CN110724180B

CN110724180B - 一种抑制新生血管生成的多肽及其应用

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Publication number: CN110724180B
Application number: CN201910988584.0A
Authority: CN
Inventors: 王凤山; 孙莹; 路璐; 张新科
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2019-10-17
Filing date: 2019-10-17
Publication date: 2021-08-20
Anticipated expiration: 2039-10-17
Also published as: CN110724180A

Abstract

本发明提供一种抑制新生血管生成的多肽及其应用，本发明系统研究了Tat自身活性并在Tat基础上进一步设计合成了新的多肽链transTat、RGDGtransTat、transTatGRGD。其中RGDGtransTat与transTatGRGD表现出了更好的抑制新生血管生成的作用(包括抑制HUVEC的增殖、迁移与小管生成)，且呈现一定的剂量效应关系。本发明多肽不仅能够通过抑制新生血管生成用于预防或治疗与血管生成的相关性疾病，同时也可作为血管生成抑制剂抑制体外内皮细胞的血管生成，从而为血管生成相关科学研究提供材料，因此具有良好的实际应用之前景。

Description

一种抑制新生血管生成的多肽及其应用

技术领域

本发明属于多肽及生物医药技术领域，具体涉及一种抑制新生血管生成的多肽及其应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

血管生成(angiogenesis)是指在原有毛细血管或微静脉基础上通过血管内皮细胞增殖和迁移，从先前存在的血管处以芽生或非芽生(或称套叠)的形式生成的毛细血管。血管生成可分为正常的和病理性的。正常的血管生成如黄体的形成、子宫内膜的生长、胚胎附植和胎盘的形成过程等。而病理性的血管生成如伤口和断裂面的愈合、实体肿瘤的形成、脉络膜新生血管生成、动脉粥样硬化等。

在实体肿瘤的治疗中，利用载体偶联穿膜肽与靶向肽递送药物是一种重要方向。多个研究表明这种方式可以有效抑制肿瘤的生长。Tat作为穿膜肽具有强大的运载潜能，应用极其广泛，它可以携带多肽、蛋白、核酸以及小分子化合物等进入细胞内或细胞核内。在诸多研究中往往忽视了Tat本身潜在的治疗作用。

对于眼部新生血管疾病，尤其是眼后段新生血管疾病，目前临床上的治疗方法，主要以玻璃体注射抗血管内皮生长因子为主。这种方法价格昂贵、患者顺应性较差。

发明内容

基于上述现有技术的不足，本发明提供一种抑制新生血管生成的多肽及其应用。本发明通过研究Tat蛋白转导域的治疗作用并对其进一步地改造和修饰，从而获得本发明，经试验验证，本发明的多肽具有良好的抑制新生血管生成活性。

本发明的一个方面，提供一种多肽，所述多肽具有如下氨基酸残基序列：

RKKRRQRRR(SEQ ID NO.1)，或，

RRRQRRKKR(SEQ ID NO.2)，或，

RGDGGGGRRRQRRKKR(SEQ ID NO.3)，或，

RRRQRRKKRGGGGRGD(SEQ ID NO.4)。

进一步的，所述多肽氨基酸残基序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。

上述多肽具有抑制新生血管生成的作用，可采用固相多肽合成法合成。

所述抑制新生血管生成，包括但不限于抑制血管内皮细胞增殖、血管内皮细胞迁移与小管生成。

本发明的第二个方面，提供编码所述多肽的核苷酸，其包含下组中的任一种：

(a)编码具有所述氨基酸序列的多肽的核苷酸；

(b)与(a)所述核苷酸互补的核苷酸。

本发明的第三个方面，提供上述多肽在制备预防和/或治疗(辅助治疗)血管生成相关疾病的药物或保健品中的应用。

进一步的，所述血管生成相关疾病包括但不限于癌症、眼疾病、关节炎和炎性疾病。

本发明的第四个方面，提供上述多肽作为非治疗目的的血管生成抑制剂的用途。根据本发明，所述“非治疗目的”例如在体外抑制血管内皮细胞新生血管生成。通过对血管内皮细胞(如人脐静脉内皮细胞，HUVEC)施加本发明的多肽，有利于研究血管生成信号通路及基因表达交互作用，从而为进一步研究血管生成相关性疾病提供原始材料并奠定基础。

