ES2303636T3 - Metodo para la inhibicion selectiva del gen humano n-myc a traves de acidos nucleicos peptidicos (pna) en tumores que expresan n-myc a traves de proteinas pna sentido y antisentido. - Google Patents

Metodo para la inhibicion selectiva del gen humano n-myc a traves de acidos nucleicos peptidicos (pna) en tumores que expresan n-myc a traves de proteinas pna sentido y antisentido. Download PDF

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Roberto Corradini
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Abstract

Ácido nucléico peptídico (PNA) que comprende de 12 a 24 bases nucleótidas, dicho ácido nucléico peptídico siendo complementario al filamento antisentido del gen N-myc humano.

Description

Método para la inhibición selectiva del gen humano N-MYC a través de ácidos nucléicos peptídicos (PNA) en tumores que expresan N-MYC a través de proteínas PNA sentido y antisentido.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a ácidos nucléicos peptídicos (PNA, del inglés Peptide-Nucleic Acid) sentido y antisentido. La presente invención además se refiere al uso de dichos PNAs para preparar drogas para el tratamiento de tumores.
Técnica conocida
Como se sabe, la estrategia antisentido es un método útil para tratar enfermedades genéticas o provocadas por virus.
De acuerdo con la estrategia antisentido, una porción de RNA complementaria a una región de RNA transcrito de un gen puede bloquear la expresión de RNA transcrito creando un enlace entre el DNA complementario y el RNA trascrito, de manera de impedir la traducción de RNA trascrito.
En otros términos, las secuencias cortas de DNA que comprenden 15-25 bases de longitud son sintetizadas en forma complementaria y son combinadas con porciones de mRNAs específicos de virus o de origen nocivo que se hallan en células tumorales.
Las porciones complementarias generadas de esta manera pueden bloquear directamente la traducción.
Además, es conocido el empleo de la estrategia antisentido para preparar drogas que se emplean en la terapia genética humana.
Es conocido el empleo de estructuras antisentido tales como, por ejemplo, oligonucleótidos.
En un estudio llevado a cabo por A. Rosolen y otros (Cancer Research 50, 6316-6322, 1º de Octubre de 1990), oligómeros sintéticos antisentido específicamente inhibieron la expresión del gen N-MYC en la línea celular de neuroepitelioma CHP100.
Sin embargo, en los últimos años se ha desarrollado el empleo de nuevas estructuras antisentido y antí-geno, como por ejemplo los ácidos nucléicos peptídicos (PNAs).
Otro tipo de estructura antisentido que se usó con buenos resultados es un oligonucleótido antisentido total/parcial-
mente fosforotiato contra la expresión de N-MYC mRNA humano en células de neuroblastoma (ref. U Galderisi y otros, Journal of Cellular Biochemistry 74: 31-37 (1999)).
Los ácidos nucléicos peptídicos (PNAs) comprenden análogos de los ácidos nucléicos con carga neutra que contienen una cadena seudopeptídica (backbone) en lugar de una común estructura deoxiribosa-fosfato.
Los ácidos nucléicos peptídicos (PNAs) son enzimáticamente más estables si se los compara con las estructuras antisentido oligonucleotídicas.
Los ácidos nucléicos peptídicos pueden enlazarse de manera complementaria con los filamentos de DNA/RNA, creando así una estructura híbrida PNA/DNA o PNA/RNA de doble hélice, que son termodinámicamente más estables que los homoduplexes.
Además, los ácidos nucléicos peptídicos se pueden sintetizar a través de técnicas de síntesis que se usan comúnmente para la síntesis de péptidos.
A la luz de las ventajas descritas arriba, los ácidos nucléicos peptídicos (PNAs) representan un enfoque alternativo para la terapia genética antisentido y son el sistema más ventajoso para la estrategia antigénica.
Asimismo, se ha demostrado que los ácidos nucléicos peptídicos son altamente específicos para secuencias diana y permiten inhibir la expresión de las proteínas.
Doyle y otros (ref. Biochemistry 2001, 40 53-64) experimentaron y examinaron los efectos de la inhibición de PNA antisentido en la expresión de luciferase en células de COS-7 a través de la región de codificación 5'-UTR y total de luciferase. También examinaron el efecto de bases no complementarias y el efecto de la longitud de PNA con respecto a sus propiedades inhibitorias.
Por lo tanto, los ácidos nucléicos peptídicos (PNAs) constituyen un enfoque terapéutico prometedor para el tratamiento de enfermedades génicas o provocadas por virus.
Sin embargo, los ácidos nucléicos peptídicos (PNAs) presentan una desventaja, por lo que se refiere a las estructuras oligonucleotídicas antisentido, es decir tienen una baja capacidad de pasar a través de las membrana celular.
Para superar dicho inconveniente, algunos investigadores han tratado de conjugar ácidos nucléicos peptídicos con moléculas específicas de manera de incrementar la eficacia de penetración de los ácidos nucléicos peptídicos a través de la membrana celular.
Los estudios han demostrado que el uso de varios conjugados de péptidos como transportadores: pAntennapedia (43-58) conjugado con un PNA 21-mero complementario a mRNA receptor de galanina tipo I conocido fue absorbido eficientemente por las células de Bowes (ref. M Pooga y otros, Nature Biotechnology, Volumen 16, Setiembre de 1998).
En otro estudio, se crearon secuencias conjugadas artificiales, basadas en la estructura de la tercera hélice del homeodominio de Antennapedia, y también fueron absorbidas por células, pero entraron sólo dentro del citoplasma y no del núcleo (ref. C. G. Simmons y otros, Bioorganic & medicinal Chemistry Letters, Vol. 7, N. 23, páginas 3001-3006, 1997).
Los experimentos con PNA 17-mero sintetizados como antisentido para oncogén C-MYC, que fue conjugado con variantes de un péptido NLS heptámero básico que previamente había demostrado actuar como intermediario de transferencia del T-antí-geno grande SV40 (SV40 = Simian Virus 40) a través de la membrana nuclear, demostró captación celular mediante las células Linfomas de Burkitt (que presentan una expresión translocada y excesiva del oncógeno C-MYC). Esto permitió una rápida regulación descendente de la expresión C-MYC (ref. G. Cutrona y otros, Nature Biotechnology, Volumen 18, Marzo de 2000).
Además, se sabe que aproximadamente el 25-30% de los neuroblastomas no tratados mostraron una amplificación/sobreexpresión del proto-oncógeno N-myc asociado a una etapa avanzada de la enfermedad, rápida progresión y pronóstico adverso.
Un neuroblastoma es un sarcoma originado por el sistema nervioso periférico y se compone de neuroblastos (células embrionarias que se transformarán en células nerviosas).
El neuroblastoma afecta a niños de hasta 10 años de edad y provoca metástasis craneal y hepático.
La expresión N-myc en ratones transgénicos da como resultado el desarrollo de neuroblastomas.
La inhibición antisentido de la expresión N-myc in vitro reduce la proliferación de neuroblastoma y promueve la diferenciación de las células tumorales de neuroblastoma.
Hasta hoy la inhibición ha sido acompañada tanto por estructuras de oligonucleótidos antisentido contra N-myc mRNA como por la expresión de portadores adecuados para generar RNA antisentido N-myc.
De todos modos, los oligonucleótidos antisentido tienen la desventaja que consiste en su rápida degradación debido a las nucleasas.
Por lo tanto, la identificación de inhibidores selectivos de N-MYC (proteína) podría tener una alta relevancia para el desarrollo de agentes terapéuticos específicos con una menor toxicidad y una mayor eficacia para el tratamiento de neuroblastomas con expresión N-myc.
Como consecuencia de lo anterior, existe la necesidad de secuencias PNA que puedan inhibir o eliminar la síntesis de la proteína N-MYC producida en tumores que expresan dicha proteína.
En particular, existe la necesidad de secuencias PNA, de ser necesario conjugables, a usar en estrategia antisentido y antigénica para inhibir o eliminar la síntesis de la proteína N-MYC.
Lichun y otros (Peptides 23 (2002) 1557-1565) han desarrollado una serie de construcciones que son antisentido para el oncogén N-MYC. Las mismas presentaron una mejorada citotoxicidad hacia células IMR32 del neuroblastoma humano, pero fueron limitadas por su método de reparto: los PNA fueron conjugados a análogos de somatostatina y fueron efectivos sólo con células que expresaban simultáneamente receptores de somatostatina y oncogén
N-MYC.
En particular, existe la necesidad de secuencias PNA antisentido y secuencias PNA antigénicas a usar para preparar drogas altamente específicas y efectivas (drogas antisentido y antigénicas) para el tratamiento de tumores.
En particular, existe la necesidad de ácidos nucléicos peptídicos seleccionados que se puedan enlazar con mRNA mensajero.
\newpage
Objetivos de la invención
Un objetivo de la presente invención es el de proyectar y seleccionar secuencias de PNA que puedan pasar a través de la membrana celular.
Otro objetivo de la presente invención es el de proyectar y seleccionar secuencias PNA a usar en la estrategia antisentido.
Otro objetivo de la presente invención es el de proyectar y seleccionar secuencias de PNA a usar en la estrategia antigénica.
Otro objetivo de la presente invención es el de proyectar y seleccionar secuencias de PNA para la inhibición selectiva de la proteína N-MYC, por ejemplo en células de neuroblastoma humano.
Otro objetivo de la presente invención es el de proyectar y seleccionar secuencias de PNA altamente específicas y efectivas para preparar drogas antisentido y antigénicas a usar para tratar enfermedades genéticas.
Esos y otros objetivos, como se pondrá de manifiesto a partir de la descripción detallada que sigue, han sido logrados por el Solicitante, quien propone una estrategia antisentido y una estrategia antigénica basadas en el uso de ácidos nucléicos peptídicos (PNAs) específicos para la inhibición de la síntesis de la proteína N-MYC en tumores que expresan dicha proteína, en particular en células de neuroblastoma humano.
Descripción de la invención
Por consiguiente, un primer objetivo de la presente invención es el de secuencias de PNA que presenten las características expresadas en la anexa reivindicación independiente.
Otro objetivo de la presente invención consiste en un método para preparar secuencias de PNA que presenten las características de las anexas reivindicaciones independientes.
Otro objetivo de la presente invención consiste en emplear dichas secuencias de PNA para preparar composición farmacéutica para tratar tumores, cuyas características están enumeradas en la anexa reivindicación independiente.
Otras realizaciones preferidas están listadas en las anexas reivindicaciones dependientes.
En una realización preferida, el Solicitante emplea secuencias de PNA para la inhibición selectiva de la proteína N-MYC en células de neuroblastoma humano.
Para demostrar la eficacia de los ácidos nucléicos peptídicos seleccionados por la parte Solicitante, esta última ha llevado a cabo pruebas experimentales seleccionando cuatro líneas celulares de neuroblastoma: GI-LI-N, IMR-32 donde el gen N-myc está amplificado y sobreexpresado; y GI-CA-N, GI-ME-N donde el gen N-myc no está amplificado y no está expresado.
Sorprendentemente, la parte Solicitante ha hallado que los ácidos nucléicos peptídicos antisentido seleccionados por la misma parte Solicitante pueden pasar a través de la membrana celular sin usar ningún transportador.
Además, la parte Solicitante sorprendentemente ha hallado que el efecto inhibidor, debido a los PNAs sentido y antí-geno, en la síntesis de la proteína N-MYC es altamente selectivo y específico y tiene un efecto antiproliferante.
Asimismo, la detención del crecimiento de las células GI-LI-N de neuroblastoma humano con gen N-myc amplificado, después del uso de PNAs antinsentido, es seguida directamente por diferenciación celular o apoptosis (muerte celular programada).
De manera ventajosa, el ácido nucléico peptídico (PNA) comprende de 12 a 24 bases de nucleótidos. Dicho ácido nucléico peptídico es complementario al filamento antisentido del gen N-myc humano.
Los PNAs preferidos según están descritos abajo y publicados a título ejemplificador a continuación, no deben ser vistos como una restricción de la presente invención. En efecto, también se pueden realizar otros tipos de PNA, modificando adecuadamente su estructura, de manera de mejorar su eficacia y convertirlos en más específicos y adecuados para varias necesidades terapéuticas. Por lo tanto, también esas posibles variantes caen dentro del marco y de los objetivos de la presente invención.
En una primera realización, el ácido nucléico peptídico es complementario al filamento antisentido del gen N-myc humano y recibe la denominación de PNA sentido.
En una segunda realización la parte Solicitante ha proyectado un ácido nucléico peptídico (PNA) antisentido (bp 135-150: 5'-TCCACCCAGCGCGTCC-3', número de acceso al banco de genes M13241) que es complementario sólo a una única secuencia en la región 5'-UTR del gen N-myc de manera de inhibir un ataque con el ribosoma.
Para evaluar hasta que punto es específica la actividad del PNA antisentido, se ha proyectado un PNA mutado que contiene la sustitución de tres bases (5'-CCCACTCAGCGCGCCC-3').
El PNA sentido puede ser conjugado con un portador que puede pasar a través de la membrana nuclear de células diana, es decir de células tumorales que expresan el gen N-myc.
Preferentemente, dicho portador es conjugado en la posición 3' con la secuencia de PNA.
Según una característica preferida de la invención, dicho portador se compone de adecuadas secuencias peptídicas que se derivan de apropiadas proteínas.
Dichas proteínas son de varios orígenes; por ejemplo, pueden derivar de diferentes tipos de virus.
A título puramente ejemplificador y no limitativo, dichas proteínas preferentemente pueden ser seleccionadas entre:
- señal de localización nuclear (NLS = Nuclear Localization Signal), proveniente del virus SV40: el portador se compone de un secuencia peptídica PKKKRKV;
- Penetratina, proveniente de antennapedia; el portador se compone de una secuencia peptídica RQIKIWFQNRRM
KWKK;
- Transportana: el portador se compone de una secuencia peptídica GWTLNSAGYLLGKINLAALAKKIL;
- Penetratina retro-inversa: el portador se compone de una secuencia peptídica (D)-KKWKMRRNQFWVKVQR;
- Proteína TAT, proveniente de virus VIH: el portador se compone de una secuencia peptídica GRKKRRQRRRPPQ;
- Proteína TAT, proveniente del virus VIH: el portador se compone de una secuencia peptídica YGRKKRRQRRR.
A continuación se indican, a título ejemplificador, otras secuencias peptídicas que se pueden seleccionar para emplear preferentemente como portadores:
- MSVLTPLLLGRLTGSARRLPVPRAKIHSL;
- KFFKFFKFFK;
- KKKK.
La configuración de los aminoácidos que constituyen dichas secuencias peptídicas puede ser L o DL.
Según otra característica preferida de la invención, el PNA es conjugado con portadores seleccionados entre péptidos que comprenden aminoácidos con configuración D o L, por lo cual dichos péptidos se enlazan directamente con el PNA a través de un enlace covalente estable o a través de un enlace lábil de bisulfuro, que luego puede ser abierto mediante reducción.
Son muy preferidos los péptidos que comprenden D-arginina.
Según una tercera característica preferida de la invención, el PNA es conjugado con portadores que tienen varias estructuras, por lo cual dichos portadores son enlazados directamente al PNA a través de un enlace covalente estable o a través de un enlace lábil de bisulfuro, que luego puede ser abierto mediante reducción.
Entre esos portadores son muy preferidos los ácidos retinoicos.
El PNA sentido conjugado con un portador presenta una actividad de PNA antí-geno. Entre los PNAs antí-genos, los que se enlazan con el filamento antisentido del gen N-myc se denominan PNAs antí-geno sentido.
Los PNAs antí-geno sentido han demostrado ser sumamente efectivos para con las células diana.
La parte Solicitante también ha proyectado una secuencia de PNA antí-geno sentido y una secuencia PNA antí-geno antisentido (bp antí-geno sentido: 1650-1655 5'-ATGCCGGGCATGATCT-3'; antí-geno antisentido 5'-AGAT
CATGCCCGGCAT-3' número de acceso al banco de genes M13241), que son complementarias a una secuencia del exón 2 de gen N-myc. Dichas secuencias han sido conjugadas en 3' con una señal de localización nuclear (NLS) que se deriva del virus SV40, de manera de ayudarla a pasar a través de la membrana nuclear. El portador se compone de una secuencia peptídica PKKKRKV.
En una realización preferida, los PNAs antí-genos sentido o antí-genos antisentido según la presente invención se emplean para preparar composiciones farmacéuticas.
A continuación, sólo a título ejemplificador, se describe un método de síntesis de ácidos nucléicos peptídicos (PNAs) según la presente invención en escala micromolar 10, purificación y caracterización:
- 50 mg de resina de poliestireno funcionalizada con grupos de metilbencidrilamina (MBHA-PS) son tratados con diclorometano (DCM) por una hora de manera de hinchar la misma resina. Luego la resina se lava con 5% de diisopropiletilamina (DIPEA) en dimetilformamida (DFM), DCM, nuevamente 5% de DIPEA en DFM y N-metilpirrolidona (NMP). Se prepara por separado una solución que contiene 0,01 milimoles del primer monómero C-terminal de PNA N-Boc protegido (disponible en el mercado) en 125 mililitros de NMP y una solución que contiene 0,0095 milimoles de benzotriazoliluronio hexafluorofosfato (HBTU) en 125 microlitros de NMP, para luego mezclar las dos soluciones. Se agregan 0,02 milimoles de DIPEA y se deja activar el conjunto por un período de tiempo de 2 minutos, después de lo cual la solución que contiene el monómero activado se la pone en contacto con la resina. Se deja que reaccione por 1 hora, después de lo cual se lava la resina varias veces con NMP. Los sitios donde no hubo reacción se bloquean con una solución de anhídrido acético/piridina/DMF en una relación de 1:2:2 puesta en contacto con la resina por una hora. La ausencia de sitios reactivos se controla con un Kaiser test. En caso de Kaiser test no negativo, se vuelve a repetir el método de bloqueo. Después de lo cual se lava varias veces la resina con NMP, sucesivamente con 5% de DIPEA en DMF, luego con DMC. A tal punto, la resina quedó enlazada con el primer monómero C-terminal en una relación de 0,2 milimoles/gramo.
El método de alargue de la cadena consiste, para cada monómero a introducir, en un ciclo que incluye: desprotección de grupo Boc, preactivación y acoplamiento, de existir bloqueo de sitios que no reaccionaron (capping). Tales ciclos normalmente se llevan a cabo por medio de un sintetizador automático (Applied Biosystem ABI 433A). A continuación están listadas las soluciones utilizadas para las varias etapas. Desprotección: ácido trifluoroacético (TFA)/m-cresol 95:5; preactivación y acoplamiento: 0,05 milimoles de monómero de PNA N-Boc protegido y 0,048 milimoles de HBTU disueltos en 500 microlitros de NMP y adicionados con 0,1 milimoles de DIPEA; capping: anhídrido acético:piridina:NMP 1:25:25. Los PNAs rodaminados han sido sintetizados usando en el penúltimo ciclo una molécula espaciadora (ácido Boc-aminoetoxietoxiacético) en lugar del monómero de PNA y en el último ciclo rodamina en lugar del monómero de PNA.
Los PNAs sintetizados de este modo han sido separados de la resina por medio de una solución de ácido trifluorometanosulfónico (TFMSA):TFA:m-cresol:tioanisol 2:6:1:1 y precipitados agregando éter etílico a la solución de la separación.
De este modo, los PNAs burdos así obtenidos han sido analizados a través de LC-MS (columna analítica C18 250x4,6 mm, elución por gradiente entre agua adicionada con 0,2% de ácido fórmico y una solución de agua:acetoni-
trilo 60:40 adicionada con 0,2% de ácido fórmico, caudal 1 ml/min. Detector UV a 260 nm y detector de masa en modalidad ionización positiva, intervalo 150-1500 m/z). La purificación ha sido llevada a cabo usando un sistema que se asemeja al analítico, pero usando una columna semipreparativa (250x10 mm). La identidad del compuesto puro ha sido confirmada siempre mediante espectrometría de masa. Rendimiento típico después de la purificación: 30%. Pureza típica después de la purificación: 90-95%.
Para evaluar la habilidad de los PNAs sentido y de los PNAs antí-genos para entrar dentro de células de neuroblastoma humano y para analizar la posterior localización intracelular, la parte Solicitante ha usado cuatro líneas celulares GI-LI-N e IMR-32, GI-CA-N y GI-ME-N y las ha tratado por un lapso de tiempo comprendido entre 30 minutos y 24 horas con 20 \muM de PNA antisentido o sentido conjugado con rodamina en 5'. Luego, los PNAs antí-genos fueron conjugados con NLS en 3'.
La imagen del microscopio fluorescente demuestra que la fluorescencia intracitoplasmática para el PNA antisentido 5'-UTR (en las líneas celulares GI-LI-N y GI-CA-N) y la fluorescencia intranuclear para PNAs antí-genos (en las líneas celulares GI-LI-N y GI-ME-N) pueden ser medidas ya 30 minutos después del tratamiento de las células con PNA. La máxima intensidad se logra después de 6 horas, después de lo cual el nivel permanece constante por 24 horas.
Se observaron altos valores intracitoplasmáticos de PNA antisentido, mientras que para los PNAs antí-genos se observaron altos valores intranucleares.
Las células no tratadas mostraron simplemente una fluorescencia intracelular de fondo después de seis horas.
Para evaluar la eficacia y especificidad de los ácidos nucléicos peptídicos seleccionados por la parte Solicitante, esta última ha usado las cuatro líneas celulares descritas arriba.
En las pruebas triples empleando placas con 24 tubitos, se han introducido 1,0 x 10^{5} células dentro de los primeros tubitos con 0,5 ml de RPMI1640 con el 10% de FBS y 2 mM de L-butanina.
Las células han sido encubadas por 24 horas de manera de permitirles adherirse a la base de los tubitos.
Luego, para evaluar la óptima concentración para la inhibición del crecimiento celular, se ha adicionado ácido nucléico peptídico a las células GI-LI-N con concentraciones de 10, 20, 40 y 60 \mum para PNA antisentido 5'-UTR, mientras que para los PNAs antí-geno sentido y antisentido con concentraciones de 1, 2, 5, 10 y 20 \muM en las células GI-LI-N e IMR-32.
Para evaluar la especificidad y selectividad del efecto de los ácidos nucléicos peptídicos sobre la proteína N-MYC, las células GI-LI-N han sido tratadas con una variante del ácido nucléico peptídico antisentido 5'-UTR con la incorporación de tres sitios de mutación, con una concentración de 20 \muM (concentración óptima seleccionada para tal PNA), mientras que las células GI-CA-N (sin amplificación alguna del gen N-myc) han sido tratadas con PNA antisentido 5'-UTR con una concentración de 20 \muM.
Para evaluar la especificidad de los PNAs antí-geno sentido y antisentido, se han tratado GI-ME-N y GI-CA-N (donde el gen N-myc no está amplificado y no está expresado) con PNA antí-geno sentido y antisentido con una concentración de 10 \muM (concentración óptima seleccionada para PNA antí-geno sentido).
Luego, para evaluar los efectos de los tratamientos, las células han sido recolectadas y contadas después de 24, 48 y 72 horas del tratamiento.
El cómputo y la vitalidad de las células han sido determinados usando el método de exclusión colorimétrico (tryphan blue dye).
El tratamiento con 20 \muM de PNA antisentido en células GI-LI-N con expresión de gen N-myc amplificada, muestra una alta inhibición del crecimiento celular. El máximo efecto inhibitorio es del 70% y se obtiene 48 horas después del tratamiento (figura 1).
Por el contrario, las células de neuroblastoma GI-CA-N con expresión del gen N-myc amplificado y que no expresan N-myc, no mostraron ningún efecto inhibitorio en las pruebas llevadas a cabo bajo las mismas condiciones (figura 1).
Las pruebas de proliferación sobre las células GI-LI-N usando un PNA antisentido que contiene una secuencia alterada por la introducción de tres sitios de mutación, no han mostrado ningún efecto inhibitorio (figura 1). Ello demuestra la acción selectiva y específica del PNA antisentido para la secuencia 5'-UTR del trascrito N-myc.
Se evaluó la producción de N-MYC (proteína) usando Western Blotting en la línea celular GI-LI-N después de 24, 48 y 72 horas del tratamiento con 20 \muM de PNA antisentido. Se ha encontrado una reducción evidente del nivel de proteína después de 24 horas. Dicha reducción disminuye después de 72 horas.
Un análisis de flujo citométrico sobre las células GI-LI-N 36 horas después del tratamiento con 20 \muM de PNA antisentido, demuestra que dicho PNA induce una acumulación celular en G_{0}/G_{1} del 34% al 57% y disminuye en G_{2} y en la fase S del 13% al 6% y del 53% al 37%, respectivamente.
Además, el número de células en la fase sub-G_{1} con un contenido de DNA hipodiploico (número menor de cromosomas que el DNA diploide, es decir 2n) aumenta del 3 al 22%.
Para evaluar la diferenciación de las células GI-LI-N hacia las células neuronales, dicha línea celular ha sido tratada con 20 \muM de PNA antisentido, y por medio del análisis microscópico se han detectado cambios morfológicos.
La evaluación microscópica ha sido realizada 36 y 48 horas después del crecimiento de las células GI-LI-N en presencia o ausencia de los 20 \muM de PNA antisentido.
Después de 36 horas, las células tratadas tenían una distribución menos uniforme que las células testigo, y después de 48 horas tendían a formar pequeños agregados celulares.
No se ha hallado ningún efecto de inhibición de crecimiento para las células GI-CA-N mientras que, por el contrario, dichos efectos se han encontrado en pruebas realizadas sobre células GI-LI-N.
De manera ventajosa, los PNAs según la presente invención muestran un alto grado de selectividad para el objetivo designado en la secuencia 5'-UTR del N-myc.
Como ulterior confirmación, no se ha observado ningún efecto de inhibición en la vitalidad de las células, en el ciclo de las células y en la cantidad de proteínas N-MYC incluso después del tratamiento con 10 \muM de PNA antisentido mutado. Esto corrobora la especificidad del efecto del PNA antisentido.
PNA antí-geno: el tratamiento con 10 \muM de PNA antí-geno sentido en células GI-LI-N e IMR-32 con expresión del gen N-myc amplificado, provoca una alta inhibición del crecimiento celular.
De hecho, el efecto máximo de inhibición es del 90% en las células GI-LI-N y del 80% en las células IMR-32 y se logra 48 horas después del tratamiento (figura 2; C(a) y D(b)).
Por el contrario, las células de neuroblastoma GI-ME-N y GI-CA-N con gen N-myc no amplificado y no expresado, no mostraron ningún efecto de inhibición en las pruebas realizadas bajo las mismas condiciones (figura 2; E(c)).
\newpage
Las pruebas de proliferación en las células GI-LI-N e IMR-32 usando 10 \muM de PNA antí-geno antisentido no han demostrado ningún efecto de inhibición (figura 2; C(x) y D(y)). Esto demuestra que la acción del PNA antí-geno sentido es selectiva y específica para el filamento antisentido del gen N-myc, y que probablemente la acción de inhibición de trascripción se despliega a través de la detención de la polimerasa de RNA, que usa como matriz su propio filamento antisentido.
La producción del trascrito N-myc fue evaluada antes y después de 48 horas del tratamiento con 10 \muM de PNA antí-geno sentido mediante amplificación en PCR del cDNA obtenido a partir de 250 ng de mRNA de las células GI-LI-N. Se utilizaron los siguientes primers: sentido CGACCACAAGGCCCTCAGT (Exón 2, bp 2366); antisentido TGACCACGTCGATTTCTTCCT (Exón 3, bp 5095) (banco de genes M13241). La PCR (reacción en cadena por la polimerasa) ha sido llevada a cabo con 30 ciclos de reacción. Los resultados han demostrado que en las células GI-LI-N tratadas con PNA antí-geno sentido, el producto de PCR del trascrito N-myc no puede ser detectado, mientras que puede ser detectado fácilmente en células no tratadas.
De manera ventajosa, los PNAs antí-genos según la presente invención son altamente específicos para amplificación/sobreexpresión de N-myc.
La presencia de una amplificación/sobreexpresión del gen N-myc es la característica principal que distingue las líneas celulares GI-LI-N e IMR-32 con respecto a las líneas celulares GI-ME-N y GI-CA-N.
Para las células GI-ME-N y GI-CA-N no se ha encontrado ningún efecto de inhibición de crecimiento, mientras que dichos efectos se han encontrado en pruebas realizadas en células IMR-32.
De manera ventajosa, los PNAs antí-genos según la presente invención muestran un alto grado de selectividad para el objetivo designado en la secuencia del exón 2 de N-myc.
De hecho, el PNA antí-geno tiene un alto efecto inhibitorio, puesto que interfiere directamente con la polimerasa del PNA durante la trascripción en el filamento antisentido, mientras que el PNA antí-geno antisentido complementario posee un efecto mucho menor, probablemente debido sólo a la interferencia estérica con el complejo de las vitaminas de la trascripción.
En otras pruebas sobre PNA antí-geno sentido, la producción de proteína N-MYC se ha evaluado usando Western Blotting en la línea celular IMR-32 después de tres horas de tratamiento con 10 \muM de PNA antí-geno sentido. Después de tres horas del tratamiento con PNA antí-geno sentido se ha detectado una reducción del 50% del nivel de proteína.
Un análisis citofluorimétrico en células IMR-32 realizado 24 y 48 horas después del tratamiento con PNA antí-geno sentido con una concentración de 10 \muM, indujo una acumulación celular en G_{0}/G_{1} (del 39% al 53% después de 24 horas; del 31% al 53% después de 48 horas) y una disminución en G_{2}/M (del 17% al 6% después de 24 horas; del 25% al 9% después de 48 horas) y en la fase S (del 45 al 41% después de 24 horas; del 44% al 39% después de 48 horas).
Para evaluar hasta que punto es específica la actividad del PNA antí-geno sentido, se ha proyectado un PNA mutado que contiene la sustitución de tres bases (5'-GTGCCGAGCATGGTCT-3').
No se ha observado ningún efecto inhibitorio en la vitalidad de las células, en el ciclo de las células y en la cantidad de proteína N-MYC incluso después del tratamiento con una concentración de 10 \muM de PNA antí-geno mutado y bajo las mismas condiciones de prueba utilizadas para el PNA antí-geno sentido. Esto demuestra la especificidad del efecto del PNA antí-geno sentido.
El tratamiento con 10 \muM de PNA antí-geno sentido también se ha llevado a cabo con células HT29 (derivadas de carcinoma del colon) y con células HeLa (derivadas de carcinoma cervical) que presentan una expresión del gen N-myc.
El tratamiento produce una alta inhibición del crecimiento celular. De hecho, el máximo efecto inhibitorio es del 70% en las células HT29 48 horas después del tratamiento, y del 70% en las células HeLa 24 horas después del tratamiento.
Las pruebas de proliferación en las células HT29 y HeLa usando 10 \muM de PNA antí-geno sentido mutado no han demostrado ningún efecto inhibitorio. Esto demuestra que también en los carcinomas del colon y cervicales que presentan una expresión N-myc, hay un efecto inhibitorio si se usa PNA antí-geno sentido, y que tal acción es selectiva y específica para el filamento antisentido del gen N-myc.
Los PNAs según la presente invención son interesantes para el desarrollo de drogas a base de PNA para tratamientos específicos y neuroblastomas que presentan expresión de la proteína N-MYC.
Tales PNAs también se pueden emplear para otros tipos de tumores que presentan expresión de la proteína N-MYC tales como, por ejemplo, retinoblastoma, meduloblastoma, neuroblastoma, glioblastoma, astrocitoma o tumor de pequeñas células pulmonares, rabdomiosacroma, leucemia linfoblástica aguda tipo B.
<110> UNIVERSIDAD DE BOLONIA Y OTROS
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<120> MÉTODO PARA INHIBICIÓN SELECTIVA DEL GEN N-myc HUMANO EN TUMORES QUE EXPRESAN N-myc A TRAVÉS DE ÁCIDOS NUCLÉICOS PEPTÍDICOS (PNA) ANTISENTIDO Y ANTÍ-GENO
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<130> U216412WO9
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<140> PCT/IB2004/001297
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<141> 2004-04-29
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\vskip0.400000\baselineskip
<150> IT MI2003A000860
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<151> 2003-04-29
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<160> 16
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<170> PatentIn version 3.1
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<210> 1
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<211> 16
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> PNA antisentido que es complementario sólo a una secuencia en la región 5'-UTR del gen N-myc (página 6, renglones 17-20)
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<400> 1
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tccacccagc gcgtcc 
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<211> 16
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> PNA mutado, que contiene la sustitución de tres bases (página 6, renglones 23-25)
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<400> 2
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cccactcagc gcgccc 
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> secuencia PNA antí-geno sentido que es complementaria a una secuencia de exón 2 de gen N-myc (página 8, renglones 14-19)
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<400> 3
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atgccgggca tgatct 
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> PNA antí-geno antisentido que es complementaria a una secuencia de exón 2 de gen N-myc (página 8, renglones 14-19)
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<400> 4
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<210> 5
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> "primer" sentido (exón 2, bp 2366) (página 14, renglones 21-22)
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cgaccacaag gccctcagt 
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> "primer" antisentido (exón 2, bp 5096) (página 14, renglones 22-23)
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tgaccacgtc gatttcttcc t 
\hfill
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<210> 7
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<211> 16
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> secuencia de PNA mutado que contiene la sustitución de tres bases (página 15, renglones 29-31)
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<400> 7
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\hskip-.1em\dddseqskip
gtgccgagca tggtct 
\hfill
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<210> 8
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<211> 7
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<212> PRT
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<213> virus SV40
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<220>
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<221> misc_feature
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<223> proteína portadora de NLS (página 7, renglones 5-6)
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<400> 8
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\sa{Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val}
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<210> 9
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<211> 16
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<212> PRT
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<213> antennapedia
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<220>
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<221> misc_feature
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<223> proteína portadora de penetratina (página 7, renglones 7-8)
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<400> 9
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\sa{Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp}
\sac{Lys Lys}
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<210> 10
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<211> 24
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<212> PRT
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<213> Desconocido
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<220>
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<223> proteína portadora de transportana (página 7, renglones 9-10)
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<400> 10
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\sa{Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Ile}
\sac{Asn Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys Ile Leu}
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<210> 11
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<211> 16
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<212> PRT
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<213> Desconocido
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia (D) proteína portadora de penetratina retro-inversa (página 7, renglones 11-12)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
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\sa{Lys Lys Trp Lys Met Arg Arg Asn Gln Phe Trp Val Lys Val}
\sac{Gln Arg}
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<210> 12
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<211> 13
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<212> PRT
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<213> virus VIH
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<220>
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<221> misc_feature
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<223> proteína portadora de TAT (página 7, renglones 13-14)
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<400> 12
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\sa{Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln}
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<212> PRT
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<213> Virus VIH
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<220>
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<221> misc_feature
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<223> proteína portadora de TAT (página 7, renglones 15-16)
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<400> 13
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\sa{Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg}
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<210> 14
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<212> PRT
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<213> Desconocido
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<220>
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<223> secuencia peptídica portadora (página 7, renglones 17-20)
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<400> 14
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\sa{Met Ser Val Leu Thr Pro Leu Leu Leu Arg Gly Leu Thr Gly}
\sac{Ser Ala Arg Arg Leu Pro Val Pro Arg Ala Lys Ile His Ser}
\sac{Leu}
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<211> 10
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<212> PRT
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<213> Desconocido
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<220>
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<223> secuencia peptídica portadora (página 7, renglones 17-19, 21)
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\sa{Lys Phe Phe Lys Phe Phe Lys Phe Phe Lys}
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<210> 16
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<211> 4
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<212> PRT
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<213> Desconocido
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<220>
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<223> secuencia peptídica portadora (soporte 7, renglones 17-19, 22)
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<400> 16
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\sa{Lys Lys Lys Lys}
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Claims (13)

1. Ácido nucléico peptídico (PNA) que comprende de 12 a 24 bases nucleótidas, dicho ácido nucléico peptídico siendo complementario al filamento antisentido del gen N-myc humano.
2. Ácido nucléico peptídico según la reivindicación 1 conjugado con un portador que puede pasar a través de la membrana nuclear de células diana que presentan una expresión del gen N-myc.
3. Ácido nucléico peptídico conjugado según la reivindicación 2, donde dicho portador está conjugado en la posición 3' con la secuencia del ácido nucléico peptídico.
4. Ácido nucléico peptídico según una cualquiera de las reivindicaciones 2 y 3, donde dicho portador es elegido del grupo de secuencias peptídicas que se compone de:
i)
ID SEC N. 8 (PKKKRKV);
ii)
ID SEC N. 9 (RQIKIWFQNRRMKWKK);
iii)
ID SEC N. 10 (GWTLNSAGYZLGKINZAALAKKIL);
iv)
ID SEC N. 11 ((D)-KKWKMRRNQFWVKVQR);
v)
ID SEC N. 12 (GRKKRRQRRRPPQ);
vi)
ID SEC N. 13 (YGRKKRRQRRR);
vii)
ID SEC N. 14 (MSVLTPLLLRGLTGSARRLPVPRAKIHSL);
viii)
ID SEC N. 15 (KFFKFFKFFK); y
ix)
ID SEC N. 16 (KKKK).
5. Ácido nucléico peptídico según la reivindicación 4, donde el portador es ID SEC N. 8.
6. Ácido nucléico peptídico según una cualquiera de las precedentes reivindicaciones de 1 a 5, en el cual el PNA antí-geno sentido es ID SEC N. 3 (5'-ATGCCGGGCATGATCT-3').
7. Ácido nucléico peptídico (PNA) que consta de 12 a 24 bases nucleótidas que comprende la ID SEC N. 1 (5'-TCCACCCAGCGCGTCC-3').
8. Método para sintetizar ácidos nucléicos peptídicos (PNAs) según las reivindicaciones de 1 a 7, que comprende las siguientes etapas:
- adición de un primer monómero PNA C-terminal protegido N-Boc a una resina;
- prolongación de la cadena mediante desprotección, preactivación y acoplamiento del grupo Boc;
- separación de los PNAs así sintetizados de la resina mediante ácido trifluorometanosulfónico y precipitación de la solución con adición de éter etílico.
9. Composición farmacéutica que comprende un ácido nucléico peptídico (PNA) según al menos una de las reivindicaciones de 1 a 7.
10. Empleo de un ácido nucléico peptídico (PNA) según las reivindicaciones de 1 a 7, para preparar una composición farmacéutica para tratar tumores.
11. Empleo según la reivindicación 10, donde el tumor está asociado a la expresión de la proteína N-MYC/
n-myc.
12. Empleo de un ácido nucléico peptídico (PNA) según la reivindicaciones de 1 a 6 para preparar una composición farmacéutica para tratar tumores tales como por ejemplo neuroblastoma, retinoblastoma, meduloblastoma, glioblastoma, astrocitoma o tumor de pequeñas células pulmonares, rabdomiosarcoma, leucemias agudas linfoblásticas del tipo B.
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13. Empleo de un ácido nucléico peptídico (PNA) según la reivindicación 7, para preparar una composición farmacéutica para tratar tumores tales como por ejemplo neuroblastoma, retinoblatoma, meduloblastoma, glioblastoma, astrocitoma o tumor de pequeñas células pulmonares, leucemias agudas linfoblásticas del tipo B.
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