CN106459975A - 肽载体上的多个寡核苷酸部分 - Google Patents

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Abstract

本文涉及反义寡核苷酸(AON)，例如磷二酰胺吗啉代寡核苷酸(PMO)。本文进一步涉及多个PMO与阳离子细胞穿透肽(CPP)缀合以增强PMO吸收至骨骼肌和心肌细胞。

Description

肽载体上的多个寡核苷酸部分
相关申请的交叉引用
本申请案要求保护2014年5月23日提交的美国临时专利申请号62/002,296的优先利益，其通过提述以其整体并入本文。
本发明的说明
发明领域
本文涉及反义寡核苷酸(AON)，例如，但不限于磷二酰胺吗啉代寡核苷酸(PMO)。本文进一步涉及多个PMO与阳离子细胞穿透肽(CPPs)缀合以增强PMO吸收至感兴趣的组织中，如骨骼的和心脏的肌肉细胞。本公开涵盖这样的缀合物，以及其使用方法，包括，例如使用它们调节基因表达。本公开进一步包括通过将所述多个PMO-CPP缀合物施用于对其有需要的人或动物来治疗多种疾病状态的方法。
发明内容
已显示AON在体外和体内在多种疾病状态包括例如杜氏肌营养不良(Duchennemuscular dystrophy,DMD)中成功地调节基因表达。具体地，经设计以靶向并移除框内外显子23的PMO已在DMD的mdx小鼠模型中成功恢复抗肌萎缩蛋白(dystrophin)功能。
然而，AON还显现在骨骼肌和心肌细胞中不良吸收的概貌，这妨碍其影响mRNA转录和翻译的能力。(WO 2009/147368)具体地，PMO，2-O-甲基寡核苷酸和肽核酸(PNA)不会显著地累积在骨骼肌中且其在心肌中的吸收是可忽略的。
在1980年代晚期发现了细胞穿透肽(CPP)。[Frankel和Pabo Cell 1988；Green和Loewenstein Cell 1988]这些化合物帮助转运不同部分穿过细胞膜，以其自身穿过细胞膜本来有困难。在发现CPP约20年后，使用mdx小鼠模型的数个研究显示，称为“K”(RXRRXRRXRRXRXB,SEQ ID NO.:43)和“B”(RXRRBRRXRRBRXB,SEQ ID NO.:44)的CCP连接于(tethered to)经设计以跳过编码抗肌萎缩蛋白的mRNA的外显子23(PMO23)的单一PMO极大地增加骨骼肌和心肌中的外显子跳过。[Jearawiriyapaisarn等Mol Therapy 2008]这些研究的结果证明了单一PMO-CPP缀合物在骨胳肌中呈现>85％外显子23的跳过，而裸PMO化合物则造成<15％外显子跳过。相比裸PMO(其在心肌中并未造成外显子23跳过)，在心肌中还观察到适度的效果(～60％)[如前文所述]。
WO 2009/144481涉及包括细胞递送肽与生物活性化合物如AON(包括例如PMO)的复合的构建体。WO 2004/097017(US 2004/0265879和US2009/0082547)涉及增强分子递送的方法，其包括公开了生物作用剂(如PMO)和肽转运子的缀合物。WO 2009/147368公开了新的CPP，其可与例如PNA和PMO缀合。US 2010/0130591公开了能结合人抗肌萎缩蛋白基因中所选靶向位置的PMO，其可与CPP缀合。
虽有以单一PMO-CPP缀合物观察到的增强的效力，该缀合物相比裸PMO具备增加的毒性[引用]。例如，对于使用CPP-PMO23B或CPP-PMO23K的mdx小鼠外显子23跳过研究，最大耐受剂量显示为30mg/kg。在60mg/kg的量时，小鼠体重减少而150mg/kg的剂量则为致死的。[Amantana等Bioconjugate Chem 2007]相反地，裸PMO23可以高至250mg/kg的量施用而无任何明显的毒性作用[如前文所述]。WO 2009/005793公开了具有下列四个X(6-氨基己酸)残基的CPP，包括CPP“B”呈现比之前鉴定的CPP更低的毒性。然而，如上所示，这些与单一PMO偶联的CPP相比裸PMO仍显示不可接受的毒性[如前面的引用文及Moulton和MoultonBiochemica et Biophysica Acta 2010]。
因此，本公开的主要目标是克服裸PMO的不良吸收及与单一PMO-CPP构建体有关的毒性增加的问题。通过在D-或L-对映异构位置添加谷氨酸导入CPP上的多个缀合位点以降低靠近CPP末端处的多个PMO的立体位阻。使用在P1具有氨基酸苯丙氨酸-赖氨酸的肽酶裂解位点，将-P1位置导入CPP和PMO之间。肽酶裂解位点的裂解将PMO从CPP释放。例如，CPP可经由马来酰亚胺酯化的接头以可在半胱氨酸位置导入的酶裂解位点苯丙氨酸-赖氨酸或缬氨酸-瓜氨酸与PMO附接。CPP还可经由酰胺键附接。
使用肽内化进入细胞可产生细胞内蛋白酶，包括溶酶体酶，其裂解该裂解位点而且游离的PMO会具有来自肽结合的缀合物的较低的立体位阻。该较低的立体局限可增加外显子跳过效力而具有对细胞核和细胞质较小的毒性。
在至少一方面，这通过发现如本文进一步描述的多个PMO-CPP缀合物来实现。本公开还涵盖通过取代根据本发明的缀合物增加单一PMO-CPP缀合物的安全边际的方法。本公开进一步包括调节基因表达的方法，如编码糖原合酶(GYS1或GYS2)、转化生长因子(TGFβ)、基质金属肽酶(MMP2或MMP9)、骨桥蛋白(osteopontin)、强直性抗肌萎缩蛋白激酶(DMPK)、Elav样家族成员2(还称为CUG三联体重复RNA-结合蛋白或CUGBP)、双同源异形盒4(DUX4)和/或(Frzl)的那些。下列基因：糖原合酶(GYS1或GYS2)、转化生长因子(TGFβ)、基质金属肽酶(MMP2或MMP9)、骨桥蛋白、强直性抗肌萎缩蛋白激酶(DMPK)、Elav样家族成员2(还称为CUG三联体重复RNA-结合蛋白或CUGBP)、双同源异形盒4(DUX4)和/或(Frzl)(的基因)可经由本发明的PMO-CPP缀合物而被靶向以介导外显子跳过，从而产生移码突变。任何移码突变可导致由AON序列靶向的mRNA量的功能性减少。本公开在其范围内还包括多个PMO-CPP缀合物在多种疾病状态中用于抑制微小RNA的用途。在另一方面，本公开包括治疗多种疾病和/或病况的方法，如与上文提及的基因和微小RNA有关的那些。
本公开其他目标和优势将在下述说明中列出，且部分会自然地源自于说明，或可通过实践公开的实施方案习知。本公开的目标和优势将借助所附权利要求中具体指出的要素和组合而实现和获得。
应理解的是，前述的一般说明和下列详细说明二者仅为例示性和解释性而并非限制本发明，如所要求保护的。
并入且构成本说明书的部分的附图，其说明本发明的一个(数个)实施方案，并与该说明书一起用于解释本发明的原理。
附图简述
图1为附接于单一CPP的多个AON的构造的示意图。
