ES2928486T3 - Conjugados de oligómeros con omisión de exón para la distrofia muscular - Google Patents

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Abstract

Se describen conjugados de oligómeros antisentido complementarios a un sitio diana seleccionado en el gen de la distrofina humana para inducir la omisión del exón 53. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Conjugados de oligómeros con omisión de exón para la distrofia muscular
Información relacionada
Esta solicitud de patente reivindica el beneficio de la solicitud de patente provisional de EE. UU. con número de serie 62/436,223, presentada el 19 de diciembre de 2016, la solicitud de patente provisional de EE. UU. con número de serie 62/443,484, presentada el 6 de enero de 2017, la solicitud de patente provisional de EE. UU. con número de serie 62/479,178, presentada el 30 de marzo de 2017, y solicitud de patente provisional de EE. UU. con número de serie 62/562,146, presentada el 22 de septiembre de 2017.
Campo de la divulgación
La presente descripción se refiere a nuevos conjugados de oligómeros antisentido adecuados para la omisión del exón 53 en el gen de la distrofina humana y composiciones farmacéuticas de los mismos. La descripción también proporciona conjugados y composiciones para usar en la inducción de la omisión del exón 53, la producción de distrofina en un sujeto que tiene una mutación del gen de la distrofina que es susceptible de omitir el exón 53 y el tratamiento de un sujeto que tiene una mutación del gen de la distrofina que es susceptible a la omisión del exón 53.
Antecedentes de la divulgación
Las tecnologías antisentido se están desarrollando utilizando una variedad de químicas para afectar la expresión génica en una variedad de niveles diferentes (transcripción, empalme, estabilidad, traducción). Gran parte de esa investigación se ha centrado en el uso de compuestos antisentido para corregir o compensar genes anormales o asociados a enfermedades en una amplia gama de indicaciones. Las moléculas antisentido pueden inhibir la expresión génica con especificidad y, debido a esto, muchos esfuerzos de investigación relacionados con los oligómeros como moduladores de la expresión génica se han centrado en inhibir la expresión de genes específicos o la función de elementos que actúan en cis. Los oligómeros antisentido normalmente se dirigen contra el ARN, ya sea la cadena con sentido (por ejemplo, ARNm) o la cadena negativa en el caso de algunos objetivos de ARN viral. Para lograr el efecto deseado de regulación a la baja de un gen específico, los oligómeros generalmente promueven la descomposición del ARNm objetivo, bloquean la traducción del ARNm o bloquean la función de los elementos del ARN que actúan en cis, evitando así de manera efectiva la síntesis de novo de la proteína diana o replicación del ARN viral.
Sin embargo, tales técnicas no son útiles cuando el objeto es regular al alza la producción de la proteína nativa o compensar las mutaciones que inducen la terminación prematura de la traducción, tales como mutaciones sin sentido o de cambio de marco. En estos casos, la transcripción del gen defectuoso no debe someterse a degradación dirigida o inhibición estérica, por lo que la química del oligómero antisentido no debe promover la descomposición del ARNm objetivo ni bloquear la traducción.
En una variedad de enfermedades genéticas, los efectos de las mutaciones en la expresión final de un gen se pueden modular a través de un proceso de omisión de exón durante el proceso de corte y empalme. El proceso de empalme está dirigido por una maquinaria compleja de múltiples componentes que acerca las uniones exón-intrón adyacentes en el pre-ARNm y realiza la escisión de los enlaces fosfodiéster en los extremos de los intrones con su posterior reformación entre los exones que se van a empalmar. Este proceso complejo y altamente preciso está mediado por motivos de secuencia en el pre-ARNm que son segmentos de ARN semiconservados relativamente cortos a los que se unen varios factores de empalme nuclear que luego están involucrados en las reacciones de empalme. Al cambiar la forma en que la maquinaria de empalme lee o reconoce los motivos involucrados en el procesamiento de ARNm previo, es posible crear moléculas de ARNm empalmadas diferencialmente. Ahora se ha reconocido que la mayoría de los genes humanos se empalman alternativamente durante la expresión génica normal, aunque no se han identificado los mecanismos involucrados. Bennet et al. (patente de EE. UU. Núm. 6.210.892) describen la modulación antisentido del procesamiento de ARNm celular de tipo silvestre utilizando análogos de oligómeros antisentido que no inducen la escisión del ARN diana mediada por ARNasa H. Esto encuentra utilidad al ser capaz de generar ARNm empalmados alternativamente que carecen de exones específicos (ver, por ejemplo, como se describe por Sazani, Kole, et al. 2007 para la generación de receptores de la superfamilia de t Nf solubles que carecen de exones que codifican dominios transmembrana).
En los casos en los que una proteína normalmente funcional termina prematuramente debido a mutaciones en ella, se ha demostrado que es posible un medio para restaurar alguna producción de proteína funcional a través de tecnología antisentido mediante la intervención durante los procesos de corte y empalme, y que si los exones asociados con mutaciones que causan enfermedades pueden eliminarse específicamente de algunos genes, a veces se puede producir un producto de proteína acortado que tiene propiedades biológicas similares a la proteína nativa o tiene suficiente actividad biológica para mejorar la enfermedad causada por mutaciones asociadas con el exón (ver, por ejemplo, Sierakowska, Sambade et al. 1996; Wilton, Lloyd et al. 1999; van Deutekom, Bremmer-Bout et al. 2001; Lu, Mann et al. 2003; Aartsma-Rus, Janson et al. 2004). Kole et al. (Números de patentes de EE. UU.: 5.627.274; 5.916.808; 5.976.879; y 5.665.593) divulgan métodos para combatir el corte y empalme aberrante utilizando análogos de oligómeros antisentido modificados que no promueven la descomposición del pre-ARNm objetivo. Bennet et al. (patente de EE. UU. Núm. 6.210.892) describen la modulación antisentido del procesamiento de ARNm celular de tipo silvestre utilizando también análogos de oligómeros antisentido que no inducen la escisión del ARN diana mediada por ARNasa H.
Es probable que el proceso de omisión de exón dirigido sea particularmente útil en genes largos donde hay muchos exones e intrones, donde hay redundancia en la constitución genética de los exones o donde una proteína puede funcionar sin uno o más exones particulares. Los esfuerzos para redirigir el procesamiento de genes para el tratamiento de enfermedades genéticas asociadas con truncamientos causados por mutaciones en varios genes se han centrado en el uso de oligómeros antisentido que ya sea: (1) se superponen total o parcialmente con los elementos involucrados en el proceso de empalme; o (2) se unen al pre-ARNm en una posición suficientemente cercana al elemento para interrumpir la unión y la función de los factores de corte y empalme que normalmente mediarían en una reacción de corte y empalme particular que ocurre en ese elemento.
La distrofia muscular de Duchenne (DMD) es causada por un defecto en la expresión de la proteína distrofina. El gen que codifica la proteína contiene 79 exones distribuidos en más de 2 millones de nucleótidos de ADN. Cualquier mutación exónica que cambie el marco de lectura del exón, o introduzca un codón de parada, o se caracterice por la eliminación de un exón o exones completos fuera del marco, o la duplicación de uno o más exones, tiene el potencial de interrumpir la producción de distrofina funcional, resultando en DMD
Se ha descubierto que una forma menos grave de distrofia muscular, la distrofia muscular de Becker (BMD, por sus siglas en inglés), surge cuando una mutación, generalmente una eliminación de uno o más exones, da como resultado un marco de lectura correcto a lo largo de todo el transcrito de distrofina, de modo que la traducción del ARNm en la proteína no se termina prematuramente. Si la unión de los exones aguas arriba y aguas abajo en el procesamiento de un pre-ARNm de distrofina mutado mantiene el marco de lectura correcto del gen, el resultado es un ARNm que codifica una proteína con una deleción interna corta que retiene algo de actividad, lo que resulta en un fenotipo Becker.
Durante muchos años se ha sabido que las deleciones de un exón o exones que no alteran el marco de lectura de una proteína distrofina darían lugar a un fenotipo de BMD, mientras que una deleción de exón que provoque un cambio de marco dará lugar a DMD (Monaco, Bertelson et al. 1988). En general, las mutaciones de distrofina, incluidas las mutaciones puntuales y las deleciones de exón que cambian el marco de lectura y, por lo tanto, interrumpen la traducción adecuada de la proteína dan como resultado DMD. También se debe tener en cuenta que algunos pacientes con BMD y DMD tienen deleciones de exón que cubren múltiples exones.
La modulación del empalme de pre-ARNm de distrofina mutante con oligorribonucleótidos antisentido se ha informado tanto in vitro e in vivo (ver, por ejemplo, Matsuo, Masumura et al. 1991; Takeshima, Nishio et al. 1995; Pramono, Takeshima et al. 1996; Dunckley, Eperon et al. 1997; Dunckley, Manoharan et al. 1998; Wilton, Lloyd et al. 1999; Mann, Honeyman et al. 2002; Errington, Mann et al. 2003).
Los oligómeros antisentido se han diseñado específicamente para apuntar a regiones específicas del pre-ARNm, generalmente exones para inducir la omisión de una mutación del gen DMD, restaurando así estas mutaciones fuera del marco en el marco para permitir la producción de acortado interno, pero proteína distrofina funcional. Se sabe que tales oligómeros antisentido se dirigen completamente dentro del exón (las denominadas secuencias internas del exón) o en una unión donante de empalme o aceptora de empalme que cruza desde el exón a una porción del intrón.
El descubrimiento y desarrollo de tales oligómeros antisentido para DMD ha sido un área de investigación previa. Estos desarrollos incluyen los de: (1) la Universidad de Australia Occidental y Sarepta Therapeutics (cesionario de esta solicitud): WO 2006/000057; documento WO 2010/048586; WO 2011/057350; WO 2014/100714; WO 2014/153240; WO 2014/153220; (2) Hospital Universitario de Leiden/Prosensa Technologies (ahora BioMarin Pharmaceutical): documento WO 02/24906; documento WO 2004/083432; documento WO 2004/083446; documento WO 2006/112705; documento WO 2007/133105; documento WO 2009/139630; WO 2009/054725; WO 2010/050801; WO 2010/050802; documento WO 2010/123369; WO 2013/112053; documento WO 2014/007620; (3) Centro Médico de Carolina: documento WO 2012/109296; (4) Royal Holloway: patentes y solicitudes que reivindican el beneficio de, e incluyen, los números de serie de EE. UU. 61/096,073 y 61/164,978; como US 8,084,601 y US 2017-0204413 (4) JCR Pharmaceuticals y Matsuo: US 6,653,466; patentes y solicitudes que reclaman el beneficio de, e incluyen, JP 2000-125448, como US 6,653,467; patentes y solicitudes que reivindican el beneficio de, e incluyen, JP 2000-256547, como US 6,727,355; documento WO 2004/048570; (5) Nipón Shinyaku: WO 2012/029986; WO 2013/100190; WO 2015/137409; WO 2015/194520; y (6) Instituto de la Asociación de Miología/Universidad Pierre y Marie Curie/Universitat Bern/Centro Nacional de Investigación Científica/Synthena AG: WO 2010/115993, WO 2013/053928.
El descubrimiento y desarrollo de oligómeros antisentido conjugados con péptidos de penetración celular para la DMD también ha sido un área de investigación (consulte la publicación PCT n.° Wo 2010/048586; Wu, B. et al., The American Journal of Pathology, vol. 181). (2): 392-400, 2012; Wu, R. y col., Nucleic Acids Research, vol. 35 (15): 5182-5191, 2007; Mulders, S. et al., 19° Congreso Internacional de la Sociedad Mundial del Músculo, presentación de póster Berlín, octubre de 2014; Bestas, B. et al., The Journal of Clinical Investigation, doi: 10.1172/JCI76175, 2014; Jearawiriyapaisarn, N. y col., Molecular Therapy, vol. 16(9): 1624-1629, 2008; Jearawiriyapaisarn, N. y col., Cardiovascular Research, vol. 85: 444-453, 2010; Moulton, H. M. et al., Transacciones de la Sociedad Bioquímica, vol. 35 (4): 826-828, 2007; Yin, H. y col., Molecular Therapy, vol. 19 (7): 1295-1303, 2011; Abes, R. et al., J. Pept. Ciencias, Vol. 14: 455-460, 2008; Lebleu, B. y col., Advanced Drug Delivery Reviews, vol. 60: 517-529, 2008; McCIorey, G. y col., Gene Therapy, vol. 13: 1373-1381, 2006; Alter, J. y col., Nature Medicine, vol. 12 (2): 175-177, 2006; y Youngblood, D. et al., American Chemical Society, Bioconjugate Chem., 2007, 18 (1), págs. 50-60).
Los péptidos de penetración celular (CPP, por sus siglas en inglés), por ejemplo, un resto de transporte de péptido rico en arginina, pueden ser efectivos para mejorar la penetración de, por ejemplo, un oligómero antisentido conjugado con el CPP, en una célula.
A pesar de estos esfuerzos, sigue existiendo la necesidad de oligómeros antisentido mejorados que se dirijan al exón 53 y las composiciones farmacéuticas correspondientes que sean potencialmente útiles para los métodos terapéuticos para producir distrofina y tratar la DMD.
Breve descripción de la invención
La presente descripción proporciona conjugados de oligómeros antisentido de fórmula (IV):
Figure imgf000004_0001
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En otro aspecto, la descripción proporciona conjugados de oligómeros antisentido de Fórmula (IVA):
Figure imgf000005_0001
(IVA)
En otro aspecto, la divulgación proporciona composiciones farmacéuticas que incluyen los conjugados de oligómero antisentido de la divulgación y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, el vehículo farmacéuticamente aceptable es una solución salina que incluye un tampón de fosfato.
En otro aspecto, la descripción proporciona conjugados de oligómeros antisentido como los anteriores y composiciones de los mismos para usar en el tratamiento de la distrofia muscular de Duchenne (DMD) en un sujeto que lo necesite, en el que el sujeto tiene una mutación del gen de la distrofina que es susceptible de omitir el exón 53.
En otro aspecto, la descripción proporciona conjugados de oligómeros antisentido como los anteriores y composiciones de los mismos para usar en la restauración de un marco de lectura de ARNm para inducir la producción de distrofina en un sujeto que tiene una mutación del gen de la distrofina que es susceptible de omitir el exón 53. En otro aspecto, la descripción proporciona conjugados de oligómeros antisentido como los anteriores y composiciones de los mismos para usar en la exclusión del exón 53 del pre-ARNm de distrofina durante el procesamiento del ARNm en un sujeto que tiene una mutación del gen de la distrofina que es susceptible de omitir el exón 53. En otro aspecto, la descripción proporciona conjugados de oligómeros antisentido como los anteriores y composiciones de los mismos para usar en la unión del exón 53 del pre-ARNm de distrofina en un sujeto que tiene una mutación del gen de la distrofina que es susceptible de omitir el exón 53.
En otro aspecto, la descripción proporciona un conjugado de oligómero antisentido de la descripción del presente documento para uso en terapia. En otro aspecto, la divulgación también proporciona kits para tratar la distrofia muscular de Duchenne (DMD) en un sujeto que lo necesite, en los que el sujeto tiene una mutación del gen de la distrofina que es susceptible de omitir el exón 53, kits que comprenden al menos un conjugado de oligómero antisentido de la presente divulgación, envasado en un envase adecuado e instrucciones para su uso.
Estos y otros objetos y características se entenderán mejor cuando se lea la siguiente descripción detallada de la descripción junto con las figuras.
Breve descripción de las figuras.
La Figura 1 muestra una sección de pre-ARNm de distrofina normal y ARNm maduro.
La Figura 2 muestra una sección de pre-ARNm de distrofina anormal (ejemplo de DMD) y la distrofina inestable no funcional resultante.
La Figura 3 (que no forma parte de la presente invención) representa eteplirsen, diseñado para omitir el exón 51, restauración de la lectura "en marco" de pre-ARNm.
La Figura 4 proporciona un gráfico de barras del porcentaje de omisión del exón 53 en mioblastos humanos sanos por PMO#1 y PPMO#1 en varias concentraciones 96 horas después del tratamiento, medido por RT-PCR. Las barras de error representan la media ± SD.
Las Figuras 5A-5D (que no forman parte de la presente invención) proporcionan imágenes representativas del análisis de Western Blot que mide la proteína distrofina en los cuádriceps de ratones mdx tratados con PMO (PMO4225) o PPMO (PPMO4225) para diferentes puntos de tiempo [7 días (5A), 30 días (5B), 60 días (5C) y 90 días (5D)].
La Figura 6A (que no forma parte de la presente invención) proporciona un gráfico lineal que representa el porcentaje de distrofina de tipo silvestre inducida por PMO (PMO4225) o PPMO (PPMO4225) en los cuádriceps de ratones mdx durante 90 días después de la inyección, según lo determinado por Análisis Western Blot.
La Figura 6B (que no forma parte de la presente invención) proporciona un gráfico lineal que representa el porcentaje de omisión del exón 23 inducido por PMO (PMO4225) o PPMO (PPMO4225) en los cuádriceps de ratones mdx durante 90 días después de la inyección, según lo determinado por RT- PCR.
Las Figuras 7A-7D (que no forman parte de la presente invención) proporcionan imágenes representativas del análisis Western Blot que mide la proteína distrofina en el diafragma de ratones mdx tratados con p Mo (PMO4225) o PPMO (PPMO4225) para diferentes puntos de tiempo [7 días (7A), 30 días (7B), 60 días (7C) y 90 días (7D)].
La Figura 8A (que no forma parte de la presente invención) proporciona un gráfico de líneas que representa el porcentaje de distrofina de tipo silvestre inducida por PMO (PMO4225) o PpMO (PPMO4225) en el diafragma de ratones mdx durante 90 días después de la inyección, según lo determinado por Análisis Western Blot.
La Figura 8B (que no forma parte de la presente invención) proporciona un gráfico lineal que representa el porcentaje de omisión del exón 23 inducido por PMO (PMO4225) o Pp Mo (PPMO4225) en el diafragma de ratones mdx durante 90 días después de la inyección, según lo determinado por RT- PCR.
Las Figuras 9A-9D (que no forman parte de la presente invención) proporcionan imágenes representativas del análisis de Western Blot que mide la proteína distrofina en el corazón de ratones mdx tratados con PMO (PMO4225) o PPMO (PPMO4225) para diferentes puntos de tiempo [7 días (9A), 30 días (9B), 60 días (9C) y 90 días (9D)].
La Figura 10A (que no forma parte de la presente invención) proporciona un gráfico lineal que representa el porcentaje de distrofina de tipo silvestre inducida por PMO (PMO4225) o PPMO (PPMO4225) en el corazón de ratones mdx durante 90 días después de la inyección, según lo determinado por Análisis Western Blot.
La Figura 10B (que no forma parte de la presente invención) proporciona un gráfico lineal que representa el porcentaje de omisión del exón 23 inducido por PMO (PMO4225) o PPMO (PpMO4225) en el corazón de ratones mdx durante 90 días después de la inyección, según lo determinado por RT- PCR.
La Figura 11 (que no forma parte de la presente invención) proporciona un análisis inmunohistoquímico que muestra distrofina en cuádriceps izquierdo de ratón mdx inducida por PMO (PMO4225) o PPMO (PPMO4225).
Las Figuras 12A-B (que no forman parte de la presente invención) proporcionan imágenes representativas del análisis de Western Blot que mide la proteína distrofina en el corazón de ratones mdx tratados con PMO (PMO4225) o PPMO (PPMO4225) para diferentes dosis: 40 mg/kg, 80 mg/kg y 120 mg/kg.
La Figura 13 (que no forma parte de la presente invención) proporciona un gráfico de barras que representa el porcentaje de distrofina de tipo silvestre inducida por PMO (PMO4225) o PPMO (PPMO4225) en el corazón de ratones mdx según lo determinado por análisis Western Blot 30 días después de la inyección. a diferentes dosis: 40 mg/kg, 80 mg/kg y 120 mg/kg.
Las Figuras 14A-B (que no forman parte de la presente invención) proporcionan imágenes representativas del análisis Western Blot que mide la proteína distrofina en el diafragma de ratones mdx tratados con PMO (PMO4225) o PPMO (PPMO4225) para diferentes dosis de 40 mg/kg, 80 mg/ kg y 120 mg/kg.
La Figura 15 (que no forma parte de la presente invención) proporciona un gráfico de barras que representa el porcentaje de distrofina de tipo silvestre inducida por PMO (PMO4225) o PPMO (PPMO4225) en el diafragma de ratones mdx según lo determinado por análisis Western Blot 30 días después de la inyección. a diferentes dosis: 40 mg/kg, 80 mg/kg y 120 mg/kg.
Las Figuras 16A-B (que no forman parte de la presente invención) proporcionan imágenes representativas del análisis de Western Blot que mide la proteína distrofina en los cuádriceps de ratones mdx tratados con PMO (PMO4225) o PPMO (PPMO4225) en diferentes dosis: 40 mg/kg, 80 mg/kg y 120 mg/kg.
La figura 17 (que no forma parte de la presente invención) proporciona un gráfico de barras que representa el porcentaje de distrofina de tipo silvestre inducida por PMO (PMO4225) o PPMO (PPMO4225) en los cuádriceps de ratones mdx según lo determinado por análisis Western Blot 30 días después de la inyección. a diferentes dosis: 40 mg/kg, 80 mg/kg y 120 mg/kg.
La Figura 18 muestra los ciclos de acoplamiento realizados por el método B de síntesis de PMO.
La Figura 19 (que no forma parte de la presente invención) proporciona análisis inmunohistoquímicos que muestran distrofina y laminina en diafragma y corazón de ratón mdx inducidos por PPMO (PPMO4225) en comparación con solución salina en ratones mdx y ratones de tipo silvestre.
Figura 20 proporciona un gráfico de barras del porcentaje de omisión del exón 53 en miotubos humanos sanos por PMO#1 y PPMO#1 en varias concentraciones 96 horas después del tratamiento, medido por RT-PCR. Las barras de error representan la media ± SD.
Descripción detallada de la divulgación
Las realizaciones de la presente divulgación se refieren generalmente a conjugados de oligómeros antisentido mejorados, y usos de los mismos, que están específicamente diseñados para inducir la omisión de exón en el gen de la distrofina humana. La distrofina juega un papel vital en la función muscular, y varias enfermedades relacionadas con los músculos se caracterizan por formas mutadas de este gen. Por lo tanto, en determinadas realizaciones, los conjugados de oligómeros antisentido mejorados descritos en el presente documento inducen la omisión de exón en formas mutadas del gen de la distrofina humana, como los genes de distrofina mutados que se encuentran en la distrofia muscular de Duchenne (DMD) y la distrofia muscular de Becker (BMD).
Debido a eventos aberrantes de corte y empalme del ARNm causados por mutaciones, estos genes de distrofina humana mutados expresan una proteína distrofina defectuosa o no expresan distrofina medible en absoluto, una condición que conduce a diversas formas de distrofina muscular. Para remediar esta condición, los conjugados de oligómeros antisentido de la presente descripción se hibridan con regiones seleccionadas de un ARNm preprocesado de un gen de distrofina humana mutado, inducen la omisión de exón y el empalme diferencial en ese ARNm de distrofina que de otro modo se empalmaría de manera aberrante y, por lo tanto, permiten que las células musculares producir una transcripción de ARNm que codifica una proteína distrofina funcional. En ciertas realizaciones, la proteína distrofina resultante no es necesariamente la forma de distrofina de tipo silvestre, sino más bien una forma de distrofina truncada, pero funcional.
Al aumentar los niveles de proteína distrofina funcional en las células musculares, estas realizaciones y otras relacionadas son útiles en la profilaxis y el tratamiento de la distrofia muscular, especialmente aquellas formas de distrofia muscular, como DMD y BMD, que se caracterizan por la expresión de proteínas distrofinas defectuosas. debido al empalme aberrante del ARNm. Los conjugados de oligómeros antisentido específicos descritos en el presente documento proporcionan además una orientación específica de distrofina-exón mejorada sobre otros oligómeros y, por lo tanto, ofrecen ventajas significativas y prácticas sobre tratamientos alternativos de formas relevantes de distrofia muscular.
Por lo tanto, la descripción se refiere a conjugados de oligómeros antisentido de fórmula (IV):
Figure imgf000008_0001
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
El sitio de hibridación es H53A (+36+60).
A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en este documento tienen el mismo significado que comúnmente entienden los expertos en la técnica a la que pertenece la divulgación. Aunque cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en este documento puede usarse en la práctica o prueba de la presente divulgación, se describen métodos y materiales preferidos. A los efectos de la presente divulgación, los siguientes términos se definen a continuación.
I. Definiciones
Por "aproximadamente" se entiende una cantidad, nivel, valor, número, frecuencia, porcentaje, dimensión, tamaño, cantidad, peso o longitud que varía tanto como 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1% a una cantidad de referencia, nivel, valor, número, frecuencia, porcentaje, dimensión, tamaño, cantidad, peso o longitud.
"Sensible a la omisión del exón 53" como se usa en el presente documento con respecto a un sujeto o paciente pretende incluir sujetos y pacientes que tienen una o más mutaciones en el gen de la distrofina que, en ausencia de la omisión del exón 53 del pre-ARNm de la distrofina, provoca la que el marco de lectura esté fuera del marco, interrumpiendo así la traducción del pre-ARNm, lo que conduce a una incapacidad del sujeto o paciente para producir distrofina funcional o semifuncional. Los ejemplos de mutaciones en el gen de la distrofina que son susceptibles de omitir el exón 53 incluyen, por ejemplo, la eliminación de: exones 42 a 52, exones 45 a 52, exones 47 a 52, exones 48 a 52, exones 49 a 52, exones 50 a 52, o exón 52. Determinar si un paciente tiene una mutación en el gen de la distrofina que es susceptible de omisión de exón está dentro del alcance de un experto en la técnica (ver, por ejemplo, Aartsma-Rus et al. (2009) Hummutat.
30:293-299; Gurvich y col., Hum Mutat. 2009; 30(4) 633-640; y Fletcher et al. (2010) Terapia Molecular 18(6) 1218-1223.).
El término "oligómero", como se usa en el presente documento, se refiere a una secuencia de subunidades conectadas por enlaces entre subunidades. En ciertos casos, el término "oligómero" se usa en referencia a un "oligómero antisentido". Para los "oligómeros antisentido", cada subunidad consta de: (i) un azúcar de ribosa o un derivado del mismo; y (ii) una base nitrogenada unida al mismo, de modo que el orden de los restos de apareamiento de bases forme una secuencia de bases que sea complementaria a una secuencia diana en un ácido nucleico (típicamente un ARN) por apareamiento de bases de Watson-Crick, para formar un ácido nucleico heterodúplex de ácido:oligómero dentro de la secuencia diana con la condición de que la subunidad, el enlace entre subunidades o ambos no se produzcan de forma natural. El oligómero antisentido es un PMO. En el presente documento se describen realizaciones ejemplares adicionales.
