | 11 | UGUGAAGrGAAGUGCACACUU | 16 | g·r·guGcACUucgcuucacaD | 24 | u·G·ugaAgrGaaguGcAcac·u·u |
| 1 | GUGUGCACUUCGCUUCACA | 2 | UGUGAAGCGAAGUGCACAC | 5 | GUrUGCACUUCGCUUCACAD | 11 | UGUGAAGrGAAGUGCACACUU | 18 | g·u·ruGcACUucgcuucacaD | 24 | u·G·ugaAgrGaaguGcAcac·u·u |
| 1 | GUGUGCACUUCGCUUCACA | 2 | UGUGAAGCGAAGUGCACAC | 12 | GUGUGCrCUUCGCUUCACAD | 4 | UGUGArGCGAAGUGCACACUU | 25 | g·u·guGcrCUucgcuucacaD | 17 | u·G·ugargCGaaguGcAcac·u·u |
| 1 | GUGUGCACUUCGCUUCACA | 2 | UGUGAAGCGAAGUGCACAC | 13 | GUGUGCACUUCGCUUCrCAD | 4 | UGUGArGCGAAGUGCACACUU | 26 | g·u·guGcACUucgcuucrcaD | 17 | u·G·ugargCGaaguGcAcac·u·u |
| 1 | GUGUGCACUUCGCUUCACA | 2 | UGUGAAGCGAAGUGCACAC | 14 | GUGUGCACUUCGCUUCACrD | 4 | UGUGArGCGAAGUGCACACUU | 27 | g·u·guGcACUucgcuucacrD | 17 | u·G·ugargCGaaguGcAcac·u·u |
| 1 | GUGUGCACUUCGCUUCACA | 2 | UGUGAAGCGAAGUGCACAC | 1 | GUGUGCACUUCGCUUCACAD | 4 | UGUGArGCGAAGUGCACACUU | 28 | g·u·guGcACUucgcuucacaD | 17 | u·G·ugargCGaaguGcAcac·u·u |
| 1 | GUGUGCACUUCGCUUCACA | 2 | UGUGAAGCGAAGUGCACAC | 1 | GUGUGCACUUCGCUUCACAD | 6 | UrUGAAGCGAAGUGCACACUU | 28 | g·u·guGcACUucgcuucacaD | 19 | u·r·ugaAgCGaaguGcAcac·u·u |
| 1 | GUGUGCACUUCGCUUCACA | 2 | UGUGAAGCGAAGUGCACAC | 1 | GUGUGCACUUCGCUUCACAD | 7 | UGrGAAGCGAAGUGCACACUU | 28 | g·u·guGcACUucgcuucacaD | 20 | u·G·rgaAgCGaaguGcAcac·u·u |
| 1 | GUGUGCACUUCGCUUCACA | 2 | UGUGAAGCGAAGUGCACAC | 1 | GUGUGCACUUCGCUUCACAD | 8 | UGUrAAGCGAAGUGCACACUU | 28 | g·u·guGcACUucgcuucacaD | 21 | u·G·uraAgCGaaguGcAcac·u·u |
| 1 | GUGUGCACUUCGCUUCACA | 2 | UGUGAAGCGAAGUGCACAC | 1 | GUGUGCACUUCGCUUCACAD | 9 | UGUGrAGCGAAGUGCACACUU | 28 | g·u·guGcACUucgcuucacaD | 22 | u·G·ugrAgCGaaguGcAcac·u·u |
| 1 | GUGUGCACUUCGCUUCACA | 2 | UGUGAAGCGAAGUGCACAC | 1 | GUGUGCACUUCGCUUCACAD | 10 | UGUGAArCGAAGUGCACACUU | 28 | g·u·guGcACUucgcuucacaD | 23 | u·G·ugaArCGaaguGcAcac·u·u |
| 1 | GUGUGCACUUCGCUUCACA | 2 | UGUGAAGCGAAGUGCACAC | 1 | GUGUGCACUUCGCUUCACAD | 11 | UGUGAAGrGAAGUGCACACUU | 28 | g·u·guGcACUucgcuucacaD | 24 | u·G·ugaAgrGaaguGcAcac·u·u |
| 1 | GUGUGCACUUCGCUUCACA | 2 | UGUGAAGCGAAGUGCACAC | 1 | GUGUGCACUUCGCUUCACAD | 29 | UGUGAAGCGrAGUGCACACUU | 28 | g·u·guGcACUucgcuucacaD | 33 | u·G·uga(Agn)gCGraguGcAcac·u·u |
| 1 | GUGUGCACUUCGCUUCACA | 2 | UGUGAAGCGAAGUGCACAC | 1 | GUGUGCACUUCGCUUCACAD | 30 | UGUGAAGCGArGUGCACACUU | 28 | g·u·guGcACUucgcuucacaD | 34 | u·G·uga(Agn)gCGarguGcAcac·u·u |
| 1 | GUGUGCACUUCGCUUCACA | 2 | UGUGAAGCGAAGUGCACAC | 1 | GUGUGCACUUCGCUUCACAD | 31 | UGUGAAGCGAAGUGCrCACUU | 28 | g·u·guGcACUucgcuucacaD | 35 | u·G·uga(Agn)gCGaaguGcrcac·u·u |
| 1 | GUGUGCACUUCGCUUCACA | 2 | UGUGAAGCGAAGUGCACAC | 1 | GUGUGCACUUCGCUUCACAD | 32 | UGUGAAGCGAAGUGCACrCUU | 28 | g·u·guGcACUucgcuucacaD | 36 | u·G·uga(Agn)gCGaaguGcAcrc·u·u |
| 1 | GUGUGCACUUCGCUUCACA | 2 | UGUGAAGCGAAGUGCACAC | 37 | GrGUGCACUUCGCUrCACAD | 10 | UGUGAArCGAAGUGCACACUU | 42 | g·r·guGcACUucgcurcacaD | 23 | u·G·ugaArCGaaguGcAcac·u·u |
| 1 | GUGUGCACUUCGCUUCACA | 2 | UGUGAAGCGAAGUGCACAC | 38 | GrGUGCACUUCrCUUCACAD | 10 | UGUGAArCGAAGUGCACACUU | 43 | g·r·guGcACUucrcuucacaD | 23 | u·G·ugaArCGaaguGcAcac·u·u |
| 1 | GUGUGCACUUCGCUUCACA | 2 | UGUGAAGCGAAGUGCACAC | 3 | GrGUGCACUUCGCUUCACAD | 39 | UGUrAArCGAAGUGCACACUU | 16 | g·r·guGcACUucgcuucacaD | 44 | u·G·uraArCGaaguGcAcac·u·u |
| 1 | GUGUGCACUUCGCUUCACA | 2 | UGUGAAGCGAAGUGCACAC | 3 | GrGUGCACUUCGCUUCACAD | 10 | UGUGAArCGAAGUGCACACUU | 16 | g·r·guGcACUucgcuucacaD | 45 | u·G·uga(Agn)rCGaaguGcAcac·u·u |
| 1 | GUGUGCACUUCGCUUCACA | 2 | UGUGAAGCGAAGUGCACAC | 3 | GrGUGCACUUCGCUUCACAD | 40 | UGUGAAGCGAArUGCACACUU | 16 | g·r·guGcACUucgcuucacaD | 46 | u·G·uga(Agn)gCGaaruGcAcac·u·u |
| 1 | GUGUGCACUUCGCUUCACA | 2 | UGUGAAGCGAAGUGCACAC | 3 | GrGUGCACUUCGCUUCACAD | 10 | UGUGAArCGAAGUGCACACUU | 16 | g·r·guGcACUucgcuucacaD | 47 | VPu·G·ugaArCGaaguGcAcac·u·u |
| 1 | GUGUGCACUUCGCUUCACA | 2 | UGUGAAGCGAAGUGCACAC | 3 | GrGUGCACUUCGCUUCACAD | 10 | UGUGAArCGAAGUGCACACUU | 16 | g·r·guGcACUucgcuucacaD | 48 | VPu·G·uga(Agn)rCGaaguGcAcac·u·u |
| 1 | GUGUGCACUUCGCUUCACA | 2 | UGUGAAGCGAAGUGCACAC | 3 | GrGUGCACUUCGCUUCACAD | 10 | UGUGAArCGAAGUGCACACUU | 15 | g·u·guGcACUucgcuuracaD | 41 | VPu·G·uga(Agn)gCGarguGcAcac·u·u |
*: D는 저분자 단편 D01의 화학 반응 후에 얻어지는 잔기로, 공유 결합을 통해 핵산과 결합되며, 다음과 같은 구조를 갖는다:
**: r'-임베디드 서열에서 안티센스 가닥의 서열은 코어 서열에서 3' 말단에 UU가 있는 안티센스 가닥의 서열을 기반으로 r' 임베딩에 의해 얻어진다. 예를 들어, 서열번호 4는 서열번호 2에 기초하여 3' 말단에 UU가 있는 r' 삽입에 의해 얻어진다.
***: 서열이 D를 포함하는 경우 D는 접합체 그룹 D의 결합 위치를 나타내는 데 사용된다.
예를 들어, g·r·guGcACUucgcuucacaD(5'-3')는 서열번호 16, g·r·guGcACUucgcuucaca는 3' 말단에서 D와 결합되어 있음을 나타낸다.
실시예
3: 시험관 내 (
in vitro
)
HBV
분석
1. 실험 목적
HepG2-NTCP 세포 배양 상층액 내 HBV 항원(HBsAg 및 HBeAg)의 함량은 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)를 통해 측정되었고, HBV에 대한 화합물의 억제 활성은 화합물의 EC50 값을 지표로 하여 평가되었다. 한편, 화합물의 세포독성을 평가하기 위해, 세포 생존율은 Cell-titer Glo를 통해 측정되었다.
2. 실험 물질
2.1. 세포주 : HepG2-NTCP 세포
HepG2-NTCP 세포배양 배지 [DMEM, Invitrogen-11330032; 10% 혈청, Invitrogen-10099141; 100 units/mL 페니실린 (penicillin) 및 100 μg/mL 스트렙토마이신 (streptomycin), Hyclone-SV30010; 1% 비필수 아미노산 (nonessential amino acids), Invitrogen-11140050; 2 mM L-글루타민 (L-glutamine), Invitrogen-25030081; 1 mM 소듐 피루베이트 (sodium pyruvate), Gibco-11360-070; 500 μg/mL 게네티신 (Geneticin), Invitrogen-10131027]
2.2. 시약
판크레아틴 (Pancreatin)(Invitrogen-25300062); DPBS (Corning-21031CVR); DMSO (Sigma-D2650-100 ML); Cell-titer Glo (Promega-G7573); HBsAg quantitative assay kit (Autobio-CL 0310); HBeAg quantitative assay kit (Autobio-CL 0312).
2.3. 소모품 (consumable) 및 실험기기 (instrument)
96-웰 세포배양 플레이트 (Corning-3599); CO2 배양기 (HERA-CELL-240); 마이크로플레이트 리더 (BioTek Synergy 2)
3. 실험 절차 및 방법
3.1. 0일 차에, HepG2-NTCP (7.5×104 cells/well) 세포를 48-웰 플레이트에 도말 (plate)하고, 37℃ 및 5% CO2 조건에서 밤새 배양하였다.
3.2. 1일 차에, 배지 교체 (medium change)를 위해, 1% DMSO를 함유하는 배지를 사용하였다.
3.3. 2일 차에, HepG2-NTCP (2000 GE/cell) 세포를 (HepG2.2.15 세포배양 상층액에서 농축된) HBV/D로 감염시켰다.
3.4. 3일 차에, 감염시킨 용액을 피펫팅하고, 1% DMSO를 함유하는 신선한 배지를 첨가하였다.
