JP6884250B2 - ペプチドオリゴヌクレオチドコンジュゲート - Google Patents

ペプチドオリゴヌクレオチドコンジュゲート Download PDF

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Description

関連出願の引用
本願は、２０１１年５月５日に出願された米国特許出願第１３／１０１，９４２号および２０１１年５月１３日に出願された米国特許出願第１３／１０７，５２８号に対する米国特許法第１２０条の下での利益を主張する。これらの出願は、それらの全体が本明細書中に参考として援用される。
背景
技術分野
本発明は、一般的に、アンチセンス化合物として有用なオリゴヌクレオチド化合物（オリゴマー）に関し、より詳細には、細胞浸透性ペプチドにコンジュゲートされたオリゴマー化合物、および、アンチセンス用途におけるこのようなオリゴマー化合物の使用に関する。
関連出願の説明
潜在的に有用な生物学的活性を有する多くの薬剤における実用性は、多くの場合、このような薬剤のそれらの標的への送達の困難性により妨害される。細胞内に送達される化合物は、一般的には、大部分は水性細胞外環境から送達され、次いで、細胞に入り込むために、脂溶性の細胞膜を浸透しなければならない。物質が特定の輸送メカニズムにより能動的に輸送されない限り、多くの分子、特に大きな分子は、実際の可溶化には脂溶性であり過ぎるか、または、前記膜を浸透するには親水性であり過ぎるかのいずれかである。
アミノ酸残基４９〜５７からなるＨＩＶ Ｔａｔタンパク質の断片（配列ＲＫＫＲＲＱＲＲＲを有する、Ｔａｔ４９ ５７）が、生物学的に活性なペプチドおよびタンパク質を、細胞に送達するのに使用されてきた（例えば、Ｂａｒｓｏｕｍら、１９９４，国際公開第９４／０４６８６号）。Ｔａｔ（４９ ６０）が、ホスホロチオアートオリゴヌクレオチドの送達を向上するのに使用されてきた（Ａｓｔｒｉａｂ−Ｆｉｓｈｅｒ，Ｓｅｒｇｕｅｅｖら、２０００；Ａｓｔｒｉａｂ−Ｆｉｓｈｅｒ，Ｓｅｒｇｕｅｅｖら、２００２）。リバースＴａｔまたはｒＴａｔ（５７〜４９）（ＲＲＲＱＲＲＫＫＲ）が、Ｔａｔ（４９ ５７）と比較して、フルオレセインを細胞内に、向上された有効性で送達することが報告されてきた（Ｗｅｎｄｅｒ，Ｍｉｔｃｈｅｌｌら、２０００；Ｒｏｔｈｂａｒｄ，Ｋｒｅｉｄｅｒら、２００２）。ＲｏｔｈｂａｒｄおよびＷｅｎｄｅｒは、他のアルギニンリッチ輸送ポリマーも開示してきた（特許文献１（国際公開第０１／６２２９７号）；特許文献２（米国特許第６，３０６，９９３号明細書）；特許文献３（米国特許出願公開第２００３／００３２５９３号明細書））。
オリゴヌクレオチドは、治療的使用に対して多くの場合、送達が妨害される、潜在的に有用な薬剤化合物の一分類である。ホスホロジアミダート結合モルホリノオリゴマー（ＰＭＯ；例えば、Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ ａｎｄ Ｗｅｌｌｅｒ，１９９７を参照のこと）が、荷電したオリゴヌクレオチド類似体、例えば、ホスホロチオアートより、この点で有望であることが見出されてきた。前記ＰＭＯは、水溶性であり、荷電していない、もしくは、実質的に荷電していない、スプライシングの進展、または、翻訳機構成分の結合を妨害することにより、遺伝子発現を阻害するアンチセンス分子である。ＰＭＯが、ウイルス複製を阻害または妨害することも示されてきた（Ｓｔｅｉｎ，Ｓｋｉｌｌｉｎｇら、２００１；ＭｃＣａｆｆｒｅｙ，Ｍｅｕｓｅら、２００３）。それらは、酵素消化に対して非常に抵抗性である（Ｈｕｄｚｉａｋ，Ｂａｒｏｆｓｋｙら、１９９６）。ＰＭＯは、無細胞および細胞培養モデルでの、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて（Ｓｔｅｉｎ，Ｆｏｓｔｅｒら、１９９７；Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ ａｎｄ Ｗｅｌｌｅｒ １９９７）、および、ゼブラフィッシュ、カエルおよびウニの胚での、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて（Ｈｅａｓｍａｎ，Ｋｏｆｒｏｎら、２０００；Ｎａｓｅｖｉｃｉｕｓ ａｎｄ Ｅｋｋｅｒ ２０００）、ならびに、成体動物モデル、例えば、ラット、マウス、ウサギ、イヌおよびブタにおいて（例えば、Ａｒｏｒａ ａｎｄ Ｉｖｅｒｓｅｎ ２０００；Ｑｉｎ，Ｔａｙｌｏｒら、２０００；Ｉｖｅｒｓｅｎ ２００１；Ｋｉｐｓｈｉｄｚｅ，Ｋｅａｎｅら、２００１；Ｄｅｖｉ ２００２；Ｄｅｖｉ，Ｏｌｄｅｎｋａｍｐら、２００２；Ｋｉｐｓｈｉｄｚｅ，Ｋｉｍら、２００２；Ｒｉｃｋｅｒ，Ｍａｔａら、２００２を参照のこと）、高いアンチセンス特異性および有効性を示してきた。
アンチセンスＰＭＯオリゴマーが、細胞内に取り込まれ、他の幅広く使用されているアンチセンスオリゴヌクレオチドより、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて一貫して効果的であり、ほとんど非特異的な効能を示さないことが示されてきた（例えば、Ｐ．Ｉｖｅｒｓｅｎ，“Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ Ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ”，ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｄｒｕｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓ．Ｔ．Ｃｒｏｏｋｅ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００１を参照のこと）。アルギニンリッチペプチドへの前記ＰＭＯの接合は、それらの細胞内への取り込みを向上することが示されてきた（例えば、特許文献４（米国特許第７，４６８，４１８号明細書）を参照のこと）。しかしながら、前記コンジュゲートの毒性が、有望な薬剤候補としての開発を遅らせてきた。
顕著な進展がなされてきたが、改善されたアンチセンスまたはアンチジーン性能を有するオリゴヌクレオチドコンジュゲートについての、当該分野における必要性が残っている。このような改善されたアンチセンスまたはアンチジーン性能としては、配列選択性を損なうことのない、より低い毒性、ＤＮＡおよびＲＮＡに対するより強力な親和性；改善された薬物動態および組織分布；改善された細胞送達および信頼性、ならびに、ｉｎ ｖｉｖｏにおける分布の制御可能性があげられる。
国際公開第０１／６２２９７号 米国特許第６，３０６，９９３号明細書 米国特許出願公開第２００３／００３２５９３号明細書 米国特許第７，４６８，４１８号明細書
簡単な概要
本発明の化合物は、これらの課題を解決し、当該分野における既存のアンチセンス分子についての改善を提供する。細胞浸透性ペプチドを、実質的に荷電していない核酸類似体に、グリシンまたはプロリンアミノ酸を介して結合することにより、本発明者らは、他のペプチドオリゴマーコンジュゲートに関連する毒性の課題を解決した。さらに、サブユニット間のリンケージの修飾、ならびに／または、オリゴヌクレオチド類似体、例えば、モルホリノオリゴヌクレオチドの５’末端および／もしくは３’末端への末端部分の接合も、前記コンジュゲートの特性を改善し得る。例えば、ある実施形態では、本開示のコンジュゲートは、他のオリゴヌクレオチド類似体と比較して、毒性を低下させ、ならびに／または、細胞送達、有効性および／もしくは組織分布を向上し、ならびに／または、標的器官に、より効果的に送達され得る。これらの優れた特性は、好ましい治療的指標、臨床用量の減少ならびに、物品の費用低下をもたらす。
したがって、本開示の一実施形態では、
（ａ）アミノ酸サブユニットを含むキャリアペプチド；および、
（ｂ）実質的に荷電していない骨格および、標的核酸に対する配列特異的結合用のターゲッティング塩基配列を含む核酸類似体；を含み、
前記アミノ酸サブユニットのうちの２個以上が、正電荷を有するアミノ酸であり、前記キャリアペプチドが、前記キャリアペプチドのカルボキシ末端に、グリシン（Ｇ）またはプロリン（Ｐ）アミノ酸を含み、前記キャリアペプチドが、前記核酸類似体に共有結合している、コンジュゲートを提供する。上記コンジュゲートと、薬学的に許容され得る媒体とを含む組成物も、提供する。
もう１つの実施形態では、本開示は、タンパク質の生成を阻害する方法であって、前記タンパク質をコードする核酸を、本開示のコンジュゲートに曝す工程を含む方法を提供する。
本開示のもう１つの態様は、細胞内への核酸類似体の輸送を向上するための方法であって、項目１記載のキャリアペプチドを、核酸類似体にコンジュゲートする工程を含み、前記細胞内への前記核酸類似体の輸送が、非コンジュゲート型の前記核酸類似体と比較して向上される、方法を含む。
もう１つの実施形態では、本開示は、被験体における疾患を処置する方法あって、治療的に有効量の開示されたコンジュゲートを、前記被験体に投与する工程を含む、方法に関する。前記コンジュゲートを製造する方法、それを使用するための方法、および、核酸類似体にコンジュゲートするのに有用なキャリアペプチドも提供する。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
（ａ）アミノ酸サブユニットを含むキャリアペプチド；および、
（ｂ）実質的に荷電していない骨格および、標的核酸に対する配列特異的結合用のターゲッティング塩基配列を含む核酸類似体；
を含むコンジュゲートであって、
ここで、該アミノ酸サブユニットのうちの２個以上が、正電荷を有するアミノ酸であり、該キャリアペプチドが、該キャリアペプチドのカルボキシ末端に、グリシン（Ｇ）またはプロリン（Ｐ）アミノ酸サブユニットを含み、７個以下連続したアミノ酸サブユニットが、アルギニンであり、該キャリアペプチドが、該核酸類似体に共有結合している、
コンジュゲート。
（項目２）
前記キャリアペプチドが、前記カルボキシ末端に、グリシンアミノ酸を含む、項目１記載のコンジュゲート。
（項目３）
前記キャリアペプチドが、前記カルボキシ末端に、プロリンアミノ酸を含む、項目１記載のコンジュゲート。
（項目４）
前記キャリアペプチドが、４から４０個のアミノ酸サブユニットを含む、項目１記載のコンジュゲート。
（項目５）
前記キャリアペプチドが、６から２０個のアミノ酸サブユニットを含む、項目１記載のコンジュゲート。
（項目６）
前記正電荷を有するアミノ酸が、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）またはそれらの組み合わせである、項目１記載のコンジュゲート。
（項目７）
前記正電荷を有するアミノ酸のうちの少なくとも１個が、アルギニンである、項目１記載のコンジュゲート。
（項目８）
前記カルボキシ末端のグリシンまたはプロリン以外の前記アミノ酸サブユニットの各々が、正電荷を有するアミノ酸である、項目１記載のコンジュゲート。
（項目９）
前記正電荷を有するアミノ酸の各々が、アルギニンである、項目１記載のコンジュゲート。
（項目１０）
前記正電荷を有するアミノ酸のうちの少なくとも１個が、アルギニン類似体であり、前記アルギニン類似体が、構造ＲａＮ＝Ｃ（ＮＨ２）Ｒｂの側鎖を含むカチオン性α−アミノ酸であり、ここで、ＲａがＨまたはＲｃであり；ＲｂがＲｃ、ＮＨ２、ＮＨＲまたはＮ（Ｒｃ）２であり、Ｒｃが低級アルキルまたは低級アルケニルであり、および、場合により、酸素または窒素を含み、または、ＲａおよびＲｂが、共に環を形成してもよく；前記側鎖が、ＲａまたはＲｂを介して、前記アミノ酸に結合される、項目１記載のコンジュゲート。
（項目１１）
前記アミノ酸サブユニットのうちの少なくとも２０％が、正電荷を有するアミノ酸である、項目１記載のコンジュゲート。
（項目１２）
前記アミノ酸サブユニットのうちの少なくとも５０％が、正電荷を有するアミノ酸である、項目１記載のコンジュゲート。
（項目１３）
前記アミノ酸サブユニットのうちの少なくとも８０％が、正電荷を有するアミノ酸である、項目１記載のコンジュゲート。
（項目１４）
前記カルボキシ末端のグリシンまたはプロリン以外の全ての前記アミノ酸サブユニットが、正電荷を有するアミノ酸である、項目１記載のコンジュゲート。
（項目１５）
前記キャリアペプチドが、配列（Ｒｄ）ｍを含み、Ｒｄが、各出現箇所で独立して、正電荷を有するアミノ酸であり、ｍが、２から１２の範囲の整数である、項目１記載のコンジュゲート。
（項目１６）
Ｒｄが、各出現箇所で独立して、アルギニン、ヒスチジンまたはリジンである、項目１５記載のコンジュゲート。
（項目１７）
各Ｒｄが、アルギニンである、項目１５記載のコンジュゲート。
（項目１８）
前記カルボキシ末端のグリシンまたはプロリン以外の各アミノ酸サブユニットが、アルギニンである、項目１記載のコンジュゲート。
（項目１９）
前記キャリアペプチドが、少なくとも１つの疎水性アミノ酸を含み、該疎水性アミノ酸が、置換または非置換のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリールまたはアラルキルの側鎖を含み、該アルキル、アルケニルおよびアルキニルの側鎖が、６つの炭素原子毎に、多くても１つのヘテロ原子を含む、項目１記載のコンジュゲート。
（項目２０）
前記キャリアペプチドが、２つ以上の疎水性アミノ酸を含む、項目１９記載のコンジュゲート。
（項目２１）
前記キャリアペプチドが、２つ以上連続した疎水性アミノ酸を含む、項目１９記載のコンジュゲート。
（項目２２）
前記疎水性アミノ酸のうちの少なくとも１つが、フェニルアラニンである、項目１９記載のコンジュゲート。
（項目２３）
前記疎水性アミノ酸の各々が、フェニルアラニンである、項目１９記載のコンジュゲート。
（項目２４）
前記キャリアペプチドが、下記構造（Ｙｂ）：
Figure 0006884250
を有する、少なくとも１つの中性アミノ酸を含み、式中、ｎが、２から７であり、各Ｒｅが各出現箇所で独立して、水素またはメチルである、項目１記載のコンジュゲート。
（項目２５）
前記キャリアペプチドが、配列［（ＲｄＹｂＲｄ）ｘ（ＲｄＲｄＹｂ）ｙ］ｚを含み、Ｒｄが、各出現箇所で独立して、正電荷を有するアミノ酸であり、ｘおよびｙが、各出現箇所で独立して、０または１であり、但し、ｘ＋ｙが１または２であり、ｚが、１から６の範囲の整数である、項目２４記載のコンジュゲート。
（項目２６）
Ｒｄが、各出現箇所で独立して、アルギニン、ヒスチジンまたはリジンである、項目２５記載のコンジュゲート。
（項目２７）
各Ｒｄが、アルギニンである、項目２５記載のコンジュゲート。
（項目２８）
少なくとも１つのＹｂが、６−アミノヘキサン酸またはβ−アラニンである、項目２５記載のコンジュゲート。
（項目２９）
前記キャリアペプチドが、配列ＩＬＦＱＹを含む、項目１記載のコンジュゲート。
（項目３０）
前記キャリアペプチドが、配列ＩＬＦＱ、ＩＷＦＱまたはＩＬＩＱを含む、項目１記載のコンジュゲート。
（項目３１）
前記キャリアペプチドが、配列ＰＰＭＷＳ、ＰＰＭＷＴ、ＰＰＭＦＳまたはＰＰＭＹＳを含む、項目１記載のコンジュゲート。
（項目３２）
前記キャリアペプチドが、アラニン、アスパラギン、システイン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、リジン、メチオニン、セリンまたはスレオニンのうちの少なくとも１つを含む、項目１記載のコンジュゲート。
（項目３３）
前記キャリアペプチドが、前記キャリアペプチドのアミノ末端に、アセチル、ベンゾイルまたはステアロイル部分を含む、項目１記載のコンジュゲート。
（項目３４）
前記アミノ酸サブユニットの各々が、天然アミノ酸である、項目１記載のコンジュゲート。
（項目３５）
前記荷電していない骨格が、サブユニット間リンケージにより結合されたモルホリノ環構造の配列を含み、前記サブユニット間リンケージが、１つのモルホリノ環構造の３’端を、隣接するモルホリノ環構造の５’端に結合し、前記オリゴマーが前記標的核酸に、配列特異的な方法で結合し得るように、各モルホリノ環構造が、塩基対合部分に結合され、前記サブユニット間リンケージが、下記一般構造（Ｉ）：
Figure 0006884250
または、その塩もしくはその異性体を有し、該サブユニット間リンケージ（Ｉ）の各々が、独立して、リンケージ（Ａ）またはリンケージ（Ｂ）であり：
リンケージ（Ａ）に関して：
Ｗが各出現箇所で独立して、ＳまたはＯであり；
Ｘが各出現箇所で独立して、−Ｎ（ＣＨ３）２、−ＮＲ１Ｒ２、−ＯＲ３または；
Figure 0006884250
であり；
Ｙが各出現箇所で独立して、Ｏまたは−ＮＲ２であり；
Ｒ１が各出現箇所で独立して、水素またはメチルであり；
Ｒ２が各出現箇所で独立して、水素または−ＬＮＲ４Ｒ５Ｒ７であり；
Ｒ３が各出現箇所で独立して、水素またはＣ１−Ｃ６アルキルであり；
Ｒ４が各出現箇所で独立して、水素、メチル、−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｚ−Ｌ−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２または−［Ｃ（Ｏ）ＣＨＲ’ＮＨ］ｍＨであり、Ｚが、カルボニル（Ｃ（Ｏ））または直接結合であり、Ｒ’が、天然に存在するアミノ酸の側鎖またはその１つもしくは２つの炭素同族体であり、ｍが、１から６であり；
Ｒ５が各出現箇所で独立して、水素、メチルまたは電子対であり；
Ｒ６が各出現箇所で独立して、水素またはメチルであり；
Ｒ７が各出現箇所で独立して、水素、Ｃ１−Ｃ６アルキルまたはＣ１−Ｃ６アルコキシアルキルであり；
Ｌが、アルキル、アルコキシもしくはアルキルアミノの基またはそれらの組み合わせを含む、長さ１８原子以下の必要に応じたリンカーであり、ならびに、
リンケージ（Ｂ）に関して：
Ｗが各出現箇所で独立して、ＳまたはＯであり；
Ｘが各出現箇所で独立して、−ＮＲ８Ｒ９または−ＯＲ３であり；および、
Ｙが各出現箇所で独立して、Ｏまたは−ＮＲ１０であり、
Ｒ８が各出現箇所で独立して、水素またはＣ２−Ｃ１２アルキルであり；
Ｒ９が各出現箇所で独立して、水素、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、Ｃ１−Ｃ１２アラルキルまたはアリールであり；
Ｒ１０が各出現箇所で独立して、水素、Ｃ１−Ｃ１２アルキルまたは−ＬＮＲ４Ｒ５Ｒ７であり；
Ｒ８およびＲ９が結合して、５〜１８員の単環複素環もしくは二環複素環を形成してもよく、または、Ｒ８、Ｒ９またはＲ３がＲ１０と結合して、５〜７員の複素環を形成し、Ｘが４−ピペラジノである場合、Ｘが下記構造（ＩＩＩ）：
Figure 0006884250
を有し、式中：
Ｒ１１が各出現箇所で独立して、Ｃ２−Ｃ１２アルキル、Ｃ１−Ｃ１２アミノアルキル、Ｃ１−Ｃ１２アルキルカルボニル、アリール、ヘテロアリールまたはヘテロシクリルであり；および、
Ｒが各出現箇所で独立して、電子対、水素またはＣ１−Ｃ１２アルキルであり；および、
Ｒ１２が各出現箇所で独立して、水素、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、Ｃ１−Ｃ１２アミノアルキル、−ＮＨ２、−ＣＯＮＨ２、−ＮＲ１３Ｒ１４、−ＮＲ１３Ｒ１４Ｒ１５、Ｃ１−Ｃ１２アルキルカルボニル、オキソ、−ＣＮ、トリフルオロメチル、アミジル、アミジニル、アミジニルアルキル、アミジニルアルキルカルボニル グアニジニル、グアニジニルアルキル、グアニジニルアルキルカルボニル、コラート、デオキシコラート、アリール、ヘテロアリール、複素環、−ＳＲ１３またはＣ１−Ｃ１２アルコキシであり、Ｒ１３、Ｒ１４およびＲ１５が、各出現箇所で独立して、Ｃ１−Ｃ１２アルキルである、項目１記載のコンジュゲート。
（項目３６）
前記モルホリノ環構造のうちの少なくとも１つが、下記構造（ｉ）：
Figure 0006884250
を有し、式中、Ｐｉが、各出現箇所で独立して、塩基対合部分である、項目３５記載のコンジュゲート。
（項目３７）
前記サブユニット間リンケージのうちの少なくとも１つが、リンケージ（Ａ）である、項目３５記載のコンジュゲート。
（項目３８）
前記サブユニット間リンケージの各々が、リンケージ（Ａ）である、項目３５記載のコンジュゲート。
（項目３９）
各リンケージ（Ａ）が、各出現箇所で同じ構造を有する、項目３５記載のコンジュゲート。
（項目４０）
リンケージ（Ａ）の少なくとも１つ出現箇所に関して、Ｘが、−Ｎ（ＣＨ３）２である、項目３５記載のコンジュゲート。
（項目４１）
リンケージ（Ａ）の各出現箇所で、Ｘが、−Ｎ（ＣＨ３）２である、項目３５記載のコンジュゲート。
（項目４２）
各リンケージが、リンケージ（Ａ）であり、Ｘが、−Ｎ（ＣＨ３）２である、項目３５記載のコンジュゲート。
（項目４３）
リンケージ（Ａ）の少なくとも１つの出現箇所に関して、Ｘが、下記構造：
Figure 0006884250
有する、項目３５記載のコンジュゲート。
（項目４４）
リンケージ（Ｂ）の少なくとも１つの出現箇所に関して、Ｘが、下記構造：
Figure 0006884250
有する、項目３５記載のコンジュゲート。
（項目４５）
リンケージ（Ｂ）の少なくとも１つの出現箇所に関して、Ｘが、下記構造：
Figure 0006884250
有する、項目３５記載のコンジュゲート。
（項目４６）
ＷおよびＹが、各出現箇所でＯである、項目３５記載のコンジュゲート。
（項目４７）
前記サブユニット間リンケージのうちの少なくとも５％が、リンケージ（Ｂ）である、項目３５記載のコンジュゲート。
（項目４８）
各リンケージ（Ｂ）が、各出現箇所で同じ構造を有する、項目３５記載のコンジュゲート。
（項目４９）
前記核酸類似体が、下記構造（ＸＶＩＩ）：
Figure 0006884250
または、その塩もしくは異性体を有し、式中：
Ｒ１７が各出現箇所で独立して、存在しないか、水素またはＣ１−Ｃ６アルキルであり；
Ｒ１８およびＲ１９が各出現箇所で独立して、存在しないか、水素、前記キャリアペプチド、Ｃ２−Ｃ３０アルキルカルボニル、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ２１またはＲ２０であり；
Ｒ２０が各出現箇所で独立して、グアニジニル、ヘテロシクリル、Ｃ１−Ｃ３０アルキル、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル；Ｃ６−Ｃ３０アリール、Ｃ７−Ｃ３０アラルキル、Ｃ３−Ｃ３０アルキルカルボニル、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキルカルボニル、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキルアルキルカルボニル、Ｃ７−Ｃ３０アリールカルボニル、Ｃ７−Ｃ３０アラルキルカルボニル、Ｃ２−Ｃ３０アルキルオキシカルボニル、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキルオキシカルボニル、Ｃ７−Ｃ３０アリールオキシカルボニル、Ｃ８−Ｃ３０アラルキルオキシカルボニルまたは−Ｐ（＝Ｏ）（Ｒ２２）２であり；
Ｒ２１が、１つ以上のエーテル結合、ヒドロキシル部分またはそれらの組み合わせを含むＣ１−Ｃ３０アルキルであり；
各Ｒ２２が独立して、Ｃ６−Ｃ１２アリールオキシであり；
Ｐｉが、塩基対合部分であり；
Ｌ１およびＬ２がそれぞれ、直接結合または、アルキル、ヒドロキシル、アルコキシ、アルキルアミノ、アミド、エステル、カルボニル、カルバマート、ホスホロジアミダート、ホスホロアミダート、ホスホロチオアートおよびホスホジエステルから選択される結合を含む、長さ１８原子以下のリンカーであり；
ｘが、０またはそれより大きい整数であり；および、
Ｒ１７およびＲ１８が両方とも存在し、Ｒ１８またはＲ１９のうちの少なくとも１つが、前記キャリアペプチドである、項目３５記載のコンジュゲート。
（項目５０）
Ｒ１８が、前記キャリアペプチドである、項目４９記載のコンジュゲート。
（項目５１）
Ｒ１９が、前記キャリアペプチドである、項目４９記載のコンジュゲート。
（項目５２）
Ｒ１８またはＲ１９のうちの少なくとも１つが、Ｒ２０である、項目４９記載のコンジュゲート。
（項目５３）
Ｒ１９が、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ２１である、項目４９記載のコンジュゲート。
（項目５４）
Ｒ１９が、
Figure 0006884250
である、項目５３記載のコンジュゲート。
（項目５５）
Ｌ１が、ホスホロジアミダートおよびピペラジン結合を含む、項目４９記載のコンジュゲート。
（項目５６）
Ｌ１が、下記構造（ＸＸＩＸ）：
Figure 0006884250
を有し、式中、Ｒ２４が存在しないか、ＨまたはＣ１−Ｃ６アルキルである、項目５５記載のコンジュゲート。
（項目５７）
Ｒ２４が、存在しない、項目５６記載のコンジュゲート。
（項目５８）
Ｒ１８が、前記キャリアペプチドであり、Ｌ２が、直接結合であり、前記キャリアペプチドが、前記キャリアペプチドのカルボキシ末端と前記核酸類似体の３’末端窒素との間の結合を形成する、項目４９記載のコンジュゲート。
（項目５９）
項目１記載のコンジュゲートと、薬学的に許容され得る媒体とを含む、組成物。
（項目６０）
被験体における疾患を処置する方法であって、治療的に有効量の項目１記載のコンジュゲートを、前記被験体に投与する工程を含む、方法。
（項目６１）
前記疾患が、ウイルス感染、神経筋疾患、細菌感染、炎症または多発性嚢胞腎である、項目６０記載の方法。
（項目６２）
前記ウイルス感染が、インフルエンザである、項目６１記載の方法。
（項目６３）
前記神経筋疾患が、デュシェンヌ型筋ジストロフィーである、項目６１記載の方法。
（項目６４）
細胞内への核酸類似体の輸送を向上するための方法であって、項目１記載のキャリアペプチドを、核酸類似体にコンジュゲートする工程を含み、該細胞内への該核酸類似体の輸送が、非コンジュゲート型の該核酸類似体と比較して向上される、方法。
（項目６５）
前記核酸類似体が、モルホリノオリゴマーである、項目６４記載の方法。
本発明のこれらの態様および他の態様は、下記の詳細な説明を参照することにより明らかであろう。この目的を達成するために、本願明細書において、特定の背景情報、手順、化合物および／または組成物を、より詳細に記載する、種々の参考文献が説明され、それらの全体が参照により、それぞれ本願明細書に取り込まれる。
図１Ａは、ホスホロジアミダートリンケージを含む、典型的なモルホリノオリゴマー構造を示す。 図１Ｂは、キャリアペプチドに、５’端でコンジュゲートされたモルホリノオリゴマーを示す。 図１Ｃは、キャリアペプチドに、３’端でコンジュゲートされたモルホリノオリゴマーを示す。 図１Ｄ〜Ｇは、典型的なモルホリノオリゴヌクレオチドである、指定された１Ｄから１Ｇの繰り返しサブユニットセグメントを示す。 図１Ｄ〜Ｇは、典型的なモルホリノオリゴヌクレオチドである、指定された１Ｄから１Ｇの繰り返しサブユニットセグメントを示す。 図１Ｄ〜Ｇは、典型的なモルホリノオリゴヌクレオチドである、指定された１Ｄから１Ｇの繰り返しサブユニットセグメントを示す。 図１Ｄ〜Ｇは、典型的なモルホリノオリゴヌクレオチドである、指定された１Ｄから１Ｇの繰り返しサブユニットセグメントを示す。 図２は、モルホリノ−Ｔ部分に結合される、典型的なサブユニット間リンケージを示す。 図３は、固相合成用リンカーの調製を示す反応スキームである。 図４は、オリゴマー合成用固体支持体の調製を示す。 図５Ａ、５Ｂおよび５Ｃは、マウスの大腿四頭筋、横隔膜および心臓のそれぞれにおいて、既知のコンジュゲートと比較した、典型的なコンジュゲートについての、エクソンスキッピングデータを示す。 図５Ａ、５Ｂおよび５Ｃは、マウスの大腿四頭筋、横隔膜および心臓のそれぞれにおいて、既知のコンジュゲートと比較した、典型的なコンジュゲートについての、エクソンスキッピングデータを示す。 図５Ａ、５Ｂおよび５Ｃは、マウスの大腿四頭筋、横隔膜および心臓のそれぞれにおいて、既知のコンジュゲートと比較した、典型的なコンジュゲートについての、エクソンスキッピングデータを示す。 図６Ａ、６Ｂおよび６Ｃは、マウスの大腿四頭筋、横隔膜および心臓のそれぞれにおいて、既知のコンジュゲートと比較した、典型的なコンジュゲートについての、エクソンスキッピングデータの別の表現である。 図６Ａ、６Ｂおよび６Ｃは、マウスの大腿四頭筋、横隔膜および心臓のそれぞれにおいて、既知のコンジュゲートと比較した、典型的なコンジュゲートについての、エクソンスキッピングデータの別の表現である。 図６Ａ、６Ｂおよび６Ｃは、マウスの大腿四頭筋、横隔膜および心臓のそれぞれにおいて、既知のコンジュゲートと比較した、典型的なコンジュゲートについての、エクソンスキッピングデータの別の表現である。 図７Ａおよび７Ｂは、種々のペプチド−オリゴマーコンジュゲートそれぞれで処置されたマウスにおける、血中尿素窒素（ＢＵＮ）レベルおよび生存率を示すグラフである。 図７Ａおよび７Ｂは、種々のペプチド−オリゴマーコンジュゲートそれぞれで処置されたマウスにおける、血中尿素窒素（ＢＵＮ）レベルおよび生存率を示すグラフである。 図８Ａおよび８Ｂは、種々のペプチド−オリゴマーコンジュゲートそれぞれで処置されたマウスについての、腎傷害マーカー（ＫＩＭ）データおよびクラステリン（Ｃｌｕ）データを示す。 図８Ａおよび８Ｂは、種々のペプチド−オリゴマーコンジュゲートそれぞれで処置されたマウスについての、腎傷害マーカー（ＫＩＭ）データおよびクラステリン（Ｃｌｕ）データを示す。 図９Ａ、９Ｂ、９Ｃおよび９Ｄは、既知のコンジュゲートと比較した、典型的なコンジュゲートで処置されたマウスにおける、エクソンスキッピング、ＢＵＮレベル、パーセント生存およびＫＩＭレベルのそれぞれを比較するグラフである。 図９Ａ、９Ｂ、９Ｃおよび９Ｄは、既知のコンジュゲートと比較した、典型的なコンジュゲートで処置されたマウスにおける、エクソンスキッピング、ＢＵＮレベル、パーセント生存およびＫＩＭレベルのそれぞれを比較するグラフである。 図９Ａ、９Ｂ、９Ｃおよび９Ｄは、既知のコンジュゲートと比較した、典型的なコンジュゲートで処置されたマウスにおける、エクソンスキッピング、ＢＵＮレベル、パーセント生存およびＫＩＭレベルのそれぞれを比較するグラフである。 図９Ａ、９Ｂ、９Ｃおよび９Ｄは、既知のコンジュゲートと比較した、典型的なコンジュゲートで処置されたマウスにおける、エクソンスキッピング、ＢＵＮレベル、パーセント生存およびＫＩＭレベルのそれぞれを比較するグラフである。 図１０は、種々のコンジュゲートで処置されたマウスについての、ＫＩＭデータを示す。 図１１は、種々のコンジュゲートで処置されたマウスの、ＢＵＮ分析の結果を示す。 図１２は、マウス腎臓組織における種々のオリゴマーの濃度を示すグラフである。
詳細な説明
Ｉ．定義
下記の記載では、ある特定の詳細は、種々の実施形態についての理解を通じて提供されるために、説明される。ただし、当業者であれば、本発明が、これらの詳細なしに実施され得ることを理解するであろう。他の例では、周知の構成は、その実施形態の記載が不要に曖昧になるのを避けるために、詳細には示しておらず、記載していない。特に断らない限り、下記の明細書および特許請求の範囲全体を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」の語ならびに、その変形、例えば、「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」および「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」は、オープンに包含的な意味、すなわち、「含むが、限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ，ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」として解釈される。さらに、本願明細書で提供された見出しは、便宜上のみであり、特許請求の範囲の発明のスコープまたは意味を説明するものではない。
本明細書全体を参照して、「一実施形態（ｏｎｅ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」または「実施形態（ａｎ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」は、その実施形態に関連して記載される特定の特性、構造または特徴が、少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書の各所における「一実施形態では（ｉｎ ｏｎｅ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」または「実施形態では（ｉｎ ａｎ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」の句の出現は、同じ実施形態の全てを言及する必要がない。さらに、前記特定の特性、構造または特徴は、１つ以上の実施形態において、任意の適切な方法で組み合わせられてもよい。また、本明細書および添付の特許請求の範囲で使用する場合、単数形である「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、特に断らない限り、複数の指示対象を含む。特に断らない限り、「または（ｏｒ）」の用語は、一般的に、「および／または（ａｎｄ／ｏｒ）」を含む意味において使用されることに、留意すべきである。
本願明細書で使用する場合、以下の用語は、特に断らない限り、下記の意味を有する。
「アミノ」は、−ＮＨ２基を意味する。
「シアノ」または「ニトリル」は、−ＣＮ基を意味する。
「ヒドロキシ」または「ヒドロキシル」は、−ＯＨ基を意味する。
「イミノ」は、＝ＮＨ置換基を意味する。
「グアニジニル」は、−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２置換基を意味する。
「アミジニル」は、−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２置換基を意味する。
「ニトロ」は、−ＮＯ２基を意味する。
「オキソ」は、＝Ｏ置換基を意味する。
「チオキソ」は、＝Ｓ置換基を意味する。
「コラート」は、下記構造：
Figure 0006884250
を意味する。
「デオキシコラート」は、下記構造：
Figure 0006884250
を意味する。
「アルキル」は、１から３０個の炭素原子を有し、単結合により分子の残部に付着される、飽和または不飽和（すなわち、１つ以上の二重結合および／または三重結合を含む）の、直鎖状または分岐鎖状の炭化水素鎖基を意味する。１から３０の任意の数の炭素原子を含むアルキルが含まれる。３０個以下の炭素原子を含むアルキルは、Ｃ１−Ｃ３０アルキル、同様に例えば、１２個以下の炭素原子を含むアルキルは、Ｃ１−Ｃ１２アルキルである。他の数の炭素原子を含むアルキル（および本願明細書で規定される他の部分）は、同様に表される。アルキル基としては、制限されず、Ｃ１−Ｃ３０アルキル、Ｃ１−Ｃ２０アルキル、Ｃ１−Ｃ１５アルキル、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ４アルキル、Ｃ１−Ｃ３アルキル、Ｃ１−Ｃ２アルキル、Ｃ２−Ｃ８アルキル、Ｃ３−Ｃ８アルキルおよびＣ４−Ｃ８アルキルがあげられる。典型的なアルキル基としては、制限されず、メチル、エチル、ｎ−プロピル、１−メチルエチル（ｉｓｏ−プロピル）、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、ｓ−ブチル、ｎ−ペンチル、１，１−ジメチルエチル（ｔ−ブチル）、３−メチルヘキシル、２−メチルヘキシル、エテニル、プロプ−１−エニル、ブト−１−エニル、ペント−１−エニル、ペンタ−１，４−ジエニル、エチニル、プロピニル、ブト−２−イニル、ブト−３−イニル、ペンチニル、ヘキシニル等があげられる。本明細書において特に断らない限り、アルキル基は、場合により、以下に記載のように、置換されてもよい。
「アルキレン」または「アルキレン鎖」は、前記分子の残部をラジカル基に結合する、直鎖状または分岐鎖状の二価の炭化水素鎖を意味する。アルキレンは、飽和でもよいし、または不飽和でもよい（すなわち、１つ以上の二重結合および／または三重結合を含む）。典型的なアルキレンとしては、制限されず、Ｃ１−Ｃ１２アルキレン、Ｃ１−Ｃ８アルキレン、Ｃ１−Ｃ６アルキレン、Ｃ１−Ｃ４アルキレン、Ｃ１−Ｃ３アルキレン、Ｃ１−Ｃ２アルキレン、Ｃ１アルキレンがあげられる。典型的なアルキレン基としては、制限されず、メチレン、エチレン、プロピレン、ｎ−ブチレン、エテニレン、プロペニレン、ｎ−ブテニレン、プロピニレン、ｎ−ブチニレン等があげられる。前記アルキレン鎖は、単結合または二重結合により、前記分子の残部に付着され、単結合または二重結合により、ラジカル基に付着される。前記分子の残部および前記ラジカル基への前記アルキレン鎖の付着点は、前記鎖内における１つの炭素または任意の２つの炭素を介し得る。本明細書において特に断らない限り、アルキレン鎖は、場合により、以下に記載のように、置換されてもよい。
「アルコキシ」は、式−ＯＲａの基を意味し、式中、Ｒａは、定義のように、アルキル基である。本明細書において特に断らない限り、アルコキシ基は、場合により、以下に記載のように、置換されてもよい。