Los términos "complementario" y "complementariedad" se refieren a dos o más oligómeros (es decir, cada uno de los cuales comprende una secuencia de bases nitrogenadas) que están relacionados entre sí mediante reglas de emparejamiento de bases de Watson-Crick. Por ejemplo, la secuencia de bases nitrogenadas "T-G-A (5'^-3')" es complementaria a la secuencia de bases nitrogenadas "A-C-T (3 '^5 ')". La complementariedad puede ser "parcial", en la que menos de todas las bases nitrogenadas de una secuencia de base nitrogenada dada se emparejan con la otra secuencia de base nitrogenada de acuerdo con las reglas de emparejamiento de bases. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la complementariedad entre una secuencia de base nitrogenada dada y la otra secuencia de base nitrogenada puede ser de aproximadamente 70 %, aproximadamente 75 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 % o aproximadamente 95 %. O, puede haber una complementariedad "completa" o "perfecta" (100%) entre una secuencia de base nitrogenada dada y la otra secuencia de base nitrogenada para continuar con el ejemplo. El grado de complementariedad entre las secuencias de bases nitrogenadas tiene efectos significativos sobre la eficacia y la fuerza de la hibridación entre las secuencias.
Los términos "cantidad efectiva" y "cantidad terapéuticamente efectiva" se usan indistintamente en este documento y se refieren a una cantidad de compuesto terapéutico, como un oligómero antisentido, administrado a un mamífero, ya sea como una dosis única o como parte de una serie de dosis., que es eficaz para producir un efecto terapéutico deseado. Para un oligómero antisentido, este efecto normalmente se produce al inhibir la traducción o el procesamiento de corte y empalme natural de una secuencia objetivo seleccionada, o al producir una cantidad clínicamente significativa de distrofina (significación estadística).
En algunas realizaciones, una cantidad eficaz es al menos 10 mg/kg, o al menos 20 mg/kg de una composición que incluye un oligómero antisentido durante un período de tiempo para tratar al sujeto. En algunas realizaciones, una cantidad eficaz es al menos 20 mg/kg de una composición que incluye un oligómero antisentido para aumentar el número de fibras positivas para distrofina en un sujeto al menos en un 20 % de lo normal. En determinadas realizaciones, una cantidad eficaz es 10 mg/kg, o al menos 20 mg/kg de una composición que incluye un oligómero antisentido para estabilizar, mantener o mejorar la distancia recorrida a partir de un déficit del 20 %, por ejemplo, en un 6 MWT, en un paciente, en relación con un compañero sano. En varias realizaciones, una cantidad efectiva es de al menos 10 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, al menos 20 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 25 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg o aproximadamente 30 mg /kg a aproximadamente 50 mg/kg. En algunas realizaciones, una cantidad eficaz es de aproximadamente 10 mg/kg, aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 30 mg/kg o aproximadamente 50 mg/kg. En otro aspecto, una cantidad eficaz es al menos aproximadamente 10 mg/kg, aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 25 mg/kg, aproximadamente 30 mg/kg, o aproximadamente 30 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, durante al menos 24 semanas, al menos 36 semanas, o al menos 48 semanas, para aumentar así el número de fibras positivas para distrofina en un sujeto al menos al 20 %, aproximadamente al 30 %, aproximadamente al 40 %, aproximadamente al 50 %, aproximadamente al 60 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 % de lo normal, y estabilizar o mejorar la distancia recorrida a partir de un déficit del 20 %, por ejemplo en un 6 MWT, en el paciente en relación con un compañero sano. En algunas realizaciones, el tratamiento aumenta el número de fibras positivas para distrofina al 20-60 %, o al 30-50 % de lo normal en el paciente.
Por "mejorar" o "mejorando", o "aumentar" o "aumentando", o "estimular" o "estimulando", se refiere generalmente a la capacidad de uno o más conjugados de oligómeros antisentido o composiciones farmacéuticas para producir o causar una mayor respuesta fisiológica (es decir, efectos aguas abajo) en una célula o un sujeto, en comparación con la respuesta provocada por un conjugado de oligómero no antisentido o un compuesto de control. Una mayor respuesta fisiológica puede incluir una mayor expresión de una forma funcional de una proteína distrofina, o una mayor actividad biológica relacionada con la distrofina en el tejido muscular, entre otras respuestas evidentes a partir de la comprensión de la técnica y la descripción del presente documento. También se puede medir el aumento de la función muscular, incluidos aumentos o mejoras en la función muscular en aproximadamente un 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 100%. También se puede medir el porcentaje de fibras musculares que expresan una distrofina funcional, incluido el aumento de la expresión de distrofina en aproximadamente 1 %, 2 %, 5 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 25 %, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 100% de fibras musculares. Por ejemplo, se ha demostrado que aproximadamente 40% de la mejora de la función muscular puede ocurrir si el 25-30% de las fibras expresan distrofina (ver, por ejemplo, DelloRusso et al, Proc Natl Acad Sci USA 99: 12979­ 12984, 2002). Una cantidad "aumentada" o "mejorada" suele ser una cantidad "estadísticamente significativa" y puede incluir un aumento de 1,1, 1,2, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50 o más veces (por ejemplo, 500, 1000 veces, incluidos todos los números enteros y puntos decimales entre y por encima de 1), por ejemplo, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, etc.) la cantidad producida por el oligómero antisentido conjugado (la ausencia de un agente) o un compuesto de control.
Como se usa en el presente documento, los términos "función" y "funcional" y similares se refieren a una función biológica, enzimática o terapéutica.
Una proteína distrofina "funcional" se refiere generalmente a una proteína distrofina que tiene suficiente actividad biológica para reducir la degradación progresiva del tejido muscular que de otro modo es característica de la distrofia muscular, típicamente en comparación con la forma alterada o "defectuosa" de la proteína distrofina que está presente en ciertos sujetos con DMD o BMD. En determinadas realizaciones, una proteína distrofina funcional puede tener aproximadamente el 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 100 % (incluidos todos los números enteros intermedios) de la actividad biológica in vitro o in vivo de la distrofina de tipo silvestre, medida según las técnicas habituales en la técnica. Como ejemplo, la actividad relacionada con la distrofina en cultivos musculares in vitro se puede medir según el tamaño de los miotubos, la organización (o desorganización) de las miofibrillas, la actividad contráctil y la agrupación espontánea de receptores de acetilcolina (ver, por ejemplo, Brown et al., Journal of Cell Ciencias. 112:209-216, 1999). Los modelos animales también son recursos valiosos para estudiar la patogénesis de la enfermedad y proporcionan un medio para evaluar la actividad relacionada con la distrofina. Dos de los modelos animales más utilizados para la investigación de la DMD son el ratón mdx y el perro golden retriever con distrofia muscular (GRMD, por sus siglas en inglés), ambos con distrofina negativa (ver, por ejemplo, Collins & Morgan, Int J Exp Pathol 84: 165-172, 2003). Estos y otros modelos animales se pueden usar para medir la actividad funcional de varias proteínas de distrofina. Se incluyen formas truncadas de distrofina, tales como aquellas formas que se producen después de la administración de algunos de los conjugados de oligómeros antisentido con omisión de exón de la presente descripción.
Los términos "desajuste" o "desajustes" se refieren a una o más bases nitrogenadas (ya sea contiguas o separadas) en una secuencia de bases nitrogenadas de oligómero que no se emparejan con un pre-ARNm diana de acuerdo con las reglas de emparejamiento de bases. Si bien a menudo se desea una complementariedad perfecta, algunas realizaciones pueden incluir uno o más, pero preferiblemente 6, 5, 4, 3, 2 o 1 desajustes con respecto al pre-ARNm diana. Se incluyen variaciones en cualquier ubicación dentro del oligómero. En ciertas realizaciones, los conjugados de oligómeros antisentido de la descripción incluyen variaciones en la secuencia de bases nitrogenadas cerca de los extremos, variaciones en el interior y, si están presentes, normalmente están dentro de aproximadamente 6, 5, 4, 3, 2 o 1 subunidades de las subunidades 5' y/o terminal 3'.
Los términos "morfolino", "oligómero de morfolino" y "PMO" se refieren a un oligómero de morfolino de fosforodiamidato de la siguiente estructura general:
Figure imgf000010_0001
y como se describe en la Figura 2 de Summerton, J., et al., Antisense & Nucleic Acid Drug Development, 7: 187-195 (1997). Los morfolinos, tal como se describen en el presente documento, incluyen todos los estereoisómeros y tautómeros de la estructura general anterior. La síntesis, las estructuras y las características de unión de los oligómeros de morfolino se detallan en las patentes estadounidenses nos.: 5.698.685; 5.217.866; 5.142.047; 5.034.506; 5.166.315; 5.521.063; 5.506.337; 8.076.476; y 8.299.206.
El morfolino de la presente invención se conjuga en el extremo 5' del oligómero con un resto de "cola" para aumentar su estabilidad y/o solubilidad. El resto de cola es
Figure imgf000011_0001
El resto de la cola anterior también se denomina "TEG" o "EG3".
Como se usa en el presente documento, los términos "-G-R6" y "-G-R6-Ac" se usan indistintamente y se refieren a un resto peptídico conjugado con un oligómero antisentido de la divulgación. En varias realizaciones, "G" representa un residuo de glicina conjugado con "R6" por un enlace amida, y cada "R" representa un residuo de arginina conjugado entre sí por enlaces amida de manera que "R6" significa seis (6) residuos de arginina conjugados unidas por enlaces amida. Los residuos de arginina son residuos de L-arginina. "-G-R6" o "-G-R6-Ac" se conjuga con el nitrógeno del anillo de morfolina de la subunidad 3' más morfolino de un oligómero antisentido de PMO de la divulgación. "-G-R6" o "-G-R6-Ac" se conjuga con el extremo 3' de un oligómero antisentido de la divulgación y tiene la siguiente fórmula:
Figure imgf000011_0002
Los términos "base nitrogenada" (Nu), "resto de apareamiento de bases" o "base" se usan indistintamente para referirse a una base de purina o pirimidina que se encuentra en el ADN o ARN natural o "nativo" (por ejemplo, uracilo, timina, adenina, citosina y guanina).
Las frases "administración parenteral" y "administrado por vía parenteral", tal como se utilizan en el presente documento, significan modos de administración distintos de la administración enteral y tópica, generalmente por inyección, e incluyen, entre otros, intravenoso, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbitario, intracardíaco, intradérmico, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal e inyección e infusión intraesternal.
Para mayor claridad, las estructuras de la descripción que incluyen, por ejemplo, la fórmula (IV), son continuas desde 5' hasta 3' y, para la conveniencia de representar la estructura completa en una forma compacta, varias ilustraciones se rompen con la etiqueta "CORTE A". Se han incluido "CORTE B" y "CORTE C". Como entenderá el experto en la materia, por ejemplo, cada indicación de "CORTE A" muestra una continuación de la ilustración de la estructura en estos puntos. El experto en la materia entiende que lo mismo es cierto para cada instancia de "CORTE B" y para "CORTE C" en las estructuras anteriores. Ninguno de los cortes de la ilustración, sin embargo, pretende indicar, ni el experto en la materia los entendería como una interrupción real de la estructura anterior.
Como se usa aquí, un conjunto de corchetes usados dentro de una fórmula estructural indica que la característica estructural entre los corchetes se repite. En algunas realizaciones, los corchetes usados pueden ser "[" y "]", y en ciertas realizaciones, los corchetes usados para indicar características estructurales repetidas pueden ser "(" y ")". En algunas realizaciones, el número de iteraciones repetidas de la característica estructural entre paréntesis es el número indicado fuera de los paréntesis, como 2, 3, 4, 5, 6, 7, etc. En diversas realizaciones, el número de iteraciones repetidas de la característica estructural entre los paréntesis se indica mediante una variable indicada fuera de los paréntesis como "Z".
Como se usa aquí, un enlace recto o un enlace ondulado dibujado a un átomo de fósforo o carbono quiral dentro de una fórmula estructural indica que la estereoquímica del fósforo o carbono quiral no está definida y pretende incluir todas las formas del centro quiral. A continuación, se muestran ejemplos de tales ilustraciones.
Figure imgf000012_0001
La frase "farmacéuticamente aceptable" significa que la sustancia o composición debe ser compatible, química y/o toxicológicamente, con los otros ingredientes que componen una formulación y/o el sujeto que se trata con ellos.
La frase "vehículo farmacéuticamente aceptable", como se usa en el presente documento, significa un relleno, diluyente, material de encapsulación o auxiliar de formulación de cualquier tipo, sólido, semisólido o líquido, inerte y no tóxico. Algunos ejemplos de materiales que pueden servir como vehículos farmacéuticamente aceptables son: azúcares tales como lactosa, glucosa y sacarosa; almidones tales como almidón de maíz y almidón de patata; celulosa y sus derivados tales como carboximetilcelulosa sódica, etilcelulosa y acetato de celulosa; tragacanto en polvo; malta; gelatina; talco; excipientes tales como manteca de cacao y ceras para supositorios; aceites tales como aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodón, aceite de cártamo, aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de soja; glicoles tales como propilenglicol; ésteres tales como oleato de etilo y laurato de etilo; agar; agentes tamponantes tales como hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio; ácido algínico; agua libre de pirógenos; solución salina isotónica; solución de Ringer; alcohol etílico; soluciones tampón de fosfato; lubricantes compatibles no tóxicos tales como laurilsulfato de sodio y estearato de magnesio; agentes colorantes; agentes de liberación; agentes de revestimiento; agentes edulcorantes; agentes aromatizantes; agentes perfumantes; conservantes; y antioxidantes; según el juicio del formulador.
El término "restauración" con respecto a la síntesis o producción de distrofina se refiere generalmente a la producción de una proteína distrofina que incluye formas truncadas de distrofina en un paciente con distrofina muscular después del tratamiento con un conjugado de oligómero antisentido descrito en este documento. En algunas realizaciones, el tratamiento da como resultado un aumento en la producción de nueva distrofina en un paciente en un 1 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, o 100% (incluidos todos los enteros intermedios). En algunas realizaciones, el tratamiento aumenta el número de fibras positivas para distrofina hasta al menos un 20 %, un 30 %, un 40 %, un 50 %, un 60 %, un 70 %, un 80 %, un 90 % o 95% a 100% de lo normal en el sujeto. En otras realizaciones, el tratamiento aumenta el número de fibras positivas para distrofina de aproximadamente el 20 % a aproximadamente el 60 %, o de aproximadamente el 30 % a aproximadamente el 50 %, de lo normal en el sujeto. El porcentaje de fibras positivas para distrofina en un paciente después del tratamiento puede determinarse mediante una biopsia muscular utilizando técnicas conocidas. Por ejemplo, se puede tomar una biopsia muscular de un músculo adecuado, tal como el músculo bíceps braquial de un paciente.
El análisis del porcentaje de fibras de distrofina positivas se puede realizar antes del tratamiento y/o después del tratamiento o en puntos de tiempo a lo largo del curso del tratamiento. En algunas realizaciones, se toma una biopsia posterior al tratamiento del músculo contralateral de la biopsia previa al tratamiento. El análisis de la expresión de distrofina antes y después del tratamiento se puede realizar utilizando cualquier ensayo adecuado para la distrofina. En algunas realizaciones, la detección inmunohistoquímica se realiza en secciones de tejido de la biopsia muscular utilizando un anticuerpo que es un marcador de distrofina, como un anticuerpo monoclonal o policlonal. Por ejemplo, se puede usar el anticuerpo MANDYS106, que es un marcador muy sensible para la distrofina. Puede usarse cualquier anticuerpo secundario adecuado.
En algunas realizaciones, el porcentaje de fibras positivas para distrofina se calcula dividiendo el número de fibras positivas por el total de fibras contadas. Las muestras de músculo normal tienen un 100 % de fibras positivas para distrofina. Por lo tanto, el porcentaje de fibras positivas para distrofina se puede expresar como un porcentaje de lo normal. Para controlar la presencia de trazas de distrofina en el músculo antes del tratamiento, así como fibras revertidas, se puede establecer una línea de base utilizando secciones de músculos antes del tratamiento de un paciente al contar las fibras positivas para distrofina en los músculos después del tratamiento. Esto se puede usar como un umbral para contar las fibras positivas para distrofina en las secciones del músculo posterior al tratamiento en ese paciente. En otras realizaciones, las secciones de tejido teñidas con anticuerpos también se pueden usar para la cuantificación de distrofina usando el software de análisis de imágenes Bioquant (Bioquant Image Analysis Corporation, Nashville, TN). La intensidad total de la señal de fluorescencia de la distrofina se puede informar como un porcentaje de lo normal. Además, el análisis de transferencia Western con anticuerpos monoclonales o policlonales anti-distrofina se puede utilizar para determinar el porcentaje de fibras positivas para distrofina. Por ejemplo, puede usarse el anticuerpo antidistrofina NCL-Dys1 de Leica Biosystems. El porcentaje de fibras positivas para distrofina también puede analizarse determinando la expresión de los componentes del complejo sarcoglicano (p,Y) y/o NOS neuronal.
En algunas realizaciones, el tratamiento con un conjugado de oligómero antisentido de la divulgación ralentiza o reduce la disfunción y/o falla progresiva de los músculos respiratorios en pacientes con DMD que se esperaría sin tratamiento. En algunas realizaciones, el tratamiento con un conjugado de oligómero antisentido de la divulgación puede reducir o eliminar la necesidad de asistencia de ventilación que se esperaría sin tratamiento. En algunas realizaciones, las mediciones de la función respiratoria para seguir el curso de la enfermedad, así como la evaluación de posibles intervenciones terapéuticas incluyen la presión inspiratoria máxima (MIP, por sus siglas en inglés), la presión espiratoria máxima (MEP, por sus siglas en inglés) y la capacidad vital forzada (FVC, por sus siglas en inglés). m Ip y MEP miden el nivel de presión que una persona puede generar durante la inhalación y la exhalación, respectivamente, y son medidas sensibles de la fuerza de los músculos respiratorios. MIP es una medida de la debilidad del músculo del diafragma.
En algunas realizaciones, MEP puede disminuir antes de cambios en otras pruebas de función pulmonar, incluidas MIP y FVC. En ciertas realizaciones, MEP puede ser un indicador temprano de disfunción respiratoria. En ciertas realizaciones, la FVC se puede usar para medir el volumen total de aire expulsado durante la exhalación forzada después de la inspiración máxima. En pacientes con DMD, la FVC aumenta concomitantemente con el crecimiento físico hasta los primeros años de la adolescencia. Sin embargo, a medida que el crecimiento se ralentiza o se atrofia por la progresión de la enfermedad y la debilidad muscular progresa, la capacidad vital entra en una fase descendente y disminuye a una tasa promedio de aproximadamente 8 a 8,5 por ciento por año después de los 10 a 12 años de edad. En ciertas realizaciones, el porcentaje de MIP previsto (MIP ajustado por peso), el porcentaje de MEP previsto (MEP ajustado por edad) y el porcentaje de FVC previsto (FVC ajustado por edad y altura) son análisis de apoyo.
Los términos "sujeto" y "paciente", tal como se usan en el presente documento, incluyen cualquier animal que presente un síntoma, o esté en riesgo de presentar un síntoma, que pueda tratarse con un conjugado de oligómero antisentido de la descripción, como un sujeto (o paciente) que tiene o está en riesgo de tener DMD o BMD, o cualquiera de los síntomas asociados con estas condiciones (por ejemplo, pérdida de fibra muscular). Los sujetos (o pacientes) adecuados incluyen animales de laboratorio (tales como ratones, ratas, conejos o cobayas), animales de granja y animales domésticos o mascotas (tales como gatos o perros). Se incluyen primates no humanos y, preferiblemente, pacientes (o sujetos) humanos. También se incluyen métodos para producir distrofina en un sujeto (o paciente) que tiene una mutación del gen de la distrofina que es susceptible de omitir el exón 51.
Las frases "administración sistémica", "administrado sistémicamente", "administración periférica" y "administrado periféricamente", tal como se usan en este documento, significan la administración de un compuesto, fármaco u otro material que no sea directamente en el sistema nervioso central, de modo que ingrese el sistema del paciente y, por lo tanto, está sujeto al metabolismo y otros procesos similares, por ejemplo, la administración subcutánea.
La fase "secuencia objetivo" se refiere a una secuencia de bases nitrogenadas de un oligómero que es complementaria a una secuencia de nucleótidos en un pre-ARNm objetivo. En algunas realizaciones de la divulgación, la secuencia de nucleótidos en el pre-ARNm diana es un sitio de hibridación del exón 53 en el pre-ARNm de distrofina designado como H53A (+36+60).
"Tratamiento" de un sujeto (por ejemplo, un mamífero, tal como un ser humano) o una célula es cualquier tipo de intervención utilizada en un intento de alterar el curso natural del sujeto o la célula. El tratamiento incluye, pero no se limita a, la administración de un oligómero o una composición farmacéutica del mismo, y puede realizarse profilácticamente o después del inicio de un evento patológico o contacto con un agente etiológico. El tratamiento incluye cualquier efecto deseable sobre los síntomas o patología de una enfermedad o condición asociada con la proteína distrofina, como en ciertas formas de distrofia muscular, y puede incluir, por ejemplo, cambios mínimos o mejoras en uno o más marcadores medibles de la enfermedad o condición que se está tratando. También se incluyen tratamientos "profilácticos", que pueden estar dirigidos a reducir la tasa de progresión de la enfermedad o afección que se está tratando, retrasar la aparición de esa enfermedad o afección, o reducir la gravedad de su aparición. "Tratamiento" o "profilaxis" no necesariamente indica la erradicación, cura o prevención completa de la enfermedad o afección, o los síntomas asociados de la misma.
En algunas realizaciones, el tratamiento con un conjugado de oligómero antisentido de la descripción aumenta la producción de distrofina nueva, retrasa la progresión de la enfermedad, ralentiza o reduce la pérdida de la deambulación, reduce la inflamación muscular, reduce el daño muscular, mejora la función muscular, reduce la pérdida de la función pulmonar y/ o mejora la regeneración muscular que se esperaría sin tratamiento. En algunas realizaciones, el tratamiento mantiene, retrasa o enlentece la progresión de la enfermedad. En algunas realizaciones, el tratamiento mantiene la deambulación o reduce la pérdida de la deambulación. En algunas realizaciones, el tratamiento mantiene la función pulmonar o reduce la pérdida de función pulmonar. En algunas realizaciones, el tratamiento mantiene o aumenta una distancia de caminata estable en un paciente, medida, por ejemplo, mediante la prueba de caminata de 6 minutos (6MWT, por sus siglas en inglés). En algunas realizaciones, el tratamiento mantiene o reduce el tiempo para caminar/correr 10 metros (es decir, la prueba de caminar/correr 10 metros). En algunas realizaciones, el tratamiento mantiene o reduce el tiempo para ponerse de pie desde la posición supina (es decir, tiempo para resistir la prueba). En algunas realizaciones, el tratamiento mantiene o reduce el tiempo para subir cuatro escaleras estándar (es decir, la prueba de subida de cuatro escalones). En algunas realizaciones, el tratamiento mantiene o reduce la inflamación muscular en el paciente, medida por, por ejemplo, resonancia magnética (por ejemplo, resonancia magnética de los músculos de la pierna). En algunas realizaciones, la MRI mide T2 y/o la fracción de grasa para identificar la degeneración muscular. La resonancia magnética puede identificar cambios en la estructura y composición muscular causados por inflamación, edema, daño muscular e infiltración de grasa.
En algunas realizaciones, el tratamiento con un conjugado de oligómero antisentido de la descripción aumenta la producción de distrofina nueva y ralentiza o reduce la pérdida de la deambulación que se esperaría sin tratamiento. Por ejemplo, el tratamiento puede estabilizar, mantener, mejorar o aumentar la capacidad para caminar (por ejemplo, estabilización de la deambulación) en el sujeto. En algunas realizaciones, el tratamiento mantiene o aumenta una distancia de caminata estable en un paciente, medida, por ejemplo, mediante la prueba de caminata de 6 minutos (6MWT), descrita por McDonald, et al. (Muscle Nerve, 2010; 42:966-74). Un cambio en la distancia de caminata de 6 minutos (6MWD) se puede expresar como un valor absoluto, un cambio porcentual o un cambio en el valor % previsto. En algunas realizaciones, el tratamiento mantiene o mejora una distancia recorrida estable en un 6MWT a partir de un déficit del 20 % en el sujeto en relación con un compañero sano. El rendimiento de un paciente con DMD en la 6MWT en relación con el rendimiento típico de un compañero sano se puede determinar calculando un valor de % previsto. Por ejemplo, el % previsto de 6MWD se puede calcular usando la siguiente ecuación para hombres: 196,72 (39,81 x edad) -(1,36 x edad2) (132,28 x altura en metros). Para las mujeres, el 6MWD % previsto se puede calcular mediante la siguiente ecuación: 188,61 (51,50 x edad) -(1,86 x edad2) (86,10 x altura en metros) (Henricson et al. PLoS Curr., 2012, versión 2). En algunas realizaciones, el tratamiento con un oligómero antisentido aumenta la distancia de caminata estable en el paciente desde la línea de base a más de 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30 o 50 metros (incluyendo todos enteros intermedios).
La pérdida de la función muscular en pacientes con DMD puede ocurrir en el contexto del crecimiento y desarrollo infantil normal. De hecho, los niños más pequeños con DMD pueden mostrar un aumento en la distancia recorrida durante el 6MWT en el transcurso de aproximadamente 1 año a pesar del deterioro muscular progresivo. En algunas realizaciones, el 6MWD de pacientes con DMD se compara con sujetos de control de desarrollo típico y con datos normativos existentes de sujetos emparejados por edad y sexo. En algunas realizaciones, el crecimiento y el desarrollo normales pueden tenerse en cuenta utilizando una ecuación basada en la edad y la altura ajustada a los datos normativos. Tal ecuación se puede usar para convertir 6MWD a un valor porcentual previsto (% previsto) en sujetos con DMD. En ciertas realizaciones, el análisis de los datos de % de 6MWD previsto representa un método para tener en cuenta el crecimiento y el desarrollo normales, y puede mostrar que las ganancias en la función a edades tempranas (por ejemplo, menos o igual a 7 años) representan habilidades estables en lugar de mejorar en pacientes con DMD (Henricson et al. PLoS Curr., 2012, versión 2).
Se propuso y publicó un sistema de nomenclatura de moléculas antisentido para distinguir entre las diferentes moléculas antisentido (véase Mann et al., (2002) J Gen Med 4, 644-654). Esta nomenclatura se volvió especialmente relevante cuando se probaron varias moléculas antisentido ligeramente diferentes, todas dirigidas a la misma región objetivo, como se muestra a continuación:
H#A/D(x:y).
La primera letra designa la especie (por ejemplo, H: humana, M: murina, C: canina). "#" designa el número de exón de distrofina diana. "A/D" indica un sitio de empalme aceptor o donante al principio y al final del exón, respectivamente. (x y) representa las coordenadas de hibridación donde "-" o "+" indican secuencias intrónicas o exónicas respectivamente. Por ejemplo, A(-6+18) indicaría las últimas 6 bases del intrón que preceden al exón objetivo y las primeras 18 bases del exón objetivo. El sitio de empalme más cercano sería el aceptador, por lo que estas coordenadas irían precedidas de una "A".
La descripción de las coordenadas de hibridación en el sitio de empalme donante podría ser D(+2-18) donde las últimas 2 bases exónicas y las primeras 18 bases intrónicas corresponden al sitio de hibridación de la molécula antisentido. Coordenadas de hibridación completamente exónicas que estarían representadas por A(+65+85), que es el sitio entre el nucleótido 65 y 85 desde el inicio de ese exón.
