WO2018056871A1 - Аналоги олигонуклеотидов как средства коррекции сплайсинга для лечения мышечной дистрофии дюшена - Google Patents

Аналоги олигонуклеотидов как средства коррекции сплайсинга для лечения мышечной дистрофии дюшена Download PDF

Info

Publication number
WO2018056871A1
WO2018056871A1 PCT/RU2017/050092 RU2017050092W WO2018056871A1 WO 2018056871 A1 WO2018056871 A1 WO 2018056871A1 RU 2017050092 W RU2017050092 W RU 2017050092W WO 2018056871 A1 WO2018056871 A1 WO 2018056871A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
oligonucleotide
group
oligonucleotides
oligonucleotide according
optionally
Prior art date
Application number
PCT/RU2017/050092
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Дмитрий Александрович СТЕЦЕНКО
Мэтью ВУД
Грэм МАККЛОРИ
Алеся Анатольевна ФОКИНА
Борис Павлович ЧЕЛОБАНОВ
Максим Сергеевич КУПРЮШКИН
Дмитрий Владимирович ПЫШНЫЙ
Майкл ГЕЙТ
Андрей АРЗУМАНОВ
Original Assignee
Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук
Оксфордский Университет
Лаборатория Молекулярной Биологии Совета По Медицинским Исследованиям
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук, Оксфордский Университет, Лаборатория Молекулярной Биологии Совета По Медицинским Исследованиям filed Critical Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук
Publication of WO2018056871A1 publication Critical patent/WO2018056871A1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7125—Nucleic acids or oligonucleotides having modified internucleoside linkage, i.e. other than 3'-5' phosphodiesters
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids

Definitions

  • the invention relates to the field of molecular medicine.
  • DMD Duchenne muscular dystrophy
  • the DMD gene contains approximately 2.4 x 10 6 nucleotide pairs, 79 exons, and is one of the largest genes in the human genome. Mutations in the DMD gene, as a rule, affect the region between exons 45 and 55 and can be inherited, but in approximately 35% of cases occur spontaneously.
  • the dystrophy protein has a molecular weight of about 427 kDa and is responsible for combining the cytoskeleton of each muscle fiber with the main basal plate of the extracellular matrix through a protein complex that consists of many subunits.
  • oligonucleotide analogs such as oligo-2'-0-methylribonucleoside thiophosphates (2'-OMe PS-oligonucleotides) [Goemans N.M., Tulinius M., Van den Akker J.T., Burm D.E. et al. Systemic administration of PRO051 in Duchenne's muscular dystrophy. New England J. Med. 2011, 364: 1513-1522] (Fig. 2, a) and phosphordiamide morpholine oligonucleotides (PMO) [Mendell J.R., Rodino-Clapac L.R., Sahenk Z., Roush C. et al.
  • PMO phosphordiamide morpholine oligonucleotides
  • Oligonucleotide preparations for the treatment of DMD are typically administered by intravenous or subcutaneous injection, after which they must enter the muscle cells of various skeletal tissues, the diaphragm and the heart muscle through the bloodstream.
  • oligo- 2'-0-methylribonucleotide thiophosphates (2'-OMe PS-oligonucleotides) participating in clinical trials for DMD, instead of the phosphodiester group, there is a thiophosphate group (PS), which not only increases the resistance of oligonucleotides to serum nucleases, but also gives properties favorable for therapeutic use due to binding to serum proteins [Eckstein F. Phosphorothioate oligonucleotides: what is their origin and what is unique
  • Pip5 transduction peptides direct high efficiency oligonucleotide - mediated dystrophin exon skipping in heart and phenotypic correction in mdx mice. Mol. Ther. 2011; 19: 1295-1303; Betts C. et al. Pip6-PMO, a new generation of peptide-oligonucleotide conjugates with improved cardiac exon skipping activity for Duchenne muscular dystrophy treatment. Molecular Therapy Nucleic Acids. 2012; 1: e38; Lehto T. et al. Cellular trafficking determines the exon skipping activity of Pip6a-PMO in mdx skeletal and cardiac muscle cells. Nucleic Acids Res. 2014; 42: 3207-3217].
  • P-PMOs morpholine peptide conjugates
  • the conjugate of morpholine PMO with the polycationic B-peptide RXRRBRRXRRBRXB rich in arginine (R) residues was able to cause restoration of the biosynthesis of functional dystrophin in muscle cells of mdx mice with a mutation in exon 23 of the dystrophin gene at doses 10-100 times lower than PMO [Jearawiriyapaisarn N. et al. Sustained dystrophin expression induced by peptide-conjugated morpholino oligomers in the muscles of mdx mice. Mol. Ther. 2008; 16: 1624-1629; Wu B. et al.
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) antisense oligonucleotides restore systemic muscle and cardiac dystrophin expression and function. Hum. Mol. Gen. 2008; 17: 3909-3918].
  • An additional advantage of electrically neutral oligonucleotide analogs is the relative ease of conjugation with polycationic peptides [Shabanpoor F. et al. Bi-specific splice-switching PMO oligonucleotides conjugated via a single peptide active in a mouse model of Duchenne muscular dystrophy. Nucleic Acids Res. 2014; 43: 29-39].
  • the present invention discloses the use for the treatment of splicing for the treatment of Duchenne muscular dystrophy (DMD) of oligonucleotide analogues containing instead of one or more phosphodiester groups (up to their complete replacement) phosphorus ilguanidine groups, such as 1, 1,3,3- tetramethylphosphorylguanidine group (Tmg) and 1,3-dimethyl-2-imidazolidinimino group (Dmi) (Fig. 2, c) [M. Kupryushkin, D. Pyshniy, D. Stetsenko Phosphorylguanidines. A new class of nucleic acid analogues. Acta Bachae. 2014; 6: 123-125].
  • DMD Duchenne muscular dystrophy
  • Phosphorylguanidine oligonucleotides and the method for their preparation are the subject of patent applications [Stetsenko D.A., Kupryushkin M.S., Pyshny D.V., Patent Application JV22014134380, August 22, 2014; Stetsenko D.A., Kupryushkin M.S., Pyshnyi D.V. Modified oligonucleotides and methods for their synthesis.
  • phosphorylguanidine oligonucleotides have physicochemical and biological properties favorable for their use as therapeutic agents, in particular, the ability to form stable complementary complexes with both DNA and RNA [Kupryushkin MS, Pyshny D .V., Stetsenko D.A. Phosphorylguanidines. A new class of nucleic acid analogues. Acta Bachae.
  • This invention discloses the biological activity of phosphorylguanidine oligonucleotides (CSF) with a 2-O-methylribose sugar phosphate backbone, determined by experiments in an in vitro DMD cell model in a mouse muscle fiber culture of mdx H2k and in vivo in mdx mice, which comparable or superior to the activity of the most successful of the existing analogues - phosphordiamide morpholine oligonucleotides (RMO).
  • CSF phosphorylguanidine oligonucleotides
  • Phosphorylguanidine oligonucleotides can also be used to correct in vitro and in vivo splicing in the form of conjugates with peptides (PFGO), while showing comparable results with peptide conjugates of morpholine oligonucleotides (P-PMO).
  • PFGO conjugates with peptides
  • P-PMO morpholine oligonucleotides
  • Therapeutic candidates based on two types of oligonucleotide derivatives eteplirsen from morpholino oligonucleotides (PMO) and drisapersen - oligo-2'-0-methylribonucleotide modified by thiophosphate groups - have shown the ability to effectively cause the passage of the recent human exon 51 and time passed clinical trials.
  • PMO morpholino oligonucleotides
  • drisapersen - oligo-2'-0-methylribonucleotide modified by thiophosphate groups - have shown the ability to effectively cause the passage of the recent human exon 51 and time passed clinical trials.
  • PMO morpholino oligonucleotides
  • drisapersen - oligo-2'-0-methylribonucleotide modified by thiophosphate groups - have shown the ability to effectively cause the passage of the recent human exon 51 and time passed clinical trials.
  • Sarepta Therapeutics (www.repta.com) announced that the morpholine oligonucleotide eteplirsen (A VI-4658) successfully passed Phase III clinical trials for Duchenne muscular dystrophy [Sarepta Therapeutics, Efficacy Study of AVI -4658 to Induce Dystrophin Expression in Selected Duchenne Muscular Dystrophy Patients, ClinicalTrials.gov. US Government, NIH, 10.30.2012, www.clmicaitrials.gov/ct2/shosv/NCT01.3962391. In 2014, Sarepta Therapeutics applied to the US Federal Food and Drug Administration (FDA) for approval of the admission of eteplirsen to the US pharmaceutical market. This indicates the presence of
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) morpholines have advantages over 2'-0-methyl thiophosphates in the treatment of DMD.
  • the morpholine oligonucleotide eteplirsen for the treatment of DMD did not receive FDA approval due to insufficient therapeutic efficacy, which may be due, inter alia, to its insufficient accumulation in critical body tissues, such like a diaphragm and myocardium.
  • CSFs phosphorylguanidine oligonucleotides
  • This mechanism underlies the method of treatment of DMD, which is proposed to be used in this project.
  • the structure of phosphorylguanidine oligonucleotides is closest to natural nucleic acids, since only the phosphate group undergoes modification, and
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) carbohydrate residue remains unchanged.
  • the structure of the new analogues allows the introduction of additional functional groups both in the side chain of the phosphorylguanidine group and in the sugar residue in order to improve their affinity for mRNA and penetration into cells.
  • the chemical synthesis of these derivatives is relatively simple, which allows us to predict competitive advantages in the cost of the product compared to most existing prototypes.
  • the spectrum of possible derivatives that can be synthesized based on phosphorylguanidine oligonucleotides, due to the ease of their additional chemical modification, is also significantly wider than most existing prototypes. This allows you to plan to receive products that are inaccessible to competitors using previously developed methods, and focus on new segments of the pharmaceutical market.
  • PMOs morpholine oligonucleotides
  • CPP cell penetrating peptides
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) oligonucleotides with the peptide Pip6a, facilitating penetration into muscle cells and allowing the conjugate to enter the diaphragm and heart.
  • the phosphorylguanidine modification proposed in the patent application JVT22014134380 and WO2016 / 028187 A1 concerns only the phosphate group, but does not affect the sugar residue, which allows combining the phosphorylguanidine modification with other chemical modifications previously proposed residue (deoxy) ribose in order to give the oligonucleotide favorable properties. So, to increase the affinity for RNA targets, deoxyribose antisense oligonucleotides can be replaced with 2-0-methylribose or 2-fluoro-2-deoxyribose.
  • oligoribonucleotide analogues have several advantages over DNA, namely: a high hybridization rate with RNA and increased durability of duplexes with RNA [Y. Hou et al. Biochemistry. 1996. V.35. P.15340-15348; M. Majlessi et al. Nucl. Acids Res. 1998. V.26. P.2224-2229]. This is essential for increasing the efficiency of the correction of splicing of pre-mRNA of dystrophin when exposed to the antisense oligon cleotide a.
  • phosphorylguanidine oligonucleotides containing deoxyribose, 2-O-methylribose, or 2'-fluoro-2-deoxyribose were synthesized using the protocols of solid-phase phosphitamide synthesis developed and optimized by the authors.
  • Antisense oligonucleotides were directed to the 5 'region of the intron 23 splicing region in order to ensure exon 23 skipped to thereby restore the biosynthesis of truncated dystrophin, which is capable of fulfilling the biological functions of its full-size analogue.
  • the corresponding morpholine oligonucleotides with the same nucleotide sequence were used as controls.
  • the synthesis of the vector peptide Pip6a was carried out, followed by its conjugation with phosphoryl guanidine oligon cleotides.
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) dystrophin in the cells of murine muscle fibers of the H2k mdx line.
  • the efficiency of exon skipping was determined using reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) followed by nested PCR and analysis of the reaction mixtures by agarose gel electrophoresis. To obtain quantitative characteristics, the agarose gel radio autograph was digitized. The exon skipping percentage was calculated as the ratio of the peak area of mRNA with a deletion of 23 exon ( ⁇ 23) to the sum of the peak areas of full-sized pre-mRNA, mRNA ⁇ 23 and mRNA ⁇ 23 + ⁇ 22.
  • Oligonucleotides and their peptide conjugates that showed high activity in muscle cell culture in vitro were further used to study the correction of splicing in muscle tissue of mdx mice in vivo after a single intramuscular injection into the anterior tibialis muscle of tibialis anterior (TA).
  • the activity of phosphorylguanidine oligonucleotides and their peptide conjugates was comparable with the activity of the already known morpholine oligonucleotides (PMOs) and their peptide conjugates (P-PMOs), which are currently the most effective means for correcting splicing in DMD.
  • CSFs phosphorylguanidine oligonucleotides
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) differs from the stability of natural duplexes of DNA with DNA and DNA with RNA [Kupryushkin
  • thiophosphate derivatives of oligo-2'-0-methylribonucleotides (2'-OMe PS-oligonucleotides) containing a limited number of phosphorylguanidine Tmg-rpynn electroneutral nature, which reduced the total negative charge of the oligonucleotide, were investigated.
  • Tab. 1 The sequences of oligonucleotides with 1,1,3,3-tetramethylguanidine group (Tmg) used to correct the splicing of dystrophin pre-mRNA in a mouse muscle tissue culture of H2k mdx.
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) groups in experiments on the correction of splicing of mutant dystrophin pre-mRNA with skipping of exon 23 in the mdx culture of mouse muscle cells using 2'-OMe PS oligonucleotides as a positive control both in the presence and in the absence of Lipofectamine 2000 transfectant (Fig. 3) .
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) Derivatives of oligonucleotides are promising candidates for the role of therapeutic agents for the treatment of Duchenne muscular dystrophy by exon skipping. The authors suggested that it would be advisable to study the correction of splicing using electroneutral oligonucleotides completely substituted by phosphorylguanidine groups at all internucleotide positions.
  • lipopeptide Pal-RXR4 or St-STl capable of delivering uncharged oligonucleotides to cells as a part of peptide nanoparticles [Jarver P., Zaghloul EM, Arzumanov AA, Saleh AF, McClorey G., Hammond SM , Hallbnnk M., Langel ⁇ , Smith CLE., Wood MJ, et al. // Nucleic Acid Ther. 2015. V. 25. J s 2. P. 65-77].
  • H2k mdx cells were incubated at an oligonucleotide concentration of 1 ⁇ M or 5 ⁇ M in the absence or presence of a lipopeptide for 4 hours. After isolation of total RNA from the cells, the results of splicing correction were analyzed by electrophoresis of RT-PCR products on an agarose gel (Fig. 6).
  • RMO are one of the types of antisense oligonucleotides that are currently undergoing clinical trials as potential drugs for the treatment of Duchenne muscular dystrophy (DMD) [Mendell JR, Rodino-Clapac LR, Sahenk Z., Roush K., Bird L ., Lowes LP, Alfano L., Gomez AM, Lewis S., Kota J., et al. // Ann. Neurol. 2013. V.
  • DMD Duchenne muscular dystrophy
  • CSFs phosphorylguanidine oligonucleotides
  • conjugates of phosphoryl guanidine oligonucleotides with vector peptides can be used the method of "click" chemistry [Kolb, NS, Finn M.G., Sharpless K.V., Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 2001, 40, 2004-2021], based on
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) the use of the 1,3-dipolar cycloaddition of alkylazides to alkynes (CuAAC) catalyzed by copper salts of copper (1) [Togt e C. W., Christensen C, Meldal M., J. Org. Chem., 2002, 67, 3057-3064; Rostovtsev VV, Green LG, Fokin VV, Sharpless KB, Angew. Chem. Int. Ed., 2002, 41, 2596-2599].
  • CuAAC 1,3-dipolar cycloaddition of alkylazides to alkynes
  • a derivative of the vector peptide Pip6a was used for conjugation [Lehto T., Castillo Alvaraz A., Gait MJ, Coursindel T., Wood MJA, Lebleu B., Boisguerin P., Nucleic Acids Res., 2014, 42, 3207-3217], containing an alkynyl group.
  • Derivatives of phosphorylguanidine oligonucleotides (CSF) containing the azidobutyl group necessary for conjugation were obtained according to the developed methods [D. Stetsenko, M. S. Kupryushkin, D. V. Pyshny, Application for RF Patent N ° 2014117293, Priority 29.04.
  • CSF phosphorylguanidine oligonucleotides
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) LC-MS / MS in positive ion registration mode; ⁇ An asterisk (*) indicates the position of the Dmi-group; NH2 - 6-aminohexyl group (Fig. 10, 7a); Flu — fluorescein residue; 2-hydroxymethyl-6-aminohexyl group (Fig. 10, 7b); According to MALDI-TOF MS.
  • One of the simplest methods for conjugating peptides and oligonucleotides is the formation of an amide bond in solution or on the solid phase between the C-terminal carboxyl group of the peptide and the amino group of the aminoalkyl derivative of the oligonucleotide [Venkatesan N., Kim V.N., Chem. Rev. 2006, 106, 3712-3761; Lu K., Duan Q.-P., Ma L., Zhao D.-X., Bioconjugate Chem., 2010, 21, 187-202].
  • derivatives of phosphorylguanidine oligonucleotides containing a primary amino group that can form an amide bond with the carboxyl group of the peptide are of interest.
  • CSFs phosphorylguanidine oligonucleotides
  • the simplest is the synthesis of 3'-terminal aminoalkyl derivatives of oligonucleotides, for which a suitable polymeric carrier containing a protected amino group can be used.
  • a suitable polymeric carrier containing a protected amino group can be used.
  • two main polymeric carriers are commercially available for the preparation of 3'-aminoalkyl derivatives of oligonucleotides: 3'-PT-Amino-Modifier ⁇ 6 CPG (Glen Research 20-2956) based on trimellitic acid (Fig. 10, 5a) and 3'- Amino-Modifier C7 CPG 500 (Glen Research 20-2957) with an Fmoc-protected amino group in the side chain (Fig.
  • a polymeric carrier (5a) an effective method for automated solid-phase synthesis of FGO with a 3'-aminohexyl group was developed (Fig. 10, 7a).
  • AMA reagent showed the best result in the release of oligonucleotides containing all four bases (see Table 5), while the use of a 25% ammonia solution at 55 ° C took a long time and sometimes led to adverse reactions.
  • the obtained 3'- ⁇ 2- ⁇ contained Dmi groups at all internucleotide positions and a 6-aminohexyl group attached to the 3 'end also using a phosphorylguanidine Dmi group (see Fig. 10, Table 5). It is assumed that the 6-aminohexyl group (pKa about 10) at physiological pH values of about 7 will be protonated. Probably, due to the presence of a positive charge, the obtained 3'- ⁇ 2-FGO showed better solubility in water than completely neutral FGO, not
  • Pip6a by fragment condensation in solution with the formation of a stable amide bond between the C-terminal carboxyl group of the peptide and the 3'-aminohexyl group of the TSF.
  • the primary structure of the peptide Pip6a are given in table. 6.
  • Pip6a Since ⁇ -alanine is the C-terminal amino acid in Pip6a, racemization is not possible with activation of the carboxyl group, the side chains of Arg, Tug and Gin do not require protection, and the appligina ⁇ -terminal is blocked by the acetyl group. Therefore, the Pip6a peptide is particularly suitable for fragment condensation in solution by the formation of an amide bond. Amide condensation in solution also proceeds more efficiently with uncharged nucleic acid analogs, such as morpholine oligonucleotides (PMOs) and peptide nucleic acids (PNA) [Deuss PJ, Arzumanov AA, Williams DL, Gait MJ, Org . Biomol.
  • PMOs morpholine oligonucleotides
  • PNA peptide nucleic acids
  • Uncharged analogs also include the phosphorylguanidine oligonucleotides (CSF) disclosed in this application based on 2'-OMe RNA (Table 5).
  • CSF phosphorylguanidine oligonucleotides
  • This application discloses a method for producing conjugates of phosphorylguanidine oligonucleotides (CSF), for example, with a backbone based on 2'-0-methylribose and 2'-fluoro-2'-deoxyribose, with the peptide by fragment condensation in solution with the formation of a stable amide bond between 3 the '-aminohexyl group of the CSF and the C-terminal carboxyl group of the peptide.
  • the conjugation scheme of the peptide with CSF is shown in Fig. 11.
  • Received and characterized model peptide conjugates of CSF PFGO.
  • Typical elution profiles of conjugates are shown in Fig. 12 and 13.
  • the structure of the conjugates was confirmed using MALDI-TOF mass spectrometry (Fig. 14).
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) dystrophin in TA according to protein level is shown in Fig. 17.
  • [0038] Proposed as potential antisense agents for the correction of splicing in Duchenne muscular dystrophy (DMD) phosphorylguanidine oligonucleotides (FGO) based on 2'-0-methyl-RNA show exon skipping biological activity in a murine DMD cell model comparable to activity of free RMO used as a control. The addition of a lipopeptide has been shown to potentiate the activity of free (unconjugated) TSFs.
  • DMD Duchenne muscular dystrophy
  • FGO phosphorylguanidine oligonucleotides
  • CSF CSF
  • PFGO peptide conjugates of CSF
  • PMOs morpholine oligonucleotides
  • PFGOs cause in vivo splicing correction, noted both for RNA (RT-PCR) and protein (immunohistochemical analysis), by intramuscular injection of mdx mice expressing a dystrophin gene with a mutation in exon 23 without causing this marked toxic effects according to clinical biochemistry.
  • RNA RT-PCR
  • protein immunohistochemical analysis
  • the biological activity of PFGO exceeds the biological activity of free (unconjugated) FGO and depends on the sequence, which corresponds to the antisense mechanism of their action.
  • the activity of PFGO both in vitro and in vivo is comparable to the activity of the best prototype of potential therapeutic genes for the treatment of DMD - peptide conjugates of morpholine oligonucleotides (P-PMO).
  • CSF phosphorylguanidine oligonucleotides
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) derivatives of CSF, for example, peptide conjugates of CSF (PFGO) are new promising potential therapeutic agents for the correction of splicing in the treatment of Duchenne muscular dystrophy (DMD).
  • nucleotide is used to mean a chemical compound containing a nucleoside or a modified nucleoside, and at least one phosphate group attached to it by a covalent bond.
  • a covalent bond independently and without limitation, is an ester bond between the 3 ′, 2 ′ or 5′-hydroxyl group of a nucleoside and a phosphate group.
  • oligonucleotide is used to denote a chemical compound consisting of two or more nucleotides interconnected in a polymer chain.
  • the oligonucleotide may be a DNA or RNA fragment.
  • Oligonucleotides can be single-stranded or double-stranded, i.e. contain two chains with a high degree of complementarity. In this case, either of the chains or both can be modified according to the present invention.
  • an oligonucleotide as a polymer of two or more nucleotides can have any length.
  • an oligonucleotide may have a minimum length of 2, 3, 4, 5, 6,
  • the oligonucleotide may have a maximum length of 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28,
  • oligonucleotides 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, or 500 nucleotides, although longer oligonucleotides can be used in
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) individual applications of the present invention.
  • an oligonucleotide consisting of 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 or 100 nucleotides.
  • nucleotides that are the subject of the present invention, one or more, for example, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or more nucleotides, or all nucleotides may contain a modified in accordance with the present invention phosphate group.
  • modified nucleotide and “modified oligonucleotide” are used to denote a nucleotide or oligonucleotide, respectively, which contain a chemical modification, for example, substituents in a sugar residue, in a phosphate group and / or in a heterocyclic base.
  • An example of a chemical modification is the introduction of a modified nucleotide, an optional chemical grouping at the 3 ′ and / or 5 ′ end of the oligonucleotide (for example, the 3 ′ “inverted” nucleoside residue), conjugation with the remainder of a high molecular weight compound of low immunogenicity (for example, polyethylene glycol (PEG )), conjugation with low molecular weight compounds (e.g., cholesterol), conjugation with peptides (e.g., peptides facilitating penetration into cells), substitution in the phosphate group (e.g., thiophosphate group).
  • a high molecular weight compound of low immunogenicity for example, polyethylene glycol (PEG )
  • conjugation with low molecular weight compounds e.g., cholesterol
  • conjugation with peptides e.g., peptides facilitating penetration into cells
  • substitution in the phosphate group e.g., thiophosphate group.
  • Chemical modification of heterocyclic bases may include, but are not limited to, C-5 substitution of the pyrimidine nucleotide, C-7 substitution of the 7-deazapurine nucleotide, substitution at the exocyclic amino group, introduction of 4-thiouracil, 5-bromo and / or 5 residues - ioduracil, etc.
  • Modification of the sugar residue may include the introduction of 2-aminonucleotide, 2-fluoronucleotide, 2-O-methylribonucleotide, 2-0-allylribonucleotide, 2-0-P-methoxyethylribonucleotide, a "closed" nucleotide (locked nucleic acid.
  • LNA LNA and / or tricyclo-DNA nucleotide.
  • the bonds between the central phosphorus atom in the phosphate group can be realized, inter alia, through the oxygen atom (ordinary phosphate), the nitrogen atom ( ⁇ 3'- ⁇ 5 'phosphoramide), or the sulfur atom (3'-thiophosphate); accordingly, the 3'- and / or 5'-end of the nucleoside can end, including the hydroxyl group, as in the natural nucleoside, the Z'-amino group ( ⁇ 3'- ⁇ 5 'phosphoramide) or the Z'-mercapto group (Z'-thiophosphate ) Nucleoside analogs can also be part of modified nucleotides or modified oligon cleotides.
  • nucleotides or oligonucleotides that are the subject of the present invention can be isolated or obtained in purified form.
  • nucleoside is used to denote a chemical compound containing a sugar residue and a heterocyclic base residue.
  • nucleosides may include, but are not limited to, ribose, 2-deoxyribose, 2-O-methylribose, arabinose, and the like.
  • heterocyclic bases may include, but not limited to, thymine, uracil, cytosine, adenine, guanine, purine, hypoxanthine, xanthine, 2-aminopurine, 2,6-diaminopurine, 5-methylcytosine. 5-fluorouracil, 5-chlororacil. 5- bromouracil. 5-iodouracil.
  • 5-trifluoromethyluracil 5-fluorocytosine. 5-chlorine cytosine. 5-bromocytosine. 5-iodocytosine. 2-thiouracil, 4-thiouracil, 2-thiothymine, 4-thiothymine, 5-propynyluracil. 5-propinylcytosine, 7-deazaadenine, 7-deazaguanine, 7-deaza-8-azaadenine, 7-deaza-8-azaguanine, isocytosine, isoguanine and the like.
  • nucleoside analogue is used to mean a modified nucleoside in which the sugar residue is replaced by a different cyclic or acyclic structure.
  • nucleoside analogues in which the sugar residue is replaced by a different cyclic structure may include, but not limited to, monomers of morpholine oligonucleotides (PMOs) and tricyclo-DNA.
  • PMOs morpholine oligonucleotides
  • nucleoside analogs in which the sugar residue is replaced by a different acyclic structure may include, but are not limited to, peptide nucleic acid monomers (PNAs) and glyceric nucleic acids (GNAs).
  • nucleoside analogue is used to mean a nucleoside containing a chemical modification, for example, a substituent in a sugar residue and / or in a heterocyclic base.
  • nucleoside analogues may include, but are not limited to, 2-substituted 2-deoxynucleosides, such as 2-amino and 2-fluoro, and ribonucleosides, such as 2-O-methyl, 2-O-allyl, 2- ⁇ ⁇ -methoxyethyl ribonucleosides, “closed” nucleosides (LNAs), and the like.
  • oligonucleotide analogs is used to refer to modified oligonucleotides containing, inter alia, a chemical modification of the phosphate group and / or those in which nucleosides are replaced by nucleoside analogs.
  • oligonucleotide analogs may include, but not limited to, thiophosphates (PS), selenophosphates, dithiophosphates, phosphoramides, boranophosphates, phosphordiamide derivatives of morpholino oligonucleotides (PMOs), tricyclo-DNA, and peptide-nucleic acids (PNA, ⁇ ).
  • phosphate group is used herein to mean a phosphoric acid residue NZ04, in which one or more hydrogen atoms is substituted
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) an organic radical to obtain, respectively, a phosphomonoester, phosphodiester or phosphotriether group.
  • modified phosphate group is used herein to mean a phosphate group in which any of the oxygen atoms is replaced by any chemical group.
  • substituents may include, but not limited to, sulfur or selenium atoms, an imino group (NR), or a borane residue (BH3-).
  • Preferred examples of the modified phosphate group are a thiophosphate group and a phosphoryl guanidine group.
  • the phosphate group and the modified phosphate group may be chiral. If the stereochemical configuration is not indicated, the structure includes both Rp and Sp configuration, both separately and in the form of a mixture: for example, a racemic mixture (racemate).
  • These compounds may also include more than one chiral center. In this case, it should be considered that the structure covers all possible enantiomers and diastereomers.
  • protected oligonucleotide is used herein to mean an oligonucleotide or a modified oligonucleotide containing one or more protecting groups.
  • unprotected oligonucleotide is used herein to mean an oligonucleotide or modified oligonucleotide from which one or more protecting groups have been removed.
  • nucleosides nucleotides and oligonucleotides mean both their protected derivatives and unprotected derivatives.
  • protecting group means a chemical group that is used to temporarily block a reaction site in an organic compound and can be removed under certain conditions.
  • protecting groups may include, but are not limited to, acetyl (Ac), benzoyl (Bz), isobutyryl (Ibu), t-butylphenoxyacetyl (Tac), levulinyl (Lev), methyl (Me), ⁇ -cyanoethyl (CE), allyl (AN), o-chlorophenyl (o-QPh), 4,4'-dimethoxytrityl (DMTr), 4-methoxytrityl (MMTg), t-butyldimethylsilyl (TBDMS), triisopropylsilyloxymethyl (TOM) and other groups.
  • linker is used herein to mean a chemical group for attaching an organic compound to a polymer carrier that is capable of cleaving under special conditions with cleavage of the corresponding organic compound from the corresponding polymer carrier.
  • Linker examples may
  • SUBSTITUTE SHEET include, among others, succinyl, diglycolyl, oxalyl, hydroquinone-0,0'-diacetyl (Q-linker), phthaloyl, 4,5-dichlorophthaloyl, malonyl, glutaryl, diisopropylsilyl, 1, 1,3,3-tetraisopropyl disiloxane- 1,3-diyl and other linkers.
  • linker may also refer to non-nucleotide chemical groups introduced into a modified oligonucleotide (internucleotide linkers), or non-nucleotide chemical groups connecting a nucleotide with a different chemical modification, for example, a fluorescence tag or fluorescence quencher.
  • linkers include, but are not limited to, 1,2-dodecanediol phosphate residue (DD).
  • polymer carrier is used herein to mean a polymer carrier used in solid phase oligonucleotide synthesis.
  • polymeric carriers can include, but not limited to, pore size glass (CPG), polystyrene resins, TentaGel®, TSK Gel® Toyopearl®, polyvinyl alcohol, cellulose acetate, and the like.
  • CPG pore size glass
  • polystyrene resins TentaGel®, TSK Gel® Toyopearl®
  • polyvinyl alcohol cellulose acetate
  • polymer carrier is also used with respect to varieties of substrates for parallel oligonucleotide synthesis, independently including, without limitation, filter paper disks, multipin systems, multi-well plates, and the like.
  • the phosphorylguanidine oligonucleotide analogs of the present invention can be used to prepare therapeutic oligonucleotides similarly to such well-known therapeutic oligonucleotide derivatives as siRNA [Angell & Baulcombe, EMBO J., 1997, 16, 3675; Voinnet & Baulcombe, Nature, 1997, 389, 553; Fire, A. et al, Nature, 1998, 391; Fire, A., Trends Genet., 1999, 15, 358, Sharp, Genes Dev., 2001, 15, 485; Hammond et al, Nature Rev.
  • Oligonucleotide therapeutic agents are used to treat a number of diseases, including viral infections, cancer, eye diseases, including age-related diseases, to prevent unwanted neovascularization, diseases caused by splicing disorders, such as Duchenne muscular dystrophy, and also as anticholesterol drugs.
  • the therapeutic oligonucleotide can be used in the form of a conjugate with a covalently attached peptide, including to improve penetration into cells, for example, as described in patent WO 2009/147368.
  • the oligonucleotide that is the subject of the present invention is intended for use in medicine as a medicine or therapeutic agent.
  • the oligonucleotide of the invention is intended to provide a medicament or dosage form for use in the treatment of a disease.
  • a method of treating a disease comprising administering to the patient an oligonucleotide of the invention to treat a disease.
  • the oligonucleotide of the invention may be included in a medicament or dosage form.
  • the medicament or dosage form may include the oligonucleotide that is the subject of the present invention, in isolated or purified form, as well as pharmaceutically acceptable additives.
  • Medicaments or dosage forms comprising the oligonucleotides of the invention can be administered to a patient in various ways, including, but not limited to, parenteral, intravenous, intra-arterial, intramuscular, oral and intranasal. Medicines and dosage forms may be in liquid or solid form. Liquid forms may be administered by injection into an appropriate part of the human or animal body.
  • the administration is in a therapeutically effective amount (dose), i.e. in an amount sufficient to produce a therapeutically beneficial effect.
  • dose a therapeutically effective amount
  • the amount (dose) administered and the timing of administration will depend on the nature and severity of the disease. Appropriate therapeutic decisions, as well as dosages, are within the competence of practicing physicians and, as a rule, take into account the type of disease, the condition of the patient, route of administration and other factors known to those skilled in the art. Examples of appropriate methods and protocols can be found in the medical literature, for example, in the manual [Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th Ed, 2000, Lippincott, Williams & Wilkins].
  • Methods of using the oligonucleotides of the present invention may include both their in vitro and in vivo use.
  • the term "in vitro” in this case means experiments with materials, biological samples, cells and / or tissues in the laboratory or in cultures of cells and / or tissues.
  • the term “in vivo” in this case implies experiments and procedures using living multicellular organisms.
  • the objects of use of the oligonucleotides that are the subject of the present invention can be plants, animals, preferably mammals, and, more preferably, humans, including male or female patients.
  • the present invention includes a combination of the foregoing options and preferred aspects, unless the combination is obviously unacceptable or underlined unacceptable.
  • Oligonucleotides were analyzed and isolated by reverse phase (of) HPLC on an Agilent 1200 chromatograph (USA) with a Zorbax SB-C 18 column (5 ⁇ m) 4.6x 150 mm in an acetonitrile gradient in 20 mM triethylammonium acetate, pH 7 from 0 to 40% in for 30 minutes at a flow rate of 2 ml / min.
  • a Zorbax SB-C 18 column 5 ⁇ m) 4.6x 150 mm in an acetonitrile gradient in 20 mM triethylammonium acetate, pH 7 from 0 to 40% in for 30 minutes at a flow rate of 2 ml / min.
  • PAGE polyacrylamide gel electrophoresis
  • Molecular weights of the modified oligonucleotides were determined using MALDI-TOF mass spectrometry on a Bruker Reflex III Autoflex Speed instrument (Germany) in the variant of positive or negative ions using 3-hydroxypicolinic acid as a matrix or ESI LC-MS / MS mass spectrometry on a device Agilent G6410A (USA) in the registration mode of negative or positive ions.
  • Samples were prepared by dissolving oligonucleotides in a 20 mM triethylammonium acetate buffer in 60% aqueous acetonitrile to a concentration of 0.1 mM. The volume of the analyzed sample was 10 ⁇ l.
  • the analysis was carried out using 80% aqueous acetonitrile as an eluent at a flow rate of 0.1 ml / min. Used the standard settings of the mass spectrometer. Molecular weights of oligonucleotides were calculated using sets of experimental m / z values determined for each sample to be analyzed.
  • the peptides were synthesized using a CEM Liberty peptide synthesizer (USA) at a scale of 0.1 mmol according to the Fmoc / t-Bu scheme on a Fmoc-PAL-PEG-PS polymer substrate (Applied Biosystems).
  • the aggravate negligence-terminal fatty acid residue (palmitic or stearic) was introduced using 10 eq. RuVOR and 20 equiv. DIEA in DMF.
  • Peptides were cleaved from the substrate by treatment with a mixture of 95% trifluoroacetic
  • the molecular weights of the peptides were determined using MALDI-TOF mass spectrometry on a Voyager DE Pro Workstation instrument from Perseptive Biosystems (USA) in the mode of recording positively charged ions using a solution of 10 mg / ml of a-cyano-4-hydroxycinnamic acid in 50 % acetonitrile containing 3% TFU.
  • Mouse H2k mdx myoblasts were cultured in gelatin-coated culture vials (0.01%) at 33 ° C. in 10% C0 2 atmosphere in DMEM (PAA Laboratories) containing 20% fetal calf serum (FBS Gold, PAA Laboratories) , 2% chicken embryonic extract (Seralab), 1% mixture of antibiotics penicillin, streptomycin and neomycin (PSN, Gibco) and 3 pg / ⁇ l of ⁇ -interferon (PeproTech).
  • Cells were seeded in gelatin-coated (0.01%) 24-well plates to a density of 4 x 10 5 cells / ml and incubated for two days at 33 ° C in an atmosphere of 10% C0 2 as undifferentiated myoblasts. To differentiate into muscle fibers, cells were further incubated in DMEM medium with 5% horse serum (Sigma) and 1% PSN at 37 ° C in an atmosphere of 5% C0 2 for 5 days. Cell differentiation was monitored by measuring the level of troponin T using Western blotting.
  • RT-PCR reverse transcription polymerase chain reaction
  • PCR reverse transcription polymerase chain reaction
  • a GenAMP RNA PCR kit (Invitrogen Life Technology), 400 ng RNA template, and a pair of Exon20Fo 5 ′ -C AGAATTCTGCCAATTGCTGAG-3 ′ and Exon20Ro 5′-TTCTTCAGCTTGTGTCATCC-3 ′ primers were used.
  • the following cycle was used for PCR: the first step 30 min at 42 ° C, 15 min at 94 ° C and 5 min at 5 ° C; second stage 2 min at 95 ° C, then 30
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) cycles of 30 seconds at 95 ° C, 1 min at 58 ° C, 2 min at 72 ° C and a final extension of 10 min at 72 ° C.
  • Amplitaq Gold DNA polymerase (Invitrogen Life Technology) and a pair of Exon20Fi 5'-CCCAGTCTACCACCCTATCAGAGC-3 'and Exon20Ri 5' -CCTGCCTTTAAGGCTTCCTT-3 'primers were used for nested PCR. The following cycle was used: 10 min at 95 ° C, then 22 cycles of 30 sec at 95 ° C, 1 min at 58 ° C, 2 min at 72 ° C and a final extension of 10 min at 72 ° C.
  • the products were separated by electrophoresis in 2.5% agarose gel in 0.5% TBE (100 V, 1 h) with visualization of the bands by staining with SYBR Gold (Molecular Probes).
  • the separation results were documented using a Fluor-S system with a cooled CCD camera (BioRad) and processed using the Quantity One program (BioRad).
  • the exon skipping rate (%) was calculated as the ratio of the peak area of mRNA with a deletion of 23 exon ( ⁇ 23) to the sum of the peak areas of full-sized pre-mRNA, mRNA ⁇ 23 and mRNA ⁇ 23 + ⁇ 22.
  • EXAMPLE 1 Determination of the activity of oligo-2'-0-methylribonucleotides containing simultaneously 1, 1,3,3-tetramethylguanidine groups (Tmg) and thiophosphate groups (PS), in the correction of dystrophin pre-mRNA splicing in muscle fiber culture H2k mdx mice.
  • control oligo-2'-0-methylribonucleotide (2'-OMe PO) M159 and 2'-OMe PS-oligonucleotide M560 oligo-2'-0-methylribonucleotide M162 containing, along with 14 negatively charged thiophosphate (PS) groups from the 5 'end, four electrically neutral 1, 1,3,3-tetramethylphosphorylguanidine groups (Tmg) from the 3'-end, which reduce the total negative charge of the oligonucleotide (Table 1).
  • PS negatively charged thiophosphate
  • Tmg electrically neutral 1, 1,3,3-tetramethylphosphorylguanidine groups
  • EXAMPLE 2 Determination of the activity of oligodeoxyribo- and oligo-2'-0-methylribonucleotides containing 1,3-dimethyl-2-imidazolidinimino group (Dmi) at all internucleotide positions, with the correction of dystrophin pre-mRNA splicing in a mouse muscle fiber culture H2k mdx.
  • the activity of new oligonucleotide derivatives containing phosphorylguanidine Dmi groups in a 2-deoxyribonucleotide backbone and 2'-0-methylribonucleotide backbone was studied in experiments on the correction of splicing of mutant dystrophin pre mRNA with exon 23 skipping in a murine muscle tissue ⁇ 2 Agencyd.
  • the sequence of oligonucleotides are given in table. 2.
  • a morpholine oligonucleotide (PMO) 5'-GGCCAAACCTCGGCTTACCTGAAAT was used both in the absence of any transfection agent and in the presence of 5 ⁇ M Pal-RXR4 and St-STl vector peptides (Table 3).
  • PMO morpholine oligonucleotide
  • EXAMPLE 3 Conjugation of phosphorylguanidine oligonucleotides (CSF) with a peptide using "click" chemistry.
  • the reaction was carried out with a 5-fold excess of peptide by adding 10 ⁇ l of an aqueous solution of CuS0 4 (550 mM, 50 equiv.), 4.4 mg of TBTA (50 equiv.), 10 ⁇ l of an aqueous solution of ascorbic acid (840 mm, 50 equiv.) And 20 ⁇ l 0.2 M triethylammonium acetate (TEAA), pH 7. After shaking the reaction mixture for 12 h at room temperature, the conjugate was isolated as the main peak by ion exchange chromatography.
  • TEAA triethylammonium acetate
  • EXAMPLE 4 Conjugation of phosphorylguanidine oligonucleotides (CSF) with a peptide using fragment condensation in solution.
  • CSF phosphorylguanidine oligonucleotides
  • Pip6a peptide (Table 6) was obtained by solid phase synthesis according to the Fmoc scheme using a MultiPep peptide synthesizer (Intavis AG, West Germany).
  • FGO 7a, b (250 nmol) was dissolved in 100 ⁇ l of dry DMSO.
  • a 100 mM peptide solution, 300 mM solutions of TSTU and DIPEA in NMP were mixed in a ratio of 1: 4: 3.8: 12 with respect to the oligonucleotide to preactivate the peptide to form ⁇ -hydroxysuccinimide ester 9 (Fig. 11).

