KR20170005118A - 펩티드 담체 상의 다중 올리고뉴클레오티드 모이어티 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고뉴클레오티드 (phosphorodiamidate morpholino oligonucleotides; PMO)와 같은 안티센스 올리고뉴클레오티드 (antisense oligonucleotide; AON)에 관한 것이다. 추가로 본 발명은 골격근 세포 및 심근 세포 내로의 PMO의 흡수를 향상시키기 위한 양이온성 세포 침투 펩티드 (cell penetrating peptide; CPP)에의 다중 PMO의 콘쥬게이션 (conjugation)에 관한 것이다.
Description
관련 출원과의 상호 참조
본 출원은 2014년 5월 23일자로 출원된 미국 가특허 출원 제62/002,296호의 우선권의 이득을 청구하는데, 상기 미국 가특허 출원은 본원에 그 전체가 참고로 포함된다.
본 발명은 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고뉴클레오티드 (phosphorodiamidate morpholino oligonucleotides; PMO)와 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 안티센스 올리고뉴클레오티드 (antisense oligonucleotide; AON)에 관한 것이다. 추가로 본 발명은 골격근 세포 및 심근 세포와 같은 관심 대상의 조직 내로의 PMO의 흡수를 향상시키기 위한 양이온성 세포 침투 펩티드 (cell penetrating peptide; CPP)에의 다중 PMO의 콘쥬게이션 (conjugation)에 관한 것이다. 본 발명은 그러한 콘쥬게이트와, 예를 들어 유전자 발현을 조정하기 위하여 이를 사용하는 것을 포함하는 그의 사용 방법을 포함한다. 추가로 본 발명은 다양한 질환 상태의 치료 방법을 포함하며, 이는 이를 필요로 하는 인간 또는 동물에게 상기 다중 PMO-CPP 콘쥬게이트를 투여함에 의한 것이다.
AON은 예를 들어 듀시엔형 근이영양증 (Duchenne muscular dystropy; DMD)을 포함하는 다양한 질환 상태에서 시험관 내 및 생체 내 둘 모두에서 유전자 발현을 성공적으로 조정하는 것으로 밝혀졌다. 특히, "인프레임 (in-frame) 엑손 23을 표적화하여 제거하도록 설계된 PMO는 DMD의 mdx 마우스 모델에서 디스트로핀 (dystrophin) 기능을 복구하는 데 성공적이었다.
그러나, AON은 또한 골격근 세포 및 심근 세포에서 불량한 흡수 프로파일을 나타내는 것으로 밝혀졌는데, 이는 mRNA 전사 및 번역에 영향을 주는 그의 능력을 방해한다. (국제 공개 제2009/147368호) 특히, PMO, 2-O-메틸 올리고뉴클레오티드, 및 펩티드 핵산 (peptide nucleic acid; PNA)은 골격근에서 눈에 띄게 축적되는 것은 아니며, 심근에서의 이들의 흡수는 사소하다.
세포 침투 펩티드 (CPP)는 1980년대 후반에 발견되었다. 문헌[Frankel and Pabo Cell 1988; Green and Loewenstein Cell 1988] 이러한 화합물은 상이한 모이어티들을 세포막을 가로질러 수송하는 것을 돕는데, 이는 달리, 혼자서는 세포막을 횡단하는 데 어려움을 겪는다. CPP를 발견한지 약 20년 후, 몇몇 조사 연구에 의하면 디스트로핀을 코딩하는 mRNA의 엑손 23을 스킵 (skip)하도록 설계된 단일 PMO (PMO23)에 테더링된 (tethered) "K" (RXRRXRRXRRXRXB, 서열 번호 43) 및 "B" (RXRRBRRXRRBRXB, 서열 번호 44)로 명명된 CPP들은 mdx 마우스 모델을 사용한 골격근 및 심근에서의 엑손 스킵을 크게 증가시켰다. 문헌[Jearawiriyapaisarn et al Mol Therapy 2008] 이러한 연구의 결과는 단일 PMO-CPP 콘쥬게이트가 골격근에서 엑손 23의 85% 초과의 스킵을 나타냈으며 반면에 네이키드 (naked) PMO 화합물은 15% 미만의 엑손 스킵을 생성하였음을 입증하였다. 또한 네이키드 PMO와 비교하여 보통의 영향이 심근에서 관찰되었는데 (대략 60%), 이는 심근에서 엑손 23 스킵을 초래하지 않는다. [상기 문헌]
국제 공개 제2009/144481호는 예를 들어 PMO를 포함하는, AON과 같은 생물학적 활성 화합물과의 복합체 형태의 세포 전달 펩티드를 포함하는 구성물 (contruct)에 관한 것이다. 국제 공개 제2004/097017호 (미국 특허 출원 공개 제2004/0265879호 및 미국 특허 출원 공개 제2009/0082547호)는 펩티드 수송자 (peptide transporter)와, PMO와 같은 생물학적 에이전트 (agent)의 콘쥬게이트의 개시를 포함하는, 분자의 전달을 향상시키는 방법에 관한 것이다. 국제 공개 제2009/147368호에는 신규한 CPP가 개시되어 있는데, 이는 예를 들어 PNA 및 PMO에 콘쥬게이션될 수 있다. 미국 특허 출원 공개 제2010/0130591호에는 CPP에 콘쥬게이션될 수 있는, 인간 디스트로핀 유전자에서의 선택된 표적 부위에 결합할 수 있는 PMO가 개시되어 있다.
단일 PMO-CPP 콘쥬게이트에서 관찰되는 향상된 효능에도 불구하고, 상기 콘쥬게이트는 네이키드 PMO와 비교하여 증가된 독성을 보유한다. [인용] 예를 들어, CPP-PMO23B 또는 CPP-PMO23K를 이용한 mdx 마우스 엑손 23 스킵 연구에 있어서의 최대 내용 용량은 30 mg/kg인 것으로 밝혀졌다. 60 mg/kg의 양에서, 상기 마우스는 체중이 줄었으며, 150 mg/kg의 용량은 치명적이었다. 문헌[Amantana et al Bioconjugate Chem 2007] 이와는 대조적으로, 네이키드 PMO23은 어떠한 두드러진 독성 효과도 없이 250 mg/kg만큼 많은 양으로 투여될 수 있다 [상기 문헌]. 국제 공개 제2009/005793호에는 CPP "B"를 포함하는, 4개 미만의 X (6-아미노헥산산) 잔기를 갖는 CPP가 이전에 확인된 CPP보다 더 낮은 독성을 나타냈음이 개시되어 있다. 그러나, 상기에 나타낸 바와 같이, 단일 PMO에 커플링된 (coupled) 이러한 CPP는 네이키드 PMO와 비교하여 여전히 허용불가능한 독성을 나타낸다 (상기 문헌 및 문헌[Moulton and Moulton Biochemica et Biophysica Acta 2010]).
따라서, 네이키드 PMO의 불량한 흡수성의 문제 및 단일 PMO-CPP 구성물과 결부된 증가된 독성의 문제를 극복하는 것이 본 발명의 일차 목적이다. CPP 상에서의 다수의 콘쥬게이션 부위를 D- 또는 L-거울상 이성질체 위치에서의 글루탐산의 부가에 의해 도입하여 CPP의 말단에 근접한 다수의 PMO의 입체 장애를 감소시킨다. P1, - P1 위치에서의 아미노산, 페닐알라닌-라이신을 포함하는 펩티다아제 절단 부위의 사용은 CPP와 PMO 사이에 도입된다. 상기 펩티다아제 절단 부위의 절단은 PMO를 CPP로부터 유리시킨다. 예를 들어, CPP는 시스테인 위치에서 도입될 수 있는 효소 절단 부위 페닐알라닌-라이신 또는 발린-시트룰린을 포함하는 말레이미드 에스테르화 (esterized) 링커를 통하여 PMO에 부착될 수 있다. 또한 CPP는 아미드 결합을 통하여 부착될 수 있다.
펩티드를 이용한 세포 내로의 내부화는 리소좀 효소를 포함하는 세포내 프로테아제로 이어져서 절단 부위를 절단할 수 있으며, 유리 PMO는 펩티드 결합된 콘쥬게이트로부터의 입체 장애가 더 낮다. 이러한 더 낮은 입체적 구속 (stearic constraint)은 핵 및 시토졸에 대하여 더 적은 독성을 가지고서 엑손 스킵 효율을 증가시킬 수 있다.
적어도 하나의 측면에서, 이것은 본원에 추가로 기술되는 바와 같이 다중 PMO-CPP 콘쥬게이트의 발견에 의해 달성된다. 또한 본 발명은 본 발명에 따른 콘쥬게이트의 치환에 의해 단일 PMO-CPP 콘쥬게이트의 안전역을 증가시키는 방법을 고려한다. 추가로 본 발명은 글리코겐 신타아제 (GYS1 또는 GYS2), 형질전환 성장 인자 (TGFβ), 매트릭스 메탈로펩티다아제 (MMP2 또는 MMP9), 오스테오폰틴 (osteopontin), 근강직성 이영양증 단백질 키나아제 (myotonic dystrophy protein kinase; DMPK), Elav-유사 패밀리 멤버 (Elav-Like Family Member 2) (CUG 트리플렛 반복 RNA-결합 단백질 (CUG Triplet Repeat RNA-Binding Protein) 또는 CUGBP로도 공지됨), 이중 호메오박스 4 (double homeobox 4; DUX4), 및/또는 (Frzl)을 코딩하는 것과 같은 유전자의 발현을 조정하는 방법을 포함한다. 하기 유전자: 글리코겐 신타아제 (GYS1 또는 GYS2), 형질전환 성장 인자 (TGFβ), 매트릭스 메탈로펩티다아제 (MMP2 또는 MMP9), 오스테오폰틴, 근강직성 이영양증 단백질 키나아제 (DMPK), Elav-유사 패밀리 멤버 (CUG 트리플렛 반복 RNA-결합 단백질 또는 CUGBP로도 공지됨), 이중 호메오박스 4 (DUX4), 및/또는 (Frzl)은 본 발명의 PMO-CPP 콘쥬게이트를 통하여 표적화되어 엑손 스킵을 매개하여 프레임 시프트 돌연변이 (frame shift mutation)을 생성할 수 있다. 임의의 프레임 시프트 돌연변이는 AON 서열에 의해 표적화되는 mRNA의 양의 기능적 감소로 이어질 수 있다. 본 발명은 또한 그의 범주 내에 다양한 질환 상태에서 마이크로RNA (microRNA)의 억제에 있어서의 다중 PMO-CPP 콘쥬게이트의 용도를 포함한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 다양한 질환 및/또는 병태, 예컨대 상기 유전자 및 마이크로RNA와 결부된 것의 치료 방법을 포함한다.
본 발명의 추가의 목적 및 강점이 하기 [발명을 실시하기 위한 구체적인 내용]에 부분적으로 개시될 것이며, 부분적으로는 [발명을 실시하기 위한 구체적인 내용]으로부터 자연스럽게 흘러나오거나, 개시된 실시 양태의 실행에 의해 학습될 수 있다. 본 발명의 목적 및 강점은 특히 첨부된 청구범위에서 언급된 요소 및 조합에 의해 실현되고 이루어진다.
전술한 일반적인 설명 및 하기 [발명을 실시하기 위한 구체적인 내용] 둘 모두는 단지 예시적인 것으로서 설명하는 것이고, 청구된 본 발명을 제한하는 것이 아님이 이해되어야 한다.
본 명세서에 포함되고 본 명세서의 일부를 구성하는 첨부된 도면은 본 발명의 일 (몇몇) 실시 양태(들)를 예시하며, [발명을 실시하기 위한 구체적인 내용]과 함께, 본 발명의 원리를 설명하는 역할을 한다.