图2为可寡聚化并用于本发明多个AON构造的多种反义寡核苷酸亚基的示意图。
图3描绘在野生型小鼠中一些CPP-PMO缀合物对外显子23跳过的作用。
实施方案的说明/发明详述
如上文所述，本发明的一个目标是改善单一PMO-CPP缀合物的安全概貌，而不损害缀合物进入目标细胞的摄取。一般优选的是在有效剂量和无不良作用水平(NOAEL)之间具有至少10-倍安全边际。在上述mdx/外显子23实验中，发现有效剂量为30mg/kg而NOAEL也为30mg/kg。结果，仅有极少或无安全边际。在本公开的至少一个实施方案中，多个PMO-CPP缀合物具有比上述mdx/外显子23实验更好的安全边际，如为后者的2-倍，如为5-倍，如为6-倍，如为10-倍。10-倍安全边际指该有效剂量比NOAEL低10倍(为NOAEL的1/10)。因此，当在适当的模型中测试时，根据本发明的多个PMO-CPP缀合物可具有为对应的单一PMO-CPP缀合物至少2-倍(好)的安全边际。本发明包括与单一CPP附接的多个AON，包含PMO AON。
在本公开的至少一个实施方案中，多个AON-CPP缀合物进一步包括可裂解的接头。在一些实施方案中，该接头为含有裂解基序的序列。在一些实施方案中，该裂解基序可由任何水解酶裂解。在一些实施方案中，该裂解基序可由肽酶或蛋白酶如组织蛋白酶(cathepsin)或胰蛋白酶(trypsin)裂解。在一些实施方案中，该接头可经设计以包括由特定丝氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶或金属蛋白酶或多于一个肽酶的组识别的裂解基序。在一些实施方案中，该接头可包括二或多个重叠或非重叠的裂解基序。在一些实施方案中，该接头可不含有裂解基序。在一些实施方案中，该接头可经设计使得少于100％、少于75％、少于50％或少于10％的接头被裂解。在一些实施方案中，该接头可经设计使得多于90％或99％的接头被裂解。
在本公开的至少一个实施方案中，该多个AON-CPP缀合物进一步包括可裂解的接头，如在P1/P1’位置的FK，或在另外的实施方案中在P1/P1’位置的FX，其中X为任何天然存在的氨基酸。可裂解接头(其中所述接头可由水解酶例如如组织蛋白酶裂解)可出现在AON和CPP之间或其可出现在序列中，如AON-可裂解接头-AON-可裂解接头-CPP。在另一实施方案中，多个PMO-CPP缀合物进一步包括可裂解接头，例如组织蛋白酶或P1/P1’位置的FK或在另一实施方案中，在P1/P1’位置的FX，其中X为任何天然存在的氨基酸。可裂解接头可出现在PMO和CPP之间或其可出现在序列中，如PMO-可裂解接头-PMO-可裂解接头-CPP，例如，作为PMO-组织蛋白酶接头-PMO-组织蛋白酶接头-CPP。本公开不限制AON(包括PMO)、可裂解接头和CPP的顺序，且本领域的技术人员使用本文公开的信息会能够设计根据权利要求具有至少一个组织蛋白酶裂解位点的合适的多个AON-CPP缀合物。
令人惊奇地发现，根据本公开的具有可裂解接头位点的多个PMO-CPP缀合物在一些情况下呈现甚至比无可裂解接头位点的多个PMO-CPP缀合物更好的效力。该结果为预料不到的，因为已显示，如果肽部分降解太快，则单一PMO-CPP缀合物被吸收入溶酶体中并保持陷入。换言之，如果单一PMO-CPP缀合物的CPP部分快速降解，则PMO变得陷入溶酶体中且无法到达其细胞靶标，因而减少效力。(Youngblood等，2007)作为此现象的结果，已预期在缀合物中加入可裂解接头位点会促进CPP的降解，导致效力减少。然而，在如下面具体实施例中描述的根据本发明的具有可裂解接头位点的一些多个PMO-CPP缀合物中情况并非如此。因此，在本公开的至少一个实施方案中，多个PMO-CPP缀合物具有至少一个可裂解接头位点。在本公开的至少另一个实施方案中，多个PMO-CPP缀合物具有至少一个组织蛋白酶可裂解接头位点。
本发明进一步包括调节基因表达的方法，如编码糖原合酶(GYS1或GYS2)、转化生长因子(TGFβ)、基质金属肽酶(MMP2或MMP9)、骨桥蛋白、强直性抗肌萎缩蛋白激酶(DMPK)、Elav样家族成员2(还称为CUG三联体重复RNA-结合蛋白或CUGBP)、双同源异形盒4(DUX4)和/或(Frzl)的那些，其中本发明的多个AON-CPP缀合物介导外显子跳过以产生移码突变。任何移码突变可导致靶向的mRNA的敲低。本公开在其范围内还包括多个PMO-CPP缀合物在多种疾病状态中用于抑制微小RNA的用途。在至少一个实施方案中，本公开包括治疗多种疾病和/或病况的方法，如与上文提及的基因和微小RNA有关的那些。本公开的多个CPP-PMO缀合物可通过任何合适的手段施用于对其有需要的人或动物。向人或动物患者的施用可选自非经肠(parenteral)、肌肉内、脑内、血管内、皮下或经皮。在至少一个实施方案中，施用路径是通过注射，例如静脉内或肌肉内。治疗医师会能够确定适当的施用路径。
当用作为药物时，本文公开的多个CPP-PMO缀合物反义寡核苷酸可与药物可接受的赋形剂或载剂配制以配制成药物组合物。
当用作为药物时，多个CPP-PMO缀合物反义寡核苷酸可以药物组合物的形式施用。这些化合物可通过多种路径施用，包括口服、直肠、经皮、皮下、静脉内、肌肉内和鼻内。这些化合物作为可注射和口服组合物二者都是有效的。这样的组合物以药物领域已知的方式制备并包含至少一种活性化合物。
本发明还包括药物组合物，其含有作为活性成份的一种或多种多个CPP-PMO缀合物反义寡核苷酸与一种或多种药物可接受的赋形剂或载剂的结合。在本发明的组合物的制造中，活性成份通常与赋形剂或载剂混合，用赋形剂或载剂稀释，或包含在这样的赋形剂或载剂中，其可为胶囊、囊剂(sachet)、纸或其他容器的形式。当赋形剂或载剂作为稀释剂时，其可为固体、半固体或液体材料，其充当活性成份的运载体、载剂或介质。因此，组合物可为下述形式：片剂、丸剂、粉剂、锭剂(lozenge)、囊剂、扁囊剂(cachet)、酏剂(elixir)、悬浮剂、乳剂、溶液、糖浆、气雾剂(或固体或在液体介质中)、含有例如多至按重量计10％的活性化合物的软膏(ointment)、软和硬明胶胶囊、栓剂、无菌可注射溶液和无菌包装粉末。
在配制物的制备中，必需的是在与其他的活性成份组合之前磨制活性化合物以提供适当的粒度。如果活性化合物基本上为不溶性的，其一般磨制成低于200目(mesh)的粒度。如果活性化合物为基本上水溶性的，一般通过磨制来调整粒度以提供配制物中基本上均匀的分布，例如约40目。
一些合适的赋形剂或载剂的实例包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶(gum acacia)、磷酸钙、藻酸盐、黄蓍胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、无菌水、糖浆和甲基纤维素。配制物可另外包括：润滑剂例如滑石、硬脂酸镁和矿物油；湿润剂；乳化剂和悬浮剂；防腐剂例如甲基-和丙基羟基-苯甲酸酯(盐)；及甜味剂和调味剂。本发明的组合物可通过使用本领域已知的步骤配制，从而在施用于患者后提供活性成份的快速、持续或延迟的释放。