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области молекулярной медицины. Предметом изобретения является использование аналогов олигонуклеотидов, в которых одна или более фосфодиэфирных групп замещены фосфорилгуанидиновой группой, и их производных, например, таких как конъюгаты с векторными пептидами, для коррекции сплайсинга пре- мРНК с целью создания терапевтических препаратов для лечения тяжелого генетического заболевания мышечной дистрофии Дюшена.

Description

НАЗВАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
АНАЛОГИ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ КАК СРЕДСТВА КОРРЕКЦИИ СПЛАЙСИНГА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ МЫШЕЧНОЙ ДИСТРОФИИ ДЮШЕНА
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ [0001] Изобретение относится к области молекулярной медицины.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0002] Мышечная дистрофия Дюшена (МДД) - тяжелое заболевание, которое характеризуется прогрессирующей мышечной дистрофией, приводящей в конечном итоге к полной потере способности передвигаться и ранней смерти больного [Flanigan К.М. Duchenne and Becker muscular dystrophies. Neurol. Clin. 2014; 32: 671-688]. Несмотря на то, что Всемирная организация здравоохранения относит это заболевание к категории редких, поскольку по приблизительным подсчетам им страдает 1 мальчик из 3600 (около 20000 новых случаев ежегодно), МДД является наиболее распространенной генетической болезнью, диагностируемой в детстве. МДД относится к нейродегенеративным миопатиям и обусловлена мутациями в гене DMD, локализованном в Х-хромосоме. Ген DMD содержит примерно 2.4 х 106 пар нуклеотидов, 79 экзонов и является одним из крупнейших генов в человеческом геноме. Мутации в гене DMD, как правило, затрагивают район между экзонами 45 и 55 и могут быть унаследованы, но приблизительно в 35% случаев возникают спонтанно. Белок дистрофии имеет молекулярную массу около 427 кДа и отвечает за соединение цитоскелета каждого мышечного волокна с основной базальной пластинкой внеклеточного матрикса через белковый комплекс, который состоит из многих субъединиц. Недостаток этого белка, обусловленный делециями и нонсенс-мутациями в гене DMD, нарушающими рамку считывания, приводит к некрозу мышечных волокон и замене мышечной ткани на жировую и соединительную [Muntoni F., Wood M.J. A. Targeting RNA to treat neuromuscular disease. Nature Rev. Drug Discov. 2011; 10: 621-637]. Симптомы заболевания обычно возникают у мальчиков до 5 лет и могут проявиться уже в раннем детстве. Основным симптомом МДД является мышечная слабость, которая в первую очередь связана с атрофией мышц, а именно скелетной мышечной ткани, мышц сердца, диафрагмы и дыхательных мышц (на более поздних стадиях). В связи с прогрессирующим ухудшением работы мышц, больной теряет возможность двигаться; большинство пациентов старше 12 лет уже не могут передвигаться без инвалидной коляски. Больные МДД, как правило, умирают в возрасте не старше 30 лет вследствие расстройства дыхательной и сердечной деятельности. До настоящего времени, несмотря на активно
1
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) ведущиеся исследования, все еще не существует иного способа лечения этой болезни, кроме сугубо симптоматического.
[0003] Ранее было показано, что влияние мутации удается компенсировать путем коррекции сплайсинга пре-мРНК дистрофина за счет пропуска мутантного экзона с помощью производного олигонуклеотида, пространственно блокирующего соответствующий сайт сплайсинга [Wilton S.D., Fall A.M., Harding P.L., McClorey G. et al. Antisense oligonucleotide-induced exon skipping across the guman dystrophin gene transcript. Mol. Ther. 2007; 15: 1288-1296; Saleh A.F., Arzumanov A.A., Gait M.J. Overview of alternative oligonucleotide chemistries for exon skipping. Methods Mol Biol. 2012; 867: 365-378; Jarver P., O'Donovan L., Gait M.J. A chemical view of oligonucleotides for exon skipping and related drug applications. Nucleic Acid Ther. 2014; 24: 37-47] (рис. 1). Пропуск экзона приводит к восстановлению нормальной рамки считывания и биосинтезу укороченного, но частично функционального дистрофина, что вызывает переход болезни в более мягкую клиническую форму мышечной дистрофии Беккера [Flanigan К.М. Duchenne and Becker muscular dystrophies. Neurol. Clin. 2014; 32: 671-688]. До последнего времени клинические испытания как потенциальные трапевтические препараты для лечения МДД проходили такие аналоги олигонуклеотидов, как олиго-2'-0-метилрибонуклеозидтиофосфаты (2'- ОМе PS-олигонуклеотиды) [Goemans N.M., Tulinius М., Van den Akker J.T., Burm D.E. et al. Systemic administration of PRO051 in Duchenne's muscular dystrophy. New England J. Med. 2011, 364: 1513-1522] (рис. 2, а) и фосфордиамидные морфолиновые олигонуклеотиды (PMO) [Mendell J.R., Rodino-Clapac L.R., Sahenk Z., Roush C. et al. Eteplirsen for the treatment of Duchenne muscular dystrophy. Ann. Neurol. 2013; 66: 637-647] (рис. 2, б). Однако, результаты клинических испытаний показали недостаточную эффективность обоих кандидатов. Таким образом, для достижения терапевтического результата при лечении МДД сохраняет свою актуальность создание новых аналогов олигонуклеотидов с улучшенными свойствами по сравнению с существующими прототипами.
[0004] Олигонуклеотидные препараты для лечения МДД, как правило, вводят путем внутривенной или подкожной инъекции, после чего они должны через кровоток попасть в мышечные клетки различных скелетных тканей, диафрагму и сердечную мышцу. В олиго- 2'-0-метилрибонуклеотидтиофосфатах (2'-ОМе PS-олигонуклеотидах), участвовавших в клинических испытаниях в отношении МДД, вместо фосфодиэфирной группы присутствует тиофосфатная группа (PS), которая не только приводит к возрастанию устойчивости олигонуклеотидов к действию сывороточных нуклеаз, но и придает благоприятные для терапевтического применения свойства за счет связывания с белками сыворотки [Eckstein F. Phosphorothioate oligonucleotides: what is their origin and what is unique
2
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) about them? Nucleic Acid Ther. 2014; 24: 374-387]. Однако наличие значительного суммарного отрицательного заряда препятствует эффективному проникновению 2'-ОМе PS-олигонуклеотидов в мышечные клетки. Как 2'-ОМе PS-олигонуклеотиды, так и морфолиновые олигонуклеотиды (РМО) демонстрируют относительно низкий уровень проникновения в мышечные ткани in vivo, в особенности, в сердечную мышцу. Для обеспечения терапевтического эффекта требуются повторные инъекции высоких доз обоих типов аналогов [Yin Н. et al. Pip5 transduction peptides direct high efficiency oligonucleotide - mediated dystrophin exon skipping in heart and phenotypic correction in mdx mice. Mol. Ther. 2011; 19: 1295-1303; Betts C. et al. Pip6-PMO, a new generation of peptide-oligonucleotide conjugates with improved cardiac exon skipping activity for Duchenne muscular dystrophy treatment. Molecular Therapy Nucleic Acids. 2012; 1: e38; Lehto T. et al. Cellular trafficking determines the exon skipping activity of Pip6a-PMO in mdx skeletal and cardiac muscle cells. Nucleic Acids Res. 2014; 42: 3207-3217]. В то же время, частичная или полная замена отрицательно заряженных фосфодиэфирных групп электронейтральными группами в случае морфолиновых олигонуклеотидов (РМО) приводит к улучшению проникновения незаряженных олигонуклеотидов в мышечные клетки и повышению уровня пропуска экзона как в культуре мышечных волокон H2k mdx мыши, так и in vivo по сравнению с заряженными PS-олигонуклеотидами [Fletcher S. et al. Dystrophin expression in the mdx mouse after localised and systemic administration of a morpholino antisense oligonucleotide. J Gene Med. 2006; 8: 207-216]. Для повышения эффективности доставки антисмысловых препаратов в клетки были предложены пептидные конъюгаты морфолинов (Р-РМО), в которых последовательность аналога олигонуклеотида связана ковалентной связью с последовательностью векторного пептида (cell-penetrating peptides, СРР) [Jarver P. et al. Peptide-mediated cell and in vivo delivery of antisense oligonucleotides and siRNA. Mol. Ther. Nucleic Acids. 2012; 1: е27]. Было показано, что конъюгаты Р-РМО попадают в мышечные клетки и ткани in vivo гораздо эффективнее и в меньших дозах, чем неконъюгированные (свободные) олигонуклеотиды. Например, конъюгат морфолинового РМО с поликатионным В-пептидом RXRRBRRXRRBRXB, богатым остатками аргинина (R), оказался способен вызывать восстановление биосинтеза функционального дистрофина в мышечных клетках мышей линии mdx с мутацией в экзоне 23 гена дистрофина при дозах в 10-100 раз ниже, чем неконъюгированный РМО [Jearawiriyapaisarn N. et al. Sustained dystrophin expression induced by peptide-conjugated morpholino oligomers in the muscles of mdx mice. Mol. Ther. 2008; 16: 1624-1629; Wu B. et al. Effective rescue of dystrophin improves cardiac function in dystrophin-deficient mice by a modifies morpholino oligomer. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2008; 105: 14814-14819; Yin H. et al. Cell-penetrating peptide-conjugated
3
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) antisense oligonucleotides restore systemic muscle and cardiac dystrophin expression and function. Hum. Mol. Gen. 2008; 17: 3909-3918]. Дополнительным преимуществом электронейтральных аналогов олигонуклеотидов является относительная простота конъюгации с поликатионными пептидами [Shabanpoor F. et al. Bi-specific splice- switching PMO oligonucleotides conjugated via a single peptide active in a mouse model of Duchenne muscular dystrophy. Nucleic Acids Res. 2014; 43: 29-39]. Однако, и для конъюгатов Р-РМО наблюдается существенно меньшее проникновение в диафрагму и, в особенности, в сердечную мышцу, чем в скелетную мышечную ткань. Таким образом, для достижения значимого клинического результата при лечении МДД сохраняет свою актуальность создание новых видов аналогов олигонуклеотидов с улучшенным проникновением в мышечные клетки и ткани по сравнению с существующими прототипами.
[0005] Данное изобретение раскрывает использование для коррекции сплайсинга с целью лечения мышечной дистрофии Дюшена (МДД) аналогов олигонуклеотидов, содержащих вместо одной или нескольких фосфодиэфирных групп (вплоть до полного их замещения) фосфор илгуанидиновые группы, такие как 1, 1,3,3- тетраметилфосфорилгуанидиновая группа (Tmg) и 1,3-диметил-2- имидазолидиниминогруппа (Dmi) (рис. 2, в) [Купрюшкин М.С., Пышный Д.В., Стеценко Д.А. Фосфорилгуанидины. Новый класс аналогов нуклеиновых кислот. Acta Naturae. 2014; 6: 123-125]. Фосфорилгуанидиновые олигонуклеотиды и способ их получения являются предметом заявок на патенты [Стеценко Д.А., Купрюшкин М.С., Пышный Д.В., заявка на патент РФ JV22014134380, 22 августа 2014; Stetsenko D.A., Kupryushkin M.S., Pyshnyi D.V. Modified oligonucleotides and methods for their synthesis. PCT application WO2016/028187 Al, приоритет от 22.08.2014]. Было показано, что фосфорилгуанидиновые олигонуклеотиды (ФГО) обладают физико-химическими и биологическими свойствами, благоприятных для их использования как терапевтических агентов, в частности, способностью образовывать устойчивые комплементарные комплексы как с ДНК, так и с РНК [Купрюшкин М.С., Пышный Д.В., Стеценко Д.А. Фосфорилгуанидины. Новый класс аналогов нуклеиновых кислот. Acta Naturae. 2014; 6: 123-125] и устойчивостью к действию ферментов, расщепляющих фосфодиэфирную связь [Lebedeva N.A., Anarbaev R.O., Kupryushkin M.S., Rechkunova N.I., Pyshnyi D.V., Stetsenko D.A., Lavrik O.I. Bioconjugate Chem. 2015, 26, 2046- 2053; Kuznetsov N.A., Kupryushkin M.S., Abramova N.V., Kuznetsova A.A., Miroshnikova A.D., Stetsenko D.A., Pyshnyi D.V., Fedorova O.S. Mol. BioSyst. 2016, 12, 67-75]. Так как при замещении фосфорилгуанидиновой группой химической модификации подвергается исключительно межнуклеотидная фосфатная группа, это открывает возможность для создания ФГО на основе различных вариантов сахарофосфатного остова, например, с
4
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) использованием дезоксирибозы (R2 = Н, рис. 2, в) или 2-О-метилрибозы (R2 = ОСНз, рис. 2, в).
[0006] В данном изобретении раскрывается биологическая активность фосфорилгуанидиновых олигонуклеотидов (ФГО) с сахарофосфатным остовом на основе 2-О-метилрибозы, определенная путем экспериментов в клеточной модели МДД in vitro в культуре мышечных волокон мыши H2k mdx и in vivo на мышах линии mdx, которая сравнима или превосходит активность наиболее успешных из существующих аналогов - фосфордиамидных морфолиновых олигонуклеотидов (РМО). Фосфорилгуанидиновые олигонуклеотиды также могут быть использованы для коррекции сплайсинга in vitro и in vivo в виде конъюгатов с пептидами (ПФГО), показывая при этом сравнимые результаты с пептидными конъюгатами морфолиновых олигонуклеотидов (Р-РМО).
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0007] Существующие в настоящее время аналоги олигонуклеотидов не обеспечивают потребности фармацевтического рынка в высокоэффективных и селективных терапевтических препаратах для лечения генетических болезней, таких как мышечная дистрофия Дюшена (МДД), являющаяся объектом данного изобретения. Несмотря на относительно большое число терапевтических кандидатов, проходивших клинические испытания, на рынок с 1998 г. поступило всего пять олигонуклеотидных препаратов. Терапевтические кандидаты на основе олигонуклеотидных производных двух типов: этеплирсен (Eteplirsen) из числа морфолиновых олигонуклеотидов (РМО) и дрисаперсен (Drisapersen) - олиго-2'-0-метилрибонуклеотид, модифицированный тиофосфатными группами - показали способность эффективно вызывать пропуск человеческого экзона 51 и до недавнего времени проходили клинические испытания. По итогам Фазы III клинических испытаний дрисаперсена осенью 2013 г. основной участник - фирма GlaxoSmith Kline (GSK) признала результаты испытаний неудовлетворительными и вышла из состава консорциума. В то же время, в 2013 г. компания Sarepta Therapeutics (www . repta. com) анонсировала, что морфолиновый олигонуклеотид этеплирсен (А VI- 4658) успешно прошел Фазу III клинических испытаний в отношении мышечной дистрофии Дюшена [Sarepta Therapeutics, Efficacy Study of AVI-4658 to Induce Dystrophin Expression in Selected Duchenne Muscular Dystrophy Patients, ClinicalTrials.gov. US Government, NIH, 30.10.2012, www.clmicaitrials.gov/ct2/shosv/NCT01.3962391. В 2014 г. компания Sarepta Therapeutics обратилась в Федеральную службу пищевых продуктов и лекарств США (Food & Drug Administration, FDA) с заявкой на одобрение допуска этеплирсена на фармацевтический рынок США. Это свидетельствует о наличии
5
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) преимуществ у морфолинов перед 2'-0-метильными тиофосфатами при лечении МДД.
Авторы заявки считают, что производные фосфорилгуанидиновых олигонуклеотидов, будучи в силу отсутствия отрицательного заряда концептуально ближе к морфолиновым олигонуклеотидам, чем к тиофосфатам, имеют высокие шансы оказаться подходящими инструментами для коррекции сплайсинга при МДД, что подтверждается приведенными в заявке примерами.
[0008] Однако, и морфолиновый олигонуклеотид этеплирсен для лечения МДД, по итогам экспертизы в январе 2015 г. не получил одобрения FDA ввиду недостаточной терапевтической эффективности, что может быть связано, в том числе, с его недостаточным накоплением в критически важных тканях организма, таких как диафрагма и миокард.
[0009] В силу отсутствия прорывных медицинских технологий нерешенным остается ряд глобальных задач, к которым, помимо генетических болезней и рака можно отнести инфекционные заболевания, вызываемые как вирусами (ВИЧ, лихорадка Эбола, гепатиты, грипп и т.д.), так и бактериями (туберкулез и нозокомиальные инфекции, вызываемые штаммами патогенов с множественной лекарственной устойчивостью).
[0010] В настоящее время на фармацевтическом рынке при отсутствии практически значимой конкуренции с российской стороны целиком доминируют западные решения. В то же время, круг предлагаемых для клинического использования видов аналогов олигонуклеотидов ограничен. Это тиофосфаты (предложены более 30 лет назад), siPHK (предложены более 15 лет назад), LNA (предложены 20 лет назад, срок действия патента истек) и морфолиновые олигонуклеотиды (предложены 20 лет назад, срок действия патента истек). Число новых аналогов, разработанных в более позднее время, и показавших свою перспективность как потенциальные терапевтические средства, например, трицикло-ДНК [Goyenvalle A., Griffith G., Babbs A., El Andaloussi S., Ezzat К., Avril A., Dugovic В., Chaussenot R., Ferry A., Voit Т., Amthor H., Biihr C, Schiirch S., Wood M.J.A. et al. Functional correction in mouse models of muscular dystrophy using exon-skipping tricyclo-DNA oligomers. Nature Medicine. 2015; 21: 270-275], остается весьма небольшим.
[ООН] Раскрытые в заявке на патент РФ
Figure imgf000008_0001
и заявке WO2016/028187 А1 фосфорилгуанидиновые олигонуклеотиды (ФГО) обладают свойствами, которые делают их перспективными кандидатами для разработки терапевтических препаратов, действующих путем коррекции сплайсинга по антисмысловому механизму [Zamecnik P., Stephenson М. 1978. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 75, 280-284]. Данный механизм лежит в основе способа лечения МДД, что предложено использовать в настоящем проекте. По сравнению с ГИК и РМО, структура фосфорилгуанидиновых олигонуклеотидов наиболее близка природным нуклеиновым кислотам, так как модификации подвергается только фосфатная группа, а
