JP2007527227A - フラビウィルス感染の処置のためのオリゴヌクレオチドアナログおよび方法 - Google Patents

Abstract

動物細胞内でのフラビウィルスの複製の阻害の方法、および、その方法における使用のためのオリゴヌクレオチド化合物が開示される。そのオリゴヌクレオチドアナログは、（ｉ）ヌクレアーゼ抵抗性の骨格を有し、（ｉｉ）細胞に取り込まれ得、（ｉｉｉ）８〜４０個の間のヌクレオチド塩基を含み、そして、（ｉｖ）配列番号１−４の少なくとも一部分を含む上記ウィルスの正鎖ＲＮＡゲノムの領域に相補的な、少なくとも８塩基の配列を有する。フラビウィルスに感染した細胞を、上記のアナログに曝すことは、その細胞内での、ウィルスのｓｓＲＮＡおよび上記のオリゴヌクレオチドから構成されるヘテロ二重鎖の形成に有効であり、そのヘテロ二重鎖は少なくとも４５℃で解離するＴｍによって特徴付けられ、そしてウィルスの５’末端環化配列および３’末端環化配列の間に崩壊した塩基対合を有する。

Description

（発明の分野）
本発明は、動物内でのフラビウィルスの感染の処置における使用のためのオリゴヌクレオチドアナログ、そのアナログを利用する抗ウィルス方法、ウィルスゲノムの標的部位への、そのアナログの結合をモニターする方法に関連する。

（参考文献）
以下の参考文献は、背景、または、本発明において用いられ得る方法およびプロトコールに関連する。

（発明の背景）
フラビウィルス科は、ゲノムサイズが９〜１５ｋｂの、単一正鎖ＲＮＡウィルスの一群である。これらは、約４０〜５０ｎｍのエンベロープに包まれたウィルスである。フラビウィルス科の中には、プロトタイプの黄熱病ウィルス（ＹＦＶ）、４種の血清型のデング熱ウィルス（ＤＥＮ−１、ＤＥＮ−２、ＤＥＮ−３、およびＤＥＮ−４）、日本脳炎ウィルス（ＪＥＶ）、マレーバレー脳炎ウィルス（ＭＶＥＶ）、クンジンウィルス（ＫＵＮ）、セントルイス脳炎ウィルス（ＳＬＥＶ）、西ナイルウィルス（ＷＮＶ）、ダニ媒介性脳炎ウィルス（ＴＢＥＶ）、および約７０種の、他の病原ウィルスを含むフラビウィルス属がある。

ほとんどのフラビウィルスの感染は、患者の体力を保たせるのに有効な処方（例えば、発熱を低く保つための解熱剤、体液、２次細菌感染に対する抗生物質、必要ならば呼吸の補助など）によって処置される。リバビリンの使用は、多くのＲＮＡウィルスに対して顕著な抗ウィルス性の化学療法活性を有し、そして、インフルエンザウィルス、ＲＳウィルス、ラッサ熱ウィルス、およびハンタウィルスの感染に対する処置において有効であると証明されている。様々なインターフェロン薬とリバビリンの併用は、Ｃ型肝炎ウィルスの感染を処置するために用いられる。しかし、フラビウィルス（例えば、デング熱および黄熱病）に対するリバビリンのインビトロおよびインビボでの活性は、極めて弱い（Ｌｅｙｓｓｅｎ，Ｄｅ Ｃｌｅｒｃｑら ２０００）。

４０年間の研究努力にもかかわらず、ほとんどのフラビウィルス（例えばデング熱）に対する、安全で、かつ効果的なワクチンは、まだ利用可能ではない。黄熱病ウィルスおよび日本脳炎ウィルスに対する効果的なワクチンは存在するが、これらのウィルスは、未だなお、世界的に重大な疾患の原因である。効果的なデング熱ワクチンを開発するための努力は、そのウィルスの疫学によって複雑にされる。任意の所与のデング熱の血清型に対する免疫は、その特定の血清型に対する一生の免疫を誘導するが、異なる血清型による二次感染がデング出血熱およびデング熱ショック症候群（ＤＨＦ／ＤＳＳ）を誘導し得、それらは、２０％をこえる死亡率と関連した、デング熱感染の重大な形態である（Ｍｏｎｇｋｏｌｓａｐａｙａ、Ｄｅｊｎｉｒａｔｔｉｓａｉら ２００３）。

フラビウィルスの感染に関連する疾患の重大性、ならびに、動物および特にヒトにおける、その広範性を鑑みると、フラビウィルスに感染した宿主を処置するための治療化合物および治療法の必要性がある。

（発明の要旨）
本発明は、ある局面において、動物細胞におけるフラビウィルスの複製を阻害する方法を含み、この動物細胞は哺乳動物細胞および鳥類の細胞を含む。上記の方法を実行する中で、細胞は、（ｉ）ヌクレアーゼ抵抗性の骨格を有し、（ｉｉ）その細胞に取り込まれ得、（ｉｉｉ）８〜４０ヌクレオチドの間の塩基を含み、（ｉｖ）配列番号１−４として識別される配列の１つの少なくとも一部分を含む、そのウィルスの正鎖ＲＮＡゲノムの領域に相補的な、少なくとも８塩基の配列を有し、配列番号１−４は、それぞれの配列が、フラビウィルスの２つの大クラスの内の１つにおける、ウィルスゲノムの５’末端環化配列または３’末端環化配列を表す、オリゴヌクレオチドアナログに曝される。好ましい実施形態において、上記のオリゴヌクレオチドアナログは、ウィルスゲノムの正鎖における３’末端環化配列（配列番号３または４）の少なくとも一部分と相補的な配列を有する。上記の化合物への曝露は、その細胞内において、上記のウィルスのｓｓＲＮＡおよび上記のオリゴヌクレオチドから構成されるヘテロ二重鎖構造の形成に効果的であり、このヘテロ二重鎖構造は、少なくとも４５℃で解離するＴｍで特徴付けられ、そして、そのウィルスの５’末端環化配列と３’末端環化配列との間に崩壊した塩基対合を有する。このことは、細胞内でのウィルスの複製の阻害により証明される。

ある実施形態において、上記のアナログは、配列番号１−４の配列の内の１つの全て、または一部分に相補的である。別の実施形態において、上記のアナログは、ウィルス配列とヘテロ二重鎖構造を形成し得る配列を含み、このウィルス配列は、そのゲノムの５’末端環化配列の一部分、およびそのゲノムの３’末端環化配列の相補的な部分を含む。

セントルイス脳炎ウィルス、マレーバレー脳炎ウィルス、西ナイルウィルス、クンジンウィルス、日本脳炎ウィルス、黄熱病ウィルス、デング熱ウィルス−１型、２型、３型、および４型、または西ナイルウィルスのいずれかの複製を阻害する使用のために、上記の細胞が曝される上記のオリゴヌクレオチドアナログは、配列番号１または３の、そして好ましくは配列番号３の、少なくとも一部分を含む、上記ウィルスの正鎖ＲＮＡゲノムの領域に相補的な少なくとも８塩基の配列を有する。別の実施形態において、上記のオリゴヌクレオチドアナログは、配列番号１として識別される、上記のゲノム５’末端環化配列の一部、および、配列番号３として識別される、上記のゲノムの３’末端環化配列の相補的な部分を含む配列と、ヘテロ二重鎖構造を形成し得る配列を含む。

ダニ媒介性脳炎ウィルス、ポワッサンウィルス、跳躍病ウィルス、キャサヌール森林病ウィルス、およびアルカーマウィルス（Ａｌｋｈｕｒｍａ ｖｉｒｕｓ）のいずれかの複製を阻害する使用のために、上記の細胞が曝される上記のオリゴヌクレオチドアナログは、配列番号２または４の、そして好ましくは配列番号４の、少なくとも一部分を含む、上記のウィルスの正鎖ＲＮＡゲノムの領域に相補的な少なくとも８塩基の配列を有する。別の実施形態において、上記のオリゴヌクレオチドアナログは、配列番号２として識別される上記のゲノムの５’末端環化配列の一部分、および、配列番号４として識別される上記のゲノムの３’末端環化配列の相補的な部分を含む配列と、ヘテロ二重鎖構造を形成し得る配列を含む。

好ましいオリゴヌクレオチドアナログは、電荷を持たない、または実質的に電荷を持たない骨格（例えば、図２Ａ−２Ｇに示される構造の内の１つ）を有し、そして好ましくは、実質的に電荷を持たない、リン含有骨格（例えば、図３Ａ−３Ｄに示される構造）に連結された、８〜２５個のモルホリノサブユニットから構成される。１つの好ましいアナログは、図３Ｂに示される構造であり、ここでＸはＮＲ_２であり、この中でＲは水素またはＣＨ_３であり、ぞしてＹおよびＺはそれぞれ酸素である。

ヒト被験体を含む、動物被験体におけるフラビウィルスの処置のためには、その感染した細胞は、感染した被験体への、非経口的な投与、または経口的な投与によって、上記のオリゴヌクレオチドアナログに曝され得る。その方法はさらに、上記のオリゴヌクレオチドアナログおよび上記のウィルスのゲノムの相補的な部分から構成されるヘテロ二重鎖の出現について、体液をモニターする工程を含む。

別の局面において、本発明は、動物細胞内でのフラビウィルスの複製の阻害における使用のためのオリゴヌクレオチドアナログを含む。上記のアナログは、（ｉ）ヌクレアーゼ抵抗性の骨格、（ｉｉ）動物細胞により取り込まれ得、（ｉｉｉ）８〜４０個の間のヌクレオチド塩基を含み、（ｉｖ）フラビウィルスの正鎖ＲＮＡゲノムの領域に相補的な少なくとも８塩基の配列を含み、ここで、上記のフラビウィルスの正鎖ＲＮＡゲノムは、配列番号１−４として識別されるウィルスゲノムの内の１つの少なくとも一部分を含み、この配列番号１−４はそれぞれの配列が、フラビウィルスの２つの大クラスの内の１つにおける、そのゲノムの５’末端環化配列または３’末端環化配列を表し、そして（ｖ）フラビウィルスのｓｓＲＮＡゲノムとヘテロ二重鎖構造を形成し得て、そのヘテロ二重鎖構造は、少なくとも４５℃で解離するＴｍ、およびそのウィルスの５’末端環化配列および３’末端環化配列の間に崩壊した塩基対合を有することで特徴付けられることによって、特徴付けられる。このことは、上記の細胞内でのウィルスの複製の阻害によって証明される。上記のアナログは様々な実施形態を有し、それは、抗ウィルス性の治療法における上記アナログの使用に関して、上記に記載されたものを含む。

以下の、発明の詳細な説明を、添付の図と併せて読んだ場合、本発明の、これらの、およびその他の目的および特徴が、より完全に明白になる。

（発明の詳細な説明）
（Ｉ．定義）
別に示さない限り、本明細書にて用いられる下記の用語は、以下の意味を有する。

用語「オリゴヌクレオチドアナログ」は、（ｉ）改変された骨格構造（例えば、天然のオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドにおいて見出される、標準のホスホジエステル連結以外の骨格）、ならびに（ｉｉ）随意的には、改変された糖部分（例えば、リボース部分またはデオキシリボース部分以外のモルホリノ部分）を有するオリゴヌクレオチドを言及する。上記のアナログは、標準のポリヌクレオチド塩基と、ワトソン−クリック塩基対合によって水素結合し得る塩基を支え、ここで上記のアナログの骨格は、配列特異的な方法における、上記のオリゴヌクレオチドアナログ分子と標準のポリヌクレオチド（例えば、一本鎖ＲＮＡまたは一本鎖ＤＮＡ）内の塩基との間の、このような水素結合を可能にする方法で、上記の塩基を提示する。好ましいアナログは、実質的に電荷を持たないリン含有骨格を有するものである。

オリゴヌクレオチドアナログ内の、実質的に電荷を持たないリン含有骨格は、そのサブユニット連結の大多数（例えば、６０〜１００％の間）が、生理学的なｐＨにおいて電荷を持たず、そして、単一のリン原子を含むものである。上記のアナログは８〜４０の間のサブユニットを含み、代表的には約８〜２５サブユニットを含み、そして好ましくは約１２〜２５サブユニットを含む。上記のアナログは、下記に定義するように、標的配列への正確な配列相補性、または近い相補性を有し得る。

オリゴヌクレオチドアナログの「サブユニット」は、上記のアナログの１つのヌクレオチド（またはヌクレオチドアナログ）ユニットを言及する。「電荷を持つサブユニット」に言及する場合には、その電荷は代表的にはサブユニット間連結（例えば、ホスフェート連結またはホスホロチオエート連結）内に存在するが、上記の用語は、接続されたサブユニット間連結を有する、または有しない、ヌクレオチドユニットを言及し得る。

「モルホリノオリゴヌクレオチドアナログ」は、図３Ａ−３Ｄに示される形態のモルホリノサブユニット構造から構成されるオリゴヌクレオチドアナログであり、ここで、（ｉ）これらの構造は、１〜３原子の長さで、１つのサブユニットのモルホリノ窒素を、隣接するサブユニットの５’末端の環外炭素に結合する、リン含有連結によって互いに連結され、（ｉｉ）Ｐ_ｉおよびＰ_ｊは、塩基特異的な水素結合による、ポリヌクレオチド内の塩基への結合に効果的な、プリン塩基対合部分またはピリミジン塩基対合部分である。上記のプリン塩基対合部分またはピリミジン塩基対合部分は、代表的にはアデニン、シトシン、グアニン、ウラシル、またはチミンである。モルホリノオリゴマーの合成、構造、および結合特性は、米国特許第５，６９８，６８５号、同第５，２１７，８６６号、同第５，１４２，０４７号、同第５，０３４，５０６号、同第５，１６６，３１５号、同第５，５２１，０６３号、および同第５，５０６，３３７号に詳述され、これらは全て、本明細書内に参考として援用される。