组合物优选配制成单位剂型，每个剂量含有约5mg至约100mg或更多，例如任何下述：约5mg至约10mg，约5mg至约20mg，约5mg至约30mg，约5mg至约40mg，约5mg至约50mg，约5mg至约60mg，约5mg至约70mg，约5mg至约80mg，或约5mg至约90mg的活性成分，含端值，包括这些值之间的任何范围。术语“单位剂型”指适合作为个体的单位剂量的物理上离散的单位，各单位含有经计算以产生预期治疗效果的预定量的活性物质连同合适的药物赋形剂或载剂。
多个CPP-PMO缀合物反义寡核苷酸在广泛的剂量范围有效，且一般以治疗有效量施用。然而，应该理解的是，实际上施用的多个CPP-PMO缀合物反义寡核苷酸的量会由医师依照相关的情况(包括待治疗的病况、选择的施用路径、实际施用的化合物、个体患者的年龄、重量和响应、患者症状的严重程度等)来确定。
对于制备固体组合物如片剂，将主要活性成份/多个CPP-PMO缀合物反义寡核苷酸与药物赋形剂或载剂混合以形成含有本发明化合物的均质混合物的固体预配制组合物。当称这些预配制组合物为均质时，是指该活性成份均匀地分散遍及组合物，使得组合物可容易地细分成同等有效的单位剂型，例如片剂、丸剂和胶囊。
本发明的片剂或丸剂可经涂覆或以其他方式混合以提供给予延长作用优势的剂型。例如，片剂或丸剂可包括内部剂量和外部剂量组分，后者为处于前者上的包覆物(envelope)的形式。两种组分可通过用于在胃中抵抗崩解并允许内部组分完整通过进入十二指肠或待延迟释放的肠衣层分开。多种材料可用于所述肠衣层或涂层，这样的材料包括许多聚合酸和聚合酸与物质(如虫胶(shellac)、鲸蜡醇和乙酸纤维素)的混合物。
其中可并入本发明新型组合物用于口服或注射施用的液体形式包括水溶液、适当调味的糖浆、水性或油性悬液和具有食用油类例如玉米油、棉籽油、芝麻油、椰子油或花生油的调味乳液，以及酏剂和类似的药物运载体。
用于吸入或吹入的组合物包括药物可接受的水性或有机溶剂或其混合物中的溶液和悬液，和粉末。液体或固体组合物可含有如前文所述的合适的药物可接受的赋形剂。组合物可通过口或鼻呼吸路径施用用于局部或全身作用。药物可接受的溶剂中的组合物可通过使用惰性气体雾化。雾化的溶液可从雾化装置直接吸入或该雾化装置可附接于面罩帐篷(face mask tent)或间歇式正压呼吸机。溶液、悬液或粉末组合物还可从以合适的方式递送该配制物的装置通过口或鼻施用。
根据本公开的多个CPP-AON(包括CPP-PMO)缀合物可以1-200mg/kg，如10-50mg/kg的每日剂量来施用。CPP-AON缀合物(包括CPP-PMO)可以推注(bolus)形式或在延长的注射期来施用。例如每日剂量可以一个推注剂量来施用。可替换地，每日剂量可经由注射，如静脉内或皮下注射来施用。在另一个实施方案中，每日剂量可分成数次施用，如每天两次、三次或四次。可根据需要每天重复给药，如治疗医师确定的。治疗可为短期的，如少于6个月。在另一个的实施例中，治疗可为长期的，如超过6个月，如超过1年，如超过10年，如在需要治疗的人或动物的有生之年中。
本公开的多个AON缀合物，包括PMO-CPP缀合物，特异性地与一或多个从靶基因或基因座转录的前-mRNA、mRNA和/或微小RNA或长的非编码RNA杂交。如文中所用，当多个PMO-CPP缀合物在生理条件下与靶杂交时，多个PMO-CPP缀合物特异性地与靶多核苷酸如前-mRNA或mRNA杂交。在本公开的上下文中，杂交经由氢键发生，其可为互补的嘌呤和嘧啶碱基之间的Watson-Crick、Hoogsteen或反Hoogsteen氢键。例如，腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)为互补的核碱基，其通过形成氢键来配对。根据本公开，多个PMO-CPP缀合物的PMO部分特异性地与靶核苷酸杂交。CPP部分可保持与多个PMO-CPP缀合物连接或其可在杂交前裂解，如例如在组织蛋白裂解位点裂解。
当杂交发生时，根据一般可接受的碱基配对规则，例如腺嘌呤(A)-胸腺嘧啶(T)，胞嘧啶(C)-鸟嘌呤(G)，腺嘌呤(A)-尿嘧啶(U)，本公开的PMO化合物与靶多核苷酸，如前-mRNA、mRNA或微小RNA或长非编码RNA互补。具体而言，“互补”如文中所用指两个核碱基之间精确配对的能力。例如，如果在PMO化合物一定位置的碱基(B)能与在前-mRNA或mRNA分子的相同位置的核苷酸氢键结合，则认为PMO和靶多核苷酸分子在该位置是彼此互补的。当各分子中足够数量的对应位置被可彼此氢键结合的碱基占据时，则PMO化合物和靶多核苷酸分子是彼此互补的。因此，“特异性可杂交的”和“互补的”为可用于指示足够程度的互补性或精确配对使得PMO和多核苷酸靶标之间发生稳定或特异性结合的术语。绝对互补性(即100％互补碱基配对)并非必需的，只要靶多核苷酸分子和PMO之间形成的杂双链具有预期的稳定性足以引发预期的效果。根据本公开，在其中预期特异性结合的条件下，例如对于体内施用在生理条件下，或对于体外施用在其中进行测定的条件下，当PMO化合物与靶多核苷酸分子的结合改变靶多核苷酸分子的正常功能，且存在足够程度的互补性以避免PMO与非靶序列的不合意的非特异结合时，PMO为特异性可杂交的。
PMO和靶多核苷酸分子如mRNA或前-mRNA之间的这种杂交干扰其正常功能，如从mRNA翻译蛋白和剪接前-mRNA以产生一个或多个mRNA种类。在本公开的至少一个实施方案中，PMO和前-mRNA之间的杂交影响前-mRNA剪接以形成RNA。在另一个实施方案中，杂交影响从mRNA翻译成蛋白。在本公开的另一个实施方案中，多个CPP-AON缀合物与前-mRNA或mRNA上的微小RNA结合位点的杂交可将靶前-mRNA或mRNA从后续的被微小RNA的调节解除。在此情况下，该作用可为增强由前mRNA或mRNA编码的基因产物的表达。相反地，如果多个CPP-AON，例如多个-CPP PMO，靶向微小RNA内的序列，使得微小RNA的生物活性受阻，则所述作用可能为在受到特定微小RNA的阻抑下增强多种基因产物的表达。
以靶多核苷酸的此种干扰的整体作用为选择性调节基因表达。在本公开的上下文中，“调节”指增加(刺激)或降低(抑制)基因表达。
根据本公开的AON包括PMO化合物以及PNA化合物，氨基磷酸酯化合物、亚甲基甲基亚氨基(“MMI”)化合物、2-O-甲基化合物和2-甲氧基乙基化合物，其中各亚基的寡核碱基列于图1中。寡核苷酸化合物为天然核酸的合成的类似物。具体而言，取代脱氧核糖环和磷酸-键(linkage)，该寡核苷酸化合物包括由如下所示的各寡核苷酸亚基所组成的亚基：
