JP2023503635A - Ｒｎａ分子を合成する方法 - Google Patents

Ｒｎａ分子を合成する方法 Download PDF

Info

Publication number
JP2023503635A
JP2023503635A JP2022531065A JP2022531065A JP2023503635A JP 2023503635 A JP2023503635 A JP 2023503635A JP 2022531065 A JP2022531065 A JP 2022531065A JP 2022531065 A JP2022531065 A JP 2022531065A JP 2023503635 A JP2023503635 A JP 2023503635A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
rna
rna fragment
fragment
sequence
ligation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2022531065A
Other languages
English (en)
Other versions
JPWO2021108647A5 (ja
Inventor
ジョセフ カファーティ，ブライアン
スコット マンザー，ジョン
ジャヤラマン，ムトゥサミー
シュブラ ダス，ラジャト
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
CRISPR Therapeutics AG
Bayer Healthcare LLC
Original Assignee
CRISPR Therapeutics AG
Bayer Healthcare LLC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by CRISPR Therapeutics AG, Bayer Healthcare LLC filed Critical CRISPR Therapeutics AG
Publication of JP2023503635A publication Critical patent/JP2023503635A/ja
Publication of JPWO2021108647A5 publication Critical patent/JPWO2021108647A5/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/30—Nucleotides
    • C12P19/34—Polynucleotides, e.g. nucleic acids, oligoribonucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50—Physical structure
    • C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed
    • C12N2310/531—Stem-loop; Hairpin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2330/00—Production
    • C12N2330/30—Production chemically synthesised
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/93—Ligases (6)

Abstract

本開示は、ＲＮＡフラグメントのスプリント媒介ライゲーションによって中程度の長さのＲＮＡを合成する方法に関する。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年１１月２７日に出願された米国仮特許出願第６２／９４１，１７４号の利益を主張する。その全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
本開示は、一般に、核酸の合成およびガイドＲＮＡとしても知られるエンドヌクレアーゼに関連するＲＮＡ分子を合成するための方法を含む、分子生物学およびバイオテクノロジーの分野に関する。
ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドローム反復）－Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）システムのＲＮＡ誘導型、ＤＮＡ標的化原理を使用したＤＮＡのターゲティングは、当該技術分野で広く用いられる。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、複数のＣａｓタンパク質の複合体を利用する分類１システム（Ｉ型、ＩＩＩ型およびＩＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムなど）、単一のＣａｓタンパク質を利用する分類２システム（ＩＩ型、Ｖ型およびＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムなど）の２つの部類に分類することができる。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓベースのシステムはゲノム編集に使用されており、プログラム可能なＤＮＡターゲティングのために、カスタマイズ可能なガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）によって誘導されるＣａｓポリペプチドまたはそのバリアントを必要とする。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓベースのシステムのガイドＲＮＡは、典型的には、３０～１３０のヌクレオチドの長さの範囲である（Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（２０１３）ＲＮＡ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１０（５）：７２６－７３７）。
ｇＲＮＡの合成のための手法は、例えば、外因性プラスミドの細胞内転写またはホスホロアミダイト化学を使用する固相合成を含む。ｇＲＮＡの直接化学合成により、ＲＮＡの化学的安定性を高め、免疫原性を低下させ、オフターゲット効果（すなわち、望ましくない一でゲノムＤＮＡを切断する）の可能性を低減する化学修飾を組み込むことができる。ｇＲＮＡなどのいくつかの配列の化学合成の１つの制限は、所望の一本鎖ＲＮＡの長さであり、ｇＲＮＡの場合、典型的には約６０から１００ヌクレオチド（ｎｔ）である。例えば、使用されているホスホロアミダイト化学のカップリング効率が約０．９９Ｘ（Ｘはヌクレオチドの数である）の場合、約１００ヌクレオチドの長さのｇＲＮＡを合成する場合、全体の合成プロセスで約３０～４０％の全長生成物（ＦＬＰ）が得られると予想される。不完全なカップリング（トランケーション生成物）および脱保護から形成された残りの副生成物からＦＬＰを完全な分離することは、約１００ヌクレオチドの長さのＲＮＡ分子の場合、標準的な精製方法（例えば、クロマトグラフィー）によって達成することは現状では不可能である。これらの制限のために、ｇＲＮＡを合成するより効率的な方法を設計することが望ましい。
出願人は、ＲＮＡ、特に遺伝子編集で使用されるガイドＲＮＡなどの中程度の長さのＲＮＡ（ｍｌＲＮＡ）を合成する方法の改善を発見した。したがって、本開示は、２つ以上のＲＮＡフラグメントのスプリント媒介ライゲーションを使用してｍｌＲＮＡを合成する方法を提供する。いくつかの態様では、本開示は、２つのＲＮＡフラグメントまたは３つのＲＮＡフラグメントのスプリント媒介ライゲーションを使用してｍｌＲＮＡを合成する方法を提供する。そのような方法としては、例えば、５’リン酸部分を含む末端領域を含む第１のＲＮＡフラグメント、および３’ヒドロキシル基を含む末端領域を含む第２のＲＮＡフラグメントを提供することであって、第１のＲＮＡフラグメント、第２のＲＮＡフラグメント、またはその両方は、例えば、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼに結合することができる配列の少なくとも一部分を含む、提供することと、５’リン酸部分を含む末端領域で第１のＲＮＡフラグメントに相補的な第１の部分、および３’ヒドロキシル基を含む末端領域で第２のＲＮＡフラグメントに相補的な第２の部分を含むスプリントオリゴヌクレオチドを提供することと、第１のＲＮＡフラグメント、第２のＲＮＡフラグメント、およびスプリントオリゴヌクレオチドを一緒にハイブリダイズして複合体を形成することと、複合体内に存在するライゲーション部位でリガーゼを使用して第１および第２のＲＮＡフラグメントをライゲーションし、それによってｍｌＲＮＡまたはｍｌＲＮＡの一部分を合成することと、が挙げられる。
いくつかの態様では、この方法は、（ａ）３’ヒドロキシル基を含む末端領域を含む第１のＲＮＡフラグメントと、（ｂ）（ｉ）５’リン酸部分を含む末端領域、および（ｉｉ）３’ヒドロキシル基を含む末端領域を含む第２のＲＮＡフラグメントと、（ｃ）５’リン酸基を含む末端領域を含む第３のＲＮＡフラグメントと、（ｄ）（ｉ）第１のＲＮＡフラグメントの３’ヒドロキシル基を含む末端領域に相補的な第１の部分、および（ｉｉ）第２のＲＮＡフラグメントの５’リン酸部分を含む第１の末端領域に相補的な第２の部分を含む第１のスプリントオリゴヌクレオチドと、（ｅ）（ｉ）第２のＲＮＡフラグメントの３’ヒドロキシル基を含む第２の末端領域に相補的な第１の部分、および（ｉｉ）第３のＲＮＡフラグメントの５’リン酸部分を含む末端領域に相補的な第２の部分を含む第２のスプリントオリゴヌクレオチドと、（ｆ）リガーゼと、を提供することを含み、第１のＲＮＡフラグメント、第２のＲＮＡフラグメント、第３のＲＮＡフラグメント、第１のスプリントオリゴヌクレオチド、および第２のスプリントオリゴヌクレオチドが一緒にハイブリダイズして複合体を形成し、複合体は、第１のＲＮＡフラグメントの３’ヒドロキシル基および第２のＲＮＡフラグメントの５’リン酸基間の第１のライゲーション部位、ならびに第２のＲＮＡフラグメントの３’ヒドロキシル基および第３のＲＮＡフラグメントの５’リン酸基間の第２のライゲーション部位を含み、リガーゼは、第１のライゲーション部位での第１および第２のＲＮＡフラグメントと、第２のライゲーション部位での第２および第３のＲＮＡフラグメントとのライゲーションをもたらして、それによってｍｌＲＮＡまたはｍｌＲＮＡの一部分が合成される。いくつかの態様では、第１のＲＮＡフラグメント、第２のＲＮＡフラグメント、第３のＲＮＡフラグメント、またはそれらの組み合わせは、例えば、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）に結合する配列の少なくとも一部分を含む。いくつかの態様では、第１のＲＮＡフラグメント、第２のＲＮＡフラグメント、第３のＲＮＡフラグメント、またはそれらの組み合わせは、標的ＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ分子）中の標的配列を標的とするスペーサー配列を含む。
一態様では、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を合成する方法が本明細書に提供され、方法は、５’リン酸部分を含む末端領域を含む第１のＲＮＡフラグメント、および３’ヒドロキシル基を含む末端領域を含む第２のＲＮＡフラグメントを提供することであって、第１のＲＮＡフラグメント、第２のＲＮＡフラグメント、またはその両方は、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼに結合することができる配列の少なくとも一部分を含む、提供することと、５’リン酸部分を含む末端領域で第１のＲＮＡフラグメントに相補的な第１の部分、および３’ヒドロキシル基を含む末端領域で第２のＲＮＡフラグメントに相補的な第２の部分を含むスプリントオリゴヌクレオチドを提供することと、第１のＲＮＡフラグメント、第２のＲＮＡフラグメント、およびスプリントオリゴヌクレオチドを一緒にハイブリダイズして複合体を形成することと、ＲＮＡ複合体の間に存在するライゲーション部位でリガーゼを使用して第１および第２のＲＮＡフラグメントをライゲーションし、それによってｇＲＮＡを合成することと、を含む。いくつかの実施形態では、第１および第２のＲＮＡフラグメントの長さは、それぞれ１０～９０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、第２のＲＮＡフラグメントの長さは、４０ヌクレオチド以下である。いくつかの実施形態では、５’リン酸部分は、５’－リン酸または５’－ホスホロチオエートである。いくつかの実施形態では、リガーゼは、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼＩ、またはＴ４ ＲＮＡリガーゼＩＩである。いくつかの実施形態では、スプリントオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、スプリントオリゴヌクレオチドの長さは、２０～１００ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、スプリントオリゴヌクレオチドは、固体支持体に結合している。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの長さは、３０～１６０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、標的ＤＮＡ中の配列に相補的である配列を含む。いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡは、哺乳動物ＤＮＡである。いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡは、ヒトＤＮＡである。いくつかの実施形態では、ライゲーション部位は、合成されたｇＲＮＡのステムループ構造のテトラループ部分の部位に対応する。いくつかの実施形態では、ライゲーション部位は、合成されたｇＲＮＡのステムループ構造のヘリックス部分の部位に対応する。いくつかの実施形態では、第１のＲＮＡフラグメント、第２のＲＮＡフラグメント、またはその両方は、少なくとも１つの二次構造を含み、第１のＲＮＡフラグメント、第２のＲＮＡフラグメント、およびスプリントオリゴヌクレオチドをハイブリダイズすることが、スプリントオリゴヌクレオチドが、最も低い自由エネルギーを有する二次構造のものよりも低い自由エネルギーをもたらす。いくつかの実施形態では、方法は、３つ以上のＲＮＡフラグメントをライゲーションすることを含む。いくつかの実施形態では、第１および第２のＲＮＡフラグメントを提供することは、酵素的合成またはホスホロアミダイト化学を介して第１および第２のＲＮＡフラグメントを合成することを含む。いくつかの実施形態では、第２のＲＮＡフラグメントは、５’から３’または３’から５’の方向に合成される。いくつかの実施形態では、第１および第２のＲＮＡフラグメントを提供することは、合成後に第１および第２のフラグメントを精製することを含む。いくつかの実施形態では、スプリントオリゴヌクレオチドを提供することは、酵素的合成またはホスホロアミダイト化学を介してスプリントオリゴヌクレオチドを合成することを含む。いくつかの実施形態では、スプリントオリゴヌクレオチドを提供することは、合成後にスプリントオリゴヌクレオチドを精製することを含む。いくつかの実施形態では、精製することは、クロマトグラフィー法で精製することを含む。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィー法は、逆相ＨＰＬＣ、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、もしくはポリアクリルアミドゲル精製、またはそれらの任意の組み合わせである。いくつかの実施形態では、第１のＲＮＡフラグメント、第２のＲＮＡフラグメント、またはその両方は、ＲＮＡ骨格に少なくとも１つの修飾を含む。いくつかの実施形態では、修飾は、２’メトキシ（２’ＯＭｅ）、２’フッ素（２’フルオロ）、２’－Ｏ－メトキシ－エチル（ＭＯＥ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、アンロックド核酸（ＵＮＡ）、架橋核酸、２’デオキシ核酸（ＤＮＡ）、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第１のＲＮＡフラグメント、第２のＲＮＡフラグメント、またはその両方は、少なくとも１つの塩基修飾を含む。いくつかの実施形態では、塩基修飾は、２－アミノプリン、イノシン、チミン、２，６－ジアミノプリン、２－ピリミジノン、および５－メチルシトシンからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第１のＲＮＡフラグメント、第２のＲＮＡフラグメント、またはその両方は、少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含む。いくつかの実施形態では、ハイブリダイズすることは、溶液中でハイブリダイズすることを含む。いくつかの実施形態では、溶液中のスプリントオリゴヌクレオチドの濃度、第１のＲＮＡフラグメントの濃度、および第２のＲＮＡフラグメントの濃度は、ほぼ等しい。いくつかの実施形態では、第１および第２のＲＮＡフラグメントをライゲーションすることは、１５℃～４５℃で実施される。いくつかの実施形態では、第１および第２のＲＮＡフラグメントをライゲーションすることは、約３７℃で実施される。いくつかの実施形態では、第１および第２のＲＮＡフラグメントをライゲーションすることは、約０．１～約４８時間実施される。いくつかの実施形態では、第１および第２のＲＮＡフラグメントをライゲーションすることは、プロテアーゼまたはキレート剤を使用することをさらに含む。いくつかの実施形態では、キレート剤は、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、または両方の組み合わせである。いくつかの実施形態では、第１および第２のＲＮＡフラグメントをライゲーションすることは、１つ以上の混雑剤を使用することをさらに含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の混雑剤は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、フィコール（登録商標）、エチレングリコール、デキストラン、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、第１および第２のＲＮＡフラグメントをライゲーションすることは、少なくとも１０％の完了まで進行する。いくつかの実施形態では、第１および第２のＲＮＡフラグメントをライゲーションすることは、少なくとも９０％の完了まで進行する。いくつかの実施形態では、この方法は、合成後にｇＲＮＡを精製することをさらに含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡを精製することは、クロマトグラフィー法を使用して精製することを含む。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィー法は、逆相ＨＰＬＣ、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、もしくはポリアクリルアミドゲル精製、またはそれらの任意の組み合わせである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、低分子Ｃａｓヌクレアーゼまたは低分子ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１３、およびそれらのバリアントからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９（ＳｐｙＣａｓ９）またはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＳａＣａｓ９）である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９のバリアントであり、Ｃａｓ９のバリアントは、低分子Ｃａｓ９、不活性型Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）、およびＣａｓ９ニッカーゼからなる群から選択される。
別の態様では、本開示は、ｇＲＮＡを合成する方法を提供し、この方法は、（ａ）３’ヒドロキシル基を含む末端領域を含む第１のＲＮＡフラグメントと、（ｂ）５’リン酸部分を含む第１の末端領域、および３’ヒドロキシル基を含む第２の末端領域を含む第２のＲＮＡフラグメントと、（ｃ）５’リン酸部分を含む末端領域を含む第３のＲＮＡフラグメントと、（ｄ）（ｉ）第１のＲＮＡフラグメントの３’ヒドロキシル基を含む末端領域に相補的な第１の部分、および（ｉｉ）第２のＲＮＡフラグメントの５’リン酸部分を含む第１の末端領域に相補的な第２の部分を含む第１のスプリントオリゴヌクレオチドと、（ｅ）（ｉ）第２のＲＮＡフラグメントの３’ヒドロキシル基を含む第２の末端領域に相補的な第１の部分、および（ｉｉ）第３のＲＮＡフラグメントの５’リン酸部分を含む末端領域に相補的な第２の部分を含む第２のスプリントオリゴヌクレオチドと、（ｆ）リガーゼと、を提供することを含み、第１、第２、および第３のＲＮＡフラグメント、ならびに第１および第２のスプリントオリゴヌクレオチドをハイブリダイズすることが、第１のＲＮＡフラグメントの３’ヒドロキシル基および第２のＲＮＡフラグメントの５’リン酸基間に存在する第１のライゲーション部位、ならびに第２のＲＮＡフラグメントの３’ヒドロキシル基および第３のＲＮＡフラグメントの５’リン酸基間に存在する第２のライゲーション部位を有する複合体の形成をもたらし、リガーゼは、第１のライゲーション部位での第１および第２のＲＮＡフラグメントと、第２のライゲーション部位での第２および第３のＲＮＡフラグメントとのライゲーションをもたらして、それによってｇＲＮＡを合成する。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、５’から３’に、第１のホスホジエステル結合によって第２のＲＮＡフラグメントに連結した第１のＲＮＡフラグメント、および第２のホスホジエステル結合によって第３のＲＮＡフラグメントに連結した第２のＲＮＡフラグメントを含む。いくつかの実施形態では、第１のホスホジエステル結合は、第１のＲＮＡフラグメントの３’ヒドロキシル基と第２のＲＮＡフラグメントの５’リン酸基との間に形成され、第２のホスホジエステル結合は、第２のＲＮＡフラグメントの３’ヒドロキシル基と第３のＲＮＡフラグメントの５’リン酸基との間に形成される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、単一分子ｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、約３０～約１６０ヌクレオチドの長さ、または約３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、もしくは１６０ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、第１のライゲーション部位は、第１のステムループ構造の部位に対応し、第１のステムループ構造は、合成されたｇＲＮＡにおける最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列および最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列のハイブリダイゼーションによって形成される。いくつかの実施形態では、第１のステムループ構造の部位は、テトラループ部分またはヘリックス部分にある。いくつかの実施形態では、第２のライゲーション部位は、第２のステムループ構造の部位に対応する。いくつかの実施形態では、第２のステムループは、ｇＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ配列に存在する。いくつかの実施形態では、第２のステムループ構造の部位は、テトラループ部分またはヘリックス部分にある。
いくつかの態様では、本開示は、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼとともに使用するための単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を合成する方法を提供し、この方法は、第１のＲＮＡフラグメント、第２のＲＮＡフラグメント、第３のＲＮＡフラグメント、第１のスプリントオリゴヌクレオチド、および第２のスプリントオリゴヌクレオチドの間で形成された複合体、ならびにリガーゼを提供することを含み、（ａ）第１のＲＮＡフラグメントは、（ｉ）３’ヒドロキシル基を含む末端領域を含み、（ｂ）第２のＲＮＡフラグメントは、（ｉ）５’リン酸部分を含む第１の末端領域、および（ｉｉ）３’ヒドロキシル基を含む第２の末端領域を含み、（ｃ）第３のＲＮＡフラグメントは、（ｉ）５’リン酸部分を含む末端領域を含み、（ｄ）第１のスプリントオリゴヌクレオチドは、（ｉ）第１のＲＮＡフラグメントの３’ヒドロキシル基を含む末端領域に相補的な第１の部分、および（ｉｉ）第２のＲＮＡフラグメントの５’リン酸部分を含む第１の末端領域に相補的な第２の部分を含み、（ｅ）第２のスプリントオリゴヌクレオチドは、（ｉ）第２のＲＮＡフラグメントの３’ヒドロキシル基を含む第２の末端領域に相補的な第１の部分、および（ｉｉ）第３のＲＮＡフラグメントの５’リン酸を含む末端領域に相補的な第２の部分を含み、複合体は、（ａ）（ｉ）および（ｄ）（ｉ）、（ｂ）（ｉ）および（ｄ）（ｉｉ）、（ｂ）（ｉｉ）および（ｅ）（ｉ）、ならびに（ｃ）（ｉ）および（ｅ）（ｉｉ）のハイブリダイゼーションによって形成され、複合体は、第１のＲＮＡフラグメントの３’ヒドロキシル基および第２のＲＮＡフラグメントの５’リン酸基間に存在する第１のライゲーション部位、ならびに第２のＲＮＡフラグメントの３’ヒドロキシル基および第３のＲＮＡフラグメントの５’リン酸基間に存在する第２のライゲーション部位を有し、リガーゼは、第１のライゲーション部位でのライゲーションおよび第２のライゲーション部位でのライゲーションをもたらして、５’から３’に、スペーサー配列およびＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼに結合する不変配列であって、不変配列が、ｃｒＲＮＡ反復配列とｔｒａｃｒＲＮＡ逆反復配列との間に形成されたステムループを含む、不変配列、ならびに少なくとも１つのステムループを含む３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含むｓｇＲＮＡを形成し、それによって、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼとともに使用するためのｓｇＲＮＡを合成する。
前述のまたは関連する態様のいずれかでは、第１のライゲーション部位は、ｃｒＲＮＡ反復配列とｔｒａｃｒＲＮＡ逆反復配列との間に形成されたステムループ内の部位に対応する。いくつかの実施形態では、第１のライゲーション部位は、ステムループの５’ステム、ステムループのテトラループ、またはステムループの３’ステムの部位に対応する。いくつかの実施形態では、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、第１のステムループ、第２のステムループ、および第３のステムループを含む。いくつかの実施形態では、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、第１のステムループ、第２のステムループ、および第３のステムループからなる。いくつかの実施形態では、第２のライゲーション部位は、第１のステムループ、第２のステムループ、または第３のステムループの部位に対応する。いくつかの実施形態では、第２のライゲーション部位は、第２のステムループ内の部位に対応する。いくつかの実施形態では、部位は、第２のステムループの５’ステム内、第２のステムループのテトラループ内の部位、または第２のステムループの３’ステム内の部位にある。いくつかの実施形態では、第２のライゲーション部位は、第２のステムループの５’基部に隣接する部位（例えば、第２のステムループの５’基部から±１ｎｔ、±２ｎｔ、±３ｎｔ）または第２のステムループの３’基部に隣接する部位（例えば、第２のステムループの３’基部から±１ｎｔ、±２ｎｔ、±３ｎｔ）に対応する。いくつかの実施形態では、第１のＲＮＡフラグメントは、第１のライゲーション部位の５’であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のＲＮＡフラグメントは、第１のライゲーション部位と第２のライゲーション部位との間にあるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、第３のＲＮＡフラグメントは、第２のライゲーション部位に対して３’であるヌクレオチド配列を含む。