「アルコキシアルキル」は、式−ＲｂＯＲａの基を意味し、式中、Ｒａは、定義のように、アルキル基であり、Ｒｂは、定義のように、アルキレン基である。本明細書において特に断らない限り、アルコキシアルキル基は、場合により、以下に記載のように、置換されてもよい。
「アルキルカルボニル」は、式−Ｃ（＝Ｏ）Ｒａの基を意味し、式中、Ｒａは、定義のように、アルキル基である。本明細書において特に断らない限り、アルキルカルボニル基は、場合により、以下に記載のように、置換されてもよい。
「アルキルオキシカルボニル」は、式−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲａの基を意味し、式中、Ｒａは、定義のように、アルキル基である。本明細書において特に断らない限り、アルキルオキシカルボニル基は、場合により、以下に記載のように、置換されてもよい。
「アルキルアミノ」は、式−ＮＨＲａまたは−ＮＲａＲａの基を意味し、式中、各Ｒａは、独立して、上記定義のように、アルキル基である。本明細書において特に断らない限り、アルキルアミノ基は、場合により、以下に記載のように、置換されてもよい。
「アミジル」は、式−Ｎ（Ｈ）Ｃ（＝Ｏ）Ｒａの基を意味し、式中、Ｒａは、本願明細書で定義するように、アルキル基またはアリール基である。本明細書において特に断らない限り、アミジル基は、場合により、以下に記載のように、置換されてもよい。
「アミジニルアルキル」は、式−Ｒｂ−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２の基を意味し、式中、Ｒｂは、上記定義のように、アルキレン基である。本明細書において特に断らない限り、アミジニルアルキル基は、場合により、以下に記載のように、置換されてもよい。
「アミジニルアルキルカルボニル」は、式−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｂ−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２の基を意味し、式中、Ｒｂは、上記定義のように、アルキレン基である。本明細書において特に断らない限り、アミジニルアルキルカルボニル基は、場合により、以下に記載のように、置換されてもよい。
「アミノアルキル」は、式−Ｒｂ−ＮＲａＲａの基を意味し、式中、Ｒｂは、上記定義のように、アルキレン基であり、各Ｒａは、独立して、水素またはアルキル基である。
「チオアルキル」は、式−ＳＲａの基を意味し、式中、Ｒａは、上記定義のように、アルキル基である。本明細書において特に断らない限り、チオアルキル基は、場合により置換されてもよい。
「アリール」は、水素、６から３０個の炭素原子および少なくとも１つの芳香環を含む、炭化水素環系由来の基を意味する。前記アリール基は、単環、二環、三環または四環の系でもよく、縮合環系または架橋環系を含んでもよい。アリール基としては、制限されず、アセアントリレン、アセナフチレン、アセフェナントリレン、アントラセン、アズレン、ベンゼン、クリセン、フロオランテン、フルオレン、ａｓ−インダセン、ｓ−インダセン、インダン、インデン、ナフタレン、フェナレン、フェナンスレン、プレイアデン、ピレンおよびトリフェニレンの炭化水素環系由来のアリール基があげられる。本明細書において特に断らない限り、「アリール」の用語または「ａｒ−」の接頭辞（例えば、「アラルキル（ａｒａｌｋｙｌ）」）は、場合により、置換されたアリール基を含むことを意味する。
「アラルキル」は、式−Ｒｂ−Ｒｃの基を意味し、Ｒｂは、上記定義のように、アルキレン鎖であり、Ｒｃは、上記定義のように、１つ以上のアリール基、例えば、ベンジル、ジフェニルメチル、トリチル等である。本明細書において特に断らない限り、アラルキル基は、場合により置換されてもよい。
「アリールカルボニル」は、式−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｃの基を意味し、Ｒｃは、上記定義のように、１つ以上のアリール基、例えば、フェニルである。本明細書において特に断らない限り、アリールカルボニル基は、場合により置換されてもよい。
「アリールオキシカルボニル」は、式−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｃの基を意味し、Ｒｃは、上記定義のように、１つ以上のアリール基、例えば、フェニルである。本明細書において特に断らない限り、アリールオキシカルボニル基は、場合により置換されてもよい。
「アラルキルカルボニル」は、式−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｂ−Ｒｃの基を意味し、Ｒｂは、上記定義のように、アルキレン鎖であり、Ｒｃは、上記定義のように、１つ以上のアリール基、例えば、フェニルである。本明細書において特に断らない限り、アラルキルカルボニル基は、場合により置換されてもよい。
「アラルキルオキシカルボニル」は、式−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｂ−Ｒｃの基を意味し、Ｒｂは、上記定義のように、アルキレン鎖であり、Ｒｃは、上記定義のように、１つ以上のアリール基、例えば、フェニルである。本明細書において特に断らない限り、アラルキルオキシカルボニル基は、場合により置換されてもよい。
「アリールオキシ」は、式−ＯＲｃの基を意味し、Ｒｃは、上記定義のように、１つ以上のアリール基、例えば、フェニルである。本明細書において特に断らない限り、アリールカルボニル基は、場合により置換されてもよい。
「シクロアルキル」は、安定的な非芳香族性の、単環または多環の炭素環式環を意味し、縮合環系または架橋環系を含んでもよく、飽和でもよいし、または、不飽和でもよく、単結合により前記分子の残部に付着される。典型的なシクロアルキルとしては、制限されず、３から１５個の炭素原子、および、３から８個の炭素原子を有するシクロアルキルがあげられる。単環のシクロアルキル基としては、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチルおよびシクロオクチルがあげられる。多環基としては、例えば、アダマンチル、ノルボルニル、デカリニルおよび、７，７−ジメチル−ビシクロ［２．２．１］ヘプタニルがあげられる。本明細書において特に断らない限り、シクロアルキル基は、場合により置換されてもよい。
「シクロアルキルアルキル」は、式−ＲｂＲｄの基を意味し、Ｒｂは、上記定義のように、アルキレン鎖であり、Ｒｄは、上記定義のように、シクロアルキル基である。本明細書において特に断らない限り、シクロアルキルアルキル基は、場合により置換されてもよい。
「シクロアルキルカルボニル」は、式−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｄの基を意味し、Ｒｄは、上記定義のように、シクロアルキル基である。本明細書において特に断らない限り、シクロアルキルカルボニル基は、場合により置換されてもよい。
「シクロアルキルオキシカルボニル」は、式−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｄの基を意味し、Ｒｄは、上記定義のように、シクロアルキル基である。本明細書において特に断らない限り、シクロアルキルオキシカルボニル基は、場合により置換されてもよい。
「縮合」は、既存の環構造に縮合された、本願明細書に記載の任意の環構造である。前記縮合環がヘテロシクリル環またはヘテロアリール環である場合、前記縮合ヘテロシクリル環または縮合ヘテロアリール環の部分となる、既存の環構造上の任意の炭素原子が、窒素原子に置換されてもよい。
「グアニジニルアルキル」は、式−Ｒｂ−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２の基を意味し、Ｒｂは、上記定義のように、アルキレン基である。本明細書において特に断らない限り、グアニジニルアルキル基は、場合により、以下に記載のように、置換されてもよい。
「グアニジニルアルキルカルボニル」は、式−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｂ−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２の基を意味し、Ｒｂは、上記定義のように、アルキレン基である。本明細書において特に断らない限り、グアニジニルアルキルカルボニル基は、場合により、以下に記載のように、置換されてもよい。
「ハロ」または「ハロゲン」は、ブロモ、クロロ、フルオロまたはヨードを意味する。
「ハロアルキル」は、１つ以上のハロ基、上記定義のように、例えば、トリフルオロメチル、ジフルオロメチル、フルオロメチル、トリクロロメチル、２，２，２−トリフルオロエチル、１，２−ジフロオロエチル、３−ブロモ−２−フロオロプロピル、１，２−ジブロモエチル等により置換された、上記定義のようなアルキル基を意味する。本明細書において特に断らない限り、ハロアルキル基は、場合により置換されてもよい。
「パーハロ」または「パーフロオロ」は、各水素原子それぞれが、ハロ原子またはフッ素原子により置換されている部分を意味する。
「ヘテロシクリル」「ヘテロサイクル」または「複素環」は、２から２３個の炭素原子ならびに、窒素、酸素、リンおよび硫黄からなる群から選択される、１から８個のヘテロ原子を含む、安定的な３員から２４員の非芳香族環の基を意味する。本明細書において特に断らない限り、前記ヘテロシクリル基は、単環、二環、三環または四環系でもよく、縮合環系または架橋環系を含んでもよい。前記ヘテロシクリル基における、窒素、炭素または硫黄原子は、場合により酸化されてもよく、窒素原子は、場合により四級化されてもよい。前記ヘテロシクリル基は、部分的または完全に飽和でもよい。このようなヘテロシクリル基の例としては、制限されず、ジオキソラニル、チエニル［１，３］ジチアニル、デカヒドロイソキノリル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、イソチアゾリジニル、イソキサゾリジニル、モルホリニル、オクタヒドロインドリル、オクタヒドロイソインドリル、２−オキソピペラジニル、２−オキソピペリジニル、２−オキソピロリジニル、オキサゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、４−ピペリドニル、ピロリジニル、ピラゾリジニル、キヌクリジニル、チアゾリジニル、テトラヒドロフリル、トリチアニル、テトラヒドロピラニル、チオモルホリニル、チアモルホリニル、１−オキソ−チオモルホリニル、１，１−ジオキソ−チオモルホリニル、１２−クラウン−４、１５−クラウン−５、１８−クラウン−６、２１−クラウン−７、アザ−１８−クラウン−６、ジアザ−１８−クラウン−６、アザ−２１−クラウン−７およびジアザ−２１−クラウン−７があげられる。本明細書において特に断らない限り、ヘテロシクリル基は、場合により置換されてもよい。
「ヘテロアリール」は、水素原子、１から１３個の炭素原子、窒素、酸素、リンおよび硫黄からなる群から選択される、１から６個のヘテロ原子、ならびに、少なくとも１つの芳香族環を含む、５員から１４員の環系基を意味する。本発明の目的のために、前記ヘテロアリール基は、単環、二環、三環または四環系でもよく、縮合環系または架橋環系を含んでもよい。前記ヘテロアリール基における、窒素、炭素または硫黄原子は、場合により酸化されてもよく、窒素原子は、場合により四級化されてもよい。例としては、制限さずれ、アゼピニル、アクリジニル、ベンズイミダゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンズインドリル、ベンゾジオキソリル、ベンゾフラニル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾチアジアゾリル、ベンゾ［ｂ］［１，４］ジオキセピニル、１，４−ベンゾジオキサニル、ベンゾナフトフラニル、ベンゾキサゾリル、ベンゾジオキソリル、ベンゾジオキシニル、ベンゾピラニル、ベンゾピラノニル、ベンゾフラニル、ベンゾフラノニル、ベンゾチエニル（ベンゾチオフェニル）、ベンゾトリアゾリル、ベンゾ［４，６］イミダゾ［１，２−ａ］ピリジニル、カルバゾリル、シンノリニル、ジベンゾフラニル、ジベンゾチオフェニル、フラニル、フラノニル、イソチアゾリル、イミダゾリル、インダゾリル、インドリル、インダゾリル、イソインドリル、インドリニル、イソインドリニル、イソキノリル、インドリジニル、イソキサゾリル、ナフチリジニル、オキサジアゾリル、２−オキソアゼピニル、オキサゾリル、オキシラニル、１−オキシドピリジニル、１−オキシドピリミジニル、１−オキシドピラジニル、１−オキシドピリダジニル、１−フェニル−１Ｈ−ピロリル、フェナジニル、フェノチアジニル、フェノキサジニル、フタラジニル、プテリジニル、プリニル、ピロリル、ピラゾリル、ピリジニル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、キナゾリニル、キノキサリニル、キノリニル、キヌクリジニル、イソキノリニル、テトラヒドロキノリニル、チアゾリル、チアジアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、トリアジニルおよびチオフェニル（すなわち、チエニル）があげられる。本明細書において特に断らない限り、ヘテロアリール基は、場合により置換されてもよい。
上記全ての基は、置換されてもよいし、または非置換のいずれでもよい。本願明細書で使用する場合、「置換された」の用語は、さらに官能化され得る、上記基のいずれか（すなわち、アルキル、アルキレン、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルキルカルボニル、アルキルオキシカルボニル、アルキルアミノ、アミジル、アミジニルアルキル、アミジニルアルキルカルボニル、アミノアルキル、アリール、アラルキル、アリールカルボニル、アリールオキシカルボニル、アラルキルカルボニル、アラルキルオキシカルボニル、アリールオキシ、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、シクロアルキルカルボニル、シクロアルキルアルキルカルボニル、シクロアルキルオキシカルボニル、グアニジニルアルキル、グアニジニルアルキルカルボニル、ハロアルキル、ヘテロシクリルおよび／またはヘテロアリール）を意味する。少なくとも１つの水素原子が、非水素原子置換基への結合により置換される。本明細書において特に断らない限り、置換基は、オキソ、−ＣＯ２Ｈ、ニトリル、ニトロ、−ＣＯＮＨ２、ヒドロキシル、チオオキシ、アルキル、アルキレン、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルキルカルボニル、アルキルオキシカルボニル、アリール、アラルキル、アリールカルボニル、アリールオキシカルボニル、アラルキルカルボニル、アラルキルオキシカルボニル、アリールオキシ、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、シクロアルキルカルボニル、シクロアルキルアルキルカルボニル、シクロアルキルオキシカルボニル、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、ジアルキルアミン、アリールアミン、アルキルアリールアミン、ジアリールアミン、Ｎ−オキシド、イミドおよびエナミン；例えば、トリアルキルシリル基、ジアルキルアリールシリル基、アルキルジアリールシリル基、トリアリールシリル基の基におけるケイ素原子、パーフルオロアルキルもしくはパーフルオロアルコキシ、例えば、トリフルオロメチルもしくはトリフルオロメトキシから選択される、１つ以上の置換基を含んでもよい。「置換された」は、１つ以上の水素原子が、より高い順の結合（例えば、二重結合または三重結合）により、ヘテロ原子、例えば、オキソ、カルボニル、カルボキシルおよびエステルの基における酸素；ならびに、例えば、イミン、オキシム、ヒドラゾンおよびニトリルの基における窒素に置換される、上記基のいずれかも意味する。例えば、「置換された」は、１つ以上の水素原子が、−ＮＲｇＣ（＝Ｏ）ＮＲｇＲｈ、−ＮＲｇＣ（＝Ｏ）ＯＲｈ、−ＮＲｇＳＯ２Ｒｈ、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲｇＲｈ、−ＯＲｇ、−ＳＲｇ、−ＳＯＲｇ、−ＳＯ２Ｒｇ、−ＯＳＯ２Ｒｇ、−ＳＯ２ＯＲｇ、＝ＮＳＯ２Ｒｇおよび−ＳＯ２ＮＲｇＲｈで置換される、上記基のいずれかを含む。「置換された」は、１つ以上の水素原子が、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｇ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｇ、−ＣＨ２ＳＯ２Ｒｇ、−ＣＨ２ＳＯ２ＮＲｇＲｈ、−ＳＨ、−ＳＲｇまたは−ＳＳＲｇで置換される、上記基のいずれかも意味する。前述において、ＲｇおよびＲｈは、同一でも異なってもよく、独立して、水素、アルキル、アルコキシ、アルキルアミノ、チオアルキル、アリール、アラルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ハロアルキル、ヘテロシクリル、Ｎ−ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリール、Ｎ−ヘテロアリールおよび／またはヘテロアリールアルキルである。さらに、前述の各置換基は、場合により、１つ以上の上記置換基で置換されてもよい。さらに、上記基のいずれかは、置換されて、１つ以上の内部酸素原子または硫黄原子を含んでもよい。例えば、アルキル基は、１つ以上の内部酸素原子で置換されて、エーテルまたはポリエーテル基を形成してもよい。同様に、アルキル基は、１つ以上の内部硫黄原子で置換されて、チオエーテル、ジスルフィド等を形成してもよい。アミジル部分は、２つ以下のハロ原子で置換されてもよく、一方、上記他の基は、１つ以上のハロ原子で置換されてもよい。上記基のいずれかは、アミノ、モノアルキルアミノ、グアニジニルまたはアミジニルで置換されてもよい。上記基のいずれかについての任意の置換基は、アリールホスホリル、例えば、−ＲａＰ（Ａｒ）３も含み、Ｒａは、アルキレンであり、Ａｒは、アリール部分、例えば、フェニルである。
「アンチセンスオリゴマー」または「アンチセンス化合物」の用語は、互換的に使用され、リボースもしくは他のペントース糖またはモルホリノ基で構成される骨格サブユニットに保有される塩基をそれぞれ有する、サブユニットの配列を意味する。前記骨格基は、前記化合物における塩基を、ワトソン−クリック塩基対合により、核酸（典型的にＲＮＡ）における標的配列にハイブリダイズさせて、核酸：オリゴマーヘテロ二本鎖を、標的配列内に形成させる、サブユニット間リンケージにより結合される。前記オリゴマーは、前記標的配列に対する正確な配列相補性、または、近い相補性を有し得る。このようなアンチセンスオリゴマーは、前記標的配列を含むｍＲＮＡの翻訳を妨害または阻害し、それがハイブリダイズする配列に「向けられる」と言われ得る。
「モルホリノオリゴマー」または「ＰＭＯ」は、典型的なポリヌクレオチドに水素結合可能な塩基を支持する骨格を有するポリマー分子を意味する。前記ポリマーは、ペントース糖骨格部分、より具体的には、ヌクレオチドおよびヌクレオシドに特有の、ホスホジエステル結合により結合されたリボース骨格を欠いているが、代わりに環窒素により連結する環窒素を含む。典型的な「モルホリノ」オリゴマーは、１つのサブユニットのモルホリノ窒素を、隣接するサブユニットの５’環外炭素に結合する、（チオ）ホスホロアミダートまたは（チオ）ホスホロジアミダートのリンケージにより、互いに結合されるモルホリノサブユニット構造を有する。各サブユニットが、塩基特異的水素結合により、ポリヌクレオチドにおける塩基に結合するのに有効な、プリンまたはピリミジン塩基対合部分を含む。モルホリノオリゴマー（アンチセンスオリゴマーを含む）は、例えば、米国特許第５，６９８，６８５；５，２１７，８６６；５，１４２，０４７；５，０３４，５０６；５，１６６，３１５；５，１８５，４４４；５，５２１，０６３；５，５０６，３３７号明細書、および、係属中の米国特許出願特願１２／２７１，０３６；１２／２７１，０４０号；ならびに、国際公開第２００９／０６４４７１号に詳述され、それらすべては、それらの全体が、参照により本願明細書に取り込まれる。典型的なＰＭＯとしては、前記サブユニット間リンケージがリンケージ（Ａ１）であるＰＭＯがあげられる。
「ＰＭＯ＋」は、以前に記載されている（例えば、その全体が参照により本願明細書に取り込まれる、国際公開第２００８／０３６１２７号を参照のこと）任意の数の、（１−ピペラジノ）ホスフィニリデンオキシ、（１−（４−（ω−グアニジノ−アルカノイル））−ピペラジノ）ホスフィニリデンオキシのリンケージ（Ａ２およびＡ３）を含む、ホスホロジアミダートモルホリノオリゴマーを意味する。
「ＰＭＯ−Ｘ」は、少なくとも１つのリンケージ（Ｂ）または少なくとも１つの開示された末端修飾を含む、本願明細書に開示されたホスホロジアミダートモルホリノオリゴマーを意味する。
「ホスホロアミダート」基は、３つの付着された酸素原子および１つの付着された窒素原子を有するリンを含む。一方、「ホスホロジアミダート」基（例えば、図１Ｄ〜Ｅを参照のこと）は、２つの付着された酸素原子および２つの付着された窒素原子を有するリンを含む。本願明細書、および、同時係属の米国特許出願特願６１／３４９，７８３および１１／８０１，８８５号に記載されている、前記オリゴマーの、荷電していないサブユニット間リンケージ、または、修飾されたサブユニット間リンケージにおいて、１つの窒素が、常に骨格鎖にぶら下がっている。ホスホロジアミダートリンケージにおける２番目の窒素は、典型的には、モルホリノ環構造における前記環窒素である。
「チオホスホロアミダート」または「チオホスホロジアミダート」のリンケージは、１つの酸素原子、典型的には、骨格にぶら下がった酸素が硫黄に置換されている、それぞれ、ホスホロアミダートまたはホスホロジアミダートのリンケージである。
「サブユニット間リンケージ」は、２つのモルホリノサブユニットを連結するリンケージ、例えば、構造（Ｉ）を意味する。
本願明細書で使用する場合、「荷電した」、「荷電していない」、「カチオン性」および「アニオン性」は、中性ｐＨ付近、例えば、約６から８において、化学部分の主な状態を意味する。例えば、前記用語は、生理学的ｐＨ、すなわち、約７．４における化学部分の主な状態を意味してもよい。
「低級アルキル」は、１から６個の炭素原子のアルキル基、例えば、メチル、エチル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、ｔ−ブチル、イソアミル、ｎ−ペンチルおよびイソペンチルを意味する。ある実施形態では、「低級アルキル」基は、１から４個の炭素原子を有する。他の実施形態では、「低級アルキル」基は、１から２個の炭素原子、すなわち、メチルまたはエチルを有する。同様に、「低級アルケニル」は、２から６個のアルケニル基を意味し、好ましくは、３または４個の炭素原子、例えば、アリルおよびブテニルを意味する。
「非干渉」置換基は、目的の標的に結合するための本願明細書に記載のアンチセンスオリゴマーの能力に悪影響を及ぼさないものである。このような置換基としては、小さくて、および／または、比較的に非極性の基、例えば、メチル、エチル、メトキシ、エトキシまたはフルオロがあげられる。
オリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴマーは、前記オリゴマーが生理学的条件下において、Ｔｍが３７℃より高く、４５℃より高く、好ましくは、少なくとも５０℃、および典型的には、６０℃〜８０℃以上で、標的にハイブリダイズする場合、標的ポリヌクレオチドに、「特異的にハイブリダイズする」。前記オリゴマーにおける「Ｔｍ」は、相補的なポリヌクレオチドに、５０％がハイブリダイズする温度である。Ｔｍは、例えば、Ｍｉｙａｄａら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：９４−１０７（１９８７）に記載のように、生理食塩水における標準的な条件下において決定される。このようなハイブリダイゼーションは、前記標的配列に対する、前記アンチセンスオリゴマーの「近似する」または「実質的な」相補、ならびに、正確な相補により起こり得る。
ポリヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションが、２本の一本鎖ポリヌクレオチド間で逆平衡の構成で起こる場合、互いに「相補的」であると記載される。相補性（１つのポリヌクレオチドがもう１つと相補的である度合い）は、一般的に認められた塩基対合規則に基づいて、互いに水素結合を形成することが予期される、反対鎖における塩基の割合の観点から定量化可能である。
第１の配列が第２のポリヌクレオチド配列と、生理学的条件下において特異的に結合する、または、特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドの配列である場合、第１の配列は、第２の配列に対する「アンチセンス配列」である。
「ターゲッティング配列」の用語は、ＲＮＡゲノムにおける前記標的配列に相補的である（さらに、実質的に相補的であることを意味する）、前記オリゴヌクレオチド類似体における配列である。前記類似体化合物の配列全体または一部のみが、前記標的配列に相補的でもよい。例えば、２０塩基を有する類似体において、１２〜１４個のみが、ターゲッティング配列でもよい。典型的に、前記ターゲッティング配列は、前記類似体において、連続した塩基で形成されるが、あるいは、前記標的配列に及ぶ構成配列が、例えば、前記類似体の反対側から位置する場合、非連続的な配列で形成されてもよい。
オリゴヌクレオチド類似体（例えば、荷電していないオリゴヌクレオチド類似体）の「骨格」は、前記塩基対合部分；例えば、本願明細書に記載のように、モルホリノオリゴマーを支持する構造を意味する。前記「骨格」は、サブユニット間リンケージ（例えば、リン含有リンケージ）により連結されるモルホリノ環構造を含む。「実質的に荷電していない骨格」は、５０％未満のサブユニット間リンケージが、中性付近のｐＨで荷電している、オリゴヌクレオチド類似体の骨格を意味する。例えば、実質的に荷電していない骨格は、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満またはさらに０％の、中性付近のｐＨで荷電しているサブユニット間リンケージを含んでもよい。一部の実施形態では、前記実質的に荷電していない骨格は、４つの（生理学的ｐＨで）荷電していないリンケージ毎に、多くても１つの（生理学的ｐＨで）荷電したサブユニット間リンケージ、８つの荷電していないリンケージ毎に多くても１つ、または、１６個の荷電していないリンケージ毎に多くても１つを含む。一部の実施形態では、本願明細書に記載の核酸類似体は、完全に荷電していない。
標的とターゲッティング配列は、ハイブリダイゼーションが逆平行の構成において起こる場合、互いに「相補的」であると記載される。ターゲティング配列は、前記標的配列に対して、「近似する」または「実質的な」相補性、および、目下記載された方法の目的の機能を有してもよく、すなわち「相補的」である。好ましくは、目下記載された方法に使用される前記オリゴヌクレオチド類似体化合物は、１０個のヌクレオチド毎に標的配列に対する多くても１つのミスマッチを有し、好ましくは、２０個から多くても１つのミスマッチを有する。または、使用される前記アンチセンスオリゴマーは、本願明細書で指定されるように、典型的なターゲッティング配列についての、少なくとも８０％、少なくとも９０％の配列相同性、または、少なくとも９５％の配列相同性を有する。ＲＮＡ標的に対する相補的結合の目的に関して、以下に記載のように、グアニン塩基は、シトシンまたはウラシルＲＮＡ塩基のいずれかに相補的でもよい。
「ヘテロ二本鎖」は、オリゴヌクレオチド類似体と標的ＲＮＡの相補的部分との間の二本鎖を意味する。「ヌクレアーゼ耐性ヘテロ二本鎖」は、前記ヘテロ二本鎖が、二本鎖ＲＮＡ／ＲＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡの複合体を切断可能な、細胞内および細胞外ヌクレアーゼ、例えば、ＲＮＡｓｅＨによる、ｉｎ ｖｉｖｏでの分解に対して、実質的に耐性であるように、アンチセンスオリゴマーをその相補的な標的に結合することにより形成されるヘテロ二本鎖を意味する。
薬剤が、細胞膜を通した受動拡散以外のメカニズムにより細胞に入り得る場合、「哺乳類の細胞により能動的に取り込まれる」。前記薬剤は、例えば、ＡＴＰ依存性輸送メカニズムにより、哺乳類の細胞膜を通して薬剤を輸送することを意味する「能動輸送」、または、輸送タンパク質への前記薬剤の結合を必要とし、次いで、前記膜を通して結合された薬剤の通過を促進する輸送メカニズムにより、前記細胞膜を通してアンチセンス剤を輸送することを意味する「促進輸送」により、薬剤が輸送されてもよい。
「発現を調節する」および／または「アンチセンス活性」の用語は、ＲＮＡの発現または翻訳を妨害することにより、所定のタンパク質の発現を向上または、より典型的には、低下させるかのいずれかのアンチセンスオリゴマーの能力を意味する。タンパク質の発現を低下させる場合では、前記アンチセンスオリゴマーは、所定の遺伝子の発現を直接妨害してもよいし、その遺伝子から転写されたＲＮＡの加速された分解に寄与してもよい。本願明細書で記載する時、モルホリノオリゴマーは、前者（立体妨害）のメカニズムを介して機能すると考えられる。好ましいアンチセンスは、ＡＴＧ開始コドン領域、スプライス部位、スプライス部位にごく近接する領域および、ｍＲＮＡの５’−非翻訳領域を含む立体妨害するオリゴマーを標的とするが、他の領域は、モルホリノオリゴマーを使用して、うまく標的にされている。
「アミノ酸サブユニット」は、一般的に、α−アミノ酸残基（−ＣＯ−ＣＨＲ−ＮＨ−）であるが、β−または他のアミノ酸残基（例えば、−ＣＯ−ＣＨ２ＣＨＲ−ＮＨ−）でもよく、Ｒは、アミノ酸側鎖である。
「天然に存在するアミノ酸」の用語は、天然に見出されるタンパク質に存在するアミノ酸を意味する。「非天然アミノ酸」の用語は、天然に見出されるタンパク質に存在しないそれらのアミノ酸を意味し、例えば、ベータ−アラニン（β−Ａｌａ）および６−アミノヘキサン酸（Ａｈｘ）があげられる。
「有効量」または「治療的に有効量」は、単回投与、または、一連の投与の一部のいずれかとして、哺乳類の被験体に投与され、典型的には、選択された標的核酸配列の翻訳を阻害することによる所望の治療効果を生じるのに有効な、アンチセンスオリゴマーの量を意味する。
個体（例えば、ヒト等の哺乳類）または細胞の「処置」は、前記個体または細胞の自然経過を変えるための試みに使用される、任意の種類の治療介入である。処置としては、制限されず、薬学的組成物の投与があげられ、予防的にまたは、病的な事象の始まりもしくは病原体との接触後のいずれかで行われてもよい。
ＩＩ．キャリアペプチド
Ａ．前記キャリアペプチドの特性
前述のように、本開示は、キャリアペプチドと核酸類似体とのコンジュゲートに関する。前記キャリアペプチドは、一般的に、前記核酸類似体の細胞浸透を向上するのに効果的である。さらに、本願出願人は、驚くべきことに、前記核酸類似体と前記キャリアペプチドの（例えば、前記キャリアペプチドのカルボキシ末端またはアミノ末端における）残部との間に、グリシン（Ｇ）またはプロリン（Ｐ）アミノ酸サブユニットを含むことが、前記キャリアペプチドと核酸類似体との間に、異なるリンケージを有するコンジュゲートと比較して、前記有効性が同等か、または向上されながら、前記コンジュゲートの毒性を低下させることを発見した。このため、本開示のコンジュゲートは、他のペプチド−オリゴマーコンジュゲートより、良好な治療的手段を有し、薬剤候補としての見込みがある。
毒性低減に加えて、前記核酸類似体と前記キャリアペプチドとの間のグリシンまたはプロリンアミノ酸サブユニットの存在が、更なる利点を提供するものと考えられる。例えば、グリシンは、安価であり、ラセミ化の可能性なしに、前記核酸類似体（または、必要に応じたリンカー）に容易に連結される。同様に、プロリンは、ラセミ化なしに容易に連結され、へリックス形成剤でないキャリアペプチドも提供する。プロリンの疎水性は、前記キャリアペプチドと細胞の脂質二重層との相互作用についての、特定の利点を有してもよく、（例えば、ある実施形態では、）複数のプロリンを含むキャリアペプチドは、Ｇ四重体形成に抵抗してもよい。最後に、ある実施形態では、前記プロリン部分が、アルギニンアミノ酸サブユニットに隣接する場合、前記プロリン部分は、アルギニン−プロリンのアミド結合が、一般的なエンドペプチダーゼにより切断できないため、前記コンジュゲートに代謝性を付与する。
前述のように、グリシンまたはプロリンアミノ酸サブユニットを介して核酸類似体に結合されたキャリアペプチドを含むコンジュゲートは、他の既知のコンジュゲートと比較して、より低い毒性と同等の有効性を有する。本出願のサポートにおいて行われた実験は、他のコンジュゲートと比較して、本開示のコンジュゲートにより、腎毒性マーカーが非常に低いことを示す（例えば、実施例３０に記載される、腎傷害マーカー（ＫＩＭ）および血中尿素窒素（ＢＵＮ）のデータを参照のこと）。理論に拘束される訳ではないが、本発明者は、本開示のコンジュゲートの低減された毒性は、前記核酸類似体に付着されるペプチドの部分（例えば、カルボキシ末端）に、非天然のアミノ酸、例えば、アミノヘキサン酸またはβ−アラニンが存在しないことに関連すると考えている。これらの非天然のアミノ酸は、ｉｎ ｖｉｖｏで切断されないため、切断されないペプチドの毒性濃度が蓄積し、毒性を引き起こし得ると考えられる。
前記グリシンまたはプロリン部分は、前記キャリアペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれでもよく、一部の例では、前記キャリアペプチドは、前記グリシンまたはプロリンサブユニットを介して、前記核酸類似体に直接結合されてもよいし、または、前記キャリアペプチドは、必要に応じたリンカーを介して前記核酸類似体に結合されてもよい。
一実施形態では、本開示は、
（ａ）アミノ酸サブユニットを含むキャリアペプチド；および、
（ｂ）実質的に荷電していない骨格および、標的核酸に対する配列特異的結合用のターゲッティング塩基配列を含む核酸類似体；を含み、
２つ以上の前記アミノ酸サブユニットが、正電荷を有するアミノ酸であり、前記キャリアペプチドが、前記キャリアペプチドのカルボキシ末端に、グリシン（Ｇ）またはプロリン（Ｐ）アミノ酸サブユニットを含み、前記キャリアペプチドが、前記核酸類似体に共有結合している、コンジュゲートに関する。一部の実施形態では、７個以下連続したアミノ酸サブユニットが、アルギニンであり、例えば、６個以下連続したアミノ酸サブユニットが、アルギニンである。一部の実施形態では、前記キャリアペプチドは、前記カルボキシ末端に、グリシンアミノ酸サブユニットを含む。他の実施形態では、前記キャリアペプチドは、前記カルボキシ末端に、プロリンアミノ酸サブユニットを含む。さらに他の実施形態では、前記キャリアペプチドは、前記カルボキシ末端に、単一のグリシンまたはプロリンを含む（すなわち、前記カルボキシ末端に、グリシンまたはプロリンの二量体または三量体等を含まない）。
ある実施形態では、（ｉ）前記アンチセンスオリゴマーのその標的配列への結合が、前記コードされるタンパク質用の翻訳開始コドンを妨害するのに有効な場合に、コンジュゲートされていないオリゴマーにより提供されたそれと比較して、コードされたタンパク質の発現における減少、または、
（ｉｉ）前記アンチセンスオリゴマーのその標的配列への結合が、正確にスプライシングされた、前記タンパク質をコードするプレ−ｍＲＮＡにおける異常なスプライス部位を妨害するのに有効な場合に、コンジュゲートされていないオリゴマーにより提供されたそれと比較して、コードされたタンパク質の発現における増加、からも明らかなように、実質的に荷電していない骨格を有するアンチセンスオリゴマーにコンジュゲートされた場合、前記キャリアペプチドは、コンジュゲートされていない状態でのアンチセンスオリゴマーと比較して、その標的配列へのアンチセンスオリゴマーの結合を向上するのに有効である。これらの効果の測定に適したアッセイは、以下にさらに記載される。一実施形態では、前記ペプチドの接合は、本願明細書で記載する時、無細胞翻訳アッセイにおけるこの活性を提供する。一部の実施形態では、活性は、少なくとも２つの因子、少なくとも５つの因子または少なくとも１０個の因子により向上される。
もう１つの方法として、またはさらに、前記キャリアペプチドは、コンジュゲートされていない状態の類似体と比較して、細胞内への前記核酸類似体の輸送を向上するのに効果的である。ある実施形態では、輸送は、少なくとも２つの因子、少なくとも２つの因子、少なくとも５つの因子または少なくとも１０個の因子により向上される。
他の実施形態では、前記キャリアペプチドは、末端グリシンまたはプロリンアミノサブユニットを欠いたキャリアペプチドを含むコンジュゲートと比較して、前記コンジュゲートの毒性を低減する（すなわち、最大耐性用量が増加する）のに有効である。ある実施形態では、毒性は、少なくとも２つの因子、少なくとも２つの因子、少なくとも５つの因子または少なくとも１０個の因子により低減される。