在各式1-VI的情况中，B为核苷酸碱基。主要的核碱基有胞嘧啶(DNA和RNA)、鸟嘌呤(DNA和RNA)、腺嘌呤(DNA和RNA)、胸腺嘧啶(DNA)和尿嘧啶(RNA)，缩写分别为C、G、A、T和U。A、G、C和T出现在DNA中，这些分子称为DNA-碱基；A、G、C和U称为RNA-碱基。尿嘧啶在RNA中替代胸腺嘧啶。除了尿嘧啶缺乏5'甲基外，这两个碱基是相同的。腺嘌呤和鸟嘌呤属于称为嘌呤(缩写为R)的双环类分子。胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶都为嘧啶类(缩写为Y)。
PMO化合物具有分别由吗啉环和磷酰二氨-连接基团组成的亚基。例如，本公开包括含有式(II)的15至30个亚基的PMO化合物：
其中R为烷基而B为选自胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)或胸腺嘧啶(T)的天然存在的嘌呤或嘧啶核苷酸碱基。
PNA化合物具有由式I的亚基所组成的亚基。本公开包括含有式(I)的15至30个亚基的PMO化合物：
其中B为选自胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)或胸腺嘧啶(T)的嘌呤或嘧啶核苷酸碱基。
氨基磷酸酯化合物具有由式III的亚基组成的亚基。本公开包括含有式III的15至30个亚基的氨基磷酸酯化合物：
其中B为选自胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)或胸腺嘧啶(T)的嘌呤或嘧啶核苷酸碱基。
MMI化合物具有由式IV的亚基组成的亚基。例如，本公开包括含有式(IV)的15至30个亚基的MMI化合物：
其中B为选自胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)或胸腺嘧啶(T)的嘌呤或嘧啶核苷酸碱基。
2-OMe化合物具有由式V组成的亚基。例如，本公开包括含有式(V)的15至30个亚基的2-OMe化合物：
其中B为选自胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)或胸腺嘧啶(T)的嘌呤或嘧啶核苷酸碱基。
2-MOE化合物具有由式VI组成的亚基。例如，本公开包括含有式(VI)的15至30个亚基的2MOE化合物：
其中B为选自胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)或胸腺嘧啶(T)的嘌呤或嘧啶核苷酸碱基。
各类AON的上述说明可各自被取代，其中AON-CPP描述于说明书中，例如2MOE-CPP、MMI-CPP、2-OMe-CPP、PNA-CPP和氨基磷酸酯-CPP。
在至少一个实施例中，AON化合物具有式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)或(VI)的15-25个亚基。在另一个的实施方案中，AON化合物具有式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)或(VI)的20-25个亚基。在又一个实施方案中，AON化合物具有式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)或(VI)的约25个亚基，例如24-26个亚基。
根据本公开，多个PMO-CPP缀合物具有少于60％的PMO亚基，其中核碱基(B)为C或G。在至少一个实施方案中，多个PMO-CPP缀合物具有低于50％的PMO亚基，其中核碱基为C或G。
根据本公开，多个AON-CPP缀合物具有低于60％的AON(式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)或(VI)的)亚基，其中核碱基(B)为C或G。在至少一个实施方案中，多个AON-CPP缀合物具有低于50％的AON亚基，其中核碱基为C或G。
本公开的多个PMO-CPP缀合物具有至少2个PMO化合物，所述PMO化合物具有0至3个重复亚基，其中核碱基为G。在至少一个实施方案中，多个PMO-CPP缀合物具有0个重复亚基，其中B为G。在另一个实施方案中，多个PMO-CPP缀合物具有1、2或3个重复亚基，其中B为G。通过在D-或L-对映异构位置加入谷氨酸而导入CPP上的多个缀合位点以降低在CPP末端附近的多个PMO的立体位阻。使用在P1具有氨基酸苯丙氨酸-赖氨酸的肽酶裂解位点，将-P1位置导入CPP和PMO之间。肽酶裂解位点的裂解将PMO从CPP释放。例如，CPP可经由马来酰亚胺酯化接头以可在半胱氨酸位置导入的酶裂解位点苯丙氨酸-赖氨酸或缬氨酸-瓜氨酸附接于PMO。CPP可通过酰胺键附接。
本公开的多个AON-CPP缀合物具有至少两个AON化合物，该AON化合物具有0至3个重复亚基，其中核碱基为G。在至少一个实施方案中，多个AON-CPP缀合物具有0个重复亚基，其中B为G。在另一个实施方案中，多个AON-CPP缀合物具有1、2或3个重复亚基，其中B为G。通过在D-或L-对映异构位置加入谷氨酸而导入CPP上的多个缀合位点以降低在CPP末端附近的多个AON的立体位阻。使用在P1具有氨基酸苯丙氨酸-赖氨酸的肽酶裂解位点，将-P1位置导入CPP和AON之间。肽酶裂解位点的裂解将AON从CPP释放。例如，CPP可经由马来酰亚胺酯化接头以可在半胱氨酸位置导入的酶裂解位点苯丙氨酸-赖氨酸或缬氨酸-瓜氨酸附接于AON。CPP可通过酰胺键附接。
使用肽内化入细胞可产生细胞内蛋白酶(包括溶酶体酶)，其裂解该裂解位点且游离的PMO或AON会具有来自肽结合缀合物的较低的立体位阻。该较低的立体局限可增加外显子跳过效力而具有对细胞核和细胞质较小的毒性。
根据本公开，多个PMO-CPP缀合物的CPP组分可选自已知的CPP，如命名为A-N的那些，其具有表1、2、图1或本公开所述的K系列或B系列CPP中的序列。
根据本公开，多个AON-CPP缀合物的CPP组分可选自已知的CPP，如命名为A-N的那些，其具有表1、2、图1或本公开所述的K系列或B系列CPP中的序列。
在至少一个实施方案中，CPP组分为肽K：RXRRXRRXRRXRXB(SEQ ID NO：43)，其中R为D-精氨酸，X为6-氨基己酸且B为β-丙氨酸。在另外的实施例中，CPP组分为肽B：RXRRBRRXRRBRXB(SEQ ID NO：44)，其中R、X和B如上文所定义。