3.5. 6일 차에, siRNA 결합체 (conjugate)는 Lipofectamine® RNAiMax (Invitrogen)의 지침에 따라 형질감염 (transfect)시켰다. 결합체는 5배 구배 희석 (gradient dilution)을 통해 7개의 농도를 얻었고, 3개의 복제(triplicate) 웰을 세팅했으며, 최종 농도는 0.16 pM이었다. 화합물은 sense 및 antisense 가닥의 조합이고, 단일 화학 독립체 (entity)이며, 최대 농도는 2.5 nM이었다.
3.6. 12일 차에, 배양 웰에서 상층액을 채취하고, HBsAg 및 HBeAg를 ELISA를 통해 분석하였다. 상층액 채취 후, 세포 생존율을 측정하기 위해, Cell-titer Glo를 첨가하였다.
3.7. HBsAg 및 HBeAg에 대한 ELISA 분석의 구체적인 절차는 제품의 설명서를 참조하였고, 간단한 절차는 다음과 같다: 시료 50 μL 및 표준물질 50μL를 각각 반응 플레이트에 첨가하고, 효소 결합체 (conjugate)를 50 μL/well로 첨가한 후, 혼합물을 흔들어 잘 섞어주고, 37℃에서 60분 동안 배양하였다. 그 후, 세척액을 사용하여 플레이트를 5회 세척하고, 발광 기질 (substrate)을 50 μL/well 첨가한 후, 혼합물을 잘 혼합하여 상온의 암실에서 10분 동안 반응시키고, 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 최종적으로 화학발광 (chemiluminescence) 강도를 측정하였다.
3.8. 데이터 분석:
세포 생존율 비율 계산:
% 생존율 = (샘플의 발광 값 - 배지 대조군 발광 값)/(DMSO 대조군 발광 값 - 배지 대조군 발광 값) × 100.
HBsAg 및 HBeAg 억제율 계산:
% 억제율 = (1 - 샘플 내 항원 값/DMSO 대조군 내 항원 값) × 100.
CC50 및 EC50 계산 : 화합물의 CC50 및 HBV에 대한 50% 억제 농도(EC50) 값은 GraphPad Prism software를 사용하여 계산하였다.
4. 실험 결과 : 표 2 참조
| 시험 서열 | 실험 결과 | |||||
| 서열 번호 |
센스 가닥 서열 (5'-3') |
서열 번호 |
안티센스 가닥 서열 (5'-3') |
HBsAg EC50(pM) | HBeAg EC50(pM) | 세포 생존율 CC50(nM) |
| 16 | g·r·guGcACUucgcuucacaD | 17 | u·G·ugargCGaaguGcAcac·u·u | 13.75 | 20.84 | >2.5 |
| 16 | g·r·guGcACUucgcuucacaD | 20 | u·G·rgaAgCGaaguGcAcac·u·u | 17.40 | 34.21 | >2.5 |
| 16 | g·r·guGcACUucgcuucacaD | 23 | u·G·ugaArCGaaguGcAcac·u·u | 12.44 | 21.07 | >2.5 |
| 28 | g·u·guGcACUucgcuucacaD | 17 | u·G·ugargCGaaguGcAcac·u·u | 13.09 | 22.68 | >2.5 |
| 28 | g·u·guGcACUucgcuucacaD | 20 | u·G·rgaAgCGaaguGcAcac·u·u | 14.69 | 28.90 | >2.5 |
| 28 | g·u·guGcACUucgcuucacaD | 23 | u·G·ugaArCGaaguGcAcac·u·u | 14.99 | 34.72 | >2.5 |
| 28 | g·u·guGcACUucgcuucacaD | 34 | u·G·uga(Agn)gCGarguGcAcac·u·u | 30.72 | 52.56 | >2.5 |
*시험 샘플은 이중가닥 siRNA 아날로그 접합체 (conjugate)이다.
실시예
4. 항-B형 간염 바이러스 활성 및 재조합 8개 유형의
아데노
연관 바이러스 벡터 매개 B형 간염 바이러스 마우스 모델 (AVV-HBV) 내 안전성 조사
실험 목적:
AAV 벡터 매개 HBV 형질전환 마우스 모델은 빠르고 효율적인 HBV 모델이다. AAV8 벡터의 높은 간 향성 (hepatotropism)을 이용함으로써, HBV 게놈 (rAAV8-1.3)의 1.3개의 카피 (copy)를 가진 재조합 8개 유형의 아데노 관련 바이러스를 마우스 꼬리 정맥을 통해 주입하여 상기 HBV 게놈의 1.3개의 카피가 간세포에 효율적으로 전달되도록 유도하였다. AAV 바이러스 벡터의 특성 때문에, 이에 의해 매개되는 벡터는 장기간 지속적으로 발현될 수 있고, AAV/HBV 모델을 적용함으로써, HBV DNA는 지속적으로 복제될 수 있고, HBsAg 및 HBeAg는 마우스 간 내에서 발현될 수 있다.
AAV/HBV 마우스 모델을 이용함으로써, 시험 화합물을 마우스에 처리한 후 마우스 혈청 내 HBsAg, HBeAg, DNA 및 pgRNA와 마우스 무게를 측정하여 생체 내 (in vivo) 항-HBV 효과 및 시험 화합물의 안전성을 평가하였다.
실험 물질:
C57BL/6 마우스, 비히클 (vehicle)로서 PBS (RNase free), 시험 화합물, 재조합 바이러스 rAAV8-1.3HBV. 본 실험의 시약은 QIAamp96 DNA Kit (Qiagen, 51162), FastStart Universal Probe Master (Rox)(Roche, 04914058001), HBsAg assay kit (Autobio-CL0310); HBeAg assay kit (Autobio-CL0918), PureLinkTM Pro 96 Viral RNA/DNA kit (Invitrogen, 12280-096A) 및 FastQuant RT Kit (with gDNase)(TIANGEN, KR106-02)을 포함한다. 실험기기는 원심분리기 (Beckman Allegra X-15R), 다기능 마이크로플레이트 리더 (BioTek, Synergy 2), 형광 quantitative PCR 기기 (Applied Biosystems, 7900HT Fast Real-time PCR system) 및 마이크로플레이트 리더 (Molecular Devices, SpectraMax 340PC384)를 포함한다.
실험 방법:
a) 마우스는 바이러스 주입 후 34일 차에 피하주사를 되도록 하였고, 이 날을 0일 차로 설정하였다. 피하주사 전 모든 마우스는 혈장 채취를 위해 위턱 밑 (submaxillary)에서 채혈을 하였다. 구체적인 투여 방법은 표 3과 같다.
b) 마우스는 혈장 채취를 위해 투여한 후 0일, 14일, 21일, 28일 및 32일 차에 위턱 밑 (submaxillary) 정맥에서 채혈을 하였고, 혈액 샘플은 K2-EDTA로 항응고한 후, 4 ℃ 및 7000 g/min 조건에서 10분 동안 원심분리하여 혈장을 채취하였다. 구체적인 채혈 시간은 표 3과 같다.
c) 35일 또는 42일 차에 모든 마우스는 혈장 채취를 위해 위턱 밑 (submaxillary) 정맥에서 채혈을 하였고, CO2 흡입으로 안락사시켰다. 혈장 샘플은 심장 채혈을 통해 채취하였고, 간 샘플을 채취하였다.
d) 혈장 샘플은 측정을 위해 보내졌다.
| 마우스 수 | 투여 디자인 | 비-종점 채혈 계획 |
실험 종점 | |||
| 시험 화합물 |
투여량 (mg/kg) |
투여 부피 (mL/kg) |
투여방법 | |||
| 5 | Vehicle | / | 5 | 바이러스 주입 후 34일 차를 0일 차로 설정하였다. 약물 투여는 0일 및 29일 차에 피하주사를 통해 한번 수행되었다. | 바이러스 주입 후 34일차를 0일차로 설정하였다. 채혈 시간은 0일, 7일, 14일, 21일, 28일, 32일 및 35일이었다. | 투여 후 35일 차에, 마우스는 혈장 채취를 위해 위턱 밑 (submaxillary) 정맥총에서 채혈을 하였고, CO2 흡입에 의해 안락시켰다. 혈장 샘플은 심장 채혈을 통해 채취하였고, 간 샘플을 채취하였다. |
| 5 | WRG01 *1 | 3 | ||||
| 5 | WR007 *2 | 3 | 바이러스 주입 후 34일 차를 0일 차로 설정하였다. 약물 투여는 피하주사를 통해 한번 수행되었다. | / | ||
| 5 | WR012 *3 | 3 | ||||
*1 : WRG01은 접합체 (conjugate)이고, 센스 가닥 서열번호는 16이고, 안티센스 가닥 서열번호는 23이며, 접합체 그룹은 D이다. *2 : WR007은 접합체 (conjugate)이고, 센스 가닥 서열번호는 42이고, 안티센스 가닥 서열번호는 23이며, 접합체 그룹은 D이다.
*3 : WR012은 접합체 (conjugate)이고, 센스 가닥 서열번호는 16이고, 안티센스 가닥 서열번호는 47이며, 접합체 그룹은 D이다.
/: 종점 (end point)이 도달되지 않았다.
샘플 분석:
마우스 혈청 내 HBsAg 및 HBeAg 함량에 대한 ELISA 분석: 실험 절차를 위해 HBsAg ELISA 키트 (Autobio, CL0310) 및 HBeAg ELISA 키트 (Autobio, CL0918)의 지침을 참조했다.
마우스 혈장 내 HBV DNA 함량에 대한 qPCR 분석: 혈장 내 HBV DNA를 추출하였고, 실험 절차를 위해 QIAamp 96 DNA Blood Kit의 지침을 참조하였으며, 마우스 혈장 내 HBV DNA 함량을 qPCR을 통해 측정하였다.
마우스의 혈장 내 HBV pgRNA 함량에 대한 RT-qPCR 분석: HBV pgRNA를 혈장에서 추출하였고, 실험 절차를 위해 PureLink™ Pro 96 Viral RNA/DNA Kit의 지침을 참조했다. B형 간염 바이러스 특정 서열이 포함된 3' RACE 프라이머를 사용하여 DNA를 절단하고, RNA를 cDNA로 역전사하였으며, 실험 절차를 위해 FastQuant RT Kit (gDNase 포함)의 지침을 참조하였다. 마지막으로, cDNA의 함량을 qPCR을 통해 정량적으로 측정하였고, 다시 말해서 마우스 혈장 내 HBV pgRNA의 함량을 측정하였다.
평균±표준 오차는 마우스 샘플 각 그룹 값을 표현하는 데 사용하였고, 달리 명시되지 않은 한, n = 5였다. 통계 분석은 Student's t-test를 통해 수행되었다.