前記ペプチド輸送部分の更なる利点は、アンチセンスオリゴマーとその標的核酸配列との間の二本鎖を安定化するための、その予期された能力である。理論に拘束される訳ではないが、二本鎖を安定化するこの能力は、正電荷を有する輸送部分と負電荷を有する核酸との間の静電相互作用に起因し得る。
前記キャリアペプチドの長さは、特に制限されず、種々の実施形態で変化する。一部の実施形態では、前記キャリアペプチドは、４から４０個のアミノ酸サブユニットを含む。他の実施形態では、前記キャリアペプチドは、６から３０個、６から２０個、８から２５個または１０から２０個のアミノ酸サブユニットを含む。一部の実施形態では、前記キャリアペプチドは、直鎖状であり、一方、他の実施形態では、前記キャリアペプチドは、分岐鎖状である。
一部の実施形態では、前記キャリアペプチドは、正電荷を有するアミノ酸サブユニット、例えば、アルギニンアミノ酸サブユニットリッチである。少なくとも１０％のアミノ酸サブユニットが正電荷を有する場合、キャリアペプチドは、正電荷を有するアミノ酸「リッチ」である。例えば、一部の実施形態では、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％のアミノ酸サブユニットが、正電荷を有する。さらに他の実施形態では、グリシンまたはプロリンアミノ酸サブユニットを除くすべてのアミノ酸サブユニットが、正電荷を有する。さらに他の実施形態では、前記正電荷を有するアミノ酸サブユニットの全てが、アルギニンである。
他の実施形態では、前記キャリアペプチドにおける正電荷を有するアミノ酸サブユニットの数は、１から２０個、例えば、１から１０個または１から６個の範囲である。ある実施形態では、前記キャリアペプチドにおける正電荷を有するアミノ酸サブユニットの数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個である。
前記正電荷を有するアミノ酸は、天然に存在するアミノ酸、天然に存在しないアミノ酸、合成アミノ酸、修飾アミノ酸または天然アミノ酸の類似体であり得る。例えば、正味の正電荷を有する修飾アミノ酸は、以下により詳細に記載するように、本発明に使用するために特別に設計されてもよい。アミノ酸に対する、多くの種々の種類の修飾が、当該分野において周知である。ある実施形態では、前記正電荷を有するアミノ酸は、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）である。他の実施形態では、前記キャリアペプチドは、天然のアミノ酸サブユニットのみを含む（すなわち、非天然のアミノ酸を含まない）。他の実施形態では、前記末端アミノ酸は、例えば、アセチル、ベンゾイル、ステアリル部分により、例えば、Ｎ末端でキャップされてもよい。
任意の数、組み合わせおよび／または配列の、Ｈ、Ｋおよび／またはＲが、前記キャリアペプチドに存在し得る。一部の実施形態では、前記カルボキシ末端のグリシンまたはプロリン以外の、全てのアミノ酸サブユニットが、正電荷を有するアミノ酸である。他の実施形態では、前記正電荷を有するアミノ酸のうちの少なくとも１個が、アルギニンである。例えば、一部の実施形態では、正電荷を有するアミノ酸の全てが、アルギニンであり、さらに他の実施形態では、前記キャリアペプチドは、アルギニンと前記カルボキシ末端のグリシンまたはプロリンとからなる。さらに他の実施形態では、前記キャリアペプチドは、７つ以下連続したアルギニン、例えば、６個以下連続したアルギニンを含む。
他の種類の正電荷を有するアミノ酸も、想定される。例えば、ある実施形態では、前記正電荷を有するアミノ酸のうちの少なくとも１個は、アルギニン類似体である。例えば、前記アルギニン類似体は、構造ＲａＮ＝Ｃ（ＮＨ２）Ｒｂ（ここで、ＲａがＨまたはＲｃであり；ＲｂがＲｃ、ＮＨ２、ＮＨＲまたはＮ（Ｒｃ）２であり、Ｒｃが低級アルキルまたは低級アルケニルであり、および、場合により、酸素または窒素を含み、または、ＲａおよびＲｂが、共に環を形成する）の側鎖を含むカチオン性α−アミノ酸でもよく、前記側鎖は、ＲａまたはＲｂを介して前記アミノ酸に結合される。前記キャリアペプチドは、任意の数のこれらのアルギニン類似体を含んでもよい。
前記正電荷を有するアミノ酸は、前記キャリアペプチド内の任意の配列に生じてもよい。例えば、一部の実施形態では、前記正電荷を有するアミノ酸は、交互でもよいし、または、連続でもよい。例えば、前記キャリアペプチドは、配列（Ｒｄ）ｍを含んでもよく、Ｒｄは、各出現箇所で独立して、正電荷を有するアミノ酸であり、ｍが、２から１２、２から１０、２から８または２から６の範囲の整数である。例えば、ある実施形態では、Ｒｄは、アルギニンであり、前記キャリアペプチドは、（Ｒ）４、（Ｒ）５、（Ｒ）６、（Ｒ）７および（Ｒ）８から選択され、または、（Ｒ）４、（Ｒ）５、（Ｒ）６および（Ｒ）７から選択される配列を含む。例えば、特定の実施形態では、前記キャリアペプチドは、配列（Ｒ）６、例えば、（Ｒ）６Ｇまたは（Ｒ）６Ｐを含む。
他の実施形態では、前記キャリアペプチドは、配列（Ｒｄ）ｍと、前記カルボキシ末端のグリシンまたはプロリンとからなり、Ｒｄは、各出現箇所で独立して、正電荷を有するアミノ酸であり、ｍが、２から１２、２から１０、２から８または２から６の範囲の整数である。ある実施形態では、Ｒｄは、各出現箇所で独立して、アルギニン、ヒスチジンまたはリジンである。例えば、ある実施形態では、Ｒｄは、アルギニンであり、前記キャリアペプチドは、（Ｒ）４、（Ｒ）５、（Ｒ）６、（Ｒ）７および（Ｒ）８から選択される配列と、前記カルボキシ末端のグリシンまたはプロリンとからなる。例えば、特定の実施形態では、前記キャリアペプチドは、配列（Ｒ）６Ｇまたは（Ｒ）６Ｐからなる。
一部の他の実施形態では、前記キャリアペプチドは、１つ以上の疎水性アミノ酸サブユニットを含んでもよい。前記疎水性アミノ酸サブユニットは、置換または非置換のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリールまたはアラルキルの側鎖を含み、前記アルキル、アルケニルおよびアルキニルの側鎖は、６つの炭素原子酸毎に、多くても１つのヘテロ原子を含む。一部の実施形態では、前記疎水性アミノ酸は、フェニルアラニン（Ｆ）である。例えば、前記キャリアペプチドは、２個以上連続した疎水性アミノ酸、例えば、フェニルアラニン（Ｆ）、例えば、２個連続したフェニルアラニン部分を含んでもよい。前記疎水性アミノ酸は、前記キャリアペプチド配列における任意の箇所に存在し得る。
他の実施形態では、前記キャリアペプチドは、配列［（ＲｄＹｂＲｄ）ｘ（ＲｄＲｄＹｂ）ｙ］ｚまたは［（ＲｄＲｄＹｂ）ｙ（ＲｄＹｂＲｄ）ｘ］ｚを含み、Ｒｄは、各出現箇所で独立して、正電荷を有するアミノ酸であり、ｘおよびｙは、各出現箇所で独立して、０または１であり、ｘ＋ｙは、１または２であることが提供され、ｚは、１、２、３、４、５または６であり、および、Ｙｂは、
Figure 0006884250
であり、
式中、ｎは、２から７であり、各Ｒｅは、各出現箇所で独立して、水素またはメチルである。一部のこれらの実施形態では、Ｒｄは、各出現箇所で独立して、アルギニン、ヒスチジンまたはリジンである。他の実施形態では、各Ｒｄは、アルギニンである。他の実施形態では、ｎは５であり、Ｙｂは、アミノヘキサン酸部分である。他の実施形態では、ｎは２であり、Ｙｂは、β−アラニン部分である。さらに他の実施形態では、Ｒｅは、水素である。
前述のある実施形態では、ｘは１であり、ｙは０であり、前記キャリアペプチドは、配列（ＲｄＹｂＲｄ）ｚを含む。他の実施形態では、ｎは５であり、Ｙｂは、アミノヘキサン酸部分である。他の実施形態では、ｎは２であり、Ｙｂは、β−アラニン部分である。さらに他の実施形態では、Ｒｅは、水素である。
前述のさらに他の実施形態では、ｘは０であり、ｙは１であり、前記キャリアペプチドは、配列（ＲｄＲｄＹｂ）ｚを含む。他の実施形態では、ｎは５であり、Ｙｂは、アミノヘキサン酸部分である。他の実施形態では、ｎは２であり、Ｙｂは、β−アラニン部分である。さらに他の実施形態では、Ｒｅは、水素である。
他の実施形態では、前記キャリアペプチドは、配列（ＲｄＹｂ）ｐを含む。ＲｄおよびＹｂは、上記定義のとおりであり、ｐは、２から８の範囲の整数である。他の実施形態では、各Ｒｄは、アルギニンである。他の実施形態では、ｎは５であり、Ｙｂは、アミノヘキサン酸部分である。他の実施形態では、ｎは２であり、Ｙｂは、β−アラニン部分である。さらに他の実施形態では、Ｒｅは、水素である。
他の実施形態では、前記キャリアペプチドは、配列ＩＬＦＱＹを含む。前記ペプチドは、ＩＬＦＱＹ配列に加えて、本願明細書に開示の任意の他の配列を含んでもよい。例えば、前記キャリアペプチドは、ＩＬＦＱＹおよび、［（ＲｄＹｂＲｄ）ｘ（ＲｄＲｄＹｂ）ｙ］ｚ、［（ＲｄＲｄＹｂ）ｙ（ＲｄＹｂＲｄ）ｘ］ｚ、（ＲｄＹｂ）ｐまたはそれらの組み合わせを含んでもよく、Ｒｄ、ｘ、ｙおよびＹｂは、上記定義のとおりである。前記［（ＲｄＹｂＲｄ）ｘ（ＲｄＲｄＹｂ）ｙ］ｚ、［（ＲｄＲｄＹｂ）ｙ（ＲｄＹｂＲｄ）ｘ］ｚまたは（ＲｄＹｂ）ｐの配列は、前記ＩＬＦＱＹ配列のアミノ末端、カルボキシ末端または両方に存在してもよい。ある実施形態では、ｘは１であり、ｙは０であり、前記キャリアペプチドは、任意のＺリンカーを介して、前記ＩＬＦＱＹ配列に結合される（ＲｄＹｂＲｄ）ｚを含む。
他の関連する実施形態では、前記キャリアペプチドは、配列ＩＬＦＱ、ＩＷＦＱまたはＩＬＩＱを含む。他の実施形態は、配列ＰＰＭＷＳ、ＰＰＭＷＴ、ＰＰＭＦＳまたはＰＰＭＹＳを含むキャリアペプチドを含む。前記キャリアペプチドは、これらの配列に加えて、本願明細書に記載の任意の他の配列、例えば、さらに、配列［（ＲｄＹｂＲｄ）ｘ（ＲｄＲｄＹｂ）ｙ］ｚ、［（ＲｄＲｄＹｂ）ｙ（ＲｄＹｂＲｄ）ｘ］ｚ、または（ＲｄＹｂ）ｐを含んでもよく、Ｒｄ、ｘ、ｙおよびＹｂは、上記定義のとおりである。
前記キャリアペプチドの一部の実施形態では、天然に存在するアミノ酸サブユニットに対する修飾を有し、例えば、前記アミノ末端またはカルボキシ末端のアミノ酸サブユニットが、修飾され得る。このような修飾としては、結合していないアミノまたは結合していないカルボキシを、疎水性基でキャップすることを含む。例えば、前記アミノ末端は、アセチル、ベンゾイルまたはステアロイル部分によりキャップされてもよい。例えば、表１における任意のペプチド配列が、前記表において特別に示されていなくても、このような修飾を有し得る。これらの実施形態では、前記キャリアペプチドのアミノ末端は、下記のように示され得る。
Figure 0006884250
さらに他の実施形態では、前記キャリアペプチドは、アラニン、アスパラギン、システイン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、リジン、メチオニン、セリンまたはスレオニンのうちの少なくとも１つを含む。
本願明細書に開示の一部の実施形態では、前記キャリアペプチドは、上記の配列と、前記カルボキシ末端のグリシンまたはプロリンアミノ酸サブユニットとからなる。
一部の実施形態では、前記キャリアペプチドは、下記の配列（アミノ末端からカルボキシ末端）：Ｒ６Ｇ、Ｒ７Ｇ、Ｒ８Ｇ、Ｒ５ＧＲ４Ｇ、Ｒ５Ｆ２Ｒ４Ｇ、Ｔａｔ−Ｇ、ｒＴａｔ−Ｇ、（ＲＸＲ２Ｇ２）２または（ＲＸＲ３Ｘ）２Ｇを構成しない。さらに他の実施形態では、前記キャリアペプチドは、Ｒ８Ｇ、Ｒ９ＧまたはＲ９Ｆ２Ｇを構成しない。さらに他の実施形態では、前記キャリアペプチドは、下記の配列：Ｔａｔ−Ｇ、ｒＴａｔ−Ｇ、Ｒ９Ｆ２Ｇ、Ｒ５Ｆ２Ｒ４、Ｒ４Ｇ、Ｒ５Ｇ、Ｒ６Ｇ、Ｒ７Ｇ、Ｒ８Ｇ、Ｒ９Ｇ、（ＲＸＲ）４Ｇ、（ＲＸＲ）５Ｇ、（ＲＸＲＲＢＲ）２Ｇ、（ＲＡＲ）４Ｆ２または（ＲＧＲ）４Ｆ２を構成しない。他の実施形態では、前記キャリアペプチドは、「ペネトラチン」または「Ｒ６Ｐｅｎ」を構成しない。
もう１つの態様では、本開示は、
実質的に荷電していない骨格およびターゲッティング塩基配列を有する核酸類似体、および、
前記核酸類似体に共有結合され、前記カルボキシ末端のグリシンまたはプロリンのアミノ酸サブユニットを含み、Ｒｄサブユニット、Ｙサブユニットおよび任意のＺサブユニットから選択される、８から１６個の更なる他のサブユニットからなり、少なくとも８つのＲｄサブユニット、少なくとも２つのＹサブユニットおよび、多くても３つのＺサブユニットを含み、前記サブユニットの＞５０％が、Ｒｄサブユニットである、ペプチドを含み、
（ａ）各Ｒｄサブユニットは、独立して、アルギニンまたはアルギニン類似体で表わされ、前記アルギニン類似体が、構造ＲａＮ＝Ｃ（ＮＨ２）Ｒｂ（ここで、ＲａがＨまたはＲｃであり；ＲｂがＲｃ、ＮＨ２、ＮＨＲまたはＮ（Ｒｃ）２であり、Ｒｃが低級アルキルまたは低級アルケニルであり、および、場合により、酸素または窒素を含み、または、ＲａおよびＲｂが、共に環を形成する）の側鎖を含むカチオン性α−アミノ酸であり、前記側鎖は、ＲａまたはＲｂを介してアミノ酸に結合され、
（ｂ）前記少なくとも２つのＹサブユニットは、ＹａまたはＹｂであり、
（ｉ）各Ｙａは、独立して、置換または非置換のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリールおよびアラルキルから独立して選択される側鎖を有する、中性のα−アミノ酸サブユニットであり、置換されたアルキル、アルケニルおよびアルキニルから選択された場合、前記側鎖は、２つ毎、好ましくは４つ毎、およびより好ましくは、６つの炭素原子毎に多くても１つのヘテロ原子を含み、前記サブユニットは、連続的であるか、または、リンカー部分に隣接しており、および、
（ｉｉ）Ｙｂは、
Figure 0006884250
であり、式中、ｎは、２から７であり、各Ｒｅは、各出現箇所で独立して、水素またはメチルであり、
（ｃ）Ｚは、アラニン、アスパラギン、システイン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、リジン、メチオニン、セリン、スレオニンおよび、生理学的ｐＨで負に荷電している側鎖（例えば、カルボキシレート側鎖）を除く、天然に存在する側鎖の１つまたは２つの炭素同族体である側鎖を有するアミノ酸から選択されるアミノ酸サブユニットを表わす、ペプチド−核酸類似体コンジュゲートを提供する。一部の実施形態では、前記側鎖は、中性である。他の実施形態では、前記Ｚ側鎖は、天然に存在するアミノ酸の側鎖である。一部の実施形態では、前記任意のＺサブユニットは、アラニン、グリシン、メチオニン、セリンおよびスレオニンから選択される。前記キャリアペプチドは、０、１、２または３つのＺサブユニットを含んでもよく、一部の実施形態では、多くても２つのＺサブユニットを含む。
選択された実施形態では、前記キャリアペプチドは、Ｙａ型のＹサブユニットを、正確に２つ有する。前記Ｙサブユニットは、連続しているか、または、システインサブユニットに隣接している。一部の実施形態では、前記２つのＹａサブユニットは、連続している。他の実施形態では、Ｙａサブユニットについての側鎖は、生理学的ｐＨで荷電している側鎖を除く、天然に存在するアミノ酸の側鎖、および、それらの１つまたは２つの炭素同族体を含む。他の可能性のある側鎖は、天然に存在するアミノ酸の側鎖である。更なる実施形態では、前記側鎖は、アリールまたはアラルキルの側鎖であり、例えば、各Ｙａは、独立して、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、ロイシン、イソロイシンおよびバリンから選択されてもよい。
選択された実施形態では、各Ｙａは、独立して、フェニルアラニンおよびチロシンから選択される。更なる実施形態では、各Ｙａは、フェニルアラニンである。これにより、例えば、アルギニンサブユニット、フェニルアラニンサブユニット、前記グリシンまたはプロリンアミノ酸サブユニット、必要に応じたリンカー部分および核酸類似体からなるコンジュゲートが含まれる。１つのこのようなコンジュゲートは、式Ａｒｇ９Ｐｈｅ２ａａを有するペプチドを含み、ａａは、グリシンまたはプロリンである。
前述のキャリアペプチドは、ＩＬＦＱＹ、ＩＬＦＱ、ＩＷＦＱまたはＩＬＩＱを含んでもよい。他の実施形態は、前記配列ＰＰＭＷＳ、ＰＰＭＷＴ、ＰＰＭＦＳまたはＰＰＭＹＳを含む、前述のキャリアペプチドを含む
本発明のペプチド−オリゴマーコンジュゲートは、コンジュゲートしていないオリゴマーより、無細胞翻訳系を含むタンパク質発現系における標的のｍＲＮＡの発現阻害；標的のプレ−ｍＲＮＡのスプライシング阻害；および、ウイルスの核酸複製またはｍＲＮＡ転写を制御するシス作用性要素を標的とすることにより、ウイルスの複製を阻害することを含む、種々の機能において効果的である。
他の薬物（すなわち、核酸類似体でない）と、前記キャリアペプチドとのコンジュゲートも、本発明のスコープ内に含まれる。具体的には、一部の実施形態は、
（ａ）アミノ酸サブユニットを含むキャリアペプチド；および
（ｂ）薬物；を含み、
２つ以上の前記アミノ酸サブユニットが、正電荷を有するアミノ酸であり、前記キャリアペプチドが、前記キャリアペプチドのカルボキシ末端に、グリシン（Ｇ）またはプロリン（Ｐ）アミノ酸サブユニットを含み、前記キャリアペプチドが、前記薬物に共有結合しているコンジュゲートを提供する。これらの実施形態における前記キャリアペプチドは、本願明細書に記載の任意のキャリアペプチドでもよい。前記薬物を前記キャリアペプチドにコンジュゲートすることにより、前記薬物を送達するための方法も提供される。
送達される前記薬物は、生物学的に活性な薬剤、例えば、治療剤または診断剤でもよく、前記薬物は、検出に使用される化合物、例えば、蛍光化合物でもよい。生物学的に活性な薬剤としては、生体分子、例えば、ペプチド、タンパク質、糖類または核酸、特にアンチセンスオリゴヌクレオチド、または、「小分子」の有機もしくは無機の化合物から選択される原薬があげられる。「小分子」化合物は、前述の生体分子ではない、有機、無機または有機金属の化合物として、幅広く規定されてもよい。典型的には、このような化合物は、１０００未満、一実施形態では、５００未満の分子量を有する。
一実施形態では、送達される前記薬物は、単一のアミノ酸、ジペプチドまたはトリペプチドを含まないと考えられる。別の実施形態では、送達される前記薬物は、短いオリゴペプチド；すなわち、６つ以下のアミノ酸サブユニットを有するオリゴペプチドを含まない。更なる実施形態では、送達される前記薬物は、より長いオリゴペプチド；すなわち、７個と２０個との間のアミノ酸サブユニットを有するオリゴペプチドを含まない。更なる実施形態では、送達される前記薬物は、２０個より多いアミノ酸サブユニットを有するポリペプチドまたはタンパク質を含まない。
前記キャリアペプチドは、コンジュゲートされていない状態での前記薬物と比較して、細胞内への前記薬物の輸送を向上するのに効果的であり、および／または、グリシンまたはプロリンサブユニットを欠いている相当するペプチドにコンジュゲートされた前記薬物と比較して、より低い毒性を有する。一部の実施形態では、輸送は、少なくとも２つ、少なくとも５つまたは少なくとも１０個の因子により向上される。他の実施形態では、毒性は、少なくとも２つ、少なくとも５つまたは少なくとも１０個の因子により低減される（すなわち、最大耐性用量が増加される）。
Ｂ．ペプチドリンカー
前記キャリアペプチドは、当業者に利用可能な各種の方法により、送達される前記薬剤（例えば、核酸類似体、薬物等）に結合され得る。一部の実施形態では、前記キャリアペプチドは、介在リンカーなしに、前記核酸類似体に直接結合される。この点で、末端アミノ酸と、前記核酸類似体上の結合していないカルボキシルの結合していないアミンとの間のアミド結合の形成は、前記コンジュゲートの形成に有用であり得る。ある実施形態では、前記カルボキシ末端のグリシンまたはプロリンサブユニットは、前記核酸類似体の３’端に、直接結合される。例えば、前記キャリアペプチドは、前記カルボキシ末端のグリシンまたはプロリン部分と、３’モルホリノ環窒素との間にアミド結合を形成することにより、結合されてもよい（例えば、図１Ｃを参照のこと）。
一部の実施形態では、前記核酸類似体は、ＹａまたはＹｂサブユニット、システインサブユニットおよび、荷電していない非アミノ酸リンカー部分から選択されるリンカー部分を介して、前記キャリアペプチドにコンジュゲートされる。他の実施形態では、前記核酸類似体は、前記キャリアペプチドに、前記グリシンまたはプロリン部分を介して、前記核酸類似体の５’端または３’端のいずれかに直接結合される。一部の実施形態では、前記キャリアペプチドは、前記グリシンまたはプロリンアミノ酸サブユニットを介して、前記核酸類似体の３’に、直接結合され、例えば、アミド結合を介して、３’モルホリノ窒素に直接結合される。
他の実施形態では、前記コンジュゲートは、前記末端グリシンまたはプロリンアミノ酸サブユニット間に、結合部分を含む。一部の実施形態では、前記リンカーは、アルキル、ヒドロキシル、アルコキシ、アルキルアミノ、アミド、エステル、カルボニル、カルバマート、ホスホロジアミダート、ホスホロアミダート、ホスホロチオアートおよびホスホジエステルから選択される結合を含む、長さ１８原子以下である。ある実施形態では、前記リンカーは、ホスホロジアミダートおよびピペラジン結合を含む。例えば、一部の実施形態では、前記リンカーは、下記構造（ＸＸＩＸ）：
Figure 0006884250
を有し、ここで、Ｒ２４は存在しないか、ＨまたはＣ１−Ｃ６アルキルである。ある実施形態では、Ｒ２４は存在せず、他の実施形態では、構造（ＸＸＩＸ）は、核酸類似体（例えば、モルホリノオリゴマー）の５’端を、前記キャリアペプチドに結合する（例えば、図１Ｂを参照のこと）。
一部の実施形態では、前記Ｒｄサブユニットの側鎖部分は、独立して、グアニジル（ＨＮ＝Ｃ（ＮＨ２）ＮＨ−）、アミジニル（ＨＮ＝Ｃ（ＮＨ２）Ｃ＜）、２−アミノジヒドロピリミジル、２−アミノテトラヒドロピリミジル、２−アミノピリジルおよび２−アミノピリミジルから選択される。
複数のキャリアペプチドは、必要に応じて、単一の化合物に付着され得る。または、複数の化合物は、単一の輸送体にコンジュゲートされ得る。前記キャリアペプチドと前記核酸類似体との間の前記リンカーは、天然のアミノ酸または非天然のアミノ酸（例えば、６−アミノヘキサン酸またはβ−アラニン）から構成されてもよい。前記リンカーは、前記輸送体ペプチドのカルボキシ末端と、前記核酸類似体のアミンまたはヒドロキシ基（例えば、３’モルホリノ窒素または５’ＯＨ）との間に、例えば、カルボジイミドにより促進された縮合により形成された、直接結合を含んでもよい。
一般的に、前記リンカーは、前記コンジュゲートの輸送または機能を妨害しない、任意の非反応性部分を含んでもよい。リンカーは、例えば、エーテル、チオエーテル、アミドまたはカルバマート結合を含む、通常の使用条件下において、非開裂性であるものから選択され得る。他の実施形態では、前記リンカーは、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて開裂可能な、前記キャリアペプチドと化合物（例えば、オリゴヌクレオチド類似体、薬物等）との間のリンケージを含むことが望まれる。ｉｎ ｖｉｖｏにおいて開裂可能な結合は、当該分野において公知であり、例えば、酵素的に加水分解されるカルボン酸エステル、および、グルタチオンの存在下において開裂されるジスルフィドがあげられる。適切な波長の放射の適用により、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、光分解で開裂可能なリンケージ、例えば、オルト−ニトロフェニルエーテルを、開裂するのに適していてもよい。開裂性のジスルフィド基をさらに含む、典型的なヘテロ二機能性結合剤としては、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル ３−［（４−アジドフェニル）ジチオ］プロピオネートおよび、Ｖａｎｉｎ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ Ｊｉ，Ｔ．Ｈ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０：６７５４−６７６０（１９８１）に記載の他のものがあげられる。
Ｃ．典型的なキャリアペプチド
典型的なキャリアペプチドの配列およびオリゴヌクレオチド配列の表が、以下の表１に提供される。一部の実施形態では、本開示は、ペプチドオリゴマーコンジュゲートを提供し、前記ペプチドは、表１における前記ペプチド配列のいずれか１つを含むか、または、前記いずれか１つからなる。もう１つの実施形態では、前記核酸類似体は、表１における前記オリゴヌクレオチド配列のいずれかを含むか、または、前記いずれかからなる。さらに他の実施形態では、本開示は、ペプチドオリゴマーコンジュゲートを提供し、前記ペプチドは、表１における前記ペプチド配列のいずれか１つを含むか、または、前記いずれか１つからなり、前記核酸類似体は、表１における前記オリゴヌクレオチド配列のいずれかを含むか、または、前記いずれかからなる。他の実施形態では、本開示は、表１における前記配列のいずれか１つを含むか、または、前記いずれか１つからなるペプチドを提供する。
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ａａ＝グリシンまたはプロリン；Ｂ＝β−アラニン；Ｘ＝６−アミノヘキサン酸；ｔｇ＝非修飾アミノ末端または、アセチル、ベンゾイルもしくはステアロイルの基によりキャップされたアミノ末端（すなわち、アセチルアミド、ベンゾイルアミドまたはステアロイルアミド）、ならびに、Ｙｂは、−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨＲｅ）ｎ−ＮＨ−であり、ｎは、２から７であり、各Ｒｅは、各出現箇所で独立して、水素またはメチルである。分かりやすくするために、全ての配列が、末端ｔｇ基を有することに言及しているわけではない。ただし、上記各配列は、非修飾アミノ末端または、アセチル、ベンゾイルもしくはステアロイルの基によりキャップされたアミノ末端を含んでもよい。
ＩＩＩ．アンチセンスオリゴマー
本発明のコンジュゲートに含まれる核酸類似体は、ポリヌクレオチドの標的配列に、塩基特異的に結合可能な、実質的に荷電していない合成オリゴマー、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド類似体である。このような類似体としては、例えば、メチルホスホネート、ペプチド核酸、実質的に荷電していないＮ３’→Ｐ５’ホスホロアミダートおよびモルホリノオリゴマーがあげられる。
類似体骨格により支持された塩基対合基により提供される、前記核酸類似体の塩基配列は、任意の配列とすることができ、前記支持された塩基対合基としては、標準もしくは修飾されたＡ、Ｔ、Ｃ、ＧおよびＵの塩基、または、非標準的なイノシン（Ｉ）および７−デアザ−Ｇ塩基があげられる。
一部の実施形態では、前記核酸類似体は、モルホリノオリゴマー、すなわち、図１に示される型のモルホリノサブユニット構造で構成されるオリゴヌクレオチド類似体である。（ｉ）前記構造は、長さ１〜３原子、好ましくは長さ２原子のリン含有リンケージが、１つのサブユニットの前記モルホリノ窒素を、隣接するサブユニットの５’環外炭素に結合することにより、互いに結合される。（ｉｉ）ＰｉおよびＰｊは、塩基特異的な水素結合により、ポリヌクレオチドにおける塩基に結合するのに効果的な、プリンまたはピリミジンの塩基対合部分である。前記プリンまたはピリミジンの塩基対合部分は、典型的に、アデニン、シトシン、グアニン、ウラシルまたはチミンである。前記モルホリノオリゴマーの合成、構造および結合特性は、以下でさらに記載され、米国特許第５，６９８，６８５、５，２１７，８６６、５，１４２，０４７、５，０３４，５０６、５，１６６，３１５、５，５２１，０６３および５，５０６，３３７号明細書に詳述されており、それらの全てが参照により本願明細書に取り込まれる。
前記モルホリノベースのオリゴマーの所望の化学的特性としては、８〜１４塩基の短さのオリゴマーでさえ高いＴｍを有する標的ＲＮＡを含む、相補的塩基標的核酸と選択的にハイブリダイズする能力、哺乳類の細胞内に能動的に輸送される能力、および、ＲＮＡｓｅ分解に耐性を有するオリゴマー：ＲＮＡヘテロ二本鎖の能力があげられる。
好ましい実施形態では、前記モルホリノオリゴマーは、長さが約８〜４０個のサブユニットである。より典型的には、前記オリゴマーは、長さが約８〜２０個、約８〜１６個、約１０〜３０個または約１２〜２５個のサブユニットである。一部の用途、例えば、抗菌に関して、例えば、長さが約８〜１２個のサブユニットの短いオリゴマーが、本願明細書に開示のように、ペプチド輸送体に付着される場合、特に有利であり得る。
Ａ．修飾されたサブユニット間リンケージを有するオリゴマー
本開示の一実施形態は、修飾されたサブユニット間リンケージを含む核酸類似体（例えば、モルホリノオリゴマー）を含む、ペプチド−オリゴマーコンジュゲートに関する。一部の実施形態では、前記コンジュゲートは、対応する非修飾オリゴマーが有するより高い、ＤＮＡおよびＲＮＡに対する親和性を有し、他のサブユニット間リンケージを有するオリゴマーと比較して、改善された細胞送達、有効性および／または組織分布特性を示す。一実施形態では、前記コンジュゲートは、以下に定義されるように、１つ以上の（Ａ）型のサブユニット間リンケージを含む。他の実施形態では、前記コンジュゲートは、以下に定義されるように、少なくとも１つの（Ｂ）型のサブユニット間リンケージを含む。さらに他の実施形態では、前記コンジュゲートは、（Ａ）型および（Ｂ）型のサブユニット間リンケージを含む。さらに他の実施形態では、前記コンジュゲートは、以下により詳細に記載するように、モルホリノオリゴマーを含む。種々のリンケージ型およびオリゴマーの構造的特徴および特性は、下記記載においてより詳細に記載される。
１．リンケージ（Ａ）
本願出願人は、アンチセンス活性、生体内分布および／または他の所望の特性の向上が、種々のサブユニット間リンケージを有するオリゴマーを調製することにより最適化され得ることを見出した。例えば、前記オリゴマーは、場合により、１つ以上の（Ａ）型のサブユニット間リンケージを含んでもよい。ある実施形態では、前記オリゴマーは、少なくとも１つの（Ａ）型のリンケージを含み、例えば、各リンケージが、（Ａ）型でもよい。一部の他の実施形態では、各（Ａ）型リンケージは、同じ構造を有する。（Ａ）型のリンケージは、その全体が参照により本願明細書に取り込まれる、共所有の米国特許第７，９４３，７６２号明細書に開示されたリンケージを含んでもよい。リンケージ（Ａ）は、３’および５’が、それぞれ、前記モルホリノ環（すなわち、以下に記載される構造（ｉ））の３’端および５’端に対する付着点を示す下記構造（Ｉ）
Figure 0006884250
または、その塩もしくはその異性体を有し、式中、
Ｗは、各出現箇所で独立して、ＳまたはＯであり；
Ｘは、各出現箇所で独立して、−Ｎ（ＣＨ３）２、−ＮＲ１Ｒ２、−ＯＲ３または
Figure 0006884250
であり；
Ｙは、各出現箇所で独立して、Ｏまたは−ＮＲ２であり；
Ｒ１は、各出現箇所で独立して、水素またはメチルであり；
Ｒ２は、各出現箇所で独立して、水素または−ＬＮＲ４Ｒ５Ｒ７であり；
Ｒ３は、各出現箇所で独立して、水素またはＣ１−Ｃ６アルキルであり；
Ｒ４は、各出現箇所で独立して、水素、メチル、−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｚ−Ｌ−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２または−［Ｃ（Ｏ）ＣＨＲ’ＮＨ］ｍＨであり、Ｚは、−Ｃ（＝Ｏ）−または直接結合であり、Ｒ’は、天然に存在するアミノ酸または１つもしくは２つのその炭素同族体の側鎖であり、ｍは、１から６であり；
Ｒ５は、各出現箇所で独立して、水素、メチルまたは電子対であり；
Ｒ６は、各出現箇所で独立して、水素またはメチルであり；
Ｒ７は、各出現箇所で独立して、水素、Ｃ１−Ｃ６アルキルまたはＣ１−Ｃ６アルコキシアルキルであり；
Ｌは、アルキル、アルコキシもしくはアルキルアミノの基またはそれらの組み合わせを含む、長さ１８個原子以下の必要に応じたリンカーである。
一部の例では、前記オリゴマーは、少なくとも１つの（Ａ）型リンケージを含む。一部の他の実施形態では、前記オリゴマーは、少なくとも２個連続した（Ａ）型リンケージを含む。更なる実施形態では、前記オリゴマーにおける少なくとも５％のリンケージが、（Ａ）型である。例えば、一部の実施形態では、５％−９５％、１０％から９０％、１０％から５０％または１０％から３５％の前記リンケージが、（Ａ）型リンケージでもよい。一部の特定の実施形態では、少なくとも１つの（Ａ）型リンケージは、−Ｎ（ＣＨ３）２である。他の実施形態では、各（Ａ）型リンケージは、−Ｎ（ＣＨ３）２である。さらに他の実施形態では、前記オリゴマーにおける各リンケージは、−Ｎ（ＣＨ３）２である。他の実施形態では、少なくとも１つの（Ａ）型リンケージは、ピペリジン−１−イル、例えば、非置換のピペラジン−１−イル（例えば、Ａ２またはＡ３）である。他の実施形態では、各（Ａ）型リンケージは、ピペリジン−１−イル、例えば、非置換のピペラジン−１−イルである。
一部の実施形態では、Ｗは、各出現箇所で独立して、ＳまたはＯであり、ある実施形態では、Ｗは、Ｏである。
一部の実施形態では、Ｘは、各出現箇所で独立して、−Ｎ（ＣＨ３）２、−ＮＲ１Ｒ２、−ＯＲ３である。一部の実施形態では、Ｘは、−Ｎ（ＣＨ３）２である。他の態様では、Ｘは、−ＮＲ１Ｒ２であり、他の例では、Ｘは、−ＯＲ３である。
一部の実施形態では、Ｒ１は、各出現箇所で独立して、水素またはメチルである。一部の実施形態では、Ｒ１は、水素である。他の実施形態では、Ｘは、メチルである。
一部の実施形態では、Ｒ２は、各出現箇所で水素である。他の実施形態では、Ｒ２は、各出現箇所で−ＬＮＲ４Ｒ５Ｒ７である。一部の実施形態では、Ｒ３は、各出現箇所で独立して、水素またはＣ１−Ｃ６アルキルである。他の実施形態では、Ｒ３は、メチルである。さらに他の実施形態では、Ｒ３は、エチルである。一部の他の実施形態では、Ｒ３は、ｎ−プロピルまたはイソプロピルである。一部の他の実施形態では、Ｒ３は、Ｃ４アルキルである。他の実施形態では、Ｒ３は、Ｃ５アルキルである。一部の他の実施形態では、Ｒ３は、Ｃ６アルキルである。
ある実施形態では、Ｒ４は、各出現箇所で独立して、水素である。他の実施形態では、Ｒ４は、メチルである。さらに他の実施形態では、Ｒ４は、−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２である。他の実施形態では、Ｒ４は、−Ｚ−Ｌ−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２である。さらに他の実施形態では、Ｒ４は、−［Ｃ（＝Ｏ）ＣＨＲ’ＮＨ］ｍＨである。一実施形態では、Ｚは、−Ｃ（＝Ｏ）−であり、もう１つの実施形態では、Ｚは、直接結合である。Ｒ’は、天然に存在するアミノ酸の側鎖である。一部の実施形態では、Ｒ’は、１つまたは２つの、天然に存在するアミノ酸の側鎖の炭素同族体である。
ｍは、１から６の整数である。ｍは、１でもよい。ｍは、２でもよい。ｍは、３でもよい。ｍは、４でもよい。ｍは、５でもよい。ｍは、６でもよい。
一部の実施形態では、Ｒ５は、各出現箇所で独立して、水素、メチルまたは電子対である。一部の実施形態では、Ｒ５は、水素である。他の実施形態では、Ｒ５は、メチルである。さらに他の実施形態では、Ｒ５は、電子対である。
一部の実施形態では、Ｒ６は、各出現箇所で独立して、水素またはメチルである。一部の実施形態では、Ｒ６は、水素である。他の実施形態では、Ｒ６は、メチルである。
他の実施形態では、Ｒ７は、各出現箇所で独立して、水素、Ｃ１−Ｃ６アルキルまたはＣ２−Ｃ６アルコキシアルキルである。一部の実施形態では、Ｒ７は、水素である。他の実施形態では、Ｒ７は、Ｃ１−Ｃ６アルキルである。さらに他の実施形態では、Ｒ７は、Ｃ２−Ｃ６アルコキシアルキルである。一部の実施形態では、Ｒ７は、メチルである。他の実施形態では、Ｒ７は、エチルである。さらに他の実施形態では、Ｒ７は、ｎ−プロピルまたはイソプロピルである。一部の他の実施形態では、Ｒ７は、Ｃ４アルキルである。一部の実施形態では、Ｒ７は、Ｃ５アルキルである。一部の実施形態では、Ｒ７は、Ｃ６アルキルである。さらに他の実施形態では、Ｒ７は、Ｃ２アルコキシアルキルである。一部の他の実施形態では、Ｒ７は、Ｃ３アルコキシアルキルである。さらに他の実施形態では、Ｒ７は、Ｃ４アルコキシアルキルである。一部の実施形態では、Ｒ７は、Ｃ５アルコキシアルキルである。他の実施形態では、Ｒ７は、Ｃ６アルコキシアルキルである。
前述のように、リンカー基Ｌは、Ｌにおける末端原子（例えば、カルボニルまたは窒素に隣接するもの）が炭素原子であるという条件で、アルキル（例えば、−ＣＨ２−ＣＨ２−）、アルコキシ（例えば、−Ｃ−Ｏ−Ｃ−）およびアルキルアミノ（例えば、−ＣＨ２−ＮＨ−）から選択されるその骨格における結合を含む。分岐鎖状のリンケージ（例えば、−ＣＨ２−ＣＨＣＨ３−）が可能であるが、前記リンカーは、一般的に非分岐鎖状である。一実施形態では、前記リンカーは、炭化水素リンカーである。このようなリンカーは、構造（ＣＨ２）ｎ−を有してもよく、ｎは、１−１２、好ましくは２−８、および、より好ましくは２−６である。
任意の数の（Ａ）型リンケージを有するオリゴマーが、提供される。一部の実施形態では、前記オリゴマーは、（Ａ）型リンケージを含まない。ある実施形態では、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０または９０パーセントの前記リンケージが、（Ａ）型リンケージである。選択された実施形態では、１０から８０、２０から８０、２０から６０、２０から５０、２０から４０または２０から３５パーセントの前記リンケージが、（Ａ）型リンケージである。さらに他の実施形態では、各リンケージが、（Ａ）型である。