本公开的多个PMO-CPP或AON-CPP缀合物的CPP组分还可为包括式可变序列-间隔(spacer)-接头的化合物，其中可变序列为Ac-R(O)nR，其中n≥7；其中O为选自R、X和Z的残基的序列；其中R为L-精氨酸，X为3-顺式-氨基环己烷，且Z为顺式-2-氨基环戊烷-1-羰基。在一些实施方案中，接头为含有裂解基序的序列。在一些实施方案中，裂解基序可通过任何水解酶裂解。在一些实施方案中，裂解基序可通过肽酶或蛋白酶如组织蛋白酶或胰蛋白酶裂解。在一些实施方案中，接头可经设计以包括由特定丝氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶或金属蛋白酶或多于一个肽酶的组识别的裂解基序。在一些实施方案中，接头可包括两个或多个重叠或非重叠的裂解基序。在一些实施方案中，接头可不含有裂解基序。在一些实施方案中，接头可经设计使得少于100％，少于75％，少于50％，或少于10％的接头被裂解。在一些实施方案中，接头可经设计使得多于90％或99％的接头被裂解。
在一些实施方案中，CPP可为包括式可变序列-间隔-接头的化合物，其中可变序列为Ac-R(O)nR，其中n≥7；其中O为选自R、X和Z的残基的序列；其中R为L-精氨酸，X为3-顺式-氨基环己胺，且Z为顺式-2-氨基环戊烷-1-羰基；且其中可变序列包括α-、β-、γ-或δ-氨基酸或环烷结构。
在一些实施方案中，CPP可为包括式可变序列-间隔-接头的化合物，其中可变序列为Ac-R(O)nR，其中n≥7；其中O为选自R、X和Z的残基的序列；其中R为L-精氨酸，X为3-顺式-氨基环己烷，且Z为顺式-2-氨基环戊烷-1-羰基；且其中可变序列引起化合物靶向细胞核。
在一些实施方案中，CPP可为包括式可变序列-间隔-接头的化合物，其中可变序列为Ac-R(O)nR，其中n≥7；其中O为选自R、X和Z的残基的序列；其中R为L-精氨酸，X为3-顺式-氨基环己烷，且Z为顺式-2-氨基环戊烷-1-羰基；且其中可变序列引起化合物靶向细胞质。
在一些实施方案中，CPP可为包括式可变序列-间隔-接头的化合物，其中可变序列为Ac-R(O)nR，其中n≥7；其中O为选自R、X和Z的残基的序列；其中R为L-精氨酸，X为3-顺式-氨基环己烷，且Z为顺式-2-氨基环戊烷-1-羰基；且其中可变序列引起化合物靶向线粒体。
在一些实施方案中，CPP可为包括式可变序列-间隔-接头的化合物，其中可变序列为Ac-R(O)nR，其中n≥7；其中O为选自R、X和Z的残基的序列；其中R为L-精氨酸，X为3-顺式-氨基环己烷，且Z为顺式-2-氨基环戊烷-1-羰基；且其中所述间隔包括氨基己酸(Ahx)。
在一些实施方案中，CPP可为包括式可变序列-间隔-接头的化合物，其中可变序列为Ac-R(O)nR，其中n≥7；其中O为选自R、X和Z的残基的序列；其中R为L-精氨酸，X为3-顺式-氨基环己烷，且Z为顺式-2-氨基环戊烷-1-羰基；且其中所述间隔包括(Ahx)B，其中B选自β-丙氨酸或β-甘氨酸。
在一些实施方案中，CPP可为包括式可变序列-间隔-接头的化合物，其中可变序列为Ac-R(O)nR，其中n≥7；其中O为选自R、X和Z的残基的序列；其中R为L-精氨酸，X为3-顺式-氨基环己烷，且Z为顺式-2-氨基环戊烷-1-羰基；且其中所述接头包括裂解基序。
在一些实施方案中，CPP可为包括式可变序列-间隔-接头的化合物，其中可变序列为Ac-R(O)nR，其中n≥7；其中O为选自R、X和Z的残基的序列；其中R为L-精氨酸，X为3-顺式-氨基环己烷，且Z为顺式-2-氨基环戊烷-1-羰基；其中所述接头包括裂解基序；且其中裂解基序可通过水解酶裂解。
在一些实施方案中，此CPP可为包括式可变序列-间隔-接头的化合物，其中可变序列为Ac-R(O)nR，其中n≥7；其中O为选自R、X和Z的残基的序列；其中R为L-精氨酸，X为3-顺式-氨基环己烷，且Z为顺式-2-氨基环戊烷-1-羰基；且其中所述接头包括FS。
在一些实施方案中，CPP可为包括式可变序列-间隔-接头的化合物，其中可变序列为Ac-R(O)nR，其中n≥7；其中O为选自R、X和Z的残基的序列；其中R为L-精氨酸，X为3-顺式-氨基环己烷，且Z为顺式-2-氨基环戊烷-1-羰基；且其中所述接头包括FSQ。
在一些实施方案中，CPP可为包括式可变序列-间隔-接头的化合物，其中可变序列为Ac-R(O)nR，其中n≥7；其中O为选自R、X和Z的残基的序列；其中R为L-精氨酸，X为3-顺式-氨基环己烷，且Z为顺式-2-氨基环戊烷-1-羰基；且其中所述接头包括FSQK。
在一些实施方案中，CPP可为包括式可变序列-间隔-接头的化合物，其中可变序列为Ac-R(O)nR，其中n≥7；其中O为选自R、X和Z的残基的序列；其中R为L-精氨酸，X为3-顺式-氨基环己烷，且Z为顺式-2-氨基环戊烷-1-羰基；且其中所述接头包括FxyB，x为任何氨基酸，y选自谷氨酸(E)、天冬氨酸(D)、赖氨酸(K)、丝氨酸(S)和苏氨酸(T)，而B为β-丙氨酸。
在一些实施方案中，CPP可为包括式可变序列-间隔-接头的化合物，其中可变序列为Ac-R(O)nR，其中n≥7；其中O为选自R、X和Z的残基的序列；其中R为L-精氨酸，X为3-顺式-氨基环己烷，且Z为顺式-2-氨基环戊烷-1-羰基；且其中所述接头包括FxyB，x为任何氨基酸，y选自谷氨酸(E)、天冬氨酸(D)、赖氨酸(K)、丝氨酸(S)和苏氨酸(T)，而B为β-丙氨酸；且其中y为谷氨酸的非天然类似物。
在一些实施方案中，CPP可为包括式可变序列-间隔-接头的化合物，其中可变序列为Ac-R(O)nR，其中n≥7；其中O为选自R、X和Z的残基的序列；其中R为L-精氨酸，X为3-顺式-氨基环己烷，且Z为顺式-2-氨基环戊烷-1-羰基；且其中所述接头包括FxyB，x为任何氨基酸，y选自谷氨酸(E)、天冬氨酸(D)、赖氨酸(K)、丝氨酸(S)及苏氨酸(T)，而B为β-丙氨酸；且其中y为天冬氨酸的非天然类似物。
在一些实施方案中，CPP可为包括式可变序列-间隔-接头的化合物，其中可变序列为Ac-R(O)nR，其中n≥7；其中O为选自R、X和Z的残基的序列；其中R为L-精氨酸，X为3-顺式-氨基环己烷，且Z为顺式-2-氨基环戊烷-1-羰基；且其中所述接头包括FxyB，x为任何氨基酸，y选自谷氨酸(E)、天冬氨酸(D)、赖氨酸(K)、丝氨酸(S)及苏氨酸(T)，而B为β-丙氨酸；且其中y为赖氨酸的非天然类似物。
在一些实施方案中，CPP可为包括式可变序列-间隔-接头的化合物，其中可变序列为Ac-R(O)nR，其中n≥7；其中O为选自R、X和Z的残基的序列；其中R为L-精氨酸，X为3-顺式-氨基环己烷，且Z为顺式-2-氨基环戊烷-1-羰基；且其中所述接头包括FxyB，x为任何氨基酸，y选自谷氨酸(E)、天冬氨酸(D)、赖氨酸(K)、丝氨酸(S)及苏氨酸(T)，而B为β-丙氨酸；且其中y为丝氨酸的非天然类似物。
在一些实施方案中，CPP可为包括式可变序列-间隔-接头的化合物，其中可变序列为Ac-R(O)nR，其中n≥7；其中O为选自R、X和Z的残基的序列；其中R为L-精氨酸，X为3-顺式-氨基环己烷，且Z为顺式-2-氨基环戊烷-1-羰基；且其中所述接头包括FxyB，x为任何的氨基酸，y选自谷氨酸(E)、天冬氨酸(D)、赖氨酸(K)、丝氨酸(S)及苏氨酸(T)，而B为β-丙氨酸；且其中y为E、D、K、S或T的非天然类似物。