前述のまたは関連する態様のいずれかでは、（ａ）（ｉ）の末端領域は、第１のＲＮＡフラグメントの３’末端に位置する約１０～約３０ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、（ａ）（ｉ）の末端領域は、ｓｇＲＮＡのスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態では、（ａ）（ｉ）の末端領域は、ｓｇＲＮＡのスペーサー配列を含まない。いくつかの実施形態では、スペーサー配列の５’末端は、第１のＲＮＡフラグメントの５’末端と整列し、（ａ）（ｉ）の末端領域は、ｓｇＲＮＡのスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態では、（ａ）（ｉ）の末端領域は、第１のＲＮＡフラグメントの３’末端から延びて、スペーサー配列の３’末端の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ｎｔ上流を含む。いくつかの実施形態では、（ａ）（ｉ）の末端領域は、第１のＲＮＡフラグメントの３’末端から延びて、スペーサー配列の３’末端に直接隣接する。いくつかの実施形態では、（ｄ）（ｉ）の第１の部分は、（ａ）（ｉ）の末端領域に完全に相補的である。いくつかの実施形態では、（ｄ）（ｉ）の第１の部分は、（ａ）（ｉ）の末端領域に対して１、２、または３のミスマッチを有する。いくつかの実施形態では、（ｂ）（ｉ）の末端領域は、第２のＲＮＡフラグメントの５’末端に位置する約１０～約３０ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、（ｄ）（ｉｉ）の第２の部分は、（ｂ）（ｉ）の末端領域に完全に相補的である。いくつかの実施形態では、（ｄ）（ｉｉ）の第２の部分は、（ｄ）（ｉｉ）の末端領域に対して１、２、または３のミスマッチを有する。いくつかの実施形態では、（ｂ）（ｉｉ）の末端領域は、第２のＲＮＡフラグメントの３’末端に位置する約１０～約３０ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、（ｅ）（ｉ）の第１の部分は、（ｂ）（ｉｉ）の末端領域に完全に相補的である。いくつかの実施形態では、（ｅ）（ｉ）の第１の部分は、（ｂ）（ｉｉ）の末端領域に対して１、２、または３のミスマッチを有する。いくつかの実施形態では、（ｃ）（ｉ）の末端領域は、第３のＲＮＡフラグメントの５’末端に位置する約１０～約４０ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、（ｅ）（ｉｉ）の第２の部分は、（ｃ）（ｉ）の末端領域に完全に相補的である。いくつかの実施形態では、（ｅ）（ｉｉ）の第２の部分は、（ｃ）（ｉ）の末端領域に対して１、２、または３のミスマッチを有する。
前述のまたは関連する態様のいずれかでは、第１のＲＮＡフラグメント、第２のＲＮＡフラグメント、および第３のＲＮＡフラグメントは、それぞれ独立して、約１０～約９０ヌクレオチド、約１０～約６０ヌクレオチド、約１０～約５０ヌクレオチド、約１０～約４０ヌクレオチド、約２０～約４０ヌクレオチド、約３０～約４０のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、第１のスプリントオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドであり、第２のスプリントオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、第１のスプリントオリゴヌクレオチドおよび第２のスプリントオリゴヌクレオチドは、それぞれ独立して、約２０～約１００ヌクレオチド、約２０～約９０ヌクレオチド、約２０～約８０ヌクレオチド、約２０～約７０ヌクレオチド、約２０～約６０ヌクレオチド、約３０～約６０ヌクレオチド、または約３０～約５０ヌクレオチドの長さである。
前述のまたは関連する態様のいずれかでは、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、標的ＤＮＡの配列に相補的であるスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡは、哺乳動物ＤＮＡまたはヒトＤＮＡである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、低分子Ｃａｓヌクレアーゼまたは低分子ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１３、およびそれらのバリアントからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９（ＳｐｙＣａｓ９）またはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＳａＣａｓ９）である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９のバリアントであり、Ｃａｓ９のバリアントは、低分子Ｃａｓ９、不活性型Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）、およびＣａｓ９ニッカーゼからなる群から選択される。
前述のまたは関連する態様のいずれかでは、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、ＳｐｙＣａｓ９である。いくつかの実施形態では、不変配列は、配列番号１７のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、不変配列は、配列番号１７に対して最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチドの欠失、挿入、または置換を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のＲＮＡフラグメント、第２のＲＮＡフラグメント、および第３のＲＮＡフラグメントは、それぞれ、（ａ）（ｉ）Ｎ１５－３０ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧ（配列番号５６）（Ｎ１５－３０はスペーサー配列に対応する）、（ｉｉ）配列番号３、および（ｉｉｉ）配列番号４、（ｂ）（ｉ）Ｎ１５－３０ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡ（配列番号５７）（Ｎ１５－３０はスペーサー配列に対応する）、（ｉｉ）配列番号４０、および（ｉｉｉ）配列番号４２、（ｃ）（ｉ）Ｎ１５－３０ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧ（配列番号５６）（Ｎ１５－３０はスペーサー配列に対応する）、（ｉｉ）配列番号５８、および（ｉｉｉ）配列番号４２、または（ｄ）（ｉ）Ｎ１５－３０ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡ（配列番号５７）（Ｎ１５－３０はスペーサー配列に対応する）、（ｉｉ）配列番号５９、および（ｉｉｉ）配列番号４、を含むヌクレオチド配列から選択される。いくつかの実施形態では、スペーサー配列は、標的核酸分子（例えば、ゲノムＤＮＡ）の標的部位を標的とする。いくつかの実施形態では、スペーサー配列は、約１０～約３０ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、スペーサー配列は、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、スペーサー配列は、１９ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、スペーサー配列は、２０ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、スペーサー配列は、２１ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、スペーサー配列は、２２ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、第１のスプリントオリゴヌクレオチドは、配列番号６０、配列番号４４、または配列番号６１に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のスプリントオリゴヌクレオチドのどの部分もスペーサー配列に相補的ではない。いくつかの実施形態では、第１のスプリントオリゴヌクレオチドは、スペーサー配列またはスペーサー配列の３’末端に存在する１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０ヌクレオチドに相補的である、ヌクレオチド配列を有する３’末端をさらに含む。
前述のまたは関連する態様のいずれかでは、第１のＲＮＡフラグメント、第２のＲＮＡフラグメント、および／または第３のＲＮＡフラグメントは、少なくとも１つの二次構造を含み、第１、第２、および第３のＲＮＡフラグメント、ならびに第１および第２のスプリントオリゴヌクレオチドをハイブリダイズすることによって形成された複合体は、自由エネルギーが最も低い二次構造の自由エネルギーよりも低いという結果になる。いくつかの実施形態では、第１のＲＮＡフラグメント、第２のＲＮＡフラグメント、および第３のＲＮＡフラグメントを提供することは、酵素的合成またはホスホロアミダイト化学を使用するＲＮＡフラグメントの合成を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡフラグメントを提供することは、合成後にＲＮＡフラグメントを精製することをさらに含む。いくつかの実施形態では、ホスホロアミダイト化学を使用するＲＮＡフラグメントの合成は、それぞれ５’から３’または３’から５’の方向の第１のＲＮＡフラグメントの合成、第２のＲＮＡフラグメントの合成、および第３のＲＮＡフラグメントの合成を含む。いくつかの実施形態では、ホスホロアミダイト化学を使用するＲＮＡフラグメントの合成は、それぞれ５’から３’または３’から５’の方向の第１のＲＮＡフラグメントの合成、ならびにそれぞれ３’から５’の方向の第２のＲＮＡフラグメントの合成および第３のＲＮＡフラグメントの合成を含む。いくつかの実施形態では、第１および第２のスプリントオリゴヌクレオチドを提供することは、酵素的合成またはホスホロアミダイト化学を使用するオリゴヌクレオチドの合成を含む。いくつかの実施形態では、スプリントオリゴヌクレオチドを提供することは、合成後にオリゴヌクレオチドを精製することをさらに含む。いくつかの実施形態では、第１のＲＮＡフラグメント、第２のＲＮＡフラグメント、および／または第３のＲＮＡフラグメントは、ＲＮＡ骨格に少なくとも１つの修飾を含む。いくつかの実施形態では、修飾は、２’メトキシ（２’ＯＭｅ）、２’フッ素（２’フルオロ）、２’－Ｏ－メトキシ－エチル（ＭＯＥ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、アンロックド核酸（ＵＮＡ）、架橋核酸、２’デオキシ核酸（ＤＮＡ）、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、修飾は、ＲＮＡ骨格に存在する１つ以上のヌクレオチドの２’－Ｏ－メチル化である。いくつかの実施形態では、第１のＲＮＡフラグメント、第２のＲＮＡフラグメント、および／または第３のＲＮＡフラグメントは、少なくとも１つの塩基修飾を含む。いくつかの実施形態では、塩基修飾は、２－アミノプリン、イノシン、チミン、２，６－ジアミノプリン、２－ピリミジノン、および５－メチルシトシンからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第１のＲＮＡフラグメント、第２のＲＮＡフラグメント、および／または第３のＲＮＡフラグメントは、少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含む。いくつかの実施形態では、ハイブリダイズすることは、溶液中で行われる。いくつかの実施形態では、ハイブリダイズすることは、アニーリングステップなしで行われる。いくつかの実施形態では、ハイブリダイズすることは、アニーリングステップで行われる。いくつかの実施形態では、アニーリングステップは、（ｉ）約１０分未満（例えば、１、２、３、４、または５分）の期間、溶液を約８０℃～約９５℃に加熱することと、（ｉｉ）約０．１℃～約２℃／秒（例えば、１℃／秒）の速度で、ライゲーションに使用される温度（例えば、約１５℃～約４０℃、または約３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、もしくは４０℃）まで溶液を冷却することと、を含む。いくつかの実施形態では、溶液中の第１のスプリントオリゴヌクレオチドの濃度、第２のスプリントオリゴヌクレオチドの濃度、第１のＲＮＡフラグメントの濃度、第２のＲＮＡフラグメントの濃度、および第３のＲＮＡフラグメントの濃度は、ほぼ等しい。いくつかの実施形態では、濃度は約５μＭ～約５０μＭである。いくつかの実施形態では、濃度は、約５μＭ、約１０μＭ、約１５μＭ、約２０μＭ、または約２５μＭである。いくつかの実施形態では、ライゲーションは、約１５℃～約４５℃、または約３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、もしくは４０℃で実行される。いくつかの実施形態では、ライゲーションは、約０．１～約４８時間、または約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０時間実行される。いくつかの実施形態では、第１および第２のＲＮＡフラグメントをライゲーションすることは、プロテアーゼまたはキレート剤を使用することをさらに含む。いくつかの実施形態では、キレート剤は、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、または両方の組み合わせである。いくつかの実施形態では、第１および第２のＲＮＡフラグメントをライゲーションすることは、１つ以上の混雑剤を使用することをさらに含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の混雑剤は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、フィコール（登録商標）、エチレングリコール、デキストラン、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ライゲーションは、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％の完了まで進行する。いくつかの実施形態では、この方法は、合成後にｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを精製することをさらに含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを精製することは、クロマトグラフィー法を使用して精製することを含む。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィー法は、逆相ＨＰＬＣ、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、もしくはポリアクリルアミドゲル精製、またはそれらの任意の組み合わせである。
別の態様では、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む二重分子ｇＲＮＡを生成する方法が本明細書に提供され、方法は、５’リン酸部分を含む末端領域を含む第１のＲＮＡフラグメント、および３’ヒドロキシル基を含む末端領域を含む第２のＲＮＡフラグメントを提供することであって、第１のＲＮＡフラグメント、第２のＲＮＡフラグメント、またはその両方は、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼに結合することができる配列の少なくとも一部分を含む、提供することと、５’リン酸部分を含む末端領域で第１のＲＮＡフラグメントに相補的な第１の部分、および３’ヒドロキシル基を含む末端領域で第２のＲＮＡフラグメントに相補的な第２の部分を含むスプリントオリゴヌクレオチドを提供することと、第１のＲＮＡフラグメント、第２のＲＮＡフラグメント、およびスプリントオリゴヌクレオチドを一緒にハイブリダイズして複合体を形成することと、ＲＮＡ複合体の間に存在するライゲーション部位でリガーゼを使用して第１および第２のＲＮＡフラグメントをライゲーションし、それによってｔｒａｃｒＲＮＡを合成することと、標的ＤＮＡの配列に相補的である配列を含むｃｒＲＮＡを提供することと、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡがハイブリダイズすることを可能にし、それによって二重分子ｇＲＮＡを生成することと、を含む。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡを提供することは、酵素的合成またはホスホロアミダイト化学を介してｃｒＲＮＡを合成することを含む。
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと類似または同等の方法および材料を本発明の実施または試験に使用することができるが、好適な方法および材料を以下に記載する。本明細書で言及するすべての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、それらの全体が参照により組み込まれる。矛盾がある場合、本明細書が、定義を含め、優先される。加えて、材料、方法、および実施例は例示にすぎず、限定することを意図するものではない。
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明、および特許請求の範囲から明らかになるであろう。
スプリントオリゴヌクレオチドを使用して２つのＲＮＡフラグメントをライゲーションすることによるｇＲＮＡ分子の合成を示す概略図。 ２つのスプリントオリゴヌクレオチドを使用して３つのＲＮＡフラグメントをライゲーションすることによるｇＲＮＡ分子の合成を示す概略図。 不変ＲＮＡ構築物の生成と、それに続くスプリントオリゴヌクレオチドを使用した追加のＲＮＡフラグメントとのライゲーションによるｇＲＮＡ分子の生成を示す概略図。 例示的なｇＲＮＡ分子（配列番号１６）をＲＮＡフラグメント（それぞれ配列番号５６、３、および４に示されるヌクレオチド配列を有するＲＮＡフラグメント１、ＲＮＡフラグメント２、およびＲＮＡフラグメント３）にセグメント化するための位置を示す図解。 ＲＮＡフラグメント１～３のスプリント媒介ライゲーション前後のＨＰＬＣ分析の結果を示すクロマトグラム。 ＳｐＣａｓ９およびスプリント媒介ライゲーションを使用して生成されたｇＲＮＡによる標的ＤＮＡ配列を含むプラスミドの切断を示す。 修飾されたＲＮＡフラグメントのＲＮＡ修飾およびスプリント媒介ライゲーションの例を示す。図７Ａは、未修飾リボヌクレオチド、２’－Ｏ－メチルおよびホスホロチオエート修飾リボヌクレオチドの構造を示す。図７Ｂは、スプリント媒介ライゲーション生成物のＨＰＬＣ分析の結果を示すクロマトグラムである。 修飾されたＲＮＡフラグメントのＲＮＡ修飾およびスプリント媒介ライゲーションの例を示す。図７Ａは、未修飾リボヌクレオチド、２’－Ｏ－メチルおよびホスホロチオエート修飾リボヌクレオチドの構造を示す。図７Ｂは、スプリント媒介ライゲーション生成物のＨＰＬＣ分析の結果を示すクロマトグラムである。 精製前後のスプリント媒介ライゲーション生成物のＨＰＬＣ分析の結果を示すクロマトグラム。 ３つの修飾ＲＮＡフラグメント（ＲＮＡ１、ＲＮＡ２、およびＲＮＡ３）と２つのＤＮＡスプリントオリゴヌクレオチド（ＤＮＡスプリント１およびＤＮＡスプリント２）との間のスプリント媒介ライゲーションの概略図を提供し、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９（ＳｐｙＣａｓ９）とともに使用して修飾単一分子ｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を生成し、ヒトＧ６ＰＣ遺伝子を標的にする。ＲＮＡ１（配列番号１１）、ＲＮＡ２（配列番号１２）、およびＲＮＡ３（配列番号１３）の配列、ならびにＲＮＡフラグメント間のライゲーション部位を図９Ｂに示す。 ３つの修飾ＲＮＡフラグメント（ＲＮＡ１、ＲＮＡ２、およびＲＮＡ３）と２つのＤＮＡスプリントオリゴヌクレオチド（ＤＮＡスプリント１およびＤＮＡスプリント２）との間のスプリント媒介ライゲーションの概略図を提供し、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９（ＳｐｙＣａｓ９）とともに使用して修飾単一分子ｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を生成し、ヒトＧ６ＰＣ遺伝子を標的にする。ＲＮＡ１（配列番号１１）、ＲＮＡ２（配列番号１２）、およびＲＮＡ３（配列番号１３）の配列、ならびにＲＮＡフラグメント間のライゲーション部位を図９Ｂに示す。 （ｉ）リガーゼの添加前（「ライゲーション前」）、（ｉｉ）マグネシウム塩を添加したまたは添加しないリガーゼの添加後（それぞれ「Ｍｇ２＋を用いたライゲーション後」および「Ｍｇ２＋を用いないライゲーション後」）、または（ｉｉｉ）ＲＮＡフラグメントおよびＤＮＡスプリントの事前アニーリングなしで実行されたリガーゼの添加後（「アニーリングなしのライゲーション後」）に分析された混合物について、図９Ａ～９Ｂに示されるスプリント媒介ライゲーション反応のＨＰＬＣ分析の結果を示すクロマトグラム。全長ｓｇＲＮＡ（配列番号２０）は、保持時間が３０．５８分を有するピークに対応する。 ｓｇＲＮＡを合成するためのスプリント媒介ライゲーションのためのＲＮＡ／ＤＮＡ複合体を形成する３つのＲＮＡフラグメントおよび２つのＤＮＡスプリントのアラインメントを提供する。５’から３’のヌクレオチド配列は、ｓｇＲＮＡ最終生成物（配列番号１９）のＤＮＡバージョンである。ｓｇＲＮＡは、ＲＮＡ１、ＲＮＡ２、およびＲＮＡ３と、ＤＮＡスプリント１およびＤＮＡスプリント２とのハイブリダイゼーションと、それに続くＲＮＡ１の３’末端とＲＮＡ２の５’末端との間のライゲーション部位およびＲＮＡ２の３’末端とＲＮＡ３の５’末端との間のライゲーション部位でのライゲーションによって合成される。ＤＮＡスプリント１およびＤＮＡスプリント２のヌクレオチド配列は３’から５’の方向に示され、それぞれ配列番号５２および５３に対応する。
本開示は、１つ以上のスプリントオリゴヌクレオチドおよびリガーゼを使用してＲＮＡフラグメントをライゲーションすることにより、ＲＮＡ、特にガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）などの中程度の長さのＲＮＡ（ｍｌＲＮＡ）を合成するための方法を提供する。場合によっては、１つ以上のＲＮＡフラグメントは、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼに結合することができる配列の少なくとも一部分を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のＲＮＡフラグメントは、標的ＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ分子）中の標的配列を標的化するためのスペーサー配列を含む。
ｍｌＲＮＡの合成のための現在の手法には、例えば、外因性プラスミドの細胞内転写またはホスホロアミダイト化学を使用する固相合成が含まれる。ｍｌＲＮＡの化学合成の１つの制限は、得られた一本鎖ＲＮＡの長さである。例えば、使用されているホスホロアミダイト化学のカップリング効率が約０．９９Ｘ（Ｘはヌクレオチドの数である）の場合、約１００ヌクレオチドの長さのＲＮＡを合成する場合、全体の合成プロセスで約３０～４０％の完全長生成物（ＦＬＰ）が得られると予想される。不完全なカップリング（トランケーション生成物）および脱保護から形成された残りの副生成物からＦＬＰを完全な分離することは、約１００ヌクレオチドの長さのＲＮＡ分子の場合、標準的な精製方法（例えば、クロマトグラフィー）を使用して達成することは現状では不可能である。本開示は、完全長生成物の収量を改善し、生成されるトランケーション生成物の数を減少させる、ｍｌＲＮＡを合成するより効率的な方法を提供する。さらに、本開示の方法は、未修飾のｍｌＲＮＡ（例えば、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ）と、１つ以上の化学修飾、例えば、骨格修飾（例えば、ホスホロチオエート結合）および／またはヌクレオシド修飾（例えば、２’－Ｏ－メチル化）を含むｍｌＲＮＡとの両方の合成を提供することを本明細書で実証する。
本開示はまた、少なくとも部分的に、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）とともに使用するための単一分子ｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）が、本明細書に記載のスプリント媒介ライゲーション手法、例えば、１つ以上のスプリントオリゴヌクレオチド、およびリガーゼを使用する２つまたは３つのＲＮＡフラグメントのライゲーションを使用して効果的に合成されるという発見に基づく。いくつかの態様では、ライゲーションは、２つのＲＮＡフラグメント、１つのスプリントオリゴヌクレオチド、およびリガーゼを含み、２つのＲＮＡフラグメントは、スプリントオリゴヌクレオチドをハイブリダイズして、ライゲーション部位を含む複合体を形成し、リガーゼは、ライゲーション部位でのライゲーションをもたらして、それによってＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼで使用するためのｓｇＲＮＡを形成する。いくつかの態様では、ｓｇＲＮＡは、ライゲーション部位の５’であるヌクレオチド配列およびライゲーション部位の３’であるヌクレオチド配列を含み、第１のＲＮＡフラグメントは、ライゲーション部位の５’であるヌクレオチド配列に対応し、第２のＲＮＡフラグメントは、ライゲーション部位の３’であるヌクレオチド配列に対応し、ライゲーション部位でのライゲーションは、第１および第２のＲＮＡフラグメントの結合を可能にして、ｓｇＲＮＡのヌクレオチド配列を形成する。
いくつかの態様では、ライゲーションは、３つのＲＮＡフラグメント、２つのスプリントオリゴヌクレオチド、およびリガーゼを含み、３つのＲＮＡフラグメントは、２つのスプリントオリゴヌクレオチドをハイブリダイズして、第１および第２のライゲーション部位を含む複合体を形成し、リガーゼは、第１および第２のライゲーション部位でのライゲーションをもたらして、それによってＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼで使用するためのｓｇＲＮＡを形成する。いくつかの態様では、ｓｇＲＮＡは、第１のライゲーション部位の５’であるヌクレオチド配列、第１のライゲーション部位の３’および第２のライゲーション部位の５’であるヌクレオチド配列、ならびに第２のライゲーション部位の３’であるヌクレオチド配列を含み、第１のＲＮＡフラグメントは、第１のライゲーション部位の５’であるヌクレオチド配列に対応し、第２のＲＮＡフラグメントは、第１のライゲーション部位の３’および第２のライゲーション部位の５’であるヌクレオチド配列に対応し、第３のＲＮＡフラグメントは、第２のライゲーション部位の３’であるヌクレオチド配列に対応し、第１および第２のライゲーション部位でのライゲーションは、第１、第２、および第３のＲＮＡフラグメントの結合を可能にして、ｓｇＲＮＡのヌクレオチド配列を形成する。
いくつかの態様では、ｓｇＲＮＡのヌクレオチド配列は、５’から３’に、核酸分子（例えば、ゲノムＤＮＡ分子）の標的部位を標的とするためのスペーサー配列、およびＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼに結合する不変配列を含み、不変配列は、５’から３’に、ＣＲＩＳＰＲ反復配列とｔｒａｃｒＲＮＡ逆反復配列との間に形成されたステムループ、および少なくとも１つのステムループを含むｔｒａｃｒＲＮＡを含む。いくつかの態様では、スプリント媒介ライゲーション手法は、スペーサー配列を含む、少なくとも１つのＲＮＡフラグメント、またはＲＮＡフラグメントの組み合わせ、および不変配列を含む、少なくとも１つのＲＮＡフラグメント、またはＲＮＡフラグメントの組み合わせを提供する。
いくつかの態様では、スプリント媒介ライゲーション手法は、ｓｇＲＮＡにおけるライゲーション部位の配置、ｓｇＲＮＡの不変配列におけるステムループ内または近位のライゲーション部位（例えば、ＣＲＩＳＰＲ反復配列とｔｒａｃｒＲＮＡ逆反復配列との間に形成されたステムループ内または近位、例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡのステムループ内または近位）を含む。本明細書に記載されるように、ステムループにおけるライゲーション部位の配置は、ＲＮＡフラグメントとスプリントオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを防止または不利にするＲＮＡフラグメント（すなわち、ライゲーション部位で結合されたＲＮＡフラグメント）における二次構造の形成を防止する。例えば、ライゲーション部位によるステムループの破壊は、（ｉ）最小限の二次構造および／または（ｉｉ）ＲＮＡフラグメントおよびスプリントオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションから生じる自由エネルギーよりも高い自由エネルギーを有する二次構造を有するＲＮＡフラグメント（すなわち、ライゲーション部位で結合されたＲＮＡフラグメント）を提供する。