図３Ｂに示される上記サブユニットおよび連結は６原子の反復ユニット骨格として、図３Ｂ（上記の６原子は：モルホリノ窒素、連結されたリン原子、そのリン原子を５’末端環外炭素に連結する原子（通常は酸素）、５’末端環外炭素、そして次のモルホリノ環の２つの炭素原子を含む）に示されるように、用いられる。これらの構造において、５’末端環外モルホリノ炭素をリン含有基に連結する原子Ｙ_１は、硫黄、窒素、炭素、または好ましくは酸素であり得る。リンから垂れ下がるＸ部分は、塩基特異的水素結合を妨げない、任意の安定な基である。好ましいＸ基としては、フルオロ、アルキル、アルコキシ、チオアルコキシ、および、環状アミンを含むアルキルアミノが挙げられ、その全てが、塩基特異的結合が崩壊しない限りは、多様に置換され得る。アルキル、アルコキシ、およびチオアルコキシは、好ましくは、１〜６個の炭素原子を含む。アルキルアミノは、好ましくは、低級アルキル（Ｃ_１〜Ｃ_６）置換を適用し、そして、環化アミンは、好ましくは、５〜７員の窒素複素環であって、それは随意的に、酸素、窒素、および硫黄から選択される１〜２個のさらなるヘテロ原子を含む。Ｚは硫黄または酸素であり、好ましくは酸素である。

好ましいモルホリノオリゴマーは、ホスホロジアミデートが連結したモルホリノオリゴマーであり、本明細書ではＰＭＯとよぶ。こうしたオリゴマーは、図３Ｂにしめされるようなモルホリノサブユニット構造から構成され、ここで、ＸはＮＨ_２、ＮＨＲ、またはＮＲ_２（ここで、Ｒは低級アルキルであり、好ましくはメチルである）であり、Ｙは酸素であり、およびＺは酸素であり、そして、Ｐ_ｉおよびＰ_ｊは、塩基特異的水素結合によるポリヌクレオチド内の塩基への結合に効果的な、プリン塩基対合部分またはピリミジン塩基対合部分である。代わりのホスホロジアミデート連結を有する構造もまた好ましく、ここで、図３Ｂにおいて、Ｘは低級アルコキシ（例えば、メトキシまたはエトキシ）であり、ＹはＮＨまたはＮＲ（ここで、Ｒは低級アルキルである）であり、そしてＺは酸素である。

用語「置換された」は、特にアルキル基、アルコキシ基、チオアルコキシ基、またはアルキルアミノ基に関して、炭素に結合した水素原子の、ヘテロ原子を含む置換基（例えば、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、チオール、アルキルチオ、アミノ、アルキルアミノ、イミノ、オキソ（ケト）、ニトロ、シアノ、あるいは、様々な酸またはエステル（例えば、カルボキシル、スルホン、またはホスホン））による置換を言及する。それはまた、ヘテロ原子に結合した水素原子（例えば、アミン水素）の、アルキル、カルボニル、または他の炭素含有基による置換も言及し得る。

本明細書で用いられるように、用語「標的」は、ウィルスのゲノムＲＮＡに関連して、ウィルスのゲノムＲＮＡを言及し、そして、ウィルスの複製的な鎖である正鎖ＲＮＡ、あるいは、正鎖ＲＮＡの複数の新たな複製の生成の中で形成される、逆鎖またはアンチセンス鎖のいずれかを含み得る。

用語「標的配列」は、上記のオリゴヌクレオチドアナログが配向される標的ＲＮＡの一部分、すなわち、上記のオリゴヌクレオチドアナログがハイブリダイズする配列を言及する。標的配列は、配列番号１−４として識別される配列の１つの少なくとも一部分を含み、これは、さらに下記で論ずるように、フラビウィルスの２つの大クラスの内の１つにおける、上記のゲノムの５’末端環化配列または３’末端環化配列を表す。後に見るように、上記の標的配列は、ウィルスゲノムの連続した領域であってよく、または、上記のゲノムの５’末端環化配列および３’末端環化配列の双方の相補的な配列から構成されてもよい。

用語「ターゲティング配列」は、上記のＲＮＡゲノム内の標的配列に相補的であるか、または実質的に相補的な、上記のオリゴヌクレオチドアナログ内の配列である。上記アナログの全体の配列、またはその一部分のみは、標的配列に相補的であってよく、あるいはアナログの全配列の一部分のみであってよい。例えば、２０塩基を有するアナログにおいて、８〜１２塩基のみがターゲティング配列であり得る。代表的には、ターゲティング配列は、上記のアナログにおける連続した塩基から形成されるが、代わりに、例えば上記アナログの反対側の末端から一緒に置かれた場合に標的配列に及ぶ配列を構成する、非連続な配列から形成されてもよい。後に見るように、標的配列およびターゲティング配列は、上記アナログのウィルスゲノムへの結合が、ゲノム内の５’末端環化配列および３’末端環化配列により形成されるＲＮＡの二次構造の形成を崩壊させるか、または防ぐために働くように、選択される。

標的配列およびターゲティング配列は、逆平行な構成においてハイブリダイゼーションが起きた場合、互いに「相補的」と記述される。二重鎖ポリヌクレオチドは、もう１つのポリヌクレオチドと「相補的」であり得る。ターゲティングは、標的配列に、「ほぼ」または「実質的に」相補的であり得、本発明の目的のために、なお機能する。好ましくは、本発明で使用されるオリゴヌクレオチドアナログは、標的配列との不一致を、１０ヌクレオチドの内多くとも１ヌクレオチドを有し、そして好ましくは、２０個の内多くとも１個の不一致を有する。あるいは、使用されるアンチセンスオリゴマーは、本明細書に示される模範的なターゲティング配列と、少なくとも９０％の配列相同性を有し、そして好ましくは、少なくとも９５％の配列相同性を有する。

オリゴマーが、生理学的条件下、実質的に４５℃をこえるＴ_ｍで、好ましくは少なくとも５０℃をこえるＴ_ｍで、そして代表的には６０℃〜８０℃またはそれ以上のＴ_ｍで、標的にハイブリダイズした場合、オリゴヌクレオチドアナログは標的ポリヌクレオチドに「特異的にハイブリダイズする」。こうしたハイブリダイゼーションは、好ましくは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に対応する。所与のイオン強度およびｐＨにおいて、Ｔ_ｍは、標的配列の５０％が相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズする温度である。また一方、こうしたハイブリダイゼーションは、アンチセンスオリゴマーが標的配列に「ほぼ」または［実質的に」相補的である場合、正確に相補的である場合と同様に、起こり得る。

「ヌクレアーゼ抵抗性」オリゴマー分子（オリゴマー）は、ハイブリダイズしない形、またはハイブリダイズした形において、その骨格がヌクレアーゼによる切断に実質的に抵抗性があるものを言及し；その切断は体内の通常の細胞外ヌクレアーゼおよび細胞内ヌクレアーゼによるものであって；すなわち、上記のオリゴマーは、オリゴマーが曝される体内の通常のヌクレアーゼ条件において、ヌクレアーゼによる切断をほとんど、または全く示さない。

「ヘテロ二重鎖」は、オリゴヌクレオチドアナログと、標的ＲＮＡの相補的な部分との二重鎖を言及する。「ヌクレアーゼ抵抗性ヘテロ二重鎖」は、アンチセンスオリゴマーの、その相補的な標的への結合によって形成されるヘテロ二重鎖を言及し、そのヘテロ二重鎖は、二重鎖ＲＮＡ／ＲＮＡ複合体または二重鎖ＲＮＡ／ＤＮＡ複合体を切断し得る、細胞内ヌクレアーゼおよび細胞外ヌクレアーゼ（例えばＲＮＡ分解酵素Ｈ）によるインビボでの分解に実質的に抵抗性を示すようなものである。

「標的ＲＮＡに関する、塩基特異的な細胞内結合現象」は、オリゴヌクレオチドアナログの、標的ＲＮＡ配列への細胞内での特異的な結合を言及する。こうした結合の塩基特異性は、配列に特異的である。例えば、一本鎖ポリヌクレオチドは、配列内で相補的な一本鎖ポリヌクレオチドに、特異的に結合し得る。

感染したｓｓＲＮＡウィルスを対象として「十分な量」のアンチセンスオリゴマーは、感染したウィルスの複製の速度、および／またはウィルスの負荷、および／またはウィルス感染に関連する症状を減少させるために十分に効果的である。

本明細書にて用いられるように、用語「体液」は、尿、唾液、血漿、血液、髄液、またはその他の生物学的な起源を持つサンプル（例えば、皮膚細胞または皮膚細片）を含む、被験体から得られる様々なサンプル型を包含し、そして、そこに懸濁されている細胞または細胞断片、または液体培地およびその溶質を言及し得る。

用語「相対量」は、試験測定とコントロール測定との間で比較がなされた場合に用いられる。反応中に複合体を形成する試薬の相対量は、コントロール試料と反応する量に比較して、試験試料と反応する量である。上記のコントロール試料は、同一のアッセイにて別々に用いられてよく、または、同一のサンプルの一部（例えば、組織切片中で、悪性の部位を囲む正常な組織）であってもよい。

個体または細胞の「処置」は、その個体または細胞の自然経過を変化させる手段として提供される操作の、任意の型である。処置の例としては、例えば薬学的組成物の投与が挙げられるが、これに限るものではない。そして、予防的に、あるいは、病的現象の惹起または病因的因子との接触の後か、いずれかにおいて、行われ得る。特定のウィルスに感染したと診断された患者に関連して、関連した用語「改良された治療結果」は、ウィルスの成長、またはウィルスの負荷、または、その特定のウィルスによる感染に関連した検出し得る症状の遅滞または減少を言及する。

ある因子は、受動拡散以外の仕組みによって、細胞膜を越えて哺乳動物細胞に入り得る場合、「哺乳動物細胞に能動的に取り込まれる」。例えば、その因子は「能動輸送」によって輸送されてよく、それは、例えばＡＴＰ依存性輸送機構による、哺乳動物の細胞膜を越えた因子の輸送を言及し、あるいは「促進輸送」によって輸送されてもよく、それは、その因子の輸送タンパク質への結合を必要とし、そして結合した因子の膜を超えた通過を促進する輸送機構による、細胞膜を超えたアンチセンス因子の輸送を言及する。能動輸送および促進輸送の双方のためには、上記のオリゴヌクレオチドアナログは、好ましくは、下記に定義するように、実質的に電荷を持たない骨格を有する。あるいは、上記のアンチセンス化合物は複合型の形式（例えば、陽イオン性の脂質またはリポゾームと複合された陰イオン性の骨格を有し、それはエンドサイトーシスの機構によって細胞中に取り込まれ得る因子）に構築され得る。上記のアナログは、標的宿主細胞への輸送を促進するために、例えばその５’末端または３’末端にて、アルギニンの豊富なペプチド（例えば、ＨＩＶ ＴＡＴタンパク質）に結合体化され得る。

（ＩＩ．標的フラビウィルス）
本発明は、オリゴマーアナログであって、（ｉ）フラビウィルスＲＮＡの３’−ＣＳ領域（または５’−ＣＳ領域）を標的とし、（ｉｉ）そのアナログと宿主細胞内のウィルスＲＮＡとの間で効果的な相互作用をし得るような、物理的特徴および薬物動態学的特徴を有するオリゴマーアナログに、フラビウィルスに感染した細胞を曝すことによって、フラビウィルスの複製の効果的な阻害が達成され得るという発見に基づく。１つの局面において、そのアナログは、ウィルスに感染した哺乳動物被験体の処置に用いられ得る。

本発明は、下記に記述するウィルスを含む、フラビウィルス科のフラビウィルス属のメンバーを対象とする。フラビウィルス属（ｇｅｎｅｓ）およびそのメンバーの、様々な物理的特徴、形態学的特徴、および生物学的特徴が、例えば、Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｒ．Ｂｅｌｓｈｅ編，第２版，Ｍｏｓｂｙ，１９９１、または上記に引用した参考文献の１つ以上に見出され得る。フラビウィルスのメンバーそれぞれの、鍵となる生物学的特徴、病理学的特徴、および疫学的特徴のいくつかは、以下に概要を述べる。

（フラビウィルスの複製）
フラビウィルスは小さな、エンベロープに包まれたウィルスで、短い５’末端非翻訳領域および３’末端非翻訳領域（ＮＴＲｓ）、単一の長いオープンリーディングフレーム、５’キャップ、およびポリアデニル化されていない３’終端を含む、長さ約１０，５００ヌクレオチドの、一本鎖の正鎖ゲノムＲＮＡを含む。４種全ての血清型のデング熱、黄熱病ウィルス、日本脳炎ウィルス、西ナイルウィルス、およびダニ媒介性脳炎ウィルスを含む、多数のフラビウィルスのゲノムの完全なヌクレオチド配列が報告されている。全てのフラビウィルスタンパク質は、宿主により媒介される正確なプロセッシング事象、およびウィルスにコードされたプロテアーゼを通して、単一の長いポリタンパク質から引き出される。単一のオープンリーディングフレームにコードされる１０個の遺伝子産物は、順に、カプシド（Ｃ）、プレメンブレン（ｐｒＭ、これは、細胞からのウィルスの放出の直前に、膜（Ｍ）に加工される）、エンベロープ（Ｅ）、そして７個の非構造（ＮＳ）タンパク質：ＮＳ１、ＮＳ２ａ、ＮＳ２ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、およびＮＳ５を構成するポリタンパク質として翻訳される（Ｌｅｙｓｓｅｎ，Ｄｅ Ｃｌｅｒｃｑら ２０００；Ｂｒｉｎｔｏｎ ２００２）。