在一些实施方案中，CPP可为包括式可变序列-间隔-接头的化合物，其中可变序列为Ac-R(O)nR，其中n≥7；其中O为选自R、X和Z的残基的序列；其中R为L-精氨酸，X为3-顺式-氨基环己烷，且Z为顺式-2-氨基环戊烷-1-羰基；且其中所述间隔包括氨基己酸(Ahx)；且其中所述接头包括FSQG-OH。
在一些实施方案中，CPP可为包括式可变序列-间隔-接头的化合物，其中可变序列为Ac-R(O)nR，其中n≥7；其中O为选自R、X和Z的残基的序列；其中R为L-精氨酸，X为3-顺式-氨基环己烷，且Z为顺式-2-氨基环戊烷-1-羰基；且其中所述接头包括FxyB，x为任何氨基酸，y选自谷氨酸(E)、天冬氨酸(D)、赖氨酸(K)、丝氨酸(S)及苏氨酸(T)，而B为β-丙氨酸；且其中y为苏氨酸的非天然类似物；且其中n为7，而所述间隔为(Ahx)。
在一些实施方案中，CPP可为包括式可变序列-间隔-接头的化合物，其中可变序列为Ac-R(O)nR，其中n≥7；其中O为选自R、X和Z的残基的序列；其中R为L-精氨酸，X为3-顺式-氨基环己烷，且Z为顺式-2-氨基环戊烷-1-羰基；且其中所述可变序列、间隔和接头包含选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和11的序列。
在一些实施方案中，CPP-PMO或CPP-AON可为包括式可变序列-间隔-接头的化合物，其中可变序列为Ac-R(O)nR，其中n≥7；其中O为选自R、X和Z的残基的序列；其中R为L-精氨酸，X为3-顺式-氨基环己烷，且Z为顺式-2-环戊胺-1-羰基，其进一步包括与接头缀合的载物，其中该载物包括磷二酰胺吗啉代寡聚物(PMO)。
在一些实施方案中，CPP-PMO或CPP-AON可为包括式可变序列-间隔-接头的化合物，其中可变序列为Ac-R(O)nR，其中n≥7；其中O为选自R、X和Z的残基的序列；其中R为L-精氨酸，X为3-顺式-氨基环己烷，且Z为顺式-2-氨基环戊烷-1-羰基，其进一步包括与接头缀合的载物，其中该载物进一步包括一个或多个另外的PMO。
在一些实施方案中，CPP可包括根据表1的任何序列的可变序列-间隔-接头：
表1:
靶标 序列 位置 SEQ ID NO:
2C4 Ac-RXXXXXRRR(Ahx)FSQG-OH 核 1
4G9 Ac-RXXXXXXRR(Ahx)FSQG-OH 核 2
9F5 Ac-RXXXRXRXR(Ahx)FSQG-OH 核 3
12G4 Ac-RRXXZXXXR(Ahx)FSQG-OH 核 4
12D10 Ac-RRRXXXXXR(Ahx)FSQG-OH 核 5
12D11 Ac-RXRXXXXXR(Ahx)FSQG-OH 核 6
12E4 Ac-RRZXXXXXR(Ahx)FSQG-OH 核 7
21A5 Ac-RXXXXZXZR(Ahx)FSQG-OH 核 8
11G1 Ac-RXXZXRXXR(Ahx)FSQG-OH 细胞质 9
12D4 Ac-RRXRXXXXR(Ahx)FSQG-OH 细胞质 10
13D2 Ac-RRZXXZXXR(Ahx)FSQG-OH 细胞质 11
在一些实施方案中，CPP可包括表2所列的如下序列
表2:
靶标 序列 SEQ ID NO:
9H8 Ac-RXXXXXRXR(Ahx) 12
9H9 Ac-RZXXXXRXR(Ahx) 13
9H11 Ac-RXZXXXRXR(Ahx) 14
1A2 Ac-RRRRRRRRR(Ahx) 15
12D12 Ac-RZRXXXXXR(Ahx) 16
13D3 Ac-RXZXXZXXR(Ahx) 17
12D10 Ac-RRRXXXXXR(Ahx) 18
2C4 Ac-RXXXXXRRR(Ahx) 19
4G9 Ac-RXXXXXXRR(Ahx) 20
11F4 Ac-RXXXXRXXR(Ahx) 21
9F5 Ac-RXXXRXRXR(Ahx) 22
12D11 Ac-RXRXXXXXR(Ahx) 23
20B7 Ac-RXXXXXXZR(Ahx) 24
20C4 Ac-RXXZXXXZR(Ahx) 25
5D4 Ac-RXXXRZXRR(Ahx) 26
9H7 Ac-RRXXXXRXR(Ahx) 27
5B1 Ac-RXXXZXXRR(Ahx) 28
4H6 Ac-RXXZXXXRR(Ahx) 29
12D4 Ac-RRXRXXXXR(Ahx) 30
15A8 Ac-RXXXXXZXR(Ahx) 31
12D8 Ac-RXZRXXXXR(Ahx) 32
12E3 Ac-RZXXXXXXR(Ahx) 33
12H2 Ac-RXXZZXXXR(Ahx) 34
4G10 Ac-RZXXXXXRR(Ahx) 35
15H5 Ac-RXXXXZZXR(Ahx) 36
11F1 Ac-RXRXXRXXR(Ahx) 37
21C7 Ac-RRXXZZXZR(Ahx) 38
12E2 Ac-RXXXXXXXR(Ahx) 39
12E4 Ac-RRZXXXXXR(Ahx) 40
12G4 Ac-RRXXZXXXR(Ahx) 41
21A5 Ac-RXXXXZXZR(Ahx) 42
本领域的普通技术人员会能够设计可实现本公开的目标(如增强的细胞穿透)的其他CPP序列。结果，目前公开的多个PMO-CPP和AON-CPP缀合物并不限于本文公开的CPP组分。
如本文使用的，NOAEL指未观察到不利影响的剂量水平。换言之，NOAEL为最大安全剂量。
在一些实施方案中，接头为含有裂解基序的序列。在一些实施方案中，裂解基序可通过任何水解酶裂解。在一些实施方案中，裂解基序可通过肽酶或蛋白酶，例如组织蛋白酶或胰蛋白酶裂解。如本文使用的，组织蛋白酶可裂解接头与组织蛋白酶裂解位点同义。根据本公开的可裂解接头能被胞内酶裂解，即化学降解。在一些实施方案中，接头可经设计以包括由特定丝氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶或金属蛋白酶或多于一个肽酶的组识别的裂解基序。在一些实施方案中，接头可包括两个或多个重叠或非重叠的裂解基序。在一些实施方案中，接头可不含有裂解基序。在一些实施例中，接头可经设计使得少于100％、少于75％、少于50％或少于10％的接头被裂解。在一些实施方案中，接头可经设计使得多于90％或99％的接头被裂解。