２．リンケージ（Ｂ）
一部の実施形態では、前記オリゴマーは、少なくとも１つの（Ｂ）型リンケージを含む。例えば、前記オリゴマーは、１、２、３、４、５、６個以上の（Ｂ）型リンケージを含んでもよい。前記（Ｂ）型リンケージは、隣接してもよいし、または、前記オリゴマー全体に分散されてもよい。（Ｂ）型リンケージは、下記化合構造（Ｉ）：
Figure 0006884250
または、その塩もしくはその異性体を有する。式中、
Ｗは、各出現箇所で独立して、ＳまたはＯであり；
Ｘは、各出現箇所で独立して、−ＮＲ８Ｒ９または−ＯＲ３であり；および、
Ｙは、各出現箇所で独立して、Ｏまたは−ＮＲ１０であり、
Ｒ３は、各出現箇所で独立して、水素またはＣ１−Ｃ６アルキルであり；
Ｒ８は、各出現箇所で独立して、水素またはＣ２−Ｃ１２アルキルであり；
Ｒ９は、各出現箇所で独立して、水素、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、Ｃ１−Ｃ１２アラルキルまたはアリールであり；
Ｒ１０は、各出現箇所で独立して、水素、Ｃ１−Ｃ１２アルキルまたは−ＬＮＲ４Ｒ５Ｒ７であり；
Ｒ８およびＲ９が結合して、５〜１８員の単環もしくは二環複素環、または、Ｒ８、Ｒ９またはＲ３がＲ１０と結合して、５〜７員の複素環を形成する。Ｘが４−ピペラジノである場合、Ｘは、下記構造（ＩＩＩ）：
Figure 0006884250
を有する。式中、
Ｒ１１は、各出現箇所で独立して、Ｃ２−Ｃ１２アルキル、Ｃ１−Ｃ１２アミノアルキル、Ｃ１−Ｃ１２アルキルカルボニル、アリール、ヘテロアリールまたはヘテロシクリルであり；
Ｒは、各出現箇所で独立して、電子対、水素またはＣ１−Ｃ１２アルキルであり；および、
Ｒ１２は、各出現箇所で独立して、水素、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、Ｃ１−Ｃ１２アミノアルキル、−ＮＨ２、−ＣＯＮＨ２、−ＮＲ１３Ｒ１４、−ＮＲ１３Ｒ１４Ｒ１５、Ｃ１−Ｃ１２アルキルカルボニル、オキソ、−ＣＮ、トリフルオロメチル、アミジル、アミジニル、アミジニルアルキル、アミジニルアルキルカルボニル、グアニジニル、グアニジニルアルキル、グアニジニルアルキルカルボニル、コラート、デオキシコラート、アリール、ヘテロアリール、複素環、−ＳＲ１３またはＣ１−Ｃ１２アルコキシであり、Ｒ１３、Ｒ１４およびＲ１５は、各出現箇所で独立して、Ｃ１−Ｃ１２アルキルである。
一部の実施例では、前記オリゴマーは、１つの（Ｂ）型リンケージを含む。一部の他の実施形態では、前記オリゴマーは、２つの（Ｂ）型リンケージを含む。一部の他の実施形態では、前記オリゴマーは、３つの（Ｂ）型リンケージを含む。一部の他の実施形態では、前記オリゴマーは、４つの（Ｂ）型リンケージを含む。さらに他の実施形態では、前記（Ｂ）型リンケージは、連続的である（すなわち、前記（Ｂ）型リンケージは、互いに隣接する）。更なる実施形態では、前記オリゴマーにおける少なくとも５％の前記リンケージは、（Ｂ）型である。例えば、一部の実施形態では、５％−９５％、１０％から９０％、１０％から５０％または１０％から３５％の前記リンケージが、（Ｂ）型リンケージでもよい。
他の実施形態では、Ｒ３は、各出現箇所で独立して、水素またはＣ１−Ｃ６アルキルである。さらに他の実施形態では、Ｒ３は、メチルでもよい。一部の実施形態では、Ｒ３は、エチルでもよい。一部の他の実施形態では、Ｒ３は、ｎ−プロピルまたはイソプロピルでもよい。さらに他の実施形態では、Ｒ３は、Ｃ４アルキルでもよい。一部の実施形態では、Ｒ３は、Ｃ５アルキルでもよい。一部の実施形態では、Ｒ３は、Ｃ６アルキルでもよい。
一部の実施形態では、Ｒ８は、各出現箇所で独立して、水素またはＣ２−Ｃ１２アルキルである。一部の実施形態では、Ｒ８は、水素である。さらに他の実施形態では、Ｒ８は、エチルである。一部の他の実施形態では、Ｒ８は、ｎ−プロピルまたはイソプロピルである。一部の実施形態では、Ｒ８は、Ｃ４アルキルである。さらに他の実施形態では、Ｒ８は、Ｃ５アルキルである。他の実施形態では、Ｒ８は、Ｃ６アルキルである。一部の実施形態では、Ｒ８は、Ｃ７アルキルである。さらに他の実施形態では、Ｒ８は、Ｃ８アルキルである。他の実施形態では、Ｒ８は、Ｃ９アルキルである。さらに他の実施形態では、Ｒ８は、Ｃ１０アルキルである。一部の他の実施形態では、Ｒ８は、Ｃ１１アルキルである。さらに他の実施形態では、Ｒ８は、Ｃ１２アルキルである。一部の他の実施形態では、Ｒ８は、Ｃ２−Ｃ１２アルキルであり、前記Ｃ２−Ｃ１２アルキルは、１つ以上の二重結合（例えば、アルケン）、三重結合（例えば、アルキン）または両方を含む。一部の実施形態では、Ｒ８は、非置換のＣ２−Ｃ１２アルキルである。
一部の実施形態では、Ｒ９は、各出現箇所で独立して、水素、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、Ｃ１−Ｃ１２アラルキルまたはアリールである。一部の実施形態では、Ｒ９は、水素である。さらに他の実施形態では、Ｒ９は、Ｃ１−Ｃ１２アルキルである。他の実施形態では、Ｒ９は、メチルである。さらに他の実施形態では、Ｒ９は、エチルである。一部の他の実施形態では、Ｒ９は、ｎ−プロピルまたはイソプロピルである。一部の実施形態では、Ｒ９は、Ｃ４アルキルである。一部の実施形態では、Ｒ９は、Ｃ５アルキルである。さらに他の実施形態では、Ｒ９は、Ｃ６アルキルである。一部の他の実施形態では、Ｒ９は、Ｃ７アルキルである。一部の実施形態では、Ｒ９は、Ｃ８アルキルである。一部の実施形態では、Ｒ９は、Ｃ９アルキルである。一部の他の実施形態では、Ｒ９は、Ｃ１０アルキルである。一部の他の実施形態では、Ｒ９は、Ｃ１１アルキルである。さらに他の実施形態では、Ｒ９は、Ｃ１２アルキルである。
一部の他の実施形態では、Ｒ９は、Ｃ１−Ｃ１２アラルキルである。例えば、一部の実施形態では、Ｒ９は、ベンジルであり、前記ベンジルは、場合により、フェニル環またはベンジル炭素のいずれかにおいて置換されてもよい。この点で、置換基としては、アルキルおよびアルコキシの基、例えば、メチルまたはメトキシがあげられる。一部の実施形態では、前記ベンジル基は、前記ベンジル炭素において、メチルで置換される。例えば、一部の実施形態では、Ｒ９は、下記構造（ＸＩＶ）：
Figure 0006884250
を有する。
他の実施形態では、Ｒ９は、アリールである。例えば、一部の実施形態では、Ｒ９は、フェニルであり、前記フェニルは、場合により置換されてもよい。この点で、置換基としては、アルキルおよびアルコキシの基、例えば、メチルまたはメトキシがあげられる。他の実施形態では、Ｒ９は、フェニルであり、前記フェニルは、クラウンエーテル部分、例えば、１２〜１８員のクラウンエーテルを含む。一実施形態では、前記クラウンエーテルは、１８員環であり、なお更なるフェニル部分を含んでもよい。例えば、一実施形態では、Ｒ９は、下記構造（ＸＶ）または（ＸＶＩ）：
Figure 0006884250
の１つを有する。
一部の実施形態では、Ｒ１０は、各出現箇所で独立して、水素、Ｃ１−Ｃ１２アルキルまたは−ＬＮＲ４Ｒ５Ｒ７であり、Ｒ４、Ｒ５およびＲ７は、リンケージ（Ａ）に関して上記定義のとおりである。他の実施形態では、Ｒ１０は、水素である。他の実施形態では、Ｒ１０は、Ｃ１−Ｃ１２アルキルである。他の実施形態では、Ｒ１０は、−ＬＮＲ４Ｒ５Ｒ７である。一部の実施形態では、Ｒ１０は、メチルである。さらに他の実施形態では、Ｒ１０は、エチルである。一部の実施形態では、Ｒ１０は、Ｃ３アルキルである。一部の実施形態では、Ｒ１０は、Ｃ４アルキルである。さらに他の実施形態では、Ｒ１０は、Ｃ５アルキルである。一部の他の実施形態では、Ｒ１０は、Ｃ６アルキルである。他の実施形態では、Ｒ１０は、Ｃ７アルキルである。さらに他の実施形態では、Ｒ１０は、Ｃ８アルキルである。一部の実施形態では、Ｒ１０は、Ｃ９アルキルである。他の実施形態では、Ｒ１０は、Ｃ１０アルキルである。さらに他の実施形態では、Ｒ１０は、Ｃ１１アルキルである。一部の他の実施形態では、Ｒ１０は、Ｃ１２アルキルである。
一部の実施形態では、Ｒ８およびＲ９が結合して、５〜１８員の単環もしくは二環複素環を形成する。一部の実施形態では、前記複素環は、５または６員の単環複素環である。例えば、一部の実施形態では、リンケージ（Ｂ）は、下記構造（ＩＶ）：
Figure 0006884250
を有する。式中、Ｚは、５または６員の単環複素環を表わす。
他の実施形態では、複素環は、二環、例えば、１２員の二環複素環である。前記複素環は、ピペリジンでもよい。前記複素環は、モルホリノでもよい。前記複素環は、ピペリジニルでもよい。前記複素環は、デカヒドロイソキノリンでもよい。典型的な複素環としては、下記：
Figure 0006884250
が挙げられる。
一部の実施形態では、Ｒ１１は、各出現箇所で独立して、Ｃ２−Ｃ１２アルキル、Ｃ１−Ｃ１２アミノアルキル、アリール、ヘテロアリールまたはヘテロシクリルである。
一部の実施形態では、Ｒ１１は、Ｃ２−Ｃ１２アルキルである。一部の実施形態では、Ｒ１１は、エチルである。他の実施形態では、Ｒ１１は、Ｃ３アルキルである。さらに他の実施形態では、Ｒ１１は、イソプロピルである。一部の他の実施形態では、Ｒ１１は、Ｃ４アルキルである。他の実施形態では、Ｒ１１は、Ｃ５アルキルである。一部の実施形態では、Ｒ１１は、Ｃ６アルキルである。他の実施形態では、Ｒ１１は、Ｃ７アルキルである。一部の実施形態では、Ｒ１１は、Ｃ８アルキルである。他の実施形態では、Ｒ１１は、Ｃ９アルキルである。さらに他の実施形態では、Ｒ１１は、Ｃ１０アルキルである。一部の他の実施形態では、Ｒ１１は、Ｃ１１アルキルである。一部の実施形態では、Ｒ１１は、Ｃ１２アルキルである。
他の実施形態では、Ｒ１１は、Ｃ１−Ｃ１２アミノアルキルである。一部の実施形態では、Ｒ１１は、メチルアミノである。一部の実施形態では、Ｒ１１は、エチルアミノである。他の実施形態では、Ｒ１１は、Ｃ３アミノアルキルである。さらに他の実施形態では、Ｒ１１は、Ｃ４アミノアルキルである。一部の他の実施形態では、Ｒ１１は、Ｃ５アミノアルキルである。他の実施形態では、Ｒ１１は、Ｃ６アミノアルキルである。さらに他の実施形態では、Ｒ１１は、Ｃ７アミノアルキルである。一部の実施形態では、Ｒ１１は、Ｃ８アミノアルキルである。他の実施形態では、Ｒ１１は、Ｃ９アミノアルキルである。さらに他の実施形態では、Ｒ１１は、Ｃ１０アミノアルキルである。一部の他の実施形態では、Ｒ１１は、Ｃ１１アミノアルキルである。他の実施形態では、Ｒ１１は、Ｃ１２アミノアルキルである。
他の実施形態では、Ｒ１１は、Ｃ１−Ｃ１２アルキルカルボニルである。さらに他の実施形態では、Ｒ１１は、Ｃ１アルキルカルボニルである。他の実施形態では、Ｒ１１は、Ｃ２アルキルカルボニルである。一部の実施形態では、Ｒ１１は、Ｃ３アルキルカルボニルである。さらに他の実施形態では、Ｒ１１は、Ｃ４アルキルカルボニルである。一部の実施形態では、Ｒ１１は、Ｃ５アルキルカルボニルである。一部の他の実施形態では、Ｒ１１は、Ｃ６アルキルカルボニルである。他の実施形態では、Ｒ１１は、Ｃ７アルキルカルボニルである。さらに他の実施形態では、Ｒ１１は、Ｃ８アルキルカルボニルである。一部の実施形態では、Ｒ１１は、Ｃ９アルキルカルボニルである。さらに他の実施形態では、Ｒ１１は、Ｃ１０アルキルカルボニルである。一部の他の実施形態では、Ｒ１１は、Ｃ１１アルキルカルボニルである。一部の実施形態では、Ｒ１１は、Ｃ１２アルキルカルボニルである。さらに他の実施形態では、Ｒ１１は、−Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎＣＯ２Ｈであり、ｎは、１から６である。例えば、一部の実施形態では、ｎは、１である。他の実施形態では、ｎは、２である。さらに他の実施形態では、ｎは、３である。一部の他の実施形態では、ｎは、４である。さらに他の実施形態では、ｎは、５である。他の実施形態では、ｎは、６である。
他の実施形態では、Ｒ１１は、アリールである。例えば、一部の実施形態では、Ｒ１１は、フェニルである。一部の実施形態では、前記フェニルは、例えば、ニトロ基により置換される。
他の実施形態では、Ｒ１１は、ヘテロアリールである。例えば、一部の実施形態では、Ｒ１１は、ピリジニルである。他の実施形態では、Ｒ１１は、ピリミジニルである。
他の実施形態では、Ｒ１１は、ヘテロシクリルである。例えば、一部の実施形態では、Ｒ１１は、ピペリジニル、例えば、ピペリジン−４−イルである。
一部の実施形態では、Ｒ１１は、エチル、イソプロピル、ピペリジニル、ピリミジニル、コラート、デオキシコラートまたは−Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎＣＯ２Ｈであり、ｎは、１から６である。
一部の実施形態では、Ｒは、電子対である。他の実施形態では、Ｒは、水素である。他の実施形態では、Ｒは、Ｃ１−Ｃ１２アルキルである。一部の実施形態では、Ｒは、メチルである。一部の実施形態では、Ｒは、エチルである。他の実施形態では、Ｒは、Ｃ３アルキルである。さらに他の実施形態では、Ｒは、イソプロピルである。一部の他の実施形態では、Ｒは、Ｃ４アルキルである。さらに他の実施形態では、Ｒは、Ｃ５アルキルである。一部の実施形態では、Ｒは、Ｃ６アルキルである。他の実施形態では、Ｒは、Ｃ７アルキルである。さらに他の実施形態では、Ｒは、Ｃ８アルキルである。他の実施形態では、Ｒは、Ｃ９アルキルである。一部の実施形態では、Ｒは、Ｃ１０アルキルである。さらに他の実施形態では、Ｒは、Ｃ１１アルキルである。一部の実施形態では、Ｒは、Ｃ１２アルキルである。
一部の実施形態では、Ｒ１２は、各出現箇所で独立して、水素、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、Ｃ１−Ｃ１２アミノアルキル、−ＮＨ２、−ＣＯＮＨ２、−ＮＲ１３Ｒ１４、−ＮＲ１３Ｒ１４Ｒ１５、オキソ、−ＣＮ、トリフルオロメチル、アミジル、アミジニル、アミジニルアルキル、アミジニルアルキルカルボニル グアニジニル、グアニジニルアルキル、グアニジニルアルキルカルボニル、コラート、デオキシコラート、アリール、ヘテロアリール、複素環、−ＳＲ１３またはＣ１−Ｃ１２アルコキシであり、Ｒ１３、Ｒ１４およびＲ１５は、各出現箇所で独立して、Ｃ１−Ｃ１２アルキルである。
一部の実施形態では、Ｒ１２は、水素である。一部の実施形態では、Ｒ１２は、Ｃ１−Ｃ１２アルキルである。一部の実施形態では、Ｒ１２は、Ｃ１−Ｃ１２アミノアルキルである。一部の実施形態では、Ｒ１２は、−ＮＨ２である。一部の実施形態では、Ｒ１２は、−ＣＯＮＨ２である。一部の実施形態では、Ｒ１２は、−ＮＲ１３Ｒ１４である。一部の実施形態では、Ｒ１２は、−ＮＲ１３Ｒ１４Ｒ１５である。一部の実施形態では、Ｒ１２は、Ｃ１−Ｃ１２アルキルカルボニルである。一部の実施形態では、Ｒ１２は、オキソである。一部の実施形態では、Ｒ１２は、−ＣＮである。一部の実施形態では、Ｒ１２は、トリフルオロメチルである。一部の実施形態では、Ｒ１２は、アミジルである。一部の実施形態では、Ｒ１２は、アミジニルである。一部の実施形態では、Ｒ１２は、アミジニルアルキルである。一部の実施形態では、Ｒ１２は、アミジニルアルキルカルボニルである。一部の実施形態では、Ｒ１２は、グアニジニル、例えば、モノメチルグアニジニルまたはジメチルグアニジニルである。一部の実施形態では、Ｒ１２は、グアニジニルアルキルである。一部の実施形態では、Ｒ１２は、アミジニルアルキルカルボニルである。一部の実施形態では、Ｒ１２は、コラートである。一部の実施形態では、Ｒ１２は、デオキシコラートである。一部の実施形態では、Ｒ１２は、アリールである。一部の実施形態では、Ｒ１２は、ヘテロアリールである。一部の実施形態では、Ｒ１２は、複素環である。一部の実施形態では、Ｒ１２は、−ＳＲ１３である。一部の実施形態では、Ｒ１２は、Ｃ１−Ｃ１２アルコキシである。一部の実施形態では、Ｒ１２は、ジメチルアミンである。
他の実施形態では、Ｒ１２は、メチルである。さらに他の実施形態では、Ｒ１２は、エチルである。一部の実施形態では、Ｒ１２は、Ｃ３アルキルである。一部の実施形態では、Ｒ１２は、イソプロピルである。一部の実施形態では、Ｒ１２は、Ｃ４アルキルである。他の実施形態では、Ｒ１２は、Ｃ５アルキルである。さらに他の実施形態では、Ｒ１２は、Ｃ６アルキルである。一部の他の実施形態では、Ｒ１２は、Ｃ７アルキルである。一部の実施形態では、Ｒ１２は、Ｃ８アルキルである。さらに他の実施形態では、Ｒ１２は、Ｃ９アルキルである。一部の実施形態では、Ｒ１２は、Ｃ１０アルキルである。さらに他の実施形態では、Ｒ１２は、Ｃ１１アルキルである。他の実施形態では、Ｒ１２は、Ｃ１２アルキルである。さらに他の実施形態では、前記アルキル部分は、１つ以上の酸素原子により置換されて、エーテル部分、例えば、メトキシメチル部分を形成する。
一部の実施形態では、Ｒ１２は、メチルアミノである。他の実施形態では、Ｒ１２は、エチルアミノである。さらに他の実施形態では、Ｒ１２は、Ｃ３アミノアルキルである。一部の実施形態では、Ｒ１２は、Ｃ４アミノアルキルである。さらに他の実施形態では、Ｒ１２は、Ｃ５アミノアルキルである。一部の他の実施形態では、Ｒ１２は、Ｃ６アミノアルキルである。一部の実施形態では、Ｒ１２は、Ｃ７アミノアルキルである。一部の実施形態では、Ｒ１２は、Ｃ８アミノアルキルである。さらに他の実施形態では、Ｒ１２は、Ｃ９アミノアルキルである。一部の他の実施形態では、Ｒ１２は、Ｃ１０アミノアルキルである。さらに他の実施形態では、Ｒ１２は、Ｃ１１アミノアルキルである。他の実施形態では、Ｒ１２は、Ｃ１２アミノアルキルである。一部の実施形態では、前記アミノアルキルは、ジメキルアミノアルキルである。
さらに他の実施形態では、Ｒ１２は、アセチルである。一部の他の実施形態では、Ｒ１２は、Ｃ２アルキルカルボニルである。一部の実施形態では、Ｒ１２は、Ｃ３アルキルカルボニルである。さらに他の実施形態では、Ｒ１２は、Ｃ４アルキルカルボニルである。一部の実施形態では、Ｒ１２は、Ｃ５アルキルカルボニルである。さらに他の実施形態では、Ｒ１２は、Ｃ６アルキルカルボニルである。一部の他の実施形態では、Ｒ１２は、Ｃ７アルキルカルボニルである。一部の実施形態では、Ｒ１２は、Ｃ８アルキルカルボニルである。さらに他の実施形態では、Ｒ１２は、Ｃ９アルキルカルボニルである。一部の他の実施形態では、Ｒ１２は、Ｃ１０アルキルカルボニルである。一部の実施形態では、Ｒ１２は、Ｃ１１アルキルカルボニルである。他の実施形態では、Ｒ１２は、Ｃ１２アルキルカルボニルである。前記アルキルカルボニルは、カルボキシ部分により置換される。例えば、前記アルキルカルボニルは、置換されて、コハク酸部分（すなわち、３−カルボキシアルキルカルボニル）を形成する。他の実施形態では、前記アルキルカルボニルは、末端−ＳＨ基により置換される。
一部の実施形態では、Ｒ１２は、アミジルである。一部の実施形態では、前記アミジルは、例えば、−ＳＨ、カルバマートまたは、それらの組み合わせにより、さらに置換されたアルキル部分を含む。他の実施形態では、前記アミジルは、アリール部分、例えば、フェニルにより置換される。ある実施形態では、Ｒ１２は、下記構造（ＩＸ）：
Figure 0006884250
を有してもよい。
式中、Ｒ１６は、各出現箇所で独立して、水素、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、Ｃ１−Ｃ１２アルコキシ、−ＣＮ、アリールまたはヘテロアリールである。
一部の実施形態では、Ｒ１２は、メトキシである。他の実施形態では、Ｒ１２は、エトキシである。さらに他の実施形態では、Ｒ１２は、Ｃ３アルコキシである。一部の実施形態では、Ｒ１２は、Ｃ４アルコキシである。一部の実施形態では、Ｒ１２は、Ｃ５アルコキシである。一部の他の実施形態では、Ｒ１２は、Ｃ６アルコキシである。他の実施形態では、Ｒ１２は、Ｃ７アルコキシである。一部の他の実施形態では、Ｒ１２は、Ｃ８アルコキシである。一部の実施形態では、Ｒ１２は、Ｃ９アルコキシである。他の実施形態では、Ｒ１２は、Ｃ１０アルコキシである。一部の実施形態では、Ｒ１２は、Ｃ１１アルコキシである。さらに他の実施形態では、Ｒ１２は、Ｃ１２アルコキシである。
ある実施形態では、Ｒ１２は、ピロリジニル、例えば、ピロリジン−１−イルである。他の実施形態では、Ｒ１２は、ピペリジニル、例えば、ピペリジン−１−イルまたはピペリジン−４−イルである。他の実施形態では、Ｒ１２は、モルホリノ、例えば、モルホリン−４−イルである。他の実施形態では、Ｒ１２は、フェニルであり、なお更なる実施形態では、前記フェニルは、例えば、ニトロ基により置換される。さらに他の実施形態では、Ｒ１２は、ピリミジニル、例えば、ピリミジン−２−イルである。
他の実施形態では、Ｒ１３、Ｒ１４およびＲ１５は、各出現箇所で独立して、Ｃ１−Ｃ１２アルキルである。一部の実施形態では、Ｒ１３、Ｒ１４またはＲ１５は、メチルである。さらに他の実施形態では、Ｒ１３、Ｒ１４またはＲ１５は、エチルである。他の実施形態では、Ｒ１３、Ｒ１４またはＲ１５は、Ｃ３アルキルである。さらに他の実施形態では、Ｒ１３、Ｒ１４またはＲ１５は、イソプロピルである。他の実施形態では、Ｒ１３、Ｒ１４またはＲ１５は、Ｃ４アルキルである。一部の実施形態では、Ｒ１３、Ｒ１４またはＲ１５は、Ｃ５アルキルである。一部の他の実施形態では、Ｒ１３、Ｒ１４またはＲ１５は、Ｃ６アルキルである。他の実施形態では、Ｒ１３、Ｒ１４またはＲ１５は、Ｃ７アルキルである。さらに他の実施形態では、Ｒ１３、Ｒ１４またはＲ１５は、Ｃ８アルキルである。他の実施形態では、Ｒ１３、Ｒ１４またはＲ１５は、Ｃ９アルキルである。一部の実施形態では、Ｒ１３、Ｒ１４またはＲ１５は、Ｃ１０アルキルである。一部の実施形態では、Ｒ１３、Ｒ１４またはＲ１５は、Ｃ１１アルキルである。さらに他の実施形態では、Ｒ１３、Ｒ１４またはＲ１５は、Ｃ１２アルキルである。
上記のように、一部の実施形態では、Ｒ１２は、アリール部分により置換されたアミジルである。この点で、各Ｒ１６は、同じでも、異なってもよい。あるこれらの実施形態では、Ｒ１６は、水素である。他の実施形態では、Ｒ１６は、−ＣＮである。他の実施形態では、Ｒ１６は、ヘテロアリール、例えば、テトラゾリルである。ある他の実施形態では、Ｒ１６は、メトキシである。他の実施形態では、Ｒ１６は、アリールであり、前記アリールは、場合により置換される。この点で、任意の置換基としては、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、Ｃ１−Ｃ１２アルコキシ、例えば、メトキシ；トリフルオロメトキシ；ハロ、例えば、クロロ；およびトリフルオロメチルがあげられる。
他の実施形態では、Ｒ１６は、メチルである。さらに他の実施形態では、Ｒ１６は、エチルである。一部の実施形態では、Ｒ１６は、Ｃ３アルキルである。一部の他の実施形態では、Ｒ１６は、イソプロピルである。さらに他の実施形態では、Ｒ１６は、Ｃ４アルキルである。他の実施形態では、Ｒ１６は、Ｃ５アルキルである。さらに他の実施形態では、Ｒ１６は、Ｃ６アルキルである。一部の他の実施形態では、Ｒ１６は、Ｃ７アルキルである。一部の実施形態では、Ｒ１６は、Ｃ８アルキルである。さらに他の実施形態では、Ｒ１６は、Ｃ９アルキルである。一部の他の実施形態では、Ｒ１６は、Ｃ１０アルキルである。他の実施形態では、Ｒ１６は、Ｃ１１アルキルである。一部の他の実施形態では、Ｒ１６は、Ｃ１２アルキルである。
一部の実施形態では、Ｒ１６は、メトキシである。一部の実施形態では、Ｒ１６は、エトキシである。さらに他の実施形態では、Ｒ１６は、Ｃ３アルコキシである。一部の他の実施形態では、Ｒ１６は、Ｃ４アルコキシである。他の実施形態では、Ｒ１６は、Ｃ５アルコキシである。一部の他の実施形態では、Ｒ１６は、Ｃ６アルコキシである。さらに他の実施形態では、Ｒ１６は、Ｃ７アルコキシである。一部の他の実施形態では、Ｒ１６は、Ｃ８アルコキシである。さらに他の実施形態では、Ｒ１６は、Ｃ９アルコキシである。一部の他の実施形態では、Ｒ１６は、Ｃ１０アルコキシである。一部の実施形態では、Ｒ１６は、Ｃ１１アルコキシである。一部の他の実施形態では、Ｒ１６は、Ｃ１２アルコキシである。
一部の他の実施形態では、Ｒ８およびＲ９が結合して、１２〜１８員のクラウンエーテルを形成する。例えば、一部の実施形態では、前記クラウンエーテルは、１８員であり、他の実施形態では、前記クラウンエーテルは、１５員である。ある実施形態では、Ｒ８およびＲ９が結合して、下記構造（Ｘ）または（ＸＩ）：
Figure 0006884250
の１つを有する複素環を形成する。
一部の実施形態では、Ｒ８、Ｒ９またはＲ３がＲ１０と結合して、５〜７員の複素環を形成する。例えば、一部の実施形態では、Ｒ３がＲ１０と結合して、５〜７員の複素環を形成する。一部の実施形態では、前記複素環は、５員である。他の実施形態では、前記複素環は、６員である。他の実施形態では、前記複素環は、７員である。一部の実施形態では、前記複素環は、下記構造（ＸＩＩ）：
Figure 0006884250
で表わされる。式中、Ｚ’は、５〜７員の複素環を表わす。構造（ＸＩ）のある実施形態では、Ｒ１２は、各出現箇所で水素である。例えば、リンケージ（Ｂ）が、下記構造（Ｂ１）、（Ｂ２）または（Ｂ３）：
Figure 0006884250
の１つを有してもよい。
ある他の実施形態では、Ｒ１２は、Ｃ１−Ｃ１２アルキルカルボニルまたは、アリールホスホリル部分、例えば、トリフェニルホスホリル部分により、さらに置換されたアミジルである。この構造を有するリンケージの例としては、Ｂ５６およびＢ５５があげられる。
ある実施形態では、リンケージ（Ｂ）は、構造Ａ１〜Ａ５のいずれも有さない。
表２は、（Ａ）型および（Ｂ）型の典型的なリンケージを示す。
Figure 0006884250
Figure 0006884250
Figure 0006884250
Figure 0006884250
Figure 0006884250
Figure 0006884250
Figure 0006884250
Figure 0006884250
Figure 0006884250
Figure 0006884250
Figure 0006884250
Figure 0006884250
以下の配列および記載において、前記リンケージについての上記名称が、多くの場合使用される。例えば、ＰＭＯａｐｎリンケージを含む塩基は、ａｐｎＢとして示される。Ｂは、塩基である。他のリンケージも、同様に指名される。さらに、略称が使用されてもよく、例えば、上記丸括弧内の略称が使用されてもよい（例えば、ａＢは、ａｐｎＢを意味する）。他の直ちに識別可能な略称も使用され得る。
Ｂ．修飾末端基を有するオリゴマー
前記キャリアペプチドに加えて、前記コンジュゲートは、修飾末端基を含むオリゴマーを含んでもよい。本願出願人は、種々の化学的部分による前記オリゴマーの３’端および／または５’端の修飾が、前記コンジュゲートに有利な治療特性（例えば、向上された細胞送達、有効性および／または組織分布等）を提供することを見出した。種々の実施形態において、前記修飾末端基は、疎水性部分を含む。一方、他の実施形態では、前記修飾末端基は、親水性部分を含む。前記修飾末端基は、前述のリンケージと共に、または、前述のリンケージなしに存在してもよい。例えば、一部の実施形態では、前記キャリアペプチドにコンジュゲートされた前記オリゴマーは、１つ以上の修飾末端基と、（Ａ）型リンケージ、例えば、Ｘが−Ｎ（ＣＨ３）２であるリンケージとを含む。他の実施形態では、前記オリゴマーは、１つ以上の修飾末端基と、（Ｂ）型リンケージ、例えば、Ｘが４−アミノピペリジン−１−イル（すなわち、ＡＰＮ）であるリンケージとを含む。さらに他の実施形態では、前記オリゴマーは、１つ以上の修飾末端基と、リンケージ（Ａ）および（Ｂ）の混合物とを含む。例えば、前記オリゴマーは、１つ以上の修飾末端基（例えば、トリチルまたはトリフェニルアセチル）と、Ｘが−Ｎ（ＣＨ３）２であるリンケージ、および、Ｘが４−アミノピペリジン−１−イルであるリンケージとを含んでもよい。修飾末端基と修飾リンケージとの他の組み合わせも、好ましい治療特性を前記オリゴマーに提供する。
一実施形態では、修飾末端を含む前記オリゴマーは、下記構造（ＸＶＩＩ）：
Figure 0006884250
または、その塩もしくはその異性体を有し、式中、Ｘ、ＷおよびＹは、リンケージ（Ａ）および（Ｂ）のいずれかについての上記定義の通りであり、
Ｒ１７は、各出現箇所で独立して、存在しないか、水素またはＣ１−Ｃ６アルキルであり；
Ｒ１８およびＲ１９は、各出現箇所で独立して、存在しないか、水素、前記キャリアペプチド、天然もしくは非天然のアミノ酸、Ｃ２−Ｃ３０アルキルカルボニル、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ２１またはＲ２０であり；
Ｒ２０は、各出現箇所で独立して、グアニジニル、ヘテロシクリル、Ｃ１−Ｃ３０アルキル、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル；Ｃ６−Ｃ３０アリール、Ｃ７−Ｃ３０アラルキル、Ｃ３−Ｃ３０アルキルカルボニル、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキルカルボニル、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキルアルキルカルボニル、Ｃ７−Ｃ３０アリールカルボニル、Ｃ７−Ｃ３０アラルキルカルボニル、Ｃ２−Ｃ３０アルキルオキシカルボニル、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキルオキシカルボニル、Ｃ７−Ｃ３０アリールオキシカルボニル、Ｃ８−Ｃ３０アラルキルオキシカルボニルまたは−Ｐ（＝Ｏ）（Ｒ２２）２であり；
Ｐｉは、各出現箇所で独立して、塩基対合部分であり；
Ｌ１は、アルキル、ヒドロキシル、アルコキシ、アルキルアミノ、アミド、エステル、ジスルフィド、カルボニル、カルバマート、ホスホロジアミダート、ホスホロアミダート、ホスホロチオアート、ピペラジンおよびホスホジエステルから選択される結合を含む、長さ１８個原子以下の必要に応じたリンカーであり；および、
ｘは、０またはそれより大きい整数であり；および、
Ｒ１８またはＲ１９の少なくとも１つが、Ｒ２０であり；および、
Ｒ１８またはＲ１９の少なくとも１つが、Ｒ２０であり、但し、Ｒ１７およびＲ１８は両方とも存在する。
修飾末端基を有する前記オリゴマーは、任意の数の（Ａ）型および（Ｂ）型リンケージを含み得る。例えば、前記オリゴマーは、（Ａ）型リンケージのみを含んでもよい。例えば、各リンケージにおけるＸは、−Ｎ（ＣＨ３）２でもよい。または、前記オリゴマーは、リンケージ（Ｂ）のみを含んでもよい。ある実施形態では、前記オリゴマーは、リンケージ（Ａ）および（Ｂ）の混合物を含み、例えば、１から４個のリンケージが（Ｂ）型であり、残りのリンケージが（Ａ）型である。この点で、リンケージとしては、制限されず、Ｘが、（Ｂ）型についてはアミノピペリジニル、および、（Ａ）型についてはジメチルアミノであるリンケージがあげられる。
一部の実施形態では、Ｒ１７は、存在しない。一部の実施形態では、Ｒ１７は、水素である。一部の実施形態では、Ｒ１７は、Ｃ１−Ｃ６アルキルである。一部の実施形態では、Ｒ１７は、メチルである。さらに他の実施形態では、Ｒ１７は、エチルである。一部の実施形態では、Ｒ１７は、Ｃ３アルキルである。一部の他の実施形態では、Ｒ１７は、イソプロピルである。他の実施形態では、Ｒ１７は、Ｃ４アルキルである。さらに他の実施形態では、Ｒ１７は、Ｃ５アルキルである。一部の他の実施形態では、Ｒ１７は、Ｃ６アルキルである。
他の実施形態では、Ｒ１８は、存在しない。一部の実施形態では、Ｒ１８は、水素である。一部の実施形態では、Ｒ１８は、前記キャリアペプチドである。一部の実施形態では、Ｒ１８は、天然もしくは非天然のアミノ酸、例えば、トリメチルグリシンである。一部の実施形態では、Ｒ１８は、Ｒ２０はである。
他の実施形態では、Ｒ１９は、存在しない。一部の実施形態では、Ｒ１９は、水素である。一部の実施形態では、Ｒ１９は、前記キャリアペプチドである。一部の実施形態では、Ｒ１９は、天然もしくは非天然のアミノ酸、例えば、トリメチルグリシンである。一部の実施形態では、Ｒ１９は、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ１７であり、例えば、Ｒ１９は、下記構造：
Figure 0006884250
を有してもよい。
他の実施形態では、Ｒ１８またはＲ１９は、Ｃ２−Ｃ３０アルキルカルボニル、例えば、−Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎＣＯ２Ｈであり、ｎは、１から６、例えば、２である。他の例では、Ｒ１８またはＲ１９は、アセチルである。
一部の実施形態では、Ｒ２０は、各出現箇所で独立して、グアニジニル、ヘテロシクリル、Ｃ１−Ｃ３０アルキル、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル；Ｃ６−Ｃ３０アリール、Ｃ７−Ｃ３０アラルキル、Ｃ３−Ｃ３０アルキルカルボニル、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキルカルボニル、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキルアルキルカルボニル、Ｃ６−Ｃ３０アリールカルボニル、Ｃ７−Ｃ３０アラルキルカルボニル、Ｃ２−Ｃ３０アルキルオキシカルボニル、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキルオキシカルボニル、Ｃ７−Ｃ３０アリールオキシカルボニル、Ｃ８−Ｃ３０アラルキルオキシカルボニル、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ２１または−Ｐ（＝Ｏ）（Ｒ２２）２である。Ｒ２１は、１つ以上の酸素もしくはヒドロキシル部分またはそれらの組み合わせを含むＣ１−Ｃ３０アルキルである。各Ｒ２２は、Ｃ６−Ｃ１２アリールオキシである。
ある他の実施形態では、Ｒ１９は、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ２１であり、Ｒ１８は、水素、グアニジニル、ヘテロシクリル、Ｃ１−Ｃ３０アルキル、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル；Ｃ６−Ｃ３０アリール、Ｃ３−Ｃ３０アルキルカルボニル、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキルカルボニル、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキルアルキルカルボニル、Ｃ７−Ｃ３０アリールカルボニル、Ｃ７−Ｃ３０アラルキルカルボニル、Ｃ２−Ｃ３０アルキルオキシカルボニル、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキルオキシカルボニル、Ｃ７−Ｃ３０アリールオキシカルボニル、Ｃ８−Ｃ３０アラルキルオキシカルボニルまたは−Ｐ（＝Ｏ）（Ｒ２２）２である。各Ｒ２２は、Ｃ６−Ｃ１２アリールオキシである。
他の実施形態では、Ｒ２０は、各出現箇所で独立して、グアニジニル、ヘテロシクリル、Ｃ１−Ｃ３０アルキル、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル；Ｃ６−Ｃ３０アリール、Ｃ３−Ｃ３０アルキルカルボニル、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキルカルボニル、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキルアルキルカルボニル、Ｃ７−Ｃ３０アリールカルボニル、Ｃ７−Ｃ３０アラルキルカルボニル、Ｃ２−Ｃ３０アルキルオキシカルボニル、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキルオキシカルボニル、Ｃ７−Ｃ３０アリールオキシカルボニル、Ｃ８−Ｃ３０アラルキルオキシカルボニルまたは−Ｐ（＝Ｏ）（Ｒ２２）２である。一方、他の例では、Ｒ２０は、各出現箇所で独立して、グアニジニル、ヘテロシクリル、Ｃ１−Ｃ３０アルキル、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル；Ｃ６−Ｃ３０アリール、Ｃ７−Ｃ３０アラルキル、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキルカルボニル、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキルアルキルカルボニル、Ｃ７−Ｃ３０アリールカルボニル、Ｃ７−Ｃ３０アラルキルカルボニル、Ｃ２−Ｃ３０アルキルオキシカルボニル、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキルオキシカルボニル、Ｃ７−Ｃ３０アリールオキシカルボニル、Ｃ８−Ｃ３０アラルキルオキシカルボニルまたは−Ｐ（＝Ｏ）（Ｒ２２）２である。