いくつかの態様では、スプリント媒介ライゲーション手法は、ｓｇＲＮＡにおける第１および第２のライゲーション部位の配置を含み、第１のライゲーション部位の配置は、第１のライゲーション部位の５’であるヌクレオチド配列を含むＲＮＡフラグメントおよび第１のライゲーション部位の３’であるヌクレオチド配列を含むＲＮＡフラグメントのステムループ形成を破壊するように、第１および第２のライゲーション部位は、それぞれ、ｓｇＲＮＡの不変配列におけるステムループ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ反復配列とｔｒａｃｒＲＮＡ逆反復配列との間に形成されたステムループ、例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡのステムループ）内または近位にあり、第２のライゲーション部位の配置は、第２のライゲーション部位の５’であるヌクレオチド配列を含むＲＮＡフラグメントおよび第２のライゲーション部位の３’であるヌクレオチド配列を含むＲＮＡフラグメントにおけるステムループ形成を破壊し、スプリント媒介ライゲーション反応で使用される各々またはすべてのＲＮＡフラグメントにおける二次構造の形成は、スプリントオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションに比べて不利である。
以下の詳細な説明では、添付の図面を参照する。図面では、文脈上別段の指示がない限り、同様の記号は一般に同様の構成成分を識別する。詳細な説明、図面、および特許請求の範囲に記載されている例示的な代替案は、限定することを意図したものではない。本明細書に提示された主題の趣旨または範囲から逸脱することなく、他の代替案を使用することができ、他の変更を行うことができる。本明細書に一般的に記載され、図に示されるような態様は、多種多様な異なる構成で配置、置換、組み合わせ、および設計することができ、それらはすべて明示的に企図され、本出願の一部となることが容易に理解されよう。
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語、表記法、および他の科学用語または用語は、本出願が関係する当業者によって一般に理解される意味を有することを意図している。場合によっては、一般に理解されている意味を持つ用語は、明確にするためおよび／またはすぐに参照できるように本明細書で定義され、本明細書にそのような定義を含めることは、当該技術分野で一般に理解されているものとの実質的な違いを表すと必ずしも解釈されるべきではない。
「中程度の長さのＲＮＡ（ｍｌＲＮＡ）」とは、約３０～約１６０ヌクレオチド（例えば、約３０～約１５０、約３０～約１４０、約３０～約１３０、約３０～約１２０、約３０～約１１０、約３０～約１００、約３０～約９０、約３０～約８０、約３０～約７０、約３０～約６０、約３０～約５０、約３０～約４０、約４０～約１６０、約４０～約１５０、約４０～約１４０、約４０～約１３０、約４０～約１２０、約４０～約１１０、約４０～約１００、約４０～約９０、約４０～約８０、約４０～約７０、約４０～約６０、約４０～約５０、約５０～約１６０、約５０～約１５０、約５０～約１４０、約５０～約１３０、約５０～約１２０、約５０～約１１０、約５０～約１００、約５０～約９０、約５０～約８０、約５０～約７０、約５０～約６０、約６０～約１６０、約６０～約１５０、約６０～約１４０、約６０～約１３０、約６０～約１２０、約６０～約１１０、約６０～約１００、約６０～約９０、約６０～約８０、約６０～約７０、約７０～約１６０、約７０～約１５０、約７０～約１４０、約７０～約１３０、約７０～約１２０、約７０～約１１０、約７０～約１００、約７０～約９０、約７０～約８０、約８０～約１６０、約８０～約１５０、約８０～約１４０、約８０～約１３０、約８０～約１２０、約８０～約１１０、約８０～約１００、約８０～約９０、約９０～約１６０、約９０～約１５０、約９０～約１４０、約９０～約１３０、約９０～約１２０、約９０～約１１０、約９０～約１００、約１００～約１６０、約１００～約１５０、約１００～約１４０、約１００～約１３０、約１００～約１２０、約１００～約１１０、約１１０～約１６０、約１１０～約１５０、約１１０～約１４０、約１１０～約１３０、約１１０～約１２０、約１２０～約１６０、約１２０～約１５０、約１２０～約１４０、約１２０～約１３０、約１３０～約１６０、約１３０～約１５０、約１３０～約１４０、約１４０～約１６０、約１４０～約１５０または約１５０～約１６０ヌクレオチド）の長さを持つＲＮＡ分子を意味する。
「ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ」とは、ＲＮＡ（例えば、ｇＲＮＡ）に結合して、特定のＤＮＡ配列（例えば、標的ＤＮＡ内）を標的とする複合体を形成することができるポリペプチドを意味する。例示的なＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼなどのＣａｓエンドヌクレアーゼ）である。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるようなＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、それが結合されるＲＮＡ分子によって、標的ＤＮＡ中の特定のＤＮＡ配列を標的とする。ＲＮＡ分子は、標的ＤＮＡ内の標的配列に相補的であり、それとハイブリダイズすることができる配列を含み、したがって、結合したポリペプチドを標的ＤＮＡ内の特定の位置に標的化することを可能にする。
本明細書で使用される「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」は、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼに結合して複合体を形成し、結合したＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（Ｃａｓエンドヌクレアーゼなど）の活性を標的核酸内の特定の標的配列に向けることができる部位特異的標的ＲＮＡである。ガイドＲＮＡは、１つ以上のＲＮＡ分子を含むことができる。
本明細書で使用される場合、核酸分子（例えば、ＲＮＡフラグメント、またはｇＲＮＡ）の「二次構造」は、核酸分子内の塩基対形成相互作用を指す。
本明細書で使用される「標的ＤＮＡ」は、「標的部位」または「標的配列」を含むＤＮＡである。「標的配列」という用語は、ハイブリダイゼーションのための十分な条件が存在する場合に、ｇＲＮＡのＤＮＡ標的化配列またはセグメント（本明細書では「スペーサー」とも呼ばれる）がハイブリダイズすることができる標的ＤＮＡに存在する核酸配列を指すために本明細書で使用される。例えば、標的ＤＮＡ内の標的配列５’ＧＡＧＣＡＴＡＴＣ－３’は、ＲＮＡ配列５’－ＧＡＵＡＵＧＣＵＣ－３’によって標的化される（またはハイブリダイズすることができるか、または相補的である）。ｇＲＮＡのＤＮＡ標的化配列またはセグメントと標的配列との間のハイブリダイゼーションは、例えば、ＤＮＡ標的化配列またはセグメントにおけるプログラム可能性を可能にするワトソン－クリック型塩基対ルールに基づくことができる。ｇＲＮＡのＤＮＡ標的化配列またはセグメントは、例えば、任意の標的配列とハイブリダイズするように設計することができる。
本明細書で使用される「Ｃａｓエンドヌクレアーゼ」または「Ｃａｓヌクレアーゼ」という用語は、例えば、ＣＲＩＳＰＲ適応免疫システムに関連するＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼを含むが、これらに限定されない。
特に明記しない限り、「ヌクレアーゼ」および「エンドヌクレアーゼ」は、本明細書では交換可能に使用され、ポリヌクレオチド切断のためのエンドヌクレアーゼ触媒活性を有する酵素を意味する。
本明細書で使用される「切断」は、ＤＮＡ分子の共有結合骨格の切断を意味する。一本鎖切断および二本鎖切断の両方が可能であり、二本鎖切断は、２つの異なる一本鎖切断事象の結果として発生する可能性がある。
「ドメイン」という用語は、本明細書では、タンパク質または核酸のセグメントを説明するために使用される。特に明記されていない限り、ドメインは特定の機能性質を有する必要がない。
「スプリントオリゴヌクレオチド」は、他のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡフラグメント）にハイブリダイズしたときに、「スプリント」として作用して、ポリヌクレオチドの末端を互いに隣接させて、それらを一緒に連結できるようにするオリゴヌクレオチドである。スプリントオリゴヌクレオチドは、ワトソン－クリック塩基対相互作用を介してポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができる任意のオリゴマーであり得る。スプリントオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、非天然または人工の核酸（例えば、ペプチド核酸）であり得る。スプリントオリゴヌクレオチドは、２つ以上の異なるオリゴヌクレオチドからのヌクレオチド配列に部分的に相補的であるヌクレオチド配列を含むことができる。一般に、ＲＮＡリガーゼ、ＤＮＡリガーゼ、または別の種類のリガーゼを使用して、２つのヌクレオチド配列を一緒にライゲーションすることができる。
ｇＲＮＡの「スペーサー」または「可変領域」は、標的ＤＮＡ（標的ＤＮＡの相補鎖）内の特定の配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様では、スペーサーは、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼと組み合わされたｇＲＮＡに標的特異性を付与し、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが標的ＤＮＡのスペーサーによって標的とされる標的部位で切断することを可能にする。本明細書で使用される場合、「スペーサー」という用語は、「スペーサー配列」という用語と交換可能に使用される。
ｇＲＮＡの「不変領域」という用語は、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼと結合するｇＲＮＡのヌクレオチド配列を指す。いくつかの態様では、ｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡおよびトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含み、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡは、互いにハイブリダイズして二本鎖を形成する。いくつかの態様では、ｃｒＲＮＡは５’から３’：スペーサー配列および最小ＣＲＩＳＰＲ反復（本明細書では「ｃｒＲＮＡ反復配列」とも呼ばれる）を含み、ｔｒａｃｒＲＮＡは、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列に相補的な最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（本明細書では「ｔｒａｃｒＲＮＡ逆反復配列」とも呼ばれる）および３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含む。いくつかの態様では、ｇＲＮＡの不変領域は、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列およびｔｒａｃｒＲＮＡであるｃｒＲＮＡの部分を指す。
「ポリヌクレオチド」および「核酸」という用語は、本明細書では交換可能に使用され、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかの任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。したがって、これらの用語は、一本鎖、二本鎖、または多本鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド／三重らせん、あるいはプリンおよびピリミジン塩基、または他の天然の、化学的もしくは生化学的に修飾された、非天然の、または誘導体化されたヌクレオチド塩基を有するポリマーを含むが、これらに限定されない。
本明細書で使用される「結合」は、高分子間の非共有相互作用（例えば、タンパク質と核酸との間）を指す。非共有相互作用の状態にある間、高分子は「結合」または「相互作用」または「結合」していると言われている（例えば、分子Ｘが分子Ｙと相互作用すると言われる場合、分子Ｘが分子Ｙと非共有結合的に結合することを意味する）。結合相互作用は一般に、解離定数（Ｋｄ）が１０－６Ｍ未満、１０－７Ｍ未満、１０－８Ｍ未満、１０－９Ｍ未満、１０－１０Ｍ未満、１０－１１Ｍ未満、１０－１２Ｍ未満、１０－１３Ｍ未満、１０－１４Ｍ未満、または１０－１５Ｍ未満で特徴付けられる。Ｋｄは当業者に知られているように環境条件、例えば、ｐＨおよび温度に依存する。「親和性」とは結合の強さを指し、結合親和性の増加はＫｄの低下と相関している。
「ハイブリダイズすること（ｈｙｂｒｉｄｉｚｉｎｇ）」または「ハイブリダイズする（ｈｙｂｒｉｄｉｚｅ）」という用語は、２つの異なる分子内の実質的に相補的または相補的な核酸配列の対を指す。対は、核酸配列が塩基対を介して実質的または完全に相補的配列と結合してハイブリダイゼーション複合体を形成する任意のプロセスによって達成することができる。いくつかの実施形態では、「ハイブリダイズすること（ｈｙｂｒｉｄｉｚｉｎｇ）」または「ハイブリダイズする（ｈｙｂｒｉｄｉｚｅ）」は、分子を変性させて、分子内の分子内構造（例えば、二次構造）を破壊することを含む。いくつかの実施形態では、分子を変性させることは、分子を含む溶液を、分子の分子内構造を破壊するのに十分な温度に加熱することを含む。場合によっては、分子を変性させることは、分子を含む溶液のｐＨを、分子の分子内構造を破壊するのに十分なｐＨに調整することを含む。ハイブリダイゼーションの目的で、２つの核酸配列または配列のセグメントは、それらの個々の塩基の少なくとも８０％が互いに相補的である場合、「実質的に相補的」である。例えば、スプリントオリゴヌクレオチド配列は、一般に、それが相補的であるように設計されている２つのポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡフラグメント）のうちの１つと約５０％以下同一である。しかしながら、各配列の相補的部分は、本明細書では「セグメント」と呼ぶことができ、セグメントは、それらが８０％以上の同一性を有する場合、実質的に相補的である。
値の範囲が提供されている場合、文脈上明らかにそうでない場合を除き、その範囲の上限と下限との間の、下限の単位の１０分の１の各介入値、およびその記載される範囲の他の述べられたまたは介在する値は、本発明の範囲に包含されると理解される。これらのより小さな範囲の上限および下限は独立して、そのより小さな範囲内に含まれ得、また、記載される範囲内の任意の具体的に除外される限界値に従って、本開示内に包含される。記載される範囲がこれらの限界値のうちの１つまたは両方を含む場合、これらの含まれる限界値のいずれかまたは両方を除く範囲も、本開示に含まれる。
特定の範囲は、数値が「約」という用語で先行されて本明細書に示されている。「約」というは、本明細書では、その用語が先行する正確な数値、およびその用語が先行する数値に近い、またはおおよその数値に対する文字通りの裏付けを提供するために使用されている。数が具体的に列挙された数に近いか近似しているかを決定する際に、近くまたは近似の非引用数は、それが提示される文脈において、具体的に引用された数と実質的に同等を提供する数であり得る。
明確にするために、別個の実施形態の文脈で説明される本開示の特定の特徴もまた、単一の実施形態では組み合わせて提供され得ることが理解される。本開示の様々な特徴は、単一の実施形態の文脈で説明され得るが、特徴はまた、別個に、または任意の好適な下位組み合わせで提供され得る。本開示に関連する実施形態のすべての組み合わせは、本開示によって具体的に包含され、あたかもすべての組み合わせが個別に明示的に開示されたかのように、本明細書に開示される。加えて、様々な実施形態およびその要素のすべての下位組み合わせもまた、本開示によって具体的に包含され、あたかもそのような下位組み合わせのそれぞれが個別にかつ明示的に本明細書に開示されたかのように本明細書に開示される。
Ｉ．スプリントオリゴヌクレオチド
本開示は、ＲＮＡ、特に２つ以上のＲＮＡフラグメントのスプリント媒介ライゲーションを使用するｇＲＮＡなどのｍｌＲＮＡを合成する方法を提供する。いくつかの実施形態では、この方法は、２つ、３つ、またはそれ以上（例えば、４つ、５つ、６つ、７つ、または８つ）のＲＮＡフラグメントのスプリント媒介ライゲーションの使用を含む。これらの方法に不可欠なのは、スプリントオリゴヌクレオチドである。これらは、第１のＲＮＡフラグメントおよび第２のＲＮＡフラグメントとハイブリダイズして複合体を形成し、これは、ＲＮＡフラグメント間に存在するライゲーション部位での第１および第２のＲＮＡフラグメントのライゲーションを容易にする。いくつかの実施形態では、この方法は、１つのスプリントオリゴヌクレオチドを使用する２つのＲＮＡフラグメントのスプリント媒介ライゲーションの使用を含む。いくつかの実施形態では、この方法は、２つのスプリントオリゴヌクレオチドを使用する３つのＲＮＡフラグメントのスプリント媒介ライゲーションの使用を含む。いくつかの実施形態では、この方法は、ＲＮＡフラグメントをライゲーションするために必要な適切な数のスプリントオリゴヌクレオチドを使用して、３つを超えるＲＮＡフラグメント（例えば、４、５、６、７、または８つのＲＮＡフラグメント）のスプリント媒介ライゲーションの使用を含む。
スプリントオリゴヌクレオチドは、例えば、５’リン酸部分を含む末端領域で第１のＲＮＡフラグメントに相補的な第１の部分を含む。それはさらに、３’ヒドロキシル基を含む末端領域で第２のＲＮＡフラグメントに相補的な第２の部分を含む。スプリントオリゴヌクレオチドは、第１のＲＮＡフラグメントおよび第２のＲＮＡフラグメントとハイブリダイズして複合体を形成することができる。複合体では、ＲＮＡフラグメントは、ＲＮＡフラグメント間に存在するライゲーション部位でのライゲーションに有利に配置される。
スプリントオリゴヌクレオチドは、５’リン酸部分を含む末端領域での第１のＲＮＡフラグメントにおいて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５ヌクレオチドに連続的または非連続的に相補的な配列を含み得る。スプリントオリゴヌクレオチドは、第１のＲＮＡフラグメントの１～２０ヌクレオチド、２１～４０ヌクレオチド、４１～６０ヌクレオチド、または６１～８０ヌクレオチドに相補的な配列を含み得、ヌクレオチドは、連続的または非連続的であり得る。スプリントオリゴヌクレオチドは、３’ヒドロキシル基を含む末端領域での第２のＲＮＡフラグメントにおいて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５ヌクレオチドに連続的または非連続的に相補的な配列を含み得る。スプリントオリゴヌクレオチドは、第２のＲＮＡフラグメントの１～２０ヌクレオチド、２１～４０ヌクレオチド、４１～６０ヌクレオチド、または６１～８０ヌクレオチドに相補的な配列を含み得、ヌクレオチドは、連続的または非連続的であり得る。
第１のＲＮＡフラグメントに相補的なスプリントオリゴヌクレオチドの配列の長さ、および第２のＲＮＡフラグメントに相補的な配列の長さは、同じであっても異なっていてもよい。
スプリントオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡフラグメントおよび／またはスプリントオリゴヌクレオチドに存在する分子内構造（例えば、二次構造）よりも、ＲＮＡフラグメントとスプリントオリゴヌクレオチドとの間の複合体形成を優先的に容易にするように設計することができる。最小自由エネルギー予測アルゴリズムは、本開示の方法によって提供される好適なスプリントオリゴヌクレオチドを設計するために使用することができる。理論的には、自由エネルギーが低いほど、ＲＮＡフラグメントとスプリントオリゴヌクレオチドとの間の複合体が形成される可能性が高くなる。配列の最小自由エネルギー構造は、自由エネルギーの値が最も低くなるように計算される（したがって、理論上最も形成される可能性が高い）二次構造である。例として、最小自由エネルギー予測アルゴリズムを使用して、ΔＧｉｎｔｒａで表されるＲＮＡフラグメントの二次構造の自由エネルギーと、ΔＧｉｎｔｅｒで表されるＲＮＡフラグメントとスプリントオリゴヌクレオチドとの分子間ハイブリダイゼーションの自由エネルギーと、を計算することができる。場合によっては、隣接近似が使用される。ＲＮＡフラグメントの二次構造の融解温度（Ｔｍ）は、Ｔｍ－ｉｎｔｒａで表される。ＲＮＡフラグメントおよびスプリントオリゴヌクレオチドハイブリッドの融解温度は、Ｔｍ－ｉｎｔｅｒで表される。スプリントオリゴヌクレオチドの長さは、ΔＧｉｎｔｒａがΔＧｉｎｔｅｒよりも大きいこと、および／またはＴｍ－ｉｎｔｅｒがＴｍ－ｉｎｔｒａよりも大きいことを保証するように設計することができる。例示的な自由エネルギー予測アルゴリズムは、ＵＲＬ：：／／ｕｎａｆｏｌｄ．ｒｎａ．ａｌｂａｎｙ．ｅｄｕ／？ｑ＝ｍｆｏｌｄからから入手可能なものからアクセスできる。
第１のＲＮＡフラグメント、第２のＲＮＡフラグメント、またはその両方は、少なくとも１つの二次構造を含み、第１のＲＮＡフラグメント、第２のＲＮＡフラグメント、およびスプリントオリゴヌクレオチドをハイブリダイズする場合、少なくとも１つの二次構造のうちの１つに関連する自由エネルギーよりも低い自由エネルギーという結果になる。第１のＲＮＡフラグメント、第２のＲＮＡフラグメント、およびスプリントオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせることはまた、例えば、第１のＲＮＡフラグメント、第２のＲＮＡフラグメント、またはその両方の最低の自由エネルギー（または最小の自由エネルギー）を有する二次構造の自由エネルギーよりも低い自由エネルギーという結果にもなり得る。
１つ以上のスプリントオリゴヌクレオチドを使用して、ＲＮＡフラグメントとハイブリダイズして、ＲＮＡフラグメントのライゲーションを媒介することができる。ライゲーションを媒介するために使用されるスプリントオリゴヌクレオチドの数は、ライゲーションされるＲＮＡフラグメントの数よりも少なくすることができる。例えば、ライゲーションを媒介するために使用されるスプリントオリゴヌクレオチドの数は、ライゲーションされるＲＮＡフラグメントの数より１つ少なくすることができ、すなわち、ライゲーションされるＲＮＡフラグメントの数がｎである場合、スプリントオリゴヌクレオチドの数がｎ－１であり得る。
スプリントオリゴヌクレオチドの長さは、２０～１００のヌクレオチド（例えば、２０～９５、２０～９０、２０～８５、２０～８０、２０～７５、２０～７０、２０～６５、２０～６０、２０～５５、２０～５０、２０～４５、２０～４０、２０～３５、２０～３０、２０～２５、２５～１００、２５～９５、２５～９０、２５～８５、２５～８０、２５～７５、２５～７０、２５～６５、２５～６０、２５～５５、２５～５０、２５～４５、２５～４０、２５～３５、２５～３０、３０～１００、３０～９５、３０～９０、３０～８５、３０～８０、３０～７５、３０～７０、３０～６５、３０～６０、３０～５５、３０～５０、３０～４５、３０～４０、３０～３５、３５～１００、３５～９５、３５～９０、３５～８５、３５～８０、３５～７５、３５～７０、３５～６５、３５～６０、３５～５５、３５～５０、３５～４５、３５～４０、４０～１００、４０～９５、４０～９０、４０～８５、４０～８０、４０～７５、４０～７０、４０～６５、４０～６０、４０～５５、４０～５０、４０～４５、４５～１００、４５～９５、４５～９０、４５～８５、４５～８０、４５～７５、４５～７０、４５～６５、４５～６０、４５～５５、４５～５０、５０～１００、５０～９５、５０～９０、５０～８５、５０～８０、５０～７５、５０～７０、５０～６５、５０～６０、５０～５５、５５～１００、５５～９５、５５～９０、５５～８５、５５～８０、５５～７５、５５～７０、５５～６５、５５～６０、６０～１００、６０～９５、６０～９０、６０～８５、６０～８０、６０～７５、６０～７０、６０～６５、６５～１００、６５～９５、６５～９０、６５～８５、６５～８０、６５～７５、６５～７０、７０～１００、７０～９５、７０～９０、７０～８５、７０～８０、７０～７５、７５～１００、７５～９５、７５～９０、７５～８５、７５～８０、８０～１００、８０～９５、８０～９０、８０～８５、８５～１００、８５～９５、８５～９０、９０～１００、または９０～９５ヌクレオチド）であり得る。
スプリントオリゴヌクレオチドは、支持体に結合することができる。スプリントオリゴヌクレオチドは、様々な技術を使用して支持体に結合することができる。例えば、スプリントオリゴヌクレオチドは、支持体に直接に結合することができ、または化学的固定化によって支持体に固定化することができる。例えば、化学的固定化は、支持体上の官能基とスプリントオリゴヌクレオチドの対応する官能基との間で起こり得る。スプリントオリゴヌクレオチドのそのような対応する機能要素は、スプリントオリゴヌクレオチドの固有の化学基、例えばヒドロキシル基であるか、または追加的に導入することができる。そのような官能基の例は、アミン基である。典型的には、固定化されるスプリントオリゴヌクレオチドは、官能性アミン基を含むか、または官能性アミン基を含むように化学的に修飾される。そのような化学修飾のための手段および方法は、当該技術分野で知られている。
固定化されるスプリントオリゴヌクレオチド内の官能基の局在化を使用して、スプリントオリゴヌクレオチドの結合挙動および／または配向を制御および形成することができ、例えば、官能基は、スプリントオリゴヌクレオチドの５’または３’末端にまたはスプリントオリゴヌクレオチドの配列内に配置することができる。固定化されるスプリントオリゴヌクレオチドの典型的な支持体は、そのようなスプリントオリゴヌクレオチド、例えば、アミン官能化核酸に結合することができる部分を含む。そのような支持体の非限定的な例としては、カルボキシ、アルデヒド、およびエポキシ支持体が挙げられる。
スプリントオリゴヌクレオチドを固定化することができる支持体は、例えば、支持体上で利用可能な官能基の活性化によって、化学的に活性化することができる。「活性化基質」という用語は、相互作用または反応性の化学官能基が化学修飾手順によって確立または可能にされた材料に関する。例えば、カルボキシル基を含む支持体は、使用前に活性化することができる。さらに、特定の支持体は、スプリントオリゴヌクレオチドにすでに存在する特定の部分と反応することができる官能基を含む。
スプリントオリゴヌクレオチドを支持体に結合するために使用される共有結合は、スプリントオリゴヌクレオチドが「直接」共有結合によって結合されているが、スプリントオリゴヌクレオチドの「第１の」ヌクレオチドを支持体から分離する化学部分またはリンカーが存在し得る（すなわち、間接結合）という意味で、直接および間接結合としてみなすことができる。場合によっては、共有結合および／または化学リンカーによって支持体に固定化されているスプリントオリゴヌクレオチドは、一般に、支持体に直接固定化または結合しているように見える。スプリントオリゴヌクレオチドは、支持体に直接結合しないかもしれないが、例えば、それ自体が支持体に直接または間接的に結合する分子に結合することによって、間接的に相互作用する。スプリントオリゴヌクレオチドはまた、支持体に間接的に結合することができる（例えば、ポリマーを含む溶液を介して）。
スプリントオリゴヌクレオチドが支持体上に間接的に、例えば、スプリントオリゴヌクレオチドを結合することができる表面オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションを介して固定化される場合、スプリントオリゴヌクレオチドは、表面オリゴヌクレオチドの５’末端にハイブリダイズできる上流配列（本明細書に記載するように２つ以上のＲＮＡフラグメントにハイブリダイズする配列の５’）にさらに含み得る。
スプリントオリゴヌクレオチドは、その５’末端またはその３’末端を介して支持体に結合することができる。支持体に結合したスプリントオリゴヌクレオチドは、支持体上でその場で合成することができる。
ＩＩ．ＲＮＡを合成する方法
ｍｌＲＮＡを合成する本明細書に開示されている方法は、一般に、第１のＲＮＡフラグメント、第２のＲＮＡフラグメント、およびスプリントオリゴヌクレオチドを提供することを含む。第１のＲＮＡフラグメント、第２のＲＮＡフラグメント、およびスプリントオリゴヌクレオチドを一緒にハイブリダイズして複合体を形成する。そのような複合体を形成すると、ライゲーションを容易にするために、第１および第２のＲＮＡフラグメントが近接して配置される。次いで、リガーゼを使用して、ライゲーション部位全体で第１および第２のＲＮＡフラグメントをライゲーションし、それによってｍｌＲＮＡを合成する。