在一些实施方案中，接头包括序列FS(SEQ ID NO.:45。在一些实施方案中，接头包括序列FSQ(SEQ ID NO.:46)或FSQK(SEQ ID NO.:47)。在一些实施方案中，接头包括序列FxyB(SEQ ID NO.:48)，其中x为任何标准或非标准氨基酸，y为谷氨酸(E)、天冬氨酸(D)、赖氨酸(K)、丝氨酸(S)或苏氨酸(T)，且B为β-丙氨酸或β-甘氨酸。在一些实施方案中，合适的组织蛋白酶裂解位点包括FKE(SEQ ID NO.:49)、FAE(SEQ ID NO.:50)、FVE(SEQ ID NO.:51)、FLE(SEQ ID NO.:52)、FSE(SEQ ID NO.:53)及V[Cit]E(SEQ ID NO.:54)，其中F为苯丙氨酸，K为赖氨酸，E为谷氨酸，A为丙氨酸，V为缬氨酸，L为亮氨酸，S为丝氨酸且Cit为瓜氨酸。本公开不限于本文公开的特定的组织蛋白酶接头，还包括能通过胞内蛋白酶裂解的其他氨基酸序列。
实施例
肽合成
使用Ranin Symphony自动肽合成仪，使用标准Fmoc化学在预装载的CLEAR(交联的聚氧乙烯醚丙烯酸酯树脂(Ethoxylate Acrylate Resin))(Peptides International,Louisville,KY)上合成肽。将氨基酸(EMD Biosciences,San Diego,CA或Anaspec,SanJose,CA)以叔丁氧基羰基(BOC)、叔丁基(tBu)2,2,4,6,7-五甲基二氢-苯并呋喃-5-磺酰基(Pbf)或三苯甲基(Trt)基团正交保护。使用摩尔比为5/5/10/1的氨基酸/HCTU/N-甲基吗啉/树脂实施偶联。使用DMF中的20％哌啶、2％1,8-二氮杂双环[5.4.0]-十一-7-烯(DBU)在各循环过程中从胺端移除Fmoc。使用DMF中摩尔比为30/8/1的乙酸酐/NMM/树脂在树脂上进行N-端乙酰化。使用2.5％水/2.5％TIS/5％苯甲醚/90％TFA体积比的15ml/0.1mM树脂的混合物将从树脂去保护/裂解进行3小时。上清在二乙醚中(-80℃)析出并在3000rpm沉淀10分钟。将乙醚倾倒出并再次清洗沉淀。将粗肽冻干并使用半制备式逆相HPLC(XBridge C18,10x250mm,5μm粒度)纯化。于5ml/分钟以99％缓冲液-A(水，0.1％TFA)和1％缓冲液-B(乙腈，0.1％TFA)的装载梯度(梯度斜率，0.3％B/分钟)实施纯化。以逆相分析型HPLC和MALDI-TOF(Waters Synapt)评估肽纯度>95％。将级分汇集、冻干并再溶解于适当的缀合缓冲液中。(所有的溶剂为HPLC等级，购自EMD Biosciences,San Diego,CA或Sigma Aldrich,St.Louis,MO)。
肽(CPP)-PMO缀合
PMO以5’-端伯氨排序并如上述合成肽。与PMO相比，在单一PMO-CPP缀合物中使用2-倍摩尔过量的肽，在多个PMO-CPP缀合物中，使用下列方程计算PMO摩尔数：(1.2-倍)x(缀合物数目)x(肽摩尔数)。将PMO溶于DMSO(5mM)并放置一旁。将肽溶于DMF(50mM)并与摩尔当量的基于铵的偶联剂2-(6-氯-1-H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基六氟磷酸铵混合。将2摩尔当量的4-甲基吗啉(NMM)加入肽混合物中并立刻添加至PMO溶液。反应于37℃进行1.5小时并使用4体积当量的水停止。将混合物添加至CM琼脂糖(sepharose)(Sigma Aldrich,St.Louis,MO)柱并以10个柱体积洗涤以移除未缀合的PMO和反应物。以1M胍-HCL、1M NaCl从柱洗脱肽CPP-PMO缀合物并针对100mM NH4HCO3以3个缓冲液交换透析以移除盐和未缀合的肽。将透析的材料冻干并以分析型HPLC分析。
根据上述的总的肽合成规程合成下列CPP：
●No.1215:Ac-(RXRRBR)2XFKEG-OH(SEQ ID NO.:55)
●No.1216:Ac-(RXRRBR)2XFD(d-Glu)EG-OH(SEQ ID NO.:56)
●No.1217:Ac-E(RXRRBR)2XFKG-酰胺(SEQ ID NO.:57)
●No.1218:Ac-E(RXRRBR)2XFKG-OH(SEQ ID NO.:58)
●No.1219:Ac-E(RXRRBR)2XFKEG-OH(SEQ ID NO.:59)
●No.1220:Ac-E(RXRRBR)2XFK(d-Glu)EG-OH(SEQ ID NO.:60)
●No.1221:Ac-(d-Glu)E(RXRRBR)2xFKG-酰胺(SEQ ID NO.:61)
●No.1222:Ac-(dGlu)E(RXRRBR)2XFKG-OH(SEQ ID NO.:62)
●No.1223:Ac-(d-Glu)E(RXRRBR)2XFKEG-OH(SEQ ID NO.:63)
●No.1224:Ac-(d-Glu)E(RXRRBR)2XFK((d-Glu)EG-OH(SEQ ID NO.:64)
●No.1225-B:Biot-(RXRRBR)2XFKG-OH(SEQ ID NO.:65)
●No.1225-F:FITC-(RXRRBR)2XFKG-OH(SEQ ID NO.:66)
●No.1226-B:Ac-(RXRRBR)2XFK(Biot)G-OH(SEQ ID NO.:67)
●No.1226-F:Ac-(RXRRBR)2XFK(FITC)G-OH(SEQ ID NO.:68)
其中Ac为乙酰基，R为D-精氨酸，X为6-氨基己酸，B为β-丙氨酸，FK为组织蛋白酶裂解位点，E为谷氨酸，G为甘氨酸，Biot为生物素，且FITC为荧光异硫氰酸盐。
使用上述的合成步骤将上文列举的CPP与PMO23缀合以形成PMO-CPP缀合物。根据此方法形成的缀合物具有下列序列：
●No.1215:Ac-(RXRRBR)2XFKE(PMO)G(PMO)(SEQ ID NO.:69)
●No.1216:Ac-(RXRRBR)2XFD(d-Glu)(PMO)E(PMO)G(PMO)(SEQ ID NO.:70)
●No.1217:Ac-E(PMO)(RXRRBR)2XFKG(SEQ ID NO.:71)
●No.1218:Ac-E(PMO)(RXRRBR)2XFKG(PMO)(SEQ ID NO.:72)
●No.1219:Ac-E(PMO)(RXRRBR)2XFKE(PMO)G(PMO)(SEQ ID NO.:73)
●No.1220:Ac-E(PMO)(RXRRBR)2XFK(d-Glu)(PMO)E(PMO)G(PMO)(SEQ ID NO.:74)
●No.1221:Ac-(d-Glu)(PMO)E(PMO)(RXRRBR)2XFKG(SEQ ID NO.:75)
●No.1222:Ac-(dGlu)(PMO)E(PMO)(RXRRBR)2XFKG(PMO)(SEQ ID NO.:76)
●No.1223:Ac-(d-Glu)(PMO)E(PMO)(RXRRBR)2XFKE(PMO)G(PMO)(SEQ ID NO.:77)