一部の実施形態では、Ｒ２０は、グアニジニル、例えば、モノメチルグアニジニルまたはジメチルグアニジニルである。他の実施形態では、Ｒ２０は、ヘテロシクリルである。例えば、一部の実施形態では、Ｒ２０は、ピペリジン−４−イルである。一部の実施形態では、ピペリジン−４−イルは、トリチルまたはＢｏｃの基により置換される。他の実施形態では、Ｒ２０は、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキルである。他の実施形態では、Ｒ２０は、Ｃ６−Ｃ３０アリールである。
一部の実施形態では、Ｒ２０は、Ｃ７−Ｃ３０アリールカルボニルである。例えば、一部の実施形態では、Ｒ２０は、下記構造（ＸＶＩＩＩ）：
Figure 0006884250
を有する。式中、Ｒ２３は、各出現箇所で独立して、水素、ハロ、Ｃ１−Ｃ３０アルキル、Ｃ１−Ｃ３０アルコキシ、Ｃ１−Ｃ３０アルキルオキシカルボニル、Ｃ７−Ｃ３０アラルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリルまたはヘテロシクロアルキル（ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌａｌｋｙｌ）である。１つのＲ２３は、もう１つのＲ２３と結合して、ヘテロシクリル環を形成してもよい。一部の実施形態では、少なくとも１つのＲ２３は、水素であり、例えば、一部の実施形態では、各Ｒ２３は、水素である。他の実施形態では、少なくとも１つのＲ２３は、Ｃ１−Ｃ３０アルコキシであり、例えば、一部の実施形態では、各Ｒ２３は、メトキシである。他の実施形態では、少なくとも１つのＲ２３は、ヘテロアリールであり、例えば、一部の実施形態では、少なくとも１つのＲ２３は、下記構造（ＸＶＩＩＩａ）または（ｏｆ）（ＸＶＩＩＩｂ）：
Figure 0006884250
の１つを有する。
さらに他の実施形態では、１つのＲ２３は、もう１つのＲ２３と結合して、ヘテロシクリル環を形成する。例えば、一実施形態では、Ｒ２０は、５−カルボキシフルオレセインである。
他の実施形態では、Ｒ２０は、Ｃ７−Ｃ３０アラルキルカルボニルである。例えば、種々の実施形態では、Ｒ２０は、下記構造（ＸＩＸ）、（ＸＸ）または（ＸＸＩ）：
Figure 0006884250
の１つを有する。
式中、Ｒ２３は、各出現箇所で独立して、水素、ハロ、Ｃ１−Ｃ３０アルキル、Ｃ１−Ｃ３０アルコキシ、Ｃ１−Ｃ３０アルキルオキシカルボニル、Ｃ７−Ｃ３０アラルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリルまたはヘテロシクロアルキル（ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌａｌｋｙｌ）である。１つのＲ２３は、もう１つのＲ２３と結合して、ヘテロシクリル環を形成してもよい。Ｘは、−ＯＨまたはハロである。ｍは、０から６の整数である。一部の特定の実施形態では、ｍは、０である。他の実施形態では、ｍは、１である。一方、他の実施形態では、ｍは、２である。他の実施形態では、少なくとも１つのＲ２３は、水素であり、例えば、一部の実施形態では、各Ｒ２３は、水素である。一部の実施形態では、Ｘは、水素である。他の実施形態では、Ｘは、−ＯＨである。他の実施形態では、Ｘは、Ｃｌである。他の実施形態では、少なくとも１つのＲ２３は、Ｃ１−Ｃ３０アルコキシであり、例えば、メトキシである。
さらに他の実施形態では、Ｒ２０は、Ｃ７−Ｃ３０アラルキル、例えば、トリチルである。他の実施形態では、Ｒ２０は、メトキシトリチルである。一部の実施形態では、Ｒ２０は、下記構造（ＸＸＩＩ）：
Figure 0006884250
を有する。ここで、Ｒ２３は、各出現箇所で独立して、水素、ハロ、Ｃ１−Ｃ３０アルキル、Ｃ１−Ｃ３０アルコキシ、Ｃ１−Ｃ３０アルキルオキシカルボニル、Ｃ７−Ｃ３０アラルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリルまたはヘテロシクロアルキル（ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌａｌｋｙｌ）である。１つのＲ２３は、もう１つのＲ２３と結合して、ヘテロシクリル環を形成してもよい。例えば、一部の実施形態では、各Ｒ２３は、水素である。他の実施形態では、少なくとも１つのＲ２３は、Ｃ１−Ｃ３０アルコキシであり、例えば、メトキシである。
さらに他の実施形態では、Ｒ２０は、Ｃ７−Ｃ３０アラルキルであり、Ｒ２０は、下記構造（ＸＸＩＩＩ）：
Figure 0006884250
を有する。
一部の実施形態では、少なくとも１つのＲ２３は、ハロ、例えば、クロロである。一部の他の実施形態では、１つのＲ２３は、パラ位におけるクロロである。
他の実施形態では、Ｒ２０は、Ｃ１−Ｃ３０アルキルである。例えば、一部の実施形態では、Ｒ２０は、Ｃ４−Ｃ２０アルキルであり、場合により、１つ以上の二重結合を含む。例えば、一部の実施形態では、Ｒ２０は、三重結合、例えば、末端三重結合を含むＣ４−Ｃ１０アルキルである。一部の実施形態では、Ｒ２０は、ヘキシン−６−イルである。一部の実施形態では、Ｒ２０は、下記構造（ＸＸＩＶ）、（ＸＸＶ）、（ＸＸＶＩ）または（ＸＸＶＩＩ）：
Figure 0006884250
の１つを有する。
さらに他の実施形態では、Ｒ２０は、Ｃ３−Ｃ３０アルキルカルボニル、例えば、Ｃ３−Ｃ１０アルキルカルボニルである。一部の実施形態では、Ｒ２０は、−Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｐＳＨまたは−Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｐＳＳＨｅｔであり、ｐは、１から６の整数であり、Ｈｅｔは、ヘテロアリールである。例えば、ｐは、１でもよいし、または、ｐは、２でもよい。他の例では、Ｈｅｔは、ピリジニル、例えば、ピリジン−２−イルである。他の実施形態では、Ｃ３−Ｃ３０アルキルカルボニルは、更なるオリゴマーにより置換される。例えば、一部の実施形態では、前記オリゴマーは、前記オリゴマーをもう１つのオリゴマーの３’位に結合する、Ｃ３−Ｃ３０アルキルカルボニルを、３’位に含む。このような末端修飾は、本開示のスコープ内に含まれる。
他の実施形態では、Ｒ２０は、アリールホスホリル部分、例えば、トリフェニルホスホリルにより、さらに置換されたＣ３−Ｃ３０アルキルカルボニルである。このようなＲ２０基の例としては、表３における構造３３があげられる。
他の例では、Ｒ２０は、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキルカルボニル、例えば、Ｃ５−Ｃ７アルキルカルボニルである。これらの実施形態では、Ｒ２０は、下記構造（ＸＸＶＩＩＩ）：
Figure 0006884250
を有する。式中、Ｒ２３は、各出現箇所で独立して、水素、ハロ、Ｃ１−Ｃ３０アルキル、Ｃ１−Ｃ３０アルコキシ、Ｃ１−Ｃ３０アルキルオキシカルボニル、Ｃ７−Ｃ３０アラルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリルまたはヘテロシクロアルキル（ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌａｌｋｙｌ）である。１つのＲ２３は、もう１つのＲ２３と結合して、ヘテロシクリル環を形成してもよい。一部の実施形態では、Ｒ２３は、ヘテロシクロアルキル（ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌａｌｋｙｌ）であり、例えば、一部の実施形態では、Ｒ２３は、下記構造：
Figure 0006884250
を有する。
一部の他の実施形態では、Ｒ２０は、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキルアルキルカルボニルである。他の実施形態では、Ｒ２０は、Ｃ２−Ｃ３０アルキルオキシカルボニルである。他の実施形態では、Ｒ２０は、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキルオキシカルボニルである。他の実施形態では、Ｒ２０は、Ｃ７−Ｃ３０アリールオキシカルボニルである。他の実施形態では、Ｒ２０は、Ｃ８−Ｃ３０アラルキルオキシカルボニルである。他の実施形態では、Ｒ２０は、−Ｐ（＝Ｏ）（Ｒ２２）２であり、各Ｒ２２は、Ｃ６−Ｃ１２アリールオキシである。例えば、一部の実施形態では、Ｒ２０は、下記構造（Ｃ２４）：
Figure 0006884250
を有する。
他の実施形態では、Ｒ２０は、１つ以上のハロ原子を含む。例えば、一部の実施形態では、Ｒ２０は、上記Ｒ２０部分のいずれかの、パーフルオロ類似体を含む。他の実施形態では、Ｒ２０は、ｐ−トリフルオロメチルフェニル、ｐ−トリフルオロメチルトリチル、パーフルオロペンチルまたはペンタフルオロフェニルを含む。
一部の実施形態では、３’末端が、修飾を含み、他の実施形態では、５’末端が、修飾を含む。他の実施形態では、３’末端および５’末端の両方が、修飾を含む。したがって、一部の実施形態では、Ｒ１８は、存在せず、Ｒ１９は、Ｒ２０である。他の実施形態では、Ｒ１９は、存在せず、Ｒ１８は、Ｒ２０である。さらに他の実施形態では、Ｒ１８およびＲ１９はそれぞれ、Ｒ２０である。
一部の実施形態では、前記オリゴマーは、３’または５’修飾に加えて、細胞浸透性ペプチドを含む。したがって、一部の実施形態では、Ｒ１９は、細胞浸透性ペプチドであり、Ｒ１８は、Ｒ２０である。他の実施形態では、Ｒ１８は、細胞浸透性ペプチドであり、Ｒ１９は、Ｒ２０である。前述の更なる実施形態では、前記細胞浸透性ペプチドは、アルギニンリッチのペプチドである。
一部の実施形態では、５’末端基（すなわち、Ｒ１９）を前記オリゴマーに結合するリンカーＬ１は、存在してもよいし、または、存在しなくてもよい。前記リンカーは、任意の数の官能基と、前記リンカーが、前記５’末端基を前記オリゴマーに結合するためのその能力を保持することが提供され、前記リンカーが、配列特異的に標的配列に結合するための前記オリゴマーの能力を妨害しないことが提供される、長さとを含む。一実施形態では、Ｌは、ホスホロジアミダートおよびピペラジン結合を含む。例えば、一部の実施形態では、Ｌは、下記構造（ＸＸＩＸ）：
Figure 0006884250
を有する。
式中、Ｒ２４は、存在しないか、水素またはＣ１−Ｃ６アルキルである。一部の実施形態では、Ｒ２４は、存在しない。一部の実施形態では、Ｒ２４は、水素である。一部の実施形態では、Ｒ２４は、Ｃ１−Ｃ６アルキルである。一部の実施形態では、Ｒ２４は、メチルである。他の実施形態では、Ｒ２４は、エチルである。さらに他の実施形態では、Ｒ２４は、Ｃ３アルキルである。一部の他の実施形態では、Ｒ２４は、イソプロピルである。さらに他の実施形態では、Ｒ２４は、Ｃ４アルキルである。一部の実施形態では、Ｒ２４は、Ｃ５アルキルである。さらに他の実施形態では、Ｒ２４は、Ｃ６アルキルである。
さらに他の実施形態では、Ｒ２０は、Ｃ３−Ｃ３０アルキルカルボニルである。Ｒ２０は、下記構造（ＸＸＸ）：
Figure 0006884250
を有する。式中、Ｒ２５は、水素または−ＳＲ２６であり、Ｒ２６は、水素、Ｃ１−Ｃ３０アルキル、ヘテロシクリル、アリールまたはヘテロアリールである。ｑは、０から６の整数である。
上記のいずれかの更なる実施形態では、Ｒ２３は、各出現箇所で独立して、水素、ハロ、Ｃ１−Ｃ３０アルキル、Ｃ１−Ｃ３０アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリルまたはヘテロシクロアルキル（ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌａｌｋｙｌ）である。
一部の他の実施形態では、前記オリゴマーの３’末端のみが、上記基の１つにコンジュゲートされる。一部の他の実施形態では、前記オリゴマーの５’末端のみが、上記基の１つにコンジュゲートされる。他の実施形態では、前記３’および５’末端の両方が、上記基の１つを含む。前記末端基は、上記基のいずれか１つ、または、表３に示される特定の基のいずれかから選択されてもよい。
Figure 0006884250
Figure 0006884250
Figure 0006884250
Figure 0006884250
Figure 0006884250
Figure 0006884250
Ｃ．コンジュゲートの特性
前述のように、本開示は、キャリアペプチドとオリゴヌクレオチド類似体（すなわち、オリゴマー）とのコンジュゲートに関する。前記オリゴマーは、前記オリゴマーに所望の特性（例えば、向上されたアンチセンス活性）を付与する、種々の修飾を含んでもよい。ある実施形態では、前記オリゴマーは、サブユニット間リンケージにより結合されたモルホリノ環構造の配列を含む骨格を含む。前記サブユニット間リンケージは、１つのモルホリノ環構造の３’端を、隣接するモルホリノ環構造の５’端に結合する。各モルホリノ環構造は、前記オリゴマーが、配列特異的な方法で、標的核酸に結合し得るように、塩基対合部分に結合される。前記モルホリノ環構造は、下記構造（ｉ）：
Figure 0006884250
を有してもよい。
式中、Ｐｉは、各出現箇所で独立して、塩基対合部分である。
各モルホリノ環構造は、塩基対合部分（Ｐｉ）を支持して、細胞または処置被験体における選択されたアンチセンス標的にハイブリダイズするために、典型的に設計された塩基対合部分の配列を形成する。前記塩基対合部分は、天然のＤＮＡまたはＲＮＡにおいて見出される、プリンもしくはピリミジン（Ａ、Ｇ、Ｃ、ＴまたはＵ）または、類似体、例えば、ヒポキサンチン（ヌクレオシドイノシンの塩基成分）もしくは５−メチルシトシンであり得る。前記オリゴマーに改善された結合親和性を付与する類似体塩基も、使用され得る。この点で、典型的な類似体としては、Ｃ５−プロピニル−修飾ピリミジン、９−（アミノエトキシ）フェノキサジン（Ｇ−クランプ）等があげられる。
前述のように、前記オリゴマーは、本発明の態様に基づいて修飾されて、１つ以上のリンケージ（Ｂ）を、例えば、２〜５個の荷電していないリンケージ毎に約１個以下、典型的には、１０個の荷電していないリンケージ毎に３〜５個含んでもよい。ある実施形態は、１つ以上の（Ｂ）型リンケージも含む。一部の実施形態では、アンチセンス活性における最適な改善は、約半分以下の骨格リンケージが（Ｂ）型である場合に見られる。おおよそ、最大向上は、典型的には、例えば、１０〜２０％の少量のリンケージ（Ｂ）でも見られる。
一実施形態では、（Ａ）型および（Ｂ）型リンケージは、前記骨格に沿ってちりばめられている。一部の実施形態では、前記オリゴマーは、その長さ全体に沿って、リンケージ（Ａ）および（Ｂ）の代替パターンを厳密に有していない。前記キャリアペプチドに加えて、前記オリゴマーは、場合により、前述のように、５’および／または３’修飾を含み得る。
オリゴマーは、リンケージ（Ａ）のブロックとリンケージ（Ｂ）のブロックとを有するとも考えられる。例えば、リンケージ（Ａ）の中央ブロックが、リンケージ（Ｂ）のブロックにより、側面に位置されてもよく、逆もまた同様である。一実施形態では、前記オリゴマーは、おおよそ等しい長さの、５’、３；および中央の領域を有する。前記中央領域におけるリンケージ（Ｂ）または（Ａ）の割合は、約５０％より高く、または（ｏ）、約７０％より高い。アンチセンス用途に使用するオリゴマーは、一般的に、長さが約１０個から約４０個のサブユニット、より好ましくは約１５個から２５個のサブユニットの範囲である。例えば、１９〜２０個のサブユニットを有し、アンチセンスオリゴマーとして有用な長さを有する本発明のオリゴマーは、理想的には、２から７個、例えば、４から６個または３から５個のリンケージ（Ｂ）および、残りのリンケージ（Ａ）を有してもよい。１４〜１５個のサブユニットを有するオリゴマーは、理想的には、２から５個、例えば、３または４個のリンケージ（Ｂ）および、残りのリンケージ（Ａ）を有してもよい。
前記モルホリノサブユニットは、以下にさらに記載するように、非リンベースのサブユニット間リンケージにより結合されてもよい。
その非修飾状態で荷電していないが、ペンダントアミン置換基も有し得る、他のオリゴヌクレオチド類似体リンケージも使用され得る。例えば、モルホリノ環上の５’窒素原子は、スルファミドリンケージ（または、リンが炭素または硫黄にそれぞれ置換された場合、尿素リンケージ）に使用され得る。
アンチセンス用途についての一部の実施形態では、前記オリゴマーは、前記核酸標的配列に、１００％相補的であってもよく、または、前記オリゴマーと核酸標的配列との間に形成されたヘテロ二本鎖が、細胞ヌクレアーゼの作用および、ｉｎ ｖｉｖｏで起こり得る他の方式の分解に抵抗するのに十分安定している限りは、例えば、変異を調整するためのミスマッチを含んでもよい。ミスマッチが存在する場合、中央におけるより、ハイブリッド二本鎖の末端領域に向かって不安定になる。許容されるミスマッチの数は、二本鎖の安定性において十分理解された原理に基づいて、前記オリゴマーの長さ、前記二本鎖におけるＧ：Ｃ塩基対の割合、および、前記二本鎖におけるミスマッチの位置により決まるであろう。このようなアンチセンスオリゴマーは、核酸標的配列に対して、必ずしも１００％相補的ではないが、前記核酸標的の生物学的活性、例えば、コードされたタンパク質の発現が調節されるように、前記標的配列に対する安定的で、特異的な結合に効果的である。
オリゴマーと前記標的配列との間で形成された前記二本鎖の安定性は、結合Ｔｍと、細胞酵素的開裂に対する前記二本鎖の感受性との作用である。相補的な配列ＲＮＡに対するアンチセンス化合物のＴｍは、従来の方法、例えば、Ｈａｍｅｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８５，ｐｐ．１０７−１０８により記載されたものにより、または、Ｍｉｙａｄａ Ｃ．Ｇ．ａｎｄ Ｗａｌｌａｃｅ Ｒ．Ｂ．，１９８７，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｖｏｌ．１５４ ｐｐ．９４−１０７に記載のように、測定され得る。
一部の実施形態では、各アンチセンスオリゴマーは、体温より高い、または、他の実施形態では、５０℃より高い、相補的な配列ＲＮＡに対する結合Ｔｍを有する。他の実施形態では、Ｔｍは、６０−８０℃より高い範囲である。周知の原理に基づいて、相補性ベースのＲＮＡハイブリッドに対するオリゴマー化合物のＴｍは、前記二本鎖におけるＣ：Ｇ対塩基の比率の増加により、および／または、前記ヘテロ二本鎖の（塩基対における）長さの増加により、向上され得る。同時に、細胞取り込みを最適化する目的のために、前記オリゴマーのサイズを制限するのが有効であり得る。この理由に関して、長さ２０塩基以下で、高いＴｍ（５０℃より高い）を示す化合物は、高いＴｍ値のために、２０塩基より長いのを必要とするものに対して、一般的に好ましい。一部の用途に関して、より長い、例えば、２０塩基より長いオリゴマーは、特定の利点を有し得る。例えば、ある実施形態では、より長いオリゴマーにより、エクソンスキッピングまたはスプライス調節に使用するための特定の有用性が見出され得る。
前記ターゲッティング配列塩基は、通常のＤＮＡ塩基でもよいし、または、その類似体、例えば、標的配列ＲＮＡ塩基にワトソン−クリック塩基対合が可能な、ウラシルおよびイノシンでもよい。
前記オリゴマーは、標的ヌクレオチドがウラシル残基の場合、アデニンの代わりにグアニン塩基を包含してもよい。このことは、前記標的配列が、種々のウイルス種にわたって変化し、任意の所定のヌクレオチド残基での変異が、シトシンまたはウラシルのいずれかである場合、有用である。前記ターゲッティングオリゴマーにおいて、可変部分にグアニンを使用することにより、ウラシルとの塩基対（Ｃ／Ｕ：Ｇ塩基対と呼ばれる）に対するグアニンの周知の能力が、利用され得る。これらの位置にグアニンを包含することにより、単一のオリゴマーが、幅広い範囲のＲＮＡ標的可変性を、効果的に標的とし得る。
前記化合物（例えば、オリゴマー、サブユニット間リンケージ、末端基）には、種々の異性体、例えば、構造異性体（例えば、互換異性体）が存在してもよい。立体異性体に関しては、前記化合物は、キラル中心を有してもよく、ラセミ化合物、鏡像異性体的に濃縮された混合物、個々の鏡像体、ジアステレオマーの混合物または個々のジアステレオマーとして存在してもよい。全てのこのような異性体は、それらの混合物を含めて、本発明内に含まれる。前記化合物は、アトロプ異性体をもたらし得る軸性キラリティーを有してもよい。さらに、前記化合物における一部の結晶形は、多形体として存在してもよく、前記多形体は、本発明に含まれる。さらに、一部の化合物は、水との溶媒和物、または、他の有機溶媒和物を形成してもよい。このような溶媒和物は、同様に、本発明のスコープ内に含まれる。
本願明細書に記載の前記オリゴマーは、タンパク質の産生またはウイルスの複製を阻害する方法に使用されてもよい。したがって、一実施形態では、このようなタンパク質をコードする核酸は、本願明細書に開示のオリゴマーに曝される。前述の更なる実施形態では、前記アンチセンスオリゴマーは、本願明細書に開示のように、５’もしくは３’修飾末端基のいずれか、またはそれらの組み合わせを含み、前記塩基対部分Ｂは、前記タンパク質の産生を阻害するのに効果的な位置における前記核酸の部分に対して、ハイブリダイズするのに効果的な配列を形成する。一実施形態では、前記位置は、ｍＲＮＡのＡＴＧ開始コドン領域、プレ−ｍＲＮＡのスプライス部位、または、以下に記載するウイルスの標的配列である。
一実施形態では、前記オリゴマーは、前記標的配列への結合に対して、約５０℃より高いＴｍを有し、哺乳類の細胞または細菌の細胞により取り込まれる。もう１つの実施形態では、前記オリゴマーは、本願明細書に記載のように、輸送部分、例えば、アルギニンリッチペプチドにコンジュゲートされて、このような取り込みを促進し得る。もう１つの実施形態では、本願明細書に記載の前記末端修飾は、輸送部分として機能して、哺乳類および／または細菌の細胞による取り込みを促進し得る。
モルホリノオリゴマーの調製および特性は、以下により詳細に記載され、および、米国特許第５，１８５，４４４号明細書および国際公開第２００９／０６４４７１号に記載されており、それらの全体は参照に本願明細書に取り込まれる。
Ｄ．コンジュゲートの配合および投与
本開示は、前記開示されたコンジュゲートの配合および送達も提供する。したがって、一実施形態では、本開示は、本願明細書に開示のペプチド−オリゴマーコンジュゲートと、薬学的許容され得る媒体とを含む組成物に関する。
前記標的核酸に対する前記コンジュゲートの効果的な送達は、処置の重要な態様である。アンチセンスオリゴマー送達の経路としては、制限されず、経口および非経口の経路、例えば、静脈、皮下、腹腔内および筋肉内を含む種々の全身経路、ならびに吸入、経皮的送達および局所送達があげられる。適切な経路は、処置下の被験体の症状に適合するように、当業者により決定され得る。例えば、皮膚のウイルス感染の処置におけるアンチセンスオリゴマーの送達に適した経路は、局所送達である。一方、ウイルスの呼吸器感染の処置用のアンチセンスオリゴマーの送達は、吸入による。前記オリゴマーは、ウイルス感染部位に直接送達されてもよいし、または、血流に送達されてもよい。
前記コンジュゲートは、生理学的および／または薬学的に許容され得る、任意の便利な媒体において投与されてもよい。このような組成物は、当業者により使用される、任意の各種の標準的な薬学的に許容され得るキャリアを含んでもよい。例えば、制限されず、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、水、水性エタノール、エマルジョン、例えば、油／水エマルジョンまたはトリグリセリドエマルジョン、錠剤およびカプセルがあげられる。適切な生理学的に許容され得るキャリアの選択は、選択される投与方式に応じて変更されるであろう。
本発明の化合物（例えば、コンジュゲート）は、一般的に、遊離酸または遊離塩基として使用され得る。または、本発明の化合物は、酸または塩基付加塩の状態で使用され得る。本発明の遊離アミノ化合物の酸付加塩は、当該分野における周知の方法により調製され、有機および無機の酸から形成され得る。適切な有機酸としては、マレイン酸、フマル酸、安息香酸、アスコルビン酸、コハク酸、メタンスルホン酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、シュウ酸、プロピオン酸、酒石酸、サリチル酸、クエン酸、グルコン酸、乳酸、マンデル酸、桂皮酸、アスパラギン酸、ステアリン酸、パルミチン酸、グリコール酸、グルタミン酸およびベンゼンスルホン酸があげられる。適切な無機酸としては、塩化水素酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸および硝酸があげられる。塩基付加塩は、カルボン酸アニオンと形成するそれらの塩を含み、有機および無機のカチオン、例えば、アルカリ金属およびアルカリ土類金属（例えば、リチウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、バリウムおよびカルシウム）ならびに、アンモニウムイオンならびに、それらの置換誘導体（例えば、ジベンジルアンモニウム、ベンジルアンモニウム、２−ヒドロキシエチルアンモニウム等）から選択されるものと形成される塩を含む。このため、構造（Ｉ）の「薬学的に許容され得る塩」の用語は、任意および全ての許容され得る塩形態を包含することを意図する。
さらに、プロドラッグも、本発明の文脈内に含まれる。プロドラッグは、このようなプロドラッグが患者に投与された際、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて構造（Ｉ）の化合物を放出する、任意に共有結合されたキャリアである。プロドラッグは、一般的に、ルーチン操作により、または、ｉｎ ｖｉｖｏのいずれかで、前記修飾が開裂されて、親化合物を生じるような方法において、官能基を修飾することにより調製される。プロドラッグとしては、例えば、患者に投与され、開裂して、ヒドロキシ、アミンまたはスルフヒドリルの基を形成する場合、ヒドロキシ、アミンまたはスルフヒドリルの基が任意の基に結合される、本発明の化合物があげられる。したがって、典型的なプロドラッグとしては、（制限されず）構造（Ｉ）の化合物におけるアルコールおよびアミン官能基の酢酸塩、ギ酸塩および安息香酸塩誘導体があげられる。さらに、カルボン酸（−ＣＯＯＨ）の場合、エステル、例えば、メチルエステル、エチルエステル等が使用され得る。
一部の例では、細胞内への前記アンチセンスオリゴヌクレオチドの取り込みを促進するために、リポソームが使用され得る（例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｓ．Ａ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ １０（１２）：１９８０−１９８９，１９９６；Ｌａｐｐａｌａｉｎｅｎら、Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ．２３：１１９，１９９４；Ｕｈｌｍａｎｎら、ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ：ａ ｎｅｗ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｖｏｌｕｍｅ ９０，Ｎｏ．４，ｐａｇｅｓ ５４４−５８４，１９９０；Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，Ｇ．，Ｃｈａｐｔｅｒ １４，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ，Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｐｐ．２８７−３４１，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９７９を参照のこと）。例えば、国際公開第９３／０１２８６号に記載のように、アンチセンスオリゴマー投与用の媒体として、ヒドロゲルが使用されてもよい。または、前記オリゴヌクレオチドは、マイクロスフェアまたはマイクロ粒子で投与されてもよい（例えば、Ｗｕ，Ｇ．Ｙ．ａｎｄ Ｗｕ，Ｃ．Ｈ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２，１９８７を参照のこと）。または、米国特許第６，２４５，７４７号明細書に記載のように、アンチセンスオリゴマーと複合されたガス充填マイクロバブルの使用が、標的組織への送達を向上し得る。持続放出性の組成物も使用され得る。これらは、成形した物品、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの形態における、半透過性ポリマーマトリクスを含んでもよい。
一実施形態では、アンチセンス阻害は、特定のウイルスの複製を阻害するのに効果的なアンチセンス剤とウイルスに感染した細胞とを接触させることにより、ウイルスによる宿主動物における感染を処置するのに効果的である。前記アンチセンス剤は、適切な薬学的なキャリアで、所定のウイルスに感染した哺乳類の被験体、例えば、ヒトまたは家畜に投与される。前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、宿主におけるＲＮＡウイルスの増殖を阻害することが、考慮される。前記宿主の正常な成長または発達に対する有害作用がほとんどないか、または、前記有害作用がない状態で、前記ＲＮＡウイルスは、数が減少され、または、除去される。
前記方法の一態様では、前記被験体は、ヒトの被験体、例えば、局所または全身性のウイルス感染を有すると診断された患者である。患者の症状、例えば、（１）免疫不全である；（２）やけど患者である；（３）留置カテーテルを有する、または（４）外科手術を受けるもしくは最近受けた患者の場合も、本発明のアンチセンスオリゴマーの予防的投与に影響する。好ましい一実施形態では、前記オリゴマーは、薬学的に許容され得るキャリアに含まれるホスホロジアミダートモルホリノオリゴマーであり、経口的に送達される。もう１つの好ましい実施形態では、前記オリゴマーは、薬学的に許容され得るキャリアに含まれるホスホロジアミダートモルホリノオリゴマーであり、静脈に送達される（ｉ．ｖ．）。
本発明の別の用途では、前記被験体は、家畜動物、例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、ブタ、ウシまたはヤギ等である。前記処置は、予防または治療のいずれかである。本発明は、治療量以下の量の上記種類の抗ウイルス性アンチセンス化合物を補った穀類を含む、家畜および家禽の飼料組成物も含む。治療量以下のレベルの抗ウイルス剤を補った穀類で家畜および家禽を飼育する方法において、穀類が、前述のように、治療量以下の量の抗ウイルス性オリゴヌクレオチド組成物で補われる、改善も考慮される。
一実施形態では、前記コンジュゲートは、少なくとも２００〜４００ｎＭのアンチセンスオリゴマーのピーク血中濃度をもたらすのに効果的な量および方法で投与される。典型的に、アンチセンスオリゴマーの１回以上の投与が、一般的に、約１から２週間の期間に、一定間隔で投与される。経口投与についての好ましい投与量は、７０ｋｇあたりに、約１〜１０００ｍｇのオリゴマーである。一部の場合には、１０００ｍｇオリゴマー／患者より多い投与量が必要となる場合がある。ｉ．ｖ．投与に関して、好ましい投与量は、７０ｋｇあたりに、約０．５ｍｇから１０００ｍｇのオリゴマーである。前記コンジュゲートは、例えば、２週間以内の短い期間に毎日一定間隔で投与されてもよい。ただし、一部の場合には、前記コンジュゲートは、長期間にわたって断続的に投与される。投与は、抗生物質の投与または他の治療的処置に続けられてもよいし、または、併用されてもよい。処置計画は、処置下における被験体の免疫学的アッセイ、他の生化学試験および生理学的実験の結果に基づいて、適応があれば、（投与量、頻度、経路等を）調節され得る。
本発明のコンジュゲートを使用するｉｎ ｖｉｖｏでの処置計画における有効性は、投与の継続期間、投与量、頻度および経路ならびに、処置下における被験体の症状に基づいて、変動し得る（すなわち、予防投与対、局所または全身性感染に対する投与）。したがって、このようなｉｎ ｖｉｖｏの治療は、最適な治療結果を達成するために、多くの場合、処置下において、特定の種類のウイルス感染に適した試験によりモニタリングし、投与量または処置計画における対応する調節をする必要があるであろう。処置は、例えば、疾病および／または感染の一般的な指針、例えば、完全血球算定（ＣＢＣ）、核酸検出法、免疫診断試験、ウイルス培養またはヘテロ二本鎖検出によりモニターされてもよい。
ｉｎ ｖｉｖｏにおいて投与された本発明の抗ウイルスコンジュゲートの、１種類以上のＲＮＡウイルスの増殖を阻害または除去することにおける有効性は、前記アンチセンスオリゴマーの投与前、投与中および投与後に被験体から採取した、生物学的サンプル（組織、血液、尿等）から決定され得る。このようなサンプルのアッセイはとしては、（１）当業者に公知の手法、例えば、電気泳動ゲル移動度アッセイを使用し、標的および非標的配列とのヘテロ二本鎖形成の有無をモニターすること；（２）標準的な技術、例えば、ＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロッティングにより測定する場合の、ウイルスタンパク質産生量をモニターすること、または（３）例えば、スペアマン−カーバー法により、ウイルス力価における効果を測定すること（例えば、Ｐａｒｉ，Ｇ．Ｓ．ら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ３９（５）：１１５７−１１６１，１９９５；Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｋ．Ｐ．ら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ
ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ４０（９）：２００４−２０１１，１９９６，Ｃｏｔｔｒａｌ，Ｇ．Ｅ．（ｅｄ）ｉｎ：Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｐ．６０−９３，１９７８を参照のこと）があげられる。
Ｅ．コンジュゲートの調製
前記モルホリノサブユニット、前記修飾サブユニット間リンケージおよび、それらを含むオリゴマーは、実施例ならびに、その全体が参照により本願明細書に取り込まれる、米国特許第５，１８５，４４４および７，９４３，７６２号明細書に記載のように、調製され得る。前記モルホリノサブユニットは、下記の一般的な反応スキームＩに基づいて調製され得る。
反応スキーム１．モルホリノサブユニットの調製
Figure 0006884250
反応スキーム１を参照して、Ｂは、塩基対部分を表わし、ＰＧは、保護基を表わす。前記モルホリノサブユニットは、対応するリボヌクレオシド（１）から、示されるように調製され得る。前記モルホリノサブユニット（２）は、場合により、適切な保護基前駆体、例えば、塩化トリチルとの反応により保護されてもよい。３’保護基は、一般的に、以下により詳細に記載されるように、固相オリゴマー合成中に除去される。塩基対合部分（ｐｏｉｅｔｙ）は、固相オリゴマー合成の間に、適切に保護され得る。適切な保護基としては、アデニンおよびシトシンについてはベンゾイル、グアニンについてはフェニルアセチル、ヒポキサンチン（Ｉ）についてはピバロイルオキシメチルがあげられる。前記ピバロイルオキシメチル基は、ヒポキサンチン複素環塩基のＮ１位上に導入され得る。保護されていないヒポキサンチンサブユニットが使用されてもよいが、前記塩基が保護された場合、活性化反応における収率が、はるかに優れている。他の適切な保護基としては、その全体が参照により本願明細書に取り込まれる、同時係属の米国特許出願特願１２／２７１，０４０号に開示されたものがあげられる。
３と活性化リン化合物４との反応は、所望のリンケージ部分（５）を有するモルホリノサブユニットをもたらす。構造４の化合物は、当業者に公知の任意数の方法を使用して調製され得る。例えば、このような化合物は、対応するアミンとオキシ塩化リンとの反応により調製され得る。この点で、前記アミン開始材料は、当該分野において公知の任意の方法、例えば、実施例および、米国特許第７，９４３，７６２号明細書に記載された方法を使用して調製され得る。上記スキームは、（Ｂ）型（例えば、Ｘが−ＮＲ８Ｒ９である）リンケージの調製を示すが、（Ａ）型リンケージ（例えば、Ｘが、ジメチルアミンである）が、類似の方法で調製され得る。
構造５の化合物は、前記サブユニット間リンケージを含むオリゴマーの調製についての、固相自動化オリゴマー合成に使用され得る。このような方法は、当該分野において周知である。つまり、構造５の化合物は、固体支持体に対するリンカーを含むように、５’端で修飾され得る。例えば、化合物５は、Ｌ１および／またはＲ１９を含むリンカーにより、固体支持体に結合され得る。典型的な方法は、図３および４に示される。このようにして、前記オリゴは、オリゴマー合成が完了し、前記オリゴマーが前記固体支持体から切断された後に、５’末端修飾を含み得る。支持される時点で、５の保護基（例えば、トリチル）は除去され、結合していないアミンが、構造５の第２の化合物における活性化リン部分と反応される。所望の長さのオリゴが得られるまで、この順序が繰り返される。５’末端における前記保護基は、除去されてもよいし、５’修飾が必要であれば残してもよい。前記オリゴは、任意数の方法、または、前記固体支持体に対する前記リンケージを切断するための塩基との実施例の処理を使用して、前記固体支持体から除去され得る。