실험결과
a) AAV/HBV 마우스 모델 내 시험 화합물의 항-HBV 활성은 혈청 내 HBsAg 함량에 따라 평가되었다. 그 결과는 표 4, 표 5, 도 1 및 도 6에 나타내었다. 마우스 혈장 내 HBsAg의 함량은 ELISA에 의해 측정되었다. 오류 표시줄 (error bar)은 표준 오차를 나타낸다. 0일 차: 모든 마우스에 처음으로 비히클 (vehicle) 또는 화합물을 투여하였다. 29일 차: 실험군 WRG01 내 마우스와 blank 대조군 내 마우스에 두 번째로 비히클 (vehicle) 또는 화합물을 접종하였다.
| 측정일 (day) | Blank (SC) | WRG01 (SC) |
| 0 | 4.70 | 4.72 |
| 7 | 4.82 | 2.90 |
| 14 | 4.43 | 2.90 |
| 21 | 4.94 | 3.28 |
| 28 | 4.84 | 3.77 |
| 35 | 4.78 | 2.83 |
| 측정일 (day) | Blank (SC) | WR007 (SC) | WR012 (SC) |
| 0 | 4.58 | 4.19 | 4.47 |
| 7 | 4.15 | 1.92 | 2.00 |
| 14 | 4.57 | 2.29 | 2.20 |
| 21 | 4.41 | 2.63 | 2.36 |
| 28 | 4.76 | 2.94 | 3.10 |
| 35 | 4.62 | 3.31 | 3.19 |
b) AAV/HBV 마우스 모델 내 시험 화합물의 항-HBV 활성은 혈청 내 HBeAg 함량에 따라 평가되었다. 그 결과는 표 6, 표 7, 도 2 및 도 7에 나타내었다. 마우스 혈장 내 HBeAg의 함량은 ELISA에 의해 측정되었다. 오류 표시줄 (error bar)은 표준 오차를 나타낸다. 0일 차: 모든 마우스에 처음으로 비히클 (vehicle) 또는 화합물을 투여하였다.
| 측정일 (day) | Blank (SC) | WRG01 (SC) |
| 0 | 3.56 | 3.51 |
| 7 | 3.37 | 2.89 |
| 14 | 3.56 | 3.06 |
| 21 | 3.66 | 3.22 |
| 측정일 (day) | Blank (SC) | WR007 (SC) | WR012 (SC) |
| 0 | 3.44 | 3.35 | 3.40 |
| 7 | 3.24 | 2.49 | 2.53 |
| 14 | 3.57 | 2.80 | 2.89 |
| 21 | 3.32 | 2.81 | 2.82 |
| 28 | 3.38 | 2.95 | 2.91 |
| 35 | 3.37 | 3.09 | 3.02 |
c) AAV/HBV 마우스 모델 내 시험 화합물의 항-HBV 활성은 혈청 내 DNA 함량에 따라 평가되었다. 그 결과는 표 8, 표 9, 도 3 및 도 8에 나타내었다. 마우스 혈장 내 HBV DNA의 함량은 정량적 PCR에 의해 측정되었다. 오류 표시줄 (error bar)은 표준 오차를 나타낸다. 0일 차: 모든 마우스에 처음으로 비히클 (vehicle) 또는 화합물을 투여하였다. 29일 차: 모든 마우스에 두 번째로 비히클 (vehicle) 또는 화합물을 접종하였다.
| 측정일 (day) | Blank (SC) | WRG01 (SC) |
| 0 | 5.27 | 4.84 |
| 7 | 5.39 | 3.93 |
| 14 | 5.51 | 3.97 |
| 21 | 5.63 | 4.37 |
| 측정일 (day) | Blank (SC) | WR007 (SC) | WR012 (SC) |
| 0 | 5.53 | / | / |
| 7 | 4.98 | / | / |
| 14 | 5.34 | 3.44 | 3.95 |
| 21 | 5.45 | 3.71 | 4.21 |
| 28 | 5.63 | 4.08 | 4.66 |
| 35 | 5.26 | 4.42 | 4.78 |
/: 데이터를 얻지 못했다.
d) AAV/HBV 마우스 모델 내 시험 화합물의 항-HBV 활성은 혈청 내 pgRNA 함량에 따라 평가되었다. 그 결과는 표 10 및 도 4에 나타내었다. 마우스 혈장 내 HBV pgRNA의 함량은 정량적 PCR에 의해 측정되었다. 오류 표시줄 (error bar)은 표준 오차를 나타낸다. 0일 차: 모든 마우스에 처음으로 비히클 (vehicle) 또는 화합물을 투여하였다. 29일 차: 모든 마우스에 두 번째로 비히클 (vehicle) 또는 화합물을 접종하였다.
| 측정일 (day) | Blank (SC) | WRG01 (SC) |
| 0 | 4.92 | 4.56 |
| 7 | 4.96 | 3.28 |
| 14 | 4.93 | 3.26 |
| 21 | 5.02 | 3.50 |
| 28 | 5.06 | 4.13 |
| 35 | 5.17 | 3.37 |
e) 체중 변화를 도 5에 나타내었다. 비교는 0일 차 체중을 기준 (baseline)으로 사용하여 수행되었다. IACUC 규정에 따르면 체중의 20% 감소는 인간의 (humane) 종점 (endpoint)로 간주되며, 체중의 20% 이상 감소한 마우스는 실험에서 제거되어야 한다. 본 실험에서 체중 감소로 인해 제거된 마우스는 한 마리도 없었다.
실험 결론
본 실험에서, 시험 화합물은 AAV/HBV 마우스 모델 내 HBsAg, DNA 및 pgRNA를 유의하게 감소시킬 수 있었다. 한편, 시험 화합물들은 HBeAg에 대해 확실한 억제 효과를 보였다. 시험 화합물을 처리한 동안, 마우스는 우수한 내성 (tolerance)을 보였고, 체중은 점차 증가했다.
실시예
5:
HepG2
.2.15 세포의
HBV
시험관 내 (
in Vitro
) 분석
1. 실험 목적:
실시간 qPCR을 이용하여 HepG2.2.15 세포배양 상층액 내 HBV DNA의 함량을 측정하였고, ELISA를 이용하여 HBsAg 및 HBeAg의 함량을 측정하였으며, qRT-PCR을 이용하여 세포 내 HBV RNA의 함량을 측정하였다. 화합물의 EC50 값은 HBV에 대한 화합물의 억제 효과를 평가하는 지표로 사용하였고, 세포 생존률에 대한 시험 화합물의 영향을 CCK8 방법을 이용하여 측정하였다.
2. 실험 물질
2.4. 세포주: HepG2.2.15
HepG2.2.15 세포배양배지 [DMEM/F12, Invitrogen-11330032; 10% 혈청, Hyclone-SV30087.0; 100 units/mL 페니실린 (penicillin) 및 100 μg/mL 스트렙토마이신 (streptomycin), Hyclone-SV30010; 1% 비필수 아미노산 (nonessential amino acids), Invitrogen-11140050; 2 mM L-글루타민 (L-glutamine), Invitrogen-25030081; 300 μg/mL 게네티신 (Geneticin), Invitrogen-10131027].
2.5. 시약
Opti-MEM (Gibco-31985-070); Lipofectamine® RNAiMAX (Invitrogen-13778-150); CCK8 (Life-iLab-AC11L057); high-throughput DNA purification kit (QIAamp 96 DNA Blood Kit, Qiagen-51162); RNA preparation RNEASY Kit (RNeasy 96 Kit (12), Qiagen-74182); quantitative fast start universal probe reagent (FastStart Universal Probe Master, Roche-04914058001); FastKing cDNA first strand synthesis kit (TianGen-KR106-02); HBsAg quantitative assay kit (Autobio-CL 0310); HBeAg quantitative assay kit (Autobio-CL 0312).
2.6. 소모품 (consumable) 및 실험기기 (instrument)
Collagen I 96 웰 White/Clear Flat Bottom TC-Treated 마이크로플레이트(Corning BioCoat-356650); CO2 배양기 (HERA-CELL-240); 형광 quantitative PCR instrument (Applied Biosystems-7900 real time PCR system); 형광 quantitative PCR instrument (Applied Biosystems-QuantStudio 6 Flex); 마이크로플레이트 리더 (Molecular Device-SpectraMax M2e); 마이크로플레이트 리더 (BioTek-Synergy 2).
3. 실험 절차 및 방법:
3.1. 실험 1일 차에, siRNA의 형질주입 (transfection) 및 세포 분주가 동시에 수행되었고, 간단한 절차는 다음과 같다. HepG2.2.15 세포를 DPBS로 세척하고, 0.05% 트립신 (trypsin)으로 절단한 후, 10% FBS를 포함하는 DMEM/F12 배지로 digestion을 종료하였다. 그 후, 세포를 원심분리하고 재현탁했으며, 단일세포로 피펫팅 (pipet)하고, 계수 (count)하였다. 원하는 형질주입 시약의 volume은 특정 비율에 따라 설정되었고 (표 11), 세포는 상온에서 15분간 배양하였다.
| 시약 | 비율 (실시예로서 하나의 웰에 대한 할당) |
| Lipofectamine® RNAiMAX | 1.5 |
| Opti-MEM | 23.5 |
siRNA를 3배로 구배 희석 (gradient dillution)하여 8종류의 농도를 얻고, 2개의 중복 (duplicate) 웰을 세팅하였다. 15 μL의 RNAiMAX/Opti-MEM 혼합물을 15 μL의 농도별 siRNA와 혼합하고, 상온에서 15분 동안 배양하였다. 상기 혼합용액 10 μL를 96-웰 세포배양 플레이트에 첨가하고, 90 μL의 세포 현탁액을 첨가한 후, 최종 세포밀도는 15,000 cell/well, 최종 부피는 100 μL/well이었다. 세포는 37 ℃ 및 5% CO2의 배양기에서 배양되었다.
3.2. 4일 차에, 초기 (original) 배지를 화합물이 함유된 신선 배지로 교체하고, 형질주입은 1일 차와 동일하게 수행하였다.
3.3. 7일 차에, 배양 웰 내 배양액을 채취하고, 샘플링을 수행하였다. 샘플의 일부는 HBsAg 및 HBeAg의 함량 분석을 위한 ELISA 분석에 사용되었고, 샘플의 일부는 high-throughput DNA 정제 키트 (Qiagen-51162) 사용을 통한 DNA 추출에 사용되었으며, 상층액 채취 후, CCK-8 키트의 지침에 따라 세포 생존율을 측정하였고, 각 웰의 흡광도(450 nm/650 nm)는 마이크로플레이트 리더 (SpectraMax M2e)로 측정되었으며, HBV RNA는 키트 지침을 참조하여 RNeasy 96 키트 추출 키트 (Qiagen-74182)를 사용하여 세포 배양액에서 추출되었다.
3.4. PCR 반응 용액의 제조는 표 12와 같다.
| Items | 1 웰당 필요량 (voulme, μL) |
100 웰당 필요량 (voulme, μL) |
| Quantitative fast start universal probe reagent | 5 | 500 |
| Forward primer (10 μmol) | 0.4 | 40 |
| Reverse primer (10 μmol) | 0.4 | 40 |
| Probe (10 μmol) | 0.2 | 20 |
| AE | 2 | 200 |
8 μL의 반응 혼합물을 96-웰 PCR 플레이트의 각 웰에 첨가하고, 각 웰에 샘플 DNA 또는 HBV DNA 표준물질 2 μL를 첨가하였다.PCR의 반응 조건은 다음과 같다: 95 ℃에서 10분 동안 가열, 95 ℃에서 15초 동안 변성 (denaturation), 60 ℃에서 1분 동안 확장 (extention), 총 40 사이클.
3.5. HBsAg 및 HBeAg의 함량 분석을 위한 ELISA 분석의 구체적인 절차는 제품의 설명서를 참조하였으며, 간단한 절차는 다음과 같다: 반응 플레이트에 샘플 50 μL 및 표준물질 50 μL를 각각 첨가하고, 효소 접합체 (enzyme conjugate)를 50 μL/well로 첨가한 후, 상기 혼합물을 흔들어 잘 섞어주고, 따뜻한 bath에서 37 ℃에서 60분 동안 배양하였다. 플레이트는 세척액을 사용하여 5회 세척하고, 발광 기질 (luminescent substrate)을 50 μL/well로 첨가하고, 혼합물을 잘 혼합하여 상온의 암실에서 10분 동안 반응시킨 후, 마이크로플레이트 리더를 사용하여 화학발광 (chemiluminescence) 강도를 측정하였다.
3.6. 세포 배양 내 HBV RNA는 키트 설명서를 참조하여 RNeasy 96 키트 추출 키트 (Qiagen, 74182)를 사용하여 추출되었다. 세포는 150 μL의 RLT로 용해되었고, 마지막으로 RNA는 50 μL의 RNase-free 물로 용출되었다. 역전사 키트 (Tiangen, KR106)의 지침에 따라, 역전사를 위해 임의의 프라이머를 cDNA에 첨가하고, 샘플 내 총 RNA를 측정하기 위해 HBV 특정 프라이머를 사용하였으며, GAPDH 프라이머 및 프로브는 GAPDH cDNA를 특이적으로 측정하기 위해 사용하였고, 샘플 내 HBV cDNA 정량화를 위해 qPCR 방법을 사용하였다.
qPCR 반응: 95 ℃, 10분; 95 ℃, 15초; 60 ℃ 1분, 총 40 사이클. 각 샘플 내 HBV RNA의 함량은 시료의 Ct 값에 따라 계산되었다.