全ての蚊媒介性フラビウィルスは、保存性のＲＮＡ配列およびＲＮＡ構造を共有する（Ｐｒｏｕｔｓｋｉ，Ｇｏｕｌｄら １９９７；Ｚｅｎｇ，Ｆａｌｇｏｕｔら １９９８；Ｌｉ，Ｌｉら ２００２）。フラビウィルスの３’−ＮＴＲおよび５’−ＮＴＲの、配列の比較およびＲＮＡの２次構造の予測から、いくつかの短い、良く保存された配列が明らかとなっており、３’末端領域（約９０塩基）が、保存されたステム−ループ構造内に折り畳まれ得ていることが示される（Ｈａｈｎ，Ｈａｈｎら １９８７）。保存されたステムループ構造は、多くの正鎖ＲＮＡウィルスにおいてウィルスの複製に重要であることが示された。フラビウィルスの３’末端ステム−ループ構造の１次配列は、フラビウィルスの間で良く保存されてはいないが、二次構造は良く保存されている。短い保存された配列（３’−ＣＳ、配列番号３）が、保存されたステム−ループ構造の上流に（つまり、５’末端方向に）確認されている。３’−ＣＳと、ゲノムの５’末端における保存された配列（５’−ＣＳ、配列番号１）との間の相補性は、結果として、長い範囲での分子内のＲＮＡ相互作用、またはゲノムＲＮＡの環化をもたらすことが提唱されている（Ｈａｈｎ，Ｈａｈｎら １９８７；Ｙｏｕ，Ｆａｌｇｏｕｔら ２００１；Ｃｏｒｖｅｒ，Ｌｅｎｃｈｅｓら ２００３）。最近の実験からは、これらの配列の間の塩基対合が、クンジンウィルスレプリコンのＲＮＡ複製に必須であることが示唆されている（Ｋｈｒｏｍｙｋｈ，Ｍｅｋａら ２００１）。コンピューターにより生成された、デング熱ウィルスの５’−ＣＳと３’−ＣＳの間の予測された二次構造は図１に示され（Ｋｈｒｏｍｙｋｈ，Ｍｅｋａら ２００１）、図の上部のボックス内に５’−ＣＳおよび３’−ＣＳが示され、そして本明細書において、それぞれ配列番号１および配列番号３として識別される。短い相補的な配列がまた、ダニ媒介性脳炎ウィルスゲノムの５’末端領域および３’末端領域において識別され（それぞれ、配列番号２および配列番号４）、そして潜在的な環化配列と同様に働くことが提唱されている（Ｋｈｒｏｍｙｋｈ，Ｍｅｋａら ２００１）。

（デング熱ウィルス）
フラビウィルスの伝染および感染病理は、異なるウィルス間で極めて異なるが、デング熱ウィルスは、この属における説明に役立つ実例として都合が良い。デング熱ウィルスは節足動物媒介性ウィルス（アルボウィルス）であり、そしてシマカ属の蚊、第一にＡ．ａｅｇｙｐｔｉおよびＡ．ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓによって、ヒトに伝染する。このウィルスは、高い発熱、頭痛、筋肉および関節の痛み、ならびに発疹によって明示される疾病を引き起こす。いくつかの場合において、代表的には子供において、より激しい型の感染がデング出血熱／デング熱ショック症候群（ＤＨＦ／ＤＳＳ）と共に見られ、これらは、ショックに通じる、激しい出血、血管透過性、またはその両方によって特徴付けられる。所与のデング熱の血清型に感染し、そして引き続いて異なる血清型に感染した個体は、ＤＨＦ／ＤＳＳに対してより顕著に危険な状態にある。診断および迅速な医療行為無しでは、ＤＨＦ／ＤＳＳの急激な発症および急速な進行は、致命的になり得る。

４種類のデング熱ウィルスの１種類以上に起因する、特定の地方に特有のデング熱は、熱帯および亜熱帯の多くにおいて、主要な公衆衛生問題である。時には１００万人以上を巻き込む、散発的なデング熱の流行が発生し続けている。デング熱ウィルスは、５００，０００例のＤＨＦ／ＤＳＳを含む、年間１億例のデング熱が発生していると見積もられる、世界的な罹患率および死亡率について、節足動物伝染性ウィルスの最も重要なグループである。人口の世界的な増加、特に熱帯の全体にわたる住民の都市化、および、持続した蚊の抑制措置の欠如によって、デング熱を媒介する蚊は、熱帯、亜熱帯、およびいくつかの温帯の全体にわたってその分布が広がっており、世界人口の過半数にデング熱感染の危険をもたらしている。現代のジェット機旅行および人々の移住は、デング熱の血清型の世界的な分布を促進し、現在では、デング熱の複数の血清型が、多くの地域において地方特有となっている。これに付随して、最近１５年間において、デング熱の流行の頻度、およびＤＨＦ／ＤＳＳの発生率の増加がある。例えば、東南アジアにおいて、ＤＨＦ／ＤＳＳは子供の間で入院および死亡の主要な原因である（ＨａｙｅｓおよびＧｕｂｌｅｒ １９９２）。

以下に記述するように、フラビウィルス属の多くの他のメンバーもまた、重篤な疾患（例えば、黄熱病、日本脳炎、セントルイス脳炎、オーストラリア脳炎、およびダニ媒介性脳炎）の病因因子である。

（黄熱病ウィルス）
黄熱病に対する効果的なワクチンが何年も利用可能であるが、このウィルスは、死亡率が５０％である、出血熱の主要な原因である。世界中で、年間２００，０００例と見積もられる黄熱病（内３０，０００例の死亡）がある。黄熱病のない国において移入された事例も、少数起きている（ＷＨＯ，Ｆａｃｔ Ｓｈｅｅｔ １００，２００１）。

（日本脳炎ウィルス）
このアルボウィルスは、世界的なウィルス性脳炎の主要な原因である。アジアでは年間約５０，０００例が起きており、高い（３０％）死亡率をもたらすか、または生存した患者の永久的な神経的後遺症（３０％）をもたらす。ＪＥＶによって引き起こされる集団発生は、熱帯アジアおよび亜熱帯アジアの人口が稠密である地域において、重要な公衆衛生問題をもたらし続けている。この疾患は蚊のイエカ属に属する種によって伝染され、臨床的には脳炎として明示され、幼い子供および高齢者の間で、しばしば重度となり、そして高い死亡率をもたらす。ＪＥＶはまた、家畜（例えばブタおよびウマ）にも感染する。最近２０年間で、不活化されたＪＥＶワクチンを用いた免疫化が、日本、韓国、および台湾において、疾患を抑制している。しかしながら、ワクチンの生産に高いコストがかかるために、それが最も必要とされている国々では、容易には利用可能ではない（ＣＤＣ，Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ Ｆａｃｔ Ｓｈｅｅｔ，２００１）。

（マレーバレー脳炎ウィルスおよびクンジンウィルス）
これらのウィルスは「オーストラリア脳炎」の原因因子であり、「オーストラリア脳炎」は、無菌性髄膜炎および／または脳炎によって特徴付けられる臨床的な症候群である。双方ともアルボウィルスであり、イエカ属の蚊によって伝染され、そして北オーストラリアにおいて固有である。マレーバレー脳炎の症状は、ほとんど常に、急激な発熱；摂食障害および頭痛の発生を含む。数日後に脳機能障害となり得、そして昏睡および死亡の双方が確実となり得る。いくつかの後遺症となる、精神的な障害も機能的な障害もなしに、この脳炎症候群から回復することは、まれである。クンジンウィルスは、西ナイルウィルスに密接に関連したウィルスであり（Ｓｃｈｅｒｒｅｔ，Ｐｏｉｄｉｎｇｅｒら ２００１）、マレーバレー脳炎ウィルスに臨床的に類似した疾病を引き起こすが、一般により重篤度が低く、ヒトへの感染の頻度は低いと報告されている。

（西ナイルウィルス）
西ナイルウィルス（ＷＮＶ）は、もう１つの節足動物媒介性フラビウィルスで、近年、ヒトのみならずその他の動物種（例えばウマおよび鳥類）に対しても、致死性の健康への脅威として出現した。１９９９年にニューヨークが、西ナイルウィルス感染の事例を報告する、北アメリカで最初の地域になった。西ナイルウィルスのヒトへの感染は、かつてはアフリカ、中東および東ヨーロッパのみで見つかった。上記のウィルスは、ヒトおよびいくつかの動物種に、感染した鳥類を餌とすることでウィルスを取り入れた蚊によって伝染する。西ナイルウィルスは公衆衛生にとって、引き続き脅威のままである。疫学的研究およびウィルス学的研究から、生きたウィルスが、蚊および鳥類の集団の中で生存していることが示されている。蚊の抑制措置が、ニューヨーク、ニュージャージー、コネチカット、およびその他の多くの東部諸州で実行されたが、西ナイルウィルスの新しい事例はまだ診断されている。現在、西ナイルウィルスは、米国のほぼ全ての州で見つかっている（Ｅｎｓｅｒｉｎｋ ２００２）。

ヒトに感染した西ナイルウィルスの中で、１５０〜３００ごとにおよそ１つが、発熱、筋肉痛、および場合によっては発疹を伴う疾患となる。症候性のものの内、約１０〜１５％が、髄膜炎（頭痛、肩こり）、または脳炎（精神状態の変化、末梢神経の異常、筋衰弱）の徴候を有する。ほとんど全ての死亡は、５０歳をこえるヒトにおいて起きている。中枢神経系へ感染した患者の致死率は、５％〜１１％の間である。致死は、換気の補助を必要とし、そして第２の合併症につながる、中枢神経系の長期の機能障害に起因していた。長期の神経性の症状は、西ナイルウィルスに引き起こされた脳炎の生存者に起こっている。

（セントルイス脳炎ウィルス）
セントルイス脳炎ウィルスの最近の流行はないものの、それは米国西部で固有のままであり、そして、無菌性髄膜炎および／または脳炎を含む重篤な疾患の原因である。もう１つのアルボウィルスであるＳＬＥＶは、１９７５年および１９９０年に起こった、最大の最近の米国での突発と共に、予測不可能で、かつ断続的な流行の原因である。

（ダニ媒介性脳炎）
ダニ媒介性脳炎（ＴＢＥ）は、ヨーロッパおよびアジアの大部分で発生する、最も危険なヒトの感染症の１つである。病因因子はダニ媒介性脳炎ウィルス（ＴＢＥＶ）である。ＴＢＥＶは、８９〜１６６件の死亡を含む、ロシアでの、年間少なくとも１１，０００件のヒトの脳炎の事例、および、残りのヨーロッパでの年間約３０００件の事例の原因であると考えられている（Ｔｅｒｎｏｖｏｉ，Ｋｕｒｚｈｕｋｏｖら ２００３）。ＴＢＥウィルスはしばしば、温和な、または無症候性から、４０％に達する致死率の重篤な脳炎に至る範囲の症状を示す、病原性を示す。同じグループに含まれる関連したウィルスである、跳躍病ウィルス（ＬＩＶ）およびポワッサンウィルス（ＰＯＷ）もまたヒトの脳炎を引き起こすが、めったに流行の規模にはならない。同じグループに属する２つのほかのウィルスである、キャサヌール森林病ウィルス（ＫＦＤ）およびアルカーマウィルス（ＡＬＫ）は、ＴＢＥ複合ウィルスに密接に関連し、脳炎よりも、致死的な出血熱の原因になる傾向がある（Ｇｒｉｔｓｕｎ，Ｌａｓｈｋｅｖｉｃｈら ２００３）。

（ＩＩＩ．ウィルス標的領域およびターゲティング配列）
好ましい標的配列は、隣接し、および正鎖フラビウィルスＲＮＡの５’−ＣＳ配列または３’−ＣＳ配列の少なくとも一部分（例えば、少なくとも２〜８塩基）を含む配列である。上記にて論じたように、これらの保存された環化配列（ＣＳ）は、ＲＮＡ複製を惹起するために、ウィルスＲＮＡの３’末端領域および５’末端領域を非常に近くまで移動させることによって、ウィルスの複製に役割を果たしていると考えられる（Ｈａｈｎ，Ｈａｈｎら １９８７；Ｋｈｒｏｍｙｋｈ，Ｍｅｋａら ２００１）。種々のフラビウィルスゲノム配列は、周知の出所（例えば、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｂａｎｋデータベース）から利用可能である。あるいは、当業者は多くの被験体ウィルスの配列を、公開された文献内に探し得る（例えば、目的とするウィルスの配列情報を公開している参考文献を探すことによって）。一旦、完全な、または部分的なウィルス配列が得られた場合、そのウィルスの５’ＣＳ配列および３’ＣＳ配列が識別される。

対応するウィルスゲノム内の５’−ＣＳ末端ターミナル配列および３’−ＣＳ末端ターミナル配列を含む、模範的なウィルス核酸配列のためのＧｅｎＢａｎｋの参照を、以下の表１に収載する。これらの配列は、フラビウィルス属に含まれる他の配列の例証に過ぎないことが理解される。なぜなら、それらは、文献の出自または特許の出自の、利用可能な遺伝子配列データベースから利用可能であり得るからである。配列番号５−１５として識別される以下の配列はまた、本明細書の末尾にある表３にも収載される。保存された５’−ＣＳおよび３’−ＣＳは、表１において太字で示され、そして表１において配列番号１−４として収載される。