6
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) углеводный остаток сохраняется неизменным. Кроме того, структура новых аналогов позволяет вводить дополнительные функциональные группы как в боковую цепь фосфорилгуанидиновой группы, так и в остаток сахара с целью улучшить их сродство к мРНК и проникновение в клетки. В то же время химический синтез этих производных относительно несложен, что позволяет прогнозировать конкурентные преимущества в себестоимости продукта по сравнению с большинством существующих прототипов. Кроме того, спектр возможных производных, которые могут быть синтезированы на основе фосфорилгуанидиновых олигонуклеотидов, в силу легкости их дополнительной химической модификации также значительно шире, чем у большинства существующих прототипов. Это позволяет планировать получение продуктов, недоступных конкурентам, использующим разработанные ранее методы, и ориентироваться на новые сегменты фармацевтического рынка.
[0012] Для синтеза фосфорилгуанидиновых олигонуклеотидов используется автоматизированный твердофазный синтез по фосфитамидному методу, который обеспечивает универсальность и простоту получения терапевтических препаратов для лечения МДД, а также их умеренную стоимость. В то же время способ синтез морфолиновых олигонуклеотидов сильно отличается от наиболее эффективного в настоящее время фосфитамидного метода и поэтому несовместим с большинством уже разработанных модифицирующих реагентов, в том числе, реагентов для введения флуоресцентных меток и т.д. [Summerton, J.; Weller, D. Antisense Nucl. Acid Drug Dev. 1997, 7, 187-195]. Также, по некоторым данным, синтез морфолиновых олигонуклеотидов сопровождается побочными реакциями по остаткам гуанина.
[0013] На основании литературных данных о незаряженных морфолиновых олигонуклеотидах и собственных предварительных результатов авторы заявки предположили, что нейтральные фосфорилгуанидиновые олигонуклеотиды могут проникать в мышечные клетки не хуже морфолиновых аналогов и лучше, чем отрицательно заряженные 2'-ОМе тиофосфаты. Для наиболее эффективного проникновения в мышечные клетки и распределения в наиболее важные органы и ткани - такие, как сердечная мышца и диафрагма - может быть использована конъюгация с пептидами. Известно, что конъюгаты морфолиновых олигонуклеотидов (РМО) с векторными пептидами, обеспечивающими проникновение в клетки (cell penetrating peptides, СРР) - т.н. Р-РМО являются активными агентами для коррекции сплайсинга при МДД, в частности, Р-РМО на основе оптимизированного пептида Pip6a. Для обеспечения эффективного проникновения фосфорилгуанидиновых олигонуклеотидов в критически важные мышечные ткани типа сердечной мышцы была осуществлена конъюгация фосфорилгуанидиновых
7
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) олигонуклеотидов с пептидом Pip6a, облегчающим проникновение в мышечные клетки и обеспечивающим попадание конъюгата в диафрагму и сердце.
[0014] Следует отметить, что в отличие от морфолинов, предложенная в заявке на патент РФ JVT22014134380 и заявке WO2016/028187 А1 фосфорилгуанидиновая модификация касается только фосфатной группы, но не затрагивает остатка сахара, что позволяет комбинировать фосфорилгуанидиновую модификацию с другими, предложенными ранее химическими модификациями остатка (дезокси)рибозы с целью придания олигонуклеотиду благоприятных свойств. Так, для повышения сродства к РНК- мишени в антисмысловых олигонуклеотидах дезоксирибоза могут быть заменена на 2-0- метилрибозу или 2-фтор-2-дезоксирибозу. Данные аналоги олигорибонуклеотидов обладают рядом преимуществ по сравнению с ДНК, а именно: высокой скоростью гибридизации с РНК и повышенной устойчивостью дуплексов с РНК [Y. Hou et al. Biochemistry. 1996. V.35. Р.15340-15348; М. Majlessi et al. Nucl. Acids. Res. 1998. V.26. P.2224-2229]. Это является существенным для повышения эффективности коррекции сплайсинга пре-мРНК дистрофина при воздействии на нее антисмыслового ол игону кл еотид а .
[0015] В качестве клеточной линии для изучения способности фосфорилгуанидиновых олигонуклеотидов восстанавливать биосинтез укороченного на один экзон, но функционального дистрофина были использованы мышечные волокна мыши H2k mdx, экспрессирующие мутантный ген дистрофина. В данной клеточной линии мутация в гене дистрофина приводит к образованию стоп-кодона в 23 экзоне мРНК, терминируя тем самым биосинтез дистрофина [Muntoni F, Wood MJ. Nat Rev Drug Discov. 2011. V. 10. P. 621-637]. На автоматическом синтезаторе ASM-800 (Россия) с использованием разработанных и оптимизированных авторами протоколов твердофазного фосфитамидного синтеза были синтезированы фосфорилгуанидиновые олигонуклеотиды, содержащие дезоксирибозу, 2-О-метилрибозу или 2'-фтор-2-дезоксирибозу. Антисмысловые олигонуклеотиды были направлены на 5 '-регион сплайсингового участка интрона 23 с целью обеспечить пропуск экзона 23 для восстановления тем самым биосинтеза укороченного дистрофина, который способен выполнять биологические функции своего полноразмерного аналога. В качестве контрольных были использованы соответствующие морфолиновые олигонуклеотиды с той же последовательностью нуклеотидов. Параллельно был проведен синтез векторного пептида Pip6a с последующей его конъюгацией с фосфорилгуанидиновыми ол игону кл еотид ами.
[0016] Отобранные фосфорилгуанидиновые олигонуклеотиды были исследованы на способность корректировать мутацию в гене DMD путем пропуска экзона 23 пре-мРНК
8
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) дистрофина в клетках мышиных мышечных волокон линии H2k mdx. Эффективность пропуска экзона была определена при помощи метода полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) с последующей гнездовой ПЦР и анализом реакционных смесей методом гель-электрофореза в агарозе. Для получения количественных характеристик радиоавтограф агарозного геля был переведен в цифровую форму. Процент пропуска экзона рассчитывался как отношение площади пика мРНК с делецией 23 экзона (Δ23) к сумме площадей пиков полноразмерной пре-мРНК, мРНК Δ23 и мРНК Δ23+Δ22.
[0017] Олигонуклеотиды и их пептидные конъюгаты, показавшие высокую активность в культуре мышечных клеток in vitro были далее использованы для изучения коррекции сплайсинга в мышечной ткани мышей линии mdx in vivo после однократной внутримышечной инъекции в переднюю болыиеберцовую мышцу tibialis anterior (ТА). Активность фосфорилгуанидиновых олигонуклеотидов и их пептидных конъюгатов при этом была сравнима с активностью уже известных морфолиновых олигонуклеотидов (РМО) и их пептидных конъюгатов (Р-РМО), которые являются наиболее эффективными в настоящее время средствами для коррекции сплайсинга при МДД.
[0018] На завершающем этапе были проведены эксперименты in vivo на мышах линии mdx путем внутривенной инъекции наиболее активных в культуре клеток олигонуклеотидов и конъюгатов. В этих экспериментах были использованы мыши линии mdx возрастом 4.5-5.5 недель и массой 25-30 г. Опыты были проведены согласно процедурам, одобренным Министерством внутренних дел Великобритании. Олигонуклеотиды в виде раствора с25% диметилсульфоксида (DMSO) были введены в хвостовую вену мышей в условиях обезболивания. Две недели спустя мыши были усыплены вдыханием С02, и полученные образцы мышечной ткани, диафрагмы и миокарда хранились при -80°С после замораживания в охлажденном изопентане. Визуализация дистрофина и количественное его определение в образцах тканей были проведены при помощи иммуногистохимического анализа и Вестерн-блоттинга, как описано в ссылке [Betts С et al 2012 Mol Ther Nucl Acids 1: е38]. Эффективность пропуска экзона была определена при помощи ОТ-ПЦР и количественной ПЦР в реальном времени. Анализ биомаркеров токсичности был проведен путем определения показателей клинической биохимии в образцах плазмы крови, отобранных из яремной вены мышей линии mdx сразу после усыпления вдыханием углекислого газа.
[0019] Ранее авторами было показано, что фосфорилгуанидиновые олигонуклеотиды (ФГО) с остовом на основе ДНК способны образовывать комплементарные комплексы с ДНК или РНК, устойчивость которых лишь незначительно
9
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) отличается от устойчивости природных дуплексов ДНК с ДНК и ДНК с РНК [Купрюшкин
М.С., Пышный Д.В., Стеценко Д.А. Фосфорилгуанидины. Новый класс аналогов нуклеиновых кислот. Acta Naturae. 2014; 6: 123-125]. Это позволило предположить, что ФГО могли бы послужить подходящими антисмысловыми агентами для коррекции сплайсинга при мышечной дистрофии Дюшена (МДД). Ожидалось, что уровень пропуска экзона будет в основном определяться эффективностью доставки олигонуклеотида в мышечные клетки. Для проверки этой гипотезы были исследованы тиофосфатные производные олиго-2'-0-метилрибонуклеотидов (2'-ОМе PS-олигонуклеотиды), содержащие ограниченное число фосфорилгуанидиновых Tmg-rpynn электронейтрального характера, уменьшивших суммарный отрицательный заряд олигонуклеотида.
Табл. 1. Последовательности олигонуклеотидов с 1,1,3,3-тетраметилгуанидиновой группой (Tmg), использованных для коррекции сплайсинга пре-мРНК дистрофина в культуре мышечных волокон мыши Н2к mdx.
Figure imgf000012_0001
a Последовательности олиго-2'-0-метилрибонуклеотидов обозначены прописными буквами, LNA - строчными буквами; 6 s - межнуклеотидная тиофосфатная группа -P(=S)(0")-; " Flu - остаток 5'- флуоресцеина; г звездочкой (*) обозначено положение межнуклеотидной Tmg-группы.
[0020] Была изучена активность новых олигонуклеотидных производных, содержащих четыре фосфорилгуанидиновые группы Tmg на месте 3' -концевых фосфатных
10
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) групп, в экспериментах по коррекции сплайсинга мутантной пре-мРНК дистрофина с пропуском экзона 23 в культуре mdx мышиных мышечных клеток с использованием 2'- ОМе PS олигонуклеотидов в качестве положительного контроля как в присутствии, так и в отсутствии трансфектанта Lipofectamine 2000 (рис. 3).
[0021] Эксперимент показал, что в присутствие Lipofectamine 2000 модифицированный Tmg-группами олигонуклеотид (Ml 62) не проявил преимущества перед контрольным 2'-ОМе PS-олигонуклеотидом (М560). Корректирующая активность смешанных 2'-OMe/LNA PS олигонуклеотидов как с Tmg-группами (М662), так и без Tmg- групп (М563) заметно уступала активности контрольного 2'-ОМе PS -олигонуклеотида (М560), а олиго-2'-0-метилрибонуклеотид, содержащий обычные фосфатные группы (Ml 59), вообще не проявил корректирующей сплайсинг активности (рис. 3).
[0022] В то же время в условиях свободного проникновения без всякого трансфектанта (гимноз) в течение 24 ч в присутствии 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) 2'-ОМе PS-олигонуклеотид, модифицированный четырьмя Tmg-группами (М162), показал более высокую активность по пропуску экзона 23, чем контрольный 2' - ОМе PS-олигонуклеотид (М560) (рис. 4). Можно сделать вывод, что присутствие даже четырех модифицирующих Tmg-групп в составе олигонуклеотида с 3' -конца не только обеспечивает эффективную защиту от действия З'-экзонуклеаз, присутствующих в сыворотке, но и обеспечивает улучшенное проникновение модифицированного Tmg- группами олигонуклеотида в мышечные клетки в отсутствие трансфектанта. В то же время наибольший уровень пропуска экзона (>70%) был достигнут с помощью пептидного конъюгата морфолинового олигонуклеотида Pip6a-PMO в концентрации 0.5 мкМ (рис. 5).
[0023] Следует также отметить, что 2'-ОМе PS-олигонуклеотиды с четырьмя Tmg- группами не проявляли цитотоксичности в отношении мышечных клеток H2k mdx при концентрации до 20 мкМ и времени инкубации до 24 ч.
[0024] Можно заключить, что PS-олигонуклеотиды, модифицированные электронейтральными фосфорилгуанидиновыми группами Tmg, в условиях модельной коррекции мышечной дистрофии Дюшенна (МДД) в культуре клеток in vitro показали биологическую активность, сопоставимую с активностью контрольного 2' -ОМе PS- олигонуклеотида без модификации при отсутствии выраженной цитотоксичности. В то же время в условиях свободного проникновения без трансфектанта (гимноз) при добавлении сыворотки Tmg-модифицированный олигонуклеотид превосходил по своей активности контрольный олигонуклеотид без модификации, что можно объяснить повышенной биологической устойчивостью нового олигонуклеотидного аналога и улучшенным проникновением его в мышечные клетки. Таким образом, фосфорилгуанидиновые
11
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) производные олигонуклеотидов являются перспективными кандидатами на роль терапевтических средств для лечения мышечной дистрофии Дюшена методом пропуска экзона. Авторы предположили, что было бы целесообразно исследовать коррекцию сплайсинга при помощи электронейтральных олигонуклеотидов, полностью замещенных фосфорилгуанидиновыми группами по всем межнуклеотидным положениям.
[0025] Для проверки этого предположения с использованием ранее раскрытого способа [Стеценко Д.А., Купрюшкин М.С., Пышный Д.В., заявка на патент РФ j\°2014134380, 22 августа 2014; Stetsenko D.A., Kupryushkin M.S., Pyshnyi D.V. Modified oligonucleotides and methods for their synthesis. PCT application WO2016/028187 Al, приоритет от 22.08.2014] авторами были получены два незаряженных 20-звенных ФГО М634 и М551 с остовом на основе 2-дезоксирибозы (2'-дезокси-ФГО) и 2-О-метилрибозы (2'-0-метил-ФГО), соответственно, содержащие 1,3-диметил-2- имидазолидиниминогруппы (Dmi) (рис. 2, в) по всем межнуклеотидным положениям (табл. 2). В качестве положительного контроля был использован 25-звенный морфолиновый олигонуклеотид (РМО) 5 ' -GGCCAAACCTCGGCTTACCTGAAAT [Lehto Т., Castillo Alvaraz A., Gait M.J., Coursindel Т., Wood M.J.A., Lebleu В., Boisguerin P. // Nucleic Acids Res. 2014. V. 42. N° 5. P. 3207-3217]. Также было исследовано влияние добавления 5 экв. липопептида Pal-RXR4 или St-STl (табл. 3), способных доставлять незаряженные олигонуклеотиды в клетки в составе пептидных наночастиц [Jarver P., Zaghloul Е.М., Arzumanov А.А., Saleh A.F., McClorey G., Hammond S.M., Hallbnnk M., Langel ΐΐ, Smith CLE., Wood M.J., et al. // Nucleic Acid Ther. 2015. V. 25. J s 2. P. 65-77]. Клетки H2k mdx инкубировали при концентрации олигонуклеотида 1 мкМ или 5 мкМ в отсутствие или в присутствии липопептида в течение 4 ч. После выделения из клеток суммарной РНК результаты коррекции сплайсинга анализировали с помощью электрофореза продуктов ОТ- ПЦР в агарозном геле (рис. 6).
Табл. 2. Последовательности и молекулярные массы олигонуклеотидов, использованных для изучения коррекции сплайсинга в культуре мышечных волокон мыши Н2к mdx.
Код Последовательность, 5'-3 '' Молекулярная масса,
Расч. [М] Эксп. [М]
М159 GGCCAAACCUCGGCUUACCU 6598.39 6595.06
М560 GseGsCsCsAsAsAsCsCsUsCsGsGsCsUsUsAsCsCsU 6887.57 6884.27
12
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) M162 GsGsCsCsAsAsAsCsCsUsCsGsGsCsU#2U#AC#C#U 7195.99 7193.64
M634 g 7845.82 7843.30
M551 G*G*C*C*A*A*A*C*C*U*C*G*G*CnjnJ*A*C*C*U 8390.24 8387.98 a 2'-0-Метилрибонуклеотиды обозначены прописными буквами, 2'-дезоксирибонуклеотиды - строчными буквами; 6 по данным ESI LC -MS/MS; е (s) - положение тиофосфатной группы (PS); г (#) - положение Tmg- группы; д (*) - положение Dmi-группы.
Табл. 3. Последовательности липопептидов, использованных в качестве добавок при трансфекции олигонуклеотидов в клетки H2k mdx.
Код Последовательность
Pal-RXR4 Пальмитоил-Arg- -Ahxa-Arg-Arg-Ahx-Arg-Arg-Ahx-Arg-Arg-Ahx-Arg-aMiifl St-STl Стеароил-Ser-Ar '-Thr-Om-Ser-Ser-Tyr-Om-Thr-Arg-Ser-Thr-Arg-Ser-Om-Gly-амид а Ahx - ε-аминогексановая кислота.
[0026] Денситометрическая обработка полученных данных ОТ-ПЦР (рис. 7) показала, что 20-звенный 2' -О-метил-ФГО М551 проявляет антисмысловую активность по коррекции сплайсинга in vitro в культуре клеток H2k mdx, которая соответствует или несколько превышает активность 25-звенного морфолинового олигонуклеотида (РМО). Активность 20-звенного 2'-дезокси-ФГО М634 была существенно ниже. Добавка 5 мкМ липопептида Pal-RXR4 или St-STl к РМО или 2' -О-метил-ФГО М551 (оба 1 мкМ) оказывала заметный положительный эффект на коррекцию сплайсинга.
[0027] Таким образом, было показано, что фосфорилгуанидиновые олигонуклеотиды (ФГО) с остовом на основе 2-О-метилрибозы способны корректировать сплайсинг мутантной пре-мРНК дистрофина in vitro в культуре мышечных волокон мыши H2k mdx, которая является лабораторной моделью мышечной дистрофии Дюшена. При этом степень пропуска экзона, вызываемая 2' -О-метил-ФГО длиной 20 нт, хорошо соответствовала или несколько превосходила активность, показанную морфолиновым олигонуклеотидом (РМО) длиной 25 нт. Следует отметить, что РМО являются одним из видов антисмысловых олигонуклеотидов, которые в настоящее время проходят клинические испытания как потенциальные лекарственные препараты для терапии мышечной дистрофии Дюшена (МДД) [Mendell J.R., Rodino-Clapac L.R., Sahenk Z., Roush К., Bird L., Lowes L.P., Alfano L., Gomez A.M., Lewis S., Kota J., et al. // Ann. Neurol. 2013. V.
13
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) 66. N° 5. P. 637-647]. В то же время аналогичный ФГО с остовом на основе 2-дезоксирибозы проявил значительно меньшую активность по коррекции сплайсинга in vitro. Добавление липопептида, способного доставлять в клетки незаряженные аналоги олигонуклеотидов [Jarver P., Zaghloul Е.М., Arzumanov А.А., Saleh A.F., McClorey G., Hammond S.M., Hallbrink M, Langel Tj., Smith CLE., Wood M.J., et al. // Nucleic Acid Ther. 2015. V. 25. J s 2. P. 65-77], увеличивало степень пропуска экзона как в случае РМО, так и в случае 2' -0-метил-ФГО. Из полученных результатов можно сделать вывод, что фосфорилгуанидиновые олигонуклеотиды (ФГО) с остовом на основе 2'-0-метил-РНК являются перспективными терапевтическими кандидатами для лечения МДД, в том числе при доставке их с помощью пептидов.
[0028] Анализ выживаемости клеток гепатокарциномы Huh-7 методом MTS показал, что фосфорилгуанидиновые олигонуклеотиды М551 и М634, также как и олиго-2'-0- метилрибонуклеозидтиофосфаты (PS) и морфолины (РМО), не проявляли токсичности при инкубации в течение 4 ч при концентрации от 5 до 60 DM (рис. 8).
Табл. 4. Последовательности и молекулярные массы фосфорилгуанидиновых олигонуклеотидов (ФГО) с 5'-концевой 1 -(4-азидобутил)фосфорамидной группой, использованных для конъюгации с пептидом Pip6a.
Молекулярная масса6
Код Последовательность, 5'-3 'а
Расч. [М] Эксп. [М]
04 8509.45 8506.08
05 Flu pNG*G*C*C*A*A*A*C*C*U*C*G*G*C*U*U*A*C*C*U 9053.87 9051.57
Об pNG*G*C*C*A*A*A*C*C*U*C*G*G*C*U*U*A*C*C*U 8566.21 8563.68
07 pNC*A*U*U*G*C*C*A*A*C*C*A*G*U*C*C*C*G*G*U 8566.21 8563.65 а Остатки 2'-дезоксирибонуклеотидов обозначены строчными буквами, 2'-0-метилрибонуклеотидов - прописными буквами; 6 По данным ESI LC-MS/MS в режиме регистрации положительных ионов; β Flu - остаток флуоресцеина; г PN - -(4-азидобутил)-фосфорамидная группа >P(=0)-NH(CH2)4N3; д Звездочкой (*) обозначено положение Dmi-группы; Dmi - 1,3-диметил-2-имидазолидиниминогруппа.
[0029] Для получения конъюгатов фосфорилгуанидиновых олигонуклеотидов с векторными пептидами (ПФГО) может быть использован способ «клик»-химии [Kolb Н.С., Finn M.G., Sharpless К.В., Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 2001, 40, 2004-2021], основанный на
14
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) использовании катализируемого солями меди(1) 1,3-диполярного циклоприсоединения алкилазидов к алкинам (CuAAC) [Тогт е С. W., Christensen С, Meldal М., J. Org. Chem., 2002, 67, 3057-3064; Rostovtsev V.V., Green L.G., Fokin V.V., Sharpless K.B., Angew. Chem. Int. Ed., 2002, 41, 2596-2599]. Для конъюгации было использовано производное векторного пептида Pip6a [Lehto Т., Castillo Alvaraz A., Gait M.J., Coursindel Т., Wood M.J.A., Lebleu В., Boisguerin P., Nucleic Acids Res., 2014, 42, 3207-3217], содержащее алкинильную группу. Необходимые для конъюгации производные фосфорилгуанидиновых олигонуклеотидов (ФГО), содержащие азидобутильную группу, были получены согласно разработанным методикам [Стеценко Д. А., Купрюшкин М.С., Пышный Д. В., заявка на патент РФ N° 2014117293, приоритет от 29.04.2014; Купрюшкин М.С., Апухтина B.C., Васильева СВ., Пышный Д.В., Стеценко Д.А., Изв. Акад. Наук, Сер. Хим., 2015, 7, 1678-1681]. Последовательности полученных азидобутильных производных ФГО 04-07 приведены в табл. 4. Схема синтеза азидобутильных производных ФГО показана на рис. 9.
Табл. 5. Последовательности и молекулярные массы полученных З'-аминоалкильных
производных фосфорилгуанидиновых олигонуклеотидов (ФГО).
Молекулярная масса6
Код Последовательность, 5 '-3 'А
Расч. [М] Эксп. [М]
08 g*ec*g*c*c*a*a*a*c*a*NH2z 4136.69 4135.14
09 C*A*G*A*G*U*U*C*U*C*A*G*G*A*U*G*U*A*NH2 7896.67 7897.88
О10 G*A*G*A*C*U*U*A*C*C*A*C*U*U*C*C*U*U*NH2 7753.63 7755.39
ОН G*U*C*C*A*G*C*C*C*C*A*U*G*G*A*NH2 6563.27 6563.60
012 C*A*G*U*C*A*C*U*G*A*A*A*A*U*C*C*U*U*U*C*U*A*NH2 9483.21 9484.66
013 G*G*U*U*U*U*G*G*U*G*G*U*G*C*A*C*A*U*C*G*A*NH2 9213.06 9214.48
014 C*C*A*U*G*G*C*A*U*U*C*A*G*G*G*U*A*C*U*U*U*G*G*NH2 10025.35 10026.65
015 A*C*A*C*C*A*C*A*A*U*C*G*C*U*C*C*C*U*C*NH2 8148.82 8150.38
016 Ρ1υό*Α*Ο*υ*€*υ*€*Ο*Α*0*υ*υ*Ο*€*υ*Α*€*€*^2*ε 7955,78 7962,82Ж
Figure imgf000017_0001
018 A*G*U* C*U*C* G*A*C* U*U*G* C*U*A* С*С*ли2* 7183,47 7184,62 а Остатки 2'-дезоксирибонуклеотидов обозначены строчными буквами, остатки 2'-0-метилрибонуклеотидов обозначены прописными буквами, остатки 2'-фтор-2'-дезоксирибонуклеотидов подчёркнуты; 6 По данным ESI
15
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) LC-MS/MS в режиме регистрации положительных ионов; β Звёздочкой (*) обозначено положение Dmi- группы; NH2 - 6-аминогексильная группа (рис. 10, 7а); Flu - остаток флуоресцеина; 2-гидроксиметил- 6-аминогексильная группа (рис. 10, 7Ь); По данным MALDI-TOF MS.
[0030] Одним из наиболее простых способов конъюгации пептидов и олигонуклеотидов является образование амидной связи в растворе или на твёрдой фазе между С-концевой карбоксильной группой пептида и аминогруппой аминоалкильного производного олигонуклеотида [Venkatesan N., Kim В.Н., Chem. Rev., 2006, 106, 3712-3761; Lu К., Duan Q.-P., Ma L., Zhao D.-X., Bioconjugate Chem., 2010, 21, 187-202]. В этой связи представляют интерес производные фосфорилгуанидиновых олигонуклеотидов (ФГО), содержащие первичную аминогруппу, которая может образовывать амидную связь с карбоксильной группой пептида. Наиболее простым является синтез 3' -концевых аминоалкильных производных олигонуклеотидов, для которого можно использовать подходящий полимерный носитель, содержащий защищенную аминогруппу. В настоящее время коммерчески доступны два основных полимерных носителя для получения 3'- аминоалкильных производных олигонуклеотидов: З'-PT-Amino-Modifier С6 CPG (Glen Research 20-2956) на основе тримеллитовой кислоты (рис. 10, 5а) и З'-Amino-Modifier С7 CPG 500 (Glen Research 20-2957) с Fmoc-защищенной аминогруппой в боковой цепи (рис. 10, 5Ь).
[0031] С использованием полимерного носителя (5а) был разработан эффективный метод автоматизированного твердофазного синтеза ФГО с З'-аминогексильной группой (рис. 10, 7а). Была оптимизирована методика одновременного удаления защитных групп и отщепления 3'-ΝΗ2-ΦΓΟ от полимера с раскрытием фталимидной группы (6а) при помощи реагента АМА (смеси 40% водного метиламина с 25% водным аммиаком 1 : 1) в течение 15 мин при 65оС. Реагент АМА показал наилучший результат при деблокировании олигонуклеотидов, содержащих все четыре основания (см. табл. 5), в то время как использование 25% раствора аммиака при 55оС требовало длительного времени и иногда приводило к побочным реакциям.
[0032] Полученные 3'-ΝΗ2-ΦΓΟ содержали Dmi-группы по всем межнуклеотидным положениям и 6-аминогексильную группу, присоединенную к 3' -концу также при помощи фосфорилгуанидиновой Dmi-группы (см. рис. 10, табл. 5). Предполагается, что 6- аминогексильная группа (рКа около 10) при физиологических значениях рН около 7 будет протонирована. Вероятно, из-за присутствия положительного заряда полученные 3'-ΝΗ2- ФГО показали лучшую растворимость в воде, чем полностью нейтральные ФГО, не
16
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) содержащие аминогруппы. 3'-ΝΗ2-ΦΓΟ были использованы для конъюгации с пептидом
Pip6a путем фрагментной конденсации в растворе с образованием стабильной амидной связи между С-концевой карбоксильной группой пептида и З'-аминогексильной группой ФГО. Первичная структура пептида Pip6a приведена в табл. 6.
Табл. 6. Первичная структура пептида Pip6a.
Pip6a Ac-RXRRBRRXRYQFLIRXRBRXRB -ОН В = β-аланин, X = ε-аминокапроновая кислота
[0033] Так как С-концевой аминокислотой в Pip6a является β-аланин, то рацемизация при активации карбоксильной группы невозможна, боковые цепи Arg, Туг и Gin не требуют защиты, а Ν-конец блокирован ацетильной группой. Поэтому пептид Pip6a особенно подходит для фрагментной конденсации в растворе путем образования амидной связи. Также амидная конденсация в растворе более эффективно протекает с незаряженными аналогами нуклеиновых кислот, такими как морфолиновые олигонуклеотиды (РМО) и пептидно- нуклеиновые кислоты (ПНК, англ. PNA) [Deuss P.J., Arzumanov А.А., Williams D.L., Gait M.J., Org. Biomol. Chem., 2013, 11, 7621-7630]. К незаряженным аналогам принадлежат и раскрытые в настоящей заявке фосфорилгуанидиновые олигонуклеотиды (ФГО) на основе 2'-ОМе РНК (табл. 5). В настоящей заявке раскрыт способ получения конъюгатов фосфорилгуанидиновых олигонуклеотидов (ФГО), например, с остовом на основе 2'-0-метилрибозы и 2'-фтор-2'- дезоксирибозы, с пептидом путем фрагментной конденсации в растворе с образованием стабильной амидной связи между З'-аминогексильной группой ФГО и С-концевой карбоксильной группой пептида. Схема конъюгации пептида с ФГО приведена на рис. 11. Получены и охарактеризованы модельные пептидные конъюгаты ФГО (ПФГО). Типичные профили элюции конъюгатов приведены на рис. 12 и 13. Структура конъюгатов была подтверждена с помощью масс-спектрометрии MALDI-TOF (рис. 14).
Табл. 7. Последовательности и молекулярные массы полученных производных фосфорилгуанидиновых олигонуклеотидов (ФГО) с остовом на основе 2-О-метилрибозы и 2-фтор- 2-дезоксирибозы .
Figure imgf000019_0001
17
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) M177 (20 нт AS) G*G*C*C*A*A*A*C*C*U*C*G*G*C*U*U*A*C*C*UNH2j 8664.39 8665.08Й
M178 (20 нт Scr) C*A*U*U*G*C*C*A*A*C*C*A*G*U*C*C*C*G*G*UNH2 8664.39 8665.24Й
T134 (20 нт AS) 0*0*С*С*А*А*А*С*С*и*С*0*0*С*и*и*А*С*С*Щя2»е 8695.22 8694.00
T136 (20 нт Scr) C*A*U*U*G*C*C*A*A*C*C*A*G*U*C*C*C*G*G*UAT«2» 8695.22 8688.00
T013, T016,
T021, T027,
G*G*C*C*A*A*A*C*C*U*C*G*G*C*U*U*A*C*C*U*G*A*A*A*U*NH2 10848.97 10846.36 T099, T102
(25 нт AS)
T014, T018,
T028, ТЮО,
C*A*U*U*G*C*C*A*A*C*C*A*G*U*C*C*C*G*G*U*A*U*C*G*A*NH2 10826.23 10823.26 ТЮЗ
(25 нт Scr+)
T133 (25 нт AS) G*G*C*C*A*A*A*C*C*U*C*G*G*C*U*U*A*C*C*U*G*A*A*A*U*,vtf2» 10880.30 10881.00
T135 (25 нт 10856.00
С*А*и*и*0*С*С*А*А*С*С*А*0*и*С*С*С*0*0*и*А*и*С*0*А*#я2» 10856.25
Scr+)
F032 G*C*A*A*A*A*G*C*A*G*G*G*U*A*G*A*U*A*A*U*C*ffl2. 8816.84 8826.87
F033 C*C*A*U*G*G*C*A*U*U*C*A*G*G*G*U*A*C*U*U*U*G*G*,vtf2» 9769.66 9780.81 a Остатки 2'-0-метилрибонуклеотидов обозначены прописными буквами, остатки 2'-фтор-2'- дезоксирибонуклеотидов подчеркнуты; 6 По данным ESI LC -MS/MS в режиме регистрации положительных ионов; β Звездочкой (*) обозначено положение Dmi-группы; г ΝΗ2 - 6-аминогексильная группа (рис. 10, 7а); д По данным MALDI-TOF MS, [М+Н]+; е Ш2* - 2-гидроксиметил-6-аминогексильная группа (рис. 10, 7Ь).
[0034] Конъюгаты пептида Pip6a (табл. 6) с антисмысловым 20-звенным ФГО М177
(20 нт AS) и 20-звенным ФГО Ml 78 случайной последовательности, но совпадающего с М177 состава (20 нт Scr) (табл. 7), полученные по раскрытой методике (Пример 4), были использованы для определения уровня пропуска экзона в мышиной клеточной модели МДД. Была определена зависимость степени коррекции сплайсинга от концентрации конъюгата в условиях, аналогичных опыту с неконъюгированными олигонуклеотидами (Пример 2). Анализ продуктов количественного ОТ-ПЦР суммарной РНК, выделенной из мышечных клеток после инкубации с антисмысловыми олигонуклеотидами, показал, что активность конъюгата Pip6a-M177 по коррекции сплайсинга проявлялась, начиная с концентрации 0.125 мкмМ, а в концентрации 1 мкМ конъюгат демонстрировал уровень пропуска экзона более 70%, что практически не отличается от эффекта, вызываемого лучшим из имеющихся на сегодняшний день клинических кандидатов Pip6a-PMO (рис. 15).
18
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) В то же время в меньших концентрациях эффективность Pip6a-M177 снижалась. Конъюгат
ФГО Ml 78 со случайной последовательностью показал весьма незначительную активность (порядка 10% от целевого М177), что свидетельствует о том, что конъюгат М177 действительно проявляет специфическую зависимую от последовательности антисмысловую активность. Однако, уровень активности конъюгата Pip6a-M178 оказался большим, чем ожидалось для случайной последовательности (Scr). Было выдвинуто предположение, что имела место загрязнение образца конъюгата М178 небольшим количеством антисмыслового конъюгата М177, который совпадает с конъюгатом М178 по молекулярной массе. Такая контаминация могла иметь место при обессоливании ФГО Ml 77 и Ml 78 друг за другом на одном и том же картридже PolyPak II (Glen Research, США) ввиду более выраженной фиксации ФГО на полимерной матрице картриджа в силу отсутствия заряда и, как следствие, более гидрофобного характера ФГО по сравнению с обычными олигонуклеотидами. Для того, чтобы избежать в будущем трудностей с выявлением контаминации с помощью масс-спектрометрии было принято решение в случае ФГО длиной 25 нт заменить один из нуклеотидов случайной последовательности ФГО с С на А для получения детектируемой разницы в молекулярной массе (табл. 7, 25 нт Scr+).
[0035] Коррекция сплайсинга с помощью конъюгатов пептида Pip6a с антисмысловым 20-звенным ФГО М177 (20 нт AS) и 20-звенным ФГО М178 случайной последовательности, но совпадающего с М177 состава (20 нт Scr) по сравнению с контрольным конъюгатом 25-звенного РМО и свободными (неконъюгированными) ФГО была исследована in vivo при однократной внутримышечной инъекции 1 нмоль каждого соединения в переднюю болыиеберцовую мышцу tibialis anterior (ТА) мышей линии mdx. В экспериментах были использованы мыши линии mdx возрастом 4.5-5.5 месяцев. Опыты проводились согласно процедурам, одобренным Министерством внутренних дел Великобритании. Конъюгаты в количестве 1 нмоль в физиологическом растворе были введены в мышцу ТА мышей в условиях обезболивания. Две недели спустя мыши были усыплены вдыханием С02, и полученные образцы мышечной ткани исследованы на эффективность пропуска экзона по уровню РНК при помощи количественной ОТ-ПЦР. Результаты определения восстановления биосинтеза дистрофина в ТА по уровню РНК приведены на рис. 16.
[0036] Визуализация дистрофина в образцах мышечной ткани проводились при помощи иммуногистохимического анализа, как описано в работе [Betts С, Saleh A.F., Arzumanov A. A., Hammond S.M., Godfrey С, Coursindel Т., Gait M.J., Wood M.J. A., Mol. Therapy Nucleic Acids, 2012, 1, е38]. Результаты определения восстановления биосинтеза
19
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) дистрофина в ТА по уровню белка приведены на рис. 17. Анализ биомаркеров токсичности путем определения показателей клинической биохимии в образцах плазмы крови, отобранных из яремной вены мышей линии mdx сразу после усыпления вдыханием углекислого газа не выявил признаков острой токсичности конъюгатов ФГО с пептидом Pip6a.
ТЕХНИЧЕСКИЙ РЕЗУЛЬТАТ
[0037] Раскрытые авторами в данной заявке результаты позволяют сделать следующие выводы о достижении технического результата изобретения:
[0038] 1. Предложенные в качестве потенциальных антисмысловых агентов для коррекции сплайсинга при мышечной дистрофии Дюшена (МДД) фосфорилгуанидиновые олигонуклеотиды (ФГО) на основе 2'-0-метил-РНК показывают биологическую активность по пропуску экзона в мышиной клеточной модели МДД, сравнимую с активностью свободных РМО, использованных в качестве контроля. Было показано, что прибавление липопептида потенцирует активность свободных (неконъюгированных) ФГО.
[0039] 2. Полученные производные фосфорилгуанидиновых олигонуклеотидов
(ФГО), например, пептидные конъюгаты ФГО (ПФГО), например, ПФГО на основе пептида Pip6a показывают биологическую активность по коррекции сплайсинга в мышиной клеточной модели МДД, сравнимую с активностью пептидных конъюгатов морфолиновых олигонуклеотидов (РМО), которые являются наиболее активными из имеющихся в настоящее время потенциальных терапевтических средств для лечения МДД. Активность ПФГО зависит от последовательности, что подтверждает антисмысловой механизм их действия.
[0040] 3. ПФГО вызывают коррекцию сплайсинга in vivo, отмеченную как по уровню РНК (ОТ-ПЦР), так и белка (иммуногистохимический анализ), при внутримышечной инъекции мышам линии mdx, экспрессирующим ген дистрофина с мутацией в экзоне 23, не вызывая при этом заметных токсических эффектов согласно показателям клинической биохимии. При этом биологическая активность ПФГО превосходит биологическую активность свободных (неконъюгированных) ФГО и зависит от последовательности, что соответствует антисмысловому механизму их действия. Активность ПФГО как in vitro, так и in vivo сопоставима с активностью лучшего из существующих прототипов потенциальных терапевтических гентов для лечения МДД - пептидных конъюгатов морфолиновых олигонуклеотидов (Р-РМО).
[0041] Таким образом, раскрытые в данной заявке фосфорилгуанидиновые олигонуклеотиды (ФГО), например, с остовом на основе 2-О-метилрибозы, а также
20
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) производные ФГО, например, пептидные конъюгаты ФГО (ПФГО) являются новыми перспективными потенциальными терапевтическими агентами для коррекции сплайсинга при лечении мышечной дистрофии Дюшена (МДД).
[0042] Результаты, показанные фосфорилгуанидиновыми олигонуклеотидами в отношении мышечной дистрофии Дюшена (МДД) как самими по себе (т.е., в условиях гимноза), так и при доставке олигонуклеотидов в мышечную ткань с помощью пептидов могут быть в дальнейшем использованы при разработке олигонуклеотидной терапии других заболеваний, связанных с экспрессией определенных генов. Это может послужить решению важной проблемы современной молекулярной медицины, связанной с недостаточной эффективностью существующих методов олигонуклеотидной терапии.
ОПРЕДЕЛЕНИЯ
[0043] Термин «нуклеотид» используется для обозначения химического соединения, содержащего нуклеозид или модифицированный нуклеозид, и хотя бы одну фосфатную группу, присоединенную к нему ковалентной связью. Примером ковалентной связи независимо и без ограничений является эфирная связь между 3', 2' или 5'-гидроксильной группой нуклеозида и фосфатной группой.
[0044] Термин «олигонуклеотид» используется для обозначения химического соединения, состоящего из двух или более нуклеотидов, соединенных между собой в полимерную цепь. Олигонуклеотид может представлять собой фрагмент ДНК или РНК. Олигонуклеотиды могут быть одноцепочечными или двуцепочечными, т.е. содержать две цепи с высокой степенью комплементарности. При этом любая из цепей или обе могут быть модифицированы согласно настоящему изобретению.
[0045] Олигонуклеотид как полимер из двух или более нуклеотидов может иметь любую длину. Например, олигонуклеотид может иметь минимальную длину в 2, 3, 4, 5, 6,
7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33,
34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40 нуклеотидов. Опционально, олигонуклеотид может иметь максимальную длину в 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28,
29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54,
55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80,
81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, ПО, 120, 130, 140,
150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330,
340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, или 500 нуклеотидов, хотя и более длинные олигонуклеотиды могут быть использованы в
21
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) отдельных вариантах применения днного изобретения. Для примера, может быть получен олигонуклеотид, состоящий из 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100 нуклеотидов.
[0046] В олигонуклеотидах, являющихся предметом настоящего изобретения, один или несколько, например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более нуклеотидов, или же все нуклеотиды могут содержать модифицированную в соответствии с настоящим изобретением фосфатную группу.
[0047] Термины «модифицированный нуклеотид» и «модифицированный олигонуклеотид» используются для обозначения нуклеотида или олигонуклеотида, соответственно, которые содержат химическую модификацию, например, заместители в остатке сахара, в фосфатной группе и/или в гетероциклическом основании. Примером химической модификации может служить введение модифицированного нуклеотида, опциональной химической группировки на 3'- и/или 5'-конец олигонуклеотида (например, остатка 3' -«инвертированного» нуклеозида), конъюгация с остатком высокомолекулярного соединения низкой иммуногенности (например, полиэтиленгликоля (ПЭГ)), конъюгация с низкомолекулярными соединениями (например, холестерином), конъюгация с пептидами (например, пептидами, облегчающими проникновение в клетки), замещение в фосфатной группе (например, тиофосфатную группу). Химическая модификация гетероциклических оснований может включать в себя, в том числе, замещение по С-5 пиримидинового нуклеотида, замещение по С -7 7-деазапуринового нуклеотида, замещение по экзоциклической аминогруппе, введение остатков 4-тиоурацила, 5-бром- и/или 5- иодурацила и пр. Модификация остатка сахара может включать в себя введение 2- аминонуклеотида, 2-фторнуклеотида, 2-О-метилрибонуклеотида, 2-0- аллилрибонуклеотида, 2-0-Р-метоксиэтилрибонуклеотида, «замкнутого» нуклеотида (locked nucleic acid. LNA) и/или трицикло-ДНК нуклеотида. Связи между центральным атомом фосфора в фосфатной группе могут осуществляться, в том числе, через атом кислорода (обычный фосфат), атом азота (Ν3'-Ρ5' фосфорамид) или атом серы (3'- тиофосфат); соответственно, 3'- и/или 5'-конец нуклеозида может оканчиваться, в том числе, гидроксильной группой, как в природном нуклеозиде, З'-аминогруппой (Ν3'-Ρ5' фосфорамид) или З'-меркаптогруппой (З'-тиофосфат). Аналоги нуклеозидов также могут входить в состав модифицированных нуклеотидов или модифицированных ол игону кл еотид ов .
22
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) [0048] Нуклеотиды или олигонуклеотиды, являющиеся предметом настоящего изобретения, могут быть выделены или получены в очищенном виде.
[0049] Термин «нуклеозид» используется для обозначения химического соединения, содержащего остаток сахара и остаток гетероциклического основания. Примеры нуклеозидов могут включать, в том числе, рибозу, 2-дезоксирибозу, 2-О-метилрибозу, арабинозу и т.п. Примеры гетероциклических оснований могут включать в себя, в том числе, тимин, урацил, цитозин, аденин, гуанин, пурин, гипоксантин, ксантин, 2- аминопурин, 2,6-диаминопурин, 5-метилцитозин. 5-фторурацил, 5-хлорурацил. 5- бромурацил. 5-иодурацил. 5-трифторметилурацил. 5-фторцитозин. 5 -хлор цитозин. 5- бромцитозин. 5-иодцитозин. 2-тиоурацил, 4-тиоурацил, 2-тиотимин, 4-тиотимин, 5- пропинилурацил. 5-пропинилцитозин, 7-деазааденин, 7-деазагуанин, 7-деаза-8-азааденин, 7-деаза-8-азагуанин, изоцитозин, изогуанин и т.п.
[0050] Термин «аналог нуклеозида» используется для обозначения модифицированного нуклеозида, в котором остаток сахара заменен иной циклической или ациклической структурой. Примеры аналогов нуклеозидов, в которых остаток сахара заменен иной циклической структурой, могут включать в себя, в том числе, мономеры морфолиновых олигонуклеотидов (РМО) и трицикло-ДНК. Примеры аналогов нуклеозидов, в которых остаток сахара заменен иной ациклической структурой, могут включать в себя, в том числе, мономеры пептидно-нуклеиновых кислот (ПНК, англ. peptide nucleic acids, PNA) и глицериновых нуклеиновых кислот (GNA).
[0051] Также, термин «аналог нуклеозида» используется для обозначения нуклеозида, содержащего химическую модификацию, например, заместитель в остатке сахара и/или в гетероциклическом основании. Примеры таких аналогов нуклеозидов могут включать в себя, в том числе, 2-замещенные 2-дезоксинуклеозиды, такие как 2-амино и 2- фтор, и рибонуклеозиды, такие как 2-О-метил, 2-О-аллил, 2-Ο-β- метоксиэтилрибонуклеозиды, «замкнутые» нуклеозиды (LNA) и т.п.
[0052] Термин «аналоги олигонуклеотидов» используется для обозначения модифицированных олигонуклеотидов, содержащих, в том числе, химическую модификацию фосфатной группы и/или же таких, в которых нуклеозиды заменены аналогами нуклеозидов. Примеры аналогов олигонуклеотидов могут включать, в том числе, тиофосфаты (PS), селенофосфаты, дитиофосфаты, фосфорамиды, боранофосфаты, фосфордиамидные производные морфолиноолигонуклеотидов (РМО), трицикло-ДНК и пептидно-нуклеиновые кислоты (ПНК, ΡΝΑ).
[0053] Термин «фосфатная группа» используется здесь для обозначения остатка фосфорной кислоты НЗР04, в котором один или более атомов водорода замещен
23
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) органическим радикалом с получением, соответственно, фосфомоноэфирной, фосфодиэфирной или фосфотриэфирной группы.
[0054] Термин «модифицированная фосфатная группа» используется здесь для обозначения фосфатной группы, в которой любой из атомов кислорода замещен любой химической группой. Примерами заместителей могут быть, в том числе, атомы серы или селена, иминогруппа (NR) или остаток борана (ВНЗ-). Предпочтительными примерами модифицированной фосфатной группы являются тиофосфатная группа и фосфорилгуанидиновая группа.
[0055] В зависимости от заместителей, фосфатная группа и модифицированная фосфатная группа могут быть хиральными. В случае, если стереохимическая конфигурация не обозначена, структура включает в себя как Rp, так и Sp конфигурацию, как раздельно, таки и в виде смеси: например, рацемической смеси (рацемата).
[0056] Указанные соединения также могут включать в себя более одного хирального центра. В таком случае следует считать, что структура охватывает все возможные энантиомеры и диастереомеры.
[0057] Термин «защищенный олигонуклеотид» используется здесь для обозначения олигонуклеотида или модифицированного олигонуклеотида, содержащего одну или более защитных групп.
[0058] Термин «незащищенный олигонуклеотид» используется здесь для обозначения олигонуклеотида или модифицированного олигонуклеотида, из состава которого были удалены одна или более защитных групп.
[0059] Упоминаемые в тексте нуклеозиды, нуклеотиды и олигонуклеотиды подразумевают как их защищенные производные, так и незащищенные производные.
[0060] Термин «защитная группа» обозначает химическую группу, которая используется для временного блокирования реакционного сайта в органическом соединении и может удаляться в определенных условиях. Примеры защитных групп могут включать, в том числе, ацетильную (Ас), бензоильную (Bz), изобутирильную (Ibu), т- бутилфеноксиацетильную (Тас), левулинильную (Lev), метильную (Me), β-цианэтильную (СЕ), аллильную (АН), о-хлорфенильную (o-QPh), 4,4'-диметокситритильную (DMTr), 4- метокситритильную (ММТг), т-бутилдиметилсилильную (TBDMS), триизопропилсилилоксиметильную (ТОМ) и другие группы.
[0061] Термин «линкер» используется здесь для обозначения химической группы для присоединения органического соединения к полимерному носителю, которая способна расщепляться в особых условиях с отщеплением соответствующего органического соединения от соответствующего полимерного носителя. Примеры линкеров могут
24
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) включать, в том числе, сукцинильный, дигликолильный, оксалильный, гидрохинон-0,0'- диацетильный (Q- линкер), фталоильный, 4,5-дихлорфталоильный, малонильный, глутарильный, диизопропилсилильный, 1, 1,3,3-тетраизопропилдисилоксан-1,3-диильный и другие линкеры.
[0062] Термин «линкер» может также относиться к ненуклеотидным химическим группам, введённым в состав модифицированного олигонуклеотида (межнуклеотидные линкеры), или ненуклеотидным химическим группам, соединяющим нуклеотид с иной химической модификацией, например, флуоресцентной меткой или гасителем флуоресценции. Известные примеры линкеров включают, в том числе, остаток фосфата 1,2- додекандиола (DD).
[0063] Термин «полимерный носитель» используется здесь для обозначения полимерного носителя, используемого в твердофазном олигонуклеотидном синтезе. Примеры полимерных носителей могут включать, в том числе, стекло с контролируемым размером пор (CPG), полистирольные смолы, TentaGel®, TSK Gel® Toyopearl®, поливиниловый спирт, ацетат целлюлозы и т.п. Термин «полимерный носитель» используется также в отношении разновидностей подложек для параллельного олигонуклеотидного синтеза, независимо включая, без ограничений, диски из фильтровальной бумаги, мультипиновые системы, многолуночные планшеты и т.п.
[0064] Фосфорилгуанидиновые аналоги олигонуклеотидов, являющиеся предметом настоящего изобретения, могут использоваться для получения терапевтических олигонуклеотидов аналогично таким известным терапевтическим производным олигонуклеотидов, как siPHK [Angell & Baulcombe, EMBO J., 1997, 16, 3675; Voinnet & Baulcombe, Nature, 1997, 389, 553; Fire, A. et al, Nature, 1998, 391; Fire, A., Trends Genet., 1999, 15, 358, Sharp, Genes Dev., 2001, 15, 485; Hammond et al, Nature Rev. Genet., 2001, 2, 1110; Tuschl, ChemBioChem, 2001, 2, 239], рибозимы, ДНКзимы, аптамеры [Gould, L. et al, Science, 1990, 249, 505; патент WO 91/19813], антисмысловые (антисенс) олигонуклеотиды (ПНК, РМО, LNA, «гапмеры»). Олигонуклеотидные терапевтические агенты применяются для лечения ряда заболеваний, в том числе вирусных инфекций, рака, глазных болезней, в том числе возрастных, предотвращения нежелательной неоваскуляризации, заболеваний, вызванных расстройством сплайсинга, такими как мышечная дистрофия Дюшена, а также в качестве антихолестериновых средств. Опционально, терапевтический олигонуклеотид может использоваться в виде конъюгата с ковалентно-присоединенным пептидом, в том числе, для улучшения проникновения в клетки, например, как описано в патенте WO 2009/147368.
25
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) [0065] Соответственно, олигонуклеотид, являющийся предметом настоящего изобретения, предназначается для использования в медицине в качестве лекарственного средства или терапевтического агента. В другом применении олигонуклеотид, являющийся предметом настоящего изобретения, предназначается для получения медикамента или лекарственной формы для использования при лечении заболевания. В другом применении используется метод лечения заболевания, состоящий во введении в организм пациента олигонуклеотида, являющегося предметом настоящего изобретения, с целью лечения заболевания.
[0066] Олигонуклеотид, являющийся предметом настоящего изобретения, может входить в состав медикамента или лекарственной формы. Медикамент или лекарственная форма могут включать олигонуклеотид, являющийся предметом настоящего изобретения, в выделенном или очищенном виде, а также фармацевтически допустимые добавки.
[0067] Медикаменты или лекарственные формы, включающие олигонуклеотиды, являющиеся предметом настоящего изобретения, могут быть введены в организм пациента различными способами, включая, в том числе, парентеральный, внутривенный, внутриартериальный, внутримышечный, пероральный и интраназальный. Медикаменты и лекарственные формы могут пребывать в жидком или твердом виде. Жидкие формы могут быть введены путем инъекции в соответствующую часть тела человека или животного.
[0068] Предпочтительно, введение осуществляется в терапевтически эффективном количестве (дозе), т.е. в количестве, достаточном для произведения терапевтически благотворного эффекта. Введенное количество (доза) и временной регламент введения будут зависеть от природы и тяжести заболевания. Соответствующие терапевтические решения, равно как и дозировки, находятся в компетенции практикующих врачей и, как правило, принимают во внимание вид заболевания, состояние пациента, способ введения и другие факторы, известные специалистам. Примеры соответствующих методов и протоколов можно найти в медицинской литературе, например, в справочнике [Remington' s Pharmaceutical Sciences, 20th Ed, 2000, Lippincott, Williams & Wilkins].
[0069] Способы использования олигонуклеотидов, являющихся предметом настоящего изобретения, могут включать в себя как их применение in vitro, так и in vivo. Термин «in vitro» в данном случае подразумевает эксперименты с материалами, биологическими образцами, клетками и/или тканями в лабораторных условиях или в культурах клеток и/или тканей. В то же время термин «in vivo» в данном случае подразумевает эксперименты и процедуры с использованием живых многоклеточных организмов.
26
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) [0070] Объектами использования олигонуклеотидов, являющихся предметом настоящего изобретения, могут быть растения, животные, предпочтительно, млекопитающие, и, более предпочтительно, люди, в том числе пациенты мужского или женского пола.
[0071] Настоящее изобретение включает сочетание изложенных вариантов и предпочтительных аспектов, за исключением тех случаев, когда сочетание очевидно недопустимо или подчеркнуто непозволительно.
[0072] Заглавия разделов введены исключительно для организационных нужд и не должны быть интерпретированы как рамки, ограничивающие обсуждение материала.
[0073] Повсеместно в данном описании, включая последующую Формулу изобретения, за исключением тех случаев, когда из контекста следует обратное, выражение «включать» и вариации «включает» и «включая» подразумевают прибавление оговоренной целой части или стадии, или группы целых частей или стадий, но не исключение любой другой целой части или стадии, или группы целых частей или стадий.
[0074] Следует учитывать, что в данном Описании и сопутствующей Формуле изобретения употребленные форм единственного числа подразумевают также формы множественного числа, за исключением тех случаев, когда из контекста следует обратное. Интервалы могут быть выражены от «около» одного значения до «около» другого значения. В тех случаях, когда используется такой интервал, иной вариант применения может включать точные значения границ интервала. Аналогично, когда величины выражены приблизительно с использованием обозначения «около», следует понимать, что точные значения границ интервала составляют иной вариант применения.
[0075] Хотя данное изобретение было описано на примере конкретных вариантов применения, специалистам в данной области будут очевидны многочисленные изменения и дополнения, которые могут быть внесены в основные способы использования настоящего изобретения без отклонения от его духа и выхода за его рамки.
[0076] Вдобавок, многие изменения могут быть внесены с целью приспособления конкретной ситуации, материала, состава, процесса, стадии или стадий процесса, к объективному духу и охвату настоящего изобретения. Все подобные изменения рассматриваются как лежащие в пределах охвата приведенной Формулы изобретения.
[0077] Варианты применения настоящего изобретения далее будут проиллюстрированы в виде Примеров со ссылками на сопутствующие Рисунки. Другие варианты и аспекты применений могут быть понятны специалистам в данной области. Все документы, цитируемые в тексте, включены для сравнения.
27
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) ПРИМЕРЫ
[0078] Ниже следуют примеры, которые приводятся для иллюстрации технического применения данного изобретения.
Общие методы
[0079] Последовательности 2'-дезокси- и 2'-0-метил-ФГО были получены с помощью автоматического синтезатора ДНК/РНК ASM-800 компании «Биоссет» (Новосибирск, Россия) в масштабе 0.2 мкмоль по описанным методикам [Стеценко Д.А., Купрюшкин М.С., Пышный Д.В., заявка на патент РФ 2014134380, 22 августа 2014; Stetsenko D.A., Kupryushkin M.S., Pyshnyi D.V. Modified oligonucleotides and methods for their synthesis. PCT application WO2016/028187 Al, приоритет от 22.08.2014]. Олигонуклеотиды анализировали и выделяли обращенно-фазовой (оф) ВЭЖХ на хроматографе Agilent 1200 (США) с колонкой Zorbax SB-C 18 (5 мкм) 4.6x 150 мм в градиенте ацетонитрила в 20 мМ ацетате триэтиламмония, рН 7 от 0 до 40% в течение 30 мин при скорости потока 2 мл/мин. Для контроля чистоты олигонуклеотидов, сохраняющих отрицательный заряд, использовали денатурирующий гель-электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ) с 20% метилен-бис-акриламида, с последующей визуализацией полосок путем окрашивания красителем Stains- АН. Молекулярные массы модифицированных олигонуклеотидов определяли с помощью масс-спектрометрии MALDI-TOF на приборе Bruker Reflex III Autoflex Speed (Германия) в варианте положительных или отрицательных ионов с использованием 3-гидроксипиколиновой кислоты в качестве матрицы либо масс- спектрометрии ESI LC-MS/MS на приборе Agilent G6410A (США) в режиме регистрации отрицательных или положительных ионов. Образцы готовили, растворяя олигонуклеотиды в буфере 20 мМ ацетат триэтиламмония в 60% водном ацетонитриле до концентрации 0.1 мМ. Объем анализируемого образца составлял 10 мкл. Анализ проводили с использованием в качестве элюента 80% водного ацетонитрила при скорости потока 0.1 мл/мин. Использовали стандартные параметры настройки масс-спектрометра. Молекулярные массы олигонуклеотидов рассчитывали, используя наборы экспериментальных значений m/z, определенные для каждого анализируемого образца.
[0080] Пептиды были синтезированы с помощью пептидного синтезатора Liberty компании СЕМ (США) в масштабе 0.1 ммоль согласно Fmoc/t-Bu схеме на полимерной подложке Fmoc-PAL-PEG-PS (Applied Biosystems). Ν-концевой остаток жирной кислоты (пальмитиновой или стеариновой) вводили при помощи 10 экв. РуВОР и 20 экв. DIEA в ДМФА. Пептиды отщепляли от подложки при обработке смесью 95% трифторуксусной
28
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) кислоты (ТФУ), 2.5% триизопропилсилана и 2.5% воды в течение 3 ч. Пептиды очищали с помощью офВЭЖХ на колонке Phenomenex Jupiter 10-μ С18 10x250 мм в градиенте ацетонитрила в 0.1% водной ТФУ от 0 до 40% за 30 мин при скорости потока 10 мл/мин. Молекулярные массы пептидов определяли с помощью масс-спектрометрии MALDI-TOF на приборе Voyager DE Pro Workstation компании Perseptive Biosystems (США) в режиме регистрации положительно заряженных ионов с использованием в качестве матрицы раствора 10 мг/мл а-циано-4-гидроксикоричной кислоты в 50% ацетонитриле, содержащем 3% ТФУ.
[0081] Мышиные миобласты H2k mdx культивировали в культуральных флаконах, покрытых желатином (0.01%), при 33°С в атмосфере 10% С02 в среде DMEM (РАА Laboratories), содержащей 20% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS Gold, РАА Laboratories), 2% куриного эмбрионального экстракта (Seralab), 1% смеси антибиотиков пенициллина, стрептомицина и неомицина (PSN, Gibco) и 3 пг/мкл γ-интерферона (PeproTech). Клетки высевали в покрытые желатином (0.01%) 24-луночные планшеты до плотности 4х 105 клеток/мл и инкубировали двое суток при 33°С в атмосфере 10% С02 как недифференцированные миобласты. Для дифференциации в мышечные волокна клетки далее инкубировали в среде DMEM с 5% лошадиной сыворотки (Sigma) и 1% PSN при 37°С в атмосфере 5% С02 в течение 5 суток. Дифференциацию клеток контролировали путем измерения уровня тропонина Т с помощью Вестерн блоттинга. Клетки инкубировали с олигонуклеотидами РМО, 2'-дезокси-ФГО или 2'-0-метил-ФГО в концентрации 1 мкМ или 5 мкМ, в отсутствие векторного пептида или в присутствии 5 мкМ пептида (5 экв.). Трансфекцию проводили в конечном объеме 500 мкл в течение 4 ч в среде OptiMEM. После инкубации с олигонуклеотидом клетки инкубировали в течение 20 ч в среде DMEM с 10% FBS при 37°С, дважды промывали PBS и лизировали с помощью 1 мл Trizol (TRI Reagent® RNA Isolation Reagent, Sigma). Суммарную РНК выделяли при помощи экстракции Trizol в соответствии с протоколом производителя. Количественное определение РНК проводили с использованием спектрофотометра Nanodrop 2000с (ThermoFisher Scientific).
[0082] Эффективность пропуска экзона определяли при помощи метода полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) с последующей гнездовой ПЦР и анализом реакционных смесей методом гель-электрофореза в агарозе. Для ПЦР использовали набор GenAMP RNA PCR (Invitrogen Life Technology), 400 нг матрицы РНК и пару праймеров Exon20Fo 5 ' -С AGAATTCTGCCAATTGCTGAG-3 ' и Exon20Ro 5'- TTCTTCAGCTTGTGTCATCC-3'. Для ПЦР использовали следующий цикл: первая стадия 30 мин при 42°С, 15 мин при 94°С и 5 мин при 5°С; вторая стадия 2 мин при 95°С, затем 30
29
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) циклов по 30 сек при 95°С, 1 мин при 58°С, 2 мин при 72°С и завершающее удлинение 10 мин при 72°С. Для гнездовой ПЦР использовали ДНК-полимеразу Amplitaq Gold (Invitrogen Life Technology) и пару праймеров Exon20Fi 5'-CCCAGTCTACCACCCTATCAGAGC-3' и Exon20Ri 5 '-CCTGCCTTTAAGGCTTCCTT-3' . Использовали следующий цикл: 10 мин при 95°С, затем 22 цикла по 30 сек при 95°С, 1 мин при 58°С, 2 мин при 72°С и завершающее удлинение 10 мин при 72°С. Продукты разделяли путем электрофореза в 2.5% агарозном геле в 0.5% ТВЕ (100 В, 1 ч) с визуализацией полос окрашиванием красителем SYBR Gold (Molecular Probes). Результаты разделения документировали с помощью системы Fluor-S с охлаждаемой CCD камерой (BioRad) и обрабатывали с помощью программы Quantity One (BioRad). Степень пропуска экзона (%) рассчитывали как отношение площади пика мРНК с делецией 23 экзона (Δ23) к сумме площадей пиков полноразмерной пре-мРНК, мРНК Δ23 и мРНК Δ23+Δ22.
[0083] ПРИМЕР 1. Определение активности олиго-2'-0-метилрибонуклеотидов, содержащих одновременно 1, 1,3,3-тетраметилгуанидиновые группы (Tmg) и тиофосфатные группы (PS), при коррекции сплайсинга пре-мРНК дистрофина в культуре мышечных волокон мыши Н2к mdx.
[0084] Были синтезированы следующие последовательности 20-звенных олигонуклеотидов: контрольные олиго-2'-0-метилрибонуклеотид (2'-ОМе РО) М159 и 2'- ОМе PS-олигонуклеотид М560, и олиго-2'-0-метилрибонуклеотид М162, содержащий наряду с 14 отрицательно заряженными тиофосфатными (PS) группами с 5 '-конца четыре электронейтральные 1, 1,3,3-тетраметилфосфорилгуанидиновые группы (Tmg) с З'-конца, уменьшающие суммарный отрицательный заряд олигонуклеотида (табл. 1). При трансфекции олигонуклеотидов (1 мкМ, 4 ч) с помощью трансфицирующего реагента Lipofectamine 2000 в клетки мышечных волокон мыши H2k mdx, несущих мутацию в экзоне 23 гена дистрофина, 2'-ОМе РО-олигонуклеотид М159 не проявил активности, наибольшую активность (21% пропуска экзона) показал PS-олигонуклеотид М560, а активность олигонуклеотида М162 составила около от активности М560 (рис. 3). Это можно объяснить негативным влиянием снижения суммарного отрицательного заряда олигонуклеотида в случае Ml 62 на образование комплекса с катионным липидом Lipofectamine 2000. В то же время, без трансфицирующего реагента (т.е. в условиях гимноза) в течение 24 ч в присутствии 10% FBS Ml 62 в более высокой концентрации (5 мкМ) показал примерно вдвое большую активность, чем М560 (рис. 4).
30
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) [0085] ПРИМЕР 2. Определение активности олигодезоксирибо- и олиго-2'-0- метилрибонуклеотидов, содержащих 1,3-диметил-2-имидазолидиниминогруппы (Dmi) по всем межнуклеотидным положениям, при коррекции сплайсинга пре-мРНК дистрофина в культуре мышечных волокон мыши Н2к mdx.
[0086] Для биологических исследований были использованы производные олигодезокси- и олиго-2'-0-метилрибонуклеотидов М634 и М551, соответственно. Оба олигонуклеотида содержали Dmi-группы, уменьшающие суммарный отрицательный заряд (рис. 2, в). Была изучена активность новых олигонуклеотидных производных, содержащих фосфорилгуанидиновые Dmi-группы в 2-дезоксирибонуклеотидном остове и 2'-0- метилрибонуклеотидном остове в экспериментах по коррекции сплайсинга мутантной пре- мРНК дистрофина с пропуском экзона 23 в культуре мышиных мышечных волокон Н2к mdx. Последовательности олигонуклеотидов приведены в табл. 2. В качестве положительного контроля был использован морфолиновый олигонуклеотид (РМО) 5'- GGCCAAACCTCGGCTTACCTGAAAT как в отсутствие всякого трансфекционного агента, так и в присутствии 5 мкМ векторных пептидов Pal-RXR4 и St-STl (табл. 3). Анализ продуктов ОТ-ПЦР суммарной РНК, выделенной из мышечных клеток после инкубации с антисмысловыми олигонуклеотидами (рис. 6), показал, что как в отсутствие трансфекционного реагента при концентрациях олигонуклеотида 1 мкМ и 5 мкМ, так и в присутствии 5 мкМ векторного пептида ФГО М551 с остовом на основе 2'-ОМе-РНК проявил антисмысловую активность на таком же или несколько более высоком уровне, чем контрольный РМО (рис. 7). В то же время ФГО М634 с остовом на основе ДНК показал значительно меньшую активность, что может быть связано с его меньшим сродством к РНК, чем у 2'-метил-ФГО. При этом длина обоих ФГО составляла 20 нт, в то время как у РМО - 25 нт.
[0087] ПРИМЕР 3. Конъюгация фосфорилгуанидиновых олигонуклеотидов (ФГО) с пептидом при помощи «клик»-химии.
[0088] 4-Азидобутильную группу вводили на 5'-конец полимерно-связанного ФГО
(1) путём конденсации с коммерческими 6-флуоресцеиновым амидофосфитом (Glen Research 10-1964) или фосфорилирующим реагентом II (Glen Research 10-1901) с получением 2-цианэтилфосфитных производных (2а) или (2Ь), соответственно (рис. 9). Полученные фосфиты после реакции Штаудингера с 1,4-диазидобутаном [Стеценко Д. А., Купрюшкин М.С., Пышный Д.В., заявка на патент РФ N° 2014117293, приоритет от 29.04.2014], 5'-детритилирования, отщепления от полимерного носителя и удаления
31
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) защитных групп превращали в соответствующие 1Ч-(4-азидобутил)фосфорамидные производные ФГО, которые выделяли офВЭЖХ, как описано выше (см. раздел Общие методы). Молекулярные массы ФГО определяли с помощью масс-спектрометрии ESI (табл. 4).
[0089] Конъюгацию азидных производных ФГО 4Ь (Об и 07) с алкинильным производным векторного пептида Pip6a проводили в соответствии с опубликованным протоколом [Ustinov A.V., Dubnyakova V.V., Korshun V.A., Tetrahedron, 2008, 64, 1467- 1473]. К 15 мкл 0.733 мМ раствора азид-модифицированного олигонуклеотида в воде было добавлено 12 мкл 0.916 мМ раствора алкинилированного пептида в диметилсульфоксиде (ДМСО). Реакцию проводили при 5 -кратном избытке пептида путём добавления 10 мкл водного раствора CuS04 (550 мМ, 50 экв.), 4.4 мг ТВТА (50 экв.), 10 мкл водного раствора аскорбиновой кислоты (840 мМ, 50 экв.) и 20 мкл 0.2 М ацетата триэтиламмония (ТЕАА), рН 7. После встряхивания реакционной смеси в течение 12 ч при комнатной температуре конъюгат в виде основного пика выделяли с помощью ионообменной хроматографии.
[0090] ПРИМЕР 4. Конъюгация фосфорилгуанидиновых олигонуклеотидов (ФГО) с пептидом при помощи фрагментной конденсации в растворе.
[0091] Пептид Pip6a (табл. 6) получали твердофазным синтезом по Fmoc-схеме с помощью пептидного синтезатора MultiPep (Intavis AG, ФРГ). ФГО 7a,b (250 нмоль) растворяли в 100 мкл сухого DMSO. 100 мМ раствор пептида, 300 мМ растворы TSTU и DIPEA в NMP смешивали в пропорции 1 :4:3,8: 12 по отношению к олигонуклеотиду для предварительной активации пептида с образованием Ν-гидроксисукцинимидного эфира 9 (рис. 11). Смесь встряхивали на шейкере и оставляли на 30 мин при комнатной температуре, затем прибавляли к раствору ФГО в DMSO. Конъюгацию проводили при 37°С в течение 4- 5 ч, останавливали реакцию прибавлением 3 объемов дистиллированной воды и выделяли пептидный конъюгат 10а или 10b ионнообменной (ио) ВЭЖХ (рис. 12). Выделенную фракцию обессоливали на мембранном фильтре Amicon Ultra- 15 Centrifugal filters Ultra 3k (Merck Millipore, США) согласно протоколу производителя и обессоленный раствор пептидного конъюгата в воде лиофилизовали в течение 16 ч. Выход конъюгации составлял 25-50% по олигонуклеотиду (см. рис. 13). Структура конъюгатов была подтверждена с помощью масс-спектрометрии MALDI-TOF (рис. 14).
32
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Олигонуклеотид, способный вызывать коррекцию сплайсинга, и содержащий хотя бы одну группу, отвечающую формуле (I),
Figure imgf000035_0001
где В - независимо представляет собой природное или модифицированное азотистое основание; где заместители R и R1 независимо представляют собой Н, остаток нуклеотида, модифицированного нуклеотида, аналога нуклеотида, олигонуклеотида, модифицированного олигонуклеотида или аналога олигонуклеотида; или остаток пептида, присоединенный через линкерную группу, как показано в формулах (II) или (III);
Figure imgf000035_0002
(П)
(III) где пептид может быть присоединен к олигонуклеотиду посредством своего С-конца, N- конца или через боковую цепь какой-либо аминокислоты в составе указанного пептида; где каждый из заместителей R2, R3, R4 и R5 независимо выбирается из группы, включающей Н, -С1-20 алкил, -С2-20 алкенил, -С2-20 алкинил, -Сб-ю арил, и -С5-10 гетероарил; где опционально R2 и R5 вместе образуют алкиленовую или гетероалкиленовую цепь длиной 2-4 атома, опционально -СН2СН2- или -СН2СН2СН2-;
33
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) где опционально R2 и R3 или R4 и R5 вместе с атомом, с которым они связаны, образуют 5- 8-членный гетероцикл, опционально 5-6-членный гетероцикл; где R6 независимо выбирается из группы, включающей Н, F, О, ОН, -ОС1-20 алкил, -ОС2-20 алкенил, -ОС2-20 алкинил, -ОС6-ю арил, и -ОС5-10 гетероарил; где R7 представляет собой Н или -С1-6 алкил, -С2-6 алкенил, -С2-6 алкинил; где опционально R6 и R7 вместе с атомом, с которым они связаны, образуют 5-8-членный гетероцикл; где каждый алкил, алкенил, алкинил, арил, гетероарил или гетероцикл могут быть дополнительно замещены.
2. Олигонуклеотид по п. 1, в котором, кроме хотя бы одной группы, отвечающей формуле (I), имеются модифицированные фосфатные группы в произвольном сочетании, соответствующие, но не ограничиваемые, формулами (IV) или (V).
Figure imgf000036_0001
где модифицированная фосфатная группа опционально представляет собой остаток тиофосфата (X = ОН, Y = S), дитиофосфата (X = SH, Y = S), селенофосфата (X = ОН, Y = Se) или боранофосфата (X = ВНз, Y = О), включая ионизованные формы модифицированных фосфатных групп с противоином, который предпочтительно, но не исключительно, представляет собой NH4 +, Na+, К+ или Li+; где значения п и т выбираются из диапазона от 0 до 100, предпочтительно от 0 до 50;
34
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) где олигонуклеотид по п. 2 опционально включает регулярно чередующиеся межнуклеотидные группы по формуле (I) и модифицированные фосфатные группы, предпочтительно, но не исключительно, руководствуясь формулой (VI).
Figure imgf000037_0001
(VI)
3. Олигонуклеотид по п. 1, в котором R2, R3, R4 и R5 независимо выбираются из группы, включающей -С1-6 алкил, -С2-б алкенил, -С2-6 алкинил.
4. Олигонуклеотид по п. 1, в котором R2, R3, R4 и R5 представляют собой метальную группу -СНз.
5. Олигонуклеотид по п. 1, в котором R2 и R5 вместе образуют алкиленовую или гетероалкиленовую цепь длиной 2-4 атома, опционально -СН2СН2- или -СН2СН2СН2-; а R3 и R4 каждый независимо выбираются из группы, включающей Н и -Ci-4 алкил, опционально R3 и R4 это метил ьная группа -СНз.
6. Олигонуклеотид по п. 1, в котором независимо R2 и R3 или R4 и R5 вместе с атомом, с которым они связаны, образуют 5-8-членный гетероцикл, опционально пирролидин, пиперидин, морфолин, тиоморфолин, тиоморфолин-5,5- диоксид или пиперазин.
35
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
7. Олигонуклеотид по п. 1, в котором остаток пептида в соответствии с формулами (II) и
(III) опционально включает остатки модифицированных (небелковых) аминокислот, остатки (5)-аминокислот или ( ?)-аминокислот, или заместители, присоединенные через С- конец, N-конец или боковую цепь какой-либо аминокислоты.
8. Олигонуклеотид по п. 1, в котором линкер L может включать в себя группы, расщепляемые в особых условиях, например, внутри живого организма или клетки, опционально дисульфидную связь -S-S-
9. Олигонуклеотид по п. 1, в котором межнуклеотидная группа, отвечающая формуле (I), равно как и модифицированные фосфатные группы по п. 2 в соответствии с формулами
(IV) и (V), представляет собой индивидуальный стереоизомер или смесь стереоизомеров.
10. Использование олигонуклеотида по п. 1 вне живого организма для коррекции сплайсинга in vitro.
11. Использование олигонуклеотида по п. 1 в медицине в качестве лекарственного средства, основанное на коррекции сплайсинга при мышечной дистрофии Дюшена.
12. Использование олигонуклеотида по п. 1 в составе фармацевтической композиции, содержащей олигонуклеотид по п. 1 и фармацевтически приемлемый компонент или компоненты для лечения мышечной дистрофии Дюшена.
13. Использование олигонуклеотида по п. 1, состоящее во введении пациенту, нуждающемуся в лечении, олигонуклеотида по п. 1 с целью лечения мышечной дистрофии Дюшена.
36
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
PCT/RU2017/050092 2016-09-26 2017-09-25 Аналоги олигонуклеотидов как средства коррекции сплайсинга для лечения мышечной дистрофии дюшена WO2018056871A1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2016138168A RU2016138168A (ru) 2016-09-26 2016-09-26 Аналоги олигонуклеотидов как средства коррекции сплайсинга для лечения мышечной дистрофии дюшена
RU2016138168 2016-09-26

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2018056871A1 true WO2018056871A1 (ru) 2018-03-29

Family

ID=61689704

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2017/050092 WO2018056871A1 (ru) 2016-09-26 2017-09-25 Аналоги олигонуклеотидов как средства коррекции сплайсинга для лечения мышечной дистрофии дюшена

Country Status (2)

Country Link
RU (1) RU2016138168A (ru)
WO (1) WO2018056871A1 (ru)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10450568B2 (en) 2015-10-09 2019-10-22 Wave Life Sciences Ltd. Oligonucleotide compositions and methods thereof
US11208430B2 (en) 2014-08-22 2021-12-28 Noogen Llc Modified oligonucleotides and methods for their synthesis
US11603532B2 (en) 2017-06-02 2023-03-14 Wave Life Sciences Ltd. Oligonucleotide compositions and methods of use thereof

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009147368A1 (en) * 2008-06-04 2009-12-10 Medical Research Council Peptides
WO2016028187A1 (en) * 2014-08-22 2016-02-25 Noogen Llc Modified oligonucleotides and methods for their synthesis

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009147368A1 (en) * 2008-06-04 2009-12-10 Medical Research Council Peptides
WO2016028187A1 (en) * 2014-08-22 2016-02-25 Noogen Llc Modified oligonucleotides and methods for their synthesis

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11208430B2 (en) 2014-08-22 2021-12-28 Noogen Llc Modified oligonucleotides and methods for their synthesis
US10450568B2 (en) 2015-10-09 2019-10-22 Wave Life Sciences Ltd. Oligonucleotide compositions and methods thereof
US11603532B2 (en) 2017-06-02 2023-03-14 Wave Life Sciences Ltd. Oligonucleotide compositions and methods of use thereof

Also Published As

Publication number Publication date
RU2016138168A3 (ru) 2018-03-29
RU2016138168A (ru) 2018-03-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6884250B2 (ja) ペプチドオリゴヌクレオチドコンジュゲート
AU2021203383B2 (en) Antisense nucleic acid
US9988629B2 (en) Antisense nucleic acids
KR102182663B1 (ko) 변형된 서브유니트간 결합 및/또는 말단 그룹을 갖는 올리고뉴클레오타이드 유사체
AU2016324800B2 (en) Antisense nucleic acid
EA034605B1 (ru) Новые лиганды rig-i и способы их получения
KR20180134389A (ko) 안티센스 올리고머, 및 산성 알파-글루코시다제 유전자와 연관된 질환을 치료하기 위한 이의 사용 방법
WO2014159990A1 (en) Interferon production using short rna duplexes
WO2018056871A1 (ru) Аналоги олигонуклеотидов как средства коррекции сплайсинга для лечения мышечной дистрофии дюшена
CN115397436A (zh) 用于抑制PNPLA3表达的RNAi剂、其药物组合物和使用方法
WO2018156056A1 (ru) Модифицированные олигонуклеотиды, активирующие рнказу н
JP6987041B2 (ja) 脊髄性筋萎縮症におけるエクソン包含のための修飾アンチセンスオリゴマー
JP2021500016A (ja) アンチセンスオリゴマー化合物
WO2022081046A1 (ru) Химическое соединение с триазиновой группой и способ его получения
CA3173049A1 (en) Antisense nucleic acid inducing skipping of exon 51
CN114846142A (zh) 用于抑制β-ENaC表达的RNAi试剂、其组合物和使用方法
Uhlmann Oligonucleotide technologies: synthesis, production, regulations and applications
WO2020044349A1 (en) Compounds, cojugates and compositions for use in the methods for trans-membrane delivery of molecules
RU2799452C2 (ru) Химическое соединение с триазиновой группой и способ его получения
TW202405174A (zh) 用於抑制超氧化物歧化酶1(SOD1)表現之RNAi藥劑、其組合物及使用方法
EP4077671A1 (en) Use of saraf inhibitors for treating hepatitis b virus infection
CN117980003A (zh) 核酸的脂肪酸缀合物
EA045808B1 (ru) Антисмысловая нуклеиновая кислота, которая индуцирует пропуск экзона 50
NZ740562B2 (en) Antisense nucleic acid

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 17853534

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 17853534

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1