도 1은 단일 CPP에 부착된 다중 AON의 구성의 개략도이다.
도 2는 올리고머화되어 본 발명의 다중 AON 구성에서 사용될 수 있는 다양한 안티센스 올리고뉴클레오티드 서브유닛 (subunit)의 개략도이다.
도 3은 야생형 마우스에서 엑손 23 스킵에 대한 CPP-PMO 콘쥬게이트들 중 일부의 영향을 도시한다.
도 2는 올리고머화되어 본 발명의 다중 AON 구성에서 사용될 수 있는 다양한 안티센스 올리고뉴클레오티드 서브유닛 (subunit)의 개략도이다.
도 3은 야생형 마우스에서 엑손 23 스킵에 대한 CPP-PMO 콘쥬게이트들 중 일부의 영향을 도시한다.
상기한 바와 같이, 표적 세포 내로의 단일 PMO-CPP 콘쥬게이트의 흡수를 손상시키지 않고서 상기 콘쥬게이트의 안전성 프로파일을 개선시키는 것이 본 발명의 하나의 목적이다. 일반적으로, 유효 용량과 무독성량 (no adverse effect level; NOAEL) 사이에 적어도 10배의 안전역이 있는 것이 바람직하다. 상기에 기술된 mdx/엑손 23 실험에서, 유효 용량은 30 mg/kg인 것으로 밝혀졌으며, NOAEL도 30 mg/kg이었다. 그 결과, 안전역이 거의 없거나 전혀 없었다. 본 발명의 적어도 하나의 실시 양태에서, 다중 PMO-CPP 콘쥬게이트는 상기에 기술된 mdx/엑손 23 실험보다 더 우수한 안전역, 예컨대 2배보다 더 우수한 안전역, 예컨대 5배보다 더 우수한 안전역, 예컨대 6배보다 더 우수한 안전역, 예컨대 10배보다 더 우수한 안전역을 갖는다. 10배 안전역은 유효 용량이 NOAEL보다 10배 더 낮음을 의미한다. 따라서, 적절한 모델에서 시험될 때, 본 발명에 따른 다중 PMO-CPP 콘쥬게이트는 상응하는 단일 PMO-CPP 콘쥬게이트보다 적어도 2배 더 우수한 안전역을 가질 수 있다. 본 발명은 단일 CPP에 부착된, PMO AON을 포함하는 다중 AON을 포함한다.
본 발명의 적어도 하나의 실시 양태에서, 다중 AON-CPP 콘쥬게이트는 절단가능한 링커를 추가로 포함한다. 일부 실시 양태에서, 링커는 절단 모티프를 포함하는 서열이다. 일부 실시 양태에서, 절단 모티프는 임의의 가수분해 효소에 의해 절단될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 절단 모티프는 펩티다아제 또는 프로테아제, 예컨대 카텝신 또는 트립신에 의해 절단될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 링커는 특정한 세린 프로테아제, 트레오닌 프로테아제, 시스테인 프로테아제, 아스파르테이트 프로테아제, 글루탐산 프로테아제 또는 메탈로프로테아제, 또는 하나 초과의 펩티다아제의 군에 의해 인식되는 절단 모티프를 포함하도록 설계될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 링커는 중첩 또는 비중첩되는 2개 이상의 절단 모티프를 포함할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 링커는 절단 모티프를 전혀 포함하지 않을 수 있다. 일부 실시 양태에서, 링커는 링커 중 100% 미만, 75% 미만, 50% 미만, 또는 10% 미만이 절단되도록 설계될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 링커는 링커 중 90% 또는 99% 초과가 절단되도록 설계된다.
본 발명의 적어도 하나의 실시 양태에서, 다중 AON-CPP 콘쥬게이트는 절단가능한 링커, 예컨대 P1/P1' 위치에서 FK, 또는 또 다른 실시 양태에서, P1/P1' 위치에서 FX를 추가로 포함하며, 여기서, X는 임의의 자연 발생 아미노산이다. 예를 들어 카텝신과 같은 가수분해 효소에 의해 절단가능한 절단가능 링커는 AON과 CPP 사이에 나타날 수 있거나 이것은 AON-절단가능한 링커-AON-절단가능한 링커-CPP와 같은 서열로 나타날 수 있다. 또 다른 실시 양태에서, 다중 PMO-CPP 콘쥬게이트는 절단가능한 링커, 예컨대 카텝신, 또는 P1/P1' 위치에서 FK 또는 또 다른 실시 양태에서 P1/P1' 위치에서 FX를 추가로 포함하며, 여기서, X는 임의의 자연 발생 아미노산이다. 절단가능한 링커는 PMO와 CPP 사이에 나타날 수 있거나 이것은 PMO-절단가능한 링커-PMO-절단가능한 링커-CPP와 같은 서열로, 또는 예를 들어 PMO-카텝신 링커-PMO-카텝신 링커-CPP로서 나타날 수 있다. 본 발명은 AON (PMO를 포함함), 절단가능한 링커, 및 CPP의 순서를 제한하지 않으며, 당업자라면 본원에 개시된 정보를 이용하여 청구범위에 따른 적어도 하나의 카텝신 절단 부위를 갖는 적합한 다중 AON-CPP 콘쥬게이트를 설계할 수 있을 것이다.
놀랍게도, 일부 예에서 본 발명에 따른 절단가능한 링커 부위를 포함하는 다중 PMO-CPP 콘쥬게이트가 상기 부위를 포함하지 않는 다중 PMO-CPP 콘쥬게이트보다 훨씬 더 우수한 효능을 나타낸다는 것이 밝혀졌다. 단일 PMO-CPP 콘쥬게이트가 리소좀 내로 흡수되고, 펩티드 모이어티가 너무 빠르게 분해될 경우 여기에서 포획된 채로 남아 있을 수 있음이 밝혀졌기 때문에, 이러한 결과는 예기치 않은 것이었다. 환언하면, 단일 PMO-CPP 콘쥬게이트의 CPP 부분이 빠르게 분해될 경우, PMO는 리소좀 내에 포획되게 되고, 그의 세포 표적에 도달할 수 없으며, 따라서 효능이 감소한다. (문헌[Youngblood et al. 2007]) 이러한 현상의 결과로서, 상기 콘쥬게이트 내의 절단가능한 링커 부위의 부가가 CPP의 분해를 용이하게 하여 효능을 감소시킬 것으로 예상되었다. 그러나, 하기 특정 실시예에 기술되는 바와 같이 본 발명에 따른 절단가능한 링커 부위를 포함하는 특정 다중 PMO-CPP 콘쥬게이트에서는 그렇지 않았다. 따라서, 본 발명의 적어도 하나의 실시 양태에서, 다중 PMO-CPP 콘쥬게이트는 적어도 하나의 절단가능한 링커 부위를 갖는다. 본 발명의 적어도 또 다른 실시 양태에서, 다중 PMO-CPP 콘쥬게이트는 적어도 하나의 카텝신 절단가능 링커 부위를 갖는다.
추가로 본 발명은 글리코겐 신타아제 (GYS1 또는 GYS2), 형질전환 성장 인자 (TGFβ), 매트릭스 메탈로펩티다아제 (MMP2 또는 MMP9), 오스테오폰틴, 근강직성 이영양증 단백질 키나아제 (DMPK), Elav-유사 패밀리 멤버 2 (CUG 트리플렛 반복 RNA-결합 단백질 또는 CUGBP로도 공지됨), 이중 호메오박스 4 (DUX4), 및/또는 (Frzl)을 코딩하는 것과 같은 유전자의 발현의 조정 방법을 포함하며, 여기서, 본 발명의 다중 AON-CPP 콘쥬게이트는 프레임 시프트 돌연변이를 생성하도록 엑손 스킵을 매개하기 위한 것이다. 임의의 프레임 시프트 돌연변이는 표적화된 mRNA를 넉다운 (knock-down)시킬 수 있다. 본 발명은 또한 그의 범주 내에 다양한 질환 상태에서 마이크로RNA의 억제에 있어서의 다중 PMO-CPP 콘쥬게이트의 용도를 포함한다. 적어도 하나의 실시 양태에서, 본 발명은 상기 유전자 및 마이크로RNA와 결부된 것과 같은 다양한 질환 및/또는 병태의 치료 방법을 포함한다. 본 발명의 다중 CPP-PMO 콘쥬게이트는 이를 필요로 하는 인간 또는 동물에게 임의의 적합한 수단에 의해 투여될 수 있다. 인간 또는 동물 대상체에의 투여는 비경구, 근육내, 대뇌내, 혈관내, 피하 또는 경피 투여로부터 선택될 수 있다. 적어도 하나의 실시 양태에서, 투여 경로는 주사, 예컨대 정맥내 또는 근육내 주사에 의한 것이다. 치료 의사는 적절한 투여 경로를 결정할 수 있을 것이다.
의약품으로 이용될 때, 본원에 개시된 다중 CPP-PMO 콘쥬게이트 안티센스 올리고뉴클레오티드는 제약 조성물로 제형화되도록 제약상 허용가능한 부형제 또는 담체를 이용하여 제형화될 수 있다.
의약품으로 이용될 때, 다중 CPP-PMO 콘쥬게이트 안티센스 올리고뉴클레오티드는 제약 조성물의 형태로 투여될 수 있다. 이러한 화합물은 경구, 직장, 경피, 피하, 정맥내, 근육내 및 비강내를 포함하는 다양한 경로에 의해 투여될 수 있다. 이러한 화합물은 주사가능 조성물 및 경구 조성물 둘 모두로서 효과적이다. 그러한 조성물은 의약품 업계에 잘 알려진 방식으로 제조되며, 적어도 하나의 활성 화합물을 포함한다.
또한 본 발명은 활성 성분으로서, 1가지 이상의 제약상 허용가능한 부형제 또는 담체와 결부된 다중 CPP-PMO 콘쥬게이트 안티센스 올리고뉴클레오티드 중 하나 이상을 함유하는 제약 조성물을 포함한다. 본 발명의 조성물의 제조에서, 활성 성분은 일반적으로 부형제 또는 담체와 혼합되거나, 부형제 또는 담체에 의해 희석되거나, 캡슐, 사세, 종이 또는 기타 용기의 형태로 존재할 수 있는 그러한 부형제 또는 담체 내에 봉입된다. 부형제 또는 담체가 희석제로서의 역할을 할 때, 이것은 고체, 반고체 또는 액체 물질일 수 있는데, 이는 활성 성분을 위한 비히클, 담체 또는 매체로서 작용한다. 따라서, 조성물은 정제, 알약, 산제, 로젠지제, 사세제, 카세제, 엘릭시르, 현탁액, 에멀젼, 용액, 시럽, 에어로졸 (고체로서 또는 액체 매체의 형태), 예를 들어 10 중량% 이하의 활성 화합물을 함유하는 연고, 연질 및 경질 젤라틴 캡슐, 좌약제, 살균 주사가능 용액, 및 살균 패키징 (packaged) 산제의 형태로 존재할 수 있다.
제형의 제조에서, 활성 화합물을 밀링 (mill)하여 적절한 입자 크기를 제공한 후 다른 성분과 조합하는 것이 필요할 수 있다. 활성 화합물이 실질적으로 불용성일 경우, 이것은 보통 200 메시 (mesh) 미만의 입자 크기까지 밀링된다. 활성 화합물이 실질적으로 수용성일 경우, 입자 크기는 보통 밀링에 의해 조정되어 제형에서 실질적으로 균일한 분포, 예를 들어 약 40 메시를 제공한다.