각 시료의 표적 유전자인 HBV mRNA의 발현 수준은 ΔΔCt의 상대 정량법으로 계산되었다. 표적 유전자의 상대적 발현 수준은 2-ΔΔCT로 표현하였으며, 계산식은 다음과 같다:
ΔCT = 표적 유전자의 평균 Ct 값 - 참조 유전자의 평균 Ct 값;
ΔΔCT = ΔCT (처리군) - ΔCT (RNAiMAX 대조군);
HBV mRNA의 상대적 발현 수준 = 2-ΔΔCT
3.7. 데이터 분석:
억제 백분율의 계산
% Inh. = (1 - 샘플 값/PBS 대조군 값) × 100
세포 생존율 % = (샘플의 측정값 - 배양액 백그라운드 평균 측정값) / (대조군 평균 측정값 - 배양액 백그라운드 평균 측정값) × 100
EC50 및 CC50 계산: HBV에 대한 화합물의 50% 억제 농도(EC50) 및 50% 세포사망(CC50) 상태에서 약물 농도(CC50)는 GraphPad Prism software를 사용하여 계산하였다.
| 시험 서열 | 실혐 결과 | |||||||
| 서열 번호 |
센스 서열 (5'-3') |
서열 번호 |
안티센스 서열 (5'-3') |
HBsAg EC50 (nM) |
HBeAg EC50 (nM) |
DNA EC50 (nM) |
RNA EC50 (nM) |
세포 생존률 CC50(nM) |
| 16 | g·r·guGcACUucgcuucacaD | 23 | u·G·ugaArCGaaguGcAcac·u·u | 0.179 | 0.755 | 0.14 | 0.87 | >50 |
| 28 | g·u·guGcACUucgcuucacaD | 17 | u·G·ugargCGaaguGcAcac·u·u | 0.105 | 0.37 | 0.16 | 0.567 | >50 |
| 28 | g·u·guGcACUucgcuucacaD | 23 | u·G·ugaArCGaaguGcAcac·u·u | 0.079 | 0.587 | 0.135 | 3.197 | >50 |
| 28 | g·u·guGcACUucgcuucacaD | 34 | u·G·uga(Agn)gCGarguGcAcac·u·u | 0.263 | 1.268 | 0.553 | 0.963 | >50 |
| 42 | g·r·guGcACUucgcurcacaD | 23 | u·G·ugaArCGaaguGcAcac·u·u | 0.07 | 0.389 | 0.019 | 0.65 | >50 |
| 43 | g·r·guGcACUucrcuucacaD | 23 | u·G·ugaArCGaaguGcAcac·u·u | 0.231 | / | / | / | >50 |
| 16 | g·r·guGcACUucgcuucacaD | 44 | u·G·uraArCGaaguGcAcac·u·u | 0.072 | 2.202 | 0.06 | / | >50 |
| 16 | g·r·guGcACUucgcuucacaD | 45 | u·G·uga(Agn)rCGaaguGcAcac·u·u | 0.054 | 3.707 | 0.15 | / | >50 |
| 16 | g·r·guGcACUucgcuucacaD | 46 | u·G·uga(Agn)gCGaaruGcAcac·u·u |
0.497 | / | / | / | >50 |
| 16 | g·r·guGcACUucgcuucacaD | 47 | VPu·G·ugaArCGaaguGcAcac·u·u | 0.082 | 0.205 | 0.037 | 0.68 | >50 |
| 16 | g·r·guGcACUucgcuucacaD | 48 | VPu·G·uga(Agn)rCGaaguGcAcac·u·u | 0.104 | 3.83 | 0.105 | / | >50 |
/: 데이터를 얻지 못했다.
*시험 샘플은 이중가닥 siRNA 아날로그의 접합체 (conjugate)였다.
실시예
6:
AAV
-
HBV
마우스 모델 내 효과적인 항-B형 간염 바이러스 활성을 위한 투여량 탐색
AAV/HBV 마우스 모델을 사용하여, 시험 화합물을 용량별로 마우스에 처리한 후, 마우스 혈청 내 HBsAg를 측정하여 test 화합물의 생체 내 (in vivo) 항-HBV 효과를 평가하였다.
실험물질:
C57BL/6 마우스, 비히클 (vehicle)로서 PBS(RNase free), 시험 화합물, 재조합 바이러스 rAAV8-1.3HBV. 실험의 주요 시약은 FastStart Universal Probe Master (Rox)(Roche, 04914058001) 및 HBsAg assay kit (Autobio, CL0310)를 포함한다. 주요 기구는 원심분리기 (Beckman Allegra X-15R), 다기능 마이크로플레이트 리더 (BioTek, Synergy 2), 마이크로플레이트 리더 (Molecular Devices, SpectraMax 340PC384)를 포함한다.
실험방법
a) 모든 마우스는 바이러스 주입 후 34일 차에 피하주사를 하였고, 이 날을 0일 차로 설정하였다. 투여 전에, 모든 마우스는 혈장 채취를 위해 위턱 밑 (submaxillary)에서 채혈을 하였다. 약물 투여는 0일 차에 한 번 수행되었다. 구체적인 투여 방법은 표 14와 같다.
b) 모든 마우스는 혈장 채취를 위해 투여 후 0일, 14일, 21일, 28일 및 35일 차에 위턱 밑 (submaxillary) 정맥을 통해 채혈을 하였고, 혈액 샘플은 K2-EDTA로 항응고하고, 4 ℃ 및 7000 g/min에서 10분 동안 원심분리하여 혈장을 채취하였다. 채혈을 위한 구체적인 시간은 표 14와 같다.
c) 42일 차에, 모든 마우스는 혈장 채취를 위해 위턱 밑 (submaxillary) 정맥을 통해 채혈을 하였고, 그 후 CO2 흡입에 의해 안락사되었다. 혈장 샘플은 심장 채혈을 통해 채취하였고, 간 샘플을 채취하였다.
d) 모든 혈장 샘플은 측정을 위해 보내졌다.
| 마우스 수 | 투여 디자인 | 비-종점 채혈 계획 |
실험 종점 | |||
| 시험 화합물 |
투여량 (mg/kg) |
투여 부피 (mL/kg) |
투여방법 | |||
| 5 | Vehicle | / | 5 | 바이러스 주입 후 34일차 를 0일 차로 설정하였다.0일 차에 피하주사를 한번 하였다. | 바이러스 주입 후 34일 차를 0일 차로 설정하였다. 채혈 시간은 0일, 7일, 14일, 21일, 28일 및 35일이었다. | |
| 5 | WRG01* | 0.3 | 투여 후 42일차에, 든 마우스는 혈장 채취를 위해 위턱 밑 (submaxillary) 정맥총을 통해 채혈을 하였고, 그 후 CO2 흡입에 의해 안락사되었다. 혈장 샘플은 심장에서 채혈하여 채취하였고, 간 샘플을 채취하였다. | |||
| 5 | 1 | |||||
| 5 | 3 | / | ||||
| 5 | 10 | / | ||||
*: WRG01은 접합체 (conjugate)이고, 센스 가닥은 서열번호 16이고, 안티센스 가닥은 서열번호 23이며, 접합체 그룹은 D이다.
/: 종점 (endpoint)은 도달되지 않았다.
샘플 분석:
마우스 혈청 내 HBsAg 함량에 대한 ELISA 분석: 실험 절차를 위해 HBsAg ELISA 키트 (Autobio, CL0310)의 지침을 참조하였다.
평균±표준 오차는 마우스 샘플 각 그룹 값을 표현하는 데 사용되었고, 달리 명시되지 않은 한 n = 5였다. 통계 분석은 Student's t-test를 사용하여 수행되었다.
실험결과:
AAV/HBV 마우스 모델 내 시험 화합물의 항-HBV 활성은 혈청 내 HBsAg 함량을 측정하여 평가하였다. 그 결과는 표 15 및 도 9에 나타내었다. 마우스 혈장 내 HBsAg의 함량은 ELISA에 의해 측정되었다. 오류 표시줄 (error bar)은 표준 오차를 나타낸다. 0일 차: 모든 마우스는 처음으로 비히클 (vehicle) 또는 화합물을 투여하였다.
| 측정일 (day) | Blank (SC) | WRG01, 0.3 mpk (SC) |
WRG01, 1 mpk (SC) |
WRG01, 3 mpk (SC) |
WRG01, 10 mpk (SC) |
| 0 | 4.58 | 4.49 | 4.53 | 4.31 | 4.56 |
| 7 | 4.15 | 3.67 | 2.93 | 2.19 | 1.98 |
| 14 | 4.57 | 4.18 | 3.60 | 2.26 | 2.21 |
| 21 | 4.41 | 4.46 | 3.80 | 2.48 | 2.17 |
| 28 | 4.76 | 4.76 | 4.25 | 3.22 | 2.99 |
| 35 | 4.62 | 4.65 | 4.31 | 3.40 | 3.12 |
실험 결론
본 실험에서, 시험 화합물 WRG01은 AAV/HBV 마우스 모델 내 HBsAg 감소에 대한 양호한 용량 의존성을 보였다. 즉, 약물 투여량 증가와 함께, HBsAg 감소에 대한 활성이 증가하였고, HBsAg 억제에 대한 장기적인 효과를 나타내었다.
실시예
7: 마우스 혈청, 간 및 신장에서 약물 농도 시험
본 실험에서, C57BL/6 마우스는 피하 주사를 통해 단일 투여되었고, 혈장 및 조직 샘플은 약물 투여 후 여러 시점에서 수확되었으며, 마우스에서 화합물의 대사 수준은 혈장 및 조직에서의 siRNA 수준에 대한 SL-qPCR 측정을 통해 평가하였다.
| 마우스 수 | 투여 디자인 | 비-종점 말초혈액 채취 계획 | 실험 종점 | |||
| 시험 화합물 |
투여량 (mg/kg) |
투여 부피 (mg/kg) |
투여 방법 | |||
| 3 | WRG01* | 3 | 5 | 약물 투여는 0일 차에 피하주사를 통해 한번 수행되었다. | 투여 후 채혈 시간은 0.083 h이었다. | 투여 0.5시간 차에, 혈장 채취를 위해 위턱 밑(submaxillary) 정맥총을 통해 채혈하였고, 그 후 마우스를 CO2 흡입에 의해 안락사하고, 간 및 신장 샘플을 채취하였다. |
| 3 | 3 | 투여 후 채혈 시간은 0.25 h이었다. | 투여 1시간 차에, 혈장 채취를 위해 위턱 밑(submaxillary) 정맥총을 통해 채혈하였고, 그 후 마우스를 CO2 흡입에 의해 안락사하고, 간 및 신장 샘플을 채취하였다. | |||
| 3 | 3 | / | 투여 2시간 차에, 혈장 채취를 위해 위턱 밑(submaxillary) 정맥총을 통해 채혈하였고, 그 후 마우스를 CO2 흡입에 의해 안락사하고, 간 및 신장 샘플을 채취하였다. | |||
| 3 | 3 | / | 투여 4시간 차에, 혈장 채취를 위해 위턱 밑(submaxillary) 정맥총을 통해 채혈하였고, 그 후 마우스를 CO2 흡입에 의해 안락사하고, 간 및 신장 샘플을 채취하였다. | |||
| 3 | 3 | / | 투여 8시간 차에, 혈장 채취를 위해 위턱 밑(submaxillary) 정맥총을 통해 채혈하였고, 그 후 마우스를 CO2 흡입에 의해 안락사하고, 간 및 신장 샘플을 채취하였다. | |||
| 3 | 3 | / | 투여 32시간 차에, 혈장 채취를 위해 위턱 밑(submaxillary) 정맥총을 통해 채혈하였고, 그 후 마우스를 CO2 흡입에 의해 안락사하고, 간 및 신장 샘플을 채취하였다. | |||
| 3 | 3 | 투여 후 채혈 시간은 48 h 및 96 h이었다. | 투여 168시간 차에, 혈장 채취를 위해 위턱 밑(submaxillary) 정맥총을 통해 채혈하였고, 그 후 마우스를 CO2 흡입에 의해 안락사하고, 간 및 신장 샘플을 채취하였다. | |||
*: WRG01은 접합체 (conjugate)이고, 센스 가닥은 SEQ ID NO: 16이고, 안티센스 가닥은 서열번호 23이며, 접합체 그룹은 D이다.