II. Oligómeros antisentido
A. Conjugados de oligómero antisentido diseñados para inducir la omisión del exón 53
Los conjugados de oligómero antisentido de la descripción son de fórmula (IV) y son complementarios a una región diana del exón 53 del gen de la distrofina e inducen la omisión del exón 53. En particular, la descripción se refiere a conjugados de oligómeros antisentido complementarios a una región diana del exón 53 del pre-ARNm de distrofina designado como sitio de hibridación. El sitio de hibridación es H53A (+36+60).
Los conjugados de oligómeros antisentido del pre-ARNm de distrofina objetivo de la divulgación inducen la omisión del exón 53, por lo que se excluye o se omite del transcrito de ARNm maduro y empalmado. Al omitir el exón 53, el marco de lectura interrumpido se restaura a una mutación en el marco. Si bien la DMD se compone de varios subtipos genéticos, los conjugados de oligómeros antisentido de la divulgación se diseñaron específicamente para omitir el exón 53 del pre-ARNm de distrofina. Las mutaciones de DMD susceptibles de omitir el exón 53 comprenden un subgrupo de pacientes con DMD (8%).
B. Características químicas de los oligómeros
Oligómeros de morfolino
El conjugado de oligómero antisentido de la presente invención tiene la fórmula (IV):
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o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En algunas realizaciones, un conjugado de oligómero antisentido de fórmula (IV) es una sal de HCl (ácido clorhídrico) del mismo. En ciertas realizaciones, la sal de HCl es una sal de .6HCl.
En algunas realizaciones, que incluyen, por ejemplo, realizaciones de conjugados de oligómeros antisentido de fórmula (IV), un conjugado de oligómeros antisentido de la descripción es según la fórmula (IVA):
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(IVA).
Sales farmacéuticamente aceptables de conjugados de oligómero antisentido
Ciertas realizaciones de conjugados de oligómeros antisentido descritos en el presente documento pueden contener un grupo funcional básico, como amino o alquilamino, y, por lo tanto, son capaces de formar sales farmacéuticamente aceptables con ácidos farmacéuticamente aceptables. El término "sales farmacéuticamente aceptables" a este respecto, se refiere a las sales de adición de ácidos inorgánicos y orgánicos, relativamente no tóxicas, de conjugados de oligómeros antisentido de la presente descripción. Estas sales se pueden preparar in situ en el vehículo de administración o en el proceso de fabricación de la forma de dosificación, o haciendo reaccionar por separado un conjugado de oligómero antisentido purificado de la divulgación en su forma de base libre con un ácido orgánico o inorgánico adecuado, y aislando la sal así formada durante purificación posterior. Las sales representativas incluyen bromhidrato, clorhidrato, sulfato, bisulfato, fosfato, nitrato, acetato, valerato, oleato, palmitato, estearato, laurato, benzoato, lactato, tosilato, citrato, maleato, fumarato, succinato, tartrato, naftilato, mesilato, sales de glucoheptonato, lactobionato y laurilsulfonato. (Ver, por ejemplo, Berge et al. (1977) "Sales Farmacéuticas", J. Pharm. ciencia 66: 1-19).
Las sales farmacéuticamente aceptables de los conjugados de oligómeros antisentido en cuestión incluyen las sales no tóxicas convencionales o las sales de amonio cuaternario de los conjugados de oligómeros antisentido, por ejemplo, de ácidos orgánicos o inorgánicos no tóxicos. Por ejemplo, dichas sales no tóxicas convencionales incluyen las derivadas de ácidos inorgánicos tales como clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, sulfámico, fosfórico y nítrico; y las sales preparadas a partir de ácidos orgánicos tales como acético, propiónico, succínico, glicólico, esteárico, láctico, málico, tartárico, cítrico, ascórbico, palmítico, maleico, hidroximaleico, fenilacético, glutámico, benzoico, salicílico, sulfanílico, 2-acetoxibenzoico , fumárico, toluenosulfónico, metanosulfónico, etano disulfónico, oxálico e isotiónico.
En ciertas realizaciones, los conjugados de oligómeros antisentido de la presente divulgación pueden contener uno o más grupos funcionales ácidos y, por lo tanto, son capaces de formar sales farmacéuticamente aceptables con bases farmacéuticamente aceptables. El término "sales farmacéuticamente aceptables" en estos casos se refiere a las sales de adición de bases orgánicas e inorgánicas relativamente no tóxicas de conjugados de oligómeros antisentido de la presente divulgación. Estas sales también se pueden preparar in situ en el vehículo de administración o en el proceso de fabricación de la forma de dosificación, o haciendo reaccionar por separado el conjugado de oligómero antisentido purificado en su forma de ácido libre con una base adecuada, como el hidróxido, carbonato o bicarbonato de un producto farmacéutico. -catión metálico aceptable, con amoníaco, o con una amina primaria, secundaria o terciaria orgánica farmacéuticamente aceptable. Las sales alcalinas o alcalinotérreas representativas incluyen las sales de litio, sodio, potasio, calcio, magnesio y aluminio. Las aminas orgánicas representativas útiles para la formación de sales de adición de bases incluyen etilamina, dietilamina, etilendiamina, etanolamina, dietanolamina y piperazina. (Ver, por ejemplo, Berge et al., supra).
III. Formulaciones y modos de administración
En ciertas realizaciones, la presente descripción proporciona formulaciones o composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración terapéutica de conjugados de oligómeros antisentido, como se describe en el presente documento. Por lo tanto, en ciertas realizaciones, la presente descripción proporciona composiciones farmacéuticamente aceptables que comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de uno o más de los conjugados de oligómeros antisentido descritos en este documento, formulados junto con uno o más vehículos (aditivos) y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables. Si bien es posible que un conjugado de oligómero antisentido de la presente descripción se administre solo, es preferible administrar el conjugado de oligómero antisentido como una formulación farmacéutica (composición). El conjugado de oligómero antisentido de la formulación está de acuerdo con la Fórmula (IV) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Los métodos para el suministro de moléculas de ácido nucleico, que pueden ser aplicables a los conjugados de oligómeros antisentido de la presente descripción, se describen, por ejemplo, en: Akhtar y col., 1992, Trends Cell Bio., 2:139; Estrategias de administración para la terapéutica de oligonucleótidos antisentido, ed. Akhtar, 1995, CRC Press; y Sullivan y col., PCT WO 94/02595. Estos y otros protocolos se pueden utilizar para la administración de prácticamente cualquier molécula de ácido nucleico, incluidos los conjugados de oligómeros antisentido de la presente divulgación.
Las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación pueden formularse especialmente para su administración en forma sólida o líquida, incluidas aquellas adaptadas para lo siguiente: (1) administración oral, por ejemplo, empapados (soluciones o suspensiones acuosas o no acuosas), tabletas (dirigidas a la absorción bucal, sublingual o sistémica), bolos, polvos, gránulos, pastas para aplicación en la lengua; (2) administración parenteral, por ejemplo, mediante inyección subcutánea, intramuscular, intravenosa o epidural como, por ejemplo, una solución o suspensión estéril, o una formulación de liberación sostenida; (3) aplicación tópica, por ejemplo, como crema, ungüento o parche o spray de liberación controlada aplicado a la piel; (4) por vía intravaginal o intrarrectal, por ejemplo, como un pesario, crema o espuma; (5) sublingualmente; (6) ocularmente; (7) por vía transdérmica; o (8) nasalmente.
Algunos ejemplos de materiales que pueden servir como vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen, entre otros: (1) azúcares, como lactosa, glucosa y sacarosa; (2) almidones, tales como almidón de maíz y almidón de patata; (3) celulosa y sus derivados, tales como carboximetilcelulosa sódica, etilcelulosa y acetato de celulosa; (4) polvo de tragacanto; (5) malta; (6) gelatina; (7) talco; (8) excipientes, como manteca de cacao y ceras para supositorios; (9) aceites, como aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodón, aceite de cártamo, aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de soja; (10) glicoles, como propilenglicol; (11) polioles, tales como glicerina, sorbitol, manitol y polietilenglicol; (12) ésteres, tales como oleato de etilo y laurato de etilo; (13) agar; (14) agentes amortiguadores, tales como hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio; (15) ácido algínico; (16) agua libre de pirógenos; (17) solución salina isotónica; (18) solución de Ringer; (19) alcohol etílico; (20) soluciones tamponadas de pH; (21) poliésteres, policarbonatos y/o polianhídridos; y (22) otras sustancias compatibles no tóxicas empleadas en formulaciones farmacéuticas.
Los ejemplos no limitantes adicionales de agentes adecuados para la formulación con los conjugados de oligómeros antisentido de la presente descripción incluyen: ácidos nucleicos conjugados con PEG; ácidos nucleicos conjugados con fosfolípidos; ácidos nucleicos que contienen restos lipófilos; fosforotioatos; inhibidores de la glicoproteína P (como Pluronic P85) que pueden mejorar la entrada de fármacos en diversos tejidos; polímeros biodegradables, tales como microesferas de poli(D,L-lactidecoglicólido) para liberación sostenida después de la implantación (Emerich, D F et al., 1999, Cell Transplant, 8, 47-58) Alkermes, Inc. Cambridge, Mass.; y nanopartículas cargadas, como las hechas de polibutilcianoacrilato, que pueden administrar fármacos a través de la barrera hematoencefálica y pueden alterar los mecanismos de captación neuronal (Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry, 23, 941-949, 1999).
La descripción también presenta el uso de la composición que comprende liposomas modificados en la superficie que contienen lípidos de poli(etilenglicol) ("PEG") (modificados con PEG, ramificados y no ramificados o combinaciones de los mismos, o liposomas de circulación prolongada o liposomas sigilosos). Estas formulaciones ofrecen un método para aumentar la acumulación de fármacos en los tejidos diana. Esta clase de transportadores de fármacos resiste la opsonización y la eliminación por parte del sistema fagocítico mononuclear (MPS o RES), lo que permite tiempos de circulación sanguínea más prolongados y una mayor exposición de los tejidos para el fármaco encapsulado (Lasic et al. química Rev. 1995, 95, 2601-2627; Ishiwata y col., Chem. Pharm. Bull. 1995, 43, 1005-1011). Se ha demostrado que dichos liposomas se acumulan selectivamente en tumores, presumiblemente por extravasación y captura en los tejidos diana neovascularizados (Lasic et al., Science 1995, 267, 1275-1276; Oku et al., 1995, Biochim. Biophys. Acta, 1238, 86­ 90). Los liposomas de circulación prolongada mejoran la farmacocinética y la farmacodinámica del ADN y el ARN, particularmente en comparación con los liposomas catiónicos convencionales que se sabe que se acumulan en los tejidos de la MPS (Liu et al., J. Biol. química 1995, 42, 24864-24870; Choi et al., Publicación internacional PCT Núm. WO 96/10391; Ansell et al., Publicación internacional PCT Núm. WO 96/10390; Holland et al., Publicación internacional PCT Núm. WO 96/10392). También es probable que los liposomas de circulación prolongada protejan a los fármacos de la degradación por nucleasas en mayor medida que los liposomas catiónicos, en función de su capacidad para evitar la acumulación en tejidos MPS metabólicamente agresivos, como el hígado y el bazo.
En una realización adicional, la presente descripción incluye composiciones farmacéuticas de conjugados de oligómero antisentido preparadas para la administración como se describe en las patentes de EE.UU. Nos.: 6.692.911; 7.163.695; y 7.070.807. A este respecto, en una realización, la presente divulgación proporciona un conjugado de oligómero antisentido de la presente divulgación en una composición que comprende copolímeros de lisina e histidina (HK) (como se describe en las patentes de EE.UU. Nos.: 7.163.695; 7.070.807; y 6.692.911) ya sea solo o en combinación con PEG (por ejemplo, PEG ramificado o no ramificado o una mezcla de ambos), en combinación con PEG y un resto de direccionamiento, o cualquiera de los anteriores en combinación con un agente de reticulación. En ciertas realizaciones, la presente descripción proporciona conjugados de oligómeros antisentido en composiciones farmacéuticas que comprenden polihistidina modificada con ácido glucónico o polihistidina/transferrina-polilisina gluconilada. Un experto en la técnica también reconocerá que los aminoácidos con propiedades similares a His y Lys pueden sustituirse dentro de la composición.
Agentes humectantes, emulsionantes y lubricantes (tales como laurilsulfato de sodio y estearato de magnesio), agentes colorantes, agentes de liberación, agentes de recubrimiento, agentes edulcorantes, agentes aromatizantes, agentes perfumantes, conservantes y antioxidantes también pueden estar presentes en las composiciones.
Los ejemplos de antioxidantes farmacéuticamente aceptables incluyen: (1) antioxidantes solubles en agua, como ácido ascórbico, clorhidrato de cisteína, bisulfato de sodio, metabisulfito de sodio y sulfito de sodio; (2) antioxidantes solubles en aceite, como palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, galato de propilo y alfa-tocoferol; y (3) agentes quelantes de metales, tales como ácido cítrico, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico y ácido fosfórico.
Las formulaciones de la presente descripción incluyen las adecuadas para administración oral, nasal, tópica (incluyendo bucal y sublingual), rectal, vaginal y/o parenteral. Las formulaciones se pueden presentar convenientemente en forma de dosificación unitaria y se pueden preparar mediante cualquier método bien conocido en la técnica farmacéutica. La cantidad de ingrediente activo que se puede combinar con un material portador para producir una única forma de dosificación variará dependiendo del sujeto que se esté tratando y del modo particular de administración. La cantidad de ingrediente activo que puede combinarse con un material vehículo para producir una única forma de dosificación será generalmente la cantidad de ingrediente activo que produce un efecto terapéutico. En general, esta cantidad oscilará entre aproximadamente el 0,1 por ciento y aproximadamente el noventa y nueve por ciento del ingrediente activo, preferiblemente entre aproximadamente el 5 por ciento y aproximadamente el 70 por ciento, más preferiblemente entre aproximadamente el 10 por ciento y aproximadamente el 30 por ciento.
En ciertas realizaciones, una formulación de la presente divulgación comprende un excipiente seleccionado de ciclodextrinas, celulosas, liposomas, agentes formadores de micelas, por ejemplo, ácidos biliares y vehículos poliméricos, por ejemplo, poliésteres y polianhídridos; y un conjugado de oligómero antisentido de la presente descripción. El conjugado de oligómero antisentido de la formulación está de acuerdo con la Fórmula (IV) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. En ciertas realizaciones, una formulación antes mencionada vuelve biodisponible por vía oral un conjugado de oligómero antisentido de la presente descripción.
Los métodos para preparar estas formulaciones o composiciones farmacéuticas incluyen el paso de asociar un conjugado de oligómero antisentido de la presente divulgación con el vehículo y, opcionalmente, uno o más ingredientes accesorios. En general, las formulaciones se preparan asociando uniforme e íntimamente un conjugado de oligómero antisentido de la presente descripción con vehículos líquidos, o vehículos sólidos finamente divididos, o ambos, y luego, si es necesario, moldeando el producto.
Las formulaciones de la descripción adecuadas para la administración oral pueden estar en forma de cápsulas, sellos, píldoras, tabletas, pastillas para chupar (utilizando una base aromatizada, generalmente sacarosa y acacia o tragacanto), polvos, gránulos o como una solución o suspensión en un líquido acuoso o no acuoso, o como una emulsión líquida de aceite en agua o agua en aceite, o como un elixir o jarabe, o como pastillas (utilizando una base inerte, como gelatina y glicerina, o sacarosa y acacia ) y/o como enjuagues bucales, cada uno de los cuales contiene una cantidad predeterminada de un conjugado de oligómero antisentido de la presente divulgación como ingrediente activo. Un conjugado de oligómero antisentido de la presente divulgación también se puede administrar como bolo, electuario o pasta.
En formas de dosificación sólidas de la divulgación para administración oral (cápsulas, tabletas, píldoras, grageas, polvos, gránulos, pastillas), el ingrediente activo puede mezclarse con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables, como citrato de sodio o fosfato dicálcico, y/o cualquiera de los siguientes: (1) rellenos o extensores, como almidones, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol y/o ácido silícico; (2) aglutinantes, tales como, por ejemplo, carboximetilcelulosa, alginatos, gelatina, polivinilpirrolidona, sacarosa y/o goma arábiga; (3) humectantes, como glicerol; (4) agentes disgregantes, tales como agar-agar, carbonato de calcio, almidón de patata o tapioca, ácido algínico, ciertos silicatos y carbonato de sodio; (5) agentes retardantes de la solución, como parafina; (6) aceleradores de absorción, como compuestos de amonio cuaternario y tensioactivos, como poloxámero y laurilsulfato de sodio; (7) agentes humectantes, tales como, por ejemplo, alcohol cetílico, monoestearato de glicerol y tensioactivos no iónicos; (8) absorbentes, como caolín y arcilla de bentonita; (9) lubricantes, tales como talco, estearato de calcio, estearato de magnesio, polietilenglicoles sólidos, laurilsulfato de sodio, estearato de zinc, estearato de sodio, ácido esteárico y mezclas de los mismos; (10) agentes colorantes; y (11) agentes de liberación controlada como crospovidona o etilcelulosa. En el caso de cápsulas, tabletas y píldoras, las composiciones farmacéuticas también pueden comprender agentes tamponantes. También pueden emplearse composiciones farmacéuticas sólidas de un tipo similar como cargas en cápsulas de gelatina blandas y de cubierta dura utilizando excipientes tales como lactosa o azúcares de leche, así como polietilenglicoles de alto peso molecular.
Una tableta se puede hacer por compresión o moldeo, opcionalmente con uno o más ingredientes accesorios. Las tabletas comprimidas se pueden preparar utilizando un aglutinante (por ejemplo, gelatina o hidroxipropilmetilcelulosa), lubricante, diluyente inerte, conservante, desintegrante (por ejemplo, glicolato de almidón sódico o carboximetilcelulosa sódica reticulada), tensoactivo o agente dispersante. Los comprimidos moldeados pueden fabricarse moldeando en una máquina adecuada una mezcla del compuesto en polvo humedecido con un diluyente líquido inerte.
Las tabletas y otras formas de dosificación sólidas de las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación, como grageas, cápsulas, píldoras y gránulos, pueden opcionalmente ser ranuradas o preparadas con recubrimientos y cubiertas, como recubrimientos entéricos y otros recubrimientos bien conocidos en la industria de la formulación farmacéutica. También se pueden formular para proporcionar una liberación lenta o controlada del ingrediente activo utilizando, por ejemplo, hidroxipropilmetilcelulosa en proporciones variables para proporcionar el perfil de liberación deseado, otras matrices poliméricas, liposomas y/o microesferas. Pueden formularse para una liberación rápida, por ejemplo, liofilizados. Pueden esterilizarse, por ejemplo, mediante filtración a través de un filtro que retiene bacterias, o incorporando agentes esterilizantes en forma de composiciones farmacéuticas sólidas estériles que pueden disolverse en agua estéril, o algún otro medio inyectable estéril inmediatamente antes de su uso. Estas composiciones farmacéuticas también pueden contener opcionalmente agentes opacificantes y pueden ser de una composición que liberen el o los ingredientes activos solo, o preferentemente, en una determinada porción del tracto gastrointestinal, opcionalmente, de manera retardada. Los ejemplos de composiciones de inclusión que se pueden usar incluyen sustancias poliméricas y ceras. El principio activo también puede estar en forma microencapsulada, si procede, con uno o varios de los excipientes descritos anteriormente.
Las formas de dosificación líquidas para la administración oral de los conjugados de oligómeros antisentido de la descripción incluyen emulsiones, microemulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes y elixires farmacéuticamente aceptables. Además del ingrediente activo, las formas de dosificación líquidas pueden contener diluyentes inertes comúnmente utilizados en la técnica, como, por ejemplo, agua u otros solventes, agentes solubilizantes y emulsionantes, como alcohol etílico, alcohol isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo. , alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, aceites (en particular, aceites de semilla de algodón, cacahuete, maíz, germen, oliva, ricino y sésamo), glicerol, alcohol tetrahidrofurílico, polietilenglicoles y ésteres de ácidos grasos de sorbitán y mezclas de los mismos.
Además de los diluyentes inertes, las composiciones farmacéuticas orales también pueden incluir adyuvantes tales como agentes humectantes, agentes emulsionantes y de suspensión, agentes edulcorantes, aromatizantes, colorantes, perfumantes y conservantes.
Las suspensiones, además de los compuestos activos, pueden contener agentes de suspensión como, por ejemplo, alcoholes isoestearílicos etoxilados, polioxietilen sorbitol y ésteres de sorbitán, celulosa microcristalina, metahidróxido de aluminio, bentonita, agar-agar y tragacanto, y mezclas de los mismos.
Las formulaciones para administración rectal o vaginal pueden presentarse como un supositorio, que puede prepararse mezclando uno o más compuestos de la descripción con uno o más excipientes o vehículos no irritantes adecuados que comprenden, por ejemplo, manteca de cacao, polietilenglicol, un supositorio cera o un salicilato, y que es sólido a temperatura ambiente, pero líquido a temperatura corporal y, por lo tanto, se derretirá en el recto o en la cavidad vaginal y liberará el compuesto activo.
Las formulaciones o formas de dosificación para la administración tópica o transdérmica de un oligómero como se proporciona aquí incluyen polvos, aerosoles, ungüentos, pastas, cremas, lociones, geles, soluciones, parches e inhalantes. Los conjugados de oligómeros activos se pueden mezclar en condiciones estériles con un vehículo farmacéuticamente aceptable y con cualquier conservante, tampón o propulsor que pueda ser necesario. Los ungüentos, pastas, cremas y geles pueden contener, además de un compuesto activo de esta divulgación, excipientes, tales como grasas animales y vegetales, aceites, ceras, parafinas, almidón, tragacanto, derivados de celulosa, polietilenglicoles, siliconas, bentonitas, ácido silícico, talco y óxido de zinc, o mezclas de los mismos.
Los polvos y aerosoles pueden contener, además de un conjugado de oligómero antisentido de la presente divulgación, excipientes tales como lactosa, talco, ácido silícico, hidróxido de aluminio, silicatos de calcio y poliamida en polvo, o mezclas de estas sustancias. Los aerosoles pueden contener además propulsores habituales, como clorofluorohidrocarburos e hidrocarburos volátiles no sustituidos, como butano y propano.
Los parches transdérmicos tienen la ventaja añadida de proporcionar una administración controlada de un conjugado de oligómero antisentido de la presente divulgación al cuerpo. Dichas formas de dosificación pueden prepararse disolviendo o dispersando el oligómero en el medio apropiado. También se pueden usar potenciadores de la absorción para aumentar el flujo del agente a través de la piel. La velocidad de dicho flujo se puede controlar proporcionando una membrana de control de la velocidad o dispersando el agente en una matriz polimérica o gel, entre otros métodos conocidos en la técnica.
Las composiciones farmacéuticas adecuadas para administración parenteral pueden comprender uno o más conjugados de oligómeros de la divulgación en combinación con una o más soluciones, dispersiones, suspensiones o emulsiones acuosas o no acuosas isotónicas estériles farmacéuticamente aceptables, o polvos estériles que pueden reconstituirse en soluciones o dispersiones inyectables estériles justo antes de su uso, que pueden contener azúcares, alcoholes, antioxidantes, tampones, bacteriostáticos, solutos que hacen que la formulación sea isotónica con la sangre del receptor previsto o agentes de suspensión o espesantes. Los ejemplos de vehículos acuosos y no acuosos adecuados que pueden emplearse en las composiciones farmacéuticas de la divulgación incluyen agua, etanol, polioles (como glicerol, propilenglicol y polietilenglicol) y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales, como aceite de oliva aceite y ésteres orgánicos inyectables, como el oleato de etilo. La fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de materiales de revestimiento, como la lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de las dispersiones y mediante el uso de tensioactivos. El conjugado de oligómero antisentido de la composición farmacéutica está de acuerdo con la Fórmula (IV) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Estas composiciones farmacéuticas también pueden contener adyuvantes tales como conservantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes y agentes dispersantes. La prevención de la acción de los microorganismos sobre los conjugados de oligómero en cuestión se puede asegurar mediante la inclusión de diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabeno, clorobutanol y ácido fenol sórbico. También puede ser deseable incluir agentes isotónicos, tales como azúcares y cloruro de sodio en las composiciones. Además, la absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable puede lograrse mediante la inclusión de agentes que retrasen la absorción, como el monoestearato de aluminio y la gelatina.
En algunos casos, para prolongar el efecto de un fármaco, es deseable retardar la absorción del fármaco por inyección subcutánea o intramuscular. Esto se puede lograr mediante el uso de una suspensión líquida de material cristalino o amorfo que tiene poca solubilidad en agua, entre otros métodos conocidos en la técnica. La velocidad de absorción del fármaco depende entonces de su velocidad de disolución que, a su vez, puede depender del tamaño y la forma del cristal. Alternativamente, la absorción retardada de una forma de fármaco administrada por vía parenteral se consigue disolviendo o suspendiendo el fármaco en un vehículo oleoso.
Las formas de depósito inyectables pueden fabricarse formando matrices de microcápsulas de los conjugados de oligómero en cuestión en polímeros biodegradables tales como poliláctido-poliglicólido. Dependiendo de la proporción de oligómero a polímero y de la naturaleza del polímero particular empleado, se puede controlar la velocidad de liberación del oligómero. Los ejemplos de otros polímeros biodegradables incluyen poli(ortoésteres) y poli(anhídridos). Las formulaciones inyectables de depósito también se pueden preparar atrapando el fármaco en liposomas o microemulsiones que sean compatibles con los tejidos corporales.
Cuando los conjugados de oligómeros antisentido de la presente descripción se administran como productos farmacéuticos a seres humanos y animales, se pueden administrar per se o como una composición farmacéutica que contiene, por ejemplo, del 0,1 al 99 % (más preferiblemente, del 10 al 30 %) de los conjugado de oligómero antisentido en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Las formulaciones o preparaciones de la presente divulgación pueden administrarse por vía oral, parenteral, tópica o rectal. Por lo general, se administran en formas adecuadas para cada vía de administración. Por ejemplo, se administran en forma de tabletas o cápsulas, por inyección, inhalación, loción ocular, ungüento, supositorio o infusión; tópicamente por loción o ungüento; o rectalmente por supositorios.
Independientemente de la vía de administración seleccionada, los conjugados de oligómeros antisentido de la presente divulgación, que pueden usarse en una forma hidratada adecuada, y/o las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación, pueden formularse en formas de dosificación farmacéuticamente aceptables mediante métodos convencionales. conocido por los expertos en la técnica. Los niveles de dosificación reales de los ingredientes activos en las composiciones farmacéuticas de esta divulgación pueden variar para obtener una cantidad del ingrediente activo que sea eficaz para lograr la respuesta terapéutica deseada para un paciente, composición y modo de administración en particular, sin ser inaceptablemente tóxico para el paciente.