적합한 부형제 또는 담체의 일부 예는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 소르비톨, 만니톨, 전분, 아라비아 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 트래거캔스, 젤라틴, 규산칼슘, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 살균수, 시럽 및 메틸 셀룰로오스를 포함한다. 제형은 추가로 하기를 포함한다: 활택제, 예컨대 활석, 스테아르산마그네슘, 및 광유; 습윤제, 유화제 및 현탁제; 보존제, 예컨대 메틸- 및 프로필히드록시-벤조에이트; 감미제; 및 착향제. 본 발명의 조성물은 본 기술 분야에 공지된 절차를 이용하여 환자에게 투여한 후 활성 성분의 빠른 방출, 지속된 방출 또는 지연된 방출을 제공하도록 제형화될 수 있다.
조성물은 바람직하게는 단위 투여 형태로 제형화되며, 각각의 투여형은 약 5 mg 내지 약 100 mg 또는 이보다 더 많은 양, 예컨대 약 5 mg 내지 약 10 mg, 약 5 mg 내지 약 20 mg, 약 5 mg 내지 약 30 mg, 약 5 mg 내지 약 40 mg, 약 5 mg 내지 약 50 mg, 약 5 mg 내지 약 60 mg, 약 5 mg 내지 약 70 mg, 약 5 mg 내지 약 80 mg, 또는 약 5 mg 내지 약 90 mg 중 임의의 것 (이들 값들 사이의 임의의 범위를 포함하여 포괄적임)의 활성 성분을 포함한다. "단위 투여 형태"라는 용어는 적합한 제약 부형제 또는 담체와 회합된, 요망되는 치료 효과를 생성하도록 계산된 소정량의 활성 물질을 각각의 단위가 포함하는, 개체에 대하여 일원화 투여형으로서 적합한 물리적으로 별개인 단위들을 나타낸다.
다중 CPP-PMO 콘쥬게이트 안티센스 올리고뉴클레오티드는 넓은 투여량 범위에 걸쳐 효과적이며, 일반적으로 치료적 유효량으로 투여된다. 그러나, 실제로 투여되는 다중 CPP-PMO 콘쥬게이트 안티센스 올리고뉴클레오티드의 양은 치료될 병태, 선택된 투여 경로, 투여되는 실제 화합물, 개별 환자의 연령, 중량 및 반응, 환자의 증상의 중증도 등을 포함하는 관련 상황을 고려하여 의사에 의해 결정됨이 이해될 것이다.
고체 조성물, 예컨대 정제의 제조에 있어서, 주요 활성 성분/다중 CPP-PMO 콘쥬게이트 안티센스 올리고뉴클레오티드는 본 발명의 화합물의 균질 혼합물을 함유하는 고체 예비제형 (preformulation) 조성물을 형성하도록 제약 부형제 또는 담체와 혼합된다. 이러한 예비제형 조성물을 균질한 것으로 칭할 때, 이것은 조성물이 동일하게 효과적인 단위 투여 형태, 예컨대 정제, 알약 및 캡슐로 쉽게 세분될 수 있도록 활성 성분이 조성물 전체에 걸쳐 고르게 분산됨을 의미한다.
본 발명의 정제 또는 알약은 코팅되거나, 또는 달리 배합되어 장시간 작용의 강점을 제공하는 투여 형태를 제공할 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 알약은 내측 투여 성분 및 외측 투여 성분을 포함할 수 있으며, 후자는 전자 위의 엔벨로프 (envelope)의 형태로 존재한다. 두 성분은 위에서의 붕해에 저항하여 내측 성분이 십이지장 내로 온전하게 지나가게 하거나 방출이 지연되게 하는 역할을 하는 장용 층에 의해 분리될 수 있다. 다양한 물질이 그러한 장용 층 또는 코팅용으로 사용될 수 있으며, 그러한 물질은 다수의 중합체성 산 및 중합체성 산과 셸락, 세틸 알코올 및 셀룰로오스 아세테이트와 같은 물질의 혼합물을 포함한다.
본 발명의 신규한 조성물이 경구 투여를 위하여 또는 주사에 의해 포함될 수 있는 액체 형태는 엘릭시르 및 유사한 제약 비히클 뿐만 아니라 식용 오일, 예컨대 옥수수유, 면실유, 참깨유, 코코넛유 또는 땅콩유도 포함하는 착향된 에멀젼, 수성 또는 오일 현탁액, 적합하게 착향된 시럽 및 수성 용액을 포함한다.
흡입 또는 통기용 조성물은 제약상 허용가능한 수성 또는 유기 용매 또는 이들의 혼합물 중 용액 및 현탁액과, 산제를 포함한다. 액체 또는 고체 조성물은 상기에 기술된 적합한 제약상 허용가능한 부형제를 함유할 수 있다. 조성물은 국소 또는 전신 효과를 위하여 경구 또는 비강 호흡기 경로에 의해 투여될 수 있다. 제약상 허용가능한 용매 중 조성물은 불활성 가스의 사용에 의해 분무될 수 있다. 분무된 용액은 분무 장치로부터 직접적으로 흡입될 수 있거나 분무 장치는 페이스 마스크 텐트 (face mask tent), 또는 간헐적 양압 호흡기에 부착될 수 있다. 용액, 현탁액, 또는 산제 조성물은 또한 제형을 적절한 방식으로 전달하는 장치로부터 경구 투여되거나 비강 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 콘쥬게이트, CPP-PMO를 포함하는 다중 CPP-AON은 1 내지 200 mg/kg, 예컨대 10 내지 50 mg/kg의 범위의 일일 용량으로 투여될 수 있다. CPP-PMO를 포함하는 CPP-AON 콘쥬게이트는 볼루스 (bolus) 형태로 또는 장시간의 주사 기간에 걸쳐 투여될 수 있다. 예를 들어, 일일 투여량은 하나의 볼루스의 용량으로 투여될 수 있다. 대안적으로, 일일 투여량은 주사, 예컨대 정맥내 주사 또는 피하 주사를 통하여 투여될 수 있다. 또 다른 실시 양태에서, 일일 투여량은 일일 2회, 3회 또는 4회와 같은 수 회 투여로 분할될 수 있다. 투약은 치료 의사에 의해 결정되는 바와 같이 필요에 따라 매일 반복될 수 있다. 치료는 단기, 예컨대 6개월 미만 동안일 수 있다. 또 다른 실시 양태에서, 치료는 장기, 예컨대 6개월 초과, 예컨대 1년 초과, 예컨대 10년 초과, 예컨대 치료를 필요로 하는 인간 또는 동물의 일생에 걸친 것일 수 있다.
본 발명의 콘쥬게이트, PMO-CPP를 포함하는 다중 AON 콘쥬게이트는 표적 유전자 또는 유전자좌로부터 전사되는 프리 (pre)-mRNA, mRNA, 및/또는 마이크로RNA 또는 긴 비-코딩 RNA 중 하나 이상과 특이적으로 혼성화된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 다중 PMO-CPP 콘쥬게이트는 다중 PMO-CPP 콘쥬게이트가 생리학적 조건 하에 표적에 혼성화될 때 표적 폴리뉴클레오티드, 예컨대 프리-mRNA 또는 mRNA에 특이적으로 혼성화된다. 본 발명의 맥락에서, 혼성화는 상보성 퓨린 및 피리미딘 염기 사이에서 왓슨-크릭 (Watson-Crick), 후그스틴 (Hoogsteen) 또는 역 후그스틴 수소 결합일 수 있는 수소 결합을 통하여 일어난다. 예를 들어, 아데닌 (A) 및 티민 (T)은 수소 결합의 형성을 통하여 쌍을 형성하는 상보성 핵염기이다. 본 발명에 따르면, 다중 PMO-CPP 콘쥬게이트의 PMO 부분은 표적 뉴클레오티드에 특이적으로 혼성화된다. CPP 모이어티는 다중 PMO-CPP 콘쥬게이트에 테더링된 채로 남아 있을 수 있거나 이것은 예를 들어 카텝신 절단 부위에서와 같이 혼성화 전에 절단될 수 있다.
본 발명의 PMO 화합물은 혼성화가 일반적으로 용인되는 염기쌍 형성 규칙, 예를 들어 아데닌 (A)-티민 (T), 시토신 (C)-구아닌 (G), 아데닌 (A)-우라실 (U)에 따라 일어날 때, 표적 폴리뉴클레오티드, 예컨대 프리-mRNA, mRNA, 또는 마이크로RNA, 또는 긴 비-코딩 RNA와 상보성이다. 특히, 본원에서 사용되는 바와 같이 "상보성"은 두 핵염기 사이에서 정확하게 쌍을 형성하는 능력을 나타낸다. 예를 들어, PMO 화합물의 특정한 위치의 염기 (B)가 프리-mRNA 또는 mRNA 분자의 동일 위치의 뉴클레오티드와 수소 결합할 수 있다면, PMO와 표적 폴리뉴클레오티드 분자는 그 위치에서 서로와 상보성인 것으로 간주된다. PMO 화합물과 표적 폴리뉴클레오티드 분자는 각각의 분자 내의 충분한 수의 상응하는 위치들이 서로와 수소 결합할 수 있는 염기들에 의해 점유될 때 서로와 상보성이다. 따라서, "특이적으로 혼성화가능한" 및 "상보성"은 PMO와 폴리뉴클레오티드 표적 사이에 안정하고 특이적인 결합이 일어나도록 하기에 충분한 정도의 상보성 또는 정확한 쌍 형성을 나타내는 데 사용되는 용어이다. 절대적인 상보성, 즉, 100%의 상보성 염기 쌍 매치 (match)는, 표적 폴리뉴클레오티드 분자와 PMO 사이에 형성되는 헤테로듀플렉스 (heteroduplex)가 요망되는 효과를 야기하기에 충분한 요망되는 안정성을 갖기만 한다면 필요하지 않다. 본 발명에 따르면, PMO는 표적 폴리뉴클레오티드 분자에의 PMO 화합물의 결합이 표적 폴리뉴클레오티드 분자의 정상적인 기능을 변화시키고, 특이적 결합이 요망되는 조건 하에서, 예를 들어 생체 내 응용을 위하여 생리학적 조건 하에서 또는 시험관 내 응용을 위하여 분석이 수행되는 조건 하에서 비-표적 서열에의 PMO의 바람직하지 않은 비-특이적 결합을 회피하기에 충분한 정도의 상보성이 있을 때, 특이적으로 혼성화가능하다.
PMO와 표적 폴리뉴클레오티드 분자, 예컨대 mRNA 또는 프리-mRNA 사이의 그러한 혼성화는 이들의 정상적인 기능, 예컨대 mRNA로부터의 단백질의 번역 및 프리-mRNA의 스플라이싱 (splicing)에 의한 하나 이상의 mRNA 종의 생성을 간섭한다. 본 발명의 적어도 하나의 실시 양태에서, PMO와 프리-mRNA 사이의 혼성화는 프리-mRNA의 스플라이싱에 의한 RNA의 형성에 영향을 준다. 또 다른 실시 양태에서, 혼성화는 mRNA로부터의 단백질의 번역에 영향을 준다. 본 발명의 또 다른 실시 양태에서, 프리-mRNA 또는 mRNA 상에서의 마이크로 RNA 결합 부위에의 다중 CPP-AON 콘쥬게이트의 혼성화가 마이크로 RNA에 의한 후속적인 조절로부터 표적 프리-mRNA 또는 mRNA를 해방시킬 수 있다. 이러한 경우에, 그 영향은 프리 mRNA 또는 mRNA에 의해 코딩되는 유전자 생성물의 발현을 향상시키는 것일 수 있다. 이와는 대조적으로, 다중 CPP-AON, 예를 들어 다중-CPP PMO가 마이크로 RNA 내의 서열에 표적화되어서 마이크로RNA의 생물학적 활성이 방해될 경우, 그 영향은 아마도, 그 특정 마이크로 RNA에 의한 억제 하에 다양한 유전자 생성물의 발현을 향상시키는 것일 것이다.