●No.1224:Ac-(d-Glu)(PMO)E(PMO)(RXRRBR)2XFK(d-Glu)(PMO)E(PMO)G(PMO)(SEQ ID NO.:78)
●No.1225-B:Biot-(RXRRBR)2XFKG(PMO)(SEQ ID NO.:79)
●No.1226-B:Ac-(RXRRBR)2XFK(Biot)G(PMO)(SEQ ID NO.:80)
将上述参照的CPP-PMO缀合物以及No.1120(Ac-(RXR)4XFKE-((PEG)2-PMO)G-(PMO))(SEQ ID NO.:81)和(Ac-(RXRRBR)2XBA-PMO)(SEQ ID NO.:82)以2.84μM/kg的剂量静脉内施用于野生型小鼠。
在给药结束后，在麻醉下收获组织并于液氮中冷冻。处理冷冻的心脏和四头肌以分离RNA。使用nanodrop ND1000分光光度计定量样本。将样本进一步稀释成15ng/μl的浓度。将样品使用具有下列序列的引物扩增：CAGAATTCTGCCAATTGCTGAG(SEQ ID NO.:83)及TTCTTCAGCTTGTGTCATCC(SEQ ID NO.:84)。以55℃/30分钟；94℃/2分钟；94℃/15秒x 30次；55℃/30秒；68℃/1.5分钟的运行序列进行PCR。
各缀合物的外显子23跳过的百分比如表3中所示。
表3:
与CPP的N-末端缀合的PMO性能不如相同数目的与C-末端缀合的PMO。缀合物号1212性能不如K-肽缀合物号1120。仅具有一个PMO的编号1204性能优于具有2个PMO的缀合物号1120。编号1225-B性能优于编号1226-B。
根据上述步骤合成下列另外的CPP-PMO缀合物。用于下列缀合物的PMO为GGCCAAACCTCGGCTTACCTGAAAT(SEQ ID NO.:85)。
K系列(PMO为PMO23)：
●No.1118:Ac-(RXR)4XEG-(PMO)(SEQ ID NO.:86)
●No.1119:Ac-(RXR)4XE-((PEG)2-PMO)G-(PMO)(SEQ ID NO.:87)
●No.1120:Ac-(RXR)4XFKE-((PEG)2-PMO)G-(PMO)(SEQ ID NO.:81)
●No.970-S:硬脂酰-(RXR)4XA-PMO(SEQ ID NO.:88)
B系列(PMO为PMO23):
●No.1204:Ac-(RXRRBR)2XBA-PMO(SEQ ID NO.:82)
●E(PMO)(RXRRBR)2XFKG,“n-末端PPMO-B”(SEQ ID NO.:89)
●No.1239:Ac-(RXRRBR)2XE(PMO)G(PMO)(SEQ ID NO.:90)
●Ac-(RXRRBR)2FKEG-(PMO)2,“二-PMO-B+FK”(SEQ ID NO.:91)
其中Ac为乙酰基，R为D-精氨酸，X为6-氨基己酸，B为β-丙氨酸，FK为组织蛋白酶裂解位点，E为谷氨酸，且G为甘氨酸。
在一些实施方案中，X还可包括其他类型的残基，例如脯氨酸、甘氨酸或丙氨酸，或另外经修饰的或非标准的氨基酸。在一些实施方案中，可变序列包括α、β、γ或δ氨基酸，或环烷结构。在一些实施方案中，接头包括序列FS(SEQ ID NO.:45)。在一些实施方案中，接头包括序列FSQ(SEQ ID NO.:46)或FSQK序列(SEQ ID NO.:47)，其中F为苯丙氨酸，S为丝氨酸，K为赖氨酸而Q为谷氨酰胺。在一些实施方案中，接头包括序列FxyB(SEQ ID NO.:48)，其中x为任何标准的或非标准的氨基酸，y为谷氨酸(E)、天冬氨酸(D)、和赖氨酸(K)、丝氨酸(S)或苏氨酸(T)，且B为β-丙氨酸或β-甘氨酸。对野生型小鼠以2.84μM/kg的剂量静脉内施用缀合物号1204、1119、1120、1239和1215。收获组织并如上述分离RNA。外显子23跳过的百分比示于表4中。
表4:
图3还描绘了野生型小鼠中一些多个CPP-PMO缀合物对外显子23跳过的作用。
如上所示，通过将多于一个PMO附接于单一的CPP-K而非CPP-B而改进了效力。通过IV注射递送的单一剂量CPP-B(其与2个PMO外显子23部分缀合)(编号1239)效力远不及与单一PMO外显子23缀合的CPP-B(编号1204)。令人惊奇的是，我们发现以完全相同的化学方式与2个PMO缀合的单一剂量CPP-K(编号1119)效力为与单一PMO外显子23缀合的单一剂量CPP-K(编号1118)的大约2倍。有趣的是，作为单体构建体，CPP-PMO23B比CPP-PMO23K更有效。在其中3个PMO与CPP连接的多个CPP-PMO缀合物研究中，3个PMO23部分与单一肽B缀合(编号1216)与二-PMO B相比活性加倍(尽管三-PMO23-B就其外显子跳过能力而言与二-PMO23-K类似)。这些结果表明哪些多个CPP-PMO缀合物会具有预期的性质无法事先预知，且因此本领域的普通技术人员必须使用本公开所述的方法实施初步研究以确定制备的每种缀合物的效力。
从本文公开的说明书的考量和本发明的实践，本发明的其他实施方案对于本领域的技术人员会是显而易见的。意欲的是说明书和实施例仅被认为是例示性的，而本发明真正的范围及精神通过下列权利要求指示。

Claims (2)

1.一种肽缀合的AON化合物，其包含至少两个AON化合物，所述AON化合物包含式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)或(VI)的15至30个亚基，
其中B为选自C、G、A或T的天然存在的嘌呤或嘧啶核苷酸碱基；
其中所述至少两个AON化合物具有与靶标前-mRNA或mRNA的至少75％的碱基互补的核苷酸碱基序列；
其中所述至少两个AON化合物具有0至3个重复的亚基，其中B为G；
其中所述至少两个AON化合物具有少于60％的所述亚基，其中B为C或G；
其中所述至少两个AON化合物具有非自我互补的序列；且
其中所述至少两个AON化合物与聚阳离子肽缀合。
2.一种肽缀合的磷二酰胺吗啉代化合物，其包含至少两个磷二酰胺吗啉代化合物，该磷二酰胺吗啉代化合物包含式(I)的15至30个亚基：
其中R为烷基且B为选自C、G、A或T的天然存在的嘌呤或嘧啶核苷酸碱基；
其中所述至少两个磷二酰胺吗啉代化合物具有与靶标前-mRNA或mRNA的至少8个连续碱基互补的核苷酸碱基序列；
其中所述至少两个磷二酰胺吗啉代化合物具有0至3个重复的亚基，其中B为G；
其中所述至少两个磷二酰胺吗啉代化合物具有少于60％的所述亚基，其中B为C或G；
其中所述至少两个磷二酰胺吗啉代化合物具有非自我互补的序列；且
其中所述至少两个磷二酰胺吗啉代化合物与聚阳离子肽缀合。
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