本发明的第五个方面，提供一种体外抑制新生血管生成的方法，所述方法包括给予体外培养的内皮细胞上述多肽。

其中，所述抑制新生血管生成包括但不限于抑制血管内皮细胞增殖、血管内皮细胞迁移与小管生成。

本发明的有益技术效果：

本发明系统研究了Tat(SEQ ID NO.1)自身活性并在Tat基础上进一步设计合成了新的多肽链transTat(SEQ ID NO.2)、RGDGtransTat(SEQ ID NO.3)、transTatGRGD(SEQ IDNO.4)。其中RGDGtransTat与transTatGRGD表现出了更好的抑制新生血管生成的作用(包括抑制HUVEC的增殖、迁移与小管生成)，且呈现一定的剂量效应关系。

本发明多肽不仅能够通过抑制新生血管生成用于预防或治疗与血管生成的相关性疾病，同时也可作为血管生成抑制剂抑制体外内皮细胞的血管生成，从而为血管生成相关科学研究提供材料，因此具有良好的实际应用之前景。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为本发明实施例1中transTat与Tat穿膜能力对比图；

图2为本发明实施例2中RGDGtransTat对HUVEC增殖抑制作用图。

图3a为本发明实施例3中各组多肽处理后的HUVEC划痕实验图，比例尺＝20μm；

图3b为本发明实施例3中各组多肽对HUVEC的迁移抑制统计图；

图4a为本发明实施例4中各组多肽处理后的HUVEC小管生成图，比例尺＝20μm；

图4b为本发明实施例4中各多肽对HUVEC小管生成抑制统计图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

如前所述，Tat作为穿膜肽具有强大的运载潜能，应用极其广泛。它可以携带多肽、蛋白、核酸以及小分子化合物等进入细胞内或细胞核内。在诸多研究中往往忽视了Tat本身潜在的治疗作用。

Tat的最小功能单位为九肽RKKRRQRRR(SEQ ID NO.1)，本发明依据碳端规则理论，将Tat蛋白转导域N端与C端序列倒置，构成一条新的肽段。命名为transTat，其氨基酸序列为RRRQRRKKR(SEQ ID NO.2)，经研究发现，Tat蛋白转导域具有抑制新生血管生成活性，为进一步增强其活性，为使其增强靶向性，提高抑制新生血管的作用，我们将RGD多肽分别连接与transTat的N端或C端。并研究了RGD肽位于transTat N端或C端对于抑制新生血管作用的影响。因此，本发明的一个具体实施方式中，提供四条多肽链，其氨基酸残基序列如下：

Tat：RKKRRQRRR(SEQ ID NO.1)；

transTat：RRRQRRKKR(SEQ ID NO.2)；

RGDGtransTat：RGDGGGGRRRQRRKKR(SEQ ID NO.3)；

transTatGRGD：RRRQRRKKRGGGGRGD(SEQ ID NO.4)。

同时，经试验证实，RGDGtransTat和transTatGRGD表现出更好的抑制新生血管生成的作用。上述多肽链可采用固相多肽合成法合成。

本发明的又一具体实施方式中，所述抑制新生血管生成，包括但不限于抑制血管内皮细胞增殖、血管内皮细胞迁移与小管生成。

本发明的又一具体实施方式中，提供编码所述多肽的核苷酸，其包含下组中的任一种：

(a)编码具有所述氨基酸序列的多肽的核苷酸；

(b)与(a)所述核苷酸互补的核苷酸。

本发明的又一具体实施方式中，提供上述多肽在制备预防和/或治疗(辅助治疗)血管生成相关疾病的药物或保健品中的应用。

本发明的又一具体实施方式中，所述血管生成相关疾病包括但不限于癌症、眼疾病、关节炎和炎性疾病。

本发明的又一具体实施方式中，所述癌症包括但不限于乳腺癌、卵巢癌、胃癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、肺癌、肾癌、结肠癌、结肠直肠癌、食管癌、甲状腺癌、胰腺癌、前列腺癌和膀胱癌以及其他肿瘤疾病例如黑色素瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、神经胶质瘤、肝细胞(肝)癌、肉瘤、头颈癌、间皮瘤、胆癌(胆管癌(cholangiocarcinoma))、小肠腺癌、儿童恶性肿瘤和胶质母细胞瘤。