模範的な標的配列のもう１つのグループは、配列番号５−１５の相補体である；それは、識別された配列５−１５の１つに、相補的に逆平行な配列を有する配列である。例えば、配列番号５：

の相補体は、

である。

標的配列とターゲティング配列との間の相補性の度合いは、安定な二重鎖を形成するに十分である。上記のアンチセンスオリゴマーの、標的ＲＮＡ配列への相補的な領域は、８〜１１塩基の短さであってよく、しかし好ましくは１２〜１５塩基またはそれ以上（例えば、１２〜２０塩基）であり、あるいは１２〜２５塩基である。およそ１５塩基のアンチセンスオリゴマーは、一般に、上記のウィルスゲノム内に特有の相補配列を有するに十分な長さである。さらに、相補的な塩基の最小の長さは、下記に論ずるように、要求される結合のＴ_ｍを実現することを要求され得る。

４０塩基の長さのオリゴマーが適し得、そこで、少なくとも最小の塩基数（例えば８〜１１塩基、好ましくは１２〜１５塩基）が、上記の標的配列と相補的である。しかし、一般に、細胞内の促進的な取り込み、または能動的な取り込みは、約３０未満の長さのオリゴマーで、好ましくは２５未満であり、そしてより好ましくは２０またはそれ未満の塩基数で最適化される。ＰＭＯオリゴマーのためには、さらに下記に論ずるように、結合安定性および取り込みの最適なバランスは一般に、１３〜２３塩基の長さで生じる。

上記のオリゴマーは、ウィルス核酸標的配列に１００％相補的であり得るか、または、上記のオリゴマーとウィルス核酸標的配列との間に形成されるヘテロ二重鎖が、細胞性ヌクレアーゼおよびインビボで起こり得るその他の分解様式に耐える程度に十分に安定である限りは、例えば改変体に対応するために、不一致を含み得る。ヌクレアーゼによる切断に、より感受性の低いオリゴマー骨格は、以下で論じられる。不一致は、もし存在するならば、ハイブリッド二重鎖の中間領域よりも末端領域に対して、より不安定性が低い。許容される不一致の数は、オリゴマーの長さ、二重鎖内のＧ：Ｃ塩基対合の割合、および二重鎖内の不一致の位置に、良く知られた二重鎖の安定性の原則に従って、依存する。こうしたアンチセンスオリゴマーは、ウィルス核酸標的配列に１００％相補的である必要は無いが、核酸標的の生物学的活性（例えば、ウィルスＲＮＡの環化）が調節されるように、それは標的配列への安定かつ特異的な結合に効果的である。

上記のオリゴマーと上記の標的配列との間に形成される二重鎖の安定性は、結合のＴ_ｍと細胞性酵素による切断に対する二重鎖の感受性との関数である。相補配列ＲＮＡに対するアンチセンス化合物のＴ_ｍは、従来の方法（例えば、Ｈａｍｅｓら Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８５，１０７−１０８頁によって記述されたもの）によって測定され得る。それぞれのアンチセンスオリゴマーは、相補配列ＲＮＡに対して、体温より高い、そして好ましくは４５℃より高い結合Ｔ_ｍを有するべきである。６０〜８０℃の範囲、またはそれより高いＴ_ｍが好ましい。周知の原則に従って、相補的な塩基のＲＮＡハイブリッドに対するオリゴマー化合物のＴ_ｍは、二重鎖内のＣ：Ｇ対合した塩基の割合を増加させること、および／または、ヘテロ二重鎖の（塩基対合内の）長さを増加させることによって、増加し得る。同時に、細胞による取り込みを最適化させる目的のために、オリゴマーのサイズを制限することが有利であり得る。従って、１５塩基以下の長さで、高いＴ_ｍ（５０℃以上）を示す化合物が一般に、高いＴ_ｍ値のために２０塩基以上を要求する化合物よりも好ましい。

以下の表２には、フラビウィルス属の選択されたウィルスの５’−ＣＳおよび３’−ＣＳを指向した、模範的なターゲティング配列を収載する。配列番号１６−２７によって識別されるこれらの配列は、上記の配列番号５−１５として識別される配列に相補的かつ逆平行である（配列番号１９は配列番号８に相補的であり、そして配列番号９に対して、１つの不一致を含んで相補的であり、配列番号２７はデング熱２型ウィルスの３’末端環化配列を標的としている）。上記のように、オリゴヌクレオチドアナログ内の実際の標的配列は、表１内の対応する標的配列の一部分のみに相補的であってよく、配列番号１内の配列の一部、またはそれに相補的な配列番号３、あるいは配列番号２またはそれに相補的な配列番号４を含む。

より一般的には、本発明では、模範的なターゲティング配列として、ウィルスの正鎖ＲＮＡゲノムの領域に相補的な、少なくとも８塩基の配列を意図し、その領域は、ゲノムの５’末端環化配列もしくは３’末端環化配列である配列番号１、またはそれに相補的な配列番号３の少なくとも一部を、この５’−ＣＳで識別されるフラビウィルスのグループのために含むか、あるいは、配列番号２またはそれに相補的な配列番号４の少なくとも一部を、この５’−ＣＳで識別されるフラビウィルスのグループのために含む。好ましい実施形態において、ターゲティング配列は、フラビウィルスの１つのグループのために、配列番号３として識別される、ゲノムの３’末端環化配列の少なくとも一部分に、および、フラビウィルスのもう１つのグループのために、配列番号４として識別される、ゲノムの３’末端環化配列の少なくとも一部分に、相補的である。ターゲティング配列は、ウィルスの５’末端環化配列と３’末端環化配列との間の塩基対合を崩壊させる（すなわち、図１に図示されたように、環化ボックス内に示された、対合する塩基のステム二次構造を崩壊させる）に十分な数の塩基を、ＣＳ配列内に含む。この構造を崩壊させるために要求されるターゲティング配列の数は、好ましくは、２つの相補的な環化配列の内の１つに相補的な、少なくとも２〜４塩基に加えて、隣接する標的配列の塩基に相補的な塩基である。

１つの実施形態において、ターゲティング配列は、選択したウィルスの５’末端環化配列または３’末端環化配列（すなわち、配列番号１−４のいずれか）の全体に相補的な塩基を含む。

もう１つの実施形態において、ターゲティング配列は、２つの環化配列の、対応する相補的な領域に相補的である。例えば、図１の配列ボックスの上端に示される２つの環化配列の相補的な４塩基部分を含む８塩基の標的配列は、不連続な配列５’ＣＡＵＡ．．．ＵＡＵＧ３’を有する。この配列に効果的に結合し、そして崩壊させるターゲティング配列は、配列５’ＣＡＴＡ．．．ＴＡＴＧ３’を有し得、ここで「．．．」は直接的な５’末端−３’末端のサブユニット連結であってよく、または、標的配列内の不連続面に適応するように設計された、ＰＥＧリンカーのようなスペーサーであってよい。

後者の実施形態は、本発明のもう１つの局面に従って、アンチセンスオリゴヌクレオチドアナログの特定の事例を表し、このアンチセンスヌクレオチドは、ＲＮＡ内の「ステム」二次構造を形成する配列の相補的な部分に対して指向され、そして、ステム構造を崩壊させる目的のために、ステム構造の双方の鎖に相補的な塩基を、ターゲティング塩基として含む。

表１内の標的配列は、ＲＮＡに特徴的なウラシル（Ｕ）塩基を含むように表され、そして表２内のターゲティング配列は、ＤＮＡに特徴的なチミン塩基を含むように表されることに留意のこと。ターゲティング配列の塩基は、通常のＤＮＡ塩基またはそのアナログ（例えばウラシル）であり、それは、標的配列のＲＮＡ塩基とのワトソン−クリック塩基対合を可能とすることが、理解される。

（ＩＶ．アンチセンスオリゴマー）
（Ａ．性質）
上記に詳述したように、アンチセンスオリゴマーは、ウィルスゲノム、好ましくは５’−ＣＳまたは３’ＣＳのどちらかの標的部分に向けて指向された塩基配列を有する。さらに、上記のオリゴマーは、感染した宿主細胞（例えば、感染した動物被験体内）に投与された場合、感染したウィルスを効果的に標的とし得る。上記のオリゴマー化合物が、（ａ）哺乳動物細胞に能動的に取り込まれる能力を有し、そして（ｂ）一旦取り込まれると、約５０℃をこえるＴ_ｍを有する標的ｓｓＲＮＡと二重鎖を形成する場合、この要求が満たされる。

下記に記述するように、細胞によって取り込まれる能力は、上記のオリゴマーの骨格が実質的に電荷を持たないことを要求し、そして好ましくは、上記のオリゴマーの構造が、細胞膜を越えた能動輸送または促進輸送の基質として認識されることを要求する。上記のオリゴマーが標的ＲＮＡと安定な二重鎖を形成する能力はまた、オリゴマーの骨格、ならびに、上記に記した因子、アンチセンスオリゴマーの標的に関した相補性の長さおよび程度、Ａ：Ｔ塩基対に対するＧ：Ｃ塩基対の割合、ならびに、任意の不一致の塩基の位置にも依存する。上記のアンチセンスオリゴマーの、細胞性ヌクレアーゼに抵抗する能力は、因子の残存、および因子の、細胞の原形質への最終的な輸送を促進する。

以下は、任意の所与の、実質的に電荷を持たない骨格を、これらの要求に応ずる能力について試験するための、開示された方法である。

（Ａ１．細胞による能動的な取り込み、または促進的な取り込み）
上記のアンチセンス化合物は、遊離の（複合体でない）形態で投与される場合には、促進輸送または能動輸送によって、または、複合体の形態で投与される場合には、エンドサイトーシスの機構によって、宿主の細胞膜を越えて、宿主細胞により取り込まれ得る。

因子が遊離の形態で投与される場合には、上記のアンチセンス化合物は実質的に電荷を持つべきでなく、このことは、そのサブユニット間の連結の大多数が、生理的ｐＨにおいて電荷を持たないことを意味する。本発明を支持して実行された実験は、少数の正味の電荷（例えば、１５〜２０マーのオリゴマーについて１〜２）が、実際に、実質的に電荷を持たない骨格を有する、あるオリゴマーの、細胞による取り込みを亢進し得ることを示す。電荷は、オリゴマー自身（例えば、骨格の連結内）に保有されてもよく、または末端の荷電した基の付属物であってもよい。好ましくは、荷電した連結の数は、４つの電荷を持たない連結あたり、荷電した連結はわずか１つである。より好ましくは、その数は、１０の電荷を持たない連結あたりわずか１つであり、または２０の電荷を持たない連結あたりわずか１つである。ある実施形態において、オリゴマーは完全に電荷を持たない。

オリゴマーはまた、反対の電荷がおよそ同数存在している限り、負に荷電した骨格連結、および正に荷電した骨格連結の双方を含み得る。好ましくは、上記のオリゴマーは、どちらかの電荷が、３〜５個を越えて連続したサブユニットの連続を含まない。例えば、上記のオリゴマーは、所与の数の陰イオン性の連結（例えば、ホスホロチオエート、またはＮ３’→Ｐ５’ホスホラミデート連結）、および、匹敵する数の陽イオン性の連結（例えば、Ｎ，Ｎ−ジエチレンジアミンホスホラミデート（Ｄａｇｌｅ，Ｌｉｔｔｉｇら ２０００））を有し得る。正味の電荷は、好ましくは、中性であるか、またはオリゴマー１つにつき最大で１〜２の正味の電荷である。

実質的に、または完全に電荷を持たないことに加えて、上記のアンチセンス因子は、好ましくは、膜輸送系（すなわち、膜タンパク質またはタンパク質）の基質であり、この膜輸送系は、細胞膜を越えた、オリゴマーの促進輸送または能動輸送を可能とする。この特徴は、以下の通りの、オリゴマーの相互作用または細胞の取り込みの、多数の試験の１つによって決定される。

第１の試験は、細胞表面の受容体への結合を評価し、これは、オリゴマー化合物が、細胞表面において、選択された荷電したオリゴマー（例えば、ホスホロチオエートオリゴマー）を置換するか、あるいはそれによって置換される能力を調べることによる。細胞は、所与の量の試験オリゴマーとともにインキュベートされ、この試験オリゴマーは代表的には蛍光標識されており、最終的なオリゴマー濃度は、約１０〜３００ｎＭの間である。すぐその後に（例えば、（試験オリゴマーの顕著な内部移行が起き得た後）１０〜３０分間）、置換化合物が、濃度を徐々に増大させて、加えられる。試験化合物が細胞表面の受容体に結合し得るならば、置換化合物が、試験化合物を置換することが観察される。置換化合物が、試験化合物の濃度の１０倍以下の濃度において、５０％の置換を引き起こすことが示されたならば、その試験化合物は、置換化合物と同じ、細胞輸送系の認識部位に結合するものと考えられる。

第２の試験は細胞輸送を測定し、それは、試験化合物の、標識されたリポーター（例えば、蛍光リポーター）を細胞内に輸送する能力を調べることによる。細胞は、標識された試験化合物の存在下でインキュベートされ、標識された試験化合物は、最終濃度が約１０〜３００ｎＭの間で加えられる。３０〜１２０分間のインキュベート後、細胞は、例えば顕微鏡によって、細胞内の標識を調べられる。顕著な細胞内の標識の存在は、試験化合物が、促進輸送または能動輸送によって輸送されたことの証明である。