ペプチドオリゴマーコンジュゲートは、（当該分野において公知の標準的なペプチド合成法に基づいて調製された）所望のペプチドと、結合していないＮＨ（例えば、モルホリノオリゴマーの３’ＮＨ）を含むオリゴマーとを、適切な活性化試薬（例えば、ＨＡＴＵ）の存在下において結合することにより、調製され得る。コンジュゲートは、当該分野において公知の多数の技術、例えば、ＳＣＸクロマトグラフィーを使用して、精製され得る。
修飾モルホリノサブユニットおよびペプチドオリゴマーコンジュゲートの調製は、実施例により詳細に記載されている。任意数の修飾リンケージを含む前記ペプチドオリゴマーコンジュゲートは、本願明細書に記載の方法、当該分野において公知の方法および／または本願明細書での参考文献に記載される方法を使用して、調製され得る。実施例に記載されたものは、以前に記載された（例えば、国際公開第２００８０３６１２７号を参照のこと）のと同様に、調製されたＰＭＯ＋モルホリノオリゴマーの全体的な修飾である。
Ｆ．オリゴマーのアンチセンス活性
本開示は、タンパク質の産生を阻害する方法も提供する。前記方法は、前記タンパク質をコードする核酸を、本願明細書に開示のペプチド−オリゴマーコンジュゲートに曝す工程を含む。したがって、一実施形態では、このようなタンパク質をコードする核酸は、本願明細書に開示のように、コンジュゲートに曝される。前記塩基対合部分Ｐｉが、前記タンパク質の産生を阻害するのに効果的な位置において、前記核酸の一部にハイブリダイズするのに効果的な配列を形成する。前記オリゴマーは、例えば、ｍＲＮＡのＡＴＧ開始コドン領域、プレ−ｍＲＮＡのスプライス部位、または、以下に記載するウイルスの標的配列を標的としてもよい。
もう１つの実施形態では、本開示は、モルホリノサブユニットの配列を有し、サブユニット間リンケージにより結合され、塩基対合部分を支持する、オリゴヌクレオチド類似体を含む、ペプチドオリゴマーコンジュゲートのアンチセンス活性を向上する方法を提供する。前記方法は、本願明細書に記載のキャリアペプチドを、前記オリゴヌクレオチドにコンジュゲートする工程を含む。
一部の実施形態では、アンチセンス活性の向上は、
（ｉ）前記アンチセンスオリゴマーのその標的配列への結合が、前記コードされるタンパク質用の翻訳開始コドンを妨害するのに効果的な場合に、対応する非修飾のオリゴマーにより提供されたそれと比較して、コードされたタンパク質の発現における減少、または、
（ｉｉ）前記アンチセンスオリゴマーのその標的配列への結合が、正確にスプライシングされた、前記タンパク質をコードするプレ−ｍＲＮＡにおける異常なスプライス部位を妨害するのに効果的な場合に、対応する非修飾のオリゴマーにより提供されたそれと比較して、コードされたタンパク質の発現における増加により証明され得る。これらの効果の測定に適したアッセイは、以下にさらに記載される。一実施形態では、修飾は、無細胞翻訳アッセイ、細胞培養におけるスプライス修正翻訳アッセイ、または、本願明細書に記載の機能性動物モデル系のスプライス修正ゲインにおいて、この活性を提供する。一実施形態では、活性は、少なくとも２つ、少なくとも５つまたは少なくとも１０個の因子により向上される。
本発明のコンジュゲートについての、抗ウイルス用途、神経筋疾患の処置、細菌感染、炎症および多発性嚢胞腎を含む、種々の典型的な用途が、以下に記載される。この記載は、決して本発明を限定することを意味しておらず、本願明細書に記載のコンジュゲートを使用して解決され得る、ヒトおよび動物の疾患症状の範囲を例示するのに役立つものである。
Ｇ．コンジュゲートの典型的な治療的使用
前記キャリアペプチドにコンジュゲートされた前記オリゴマーは、良好な有効性と低い毒性とを含み、このため、他のオリゴマーまたはペプチド−オリゴマーコンジュゲートで得られるよりも、良好な治療的手段をもたらす。下記の記載は、制限されず、前記コンジュゲートの典型的な治療的使用の例を提供する。
１．ｓｓＲＮＡウイルスのステム−ループ２次構造のターゲッティグ
典型的なアンチセンス抗ウイルス化合物の一分類は、１２−４０個のサブユニットの配列を有し、標的ウイルスのポジティブセンスＲＮＡ鎖の５’末端の４０塩基内における、ステム−ループ２次構造に関連する領域に相補的な配列を標的とする、本願明細書に記載のモルホリノオリゴマーである（例えば、参照により本願明細書に取り込まれる、国際公開第２００６／０３３９３３号または米国特許出願公開第２００６０２６９９１１および２００５００９６２９１号明細書を参照こと）。
前記方法は、まず、配列が内部ステム−ループ２次構造を形成可能な、感染ウイルスにおけるポジティブ鎖の５’末端の４０塩基内の領域を、ウイルスの標的配列として同定する工程を含む。次いで、内部二本鎖構造を形成可能なウイルス−ゲノム領域に相補的な、少なくとも１２個のサブユニットのターゲッティング配列を有するモルホリノオリゴマーが、段階的な固相合成により構築される。前記オリゴマーは、前記ウイルスのポジティブセンス鎖と前記オリゴヌクレオチド化合物とから構成され、Ｔｍが少なくとも４５℃の乖離、このようなステム−ループ構造の分解により特徴付けられる、ウイルス標的配列についてのヘテロ二本鎖構造を形成可能である。前記オリゴマーは、本願明細書に記載のキャリアペプチドにコンジュゲートされる。
前記標的配列は、５’末端配列、例えば、５’末端の４０塩基を、入力ＲＮＡ配列の最少自由エネルギー状態についての調査に基づく、２次構造予測を実行可能なコンピュータプログラムにより分析することにより特定され得る。
関連する態様では、前記コンジュゲートは、一本鎖のポジティブ−センスゲノムを有し、フラビウイルス、ピコルナウイルス、カリシウイルス、トガウイルス、アルテリウイルス、コロナウイルス、アストロウイルスまたはヘペウイルスの科の１つから選択される、感染ＲＮＡウイルスの複製を、哺乳類の宿主細胞において阻害する方法に使用され得る。前記方法は、感染した宿主細胞に、ウイルス阻害量の本願明細書に記載の、内部ステム−ループ２次構造を形成可能な、ポジティブ鎖ウイルスゲノムの５’末端の４０塩基内の領域に相補的な、少なくとも１２個のサブユニットのターゲッティング配列を有するコンジュゲートを投与する工程を含む。前記コンジュゲートは、（ｉ）前記ウイルスのポジティブセンス鎖と前記オリゴヌクレオチド化合物とから構成され、（ｉｉ）Ｔｍが少なくとも４５℃の乖離および、このようなステム−ループ２次構造の分解により特徴付けられる、ヘテロ二本鎖構造を形成するために、前記宿主細胞に投与された場合、効果的である。前記コンジュゲートは、前記ウイルスに感染した、または、前記ウイルスによる感染リスクがある哺乳類の被験体に投与され得る。
デング熱ウイルスおよび日本脳炎ウイルスの末端ステムループ構造を標的とする典型的なターゲッティング配列は、配列番号１および２として、以下にそれぞれ列記される。
ｓｓＲＮＡウイルスの末端ステムループ構造を標的とする、更なる典型的なターゲッティング配列が、参照により本願明細書に取り込まれる、米国特許出願特願１１／８０１，８８５号および国際公開第２００８／０３６１２７号にも見出され得る。
２．ｓｓＲＮＡウイルスの第１のオープンリーディングフレームのターゲッティング
典型的なコンジュゲートの第２分類は、一本鎖で、１２ｋｂ未満のポジティブセンスゲノムおよび、多機能性タンパク質を含むポリタンパク質をコードする、第１のオープンリーディングフレームを有する、ピコルナウイルス、カリシウイルス、トガウイルス、コロナウイルスおよびフラビウイルスの科のウイルスについての増殖の阻害における使用についてである。特定の実施形態では、前記ウイルスは、コロナウイルス科または、フラビウイルスの科由来の西ナイルウイルス、黄熱病ウイルスまたはデング熱ウイルス由来のＲＮＡウイルスである。前記阻害性コンジュゲートは、本願明細書に記載の、前記ウイルスゲノムの第１のオープンリーディングフレームのＡＵＧ開始部位に及ぶ、ウイルス標的配列に対して実質的に相補的なターゲッティング塩基配列を有する、アンチセンスオリゴマーを含む。前記方法の一実施形態では、前記コンジュゲートは、前記ウイルスに感染した哺乳類の被験体に投与される。例えば、参照により本願明細書に取り込まれる、国際公開第２００５／００７８０５号および米国特許出願公開第２００３２２４３５３号明細書を参照のこと。
好ましい標的配列は、前記ウイルスゲノムの第１のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ１）のＡＵＧ開始部位に及ぶ領域である。前記第１のＯＲＦは、一般的に、非構造タンパク質、例えば、ポリメラーゼ、ヘリカーゼおよびプロテアーゼを含むポリタンパク質をコードする。「ＡＵＧ開始部位に及ぶ」は、前記標的配列が、一方の側のＡＵＧ開始部位上の少なくとも３つの塩基、および、他のものの少なくとも２つの塩基（合計で少なくとも８つの塩基）を含むことを意味する。好ましくは、前記標的配列が、両側の前記開始部位上の少なくとも４つの塩基（合計で少なくとも１１個の塩基）を含む。
より一般的には、好ましい標的部位は、各種ウイルス単離株間に保存される標的を含む。他の好ましい部位としては、ＩＲＥＳ（内部リボソーム侵入部位）、トランス活性化タンパク質結合部位および複製開始部位があげられる。複数の不必要な遺伝子を提供し得る複合体および大きなウイルスゲノムは、ウイルス侵入およびウイルスの存在に対する宿主応答用にコードする宿主細胞遺伝子を標的とすることより、効果的に標的にされ得る。
各種のウイルス−ゲノム配列は、周知の供給元、例えば、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｂａｎｋデータベースから入手できる。ＯＲＦ１のＡＵＧ開始部位は、前記遺伝子データベースまたは参考文献によっても特定され得る。または、ＯＲＦ１のＡＵＧ開始部位は、予測されたＯＲＦ１開始部位の領域において、ＡＵＧコドンについての配列をスキャンすることにより見出され得る。
４種類のウイルス科それぞれについての、全体的なゲノム機構は、以下の通りであり、続けて、各科内で選択されたメンバー（属、種または株）についての典型的な標的配列を得た。
３．インフルエンザウイルスのターゲッティング
典型的なコンジュゲートの第３の分類は、オルソミクソウイルス科のウイルスの増殖阻害、および、ウイルス感染の処置に使用される。一実施形態では、前記宿主細胞は、本願明細書に記載のコンジュゲートに接触される。例えば、前記コンジュゲートは、下記：１）ネガティブセンスウイルスＲＮＡ断片の５’末端または３’末端の２５塩基；２）ポジティブセンスｃＲＮＡの５’末端または３’末端の末端２５塩基；３）インフルエンザウイルスのｍＲＮＡにおけるＡＵＧ開始コドン付近の４５塩基；４）選択的スプライシングの影響を受けるインフルエンザｍＲＮＡのスプライスドナーまたはアクセプター部位付近の５０塩基から選択される標的領域にハイブリダイズするのに効果的な塩基配列を含む（例えば、参照により本願明細書に取り込まれる、国際公開第２００６／０４７６８３号；米国特許出願公開第２００７０００４６６１号明細書；ならびに、国際特許出願特願第２０１０／０５６６１３号および米国特許出願特願第１２／９４５，０８１号を参照のこと）。
この点で、典型的なコンジュゲートとしては、配列番号３を含むオリゴマーを含むコンジュゲートがあげられる。
Figure 0006884250
＊＊３’−ベンズヒドリル；＊＋リンケージは、ＰＭＯプラスリンケージでアシル化されたトリメチルグリシンである；ＰＭＯｍは、３−窒素部位にメチル基を有するＴ塩基を表わす。
前記コンジュゲートは、哺乳類におけるインフルエンザウイルス感染の処置に、特に有用である。前記コンジュゲートは、前記インフルエンザウイルスに感染した、または、前記インフルエンザウイルスによる感染リスクがある哺乳類の被験体に投与され得る。
４．ピコルナウイルス科のウイルスのターゲッティング
典型的なコンジュゲートの第４の分類は、ピコルナウイルス科のウイルスの増殖阻害、および、ウイルス感染の処置に使用される。前記コンジュゲートは、哺乳類におけるエンテロウイルスおよび／またはライノウイルス感染の処置に、特に有用である。この実施形態では、前記コンジュゲートは、ウイルスの５’非翻訳領域における３２個の保存されたヌクレオチド領域の２つのうちのどちらか内に、ウイルスＲＮＡ配列に関連する領域に相補的な、ターゲッティング配列を有する少なくとも１２個のサブユニットを含む、１２〜４０個のサブユニットの配列を有するモルホリノオリゴマーを含む（例えば、参照により本願明細書に取り込まれる、国際公開第２００７／０３０５７６および２００７／０３０６９１号または、同時係属および共所有の米国特許出願特願第１１／５１８，０５８および１１／５１７，７５７号を参照のこと）。典型的なターゲッティング配列は、以下の配列番号６に列記される。
５．フラビウイルス科のウイルスのターゲッティング
典型的なコンジュゲートの第５の分類は、動物細胞におけるフラビウイルスの複製阻害に使用される。この分類の典型的なコンジュゲートは、長さ８〜４０個の間のヌクレオチド塩基で、ポジティブ鎖フラビウイルスＲＮＡの、少なくとも５’環化配列（５’−ＣＳ）または３’−ＣＳ配列の一部を含む、ウイルスのポジティブ鎖ＲＮＡゲノムの領域に相補的な少なくとも８個の塩基の配列を有するモルホリノオリゴマーを含む。非常に好ましい標的は、前記３’−ＣＳであり、デング熱ウイルス用の典型的なターゲッティング配列は、以下の配列番号７に列記される（例えば、参照により本願明細書に取り込まれる、国際公開第２００５／０３０８００号、または、同時係属および共所有の米国特許出願特願第１０／９１３，９９６号を参照のこと）。
６．ニドウイルス科のウイルスのターゲッティング
典型的なコンジュゲートの第６の分類は、ウイルス感染した動物細胞におけるニドウイルスの複製阻害に使用される。この分類の典型的なコンジュゲートは、８〜２５個の間のヌクレオチド塩基を含み、ポジティブ鎖ウイルスゲノムの５’リーダー部位、および、ネガティブ鎖の３’サブゲノム領域における、転写調整配列（ＴＲＳ）間での塩基対合を妨害可能な配列を有するモルホリノオリゴマーを含む（例えば、参照により本願明細書に取り込まれる、国際公開第２００５／０６５２６８号または米国出願公開第２００７００３７７６３号明細書を参照のこと）。
７．フィロウイルスのターゲッティング
別の実施形態では、本願明細書に記載の１つ以上のコンジュゲートは、エボラウイルスまたはマールブルクウイルスの宿主細胞内での複製を、前記細胞を、本願明細書に記載のコンジュゲート、例えば、以下にさらに記載するように、ポジティブ鎖ｍＲＮＡのＡＵＧ開始部位領域内における、少なくとも１２個連続した塩基から構成される標的配列に相補的な、ターゲッティング塩基配列を有するコンジュゲートと接触させることにより、阻害する方法に使用され得る。
フィロウイルスのウイルスゲノムは、セグメント化されておらず、アンチセンス方向における一本鎖ＲＮＡの、おおよそ１９，０００塩基である。前記ゲノムは、ｖＲＮＡに相補的なモノシストロン性のｍＲＮＡから、７つのタンパク質をコードする。
標的配列は、選択されたエボラウイルスのタンパク質のＡＵＧ開始コドンのすぐ下流（２５塩基以内）もしくは上流（１００塩基以内）または、マイナス鎖ウイルスＲＮＡの３’末端における３０個の塩基に及ぶか、または、同下流もしくは上流または前記塩基である、ポジティブ鎖（センス）ＲＮＡ配列である。好ましいタンパク質の標的は、ウイルスのポリメラーゼサブユニットＶＰ３５およびＶＰ２４であるが、Ｌ、核タンパク質ＮＰおよびＶＰ３０も考慮される。これらの中でも、最初のタンパク質が好ましく、例えば、ＶＰ３５が後者の発現されたＬポリメラーゼに対して好ましい。
別の実施形態では、本願明細書に記載の１つ以上のコンジュゲートは、エボラウイルスまたはマールブルクウイルスの宿主細胞内での複製を、前記細胞を、フィロウイルスのｍＲＮＡ配列におけるポジティブ鎖ｍＲＮＡのＡＵＧ開始部位領域内における、少なくとも１２個連続した塩基から構成される標的配列に相補的な、ターゲッティング塩基配列を有する、本願明細書に記載のコンジュゲートと接触させることにより、阻害する方法に使用され得る（例えば、参照により本願明細書に取り込まれる、国際公開第２００６／０５０４１４号または米国特許第７，５２４，８２９および７，５０７，１９６号明細書、ならびに、米国特許出願特願第１２／４０２，４５５；１２／４０２，４６１；１２／４０２，４６４；および１２／８５３，１８０号による継続出願を参照のこと）。
８．アレナウイルスのターゲッティング
別の実施形態では、本願明細書に記載のコンジュゲートは、アレナウイルス科における種による哺乳類細胞におけるウイルス感染を阻害するための方法に使用され得る。一態様では、前記コンジュゲートは、前記ウイルスに感染した哺乳類の被験体を処置するのに使用され得る（例えば、参照により本願明細書に取り込まれる、国際公開第２００７／１０３５２９号または米国特許第７，５８２，６１５号明細書を参照のこと）。
表５は、その旧世界または新世界のアレナウイルス分類によりまとめられた場合の、本発明のコンジュゲートにより標的とされた標的ウイルスの典型的な一覧表である。
Figure 0006884250
アレナウイルスのゲノムは、Ｓ（小型）およびＬ（大型）と指定された、２本の一本鎖ＲＮＡセグメントからなる。ビリオンにおいて、Ｌ−セグメントＲＮＡに対するＳ−セグメントＲＮＡのモル比は、おおよそ２：１である。完全なＳ−セグメントＲＮＡ配列は、複数のアレナウイルスについて決定され、３，３６６から３，５３５個のヌクレオチドの範囲である。完全なＬ−セグメントＲＮＡ配列も、複数のアレナウイルスについて決定され、７，１０２から７，２７９個のヌクレオチドの範囲である。ＳおよびＬのＲＮＡセグメントにおける３’末端配列は、最後の１９個のうちの１７個のヌクレオチドで同一である。これらの末端配列は、全ての既知のアレナウイルスの中で保存されている。各ゲノムＲＮＡの始めにおける５’末端の１９または２０個のヌクレオチドは、それぞれ対応する３’端と不十分に相補的である。この相補性のために、３’末端および５’末端は、塩基対と考えられ、パンハンドル構造を形成する。
アンチゲノムの、ウイルス−相補的ＲＮＡ（ｖｃＲＮＡ）鎖を形成するための、感染ビリオンまたはウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）の複製が、感染細胞で起こる。ｖＲＮＡおよびｖｃＲＮＡの両方が、相補的なｍＲＮＡをコードする。したがって、アレナウイルスは、ネガティブセンスＲＮＡウイルスまたはポジティブセンスＲＮＡウイルスよりもむしろ、アンビセンスＲＮＡウイルスとして分類される。ウイルス遺伝子のアンビセンス配向は、Ｌ−セグメントおよびＳ−セグメントの両方である。前記ＮＰおよびポリメラーゼ遺伝子は、ＳおよびＬのｖＲＮＡセグメントにおける３’端に、それぞれ存在し、従来のネガティブンセンスにおいてコードされる（すなわち、それらは、ｖＲＮＡまたはゲノム相補的なｍＲＮＡの転写を通して発現される）。ＳおよびＬのｖＲＮＡセグメントの５’端に位置する遺伝子である、ＧＰＣおよびＺはそれぞれ、ｍＲＮＡセンスにおいてコードされるが、ゲノムｖＲＮＡから直接翻訳される証拠がない。これらの遺伝子は、アンチゲノム由来のゲノム−センスｍＲＮＡ（すなわち、ｖｃＲＮＡ）の転写を通してよりも、複製中間体として機能するゲノムｖＲＮＡの全長相補的複製により発現される。
アレナウイルス科のウイルス用の典型的なターゲッティング配列は、以下の配列番号８に列記される。
９．呼吸器合胞体ウイルスのターゲッティング
呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）は、幼児における最も重要な唯一の呼吸器病原体である。ＲＳＶ起因性下呼吸器症状、例えば、細気管支炎および肺炎は、多くの場合、一歳未満の子供における入院を必要とする。心肺の疾患を有する子供および未熟児は、特に、この感染から重篤な障害を経験しがちである。ＲＳＶ感染は、高齢者および危険性の高い成人において、重要な病気でもある。ＲＳＶ感染は、高齢者におけるウイルス性肺炎の、２番目に最も一般的に特定される原因である（Ｆａｌｓｅｙ，Ｈｅｎｎｅｓｓｅｙら、２００５）。世界保健機関は、ＲＳＶが、毎年世界中で６４００万人の臨床感染および１６万人の死者の原因となっていると推定している。現在、ＲＳＶ感染を予防するワクチンは、利用できるものがない。ＲＳＶの生物学、疫学、病態生理学および宿主免疫反応の我々の理解における多くの主要な進歩は、数十年前から存在するが、ＲＳＶに感染した幼児および子供の最適な管理に関する議論がかなり続けられている。リバビリンは、ＲＳＶ感染を処置するための、唯一認可された抗ウイルス剤であるが、その使用は、危険性の高いまたは重篤な幼児に限定されている。リバビリンの有用性は、そのコスト、利用可能な有効性、耐性ウイルス発生の傾向（Ｍａｒｑｕａｒｄｔ １９９５；Ｐｒｉｎｃｅ ２００１）によって制限されてきた。更なる有効な抗ＲＳＶ剤についての現在の必要性が、十分認識されている。
ペプチドがコンジュゲートしたＰＭＯ（ＰＰＭＯ）が、組織培養およびｉｎ ｖｉｖｏでの動物モデル系の両方において、ＲＳＶ阻害に有効であり得ることが知られている（Ｌａｉ，Ｓｔｅｉｎら、２００８）。ＲＳＶ Ｌ ｍＲＮＡの５’末端領域および翻訳開始部位領域を含む配列を標的にするために設計された、２種類のアンチセンスＰＰＭＯが、２種類のヒト気道細胞株の培養において、抗ＲＳＶ活性について試験された。それらのうちの１つ（ＳＲＶ−ＡＵＧ−２；配列番号１０）は、ウイルス力価を＞２．０ｌｏｇ１０まで低下させた。ＲＳＶ接種前でのＲＳＶ−ＡＵＧ−２ ＰＰＭＯによる、ＢＡＬＢ／ｃマウスの鼻腔内（ｉ．ｎ．）処置により、感染後（ｐ．ｉ．）５日での肺組織において、ウイルス力価を１．２ｌｏｇ１０に低下させ、および、感染後７日での肺炎症を軽減した。これらのデータは、ＲＳＶ−ＡＵＧ−２が、潜在的な治療用途についての候補として更なる研究に値する強力な抗ＲＳＶ活性を提供したことを示した（Ｌａｉ，Ｓｔｅｉｎら、２００８）。前述のように、ＲＳＶ−ＡＵＧ−２ ＰＰＭＯによる成功にも関わらず、以前のペプチドコンジュゲートに関する毒性を解決するために、本願明細書に開示のコンジュゲートを使用することが望まれる。このため、本発明の別の実施形態では、本願明細書に記載の１つ以上のコンジュゲートは、ＲＳＶの宿主細胞内での複製を、前記細胞を本願明細書に記載のコンジュゲート、例えば、以下にさらに記載するように、ＲＳＶ由来のｍＲＮＡのＡＵＧ開始部位領域内に、少なくとも１２個連続した塩基で構成される、標的配列に相補的なターゲッティング塩基配列を有するコンジュゲートと接触させることにより、阻害する方法に使用され得る。
ＲＳＶのＬ遺伝子は、ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ複合体の重要な成分をコードする。ＲＳＶ Ｌ遺伝子ｍＲＮＡのＡＵＧ翻訳開始部位コドンに及ぶ配列に対して、ＲＳＶ−ＡＵＧ−２ ＰＰＭＯの状態で設計されたアンチセンスＰＰＭＯは、Ｌ ｍＲＮＡの５’末端からそのコード配列における１３ｎｔに存在する「遺伝子開始」配列（ＧＳ）由来の配列に相補的である。したがって、好ましいＬ遺伝子ターゲッティング配列は、以下の表６において、配列番号９として示されるＬ遺伝子ｍＲＮＡの、５’端から３’方向に伸長する４０個の塩基からの任意の１２個連続した塩基、または、Ｌ遺伝子コード配列内の２２個の塩基に相補的である。典型的なＲＳＶ Ｌ遺伝子ターゲッティング配列は、以下の表６において、配列番号１０〜１４として列記される。本願明細書に記載の本発明のサブユニット間修飾のいずれかが、前記オリゴマーに包含されて、向上されたアンチセンス活性、改善された細胞内送達および／または改善された治療活性についての組織特異性を提供し得る。本発明のサブユニット間リンケージを含む典型的なオリゴマー配列は、以下の表６に列記される。
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１０．神経筋疾患
別の実施形態では、治療的コンジュゲートが、哺乳類の被験体における神経筋疾患に関連する疾患症状の処置に使用するのに提供される。アンチセンスオリゴマー（例えば、配列番号１６）は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）についてのＭＤＸマウスモデルにおいて、活性を有することが示されてきた。一部の実施形態において使用されるリンケージを包含する典型的なオリゴマー配列は、以下の表７に列記される。一部の実施形態では、前記コンジュゲートは、
（ａ）以前に記載されたように（例えば、参照により本願明細書に取り込まれる、米国特許出願特願第１２／４９３，１４０号；および、国際公開第２００６／０８６６６７号を参照のこと）、筋肉疲労症状を処置するための、配列番号１８により特定されたヒトのミオスタチンｍＲＮＡの標的領域における、少なくとも１２個連続した塩基に相補的な塩基配列を有する、ヒトのミオスタチンを標的とするアンチセンスオリゴマー（典型的なマウスのターゲッティング配列は、配列番号１９〜２０として列記される）；および、
（ｂ）以前に記載されたように（例えば、参照により本願明細書にそれら全てが取り込まれる、国際公開第２０１０／０４８５８６および２００６／００００５７号、または、米国特許出願公開第０９／０６１９６０号明細書を参照のこと）、ＤＭＤを処置するための、ジストロフィンタンパク質の部分的な活性を回復させるために、ＤＭＤタンパク質（ジストロフィン）においてエクソンスキッピングを発生可能なアンチセンスオリゴマー、例えば、配列番号２２から３５から選択された配列を有するＰＭＯ、から選択されるオリゴマーを含む。
複数の他の神経筋疾患は、本発明の修飾リンケージおよび末端基を使用して、処置され得る。脊髄性筋萎縮（ＳＭＡ）および筋強直性ジストロフィー（ＤＭ）の処置に関する典型的な化合物が、以下に記載される。
ＳＭＡは、脊髄におけるアルファ−運動ニューロンの慢性欠損により引き起こされる、常染色体劣性疾患であり、子供および大人の両方に影響を及ぼす。残った運動ニューロン（ＳＭＮ）の低下した発現は、前記疾患の原因となる（Ｈｕａ，Ｓａｈａｓｈｉら、２０１０）。ＳＭＡを引き起こす変異は、ＳＭＮＩ遺伝子に位置するが、欠損エクソン７（デルタ７ＳＭＮ２）を形成する選択的スプライスから発現された場合、パラロガス遺伝子であるＳＭＮ２が、ＳＭＮ１欠損を補償することにより、利用可能となる。イントロン（ｉｎｔｏｎ）６、エクソン７およびイントロン７を標的とするアンチセンス化合物は全て、変異の程度を含んだエクソン７を誘導することが示された。イントロン７を標的にするアンチセンス化合物が好ましい（例えば、国際公開第２０１０／１４８２４９、２０１０／１２０８２０、２００７／００２３９０号および米国特許第７８３８６５７号明細書を参照のこと）。前記ＳＭＮ２のプレｍＲＮＡを標的にし、改善されたエクソン７含有物を誘導する、典型的なアンチセンス配列は、配列番号３６〜３８として、以下に列記される。本願明細書に記載の修飾リンケージおよび末端基を使用する、これらのオリゴマー配列の選択された修飾は、当該分野において公知のものと比較して、改善された特性を有するであろうと考慮される。さらに、ＳＭＮ２遺伝子のイントロン７を標的とし、本発明の特徴を包含する任意のオリゴマーは、エクソン７含有物を誘導し、ＳＭＡ患者に治療的利益を提供する可能性を有すると考えられる。筋強直性ジストロフィー１型（ＤＭ１）および２型（ＤＭ２）は、神経筋変性の原因となる毒性ＲＮＡの発現により引き起こされる、優性の遺伝性疾患である。ＤＭ１およびＤＭ２は、筋強直性異栄養症プロテインキナーゼ（ＤＭＰＫ）およびジンクフィンガータンパク質９（ＺＮＦ９）それぞれの、３’−ＵＴＲおよびイントロン１領域における、長いポリＣＵＧおよびポリＣＣＵＧの繰り返しに関連する（例えば、国際公開第２００８／０３６４０６号を参照のこと）。正常な個体は、３０回ものＣＴＧ繰り返しを有するが、ＤＭ１患者は、５０から１０００の範囲の多くの回数の繰り返しを有する。前記疾患の重症度と発病の年齢とは、繰り返しの数と相互に関連がある。成人発症の患者は、軽度の症候を示し、１００回未満の繰り返しを有する。若年発症のＤＭ１患者は５００回もの繰り返しを有し、先天性の場合は、通常、１０００回近くのＣＴＧ繰り返しを有する。ＣＵＧ繰り返しを含む延長された転写産物は、二次構造を形成し、核焦点の状態で核に蓄積し、ＲＮＡ結合タンパク質（ＲＮＡ−ＢＰ）を捕捉する。ｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄ−ｌｉｋｅ（ＭＢＮＬ）タンパク質およびＣＵＧ結合タンパク質（ＣＵＧＢＰ）を含む、複数のＲＮＡ−ＢＰは、前記疾患に関与してきた。ＭＢＮＬタンパク質は、光受容体および筋肉分化に必要とされる、ショウジョウバエｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄ（Ｍｂｌ）タンパク質と相同である。ＭＢＮＬおよびＣＵＧＢＰは、ＤＭ１、例えば、心臓トロポニンＴ（ｃＴＮＴ）、インスリン受容体（ＩＲ）および筋特異的塩化物チャネル（ＣｌＣ−１）に影響を受ける、転写産物の拮抗性スプライシング調節遺伝子として特定された。
ＤＭＰＫ遺伝子の延長された繰り返しを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドが、ＤＭ１の動物モデルにおいて、ＲＮＡ−ＢＰ隔離を置換し、筋強直症状を逆行させることは、当該分野において公知である（国際公開第２００８／０３６４０６号）。本発明の特徴を包含するオリゴマーは、ＤＭ１およびＤＭ２の患者についての、改善された活性および治療的可能性を提供するであろうことが考慮される。前述のポリＣＵＧおよびポリＣＣＵＧ繰り返しを標的とする典型的な配列は、配列番号３９−５５として、以下に列記され、その全体が本願明細書に取り込まれる米国特許出願特願１３／１０１，９４２号に、さらに記載されている。
神経筋障害を処置するための本発明における更なる実施形態は、他のＤＮＡ繰り返し不安定遺伝子障害を処置するように設計されたオリゴマーを見込み、含む。これらの疾患はとしては、国際公開第２００８／０１８７９５号に記載のように、ハンチントン病、脊髄小脳失調、Ｘ連鎖性球脊髄性筋委縮症および脊髄小脳失調１０型（ＳＣＡ１０）があげられる。
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＊二量体化は、前記オリゴマーが、２つのモノマーの３’端を結合するリンケージにより二量体化されていることを示す。例えば、前記リンケージは、−ＣＯＣＨ２ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ（ＣＯＮＨ２）ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＯ−、または、他の適切なリンケージであり得る。ＥＧ３は、トリエチレングリコールテールを意味する（例えば、実施例３０および３１におけるコンジュゲートを参照のこと）。
１１．抗菌用途
別の実施形態では、本発明は、哺乳類の宿主における細菌感染を処置するのに使用するための、抗菌性アンチセンスオリゴマーを含むコンジュゲートを含む。一部の実施形態では、前記オリゴマーは、１０〜２０個の間の塩基を含み、アシルキャリアタンパク質（ａｃｐＰ）、ギラーゼＡサブユニット（ｇｙｒＡ）、ｆｔｓＺ、リボゾームタンパク質Ｓ１０（ｒｐｓＪ）、ｌｅｕＤ、ｍｇｔＣ、ｐｉｒＧ、ｐｃａＡおよびｃｍａｌ遺伝子についての、感染細菌のｍＲＮＡの標的領域に相補的な、少なくとも１０個連続した塩基のターゲッティング配列を含む。前記標的領域は、細菌性ｍＲＮＡの翻訳開始コドン、または、前記翻訳開始コドンの上流（すなわち、５’）方向または下流（すなわち、３’）方向に２０個以内の塩基である配列を含む。前記オリゴマーは、ｍＲＮＡに結合して、ヘテロ二本鎖を形成し、これにより、前記細菌の複製を阻害する。
１２．核ホルモン受容体の調節
別の実施形態では、本発明は、核ホルモン受容体スーパーファミリー（ＮＨＲＳＦ）由来の核ホルモン受容体（ＮＨＲ）の発現を、主に、前記受容体についてコードするプレ−ｍＲＮＡのスプライシングを制御または変更することにより、調節するための組成物および方法に関する。具体的なＮＨＲの例としては、グルココルチコイド受容体（ＧＲ）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）およびアンドロゲン受容体（ＡＲ）があげられる。ある実施形態では、本願明細書に記載のコンジュゲートは、リガンド非依存性または他の選択された型の前記受容体の向上された発現をもたらし、その不活性型の低下された発現をもたらす。
本発明の実施形態は、オリゴマー、例えば、本願明細書に記載のＮＨＲ−ドメインの中でも、ＮＨＲＳＦプレ−ｍＲＮＡの「リガンド結合エクソン」および／または隣接するイントロンを含む、選択されたＮＨＲのエクソン配列またはイントロン配列に相補的なオリゴマーを含むコンジュゲートを含む。「リガンド結合エクソン」の用語は、野生型のｍＲＮＡに存在するが、リガンド非依存性型のｍＲＮＡを産生するために、一次転写（「プレ−ｍＲＮＡ」）から除去されるエクソンを意味する。ある実施形態では、相補性は、スプライス部位に及ぶプレ−ｍＲＮＡの配列における配列に基づき得る。前記スプライス部位は、制限されず、エクソン−イントロン結合に及ぶ配列に基づく相補性を含む。他の実施形態では、相補性は、前記イントロンの配列にのみ基づき得る。他の実施形態では、相補性は、前記エクソンの配列にのみ基づき得る（例えば、参照により本願明細書に取り込まれる米国特許出願特願１３／０４６，３５６号を参照のこと）。
ＮＨＲ修飾因子は、転写がＮＨＲにより刺激または抑制される遺伝子の発現産物に関連する疾患を含む、ＮＨＲ関連疾患を処置するのに有用であり得る。例えば、ＡＰ−１および／またはＮＦ−κＢを阻害するＮＨＲの修飾因子が、炎症および免疫の疾患および障害、例えば、特に本願明細書に記載され、当該分野において公知の、変形性関節症、関節リウマチ、多発性硬化症、ぜんそく、炎症性大腸炎、移植拒絶反応、移植片対宿主疾患の処置に有用であり得る。転写促進と拮抗する化合物は、グルココルチコイドの向上したレベルに関連する代謝疾患、例えば、特に糖尿病、骨粗しょう症および緑内障を処置するのに有用であり得る。また、転写促進を刺激する化合物は、グルココルチコイドの欠如に関連する代謝疾患、例えば、特にアジソン病を処置するのに有用であり得る。
本発明の実施形態は、前記キャリアタンパク質と、１つのサブユニットのモルホリノ窒素を、隣接するサブユニットの５’環外炭素に結合するリン含有サブユニット間リンケージにより結合されるモルホリノサブユニットから構成される、アンチセンスオリゴマーとを含むコンジュゲートに、細胞を接触させる工程を含む、細胞核のＮＨＲ活性または細胞における発現を調節する方法を含む。前記オリゴヌクレオチドは、１０〜４０個の間の塩基、および、標的配列に相補的な、少なくとも１０個連続した塩基のターゲッティング配列を含む。前記標的配列は、ＮＨＲのプレ−ｍＲＮＡ転写産物である。これにより、ＮＨＲの活性または発現を調節する。ある実施形態では、前記オリゴマーは、プレ−ｍＲＮＡ転写産物のスプライシングを変更し、ＮＨＲの変異体の発現を増加させる。一部の実施形態では、前記オリゴマーは、前記プレ−ｍＲＮＡ転写産物における１つ以上のエクソンの、完全または部分的なエクソンスキッピングを誘導する。ある実施形態では、前記１つ以上のエクソンは、ＮＨＲのリガンド結合ドメインの、少なくとも一部をコードし、前記変異体は、リガンド非依存性型のＮＨＲである。ある実施形態では、前記１つ以上のエクソンは、ＮＨＲの転写促進ドメインの少なくとも一部をコードし、前記変異体は、転写活性化活性を低下させる。ある実施形態では、前記１つ以上のエクソンは、ＮＨＲのＤＮＡ結合ドメインの少なくとも一部をコードする。ある実施形態では、前記１つ以上のエクソンは、ＮＨＲのＮ−末端活性化ドメインの少なくとも一部をコードする。ある実施形態では、前記１つ以上のエクソンは、ＮＨＲのカルボキシ末端ドメインの少なくとも一部をコードする。特定の実施形態では、前記変異体は、ＮＦ−κＢ、ＡＰ−１または両方に結合し、１つ以上のその炎症誘発標的遺伝子の転写を低下させる。
ある実施形態では、前記オリゴマーは、ＮＨＲの転写活性の転写活性を刺激する。他の実施形態では、前記オリゴマーは、ＮＨＲの転写活性の転写活性と拮抗する。ある実施形態では、前記オリゴマーは、ＮＨＲの転写抑制活性を刺激する。他の実施形態では、前記オリゴマーは、ＮＨＲの転写抑制活性と拮抗する。特定の実施形態では、前記オリゴマーは、ＮＨＲの転写活性の転写活性と拮抗し、ＮＨＲの転写抑制活性を刺激する（例えば、参照により本願明細書に取り込まれる、米国特許出願特願６１／３１３，６５２号を参照のこと）。
特に断らない限り、全ての化学物質を、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ−Ｆｌｕｋａから入手した。ベンゾイルアデノシン、ベンゾイルシチジンおよびフェニルアセチルグアノシンを、Ｃａｒｂｏｓｙｎｔｈ Ｌｉｍｉｔｅｄ、ＵＫから入手した。
ＰＭＯ、ＰＭＯ＋、ＰＰＭＯおよび、本願明細書に記載の更なるリンケージ修飾を含むＰＭＯの合成を、当該分野において公知であり、それらの全体が参照により本願明細書に組み込まれる、係属中の米国特許出願特願１２／２７１，０３６号および１２／２７１，０４０号ならびに国際公開２００９／０６４４７１号に記載の方法を使用して行った。
３’トリチル修飾を有するＰＭＯを、脱トリチル工程を省略すること以外は、基本的に国際公開２００９／０６４４７１号に記載のように合成する。
（実施例１）