除了实体瘤和其转移灶外，血液恶性肿瘤例如白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤也是依赖于血管生成的。过度的血管生长促成许多非肿瘤病症。此类非肿瘤的依赖于血管生成的疾病包括：动脉粥样硬化、血管瘤、血管内皮瘤、血管纤维瘤、血管畸形(例如遗传性出血性毛细血管扩张(Hereditary HemorrhagicTeleangiectasia，HHT)或Osler-Weber综合征)、疣、脓性肉芽肿、过度毛发生长、卡波西肉瘤、瘢痕疙瘩(scar keloids)、变应性水肿、银屑病、功能障碍性子宫出血、滤泡囊肿(ollicular cyst)、卵巢过度刺激、子宫内膜异位、呼吸窘迫、腹水、透析患者的腹膜硬化、由腹部手术引起的粘连形成、肥胖、类风湿性关节炎、滑膜炎、骨髓炎、血管翳生长(pannus growth)、骨赘、血友病性关节、炎性和感染性过程(例如肝炎、肺炎、肾小球肾炎)、哮喘、鼻息肉、肝再生、肺动脉高压、早产儿视网膜病变、糖尿病性视网膜病变、年龄相关性黄斑变性、白质软化、新生血管性青光眼、角膜移植新生血管形成、沙眼、甲状腺炎、甲状腺肿大和淋巴增生性病症。

本发明的又一具体实施方式中，提供上述多肽作为非治疗目的的血管生成抑制剂的用途。根据本发明，所述“非治疗目的”例如在体外抑制血管内皮细胞新生血管生成。通过对血管内皮细胞(如人脐静脉内皮细胞，HUVEC)施加本发明的多肽，有利于研究血管生成信号通路及基因表达交互作用，从而为进一步研究血管生成相关性疾病提供原始材料并奠定基础。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种体外抑制新生血管生成的方法，所述方法包括给予体外培养的内皮细胞上述多肽。

本发明的又一具体实施方式中，所述内皮细胞为人脐静脉内皮细胞；

本发明的又一具体实施方式中，所述多肽浓度10～500μmol/L，更进一步为25～400μmol/L；所述多肽浓度包括但不限于25μmol/L，50μmol/L，100μmol/L，200μmol/L和400μmol/L。经试验证明，本发明的多肽对新生血管生成抑制呈现浓度依赖性。

以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1 transTat、Tat穿膜能力比较

荧光倒置显微镜观察并利用流式细胞术进行定量检测transTat、Tat对于HUVEC细胞的穿膜能力。见图1。

结果显示，transTat与Tat穿膜能力没有显著差别。

实施例2 CCK-8法测定RGDGtransTat对HUVEC增殖的抑制作用

将HUVEC的冻存液在37℃水浴锅内快速融化，800r/min离心3min，弃上清。用标准内皮细胞培养基将细胞沉淀重悬并吹打均匀，形成细胞悬液，于细胞计数板上进行细胞计数。然后接种于培养瓶中，于CO₂恒温培养箱(5％CO₂，37℃)中培养12h，换液。待细胞长至融合状态，细胞用PBS清洗一遍，然后加入0.25％胰蛋白酶1ml，37℃消化约1min，在倒置显微镜下观察，待细胞变大变圆，细胞间隙增大，加入标准内皮细胞培养基终止消化，用无菌的塑料滴管反复捶打培养瓶壁上的细胞，使大部分细胞脱落形成细胞悬液，于倒置显微镜下计数，然后以10⁵/ml密度接种于新的培养瓶中，恒温培养箱中继续培养。

采用CCK-8测定RGDGtransTat抑制HUVEC增殖的活性。收集对数期细胞，调整细胞浓度为5000/孔，接种于96孔板内，每孔100μl，于CO₂恒温培养箱(5％CO₂，37℃)中培养过夜；加入培养基稀释的RGDGtransTat(每组设置5个浓度梯度：25μmol/L，50μmol/L，100μmol/L，200μmol/L，400μmol/L)，每个浓度设置5个平行孔，继续培养48h；用注射器将细胞上清小心吸出，加入新鲜培养基100μl；每孔加入CCK-8溶液10μl，CO₂培养箱中继续培养3h后终止培养，用酶联免疫检测仪于波长490nm处测定各孔吸光度(A)值，并计算其抑制率：抑制率＝[1-(实验组A/对照组A)]×100％。重复试验3次，取平均值。