/: 채혈은 비-종점 (endpoint) 시간대에서 수행되지 않았고, 종점에서만 수행되었다.
실험결과:
투여 후 시간에 따른 마우스 혈장, 간 및 신장의 siRNA 수준은 SL-qPCR 방법 (참고문헌: Nair et al., Nuclear Acids Research (2017), 45, 10969-10977)을 이용하여 측정되었으며, 그 결과는 도 10에 나타내었다.
실험 결론:
본 실험에서, 시험 화합물 WRG01은 C57BL/6 마우스 모델 내 조직 분포 및 대사 안정성이 우수하였다. WRG01은 간 노출이 크고, 반감기가 길며, 간 대 혈액 비율이 500배 이상으로 높아 대사 안정성과 높은 간 표적화 특성을 가지고 있음을 증명한다.
실시예 8: FRG-KO 인간화 간을 가진 마우스의 혈액 생화학적 실험
인간화된 FRG 마우스는 가장 일반적으로 사용되는 인간화 간 모델 중 하나이며, 일반적으로 인간화 비율이 70% 정도이다. 인간 간세포가 마우스 간 내 이식되어 있기 때문에, 자연적인 HBV 감염 및 인체 내 cccDNA 복제 과정을 더 잘 시뮬레이션할 수 있으며, 이 모델은 인체의 약물 동태 (pharmacokinetics) 및 간독성 (hepatotoxicity)을 잘 예측할 수 있다.
본 실험에서, 인간화된 FRG 마우스에 여러 차례 약물 투여하고, 투여 후 시간에 따라 혈장 샘플을 채취하였으며, 혈장 내 ALT, AST, 빌리루빈 (bilirubin) 수치를 측정하여 마우스 간 내 화합물의 독성 및 부작용을 평가하였다. 본 실험에서, 시험 화합물은 인간화된 간의 유의미한 염증 반응을 유발하지 않아 인체 안전성이 양호한 것으로 나타났다.
| 마우스 수 | 투여 디자인 | 비-종점 말초혈액 채취 계획 | 실험 종점 | |||
| 시험 화합물 |
투여량 (mg/kg) |
투여 부피 (mg/kg) |
투여 방법 | |||
| 3 | 비히클 | / | 5 | 0일, 21일, 28일, 35일 및 42일 차에 피하주사를 통해 약물투여가 수행되었다. | 채혈 시간은 투여 전 1일 전과 투여 후 7일, 14일, 21일, 28일, 35일 및 42일 차이었다. | / |
| 3 | WRG01* | 15 | ||||
| 3 | WRG01* | 50 | ||||
*: WRG01은 접합체 (conjugate)이고, 센스 가닥은 서열번호 16이고, 안티센스 가닥은 서열번호 23이며, 접합체 그룹은 D이다.
/: 종점 (endpoint)은 도달되지 않았다.
본 발명은 HBV DNA 및 pgRNA의 발현을 효과적으로 억제하면서 HBsAg 및 HBeAg에 대해 예측할 수 없을 정도로 우수한 억제 활성을 나타내는데, 이는 본 발명이 B형 간염 바이러스의 활성을 억제할 수 있음을 보여준다. 한편, 본 발명은 조직 분포 및 대사 안정성이 양호하고, 간 표적성이 높아 마우스 간 기능에 거의 영향을 미치지 않을 것으로 기대된다. 임상에서 만성 B형 간염과 같은 B형 간염에 대한 효율적인 치료 수단을 제공할 것이다.
<110> Chia Tai Tianqing Pharmaceutical Group Co., Ltd.
Medshine Discovery Inc.
<120> CONJUGATE OF DOUBLE-STRANDED SIRNA ANALOGUE
<130> P21435130T
<150> CN202010529520.7
<151> 2020-06-11
<150> CN202011524835.9
<151> 2020-12-21
<150> CN202010524584.8
<151> 2020-06-10
<150> PCT/CN2020/133982
<151> 2020-12-04
<150> CN202010522407.6
<151> 2020-06-10
<150> CN202011524307.3
<151> 2020-12-21
<160> 48
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sense strand
<400> 1
gugugcacuu cgcuucaca 19
<210> 2
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense strand
<400> 2
ugugaagcga agugcacac 19
<210> 3
<211> 18
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sense strand
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(2)
<223> The nucleotides are linked by phosphate groups via structural
unit r
<400> 3
ggugcacuuc gcuucaca 18
<210> 4
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense strand
<220>
<221> modified_base
<222> (5)..(6)
<223> The nucleotides are linked by phosphate groups via structural
unit r
<400> 4
ugugagcgaa gugcacacuu 20
<210> 5
<211> 18
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sense strand
<220>
<221> modified_base
<222> (2)..(3)
<223> The nucleotides are linked by phosphate groups via structural
unit r
<400> 5
guugcacuuc gcuucaca 18
<210> 6
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense strand
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(2)
<223> The nucleotides are linked by phosphate groups via structural
unit r
<400> 6
uugaagcgaa gugcacacuu 20
<210> 7
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense strand
<220>
<221> modified_base
<222> (2)..(3)
<223> The nucleotides are linked by phosphate groups via structural
unit r
<400> 7
uggaagcgaa gugcacacuu 20
<210> 8
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense strand
<220>
<221> modified_base
<222> (3)..(4)
<223> The nucleotides are linked by phosphate groups via structural
unit r
<400> 8
uguaagcgaa gugcacacuu 20
<210> 9
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense strand
<220>
<221> modified_base
<222> (4)..(5)
<223> The nucleotides are linked by phosphate groups via structural
unit r
<400> 9
ugugagcgaa gugcacacuu 20
<210> 10
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense strand
<220>
<221> modified_base
<222> (6)..(7)
<223> The nucleotides are linked by phosphate groups via structural
unit r
<400> 10
ugugaacgaa gugcacacuu 20
<210> 11
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense strand
<220>
<221> modified_base
<222> (7)..(8)
<223> The nucleotides are linked by phosphate groups via structural
unit r
<400> 11
ugugaaggaa gugcacacuu 20
<210> 12
<211> 18
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sense strand
<220>
<221> modified_base
<222> (6)..(7)
<223> The nucleotides are linked by phosphate groups via structural
unit r
<400> 12
gugugccuuc gcuucaca 18
<210> 13
<211> 18
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sense strand
<220>
<221> modified_base
<222> (16)..(17)
<223> The nucleotides are linked by phosphate groups via structural
unit r
<400> 13
gugugcacuu cgcuucca 18
<210> 14
<211> 18
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sense strand
<220>
<221> modified_base
<222> (17)
<223> Linked by phosphate groups via structural unit r
<400> 14
gugugcacuu cgcuucac 18
<210> 15
<211> 18
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sense strand
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(2)
<223> Phosphorothioate linkage
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(4)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (2)..(3)
<223> Phosphorothioate linkage
<220>
<221> modified_base
<222> (5)
<223> Fluoro modification
<220>
<221> modified_base
<222> (6)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (7)..(9)
<223> Fluoro modification
<220>
<221> modified_base
<222> (10)..(18)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (15)..(16)
<223> The nucleotides are linked by phosphate groups via structural
unit r
<400> 15
gugugcacuu cgcuuaca 18
<210> 16
<211> 18
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sense strand
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(2)
<223> The nucleotides are linked by phosphorothioate groups via
structural unit r
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(3)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (4)
<223> Fluoro modification
<220>
<221> modified_base
<222> (5)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (6)..(8)
<223> Fluoro modification
<220>
<221> modified_base
<222> (9)..(18)
<223> Methoxy modification
<400> 16
ggugcacuuc gcuucaca 18
<210> 17
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense strand
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(2)
<223> Phosphorothioate linkage
<220>
<221> modified_base
<222> (1)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (2)..(3)
<223> Phosphorothioate linkage
<220>
<221> modified_base
<222> (2)
<223> Fluoro modification
<220>
<221> modified_base
<222> (3)..(6)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (5)..(6)
<223> The nucleotides are linked by phosphate groups via structural
unit r
<220>
<221> modified_base
<222> (7)..(8)
<223> Fluoro modification
<220>
<221> modified_base
<222> (9)..(12)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (13)
<223> Fluoro modification
<220>
<221> modified_base
<222> (14)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (15)
<223> Fluoro modification
<220>
<221> modified_base
<222> (16)..(20)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (18)..(19)
<223> Phosphorothioate linkage
<220>
<221> modified_base
<222> (19)..(20)
<223> Phosphorothioate linkage
<400> 17
ugugagcgaa gugcacacuu 20
<210> 18
<211> 18
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sense strand
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(2)
<223> Phosphorothioate linkage
<220>
<221> modified_base
<222> (2)..(3)
<223> The nucleotide at position 2 is linked to the structural unit r
via a phosphorothioate group, and the r is linked to the
nucleotide at position 3 via a phosphate group
<220>
<221> modified_base
<222> (4)
<223> Fluoro modification
<220>
<221> modified_base
<222> (5)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (6)..(8)
<223> Fluoro modification
<220>
<221> modified_base
<222> (9)..(18)
<223> Methoxy modification
<400> 18
guugcacuuc gcuucaca 18
<210> 19
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense strand
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(2)
<223> The nucleotides are linked by phosphorothioate groups via
structural unit r
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(4)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (5)
<223> Fluoro modification
<220>
<221> modified_base
<222> (6)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (7)..(8)
<223> Fluoro modification
<220>
<221> modified_base
<222> (9)..(12)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (13)
<223> Fluoro modification
<220>
<221> modified_base
<222> (14)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (15)
<223> Fluoro modification
<220>
<221> modified_base
<222> (16)..(20)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (18)..(19)
<223> Linked via a phosphorothioate group
<220>
<221> modified_base
<222> (19)..(20)
<223> Linked via a phosphorothioate group
<400> 19
uugaagcgaa gugcacacuu 20
<210> 20
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense strand
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(2)
<223> Phosphorothioate linkage
<220>
<221> modified_base
<222> (1)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (2)..(3)
<223> The nucleotide at position 2 is linked to the structural unit r
via a phosphorothioate group, and the r is linked to the
nucleotide at position 3 via a phosphate group
<220>
<221> modified_base
<222> (2)
<223> Fluoro modification
<220>
<221> modified_base
<222> (3)..(4)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (5)
<223> Fluoro modification
<220>
<221> modified_base
<222> (6)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (7)..(8)
<223> Fluoro modification
<220>
<221> modified_base
<222> (9)..(12)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (13)
<223> Fluoro modification
<220>
<221> modified_base
<222> (14)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (15)
<223> Fluoro modification
<220>
<221> modified_base
<222> (16)..(20)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (18)..(19)
<223> Phosphorothioate linkage
<220>
<221> modified_base
<222> (19)..(20)
<223> Phosphorothioate linkage
<400> 20
uggaagcgaa gugcacacuu 20
<210> 21
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense strand
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(2)
<223> Phosphorothioate linkage
<220>
<221> modified_base
<222> (1)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (2)..(3)
<223> Phosphorothioate linkage
<220>
<221> modified_base
<222> (2)
<223> Fluoro modification
<220>
<221> modified_base
<222> (3)..(4)
<223> The nucleotides are linked by phosphate groups via structural
unit r
<220>
<221> modified_base
<222> (3)..(4)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (5)
<223> Fluoro modification
<220>
<221> modified_base
<222> (6)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (7)..(8)
<223> Fluoro modification
<220>
<221> modified_base
<222> (9)..(12)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (13)
<223> Fluoro modification
<220>
<221> modified_base
<222> (14)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (15)
<223> Fluoro modification
<220>
<221> modified_base
<222> (16)..(20)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (18)..(19)
<223> Phosphorothioate linkage