ＴＥＲＴ−ブチル−４−（２，２，２−トリフルオロアセタミド）ピペリジン−１−カルボキシレート
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ＤＣＭ（２５０ｍＬ）における、ｔｅｒｔ−ブチル ４−アミノピペリジン−１−カルボキシレート（４８．７ｇ、０．２４３ｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（１３０ｍＬ、０．７４９ｍｏｌ）の懸濁液に、エチルトリフルオロアセテート（３５．６ｍＬ、０．３００ｍｏｌ）を、攪拌しながら滴下して添加した。２０時間後、前記溶液を、クエン酸溶液（２００ｍＬ×３、１０％ｗ／ｖ水溶液）および重炭酸ナトリウム溶液（２００ｍＬ×３、濃縮水溶液）で洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、シリカ（２４ｇ）を通してろ過した。前記シリカを、ＤＣＭで洗浄し、合わせた溶出液を、部分的に濃縮し（１００ｍＬ）、次の工程に直接使用した。Ｃ１２Ｈ１９Ｆ３Ｎ２Ｏ３のＡＰＣＩ／ＭＳ計算値２９６．１、実測値ｍ／ｚ＝２９４．９（Ｍ−１）。
（実施例２）
２，２，２−トリフルオロ−Ｎ−（ピペリジン−４−イル）アセタミド塩酸塩
Figure 0006884250
実施例１における表題の化合物の攪拌ＤＣＭ溶液（１００ｍＬ）に、１，４−ジオキサン（４Ｍ）における塩化水素の溶液（２５０ｍＬ、１．０ｍｏｌ）を滴下して添加した。攪拌を６時間継続し、次いで、懸濁液をろ過し、固形物をジエチルエーテル（５００ｍＬ）で洗浄して、白色の固形物として、表題の化合物（５４．２ｇ、収率９６％）を得た。Ｃ７Ｈ１１Ｆ３Ｎ２ＯのＡＰＣＩ／ＭＳ計算値１９６．１、実測値ｍ／ｚ＝１９６．９（Ｍ＋１）。
（実施例３）
（４−（２，２，２−トリフルオロアセタミド）ピペリジン−１−イル）ホスホン酸ジクロライド
Figure 0006884250
ＤＣＭ（２５０ｍＬ）における、実施例２における表題の化合物（５４．２ｇ、０．２３３ｍｏｌ）についての、冷却した懸濁液（氷／水浴）に、オキシ塩化リン（２３．９ｍＬ、０．２５６ｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（１２１．７ｍＬ、０．６９９ｍｏｌ）を滴下して添加し、攪拌した。１５分後、前記浴を取り除き、周囲温度に温まるように、前記混合物を攪拌し続けた。１時間後、前記混合物を部分的に濃縮し（１００ｍＬ）、懸濁液をろ過し、固形物をジエチルエーテルで洗浄して、白色の固形物として、表題の化合物（４３．８ｇ、収率６０％）を得た。溶出液を部分的に濃縮し（１００ｍＬ）、得られた懸濁液をろ過し、固形物をジエチルエーテルで洗浄して、追加の表題の化合物（６．５ｇ、収率９％）を得た。１−（４−ニトロフェニル）ピペラジン誘導体Ｃ１７Ｈ２２ＣｌＦ３Ｎ５Ｏ４ＰのＥＳＩ／ＭＳ計算値４８３．１、実測値ｍ／ｚ＝４８２．１（Ｍ−１）。
（実施例４）
（（２Ｓ，６Ｓ）−６−（（Ｒ）−５−メチル−２，６−ジオキソ−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン−３−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メチル（４−（２，２，２−トリフルオロアセタミド）ピペリジン−１−イル）ホスホノクロリデート
Figure 0006884250
ＤＣＭ（１００ｍＬ）における、実施例３における表題の化合物（２９．２ｇ、９３．３ｍｍｏｌ）の、攪拌冷却溶液（氷／水浴）に、Ｍｏ（Ｔｒ）Ｔ＃（２２．６ｇ、４６．７ｍｍｏｌ）のＤＣＭ溶液（１００ｍＬ）、２，６−ルチジン（２１．７ｍＬ、１８７ｍｍｏｌ）および４−（ジメチルアミノ）ピリジン（１．１４ｇ、９．３３ｍｍｏｌ）を、１０分にわたって、滴下して添加した。前記浴を、室温に温めさせた。１５時間後、前記溶液を、クエン酸溶液（２００ｍＬ×３、１０％ｗ／ｖ水溶液）で洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濃縮し、粗製油を、直接カラムに載せた。クロマトグラフィー［ＳｉＯ２カラム（１２０ｇ）、ヘキサン／ＥｔＯＡｃ溶出液（勾配１：１から０：１）、３回繰り返し］画分を濃縮して、白色の固形物として、表題の化合物（２７．２ｇ、収率７７％）を提供した。１−（４−ニトロフェニル）ピペラジン誘導体Ｃ４６Ｈ５０Ｆ３Ｎ８Ｏ８ＰのＥＳＩ／ＭＳ計算値９３０．３、実測値ｍ／ｚ＝９２９．５（Ｍ−１）。
（実施例５）
（（２Ｓ，６Ｒ）−６−（６−ベンズアミド−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メチル（４−（２，２，２−トリフルオロアセタミド）ピペリジン−１−イル）ホスホノクロリデート
Figure 0006884250
表題の化合物を、実施例４に記載の方法に類似した方法で合成して、白色固形物として、表題の化合物（１５．４ｇ、収率６６％）を得た。１−（４−ニトロフェニル）ピペラジン誘導体Ｃ５３Ｈ５３Ｆ３Ｎ１１Ｏ７ＰのＥＳＩ／ＭＳ計算値１０４３．４、実測値ｍ／ｚ＝１０４２．５（Ｍ−１）。
（実施例６）
（Ｒ）−メチル（１−フェニルエチル）ホスホロアミド二塩化物
Figure 0006884250
ＤＣＭ（３０ｍＬ）におけるオキシ塩化リン（２．８３ｍＬ、３０．３ｍｍｏｌ）の冷却溶液（氷／水浴）に、２，６−ルチジン（７．０６ｍＬ、６０．６ｍｍｏｌ）および、（Ｒ）−（＋）−Ｎ，ａ−ジメチルベンジルアミン（３．７３ｇ、２７．６ｍｍｏｌ）のＤＣＭ溶液を、攪拌しながら、続けて滴下して添加した。５分後、前記浴を取り除き、反応混合物を、室温に温めさせた。１時間後、前記反応溶液を、クエン酸溶液（５０ｍＬ×３、１０％ｗ／ｖ水溶液）で洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、ＳｉＯ２を通してろ過し、濃縮して、白色の泡状物質として、表題の化合物（３．８０ｇ）を提供した。１−（４−ニトロフェニル）ピペラジン誘導体Ｃ１９Ｈ２５Ｎ４Ｏ４ＰのＥＳＩ／ＭＳ計算値４０４．２、実測値ｍ／ｚ＝４０３．１（Ｍ−１）。
（実施例７）
（Ｓ）−メチル（１−フェニルエチル）ホスホロアミド二塩化物
Figure 0006884250
表題の化合物を、実施例６に記載の方法に類似した方法で合成して、白色の泡状物質として、表題の化合物（３．９５ｇ）を得た。１−（４−ニトロフェニル）ピペラジン誘導体Ｃ１９Ｈ２５Ｎ４Ｏ４ＰのＥＳＩ／ＭＳ計算値４０４．２、実測値ｍ／ｚ＝４０３．１（Ｍ−１）。
（実施例８）
（（２Ｓ，６Ｒ）−６−（５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メチル メチル（（Ｒ）−１−フェニルエチル）ホスホロアミドクロリデート
Figure 0006884250
表題の化合物を、実施例４に記載の方法に類似した方法で合成して、白色の固形物として、表題のクロロホスホロアミダート（４．４６ｇ、収率２８％）を得た。Ｃ３８Ｈ４０ＣｌＮ４Ｏ５ＰのＥＳＩ／ＭＳ計算値６９８．２、実測値ｍ／ｚ＝６９７．３（Ｍ−１）。
（実施例９）
（（２Ｓ，６Ｒ）−６−（５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メチル メチル（（Ｓ）−１−フェニルエチル）ホスホロアミドクロリデート
Figure 0006884250
表題の化合物を、実施例４に記載の方法に類似した方法で合成して、白色の固形物として、表題のクロロホスホロアミダート（４．６５ｇ、収率２３％）を得た。Ｃ３８Ｈ４０ＣｌＮ４Ｏ５ＰのＥＳＩ／ＭＳ計算値６９８．２、実測値ｍ／ｚ＝６９７．３（Ｍ−１）。
（実施例１０）
（４−（ピロリジン−１−イル）ピペリジン−１−イル）ホスホン酸二塩化物塩酸塩
Figure 0006884250
ＤＣＭ（３０ｍＬ）におけるオキシ塩化リン（５．７０ｍＬ、５５．６ｍｍｏｌ）の冷却溶液（氷／水浴）に、２，６−ルチジン（１９．４ｍＬ、１６７ｍｍｏｌ）および、４−（１−ピロリジニル）−ピペリジン（８．５８ｇ、５５．６ｍｍｏｌ）のＤＣＭ溶液（３０ｍＬ）を添加し、１時間攪拌した。懸濁液をろ過し、固形物を過剰のジエチルエーテルで洗浄して、白色の固形物として、表題のピロリジン（１７．７ｇ、収率９１％）を得た。１−（４−ニトロフェニル）ピペラジン誘導体Ｃ１９Ｈ３０Ｎ５Ｏ４ＰのＥＳＩ／ＭＳ計算値４２３．２、実測値ｍ／ｚ＝４２２．２（Ｍ−１）。
（実施例１１）
（（２Ｓ，６Ｒ）−６−（５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル） メチル（４−（ピロリジン−１−イル）ピペリジン−１−イル）ホスホノクロリデート塩酸塩
Figure 0006884250
ＤＣＭ（１００ｍＬ）におけるジクロロホスホロアミダート８（１７．７ｇ、５０．６ｍｍｏｌ）の攪拌冷却溶液（氷／水浴）に、Ｍｏ（Ｔｒ）Ｔ＃（２４．５ｇ、５０．６ｍｍｏｌ）のＤＣＭ溶液（１００ｍＬ）、２，６−ルチジン（１７．７ｍＬ、１５２ｍｍｏｌ）および１−メチルイミダゾール（０．４０１ｍＬ、５．０６ｍｍｏｌ）のＤＣＭ溶液（１００ｍＬ）を、１０分にわたって、滴下して添加した。懸濁液を攪拌しながら、前記浴を、室温に温めさせた。６時間後、前記懸濁液を、ジエチルエーテル（１Ｌ）に注ぎ、１５分攪拌し、ろ過し、固形物を、更なるエーテルで洗浄して、白色の固形物（４５．４ｇ）を得た。前記粗製生成物を、クロマトグラフィー［ＳｉＯ２カラム（１２０グラム）、ＤＣＭ／ＭｅＯＨ溶出液（勾配１：０から６：４）］により精製し、合わせた画分を、ジエチルエーテル（２．５Ｌ）に注ぎ、１５分攪拌し、ろ過し、得られた固形物を、更なるエーテルで洗浄して、白色の固形物として、表題の化合物（２３．１ｇ、収率６０％）を得た。１−（４−ニトロフェニル）ピペラジン誘導体Ｃ４８Ｈ５７Ｎ８Ｏ７ＰのＥＳＩ／ＭＳ計算値８８８．４、実測値ｍ／ｚ＝８８７．６（Ｍ−１）。
（実施例１２）
３−（ＴＥＲＴ−ブチルジスルファニル）−２−（イソブトキシカルボニルアミノ）プロパン酸
Figure 0006884250
ＣＨ３ＣＮ（４０ｍＬ）におけるＳ−ｔｅｒｔ−ブチルメルカプト−Ｌ−システイン（１０ｇ、４７．８ｍｍｏｌ）に、Ｈ２Ｏ（２０ｍＬ）におけるＫ２ＣＯ３（１６．５ｇ、１１９．５ｍｍｏｌ）を添加した。１５分間の攪拌後、ｉｓｏ−ブチルクロロギ酸（９．４ｍＬ、７２ｍｍｏｌ）を、ゆっくり入れた。前記反応を、３時間行った。白色固形物を、セライトを通してろ過し、ろ液を濃縮して、ＣＨ３ＣＮを除去した。残渣を、酢酸エチル（２００ｍＬ）に溶解し、１Ｎ ＨＣｌ（４０ｍｌ×３）、塩水（４０×１）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。所望の生成物（２）を、クロマトグラフィー（５％ ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）後に得た。
（実施例１３）
ＴＥＲＴ−ブチル ４−（３−（ＴＥＲＴ−ブチルジスルファニル）−２−（イソブトキシカルボニルアミノ）プロパンアミド）ピペリジン−１−カルボキシレート
Figure 0006884250
ＤＭＦ（５０ｍｌ）における前記酸（実施例１２からの化合物２、６．９８ｇ、２２．６ｍｍｏｌ）に、ＨＡＴＵ（８．５８ｇ、２２．６ｍｍｏｌ）を添加した。３０分後、Ｈｕｎｉｇ塩基（４．７１ｍｌ、２７．１ｍｍｏｌ）および１−Ｂｏｃ−４−アミノピペリジン（５．４３ｇ、２７．１ｍｍｏｌ）を、前記混合物に添加した。反応を、ＲＴでもう３時間攪拌しながら継続した。ＤＭＦを高真空で除去し、粗製残渣をＥｔＡｃ（３００ｍｌ）に溶解し、Ｈ２Ｏ（５０ｍｌ×３）で洗浄した。最終生成物（３）を、ＩＳＣＯ精製（５％ ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）後に得た。
（実施例１４）
イソブチル ３−（ＴＥＲＴ−ブチルジスルファニル）−１−オキソ−１−（ピペリジン−４−イルアミノ）プロパン−２−イルカルバメート
Figure 0006884250
実施例１３で調製された化合物３（７．０８５ｇ、１８．１２ｍｍｏｌ）に、３０ｍＬの４Ｍ ＨＣｌ／ジオキサンを添加した。反応を、ＲＴで２時間後に完了した。塩酸塩（４）を、さらに精製せずに、次の工程に使用した。
（実施例１５）
イソブチル ３−（ＴＥＲＴ−ブチルジスルファニル）−１−（１−（ジクロロホスホリル）ピペリジン−４−イルアミノ）−１−オキソプロパン−２−イルカルバメート
Figure 0006884250
−７８℃でのＤＣＭ（２００ｍｌ）における、実施例１５で調製した化合物４（７．７４６ｇ、１８．１２ｍｍｏｌ）に、Ａｒ下において、ＰＯＣｌ３（１．６９ｍｌ、１８．１２ｍｍｏｌ）を、ゆっくり入れ、続けて、Ｅｔ３Ｎ（７．５８ｍｌ、５４．３６ｍｍｏｌ）を添加した。反応を、ＲＴで５時間撹拌し、濃縮して、過剰の塩基および溶媒を除去した。ＩＳＣＯ精製（５０％ ＥｔＡｃ／ヘキサン）後に、生成物（５）を、白色の固形物として得た。
（実施例１６）
イソブチル ３−（ＴＥＲＴ−ブチルジスルファニル）−１−（１−クロロ（（（２Ｓ，６Ｒ）−６−（５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メトキシ）ホスホリル）ピペリジン−４−イルアミノ）−１−オキソプロパン−２−イルカルバメート
Figure 0006884250
０℃でのＤＣＭ（１００ｍｌ）における、１−（（２Ｒ，６Ｓ）−６−（ヒドロキシメチル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）−５−メチルピリミジン−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ジオン（ｍｏＴ（Ｔｒ））（５．５７６ｇ、１０．９８ｍｍｏｌ）に、ルチジン（１．９２ｍｌ、１６．４７ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（６６９ｍｇ、５．５ｍｍｏｌ）を添加し、続けて、４（６．１３ｇ、１２．０８ｍｍｏｌ）を添加した。反応を、ＲＴで１８時間、撹拌したままにしておいた。ＩＳＣＯ精製（５０％ ＥｔＡｃ／ヘキサン）後に、所望の生成物（６）を得た。
（実施例１７）
（（２Ｓ，６Ｒ）−６−（５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メチル ヘキシル（メチル）ホスホロアミドクロリデート
Figure 0006884250
Ｎ−ヒドロキシルメチルアミン（４．８５ｍｌ、３２ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（８０ｍｌ）溶液を、Ｎ２下において、−７８℃に冷却した。ＤＣＭ（１０ｍｌ）における塩化ホスホリル（２．９８ｍｌ、３２ｍｍｏｌ）の溶液、続けて、ＤＣＭ（１０ｍｌ）におけるＥｔ３Ｎ（４．４６ｍｌ、３２ｍｍｏｌ）の溶液を、ゆっくり添加した。反応をオーバーナイトでＲＴに温めながら、撹拌を継続した。ＩＳＣＯ精製（２０％ ＥｔＡｃ／ヘキサン）後に、所望の生成物（１）を、透明なオイルとして得た。
０℃でのＤＣＭ（１００ｍｌ）におけるｍｏＴ（Ｔｒ）（５．１０ｇ、１０．５４ｍｍｏｌ）に、ルチジン（３．６８ｍｌ、３１．６ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（６４２ｍｇ、５．２７ｍｍｏｌ）を添加し、続けて、１（４．８９ｇ、２１．０８ｍｍｏｌ）を添加した。反応を、ＲＴで１８時間、撹拌したままにした。ＩＳＣＯ精製（５０％ ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）後に、所望の生成物（２）を得た。
（実施例１８）
（（２Ｓ，６Ｒ）−６−（５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メチル ドデシル（メチル）ホスホロアミドクロリデート
Figure 0006884250
表題の化合物を、実施例６および８に記載の、一般的な手順に基づいて調製した。
（実施例１９）
（（２Ｓ，６Ｒ）−６−（５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メチル モルホリノホスホノクロリデート
Figure 0006884250
表題の化合物を、実施例６および８に記載の、一般的な手順に基づいて調製した。
（実施例２０）
（（２Ｓ，６Ｒ）−６−（５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メチル （Ｓ）−２−（メトキシメチル）ピロリジン−１−イルホスホノクロリデート
Figure 0006884250
表題の化合物を、実施例６および８に記載の、一般的な手順に基づいて調製した。
（実施例２１）
（（２Ｓ，６Ｒ）−６−（５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メチル ４−（３，４，５−トリメトキシベンズアミド）ピペリジン−１−イルホスホノクロリデート
Figure 0006884250
ＤＣＭ（２０ｍｌ）における１−Ｂｏｃ−４−ピペリジン（１ｇ、５ｍｍｏｌ）に、Ｈｕｎｉｇ塩基（１．７４ｍｌ、１０ｍｍｏｌ）を添加し、続けて、３，４，５−トリメトキシベンゾイルクロリド（１．３８ｇ、６ｍｍｏｌ）を添加した。反応を、ＲＴで３時間行い、濃縮して溶媒および過剰な塩基を除去した。残渣を、ＥｔＡｃ（１００ｍｌ）に溶解し、０．０５Ｎ ＨＣｌ（３×１５ｍｌ）、飽和ＮａＨＣＯ３（２×１５ｍｌ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。ＩＳＣＯ精製（５％ ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）後に、生成物（１）を得た。
７に、１５ｍｌの４Ｎ ＨＣｌ／ジオキサンを添加し、反応を、４時間後に終了した。８を、白色の固形物として得た。
８（１．２３ｇ、４．１８ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（２０ｍｌ）溶液を、Ｎ２下において、−７８℃に冷却した。ＤＣＭ（２ｍｌ）における塩化ホスホリル（０．３９ｍｌ、４．１８ｍｍｏｌ）の溶液、続けて、ＤＣＭ（２ｍｌ）におけるＥｔ３Ｎ（０．５８３ｍｌ、４．１８ｍｍｏｌ）の溶液を、ゆっくり添加した。反応をオーバーナイトでＲＴに温めながら、撹拌を継続した。ＩＳＣＯ精製（５０％ ＥｔＡｃ／ヘキサン）後に、所望の生成物（９）を得た。
０℃でのＤＣＭ（２０ｍｌ）におけるｍｏＴ（Ｔｒ）（１．９３３ｇ、４．０ｍｍｏｌ）に、ルチジン（０．９３ｍｌ、８ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（４９ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）を添加し、続けて、９（１．６４７ｇ、４ｍｍｏｌ）を添加した。反応を、ＲＴで１８時間、撹拌したままにした。ＩＳＣＯ精製（５０％ ＥｔＡｃ／ヘキサン）後に、所望の生成物（１０）を得た。
（実施例２２）
サブユニット（ＣＰＴ）を含むシクロホスホロアミドの合成
Figure 0006884250
ｍｏＴサブユニット（２５ｇ）を、ＤＣＭ（１７５ｍｌ）に懸濁し、ＮＭＩ（Ｎ−メチルイミダゾール、５．９４ｇ、１．４当量）を添加して、透明な溶液を得た。塩化トシルを、前記反応混合物に添加し、反応の進行を、終了するまで（約２時間）、ＴＬＣによりモニターした。水性処理を、０．５Ｍ クエン酸緩衝液（ｐＨ＝５）、続けて、塩水による洗浄により行った。有機層を分離し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。溶媒を、ロータリーエバポレータで除去して、粗生成物を得た。その粗生成物を、さらに精製することなく、次の工程に使用した。
上記で調製したｍｏＴトシレートを、プロパノールアミン（１ｇ／１０ｍｌ）と混合した。次いで、反応混合物を、４５℃でオーバーナイト、オーブンに置き、続けて、ＤＣＭ（１０ｍｌ）で希釈した。水性処理を、０．５Ｍ クエン酸緩衝液（ｐＨ＝５）、続けて、塩水による洗浄により行った。有機層を分離し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。溶媒を、ロータリーエバポレータで除去して、粗生成物を得た。前記粗生成物を、ＮＭＲおよびＨＰＬＣにより分析、測定して、さらに精製することなく、次の工程に準備した。
前記粗生成物を、ＤＣＭ（２．５ｍｌ ＤＣＭ／ｇ、１当量）に溶解し、ＤＩＥＡ（３当量）と混合した。この溶液を、ドライアイス−アセトンで冷却し、ＰＯＣｌ３（１．５当量）を、滴下して添加した。得られた混合物を、室温でオーバーナイト撹拌した。水性処理を、０．５Ｍ クエン酸緩衝液（ｐＨ＝５）、続けて、塩水による洗浄により行った。有機層を分離し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。溶媒を、ロータリーエバポレータで除去して、黄色の固形物として、粗生成物を得た。前記粗生成物を、シリカゲルクロマトグラフィー（粗生成物／シリカ＝１から５の比率、勾配 ＤＣＭから５０％ＥＡ／ＤＣＭ）により精製し、画分を、ＴＬＣ分析に基づいてプールした。溶媒を除去して、ジアステレオマーの混合物として、所望の生成物を得た。前記精製された生成物を、ＨＰＬＣ（ＮＰＰ停止）およびＮＭＲ（Ｈ−１およびＰ−３１）により分析した。
前記ジアステレオマー混合物を、下記の手順に基づいて分離した。前記混合物（２．６ｇ）を、ＤＣＭに溶解した。このサンプルを、ＲｅｄｉＳｅｐＲｆカラム（Ｔｅｌｅｄｙｎｅ Ｉｓｃｏにより製造された、８０ｇの順相）に載せ、１０％ＥＡ／ＤＣＭから５０％ＥＡ／ＤＣＭで、２０分にわたって溶出した。画分を収集し、ＴＬＣにより分析した。画分を、ＴＬＣ分析に基づいてプールし、室温でロータリーエバポレータにより、溶媒を除去した。プールした画分のジアステレオマー比率を、Ｐ−３１ ＮＭＲおよびＮＰＰ−ＴＦＡ分析により決定した。必要に応じて、前記ジアステレオマー比率が９７％に達するまで、上記手順を繰り返した。
（実施例２３）
ＰＭＯプラスの全体的なコール酸修飾
Figure 0006884250
スクシンイミド活性化コール酸誘導体を、下記の手順に基づいて調製した。コール酸（１２ｇ、２９．４ｍｍｏｌ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（４．０ｇ、３４．８ｍｍｏｌ）、ＥＤＣｌ（５．６ｇ、２９．３ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（１ｇ、８．２ｍｍｏｌ）を、丸底フラスコに入れた。ＤＣＭ（４００ｍｌ）およびＴＨＦ（４０ｍｌ）を添加して、溶解した。反応混合物を、室温でオーバーナイト攪拌した。次いで、水（４００ｍｌ）を、前記反応混合物に添加し、有機層を分離し、水（２×４００ｍｌ）、続けて、飽和ＮａＨＣＯ３（３００ｍｌ）および塩水（３００ｍｌ）で洗浄した。次いで、前記有機層を、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。溶媒をロータリーエバポレータで除去して、白色の固形物を得た。粗生成物を、クロロホルム（１００ｍｌ）に溶解し、ヘプタン（１０００ｍｌ）に沈殿させた。固形物を、ろ過により収集し、ＨＰＬＣおよびＮＭＲにより分析し、さらに精製することなく使用した。
適切な量のＰＭＯプラス（２０ｍｇ、２．８μｍｏｌ）を、バイアル（４ｍｌ）に秤量し、ＤＭＳＯ（５００μｌ）に溶解した。活性化コール酸エステル（１３ｍｇ、２５μｍｏｌ）を、１つの修飾部位あたりに、２当量の活性エステルの比率に基づいて、反応混合物に添加し、続けて、室温でオーバーナイト攪拌した。反応の進行を、ＭＡＬＤＩおよびＨＰＬＣ（Ｃ−１８またはＳＡＸ）により測定した。
前記反応が完了した後（開始ＰＭＯプラスの消滅により決定）、１ｍｌの濃アンモニアを、前記反応が完了した時点で、前記反応混合物に添加した。次いで、反応バイアルを、オーブン（４５℃）に、オーバーナイト（１８時間）入れ、続けて、室温に冷却し、水（１０ｍｌ）における１％のアンモニアで希釈した。このサンプルを、ＳＰＥカラム（２ｃｍ）に載せ、前記バイアルを、１％のアンモニア溶液（２×２ｍｌ）ですすいだ。前記ＳＰＥカラムを、水における１％のアンモニア（３×６ｍｌ）で洗浄し、生成物を、水（６ｍｌ）における１％のアンモニアにおける４５％アセトニトリルで溶出した。オリゴマーを含む画分を、ＵＶ光学密度測定により特定した。生成物を、凍結乾燥により単離した。純度および同一性を、ＭＡＬＤＩおよびＨＰＬＣ（Ｃ−１８および／またはＳＡＸ）により測定した。
これと同じ手順は、デオキシコール酸活性化およびＰＭＯ＋への接合に適用可能である。
（実施例２４）
ＰＭＯプラスの全体的なグアニジニル化
適切な量のＰＭＯプラス（２５ｍｇ、２．８μｍｏｌ）を、バイアル（６ｍｌ）に秤量した。１Ｈ−ピロゾール−１−カルボキサミジン塩化物（１５ｍｇ、１０２μｍｏｌ）および炭酸カリウム（２０ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）を、前記バイアルに添加した。水（５００μｌ）を添加し、反応混合物を、室温でオーバーナイト（約１８時間）攪拌した。反応の完了を、ＭＡＬＤＩにより決定した。
完了した時点で、前記反応を、水（１０ｍｌ）における１％のアンモニアで希釈し、ＳＰＥカラム（２ｃｍ）に載せた。前記バイアルを、１％のアンモニア溶液（２×２ｍｌ）ですすぎ、前記ＳＰＥカラムを、水における１％のアンモニア（３×６ｍｌ）で洗浄した。生成物を、水（６ｍｌ）における１％のアンモニアにおける４５％アセトニトリルで溶出した。オリゴマーを含む画分を、ＵＶ光学密度測定により特定した。生成物を、凍結乾燥により単離した。純度および同一性を、ＭＡＬＤＩおよびＨＰＬＣ（Ｃ−１８および／またはＳＡＸ）により測定した。
（実施例２５）
ＰＭＯプラス（Ｍ２３Ｄ）の全体的なチオアセチル修飾
Figure 0006884250
適切な量のＰＭＯプラス（２０ｍｇ、２．３μｍｏｌ）を、バイアル（４ｍｌ）に秤量し、ＤＭＳＯ（５００μｌ）に溶解した。Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）（７ｍｇ、２８μｍｏｌ）を、反応混合物に添加し、室温でオーバーナイト攪拌させた。反応の進行を、ＭＡＬＤＩおよびＨＰＬＣによりモニターした。
完了した時点で、水における１％のアンモニアを、前記反応混合物に添加し、室温で２時間攪拌した。この溶液を、ＳＰＥカラム（２ｃｍ）に載せた。前記バイアルを、１％のアンモニア溶液（２×２ｍｌ）ですすいだ。前記ＳＰＥカラムを、水における１％のアンモニア（３×６ｍｌ）で洗浄した。生成物を、水（６ｍｌ）における１％のアンモニアにおける４５％アセトニトリルで溶出した。オリゴマーを含む画分を、ＵＶ光学密度測定により特定した。生成物を、凍結乾燥により単離した。純度および同一性を、ＭＡＬＤＩおよびＨＰＬＣ（Ｃ−１８および／またはＳＡＸ）により測定した。
（実施例２６）
ＰＭＯプラスの全体的なコハク酸修飾
Figure 0006884250
適切な量のＰＭＯプラス（３２ｍｇ、３．７μｍｏｌ）を、バイアル（４ｍｌ）に秤量し、ＤＭＳＯ（５００μｌ）に溶解した。Ｎ−エチルモルホリノ（１２ｍｇ、１００μｍｏｌ）および無水コハク酸（１０ｍｇ、１００μｍｏｌ）を、反応混合物に添加し、室温でオーバーナイト攪拌させた。反応の進行を、ＭＡＬＤＩおよびＨＰＬＣによりモニターした。
完了した時点で、水における１％のアンモニアを、前記反応混合物に添加し、室温で２時間攪拌した。この溶液を、ＳＰＥカラム（２ｃｍ）に載せた。前記バイアルを、１％のアンモニア溶液（２×２ｍｌ）ですすいだ。前記ＳＰＥカラムを、水における１％のアンモニア（３×６ｍｌ）で洗浄した。生成物を、水（６ｍｌ）における１％のアンモニアにおける４５％アセトニトリルで溶出した。オリゴマーを含む画分を、ＵＶ光学密度測定により特定した。生成物を、凍結乾燥により単離した。純度および同一性を、ＭＡＬＤＩおよびＨＰＬＣ（Ｃ−１８および／またはＳＡＸ）により測定した。
上記手順を、さらに、ＰＭＯプラスのグルタル酸（無水グルタル酸）およびテトラメチレングルタル酸（無水テトラメチレングルタル酸）修飾に適応した。
Figure 0006884250
（実施例２７）
修飾末端基を含むオリゴヌクレオチド類似体の調製
ＤＭＳＯ（３００μＬ）における、結合していない３’端を含む、２５塩基長のＰＭＯ（２７．７ｍｇ、３．２２６μｍｏｌ）の溶液に、臭化ファルネシル（１．７５μｌ、６．４５２μｍｏｌ）およびジイソプロピルエチルアミン（２．２４μＬ、１２．９μｍｏｌ）を添加した。反応混合物を、室温で５時間攪拌した。前記粗製反応混合物を、１０ｍＬの１％のＮＨ４ＯＨ水溶液で希釈し、次いで、２ｍＬのＡｍｂｅｒｃｈｒｏｍｅ ＣＧ３００Ｍカラムに載せた。次いで、前記カラムを、カラムの３倍量の水ですすいだ。生成物を、６ｍＬの、１：１ アセトニトリルおよび水（ｖ／ｖ）で溶出した。次いで、前記溶液を、凍結乾燥して、白色の固形物として、表題の化合物を得た。
（実施例２８）
モルホリノオリゴマーの調製
トリチルピペラジンフェニルカルバマート３５（図３を参照のこと）の調製：
ジクロロメタン（６ｍＬ／ｇ １１）における化合物１１の冷却懸濁液に、水（４ｍＬ／ｇ 炭酸カリウム）における炭酸カリウムの溶液（３．２当量）を添加した。この二相混合物に、ジクロロメタン（２ｇ／ｇ フェニルクロロギ酸）におけるフェニルクロロギ酸の溶液（１．０３当量）を、ゆっくり添加した。反応混合物を、２０℃に温めた。反応完了（１〜２時間）の状態で、前記層を分離した。有機層を、水で洗浄し、無水炭酸カリウムで乾燥させた。生成物３５を、アセトニトリルから結晶化により単離した。収率＝８０％。
カルバミン酸アルコール３６の調製：
水素化ナトリウム（１．２当量）を、１−メチル−２−ピロリジノン（３２ｍＬ／ｇ 水素化ナトリウム）に懸濁した。この懸濁液に、トリエチレングリコール（１０．０当量）および化合物３５（１．０当量）を添加した。得られたスラリーを、９５℃に加熱した。反応完了（１〜２時間）の状態で、混合物を、２０℃に冷却した。この混合物に、３０％のジクロロメタン／メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（ｖ：ｖ）および水を添加した。引き続いて、生成物含有有機層を、ＮａＯＨ水溶液、コハク酸水溶液および飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄した。生成物３６を、ジクロロメタン／メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル／ヘプタンから、結晶化により単離した。収率＝９０％。
テール酸（ｔａｉｌ ａｃｉｄ）３７の調製：
テトラヒドロフラン（７ｍＬ／ｇ ３６）における化合物３６の溶液に無水コハク酸（２．０当量）およびＤＭＡＰ（０．５当量）を添加した。混合物を、５０℃に加熱した。反応完了（５時間）の状態で、前記混合物を、２０℃に冷却し、ＮａＨＣＯ３水溶液でｐＨ８．５に調節した。メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルを添加し、生成物を、水層中に抽出した。ジクロロメタンを添加し、混合物を、クエン酸水溶液でｐＨ３に調節した。生成物含有有機層を、ｐＨ＝３の、クエン酸緩衝液と飽和塩化ナトリウム水溶液との混合物で洗浄した。３７のジクロロメタン溶液を単離せずに、化合物３８の調製に使用した。
３８の調製：
化合物３７の前記溶液に、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボン酸イミド（ＨＯＮＢ）（１．０２当量）、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）（０．３４当量）を添加し、次いで、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）（１．１当量）を添加した。混合物を、５５℃に加熱した。反応完了（４〜５時間）の状態で、前記混合物を、２０℃に冷却し、引き続いて、１：１ ０．２Ｍクエン酸／塩水、および塩水で洗浄した。前記ジクロロメタン溶液を、アセトンに溶媒交換し、次いで、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶媒交換した。生成物を、アセトン／Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドから、飽和塩化ナトリウム水溶液中への沈殿により単離した。粗生成物を、水に複数回、再スラリー化して、残ったＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドおよび塩を除去した。化合物３６からの３８への収率＝７０％。ジスルフィドアンカー樹脂上への、活性型「テール（Ｔａｉｌ）」の導入を、固相合成中に、サブユニットの取り込みに使用される手順により、ＮＭＰにおいて行った。
モルホリノオリゴマーの合成用固体支持体の調製：
この手順を、粗大気孔群（４０〜６０μｍ）のガラスフリット、オーバーヘッドスターラーおよび、前記フリットによるＮ２のバブリングまたは真空抽出のための、３方向テフロン（登録商標）コックを有する、シラン化、被覆ペプチド容器（ＣｈｅｍＧｌａｓｓ、ＮＪ、ＵＳＡによる特注）において行った。温度制御を、循環水浴により、前記反応容器において達成した。
下記の手順における樹脂処理／洗浄工程は、２つの基本的な操作：樹脂流体化および溶媒／溶液抽出からなる。樹脂流体化に関して、前記コックを、Ｎ２が前記フリットを通して流れ込むように位置させ、特定の樹脂処理／洗浄を、前記反応器に添加し、充満させ、完全に前記樹脂を湿らせた。次いで、混合を開始し、樹脂スラリーを所定の時間混合した。溶媒／溶液抽出に関して、混合およびＮ２フローを停止し、真空ポンプを開始し、次いで、前記コックを、樹脂処理／洗浄から廃棄物に排出するように位置させた。全ての樹脂処理／洗浄容量を、特に断らない限り、１５ｍＬ／ｇの樹脂とした。
シラン化、被覆ペプチド容器における、アミノメチルポリスチレン樹脂（１００〜２００メッシュ；約１．０ｍｍｏｌ／ｇ Ｎ２置換；７５ｇ、１当量、Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｌａｂｓ、ＵＫ、ｐａｒｔ＃１４６４−Ｘ７９９）に、１−メチル−２−ピロリジノン（ＮＭＰ；２０ｍｌ／ｇ 樹脂）を添加し、１〜２時間混合しながら、樹脂を膨張させた。続けて、前記膨張した溶媒を排出し、前記樹脂を、ジクロロメタン（２×１〜２分）、２５％イソプロパノール／ジクロロメタンにおける、５％のジイソプロピルエチルアミン（２×３〜４分）およびジクロロメタン（２×１〜２分）で洗浄した。最後の洗浄の排出後、前記樹脂を、１−メチル−２−ピロリジノンにおけるジスルフィドアンカー３４（０．１７Ｍ；１５ｍＬ／ｇ 樹脂、約２．５当量）の溶液で流体化し、前記樹脂／試薬混合物を、４５℃で６０時間加熱した。反応完了の状態で、加熱を完了し、前記アンカー溶液を廃棄し、前記樹脂を、１−メチル−２−ピロリジノン（４×３−４分）およびジクロロメタン（６×１〜２分）で洗浄した。前記樹脂を、ジクロロメタンにおける１０％（ｖ／ｖ）の重炭酸ジエチルの溶液（１６ｍＬ／ｇ；２×５〜６分）で処理し、次いで、ジクロロメタン（６×１〜２分）で洗浄した。樹脂３９（図４を参照のこと）を、Ｎ２の流れ下で１〜３時間、次いで真空下において、一定重量（±２％）に乾燥させた。収率：元の樹脂重量の１１０〜１５０％。
アミノメチルポリスチレン−ジスルフィド樹脂の電荷の測定：
前記樹脂の電荷（利用できる可能性のある反応性部位の数）を、樹脂１グラムあたりのトリフェニルメチル（トリル）基の数についての、分光アッセイにより測定した。
既知の重量の乾燥樹脂（２５±３ｍｇ）を、容積２５ｍｌの、シラン化フラスコに移し、約５ｍＬの、ジクロロメタンにおける２％（ｖ／ｖ）のトリフルオロ酢酸を添加した。内容物を、穏やかに攪拌することにより混合し、次いで、３０分間静置した。容量を、更なるジクロロメタンにおける２％（ｖ／ｖ）のトリフルオロ酢酸で２５ｍＬにし、内容物を完全に混合した。容積式ピペットを使用して、トリチル含有溶液のアリコート（５００μＬ）を、容積１０ｍＬのフラスコに移し、容積を、メタンスルホン酸で１０ｍＬにした。
最終的な溶液におけるトリチルカチオン含量を、４３１．７ｎｍでのＵＶ吸光度により測定し、前記樹脂の電荷を、樹脂１ｇあたりのトリチル基（μｍｏｌ／ｇ）において、適切な容量、希釈、吸光度係数（ε：４１μｍｏｌ−１ｃｍ−１）および樹脂重量を使用して算出した。前記アッセイを３回行い、平均電荷を算出した。
本実施例における樹脂電荷手順により、おおよそ５００μｍｏｌ／ｇの電荷を有する樹脂が提供されるであろう。前記ジスルフィドアンカー取り込み工程を、室温で２４時間行う場合、３００〜４００μｍｏｌ／ｇの電荷が得られた。
テール電荷：
アミノメチルポリスチレン−ジスルフィド樹脂の調製と同様の設定および容量を使用して、前記テールが、前記分子に導入され得る。連結工程に関して、４−エチルモルホリン（ＮＥＭ、０．４Ｍ）を含むＮＭＰにおける、３８の溶液（０．２Ｍ）を、前記ジスルフィドアンカー溶液の代わりに使用した。４５℃で２時間後、２５％のイソプロパノール／ジクロロメタンにおける、５％のジイソプロピルエチルアミンで２回、ＤＣＭで１回、樹脂３９を洗浄した。安息香酸無水物（０．４Ｍ）およびＮＥＭ（０．４Ｍ）の溶液を、前記樹脂に添加した。２５分後、反応器ジャケットを、室温に冷却し、前記樹脂を、２５％のイソプロパノール／ジクロロメタンにおける、５％のジイソプロピルエチルアミンで２回、および、ＤＣＭで８回洗浄した。樹脂４０をろ過し、高真空下において乾燥させた。樹脂４０についての電荷を、前記テール電荷に使用した元のアミノメチルポリスチレン−ジスルフィド樹脂３９の電荷であると規定した。