いくつかの実施形態では、方法は、第１のＲＮＡフラグメント、第２のＲＮＡフラグメント、第３のＲＮＡフラグメント、第１のスプリントオリゴヌクレオチド、および第２のオリゴヌクレオチドを提供することを含む。第１のＲＮＡフラグメント、第２のＲＮＡフラグメント、および第１のスプリントオリゴヌクレオチドは一緒にハイブリダイズし、第２のＲＮＡフラグメント、第３のＲＮＡフラグメント、および第２のスプリントオリゴヌクレオチドは一緒にハイブリダイズして、それによって、第１、第２、および第３のＲＮＡフラグメント、ならびに第１および第２のスプリントオリゴヌクレオチドを含む複合体を形成する。複合体位置の形成が、（ｉ）第１のＲＮＡフラグメントの３’ヒドロキシル基および第２のＲＮＡフラグメントの５’リン酸部分が近接して第１のライゲーション部位を提供し、（ｉｉ）第２のＲＮＡフラグメントの３’ヒドロキシル基および第３のＲＮＡフラグメントの５’リン酸部分が近接して第２のライゲーション部位を提供する位置を特定する。この方法はさらに、第１のライゲーション部位で第１および第２のＲＮＡフラグメントをライゲーションし、第２のライゲーション部位で第２および第３のＲＮＡフラグメントをライゲーションし、それによってｍｌＲＮＡを合成するリガーゼを提供する。
第１のＲＮＡフラグメント、第２のＲＮＡフラグメント、およびスプリントオリゴヌクレオチドをハイブリダイズすることは、溶液中で行うことができる。いくつかの実施形態では、ハイブリダイズすることは、溶液中で行われる第３のＲＮＡフラグメントおよび第２のスプリントオリゴヌクレオチドをさらに含む。溶液中でハイブリダイズする場合、第１のＲＮＡフラグメントの濃度は、例えば、第２のＲＮＡフラグメントの濃度にほぼ等しくなり得る。いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーションが第３のＲＮＡフラグメントをさらに含む場合、第１のＲＮＡフラグメントおよび第２のＲＮＡフラグメントの濃度は、それぞれ、第３のＲＮＡフラグメントの濃度にほぼ等しい。使用される方法、フラグメント、およびスプリントオリゴヌクレオチドに応じて、溶液中のスプリントオリゴヌクレオチドの濃度または溶液中の第２のＲＮＡフラグメントの濃度は、溶液中の第１のＲＮＡフラグメントの濃度にほぼ等しいか、それより多いか、またはそれより少ない。例えば、スプリントオリゴヌクレオチド、第１のＲＮＡフラグメント、および第２のＲＮＡフラグメントの濃度は、ほぼ等しくなり得る。いくつかの実施形態では、この方法は、第１、第２、および第３のＲＮＡフラグメント、ならびに第１および第２のスプリントオリゴヌクレオチドを含み、第１のスプリントオリゴヌクレオチドの濃度、第２のスプリントオリゴヌクレオチドの濃度、第１のＲＮＡフラグメントの濃度、溶液中の第２のＲＮＡフラグメントの濃度と第３のＲＮＡフラグメントの濃度はそれぞれほぼ等しい。
場合によっては、ハイブリダイズするために、ＲＮＡフラグメントおよび／またはスプリントオリゴヌクレオチドが変性される、すなわち、ＲＮＡフラグメントおよび／またはスプリントオリゴヌクレオチドの分子内構造が破壊されて、ＲＮＡフラグメントとスプリントオリゴヌクレオチドとの間のアニーリングが可能になる。変性は、例えば、ＲＮＡフラグメントおよびスプリントオリゴヌクレオチドを含む溶液を少なくとも約３７℃（例えば、少なくとも約３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４２℃、４４℃、４６℃、４８℃、５０℃、５２℃、５４℃、５６℃、５８℃、６０℃、６５℃、７０℃、７５℃、８０℃、８５℃、９０℃、９５℃、または少なくとも約１００℃）に加熱することによって達成することができる。場合によっては、ハイブリダイズすることは、溶液を約８０℃～約１００℃、例えば、約８２℃～約９８℃、約８４℃～約９６℃、約８６℃～約９４℃、または約８８℃～約９２℃（例えば、８１℃、約８２℃、約８３℃、約８４℃、約８５℃、約８６℃、約８７℃、約８８℃、約８９℃、約９０℃、約９１℃、約９２℃、約９３℃、約９４℃、約９５℃、約９６℃、約９７℃、約９８℃、または約９９℃）の温度に加熱することを含む。他の例では、ハイブリダイズすることは溶液を加熱することを含まない。
場合によっては、ハイブリダイズすることは、加熱後に溶液を約２０℃～約４５℃、例えば、約２２℃～約４３℃、約２５℃～約４０℃、または約２７℃～約３８℃（例えば、約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃、約２５℃、約２６℃、約２７℃、約２８℃、約２９℃、約３０℃、約３１℃、約３２℃、約３３℃、約３４℃、約３５℃、約３６℃、約３７℃、約３８℃、約３９℃、約４０℃、約４１℃、約４２℃、約４３℃、または約４４℃）の温度に冷却することを含む。例えば、場合によっては、ハイブリダイズすることは、加熱後に溶液を約３７℃に冷却することを含む。ハイブリダイズすることは、本明細書中に記載されている方法で使用されるリガーゼが第１および第２のＲＮＡフラグメントをライゲーションするのに十分なリガーゼ活性を保持する温度、ならびに／またはハイブリダイゼーション時のＲＮＡフラグメントおよびスプリントオリゴヌクレオチドによって形成された複合体の融解温度より低い温度に溶液を冷却することを含み得る。ハイブリダイズすることが溶液の加熱を含まない場合、ハイブリダイズすることは、ハイブリダイゼーション時にＲＮＡフラグメントおよびスプリントオリゴヌクレオチドによって形成された複合体の融解温度よりも低い温度で実施することができる。実行される特定の方法に応じて、加熱後に溶液を冷却することは、一定の速度または制御されていない速度で溶液の温度を下げることを含み得る。
本開示に記載される方法は、ライゲーション部位でリガーゼを使用して第１および第２のＲＮＡフラグメントをライゲーションすることを含む。ライゲーションは、第１のＲＮＡフラグメントの末端領域の５’リン酸基を第２のＲＮＡフラグメントの末端領域の３’ヒドロキシル基とライゲーションすることを含み得る。リガーゼによって触媒され、５’リン酸基および３’ヒドロキシル基が反応してホスホジエステル結合を形成する。ライゲーション部位は、５’リン酸基と３’ヒドロキシル基との間のホスホジエステル結合が形成される部位であり得る。
いくつかの実施形態では、方法は、第１のライゲーション部位でリガーゼを使用して第１のＲＮＡフラグメントおよび第２のＲＮＡフラグメントをライゲーションし、第２のライゲーション部位でリガーゼを使用して第２のＲＮＡフラグメントおよび第３のＲＮＡフラグメントをライゲーションすることを含む。いくつかの実施形態では、ライゲーションは、第１のＲＮＡフラグメントの末端での３’ヒドロキシル基と、第２のＲＮＡフラグメントの末端での５’リン酸とのライゲーションを含み、第２のＲＮＡフラグメントの末端での３’ヒドロキシル基および第３のＲＮＡフラグメントの末端での５’リン酸のライゲーション、それぞれのライゲーションは、ホスホジエステル結合の形成をもたらす。
一般に、第１および第２のＲＮＡフラグメントをライゲーションすることは、約１５℃～約４５℃、例えば、約１７℃～約４３℃、約２０℃～約４０℃、または約２２℃～約３８℃（例えば、約１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、または約４５℃）の温度で実行することができる。例えば、第１および第２のＲＮＡフラグメントをライゲーションすることは、３７℃で実行することができる。第１および第２のＲＮＡフラグメントをライゲーションすることは、実施される方法に応じて様々な期間、例えば、約０．１～約４８時間、例えば、約０．３～約４５時間、約０．５～約４０時間、約０．７～約３５時間、約１～約３０時間、約１．５～約２５時間（例えば、約１、２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、または約４５時間）で実行することができる。いくつかの実施形態では、スプリント媒介ライゲーション反応に使用される温度および／または反応時間は、反応に使用されるＲＮＡフラグメントの数に依存せず、例えば、２つのＲＮＡフラグメントを含むスプリント媒介ライゲーションに適した反応温度および／または反応時間は、３つ以上のＲＮＡフラグメントを含むスプリント媒介ライゲーション反応に適している。
場合によっては、ｇＲＮＡの合成に続いてライゲーション反応をクエンチすることが有用である。例えば、ライゲーション反応は、プロテアーゼまたはキレート剤を使用してクエンチすることができる。プロテアーゼの非限定的な例には、プロテイナーゼＫが含まれる。キレート剤の非限定的な例には、ＥＤＴＡおよびＥＧＴＡ、または両方の組み合わせが含まれる。
場合によっては、第１および第２のＲＮＡフラグメントをライゲーションすることは、１つ以上の混雑剤を使用することをさらに含む。混雑剤の非限定的な例には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、フィコール（登録商標）、エチレングリコール、およびデキストラン、またはそれらの任意の組み合わせが含まれる。いくつかの実施形態では、１つ以上の混雑剤の使用は、２つ、３つ、またはそれ以上のＲＮＡフラグメントを含むスプリント媒介ライゲーション反応において好適である。
本明細書中に記載されている方法では、様々なリガーゼを使用することができる。例えば、リガーゼは、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼＩ、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼＩＩ、ＲｔｃＢリガーゼ、Ｔ３ ＤＮＡリガーゼ、Ｔ７ ＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼ、ＰＢＣＶ－１ ＤＮＡリガーゼ、熱安定性ＤＮＡリガーゼ（例えば、５’ＡｐｐＤＮＡ／ＲＮＡリガーゼ）、またはＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼであり得る。場合によっては、任意の２つ以上のそのようなリガーゼの組み合わせを使用することができる。
Ｔ４ ＲＮＡリガーゼＩＩは、本明細書中に記載されている方法で特に有用である。場合によっては、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼＩＩを修飾することができる。例えば、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼＩＩは、切断され得、および／または変異を含み得る。例えば、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼＩＩは、Ｋ２２７Ｑ変異および／またはＲ５５Ｋ変異を含み得る。場合によっては、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼＩＩは切断され、Ｋ２２７Ｑおよび／またはＲ５５Ｋ変異を有することができる。また、本明細書中に記載されている方法において有用なのは、ＰＢＣＶ－１ ＤＮＡリガーゼ（すなわち、ＣｈｌｏｒｅｌｌａウイルスＤＮＡリガーゼ、ＳｐｌｉｎｔＲ（登録商標）リガーゼ）である。場合によっては、リガーゼはＤＮＡリガーゼ（例えば、９°Ｎ（登録商標） ＤＮＡリガーゼ）であり得る。
本明細書に記載のいくつかの方法では、３つ以上（例えば、３つ、４つ、または５つ）のＲＮＡフラグメントをライゲーションして、ｍｌＲＮＡを合成することができる。３つ以上のＲＮＡフラグメントをライゲーションすることは、同じステップで実行することも、別個のステップで実行することもできる（段階的な方法など）。
本明細書に記載の方法は、合成後にｍｌＲＮＡを精製することをさらに含むことができる。精製により、未反応のＲＮＡフラグメントおよび／またはスプリントオリゴヌクレオチドから完全長ＲＮＡ生成物を分離できる。精製には、例えば、未反応のＲＮＡフラグメントを、例えば、５’－リン酸含有ＲＮＡに特異的なものなどのエキソヌクレアーゼを使用して酵素的に分解することが含まれ得る。例示的なエキソヌクレアーゼは、ＸＲＮ－１である。
未反応のＲＮＡフラグメントおよび／またはスプリントオリゴヌクレオチドからの完全長ＲＮＡ生成物の精製は、限外濾過またはクロマトグラフィー法を使用して実行することもできる。クロマトグラフィー法の非限定的な例には、逆相ＨＰＬＣ、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、強陰イオン交換ＨＰＬＣまたは弱陰イオン交換ＨＰＬＣ）、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣＭＳ）、キャピラリークロマトグラフィー（ＣＥ）、キャピラリーゲルクロマトグラフィー（ＣＧＥ）、およびポリアクリルアミドゲル精製が含まれる。
本明細書に記載の方法のいずれかを使用して、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の全部または一部分を含むＲＮＡ分子を合成する方法も本明細書に提供される。ＲＮＡ分子は、任意選択で精製され、全長ｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ）を生成するために使用され得る。全長ｓｇＲＮＡを生成するには、スプリントオリゴヌクレオチドを使用して、スペーサーおよび最小ＣＲＩＳＰＲ反復（ｃｒＲＮＡなど）を含む追加のＲＮＡフラグメントを以前に合成したＲＮＡ分子とライゲーションする。これらの方法は、例えば、対応するスペーサー配列を含むＲＮＡフラグメントを、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の全部または一部分を含む以前に合成されたＲＮＡ分子にライゲーションすることによって、任意の標的ＤＮＡ配列に特異的な全長ｇＲＮＡを生成することができる。図３は、スプリントオリゴヌクレオチドを使用して、ＲＮＡフラグメントのうちの２つ（フラグメントＩＩおよびＩＩＩ）が最初にライゲーションされて、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の一部分を含む不変ＲＮＡ構築物を形成する３－フラグメントシステムを示す代表的な概略図である。このＲＮＡ生成物は、例えば、後で使用するために精製および保存することができる。次に、特定の標的ＤＮＡに相補的な配列を含むＲＮＡフラグメントＩ’を、以前に合成されたＲＮＡ構築物と組み合わせて、全長ｇＲＮＡを形成することができる。
ＩＩＩ．ＲＮＡフラグメント
本開示に記載されるようにｍｌＲＮＡを合成する方法は、５’リン酸部分を含む末端領域を含む第１のＲＮＡフラグメント、および３’ヒドロキシル基を含む末端領域を含む第２のＲＮＡフラグメントを提供することを含み、ＲＮＡは、第１および第２のＲＮＡフラグメントをライゲーションすることによって合成される。ｇＲＮＡを合成する場合、第１のＲＮＡフラグメント、第２のＲＮＡフラグメント、またはその両方は、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼに結合することができる配列の少なくとも一部分を含むことができる。記載された方法によって合成される例示的なｍｌＲＮＡは、５’から３’に、第２のＲＮＡフラグメントとそれに続く第１のＲＮＡフラグメントを含むことができる。第２のＲＮＡフラグメントは、５’リン酸部分を含まない場合がある。５’リン酸部分は、例えば、５’－リン酸または５’－ホスホロチオエートであり得る。第１のフラグメント、第２のＲＮＡフラグメント、またはその両方は、標的ＤＮＡ中の配列に相補的である配列または配列の一部分を含むことができる。場合によっては、第２のＲＮＡフラグメントは、標的ＤＮＡの配列に相補的である配列を含む。
ｍｌＲＮＡは、３つ以上（例えば、３つ、４つ、５つ、または６つ）のＲＮＡフラグメントをライゲーションすることによって合成することができる。図２は、２つのスプリントオリゴヌクレオチドを使用して３つのＲＮＡフラグメントのライゲーションを示す概略図である。場合によっては、ＲＮＡは６つ未満のＲＮＡフラグメントをライゲーションすることによって合成される。例として、ＲＮＡフラグメントＡ、Ｂ、およびＣ（５’から３’の順序で列挙）をライゲーションすることによって合成されたＲＮＡの場合、ライゲーションの前に、ＲＮＡフラグメントＡは、３’ヒドロキシル基を含むことができ、５’リン酸部分を含む場合があり、ＲＮＡフラグメントＢは、３’ヒドロキシル基および５’リン酸部分の両方を含むことができ、ＲＮＡフラグメントＣは、５’リン酸部分を含むことができ、３’ヒドロキシル基を含む場合と含まない場合がある。ＲＮＡフラグメントＡ、Ｂ、およびＣをライゲーションすることは、Ａの３’ヒドロキシル基とＢの５’リン酸部分との間のホスホジエステル結合、およびＢの３’ヒドロキシル基とＣの５’リン酸との間のホスホジエステル結合の形成を含むことができる。
ＲＮＡフラグメントのいずれかの長さは、１０～９０のヌクレオチド（例えば、１０～８５、１０～８０、１０～７５、１０～７０、１０～６５、１０～６０、１０～５５、１０～５０、１０～４５、１０～４０、１０～３５、１０～３０、１０～２５、１０～２０、１０～１５、１５～９０、１５～８５、１５～８０、１５～７５、１５～７０、１５～６５、１５～６０、１５～５５、１５～５０、１５～４５、１５～４０、１５～３５、１５～３０、１５～２５、１５～２０、２０～９０、２０～８５、２０～８０、２０～７５、２０～７０、２０～６５、２０～６０、２０～５５、２０～５０、２０～４５、２０～４０、２０～３５、２０～３０、２０～２５、２５～９０、２５～８５、２５～８０、２５～７５、２５～７０、２５～６５、２５～６０、２５～５５、２５～５０、２５～４５、２５～４０、２５～３５、２５～３０、３０～９０、３０～８５、３０～８０、３０～７５、３０～７０、３０～６５、３０～６０、３０～５５、３０～５０、３０～４５、３０～４０、３０～３５、３５～９０、３５～８５、３５～８０、３５～７５、３５～７０、３５～６５、３５～６０、３５～５５、３５～５０、３５～４５、３５～４０、４０～９０、４０～８５、４０～８０、４０～７５、４０～７０、４０～６５、４０～６０、４０～５５、４０～５０、４０～４５、４５～９０、４５～８５、４５～８０、４５～７５、４５～７０、４５～６５、４５～６０、４５～５５、４５～５０、５０～９０、５０～８５、５０～８０、５０～７５、５０～７０、５０～６５、５０～６０、５０～５５、５５～９０、５５～８５、５５～８０、５５～７５、５５～７０、５５～６５、５５～６０、６０～９０、６０～８５、６０～８０、６０～７５、６０～７０、６０～６５、６５～９０、６５～８５、６５～８０、６５～７５、６５～７０、７０～９０、７０～８５、７０～８０、７０～７５、７５～９０、７５～８５、７５～８０、８０～９０、８０～８５、または８５～９０ヌクレオチド）であり得る。第１および第２のＲＮＡフラグメントの長さは、例えば、それぞれ１０～９０ヌクレオチドであり得る。第２のＲＮＡフラグメントの長さは、約４０ヌクレオチド以下（例えば、約３５、３０、２５、２０、１５、または約１０ヌクレオチド）であり得る。場合によっては、第２のＲＮＡフラグメントの長さは、約２０ヌクレオチドであり得るが、第１のＲＮＡフラグメントの長さは、約８０ヌクレオチドであり得る。
ＲＮＡフラグメントは、１つ以上の二次構造を含むことができる。ＲＮＡ分子の二次構造（例えば、ＲＮＡフラグメントまたはｍｌＲＮＡ）は、ステムおよびループ、またはそれらの組み合わせを含むことができる。ＲＮＡ分子の二次構造の非限定的な例としては、ステムループ、ヘアピン、ヘアピンループ、テトラループ、内部ループ、バルジ、シュードノット、およびクローバーリーフが挙げられる。場合によっては、ＲＮＡフラグメントには、二次構造（例えば、ステムループ）が含まれない。本明細書に提供される方法によって合成されるＲＮＡは、ＲＮＡフラグメントのライゲーション時に形成される１つ以上のステムループ構造などの１つ以上の二次構造を含むことができるが、これらに限定されない。場合によっては、ＲＮＡフラグメント間に存在するライゲーション部位は、合成されたＲＮＡの二次構造（例えば、ステムループ構造）の部位に対応する。ライゲーション部位は、ステムループ構造のテトラループ部分またはヘリックス部分を含むがこれらに限定されない、二次構造の一部分の部位に対応し得る。
本開示の方法は、ＲＮＡフラグメントの配列に基づいて、ＲＮＡフラグメントの二次構造および／または二次構造に関連する自由エネルギーを予測することを含むことができる。ＲＮＡの二次構造を予測する方法は、当該技術分野で知られており、Ｚｕｋｅｒ ａｎｄ Ｓｔｉｅｇｌｅｒ（１９８１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，９（１）：１３３－１４８，Ｒｅｕｔｅｒ ａｎｄ Ｍａｔｈｅｗｓ（２０１０）ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １１：１２９、およびＸｉａ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３７：１４７１９－１４７３５に記載されるものを含む。ＲＮＡの二次構造は、Ｍａｔｈｅｗｓ ａｎｄ Ｔｕｒｎｅｒ（２００６）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１６：２７０－２７８に記載されるもののような、自由エネルギーの最小化によってＲＮＡの配列から予測できる。ＲＮＡの二次構造予測のためのソフトウェアの非限定的な例は、ｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ｌｉｓｔ＿ｏｆ＿ＲＮＡ＿ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ＿ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ＿ｓｏｆｔｗａｒｅから入手可能なＵＲＬを参照することができる。
修飾
ＲＮＡフラグメントは１つ以上の修飾を含むことができる。例えば、ＲＮＡフラグメントは、ＲＮＡ骨格に少なくとも１つの修飾を含み得る。骨格修飾の非限定的な例としては、２’メトキシ（２’ＯＭｅ）、２’フッ素（２’フルオロ）、２’－Ｏ－メトキシ－エチル（ＭＯＥ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、アンロックド核酸（ＵＮＡ）、架橋核酸、２’デオキシ核酸（ＤＮＡ）、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）が挙げられる。代替的または追加的に、ＲＮＡフラグメントは、少なくとも１つの塩基修飾を含むことができる。塩基修飾の非限定的な例としては、２－アミノプリン、イノシン、チミン、２，６－ジアミノプリン、２－ピリミジノン、および５－メチルシトシンが挙げられる。場合によっては、ＲＮＡフラグメントは、少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含む。
ＲＮＡフラグメントの修飾は、例えば、安定性を高め、自然免疫応答の可能性または程度を減らし、かつ／または他の属性を高めるために使用することができ、新しい種類の修飾が定期的に開発されている。様々な種類の修飾の実例として、修飾は、２’－Ｏ－アルキル、２’－Ｏ－アルキル－Ｏ－アルキル、または２’－フルオロ修飾ヌクレオチドなどであるが、これらに限定されない、糖の２’位置で修飾された１つ以上のヌクレオチドを含むことができる。。ＤＮＡ（２’デオキシ－）ヌクレオチド置換もまた、検討される。ＲＮＡの修飾の非限定的な例としてはまた、ピリミジンのリボース上の２’－フルオロ、２’－アミノ、２’Ｏ－メチル修飾、およびＲＮＡの３’末端での塩基残基または逆塩基が挙げられる。そのような修飾は、オリゴヌクレオチドに組み込まれ、これらのオリゴヌクレオチドは、所与の標的に対する２’－デオキシオリゴヌクレオチドよりも高いＴｍ（すなわち、より高い標的結合親和性）を有することが示されている。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＲＮＡフラグメントの修飾は、ＲＮＡフラグメント中の１つ以上のヌクレオシドの２’Ｏ－メチル修飾を含む。
本明細書に記載の実施形態のいずれかによるＲＮＡフラグメントは、例えば、天然の核酸と比較してヌクレアーゼ消化に対する耐性を増加させる修飾を含むことができる。場合によっては、修飾核酸は、例えば、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、短鎖アルキルまたはシクロアルキル糖間結合、および短鎖ヘテロ原子または複素環式糖間結合から選択される修飾骨格を含む。核酸は、ホスホロチオエート骨格またはヘテロ原子骨格、例えば、ＣＨ２－ＮＨ－Ｏ－ＣＨ２、ＣＨ－Ｎ（ＣＨ３）－Ｏ－ＣＨ２（メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ骨格として知られている）、ＣＨ２－Ｏ－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ２、ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ３）－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ２およびＯ－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ２－ＣＨ２骨格、アミド骨格（Ｄｅ Ｍｅｓｍａｅｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，２８（９）：３６６－３７４を参照）、モルフォリノ骨格構造物（Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ ａｎｄ Ｗｅｌｌｅｒ、米国特許第５，０３４，５０６号を参照）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）骨格（オリゴヌクレオチドのホスホジエステル骨格は、ポリアミド骨格で置き換えられ、ヌクレオチドは、ポリアミド骨格のアザ窒素原子に直接または間接的に結合している、Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４（５０３７）：１４９７－１５００を参照）を有することができる。リン含有結合には、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチル、ならびに３’アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含む他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’－アミノホスホルアミデートおよびアミノアルキルホスホルアミデートを含むホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、ならびに正常な３’－５’結合を有するボラノホスフェート、これらの２’－５’結合した類似体、ならびに反転極性を有するものが含まれるが、これらに限定されず、ヌクレオシド単位の隣接対が３’－５’と５’－３’または２’－５’と５’－２’に結合されており、米国特許第３，６８７，８０８号、同第４，４６９，８６３号、同第４，４７６，３０１号、同第５，０２３，２４３号、同第５，１７７、１９６号、同第５，１８８，８９７号、同第５，２６４，４２３号、同第５，２７６，０１９号、同第５，２７８，３０２号、同第５，２８６，７１７号、同第５，３２１，１３１号、同第５，３９９，６７６号、同第５，４０５，９３９号、同第５，４５３，４９６号、同第５，４５５、２３３号、同第５，４６６，６７７号、同第５，４７６，９２５号、同第５，５１９，１２６号、同第５，５３６，８２１号、同第５，５４１，３０６号、同第５，５５０，１１１号、同第５，５６３、２５３号、同第５，５７１，７９９号、同第５，５８７，３６１号、および同第５，６２５，０５０号を参照されたい。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＲＮＡフラグメントの修飾は、ＲＮＡフラグメントの骨格における１つ以上のホスホロチオエート結合を含む。
モルフォリノ系オリゴマー化合物は、Ｂｒａａｓｃｈ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４１（１４）：４５０３－４５１０、Ｇｅｎｅｓｉｓ，Ｖｏｌｕｍｅ ３０，Ｉｓｓｕｅ ３，（２００１）Ｗｉｌｅｙ Ｏｎｌｉｎｅ Ｌｉｂｒａｒｙ；Ｈｅａｓｍａｎ（２００２）Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，２４３（２）：２０９－２１４、Ｎａｓｅｖｉｃｉｕｓ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２６（２）：２１６－２２０、Ｌａｃｅｒｒａ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７（１７）：９５９１－９５９１、および米国特許第５，０３４，５０６号に記載されている。シクロヘキセニル核酸オリゴヌクレオチド模倣物は、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２２（３６）：８５９５－８６０２に記載されている。
本明細書に記載の実施形態のいずれかによるＲＮＡフラグメントは、リン原子を内部に含まない骨格、例えば、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または１つ以上の短鎖ヘテロ原子もしくは複素環ヌクレオシド間結合によって形成される骨格を含むことができる。これらは、モルフォリノ結合（ヌクレオシドの糖部分から一部形成される）を有するもの、シロキサン骨格、硫化物、スルホキシドおよびスルホン骨格、ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格、メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格、アルケン含有骨格、スルファメート骨格、メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格、スルホン酸およびスルホンアミド骨格、アミド骨格、ならびにＮ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２構成部品が混合しているものを含、み、例えば、米国特許第５，０３４，５０６号、同第５，１６６，３１５、同第５，１８５，４４４、同第５，２１４，１３４、同第５，２１６，１４１、同第５，２３５，０３３、同第５，２６４，５６２、同第５，２６４，５６４、同第５，４０５，９３８、同第５，４３４，２５７、同第５，４６６，６７７、同第５，４７０，９６７、同第５，４８９，６７７、同第５，５４１，３０７、同第５，５６１，２２５、同第５，５９６，０８６、同第５，６０２，２４０、同第５，６１０，２８９、同第５，６０２，２４０、同第５，６０８，０４６、同第５，６１０，２８９、同第５，６１８，７０４、同第５，６２３，０７０、同第５，６６３，３１２、同第５，６３３，３６０、同第５，６７７，４３７号、および同第５，６７７，４３９号を参照されたい。
本明細書に記載の実施形態のいずれかによるＲＮＡフラグメントは、例えば、２’位に以下のうちの１つ：ＯＨ、ＳＨ、ＳＣＨ３、Ｆ、ＯＣＮ、ＯＣＨ３、ＯＣＨ３Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、もしくはＯ（ＣＨ２）ｎＣＨ３（式中、ｎは、１～１０である）、Ｃ１～Ｃ１０低級アルキル、アルコキシアルコキシ、置換低級アルキル、アルカリルもしくはアラルキル、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、Ｏ－、Ｓ－、もしくはＮアルキル、Ｏ－、Ｓ－、もしくはＮ－アルケニル、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、挿入剤、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善するための基、またはオリゴヌクレオチドおよび同様の特性を有する他の置換基の薬力学的特性を改善するための基を含む１つ以上の置換糖部位を含むことができる。例えば、修飾には２’－メトキシエトキシ（２’－Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）としても知られる）を含めることができる（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，７８（２）：４８６－５０４）。他の修飾は、２’－メトキシ（２’－Ｏ－ＣＨ３）、２’－プロポキシ（２’－ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）および２’－フルオロ（２’－Ｆ）を含む。同様の修飾は、オリゴヌクレオチドの他の位置、特に３’末端ヌクレオチド上の糖の３’位および５’末端ヌクレオチドの５’位で行うこともできる。オリゴヌクレオチドはまた、ペントフラノシル基の代わりにシクロブチルなどの糖模倣物を有していてもよい。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド単位の糖およびヌクレオシド間結合の両方、例えば、骨格は、新規の基で置き換えられる。塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。そのようなオリゴマー化合物の１つである、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されているオリゴヌクレオチド模倣物は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と呼ばれる。ＰＮＡ化合物において、オリゴヌクレオチドの糖骨格は、例えば、アミノエチルグリシン骨格などの骨格を含むアミドで置き換えられる。核酸塩基は保持され、直接または間接的に骨格のアミド部分のアザ窒素原子に結合される。ＰＮＡ化合物の調製を教示する代表的な米国特許としては、米国特許第５，５３９，０８２号、同第５，７１４，３３１号、および同第５，７１９，２６２号が挙げられるが、これらに限定されない。ＰＮＡ化合物のさらなる教示は、Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４（５０３７）：１４９７－１５００中に見出すことができる。本明細書に記載されるＲＮＡフラグメントは、２’－Ｏ－チオノーカルバメートＭＰ（２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホノーアセテート）およびＭＳＰ（Ｏ－メチル－３’－チオホスホノーアセテート）を含むことができる（Ｒｙａｎ ｅｔ ａｌ．，（２０１７）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４６（２）：７９２－８０３）。
本明細書に記載のＲＮＡフラグメントは、シュードウリジン、Ｎ１－メチルシュードウリジン、および５－メトキシウリジンからなる群から選択される１つ以上の修飾を含むことができる。例えば、１つ以上のＮ１－メチルシュードウリジンをＲＮＡフラグメントに組み込んで、哺乳動物細胞（例えば、ヒトおよびマウスの細胞）などの動物細胞において、ＲＮＡ安定性を高め、免疫原性を低下させることができる。Ｎ１－メチルシュードウリジン修飾は、１つ以上の５－メチルシチジンと組み合わせて組み込むこともできる。
例えば、Ｔｒｉｌｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ａｘｏｌａｂｓ，Ｂｉｏ－Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｉｎｃ．、ａｎｄ Ｄｈａｒｍａｃｏｎを含む、修飾ＲＮＡの多数の市販の業者が存在する。Ｔｒｉｌｉｎｋに記載されているように、例えば、５－メチル－ＣＴＰを使用して、ヌクレアーゼ安定性の増加または先天性免疫受容体とインビトロ転写ＲＮＡとの相互作用の低減などの望ましい特性を付与することができる。５’－メチルシチジン－５’－三リン酸（５－メチル－ＣＴＰ）、Ｎ６－メチル－ＡＴＰ、および疑似ＵＴＰト２－チオ－ＵＴＰも、Ｋｏｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２９：１５４－１５７およびＷａｒｒｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１０） Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，７（５）：６１８－６３０に示されるように培養およびインビボでの自然免疫刺激を低下させることが示されている。
ＲＮＡフラグメントは、生来の抗ウイルス応答をバイパスするように設計された修飾を組み込むことができる。例えば、Ｗａｒｒｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，７（５）：６１８－６３０を参照されたい。例えば、ＲＮＡは、５－メチル－ＣＴＰ、ｐｓｅｕｄｏ－ＵＴＰ、および／またはアンチリバースキャップアナログ（ＡＲＣＡ）を組み込んだ酵素的に合成されたＲＮＡであり得る。例えば、Ｗａｒｒｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，７（５）：６１８－６３０を参照されたい。
ＲＮＡの安定性を高め、自然免疫応答を低減し、かつ／または他の利点を達成するために、多種多様な修飾が開発および適用されてきた。例えば、Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．によるレビュー（２０１１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃ．Ｅｎｇ．，２：７７－９６、Ｇａｇｌｉｏｎｅ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｍｉｎｉ Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１０（７）：５７８－５９５、Ｃｈｅｒｎｏｌｏｖｓｋａｙａ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１２（２）：１５８－１６７、Ｄｅｌｅａｖｅｙ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍ．，３９（１）：１６．３．１－１６．３．２２、Ｂｅｈｌｋｅ（２００８）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１８（４）：３０５－３１９、Ｆｕｃｉｎｉ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｔｈｅｒ．，２２（３）：２０５－２１０、Ｂｒｅｍｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｆｒｏｎｔ．Ｇｅｎｅｔ．，３：１５４を参照されたい。
模倣物
ＲＮＡフラグメントは、核酸模倣物であり得る。ポリヌクレオチドに適用される「模倣物」という用語は、フラノース環のみ、またはフラノース環およびヌクレオチド間結合の両方が非フラノース基で置き換えられているポリヌクレオチドを含むことを意図している。フラノース環のみの置換は、当該技術分野では糖代替物とも呼ばれる。複素環式塩基部分または修飾された複素環式塩基部分は、適切な標的核酸とのハイブリダイゼーションのために維持される。そのような核酸の１つである、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されているポリヌクレオチド模倣物は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と呼ばれる。ＰＮＡでは、ポリヌクレオチドの糖骨格は、アミド含有骨格、特にアミノエチルグリシン骨格で置き換えられている。ヌクレオチドは保持され、直接または間接的に骨格のアミド部分のアザ窒素原子に結合される。ＰＮＡ化合物の調製を教示する代表的な米国特許としては、米国特許第５，５３９，０８２号、同第５，７１４，３３１号、および同第５，７１９，２６２が挙げられるが、これらに限定されない。場合によっては、本明細書に記載のＲＮＡフラグメントは、ＰＮＡである。
ＲＮＡフラグメントは、モルフォリノ環に結合した複素環式塩基を有する連結されたモルフォリノ単位（モルフォリノ核酸）に基づくポリヌクレオチド模倣物であり得る。モルフォリノ核酸中のモルフォリノモノマー単位を連結する多数の連結基が報告されている。非イオン性オリゴマー化合物を与えるために、１つの分類の連結基が選択されている。モルフォリノ系ポリヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの非イオン性模倣物であり、細胞タンパク質との望ましくない相互作用を形成する可能性が低い（Ｂｒａａｓｃｈ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４１（１４）：４５０３－４５１０）。モルフォリノ系ポリヌクレオチドは、米国特許第５，０３４，５０６号に開示されている。ポリヌクレオチドのモルフォリノ分類内の様々な化合物が調製されており、単量体サブユニットを結合する様々な異なる連結基を有する。
ＲＮＡフラグメントは、シクロヘキセニル核酸（ＧｅＮＡ）と呼ばれるポリヌクレオチド模倣物であり得、ＤＮＡ／ＲＮＡ分子に通常存在するフラノース環がシドヘキセニル環で置き換えられている。ＧｅＮＡ ＤＭＴで保護されたホスホロアミダイトモノマーが調製され、古典的なホスホロアミダイト化学に続くオリゴマー化合物合成に使用されている。完全に修飾されたＧｅＮＡオリゴマー化合物およびＧｅＮＡで修飾された特定の位置を有するオリゴヌクレオチドが調製され、研究されている（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２２（３６）：８５９５－８６０２を参照）。ＧｅＮＡ構造を天然の核酸構造に組み込む研究は、ＮＭＲおよび円二色性によって容易なコンフォメーション適応を進めることが示された。
ＲＮＡフラグメントはロックド核酸（ＬＮＡ）であり、２’－ヒドロキシル基が糖環の４’炭素原子に連結し、２’－Ｃ，４’－Ｃ－オキシメチレン結合を形成し、それによって二環式糖部分を形成する。特定の態様では、結合は、２’酸素原子と４’炭素原子とを架橋するメチレン（－ＣＨ２）ｎ基であり、式中、ｎは１または２である（Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，４：４５５－４５６）。ＬＮＡおよびＬＮＡ類似体は、相補的ＤＮＡおよびＲＮＡ（Ｔｍ＝＋３～＋１０℃）、３’－エキソヌクレアーゼ分解に対する安定性、および良好な溶解特性を備えた非常に高い二重熱安定性を示す。ＬＮＡを含む強力で非毒性のアンチセンスオリゴヌクレオチドが記載されている（Ｗａｈｌｅｓｔｅｄｔ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ，９７（１０）：５６３３－５６３８）。ＬＮＡモノマーであるアデニン、シトシン、グアニン、５－メチルシトシン、チミン、およびウラシルの合成および調製、およびそれらのオリゴマー化、および核酸認識特性が説明されている（Ｋｏｓｈｋｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５４（１４）：３６０７－３６３０）。ＬＮＡおよびその調製は、ＷＯ９８／３９３５２およびＷＯ９９／１４２２６に記載されている。
修飾された糖部分
ＲＮＡフラグメントは、例えば、ＯＨ、Ｆ、Ｏ－、Ｓ－、もしくはＮアルキル、Ｏ－Ｓ－、もしくはＮ－アルケニル、Ｏ－、Ｓ－もしくはＮ－アルキニル、またはＯ－アルキル－Ｏ－アルキルから選択される糖置換基を含む１つ以上の置換糖部分を含むことができ、アルキル、アルケニルおよびアルキニルは、置換または非置換Ｃ１～Ｃ１０アルケニルまたはＣ２～Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルであり得る。特に適しているのは、Ｏ（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨｚ）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ（（ＣＨ２）ｎＣＨ３）２であり、式中、ｎおよびｍは、１～約１０である。他のＲＮＡフラグメントは、Ｃ１～Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、アルアルキル、Ｏ－アルカリルまたはＯ－アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、およびＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善するための基、またはオリゴヌクレオチドの薬物力学的特性を改善するための基、ならびに同様の特性を有する他の置換基から選択される好適な糖置換基を含む。好適な修飾としては、２’－メトキシエトキシ２’－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２ＯＣＨ３（－２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）または２’－ＭＯＥとしても知られる）例えば、アルコキシアルコキシ基が含まれる（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，７８（２）：４８６－５０４）。さらなる好適な修飾としては、２’－ジメチルアミノオキシエトキシ、例えば、以下の本明細書の実施例に記載される２’－ＤＭＡＯＥとしても知られるＯ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基、および２’ジメチルアミノエトキシエトキシ（２’－Ｏ－ジメチル－アミノエトキシエチルまたは２’ＤＭＡＥＯＥとしても当該分野で知られている）、例えば２’－Ｏ－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ３）２が含まれる。
他の好適な糖置換基としては、メトキシ（－Ｏ－ＣＨ３）、アミノプロポキシ（－Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、アリル（－ＣＨ２－ＣＨ＝ＣＨ２）、－Ｏ－アリル（－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ＝ＣＨ２）およびフルオロ（Ｆ）が挙げられる。２’修飾は、アラビノ（上）位またはリボ（下）位にあってもよい。好適な２’－アラビノ修飾は２’－Ｆである。同様の修飾はまた、オリゴマー化合物の他の位置、例えば、３’末端ヌクレオチド上の糖の３’位、または２’－５’結合オリゴヌクレオチド中、および５’末端ヌクレオチドの５’位で行ってもよい。オリゴヌクレオチドはまた、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分などの糖模倣物を有していてもよい。
塩基修飾および置換
本明細書に記載の実施形態のいずれかによるＲＮＡフラグメントは、追加的または代替的に、核酸塩基（当該技術分野では単に「塩基」と呼ばれることが多い）修飾または置換を含むことができる。本明細書で使用される場合、「未修飾」または「天然」核酸塩基には、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、およびウラシル（Ｕ）が含まれる。修飾された核酸塩基には、天然核酸に稀にまたは一時的にしか見られない核酸塩基、例えば、ヒポキサンチン、６－メチルアデニン、５－Ｍｅピリミジン、特に５－メチルシトシン（５－メチル－２’デオキシシトシンとも呼ばれ、当該技術分野ではしばしば５－Ｍｅ－Ｃと呼ばれる）、５－ヒドロキシメチルシトシン（ＨＭＣ）、グリコシルＨＭＣおよびゲントビオシルＨＭＣ、ならびに合成核酸塩基、例えば、２－アミノアデニン、２－（メチルアミノ）アデニン、２－（イミダゾリルアルキル）アデニン、２－（アミノアルキルアミノ）アデニン、または他のヘテロ置換アルキルアデニン、２－チオウラシル、２－チオチミン、５－ブロモウラシル、５－ヒドロキシメチルウラシル、８－アザグアニン、７－デアザグアニン、Ｎ６（６－アミノヘキシル）アデニン、および２，６－ジアミノプリンが含まれる（Ｋｏｒｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．（１９８０）ＤＮＡ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ（２ｎｄ ｅｄ．）（ｐｐ．７５－７７）．Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ：Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．、Ｇｅｂｅｙｅｈｕ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１５（１１）：４５１３－４５３４を参照）。当該技術分野で知られている「ユニバーサル」塩基、例えばイノシンも含むことができる。５－Ｍｅ－Ｃ置換は、核酸二重鎖の安定性が０．６～１．２℃向上することが示されており（Ｓａｎｇｈｖｉ（１９９３）．Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，（ｐｐ．２７６－２７８）．Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，（Ｅｄｓ．），Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ：ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ）塩基置換の実施形態である。
修飾された核酸塩基は、他の合成および天然の核酸塩基、例えば、５－メチルシトシン（５－ｍｅ－Ｃ）、５－ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２－アミノアデニン、６－メチルおよびアデニンとグアニンの他のアルキル誘導体、２－プロピルおよびアデニンとグアニンの他のアルキル誘導体、２－チオウラシル、２－チオチミンおよび２－チオシトシン、５－ハロウラシルおよびシトシン、５－プロピニルウラシルおよびシトシン、６－アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５－ウラシル（疑似－ウラシル）、４－チオウラシル、８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシルおよび他の置換アデニンおよびグアニン、５－ハロ、特に５－ブロモ、５－トリフルオロメチルおよび他の５－置換ウラシルおよびシトシン、７－メチルクアニンおよび７－メチルアデニン、８－アザグアニンおよび８－アザアデニン、７－デアザグアニンおよび７－デアザアデニン、ならびに３－デアザグアニンおよび３－デアザアデニンを含む。
さらに、核酸塩基には、米国特許第３，６８７，８０８号に開示されているもの、Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ（Ｅｄ．）（１９９０）．Ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，（ｐｐ．８５８－８５９）．Ｈｏｂｏｋｅｎ，Ｎ．Ｊ．：Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓによって開示されているもの、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ，３０（６）：６１３－７２２によって開示されているもの、およびＳａｎｇｈｖｉ（１９９３）Ｃｈａｐｔｅｒ １５，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，（ｐｐ．２８９－３０２），Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．（Ｅｄｓ），Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ：ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓによって開示されているものが含まれる。これらのある特定の核酸塩基は、本開示のオリゴマー化合物の結合親和性を高めるのに特に有用である。これらには、５－置換ピリミジン、６－アザピリミジン、ならびにＮ－２、Ｎ－６、および－０－６置換プリンが含まれ、２－アミノプロピルアデニン、５－プロピニルウラシル、および５－プロピニルシトシンを含む。５－メチルシトシン置換は、核酸二重鎖の安定性を０．６～１．２ｏｃ増加させることが示されており（Ｓａｎｇｈｖｉ（１９９３）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，（ｐｐ．２７６－２７８）．Ｃｒｏｏｋｅ ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ，（Ｅｄｓ．），Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ：ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ）塩基置換の実施形態であり、さらに特に２’－Ｏ－メトキシエチル糖修飾と組み合わされる場合である。修飾された核酸塩基は、例えば、米国特許第３，６８７，８０８号、および同第４，８４５，２０５号、同第５，１３０，３０２号、同第５，１３４，０６６号、同第５，１７５，２７３号、同第５，３６７，０６６号、同第５，４３２，２７２号、同第５，４５７，１８７号、同第５，４５９，２５５号、同第５，４８４，９０８号、同第５，５０２，１７７号、同第５，５２５，７１１号、同第５，５５２，５４０号、同第５，５８７，４６９号、同第５，５９６，０９１号、同第５，６１４，６１７号、同第５，６８１，９４１号、同第５，７５０，６９２号、同第５，７６３，５８８号、同第５，８３０，６５３号、同第６，００５，０９６号、ならびに米国特許出願公開第２００３／０１５８４０３号に記載されている。
核酸塩基修飾または置換を含む本明細書に記載の実施形態のいずれかによるＲＮＡフラグメントは、すべての位置が均一に修飾されているとは限らない場合がある。例えば、ＲＮＡフラグメントは、単一のヌクレオシドに組み込まれた修飾を有し得る。
ＩＶ．ＲＮＡフラグメントおよびスプリントオリゴヌクレオチドの合成
本開示によって提供されるＲＮＡフラグメントおよびスプリントオリゴヌクレオチドは、本明細書に記載されるかまたは当該技術分野で知られているオリゴヌクレオチド合成に適した任意の方法によって合成することができる。非限定的な例としては、酵素的合成および化学合成（例えば、ホスホロアミダイト化学）が挙げられる。
ＤＮＡテンプレートからＲＮＡを合成する方法は当該技術分野で知られている。例えば、ＲＮＡフラグメントおよびスプリントオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡポリメラーゼ酵素（例えば、Ｔ７ポリメラーゼ、Ｔ３ポリメラーゼ、ＳＰ６ポリメラーゼなど）を使用してインビトロで合成することができる。ホスホロアミダイト化学を使用した固相合成では、保護された２’－デオキシヌクレオシド（ｄＡ、ｄＣ、ｄＧ、およびＴ）、リボヌクレオシド（Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＵＳ）、または化学修飾ヌクレオシド、例えばＬＮＡもしくはＢＮＡのモノマーの組み立てを伴う。モノマーは、生成物の配列に必要な順序で、成長するオリゴヌクレオチド鎖に順次結合される。鎖の組み立てが完了すると、生成物は固相から溶液に放出され、脱保護され、回収される。
ＲＮＡフラグメントおよびスプリントオリゴヌクレオチドは、５’から３’の方向または３’から５’の方向に合成することができる。場合によっては、第２のＲＮＡフラグメントは５’から３’の方向に合成される。合成されたＲＮＡフラグメントおよびスプリントオリゴヌクレオチドは、これらに限定されないが、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、逆相ＨＰＬＣ、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、およびポリアクリルアミドゲル精製などの当該技術分野での既知の方法に従って、ライゲーションの前に精製することができる。
Ｖ．中程度の長さのＲＮＡ
本明細書に記載の方法のいずれかを使用して合成された例示的なｍｌＲＮＡは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）（例えば、本明細書に記載のｇＲＮＡのいずれか）である。本開示の方法によって合成されるｇＲＮＡは、単一分子ｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）または二重分子ｇＲＮＡであり得る。ｇＲＮＡは、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼとの結合により標的特異性を提供し、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼの活性を誘導する。本開示のＲＮＡは、１つ以上のスプリントを使用して、２つ以上のＲＮＡ分子（ＲＮＡフラグメントと呼ばれる）から合成することができる。例示的な二重分子ｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡおよびトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含み、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡは、互いにハイブリダイズして二本鎖を形成する。二重分子ｇＲＮＡはまた、２つのｃｒＲＮＡの二重鎖であり得る。ｇＲＮＡ二重鎖は、ｇＲＮＡおよびＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが複合体を形成するように、ＲＮＡ誘導エンドヌクレアーゼを結合することができる。ｃｒＲＮＡは、目的の標的核酸配列にハイブリダイズすることができるスペーサー配列およびｃｒＲＮＡ反復配列の両方を含む。ｔｒａｃｒＲＮＡは、任意の形式（例えば、完全長ｔｒａｃｒＲＮＡまたはアクティブな部分ｔｒａｃｒＲＮＡ）で、様々な長さにすることができる。例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡは、野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の全部または一部分（例えば、約または少なくとも２０、２６、３２、４５、４８、５４、６３、６７、８５またはそれ以上のヌクレオチド野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ配列）を含むか、またはそれらからなり得る。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来の野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の例としては、１７１－ヌクレオチド、８９－ヌクレオチド、７５－ヌクレオチドおよび６５－ヌクレオチドバージョンが挙げられる。例えば、Ｄｅｌｔｃｈｅｖａ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ ４７１：６０２－６０７およびＷＯ２０１４／０９３６６１を参照されたい。一例として、ｃｒＲＮＡは、５’から３’方向に、任意のスペーサー伸長配列、スペーサー配列、および最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列を有する。ｔｒａｃｒＲＮＡは、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列に相補的）、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列、および任意のｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列を有することができる。任意のｔｒａｃｒＲＮＡ伸長は、ｇＲＮＡに追加機能を付与する要素を有し得る、１つ以上のヘアピン構造を有することができる。ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡは、最小ＣＲＩＳＰＲ反復および最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を介してハイブリダイズし、ｇＲＮＡを形成する。
例示的なｓｇＲＮＡは、標的ＤＮＡの配列に相補的であるヌクレオチド配列、およびＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼに結合することができるヌクレオチド配列を含む。一例として、ｓｇＲＮＡは、５’から３’方向に、任意のスペーサー伸長配列、スペーサー配列、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列、単一分子ガイドリンカー、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列、および任意のｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列を有することができる。場合によっては、ｓｇＲＮＡは５’から３’方向に、最小ＣＲＩＳＰＲ反復およびスペーサー配列を有することができる。単一分子ガイドリンカーは、最小ＣＲＩＳＰＲ反復と最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を結合させて、ヘアピン構造を形成する。いくつかの実施形態では、単一分子ガイドリンカーは、テトラループである。例示的なｇＲＮＡは、例えば、ＷＯ２０１８／００２７１９に記載されている。
一般に、ＣＲＩＳＰＲ反復配列には、以下のうちの１つ以上：（１）対応するｔｒａｃｒ配列を含む細胞内のＣＲＩＳＰＲ反復シーケンスに隣接するＤＮＡ標的セグメントの切除と、（２）標的配列でのＣＲＩＳＰＲ複合体の形成と、を促進するためにｔｒａｃｒ配列と十分な相補性を有する任意の配列が含まれ、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズしたＣＲＩＳＰＲ反復配列を含む。一般に、相補性の程度は、２つの配列のうち短い方の長さに沿ったＣＲＩＳＰＲ反復配列およびｔｒａｃｒ配列の最適なアラインメントに関連している。最適なアラインメントは、任意の好適なアラインメントアルゴリズムによって決定され、ｔｒａｃｒ配列またはＣＲＩＳＰＲ反復配列のいずれか内の自己相補性などの二次構造をさらに説明する場合がある。場合によっては、最適に整列させたときの、２つのうちのより短い方の３０ヌクレオチド長に沿ったｔｒａｃｒ配列とＣＲＩＳＰＲ反復配列との間の相補性の程度は、約２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７．５％、９９％、またはそれ以上である。ｔｒａｃｒ配列は、例えば、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０以上のヌクレオチドの長さであり得る。
ｇＲＮＡのスペーサーは、標的ＤＮＡの配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む。言い換えれば、ｇＲＮＡのスペーサーは、ハイブリダイゼーション（例えば、塩基対）を介して配列特異的に標的ＤＮＡと相互作用する。このように、スペーサーのヌクレオチド配列は変化する可能性があり、ｇＲＮＡおよび標的ＤＮＡが相互作用する標的ＤＮＡ内の位置を決定する。ｇＲＮＡのスペーサーは、標的ＤＮＡ内の任意の所望の配列にハイブリダイズするように選択することができる。
スペーサーは、例えば、１０ヌクレオチド～３０ヌクレオチドの長さ（１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチドのいずれかの長さなど）を有することができる。例えば、スペーサーは、１３ヌクレオチド～２５ヌクレオチド、１５ヌクレオチド～２３ヌクレオチド、１８ヌクレオチド～２２ヌクレオチド、または２０ヌクレオチド～２２ヌクレオチドの長さを有することができる。
ｇＲＮＡのスペーサーと標的ＤＮＡの標的配列との間のパーセント配列相補性は、例えば、少なくとも約６０％（少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％のいずれかなど）であり得る。
本明細書に記載の方法によって合成されるｇＲＮＡの長さは、例えば、３０～１６０ヌクレオチド、例えば、４０～１５０、５０～１４０、６０～１３０、７０～１２０、８０～１１０、または９０～１００のヌクレオチド（例えば３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５または１５０ヌクレオチドのいずれかの長さ）であり得る。本明細書に記載の方法によって合成されたｇＲＮＡは、スペーサーを含むことができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法によって合成されるｇＲＮＡは、標的哺乳動物ＤＮＡを含むがこれに限定されない、標的ＤＮＡ中の配列に相補的である配列を含む。例えば、標的ＤＮＡは、ヒトＤＮＡであり得る。
ｍｌＲＮＡの修飾
本明細書に記載のｍｌＲＮＡは、例えば、追跡、安定性の増加、ＲＮＡを特定の細胞内位置に標的化するか、または免疫原性を低下させるのに有用な１つ以上の修飾を含むことができる。ｇＲＮＡの修飾を使用して、ｇＲＮＡおよびＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼなどのＣａｓエンドヌクレアーゼ）を含むＤＮＡ編集複合体の形成または安定性を増強することができる。ｇＲＮＡの修飾はまた、または代替として、ＤＮＡ編集複合体と標的ＤＮＡ内の標的配列との相互作用の開始、安定性、または動力学を強化するために使用することができ、例えば、標的内活性を強化するために使用することができる。ｇＲＮＡの修飾はまた、または代替として、他の（オフターゲット）部位での効果と比較して、特異性、例えば、標的内部位でのＤＮＡ編集の相対速度を高めるために使用することもできる。
修飾はまた、または代替として、例えば、細胞内に存在するリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）による分解に対する抵抗性を高めることによって、ガイドＲＮＡの安定性を高め、それにより細胞内での半減期を増加させるために使用することができる。
本明細書に記載の実施形態のいずれかによるｍｌＲＮＡは、上記の特徴のいずれかを提供する５’または３’末端のいずれかにセグメントを含むことができる。例えば、好適なセグメントとしては、リボスイッチ配列（例えば、タンパク質およびタンパク質複合体による調節された安定性および／または調節されたアクセシビリティを可能にするため）、安定性制御配列、ｄｓＲＮＡ二重鎖を形成する配列（すなわち、ヘアピン）、ＲＮＡを細胞内位置（例えば、核、ミトコンドリア、葉緑体など）に標的化する配列、追跡を提供する修飾または配列（例えば、蛍光分子への直接接合、蛍光検出を容易にする部分への接合、蛍光検出を可能にする配列など）、光または放射線に対する応答を提供する修飾または配列（例えば、ＵＶ、ｖｉｓ、ＩＲ光遺伝学的要素）、タンパク質（例えば、転写活性化因子、転写抑制因子、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡデメチラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼなどを含む、ＤＮＡに作用するタンパク質）の結合部位を提供する修飾または配列、ならびにそれらの組み合わせが挙げられる。
本明細書に記載の実施形態のいずれかによるｍｌＲＮＡは、ＲＮＡが細胞に導入されたときに、自然免疫応答を誘発する可能性または程度を低下させる修飾を含むことができる。下記および当該技術分野で説明するように、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含むＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の文脈で十分に特徴付けられているそのような応答は、ＲＮＡの半減期の低減および／またはサイトカインまたは免疫応答に関連する他の因子の誘発に関連する傾向がある。
本明細書に記載の実施形態のいずれかによるｍｌＲＮＡはまた、ＲＮＡの安定性を増強する修飾（例えば、細胞の状況において、ＲＮａｓｅによるその分解を減少させることによる）およびＲＮＡが細胞に導入されたときに自然免疫応答を誘発する可能性または程度を低下させる修飾から選択される１つ以上の修飾を含むことができる。前述のものおよび他のものなどの修飾の組み合わせも同様に使用することができる。
安定性制御配列
本明細書に記載の実施形態のいずれかによるｍｌＲＮＡは、ＲＮＡの安定性に影響を与える安定性制御配列を含むことができる。好適な安定性制御配列の非限定的な例は、転写ターミネーターセグメント（例えば、転写終結配列）である。ＲＮＡの転写ターミネーターセグメントは、約１０ヌクレオチド～約１００ヌクレオチド、例えば、約１０ヌクレオチド（ｎｔ）～約２０ｎｔ、約２０ｎｔ～約３０ｎｔ、約３０ｎｔ～約４０ｎｔ、約４０ｎｔ～約５０ｎｔ、約５０ｎｔ～約６０ｎｔ、約６０ｎｔ～約７０ｎｔ、約７０ｎｔ～約８０ｎｔ、約８０ｎｔ～約９０ｎｔ、または約９０ｎｔ～約１００ｎｔの全長を有することができる。例えば、転写ターミネーターセグメントは、約１５ヌクレオチド（ｎｔ）～約８０ｎｔ、約１５ｎｔ～約５０ｎｔ、約１５ｎｔ～約４０ｎｔ、約１５ｎｔ～約３０ｎｔ、または約１５ｎｔ～約２５ｎｔの長さを有することができる。
転写終結配列は、真核細胞および／または原核細胞で機能するものであり得る。
安定性制御配列（例えば、転写終結セグメント、または安定性の向上を提供するためのＲＮＡの任意のセグメント）に含めることができるヌクレオチド配列には、例えば、Ｒｈｏ非依存性ｔｒｐ終結部位が含まれる。
コンジュゲート
本明細書に記載の実施形態のいずれかによるｍｌＲＮＡは、ＲＮＡの活性、細胞分布、または細胞取り込みを増強する１つ以上の部分またはコンジュゲートをｇＲＮＡに化学的に連結することを含む修飾を含むことができる。これらの標的化部分またはコンジュゲートは、一級または二級ヒドロキシル基などの官能基に共有結合したコンジュゲート基を含み得る。コンジュゲート基としては、挿入剤、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬力学的特性を強化する基、およびオリゴマーの薬物動態特性を強化する基が挙げられる。好適なコンジュゲート基としては、コレステロール、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、および色素が挙げられるが、これらに限定されない。薬力学的特性を強化する基としては、取り込みを改善し、分解に対する耐性を強化し、かつ／または標的核酸との配列特異的ハイブリダイゼーションを強化する基が挙げられる。薬物動態特性を強化する基としては、核酸の取り込み、分布、代謝、または排出を改善する基が挙げられる。
本明細書に記載の実施形態のいずれかによるｍｌＲＮＡは、コレステロール部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８６（１７）：６５５３－６５５６）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，４（８）：１０５３－１０６０）、チオエーテル、例えば、ヘキシル－Ｓ－トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２）．Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，６６０（１）：３０６－３０９、およびＭａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，３（１２）：２７６５－２７７０）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０（３）：５３３－５３８）、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールもしくはウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ－Ｂｅｈｍｏａｒａｓ ｅｔ ａｌ．（１９９１）ＥＭＢＯ Ｊ．，１０（５）：１１１１－１１１８；（Ｋａｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．（１９９０）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，２５９（２）：３２７－３３０ ａｎｄ Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，７５（１－２）：４９－５４）、リン脂質、例えばジ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロールもしくはトリエチルアンモニウム１，２－ジ－Ｏ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロ－３－Ｈ－ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，３６（２１）：３６５１－３６５４；Ｓｈｅａ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８（１３）：３７７７－３７８３））、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈｏｒａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｎｕｃｌｅｏｓ．Ｎｕｃｌｅｏｔ．Ｎｕｃｌ．，１４（３－５）：９６９－９７３）、アダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，３６（２１）：３６５１－３６５４）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１２６４（２）：２２９－２３７）、またはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノカルボニル－ｔオキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２７７（２）：９２３－９３７）などの脂質部分を含むがこれらに限定されない、化学的に連結されたコンジュゲート部分を含むことができる。
本明細書に記載の実施形態のいずれかによるｍｌＲＮＡは、「タンパク質伝達ドメイン」またはＰＴＤ（細胞透過性ペプチド、またはＣＰＰとしても知られる）を含む化学的に連結されたコンジュゲートを含み得、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、炭水化物、または脂質二重層、ミセル、細胞膜、オルガネラ膜、もしくは小胞膜の通過を容易にする有機もしくは無機化合物を指し得る。別の分子に結合したＰＴＤは、小さな極性分子から大きな高分子および／またはナノ粒子の範囲であり、例えば、細胞外空間から細胞内空間へ、または細胞質ゾルから細胞小器官内へと移動する、分子が膜を通過するのを容易にする。ＰＴＤはｇＲＮＡに共有結合することができる。例示的なＰＴＤとしては、最小のウンデカペプチドタンパク質形質導入ドメイン（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号：１）を含むＨＩＶ－１ ＴＡＴの残基４７～５７に相当する）、細胞への侵入を指示するのに十分な数のアルギニンを含むポリアルギニン配列（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１０～５０個のアルギニン）、ＶＰ２２ドメイン（Ｚｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，９（６）：４８９－４９６）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａアンテナペディアタンパク質伝達ドメイン（Ｎｏｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｄｉａｂｅｔｅｓ，５２（７）：１７３２－１７３７）、切断されたヒトカルシトニンペプチド（Ｔｒｅｈｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２１（７）：１２４８－１２５６）、ポリリジン（Ｗｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７（２４）：１３００３－１３００８）が挙げられるが、これらに限定されない。ＰＴＤは、アクティブ化可能なＣＰＰ（ＡＣＰＰ）であり得る（Ａｇｕｉｌｅｒａ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｉｎｔｅｇｒ．Ｂｉｏｌ．（Ｃａｍｂ），１（５－６）：３７１－３８１）。ＡＣＰＰには、切断可能なリンカーを介して対応するポリアニオン（例えば、Ｇｌｕ９または「Ｅ９」）に接続されたポリカチオン性ＣＰＰ（例えば、Ａｒｇ９または「Ｒ９」）が含まれ、正味電荷をほぼゼロに減らし、それによって細胞への接着および取り込みを阻害する。リンカーが切断されると、ポリアニオンが放出され、ポリアルギニンおよびその固有の接着性が局所的にアンマスキングされ、ＡＣＰＰを「活性化」して膜を通過する。ＰＴＤは、ＰＴＤの生物学的利用能を高めるために化学的に修飾することができる。例示的な修飾は、Ｍａｅ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．，６（１１）：１１９５－１２０５に記載されている。
本明細書に記載の実施形態のいずれかによるｍｌＲＮＡはまた、例えば、コレステロール、トコフェロールおよび葉酸、脂質、ペプチド、ポリマー、リンカー、およびアプタマーを含む、細胞によるその送達および／または取り込みを増強することができる適用されたコンジュゲートを含むことができる。例えば、Ｗｉｎｋｌｅｒ（２０１３）Ｔｈｅｒ．Ｄｅｌｉｖ．，４（７）：７９１－８０９によるレビュー、およびそこに引用されている参考文献を参照されたい。
ＶＩ．ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ
ｇＲＮＡを合成する本明細書に開示されている方法は、一般に、第１のＲＮＡフラグメント、第２のＲＮＡフラグメントを提供することを含み、第１のＲＮＡフラグメント、第２のＲＮＡフラグメント、またはその両方は、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼに結合することができる配列の少なくとも一部分を含む。
ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、天然に存在するものであっても、非天然に存在するものであってもよい。そのようなエンドヌクレアーゼの例としては、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１およびＣｓｘ１２としても知られる）、Ｃａｓ１００、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、およびＣｐｆ１エンドヌクレアーゼ、およびそれらの機能的誘導体が挙げられる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼである。Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ＳｐｙＣａｓ９）、黄色ブドウ球菌（ＳｌｕＣａｓ９）、またはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＳａＣａｓ９）に由来する可能性があります。場合によっては、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９のバリアントであり、Ｃａｓ９のバリアントは、低分子Ｃａｓ９、不活性型Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）、およびＣａｓ９ニッカーゼからなる群から選択される。
ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、低分子ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼであり得る。低分子ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、本明細書に記載され、当該技術分野で知られているＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼのいずれかに由来するＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼの一部分から操作することができる。低分子ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、例えば、低分子Ｃａｓエンドヌクレアーゼであり得る（例えば、ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０６５８６３、ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０２３０４４）。場合によっては、低分子ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、例えば、約１，１００の長さのアミノ酸よりも小さい。
ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、変異型ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼであり得る。例えば、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、天然に存在するＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼの変異体であり得る。変異型ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼはまた、変化したエンドヌクレアーゼ活性（例えば、ＤＮＡへの結合親和性を実質的に低下させることなく変化したまたは抑止されたＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性）などの天然に存在するＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼと比較して変化した活性を有する変異型ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼであり得る。そのような修飾により、転写調節（例えば、活性化または抑制）、メチル化、脱メチル化、アセチル化もしくは脱アセチル化によるエピジェネティック修飾もしくはクロマチン修飾、または当該技術分野で知られているＤＮＡ結合および／またはＤＮＡ修飾タンパク質の他の修飾を目的とした変異型ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼの配列特異的ＤＮＡ標的が可能になる。場合によっては、変異型ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼにはＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を有しない。
ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、標的ＤＮＡの相補鎖を切断するが標的ＤＮＡの非相補鎖を切断する能力が低下しているか、または標的ＤＮＡの非相補鎖を切断するが標的ＤＮＡの相補鎖を切断する能力が低下しているニッカーゼである可能性がある。場合によっては、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、標的ＤＮＡの相補鎖および非相補鎖の両方を切断する能力が低下している。
ＶＩＩ．ｓｇＲＮＡを合成する方法
いくつかの実施形態では、本開示は、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼとともに使用するためのｓｇＲＮＡを合成するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、ＳｐｙＣａｓ９、ＳａＣａｓ９、またはＳｌｕＣａｓ９エンドヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９バリアントである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、低分子ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、低分子Ｃａｓエンドヌクレアーゼである。
いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、５’から３’に、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含み、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡは、ハイブリダイズして二本鎖を形成する。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡは、標的核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ分子）中の標的配列を標的とすることができるスペーサー配列およびｃｒＲＮＡ反復配列を含む。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡ逆反復配列および３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含む。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡ反復配列の３’末端は、例えば、テトラループによって、ｔｒａｃｒＲＮＡ逆反復配列の５’末端に連結され、ｃｒＲＮＡ反復配列およびｔｒａｃｒＲＮＡ逆反復配列は、ハイブリダイズして、ｓｇＲＮＡを形成する。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、５’から３’に、スペーサー配列、ｃｒＲＮＡ反復配列、テトラループ、ｔｒａｃｒＲＮＡ逆反復配列、および３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、５’スペーサー伸長配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、３’ｔｒａｃｒＲＮＡは、１つ以上のステムループを含む。いくつかの実施形態では、３’ｔｒａｃＲＮＡは、１つ、２つ、３つ、またはそれ以上のステムループを含む。いくつかの実施形態では、３’ｔｒａｃｒＲＮＡは、１つ、２つ、または３つのステムループからなる。
いくつかの実施形態では、この方法は、２つのＲＮＡフラグメントおよび１つのスプリントオリゴヌクレオチドを含むスプリント媒介ライゲーション手法を使用してｓｇＲＮＡを合成することを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、第１のＲＮＡフラグメント、第２のＲＮＡ、およびスプリントオリゴヌクレオチドの間で形成された複合体、ならびにリガーゼを提供することを含み、（ａ）第１のＲＮＡフラグメントは、３’ヒドロキシル基を含む末端領域を含み、（ｂ）第２のＲＮＡフラグメントは、５’リン酸部分を含む末端領域を含み、（ｃ）スプリントオリゴヌクレオチドは、（ｉ）第１のＲＮＡフラグメントの３’ヒドロキシル基を含む末端領域に相補的な第１の部分、および（ｉｉ）第２のＲＮＡフラグメントの５’リン酸部分を含む第１の末端領域に相補的な第２の部分を含み、複合体は、（ａ）および（ｃ）（ｉ）のハイブリダイゼーションおよび（ｂ）および（ｃ）（ｉｉ）のハイブリダイゼーションによって形成され、複合体は、第１のＲＮＡフラグメントの３’ヒドロキシル基および第２のＲＮＡフラグメントの５’リン酸基間に存在するライゲーション部位を含み、リガーゼは、ライゲーション部位でのライゲーションをもたらして、第１のＲＮＡフラグメントの３’ヒドロキシル基と第２のＲＮＡフラグメントの５’リン酸基との間にホスホジエステル結合を形成しライゲーションは、５’から３’に、スペーサー配列および不変配列を含むｓｇＲＮＡを形成し、不変配列が、ｃｒＲＮＡ反復配列とｔｒａｃｒＲＮＡ逆反復配列との間に形成された二本鎖、および少なくとも１つのステムループを含む３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含み、それによってｓｇＲＮＡを合成する。いくつかの実施形態では、ライゲーション部位は、ｃｒＲＮＡ反復配列とｔｒａｃｒＲＮＡ逆反復配列との間に形成された二本鎖の部位に対応する。いくつかの実施形態では、ライゲーション部位は、ｃｒＲＮＡ反復配列、ｃｒＲＮＡ反復配列およびｔｒａｃＲＮＡ逆反復配列を結合するテトラループ、またはｔｒａｃｒＲＮＡ逆反復配列にある。いくつかの実施形態では、ライゲーション部位は、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列のステムループ内にある。いくつかの実施形態では、第１のＲＮＡフラグメントは、ライゲーション部位の５’であるｓｇＲＮＡのヌクレオチド配列を含み、第２のＲＮＡフラグメントは、ライゲーション部位の３’であるｓｇＲＮＡのヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、この方法は、３つのＲＮＡフラグメントおよび２つのスプリントオリゴヌクレオチドを含むスプリント媒介ライゲーション手法を使用してｓｇＲＮＡを合成することを含む。いくつかの態様では、この方法は、第１のＲＮＡフラグメント、第２のＲＮＡフラグメント、第３のＲＮＡフラグメント、第１のスプリントオリゴヌクレオチド、および第２のスプリントオリゴヌクレオチドの間で形成された複合体、ならびにリガーゼを提供することを含み、（ａ）第１のＲＮＡフラグメントは、（ｉ）３’ヒドロキシル基を含む末端領域を含み、（ｂ）第２のＲＮＡフラグメントは、（ｉ）５’リン酸部分を含む第１の末端領域、および（ｉｉ）３’ヒドロキシル基を含む第２の末端領域を含み、（ｃ）第３のＲＮＡフラグメントは、（ｉ）５’リン酸部分を含む末端領域を含み、（ｄ）第１のスプリントオリゴヌクレオチドは、（ｉ）第１のＲＮＡフラグメントの３’ヒドロキシル基を含む末端領域に相補的な第１の部分、および（ｉｉ）第２のＲＮＡフラグメントの５’リン酸部分を含む第１の末端領域に相補的な第２の部分を含み、（ｅ）第２のスプリントオリゴヌクレオチドは、（ｉ）第２のＲＮＡフラグメントの３’ヒドロキシル基を含む第２の末端領域に相補的な第１の部分、および（ｉｉ）第３のＲＮＡフラグメントの５’リン酸を含む末端領域に相補的な第２の部分を含み、複合体は、（ａ）（ｉ）および（ｄ）（ｉ）、（ｂ）（ｉ）および（ｄ）（ｉｉ）、（ｂ）（ｉｉ）および（ｅ）（ｉ）、ならびに（ｃ）（ｉ）および（ｅ）（ｉｉ）のハイブリダイゼーションによって形成され、複合体は、第１のＲＮＡフラグメントの３’ヒドロキシル基および第２のＲＮＡフラグメントの５’リン酸基間に存在する第１のライゲーション部位、ならびに第２のＲＮＡフラグメントの３’ヒドロキシル基および第３のＲＮＡフラグメントの５’リン酸基間に存在する第２のライゲーション部位を有し、リガーゼは、第１のライゲーション部位でのライゲーションをもたらして、第１のＲＮＡフラグメントの３’ヒドロキシル基と第２のＲＮＡフラグメントの５’リン酸基との間にホスホジエステル結合を形成し、第２のライゲーション部位でのライゲーションをもたらして、第２のＲＮＡフラグメントの３’ヒドロキシル基と第３のＲＮＡフラグメントの５’リン酸基との間にホスホジエステル結合を形成し、ライゲーションは、５’から３’に、スペーサー配列および不変配列を含むｓｇＲＮＡを形成し、不変配列が、ｃｒＲＮＡ反復配列とｔｒａｃｒＲＮＡ逆反復配列との間に形成された二本鎖、および少なくとも１つのステムループを含む３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含み、それによってｓｇＲＮＡを合成する。
いくつかの実施形態では、第１のライゲーション部位は、ｃｒＲＮＡ反復配列とｔｒａｃｒＲＮＡ逆反復配列との間に形成された二本鎖の部位に対応する。いくつかの実施形態では、第１のライゲーション部位は、ｃｒＲＮＡ反復配列、ｃｒＲＮＡ反復配列およびｔｒａｃＲＮＡ逆反復配列を結合するテトラループ、またはｔｒａｃｒＲＮＡ逆反復配列にある。
いくつかの実施形態では、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、第１、第２、および第３のステムループを含む。いくつかの実施形態では、第２のライゲーション部位は、第１のステムループ、第２のステムループ、または第３のステムループの部位に対応する。いくつかの実施形態では、第２のライゲーション部位は、第２のステムループ内の部位に対応する。いくつかの実施形態では、第２のライゲーション部位は、第２のステムループの５’ステムの部位、第２のステムループのテトラループの部位、または第２のステムループの３’ステムの部位に対応する。いくつかの実施形態では、第２のライゲーション部位は、（ｉ）第２のステムループの５’ステムの基部に直接隣接するか、（ｉｉ）第２のステムループの５’ステムの基部に近位するか（例えば、５’ステムの基部から±１ｎｔ、±２ｎｔ、または±３ｎｔ）、（ｉｉｉ）第２のステムループの３’ステムの基部に直接隣接するか、または（ｉｖ）第２のステムループの３’ステムの基部に近位する（例えば、３’ステムの基部から±１ｎｔ、±２ｎｔ、または±３ｎｔ）。
いくつかの実施形態では、第１のＲＮＡフラグメントは、第１のライゲーション部位の５’であるｓｇＲＮＡのヌクレオチド配列を含み、第２のＲＮＡフラグメントは、第１のライゲーション部位の３’および第２のライゲーション部位の５’であるｓｇＲＮＡのヌクレオチド配列を含み、第３のＲＮＡフラグメントは、第２のライゲーション部位の３’であるｓｇＲＮＡのヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、第１のＲＮＡフラグメントは、５’から３’に、スペーサー配列、およびｓｇＲＮＡのｃｒＲＮＡ反復配列の一部分を含む。いくつかの実施形態では、第１のＲＮＡフラグメントは、５’から３’に、スペーサー配列、およびｓｇＲＮＡのｃｒＲＮＡ反復配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のＲＮＡフラグメントは、５’から３’に、スペーサー配列、ｃｒＲＮＡ反復配列、およびｓｇＲＮＡのテトラループの一部分を含む。いくつかの実施形態では、第１のＲＮＡフラグメントは、５’から３’に、スペーサー配列、ｃｒＲＮＡ反復配列、およびｓｇＲＮＡのテトラループを含む。いくつかの実施形態では、第１のＲＮＡフラグメントは、５’から３’に、スペーサー配列、ｃｒＲＮＡ反復配列、テトラループ、およびｓｇＲＮＡのｔｒａｃＲＮＡ反復配列の一部分を含む。いくつかの実施形態では、第１のＲＮＡフラグメントは、５’から３’に、スペーサー配列、ｃｒＲＮＡ反復配列、テトラループ、およびｓｇＲＮＡのｔｒａｃＲＮＡ反復配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のスプリントオリゴヌクレオチドの（ｄ）（ｉ）に相補的である（ａ）（ｉ）の末端領域は、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、または３４ヌクレオチドの長さであるヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチド配列は、第１のＲＮＡフラグメントの３’末端に配置される。いくつかの実施形態では、（ａ）（ｉ）の末端領域は、第１のＲＮＡフラグメントの３’末端からスペーサー配列の３’末端まで延びる（例えば、スペーサー配列の５’末端が、第１のＲＮＡフラグメントの５’末端と整列している）。いくつかの実施形態では、（ａ）（ｉ）の末端領域は、第１のＲＮＡフラグメントの３’末端から延びて、スペーサー配列の３’末端で存在する１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、第１のスプリントオリゴヌクレオチドの（ｄ）（ｉ）の第１の部分は、（ａ）（ｉ）の末端領域に完全に相補的である。いくつかの実施形態では、第１のスプリントオリゴヌクレオチドの（ｄ）（１）の第１の部分は、（ａ）（ｉ）の末端領域に対して１、２、または３つのミスマッチを有する。
いくつかの実施形態では、第２のＲＮＡフラグメントは、５’から３’に、ｃｒＲＮＡ反復配列、テトラループ、ｔｒａｃｒＲＮＡ反復配列、およびｓｇＲＮＡの３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の一部分（すなわち、第２のライゲーションに対して５’である部分）を含む。いくつかの実施形態では、第２のＲＮＡフラグメントは、５’から３’に、ｃｒＲＮＡ反復配列の一部分、テトラループ、ｔｒａｃｒＲＮＡ反復配列、およびｓｇＲＮＡの３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の一部分（すなわち、第２のライゲーションに対して５’である部分）を含む。いくつかの実施形態では、第２のＲＮＡフラグメントは、５’から３’に、テトラループ、ｔｒａｃｒＲＮＡ反復配列、およびｓｇＲＮＡの３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の一部分（すなわち、第２のライゲーションに対して５’である部分）を含む。いくつかの実施形態では、第２のＲＮＡフラグメントは、５’から３’に、テトラループの一部分、ｔｒａｃｒＲＮＡ反復配列、およびｓｇＲＮＡの３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の一部分（すなわち、第２のライゲーションに対して５’である部分）を含む。いくつかの実施形態では、第２のＲＮＡフラグメントは、５’から３’に、ｔｒａｃｒＲＮＡ反復配列、およびｓｇＲＮＡの３’ｔｒａｃｒＲＮＡの一部分（すなわち、第２のライゲーションに対して５’である部分）を含む。いくつかの実施形態では、第２のＲＮＡフラグメントは、５’から３’に、ｔｒａｃｒＲＮＡ反復配列の一部分、およびｓｇＲＮＡの３’ｔｒａｃｒＲＮＡの一部分（すなわち、第２のライゲーションに対して５’である部分）を含む。いくつかの実施形態では、第１のスプリントオリゴヌクレオチドの第２部分（ｄ）（ｉｉ）に相補的である末端領域（ｂ）（ｉ）は、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、または３４ヌクレオチドの長さであり、第２のＲＮＡフラグメントの５’末端に配置されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のスプリントオリゴヌクレオチドの第２の部分（ｄ）（ｉｉ）は、（ｂ）（ｉ）の末端領域に完全に相補的であるか、または（ｄ）（ｉｉ）の末端領域に対して１、２、もしくは３のミスマッチを有する。いくつかの実施形態では、第２のスプリントオリゴヌクレオチドの第１部分（ｅ）（ｉ）に相補的である第２のＲＮＡフラグメントの末端領域（ｂ）（ｉｉ）は、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、または３４ヌクレオチドの長さであり、第２のＲＮＡフラグメントの３’末端に配置されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のスプリントオリゴヌクレオチドの第１の部分（ｅ）（ｉ）は、（ｂ）（ｉｉ）の末端領域に完全に相補的であるか、または（ｂ）（ｉｉ）の末端領域に対して１、２、もしくは３のミスマッチを有する。
いくつかの実施形態では、第３のＲＮＡフラグメントは、ｓｇＲＮＡの３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の一部分（すなわち、第２のライゲーション部位に対して３’である）を含む。いくつかの実施形態では、第２のスプリントオリゴヌクレオチドの第２部分（ｅ）（ｉｉ）に相補的である第３のＲＮＡフラグメントの末端領域（ｃ）（ｉ）は、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、または４５ヌクレオチドの長さであり、第３のＲＮＡフラグメントの５’末端に配置されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のスプリントオリゴヌクレオチドの第２の部分（ｅ）（ｉｉ）は、（ｃ）（ｉ）の末端領域に完全に相補的であるか、または（ｃ）（ｉ）の末端領域に対して１、２、もしくは３のミスマッチを有する。
いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡの不変配列は、配列番号１７のヌクレオチド配列、または配列番号１７に対して最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０ヌクレオチドの欠失、挿入、もしくは置換を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ＳｐｙＣａｓ９エンドヌクレアーゼとともに使用するためのものであり、ｓｇＲＮＡの不変配列は、配列番号１７のヌクレオチド配列、または配列番号１７に対して最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０ヌクレオチドの欠失、挿入、もしくは置換を有するヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、第１のＲＮＡフラグメント、第２のＲＮＡフラグメント、および第３のＲＮＡフラグメントはそれぞれ、
（ａ）（ｉ）Ｎ１５－３０ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧ（配列番号５６）（Ｎ１５－３０は標的核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ分子）の標的部位を標的とするスペーサ配列に対応する）、（ｉｉ）配列番号３、および（ｉｉｉ）配列番号４、
（ｂ）（ｉ）Ｎ１５－３０ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡ（配列番号５７）（Ｎ１５－３０は標的核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ分子）の標的部位を標的とするスペーサー配列に対応する）、（ｉｉ）配列番号４０、および（ｉｉｉ）配列番号４２、
（ｃ）（ｉ）Ｎ１５－３０ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧ（配列番号５６）（Ｎ１５－３０は標的核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ分子）の標的部位を標的とするスペーサー配列に対応する）、（ｉｉ）配列番号５８、および（ｉｉｉ）配列番号４２、または
（ｄ）（ｉ）Ｎ１５－３０ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡ（配列番号５７）（Ｎ１５－３０は標的核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ分子）の標的部位を標的とするスペーサー配列に対応する）、（ｉｉ）配列番号５９、および（ｉｉｉ）配列番号４、を含むヌクレオチド配列から選択される。
いくつかの実施形態では、第１のスプリントオリゴヌクレオチドは、配列番号６０、配列番号４４、または配列番号６１に示される配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のスプリントオリゴヌクレオチドの第１の部分（ｄ）（ｉ）は、第１のＲＮＡフラグメントの末端領域（ａ）（ｉ）に相補的な配列を含み、末端領域は、第１のＲＮＡフラグメントの３’末端から延び、ｓｇＲＮＡのスペーサ配列の３’末端からの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチドを含み、スペーサー配列の５’末端は第１のＲＮＡフラグメントの５’末端と整列する。いくつかの実施形態では、第１のスプリントオリゴヌクレオチドの第１の部分（ｄ）（ｉ）は、第１のＲＮＡフラグメントの末端領域（ａ）（ｉ）に相補的な配列を含み、末端領域は、ｓｇＲＮＡのスペーサ配列の３’末端に直接隣接するかまたは１、２、もしくは３ｎｔ下流であり、スペーサー配列の５’末端は第１のＲＮＡフラグメントの５’末端と整列する。いくつかの実施形態では、第２のスプリントオリゴヌクレオチドは、配列番号６、配列番号４５、または配列番号５３に示されるヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、第１のＲＮＡフラグメント、第２のＲＮＡフラグメント、および第３のＲＮＡフラグメントは、それぞれ独立して、約１０～約９０ヌクレオチド、約１０～約６０ヌクレオチド、約１０～約５０ヌクレオチド、約１０～約４０ヌクレオチド、約２０～約４０ヌクレオチド、約３０～約４０のヌクレオチドの長さである。
いくつかの実施形態では、第１のスプリントオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、第１のスプリントオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、第２のスプリントオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、第２のスプリントオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、第１のスプリントオリゴヌクレオチドおよび第２のスプリントオリゴヌクレオチドは、それぞれ独立して、約２０～約１００ヌクレオチド、約２０～約９０ヌクレオチド、約２０～約８０ヌクレオチド、約２０～約７０ヌクレオチド、約２０～約６０ヌクレオチド、約３０～約６０ヌクレオチド、または約３０～約５０ヌクレオチドの長さである。
いくつかの実施形態では、第１、第２、および／または第３のＲＮＡフラグメントは、本明細書に記載の方法に従って、例えば、ＲＮＡポリメラーゼ酵素を使用してインビトロで、またはホスホロアミダイト化学を使用する固相合成を使用して合成される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡフラグメントは、ホスホロアミダイト化学を使用して合成され、（ｉ）５’から３’または３’から５’の方向の第１のＲＮＡフラグメントの合成、第２のＲＮＡフラグメントの合成、および第３のＲＮＡフラグメントの合成、または（ｉｉ）５’から３’または３’から５’の方向の第１のＲＮＡフラグメントの合成、ならびに３’から５’の方向の第２のＲＮＡフラグメントの合成および第３のＲＮＡフラグメントの合成、を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡフラグメントは、合成後に精製される。
いくつかの実施形態では、第１および／または第２のスプリントオリゴヌクレオチドは、本明細書に記載の方法に従って、例えば、ＲＮＡポリメラーゼ酵素を使用してインビトロで、またはホスホロアミダイト化学を使用する固相合成を使用して合成される。いくつかの実施形態では、スプリントオリゴヌクレオチドは、合成後に精製される。
いくつかの実施形態では、第１、第２、および／または第３のＲＮＡフラグメントは、本明細書に記載のＲＮＡ骨格の１つ以上の修飾、例えば、骨格結合またはヌクレオシド修飾を含む。いくつかの実施形態では、修飾は、ホスホロチオエート結合である。いくつかの実施形態では、修飾は、ヌクレオシドの２’－Ｏ－メチル化である。
いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーションは、本明細書に記載される方法に従って行われる。いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーションは、溶液中で行われる。いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーションは、アニーリングステップの有無にかかわらず行われる。いくつかの実施形態では、アニーリングは、（ｉ）約１０分未満（例えば、１、２、３、４または５分）の期間、溶液を約８０℃～約９５℃に加熱することと、（ｉｉ）約０．１℃～約２℃／秒の速度で、ライゲーションに使用される温度（例えば、約３０℃～約４０℃）まで溶液を冷却することと、を含む。
いくつかの実施形態では、ライゲーション反応は、本明細書に記載される方法に従って行われる。いくつかの実施形態では、ライゲーションは、約１５℃～約４５℃、または約３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、もしくは４０℃で実行される。いくつかの実施形態では、ライゲーションは、約０．１～約４８時間、または約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０時間実行される。いくつかの実施形態では、ライゲーションは、プロテアーゼまたはキレート剤を使用して行われる。いくつかの実施形態では、ライゲーションは、混雑剤を使用して行われる。いくつかの実施形態では、ライゲーションは、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％の完了まで進行する。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、例えば、クロマトグラフィー法を使用して、合成後に精製される。
本発明の実施は、他に示されない限り、当該技術分野で知られている分子生物学、微生物学、細胞生物学、生化学、核酸化学、および免疫学の従来の技術を使用する。非限定的な例としては、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ＆ Ｒｕｓｓｅｌｌ（２０１２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（４ｔｈ ｅｄ．）、Ａｕｓｕｂｅｌ（１９８７）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ：Ｗｉｌｅｙ（２０１４年までの補足を含む）、Ｂｏｌｌａｇ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ：Ｗｉｌｅｙ－Ｌｉｓｓ、Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎｏｎｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｋａｐｌｉｔｔｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ（１９９７）Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍａｎｕａｌ：Ｔｈｅ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｓｏｕｒｃｅｂｏｏｋ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｄｏｙｌｅ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ：Ｗｉｌｅｙ、Ｍｕｌｌｉｓ，Ｆｅｒｒｅ ＆ Ｇｉｂｂｓ（１９９４）ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ．Ｂｏｓｔｏｎ：Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ、Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ（２０１４）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ ｅｄ．）．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｅａｕｃａｇｅ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ：Ｗｉｌｅｙ，（２０１４年までの補足を含む）、およびＭａｋｒｉｄｅｓ（２００３）Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ．Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，ＮＬ：Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｂ．Ｖ．，が挙げられるが、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
追加の実施形態は、以下の実施例においてさらに詳細に開示されており、これらは、実例として提供されており、本開示または特許請求の範囲を限定することを決して意図するものではない。
実施例１：例示的なｇＲＮＡのスプリント媒介ライゲーション
化学的に合成されたＲＮＡフラグメントを使用して、スプリント媒介ライゲーションを使用して全長ｇＲＮＡ生成物を作成できることを実証するために、この方法を使用して、マウスゲノムの単一遺伝子座を標的とする例示的なｇＲＮＡ分子を合成した。ｇＲＮＡは、それぞれが４０ヌクレオチド未満の長さを有する３つのＲＮＡフラグメントに分割された（図４）。３つのＲＮＡフラグメントおよび２つのＤＮＡスプリントオリゴヌクレオチドの配列を表１に示す。ＤＮＡスプリントオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを妨げる内部ヘアピンを除去するために、ｇＲＮＡをセグメント化する位置を選択した。ｇＲＮＡをセグメント化するためのこれらの位置は、ｇＲＮＡの不変領域（すなわち、スペーサーまたは可変領域の下流）にあったため、これらの位置は、ＳｐｙＦｉなどのＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ＳｐｙＣａｓまたはＳｐＣａｓ）に由来するＣａｓ酵素によって使用される任意のｇＲＮＡに使用でき、ｇＲＮＡ構築物の末端５’位置にあるＲＮＡ（例えば、表１のＲＮＡ１）およびそれに対応するスプリント（例えば、表１のＳｐｌｉｎｔ１－＞２）のみを、異なるゲノム標的に対して一意に合成する必要がある。
Figure 2023503635000002
ｇＲＮＡセグメンテーションの選択基準
生物学的条件下では、Ｃａｓタンパク質ファミリーに関連するＲＮＡは、相補的なスプリントオリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションを妨げることができる内部構造を有する。例えば、Ｃａｓタンパク質とアセンブルすると、ＳｐＣａｓ９に関連するｇＲＮＡは４つのステムループ（ヘアピン）を有し、ｓａＣａｓ９に関連するｇＲＮＡは３つのステムループを有する。これらのステムループ、特に２つのテトラループは、ｇＲＮＡがＣａｓタンパク質と結合していない場合に存在すると想定される。スプリントとのハイブリダイゼーションを妨げるＲＮＡフラグメントの分子内会合を最小限に抑えるために、これらのステムループモチーフ内でｇＲＮＡのセグメンテーションの場所を選択して、これらのエネルギー的に好ましい二次構造を破壊した。ステムループの安定性は、ステム／ヘリックス（すなわち、ヘリックスを形成するヌクレオチドの数）およびループ（すなわち、塩基のタイプおよびループを形成するヌクレオチドの数）領域の安定性に依存する。ループ領域内での分割はステムループを除去するため、一般的に好ましい。ヘリックス内の分割もこの手法と互換性があり、スプリントへのＲＮＡフラグメントの適切な結合を確実にするために自由エネルギー計算が使用された。
ＤＮＡスプリントオリゴヌクレオチドの選択