<220>
<221> modified_base
<222> (19)..(20)
<223> Phosphorothioate linkage
<400> 21
uguaagcgaa gugcacacuu 20
<210> 22
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense strand
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(2)
<223> Phosphorothioate linkage
<220>
<221> modified_base
<222> (1)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (2)..(3)
<223> Phosphorothioate linkage
<220>
<221> modified_base
<222> (2)
<223> Fluoro modification
<220>
<221> modified_base
<222> (3)..(4)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (4)..(5)
<223> The nucleotides are linked by phosphate groups via structural
unit r
<220>
<221> modified_base
<222> (5)
<223> Fluoro modification
<220>
<221> modified_base
<222> (6)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (7)..(8)
<223> Fluoro modification
<220>
<221> modified_base
<222> (9)..(12)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (13)
<223> Fluoro modification
<220>
<221> modified_base
<222> (14)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (15)
<223> Fluoro modification
<220>
<221> modified_base
<222> (16)..(20)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (18)..(19)
<223> Phosphorothioate linkage
<220>
<221> modified_base
<222> (19)..(20)
<223> Phosphorothioate linkage
<400> 22
ugugagcgaa gugcacacuu 20
<210> 23
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense strand
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(2)
<223> Phosphorothioate linkage
<220>
<221> modified_base
<222> (1)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (2)..(3)
<223> Phosphorothioate linkage
<220>
<221> modified_base
<222> (2)
<223> Fluoro modification
<220>
<221> modified_base
<222> (3)..(5)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (6)..(7)
<223> The structural unit r is linked between nucleotides via phosphate
groups
<220>
<221> modified_base
<222> (6)..(8)
<223> Fluoro modification
<220>
<221> modified_base
<222> (9)..(12)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (13)
<223> Fluoro modification
<220>
<221> modified_base
<222> (14)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (15)
<223> Fluoro modification
<220>
<221> modified_base
<222> (16)..(20)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (18)..(19)
<223> Phosphorothioate linkage
<220>
<221> modified_base
<222> (19)..(20)
<223> Phosphorothioate linkage
<400> 23
ugugaacgaa gugcacacuu 20
<210> 24
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense strand
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(2)
<223> Phosphorothioate linkage
<220>
<221> modified_base
<222> (1)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (2)..(3)
<223> Phosphorothioate linkage
<220>
<221> modified_base
<222> (2)
<223> Fluoro modification
<220>
<221> modified_base
<222> (3)..(5)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (6)
<223> Fluoro modification
<220>
<221> modified_base
<222> (7)..(8)
<223> The nucleotides are linked by phosphate groups via structural
unit r
<220>
<221> modified_base
<222> (7)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (8)
<223> Fluoro modification
<220>
<221> modified_base
<222> (9)..(12)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (13)
<223> Fluoro modification
<220>
<221> modified_base
<222> (14)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (15)
<223> Fluoro modification
<220>
<221> modified_base
<222> (16)..(20)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (18)..(19)
<223> Phosphorothioate linkage
<220>
<221> modified_base
<222> (19)..(20)
<223> Phosphorothioate linkage
<400> 24
ugugaaggaa gugcacacuu 20
<210> 25
<211> 18
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sense strand
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(2)
<223> Phosphorothioate linkage
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(4)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (2)..(3)
<223> Phosphorothioate linkage
<220>
<221> modified_base
<222> (5)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (6)..(7)
<223> The nucleotides are linked by phosphate groups via structural
unit r
<220>
<221> modified_base
<222> (6)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (7)..(8)
<223> Fluoro modification
<220>
<221> modified_base
<222> (9)..(18)
<223> Methoxy modification
<400> 25
gugugccuuc gcuucaca 18
<210> 26
<211> 18
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sense strand
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(2)
<223> Phosphorothioate linkage
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(4)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (2)..(3)
<223> Phosphorothioate linkage
<220>
<221> modified_base
<222> (5)
<223> Fluoro modification
<220>
<221> modified_base
<222> (6)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (7)..(9)
<223> Fluoro modification
<220>
<221> modified_base
<222> (10)..(18)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (16)..(17)
<223> The nucleotides are linked by phosphate groups via structural
unit r
<400> 26
gugugcacuu cgcuucca 18
<210> 27
<211> 18
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sense strand
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(2)
<223> Phosphorothioate linkage
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(4)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (2)..(3)
<223> Phosphorothioate linkage
<220>
<221> modified_base
<222> (5)
<223> Fluoro modification
<220>
<221> modified_base
<222> (6)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (7)..(9)
<223> Fluoro modification
<220>
<221> modified_base
<222> (10)..(18)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (18)
<223> Linked to the structural unit r via a phosphate group
<400> 27
gugugcacuu cgcuucac 18
<210> 28
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sense strand
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(2)
<223> Phosphorothioate linkage
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(4)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (2)..(3)
<223> Phosphorothioate linkage
<220>
<221> modified_base
<222> (5)
<223> Fluoro modification
<220>
<221> modified_base
<222> (6)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (7)..(9)
<223> Fluoro modification
<220>
<221> modified_base
<222> (10)..(19)
<223> Methoxy modification
<400> 28
gugugcacuu cgcuucaca 19
<210> 29
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense strand
<220>
<221> modified_base
<222> (9)..(10)
<223> The nucleotides are linked by phosphate groups via structural
unit r
<400> 29
ugugaagcga gugcacacuu 20
<210> 30
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense strand
<220>
<221> modified_base
<222> (10)..(11)
<223> The nucleotides are linked by phosphate groups via structural
unit r
<400> 30
ugugaagcga gugcacacuu 20
<210> 31
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense strand
<220>
<221> modified_base
<222> (15)..(16)
<223> The nucleotides are linked by phosphate groups via structural
unit r
<400> 31
ugugaagcga agugccacuu 20
<210> 32
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense strand
<220>
<221> modified_base
<222> (17)..(18)
<223> The nucleotides are linked by phosphate groups via structural
unit r
<400> 32
ugugaagcga agugcaccuu 20
<210> 33
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense strand
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(2)
<223> Phosphorothioate linkage
<220>
<221> modified_base
<222> (1)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (2)..(3)
<223> Phosphorothioate linkage
<220>
<221> modified_base
<222> (2)
<223> Fluoro modification
<220>
<221> modified_base
<222> (3)..(6)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (5)
<223> Linked to (Agn) residues via a phosphate group
<220>
<221> modified_base
<222> (7)..(8)
<223> Fluoro modification
<220>
<221> modified_base
<222> (8)..(9)
<223> The nucleotides are linked by phosphate groups via structural
unit r
<220>
<221> modified_base
<222> (9)..(11)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (12)
<223> Fluoro modification
<220>
<221> modified_base
<222> (13)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (14)
<223> Fluoro modification
<220>
<221> modified_base
<222> (15)..(19)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (17)..(18)
<223> Phosphorothioate linkage
<220>
<221> modified_base
<222> (18)..(19)
<223> Phosphorothioate linkage
<400> 33
ugugagcgag ugcacacuu 19
<210> 34
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense strand
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(2)
<223> Linked via a phosphorothioate group
<220>
<221> modified_base
<222> (1)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (2)..(3)
<223> Linked via a phosphorothioate group
<220>
<221> modified_base
<222> (2)
<223> Fluoro modification
<220>
<221> modified_base
<222> (3)..(6)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (5)
<223> Linked to (Agn) residues via a phosphate group
<220>
<221> modified_base
<222> (7)..(8)
<223> Fluoro modification
<220>
<221> modified_base
<222> (9)..(10)
<223> The nucleotides are linked by phosphate groups via structural
unit r
<220>
<221> modified_base
<222> (9)..(11)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (12)
<223> Fluoro modification
<220>
<221> modified_base
<222> (13)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (14)
<223> Fluoro modification
<220>
<221> modified_base
<222> (15)..(19)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (17)..(18)
<223> Linked via a phosphorothioate group
<220>
<221> modified_base
<222> (18)..(19)
<223> Linked via a phosphorothioate group
<400> 34
ugugagcgag ugcacacuu 19
<210> 35
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense strand
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(2)
<223> Phosphorothioate linkage
<220>
<221> modified_base
<222> (1)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (2)..(3)
<223> Phosphorothioate linkage
<220>
<221> modified_base
<222> (2)
<223> Fluoro modification
<220>
<221> modified_base
<222> (3)..(6)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (5)
<223> Linked to (Agn) residues via a phosphate group
<220>
<221> modified_base
<222> (7)..(8)
<223> Fluoro modification
<220>
<221> modified_base
<222> (9)..(12)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (13)
<223> Fluoro modification
<220>
<221> modified_base
<222> (14)..(15)
<223> The nucleotides are linked by phosphate groups via structural
unit r
<220>
<221> modified_base
<222> (14)..(19)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (17)..(18)
<223> Phosphorothioate linkage
<220>
<221> modified_base
<222> (18)..(19)
<223> Phosphorothioate linkage
<400> 35
ugugagcgaa gugccacuu 19
<210> 36
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense strand
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(2)
<223> Phosphorothioate linkage
<220>
<221> modified_base
<222> (1)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (2)..(3)
<223> Phosphorothioate linkage
<220>
<221> modified_base
<222> (2)
<223> Fluoro modification
<220>
<221> modified_base
<222> (3)..(6)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (5)