固相合成：
モルホリノオリゴマーを、Ｇｉｌｓｏｎ ＡＭＳ−４２２ 自動ペプチド合成機における２ｍＬのＧｉｌｓｏｎポリプロピレン反応カラム（Ｐａｒｔ＃３９８０２７０）において調製した。水流用の流路を有するアルミニウムブロックを、前記合成機上に位置するように、前記カラムの周りに置いた。前記ＡＭＳ−４２２は、二者択一的に、試薬／洗浄溶液を添加し、特定時間保持し、真空を使用してカラムを廃棄するであろう。
長さ約２５個のサブユニット以下の範囲におけるオリゴマーに関して、５００μｍｏｌ／ｇ樹脂付近の電荷を有するアミノメチルポリスチレン−ジスルフィド樹脂が好ましい。より大きいオリゴマーに関して、３００−４００μｍｏｌ／ｇ樹脂の電荷を有するアミノメチルポリスチレン−ジスルフィド樹脂が好ましい。５’−テールを有する分子が望まれる場合、テールにより電荷された樹脂が、同様の電荷指針により選択される。
下記の試薬溶液を調製した。
脱トリチル溶液：４：１のジクロロメタン／アセトニトリルにおける、１０％のシアノ酢酸（ｗ／ｖ）；中和溶液：３：１のジクロロメタン／イソプロパノールにおける、５％のジイソプロピルエチルアミン；連結溶液：１，３−ジメチルイミダゾリジノンにおける、所望の塩基およびリンケージ型の、０．１８Ｍ（または、２０個のサブユニットより長い伸長を有するオリゴマーに関して、０．２４Ｍ）活性化モルホリノサブユニット、および、０．４Ｍ Ｎエチルモルホリン。ジクロロメタン（ＤＣＭ）を、異なる試薬溶液洗浄液を分離する暫定的な洗浄液として使用した。
前記合成機において、前記ブロックを、４２℃に設定し、３０ｍｇのアミノメチルポリスチレン−ジスルフィド樹脂（またはテール樹脂）を含む各カラムに、２ｍＬの１−メチル−２−ピロリジノンを添加し、室温に３０分間静置した。２ｍＬのジクロロメタンで２回洗浄した後、下記の合成サイクルを使用した。
Figure 0006884250
各カラムが適切な配列における適切な連結溶液（Ａ、Ｃ、Ｇ，Ｔ、Ｉ）を受け取るように、個々のオリゴマーの配列を、前記合成機にプログラムした。カラムにおける前記オリゴマーが、その最後のサブユニットの取り込みを完了した場合、前記カラムを、前記ブロックから取り出し、最終的なサイクルを、０．８９Ｍ ４−エチルモノホリンを含む、４−メトキシトリフェニルメチル塩化物を含んだ連結溶液（ＤＭＩにおける０．３２Ｍ）により、手動で行った。
前記樹脂からの開裂、塩基および骨格保護基の除去：
メトキシトリチル化後に、前記樹脂を、２ｍＬの１−メチル−２−ピロリジノンで８回洗浄した。１ｍＬの、１−メチル−２−ピロリジノンにおける、０．１Ｍ １，４−ジチオスレイトール（ＤＴＴ）および０．７３Ｍ トリエチルアミンからなる開裂溶液を添加し、前記カラムのふたをし、室温で３０分間静置した。その時間後、前記溶液を、１２ｍＬのＷｈｅａｔｏｎバイアル内に排出した。非常に収縮した樹脂を、３００μＬの開裂溶液で２回洗浄した。前記溶液に、４．０ｍＬの濃アンモニア水溶液（−２０℃で保存）を添加し、しっかりバイアルのふた（テフロン（登録商標）裏打ちのスクリューキャップ）をし、混合物を、前記溶液を混合するために攪拌した。前記バイアルを、４５℃のオーブンに、１６〜２４時間置き、塩基および骨格保護基の開裂を達成した。
初期のオリゴマー単離：
バイアルに入った加アンモニア分解溶液を、前記オーブンから取り出し、室温に冷却させた。前記溶液を、２０ｍＬの、０．２８％のアンモニア水溶液で希釈し、Ｍａｃｒｏｐｒｅｐ ＨＱ樹脂（ＢｉｏＲａｄ）を含む、２．５×１０ｃｍのカラムに通した。塩勾配（Ａ：０．２８％のアンモニアと、Ｂ：０．２８％のアンモニアにおける１Ｍ 塩化ナトリウム；０〜１００％Ｂ、６０分）を使用して、メトキシトリチル含有ピークを溶出した。合わせた画分をプールし、さらに、所望の生成物に応じて処理した。
モルホリノオリゴマーの脱メトキシトリチル化：
前記Ｍａｃｒｏｐｒｅｐ精製からの前記プール画分を、ｐＨ２．５以下で、１Ｍ Ｈ３ＰＯ４で処理した。最初の混合後、サンプルを、室温に４分間静置した。その時点で、前記サンプルを、２．８％のアンモニア／水で、ｐＨ１０−１１に中和した。生成物を、固相抽出（ＳＰＥ）により精製した。
Ａｍｂｅｒｃｈｒｏｍｅ ＣＧ−３００Ｍ（Ｒｏｈｍ ａｎｄ Ｈａａｓ；Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ）（３ｍＬ）を、２０ｍＬのフリットカラム（ＢｉｏＲａｄ Ｅｃｏｎｏ−Ｐａｃ クロマトグラフィーカラム（７３２〜１０１１））に詰め、前記樹脂を、３ｍＬの下記：０．２８％ＮＨ４ＯＨ／８０％アセトニトリル；０．５Ｍ ＮａＯＨ／２０％エタノール；水；５０ｍＭ Ｈ３ＰＯ４／８０％アセトニトリル；水；０．５ ＮａＯＨ／２０％エタノール；水；０．２８％のＮＨ４ＯＨですすいだ。
脱メトキシトリチル化からの溶液を、前記カラムに載せ、前記樹脂を、３〜６ｍＬの０．２８％のアンモニア水溶液で３回すすいだ。Ｗｈｅａｔｏｎバイアル（１２ｍＬ）を、前記カラムの下に置き、生成物を、２ｍＬの、０．２８％のアンモニア水溶液における４５％のアセトニトリルでの、２回の洗浄により溶出させた。前記溶液を、ドライアイスで凍結させ、前記バイアルを、凍結乾燥機に入れて、ふわふわした白色の粉末を生成した。サンプルを水に溶解し、シリンジを使用して、０．２２ミクロンフィルタ（Ｐａｌｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、０．２ミクロンのＨＴ Ｔｕｆｆｒｙｎ膜を有する、Ａｃｒｏｄｉｓｃ ２５ｍｍシリンジフィルタ）を通してろ過した。光学密度（ＯＤ）を、ＵＶ分光計で測定して、存在するオリゴマーのＯＤ単位、および、分析用の投与サンプルを決定した。次いで、前記溶液を、凍結乾燥用のＷｈｅａｔｏｎバイアルに入れ直した。
モルホリノオリゴマーの分析：
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計を、精製における画分の組成を決定し、前記オリゴマーの同一性（分子量）についての証拠を提供するのに使用した。マトリクスとして、３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシケイ皮酸（シナピン酸）、３，４，５−トリヒドロキシアセトフェノン（ｔｒｉｈｙｄｏｘｙａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ）（ＴＨＡＰ）またはアルファ−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ａｌｐｈａ−ｃｙａｎｏ−４−ｈｙｄｏｘｙｃｉｎｎａｍｉｃ ａｃｉｄ）（ＨＣＣＡ）の溶液で、サンプルの希釈を行った。
Ｄｉｏｎｅｘ ＰｒｏＰａｃ ＳＣＸ−１０、４×２５０ｍｍカラム（Ｄｉｏｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を使用し、２５ｍＭ ｐＨ＝５の、酢酸ナトリウム ２５％アセトニトリル（緩衝液Ａ）および、２５ｍＭ ｐＨ＝５の、酢酸ナトリウム ２５％アセトニトリル １．５Ｍ 塩化カリウム（緩衝液Ｂ）（１５分で、勾配 Ｂ１０〜１００％）または、ｐＨ＝３．５での、２５ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４ ２５％アセトニトリル（緩衝液Ａ）および、ｐＨ＝３．５での、１．５Ｍ 塩化カリウムを含む２５ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４ ２５％アセトニトリル（緩衝液Ｂ）（１５分で、勾配 Ｂ０〜３５％）を使用して、カチオン交換（ＳＣＸ）ＨＰＬＣを行った。前者の系を、付着したペプチドを有さない、正電荷を有するオリゴマーに使用した。一方、後者を、ペプチドコンジュゲートに使用した。
カチオン交換クロマトグラフィーによるモルホリノオリゴマーの精製：
サンプルを、２０ｍＭ 酢酸ナトリウム、ｐＨ＝４．５（緩衝液Ａ）に溶解し、Ｓｏｕｒｃｅ３０カチオン交換樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のカラムにアプライし、２０ｍＭ 酢酸ナトリウムおよび４０％アセトニトリルにおける０．５Ｍ 塩化ナトリウムｐＨ＝４．５（緩衝液Ｂ）の勾配で溶出した。生成物を含むプール画分を、濃アンモニア水溶液で中和し、Ａｍｂｅｒｃｈｒｏｍｅ ＳＰＥカラムにアプライした。生成物を、上記と同様に、溶出、凍結および凍結乾燥した。
（実施例２９）
典型的なコンジュゲートの調製
ペプチド配列ＡｃＲ６Ｇを、当該分野において公知の標準的なペプチド合成法に基づいて調製した。ＤＭＳＯ（３ｍＬ）における、前記ＰＭＯ（ＮＧ−０５−０２５５、３’−Ｈ：Ｍ２３Ｄ：５’−ＥＧ３、ｍｄｘマウスのエクソン２３に結合する配列、３５０ｍｇ、１当量）、ＡｃＲ６Ｇ（１４２ｍｇ、２当量）、ＨＡＴＵ（３１ｍｇ、２当量）の溶液に、ジイソプロピルエチルアミン（３６μＬ、５当量）を、室温で添加した。１時間後、反応を後処理し、所望のペプチド−オリゴマーコンジュゲートを、ＳＣＸクロマトグラフィー（勾配による溶出：Ａ：２５％アセトニトリル／Ｈ２Ｏにおける２０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．０；Ｂ：２５％アセトニトリル／Ｈ２Ｏにおける１．５Ｍ グアニジンＨＣｌおよび２０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．０）により精製した。合わせた画分を、固相抽出（１Ｍ ＮａＣｌ、続けて水による溶出）に供した。凍結乾燥後に、前記コンジュゲートを、白色の粉末（２５７ｍｇ、収率６５．５％）として得た。
（実施例３０）
本発明の典型的なコンジュゲートによるＭＤＸマウスの処置
前記ＭＤＸマウスは、承認され、ジストロフィン遺伝子のｅｘｓｏｎ２３に変異を含むデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）についての動物モデルとして十分特徴付けられている。Ｍ２３Ｄアンチセンス配列（配列番号：１５）は、エクソン２３のスキッピングおよび機能性ジストロピン発現の修復を誘導することが知られている。ＭＤＸマウスを、下記コンジュゲートの１つで、尾静脈注射により、１回（５０ｍｇ／ｋｇ）投与した。
１．5’-EG3-M23D-BX(RXRRBR)2 (AVI5225);
２．5’-EG3-M23D-G(R)5 (NG-11-0045);
３．5’-EG3-M23D-G(R)6 (NG-11-0009);
４．5’-EG3-M23D-G(R)7 (NG-11-0010);または、
５．5’-EG3-M23D-G(R)8 (NG-11-0216)
Ｍ２３Ｄは、配列GGCCAAACCTCGGCTTACCTGAAATを有するモルホリノオリゴヌクレオチドであり、「ＥＧ３」は、ピペラジンリンカー（すなわち、構造ＸＸＩＸ）を介して前記オリゴマーの５’端に結合した下記構造：
Figure 0006884250
を意味する。
注射後１週間で、前記ＭＤＸマウスを犠牲にし、ＲＮＡを種々の筋肉組織から抽出した。エンドポイントＰＣＲを使用して、エクソン２３を含むジストロフィンｍＲＮＡと、アンチセンス誘導エクソンスキッピングによるエクソン２３欠損ｍＲＮＡとの相対存在量を測定した。パーセントエクソン２３スキッピングは、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるアンチセンス活性の測定である。図５および６は、それぞれ処置後１週間での、大腿四頭筋（ＱＣ、図５Ａおよび６Ａ）、横隔膜（ＤＴ、図５Ｂおよび６Ｂ）および心臓（ＨＴ、図５Ｃおよび６Ｃ）からの結果を示す。ＡＶＩ−５２２５と他のコンジュゲートとの間の用量反応は、同様であった。アルギニン系の中でも、Ｒ６Ｇペプチドは、大腿四頭筋および横隔膜において、最も高い有効性を有し、心臓において他のアルギニン系ペプチドと同等であった。
（実施例３１）
典型的なコンジュゲートで処置されたマウスのＢＵＮレベルおよび生存率
マウスを、実施例３０記載の前記コンジュゲートで処置し、ＫＩＭ−１レベル、ＢＵＮレベルおよび生存率を、以下の実施例３２に記載され、当該分野において公知の一般的な手順に基づいて測定した。驚くべきことに、図７Ａは、全てのグリシン結合コンジュゲートが、ＸＢ結合コンジュゲート（ＡＶＩ−５２２５）より、顕著に低いＢＵＮレベルを有したことを示す。さらに、グリシン結合コンジュゲートで処置したマウスは、ＸＢ結合コンジュゲート、アルギニンポリマーの最小耐性であるＲ８Ｇコンジュゲートより、高い投与量で、より長く生存した（図７Ｂ）。前記Ｒ６Ｇコンジュゲート（ＮＧ−１１−０００９）で処置した全てのマウスは、４００ｍｇ／ｋｇ以下の投与量で生存した（データを示さず）。
グリシン結合コンジュゲートで処置したマウスの、前記ＫＩＭ−１（図８Ａ）およびクラステリン（図８Ｂ）のレベルは、ＡＶＩ−５２２５で処置したマウスより、顕著に低かった。このデータは、本発明のコンジュゲートが、従来のコンジュゲートより低い毒性を有し、上記実施例３０に示すように、前記コンジュゲートの有効性が低下しないことを示す。したがって、本発明のコンジュゲートは、他の公知のコンジュゲートより、良好な治療手段を有し、潜在的により良好な薬剤候補である。
（実施例３２）
典型的なコンジュゲートの毒性学
本発明における４つの典型的なコンジュゲートを、マウスにおけるその毒性学について試験した。前記コンジュゲートは、下記のとおりである。
１．5’-EG3-M23D-BX(RXRRBR)2 (AVI5225);
２．5’-EG3-M23D-G(RXRRBR)2 (NG-11-0654);
３．5’-EG3-M23D-BX(R)6 (NG-11-0634);および、
４．5’-EG3-M23D-G(R)6(NG-11-0009)
Ｍ２３Ｄは、配列GGCCAAACCTCGGCTTACCTGAAATを有するモルホリノオリゴヌクレオチドであり、「ＥＧ３」は、ピペラジンリンカー（すなわち、構造ＸＸＩＸ）を介して前記オリゴマーの５’端に結合した下記構造：
Figure 0006884250
を意味する。
８周齢のメスのマウス（Ｃ５７／ＢＬ６；Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、１８〜２２グラム）を、生理食塩水に配合した上記コンジュゲートで処置した。前記マウスを、実験手順の開始前に、最短５日間で順応させた。
前記動物を、承認された照射接触巣材を有する、透明なポリカーボネートのマイクロアイソレーターケージに、１ケージあたりに３匹以下で収容した。前記ケージは、動物保護法（全ての修正を含む）およびｔｈｅ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，２０１０で説明される基準に従った。
動物を、以下の表に規定するケージ重量に基づいて、処置群を無作為に選んだ。群割当を、研究記録に記録した。
Figure 0006884250
前記研究における投与日を、研究日１として指定した。コンジュゲートを、尾静脈を介して、ゆっくり押すボーラス投与（約５秒）として投与した。全ての動物を、２日にわたって投与した。群１〜８を初日に投与し、群９〜１６を、２日目に投与した。処置群（ＴＧ）１３〜１６を、上記表で投与した。これらのＴＧからの結果は、他のＴＧに対する進展に影響を及ぼさなかった。各コンジュゲートの最初の２ＴＧは、上記表で投与した。１００ｍｇ／ｋｇの群における全ての動物が死んだ場合、次いで、その試験項目についての残りのＴＧには投与せず、研究を終了したであろう。少なくとも１匹の動物が、１００ｍｇ／ｋｇの群において、投与後２時間で生存した場合、次いで、１５０ｍｇ／ｋｇの群を投与した。１５０ｍｇ／ｋｇの群における全ての動物が死んだ場合、次いで、その試験項目についての残りのＴＧには投与せず、研究を終了したであろう。少なくとも１匹の動物が、１５０ｍｇ／ｋｇの群において、投与後２時間で生存した場合、次いで、２００ｍｇ／ｋｇの群を投与した。
動物を、瀕死および死亡率について、１日１回観察した。苦痛のサイン、特に死が明らかに迫っているサインを示す任意の動物を、Ｎｕｍｉｒａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓに基づいて、人道的に安楽死させた。到着日、投与日および解剖日において、体重を記録した。詳細な臨床観察を、投与後０分、１５分および２時間で実行、記録して、注射の耐性を評価した。
血液サンプル（最大容量、おおよそ１ｍＬ）を、３日目投与後の解剖前に、心穿刺により全ての動物から得た。血液サンプルを、赤色栓ｍｉｃｒｏｔａｉｎｅｒチューブに収集し、遠心前に、少なくとも３０分から６０分以内の間、室温で保持した。サンプルを、おおよそ１５００〜２５００ｒｐｍで、１５〜２０分間遠心して、血清を得た。
次の定期的な観察まで生存の見込みのない動物を、秤量し、安楽死させた。死んでいることが発見された動物を秤量し、死んだ時間を可能な限り細かく推定した。血液および組織のサンプルを、収集しなかった。
３日目（投与後２日）において、全ての動物を、二酸化炭素で人道的に安楽死させた。安楽死は、承認された米国獣医師会（ＡＶＭＡ）安楽死のガイドライン Ｊｕｎｅ ２００７に基づいて行った。
一部の全体的な解剖は、実験および研究結果の記録を含んだ。全ての外表面および開口部を、評価した。組織の収集中に観察された全ての異常を、完全に記載し、記録した。更なる組織を不要とした。
左右の腎臓を収集した。組織を、安楽死から１５分以内に収集した。使用した全ての器具およびツールを、処置群間で交換した。全ての組織を、収集後可能な限り早く、急速冷凍し、＜−７０℃で保存した。
腎傷害マーカーデータを、下記のようにして取得した。マウス腎臓組織からのＲＮＡを、Ｑｕｉｃｋ Ｇｅｎｅ Ｍｉｎｉ８０ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ ＳＩＩ（Ｆｕｊｉ Ｆｉｌｍ）を使用して精製した。つまり、おおよそ４０ｍｇの組織を、ＭａｇｎａＬｙｓｅｒ Ｇｒｅｅｎ Ｂｅａｄバイアル（Ｒｏｃｈｅ）において、０．５ｍｌの溶解緩衝液（０．５ｍｌの溶解緩衝液における５μｌの２−メルカプトエタノール）に添加し、ＭａｇＮＡ Ｌｙｓｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、３×３８００ＲＰＭを２セット、および、１×６５００ＲＰＭを３セットで、均一化した。サンプルを、各低速セットおよび各高速の実行間に、氷上で３〜４分冷却した。ホモジネートを、４００×ｇで室温において５分間遠心した。前記ホモジネートを、Ｑｕｉｃｋ Ｇｅｎｅ Ｍｉｎｉ８０のプロトコルに基づいて、直ちにＲＮＡ精製について処理した。サンプルを、カラム上で５分間、ＤＮａｓｅ Ｉ（Ｑｉａｇｅｎ）でＤＮＡ消化させた。トータルＲＮＡを、ＮａｎｏＤｒｏｐ２０００分光計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で定量した。
ｑＲＴ−ＰＣＲを、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ試薬（１−ステップＲＴ−ＰＣＴ）およびプレデザインしたプライマー／プローブセット（ＡＣＴＢ、ＧＡＰＤＨ、ＫＩＭ−１、クラステリン−ＦＡＭレポーター）を使用して行った。
Figure 0006884250
各反応は、下記（合計３０μｌ）を含んだ。
１５μｌ ＡＢＩ Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ ｋｉｔからの２×ｑＲＴ−ＰＣＲ緩衝液
１．５μｌ プライマー／プローブミックス
８．７５μｌ ヌクレアーゼフリー水
０．７５μｌ ４０×マルチスクリプト＋ＲＮａｓｅ阻害剤
４μｌ ＲＮＡテンプレート（１００ｎｇ／μｌ）
ｑＲＴ １−ステッププログラムを、下記のとおり実行した。
１．４８Ｃ、３０分間
２．９５Ｃ、１０分間
３．９５Ｃ、１５秒間
４．６０Ｃ、１分間
５．ステップ３〜４を３９回繰り返し、合計４０サイクル
サンプルを、３つのウェルで行い、更なる分析のために平均化した。分析を、ΔΔＣｔ法を使用して行った。つまり、コントロールΔＣｔ［Ｃｔ（標的）−Ｃｔ（参照）］により差し引いた、実験から得たΔＣｔ［Ｃｔ（標的）−Ｃｔ（参照）］＝ΔΔＣｔである。倍数変化範囲を、算出した：２＾−（ΔΔＣｔ＋ＳＤ）から２＾−（ΔΔＣｔ−ＳＤ）。コントロール＝（プールした）媒体処置動物群、ターゲット＝ＫＩＭ−１；参照＝ＧＡＰＤＨ；ＳＤ＝Ｓｑｒｔ［（ＳＤターゲット＾２）＋（ＳＤ参照＾２）］。
ＫＩＭデータの結果を、図１０に示す。末端グリシンを有するキャリアペプチドを含むコンジュゲートは、最も低いＲ６Ｇペプチドで、より低いＫＩＭ濃度を有した。末端Ｇおよび非天然アミン酸（アミノヘキサン酸）の存在の両方が、前記コンジュゲートの毒性において役割を果たすことが明らかである。
凍結血清サンプルを、処理するために、ＩＤＥＸＸ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｅｓｔ Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ、ＣＡ）にドライアイスで送った。必要に応じて、血清希釈を、ＩＤＥＸＸ標準操作手順（ＳＯＰ）で行った。血液化学の結果を、分析した。血液尿素窒素レベルを、図１１に示す。改めて、前記Ｇ結合コンジュゲートは、より低いＢＵＮレベルを有した。末端Ｇおよびペプチド配列全体の両方が、前記コンジュゲートの毒性プロファイルにおいて役割を果たすことが明らかである。
腎臓組織（おおよそ１５０ｍｇ）を、セラミックビーズで部分的に満たした、２ｍＬのスクリューキャップバイアルに正確に量りとった。５体積部の、１０Ｕ／ｍＬのプロテイナーゼＫ（Ｓｉｇｍａ）を含む組織ＰＥ ＬＢ緩衝液（Ｇ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を、１部の組織に添加した。サンプルを、Ｒｏｃｈｅ ＭａｇｎａＬｙｓｅｒ（操作の間に冷却しながら、４×４０秒 ＠７，０００ｒｐｍ）でホモジナイズし、４０℃で３０分間インキュベートした。必要な場合に、組織ホモジネートを、ＢＳＡｓａｌ（３ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ＋２０ｍＭ ＮａＣｌ）で希釈して、較正範囲内の高サンプル濃度にした。
較正サンプルを、既知量の適切な分析参照標準を含む２０ｍＭ ＮａＣｌにおける、３ｍｇ／ｍＬのＢＳＡの溶液を添加することにより調製した。８つのサンプルの２セットを、それぞれ調製した。ＵＬＯＱは、４０μｇ／ｍＬとし、ＬＬＯＱは、０．０６５５３６μｇ／ｍＬとした。内部標準（ＮＧ−０７−０７７５）を、（薬剤および内部標準を含まない）二重ブランクとして指定された一部のブランクサンプル以外は、全てのサンプルに添加した。３倍体積のメタノールで１００μＬのアリコートをボルテックスすることにより、サンプルを抽出した。
遠心（１５分、１４，０００ｒｐｍ）後、上清を、新たなチューブに移し、Ｓｐｅｅｄｖａｃで乾燥させた。乾燥サンプルを、［１０ｍＭ トリスｐＨ８．０＋１ｍＭ ＥＤＴＡ＋１００ｍＭ ＮａＣｌ］−アセトニトリル（７５〜２５）における、適量のＦＤＮＡ（5’ d FAM-ATTTCAGGTAAGCCGAGGTTTGGCC 3’）で再構成した。
サンプルを、Ｄｉｏｎｅｘ ＵｌｔｉＭａｔｅ ３０００ ＨＰＬＣ上で、アニオン交換クロマトグラフィー（Ｄｉｏｎｅｘ ＤＮＡＰａｃ ４×２５０ｍｍカラム）を使用して分析した。注入量は、５μＬとした。移動相を、２５ｍＭ トリスｐＨ８．０を含む２０％アセトニトリルおよび８０％水、ならびに、ＮａＣｌ濃度を増加する勾配で構成した。流速は、１ｍＬ／分とし、実行時間は、１サンプルあたり１０分とした。蛍光検出器を、ＥＸ４９４ｎｍおよびＥＭ５２０ｎｍに設定した。ピークの同一性は、保持時間に基づいた。ピーク高さ比（分析対象：内部標準）を、定量に使用した。検量線を、（一方のセットがバッチの開始で実行され、他のセットがバッチの終了で実行された）２つの較正サンプルの平均応答因子に基づいて算出した。１／ｘの重み係数に適合する線形曲線を使用した。ブランクサンプル（参照化合物が含まれていない較正サンプル）および二重ブランクサンプル（内部標準添加）を使用して、アッセイ特異性およびキャリーオーバーが無いことを確認した。
図１２は、腎臓濃度が前記試験したコンジュゲートの中で同様であったことを示す。
上記データは、本発明のコンジュゲートが、他のコンジュゲートと比較して、同様の有効性および改善された毒性を有することを示す。図９Ａ〜Ｄは、Ｒ６Ｇコンジュゲート（ＮＧ−１１−０００９）に関する、これらの結果をまとめている。
上記の種々の実施形態は、組み合わされて、更なる実施形態を提供し得る。本明細書で言及および／または出願データシートに列記した、全ての米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国の特許、外国の特許出願および非特許文献は、それらの全体を、参照により本願明細書に取り込まれる。前記実施形態の態様は、更なる実施形態を提供するために、種々の特許、出願および刊行物の概念を使用する必要がある場合、修飾され得る。これらの変更および他の変更は、上記詳細な説明の観点における前記実施形態になされ得る。一般に、下記の特許請求の範囲では、使用される用語は、明細書および特許請求の範囲に開示された特定の実施形態に、前記特許請求の範囲を限定して解釈されるべきではなく、このような特許請求の範囲が権利を受けるのと均等物の完全な範囲に沿った、全ての可能性のある実施形態を含むと解釈されるべきである。したがって、特許請求の範囲は、本開示により限定されない。

Claims (27)

  1. （ａ）４から４０個のアミノ酸を含む細胞浸透性ペプチドであって、ここで、該細胞浸透性ペプチドのカルボキシ末端アミノ酸がグリシン（Ｇ）またはプロリン（Ｐ）である、細胞浸透性ペプチド；
    （ｂ）実質的に荷電していない骨格と、該標的核酸に対する配列特異的結合のためのターゲッティング塩基配列とを含む核酸類似体であって、該核酸類似体は長さ８から４０塩基である、核酸類似体；および、
    （ｃ）該核酸類似体と該細胞浸透性ペプチドとの間の共有結合付着点であって、該共有結合付着点は該カルボキシ末端のグリシンまたはプロリンを含むか、または該共有結合付着点は該カルボキシ末端のグリシンまたはプロリンおよびリンカー基を含む、共有結合付着点；
    を含むコンジュゲートであって、
    ここで、該アミノ酸のうちの２個以上が、正電荷を有するアミノ酸であり、７個以下の連続したアミノ酸が、アルギニンであり、
    該核酸類似体が、アンチセンスモルホリノオリゴマーであり、該核酸類似体は、サブユニット間リンケージにより結合された一連のモルホリノ環構造を含み、該サブユニット間リンケージが、下記一般構造（Ｉ）：
    Figure 0006884250
    または、その塩を有し、該サブユニット間リンケージ（Ｉ）の各々が、独立して、リンケージ（Ａ）またはリンケージ（Ｂ）であり：
    リンケージ（Ａ）に関して：
    Ｗが各出現箇所で独立して、ＳまたはＯであり；
    Ｘが各出現箇所で独立して、−Ｎ（ＣＨ ３ ） ２ 、−ＮＲ １ Ｒ ２ 、−ＯＲ ３ または；
    Figure 0006884250
    であり；
    Ｙが各出現箇所で独立して、Ｏまたは−ＮＲ ２ であり；
    Ｒ １ が各出現箇所で独立して、水素またはメチルであり；
    Ｒ ２ が各出現箇所で独立して、水素または−ＬＮＲ ４ Ｒ ５ Ｒ ７ であり；
    Ｒ ３ が各出現箇所で独立して、水素またはＣ １ −Ｃ ６ アルキルであり；
    Ｒ ４ が各出現箇所で独立して、水素、メチル、−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ ２ 、−Ｚ−Ｌ−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ ２ または−［Ｃ（Ｏ）ＣＨＲ’ＮＨ］ ｍ Ｈであり、Ｚが、カルボニル（Ｃ（Ｏ））または直接結合であり、Ｒ’が、天然に存在するアミノ酸の側鎖またはその１つもしくは２つの炭素同族体であり、ｍが、１から６であり；
    Ｒ ５ が各出現箇所で独立して、水素、メチルまたは電子対であり；
    Ｒ ６ が各出現箇所で独立して、水素またはメチルであり；
    Ｒ ７ が各出現箇所で独立して、水素、Ｃ １ −Ｃ ６ アルキルまたはＣ １ −Ｃ ６ アルコキシアルキルであり；
    Ｌが、直接結合であるか、または、アルキレン、アルコキシアルキレンもしくはアルキルイミノの基またはそれらの組み合わせを含む、長さ１８原子以下のリンカーであり、ならびに、
    リンケージ（Ｂ）に関して：
    Ｗが各出現箇所で独立して、ＳまたはＯであり；
    Ｘが各出現箇所で独立して、−ＮＲ ８ Ｒ ９ または−ＯＲ ３ であり；および、
    Ｙが各出現箇所で独立して、Ｏまたは−ＮＲ １０ であり、
    Ｒ ８ が各出現箇所で独立して、水素またはＣ ２ −Ｃ １２ アルキルであり；
    Ｒ ９ が各出現箇所で独立して、水素、Ｃ １ −Ｃ １２ アルキル、Ｃ １ −Ｃ １２ アラルキルまたはアリールであり；
    Ｒ １０ が各出現箇所で独立して、水素、Ｃ １ −Ｃ １２ アルキルまたは−ＬＮＲ ４ Ｒ ５ Ｒ ７ であり；
    Ｒ ８ およびＲ ９ が結合して、５〜１８員の単環複素環もしくは二環複素環を形成してもよく、または、Ｒ ８ 、Ｒ ９ またはＲ ３ がＲ １０ と結合して、５〜７員の複素環を形成し、Ｘが４−ピペラジノである場合、Ｘが下記構造（ＩＩＩ）：
    Figure 0006884250
    を有し、式中：
    Ｒ １１ が各出現箇所で独立して、Ｃ ２ −Ｃ １２ アルキル、Ｃ １ −Ｃ １２ アミノアルキル、Ｃ １ −Ｃ １２ アルキルカルボニル、アリール、ヘテロアリールまたはヘテロシクリルであり；および、
    Ｒが各出現箇所で独立して、電子対、水素またはＣ １ −Ｃ １２ アルキルであり；
    Ｒ １２ が各出現箇所で独立して、水素、Ｃ １ −Ｃ １２ アルキル、Ｃ １ −Ｃ １２ アミノアルキル、−ＮＨ ２ 、−ＣＯＮＨ ２ 、−ＮＲ １３ Ｒ １４ 、−ＮＲ １３ Ｒ １４ Ｒ １５ 、Ｃ １ −Ｃ １２ アルキルカルボニル、オキソ、−ＣＮ、トリフルオロメチル、アミジル、アミジニル、アミジニルアルキル、アミジニルアルキルカルボニル グアニジニル、グアニジニルアルキル、グアニジニルアルキルカルボニル、コラート、デオキシコラート、アリール、ヘテロアリール、複素環、−ＳＲ １３ またはＣ １ −Ｃ １２ アルコキシであり、Ｒ １３ 、Ｒ １４ およびＲ １５ が、各出現箇所で独立して、Ｃ １ −Ｃ １２ アルキルであり；および、
    Ｒ ３ 、Ｒ ４ 、Ｒ ５ 、Ｒ ７ およびＬが、リンケージ（Ａ）において定義したものと同じである、
    コンジュゲート。
  2. 前記細胞浸透性ペプチドが、前記カルボキシ末端に、グリシンアミノ酸を含む、請求項１記載のコンジュゲート。
  3. 前記細胞浸透性ペプチドが、前記カルボキシ末端に、プロリンアミノ酸を含む、請求項１記載のコンジュゲート。
  4. 前記細胞浸透性ペプチドが、４から４０個のアミノ酸を含む、請求項１記載のコンジュゲート。
  5. 前記細胞浸透性ペプチドが、６から２０個のアミノ酸を含む、請求項１記載のコンジュゲート。
  6. 前記細胞浸透性ペプチドが、配列番号６０、６９、７０、８９〜１２１、１２５、１３０〜１６０、１６２〜２５７、２７６、２７７、２８１〜２８８、２９３〜２９７、３００、３０２〜４１２、４１９〜５５２および５５４〜５６６から選択される、請求項１記載のコンジュゲート。
  7. 前記細胞浸透性ペプチドが、配列番号１３０、１５７〜１６０、２５１、２５６、３８６〜３８８および５４０から選択される、請求項１記載のコンジュゲート。
  8. 前記細胞浸透性ペプチドが配列番号１５９である、請求項１記載のコンジュゲート。
  9. 前記細胞浸透性ペプチドが、
    Figure 0006884250
    Figure 0006884250
    から選択される式のものであり、式中、
    Ｙが、４から７の整数であり；
    Ｒが、Ｈ、アセチル、ベンゾイルおよびステアロイルから選択される、
    請求項１記載のコンジュゲート。
  10. 前記細胞浸透性ペプチドが、式：
    Figure 0006884250
    のものであり、Ｙが６である、
    請求項９記載のコンジュゲート。
  11. 前記コンジュゲートが、
    Figure 0006884250
    および
    Figure 0006884250
    または前記のいずれかの薬学的に許容され得る塩から選択され、式中、
    Ｘが、６から３８の整数であり；
    Ｒが、Ｈ、アセチル、ベンゾイルおよびステアロイルから選択され；
    Ｒ １ が、Ｈ、アセチル、ベンゾイルおよびステアロイルから選択され；
    Ｒ ２ が、Ｈ、アセチル、ベンゾイル、ステアロイル、トリチルおよび４−メトキシトリチルから選択され；
    各Ｐｉが、一緒になってターゲッティング塩基配列を形成するプリンまたはピリミジン塩基対部分であり；
    該細胞浸透性ペプチドが、配列番号６０、６９、７０、８９〜１２１、１２５、１３０〜１６０、１６２〜２５７、２７６、２７７、２８１〜２８８、２９３〜２９７、３００、３０２〜４１２、４１９〜５５２および５５４〜５６６から選択され；
    Ｘａａが、該カルボキシ末端のグリシンまたはプロリンである、
    請求項１記載のコンジュゲート。
  12. 前記細胞浸透性ペプチドが、配列番号１３０、１５７〜１６０、２５１、２５６、３８６〜３８８および５４０から選択される、請求項１１記載のコンジュゲート。
  13. 前記細胞浸透性ペプチドが配列番号１５９である、請求項１１記載のコンジュゲート。
  14. 各Ｐｉが、アデニン、シトシン、グアニン、ウラシル、チミンおよびイノシンから独立して選択される、請求項１１記載のコンジュゲート。
  15. Figure 0006884250
    Figure 0006884250
    Figure 0006884250
    Figure 0006884250
    Figure 0006884250
    Figure 0006884250
    または前記のいずれかの薬学的に許容され得る塩から選択されるコンジュゲートであって、式中、
    Ｘが、６から３８の整数であり；
    Ｙが、４から９の整数であり；
    Ｚが、６または９であり；
    Ｒが、Ｈ、アセチル、ベンゾイルおよびステアロイルから選択され；
    Ｒ １ が、Ｈ、アセチル、ベンゾイルおよびステアロイルから選択され；
    Ｒ ２ が、Ｈ、アセチル、ベンゾイル、ステアロイル、トリチルおよび４−メトキシトリチルから選択され；
    各Ｐｉが、一緒になってターゲッティング塩基配列を形成するプリンまたはピリミジン塩基対部分である、
    コンジュゲート。
  16. 各Ｐｉが、アデニン、シトシン、グアニン、ウラシル、チミンおよびイノシンから独立して選択される、請求項１５記載のコンジュゲート。
  17. 前記化合物が、
    Figure 0006884250
    またはその薬学的に許容され得る塩である、請求項１５記載のコンジュゲート。
  18. ＲがＨである、請求項１７記載のコンジュゲート。
  19. Ｒがアセチルである、請求項１７記載のコンジュゲート。
  20. 各Ｐｉが、アデニン、シトシン、グアニン、ウラシル、チミンおよびイノシンから独立して選択される、請求項１７記載のコンジュゲート。
  21. 前記コンジュゲートが、式：
    ＥＧ３−Ｍ２３Ｄ−Ｘ（Ｒ） ６
    の化合物であり、式中、
    Ｍ２３Ｄが、配列ＧＧＣＣＡＡＡＣＣＴＣＧＧＣＴＴＡＣＣＴＧＡＡＡＴを有する核酸類似体であり；
    ＥＧ３が、ピペラジンリンカーを介してオリゴマーの５’末端に連結された
    Figure 0006884250
    であり；
    Ｘが、グリシンまたはプロリンであり；
    Ｒが、アルギニンである、
    請求項１記載のコンジュゲート。
  22. 請求項１記載のコンジュゲートと、薬学的に許容され得る媒体とを含む、組成物。
  23. 被験体における疾患を処置するための組成物であって、治療的に有効量の請求項１記載のコンジュゲートを含む、組成物。
  24. 前記疾患が、ウイルス感染、神経筋疾患、細菌感染、炎症または多発性嚢胞腎である、請求項２３記載の組成物。
  25. 前記ウイルス感染が、インフルエンザである、請求項２４記載の組成物。
  26. 前記神経筋疾患が、デュシェンヌ型筋ジストロフィーである、請求項２４記載の組成物。
  27. 細胞内への核酸類似体の輸送を向上するためのインビトロの方法であって、請求項１記載の細胞浸透性ペプチドを、請求項１記載の核酸類似体に共有結合によりコンジュゲートする工程を含み、該細胞内への該核酸類似体の輸送が、非コンジュゲート型の該核酸類似体と比較して向上され、該共有結合付着点が、前記カルボキシ末端のグリシンまたはプロリンに対するアミド結合からなる、方法。
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