표적 폴리뉴클레오티드를 그렇게 간섭하는 것의 전체적인 영향은 유전자의 발현의 선택적 조정이다. 본 발명의 맥락에서, "조정"은 유전자의 발현의 증가 (촉진) 또는 감소 (저해)를 의미한다.
본 발명에 따른 AON은 PMO 화합물과, PNA 화합물, 포스포르아미데이트 화합물, 메틸렌 메틸이미노 ("MMI") 화합물, 2-O-메틸 화합물 및 2-메톡시 에틸 화합물을 포함하며, 여기서, 각각의 서브유닛의 올리고핵염기는 도 1에 개시되어 있다. 올리고뉴클레오티드 화합물은 천연 핵산의 합성 유사체이다. 특히, 데옥시리보스 고리 및 포스페이트-결합 대신, 올리고뉴클레오티드 화합물은 하기에 나타낸 각각의 올리고뉴클레오티드 서브유닛으로 이루어진 서브유닛을 포함한다:
[화학식 I]
[화학식 II]
[화학식 III]
[화학식 IV]
[화학식 V]
[화학식 VI]
각각의 화학식 1 내지 VI의 경우, B는 뉴클레오티드 염기이다. 일차적 핵염기는 각각 C, G, A, T 및 U로 약칭되는 시토신 (DNA 및 RNA), 구아닌 (DNA 및 RNA), 아데닌 (DNA 및 RNA), 티민 (DNA) 및 우라실 (RNA)이다. A, G, C, 및 T는 DNA에서 나타나며, 이러한 분자는 DNA-염기로 칭해지고; A, G, C, 및 U는 RNA-염기로 칭해진다. RNA에서 우라실이 티민을 대체한다. 이들 두 염기는 우라실에 5' 메틸 기가 결여된 것을 제외하고는 동일하다. 아데닌 및 구아닌은 퓨린 (R로 약칭됨)으로 칭해지는 분자의 이중 고리형 부류에 속한다. 시토신, 티민 및 우라실은 모두 피리미딘 (Y로 약칭됨)이다.
PMO 화합물은 각각 모르폴린 고리 및 포스포로디아미데이트-연결 기로 이루어진 서브유닛을 보유한다. 예를 들어, 본 발명은 15 내지 30개의 하기 화학식 II의 서브유닛을 포함하는 PMO 화합물을 포함한다:
[화학식 II]
여기서, R은 알킬 기이며, B는 시토신 (C), 구아닌 (G), 아데닌 (A) 또는 티민 (T)으로부터 선택되는 자연 발생 퓨린 또는 피리미딘 뉴클레오티드 염기이다.
PNA 화합물은 화학식 I의 서브유닛으로 이루어진 서브유닛을 보유한다. 본 발명에 있어서 이는 15 내지 30개의 하기 화학식 I의 서브유닛을 포함하는 PMO 화합물을 포함한다:
[화학식 I]
여기서, B는 시토신 (C), 구아닌 (G), 아데닌 (A) 또는 티민 (T)으로부터 선택되는 퓨린 또는 피리미딘 뉴클레오티드 염기이다.
포스포르아미데이트 화합물은 화학식 III의 서브유닛으로 이루어진 서브유닛을 포함한다. 본 발명에 있어서 이는 15 내지 30개의 하기 화학식 III의 서브유닛을 포함하는 포스포르아미데이트 화합물을 포함한다:
[화학식 III]
여기서, B는 시토신 (C), 구아닌 (G), 아데닌 (A) 또는 티민 (T)으로부터 선택되는 퓨린 또는 피리미딘 뉴클레오티드 염기이다.
MMI 화합물은 화학식 IV의 서브유닛으로 이루어진 서브유닛을 포함한다. 예를 들어, 본 발명은 15 내지 30개의 하기 화학식 IV의 서브유닛을 포함하는 MMI 화합물을 포함한다:
[화학식 IV]
여기서, B는 시토신 (C), 구아닌 (G), 아데닌 (A) 또는 티민 (T)으로부터 선택되는 퓨린 또는 피리미딘 뉴클레오티드 염기이다.
2-OMe 화합물은 하기 화학식 V로 이루어진 서브유닛을 보유한다. 예를 들어, 본 발명은 15 내지 30개의 하기 화학식 V의 서브유닛을 포함하는 2-OMe 화합물을 포함한다:
[화학식 V]
여기서, B는 시토신 (C), 구아닌 (G), 아데닌 (A) 또는 티민 (T)으로부터 선택되는 퓨린 또는 피리미딘 뉴클레오티드 염기이다.
2-MOE 화합물은 하기 화학식 VI로 이루어진 서브유닛을 보유한다. 예를 들어, 본 발명은 15 내지 30개의 하기 화학식 VI의 서브유닛을 포함하는 2-MOE 화합물을 포함한다:
[화학식 VI]
여기서, B는 시토신 (C), 구아닌 (G), 아데닌 (A) 또는 티민 (T)으로부터 선택되는 퓨린 또는 피리미딘 뉴클레오티드 염기이다.
AON의 각각의 부류의 상기 설명은 각각 치환될 수 있으며, 여기서, AON-CPP, 예를 들어 2MOE-CPP, MMI-CPP, 2-OMe-CPP, PNA-CPP, 및 포스포르아미데이트-CPP는 상기 설명에 개시되어 있다.
적어도 하나의 실시 양태에서, AON 화합물은 15 내지 25개의 화학식 I, II, III, IV, V 또는 VI의 서브유닛을 갖는다. 또 다른 실시 양태에서, AON 화합물은 20 내지 25개의 화학식 I, II, III, IV, V 또는 VI의 서브유닛을 갖는다. 또 다른 실시 양태에서, AON 화합물은 24개 내지 26개의 서브유닛과 같은 약 25개의 화학식 I, II, III, IV, V 또는 VI의 서브유닛을 갖는다.
본 발명에 따르면, 다중 PMO-CPP 콘쥬게이트는 60% 미만의 PMO 서브유닛을 가지며, 여기서, 핵염기 (B)는 C 또는 G이다. 적어도 하나의 실시 양태에서, 다중 PMO-CPP 콘쥬게이트는 50% 미만의 PMO 서브유닛을 가지며, 여기서, 핵염기는 C 또는 G이다.
본 발명에 따르면, 다중 AON-CPP 콘쥬게이트는 60% 미만의 (화학식 I, II, III, IV, V 또는 VI의) AON 서브유닛을 가지며, 여기서, 핵염기 (B)는 C 또는 G이다. 적어도 하나의 실시 양태에서, 다중 AON-CPP 콘쥬게이트는 50% 미만의 AON 서브유닛을 가지며, 여기서, 핵염기는 C 또는 G이다.
본 발명의 다중 PMO-CPP 콘쥬게이트는 0 내지 3개의 반복 서브유닛을 갖는 2개 이상의 PMO 화합물을 가지며, 여기서, 핵염기는 G이다. 적어도 하나의 실시 양태에서, 다중 PMO-CPP 콘쥬게이트는 0개의 반복 서브유닛을 가지며, 여기서, B는 G이다. 또 다른 실시 양태에서, 다중 PMO-CPP 콘쥬게이트는 1개, 2개 또는 3개의 반복 서브유닛을 가지며, 여기서, B는 G이다. CPP 상에서의 다수의 콘쥬게이션 부위를 D- 또는 L-거울상 이성질체 위치에서의 글루탐산의 부가에 의해 도입하여 CPP의 말단에 근접한 다수의 PMO의 입체 장애를 감소시킨다. P1, - P1 위치에서의 아미노산, 페닐알라닌-라이신을 포함하는 펩티다아제 절단 부위의 사용은 CPP와 PMO 사이에 도입된다. 상기 펩티다아제 절단 부위의 절단은 PMO를 CPP로부터 유리시킨다. 예를 들어, CPP는 시스테인 위치에서 도입될 수 있는 효소 절단 부위 페닐알라닌-라이신 또는 발린-시트룰린을 포함하는 말레이미드 에스테르화 링커를 통하여 PMO에 부착될 수 있다. CPP는 아미드 결합에 의해 부착될 수 있다.
본 발명의 다중 AON-CPP 콘쥬게이트는 0 내지 3개의 반복 서브유닛을 갖는 2개 이상의 AON 화합물을 가지며, 여기서, 핵염기는 G이다. 적어도 하나의 실시 양태에서, 다중 AON-CPP 콘쥬게이트는 0개의 반복 서브유닛을 가지며, 여기서, B는 G이다. 또 다른 실시 양태에서, 다중 AON-CPP 콘쥬게이트는 1개, 2개 또는 3개의 반복 서브유닛을 가지며, 여기서, B는 G이다. CPP 상에서의 다수의 콘쥬게이션 부위를 D- 또는 L-거울상 이성질체 위치에서의 글루탐산의 부가에 의해 도입하여 CPP의 말단에 근접한 다수의 AON의 입체 장애를 감소시킨다. P1, - P1 위치에서의 아미노산, 페닐알라닌-라이신을 포함하는 펩티다아제 절단 부위의 사용은 CPP와 AON 사이에 도입된다. 상기 펩티다아제 절단 부위의 절단은 AON을 CPP로부터 유리시킨다. 예를 들어, CPP는 시스테인 위치에서 도입될 수 있는 효소 절단 부위 페닐알라닌-라이신 또는 발린-시트룰린을 포함하는 말레이미드 에스테르화 링커를 통하여 AON에 부착될 수 있다. CPP는 아미드 결합에 의해 부착될 수 있다.
펩티드를 이용한 세포 내로의 내부화는 예를 들어 리소좀 효소를 포함하는 세포내 프로테아제로 이어져서 절단 부위를 절단할 수 있으며, 유리 PMO 또는 AON은 펩티드 결합된 콘쥬게이트로부터의 입체 장애가 더 낮다. 이러한 더 낮은 입체적 구속은 핵 및 시토졸에 대하여 더 적은 독성을 가지고서 엑손 스킵 효율을 증가시킬 수 있다.
본 발명에 따르면, 다중 PMO-CPP 콘쥬게이트의 CPP 성분은 표 1, 표 2, 도 1의 서열을 갖는, A 내지 N으로 명명된 것과 같은 공지된 CPP, 또는 본원에 기술된 K 시리즈 또는 B 시리즈의 CPP로부터 선택될 수 있다.
본 발명에 따르면, 다중 AON-CPP 콘쥬게이트의 CPP 성분은 표 1, 표 2, 도 1의 서열을 갖는, A 내지 N으로 명명된 것과 같은 공지된 CPP, 또는 본원에 기술된 K 시리즈 또는 B 시리즈의 CPP로부터 선택될 수 있다.
적어도 하나의 실시 양태에서, CPP 성분은 펩티드 K: RXRRXRRXRRXRXB (서열 번호 43)이며, 여기서, R은 D-아르기닌이고, X는 6-아미노헥산산이며, B는 β-알라닌이다. 또 다른 실시 양태에서, CPP 성분은 펩티드 B: RXRRBRRXRRBRXB (서열 번호 44)이며, 여기서, R, X 및 B는 이상에서 정의되어 있다.
또한 본 발명의 콘쥬게이트, 다중 PMO-CPP, 또는 AON-CPP의 CPP 성분은 식, 가변 서열 - 스페이서 - 링커를 포함하는 화합물일 수 있으며, 여기서, 가변 서열은 Ac-R(O)nR이고, n ≥ 7이며; O는 R, X 및 Z로부터 선택되는 잔기의 서열이고; R은 L-아르기닌이며, X는 3-시스-아미노시클로헥산이고, Z는 시스-2-아미노시클로펜탄-1-카르보닐이다. 일부 실시 양태에서, 링커는 절단 모티프를 포함하는 서열이다. 일부 실시 양태에서, 절단 모티프는 임의의 가수분해 효소에 의해 절단될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 절단 모티프는 펩티다아제 또는 프로테아제, 예컨대 카텝신 또는 트립신에 의해 절단될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 링커는 특정한 세린 프로테아제, 트레오닌 프로테아제, 시스테인 프로테아제, 아스파르테이트 프로테아제, 글루탐산 프로테아제 또는 메탈로프로테아제, 또는 하나 초과의 펩티다아제의 군에 의해 인식되는 절단 모티프를 포함하도록 설계될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 링커는 중첩 또는 비중첩되는 2개 이상의 절단 모티프를 포함할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 링커는 절단 모티프를 전혀 포함하지 않을 수 있다. 일부 실시 양태에서, 링커는 링커 중 100% 미만, 75% 미만, 50% 미만, 또는 10% 미만이 절단되도록 설계될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 링커는 링커 중 90% 또는 99% 초과가 절단되도록 설계된다.
일부 실시 양태에서, CPP는 식, 가변 서열 - 스페이서 - 링커를 포함하는 화합물일 수 있으며, 여기서, 가변 서열은 Ac-R(O)nR이고, n ≥ 7이며; O는 R, X 및 Z로부터 선택되는 잔기의 서열이고; R은 L-아르기닌이며, X는 3-시스-아미노시클로헥산이고, Z는 시스-2-아미노시클로펜탄-1-카르보닐이며; 가변 서열은 α-, β-, γ-, 또는 δ-아미노산, 또는 시클로알칸 구조를 포함한다.
일부 실시 양태에서, CPP는 식, 가변 서열 - 스페이서 - 링커를 포함하는 화합물일 수 있으며, 여기서, 가변 서열은 Ac-R(O)nR이고, n ≥ 7이며; O는 R, X 및 Z로부터 선택되는 잔기의 서열이고; R은 L-아르기닌이며, X는 3-시스-아미노시클로헥산이고, Z는 시스-2-아미노시클로펜탄-1-카르보닐이며; 가변 서열은 화합물이 핵에 표적화되게 한다.
일부 실시 양태에서, CPP는 식, 가변 서열 - 스페이서 - 링커를 포함하는 화합물일 수 있으며, 여기서, 가변 서열은 Ac-R(O)nR이고, n ≥ 7이며; O는 R, X 및 Z로부터 선택되는 잔기의 서열이고; R은 L-아르기닌이며, X는 3-시스-아미노시클로헥산이고, Z는 시스-2-아미노시클로펜탄-1-카르보닐이며; 가변 서열은 화합물이 시토졸에 표적화되게 한다.
일부 실시 양태에서, CPP는 식, 가변 서열 - 스페이서 - 링커를 포함하는 화합물일 수 있으며, 여기서, 가변 서열은 Ac-R(O)nR이고, n ≥ 7이며; O는 R, X 및 Z로부터 선택되는 잔기의 서열이고; R은 L-아르기닌이며, X는 3-시스-아미노시클로헥산이고, Z는 시스-2-아미노시클로펜탄-1-카르보닐이며; 가변 서열은 화합물이 미토콘드리아에 표적화되게 한다.
일부 실시 양태에서, CPP는 식, 가변 서열 - 스페이서 - 링커를 포함하는 화합물일 수 있으며, 여기서, 가변 서열은 Ac-R(O)nR이고, n ≥ 7이며; O는 R, X 및 Z로부터 선택되는 잔기의 서열이고; R은 L-아르기닌이며, X는 3-시스-아미노시클로헥산이고, Z는 시스-2-아미노시클로펜탄-1-카르보닐이며; 스페이서는 아미노헥산산 (Ahx)을 포함한다.
일부 실시 양태에서, CPP는 식, 가변 서열 - 스페이서 - 링커를 포함하는 화합물일 수 있으며, 여기서, 가변 서열은 Ac-R(O)nR이고, n ≥ 7이며; O는 R, X 및 Z로부터 선택되는 잔기의 서열이고; R은 L-아르기닌이며, X는 3-시스-아미노시클로헥산이고, Z는 시스-2-아미노시클로펜탄-1-카르보닐이며; 스페이서는 (Ahx)B를 포함하고, B는 β-알라닌 또는 β-글리신으로부터 선택된다.
일부 실시 양태에서, CPP는 식, 가변 서열 - 스페이서 - 링커를 포함하는 화합물일 수 있으며, 여기서, 가변 서열은 Ac-R(O)nR이고, n ≥ 7이며; O는 R, X 및 Z로부터 선택되는 잔기의 서열이고; R은 L-아르기닌이며, X는 3-시스-아미노시클로헥산이고, Z는 시스-2-아미노시클로펜탄-1-카르보닐이며; 링커는 절단 모티프를 포함한다.
일부 실시 양태에서, CPP는 식, 가변 서열 - 스페이서 - 링커를 포함하는 화합물일 수 있으며, 여기서, 가변 서열은 Ac-R(O)nR이고, n ≥ 7이며; O는 R, X 및 Z로부터 선택되는 잔기의 서열이고; R은 L-아르기닌이며, X는 3-시스-아미노시클로헥산이고, Z는 시스-2-아미노시클로펜탄-1-카르보닐이며; 링커는 절단 모티프를 포함하고; 절단 모티프는 가수분해 효소에 의해 절단된다.
일부 실시 양태에서, CPP는 식, 가변 서열 - 스페이서 - 링커를 포함하는 화합물일 수 있으며, 여기서, 가변 서열은 Ac-R(O)nR이고, n ≥ 7이며; O는 R, X 및 Z로부터 선택되는 잔기의 서열이고; R은 L-아르기닌이며, X는 3-시스-아미노시클로헥산이고, Z는 시스-2-아미노시클로펜탄-1-카르보닐이며; 링커는 FS를 포함한다.
일부 실시 양태에서, CPP는 식, 가변 서열 - 스페이서 - 링커를 포함하는 화합물일 수 있으며, 여기서, 가변 서열은 Ac-R(O)nR이고, n ≥ 7이며; O는 R, X 및 Z로부터 선택되는 잔기의 서열이고; R은 L-아르기닌이며, X는 3-시스-아미노시클로헥산이고, Z는 시스-2-아미노시클로펜탄-1-카르보닐이며; 링커는 FSQ를 포함한다.
일부 실시 양태에서, CPP는 식, 가변 서열 - 스페이서 - 링커를 포함하는 화합물일 수 있으며, 여기서, 가변 서열은 Ac-R(O)nR이고, n ≥ 7이며; O는 R, X 및 Z로부터 선택되는 잔기의 서열이고; R은 L-아르기닌이며, X는 3-시스-아미노시클로헥산이고, Z는 시스-2-아미노시클로펜탄-1-카르보닐이며; 링커는 FSQK를 포함한다.
일부 실시 양태에서, CPP는 식, 가변 서열 - 스페이서 - 링커를 포함하는 화합물일 수 있으며, 여기서, 가변 서열은 Ac-R(O)nR이고, n ≥ 7이며; O는 R, X 및 Z로부터 선택되는 잔기의 서열이고; R은 L-아르기닌이며, X는 3-시스-아미노시클로헥산이고, Z는 시스-2-아미노시클로펜탄-1-카르보닐이며; 링커는 FxyB를 포함하고, x는 임의의 아미노산이며, y는 글루탐산 (E), 아스파르트산 (D), 라이신 (K), 세린 (S), 및 트레오닌 (T)으로부터 선택되고, B는 β-알라닌이다.
일부 실시 양태에서, CPP는 식, 가변 서열 - 스페이서 - 링커를 포함하는 화합물일 수 있으며, 여기서, 가변 서열은 Ac-R(O)nR이고, n ≥ 7이며; O는 R, X 및 Z로부터 선택되는 잔기의 서열이고; R은 L-아르기닌이며, X는 3-시스-아미노시클로헥산이고, Z는 시스-2-아미노시클로펜탄-1-카르보닐이며; 링커는 FxyB를 포함하고, x는 임의의 아미노산이며, y는 글루탐산 (E), 아스파르트산 (D), 라이신 (K), 세린 (S), 및 트레오닌 (T)으로부터 선택되고, B는 β-알라닌이며; y는 글루탐산의 비-천연 유사체이다.
일부 실시 양태에서, CPP는 식, 가변 서열 - 스페이서 - 링커를 포함하는 화합물일 수 있으며, 여기서, 가변 서열은 Ac-R(O)nR이고, n ≥ 7이며; O는 R, X 및 Z로부터 선택되는 잔기의 서열이고; R은 L-아르기닌이며, X는 3-시스-아미노시클로헥산이고, Z는 시스-2-아미노시클로펜탄-1-카르보닐이며; 링커는 FxyB를 포함하고, x는 임의의 아미노산이며, y는 글루탐산 (E), 아스파르트산 (D), 라이신 (K), 세린 (S), 및 트레오닌 (T)으로부터 선택되고, B는 β-알라닌이며; y는 아스파르트산의 비-천연 유사체이다.
일부 실시 양태에서, CPP는 식, 가변 서열 - 스페이서 - 링커를 포함하는 화합물일 수 있으며, 여기서, 가변 서열은 Ac-R(O)nR이고, n ≥ 7이며; O는 R, X 및 Z로부터 선택되는 잔기의 서열이고; R은 L-아르기닌이며, X는 3-시스-아미노시클로헥산이고, Z는 시스-2-아미노시클로펜탄-1-카르보닐이며; 링커는 FxyB를 포함하고, x는 임의의 아미노산이며, y는 글루탐산 (E), 아스파르트산 (D), 라이신 (K), 세린 (S), 및 트레오닌 (T)으로부터 선택되고, B는 β-알라닌이며; y는 라이신의 비-천연 유사체이다.
일부 실시 양태에서, CPP는 식, 가변 서열 - 스페이서 - 링커를 포함하는 화합물일 수 있으며, 여기서, 가변 서열은 Ac-R(O)nR이고, n ≥ 7이며; O는 R, X 및 Z로부터 선택되는 잔기의 서열이고; R은 L-아르기닌이며, X는 3-시스-아미노시클로헥산이고, Z는 시스-2-아미노시클로펜탄-1-카르보닐이며; 링커는 FxyB를 포함하고, x는 임의의 아미노산이며, y는 글루탐산 (E), 아스파르트산 (D), 라이신 (K), 세린 (S), 및 트레오닌 (T)으로부터 선택되고, B는 β-알라닌이며; y는 세린의 비-천연 유사체이다.
일부 실시 양태에서, CPP는 식, 가변 서열 - 스페이서 - 링커를 포함하는 화합물일 수 있으며, 여기서, 가변 서열은 Ac-R(O)nR이고, n ≥ 7이며; O는 R, X 및 Z로부터 선택되는 잔기의 서열이고; R은 L-아르기닌이며, X는 3-시스-아미노시클로헥산이고, Z는 시스-2-아미노시클로펜탄-1-카르보닐이며; 링커는 FxyB를 포함하고, x는 임의의 아미노산이며, y는 글루탐산 (E), 아스파르트산 (D), 라이신 (K), 세린 (S), 및 트레오닌 (T)으로부터 선택되고, B는 β-알라닌이며; y는 E, D, K, S 또는 T의 비-천연 유사체이다.
일부 실시 양태에서, CPP는 식, 가변 서열 - 스페이서 - 링커를 포함하는 화합물일 수 있으며, 여기서, 가변 서열은 Ac-R(O)nR이고, n ≥ 7이며; O는 R, X 및 Z로부터 선택되는 잔기의 서열이고; R은 L-아르기닌이며, X는 3-시스-아미노시클로헥산이고, Z는 시스-2-아미노시클로펜탄-1-카르보닐이며; 스페이서는 아미노헥산산 (Ahx)을 포함하고; 링커는 FSQG-OH를 포함한다.
일부 실시 양태에서, CPP는 식, 가변 서열 - 스페이서 - 링커를 포함하는 화합물일 수 있으며, 여기서, 가변 서열은 Ac-R(O)nR이고, n ≥ 7이며; O는 R, X 및 Z로부터 선택되는 잔기의 서열이고; R은 L-아르기닌이며, X는 3-시스-아미노시클로헥산이고, Z는 시스-2-아미노시클로펜탄-1-카르보닐이며; 링커는 FxyB를 포함하고, x는 임의의 아미노산이며, y는 글루탐산 (E), 아스파르트산 (D), 라이신 (K), 세린 (S), 및 트레오닌 (T)으로부터 선택되고, B는 β-알라닌이며; y는 트레오닌의 비-천연 유사체이고; n은 7이며, 스페이서는 (Ahx)이다.
일부 실시 양태에서, CPP는 식, 가변 서열 - 스페이서 - 링커를 포함하는 화합물일 수 있으며, 여기서, 가변 서열은 Ac-R(O)nR이고, n ≥ 7이며; O는 R, X 및 Z로부터 선택되는 잔기의 서열이고; R은 L-아르기닌이며, X는 3-시스-아미노시클로헥산이고, Z는 시스-2-아미노시클로펜탄-1-카르보닐이며, 가변 서열, 스페이서, 및 링커는 하기로부터 선택되는 서열을 포함한다: 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 및 11.
일부 실시 양태에서, CPP-PMO, 또는 CPP-AON은 식, 가변 서열 - 스페이서 - 링커를 포함하는 것일 수 있으며, 이는 링커에 콘쥬게이션된 카고 (cargo)를 추가로 포함하고, 여기서, 가변 서열은 Ac-R(O)nR이고, n ≥ 7이며; O는 R, X 및 Z로부터 선택되는 잔기의 서열이고; R은 L-아르기닌이며, X는 3-시스-아미노시클로헥산이고, Z는 시스-2-아미노시클로펜탄-1-카르보닐이며, 카고는 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머 (PMO)를 포함한다.
일부 실시 양태에서, CPP-PMO, 또는 CPP-AON은 식, 가변 서열 - 스페이서 - 링커를 포함하고 링커에 콘쥬게이션된 카고를 추가로 포함하는 화합물일 수 있으며, 여기서, 가변 서열은 Ac-R(O)nR이고, n ≥ 7이며; O는 R, X 및 Z로부터 선택되는 잔기의 서열이고; R은 L-아르기닌이며, X는 3-시스-아미노시클로헥산이고, Z는 시스-2-아미노시클로펜탄-1-카르보닐이며, 카고는 하나 이상의 추가의 PMO를 추가로 포함한다.
일부 실시 양태에서, CPP는 하기 표 1의 서열들 중 임의의 것에 따른 가변 서열 - 스페이서 - 링커를 포함할 수 있다:
일부 실시 양태에서, CPP는 표 2에 개시된 하기 서열을 포함할 수 있다:
당업자라면 본 발명의 목적, 예컨대 세포 침투의 향상을 달성할 추가의 CPP 서열을 설계할 수 있을 것이다. 그 결과, 현재 개시된 다중 PMO-CPP 및 AON-CPP 콘쥬게이트는 본원에 개시된 CPP 성분에 한정되지 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, NOAEL은 바람직하지 못한 효과가 전혀 관찰되지 않는 투여 수준을 의미한다. 환언하면, NOAEL은 최대 안전 용량이다.
일부 실시 양태에서, 링커는 절단 모티프를 포함하는 서열이다. 일부 실시 양태에서, 절단 모티프는 임의의 가수분해 효소에 의해 절단될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 절단 모티프는 펩티다아제 또는 프로테아제, 예컨대 카텝신 또는 트립신에 의해 절단될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 카텝신 절단가능 링커는 카텝신 절단 부위와 동의어이다. 본 발명에 따른 절단가능한 링커는 세포내 효소에 의해 절단될 수 있으며, 즉, 화학적으로 절단될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 링커는 특정한 세린 프로테아제, 트레오닌 프로테아제, 시스테인 프로테아제, 아스파르테이트 프로테아제, 글루탐산 프로테아제 또는 메탈로프로테아제, 또는 하나 초과의 펩티다아제의 군에 의해 인식되는 절단 모티프를 포함하도록 설계될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 링커는 중첩 또는 비중첩되는 2개 이상의 절단 모티프를 포함할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 링커는 절단 모티프를 전혀 포함하지 않을 수 있다. 일부 실시 양태에서, 링커는 링커 중 100% 미만, 75% 미만, 50% 미만, 또는 10% 미만이 절단되도록 설계될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 링커는 링커 중 90% 또는 99% 초과가 절단되도록 설계된다.
일부 실시 양태에서, 링커는 서열 FS (서열 번호 45)를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 링커는 서열 FSQ (서열 번호 46) 또는 FSQK (서열 번호 47)를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 링커는 서열 FxyB (서열 번호 48)를 포함하며, 여기서, x는 표준 또는 비표준의 임의의 아미노산이고, y는 글루탐산 (E), 아스파르트산 (D), 및 라이신 (K), 세린 (S), 또는 트레오닌 (T)이며, B는 β-알라닌 또는 β-글리신이다. 일부 실시 양태에서, 적합한 카텝신 절단 부위는 FKE (서열 번호 49), FAE (서열 번호 50), FVE (서열 번호 51), FLE (서열 번호 52), FSE (서열 번호 53), 및 V[Cit]E (서열 번호 54)를 포함하며, 여기서, F는 페닐알라닌이고, K는 라이신이며, E는 글루탐산이고, A는 알라닌이며, V는 발린이고, L은 류신이며, S는 세린이고, Cit는 시트룰린이다. 본 발명은 본원에 개시된 특정 카텝신 링커에 한정되지 않으며, 세포내 프로테아제에 의해 절단될 수 있는 추가의 아미노산 서열을 또한 포함한다.
실시예
펩티드 합성
예비 로딩된 CLEAR (가교결합된 에톡실레이트 아크릴레이트 수지 (Cross-Linked Ethoxylate Acrylate Resin)) (미국 켄터키주 루이스빌 소재의 펩티즈 인터내셔널 (Peptides International))에서 표준 Fmoc-화학을 이용하여 라닌 심포니 (Ranin Symphony) 자동 펩티드 합성기를 이용하여 펩티드를 합성하였다. 아미노산 (미국 캘리포니아주 샌디에고 소재의 이엠디 바이오사이언시즈 (EMD Biosciences), 또는 미국 캘리포니아주 새너제이 소재의 아나스펙 (Anaspec))을 tert-부톡시카르보닐 (BOC), tert-부틸 (tBu) 2,2,4,6,7-펜타메틸디히드로-벤조푸란-5-술포닐 (Pbf), 또는 트리틸 (Trt) 기로 직교로 보호하였다. 5/5/10/1의 몰 정량의 아미노산/HCTU/N-메틸모르폴린/수지를 이용하여 커플링을 수행하였다. 20%의 피페리딘, 2%의 1,8-디아자비시클로[5.4.0]-운데스-7-엔 (DBU) (DMF 중의 것)를 사용하여 각각의 사이클 동안 아민 말단으로부터 Fmoc를 제거하였다. 30/8/1의 몰비의 아세트산 무수물/NMM/수지 (DMF 중의 것)를 이용하여 수지에서 N-말단 아세틸화를 수행하였다. 탈보호/수지로부터의 절단을 15 ml/0.1 mM의, 2.5%의 물/2.5%의 TIS/5%의 아니솔 (Anisole)/90%의 TFA의 v/v 비의 수지의 혼합물을 이용하여 3시간 동안 수행하였다. 상청액을 디에틸 에테르 (-80℃)에서 침전시키고, 3000 rpm에서 10분 동안 펠렛화하였다. 에테르를 기울여서 따라내고, 펠렛을 다시 세척하였다. 조 펩티드를 동결건조시키고, 반-예비 역상 HPLC (엑스브리지 (XBridge) C18, 10 x 250 mm, 5 ㎛의 입자 크기)를 사용하여 정제하였다. 99%의 완충제-A (물, 0.1% TFA) 및 1% 완충제-B (아세토니트릴, 0.1% TFA) (구배 기울기, 0.3% B/분)의 로딩 구배를 이용하여 5 ml/분으로 정제를 수행하였다. 역상 분석용 HPLC 및 MALDI-TOF (워터스 시냅트 (Waters Synapt)))에 의하면 펩티드 순도는 95% 초과인 것으로 평가되었다. 분획물들을 풀링하고 (pooled), 동결건조시키고, 적절한 콘쥬게이션 완충제에 재용해시켰다. (모든 용매는 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재의 이엠디 바이오사이언시즈 또는 미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마 알드리치 (Sigma Aldrich)로부터 구매한 HPLC 등급의 것이었다.
펩티드 (CPP)-PMO 콘쥬게이션
5'-말단 일차 아민을 포함하는 PMO를 주문하고, 펩티드를 상기에 설명한 바와 같이 합성하였다. 단일 PMO-CPP 콘쥬게이트에서, 펩티드를 PMO와 비교하여 2배 몰 과량으로 사용하고, 다중 PMO-CPP 콘쥬게이트에서 PMO의 몰을 하기 방정식을 이용하여 계산하였다: (1.2배) x (콘쥬게이트의 수) x (펩티드의 몰). PMO를 DMSO (5 mM)에 용해시키고, 따로 두었다. 펩티드를 DMF (50 mM)에 용해시키고, 몰 당량의 아미늄-기반 커플링 시약 2-(6-클로로-1-H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸아미늄 헥사플루오로포스페이트와 혼합하였다. 2 몰 당량의 4-메틸모르폴린 (NMM)을 상기 펩티드 혼합물에 첨가하고, PMO 용액에 즉각적으로 첨가하였다. 반응을 37℃에서 1.5시간 동안 진행시키고, 4 부피 당량의 물을 이용하여 중단시켰다. 상기 혼합물을 CM 세파로스 (미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마 알드리치) 컬럼에 첨가하고, 10 컬럼 부피로 세척하여 비콘쥬게이션된 PMO 및 반응물을 제거하였다. 펩티드 CPP-PMO 콘쥬게이트를 1 M 구아니듐-HCL, 1 M NaCl을 이용하여 컬럼으로부터 용출시키고, 3회의 완충제 교환을 이용하여 100 mM NH4HCO3에 대하여 투석시켜 염 및 비콘쥬게이션된 펩티드를 제거하였다. 투석된 물질을 동결건조시키고, 분석용 HPLC를 이용하여 분석하였다.
하기 CPP를 상기에 설명한 일반 펩티드 합성 프로토콜에 따라 합성하였다:
● 제1215번: Ac-(RXRRBR)2XFKEG-OH (서열 번호 55)
● 제1216번: Ac-(RXRRBR)2XFD(d-Glu)EG-OH (서열 번호 56)
● 제1217번: Ac-E(RXRRBR)2XFKG-아미드 (서열 번호 57)
● 제1218번: Ac-E(RXRRBR)2XFKG-OH (서열 번호 58)
● 제1219번: Ac-E(RXRRBR)2XFKEG-OH (서열 번호 59)
● 제1220번: Ac-E(RXRRBR)2XFK(d-Glu)EG-OH (서열 번호 60)
● 제1221번: Ac-(d-Glu)E(RXRRBR)2xFKG-아미드 (서열 번호 61)
● 제1222번: Ac-(dGlu)E(RXRRBR)2XFKG-OH (서열 번호 62)
● 제1223번: Ac-(d-Glu)E(RXRRBR)2XFKEG-OH (서열 번호 63)
● 제1224번: Ac-(d-Glu)E(RXRRBR)2XFK((d-Glu)EG-OH (서열 번호 64)
● 제1225-B번: Biot-(RXRRBR)2XFKG-OH (서열 번호 65)
● 제1225-F: FITC-(RXRRBR)2XFKG-OH (서열 번호 66)
● 제1226-B번: Ac-(RXRRBR)2XFK(Biot)G-OH (서열 번호 67)
● 제1226-F번: Ac-(RXRRBR)2XFK(FITC)G-OH (서열 번호 68)
여기서, Ac는 아세틸이며, R은 D-아르기닌이고, X는 6-아미노헥산산이며, B는 β-알라닌이고, FK는 카텝신 절단 부위이며, E는 글루탐산이고, G는 글리신이며, Biot는 비오틴이고, FITC는 플루오레세인 이소티오시아네이트이다.
상기에 열거된 CPP를 상기에 설명한 합성 절차를 이용하여 PMO23과 콘쥬게이션시켜 PMO-CPP 콘쥬게이트를 형성하였다. 이러한 절차에 따라 형성된 콘쥬게이트는 하기 서열을 가졌다:
● 제1215번: Ac-(RXRRBR)2XFKE(PMO)G(PMO) (서열 번호 69)
● 제1216번: Ac-(RXRRBR)2XFD(d-Glu)(PMO)E(PMO)G(PMO) (서열 번호 70)
● 제1217번: Ac-E(PMO)(RXRRBR)2XFKG (서열 번호 71)
● 제1218번: Ac-E(PMO)(RXRRBR)2XFKG(PMO) (서열 번호 72)
● 제1219번: Ac-E(PMO)(RXRRBR)2XFKE(PMO)G(PMO) (서열 번호 73)
● 제1220번: Ac-E(PMO)(RXRRBR)2XFK(d-Glu)(PMO)E(PMO)G(PMO) (서열 번호 74)
● 제1221번: Ac-(d-Glu)(PMO)E(PMO)(RXRRBR)2XFKG (서열 번호 75)
● 제1222: Ac-(dGlu)(PMO)E(PMO)(RXRRBR)2XFKG(PMO) (서열 번호 76)
● 제1223번: Ac-(d-Glu)(PMO)E(PMO)(RXRRBR)2XFKE(PMO)G(PMO) (서열 번호 77)
● 제1224번: Ac-(d-Glu)(PMO)E(PMO)(RXRRBR)2XFK(d-Glu)(PMO)E(PMO)G(PMO) (서열 번호 78)
● 제1225-B번: Biot-(RXRRBR)2XFKG(PMO) (서열 번호 79)
● 제1226-B번: Ac-(RXRRBR)2XFK(Biot)G(PMO) (서열 번호 80)
상기 CPP-PMO 콘쥬게이트와, 제1120번 (Ac-(RXR)4XFKE-((PEG)2-PMO)G-(PMO)) (서열 번호 81) 및 (Ac-(RXRRBR)2XBA-PMO) (서열 번호 82)를 야생형 마우스에게 2.84 μM/kg의 용량으로 정맥내 투여하였다.
마지막의 투약 후, 조직을 마취 하에 수확하고, 액체 질소에서 냉동시켰다. 냉동된 심장 및 사두근을 프로세싱하여 RNA를 단리하였다. 샘플을 나노드롭 (nanodrop) ND1000 분광 광도계를 이용하여 정량화하였다. 샘플을 15 ng/㎕의 농도까지 추가로 희석시켰다. 샘플을 하기 서열을 갖는 프라이머를 사용하여 증폭시켰다: CAGAATTCTGCCAATTGCTGAG (서열 번호 83) 및 TTCTTCAGCTTGTGTCATCC (서열 번호 84). PCR을 55℃/30분; 94℃/2분; 94℃/15초 x 30회; 55℃/30초; 68℃/1.5분의 런 시퀀스 (run sequence)를 이용하여 행하였다.
각각의 콘쥬게이트의 엑손 23 스킵의 백분율을 표 3에 나타낸다.
CPP의 N-말단에 콘쥬게이션된 PMO는 C-말단에 콘쥬게이션된 동일한 수의 PMO만큼 잘 작동하지 않았다. 콘쥬게이트 제1212번은 K-펩티드 콘쥬게이트 제1120번만큼 잘 작동하지 않았다. 단지 하나의 PMO를 포함하는 제1204번은 2개의 PMO를 포함하는 콘쥬게이트 제1120번보다 더 우수하게 작동하였다. 제1225-B번은 제1226-B번보다 더 우수하게 작동하였다.
하기 추가의 CPP-PMO 콘쥬게이트를 상기 절차에 따라 합성하였다. 하기 콘쥬게이트에 사용한 PMO는 GGCCAAACCTCGGCTTACCTGAAAT (서열 번호 85)이다.
K 시리즈 (PMO는 PMO23임):
● 제1118번: Ac-(RXR)4XEG-(PMO) (서열 번호 86)
● 제1119번: Ac-(RXR)4XE-((PEG)2-PMO)G-(PMO) (서열 번호 87)
● 제1120번: Ac-(RXR)4XFKE-((PEG)2-PMO)G-(PMO) (서열 번호 81)
● 제970-S번: 스테아릴-(RXR)4XA-PMO (서열 번호 88)
B 시리즈 (PMO는 PMO23임):
● 제1204번: Ac-(RXRRBR)2XBA-PMO (서열 번호 82)
● E(PMO)(RXRRBR)2XFKG, "n-말단 PPMO-B" (서열 번호 89)
● 제1239번: Ac-(RXRRBR)2XE(PMO)G(PMO) (서열 번호 90)
● Ac-(RXRRBR)2FKEG-(PMO)2, "디-PMO-B + FK" (서열 번호 91)
여기서, Ac는 아세틸이며, R은 D-아르기닌이고, X는 6-아미노헥산산이며, B는 β-알라닌이고, FK는 카텝신 절단 부위이며, E는 글루탐산이고, G는 글리신이다.
일부 실시 양태에서, X는 또한 다른 유형의 잔기, 예컨대 프롤린, 글리신, 또는 알라닌, 또는 추가의 변형 또는 비표준 아미노산을 포함할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 가변 서열은 알파, 베타, 감마 또는 델타 아미노산, 또는 시클로알칸 구조를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 링커는 서열 FS (서열 번호 45)를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 링커는 서열 FSQ (서열 번호 46) 또는 FSQK (서열 번호 47)를 포함하며, 여기서, F는 페닐알라닌이고, S는 세린이며, K는 라이신이고, Q는 글루타민이다. 일부 실시 양태에서, 링커는 서열 FxyB (서열 번호 48)를 포함하며, 여기서, x는 표준 또는 비표준의 임의의 아미노산이고, y는 글루탐산 (E), 아스파르트산 (D), 및 라이신 (K), 세린 (S), 또는 트레오닌 (T)이고, B는 β-알라닌 또는 β-글리신이다. 야생형 마우스에게 콘쥬게이트 제1204번, 제1119번, 제1120번, 제1239번 및 제1215번을 2.84 μM/kg의 용량으로 정맥내 투여하였다. 조직을 수확하고, RNA를 단리하였으며, 이는 상기에 설명한 바와 같았다. 스킵된 엑손 23의 백분율을 표 4에 나타낸다.
도 3에는 또한 야생형 마우스에서 엑손 23 스킵에 대한 다중 CPP-PMO 콘쥬게이트들 중 일부의 영향이 도시되어 있다.
상기에 나타낸 바와 같이, 단일 CPP-K에의 (그러나 CPP-B는 아님) 하나 초과의 PMO의 부착에 의해 효능이 향상되었다. 2개의 PMO 엑손 23 모이어티에 콘쥬게이션된, 정맥내 주사에 의해 전달된 CPP-B (제1239번)의 단회 용량은 단일 PMO 엑손 23에 콘쥬게이션된 CPP-B (제1204번)보다 훨씬 덜 효과적이었다. 놀랍게도, 본 발명자는 2개의 PMO에 콘쥬게이션된 CPP-K (제1119번)의 단회 용량이 정확하게 동일한 화학적 방식으로, 단일 PMO 엑손 23에 콘쥬게이션된 CPP-K (제1118번)의 단회 용량의 대략 2배만큼 효력이 있음을 밝혀냈다. 흥미롭게도, CPP-PMO23B는 단량체성 구성물로서의 CPP-PMO23K보다 더 효력이 있었다. 3개의 PMO를 CPP에 테더링한 다중 CPP-PMO 콘쥬게이트 연구에서, 단일 펩티드 B에 콘쥬게이션된 3개의 PMO23 모이어티는 (트리-PMO23-B가 그의 엑손 스킵 능력 면에서 디-PMO23-K와 유사하였지만) 디-PMO B과 비교하여 활성이 2배였다. 이러한 결과는 어떠한 다중 CPP-PMO 콘쥬게이트가 요망되는 특성을 가질 것인지는 선험적으로 예측될 수 없으며, 따라서 당업자라면 제조된 각각의 콘쥬게이트의 효능을 결정하기 위하여 본 발명에 설명된 방법을 이용하여 예비 연구를 행해야 함을 시사한다.
본 발명의 다른 실시 양태는 본 명세서의 고려 및 본원에 개시된 본 발명의 실시에 의해 당업자에게 명백해질 것이다. 본 명세서 및 실시예는 단지 예시적인 것으로서 간주되는 것으로 의도되며, 이때 본 발명의 실제 범주 및 사상은 하기 청구범위로 나타낸다.
SEQUENCE LISTING
<110> GENZYME
<120> MULTIPLE OLIGONUCLEOTIDE MOIETIES ON PEPTIDE CARRIER
<130> US2013/054 WO PCT
<140>
<141>
<150> 62/002,296
<151> 2014-05-23
<160> 96
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
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<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> 3-cis-aminocyclohexane
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> 3-cis-aminocyclohexane
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 3-cis-aminocyclohexane
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> 6-aminohexanoic acid
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Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Xaa
1 5 10
<210> 40
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> cis-2-aminocyclopentane-1-carbonyl
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> 3-cis-aminocyclohexane
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> 3-cis-aminocyclohexane
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> 3-cis-aminocyclohexane
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> 3-cis-aminocyclohexane
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 3-cis-aminocyclohexane
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> 6-aminohexanoic acid
<400> 40
Arg Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Xaa
1 5 10
<210> 41
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
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<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
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<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> cis-2-aminocyclopentane-1-carbonyl
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> 3-cis-aminocyclohexane
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> 3-cis-aminocyclohexane
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 3-cis-aminocyclohexane
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> 6-aminohexanoic acid
<400> 41
Arg Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Xaa
1 5 10
<210> 42
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> 3-cis-aminocyclohexane
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> 3-cis-aminocyclohexane
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> 3-cis-aminocyclohexane
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> 3-cis-aminocyclohexane
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
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<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> 3-cis-aminocyclohexane
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> cis-2-aminocyclopentane-1-carbonyl
<220>
<221> MOD_RES
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<213> Artificial Sequence
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peptide"
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<221> MOD_RES
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<221> MOD_RES
<222> (3)..(4)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> 6-aminohexanoic acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(7)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 6-aminohexanoic acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(10)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> 6-aminohexanoic acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(13)
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<220>
<221> MOD_RES
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<220>
<221> MOD_RES
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<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
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<221> MOD_RES
<222> (3)..(4)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> Beta-Ala
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(7)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 6-aminohexanoic acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(10)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> Beta-Ala
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
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<223> 6-aminohexanoic acid
<220>
<221> MOD_RES
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<223> Beta-Ala
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Arg Xaa Arg Arg Ala Arg Arg Xaa Arg Arg Ala Arg Xaa Ala
1 5 10
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<211> 2
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 45
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<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 46
Phe Ser Gln
1
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<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 47
Phe Ser Gln Lys
1
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<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
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<221> MOD_RES
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<223> Any amino acid
<220>
<221> VARIANT
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<221> MOD_RES
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<221> VARIANT
<222> (4)..(4)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(4)
<223> /note="Variant residues given in the sequence have no
preference with respect to those in the annotations
for variant positions"
<400> 48
Phe Xaa Glu Ala
1
<210> 49
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 49
Phe Lys Glu
1
<210> 50
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 50
Phe Ala Glu
1
<210> 51
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 51
Phe Val Glu
1
<210> 52
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 52
Phe Leu Glu
1
<210> 53
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 53
Phe Ser Glu
1
<210> 54
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Citruline
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Val Xaa Glu
1
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<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
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<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
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<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> Beta-Ala
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 6-aminohexanoic acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> Beta-Ala
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(13)
<223> 6-aminohexanoic acid
<400> 55
Arg Xaa Arg Arg Ala Arg Arg Xaa Arg Arg Ala Arg Xaa Phe Lys Glu
1 5 10 15
Gly
<210> 56
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
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<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> 6-aminohexanoic acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> Beta-Ala
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 6-aminohexanoic acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> Beta-Ala
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(13)
<223> 6-aminohexanoic acid
<220>
<221> MOD_RES
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<223> D-Glu
<400> 56
Arg Xaa Arg Arg Ala Arg Arg Xaa Arg Arg Ala Arg Xaa Phe Asp Glu
1 5 10 15
Glu Gly
<210> 57
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> 6-aminohexanoic acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> Beta-Ala
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> 6-aminohexanoic acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> Beta-Ala
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(13)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(14)
<223> 6-aminohexanoic acid
<400> 57
Glu Arg Xaa Arg Arg Ala Arg Arg Xaa Arg Arg Ala Arg Xaa Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 58
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> 6-aminohexanoic acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> Beta-Ala
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> 6-aminohexanoic acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> Beta-Ala
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(13)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(14)
<223> 6-aminohexanoic acid
<400> 58
Glu Arg Xaa Arg Arg Ala Arg Arg Xaa Arg Arg Ala Arg Xaa Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 59
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> 6-aminohexanoic acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> Beta-Ala
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> 6-aminohexanoic acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> Beta-Ala
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(13)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(14)
<223> 6-aminohexanoic acid
<400> 59
Glu Arg Xaa Arg Arg Ala Arg Arg Xaa Arg Arg Ala Arg Xaa Phe Lys
1 5 10 15
Glu Gly
<210> 60
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> 6-aminohexanoic acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> Beta-Ala
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> 6-aminohexanoic acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> Beta-Ala
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(13)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(14)
<223> 6-aminohexanoic acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (17)..(17)
<223> D-Glu
<400> 60
Glu Arg Xaa Arg Arg Ala Arg Arg Xaa Arg Arg Ala Arg Xaa Phe Lys
1 5 10 15
Glu Glu Gly
<210> 61
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> D-Glu
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
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Gly
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<221> MOD_RES
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<221> MOD_RES
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<221> MOD_RES
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<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
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<220>
<221> MOD_RES
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<221> MOD_RES
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<221> MOD_RES
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<220>
<221> MOD_RES
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<223> Beta-Ala
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(14)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
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<221> misc_feature
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20
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<221> source
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peptide"
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<221> MOD_RES
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<220>
<221> MOD_RES
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<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
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<220>
<221> MOD_RES
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<221> MOD_RES
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<221> MOD_RES
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<223> D-Arg
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<221> MOD_RES
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<221> MOD_RES
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<223> D-Arg
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<221> MOD_RES
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<213> Artificial Sequence
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<221> MOD_RES
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<220>
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<222> (5)..(5)
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<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
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<220>
<221> MOD_RES
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<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 6-aminohexanoic acid
<220>
<221> MOD_RES
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<220>
<221> MOD_RES
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<223> D-Arg
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<223> D-Arg
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
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peptide"
<220>
<221> MOD_RES
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<221> MOD_RES
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<221> MOD_RES
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<221> MOD_RES
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<221> MOD_RES
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<221> MOD_RES
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<221> MOD_RES
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<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
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<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
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<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> Beta-Ala
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(13)
<223> 6-aminohexanoic acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(14)
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<213> Artificial Sequence
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primer"
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer"
<400> 84
ttcttcagct tgtgtcatcc 20
<210> 85
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide"
<400> 85
ggccaaacct cggcttacct gaaat 25
<210> 86
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
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<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
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<221> MOD_RES
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<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
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<223> 6-aminohexanoic acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 6-aminohexanoic acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
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<220>
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Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Xaa Glu Gly
1 5 10 15
<210> 87
<211> 15
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
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<222> (3)..(3)
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<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> 6-aminohexanoic acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 6-aminohexanoic acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> 6-aminohexanoic acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> D-Arg
<220>
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<222> (13)..(13)
<223> 6-aminohexanoic acid
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(15)
<223> /note="Residues at these positions are non-consecutive and are
separated by a (PEG)2-PMO molecule"
<400> 87
Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Xaa Glu Gly
1 5 10 15
<210> 88
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
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<220>
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<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
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<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 6-aminohexanoic acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> 6-aminohexanoic acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(13)
<223> 6-aminohexanoic acid
<400> 88
Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Xaa Ala
1 5 10
<210> 89
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> /note="Residues at these positions are non-consecutive and are
separated by a PMO molecule"
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> 6-aminohexanoic acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> Beta-Ala
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> 6-aminohexanoic acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
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<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(13)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(14)
<223> 6-aminohexanoic acid
<400> 89
Glu Arg Xaa Arg Arg Ala Arg Arg Xaa Arg Arg Ala Arg Xaa Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 90
<211> 15
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<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
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<220>
<221> MOD_RES
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<223> 6-aminohexanoic acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
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<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
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<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 6-aminohexanoic acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> Beta-Ala
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(13)
<223> 6-aminohexanoic acid
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(15)
<223> /note="Residues at these positions are non-consecutive and are
separated by a PMO molecule"
<400> 90
Arg Xaa Arg Arg Ala Arg Arg Xaa Arg Arg Ala Arg Xaa Glu Gly
1 5 10 15
<210> 91
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> 6-aminohexanoic acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> Beta-Ala
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 6-aminohexanoic acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> Beta-Ala
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> D-Arg
<400> 91
Arg Xaa Arg Arg Ala Arg Arg Xaa Arg Arg Ala Arg Phe Lys Glu Gly
1 5 10 15
<210> 92
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> 6-aminohexanoic acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> 6-aminohexanoic acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 6-aminohexanoic acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> 6-aminohexanoic acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(13)
<223> 6-aminohexanoic acid
<400> 92
Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Xaa Ala
1 5 10
<210> 93
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> 6-aminohexanoic acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> 6-aminohexanoic acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 6-aminohexanoic acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> 6-aminohexanoic acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(13)
<223> 6-aminohexanoic acid
<400> 93
Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Xaa Glu Gly
1 5 10 15
<210> 94
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> 6-aminohexanoic acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> 6-aminohexanoic acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 6-aminohexanoic acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> D-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> 6-aminohexanoic acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> D-Arg
<400> 94
Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Phe Lys Glu Gly
1 5 10 15
<210> 95
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 95
Phe Ser Gln Gly
1
<210> 96
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Any amino acid
<220>
<221> VARIANT
<222> (3)..(3)
<223> /replace="Asp" or "Lys" or "Ser" or "Thr"
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> Beta-Ala
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(4)
<223> /note="Variant residues given in the sequence have no
preference with respect to those in the annotations
for variant positions"
<400> 96
Phe Xaa Glu Ala
1
Claims (2)
15개 내지 30개의 화학식 I, 화학식 II, 화학식 III, 화학식 IV, 화학식 V 또는 화학식 VI의 서브유닛 (subunit)을 포함하는 2개 이상의 안티센스 올리고뉴클레오티드 (antisense oligonucleotide; AON) 화합물을 포함하며,
여기서, B는 C, G, A 또는 T로부터 선택되는 자연 발생 퓨린 또는 피리미딘 뉴클레오티드 염기이고,
상기 2개 이상의 AON 화합물은 표적 프리 (pre)-mRNA 또는 mRNA의 염기의 75% 이상과 상보성인 뉴클레오티드 염기 서열을 가지며,
상기 2개 이상의 AON 화합물은 B가 G인 0 내지 3개의 반복 서브유닛을 갖고,
상기 2개 이상의 AON 화합물은 B가 C 또는 G인 60% 미만의 상기 서브유닛을 가지며,
상기 2개 이상의 AON 화합물은 비-자가 상보성 서열을 갖고,
상기 2개 이상의 AON 화합물은 다중양이온성 펩티드에 콘쥬게이션된 (conjugated), 펩티드 콘쥬게이션된 AON 화합물.
여기서, B는 C, G, A 또는 T로부터 선택되는 자연 발생 퓨린 또는 피리미딘 뉴클레오티드 염기이고,
상기 2개 이상의 AON 화합물은 표적 프리 (pre)-mRNA 또는 mRNA의 염기의 75% 이상과 상보성인 뉴클레오티드 염기 서열을 가지며,
상기 2개 이상의 AON 화합물은 B가 G인 0 내지 3개의 반복 서브유닛을 갖고,
상기 2개 이상의 AON 화합물은 B가 C 또는 G인 60% 미만의 상기 서브유닛을 가지며,
상기 2개 이상의 AON 화합물은 비-자가 상보성 서열을 갖고,
상기 2개 이상의 AON 화합물은 다중양이온성 펩티드에 콘쥬게이션된 (conjugated), 펩티드 콘쥬게이션된 AON 화합물.
15개 내지 30개의 하기 화학식 I의 서브유닛을 포함하는 2개 이상의 포스포로디아미데이트 모르폴리노 화합물을 포함하는, 펩티드 콘쥬게이션된 포스포로디아미데이트 모르폴리노 화합물:
[화학식 I]
(여기서,
R은 알킬 기이며, B는 C, G, A 또는 T로부터 선택되는 자연 발생 퓨린 또는 피리미딘 뉴클레오티드 염기이고;
상기 2개 이상의 포스포로디아미데이트 모르폴리노 화합물은 표적 프리-mRNA 또는 mRNA의 8개 이상의 연접 염기와 상보성인 뉴클레오티드 염기 서열을 가지며;
상기 2개 이상의 포스포로디아미데이트 모르폴리노 화합물은 B가 G인 0 내지 3개의 반복 서브유닛을 갖고;
상기 2개 이상의 포스포로디아미데이트 모르폴리노 화합물은 B가 C 또는 G인 60% 미만의 상기 서브유닛을 가지며;
상기 2개 이상의 포스포로디아미데이트 모르폴리노 화합물은 비-자가 상보성 서열을 갖고;
상기 2개 이상의 포스포로디아미데이트 모르폴리노 화합물은 다중양이온성 펩티드에 콘쥬게이션됨).
[화학식 I]
(여기서,
R은 알킬 기이며, B는 C, G, A 또는 T로부터 선택되는 자연 발생 퓨린 또는 피리미딘 뉴클레오티드 염기이고;
상기 2개 이상의 포스포로디아미데이트 모르폴리노 화합물은 표적 프리-mRNA 또는 mRNA의 8개 이상의 연접 염기와 상보성인 뉴클레오티드 염기 서열을 가지며;
상기 2개 이상의 포스포로디아미데이트 모르폴리노 화합물은 B가 G인 0 내지 3개의 반복 서브유닛을 갖고;
상기 2개 이상의 포스포로디아미데이트 모르폴리노 화합물은 B가 C 또는 G인 60% 미만의 상기 서브유닛을 가지며;
상기 2개 이상의 포스포로디아미데이트 모르폴리노 화합물은 비-자가 상보성 서열을 갖고;
상기 2개 이상의 포스포로디아미데이트 모르폴리노 화합물은 다중양이온성 펩티드에 콘쥬게이션됨).
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