上記のアンチセンス化合物は、複合体の形態でもまた投与され得、ここで、複合体の因子は代表的にはポリマー（例えば、陽イオン性脂質、ポリペプチド、または非生物学的陽イオン性ポリマー）であり、アンチセンス化合物上に、任意の正味の電荷と反対の電荷を有する。陰イオン性のオリゴヌクレオチドと、陽イオン性の脂質、またはその他のポリマー構成成分との間で、二重層複合体を含む、複合体を形成する方法は周知である。例えば、リポゾーム構成成分であるＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）（Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｇａｄｅｋら １９８７）は、陽イオン性脂質であるＤＯＴＭＡ（Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）および、中性のリン脂質であるＤＯＰＥ（ジオレイルホスファチジルエタノアミン）を含み、広く用いられている。投与後、上記の複合体はエンドサイトーシス機構を通して細胞に取り込まれ、代表的には、エンドソーム体内での粒子封入に関与する。

上記のアンチセンス化合物はまた、アンチセンスオリゴマーの５’末端または３’末端に連結された、アルギニンの豊富なペプチドと結合体化された形態で投与され得る。上記のペプチドは代表的には８〜１６アミノ酸であり、アルギニン、ならびに、フェニルアラニンおよびシステインを含むその他のアミノ酸の混合からなる。オリゴマーに結合体化されたペプチドへの細胞の曝露は、結果として、細胞内への取り込み、およびＲＮＡ標的への輸送の亢進を招く（Ｍｏｕｌｔｏｎ，Ｎｅｌｓｏｎら ２００４）。

あるいは、および本発明のもう１つの局面に従って、任意の所与の骨格を有するオリゴマーの必須の性質は、単純なインビボの試験によって確かめられ得、その試験では、標識された化合物が動物に投与され、そして、オリゴマーが投与されてから数時間後に動物から採取された体液サンプルが、標的ＲＮＡとのヘテロ二重鎖の存在についてアッセイされる。この方法は、以下の小節Ｄに詳述される。

（Ａ２．ＲＮａｓｅＨに対する実質的な抵抗性）
アンチセンスオリゴヌクレオチドによる発現の阻害を説明するために、２つの一般的な機序が提唱されている（Ａｇｒａｗａｌ，Ｍａｙｒａｎｄら １９９０；Ｂｏｎｈａｍ，Ｂｒｏｗｎら １９９５；Ｂｏｕｄｖｉｌｌａｉｎ，Ｇｕｅｒｉｎら １９９７）。第１の機序では、オリゴヌクレオチドとウィルスＲＮＡとの間に形成されたヘテロ二重鎖はＲＮａｓｅＨの基質として作用し、それはウィルスＲＮＡの切断に導く。このクラスに属する、または属すると提唱されているオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、およびホスホジエステル（改変されていない「天然の」オリゴヌクレオチド）を含む。こうした化合物は、オリゴマー：ＲＮＡ二重鎖構造の中で、ウィルスＲＮＡをＲＮａｓｅＨによる加水分解に曝し、それゆえ機能を失う。

オリゴヌクレオチドアナログの第２のクラスは、「立体構造的ブロッカー」またはそれに代えて、「ＲＮａｓｅＨ不活化」または「ＲＮａｓｅＨ抵抗性」と称され、ＲＮａｓｅＨの基質として作用することが認められず、そして、標的ＲＮＡの核原形質輸送、スプライシング、翻訳、または複製を立体構造的にブロックすることで作用すると考えられる。このクラスは、メチルホスホネート（Ｔｏｕｌｍｅ，Ｔｉｎｅｖｅｚら １９９６）、モルホリノオリゴヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ある２’−Ｏ−アリルまたは２’−Ｏ−アルキルで改変されたオリゴヌクレオチド（Ｂｏｎｈａｍ，Ｂｒｏｗｎら １９９５）、およびＮ３’→Ｐ５’ホスホラミデート（Ｄｉｎｇ，Ｇｒａｙａｚｎｏｖら １９９６；Ｇｅｅ，Ｒｏｂｂｉｎｓら １９９８）を含む。

試験オリゴマーは、試験化合物とＲＮＡ：オリゴマー二重鎖を形成することによる、そのＲＮａｓｅＨ抵抗性についてアッセイされ得、そして、Ｓｔｅｉｎらに記述されているように、上記の二重鎖をＲＮａｓｅＨと共に、標準のアッセイ条件下でインキュベートする。ＲＮａｓｅＨに曝露した後、インタクトな二重鎖の存在または非存在が、ゲル電気泳動または質量分析法によってモニターされ得る。

（Ａ３．インビボでの取り込み）
本発明のもう１つの局面に基づき、所与のアンチセンスオリゴマー型が、上記に記述された、要求される特徴（すなわち、高いＴ_ｍ、宿主細胞によって能動的に取り込まれる能力、およびＲＮａｓｅＨに対する実質的な抵抗性）を備えていることを確かめるための、単純で迅速な試験が提供される。この方法は、適切に設計されたアンチセンス化合物が、哺乳動物被験体に投与された場合に、ウィルスＲＮＡ標的の相補的な部分と安定なヘテロ二重鎖を形成し、そして、引き続いてそのヘテロ二重鎖は尿（またはその他の体液）中に現れる、という発見に基づいている。この方法の詳細はまた、共有に係る米国特許出願第０９／７３６，９２０号（表題は「Ｎｏｎ−Ｉｎｖａｓｉｖｅ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ Ｔａｒｇｅｔ ＲＮＡ」（非侵襲性の方法））においても示され、その開示は本明細書にて参考として援用される。

手短に言えば、調べられる骨格を含み、公知のＲＮＡを標的とする塩基配列を有する試験オリゴマーが、動物（例えば、哺乳動物被験体）に注射される。そのアンチセンスオリゴマーは、任意の細胞内ＲＮＡに対して指向され得、その細胞内ＲＮＡは、宿主ＲＮＡまたは感染したウィルスのＲＮＡを含む。投与後数時間（代表的には８〜７２時間）において、尿がアンチセンス−ＲＮＡヘテロ二重鎖の存在についてアッセイされる。ヘテロ二重鎖が検出された場合、その骨格は、本発明のアンチセンスオリゴマーとして用いるに適している。

試験オリゴマーは、もし哺乳動物被験体に適しているならば、後の解析を容易にするために、（例えば、蛍光タグまたは放射活性タグによって）標識され得る。上記のアッセイは、任意の適した固相の形式、または液体の形式においてあり得る。一般に、固相アッセイは、ヘテロ二重鎖の分析物の固相支持体（例えば、粒子あるいは、ポリマーまたは試験小片の基材）への最初の結合、および、結合したヘテロ二重鎖の存在／量の検出を含む。液相アッセイでは、分析物サンプルは、代表的には、干渉するサンプルの構成成分を除くために前処理される。オリゴマーが標識される場合には、ヘテロ二重鎖の存在は、標識タグの検出によって確認される。非標識化合物のためには、固相の形式での場合には、ヘテロ二重鎖はイムノアッセイによって検出されてよく、または、溶液もしくは懸濁液の形式での場合には、質量分析法もしくは他の公知の方法によって検出されてよい。

上記のアンチセンスオリゴマーが、ウィルスゲノムのウィルス特異的な領域（例えば、フラビウィルスの５’−ＣＳおよび３’−ＣＳを含む領域）に相補的な場合、上記の方法は、所与のｓｓＲＮＡウィルスの存在の検出に用いられ得る。上記の方法はまた、処置方法の間の、ウィルスの量の減少をモニターするためにも用いられ得る。

（Ｂ．模範的なオリゴマー骨格）
オリゴヌクレオチドアナログにおいて用いられ得る非イオン性の連結の例は、図２Ａ−２Ｇに示される。これらに図において、Ｂは、塩基特異的な水素結合による、ポリヌクレオチド内の塩基で、好ましくは、アデニン、シトシン、グアニン、およびウラシルから選択される塩基への結合に効果的な、プリンまたはピリミジン塩基対合部を表す。適した骨格構造は、カーボネイト連結（２Ａ、Ｒは酸素）およびカルバメート連結（２Ａ、ＲはＮＨ_２）（ＭｅｒｔｅｓおよびＣｏａｔｓ １９６９；Ｇａｉｔ，Ｊｏｎｅｓら １９７４）；アルキルホスホネート連結およびホスホトリエステル連結（２Ｂ、Ｒはアルキルまたは−Ｏ−アルキル）（Ｌｅｓｎｉｋｏｗｓｋｉ，Ｊａｗｏｒｓｋａら １９９０）；アミド連結（２Ｃ）（Ｂｌｏｍｍｅｒｓ，Ｐｉｅｌｅｓら １９９４）；スルホン連結およびスルホンアミド連結（２Ｄ、Ｒ_１，Ｒ_２はＣＨ_２）（Ｒｏｕｇｈｔｅｎ １９９５；ＭｃＥｌｒｏｙ １９９４）；およびチオホルムアセチル連結（２Ｅ）（Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ １９９０；Ｃｒｏｓｓ １９９７）を含む。後者は、ホスホロチオエートアンチセンス化合物に対して、より一層の二重鎖安定性および三重鎖安定性を有することが報告されている（Ｃｒｏｓｓ １９９７）。構造２Ｆの３’−メチレン−Ｎ−メチルヒドロキシアミノ化合物もまた報告されている（Ｍｏｈａｎ １９９５）。

ペプチド核酸（ＰＮＡ）（図２Ｇ）はＤＮＡのアナログで、その骨格はデオキシリボース骨格に構造的に同型であり、ピリミジン塩基またはプリン塩基が接続されたＮ−（２−アミノエチル）グリシンユニットからなる。天然のピリミジン塩基およびプリン塩基を含むＰＮＡは、ワトソン−クリック塩基対合規則に従って、相補的なオリゴヌクレオチドにハイブリダイズし、そして、塩基対合認識の面においてＤＮＡを模倣する（Ｅｇｈｏｌｍら １９９３）。ＰＮＡの骨格は、ホスホジエステル結合ではなくてペプチド結合により形成され、それはアンチセンスの適用に適するようにしている。その骨格は電荷を持たず、結果として、通常よりも高い熱安定性を示すＰＮＡ／ＤＮＡ二重鎖またはＰＮＡ／ＲＮＡ二重鎖を得ている。ＰＮＡは、ヌクレアーゼまたはプロテアーゼによっては認識されない。

好ましいオリゴマー構造は、上記に記述したように、電荷を持たない連結に繋がった、塩基対合部を持つ、モルホリノを基本とするサブユニットを用いる。実質的に電荷を持たない、ホスホロジアミデートに連結されたモルホリノオリゴマー（例えば、図３Ａ−３Ｄに図示したような）は、特に好ましい。アンチセンスオリゴマーを含むモルホリノオリゴヌクレオチドは、例えば、共有に係る米国特許第５，６９８，６８５号、同第５，２１７，８６６号、同第５，１４２，０４７号、同第５，０３４，５０６号、同第５，１６６，３１５号、同第５，１８５，４４４号、同第５，５２１，０６３号、および同第５，５０６，３３７号に詳述され、これらは全て、本明細書内で参考として明白に援用される。

モルホリノを基本とするサブユニットの重要な性質としては以下が挙げられる：オリゴマー形態の中で、安定で電荷を持たない骨格連結によって連結される能力；形成されるポリマーが、高いＴ_ｍを有し、さらに１０〜１４塩基の短さのオリゴマーを有する、標的ＲＮＡを含む、相補的な塩基の標的核酸にハイブリダイズし得るように、ヌクレオチド塩基（例えば、アデニン、シトシン、グアニン、またはウラシル）を支持する能力；上記のオリゴマーが哺乳動物細胞内に能動的に輸送される能力；およびオリゴマー：ＲＮＡヘテロ二重鎖が、ＲＮＡｓｅによる分解に抵抗する能力。

本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの模範的な骨格構造は、図３Ａ−３Ｄに示されるβ−モルホリノサブユニット型を含み、それぞれ、電荷を持たない、リン含有サブユニット連結に連結される。図３Ａは、５原子反復ユニット骨格を形成するリン含有連結を示し、ここで、モルホリノ環は１原子のホスホアミド連結によって連結される。図３Ｂは、６原子反復ユニット骨格を生成する連結を示す。この構造では、５’モルホリノ炭素をリン基に連結する原子Ｙは、硫黄、窒素、炭素、または好ましくは酸素であり得る。リンからぶら下がったＸ部は、フッ素、アルキルまたは置換したアルキル、アルコキシまたは置換したアルコキシ、チオアルコキシまたは置換したチオアルコキシ、あるいは、置換されていない、一置換の、または二置換の窒素であり得、これらの窒素は環状構造（例えば、モルホリンまたはピペリジン）を含む。アルキル、アルコキシ、およびチオアルコキシは、好ましくは１〜６個の炭素原子を含む。Ｚ部は硫黄または酸素であり、そして好ましくは酸素である。

図３Ｃおよび３Ｄに示される連結は、７原子ユニットの長さの骨格として設計される。構造３Ｃでは、Ｘ部は構造３Ｂと同様であり、そしてＹ部はメチレン、硫黄、または好ましくは酸素である。構造３Ｄでは、Ｘ部およびＹ部は構造３Ｂと同様である。特に好ましいモルホリノオリゴヌクレオチドは、図３Ｂに示される形態のモルホリノサブユニット構造から構成されるモルホリノオリゴヌクレオチドを含み、そこでは、ＸはＮＨ_２またはＮ（ＣＨ_３）_２であり、Ｙは酸素であり、そしてＺは酸素である。

上記に記したように、実質的に電荷を持たないオリゴマーは、都合よく、限られた数の荷電した連結（例えば、毎５個の電荷を持たない連結あたり約１つ以下、より好ましくは、毎１０個の電荷を持たない連結あたり約１つ以下）を含む。これゆえ、少数の荷電した連結（例えば、荷電したホスホラミデートまたはホスホロチオエート）がまた、オリゴマーの中に取り込まれ得る。