<223> Linked to (Agn) residues via a phosphate group
<220>
<221> modified_base
<222> (7)..(8)
<223> Fluoro modification
<220>
<221> modified_base
<222> (9)..(12)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (13)
<223> Fluoro modification
<220>
<221> modified_base
<222> (14)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (15)
<223> Fluoro modification
<220>
<221> modified_base
<222> (16)..(17)
<223> The nucleotides are linked by phosphate groups via structural
unit r
<220>
<221> modified_base
<222> (16)..(19)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (17)..(18)
<223> Phosphorothioate linkage
<220>
<221> modified_base
<222> (18)..(19)
<223> Phosphorothioate linkage
<400> 36
ugugagcgaa gugcaccuu 19
<210> 37
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sense strand
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(2)
<223> The nucleotides are linked by phosphate groups via structural
unit r
<220>
<221> modified_base
<222> (13)..(14)
<223> The nucleotides are linked by phosphate groups via structural
unit r
<400> 37
ggugcacuuc gcucaca 17
<210> 38
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sense strand
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(2)
<223> The nucleotides are linked by phosphate groups via structural
unit r
<220>
<221> modified_base
<222> (10)..(11)
<223> The nucleotides are linked by phosphate groups via structural
unit r
<400> 38
ggugcacuuc cuucaca 17
<210> 39
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense strand
<220>
<221> modified_base
<222> (3)..(4)
<223> The nucleotides are linked by phosphate groups via structural
unit r
<220>
<221> modified_base
<222> (5)..(6)
<223> The nucleotides are linked by phosphate groups via structural
unit r
<400> 39
uguaacgaag ugcacacuu 19
<210> 40
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense strand
<220>
<221> modified_base
<222> (11)..(12)
<223> The nucleotides are linked by phosphate groups via structural
unit r
<400> 40
ugugaagcga augcacacuu 20
<210> 41
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense strand
<220>
<221> modified_base
<222> (1)
<223> (E)-vinyl phosphate modified nucleotide
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(2)
<223> Phosphorothioate linkage
<220>
<221> modified_base
<222> (1)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (2)..(3)
<223> Phosphorothioate linkage
<220>
<221> modified_base
<222> (2)
<223> Fluoro modification
<220>
<221> modified_base
<222> (3)..(6)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (5)
<223> Linked to (Agn) residues via a phosphate group
<220>
<221> modified_base
<222> (7)..(8)
<223> Fluoro modification
<220>
<221> modified_base
<222> (9)..(10)
<223> The nucleotides are linked by phosphate groups via structural
unit r
<220>
<221> modified_base
<222> (9)..(11)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (12)
<223> Fluoro modification
<220>
<221> modified_base
<222> (13)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (14)
<223> Fluoro modification
<220>
<221> modified_base
<222> (15)..(19)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (17)..(18)
<223> Phosphorothioate linkage
<220>
<221> modified_base
<222> (18)..(19)
<223> Phosphorothioate linkage
<400> 41
ugugagcgag ugcacacuu 19
<210> 42
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sense strand
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(2)
<223> The nucleotides are linked by phosphorothioate groups via
structural unit r
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(3)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (4)
<223> Fluoro modification
<220>
<221> modified_base
<222> (5)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (6)..(8)
<223> Fluoro modification
<220>
<221> modified_base
<222> (9)..(17)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (13)..(14)
<223> The nucleotides are linked by phosphate groups via structural
unit r
<400> 42
ggugcacuuc gcucaca 17
<210> 43
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sense strand
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(2)
<223> The nucleotides are linked by phosphate groups via structural
unit r
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(3)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (4)
<223> Fluoro modification
<220>
<221> modified_base
<222> (5)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (6)..(8)
<223> Fluoro modification
<220>
<221> modified_base
<222> (9)..(17)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (10)..(11)
<223> The nucleotides are linked by phosphate groups via structural
unit r
<400> 43
ggugcacuuc cuucaca 17
<210> 44
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense strand
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(2)
<223> Phosphorothioate linkage
<220>
<221> modified_base
<222> (1)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (2)..(3)
<223> Phosphorothioate linkage
<220>
<221> modified_base
<222> (2)
<223> Fluoro modification
<220>
<221> modified_base
<222> (3)..(4)
<223> The nucleotides are linked by phosphate groups via structural
unit r
<220>
<221> modified_base
<222> (3)..(4)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (5)..(6)
<223> The nucleotides are linked by phosphate groups via structural
unit r
<220>
<221> modified_base
<222> (5)..(7)
<223> Fluoro modification
<220>
<221> modified_base
<222> (8)..(11)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (12)
<223> Fluoro modification
<220>
<221> modified_base
<222> (13)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (14)
<223> Fluoro modification
<220>
<221> modified_base
<222> (15)..(19)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (17)..(18)
<223> Phosphorothioate linkage
<220>
<221> modified_base
<222> (18)..(19)
<223> Phosphorothioate linkage
<400> 44
uguaacgaag ugcacacuu 19
<210> 45
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense strand
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(2)
<223> Phosphorothioate linkage
<220>
<221> modified_base
<222> (1)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (2)..(3)
<223> Phosphorothioate linkage
<220>
<221> modified_base
<222> (2)
<223> Fluoro modification
<220>
<221> modified_base
<222> (3)..(5)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (5)
<223> Linked to (Agn) residues via a phosphate group
<220>
<221> modified_base
<222> (5)..(6)
<223> The nucleotides are linked by phosphate groups via structural
unit r
<220>
<221> modified_base
<222> (6)..(7)
<223> Fluoro modification
<220>
<221> modified_base
<222> (8)..(11)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (12)
<223> Fluoro modification
<220>
<221> modified_base
<222> (13)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (14)
<223> Fluoro modification
<220>
<221> modified_base
<222> (15)..(19)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (17)..(18)
<223> Phosphorothioate linkage
<220>
<221> modified_base
<222> (18)..(19)
<223> Phosphorothioate linkage
<400> 45
ugugacgaag ugcacacuu 19
<210> 46
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense strand
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(2)
<223> Phosphorothioate linkage
<220>
<221> modified_base
<222> (1)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (2)..(3)
<223> Phosphorothioate linkage
<220>
<221> modified_base
<222> (2)
<223> Fluoro modification
<220>
<221> modified_base
<222> (3)..(6)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (5)
<223> Linked to (Agn) residues via a phosphate group
<220>
<221> modified_base
<222> (7)..(8)
<223> Fluoro modification
<220>
<221> modified_base
<222> (9)..(11)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (10)..(11)
<223> The nucleotides are linked by phosphate groups via structural
unit r
<220>
<221> modified_base
<222> (12)
<223> Fluoro modification
<220>
<221> modified_base
<222> (13)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (14)
<223> Fluoro modification
<220>
<221> modified_base
<222> (15)..(19)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (17)..(18)
<223> Phosphorothioate linkage
<220>
<221> modified_base
<222> (18)..(19)
<223> Phosphorothioate linkage
<400> 46
ugugagcgaa ugcacacuu 19
<210> 47
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense strand
<220>
<221> modified_base
<222> (1)
<223> (E)-vinyl phosphate modification
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(2)
<223> Phosphorothioate linkage
<220>
<221> modified_base
<222> (1)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (2)..(3)
<223> Phosphorothioate linkage
<220>
<221> modified_base
<222> (2)
<223> Fluoro modification
<220>
<221> modified_base
<222> (3)..(5)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (6)..(7)
<223> The nucleotides are linked by phosphate groups via structural
unit r
<220>
<221> modified_base
<222> (6)..(8)
<223> Fluoro modification
<220>
<221> modified_base
<222> (9)..(12)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (13)
<223> Fluoro modification
<220>
<221> modified_base
<222> (14)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (15)
<223> Fluoro modification
<220>
<221> modified_base
<222> (16)..(20)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (18)..(19)
<223> Phosphorothioate linkage
<220>
<221> modified_base
<222> (19)..(20)
<223> Phosphorothioate linkage
<400> 47
ugugaacgaa gugcacacuu 20
<210> 48
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense strand
<220>
<221> modified_base
<222> (1)
<223> (E)-vinyl phosphate modification
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(2)
<223> Phosphorothioate linkage
<220>
<221> modified_base
<222> (1)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (2)..(3)
<223> Phosphorothioate linkage
<220>
<221> modified_base
<222> (2)
<223> Fluoro modification
<220>
<221> modified_base
<222> (3)..(5)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (5)
<223> Linked to (Agn) residues via a phosphate group
<220>
<221> modified_base
<222> (5)..(6)
<223> The nucleotides are linked by phosphate groups via structural
unit r
<220>
<221> modified_base
<222> (6)..(7)
<223> Fluoro modification
<220>
<221> modified_base
<222> (8)..(11)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (12)
<223> Fluoro modification
<220>
<221> modified_base
<222> (13)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (14)
<223> Fluoro modification
<220>
<221> modified_base
<222> (15)..(19)
<223> Methoxy modification
<220>
<221> modified_base
<222> (17)..(18)
<223> Phosphorothioate linkage
<220>
<221> modified_base
<222> (18)..(19)
<223> Phosphorothioate linkage
<400> 48
ugugacgaag ugcacacuu 19
Claims (20)
- 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하며, 상기 안티센스 가닥은 하기 r을 갖는 서열번호 2로 표시되는 서열에서 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드 잔기가 치환된 서열을 포함하는, 이중-가닥 siRNA 유도체, 이의 접합체 또는 이의 염:
상기 siRNA 유도체에서 상기 뉴클레오티드 및 상기 r은 각각 독립적으로 변형되거나 변형되지 않을 수 있음. - 제1항에 있어서, 상기 이중-가닥 siRNA 유도체에서 상기 뉴클레오티드 및 상기 r의 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 또는 그 이상이 변형되고; 임의로, 상기 이중-가닥 siRNA 유도체에서 모든 뉴클레오티드 및 r이 변형되는 것을 특징으로 하는 이중-가닥 siRNA 유도체, 이의 접합체 또는 이의 염.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 변형은 메톡시 변형, 플루오로 변형, 포스포로티오에이트 결합, (S)-글리세롤 핵산으로 뉴클레오티드 치환 또는 (E)-비닐 포스페이트로 뉴클레오티드 치환인 것을 특징으로 하는 이중-가닥 siRNA 유도체, 이의 접합체 또는 이의 염.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안티센스 가닥은 r을 갖는 서열번호 2로 표시되는 서열에서 하나, 둘, 셋, 넷 또는 다섯의 뉴클레오티드 잔기가 치환된 서열이고; 임의로, 상기 안티센스 가닥은 r을 갖는 서열번호 2로 표시되는 서열에서 하나의 뉴클레오티드 잔기가 치환된 서열인 것을 특징으로 하는 이중-가닥 siRNA 유도체, 이의 접합체 또는 이의 염.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 r의 치환은 서열번호 2의 임의의 위치에서 일어나는 것을 특징으로 하는 이중-가닥 siRNA 유도체, 이의 접합체 또는 이의 염.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 서열번호 2는 5' 말단 및/또는 3' 말단에 돌출부(overhang)를 임의로 포함하고; 상기 서열번호 2는 5' 말단 및/또는 3' 말단에 0, 1, 2, 3, 4 또는 5의 뉴클레오티드 돌출부(overhang)를 임의로 포함하고; 상기 서열번호 2는 3' 말단에 돌출부(overhang)를 임의로 포함하고; 상기 돌출부(overhang)는 변형되거나 변형되지 않은 UU로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 이중-가닥 siRNA 유도체, 이의 접합체 또는 이의 염.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 4 또는 서열번호 17, 서열번호 6 또는 서열번호 19, 서열번호 7 또는 서열번호 20, 서열번호 8 또는 서열번호 21, 서열번호 9 또는 서열번호 22, 서열번호 10 또는 서열번호 23, 서열번호 11 또는 서열번호 24, 서열번호 29 또는 서열번호 33, 서열번호 30 또는 서열번호 34, 서열번호 31 또는 서열번호 35, 서열번호 32 또는 서열번호 36, 서열번호 39 또는 서열번호 44, 서열번호 10 또는 서열번호 45, 서열번호 40 또는 서열번호 46, 서열번호 10 또는 서열번호 47, 또는 서열번호 10 또는 서열번호 48로 표시되는 서열을 포함하거나 구성하는 것을 특징으로 하는 이중-가닥 siRNA 유도체, 이의 접합체 또는 이의 염.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 센스 가닥은 서열번호 1 또는 서열번호 28로 표시되는 서열을 포함하거나 구성하는 것을 특징으로 하는 이중-가닥 siRNA 유도체, 이의 접합체 또는 이의 염.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 센스 가닥은 r을 갖는 서열번호 1로 표시되는 서열에서 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드 잔기가 치환된 서열을 포함하고; 임의로, 상기 센스 가닥은 r을 갖는 서열번호 1로 표시되는 서열에서 하나, 둘, 셋, 넷 또는 다섯의 뉴클레오티드 잔기가 치환된 서열인 것을 특징으로 하는 이중-가닥 siRNA 유도체, 이의 접합체 또는 이의 염.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 r의 치환은 서열번호 1의 5' 말단의 위치 1-19에서 일어나는 것을 특징으로 하는 이중-가닥 siRNA 유도체, 이의 접합체 또는 이의 염.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 센스 가닥의 서열은 서열번호 5 또는 서열번호 18, 서열번호 3 또는 서열번호 16, 서열번호 14 또는 서열번호 27, 서열번호 13 또는 서열번호 26, 서열번호 12 또는 서열번호 25, 서열번호 37 또는 서열번호 42, 또는 서열번호 38 또는 서열번호 43으로 표시되는 서열을 포함하거나 구성하는 것을 특징으로 하는 이중-가닥 siRNA 유도체, 이의 접합체 또는 이의 염.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이중-가닥 siRNA 유도체는 하기 S18-S28 중 어느 하나이고:
S18: 상기 센스 가닥은 서열번호 1 또는 서열번호 28이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 4 또는 서열번호 17이며,
S19: 상기 센스 가닥은 서열번호 1 또는 서열번호 28이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 6 또는 서열번호 19이며,
S20: 상기 센스 가닥은 서열번호 1 또는 서열번호 28이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 7 또는 서열번호 20이며,
S21: 상기 센스 가닥은 서열번호 1 또는 서열번호 28이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 8 또는 서열번호 21이며,
S22: 상기 센스 가닥은 서열번호 1 또는 서열번호 28이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 9 또는 서열번호 22이며,
S23: 상기 센스 가닥은 서열번호 1 또는 서열번호 28이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 10 또는 서열번호 23이며,
S24: 상기 센스 가닥은 서열번호 1 또는 서열번호 28이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 11 또는 서열번호 24이며,
S25: 상기 센스 가닥은 서열번호 1 또는 서열번호 28이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 29 또는 서열번호 33이며,
S26: 상기 센스 가닥은 서열번호 1 또는 서열번호 28이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 30 또는 서열번호 34이며,
S27: 상기 센스 가닥은 서열번호 1 또는 서열번호 28이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 31 또는 서열번호 35이며,
S28: 상기 센스 가닥은 서열번호 1 또는 서열번호 28이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 32 또는 서열번호 36이며,
또는, 상기 이중-가닥 siRNA 유도체는 하기 S1-S17 중 어느 하나이고:
S1: 상기 센스 가닥은 서열번호 3 또는 서열번호 16이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 4 또는 서열번호 17이며,
S2: 상기 센스 가닥은 서열번호 5 또는 서열번호 18이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 4 또는 서열번호 17이며,
S3: 상기 센스 가닥은 서열번호 3 또는 서열번호 16이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 6 또는 서열번호 19이며,
S4: 상기 센스 가닥은 서열번호 5 또는 서열번호 18이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 6 또는 서열번호 19이며,
S5: 상기 센스 가닥은 서열번호 3 또는 서열번호 16이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 7 또는 서열번호 20이며,
S6: 상기 센스 가닥은 서열번호 5 또는 서열번호 18이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 7 또는 서열번호 20이며,
S7: 상기 센스 가닥은 서열번호 3 또는 서열번호 16이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 8 또는 서열번호 21이며,
S8: 상기 센스 가닥은 서열번호 5 또는 서열번호 18이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 8 또는 서열번호 21이며,
S9: 상기 센스 가닥은 서열번호 3 또는 서열번호 16이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 9 또는 서열번호 22이며,
S10: 상기 센스 가닥은 서열번호 5 또는 서열번호 18이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 9 또는 서열번호 22이며,
S11: 상기 센스 가닥은 서열번호 3 또는 서열번호 16이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 10 또는 서열번호 23이며,
S12: 상기 센스 가닥은 서열번호 5 또는 서열번호 18이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 10 또는 서열번호 23이며,
S13: 상기 센스 가닥은 서열번호 3 또는 서열번호 16이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 11 또는 서열번호 24이며,
S14: 상기 센스 가닥은 서열번호 5 또는 서열번호 18이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 11 또는 서열번호 24이며,
S15: 상기 센스 가닥은 서열번호 12 또는 서열번호 25이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 4 또는 서열번호 17이며,
S16: 상기 센스 가닥은 서열번호 13 또는 서열번호 26이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 4 또는 서열번호 17이며,
S17: 상기 센스 가닥은 서열번호 14 또는 서열번호 27이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 4 또는 서열번호 17이며,
또는, 상기 이중-가닥 siRNA 유도체는 하기 S29-S35 중 어느 하나이고:
S29: 상기 센스 가닥은 서열번호 37 또는 서열번호 42이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 10 또는 서열번호 23이며,
S30: 상기 센스 가닥은 서열번호 38 또는 서열번호 43이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 10 또는 서열번호 23이며,
S31: 상기 센스 가닥은 서열번호 3 또는 서열번호 16이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 39 또는 서열번호 44이며,
S32: 상기 센스 가닥은 서열번호 3 또는 서열번호 16이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 10 또는 서열번호 45이며,
S33: 상기 센스 가닥은 서열번호 3 또는 서열번호 16이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 40 또는 서열번호 46이며,
S34: 상기 센스 가닥은 서열번호 3 또는 서열번호 16이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 10 또는 서열번호 47이며,
S35: 상기 센스 가닥은 서열번호 3 또는 서열번호 16이고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 10 또는 서열번호 48인 것을 특징으로 하는 이중-가닥 siRNA 유도체, 이의 접합체 또는 이의 염. - 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 이중-가닥 siRNA 유도체 또는 이의 염의 접합체로서, 상기 이중-가닥 siRNA 유도체는 약학적으로 허용가능한 접합체 그룹과 결합되고, 상기 약학적으로 허용가능한 접합체 그룹은 GalNAc 그룹을 포함하고; 임의로, 상기 약학적으로 허용가능한 접합체 그룹은 1 내지 5 GalNAc 그룹인, 이중-가닥 siRNA 유도체 또는 이의 염의 접합체.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이중-가닥 siRNA 유도체는 약학적으로 허용가능한 접합체 그룹과 결합되고, 상기 약학적으로 허용가능한 접합체 그룹은 하기 화합물 그룹 D를 포함하는 것을 특징으로 하는 이중-가닥 siRNA 유도체 또는 이의 염의 접합체.
- 제13항 또는 제14항에 있어서, 상기 약학적으로 허용가능한 접합체 그룹은 상기 이중-가닥 siRNA 유도체의 센스 가닥의 3' 말단에 결합되는 것을 특징으로 하는 이중-가닥 siRNA 유도체 또는 이의 염의 접합체.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이중-가닥 siRNA 유도체 또는 이의 접합체의 포스포로티오에이트 부분은 (R)- 및 (S)-거울상 이성질체(enantiomers), 부분입체 이성질체(diastereoisomers) 및/또는 이들의 라세미(racemic) 혼합물인 것을 특징으로 하는 이중-가닥 siRNA 유도체, 이의 접합체 또는 이의 염.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염은 염기 부가염, 산 부가염 및 이들의 조합으로부터 선택되고; 임의로, 상기 염기 부가염은 나트륨, 칼륨, 칼슘, 암모늄, 유기 아민, 마그네슘 염 및 이들의 조합으로부터 선택되며, 상기 산 부가염은 무기산 유래 염, 유기산 유래 염 및 이들의 조합으로부터 선택되고; 임의로, 상기 무기산은 염산, 브롬화수소산, 질산, 탄산, 중탄산염 라디칼, 인산, 인산일수소, 인산이수소, 황산, 황산수소, 요오드화수소산, 아인산 및 이들의 조합으로부터 선택되며, 상기 유기산은 아세트산, 프로피온산, 이소부틸산, 말레산, 말론산, 벤조산, 석신산, 수베르산, 푸마르산, 락트산, 만델산, 프탈산, 벤젠설폰산, p-톨루엔설폰산, 시트르산, 타르타르산, 메탄설폰산 및 이들의 조합으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 이중-가닥 siRNA 유도체, 이의 접합체 또는 이의 염.
- 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 이중-가닥 siRNA 유도체, 이의 접합체 또는 이의 염; 및 임의의 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 약학 조성물.
- 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 이중-가닥 siRNA 유도체, 이의 접합체 또는 이의 염; 또는 제18항에 따른 약학 조성물의 B형 간염 치료용 약제를 제조하기 위한 용도.
- 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 이중-가닥 siRNA 유도체, 이의 접합체 또는 이의 염; 또는 제18항에 따른 약학 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 B형 간염을 치료하는 방법.
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010529520.7 | 2020-06-11 | ||
| CN202010529520 | 2020-06-11 | ||
| CN202011524835 | 2020-12-21 | ||
| CN202011524835.9 | 2020-12-21 | ||
| PCT/CN2021/098682 WO2021249352A1 (zh) | 2020-06-10 | 2021-06-07 | 双链siRNA类似物的缀合物 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20230022892A true KR20230022892A (ko) | 2023-02-16 |
Family
ID=84950085
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020227046437A KR20230022892A (ko) | 2020-06-11 | 2021-06-07 | 이중-가닥 sirna 유도체의 접합체 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP4166144A4 (ko) |
| JP (1) | JP2023528966A (ko) |
| KR (1) | KR20230022892A (ko) |
| CN (1) | CN115768439A (ko) |
| CA (1) | CA3186763A1 (ko) |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JOP20200092A1 (ar) * | 2014-11-10 | 2017-06-16 | Alnylam Pharmaceuticals Inc | تركيبات iRNA لفيروس الكبد B (HBV) وطرق لاستخدامها |
| EP4196102A1 (en) * | 2020-10-02 | 2023-06-21 | Sirnaomics, Inc. | NUCLEOSIDE CONTAINING siRNAS FOR TREATING VIRAL DISEASES |
-
2021
- 2021-06-07 JP JP2022575954A patent/JP2023528966A/ja active Pending
- 2021-06-07 EP EP21823093.6A patent/EP4166144A4/en active Pending
- 2021-06-07 KR KR1020227046437A patent/KR20230022892A/ko active Search and Examination
- 2021-06-07 CA CA3186763A patent/CA3186763A1/en active Pending
- 2021-06-07 CN CN202180041587.9A patent/CN115768439A/zh active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN115768439A (zh) | 2023-03-07 |
| EP4166144A4 (en) | 2024-07-10 |
| JP2023528966A (ja) | 2023-07-06 |
| EP4166144A1 (en) | 2023-04-19 |
| CA3186763A1 (en) | 2021-12-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| BR112021013654A2 (pt) | Lipídeos para liberação de nanopartículas lipídicas de agentes ativos | |
| JP7273417B2 (ja) | 核酸、当該核酸を含む組成物および複合体ならびに調製方法と使用 | |
| JP7360716B2 (ja) | 核酸、当該核酸を含む組成物および複合体ならびに調製方法と使用 | |
| US11896674B2 (en) | SiRNA conjugate, preparation method therefor and use thereof | |
| JP2023082151A (ja) | 核酸、当該核酸を含む組成物及び複合体ならびに調製方法と使用 | |
| US20230235330A1 (en) | Conjugate of double-stranded sirna analogue | |
| CN112105625A (zh) | 核苷酸前体、核苷酸类似物以及含其的寡聚化合物 | |
| KR20210110839A (ko) | 핵산, 핵산을 함유하는 조성물 및 접합체, 이의 제조 방법 및 용도 | |
| EP3992290A1 (en) | Nucleic acid, pharmaceutical composition and conjugate, preparation method therefor and use thereof | |
| EP3842534A1 (en) | Nucleic acid, pharmaceutical composition and conjugate containing nucleic acid, and use thereof | |
| EP4194553A1 (en) | Modified sirna with reduced off-target activity | |
| CN116368146A (zh) | 脱唾液酸糖蛋白受体的新型配体 | |
| CN114728999A (zh) | 含有核苷酸类似物的寡核苷酸 | |
| TW202111121A (zh) | 核酸、藥物組合物與綴合物及製備方法和用途 | |
| US20230076803A1 (en) | Compound and drug conjugate, and preparation method and use thereof | |
| US20230220386A1 (en) | Sirna conjugate, double-stranded sirna conjugate, salt thereof and application thereof | |
| WO2020233651A1 (zh) | 核酸、药物组合物与缀合物及制备方法和用途 | |
| CN115884984A (zh) | 用于治疗肝纤维化的结合物和方法 | |
| KR20230022892A (ko) | 이중-가닥 sirna 유도체의 접합체 | |
| EP4365290A1 (en) | Nucleic acid ligand and conjugate thereof, and preparation method therefor and use thereof | |
| CN118302526A (zh) | 一种dsRNA、其制备方法及应用 | |
| US20230210882A1 (en) | Conjugate group and conjugate | |
| WO2024125636A1 (zh) | Toll样受体调节剂与dsRNA的联合治疗 | |
| WO2023208023A1 (zh) | 氘代化学修饰和包含其的寡核苷酸 | |
| Milton | Synthesis and Studies Of 2´-o-alkylated Oligonucleotides With Enhanced Stability and Cellpenetrating Properties |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination |