RU2016138168A

RU2016138168A - Аналоги олигонуклеотидов как средства коррекции сплайсинга для лечения мышечной дистрофии дюшена

Info

Publication number: RU2016138168A
Application number: RU2016138168A
Authority: RU
Inventors: Дмитрий Александрович Стеценко; Мэтью ВУД; Грэм Грэм МакКлори; Алеся Анатольевна Фокина; Борис Павлович Челобанов; Максим Сергеевич Купрюшкин; Дмитрий Владимирович Пышный; Майкл Гейт; Андрей Арзуманов
Original assignee: Оксфордский Университет; Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук; Лаборатория Молекулярной Биологии Совета По Медицинским Исследованиям
Priority date: 2016-09-26
Filing date: 2016-09-26
Publication date: 2018-03-29
Also published as: WO2018056871A1; RU2016138168A3

Claims

1. Производное олигонуклеотида, содержащее одну или более фосфорамидных групп, соответствующих общей формуле (I):

(I)

где заместители R и R¹ независимо являются остатками нуклеозидов или модифицированных нуклеозидов, входящих в состав олигонуклеотида, либо один из них является остатком нуклеозида или олигонуклеотида, а другой является линкером к полимерному носителю, опционально замещенным органическим радикалом, атомом водорода либо представляет собой соль соответствующей амидофосфорной кислоты;

R² может быть атомом водорода Н или опционально замещенным органическим радикалом.

2. Производное олигонуклеотида по п. 1, отличающееся тем, что органический радикал R² выбирается из группы, содержащей в том числе алкилазидную группу, соответствующие защитные группы, ацильную группу –СОR³, алкоксикарбонильную группу –СООR³, опционально 9-флуоренилметоксикарбонильную группу (Fmoc), и карбамоильную группу –СОNR³R⁴, где R³ и R⁴ могут быть независимо атомом водорода или опционально замещенным органическим радикалом, в том числе защитной группой.

3. Способ получения производных олигонуклеотидов по п. 1 , включающий взаимодействие азида R²N₃, с защищенным фосфитом (II),

(II)

где R³ является защитной группой, опционально 2-цианэтильной группой,

при котором способе фосфит (II) иммобилизован на соответствующем полимерном носителе, используемом для твердофазного синтеза олигонуклеотидов, при температуре от 15 до 80^оС в течение от 1 мин до 24 ч до превращения указанного фосфита (II) в соответствующее защищенное производное олигонуклеотида по п. 1, и последующее удаление одной или более защитных групп, включая R³, с получением незащищенного модифицированного олигонуклеотида, содержащего одну или более фосфорамидных групп (I).

4. Способ по п. 3, отличающийся тем, что проводится выделение и очистка полученного модифицированного олигонуклеотида при помощи обычных хроматографических или электрофоретических методов выделения и очистки олигонуклеотидов.

5. Способ по п. 3, отличающийся тем, что используется метод твердофазного синтеза олигонуклеотидов с использованием автоматического синтезатора.

6. Способ по п. 3, отличающийся тем, что реакция указанного фосфита (II) с азидом R²N₃ проводится в соответствующем органическом растворителе или смеси двух или более растворителей.

7. Способ по п. 6, отличающийся тем, что органический растворитель для реакции выбирается из группы, содержащей следующие растворители: ацетонитрил, ацетон, тетрагидрофуран (ТГФ), 1,4-диоксан, 1,2-диметоксиэтан, диметиловый эфир диэтиленгликоля (диглим), ДМФА, N,N-диметилацетамид (ДМА), N-метилпирролидон (NMP), тетраметилмочевина, гексаметилфосфорамид, сульфолан, этилацетат, 1,3-диметил-2-имидазолидинон, этиловый эфир, бензол или толуол.

8. Способ по п. 6, отличающийся тем, что концентрация указанного азида находится в пределах от 0,001 М до 3 М.

9. Способ по пп. 3, отличающийся тем, что при реакции фосфита с азидом дополнительно прибавляется силилирующий агент или смесь двух или более силилирующих агентов.

10. Способ по п. 9, отличающийся тем, что силилирующий агент выбирается из группы, содержащей следующие силилирующие агенты: N,O-бис(триметилсилил)ацетамид (BSA), N,O-бис(триметилсилил)трифторацетамид (BSTFA), триметилхлорсилан, триметилбромсилан, триметилиодсилан, гексаметилдисилазан, триметилсилилтрифторметансульфонат (TMSOTf), триэтилхлорсилан, трет-бутилдиметилхлорсилан, диметилдихлорсилан, дифенилдихлорсилан.

11. Способ по п. 9, отличающийся тем, что концентрация силилирующего агента или суммарная концентрация смеси двух или более силилирующих агентов находится в интервале от 0,1% до 30% по объему.

12. Способ по п. 3, отличающийся тем, что при реакции фосфита с азидом дополнительно прибавляется органическое основание.

13. Способ по п. 12, отличающийся тем, что указанное основание выбирается из группы, содержащей триэтиламин, N,N-диизопропилэтиламин (DIEA), N-метилморфолин, N-этилморфолин, N-метилпирролидин, N-метилпиперидин, трибутиламин, 2,6-лутидин, 2,4,6-коллидин, 1,4-диазабицикло[2.2.2]октан (DABCO), N-метилимидазол (NMI), 4-диметиламинопиридин (DMAP), 1,8-диазабицикло[5.4.0]ундецен-7 (DBU), 1,5-диазабицикло[4.3.0]нонен-5 (DBN), 1,8-бис-диметиламинонафталин, 1,5,7-триазабицикло[4.4.0]децен-5 (TBD), 7-метил-1,5,7-триазабицикло[4.4.0]децен-5 (MTBD), 1,1,3,3-тетраметилгуанидин (TMG), 2-трет-бутил-1,1,3,3-тетраметилгуанидин, фосфазеновое основание.

14. Способ по п. 12, отличающийся тем, что концентрация указанного основания находится в интервале от 0,1% до 30% по объему.