El nivel de dosificación seleccionado dependerá de una variedad de factores que incluyen la actividad del conjugado de oligómero antisentido particular de la presente descripción empleado, o el éster, sal o amida del mismo, la vía de administración, el tiempo de administración, la tasa de excreción o metabolismo del oligómero particular que se está empleando, la tasa y el grado de absorción, la duración del tratamiento, otros medicamentos, compuestos y/o materiales utilizados en combinación con el oligómero específico empleado, la edad, el sexo, el peso, la condición, la salud general y historial médico previo del paciente que está siendo tratado, y factores similares bien conocidos en las técnicas médicas.
Un médico o veterinario que tenga una experiencia normal en la técnica puede determinar y prescribir fácilmente la cantidad eficaz de la composición farmacéutica requerida. Por ejemplo, el médico o veterinario podría comenzar las dosis de los conjugados de oligómeros antisentido de la descripción empleados en la composición farmacéutica a niveles más bajos que los requeridos para lograr el efecto terapéutico deseado y aumentar gradualmente la dosis hasta lograr el efecto deseado. En general, una dosis diaria adecuada de un conjugado de oligómero antisentido de la divulgación será la cantidad del conjugado de oligómero antisentido que sea la dosis más baja efectiva para producir un efecto terapéutico. Dicha dosis efectiva dependerá generalmente de los factores descritos en este documento. Generalmente, las dosis orales, intravenosas, intracerebroventriculares y subcutáneas de los conjugados de oligómero antisentido de esta descripción para un paciente, cuando se usan para los efectos indicados, oscilarán entre aproximadamente 0,0001 y aproximadamente 100 mg por kilogramo de peso corporal por día.
En algunas realizaciones, los conjugados de oligómero antisentido de la presente divulgación se administran en dosis generalmente de aproximadamente 10-160 mg/kg o 20-160 mg/kg. En algunos casos, pueden ser necesarias dosis superiores a 160 mg/kg. En algunas realizaciones, las dosis para administración i.v. son de aproximadamente 0,5 mg a 160 mg/kg. En algunas realizaciones, los conjugados de oligómero antisentido se administran a dosis de aproximadamente 0,5 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 6 mg/kg, 7 mg/kg, 8 mg/kg, 9 mg/kg o 10 mg/kg. En algunas realizaciones, los conjugados de oligómero antisentido se administran a dosis de aproximadamente 10 mg/kg, 11 mg/kg, 12 mg/kg, 15 mg/kg, 18 mg/kg, 20 mg/kg, 21 mg/kg, 25 mg/kg, 26 mg/kg, 27 mg/kg, 28 mg/kg, 29 mg/kg, 30 mg/kg, 31 mg/kg, 32 mg/kg, 33 mg/kg, 34 mg/kg, 35 mg/kg, 36 mg/kg, 37 mg/kg, 38 mg/kg, 39 mg/kg, 40 mg/kg, 41 mg/kg, 42 mg/kg, 43 mg/kg, 44 mg/kg, 45 mg/kg, 46 mg/kg, 47 mg/kg, 48 mg/kg, 49 mg/kg 50 mg/kg, 51 mg/kg, 52 mg/kg, 53 mg/kg, 54 mg/kg, 55 mg /kg, 56 mg/kg, 57 mg/kg, 58 mg/kg, 59 mg/kg, 60 mg/kg, 65 mg/kg, 70 mg/kg, 75 mg/kg, 80 mg/kg, 85 mg /kg, 90 mg/kg, 95 mg/kg, 100 mg/kg, 105 mg/kg, 110 mg/kg, 115 mg/kg, 120 mg/kg, 125 mg/kg, 130 mg/kg, 135 mg /kg, 140 mg/kg, 145 mg/kg, 150 mg/kg, 155 mg/kg, 160 mg/kg, incluidos todos los números intermedios. En algunas realizaciones, el oligómero se administra a 10 mg/kg. En algunas realizaciones, el oligómero se administra a 20 mg/kg. En algunas realizaciones, el oligómero se administra a 30 mg/kg. En algunas realizaciones, el oligómero se administra a 40 mg/kg. En algunas realizaciones, el oligómero se administra a 60 mg/kg. En algunas realizaciones, el oligómero se administra a 80 mg/kg. En algunas realizaciones, el oligómero se administra a 160 mg/kg. En algunas realizaciones, el oligómero se administra a 50 mg/kg.
En algunas realizaciones, el conjugado de oligómero antisentido de Fórmula (IV) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo se administra en dosis generalmente de aproximadamente 10-160 mg/kg o 20-160 mg/kg. En algunas realizaciones, las dosis del conjugado de oligómero antisentido de Fórmula (IV) o una de sus sales farmacéuticamente aceptables para administración i.v. son de aproximadamente 0,5 mg a 160 mg/kg. En algunas realizaciones, el conjugado de oligómero antisentido de fórmula (IV) o una de sus sales farmacéuticamente aceptables se administra en dosis de aproximadamente 0,5 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 6 mg/kg, 7 mg/kg, 8 mg/kg, 9 mg/kg o 10 mg/kg. En algunas realizaciones, el conjugado de oligómero antisentido de Fórmula (IV) o una de sus sales farmacéuticamente aceptables se administra en dosis de aproximadamente 10 mg/kg, 11 mg/kg, 12 mg/kg, 15 mg/kg, 18 mg/kg, 20 mg/kg, 21 mg/kg, 25 mg/kg, 26 mg/kg, 27 mg/kg, 28 mg/kg, 29 mg/kg, 30 mg/kg, 31 mg/kg, 32 mg/kg, 33 mg/kg, 34 mg/kg, 35 mg/kg, 36 mg/kg, 37 mg/kg, 38 mg/kg, 39 mg/kg, 40 mg/kg, 41 mg/kg, 42 mg/kg, 43 mg/kg, 44 mg/kg, 45 mg/kg, 46 mg/kg, 47 mg/kg, 48 mg/kg, 49 mg/kg 50 mg/kg, 51 mg/kg, 52 mg/kg, 53 mg/kg, 54 mg/kg, 55 mg/kg, 56 mg/kg, 57 mg/kg, 58 mg/kg, 59 mg/kg, 60 mg/kg, 65 mg/kg, 70 mg/kg, 75 mg/kg, 80 mg/kg, 85 mg/kg, 90 mg/kg, 95 mg/kg, 100 mg/kg, 105 mg/kg, 110 mg/kg, 115 mg/kg, 120 mg/kg, 125 mg/kg, 130 mg/kg, 135 mg/kg, 140 mg/kg, 145 mg/kg, 150 mg/kg, 155 mg/kg, 160 mg/kg, incluidos todos los enteros intermedios. En algunas realizaciones, el conjugado de oligómero antisentido de Fórmula (IV) o una de sus sales farmacéuticamente aceptables se administra a 10 mg/kg. En algunas realizaciones, el conjugado de oligómero antisentido de Fórmula (IV) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo se administra a 20 mg/kg. En algunas realizaciones, el conjugado de oligómero antisentido de Fórmula (IV) o una de sus sales farmacéuticamente aceptables se administra a 30 mg/kg. En algunas realizaciones, el conjugado de oligómero antisentido de Fórmula (IV) o una de sus sales farmacéuticamente aceptables se administra a 40 mg/kg. En algunas realizaciones, el conjugado de oligómero antisentido de Fórmula (IV) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo se administra a 60 mg/kg. En algunas realizaciones, el conjugado de oligómero antisentido de Fórmula (IV) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo se administra a 80 mg/kg. En algunas realizaciones, el conjugado de oligómero antisentido de Fórmula (IV) o una de sus sales farmacéuticamente aceptables se administra a 160 mg/kg. En algunas realizaciones, el conjugado de oligómero antisentido de Fórmula (IV) o una de sus sales farmacéuticamente aceptables se administra a 50 mg/kg.
Si se desea, la dosis diaria eficaz del compuesto activo se puede administrar como dos, tres, cuatro, cinco, seis o más subdosis administradas por separado a intervalos apropiados a lo largo del día, opcionalmente, en formas de dosificación unitaria. En determinadas situaciones, la dosificación es de una administración al día. En ciertas realizaciones, la dosificación es una o más administraciones cada 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 días, o cada 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 semanas, o cada 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 meses, según sea necesario, para mantener el nivel deseado expresión de una proteína distrofina funcional. En ciertas realizaciones, la dosificación es una o más administraciones una vez cada dos semanas. En algunas realizaciones, la dosificación es una administración una vez cada dos semanas. En varias realizaciones, la dosificación es una o más administraciones cada mes. En ciertas realizaciones, la dosificación es una administración cada mes.
En diversas realizaciones, los conjugados de oligómero antisentido se administran semanalmente a 10 mg/kg. En varias realizaciones, los conjugados de oligómero antisentido se administran semanalmente a 20 mg/kg. En diversas realizaciones, los conjugados de oligómero antisentido se administran semanalmente a 30 mg/kg. En diversas realizaciones, los conjugados de oligómero antisentido se administran semanalmente a 40 mg/kg. En algunas realizaciones, los conjugados de oligómero antisentido se administran semanalmente a 60 mg/kg. En algunas realizaciones, los conjugados de oligómero antisentido se administran semanalmente a 80 mg/kg. En algunas realizaciones, los conjugados de oligómero antisentido se administran semanalmente a 100 mg/kg. En algunas realizaciones, los conjugados de oligómero antisentido se administran semanalmente a 160 mg/kg. Como se usa aquí, se entiende que semanalmente tiene el significado aceptado en la técnica de cada semana.
En varias realizaciones, los conjugados de oligómero antisentido se administran cada dos semanas a 10 mg/kg. En diversas realizaciones, los conjugados de oligómero antisentido se administran cada dos semanas a 20 mg/kg. En diversas realizaciones, los conjugados de oligómero antisentido se administran cada dos semanas a 30 mg/kg. En diversas realizaciones, los conjugados de oligómero antisentido se administran cada dos semanas a 40 mg/kg. En algunas realizaciones, los conjugados de oligómero antisentido se administran cada dos semanas a 60 mg/kg. En algunas realizaciones, los conjugados de oligómero antisentido se administran cada dos semanas a 80 mg/kg. En algunas realizaciones, los conjugados de oligómero antisentido se administran cada dos semanas a 100 mg/kg. En algunas realizaciones, los conjugados de oligómero antisentido se administran cada dos semanas a 160 mg/kg. Tal como se usa en el presente documento, se entiende que cada dos semanas tiene el significado aceptado en la técnica de cada dos semanas.
En varias realizaciones, los conjugados de oligómero antisentido se administran cada tres semanas a 10 mg/kg. En diversas realizaciones, los conjugados de oligómero antisentido se administran cada tres semanas a 20 mg/kg. En diversas realizaciones, los conjugados de oligómero antisentido se administran cada tres semanas a 30 mg/kg. En diversas realizaciones, los conjugados de oligómero antisentido se administran cada tres semanas a 40 mg/kg. En algunas realizaciones, los conjugados de oligómero antisentido se administran cada tres semanas a 60 mg/kg. En algunas realizaciones, los conjugados de oligómero antisentido se administran cada tres semanas a 80 mg/kg. En algunas realizaciones, los conjugados de oligómero antisentido se administran cada tres semanas a 100 mg/kg. En algunas realizaciones, los conjugados de oligómero antisentido se administran cada tres semanas a 160 mg/kg. Como se usa aquí, se entiende que cada tercera semana tiene el significado aceptado en la técnica de una vez cada tres semanas.
En diversas realizaciones, los conjugados de oligómero antisentido se administran mensualmente a 10 mg/kg. En varias realizaciones, los conjugados de oligómero antisentido se administran mensualmente a 20 mg/kg. En varias realizaciones, los conjugados de oligómero antisentido se administran mensualmente a 30 mg/kg. En varias realizaciones, los conjugados de oligómero antisentido se administran mensualmente a 40 mg/kg. En algunas realizaciones, los conjugados de oligómero antisentido se administran mensualmente a 60 mg/kg. En algunas realizaciones, los conjugados de oligómero antisentido se administran mensualmente a 80 mg/kg. En algunas realizaciones, los conjugados de oligómero antisentido se administran mensualmente a 100 mg/kg. En algunas realizaciones, los conjugados de oligómero antisentido se administran mensualmente a 160 mg/kg. Tal como se usa en el presente documento, mensual se entiende que tiene el significado aceptado en la técnica de cada mes.
Como se entendería en la técnica, las administraciones semanales, quincenales, cada tres semanas o mensuales pueden ser en una o más administraciones o subdosis como se describe en el presente documento.
Las moléculas de ácido nucleico y los conjugados de oligómeros antisentido descritos en el presente documento se pueden administrar a las células mediante una variedad de métodos conocidos por los expertos en la técnica, que incluyen, entre otros, la encapsulación en liposomas, la iontoforesis o la incorporación en otros vehículos, como hidrogeles, ciclodextrinas, nanocápsulas biodegradables y microesferas bioadhesivas, como se describe en el presente documento y se conoce en la técnica. En ciertas realizaciones, la tecnología de microemulsificación se puede utilizar para mejorar la biodisponibilidad de los agentes farmacéuticos lipofílicos (insolubles en agua). Los ejemplos incluyen Trimetrine (Dordunoo, S. K., et al., Drug Development and Industrial Pharmacy, 17(12), 1685-1713, 1991) y REV 5901 (Sheen, P. C., et al., J Pharm Sci 80(7), 712 -714, 1991). Entre otros beneficios, la microemulsificación proporciona una mayor biodisponibilidad al dirigir preferentemente la absorción al sistema linfático en lugar del sistema circulatorio, que de este modo evita el hígado y evita la destrucción de los compuestos en la circulación hepatobiliar.
En un aspecto de la divulgación, las formulaciones contienen micelas formadas a partir de un oligómero como se proporciona en el presente documento y al menos un vehículo anfifílico, en el que las micelas tienen un diámetro medio de menos de aproximadamente 100 nm. Realizaciones más preferidas proporcionan micelas que tienen un diámetro medio inferior a unos 50 nm, e incluso realizaciones más preferidas proporcionan micelas que tienen un diámetro medio inferior a unos 30 nm, o incluso menos de unos 20 nm.
Si bien se contemplan todos los vehículos anfifílicos adecuados, los vehículos actualmente preferidos son generalmente aquellos que tienen el estado Generalmente Reconocido como Seguro (GRAS, por sus siglas en inglés), y que pueden tanto solubilizar un conjugado de oligómero antisentido de la presente divulgación como microemulsionarlo en una etapa posterior cuando la solución entra en contacto con una fase acuosa compleja (como la que se encuentra en el tracto gastrointestinal humano). Por lo general, los ingredientes anfifílicos que satisfacen estos requisitos tienen valores HLB (equilibrio hidrofílico a lipofílico, por sus siglas en inglés) de 2 a 20, y sus estructuras contienen radicales alifáticos de cadena lineal en el rango de C-6 a C-20. Los ejemplos son glicéridos grasos polietilenglicolizados y polietilenglicoles.
Los ejemplos de vehículos anfifílicos incluyen glicéridos de ácidos grasos polietilenglicolizados saturados y monoinsaturados, tales como los obtenidos a partir de diversos aceites vegetales total o parcialmente hidrogenados. Dichos aceites pueden consistir ventajosamente en tri-, di- y mono-glicéridos de ácidos grasos y di- y monopoli(etilenglicol) ésteres de los ácidos grasos correspondientes, con una composición de ácidos grasos particularmente preferida que incluye ácido cáprico 4-10%, ácido cáprico 3-9%, ácido láurico 40-50%, ácido mirístico 14-24%, ácido palmítico 4-14% y ácido esteárico 5-15%. Otra clase útil de vehículos anfifílicos incluye sorbitán y/o sorbitol parcialmente esterificado, con ácidos grasos saturados o monoinsaturados (serie SPAN) o análogos etoxilados correspondientes (serie TWEEN).
Los vehículos anfifílicos disponibles en el mercado pueden ser especialmente útiles, incluidos los de la serie Gelucire, Labrafil, Labrasol o Lauroglicol (todos fabricados y distribuidos por Gattefosse Corporation, Saint Priest, Francia), monooleato de PEG, dioleato de PEG, monolaurato y dilaurato de PEG, lecitina, polisorbato 80, etc. (producidos y distribuidos por varias empresas en EE. UU. y en todo el mundo).
En ciertas realizaciones, la entrega puede ocurrir mediante el uso de liposomas, nanocápsulas, micropartículas, microesferas, partículas lipídicas y vesículas, para la introducción de las composiciones farmacéuticas de la presente descripción en células huésped adecuadas. En particular, las composiciones farmacéuticas de la presente descripción pueden formularse para su administración encapsuladas en una partícula lipídica, un liposoma, una vesícula, una nanoesfera, una nanopartícula o similar. La formulación y el uso de dichos vehículos de administración se pueden llevar a cabo utilizando técnicas conocidas y convencionales.
Los polímeros hidrofílicos adecuados para usar en la presente divulgación son aquellos que son fácilmente solubles en agua, pueden unirse covalentemente a un lípido formador de vesículas y que se toleran in vivo sin efectos tóxicos (es decir, son biocompatibles). Los polímeros adecuados incluyen poli(etilenglicol) (PEG), poliláctico (también denominado poliláctido), ácido poliglicólico (también denominado poliglicólido), un copolímero de ácido poliláctico-poliglicólico y alcohol polivinílico. En ciertas realizaciones, los polímeros tienen un peso molecular promedio en peso de aproximadamente 100 ó 120 daltons hasta aproximadamente 5000 ó 10000 daltons, o de aproximadamente 300 daltons a aproximadamente 5000 daltons. En otras realizaciones, el polímero es poli(etilenglicol) que tiene un peso molecular promedio en peso de aproximadamente 100 a aproximadamente 5000 daltons, o que tiene un peso molecular promedio en peso de aproximadamente 300 a aproximadamente 5000 daltons. En determinadas realizaciones, el polímero es un poli(etilenglicol) que tiene un peso molecular promedio en peso de aproximadamente 750 daltons, por ejemplo, PEG(750). Los polímeros también se pueden definir por el número de monómeros que contienen; una realización preferida de la presente descripción utiliza polímeros de al menos aproximadamente tres monómeros, tales polímeros de PEG que consisten en tres monómeros tienen un peso molecular de aproximadamente 132 daltons.
Otros polímeros hidrofílicos que pueden ser adecuados para usar en la presente descripción incluyen polivinilpirrolidona, polimetoxazolina, polietiloxazolina, polihidroxipropilmetacrilamida, polimetacrilamida, polidimetilacrilamida y celulosas derivatizadas tales como hidroximetilcelulosa o hidroxietilcelulosa.
En ciertas realizaciones, una formulación de la presente divulgación comprende un polímero biocompatible seleccionado del grupo que consiste en poliamidas, policarbonatos, polialquilenos, polímeros de ésteres acrílicos y metacrílicos, polímeros de polivinilo, poliglicólidos, polisiloxanos, poliuretanos y copolímeros de los mismos, celulosas, polipropileno , polietilenos, poliestireno, polímeros de ácido láctico y ácido glicólico, polianhídridos, poli(orto)ésteres, poli(ácido bútico), poli(ácido valérico), poli(lactida-cocaprolactona), polisacáridos, proteínas, ácidos polihialurónicos, policianoacrilatos y combinaciones, mezclas o copolímeros de los mismos.
Las ciclodextrinas son oligosacáridos cíclicos que constan de 6, 7 u 8 unidades de glucosa, designadas por la letra griega a, p o y, respectivamente. Las unidades de glucosa están unidas por enlaces a-1,4-glucosídicos. Como consecuencia de la conformación de silla de las unidades de azúcar, todos los grupos hidroxilo secundarios (en C-2, C-3) están ubicados en un lado del anillo, mientras que todos los grupos hidroxilo primarios en C-6 están ubicados en el otro lado. lado. Como resultado, las caras externas son hidrófilas, lo que hace que las ciclodextrinas sean solubles en agua. Por el contrario, las cavidades de las ciclodextrinas son hidrofóbicas, ya que están revestidas por el hidrógeno de los átomos C-3 y C-5 y por oxígenos similares a los éteres. Estas matrices permiten la formación de complejos con una variedad de compuestos relativamente hidrofóbicos, incluidos, por ejemplo, compuestos esteroides como el 17a-estradiol (ver, por ejemplo, van Uden et al. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 38:1-3-113 (1994)). La complejación tiene lugar por interacciones de Van der Waals y por formación de enlaces de hidrógeno. Para una revisión general de la química de las ciclodextrinas, véase Wenz, Agnew. química En t. ed. Engl., 33:803-822 (1994).
Las propiedades fisicoquímicas de los derivados de ciclodextrina dependen en gran medida del tipo y grado de sustitución. Por ejemplo, su solubilidad en agua varía de insoluble (por ejemplo, triacetil-beta-ciclodextrina) a 147 % soluble (p/v) (G-2-beta-ciclodextrina). Además, son solubles en muchos disolventes orgánicos. Las propiedades de las ciclodextrinas permiten controlar la solubilidad de varios componentes de la formulación aumentando o disminuyendo su solubilidad.
Se han descrito numerosas ciclodextrinas y métodos para su preparación. Por ejemplo, Parmeter (I), et al. (Patente de EE.UU. Núm. 3.453.259) and Gramera, et al. (Patente de EE.UU. Núm. 3.459.731) describía ciclodextrinas electroneutrales. Otros derivados incluyen ciclodextrinas con propiedades catiónicas [Parámetro (II), patente de EE.UU. Núm. 3.453.257], ciclodextrinas reticuladas insolubles (Solms, patente de EE.UU. Núm. 3.420.788), y ciclodextrinas con propiedades aniónicas [Parámetro (III), Patente de EE.UU. Núm. 3.426.011]. Entre los derivados de ciclodextrina con propiedades aniónicas, los ácidos carboxílicos, ácidos fosforosos, ácidos fosfinosos, ácidos fosfónicos, ácidos fosfóricos, ácidos tiofosfónicos, ácidos tiosulfínicos y ácidos sulfónicos se han agregado a la ciclodextrina original [ver, Parámetro (III), supra]. Además, los derivados de sulfoalquil éter ciclodextrina han sido descritos por Stella, et al. (Patente de EE.UU. Núm. 5.134.127).
Los liposomas consisten en al menos una membrana de bicapa lipídica que encierra un compartimento interno acuoso.
Los liposomas se pueden caracterizar por el tipo de membrana y por el tamaño. Las vesículas unilamelares pequeñas (SUV, por sus siglas en inglés) tienen una sola membrana y típicamente varían entre 0,02 y 0,05 pm de diámetro; las vesículas unilaminares grandes (LUVS, por sus siglas en inglés) son típicamente más grandes que 0,05 pm. Las vesículas oligolamelares grandes y las vesículas multilamelares tienen múltiples capas de membrana, generalmente concéntricas, y suelen ser mayores de 0,1 pm. Los liposomas con varias membranas no concéntricas, es decir, varias vesículas más pequeñas contenidas dentro de una vesícula más grande, se denominan vesículas multivesiculares.
Un aspecto de la presente divulgación se refiere a formulaciones que comprenden liposomas que contienen un conjugado de oligómero antisentido de la presente divulgación, donde la membrana del liposoma se formula para proporcionar un liposoma con mayor capacidad de transporte. Como alternativa o además, el conjugado de oligómero antisentido de la presente divulgación puede estar contenido dentro de la bicapa de liposomas del liposoma o ser adsorbido sobre ella. Un conjugado de oligómero antisentido de la presente divulgación puede agregarse con un tensioactivo lipídico y transportarse dentro del espacio interno del liposoma; en estos casos, la membrana de liposomas está formulada para resistir los efectos disruptivos del agregado de agente activo-tensioactivo.
De acuerdo con una realización de la presente descripción, la bicapa lipídica de un liposoma contiene lípidos derivados con poli(etilenglicol) (PEG), de modo que las cadenas de PEG se extienden desde la superficie interna de la bicapa lipídica hacia el espacio interior encapsulado por el liposoma, y se extienden desde el exterior de la bicapa lipídica hacia el entorno circundante.
Los agentes activos contenidos en los liposomas de la presente divulgación están en forma solubilizada. Los agregados de tensioactivo y agente activo (tales como emulsiones o micelas que contienen el agente activo de interés) pueden quedar atrapados dentro del espacio interior de los liposomas según la presente divulgación. Un tensioactivo actúa para dispersar y solubilizar el agente activo, y se puede seleccionar de cualquier tensioactivo alifático, cicloalifático o aromático adecuado, incluidas, entre otras, lisofosfatidilcolinas biocompatibles (LPG, por sus siglas en inglés) de diferentes longitudes de cadena (por ejemplo, de aproximadamente C14 a aproximadamente C20). Los lípidos polimerderivatizados como los lípidos PEG también se pueden utilizar para la formación de micelas, ya que actuarán para inhibir la fusión micela/membrana, y como la adición de un polímero a las moléculas de tensioactivo disminuye la CMC del tensioactivo y ayuda en la formación de micelas. Se prefieren los tensioactivos con CMO en el rango micromolar; pueden utilizarse tensioactivos de CMC superior para preparar micelas atrapadas dentro de los liposomas de la presente divulgación.
Los liposomas de acuerdo con la presente descripción pueden prepararse mediante cualquiera de una variedad de técnicas que se conocen en la técnica. Véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. Núm. 4.235.871; solicitud PCT publicada WO 96/14057; New RRC, Liposomas: Un enfoque práctico, IRL Press, Oxford (1990), páginas 33-104; y Lasic DD, liposomas desde la física hasta las aplicaciones, Elsevier Science Publishers BV, Amsterdam, 1993. Por ejemplo, los liposomas de la presente divulgación se pueden preparar mediante la difusión de un lípido derivado con un polímero hidrofílico en liposomas preformados, por ejemplo, exponiendo liposomas preformados a micelas compuestas de polímeros con injerto de lípidos, a concentraciones de lípidos correspondientes al porcentaje molar final de liposomas derivatizados. lípido que se desea en el liposoma. Los liposomas que contienen un polímero hidrófilo también se pueden formar mediante técnicas de homogeneización, hidratación de campo lipídico o extrusión, como se conoce en la técnica.
En otro procedimiento de formulación a modo de ejemplo, el agente activo se dispersa primero mediante sonicación en una lisofosfatidilcolina u otro tensioactivo de CMC bajo (incluidos los lípidos injertados con polímeros) que solubiliza fácilmente las moléculas hidrofóbicas. La suspensión micelar resultante del agente activo se usa luego para rehidratar una muestra de lípido seco que contiene un porcentaje molar adecuado de lípido injertado con polímero, o colesterol. A continuación, la suspensión de lípidos y agente activo se transforma en liposomas usando técnicas de extrusión conocidas en la técnica, y los liposomas resultantes se separan de la solución no encapsulada mediante separación estándar en columna.
En un aspecto de la presente descripción, los liposomas se preparan para que tengan tamaños sustancialmente homogéneos en un intervalo de tamaño seleccionado. Un método eficaz de encolado implica la extrusión de una suspensión acuosa de los liposomas a través de una serie de membranas de policarbonato que tienen un tamaño de poro uniforme seleccionado; el tamaño de poro de la membrana se corresponderá aproximadamente con los tamaños más grandes de liposomas producidos por extrusión a través de esa membrana. Véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. Núm. 4.737.323 (12 de abril de 1988). En determinadas realizaciones, se pueden utilizar reactivos como DharmaFECT® y Lipofectamine® para introducir polinucleótidos o proteínas en las células.
Las características de liberación de una formulación de la presente divulgación dependen del material de encapsulación, la concentración del fármaco encapsulado y la presencia de modificadores de liberación. Por ejemplo, la liberación se puede manipular para que dependa del pH, por ejemplo, utilizando un revestimiento sensible al pH que se libera solo a un pH bajo, como en el estómago, o a un pH más alto, como en el intestino. Se puede usar un recubrimiento entérico para evitar que se produzca la liberación hasta después del paso por el estómago. Se pueden utilizar múltiples recubrimientos o mezclas de cianamida encapsuladas en diferentes materiales para obtener una liberación inicial en el estómago, seguida de una liberación posterior en el intestino. La liberación también se puede manipular mediante la inclusión de sales o agentes formadores de poros, que pueden aumentar la absorción de agua o la liberación del fármaco por difusión desde la cápsula. También se pueden usar excipientes que modifican la solubilidad del fármaco para controlar la tasa de liberación. También se pueden incorporar agentes que mejoran la degradación de la matriz o la liberación de la matriz. Pueden agregarse al fármaco, agregarse como una fase separada (es decir, como partículas) o pueden disolverse conjuntamente en la fase de polímero dependiendo del compuesto. En la mayoría de los casos, la cantidad debe estar entre 0,1 y 30 por ciento (p/p de polímero). Los tipos de potenciadores de la degradación incluyen sales inorgánicas como sulfato de amonio y cloruro de amonio, ácidos orgánicos como ácido cítrico, ácido benzoico y ácido ascórbico, bases inorgánicas como carbonato de sodio, carbonato de potasio, carbonato de calcio, carbonato de zinc e hidróxido de zinc, y bases orgánicas como sulfato de protamina, espermina, colina, etanolamina, dietanolamina y trietanolamina y tensioactivos como Tween® y Pluronic®. Los agentes formadores de poros que agregan microestructura a las matrices (es decir, compuestos solubles en agua tales como sales inorgánicas y azúcares) se agregan como partículas. El rango es típicamente entre uno y treinta por ciento (p/p de polímero).
La captación también se puede manipular alterando el tiempo de residencia de las partículas en el intestino. Esto se puede lograr, por ejemplo, recubriendo la partícula con, o seleccionando como material de encapsulación, un polímero adhesivo para mucosas. Los ejemplos incluyen la mayoría de los polímeros con grupos carboxilo libres, como el quitosano, las celulosas y especialmente los poliacrilatos (como se usa aquí, poliacrilatos se refiere a polímeros que incluyen grupos acrilato y grupos acrilato modificados, como cianoacrilatos y metacrilatos).
Un conjugado de oligómero antisentido puede formularse para estar contenido dentro de, o adaptado para ser liberado por un dispositivo o implante quirúrgico o médico. En ciertos aspectos, un implante puede recubrirse o tratarse de otro modo con un conjugado de oligómero antisentido. Por ejemplo, se pueden usar hidrogeles u otros polímeros, como polímeros biocompatibles y/o biodegradables, para recubrir un implante con las composiciones farmacéuticas de la presente descripción (es decir, la composición se puede adaptar para usar con un dispositivo médico usando un hidrogel u otro polímero). Los polímeros y copolímeros para recubrir dispositivos médicos con un agente son bien conocidos en la técnica. Los ejemplos de implantes incluyen, entre otros, stents, stents liberadores de fármacos, suturas, prótesis, catéteres vasculares, catéteres de diálisis, injertos vasculares, válvulas cardíacas protésicas, marcapasos cardíacos, desfibriladores cardioversores implantables, agujas intravenosas, dispositivos para la fijación de huesos y formación, como alfileres, tornillos, placas y otros dispositivos, y matrices de tejido artificial para la cicatrización de heridas.
Además de los métodos proporcionados en el presente documento, los conjugados de oligómeros antisentido para usar de acuerdo con la descripción pueden formularse para administrarse de cualquier forma conveniente para usar en medicina humana o veterinaria, por analogía con otros productos farmacéuticos. Los conjugados de oligómeros antisentido y sus formulaciones correspondientes pueden administrarse solos o en combinación con otras estrategias terapéuticas en el tratamiento de la distrofia muscular, como el trasplante de mioblastos, terapias con células madre, administración de antibióticos aminoglucósidos, inhibidores de proteasomas y terapias de regulación al alza (por ejemplo, regulación al alza de la utrofina, un parálogo autosómico de la distrofina).
En algunas realizaciones, el agente terapéutico adicional se puede administrar antes, al mismo tiempo o posteriormente a la administración del conjugado de oligómero antisentido de la presente descripción. Por ejemplo, los conjugados de oligómeros antisentido se pueden administrar en combinación con un esteroide y/o un antibiótico. En ciertas realizaciones, los conjugados de oligómero antisentido se administran a un paciente que está en teoría de esteroides de fondo (por ejemplo, terapia de esteroides de fondo intermitente o crónica/continua). Por ejemplo, en algunas realizaciones, el paciente ha sido tratado con un corticosteroide antes de la administración de un oligómero antisentido y continúa recibiendo la terapia con esteroides. En algunas realizaciones, el esteroide es glucocorticoide o prednisona.
Las rutas de administración descritas pretenden ser solo una guía, ya que un médico experto podrá determinar fácilmente la ruta óptima de administración y cualquier dosis para cualquier animal y condición en particular. Se han intentado múltiples enfoques para introducir nuevo material genético funcional en las células, tanto in vitro como in vivo (Friedmann (1989) Science, 244:1275-1280). Estos enfoques incluyen la integración del gen a expresar en retrovirus modificados (Friedmann (1989) supra; Rosenberg (1991) Cancer Research 51(18), supl.: 5074S-5079S); integración en vectores no retrovíricos (por ejemplo, vectores virales adenoasociados) (Rosenfeld, et al. (1992) Cell, 68:143-155; Rosenfeld, et al. (1991) Science, 252:431-434); o la entrega de un transgén unido a un elemento promotor-potenciador heterólogo a través de liposomas (Friedmann (1989), supra; Brigham, et al. (1989) Am. J.Med. Sci., 298:278-281; Nabel, et al. (1990) Ciencia, 249:1285-1288; Hazinski, et al. (1991) Am. J. Resp. Molécula celular. Biol., 4:206-209; y Wang y Huang (1987) Proc. nacional Academia ciencia (EE.UU.), 84:7851-7855); acoplado a sistemas de transporte basados en cationes, específicos de ligando (Wu y Wu (1988) J. Biol. Chem., 263:14621-14624) o el uso de vectores de expresión de ADN desnudo (Nabel et al. (1990), supra; Wolff et al. (1990) Science, 247:1465-1468). La inyección directa de transgenes en el tejido produce únicamente una expresión localizada (Rosenfeld (1992) supra; Rosenfeld et al. (1991) arriba; Brigham et al. (1989) supra; Nabel (1990) supra; and Hazinski et al. (1991) supra). El Brigham et al. grupo (Am. J. Med. ciencia (1989) 298:278-281 y Clinical Research (1991) 39 (resumen)) han informado de la transfección in vivo sólo de pulmones de ratones después de la administración intravenosa o intratraqueal de un complejo de liposomas de ADN. Un ejemplo de un artículo de revisión de procedimientos de terapia génica humana es: Anderson, Ciencia (1992) 256:808-813.
En una realización adicional, las composiciones farmacéuticas de la divulgación pueden comprender adicionalmente un carbohidrato como se proporciona en Han et al., Nat. Comunicaciones 7, 10981 (2016). En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas de la divulgación pueden comprender 5% de un carbohidrato de hexosa. Por ejemplo, la composición farmacéutica de la divulgación puede comprender un 5 % de glucosa, un 5 % de fructosa o un 5 % de mañosa. En determinadas realizaciones, las composiciones farmacéuticas de la divulgación pueden comprender un 2,5 % de glucosa y un 2,5 % de fructosa. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas de la divulgación pueden comprender un carbohidrato seleccionado de: arabinosa presente en una cantidad del 5 % en volumen, glucosa presente en una cantidad del 5 % en volumen, sorbitol presente en una cantidad del 5 % en volumen, galactosa presente en una cantidad del 5 % en volumen, fructosa presente en una cantidad del 5 % en volumen, xilitol presente en una cantidad del 5 % en volumen, manosa presente en una cantidad del 5 % en volumen, una combinación de glucosa y fructosa cada una presente en una cantidad de 2,5% en volumen, y una combinación de glucosa presente en una cantidad de 5,7% en volumen, fructosa presente en una cantidad de 2,86% en volumen y xilitol presente en una cantidad de 1,4% en volumen.
IV. Usos
Restauración del marco de lectura de distrofina mediante la omisión de exón
La forma más leve de distrofinopatía conocida como DMD, que es causada por mutaciones dentro del marco, sugiere un enfoque terapéutico potencial para el tratamiento de la DMD causada por mutaciones fuera del marco en el gen de la distrofina. La capacidad de convertir una mutación fuera del marco en una mutación dentro del marco hipotéticamente preservaría el marco de lectura del ARNm y produciría una proteína distrofina internamente acortada pero funcional. Los conjugados de oligómeros antisentido de la divulgación se diseñaron para lograr esto.
La hibridación de la PMO con la secuencia de pre-ARNm objetivo interfiere con la formación del complejo de corte y empalme de pre-ARNm y elimina el exón 53 del ARNm maduro. La estructura y conformación de los conjugados de oligómeros antisentido de la descripción permiten el apareamiento de bases específico de secuencia con la secuencia complementaria. Por un mecanismo similar, eteplirsen, por ejemplo, que es un p Mo que fue diseñado para omitir el exón 51 del pre-ARNm de distrofina, permite el emparejamiento de bases específico de secuencia con la secuencia complementaria contenida en el exón 51 del pre-ARNm de distrofina.
El ARNm de distrofina normal que contiene los 79 exones producirá proteína de distrofina normal. El gráfico de la Figura 1 muestra una pequeña sección del pre-ARNm de distrofina y el ARNm maduro, desde el exón 47 hasta el exón 53. La forma de cada exón representa cómo se dividen los codones entre los exones; de nota, un codón consta de tres nucleótidos. Los exones de forma rectangular comienzan y terminan con codones completos. Los exones en forma de flecha comienzan con un codón completo, pero terminan con un codón dividido, que contiene solo el nucleótido Núm. 1 del codón. Los nucleótidos Núm. 2 y Núm. 3 de este codón están contenidos en el exón posterior que comenzará con forma de cheurón.
El ARNm de la distrofina que carece de exones completos del gen de la distrofina generalmente produce DMD. El gráfico de la Figura 2 ilustra un tipo de mutación genética (supresión del exón 50) que se sabe que produce DMD. Dado que el exón 49 termina en un codón completo y el exón 51 comienza con el segundo nucleótido de un codón, el marco de lectura después del exón 49 se desplaza, lo que da como resultado un marco de lectura de ARNm fuera del marco y la incorporación de aminoácidos incorrectos aguas abajo de la mutación. La ausencia subsiguiente de un dominio de unión de distroglicano C-terminal funcional da como resultado la producción de una proteína distrofina inestable.
Eteplirsen omite el exón 51 para restaurar el marco de lectura del ARNm. Dado que el exón 49 termina en un codón completo y el exón 52 comienza con el primer nucleótido de un codón, la eliminación del exón 51 restaura el marco de lectura, lo que resulta en la producción de una proteína de distrofina acortada internamente con un sitio de unión de distroglicano intacto, similar a una mutación BMD "en marco" (Figura 3).
La viabilidad de mejorar el fenotipo de la DMD mediante la omisión de exón para restaurar el marco de lectura abierto del ARNm de la distrofina está respaldada por investigaciones no clínicas. Numerosos estudios en modelos animales distróficos de DMD han demostrado que la restauración de la distrofina mediante la omisión de exón conduce a mejoras confiables en la fuerza y la función muscular (Sharp 2011; Yokota 2009; Wu 2008; Wu 2011; Barton-Davis 1999; Goyenvalle 2004; Gregorevic 2006; Yue 2006; Welch 2007; Kawano 2008; Reay 2008; van Putten 2012). Un ejemplo convincente de esto proviene de un estudio en el que se compararon los niveles de distrofina después de la terapia de omisión de exón (usando un PMO) con la función muscular en el mismo tejido. En ratones distróficos mdx, los músculos tibial anterior (TA) tratados con un PMO específico de ratón mantuvieron ~75 % de su capacidad de fuerza máxima después de las contracciones inductoras de estrés, mientras que los músculos TA contralaterales no tratados mantuvieron solo ~25 % de su capacidad de fuerza máxima (p <0,05) (Sharp 2011). En otro estudio, 3 perros distróficos CXMD recibieron, a los 2-5 meses de edad, terapia de omisión de exón utilizando una PMO específica para su mutación genética una vez a la semana durante 5 a 7 semanas o cada dos semanas durante 22 semanas. Después de la terapia de omisión de exón, los 3 perros demostraron una expresión extensa de distrofina en todo el cuerpo en el músculo esquelético, así como una deambulación mantenida o mejorada (prueba de carrera de 15 m) en relación con la línea de base. Por el contrario, no tratados emparejados por edad CXMD los perros mostraron una marcada disminución en la deambulación durante el transcurso del estudio (Yokota 2009).
Se demostró que los PMO tienen más actividad de omisión de exón en concentraciones equimolares que los fosforotioatos tanto en ratones mdx como en el modelo de ratón con DMD humanizado (hDMD), que expresa la transcripción de DMD humana completa (Heemskirk 2009). Los experimentos in vitro que utilizan la reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR, por sus siglas en inglés) y Western blot (WB) en células musculares esqueléticas humanas normales o células musculares de pacientes con DMD con diferentes mutaciones susceptibles de omitir el exón 51 identificaron eteplirsen (un PMO) como un potente inductor de exón 51 saltando. La omisión del exón 51 inducida por eteplirsen se ha confirmado in vivo en el modelo de ratón hDMD (Arechavala-Gomeza 2007).
Los resultados clínicos para analizar el efecto de un conjugado de oligómero antisentido que es complementario a una región diana del exón 53 del pre-ARNm de distrofina humana e induce la omisión del exón 53 incluyen el porcentaje de fibras positivas para distrofina (PDPF, por sus siglas en inglés), la prueba de caminata de seis minutos (6MWT, por sus siglas en inglés), pérdida de la deambulación (LOA, por sus siglas en inglés), evaluación ambulatoria de North Star (NSAA, por sus siglas en inglés), pruebas de función pulmonar (PFT, por sus siglas en inglés), capacidad para levantarse (desde una posición supina) sin apoyo externo, producción de distrofina de novo y otras medidas funcionales.
En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona conjugados de oligómeros antisentido como se describe en el presente documento y composiciones de los mismos para usar en la producción de distrofina en un sujeto que tiene una mutación del gen de la distrofina que es susceptible de omitir el exón 53. En ciertas realizaciones, la presente descripción proporciona conjugados de oligómeros antisentido como se describe en el presente documento y composiciones de los mismos para usar en la restauración de un marco de lectura de ARNm para inducir la producción de proteína distrofina en un sujeto con distrofia muscular de Duchenne (DMD) que tiene una mutación del gen de la distrofina que es susceptible a la omisión del exón 53. La producción de proteínas se puede medir mediante la reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR), el análisis de transferencia Western o la inmunohistoquímica (IHC).
En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona conjugados de oligómeros antisentido como se describe en el presente documento y composiciones de los mismos para usar en el tratamiento de DMD en un sujeto que lo necesite, en el que el sujeto tiene una mutación del gen de la distrofina que es susceptible de omitir el exón 53. En diversas realizaciones, el tratamiento del sujeto se mide por el retraso de la progresión de la enfermedad. En algunas realizaciones, el tratamiento del sujeto se mide por el mantenimiento de la deambulación en el sujeto o la reducción de la pérdida de la deambulación en el sujeto. En algunas realizaciones, la deambulación se mide usando la prueba de caminata de 6 minutos (6MWT). En ciertas realizaciones, la deambulación se mide usando la Evaluación Ambulatoria de North Start (NSAA).
En varias realizaciones, la presente descripción proporciona conjugados de oligómeros antisentido como se describe en el presente documento y composiciones de los mismos para usar en el mantenimiento de la función pulmonar o reducir la pérdida de la función pulmonar en un sujeto con DMD, donde el sujeto tiene una mutación del gen DMD que es susceptible de exón 53 saltando. En algunas realizaciones, la función pulmonar se mide como Presión Espiratoria Máxima (MEP). En ciertas realizaciones, la función pulmonar se mide como Presión Inspiratoria Máxima (MIP). En algunas realizaciones, la función pulmonar se mide como Capacidad Vital Forzada (FVC).
En una realización adicional, las composiciones farmacéuticas de la divulgación se pueden coadministrar con un carbohidrato en los métodos de la divulgación, ya sea en la misma formulación o en una formulación separada, como se proporciona en Han et al., Nat. Comms 7, 10981 (2016). En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas de la divulgación se pueden administrar conjuntamente con un 5 % de un carbohidrato de hexosa. Por ejemplo, las composiciones farmacéuticas de la divulgación se pueden coadministrar con glucosa al 5 %, fructosa al 5 % o manosa al 5 %. En determinadas realizaciones, las composiciones farmacéuticas de la divulgación se pueden coadministrar con glucosa al 2,5 % y fructosa al 2,5 %. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica de la divulgación se puede coadministrar con un carbohidrato seleccionado de: arabinosa presente en una cantidad del 5 % en volumen, glucosa presente en una cantidad del 5 % en volumen, sorbitol presente en una cantidad de 5% en volumen, galactosa presente en una cantidad de 5% en volumen, fructosa presente en una cantidad de 5% en volumen, xilitol presente en una cantidad de 5% en volumen, manosa presente en una cantidad de 5% en volumen, un combinación de glucosa y fructosa presente cada una en una cantidad de 2,5 % en volumen, y una combinación de glucosa presente en una cantidad de 5,7 % en volumen, fructosa presente en una cantidad de 2,86 % en volumen y xilitol presente en una cantidad de 1,4 % por volumen.
En diversas realizaciones, un conjugado de oligómero antisentido de la descripción se coadministra con una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto antiinflamatorio no esteroideo. En algunas realizaciones, el compuesto antiinflamatorio no esteroideo es un inhibidor de NF-kB. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el inhibidor de NF-kB puede ser CAT-1004 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. En diversas realizaciones, el inhibidor de NF-kB puede ser un conjugado de salicilato y DHA. En algunas realizaciones, el inhibidor de NF-kB es CAT-1041 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. En ciertas realizaciones, el inhibidor de NF-kB es un conjugado de salicilato y EPA. En varias realizaciones, el inhibidor de NF-kB es
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o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En algunas realizaciones, el compuesto antiinflamatorio no esteroideo es un inhibidor de TGF-b. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, el inhibidor de TGF-b es HT-100.
En ciertas realizaciones, se describe un conjugado de oligómero antisentido como se describe en este documento para uso en terapia.
V. kits
La divulgación también proporciona kits para el tratamiento de un paciente con una enfermedad genética cuyo kit comprende al menos un conjugado de oligómero antisentido de fórmula (IV), envasado en un recipiente adecuado, junto con instrucciones para su uso. Los kits también pueden contener reactivos periféricos como tampones, estabilizadores, etc. Los expertos en la materia deberían apreciar que las aplicaciones del método anterior tienen una amplia aplicación para identificar moléculas antisentido adecuadas para su uso en el tratamiento de muchas otras enfermedades. El kit comprende un conjugado de oligómero antisentido según la Fórmula (IV) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Ejemplos
Materiales y métodos
Condiciones de tratamiento de cultivo de células y tejidos
Se utilizaron miocitos humanos diferenciados (ZenBio, Inc.) para medir la omisión de exón. Específicamente, los mioblastos (ZenBio, Inc., SKB-F) se cultivaron hasta una confluencia del 80-90 % a 37 °C y CO2 al 5 % en medios de cultivo (SKB-M; ZenBio, Inc.). La diferenciación se inició reemplazando los medios de crecimiento con medios de diferenciación (SKM-D; ZenBio, Inc.). Para analizar la omisión del exón 53, se sembraron 1x104 células diferenciadas en una placa de 24 pocillos y se añadió a cada pocillo 1 ml de medio de diferenciación (SKM-D; ZenBio, Inc.) que contenía varias concentraciones de PMO o PPMO y se incubó durante 96 horas.
Análisis de Western Blot
Para el análisis de transferencia Western, el tejido se homogeneizó con tampón de homogeneización (SDS al 4 %, urea 4 M, tris-HCl 125 mM (pH 6,8)) en una proporción de secciones de tejido de 9 a 18 x 20-pm con un diámetro de aproximadamente 5 mm en 133 pl de tampón. El lisado correspondiente se recolectó y se sometió a la cuantificación de proteínas usando el RC DC Protein Assay Kit según las instrucciones del fabricante (BioRad Cat. 500-0122). Las muestras de extracto de tejido se diluyeron 1:10 usando un tampón de homogeneización para estar dentro del rango de la curva estándar de BSA. Las muestras se prepararon de tal manera que 35 pl de muestra contendrían la cantidad deseada de proteína utilizando 25 pl de lisado de proteínas, 7 pl de tampón de muestra NuPAGE LDS (Life Technologies Cat. NP0008, Carlsbad, California, Ee . UU.) y 3 pl de agente reductor NuPAGE (10x) (Life Technologies Cat. NP0004). Después de calentar las muestras de proteínas durante 5 minutos a 95 °C, las muestras se centrifugaron y el sobrenadante se cargó en un pocillo NuPAGE Novex 10, 1 mm, mini gel de trisacetato de poliacrilamida al 3-8 % (Life Technologies Cat. EA0375) a un máximo de 50 pg de carga total de proteínas por carril. El gel se corrió a 150 voltios a temperatura ambiente hasta que el frente de tinte se escurrió del gel. Los geles de proteínas resultantes se transfirieron a membranas de PVDF (Life Technologies Cat. LC2007) durante 75 minutos a temperatura ambiente con 30 voltios utilizando tampón de transferencia NuPAGE (Life Technologies NP006-1), metanol al 10 % y antioxidante NuPAGE al 0,1 % (Life Technologies NP0005).
Después de la transferencia de proteínas, las membranas de PVDF se sumergieron en tampón TTBS (IX TBS (Amresco Cat. J640-4L), 0,1 % (v/v) de tween-20). Las membranas se transfirieron a tampón de bloqueo (leche descremada en polvo al 5 % (p/v) (Lab Scientific Cat. M0841) en TTBS) y se remojaron durante la noche a 4 °C con balanceo suave. Después del bloqueo, las membranas se incubaron durante 60 minutos a temperatura ambiente en DYS1 (Leica Cat. NCL-DYS1) diluido 1:20 usando tampón de bloqueo, o 20 minutos a temperatura ambiente en anticuerpo anti-a-actinina (Sigma-Aldrich Cat. NA931V) diluido 1:100000 con tampón de bloqueo, seguido de seis lavados (cinco minutos cada uno con TTBS). Anti-ratón IgG conjugado con peroxidasa de rábano picante (GE Healthcare Cat. NA931V) se diluyó 1:40000 con tampón de bloqueo y se añadió a las membranas durante 45 minutos (DYS1) o 15 minutos (a-actinina), seguido de nuevo por seis lavados. Usando el kit de detección ECL Prime Western (GE Healthcare Cat. RPN2232), la película se expuso al gel y se reveló en consecuencia. La película revelada se escaneó y analizó usando el software ImageQuant TL Plus (versión 8.1) y se realizó un análisis de regresión lineal usando el software Graphpad.
Cada gel de transferencia Western incluye una curva estándar de distrofina de 4 o 5 puntos preparada con proteína total extraída de tejido normal (cuádriceps, diafragma o corazón de ratón) diluida, por ejemplo, al 64 %, 16 %, 4 %, 1 % y 0,25 % (ver. Por ejemplo. Figuras 5A y 5B) y se añadió al tejido DMD (por ejemplo, extracto de cuádriceps, diafragma o corazón de ratón mdx, o cuádriceps, diafragma o músculo liso (GI) de NHP). Las muestras de la curva estándar se procesaron como se describe anteriormente. Los niveles de proteína de distrofina como porcentaje de los niveles de distrofina de tipo silvestre (% WT) se determinaron comparando las intensidades de la banda de distrofina con la curva estándar del gel.
Análisis de RT-PCR
Para el análisis de RT-PCR, se aisló el ARN de las células utilizando el kit de centrifugado Illustra GE siguiendo el protocolo del fabricante. La concentración y la pureza del ARN se determinaron utilizando un NanoDrop. La omisión del exón 53 se midió mediante RT-PCR con un cebador directo que se une a la unión del exón 51/52 y 54 SEQ ID NO: 5 (5'-CATCAAGCAGAAGGCAACAA- 3') y un cebador inverso que se une a la unión del exón 51/52 y 54 SEQ ID NO: 6 (5'-GAAGTTTCAGGGCCAAGTCA-3'). Un exón 53 omitido resultó en un amplicón de 201 pb y un exón 53 no omitido resultó en un amplicón de 413 pb.
La omisión del exón 23 de ratón se midió mediante RT-PCR con un cebador directo-SEQ ID NO: 7 (5'-CACATCTTT-GATGGTGTGAGG-3') y un cebador inverso SEQ ID NO: 8 (5'-CAACTTCAGCCATCCATTTCTG -3').
Después de someter el ARN a RT-PCR, las muestras se analizaron usando una máquina Caliper, que usa electroforesis capilar en gel. El porcentaje de omisión de exón se calculó utilizando la siguiente ecuación: (área bajo la curva para bandas omitidas)/(suma del área bajo la curva para bandas omitidas y no omitidas)x100.
Inmunohistoquímica: tinción de distrofina:
Se usaron secciones de tejido congelado de 10 micras del cuádriceps de ratón para detectar distrofina mediante el anticuerpo primario de distrofina (dilución 1:250, conejo, Abcam, cat#ab 15277) en suero de cabra al 10 %, BSA al 1 % en PBS y anticuerpo secundario Alexa-Fluoro 488 cabra anti-conejo (dilución de 1:1000) en suero de cabra al 10% 1% BSA.
Preparación de subunidades de morfolino
l. N a lü4, McOH tac
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Esquema 1: Ruta sintética general para subunidades PMO
Haciendo referencia al Esquema 1, en el que B representa un resto de apareamiento de bases, las subunidades de morfolino pueden prepararse a partir del ribonucleósido correspondiente (1) como se muestra. La subunidad morfolino (2) puede protegerse opcionalmente por reacción con un precursor de grupo protector adecuado, por ejemplo, cloruro de tritilo. El grupo protector 3' generalmente se elimina durante la síntesis de oligómeros en estado sólido como se describe con más detalle a continuación. El resto de apareamiento de bases puede protegerse adecuadamente para la síntesis de oligómeros en fase sólida. Los grupos protectores adecuados incluyen benzoílo para adenina y citosina, fenilacetilo para guanina y pivaloiloximetilo para hipoxantina (I). El grupo pivaloiloximetilo se puede introducir en la posición N1 de la base heterocíclica de hipoxantina. Aunque puede emplearse una subunidad de hipoxantina no protegida, los rendimientos en las reacciones de activación son muy superiores cuando la base está protegida. Otros grupos protectores adecuados incluyen los descritos en la Patente de EE.UU. Núm. 8.076.476.
La reacción de 3 con el compuesto de fósforo activado 4 da como resultado subunidades de morfolino que tienen el resto de enlace deseado 5.
Los compuestos de estructura 4 se puede preparar utilizando cualquier número de métodos conocidos por los expertos en la técnica. A continuación, el acoplamiento con el resto morfolino procede como se ha indicado anteriormente.
Los compuestos de estructura 5 se puede utilizar en la síntesis de oligómeros en fase sólida para la preparación de oligómeros que comprenden los enlaces entre subunidades. Dichos métodos son bien conocidos en la técnica. Brevemente, un compuesto de estructura 5 puede modificarse en el extremo 5' para contener un enlazador a un soporte sólido. Una vez apoyado, el grupo protector de 5 (por ejemplo, tritilo en el extremo 3')) se elimina y la amina libre se hace reaccionar con un resto de fósforo activado de un segundo compuesto de estructura 5. Esta secuencia se repite hasta que se obtiene el oligo de longitud deseada. El grupo protector en el extremo del terminal 3' se puede quitar o dejar puesto si se desea una modificación de 3'. El oligo se puede eliminar del soporte sólido utilizando varios métodos o un tratamiento de ejemplo con una base para romper el enlace con el soporte sólido.
La preparación de oligómeros de morfolino en general y oligómeros de morfolino específicos de la divulgación se describen con más detalle en los Ejemplos.
Preparación de oligómeros de morfolino
La preparación de los compuestos de la divulgación se realiza utilizando el siguiente protocolo según el Esquema 2:
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Preparación de tritil piperazina fenil carbamato 35: A una suspensión enfriada de compuesto 11 en diclorometano (6 mL/g 11) se añadió una solución de carbonato de potasio (3,2 eq) en agua (4 mL/g de carbonato de potasio). A esta mezcla de dos fases se añadió lentamente una solución de cloroformiato de fenilo (1,03 eq) en diclorometano (2 g/g de cloroformiato de fenilo). La mezcla de reacción se calentó a 20 °C. Una vez completada la reacción (1-2 h), se separaron las capas. La capa orgánica se lavó con agua y se secó sobre carbonato de potasio anhidro. El producto 35 se aisló por cristalización en acetonitrilo.
Preparación de alcohol carbamato 36: Se suspendió hidruro de sodio (1,2 eq) en 1 -metii-2-pirrolidinona (32 ml/g de hidruro de sodio). A esta suspensión se añadieron trietilenglicol (10,0 eq) y el compuesto 35 (1,0 eq). La suspensión resultante se calentó a 95 °C. Una vez completada la reacción (1-2 h), la mezcla se enfrió a 20 °C. A esta mezcla se añadió diclorometano al 30 %/metil terc-butil éter (v:v) y agua. La capa orgánica que contenía el producto se lavó sucesivamente con NaOH acuoso, ácido succínico acuoso y cloruro sódico acuoso saturado. El producto 36 se aisló por cristalización en diclorometano/metil terc-butil éter/heptano.
Preparación del ácido de cola 37: A una solución de compuesto 36 en tetrahidrofurano (7 ml/g 36) se añadió anhídrido succínico (2,0 eq) y DMAP (0,5 eq). La mezcla se calentó a 50 °C. Una vez completada la reacción (5 h), la mezcla se enfrió a 20 °C y se ajustó a pH 8,5 con NaHCO3 acuoso. Se añadió metil terc-butil éter y el producto se extrajo en la fase acuosa. Se añadió diclorometano y la mezcla se ajustó a pH 3 con ácido cítrico acuoso. La capa orgánica que contenía el producto se lavó con una mezcla de tampón de citrato de pH = 3 y cloruro de sodio acuoso saturado. Esta solución de diclorometano de 37 se usó sin aislamiento en la preparación del compuesto 38.
Preparación de 38: A una solución de compuesto 37 se añadió imida de ácido N-hidroxi-5-norborneno-2,3-dicarboxílico (HONB) (1,02 eq), 4-dimetilaminopiridina (DMAP) (0,34 eq) y luego 1-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilcar - clorhidrato de bodiimida (EDC) (1,1 eq). La mezcla se calentó a 55 °C. Una vez completada la reacción (4-5 horas), la mezcla se enfrió a 20 °C y se lavó sucesivamente con ácido cítrico/salmuera 0,2 M 1:1 y salmuera. La solución de diclorometano se sometió a intercambio de disolvente a acetona y luego a N,N-dimetilformamida, y el producto se aisló por precipitación en acetona/N,N-dimetilformamida en cloruro de sodio acuoso saturado. El producto bruto se volvió a suspender varias veces en agua para eliminar la N,N-dimetilformamida residual y las sales.
Método de síntesis de PMO A: Uso de ancla de disulfuro
La introducción de la "Cola" activada en la resina cargada con ancla se realizó en dimetilimidazolidinona (DMI) mediante el procedimiento utilizado para la incorporación de las subunidades durante la síntesis en fase sólida.
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Esquema 3: Preparación del soporte solido para la síntesis de oligomeros de morfolmc
Este procedimiento se realizó en un recipiente de péptido con camisa y silanizado (ChemGlass, NJ, EE. UU.) con una frita de vidrio de porosidad gruesa (40-60 pm), agitador superior y llave de paso de teflón de 3 vías para permitir que el N2 burbujee a través de la frita o una extracción al vacío.
Los pasos de tratamiento/lavado de resina en el siguiente procedimiento consisten en dos operaciones básicas: fluidización de resina o reactor de lecho agitador y extracción de solvente/solución. Para la fluidización de la resina, la llave de paso se colocó para permitir que el N2 fluya hacia arriba a través de la frita y se agregó el tratamiento/lavado de resina especificado al reactor y se permitió que penetrara y humedeciera completamente la resina. A continuación, se inició el mezclado y la suspensión de resina se mezcló durante el tiempo especificado. Para la extracción de solución/solvente, se detuvo la mezcla y el flujo de N2 y se puso en marcha la bomba de vacío y luego se colocó la llave de paso para permitir la evacuación del tratamiento/lavado de resina a los desechos. Todos los volúmenes de tratamiento/lavado con resina fueron de 15 ml/g de resina a menos que se indique lo contrario.
A la resina de aminometilpoliestireno (malla 100-200; carga de ~1,0 mmol/g basada en la sustitución de nitrógeno; 75 g, 1 eq, Polymer Labs, Reino Unido, núm de pieza 1464-X799) en un recipiente de péptido con camisa silanizada se le añadió 1 -metil- 2-pirrolidinona (NMP; 20 ml/g de resina) y se dejó que la resina se hinchara con mezcla durante 1 -2 horas. Después de la evacuación del disolvente de hinchamiento, la resina se lavó con diclorometano (2 x 1-2 min), diisopropiletilamina al 5 % en isopropanol al 25 %/diclorometano (2 x 3-4 min) y diclorometano (2 x 1-2 min). Después de la evacuación del lavado final, la resina se trató con una solución de ancla de disulfuro 34 en 1 -metil-2-pirrolidinona (0,17 M; 15 ml/g de resina, ~2,5 eq) y la mezcla de resina/reactivo se calentó a 45 °C durante 60 h. Al finalizar la reacción, se interrumpió el calentamiento y se evacuó la solución de anclaje y se lavó la resina con 1 -metil-2-pirrolidinona (4 x 3-4 min) y diclorometano (6 x 1-2 min). La resina se trató con una solución de dicarbonato de dietilo al 10 % (v/v) en diclorometano (16 ml/g; 2 x 5-6 min) y luego se lavó con diclorometano (6 x 1-2 min). La resina 39 se secó bajo una corriente de N2 durante 1-3 horas y luego al vacío hasta peso constante (±2%). Rendimiento: 110-150% del peso original de la resina.
Determinación de la carga de resina de disulfuro de aminometilpoliestireno: La carga de la resina (número de sitios reactivos potencialmente disponibles) se determina mediante un ensayo espectrométrico del número de grupos trifenilmetilo (tritilo) por gramo de resina.
Se transfiere un peso conocido de resina seca (25 ± 3 mg) a un matraz aforado de 25 ml silanizado y se agrega ~5 mL de ácido trifluoroacético al 2% (v/v) en diclorometano. Los contenidos se mezclan agitando suavemente y luego se dejan reposar durante 30 min. El volumen se lleva hasta 25 ml con ácido trifluoroacético adicional al 2% (v/v) en diclorometano y los contenidos se mezclan completamente. Usando una pipeta de desplazamiento positivo, se transfiere una alícuota de la solución que contiene tritilo (500 pl) a un matraz volumétrico de 10 ml y se lleva el volumen a 10 ml con ácido metanosulfónico.
El contenido de catión tritilo en la solución final se mide mediante la absorbancia UV a 431,7 nm y la carga de resina se calcula en grupos tritilo por gramo de resina (pmol/g) usando los volúmenes, diluciones y coeficiente de extinción apropiados (s: 41 pmol-1 cm-1) y peso de resina. El ensayo se realiza por triplicado y se calcula una carga media.
El procedimiento de carga de resina en este ejemplo proporcionará resina con una carga de aproximadamente 500 pmol/g. Se obtuvo una carga de 300-400 en pmol/g si la etapa de incorporación del ancla de disulfuro se realiza durante 24 horas a temperatura ambiente.
Carga de cola: Usando la misma configuración y volúmenes que para la preparación de resina de disulfuro de aminometilpoliestireno, la cola se puede introducir en un soporte sólido. La resina cargada con ancla se desprotegió primero en condiciones ácidas y el material resultante se neutralizó antes del acoplamiento. Para el paso de acoplamiento, una solución de 38 (0,2 M) en DMI que contenía 4-etilmorfolina (NEM, 0,4 M) en lugar de la solución de anclaje de disulfuro. Después de 2 h a 45 °C, la resina 39 se lavó dos veces con diisopropiletilamina al 5 % en isopropanol al 25 %/diclorometano y una vez con DCM. A la resina se añadió una solución de anhídrido benzoico (0,4 M) y NEM (0,4 M). Después de 25 min, la camisa del reactor se enfrió a temperatura ambiente y la resina se lavó dos veces con diisopropiletilamina al 5 % en isopropanol al 25 %/diclorometano y ocho veces con DCM. La resina 40 se filtró y se secó a alto vacío. La carga de resina 40 se define como la carga de la resina de disulfuro de aminometilpoliestireno original 39 utilizado en la carga de cola.
Síntesis en fase sólida: Los oligómeros de morfolino se prepararon en un sintetizador de péptidos automatizado Gilson AMS-422 en columnas de reacción de polipropileno Gilson de 2 ml (n.° de pieza 3980270). Se colocó un bloque de aluminio con canales para el flujo de agua alrededor de las columnas mientras se asentaban en el sintetizador. El AMS-422 agregará alternativamente soluciones de lavado/reactivo, las mantendrá durante un tiempo específico y evacuará las columnas usando vacío.
Para oligómeros en el rango de hasta aproximadamente 25 subunidades de longitud, se prefiere resina de disulfuro de aminometilpoliestireno con una carga cercana a 500 pmol/g de resina. Para oligómeros más grandes, se prefiere la resina de disulfuro de aminometilpoliestireno con una carga de 300-400 pmol/g de resina. Si se desea una molécula con 5'-Cola, la resina que se ha cargado con Cola se elige con las mismas pautas de carga.
Se prepararon las siguientes soluciones de reactivos:
Solución de detritilación: ácido cianoacético al 10 % (p/v) en diclorometano/acetonitrilo 4:1;
Solución de neutralización: Diisopropiletilamina al 5% en diclorometano/isopropanol 3:1; y
Solución de acoplamiento: 0,18 M (o 0,24 M para oligómeros que han crecido más de 20 subunidades) subunidad de morfolino activada de la base deseada y tipo de enlace y etilmorfolina 0,4 M N, en 1,3-dimetilimidazolidinona.
Se usó diclorometano (DCM) como lavado de transición para separar los diferentes lavados de solución de reactivo.
En el sintetizador, con el bloque ajustado a 42 °C, a cada columna que contenía 30 mg de resina de disulfuro de poliestireno aminometilado (o resina Cola) se le añadieron 2 ml de 1 -metil-2-pirrolidinona y se dejó reposar a temperatura ambiente durante 30 minutos. mín. Luego de lavar con 2 veces 2 mL de diclorometano, se empleó el siguiente ciclo de síntesis:
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Las secuencias de los oligómeros individuales se programaron en el sintetizador para que cada columna reciba la solución de acoplamiento adecuada (A,C,G,T,I) en la secuencia adecuada. Cuando el oligómero en una columna hubo completado la incorporación de su subunidad final, la columna se retiró del bloque y se realizó manualmente un ciclo final con una solución de acoplamiento compuesta por cloruro de 4-metoxitrifenilmetilo (0,32 M en DMI) que contenía 0,89 M de 4-etilmorfolino.
La escisión de la resina y eliminación de bases y grupos protectores de la columna vertebral: Después de la metoxitritilación, la resina se lavó 8 veces con 2 ml de 1 -metil-2-pirrolidinona. Se añadió un ml de una solución de escisión que constaba de 1,4-ditiotreitol (DTT) 0,1 M y trietilamina 0,73 M en 1 -metil-2-pirrolidinona, se tapó la columna y se dejó reposar a temperatura ambiente durante 30 min. Pasado ese tiempo, la solución se drenó en un vial Wheaton de 12 mL. La resina muy encogida se lavó dos veces con 300 pl de solución de escisión. A la solución se añadieron 4,0 ml de solución conc. amoníaco acuoso (almacenado a -20 °C), el vial tapado herméticamente (con tapón de rosca revestido de teflón) y la mezcla se agitó para mezclar la solución. El vial se colocó en un horno a 45 °C durante 16-24 h para efectuar la escisión de los grupos protectores de la base y la columna vertebral.
Depuración de productos crudos: La solución de amonólisis en vial se retiró del horno y se dejó enfriar a temperatura ambiente. La solución se diluyó con 20 ml de amoníaco acuoso al 0,28 % y se pasó a través de una columna de 2,5 x 10 cm que contenía resina Macroprep HQ (BioRad). Un gradiente de sal (A: 0,28% de amoníaco con B: cloruro de sodio 1 M en amoniaco al 0,28%; 0-100% B en 60 min) para eluir el pico que contenía metoxitritilo. Las fracciones combinadas se agruparon y se procesaron adicionalmente según el producto deseado.
Desmetoxitritilación de oligómeros de morfolino: Las fracciones agrupadas de la purificación de Macroprep se trataron con 1 M H3PO4 para bajar el pH a 2,5. Después de la mezcla inicial, las muestras se asentaron a temperatura ambiente durante 4 min, momento en el que se neutralizaron a pH 10-11 con amoníaco/agua al 2,8 %. Los productos se purificaron mediante extracción en fase sólida (SPE).
Empaquetado y acondicionamiento de columnas SPE: Amberchrome CG-300M (Rohm and Haas; Philadelphia, PA) (3 ml) se empaqueta en columnas fritadas de 20 ml (columnas de cromatografía BioRad Econo-Pac (732-1011)) y la resina se enjuaga con 3 ml de lo siguiente: NH4OH al 0,28 % / acetonitrilo al 80 %; NaOH 0,5 M/etanol al 20 %; agua; H3PO450 mM/acetonitrilo al 80 %; agua; 0,5 NaOH/20 % de etanol; agua; NH4OH al 0,28 %.
Purificación SPE: La solución de la demetoxitritilación se cargó en la columna y la resina se enjuagó tres veces con 3-6 ml de amoníaco acuoso al 0,28 %. Se colocó un vial de Wheaton (12 ml) debajo de la columna y el producto se eluyó mediante dos lavados con 2 ml de acetonitrilo al 45 % en amoníaco acuoso al 0,28 %.
Aislamiento del producto: Las soluciones se congelaron en hielo seco y los viales se colocaron en un liofilizador para producir un polvo blanco esponjoso. Las muestras se disolvieron en agua, se filtraron a través de un filtro de 0,22 micras (Pall Life Sciences, filtro de jeringa Acrodisc de 25 mm, con una membrana HT Tuffryn de 0,2 micras) utilizando una jeringa y se midió la densidad óptica (OD, por sus siglas en inglés) en un espectrofotómetro UV para determinar las unidades OD del oligómero presente, así como también dosificar la muestra para el análisis. A continuación, las soluciones se volvieron a colocar en viales de Wheaton para su liofilización.
Análisis de oligómeros de morfolino por MALDI: Se usó espectrometría de masas MALDI-TOF para determinar la composición de las fracciones en las purificaciones, así como para proporcionar evidencia de identidad (peso molecular) de los oligómeros. Las muestras se analizaron después de la dilución con una solución de ácido 3,5-dimetoxi-4-hidroxicinámico (ácido sinapínico), 3,4,5-trihidroxiacetofenona (THAP) o ácido alfa-ciano-4-hidroxicinámico (HCCA) como matrices.
Síntesis de PMO Método B: Uso de Ancla NCP2
Síntesis de Ancla NCP2:
1. Preparación de 4-Fluoro-3-Nitrobenzoato de metilo (1)
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A un matraz de 100 L se cargaron 12,7 kg de ácido 4-fluoro-3-nitrobenzoico, se añadieron 40 kg de metanol y 2,82 kg de ácido sulfúrico concentrado. La mezcla se agitó a reflujo (65 °C) durante 36 horas. La mezcla de reacción se enfrió a 0 °C. Los cristales se formaron a 38 °C. La mezcla se mantuvo a 0°C durante 4 horas y luego se filtró bajo nitrógeno. El matraz de 100 L se lavó y la torta del filtro se lavó con 10 kg de metanol que se había enfriado a 0 °C. La torta de filtración sólida se secó en el embudo durante 1 hora, se transfirió a bandejas y se secó en un horno de vacío a temperatura ambiente hasta un peso constante de 13,695 kg de 4-fluoro-3-nitrobenzoato de metilo (100% de rendimiento; HPLC 99%).
2. Preparación de ácido 3-nitro-4-(2-oxopropil)benzoico
A. (Z)-4-(3-hidroxi-1-metoxi-1-oxobut-2-en-2-il)-3-nitrobenzoato de metilo (2)
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En un matraz de 100 L se cargaron 3,98 kg de 4-fluoro-3-nitrobenzoato de metilo (1) del paso anterior 9,8 kg DMF, 2,81 kg acetoacetato de metilo. La mezcla se agitó y se enfrió a 0 °C. A esto se le añadieron 3,66 kg de DBU durante aproximadamente 4 horas mientras la temperatura se mantenía a 5°C o menos. La mezcla se agitó durante 1 hora más. Al matraz de reacción se añadió una solución de 8,15 kg de ácido cítrico en 37,5 kg de agua purificada mientras la temperatura de reacción se mantenía a 15°C o menos. Después de la adición, la mezcla de reacción se agitó durante 30 minutos adicionales y luego se filtró bajo nitrógeno. La torta de filtración húmeda se devolvió al matraz de 100 L junto con 14,8 kg de agua purificada. La suspensión se agitó durante 10 minutos y luego se filtró. La torta húmeda se devolvió de nuevo al matraz de 100 L, se suspendió con 14,8 kg de agua purificada durante 10 minutos y se filtró hasta obtener (Z)-metil 4-(3-hidroxi-1-metoxi-1-oxobut-2-eno crudo). -2-il)-3-nitrobenzoato.
B. Ácido 3-nitro-4-(2-oxopropil)benzoico
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El 4-(3-hidroxi-1-metoxi-1-oxobut-2-en-2-il)-3-nitrobenzoato de (Z)-metilo bruto se cargó en un matraz de reacción de 100 L bajo nitrógeno. A esto se añadieron 14,2 kg de 1,4-dioxano y se agitó. Se añadió a la mezcla una solución de 16,655 kg de HCl concentrado y 13,33 kg de agua purificada (HCl 6 M) durante 2 horas mientras la temperatura de la mezcla de reacción se mantenía por debajo de 15 °C. Cuando se completó la adición, la mezcla de reacción se calentó a reflujo (80°C) durante 24 horas, se enfrió a temperatura ambiente y se filtró bajo nitrógeno. La torta de filtración sólida se trituró con 14,8 kg de agua purificada, se filtró, se trituró nuevamente con 14,8 kg de agua purificada y se filtró. El sólido se devolvió al matraz de 100 L con 39,9 kg de DCM y se sometió a reflujo con agitación durante 1 hora. Se añadieron 1,5 kg de agua purificada para disolver los sólidos restantes. La capa orgánica del fondo se dividió en un matraz de 72 L precalentado, luego se devolvió a un matraz de 100 L limpio y seco. La solución se enfrió a 0 °C, se mantuvo durante 1 hora y luego se filtró. La torta de filtración sólida se lavó dos veces cada una con una solución de 9,8 kg de DCM y 5 kg de heptano, luego se secó en el embudo. El sólido se transfirió a bandejas y se secó hasta un peso constante de 1,855 kg de ácido 3-nitro-4-(2-oxopropil)benzoico. Rendimiento total 42% del compuesto 1. HPLC 99,45%.
3. Preparación de Succinato de N-tritilpiperazina (NTP)
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En un matraz con camisa de 72 L se cargaron bajo nitrógeno 1,805 kg de cloruro de trifenilmetilo y 8,3 kg de tolueno (solución de TPC). La mezcla se agitó hasta que se disolvieron los sólidos. A un matraz de reacción con camisa de 100 L se añadieron bajo nitrógeno 5,61 kg de piperazina, 19,9 kg de tolueno y 3,72 kg de metanol. La mezcla se agitó y se enfrió a 0 °C. A esto se añadió lentamente en porciones la solución de TPC durante 4 horas mientras la temperatura de reacción se mantenía ao por debajo de 10°C. La mezcla se agitó durante 1,5 horas a 10 °C, luego se dejó calentar a 14 °C. Se cargaron 32,6 kg de agua purificada en el matraz de 72 L, luego se transfirió al matraz de 100 L mientras la temperatura interna del lote se mantenía a 20°C. /- 5°C. Se permitió que las capas se dividieran y la capa acuosa del fondo se separó y almacenó. La capa orgánica se extrajo tres veces con 32 kg de agua purificada cada vez, y las capas acuosas se separaron y combinaron con la solución acuosa almacenada.
La capa orgánica restante se enfrió a 18 °C y se añadió lentamente en porciones a la capa orgánica una solución de 847 g de ácido succínico en 10,87 kg de agua purificada. La mezcla se agitó durante 1,75 horas a 20 /-5 °C. La mezcla se filtró y los sólidos se lavaron con 2 kg de TBME y 2 kg de acetona y luego se secaron en el embudo. La torta del filtro se trituró dos veces con 5,7 kg de acetona cada una y se filtró y lavó con 1 kg de acetona entre trituraciones. El sólido se secó en el embudo, luego se transfirió a charolas y se secó en una estufa de vacío a temperatura ambiente hasta un peso constante de 2,32 kg de NTP. Rendimiento 80%.
4. Preparación de (4-(2-Hidroxipropil)-3-Nitrofenil)(4-T ritilpiperazin-1 -il)Metanona
A. Preparación de 1-(2-Nitro-4(4-Tritilpiperazina-1-Carbonil)Fenil)Propan-2-ona
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En un matraz con camisa de 100 L se cargaron bajo nitrógeno 2 kg de ácido 3-nitro-4-(2-oxopropil)benzoico (3), 18,3 kg de DCM y 1,845 kg de clorhidrato de N-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilcarbodiimida (EDC.HCl). La solución se agitó hasta que se formó una mezcla homogénea. Se añadieron 3,048 kg de NTP durante 30 minutos a temperatura ambiente y se agitó durante 8 horas. Se añadieron 5,44 kg de agua purificada a la mezcla de reacción y se agitó durante 30 minutos. Se permitió que las capas se separaran y la capa orgánica inferior que contenía el producto se drenó y almacenó. La capa acuosa se extrajo dos veces con 5,65 kg de DCM. Las capas orgánicas combinadas se lavaron con una solución de 1,08 kg de cloruro sódico en 4,08 kg de agua purificada. Las capas orgánicas se secaron sobre 1,068 kg de sulfato de sodio y se filtraron. El sulfato de sodio se lavó con 1,3 kg de DCM. Las capas orgánicas combinadas se suspendieron con 252 g de gel de sílice y se filtraron a través de un filtro de embudo que contenía un lecho de 252 g de gel de sílice. El lecho de gel de sílice se lavó con 2 kg de DCM. Las capas orgánicas combinadas se evaporaron en un evaporador rotatorio. Se añadieron 4,8 kg de THF al residuo y luego se evaporó en el evaporador rotatorio hasta alcanzar 2,5 volúmenes de 1-(2-nitro-4(4-tritilpiperazina-1-carbonil)fenil)propan-2-ona bruta en THF.
B. Preparación de (4-(2-Hidroxipropil)-3-Nitrofenil)(4-Tritilpiperazin-1-il)Metanona (5)
Figure imgf000037_0001
En un matraz con camisa de 100 L se cargaron bajo nitrógeno 3600 g de 4 del paso anterior y 9800 g de THF. La solución agitada se enfrió a <5 °C. La solución se diluyó con 11525 g de etanol y se añadieron 194 g de borohidruro de sodio durante aproximadamente 2 horas a <5 °C. La mezcla de reacción se agitó durante 2 horas más a <5 °C. La reacción se inactivó con una solución de aproximadamente 1,1 kg de cloruro de amonio en aproximadamente 3 kg de agua mediante adición lenta para mantener la temperatura a <10 °C. La mezcla de reacción se agitó durante 30 minutos más, se filtró para eliminar los compuestos inorgánicos y se recargó en un matraz con camisa de 100 L y se extrajo con 23 kg de DCM. La capa orgánica se separó y la acuosa se extrajo dos veces más con 4,7 kg de DCM cada vez. Las capas orgánicas combinadas se lavaron con una solución de aproximadamente 800 g de cloruro sódico en aproximadamente 3 kg de agua, luego se secaron sobre 2,7 kg de sulfato sódico. La suspensión se filtró y la torta del filtro se lavó con 2 kg de DCM. Los filtrados combinados se concentraron a 2,0 volúmenes, se diluyeron con aproximadamente 360 g de acetato de etilo y se evaporaron. El producto bruto se cargó en una columna de gel de sílice de 4 kg de sílice rellena con DCM en nitrógeno y se eluyó con 2,3 kg de acetato de etilo en 7,2 kg de DCM. Las fracciones combinadas se evaporaron y el residuo se recogió en 11,7 kg de tolueno. La solución de tolueno se filtró y la torta del filtro se lavó dos veces con 2 kg de tolueno cada vez. La torta de filtración se secó hasta un peso constante de 2,275 kg de compuesto 5 (46% de rendimiento del compuesto 3) HPLC 96,99%.
5. Preparación de carbonato de 2,5-dioxopirrolidin-1-il(1-(2-nitro-4-(4-trifenilmetilpiperazina-1 carbonil)fenil)propano-2-il) (anclaje NCP2)
Figure imgf000037_0002
En un matraz con camisa de 100 L se cargaron bajo nitrógeno 4,3 kg del compuesto 5 (peso ajustado en base al tolueno residual por RMN H1; todos los reactivos de aquí en adelante se escalaron en consecuencia) y 12,7 kg de piridina. A esto se cargaron 3,160 kg de DSC (78,91 % en peso por H1 NMR) mientras se mantenía la temperatura interna a < 35 °C. La mezcla de reacción se envejeció durante aproximadamente 22 horas a temperatura ambiente y luego se filtró. La torta del filtro se lavó con 200 g de piridina. En dos lotes, cada uno de los cuales comprende 1/2 el volumen de filtrado, el lavado de filtrado se cargó lentamente en un matraz con camisa de 100 l que contenía una solución de aproximadamente 11 kg de ácido cítrico en aproximadamente 50 kg de agua y se agitó durante 30 minutos para permitir la precipitación sólida. El sólido se recogió con un filtro de embudo, se lavó dos veces con 4,3 kg de agua por lavado y se secó en el filtro de embudo al vacío.
Los sólidos combinados se cargaron en un matraz con camisa de 100 L y se disolvieron en 28 kg de DCM y se lavaron con una solución de 900 g de carbonato de potasio en 4,3 kg de agua. Después de 1 hora, se permitió que las capas se separaran y se eliminó la capa acuosa. La capa orgánica se lavó con 10 kg de agua, se separó y se secó sobre 3,5 kg de sulfato sódico. El DCM se filtró, se evaporó y se secó al vacío hasta 6,16 kg de NCP2 Ancla (114 % de rendimiento).
Síntesis de resina cargada con anclaje NCP2
En un reactor de síntesis en fase sólida de 75 L con una llave de paso de teflón se cargaron aproximadamente 52 l de NMP y 2300 g de resina de aminometil poliestireno. La resina se agitó en NMP para que se hinchara durante aproximadamente 2 horas y luego se drenó. La resina se lavó dos veces con aproximadamente 4 L de DCM por lavado, luego dos veces con 39 L de solución de neutralización por lavado y luego dos veces con 39 L de DCM por lavado. La solución de anclaje NCP2 se añadió lentamente a la solución de resina en agitación, se agitó durante 24 horas a temperatura ambiente y se drenó. La resina se lavó cuatro veces con 39 L de NMP por lavado y seis veces con 39 L de DCM por lavado. La resina se trató y agitó con A de la Solución de protección de d Ed C durante 30 minutos, se drenó y se trató y agitó con la 2da A de la Solución de protección de DEDC durante 30 minutos y se drenó. La resina se lavó seis veces con 39 L de DCM por lavado y luego se secó en un horno hasta un peso constante de 3573,71 g de Resina Cargada con Ancla.
Preparación de oligómero de morfolino utilizando NCP2 Ancla
Referencia 50 L Síntesis en fase sólida de Golodirsen (PMO#1) Sustancia farmacológica cruda
1. Materiales
Tabla 2: Materiales de partida
Figure imgf000038_0001
Estructuras químicas de los materiales de partida:
A. Cola EG3 activada
Figure imgf000039_0001
B. Subunidad C activada (para conocer la preparación, consulte la patente de EE. UU. Núm. 8.067.571)
Figure imgf000039_0002
C. Subunidad A activada (para conocer la preparación, consulte la patente de EE. UU. Núm. 8.067.571)
Figure imgf000039_0003
D. Subunidad DPG activada (para preparación, consulte WO 2009/064471)
Figure imgf000040_0001
E. Subunidad T activada (para preparación, consulte WO 2013/082551)
Figure imgf000040_0002
Tabla 3: Descripción de las soluciones para la síntesis de oligómeros en fase sólida del principio activo crudo golodirsen
Figure imgf000040_0003
Figure imgf000041_0001
2. Síntesis de referencia del fármaco crudo golodirsen
A. Hinchado de resina
Se cargaron 750 g de Resina Cargada con Ancla y 10,5 L de NMP en un reactor silanizado de 50 L y se agitó durante 3 horas. Se drenó el NMP y se lavó la Resina Cargada con Ancla dos veces con 5,5 L cada una de d Cm y dos veces con 5,5 L cada uno de 30% TFE/DCM.
B. Ciclo 0: Acoplamiento de cola EG3
La resina cargada con anclaje se lavó tres veces con 5,5 l cada una de TFE/DCM al 30 % y se drenó, se lavó con 5,5 l de solución de CYFTA durante 15 minutos y se drenó, y se lavó nuevamente con 5,5 l de solución de CYTFA durante 15 minutos sin drenar hasta lo cual Se cargaron 122 ml de NEM/DCM 1:1 y la suspensión se agitó durante 2 minutos y se drenó. La resina se lavó dos veces con 5,5 l de solución de neutralización durante 5 minutos y se drenó, luego dos veces con 5,5 l cada uno de DCM y se drenó. Se cargó en la resina una solución de 706,2 g de cola EG3 activada (MW 765,85) y 234 ml de NEM en 3 L de DMI, se agitó durante 3 horas a temperatura ambiente y se drenó. La resina se lavó dos veces con 5,5 L de solución de neutralización durante 5 minutos por cada lavado y una vez con 5,5 L de DCM y se drenó. Se cargó una solución de 374,8 g de anhídrido benzoico y 195 ml de NEM en 2680 ml de NMP, se agitó durante 15 minutos y se drenó. La resina se agitó con 5,5 L de solución de neutralización durante 5 minutos, luego se lavó una vez con 5,5 L de DCM y dos veces con 5,5 L cada una de TFE al 30 %/DCM. La resina se suspendió en 5,5 L de TFE/DCM al 30% y se mantuvo durante 14 horas.
C. Ciclos de acoplamiento de subunidades 1-30
i. Tratamientos de pre-acoplamiento
Antes de cada ciclo de acoplamiento como se describe en la Figura 18, la resina estaba: 1) lavado con 30% TFE/DCM; 2) a) tratada con solución de CYTFA durante 15 minutos y drenado, y b) tratada con solución de CYTFA durante 15 minutos a la que se le añadió NEM/DCM 1:1, agitó y drenó; 3) agitar tres veces con Solución de Neutralización; y 4) lavado dos veces con DCM. Consulte la figura 18.
ii. Tratamientos posteriores al acoplamiento
Después de drenar cada solución de subunidades como se describe en la Figura 18, la resina estaba: 1) lavado con DCM; y 2) lavado dos veces con 30% TFE/DCM. Si la resina se mantuvo durante un período de tiempo antes del siguiente ciclo de acoplamiento, el segundo lavado de TFE/DCM no se drenó y la resina se retuvo en dicha solución de lavado de TFE/d Cm . Consulte la figura 18.
iii. Ciclos de acoplamiento de subunidades activadas
Los ciclos de acoplamiento se realizaron como se describe en la Figura 18.
iv. Lavado final de alcohol isopropílico
Después de realizar el paso de acoplamiento final como se describe en la Figura 18, la resina se lavó 8 veces con 19,5 L cada una de IPA y se secó al vacío a temperatura ambiente durante aproximadamente 63,5 horas hasta un peso seco de 4857,9 g.
C. Escisión
El anterior principio activo bruto de golodirsen unido a resina se dividió en dos lotes, cada lote se trató como sigue. Un lote de resina de 1619,3 g: 1) se agitó con 10 l de NMP durante 2 h, luego se drenó el NMP; 2) se lavó tres veces con 10 L cada uno de 30% TFE/Dc M; 3) tratado con 10 L de solución CYTFA durante 15 minutos; y 4) 10 L de Solución CYTFA durante 15 minutos a los que luego se añadieron 130 ml 1:1 NEM/DCM y se agitó durante 2 minutos y se drenó. La resina se trató tres veces con 10 L de solución de neutralización cada una, se lavó seis veces con 10 L de DCM y ocho veces con 10 L de NMP cada una. La resina se trató con una solución de escisión de 1530,4 g DTT y 2980 DBU en 6,96 L. NMP durante 2 horas para separar el principio activo bruto de golodirsen de la resina. La solución de escisión se drenó y retuvo en un recipiente separado. El reactor y la resina se lavaron con 4,97 L de NMP que se combinó con la solución de escisión. D. Desprotección
La solución de escisión combinada y el lavado de NMP se transfirieron a un recipiente a presión al que se añadió 39,8 L de NH4OH (NH3^H2O) que se había enfriado a una temperatura de -10 °C a -25 °C en un congelador. El recipiente a presión se selló y se calentó a 45 °C durante 16 h, luego se dejó enfriar a 25 °C. Esta solución de desprotección que contenía el fármaco crudo Golodirsen se diluyó 3:1 con agua purificada y el pH se ajustó a 3,0 con ácido fosfórico 2 M, luego a pH 8,03 con NH4OH. HPLC: C1877,552 % y SCX-1073,768 %.
Purificación de referencia de sustancia farmacológica cruda de golodirsen (PMO#1)
La solución de desprotección de la parte D anterior, que contenía el fármaco crudo Golodirsen, se cargó en una columna de resina de intercambio aniónico ToyoPearl Super-Q 650S (Tosoh Bioscience) y se eluyó con un gradiente de 0-35 % de B en 17 volúmenes de columna (tampón A: hidróxido de sodio 10 mM; Tampón B: cloruro de sodio 1 M en hidróxido de sodio 10 mM) y fracciones de pureza aceptable (C18 y SCX HPLC) se agruparon en una solución de producto farmacéutico purificado. HPLC: 93,571% (C18) 88,270% (SCX).
La solución de sustancia farmacológica purificada se desalinizó y liofilizó hasta 1450,72 g de sustancia farmacológica purificada de Golodirsen. Rendimiento 54,56 %; HPLC: 93,531% (C18) 88,354% (SCX).
Tabla 5. Acrónimos
Figure imgf000042_0002
Conjugación CPP
Figure imgf000042_0001
2 rJrLOH
a. WCX y filtración SPE con
intercambio de ion cloruro
Procedimientos analíticos: Los espectros de masas de tiempo de vuelo de ionización por desorción láser asistida por matriz (MALDI-TOF-MS) se registraron en un Bruker AutoflexTM Speed, usando una matriz de ácido sinapínico (SA). La SCX-HPLC se realizó en un sistema Thermo Dionex UltiMate 3000 equipado con un detector de matriz de diodos 3000 y una columna ProPacTM SCX-20 (250 x 4 mm) con un caudal de 1,0 ml/min (pH = 2; la temperatura de la columna a 30 °C). Las fases móviles fueron A (acetonitrilo al 25 % en agua que contenía H3 PO4 24 mM) y B (acetonitrilo al 25 % en agua que contenía KCl 1 M y H3PO424 mM). Se empleó la elución en gradiente: 0 min, 35% B; 2 min, 35% B; 22 min, 80% B; 25 min, 80% B; 25,1 min, 35% B; 30 min, 35% B.
A una mezcla de PMO#1 (1,82 g, 0,177 mmol, recién secado por liofilización durante dos días), se añadió Hexatrifluoroacetato de Ac-L-Arg-L-Arg-L-Arg-L-Arg-L-Arg-L-Arg-Gly-OH (614,7 mg, 0,354 mmol) y 1-[bis(dimetilamino)metileno]- 1H-1,2,3-triazolo[4,5-6 dimetilsulfóxido (DMSO, 20 ml) de hexafluorofosfato de 3-óxido de ]piridinio (HATU, 134,4 mg, 0,354 mmol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 3 minutos, luego se añadió W,W-diisopropiletilamina (DIPEA, 68,5 mg, 0,530 mmol). Después de 5 minutos, la mezcla turbia se convirtió en una solución transparente. La reacción se controló mediante SCX-HPLC. Después de 2 horas, se añadieron 20 mL de una solución de hidróxido de amonio al 10% (NH3 al 2,8%). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas más. La reacción se terminó mediante la adición de 400 ml de agua. Se añadió trifluoroetanol (2,0 ml) a la solución.
La solución se dividió en dos porciones y cada porción se purificó mediante una columna WCX (10 g de resina por columna). Cada columna WCX se lavó primero con acetonitrilo al 20% en agua (v/v) para eliminar el material de partida PMO#1. Los lavados (225 ml para cada columna) se detuvieron cuando el análisis de espectro de masas MALDI-TOF mostró la ausencia de señal de PMO#1. A continuación, cada columna se lavó con agua (100 ml por columna). El producto deseado, PPMO#1, se eluyó con guanidina HCl 2,0 M (140 ml para cada columna). Las soluciones purificadas de PPMO#1 se juntaron y luego se dividieron en dos porciones y cada una se desalinizó mediante una columna SPE (10 g de resina para cada columna).
La columna de SPE se lavó primero con solución acuosa de NaCl 1,0 M (100 ml para cada columna) para generar la sal de hexaclorhidrato de PPMO#1. Luego, cada columna SPE se lavó con agua (200 ml para cada columna). El PPMO#1 desalinizado final se eluyó con acetonitrilo al 50 % en agua (v/v, 150 ml para cada columna). El acetonitrilo se eliminó mediante evacuación a presión reducida. La solución acuosa resultante se liofilizó para obtener el hexahidrocloruro de PPMO#1 conjugado deseado (1,93 g, 94,5% de rendimiento).
Ejemplo de referencia 1: PMO#1
Utilizando el protocolo del método B de síntesis de PMO descrito anterior , se sintetizó PMO#1:
Figure imgf000043_0001
donde cada Nu de 1 a 25 y de 5' a 3' es:
Figure imgf000043_0002
donde A es
Figure imgf000044_0001
HPLC: 71,85%; Condiciones: Dionex DNAPac (DNX#97) Gradiente: 75%A 20%B 5%C a 0 min; 50%A a los 20 minutos; 25%A 75%C a los 21 min; Fase móvil A: NaOH 10 mM/NaCl 20 mM; C: NaOH 10 mM/NaCl 0,5 M. Temperatura de la columna: 45C; Caudal 1,0 ml/min.
E je m p lo 2: P P M O #1
Utilizando el protocolo descrito anteriormente, se sintetizó PPMO#1 a partir de PMO#1:
Figure imgf000044_0002
Figure imgf000044_0004
donde A es
Figure imgf000044_0003
E je m p lo 3: O m is ió n del exon 53 in vitro (m io b la s to s )
Dos compuestos que se dirigen al exón 53 de la distrofina humana (DMD) como se describe en la siguiente tabla, PMO#1 y PPMO#1 que contienen la misma secuencia, se evaluaron para DMD omisión del exón 53 en mioblastos humanos sanos.
Secuencias de PMO#1 y PPMO#1 para humanos DMD exón 53.
Figure imgf000045_0002
Específicamente, se cultivaron mioblastos humanos sanos (pasaje 5-6, SKB-F-SL adquiridos de Zen-Bio, Inc.) con una confluencia de ~40% cuando se trataron con PMO#1 o PPMO#1 en varias concentraciones (es decir, 40 pm, 20 pm, 10 pm, 5 pm, 2,5 pm y 1,25 pm) en medios SKM-M (Zen-Bio, Inc.). Después de noventa y seis horas de incubación, los mioblastos se lavaron con PBS y se lisaron con tampón de lisis RA1 en el kit Illustra GE RNAspin 96 (Cat#25-055-75, GE Healthcare Bio-Sciences). El ARN total se aisló según las recomendaciones del fabricante, excepto que se usaron 40 ml de agua libre de ARNasa para eluir el ARN.
Para determinar la omisión del exón 53 por parte de ambos compuestos, se realizó una RT-PCR de punto final en dos pasos. Específicamente, once microlitros de ARN total se transcribieron primero de forma inversa a ADNc mediante el kit de síntesis de primera cadena SuperScript IV (Núm. de catálogo 18091200, Invitrogen) utilizando hexámeros aleatorios según las instrucciones del fabricante. La PCR se realizó agregando 9 ml de cDNA en Platinum Taq DNA polimerasa PCR Supermix High Fidelity (Núm. de catálogo 12532024, Invitrogen) con cebadores dirigidos a unión de los exones 51/52 y 54 DMD humanos (cebador directo: (SEQ ID NO: 5): CATCAAGCAGAAG- GCAACAA; cebador reverso: (SEQ ID NO: 6): GAAGTTTCAGGGCCAAGTCA). La amplificación por PCR se realizó utilizando un termociclador en tiempo real BioRad CFX96 utilizando el programa que se muestra en la Tabla 2. La expresión de los productos de PCR omitidos o no omitidos se evaluó cargando 32 ml de producto de PCR en el sistema LabChip GX utilizando el kit de reactivos de alta sensibilidad de ADN (CLS760672, Perkin Elmer). El porcentaje de omisión de exón 53 DMD se calcula como el porcentaje de la molaridad (nmol/1) de la banda omitida del exón 53 (201 pb) en comparación con la suma de la molaridad de las bandas omitidas (201 pb) y no omitidas (413 pb).
Se utilizó la prueba t de Student no pareada de dos colas (homoscedástica) para evaluar si las medias de los 2 grupos son estadísticamente diferentes entre sí en cada dosis. PAGS-valor < 0,05 se considera estadísticamente significativo.
Programa termociclador utilizado para amplificar DMD amplicones con o sin salto del exón 53.
Figure imgf000045_0003
Los resultados se presentan en la siguiente tabla y en la Figura 4. En la Figura 4, las barras de error presentan media ± SD, "[Número] X" encima de las barras indica un cambio relativo en el porcentaje de omisión de exón por parte de PPMO#1 en comparación con PMO#1 en cada concentración, y "*" indica una diferencia significativa entre PMO#1 y PPMO#1 con un valor de p < 0,05.
Porcentaje de DMD Omisión del exón 53 por PMO#1 y PPMO#1 en mioblastos humanos.
Figure imgf000045_0001
Los datos de la tabla anterior y en a Figura 4 muestran sorprendentemente que una omisión del exón 53 significativamente mayor da como resultado mioblastos cuando las células se tratan con PPMO#1 en comparación con PMO#1 en todas las concentraciones, cuyo grado es inesperado. Es probable que esta mejora significativa se demuestre aún más en una prueba comparativa in vivo como el estudio de primates no humanos (n Hp , por sus siglas en inglés) del Ejemplo 5 donde los NHP se tratan con PPMO#1 o PMO#1 y se mide la omisión del exón 53 en varios tejidos musculares relevantes (consulte el Ejemplo 5 para obtener detalles). Además, debido a que PPMO#1 se descompone en el medio SKM-M utilizado en este ejemplo (datos no mostrados) en la escala de tiempo de este estudio, el estudio NHP puede demostrar una mejora aún mayor que la demostrada en este ejemplo.
Ejemplo de referencia 4: Estudio de ratones MDX
El ratón mdx es un modelo animal aceptado y bien caracterizado para la distrofia muscular de Duchene (DMD) que contiene una mutación en el exón 23 del gen de la distrofina. La secuencia antisentido de M23D (SEQ ID NO: 2) se sabe que induce la omisión del exón 23 y restaura la expresión funcional de distrofina. A los ratones MDX de 6-7 semanas de edad se les administró una única inyección en la vena de la cola de PPMO4225 o PMO4225 de la tabla siguiente a una dosis de 40 mg/kg, o con solución salina.
Figure imgf000046_0003
PMO4225 y PPMO4225 se prepararon cada uno mediante el Método A de PMO y los métodos de conjugación CPP descritos anteriormente.
Los ratones tratados se sacrificaron a los 7, 30, 60 y 90 días después de la inyección de dosis única (n=6 por grupo). El diafragma, el corazón y el cuádriceps derecho se procesaron para análisis de transferencia Western para medir la producción de proteína distrofina y análisis de RT-PCR para medir el porcentaje de omisión de exón, y el cuádriceps izquierdo se procesó para inmunohistoquímica y tinción H/E como se describió anteriormente.
La restauración de la proteína distrofina se cuantificó mediante transferencia Western, y el porcentaje de omisión del exón 23 se midió mediante RT-PCR, cada uno como se describió anteriormente.
Los resultados de RT-PCR y Western Blot se muestran en las Figuras 5A-10B y en las tablas a continuación. Sorprendentemente, PPMO4225 indujo niveles significativamente más altos y sostenidos de restauración de distrofina y omisión del exón 23 en comparación con PMO4225, y los niveles más altos se produjeron 30 días después de la inyección. Aún más sorprendente, PPMO4225 aumentó los niveles de distrofina en el corazón cuando PMO4225 no lo hizo; no se observaron distrofina ni omisión de exón en el corazón en todos los puntos temporales con PMO4225.
Figure imgf000046_0001
Figure imgf000046_0002
Los resultados de la inmunohistoquímica se muestran en la Figura 11. Aquí, PPMO4225 restaura la distrofina en todo el cuádriceps, mientras que 4225 produce un patrón de expresión "parcheado". La distribución uniforme de la distrofina con el tratamiento con PPMO4225 indica que se puede lograr una orientación generalizada del músculo esquelético. PPMO4225 ha mejorado significativamente la entrega con respecto a PMO4225 in vivo.
Ejemplo 5: Omisión del exón 53 en NHP
Para demostrar aún más la eficacia de la omisión de exón de los oligómeros antisentido de PPMO, se utilizan primates no humanos. Específicamente, a los monos cynomolgus que tienen tejidos musculares intactos se les inyecta por vía intravenosa PPMO#1, PMO#1 (del Ejemplo 3) o solución salina de acuerdo con el programa de dosificación de la siguiente tabla:
Horario de dosificación de Cynomolgus
Figure imgf000047_0001
Se observarán los animales durante todo el estudio, incluidas las observaciones clínicas (por ejemplo, evaluación de la piel y el pelaje, efectos respiratorios) y mediciones del peso corporal. Se tomarán muestras de sangre y orina al menos antes de que comience la prueba y 24 horas después de la primera y la última dosis (cuando corresponda).
En cada necropsia programada, o eutanasiado in extremis, se recogen y se congelan secciones de diafragma, músculo liso del duodeno, esófago y aorta, cuádriceps, deltoides, bíceps y corazón. El porcentaje de omisión del exón 53 se determina usando RT-PCR como se describe anteriormente.
Ejemplo de referencia 6: Estudio de respuesta a la dosis en ratones MDX
Ratones MDX de 6-7 semanas de edad a los que se les administró una única inyección en la vena de la cola de PPMO4225 o PMO4225 descrito anteriormente a una dosis de 40 mg/kg, 80 mg/kg o 120 mg/kg (n=6 por grupo).
Los ratones tratados se sacrificaron 30 días después de la inyección. El diafragma, el cuádriceps y el corazón se procesaron para análisis de transferencia Western para medir la producción de proteína distrofina en base al protocolo de transferencia Western descrito anteriormente (usado, por ejemplo, en el Ejemplo 4) con las siguientes modificaciones:
Figure imgf000047_0002
La restauración de la proteína distrofina como % de tipo silvestre se presenta en la siguiente tabla y en las Figuras 12-15.
Figure imgf000048_0001
Sorprendentemente, los datos muestran que una sola dosis de PPMO4225 aumenta los niveles de distrofina de manera dependiente de la dosis en ratones mdx de manera significativa y sustancialmente mayor que PMO4225.
Ejemplo de referencia 7: Estudio IHC de ratón MDX de diafragma y corazón
A los ratones MDX de 6-7 semanas de edad se les administró una única inyección en la vena de la cola de PPMO4225 a una dosis de 80 mg/kg o solución salina, y a los ratones de tipo silvestre de 6-7 semanas de edad se les administró una única inyección de solución salina. Los ratones mdx tratados, los ratones mdx con solución salina y los ratones de tipo silvestre se sacrificaron 30 días después de la inyección de dosis única (n=4 por grupo). Los resultados de la inmunohistoquímica se muestran en la Figura 19. Aquí, los resultados muestran un aumento uniforme de distrofina en tejidos asociados con morbilidad y mortalidad en Dm D en ratones mdx tratados con PPMO4225.
Ejemplo 8: Omisión del exón 53 in vitro (miotubos)
Dos compuestos que se dirigen a la distrofina humana (DMD) el exón 53 como se describe en la siguiente tabla, PMO#1 y PPMO#1 que contienen la misma secuencia, se evaluaron para DMD Salto del exón 53 en miotubos humanos sanos.
Secuencias de PMO#1 y PPMO#1 para humanos DMD exón 53.
Figure imgf000048_0002
Específicamente, se cultivaron mioblastos humanos sanos (pasaje 5-6, SKB-F-SL adquiridos de Zen-Bio, Inc.) para alcanzar una confluencia del 80-90 % en medios SKM-M antes del inicio de la diferenciación mediante incubación en medios bajos en suero (SKM-D, Zen-Bio, Inc.) Cinco días después de la diferenciación, se incubaron miotubos maduros con los compuestos anteriores en varias concentraciones (es decir, 40 pm, 20 pm, 10 pm, 5 pm, 2,5 pm y 1,25 pm). Después de noventa y seis horas de incubación, los miotubos se lavaron con PBS y se lisaron con tampón de lisis RLT del kit RNeasy Micro (Cat#74004, Qiagen). El ARN total se aisló según las recomendaciones del fabricante, excepto que se usaron 20 ml de agua libre de ARNasa para eluir el ARN.
Para determinar la omisión del exón 53 por parte de ambos compuestos, se realizó una RT-PCR de punto final en dos pasos. Específicamente, siete microlitros de ARN total primero se transcribieron inversamente a ADNc mediante el kit de síntesis de primera cadena SuperScript IV (n.° de catálogo 18091200, Invitrogen) utilizando hexámeros aleatorios según las instrucciones del fabricante. La PCR se realizó agregando 5 ml de cDNA en Platinum Taq DNA polimerasa PCR Supermix High Fidelity (Núm. de catálogo 12532024, Invitrogen) con cebadores dirigidos a la unión 51/52 de los exones DMD humanos y 54 (cebador directo: CAT CAA GCA GAA GGC AAC AA; cebador reverso: GAA GTT TCA GGG CCA AGT CA). La amplificación por PCR se realizó utilizando un termociclador en tiempo real BioRad CFX96 utilizando el programa que se muestra en la Tabla 2. La expresión de los productos de PCR omitidos o no omitidos se evaluó cargando 32 ml de producto de PCR en el sistema LabChip GX utilizando el kit de reactivos de alta sensibilidad de ADN (CLS760672, Perkin Elmer). El porcentaje de omisión del exón 53 de DMD se calcula como el porcentaje de la molaridad (nmol/1) de la banda omitida del exón 53 (201 pb) en comparación con la suma de la molaridad de las bandas omitidas (201 pb) y no omitidas (413 pb).
Se utilizó la prueba t de Student no pareada de dos colas (homoscedástica) para evaluar si las medias de los 2 grupos son estadísticamente diferentes entre sí en cada dosis. El valor de p < 0,05 se considera estadísticamente significativo. Programa termociclador utilizado para amplificar amplicones DMD con o sin salto del exón 53.
Figure imgf000049_0002
Los resultados se presentan en la siguiente tabla y en la Figura 20. En figura 20, las barras de error presentan la media ± SD, "[Número] x" indica un cambio relativo en el porcentaje de omisión de exón por PPMO#1 en comparación con PMO#1 en cada concentración, y "*", "**" indican una diferencia significativa entre PMO #1 y PPMO#1 con valor p < 0,05 o 0,005, respectivamente.
Porcentaje de omisión del exón 53 DMD por PMO#1 y PPMO#1 en miotubos humanos.
Figure imgf000049_0001
Los datos de la tabla anterior y de la Figura 20 muestran sorprendentemente que una omisión del exón 53 significativamente mayor da como resultado miotubos cuando las células se tratan con PPMO#1 en comparación con PMO#1 al menos a concentraciones de 5 mm y 10 mm, cuyo grado es inesperado. Es probable que esta mejora significativa se demuestre aún más en una prueba comparativa in vivo tal como el estudio de primates no humanos (NHP) del Ejemplo 5 donde los NHP se tratan con PPMO#1 o PMO#1 y se mide la omisión del exón 53 en varios tejidos musculares relevantes (ver el Ejemplo 5 para más detalles). Además, debido a que PPMO#1 se descompone en el medio SKM-M utilizado en este ejemplo (datos no mostrados) en la escala de tiempo de este estudio, el estudio NHP puede demostrar una mejora aún mayor que la demostrada en este ejemplo.
Referencias
Aartsma-Rus, A., A. A. Janson, et al. (2004). "Antisense-induced multiexon skipping for Duchenne muscular dystrophy makes more sense." Am J Hum Genet 74(1): 83-92. Abes, R., et al. (2008). "Arginine-rich cell penetrating peptides: design, structure-activity, and applications to alter pre-mRNA splicing by steric-block oligonucleotides." J Pept. Sci. 14: 455-460. Alter, J., et al. (2006). "Systemic delivery of morpholino oligonucleotide restores dystrophin expression bodywide and improves dystrophic pathology." Nat. Med. 12(2): 175-177.
Bestas, B., et al. (2014). "Splice-correcting ligonucleotides restore BTK function in X-linked agammaglobuline- mia model." J. Clin. Invest.
Cirak, S., V. Arechavala-Gomeza, et al. (2011). "Exon skipping and dystrophin restoration in patients with Duchenne muscular dystrophy after systemic phosphorodiamidate morpholino oligomer treatment: an open-label, phase 2, doseescalation study." Lancet 378(9791): 595-605.
Dunckley, M. G., I. C. Eperon, et al. (1997). "Modulation of splicing in the DMD gene by antisense oligoribo- nucleotides." Nucleosides & Nucleotides 16(7-9): 1665-1668.
Dunckley, M. G., M. Manoharan, et al. (1998). "Modification of splicing in the dystrophin gene in cultured Mdx muscle cells by antisense oligoribonucleotides." Hum Mol Genet 7(7): 1083-90.
Errington, S. J., C. J. Mann, et al. (2003). "Target selection for antisense oligonucleotide induced exon skipping in the dystrophin gene." J Gene Med 5(6): 518-27.
Goemans, N. M., M. Tulinius, et al. (2011). "Systemic Administraron of PR0051 in Duchenne's Muscular Dys- trophy." N Engl J Med.
Jearawiriyapaisarn, N., H. M. Moulton, et al. (2008). "Sustained Dystrophin Expression Induced by Peptide- conjugated Morpholino Oligomers in the Muscles of mdx Mice." Mol Ther.
Jearawiriyapaisarn, N., et al. (2010). "Long-term improvement in mdx cardiomyopathy after therapy with peptideconjugated morpholino oligomers." Cardiovascular Research 85: 444-453.
Kinali, M., V. Arechavala-Gomeza, et al. (2009). "Local restoration of dystrophin expression with the morpholino oligomer AVI-4658 in Duchenne muscular dystrophy: a single-blind, placebo-controlled, dose-escalation, proof-of-con- cept study." Lancet Neurol 8(10): 918-28.
Leblue, B., et al. (2008). "Cell penetrating peptide conjugates of steric block oligonucleotides." Adv. Drug Deliv. Rev. 60: 517-529.
Lu, Q. L., C. J. Mann, et al. (2003). "Functional amounts of dystrophin produced by skipping the mutated exon in the mdx dystrophic mouse." Nat Med 9(8): 1009-14.
Mann, C. J., K. Honeyman, et al. (2002). "Improved antisense oligonucleotide induced exon skipping in the mdx mouse model of muscular dystrophy." J Gene Med 4(6): 644-54.
Marshall, N. B., S. K. Oda, et al. (2007). "Arginine-rich cell-penetrating peptides facilitate delivery of antisense oligomers into murine leukocytes and alter pre-mRNA splicing." Journal of Immunological Methods 325(1-2): 114-126.
Matsuo, M., T. Masumura, et al. (1991). "Exon skipping during splicing of dystrophin mRNA precursor due to an intraexon deletion in the dystrophin gene of Duchenne muscular dystrophy kobe." J Clin Invest 87(6): 2127-31.
McClory, G., et al. (2006). "Antisense oligonucleotide-induced exon skipping restored dystrophin expression in vitro in a canine model of DMD." Gene Therapy 13: 1373-1381.
Monaco, A. P., C. J. Bertelson, et al. (1988). "An explanation for the phenotypic differences between patients bearing partial deletions of the DMD locus." Genomics 2(1): 90-5.
Moulton, H.M., (2007). "Cell-penetrating peptide-morpholino conjugates alter pre-mRNA splicing of DMD (Duch- enne muscular dystrophy) and inhibit murine coronavirus replication in vivo." Biochem. Society Trans 35(4): 826-828.
Pramono, Z. A., Y. Takeshima, et al. (1996). "Induction of exon skipping of the dystrophin transcript in lym- phoblastoid cells by transfecting an antisense oligodeoxynucleotide complementary to an exon recognition sequence." Biochem Biophys Res Commun 226(2): 445-9.
Sazani, P., R. Kole, et al. (2007). Splice switching oligomers for the TNF superfamily receptors and their use in treatment of disease. PCT WO2007058894, University of North Carolina
Sierakowska, H., M. J. Sambade, et al. (1996). "Repair of thalassemic human beta-globin mRNA in mammalian cells by antisense oligonucleotides." Proc Natl Acad Sci U S A 93(23): 12840-4.
Summerton, J. and D. Weller (1997). "Morpholino antisense oligomers: design, preparation, and properties." Antisense Nucleic Acid Drug Dev 7(3): 187-95.
Takeshima, Y., H. Nishio, et al. (1995). "Modulation of in vitro splicing of the upstream intron by modifying an intra-exon sequence which is deleted from the dystrophin gene in dystrophin Kobe." J Clin Invest 95(2): 515-20.
van Deutekom, J. C., M. Bremmer-Bout, et al. (2001). "Antisense-induced exon skipping restores dystrophin expression in DMD patient derived muscle cells." Hum Mol Genet 10(15): 1547-54.
van Deutekom, J. C., A. A. Janson, et al. (2007). "Local dystrophin restoration with antisense oligonucleotide PRO051." N Engl J Med 357(26): 2677-86.
Wilton, S. D., A. M. Fall, et al. (2007). "Antisense oligonucleotide-induced exon skipping across the human dystrophin gene transcript." Mol Ther 15(7): 1288-96.

Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Un conjugado de oligómero antisentido de Fórmula (IV):
Figure imgf000052_0001
2. El conjugado de oligómero antisentido de acuerdo con la reivindicación 1, donde el oligómero antisentido tiene la fórmula (IVA):
Figure imgf000052_0002
3. Una composición farmacéutica que comprende un conjugado de oligómero antisentido de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
4. El conjugado de oligómero antisentido o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo de la reivindicación 1 ó 2, para usarse en terapia.
5. El conjugado de oligómero antisentido o su sal farmacéuticamente aceptable de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, o la composición farmacéutica de la reivindicación 3, para usarse en el tratamiento de la distrofia muscular de Duchenne (DMD) en un sujeto que lo necesite, donde el sujeto tiene una mutación del gen de la distrofina que es susceptible a la omisión del exón 53.
6. El conjugado de oligómero antisentido o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, o la composición farmacéutica de la reivindicación 3, para usarse en la restauración de un marco de lectura de ARNm para inducir la producción de distrofina en un sujeto que tiene una mutación del gen de la distrofina que es susceptible de omisión del exón 53.
7. El conjugado de oligómero antisentido o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, o la composición farmacéutica, para uso de acuerdo con la reivindicación 5 ó 6, donde el usarse comprende administrar semanalmente el conjugado de oligómero antisentido.
8. El conjugado de oligómero antisentido o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o la composición farmacéutica, para uso de acuerdo con la reivindicación 5 ó 6, donde el usarse comprende administrar el conjugado de oligómero antisentido cada dos semanas.
9. El conjugado de oligómero antisentido o su sal farmacéuticamente aceptable, o la composición farmacéutica, para uso de acuerdo con la reivindicación 5 ó 6, donde el usarse comprende administrar el conjugado de oligómero antisentido cada tres semanas.
10. El conjugado de oligómero antisentido o su sal farmacéuticamente aceptable, o la composición farmacéutica, para uso de acuerdo con la reivindicación 5 ó 6, donde el usarse comprende administrar el conjugado de oligómero antisentido mensualmente.
11. El conjugado de oligómero antisentido o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o la composición farmacéutica, para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4-10, donde el usarse comprende administrar el conjugado de oligómero antisentido a una dosis seleccionada entre (i) aproximadamente 30 mg/kg; (ii) aproximadamente 40 mg/kg; (iii) aproximadamente 60 mg/kg; (iv) aproximadamente 80 mg/kg; y (v) aproximadamente 160 mg/kg.
12. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 3 para usarse en la exclusión del exón 53 del pre-ARNm de distrofina durante el procesamiento del ARNm en un sujeto que tiene una mutación del gen de la distrofina que es susceptible de omitir el exón 53.
13. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 3 para usarse en la unión del exón 53 del pre-ARNm de distrofina en un sujeto que tiene una mutación del gen de la distrofina que es susceptible de omitir el exón 53.
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Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI541024B (zh) 2010-09-01 2016-07-11 日本新藥股份有限公司 反義核酸
AU2017269355B2 (en) 2016-05-24 2021-04-15 Sarepta Therapeutics, Inc. Processes for preparing oligomers
US11472824B2 (en) 2016-05-24 2022-10-18 Sarepta Therapeutics, Inc. Processes for preparing phosphorodiamidate morpholino oligomers
DK4122497T3 (da) 2016-12-19 2024-06-10 Sarepta Therapeutics Inc Exonskipping-oligomerkonjugater til muskeldystrofi
DK3554552T3 (da) 2016-12-19 2022-10-24 Sarepta Therapeutics Inc Exon-skipping-oligomerkonjugater mod muskeldystrofi
EA201991450A1 (ru) * 2017-09-22 2019-12-30 Сарепта Терапьютикс, Инк. Конъюгаты олигомеров для пропуска экзона при мышечной дистрофии
US10758629B2 (en) 2018-05-29 2020-09-01 Sarepta Therapeutics, Inc. Exon skipping oligomer conjugates for muscular dystrophy
GB201821269D0 (en) 2018-12-28 2019-02-13 Nippon Shinyaku Co Ltd Myostatin signal inhibitor
US20220296633A1 (en) * 2019-06-19 2022-09-22 Sarepta Therapeutics, Inc. Methods for treating muscular dystrophy
US20230174979A1 (en) * 2019-10-09 2023-06-08 Children’S Medical Center Corporation Methods and compositions for treating ataxia telangiectasia
MX2022007937A (es) 2019-12-26 2022-07-27 Nippon Shinyaku Co Ltd Acido nucleico antisentido que induce la omision del exon 50.
IL295967A (en) 2020-02-28 2022-10-01 Nippon Shinyaku Co Ltd Antisense nucleic acids for splicing on exon 51
IL309626A (en) 2021-06-23 2024-02-01 Nippon Shinyaku Co Ltd A combination of antisense oligomers
EP4368176A1 (en) 2021-07-08 2024-05-15 Nippon Shinyaku Co., Ltd. Nephrotoxicity reducing agent
CA3225454A1 (en) 2021-07-08 2023-01-12 Nippon Shinyaku Co., Ltd. Nephrotoxicity reducing agent
TW202317147A (zh) 2021-07-08 2023-05-01 日商日本新藥股份有限公司 析出抑制劑
WO2023178230A1 (en) 2022-03-17 2023-09-21 Sarepta Therapeutics, Inc. Phosphorodiamidate morpholino oligomer conjugates

Family Cites Families (105)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CH445129A (fr) 1964-04-29 1967-10-15 Nestle Sa Procédé pour la préparation de composés d'inclusion à poids moléculaire élevé
US3459731A (en) 1966-12-16 1969-08-05 Corn Products Co Cyclodextrin polyethers and their production
US3453257A (en) 1967-02-13 1969-07-01 Corn Products Co Cyclodextrin with cationic properties
US3426011A (en) 1967-02-13 1969-02-04 Corn Products Co Cyclodextrins with anionic properties
US3453259A (en) 1967-03-22 1969-07-01 Corn Products Co Cyclodextrin polyol ethers and their oxidation products
US4235871A (en) 1978-02-24 1980-11-25 Papahadjopoulos Demetrios P Method of encapsulating biologically active materials in lipid vesicles
US5166315A (en) 1989-12-20 1992-11-24 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US5521063A (en) 1985-03-15 1996-05-28 Antivirals Inc. Polynucleotide reagent containing chiral subunits and methods of use
DE3650699T2 (de) 1985-03-15 1999-04-15 Antivirals Inc Immunotestmittel für Polynukleotid und Verfahren
US5034506A (en) 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
US5506337A (en) 1985-03-15 1996-04-09 Antivirals Inc. Morpholino-subunit combinatorial library and method
US5217866A (en) 1985-03-15 1993-06-08 Anti-Gene Development Group Polynucleotide assay reagent and method
US4737323A (en) 1986-02-13 1988-04-12 Liposome Technology, Inc. Liposome extrusion method
KR0166088B1 (ko) 1990-01-23 1999-01-15 . 수용해도가 증가된 시클로덱스트린 유도체 및 이의 용도
US5539082A (en) 1993-04-26 1996-07-23 Nielsen; Peter E. Peptide nucleic acids
US5714331A (en) 1991-05-24 1998-02-03 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having enhanced binding affinity, sequence specificity and solubility
US5719262A (en) 1993-11-22 1998-02-17 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having amino acid side chains
CA2140343A1 (en) 1992-07-17 1994-02-03 Sean M. Sullivan Method and reagent for treatment of animal diseases
CA2162361C (en) 1993-05-11 2008-10-21 Ryszard Kole Antisense oligonucleotides which combat aberrant splicing and methods of using the same
US5753613A (en) 1994-09-30 1998-05-19 Inex Pharmaceuticals Corporation Compositions for the introduction of polyanionic materials into cells
US5820873A (en) 1994-09-30 1998-10-13 The University Of British Columbia Polyethylene glycol modified ceramide lipids and liposome uses thereof
US5885613A (en) 1994-09-30 1999-03-23 The University Of British Columbia Bilayer stabilizing components and their use in forming programmable fusogenic liposomes
IL115849A0 (en) 1994-11-03 1996-01-31 Merz & Co Gmbh & Co Tangential filtration preparation of liposomal drugs and liposome product thereof
US6794499B2 (en) 1997-09-12 2004-09-21 Exiqon A/S Oligonucleotide analogues
US7572582B2 (en) 1997-09-12 2009-08-11 Exiqon A/S Oligonucleotide analogues
WO1999042091A2 (en) 1998-02-19 1999-08-26 Massachusetts Institute Of Technology Use of polycations as endosomolytic agents
US6683173B2 (en) 1998-04-03 2004-01-27 Epoch Biosciences, Inc. Tm leveling methods
US6210892B1 (en) 1998-10-07 2001-04-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Alteration of cellular behavior by antisense modulation of mRNA processing
JP2000125448A (ja) 1998-10-14 2000-04-28 Yazaki Corp 電気接続箱
JP2000256547A (ja) 1999-03-10 2000-09-19 Sumitomo Dow Ltd 耐熱性プラスチックカード用樹脂組成物
US7084125B2 (en) 1999-03-18 2006-08-01 Exiqon A/S Xylo-LNA analogues
ATE356824T1 (de) 1999-05-04 2007-04-15 Santaris Pharma As L-ribo-lna analoge
JP2000325085A (ja) 1999-05-21 2000-11-28 Masafumi Matsuo デュシェンヌ型筋ジストロフィー治療剤
WO2001047496A1 (en) 1999-12-29 2001-07-05 Mixson A James Histidine copolymer and methods for using same
US7070807B2 (en) 1999-12-29 2006-07-04 Mixson A James Branched histidine copolymers and methods for using same
US6653467B1 (en) 2000-04-26 2003-11-25 Jcr Pharmaceutical Co., Ltd. Medicament for treatment of Duchenne muscular dystrophy
US6727355B2 (en) 2000-08-25 2004-04-27 Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. Pharmaceutical composition for treatment of Duchenne muscular dystrophy
EP1191097A1 (en) 2000-09-21 2002-03-27 Leids Universitair Medisch Centrum Induction of exon skipping in eukaryotic cells
AU2002334307A1 (en) 2001-09-04 2003-03-18 Exiqon A/S Novel lna compositions and uses thereof
KR100464261B1 (ko) 2002-01-24 2005-01-03 주식회사 파나진 Ｐｎａ 올리고머를 합성하기 위한 신규한 단량체 및 그의제조방법
KR20030084444A (ko) 2002-04-26 2003-11-01 주식회사 파나진 Ｐｎａ 올리고머를 합성하기 위한 신규한 단량체 및 그의제조방법
US7569575B2 (en) 2002-05-08 2009-08-04 Santaris Pharma A/S Synthesis of locked nucleic acid derivatives
WO2004043978A2 (en) 2002-11-05 2004-05-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-methoxy substituted oligomeric compounds and compositions for use in gene modulations
JP4777777B2 (ja) 2002-11-25 2011-09-21 雅文 松尾 ｍＲＮＡ前駆体のスプライシングを修飾するＥＮＡ核酸医薬
AU2003225410A1 (en) 2003-03-21 2004-10-11 Academisch Ziekenhuis Leiden Modulation of exon recognition in pre-mrna by interfering with the secondary rna structure
WO2004097017A2 (en) 2003-04-29 2004-11-11 Avi Biopharma, Inc. Compositions for enhancing transport and antisense efficacy of nucleic acid analog into cells
US7211668B2 (en) 2003-07-28 2007-05-01 Panagene, Inc. PNA monomer and precursor
EP3228711A1 (en) 2004-06-28 2017-10-11 The University Of Western Australia Antisense oligonucleotides for inducing exon skipping and methods of use thereof
JP2008538500A (ja) 2005-04-22 2008-10-30 アカデミス ツィーケンホイス ライデン ＳＲタンパク質の結合に対する干渉とＲＮＡ二次構造に対する干渉による、ｍＲＮＡ前駆体におけるエクソン認識の調節
US8067571B2 (en) 2005-07-13 2011-11-29 Avi Biopharma, Inc. Antibacterial antisense oligonucleotide and method
CA2629323A1 (en) 2005-11-10 2007-05-24 The University Of North Carolina At Chapel Hill Splice switching oligomers for tnf superfamily receptors and their use in treatment of disease
WO2007133105A1 (en) 2006-05-17 2007-11-22 Svetlana Anatolevna Sokolova Transport means
US20100016215A1 (en) 2007-06-29 2010-01-21 Avi Biopharma, Inc. Compound and method for treating myotonic dystrophy
US20090099066A1 (en) 2007-06-29 2009-04-16 Avi Biopharma, Inc. Tissue specific peptide conjugates and methods
CN101790385A (zh) 2007-07-12 2010-07-28 普罗森那技术公司 用于使化合物靶向多种选定器官、组织或肿瘤细胞的分子
PT2203173E (pt) 2007-10-26 2016-03-15 Academisch Ziekenhuis Leiden Resumo
US8076476B2 (en) 2007-11-15 2011-12-13 Avi Biopharma, Inc. Synthesis of morpholino oligomers using doubly protected guanine morpholino subunits
US8299206B2 (en) 2007-11-15 2012-10-30 Avi Biopharma, Inc. Method of synthesis of morpholino oligomers
BRPI0819828A8 (pt) 2007-11-15 2022-12-27 Avi Biopharma Inc Processo de síntese de oligômeros de morfolino
WO2009127230A1 (en) 2008-04-16 2009-10-22 Curevac Gmbh MODIFIED (m)RNA FOR SUPPRESSING OR AVOIDING AN IMMUNOSTIMULATORY RESPONSE AND IMMUNOSUPPRESSIVE COMPOSITION
EP2119783A1 (en) 2008-05-14 2009-11-18 Prosensa Technologies B.V. Method for efficient exon (44) skipping in Duchenne Muscular Dystrophy and associated means
US8084601B2 (en) * 2008-09-11 2011-12-27 Royal Holloway And Bedford New College Royal Holloway, University Of London Oligomers
CN105779453A (zh) * 2008-10-24 2016-07-20 萨雷普塔治疗公司 用于dmd的多外显子跳跃组合物
SI2607484T1 (sl) 2008-10-27 2016-11-30 Biomarin Technologies B.V. Metode in sredstva za učinkovito preskakovanje eksona 45 v pre-mRNA Duchennove mišične distrofije
WO2010064146A2 (en) 2008-12-02 2010-06-10 Chiralgen, Ltd. Method for the synthesis of phosphorus atom modified nucleic acids
PL2417257T3 (pl) 2009-04-10 2016-11-30 Antysensowne oligonukleotydy tricyklo-dna, kompozycje i sposoby leczenia choroby
CN102459595A (zh) 2009-04-24 2012-05-16 普罗森那技术公司 用于治疗dmd的包含肌苷的寡核苷酸
KR101885383B1 (ko) 2009-07-06 2018-08-03 웨이브 라이프 사이언시스 리미티드 신규한 핵산 프로드러그 및 그의 사용 방법
US8470987B2 (en) 2009-09-16 2013-06-25 Chiralgen, Ltd. Protective group for synthesis of RNA and derivative
JP5963678B2 (ja) 2009-11-12 2016-08-03 ジ ユニバーシティ オブ ウェスタン オーストラリア 病状を治療するためのアンチセンス分子及び方法
TWI541024B (zh) * 2010-09-01 2016-07-11 日本新藥股份有限公司 反義核酸
EP2620428B1 (en) 2010-09-24 2019-05-22 Wave Life Sciences Ltd. Asymmetric auxiliary group
JP2014507143A (ja) 2011-02-08 2014-03-27 ザ シャーロット−メクレンバーグ ホスピタル オーソリティ ドゥーイング／ビジネス／アズ キャロライナズ ヘルスケア システム アンチセンスオリゴヌクレオチド
US9161948B2 (en) * 2011-05-05 2015-10-20 Sarepta Therapeutics, Inc. Peptide oligonucleotide conjugates
CA3092114A1 (en) * 2011-05-05 2012-11-08 Sarepta Therapeutics, Inc. Peptide oligonucleotide conjugates
US9607308B2 (en) 2011-06-29 2017-03-28 American Express Travel Related Services Company, Inc. Spend based digital ad targeting and measurement
PT2581448E (pt) 2011-10-13 2015-05-21 Institut National De La Santé Et De La Rech Médicale (Inserm) Dna triciclo-fosforotioato
US9944926B2 (en) 2011-11-30 2018-04-17 Sarepta Therapeutics, Inc. Induced exon inclusion in spinal muscle atrophy
WO2013100190A1 (ja) 2011-12-28 2013-07-04 日本新薬株式会社 アンチセンス核酸
CA3120918A1 (en) 2012-01-27 2013-08-01 Biomarin Technologies B.V. Rna modulating oligonucleotides with improved characteristics for the treatment of duchenne and becker muscular dystrophy
DE102012101676A1 (de) 2012-02-29 2013-08-29 Klaus-Dieter Rösler Verfahren und Vorrichtung zum Bearbeiten von Formularen mit einer Datenverarbeitungsanlage
BR112014033004B1 (pt) 2012-07-03 2021-10-19 Biomarin Technologies B.V. Oligonucleotídeo para tratamento de pacientes com distrofia muscular
JP6453212B2 (ja) 2012-07-13 2019-01-16 ウェイブ ライフ サイエンシズ リミテッドＷａｖｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｌｔｄ． キラル制御
DK2872485T3 (da) 2012-07-13 2021-03-08 Wave Life Sciences Ltd Asymmetrisk hjælpegruppe
EP2900835A4 (en) 2012-09-27 2016-05-11 Population Diagnotics Inc METHODS AND COMPOSITIONS FOR DETECTING AND TREATING DEVELOPMENTAL DISORDERS
JP2016502858A (ja) 2012-12-20 2016-02-01 サレプタ セラピューティクス， インコーポレイテッド 筋ジストロフィを処置するための改善されたエキソンスキッピング組成物
US20160040162A1 (en) * 2013-03-14 2016-02-11 Sarepta Therapeutics, Inc. Exon skipping compositions for treating muscular dystrophy
JP6449231B2 (ja) 2013-03-14 2019-01-09 サレプタ セラピューティクス， インコーポレイテッド 筋ジストロフィを処置するためのエキソンスキッピング組成物
MX2015013117A (es) * 2013-03-15 2016-07-14 Sarepta Therapeutics Inc Composiciones mejoradas para tratar distrofia muscular.
WO2015108047A1 (ja) 2014-01-15 2015-07-23 株式会社新日本科学 免疫誘導活性を有するキラル核酸アジュバンド及び免疫誘導活性剤
WO2015108046A1 (ja) 2014-01-15 2015-07-23 株式会社新日本科学 抗アレルギー作用を有するキラル核酸アジュバンド及び抗アレルギー剤
EP3095459A4 (en) 2014-01-15 2017-08-23 Shin Nippon Biomedical Laboratories, Ltd. Chiral nucleic acid adjuvant having antitumor effect and antitumor agent
SG10201912897UA (en) 2014-01-16 2020-02-27 Wave Life Sciences Ltd Chiral design
US20150329609A1 (en) 2014-03-03 2015-11-19 Sujata Acharjee Chimeric dystrophin proteins to treat dystrophinopathies
TR201901939T4 (tr) 2014-03-12 2019-03-21 Nat Center Neurology & Psychiatry Antisens nükleik asit.
SG10201912858VA (en) 2014-06-17 2020-02-27 Nippon Shinyaku Co Ltd Antisense nucleic acids
AU2015338923B2 (en) 2014-11-02 2021-10-21 Arcturus Therapeutics, Inc. Messenger UNA molecules and uses thereof
MA43072A (fr) 2015-07-22 2018-05-30 Wave Life Sciences Ltd Compositions d'oligonucléotides et procédés associés
MA45819A (fr) * 2015-10-09 2018-08-15 Sarepta Therapeutics Inc Compositions et méthodes pour traiter la dystrophie musculaire de duchenne et troubles associés
KR20180056766A (ko) 2015-10-09 2018-05-29 웨이브 라이프 사이언시스 리미티드 뉴클레오티드 조성물 및 이의 방법
MA45270A (fr) 2016-05-04 2017-11-09 Wave Life Sciences Ltd Compositions d'oligonucléotides et procédés associés
MA45290A (fr) 2016-05-04 2019-03-13 Wave Life Sciences Ltd Procédés et compositions d'agents biologiquement actifs
CN110290812B (zh) * 2016-12-19 2023-06-02 萨勒普塔医疗公司 用于肌肉萎缩症的外显子跳跃寡聚体缀合物
DK3554552T3 (da) 2016-12-19 2022-10-24 Sarepta Therapeutics Inc Exon-skipping-oligomerkonjugater mod muskeldystrofi
EA201991450A1 (ru) * 2017-09-22 2019-12-30 Сарепта Терапьютикс, Инк. Конъюгаты олигомеров для пропуска экзона при мышечной дистрофии

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