アンチセンス化合物は、段階的な固相での合成によって調製され得、そこでは、上記で引用した参考文献に詳述された方法を用いる。いくつかの事例では、（例えば、薬物動態を亢進するために、または化合物の獲得または検出を容易にするために）アンチセンス化合物に、さらなる化学的成分を加えることが望ましい。こうした成分は、標準の合成方法に従って、代表的にはオリゴマーの末端に、共有結合的に連結され得る。例えば、ポリエチレングリコール部またはその他の親水性のポリマー（例えば、１０〜１００個の単量体サブユニットを有する）の付加は、溶解性の向上に有用であり得る。１つ以上の荷電した基（例えば、陰イオン性に荷電した基（例えば、有機酸））は、細胞による取り込みを亢進し得る。リポーター部（例えば、フルオレセインまたは放射能標識された基）は、検出する目的で接続され得る。あるいは、オリゴマーに接続されたリポーター標識はリガンド（例えば、抗原またはビオチンであり、これらは標識された抗体またはストレプトアビジンに結合し得る）であり得る。アンチセンスオリゴマーに接続する、またはこれを改変するための成分の選択では、一般に、当然のことながら、生体適合性であり、そして望ましくない副作用無しに、被験体が耐性を示すような、化学物質群を選択することが望ましい。

（Ｖ．ウィルス複製の阻害）
上記に詳述したアンチセンス化合物は、哺乳動物細胞（例えばヒト細胞）および鳥類細胞を含む動物の細胞内での、フラビウィルスの複製の阻害に有用である。１つの実施形態において、こうした阻害は、これらのウィルスによる宿主動物の感染の処置において有効である。よって、１つの実施形態において、上記の方法は、ウィルスに感染した細胞を、特定のウィルスの複製を阻害するために有効なアンチセンス因子に接触させる工程を含む。この実施形態において、上記のアンチセンス因子は、所与のウィルスに感染した哺乳動物被験体（例えば、ヒトまたは家畜）に、適した薬学的キャリア中で、投与される。上記のアンチセンスオリゴヌクレオチドが、宿主内のＲＮＡウィルスの成長を阻止することが企図される。ＲＮＡウィルスは、宿主の通常の成長または発育に有害な影響をほとんど、または全く与えることなく、数の上で減少し得るか、または除去され得る。

（Ａ．感染因子の同定）
感染を引き起こす特定のウィルスは、当該分野で公知である方法（例えば、血清学的方法または培養的方法）によって、または本発明のアンチセンスオリゴマーを用いた方法によって、決定され得る。

血清学的同定は、被験体の生物学的試料（例えば、便、尿、脳脊髄液、血液など）から単離されたウィルスサンプルまたはウィルス培養物を用いる。ウィルスを検出するためのイムノアッセイは一般に、当業者に慣用的に用いられている方法（例えば、ＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロット）によって行われる。さらに、特定のウィルス株またはウィルス種に特異的なモノクローナル抗体が、たいてい市販されている。

培養的方法は、特徴（例えば、様々な培養条件下での成長率および形態）の比較を含む、しかしそれに限らない、技術を用いることで、特定の型のウィルスを単離し、同定するために用いられ得る。

感染した被験体内のウィルス感染性因子を同定するためのもう１つの方法では、多様なフラビウィルス種を標的とする１つ以上のアンチセンスオリゴマーを用いる。任意の特徴的なウィルスＲＮＡを標的とする配列が用いられ得る。望ましい標的配列は、好ましくは、（ｉ）広いウィルスの科／属に共通であり、そして（ｉｉ）感染される宿主（例えばヒト）では見つからない。多数の感染性ウィルスに特徴的な核酸配列は、公共のデータベースで入手可能であり、特異的なオリゴマーの設計のための基礎として役立ち得る。

それぞれの多数のオリゴマーのために、以下の工程が行われる：（ａ）上記のオリゴマーが被験体に投与される；（ｂ）上記の投与後、選択された時間において、被験体から体液サンプルが得られる；そして（ｃ）上記のサンプルが、アンチセンスオリゴマーおよびウィルスゲノムの相補的な部分を含む、ヌクレアーゼ抵抗性のヘテロ二重鎖の存在についてアッセイされる。工程（ａ）〜（ｃ）は、少なくとも１つの、あるいは、ウィルスまたはウィルスの科を識別するために必要なだけの、このようなオリゴマーについて行われる。オリゴマーは、経時的に、またはより便利には、同時的に、投与され得、かつアッセイされ得る。ウィルスは、アンチセンスオリゴマー、および、所与の公知のウィルスまたは所与の公知のウィルス科のウィルスゲノムの相補的部分を含むヘテロ二重鎖の存在（または非存在）に準じて、同定される。

好ましくは、広範な科を標的とする、最初の群のオリゴマーが最初に用いられ、続いて、それによって同定された広範な科／属に含まれる、特定の属および／または種および／または株に相補的な、選択されたオリゴマーが用いられる。この第２の群のオリゴマーは、広範な科／属に含まれる、特定の属および／または種および／または株を指向した標的配列を含む。いくつかの異なる第２のオリゴマーの集団（すなわち、第１の段階で試験された、広範なウィルス科／属のそれぞれの内の１つ）が一般に提供される。配列は、（ｉ）試験された、個々の属／種／株に特異的で、（ｉｉ）ヒトでは見つからないものが選択される。

（Ｂ．アンチセンスオリゴマーの投与）
標的核酸へのアンチセンスオリゴマーの有効な送達は、処置の重要な局面である。本発明に基づき、アンチセンスオリゴマーの送達の経路は、経口経路および非経口経路（例えば、静脈内送達、皮下送達、腹腔内送達、筋肉内送達、吸入による送達、経皮送達および局所的な送達）を含む、様々な全身性の経路を含むが、これらに限られない。適切な経路は、処置下にある被験体の状態に適するように、当業者によって決定され得る。例えば、皮膚のウィルス感染の処置における、アンチセンスオリゴマーの適した送達経路は、局所的な送達であり、一方、ウィルスの呼吸器感染の処置のためのアンチセンスオリゴマーの送達は、吸入による。オリゴマーはまた、ウィルス感染した場所または血流に、直接送達され得る。

アンチセンスオリゴマーは、生理的に受容可能な、任意の便利なビヒクル内において投与され得る。こうした組成物は、当業者によって用いられる、様々な標準の薬学的に受容可能なキャリアのいずれかを含み得る。例としては、生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）、水、エタノール水溶液、エマルジョン（例えば、油／水エマルジョン、またはトリグリセリドエマルジョン）、錠剤、およびカプセルが挙げられるが、これらに限られない。適した、生理的に受容可能なキャリアの選択は、選択される投与の方法に依存して、変わる。

いくつかの事例では、アンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞への取り込みを促進するために、リポソームが用いられ得る（例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｓ．Ａ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ １０（１２）：１９８０−１９８９，１９９６；Ｌａｐｐａｌａｉｎｅｎら，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ． ２３：１１９，１９９４；Ｕｈｌｍａｎｎら，ＡＮＴＩＳＥＮＳＥ ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ：Ａ ＮＥＷ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ ＰＲＩＮＣＩＰＬＥ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｖｏｌｕｍｅ ９０，Ｎｏ．４，ｐａｇｅｓ ５４４−５８４，１９９０；Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，Ｇ．，Ｃｈａｐｔｅｒ １４，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ，Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｐｐ．２８７−３４１，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９７９を参照）。ヒドロゲルもまた、アンチセンスオリゴマーの投与のためのビヒクルとして用いられ得る（例えば、ＷＯ９３／０１２８６に記載のような）。オリゴヌクレオチドはまた、細粒または微粒子内にて投与され得る（例えば、Ｗｕ，Ｇ．Ｙ．およびＷｕ，Ｃ．Ｈ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２，１９８７を参照）。あるいは、米国特許第６，２４５，７４７号に記載のように、アンチセンスオリゴマーと複合した、ガスを充填した超微粒気泡の使用は、標的組織への送達を亢進し得る。

徐放型の化合物もまた用いられ得る。これらは、造形品（例えば、フィルムまたはマイクロカプセル）の形態をした、半透性の重合体マトリックスを含み得る。

上記の方法の１つ局面において、被験体はヒト被験体（例えば、局所的な、または全身性のウィルス感染を受けていると診断された患者）である。患者の状態はまた、本発明のアンチセンスオリゴマーの予防的な投与を指示し得る（例えば、（１）免疫障害を持つ；（２）火傷を負っている；（３）留置カテーテルを有する；または（４）手術を受ける間近であるか、または最近受けた、患者の場合において）。１つの好ましい実施形態において、オリゴマーはホスホロジアミデートモルホリノオリゴマーであって、薬学的に受容可能なキャリアに含まれ、経口的に送達される。もう１つの好ましい実施形態において、オリゴマーはホスホロジアミデートモルホリノオリゴマーであって、薬学的に受容可能なキャリアに含まれ、静脈内に送達される（ＩＶ）。

上記の方法のもう１つの適用において、被験体は家畜動物（例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、ブタ、ウシ、またはヤギなど）であり、そして処置は、予防的であるか、または治療的であるかのどちらかである。他の適用において、処置される感染動物は、１回以上フラビウィルスに感染したような、動物園の動物か、または野生の動物であり得る（例えば、アザラシ、ペンギン、またはタカ）。本発明はまた、治療量以下の量の、上記にて記載した型の抗ウィルス性アンチセンス化合物を補われた、穀類を含む家畜および家禽の食品組成物を含む。また、家畜および家禽に、治療量以下の量の抗ウィルス薬を補われた穀類を与える方法において、上記の穀物が、治療量以下の量の、上記に記載されたような抗ウィルス性のオリゴヌクレオチド組成物を補われた場合における改善も企図される。

上記のアンチセンス化合物は一般に、結果として血中濃度のピークが、少なくとも２００〜４００ｎＭのアンチセンスオリゴマーとなることに有効な量および様式で、投与される。代表的には、約１〜２週間の期間に対して、１用量以上のアンチセンスオリゴマーが、一般には規則的な間隔で投与される。経口投与のための好ましい用量は、７０ｋｇあたり約１〜２５ｍｇのオリゴマーからである。いくつかの事例では、患者あたり２５ｍｇを越えるオリゴマーの用量が必要となり得る。ＩＶの投与のために、好ましい用量は、７０ｋｇあたり、約０．５ｍｇ〜１０ｍｇのオリゴマーである。上記のアンチセンスオリゴマーは、短期間に対して規則的な間隔で（例えば、２週間以下に対して毎日）投与され得る。しかし、いくつかの事例では、オリゴマーは、より長期間にわたって断続的に投与される。投与に続いて、または同時的に、抗生物質またはその他の治療上の処置が与えられ得る。処置療法は、処置をされている被験体の、イムノアッセイ、その他の生化学的な試験、および生理的検査の結果に基づいて、示されたように調製され得る（用量、頻度、経路など）。

（Ｃ．処置のモニタリング）
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた、有効なインビボの処置療法は、投与の期間、用量、頻度、および経路、ならびに処置を施される被験体の状態（すなわち、局所的な、または全身的な感染に応じた投与と対比して、予防的投与）に従って、変化し得る。よって、こうしたインビボの療法はしばしば、最適な治療結果を達成するために、処置される特定の型のウィルス感染に適当な試験によるモニタリング、および、用量または処置療法における、対応した調節を必要とする。処置は、例えば、感染の一般的な指標（例えば、完全血球算定（ＣＢＣ）、核酸検出法、免疫診断試験、ウィルスの培養、またはヘテロ二重鎖の検出）によってモニターされ得る。

１つ以上の型のＲＮＡウィルスの成長の阻害または排除における、インビボで投与される本発明のアンチセンスオリゴマーの効力は、アンチセンスオリゴマーの投与に先立って、投与の間に、および投与に続いて被験体から採取された生物学的サンプル（組織、血液、尿など）から決定され得る。こうしたサンプルのアッセイは、（１）当業者に公知の手順（例えば、電気泳動的ゲル移動度アッセイ）を用いた、標的配列および非標的配列とのヘテロ二重鎖形成の存在または非存在のモニタリング；（２）標準の技術（例えば、ＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロッティング）によって決定される、ウィルスのタンパク質生成量のモニタリング；または（３）例えばスピアマン−カーバー（Ｓｐｅａｒｍａｎ−Ｋａｒｂｅｒ）法を用いた、ウィルス力価への効果の測定を含む（例えば、Ｐａｒｉ，Ｇ．Ｓ．ら，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ３９（５）：１１５７−１１６１，１９９５；Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｋ．Ｐ．ら，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ４０（９）：２００４−２０１１，１９９６，Ｃｏｔｔｒａｌ，Ｇ．Ｅ．（編）Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｐ．６０−９３，１９７８内、を参照）。

アンチセンスオリゴマー処置の効力をモニタリングする好ましい方法は、アンチセンス−ＲＮＡヘテロ二重鎖の検出による。アンチセンスオリゴマーの投与後、選択した時間において、サンプル内のヘテロ二重鎖種の存在の検出、および／またはヘテロ二重鎖種のレベルの測定のために、体液が収集される。代表的には、体液サンプルは投与後３〜２４時間に収集され、好ましくは、投与後６〜２４時間で収集される。上記に示したように、体液サンプルは、尿、唾液、血漿、血液、髄液、または生物的起源を持つその他の液体サンプルであり得、そして、その中に懸濁される細胞または細胞片、または液体培地およびその溶質を含み得る。収集されるサンプルの量は、代表的には０．１〜１０ｍｌの範囲で、好ましくは約１ｍｌ以下である。

サンプルは、望ましくない成分を除くために、および／または、望ましくないｓｓＲＮＡの突出領域を除く目的で、（例えば、ＲＮａｓｅ処理によって）サンプル内のヘテロ二重鎖を処理するために、処理され得る。もちろん、ヘテロ二重鎖の検出がサイズによる分離（例えば、質量分析の電気泳動）に依存している場合、突出を除くことは特に重要である。

サンプルから望ましくない成分を除くためには、様々な方法が利用可能である。例えば、ヘテロ二重鎖は正味で負の荷電を有するため、中性の、または正に荷電した物質からヘテロ二重鎖を分離するために、電気泳動法またはイオン交換法の技術を用い得る。サンプルはまた、表面に結合した抗体、またはヘテロ二重鎖に特異的に結合し得るその他の因子を有する固体の支持体に接触され得る。結合しない物質を除くために支持体を洗浄した後、ヘテロ二重鎖は、さらなる解析（例えば、電気泳動、質量分析、またはイムノアッセイによる）のために、実質的に精製された形態で放出され得る。

以下の例は本発明を例証するが、決して本発明を限定する意図を持つものではない。

（実施例１：インビトロでの西ナイルウィルスのアンチセンス阻害）
２つのＰＭＯオリゴマーを、培養されたＶｅｒｏ細胞において西ナイルウィルスに対するその活性について調べた。１つの２０マーのＰＭＯオリゴマーは、西ナイルウィルスの３’−ＣＳ領域を標的としている（ＷＮＶ３’ＣＳ、配列番号２６）。もう一方の２０マーのＰＭＯ化合物は「ナンセンスな」配列（５’−ＡＧＴＣＴＣＧＡＣＴＴＧＣＴＡＣＣＴＣＡ−３’）であり（ＮＣ−１）、これは任意のヒト、サル、またはＷＮＶの遺伝子配列と顕著な相同性を持たなかった。双方のＰＭＯオリゴマーを、インビトロでの細胞による取り込みを促進するために、５’末端においてペプチドと結合体化した（Ｒ_９Ｆ_２Ｃ−５’−ＰＭＯ）。２つの別々の実験、「２点」および「８点投与反応」を、２％ウシ胎児血清を補われた標準的な哺乳動物組織培養培地内に懸濁された細胞に、ウィルス種菌と共に、それぞれのＰＭＯオリゴマーを加えることで行った。２４時間後、細胞を、顕微鏡下で視覚的に、および、記載されるように（Ｍｏｒｒｅｙ，Ｓｍｅｅら ２００２）「ニュートラルレッド色素アッセイ」を用い、マイクロプレートリーダーによって定量的に、双方の手段によって、細胞変性効果について記録した。当業者にとって、ウィルス価において５０％の減少を結果として得る有効濃度（ＥＣ５０）が２０μＭを越える場合は、低い抗ウィルス活性であるとみなし、一方、ＥＣ５０が２０μＭより低い場合には、実質的な抗ウィルス活性を示している。以下の表は、これらの結果の概要を示す。

（実施例２：ダニ媒介性脳炎のアンチセンス阻害）
この実施例では、２種のフラビウィルス、ダニ媒介性脳炎ウィルス（ＴＢＥ）および西ナイルウィルス（ＷＮ）に対する、本発明のアンチセンスＰＭＯ化合物の抗ウィルス活性を試験するために立案された研究を記述する。２つのＰＭＯオリゴマーを、抗ウィルス活性について調べた（ＴＢＥ ３’ＣＳ、配列番号２５および；乱雑なコントロール配列であるＤＳ−ｓｃｒ（５’−ＡＧＴＣＴＣＧＡＣＴＴＧＣＴＡＣＣＴＣＡ−３’））。双方のＰＭＯオリゴマーは、記述されたように（米国特許出願第６０／４６６，７０３号、およびＭｏｕｌｔｏｎ，Ｎｅｌｓｏｎら ２００４）、細胞による取り込みを亢進するために、５’末端にアルギニンの豊富なペプチドを結合体化した（Ｒ_９Ｆ_２Ｃ−５’−ＰＭＯ）。ＷＮの３’ＣＳターゲティングＰＭＯと、ＴＢＥの３’ＣＳターゲティングＰＭＯとの間には全く相同性がないため、ＷＮウィルスの感染は、ネガティブコントロール感染を提供した。このコントロールは、それぞれのＰＭＯによる非特異的なウィルス抑制のレベルを示す。ＰＭＯ化合物を、２ｍＭのストック溶液を提供するように調製し、そして、組織培養細胞上の標準用量のウィルスに対して滴定した。細胞を、１の感染効率（ｍｏｉ）で感染し、そして、感染後１８時間に採取された培地の上清のサンプル内におけるウィルス収量を評価した。

本実施例で用いられた２つのウィルス株は：
１）ＴＣ４０１ 西ナイル ９９−３４９４０−３１Ａ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ株）継代２代目
２）ＴＣ３３９ ダニ媒介性脳炎ウィルス（Ｈｙｐｒ株）継代４９代目
継代１３０代目のＳＷ１３細胞（５％ＦＢＳを加えたＲＰＭＩ１６４０培地で増殖させた、ヒトコーカサス人副腎皮質腺癌細胞 ＥＣＡＡＣ ８７０３１８０１株）のＴ１７５組織培養フラスコ（ＮＵＮＣ）４つを、トリプシン−ＥＤＴＡ（１×）で２回洗浄し、そして３７℃にて２〜３分間インキュベートした。細胞を、フラスコあたり１１．５ｍｌの増殖培地に再懸濁し、そして貯蔵した。貯蔵された細胞懸濁液について細胞計数を行い、その結果は、９９％の生存度において１．７４×１０^６細胞／ｍｌであった。６ｍｌの細胞懸濁液を、４つのＴ１７５フラスコに播種するために用い、そして４０ｍｌの細胞懸濁液を、２７０ｍｌに希釈した。これを、１５個の６ウェルプレートにおいて、ウェルあたり３ｍｌアリコートずつ分配した。プレートを、コンフルエントな細胞単層を形成するように、一晩インキュベートした。

それぞれのＰＭＯ化合物を、４ｍｌの無血清ＲＰＭＩ１６４０培地に、２５μＭ、２０μＭ、１５μＭ、１０μＭ、および５μＭに希釈した。２個の６ウェルプレートのウェルから、培地を除いた。適切な化合物の希釈溶液２ｍｌをプレートの全てのウェルに分配し、そしてこのことは、双方のＰＭＯ化合物に関して別個のプレートにおいて繰り返した。このプレートを、３７℃にて５時間インキュベートした。２種のウィルスを−７０℃のフリーザーから出し、そして迅速に解凍した。それぞれのウィルスを２×１０^６ｐｆｕ／ｍｌに希釈し、４２ｍｌの無血清培地を生成した。６ウェルプレートをインキュベーターから取り出し、そして前処理培地を全てのウェルから吸引した。１ｍｌの培地をコントロールプレートのそれぞれのウェルに加えた（化合物無し）。それぞれのプレートセットに、２×１０^６ｐｆｕ／ｍｌに希釈したＴＢＥまたはＷＮのどちらかを、１ウェルあたり１ｍｌずつ入れた。このプレートを室温にて１時間インキュベートし、次いで培地を除き、そして細胞の前処理に用いたときと同じ濃度の試験化合物を加えた、２ｍｌのＲＰＭＩ１６４０＋１％ＦＢＳで置換した。このプレートを３７℃にて１８時間インキュベートした。

ウィルス力価を決定するための２４ウェルプレートを調製するために、継代１３１代目のＳＷ１３細胞のＴ１７５組織培養フラスコ（ＮＵＮＣ）８つを、トリプシン−ＥＤＴＡ（１×）で２回洗浄し、そして３７℃にて２〜３分間インキュベートした。細胞を、１フラスコにつき１１．５ｍｌの増殖培地に再懸濁し、そして貯蔵した。貯蔵された細胞懸濁液について細胞計数を行い、そして結果は、９９％の生存率において１．７×１０^６細胞／ｍｌであった。細胞懸濁液８０ｍｌを、６８０ｍｌに希釈した。これらの細胞を、８つの２４ウェルプレート上にて、１ウェルあたり１ｍｌアリコートずつ分配した。プレートを、コンフルエントな単層を形成するように一晩インキュベートした。

感染後１８時間にて、ＰＭＯ処理をし、ウィルス感染された６ウェルプレートから得られた培地の上清を、それぞれの個々のウェルから収集した。収集物の内３０μｌを、９６ウェルプレートの１カップに、２７０μｌの無血清培地と共に配置した。サンプルの残りは、クライオチューブ（ｃｒｙｏｔｕｂｅ）に入れ、そして−７０℃で保管した。２４ウェルプレートから培地を除き、そして２５０μｌの滴定希釈液を、９６ウェルプレートから２４ウェルプレートに移し、これを３７℃にて１時間インキュベートした。１ｍｌのアガロース重層培地をそれぞれのウェルに加え、そして、室温にてアガロースが固まらせた後、プレートを３７℃にて５日間インキュベートした。５日後、プレートをインキュベーターから取り出し、それぞれのウェルに１ｍｌの１０％ホルモル生理食塩水を加え、そしてプレートを室温にて３時間放置した。アガロース培地を除くためにプレートを流水で洗浄し、そして残りのプレートを洗浄する間に、逆さにして排水するために放置した。次いで、それぞれのウェルに１ｍｌの０．１％ナフタレンブラック染色液を入れ、そして、染色液を除き、かつプレートを流水で洗浄する前に、プレートを３０分間放置した。次いで、これらを３時間乾燥させるために（逆さにして）放置した。力価を決定するために、ウィルスプラークを計数した。

図４Ａおよび４Ｂは、ＰＭＯ処理した感染から得たウィルス力価を、未処理のコントロールに対する％として示しており、ここで、ウィルスに感染された細胞を、ＴＢＥＶまたはＷＮＶのどちらかで感染し、そして、ＴＢＥアンチセンス化合物（図４Ａ、ここで、この化合物は配列番号２５を有する）または、コントロール化合物（図４Ｂ、乱雑な配列）のどちらかで処理する。図４Ａおよび図４Ｂ内のウィルス力価の比較から見られるように、全ての細胞（処置した、およびコントロールの）のウィルス力価が、化合物濃度の増加に伴って減少し、このことは、アンチセンス化合物およびコントロール化合物の双方に存在する、付属したアルギニンの豊富なペプチドの細胞毒性効果によると考えられる。化合物濃度が１５μＭ以上の場合、ＷＮＶとの比較（図４Ａ）、および、乱雑な配列のコントロールとの比較（図４Ａおよび４Ｂの比較）の双方において、ＴＢＥウィルス阻害における配列特異的な増加が見られる。

（実施例３：アンチセンスＰＭＯによるデング熱ウィルス血清型１−４の阻害）
デング熱／デング出血熱（ＤＦ／ＤＨＦ）は、過去２０年以上にわたって、主要な世界的な健康上の問題となっている。デング熱ウィルス（ＤＥＮ）の地理学的分布、蚊であるその媒介昆虫、およびそれに起因する疾患の苦しみは、増加し続けている。世界保健機関は、毎年５０００万〜１億人の新たな感染が起きていると推定する。ＤＦ／ＤＨＦは現在、南アジアにおいて、子供たちの間の入院および死亡の主要な原因であり、そして、その発生率はアメリカにおいて鋭く上昇している。現在、ワクチンも、または有効な治療法も存在しない。成功するワクチンまたは治療法の１つの必要条件は、ヒトのＤＥＮの４つの血清型全てに対して有効であることである。この研究の目的は、３’ＣＳを標的としたＰＭＯの、培養されたＶｅｒｏ細胞内の４種の血清型のＤＥＮの複製の阻害に対する効力および特異性を評価することである。５つのＰＭＯ化合物を、ウィルスの転写および／または翻訳において重要であると認識されている正鎖ＤＥＮ２ ＲＮＡ内の配列要素を標的として設計した（４、５）。本研究においてＰＭＯは、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞への侵入を容易にするために、アルギニンの豊富なペプチドと結合体化した。

デング熱２型ウィルス（ＤＥＮ２）の３’−ＣＳ領域とハイブリダイズするように設計したＰＭＯを、哺乳動物細胞培養物内でのデング熱ウィルスの複製を阻害する能力について評価した。このＰＭＯは、その培養物内の細胞への侵入を容易にするために、短いアルギニンの豊富なペプチドと結合体化した（Ｒ_９Ｆ_２Ｃ−５’−ＰＭＯ）。Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞をＰＭＯ薬剤と共にインキュベートし、ＤＥＮ血清型１−４を接種し、そして、５〜８日後のプラークアッセイによってウィルス力価を決定した。３’環化配列を標的とした化合物（３’ＣＳ ＰＭＯ）は、図５Ａに示すように、４〜６日間にわたって、用量に依存した様式および配列特異的な様式で、コントロールに比べて、規模において３オーダー以上、ＤＥＮ２の力価を減少させた。図５Ｂ−５Ｄに示すような検出限界を下回るいくつかの場合において、１０μＭの３’ＣＳ ＰＭＯ溶液はそれぞれ、４種のデング熱の血清型の力価を、規模において２オーダー以上減少させた。有効な抗ＤＥＮ化合物は、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞内で増殖した西ナイルウィルス（ＷＮＶ）の力価を変化させることは無かった。これらのデータは、３’ＣＳ ＰＭＯ化合物が、ＤＥＮ１−４型の潜在的な治療薬であることを示している。

前述から、本発明の、いかに様々な目的および特徴が満たされるか理解される。標的配列は、いくつかのフラビウィルスにわたって保存されているため、単一のオリゴヌクレオチドアナログを、いくつかのウィルスのそれぞれを処置するために用い得る。例えば、配列番号１またはその相補体である配列番号３に対して指向する単一のアナログは、セントルイス脳炎ウィルス、マレーバレー脳炎ウィルス、西ナイルウィルス、クンジンウィルス、日本脳炎ウィルス、黄熱病ウィルス、デング熱ウィルス−１型、２型、３型、および４型、ならびに西ナイルウィルスの複製の阻害に用いることができ、そして、配列番号２またはその相補体である配列番号４に対して指向する単一のアナログは、ダニ媒介性脳炎ウィルス、ポワッサンウィルス、跳躍病ウィルス、キャサヌール森林病ウィルス、およびアルカーマウィルスの処置に用いることができる。

上記の標的配列が、１つの、または相補的な環化配列に限られる場合、上記のアナログは、ゲノム上の正鎖、および最初の複製物であるアンチセンス鎖の双方における、環化ステムの二次構造の崩壊に有効であり、それによって、正鎖および逆鎖の双方の複製のレベルにおいて、ウィルス複製の阻害に働く。

上記のアナログは体内で安定であり、いくつかのアナログ構造（例えば、ＰＭＯ）について、経口投与し得る。さらに、上記のアナログとウィルス標的との間のヘテロ二重鎖の形成は、フラビウィルスによる感染の存在または非存在の確認に、および／または、宿主による治療剤の取り込みの確認に用い得る。

図１は、フラビウィルスゲノムの５’末端部分および３’末端部分を、示される二次構造、ならびに、図の上端にあるボックスで指し示される５’末端環化配列および３’末端環化配列と共に示す。 図２Ａ−２Ｇは、電荷を持たない骨格を有する、様々なオリゴヌクレオチドアナログの骨格構造を示す。 図３Ａ−３Ｄは、３Ａ−３Ｄに示された、模範的なモルホリノオリゴヌクレオチドの、反復サブユニットセグメントを示す。 図４Ａおよび図４Ｂは、ＴＢＥＶアンチセンス（図４Ａ）および混合配列のアンチセンス（図４Ｂ）の濃度の増加に対する、ＴＢＥＶおよびＷＮＶの反応をプロットしたものである。 図５Ａ−５Ｄは、ＤＥＮアンチセンス（配列番号２７）に対する、４種のデング熱ウィルスの血清型の反応をプロットしたものである。 図５Ａ−５Ｄは、ＤＥＮアンチセンス（配列番号２７）に対する、４種のデング熱ウィルスの血清型の反応をプロットしたものである。

Claims (29)

1. 動物細胞内においてフラビウィルスの複製を阻害する方法であって、
   （ａ）オリゴヌクレオチドアナログであって、（ｉ）ヌクレアーゼ抵抗性の骨格を有し、（ｉｉ）該細胞に取り込まれ得、（ｉｉｉ）８〜４０個の間のヌクレオチド塩基を含み、そして（ｉｖ）該ウィルスの正鎖ＲＮＡゲノムの領域に相補的な、少なくとも８塩基の配列を有し、該ウィルスの正鎖ＲＮＡゲノムは、配列番号１−４からなる群から選択される該ゲノムの５’末端環化配列または３’末端環化配列の少なくとも一部分を含む、オリゴヌクレオチドアナログに該細胞を曝す工程、および
   （ｂ）該曝す工程によって、該細胞内において、該ウィルスのｓｓＲＮＡおよび該オリゴヌクレオチドから構成されるヘテロ二重鎖構造を形成する工程であって、該へテロ二重鎖構造は少なくとも４５℃で解離するＴｍによって特徴付けられ、そして、該ウィルスの５’末端環化配列および３’末端環化配列の間に崩壊した塩基対合を有する、工程
   を含む方法。
2. 前記細胞が曝される前記オリゴヌクレオチドアナログが、配列番号３および４からなる群より選択される、前記ゲノムの３’末端環化配列の少なくとも一部分に相補的な配列を含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記細胞が曝される前記オリゴヌクレオチドアナログが、それぞれ、配列番号１および２からなる群より選択される前記ゲノムの５’末端環化配列の一部分、および配列番号３および４からなる群より選択される該ゲノムの３’末端環化配列の相補的な部分を含むウィルスの配列と、ヘテロ二重鎖構造を形成し得る配列を含む、請求項１に記載の方法。
4. セントルイス脳炎ウィルス、マレーバレー脳炎ウィルス、西ナイルウィルス、クンジンウィルス、日本脳炎ウィルス、黄熱病ウィルス、デング熱ウィルス−１型、２型、３型、および４型、西ナイルウィルスのいずれかの複製を阻害するための請求項１に記載の方法であって、ここで、前記細胞が曝される前記オリゴヌクレオチドアナログが、該ウィルスの正鎖ＲＮＡゲノムの領域に相補的な少なくとも８塩基の配列を有し、該ウィルスの正鎖ＲＮＡゲノムは、それぞれ配列番号１および３からなる群から選択される該ゲノムの５’末端環化配列または３’末端環化配列の少なくとも一部分を含む、方法。
5. 前記細胞が曝される前記オリゴヌクレオチドアナログが、配列番号３に相補的な配列を含む、請求項４に記載の方法。
6. 前記細胞が曝される前記オリゴヌクレオチドアナログが、配列番号１として識別される前記ゲノムの５’末端環化配列の一部、および配列番号３として識別される該ゲノムの３’末端環化配列の相補的な部分を含む配列と、ヘテロ二重鎖構造を形成し得る配列を含む、請求項４に記載の方法。
7. ダニ媒介性脳炎ウィルス、ポワッサンウィルス、跳躍病ウィルス、キャサヌール森林病ウィルス、およびアルカーマウィルス（Ａｌｋｈｕｒｍａ ｖｉｒｕｓ）のいずれかの複製を阻害するための請求項１に記載の方法であって、ここで、前記細胞が曝される前記オリゴヌクレオチドアナログが、該ウィルスの正鎖ＲＮＡゲノムの領域に相補的な少なくとも８塩基の配列を有し、該ウィルスの正鎖ＲＮＡゲノムは、それぞれ、配列番号２および４からなる群から選択される該ゲノムの５’末端環化配列または３’末端環化配列の少なくとも一部分を含む、方法。
8. 前記細胞が曝される前記オリゴヌクレオチドアナログが、配列番号４に相補的な配列を含む、請求項７に記載の方法。
9. 前記細胞が曝される前記オリゴヌクレオチドアナログが、配列番号２として識別される前記ゲノムの５’末端環化配列の一部、および配列番号４として識別される該ゲノムの３’末端環化配列を含む配列と、ヘテロ二重鎖構造を形成し得る配列を含む、請求項７に記載の方法。
10. 前記細胞に曝される前記オリゴヌクレオチドアナログが、実質的に電荷を持たない、リン含有骨格に連結された、８〜２５個のモルホリノサブユニットから構成される、請求項１に記載の方法。
11. 前記細胞が曝される前記オリゴヌクレオチドアナログが、モルホリノサブユニットおよび、１つのサブユニットのモルホリノ窒素を、隣接するサブユニットの５’末端の環外炭素に結合する、リン含有サブユニット間結合から構成される、請求項１に記載の方法。
12. 前記細胞が曝される前記アナログの前記モルホリノサブユニットが、ホスホロジアミデート連結によって結合され、該ホスホロジアミデート連結は下記の構造に従っており：
    

    

    ここで、Ｙ_１は酸素、Ｚは酸素、Ｐｊはプリンまたはピリミジン塩基対合部分であって、塩基特異的水素結合によるポリヌクレオチド内の塩基への結合が効果的な部分、および、Ｘはアルキル、アルコキシ、チオアルコキシ、アミノ、またはジアルキルアミノを含むアルキルアミノである、請求項１１に記載の方法。
13. ヒト被験体内でのフラビウィルスの感染を処置するための請求項１２に記載の方法であって、ここで、前記曝す工程が、前記オリゴヌクレオチドアナログを該被験体に経口的に投与する工程を含む、方法。
14. ヒト被験体内でのフラビウィルスの感染を処置するための請求項１２に記載の方法であって、ここで、前記曝す工程が、前記オリゴヌクレオチドアナログを該被験体に投与する工程を含み、そしてさらに、該オリゴヌクレオチドアナログおよび前記ウィルスのゲノムの相補的な部分から構成されるヘテロ二重鎖の出現について、体液をモニターする工程を含む、方法。
15. 哺乳動物被験体内での西ナイルウィルスを処置するための請求項１に記載の方法であって、ここで、前記細胞が曝される前記オリゴヌクレオチドアナログが、配列番号２６として識別される配列を含む、方法。
16. 哺乳動物被験体内でのデング熱ウィルス１−４型を処置するための請求項１に記載の方法であって、ここで、前記細胞が曝される前記オリゴヌクレオチドアナログが、配列番号２４として識別される配列および配列番号２７として識別される配列のどちらかを含む、方法。
17. 動物細胞内でのフラビウィルスの複製の阻害における使用のためのオリゴヌクレオチドアナログであって、以下：
    （ｉ）ヌクレアーゼ抵抗性の骨格、
    （ｉｉ）ウィルスに感染された動物細胞に取り込まれ得ること、
    （ｉｉｉ）８〜４０個の間のヌクレオチド塩基を含むこと、
    （ｉｖ）該フラビウィルスの正鎖ＲＮＡゲノムの領域に相補的な少なくとも８塩基の配列を含み、該フラビウィルスの正鎖ＲＮＡゲノムは、配列番号１−４からなる群から選択された、該ゲノムの５’末端環化配列または３’末端環化配列の少なくとも一部分を含み、そして
    （ｖ）該フラビウィルスのｓｓＲＮＡゲノムと、少なくとも４５℃で解離するＴｍで特徴付けられるヘテロ二重鎖構造を形成し得て、そして該ウィルスの５’末端環化配列および３’末端環化配列の間に崩壊した塩基対合を有すること
    により特徴付けられる、オリゴヌクレオチドアナログ。
18. 配列番号３および４からなる群から選択された、前記ウィルスゲノムの３’末端環化配列の少なくとも一部分に相補的な配列を含む、請求項１７に記載のアナログ。
19. ぞれぞれ、配列番号１および２からなる群より選択された、前記ゲノムの５’末端環化配列の一部分、ならびに、配列番号３および４からなる群より選択された、該ゲノムの３’末端環化配列の相補的な部分を含むウィルス配列と、ヘテロ二重鎖構造を形成し得る配列を含む、請求項１７に記載のアナログ。
20. セントルイス脳炎ウィルス、マレーバレー脳炎ウィルス、西ナイルウィルス、クンジンウィルス、日本脳炎ウィルス、黄熱病ウィルス、デング熱ウィルス−１型、２型、３型、および４型、西ナイルウィルスのいずれかの複製を阻害するための請求項１７に記載のアナログであって、該ウィルスの正鎖ＲＮＡゲノムの領域と相補的な少なくとも８塩基の配列を有し、該ウィルスの正鎖ＲＮＡゲノムは、それぞれ、配列番号１および３からなる群から選択された、該ゲノムの５’末端環化配列または３’末端環化配列の少なくとも一部分を含む、アナログ。
21. 配列番号３に相補的な配列を含む、請求項２０に記載のアナログ。
22. 配列番号１として識別される前記ゲノムの５’末端環化配列の一部分、および配列番号３として識別される該ゲノムの３’末端環化配列の相補的な部分を含む配列と、ヘテロ二重鎖構造を形成し得る、請求項２０に記載のアナログ。
23. ダニ媒介性脳炎ウィルス、ポワッサンウィルス、跳躍病ウィルス、キャサヌール森林病ウィルス、およびアルカーマウィルスのいずれかの複製を阻害するための請求項１７に記載のアナログであって、該ウィルスの正鎖ＲＮＡゲノムの領域に相補的な少なくとも８塩基の配列を含み、該ウィルスの正鎖ＲＮＡゲノムは、それぞれ、配列番号２および４からなる群から選択される、該ゲノムの５’末端環化配列または３’末端環化配列の少なくとも一部分を含む、アナログ。
24. 配列番号４の少なくとも一部分と相補的な配列を含む、請求項２３に記載のアナログ。
25. 配列番号２として識別される前記ゲノムの５’末端環化配列の一部分、および配列番号４として識別される該ゲノムの３’末端環化配列の相補的な部分を含む配列と、ヘテロ二重鎖構造を形成し得る配列を含む、請求項２３に記載のアナログ。
26. モルホリノサブユニット、および、１つのサブユニットのモルホリノ窒素を、隣接するサブユニットの５’末端の環外炭素に結合する、リン含有サブユニット間連結から構成される、請求項１７に記載のアナログ。
27. 前記モルホリノサブユニットがホスホロジアミデート連結によって結合され、該ホスホロジアミデート連結は下記の構造に従っており：
    

    

    ここで、Ｙ_１は酸素、Ｚは酸素、Ｐｊはプリンまたはピリミジン塩基対合部分であって、塩基特異的水素結合によるポリヌクレオチド内の塩基への結合が効果的な部分、および、Ｘはアルキル、アルコキシ、チオアルコキシ、アミノ、またはジアルキルアミノを含むアルキルアミノである、請求項１７に記載のアナログ。
28. 西ナイルウィルスを処置するための請求項１７に記載のアナログであって、ここで、前記細胞が曝される該オリゴヌクレオチドアナログが、配列番号２６として識別される配列を含む、アナログ。
29. デング熱ウィルス１−４型の処置における使用のための請求項１７に記載のアナログであって、前細胞が曝される該オリゴヌクレオチドアナログが、配列番号２４および配列番号２７として識別される配列のどちらかを含む、アナログ。

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