修饰后的RGDGtransTat对内皮细胞HUVEC的增殖有一定的抑制作用见图2，并具有浓度依赖性。

实施例3划痕实验测定RGDGtransTat对HUVEC迁移的影响

收集对数期人脐静脉内皮细胞HUVEC，调整细胞悬液浓度为5×10⁵/孔，接种于6孔板中，每孔2ml，置于37℃、5％CO₂的CO₂培养箱中培养过夜；将直尺提前放入超净台内紫外照射30min后，取6孔板细胞，弃上清，用PBS清洗2遍，在无菌直尺比对的同时用黄枪头轻轻划过细胞表面，形成一条无细胞的直线，每个孔画3条直线，PBS清洗2遍以去掉划掉的细胞。加入经培养基稀释的RGDGtransTat 2ml，终浓度为400μmol/L，并加入VFGF使其终浓度为5ng/ml，设置2个平行孔，置于CO₂恒温培养箱中分别培养24h和48h。取出6孔板，弃上清，置于倒置荧光显微镜下拍照，观察划痕的宽度。重复试验3次，取平均值。

实验结果见图3a-3b，可以看出RGDGtransTat、transTatGRGD对HUVEC的迁移有一定的抑制作用。

实施例4 RGDGtransTat对HUVEC成管的影响

将96孔板、黄枪头放入4℃冰箱中预冷过夜。将基质胶移冰箱4℃中融化过夜。将融化后的基质胶铺于预冷的96孔板内，60μl/孔，置于CO₂培养箱中静置培养约40-60min。待基质胶凝固后，收集对数期人脐静脉内皮细胞HUVEC，调整细胞悬液浓度为2×10⁴/孔，加入到含有基质胶的96孔板中，每孔加入100μl。加入内皮细胞标准培养基稀释的药物使其终浓度为400μmol/L，并加入VEGF使其终浓度为5ng/ml，设置3个平行孔，置于CO₂恒温培养箱中培养约4-6h。取出96孔板，置于倒置荧光显微镜下拍照，观察血管生成情况。重复试验3次，取平均值。

结果见图4a-4b，可以看出RGDGtransTat对HUVEC的小管生成有一定的抑制作用。

最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东大学

<120> 一种抑制新生血管生成的多肽及其应用

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 9

<212> PRT

<213> Tat

<400> 1

Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg

1 5

<210> 2

<211> 9

<212> PRT

<213> transTat

<400> 2

Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Lys Arg

1 5

<210> 3

<211> 16

<212> PRT

<213> RGDGtransTat

<400> 3

Arg Gly Asp Gly Gly Gly Gly Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Lys Arg

1 5 10 15

<210> 4

<211> 16

<212> PRT

<213> transTatGRGD

<400> 4

Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Lys Arg Gly Gly Gly Gly Arg Gly Asp

1 5 10 15

Claims

1.一种多肽，其特征在于，所述多肽氨基酸残基序列如下：

RGDGGGGRRRQRRKKR(SEQ ID NO.3)，或，

RRRQRRKKRGGGGRGD(SEQ ID NO.4)。

2.编码权利要求1所述多肽的核苷酸，其特征在于，其包含下组中的任一种：

(a)编码具有所述氨基酸序列的多肽的核苷酸；

(b)与(a)所述核苷酸互补的核苷酸。

3.权利要求1所述多肽在制备预防和/或治疗新生血管生成相关疾病的药物中的应用。

4.如权利要求3所述应用，其特征在于，抑制新生血管生成，包括抑制血管内皮细胞增殖、血管内皮细胞迁移和小管生成中的任意一种或多种。

5.如权利要求3所述应用，其特征在于，所述血管生成相关疾病包括癌症、眼疾病和炎性疾病。

6.如权利要求5所述应用，其特征在于，所述炎性疾病为关节炎。

7.权利要求1所述多肽作为非治疗目的的血管生成抑制剂的用途。

8.一种体外抑制新生血管生成的方法，其特征在于，所述方法包括给予体外培养的内皮细胞权利要求1所述多肽。

9.如权利要求8所述方法，其特征在于，所述抑制新生血管生成包括抑制血管内皮细胞增殖、血管内皮细胞迁移和小管生成中的任意一种或多种。

10.如权利要求8所述方法，其特征在于，所述多肽浓度为10～500μmol/L。

11.如权利要求10所述方法，其特征在于，所述多肽浓度为25～400μmol/L。