ＤＮＡスプリントオリゴヌクレオチドの長さは、ＲＮＡフラグメント内の分子内構造の形成よりもスプリントおよびＲＮＡフラグメントの間の二重鎖形成を促進するように選択された。これは、内部構造のエネルギーをスプリントと事前にライゲーションされたＲＮＡフラグメントの間に形成された二重鎖のエネルギーと比較することによってインシリコで達成された。最小自由エネルギー予測アルゴリズム（ｍＦｏｌｄ）を使用して、個々のフラグメントのＲＮＡ二次構造の自由エネルギー（ΔＧｉｎｔｒａ）およびフラグメントおよびスプリント間の分子間ハイブリダイゼーション（ΔＧｉｎｔｅｒ）を計算した。スプリントの長さは、ライゲーション中にフラグメントがスプリントに良好に結合することを保証するために、以下に記載される基準が満たされるまで延ばされた。
分子内構造の自由エネルギーは、分子間構造の自由エネルギーよりも大きくなるように設定され、融解温度（Ｔｍ）に反比例する。
ΔＧｉｎｔｒａ＞ΔＧｉｎｔｅｒ～Ｔｍ－ｉｎｔｒａ＜Ｔｍ－ｉｎｔｅｒ
加えて、ライゲーション反応が行われる温度（Ｔｒｘｎ）は、ＲＮＡ／ＤＮＡスプリント複合体のＴｍよりも低く設定された。
Ｔｒｘｎ＜Ｔｍ－ｉｎｔｅｒ
ＤＮＡスプリントオリゴヌクレオチドが使用されたのは、ｉ）Ｔ４ ＲＮＡリガーゼＩＩがライゲーションにＤＮＡ／ＲＮＡヘテロ二本鎖を使用でき、ｉｉ）ＤＮＡはＲＮＡよりも容易にかつ安価に作成できるためである。しかしながら、スプリントは、ＲＮＡ、非天然核酸、人工核酸（例えば、ペプチド核酸）、または任意の核酸模倣物から合成することもできる。自由エネルギーおよび安定性を決定するために使用されるプログラムは、ＵＲＬ：ｕｎａｆｏｌｄ．ｒｎａ．ａｌｂａｎｙ．ｅｄｕ／？ｑ＝ｍｆｏｌｄからアクセスできる。
ＲＮＡフラグメントの化学合成および精製
ＲＮＡフラグメントおよびＤＮＡスプリントオリゴヌクレオチドは、３’から５’方向に伸長する標準的なホスホロアミダイト化学を使用して合成された。Ｔ４ ＲＮＡリガーゼの基質のうちの１つは、５’リン酸化ＲＮＡオリゴマーであるため、ｇＲＮＡの末端５’末端となるフラグメント（例えば、表１のＲＮＡ１）を除くすべてのＲＮＡフラグメントは末端５’リン酸で合成された。すべてのＲＮＡフラグメントは、使用前に逆相ＨＰＬＣ、イオン交換クロマトグラフィー、またはＰＡＧＥで精製された。リン酸化はこれらのＲＮＡの合成中の最終的なカップリングステップであるため、それらの合成からのトランケーション生成物は酵素的ライゲーション中に組み込まれない。組み込むことができる唯一のトランケーション製品は、５’末端フラグメントに由来する。このため、５’末端フラグメントはライゲーションの前に精製され、このフラグメントを４０ヌクレオチド未満に設計することが有利である。場合によっては、５’末端フラグメントは５’から３’方向に合成され、他のフラグメントは３’から５’方向に合成されるため、５’末端フラグメントの合成による切断生成物が最終ライゲーション生成物に含まれないようにすることが可能である。
修飾オリゴヌクレオチド
非天然（修飾）リボホスフェート骨格を有するＲＮＡフラグメントを使用して、本明細書に記載のスプリント媒介ライゲーションを使用してｇＲＮＡを合成することもできる。一例として、３’末端ライゲーション部位または３’末端ライゲーション部位から１～２ヌクレオチド離れたところに２’ヒドロキシル基のメトキシ置換を有するＲＮＡフラグメントのライゲーションが達成された。これらのＲＮＡフラグメントには、ライゲーション部位から２０ヌクレオチド以上離れたホスホロチオエート結合も含まれていた。これらの修飾は、ライゲーション部位またはその近くでも許容される場合がある。
ライゲーション反応
ＲＮＡフラグメントおよびＤＮＡスプリントをＴ４ ＲＮＡリガーゼＩＩ反応バッファー（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ））でそれぞれ１０または２０μＭの濃度で混ぜ合わせた。ＲＮＡフラグメントおよびＤＮＡスプリントの濃度は実質的に等しかった。溶液を９０℃で３分間加熱し、１℃／秒の速度で３７℃まで冷却して、ＲＮＡフラグメントの内部構造を破壊し、ＤＮＡスプリントおよびＲＮＡフラグメントのアニーリングを可能にした。次に、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼＩＩを溶液に加え、３７℃で０．５～２４時間インキュベートした。ＮＥＢによって定義されているように、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼＩＩの１単位は、２３－ｍｅｒおよび１７－ｍｅｒのＲＮＡの等モル混合物０．４μｇを３７℃で３０分間に２０μＬの総反応量でライゲーションするために必要な酵素の量である。ライゲーション反応は他の温度、例えば２５℃でも機能し、反応時間を長くすることができ、プロテアーゼまたはＥＤＴＡを使用して反応をクエンチすることができる。混雑剤（例えば、ＰＥＧ）をライゲーション反応に加えることができる。
完全長生成物の単離
イオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して、ＤＮＡスプリントオリゴヌクレオチドおよびライゲーションされていないＲＮＡ１、２、または３フラグメントから完全長ｇＲＮＡ生成物を単離した。図５は、ライゲーション反応の前（上段）および後（下段）のオリゴヌクレオチドの存在を示すＨＰＬＣクロマトグラムである。ライゲーション生成物ＲＮＡ２－３、ＲＮＡ１－２および全長ｇＲＮＡ（ＲＮＡ １－２－３）の存在が検出された。
全長ｇＲＮＡ生成物は、標的ＤＮＡ配列を含むプラスミドを使用してＳｐＣａｓ９と組み合わせて試験された。図６に示されるように、プラスミドは、適切な標的部位でＳｐＣａｓ９によって切断された。
これらの結果は、化学的に合成されたＲＮＡフラグメントを使用して、スプリント媒介ライゲーションを使用して全長ｇＲＮＡ生成物を作成できることを実証する。
実施例２：修飾ＲＮＡのスプリント媒介ライゲーション
スプリント媒介ライゲーションを使用して修飾を含むＲＮＡフラグメントをライゲーションできるかどうかを調べるために、以下の表２に示す修飾ＲＮＡ（ＲＮＡ２ｍ１およびＲＮＡ２ｍ２）をＤＮＡスプリントオリゴヌクレオチドＳｐｌｉｎｔ１およびＳｐｌｉｎｔ２を使用してライゲーションした。図７Ａは、未修飾ＲＮＡおよび例示的な修飾の化学構造を示している。
Figure 2023503635000003
図７Ｂは、ライゲーション生成物のＨＰＬＣ分析からの結果を示すクロマトグラムである。ライゲーション生成物ＲＮＡ２ｍ１－ＲＮＡ３、ＲＮＡ１－ＲＮＡ２ｍ１およびＲＮＡ２ｍ２－ＲＮＡ３が検出された。
次に、ＲＮＡ１、ＲＮＡ２ｍ１（以下の表３および図８にＲＮＡ２として示されている）、ＲＮＡ３をライゲーションして、Ｓｐｌｉｎｔ１およびＳｐｌｉｎｔ２を使用して全長ｇＲＮＡを生成した。
Figure 2023503635000004
全長ｇＲＮＡ生成物は、ＨＰＬＣを使用して、ＤＮＡスプリントオリゴヌクレオチドおよび部分的ライゲーション生成物（ＲＮＡ２－ＲＮＡ３およびＲＮＡ１－ＲＮＡ２）から単離した。図８は、精製前後のライゲーション生成物のＨＰＬＣ分析からの結果を示すクロマトグラムである。全長ＲＮＡ生成物（ＲＮＡ１－２－３ｇＲＮＡ）が検出され、精製された全長生成物が下段に示されている。これらの結果は、ライゲーション部位の周りにメチル化修飾を有するＲＮＡフラグメントが、本開示に記載されているスプリント媒介ライゲーションを使用してライゲーションできることを示している。
本開示の特定の代替案が開示されているが、様々な修正および組み合わせが可能であり、添付の特許請求の範囲の真の趣旨および範囲内で企図されることが理解されるべきである。したがって、本書に提示されている正確な要約および開示に制限を設ける意図はない。
実施例３：スプリント媒介ライゲーションの反応条件の評価
修飾ＲＮＡのスプリント媒介ライゲーション反応を行うための実験条件を比較した。これには、（ｉ）反応へのマグネシウム塩の添加と、（ｉｉ）ライゲーション反応を行う前の熱アニーリングステップと、の使用の評価が含まれていた。
スプリント媒介ライゲーションは、ヒトＧ６ＰＣ遺伝子のエクソン２を標的とするスペーサー配列と、ＳｐｙＣａｓ９での使用に適した骨格を持つ最終修飾ｓｇＲＮＡ生成物を調製するために設計された。修飾されたｓｇＲＮＡ生成物の配列、およびそれに対応する修飾されていないバージョンを表４に示す。スプリント媒介ライゲーションでは、それぞれ表４に示すように、３つのＲＮＡフラグメントおよび２つのＤＮＡスプリントオリゴヌクレオチドを使用した。ＲＮＡフラグメントは、
（ｉ）５’から３’方向に、スペーサー配列、最終ｓｇＲＮＡ生成物のｃｒＲＮＡ反復配列、および最終ｓｇＲＮＡ生成物のテトラループの第１のグアニンを含む、３３ｍｅｒ ＲＮＡ１（配列番号１１）と、
（ｉｉ）５’から３’方向に、最終ｓｇＲＮＡ生成物のテトラループの「ＡＡＡ」、およびｔｒａｃｒＲＮＡの５’セグメントを含む、３９ｍｅｒ ＲＮＡ２（配列番号１２）と、
（ｉｉｉ）最終ｓｇＲＮＡ生成物のｔｒａｃｒＲＮＡの３’セグメントを含む、２８ｍｅｒ ＲＮＡ３（配列番号１３）と、を含んだ。
図９Ａに示されるように、ＤＮＡスプリント１オリゴヌクレオチド（配列番号５）は、ＲＮＡ１の３’セグメントおよびＲＮＡ２の５’セグメントに相補的なセグメントを用いて設計された。具体的には、ＤＮＡスプリント１の配列５’－ＣＴＡＧＣＴＣＴＡＡＡＡＣＴＣ－３’（配列番号２２）は、ＲＮＡ１の配列５’－ＧＵＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧ－３’（配列番号２３）に相補的であり、ＤＮＡスプリント１の配列５’－ＣＣＴＴＡＴＴＴＴＡＡＣＴＴＧＣＴＡＴＴＴ－３’（配列番号２４）は、ＲＮＡ２の配列５’－ＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧ－３’（配列番号２５）に相補的である。
加えて、ＤＮＡスプリント２オリゴヌクレオチド（配列番号６）は、ＲＮＡ２の３’セグメントおよびＲＮＡ３の５’セグメントに相補的なセグメントを用いて設計された。具体的には、ＤＮＡスプリント２の配列５’－ＡＡＧＴＴＧＡＴＡＡＣＧＧＡＣＴＡＧ－３’（配列番号２６）は、ＲＮＡ２の配列５’－ＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵ－３’（配列番号２７）に相補的であり、ＤＮＡスプリント２の配列５’－ＡＡＡＡＧＣＡＣＣＧＡＣＴＣＧＧＴＧＣＣＡＣＴＴＴＴＴＣ－３’（配列番号２８）は、ＲＮＡ３の配列５’－ＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ－３’（配列番号２９）に相補的である。
図９Ｂに示されるように、ＲＮＡフラグメントのライゲーションは、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとの間に形成される反復逆反復ステムループのＧＡＡＡテトラループに位置するＲＮＡフラグメント１とＲＮＡフラグメント２との間の第１のライゲーション部位、およびｔｒａｃｒＲＮＡの第２のステムループのＧＡＡＡテトラループに隣接するＲＮＡフラグメント２とＲＮＡフラグメント３との間の第２のライゲーション部位で起こる。配列番号５に示されるＤＮＡスプリント１オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ１のセグメントと相補的であるが、１つのミスマッチがある。配列番号１４に示されるＤＮＡスプリント１オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ１の同じ部分と相補的であるが、ミスマッチがなく、ライゲーション反応での使用にも適している。
Figure 2023503635000005
各オリゴヌクレオチドを１ｍＭの濃度で水に溶解した。ＲＮＡフラグメントおよびＤＮＡスプリントの等モル比の混合物を調製した。次に、ＲＮＡ／ＤＮＡ混合物を９０℃で３分間加熱し、１℃／秒の速度で３７℃まで冷却して、ＲＮＡフラグメントの内部構造を破壊し、アニーリングしてＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド構造を形成した。（「アニーリングあり」）。代替的に、このステップはスキップされた（「アニーリングステップなし」）。
次に、アニーリングありまたはアニーリングなしのＲＮＡ／ＤＮＡ混合物を、各ＲＮＡおよびＤＮＡスプリントオリゴ核酸当たり１０μＭの最終濃度で５０ＵのＴ４ ＲＮＡリガーゼＩＩを有するＴ４ ＲＮＡリガーゼＩＩ反応バッファー（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ））で希釈した。ライゲーション反応は、ＭｇＣｌ２を添加して最終濃度を１２．５ｍＭに調製するか、またはＭｇＣｌ２を添加せずに調製した。溶液を３７℃で１６時間インキュベートした。プロテイナーゼＫを添加するか、ＥＤＴＡでクエンチすることにより反応を停止させた。次に、反応混合物を、イオン交換ＨＰＬＣによって、全長ｇＲＮＡ生成物および部分的ライゲーション生成物（ＲＮＡ２－ＲＮＡ３およびＲＮＡ１－ＲＮＡ２）の存在について分析した。
図１０に示すように、評価した各条件のライゲーション反応で、全長ＲＮＡ生成物（ＲＮＡ１－２－３ｇＲＮＡ、保持時間３０．５８分）が検出された。結果は、修飾されたＲＮＡフラグメントのスプリント媒介ライゲーション反応が最初のアニーリングステップなしで達成され、マグネシウム塩の添加の有無にかかわらず正常に行うことできることを示している。
実施例４：スプリント媒介ライゲーション反応を実現するための設計バリエーション
スプリント媒介ライゲーション反応を使用して、実施例３に記載の最終的なｓｇＲＮＡ生成物（配列番号２０に示される修飾配列）を調製するために、追加の設計が開発された。この設計は、２つのスプリントオリゴヌクレオチドを使用した３つのＲＮＡフラグメントのライゲーションに基づいている。設計における１つの違いは、第１のスプリントオリゴヌクレオチドと第１のＲＮＡフラグメントとの間の相補性の程度である。以下でさらに説明するように、第１のＲＮＡフラグメントは、可変スペーサー配列および最終的なｓｇＲＮＡ生成物の不変配列の一部分を含む。第１の設計は、第１のＲＮＡフラグメントの不変セグメントのみに相補的である第１のスプリントオリゴヌクレオチドを有し、第２の設計は、不変セグメントおよび可変セグメントの一部分の両方に相補的である第１のスプリントオリゴヌクレオチドを有する。結果として、第１の設計は、異なる標的特異性を有するｓｇＲＮＡを調製するために第１のＲＮＡフラグメントのみが変更される一連の構成成分を提供する。第２の設計に基づいて、第１のＲＮＡフラグメントおよび第１のスプリントオリゴヌクレオチドの両方が変更され、異なる標的特異性を持つｓｇＲＮＡが調製される。しかしながら、この設計の利点は、第１のスプリントオリゴヌクレオチドおよび第１のＲＮＡフラグメントのオーバーラップが増加することであり、これらの構成成分間で形成されるＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二本鎖の安定性（すなわち、融解温度）が増加し、ライゲーション反応に使用される温度（例えば、３７℃）でのヘテロ二重鎖形成を促進すると期待できることである。
第１の設計には、表５に示すＲＮＡフラグメントが含まれており、修飾されたバージョンまたは修飾されていないバージョンとして示されている。。具体的には、ＲＮＡフラグメントは、
（ｉ）５’から３’にスペーサー配列（配列番号２０）、ｃｒＲＮＡ反複配列、および最終の反復－逆反復ステムループのテトラループの一部分を組み込んだ３４ｍｅｒ ＲＮＡ１と、
（ｉｉ）反復逆反復ステムループのテトラループの残りの部分、ｔｒａｃｒＲＮＡ逆反復配列、および第２のステムループの塩基に延びるｔｒａｃｒＲＮＡの一部分を含む３４ｍｅｒ ＲＮＡ２と、
（ｉｉｉ）ｔｒａｃｒＲＮＡの残りの３’部分を含む３２ｍｅｒ ＲＮＡ３と、を含む。
ＤＮＡスプリント１オリゴヌクレオチド（配列番号４４）は、ＲＮＡ１の３’セグメントおよびＲＮＡ２の５’セグメントに相補的であるセグメントを用いて設計される。具体的には、ＤＮＡスプリント１の配列５’－ＴＣＴＡＧＣＴＣＴＡＡＡＡＣ－３’（配列番号３０）は、ＲＮＡ１の配列５’－ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡ－３’（配列番号３１）に相補的であり、ＤＮＡスプリント１の配列５’－ＴＴＡＴＴＴＴＡＡＣＴＴＧＣＴＡＴＴ－３’（配列番号３２）は、ＲＮＡ２の５’－ＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡ－３’（配列番号３３）に相補的である。
さらに、ＤＮＡスプリント２オリゴヌクレオチド（配列番号４５）は、ＲＮＡ２の３’セグメントおよびＲＮＡ３の５’セグメントに相補的であるセグメントを用いて設計される。具体的には、ＤＮＡスプリント２の配列５’－ＴＧＡＴＡＡＣＧＧＡＣＴＡＧＣＣ－３’（配列番号３４）は、ＲＮＡ２の配列５’－ＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡ－３’（配列番号３５）に相補的であり、ＤＮＡスプリント２の配列５’－ＴＣＧＧＴＧＣＣＡＣＴＴＴＴＴＣＡＡＧＴ－３’（配列番号３６）は、ＲＮＡ３の配列５’－ＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡ－３’（配列番号３７）に相補的である。
この設計の利点は、第１のスプリントオリゴヌクレオチド（ＤＮＡスプリント１）が、スペーサー配列を含まない第１のＲＮＡフラグメント（ＲＮＡ１）のセグメントに相補的であることである。したがって、残存する第１および第２のスプリントオリゴヌクレオチド（ＤＮＡスプリント１およびＤＮＡスプリント２）、ならびに第２および第３のＲＮＡフラグメント（ＲＮＡ２およびＲＮＡ３）は、配列番号１７に示される不変の骨格配列を有するＳｐｙＣａｓ９で使用するｓｇＲＮＡを調製するために使用されるという点で「ユニバーサル」である。最終的なｓｇＲＮＡのスペーサー配列を含む第１のＲＮＡフラグメントのみが、ｓｇＲＮＡの目的の標的特異性に応じてカスタマイズされる。
Figure 2023503635000006
第２の設計には、表６に示すＲＮＡフラグメントが含まれており、修飾されたバージョンまたは修飾されていないバージョンとして示されており、上記の最初の設計で使用されたものと同一である。第２の設計の概略図を図１１に示し、第１および第２のＤＮＡスプリントに対する第１、第２、および第３のＲＮＡフラグメントの配列アラインメントを提供する。最終的なｓｇＲＮＡ生成物のヌクレオチド配列のＤＮＡバージョンは５’から３’の方向に示され（ヌクレオチド配列のＲＮＡバージョンは配列番号１９に示されている）、および対応するヌクレオチド配列のセグメントは第１、第２、および第３のＲＮＡフラグメントが示されている（第１、第２、および第３のＲＮＡフラグメントのＲＮＡバージョンは、それぞれ、配列番号３８、４０、および４２に示されている）。また、第１および第２のＤＮＡスプリントと第１、第２、および第３のＲＮＡフラグメントとのアラインメントが示され、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖を形成し、第１および第２のＤＮＡスプリントのヌクレオチド配列が３’から５’の方向に示されている（それぞれ配列番号５２および５３に示されるヌクレオチド配列）。
第２の設計のＤＮＡスプリント１オリゴヌクレオチド（配列番号５２）は、ＲＮＡ１の３’セグメントおよびＲＮＡ２の５’セグメントに相補的なセグメントを有する。具体的には、ＤＮＡスプリント１の配列５’－ＴＣＴＡＧＣＴＣＴＡＡＡＡＣＡＣＣＡＧＴＡＴＧ－３’（配列番号４６）は、ＲＮＡ１の配列５’－ＣＡＵＡＣＵＧＧＵＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡ－３’（配列番号４７）に相補的であり、ＤＮＡスプリント１の５’－ＴＡＴＴＴＴＡＡＣＴＴＧＣＴＡＴＴ－３’（配列番号４８）は、ＲＮＡ２の配列５’－ＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡ－３’（配列番号４９）に相補的である。この設計によれば、ＤＮＡスプリント１は、スペーサー配列の３’末端に存在するＲＮＡ１の９ヌクレオチドとオーバーラップする。第１のＲＮＡフラグメントとの延長されたオーバーラップは、第１のスプリントオリゴヌクレオチドと第１のＲＮＡフラグメントとの間に形成されたヘテロ二本鎖の安定性を高め、特にヘテロ二本鎖の融解温度を上げ、ライゲーション反応に使用される条件下でヘテロ二本鎖の形成を促進すると予想される。
さらに、ＤＮＡスプリント２オリゴヌクレオチド（配列番号５３）は、ＲＮＡ２の３’部分およびＲＮＡ３の５’部分に相補的なセグメントを用いて設計される。具体的には、ＤＮＡスプリント２の配列５’－ＴＧＡＴＡＡＣＧＧＡＣＴＡＧＣＣＴ－３’（配列番号５０）は、ＲＮＡ２の配列５’－ＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡ－３’（配列番号５１）に相補的であり、ＤＮＡスプリント２の配列５’－ＧＡＣＴＣＧＧＴＧＣＣＡＣＴＴＴＴＴＣＡＡＧＴ－３’（配列番号５４）は、ＲＮＡ３の配列５’－ＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣ－３’（配列番号５５）に相補的である。
Figure 2023503635000007
Figure 2023503635000008
Figure 2023503635000009
Figure 2023503635000010

Claims (109)

  1. ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を合成する方法であって、前記方法が、
    ５’リン酸部分を含む末端領域を含む第１のＲＮＡフラグメント、および３’ヒドロキシル基を含む末端領域を含む第２のＲＮＡフラグメントを提供することであって、前記第１のＲＮＡフラグメント、前記第２のＲＮＡフラグメント、またはその両方が、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼに結合することができる配列の少なくとも一部分を含む、提供することと、
    ５’リン酸部分を含む前記末端領域で前記第１のＲＮＡフラグメントに相補的な第１の部分、および３’ヒドロキシル基を含む前記末端領域で前記第２のＲＮＡフラグメントに相補的な第２の部分を含むスプリントオリゴヌクレオチドを提供することと、
    前記第１のＲＮＡフラグメント、前記第２のＲＮＡフラグメント、および前記スプリントオリゴヌクレオチドを一緒にハイブリダイズして複合体を形成することと、
    ＲＮＡ複合体の間に存在するライゲーション部位でリガーゼを使用して前記第１および第２のＲＮＡフラグメントをライゲーションし、それによってｇＲＮＡを合成することと、を含む、方法。
  2. 前記第１および第２のＲＮＡフラグメントの長さが、それぞれ１０～９０ヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
  3. 前記第２のＲＮＡフラグメントの前記長さが、４０ヌクレオチド以下である、請求項２に記載の方法。
  4. 前記５’リン酸部分が、５’－リン酸または５’－ホスホロチオエートである、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記リガーゼが、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼＩ、またはＴ４ ＲＮＡリガーゼＩＩである、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記スプリントオリゴヌクレオチドが、ＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドである、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記スプリントオリゴヌクレオチドの長さが、２０～１００ヌクレオチドである、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記スプリントオリゴヌクレオチドが、固体支持体に結合している、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記ｇＲＮＡの長さが、３０～１６０ヌクレオチドである、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記ｇＲＮＡが、標的ＤＮＡ中の配列に相補的である配列を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記標的ＤＮＡが、哺乳動物ＤＮＡである、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記標的ＤＮＡが、ヒトＤＮＡである、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記ライゲーション部位が、前記合成されたｇＲＮＡのステムループ構造のテトラループ部分の部位に対応する、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記ライゲーション部位が、前記合成されたｇＲＮＡのステムループ構造のヘリックス部分の部位に対応する、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記第１のＲＮＡフラグメント、前記第２のＲＮＡフラグメント、またはその両方が、少なくとも１つの二次構造を含み、前記第１のＲＮＡフラグメント、前記第２のＲＮＡフラグメント、および前記スプリントオリゴヌクレオチドをハイブリダイズすることが、最も低い自由エネルギーを有する前記二次構造のものよりも低い自由エネルギーをもたらす、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. ３つ以上のＲＮＡフラグメントをライゲーションすることを含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 前記第１および第２のＲＮＡフラグメントを提供することが、酵素的合成またはホスホロアミダイト化学を介して前記第１および第２のＲＮＡフラグメントを合成することを含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記第２のＲＮＡフラグメントが、５’から３’または３’から５’の方向に合成される、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記第１および第２のＲＮＡフラグメントを提供することが、合成後に前記第１および第２のフラグメントを精製することを含む、請求項１７または１８に記載の方法。
  20. 前記スプリントオリゴヌクレオチドを提供することが、酵素的合成またはホスホロアミダイト化学を介して前記スプリントオリゴヌクレオチドを合成することを含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. 前記スプリントオリゴヌクレオチドを提供することが、合成後に前記スプリントオリゴヌクレオチドを精製することを含む、請求項２０に記載の方法。
  22. 精製することが、クロマトグラフィー法で精製することを含む、請求項１９または２１に記載の方法。
  23. 前記クロマトグラフィー法が、逆相ＨＰＬＣ、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、もしくはポリアクリルアミドゲル精製、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項２２に記載の方法。
  24. 前記第１のＲＮＡフラグメント、前記第２のＲＮＡフラグメント、またはその両方が、ＲＮＡ骨格に少なくとも１つの修飾を含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。
  25. 前記修飾が、２’メトキシ（２’ＯＭｅ）、２’フッ素（２’フルオロ）、２’－Ｏ－メトキシ－エチル（ＭＯＥ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、アンロックド核酸（ＵＮＡ）、架橋核酸、２’デオキシ核酸（ＤＮＡ）、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）からなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
  26. 前記第１のＲＮＡフラグメント、前記第２のＲＮＡフラグメント、またはその両方が、少なくとも１つの塩基修飾を含む、請求項１～２５のいずれか一項に記載の方法。
  27. 前記塩基修飾が、２－アミノプリン、イノシン、チミン、２，６－ジアミノプリン、２－ピリミジノン、および５－メチルシトシンからなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記第１のＲＮＡフラグメント、前記第２のＲＮＡフラグメント、またはその両方が、少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含む、請求項１～２７のいずれか一項に記載の方法。
  29. ハイブリダイズすることが、溶液中でハイブリダイズすることを含む、請求項１～２８のいずれか一項に記載の方法。
  30. 前記溶液中の前記スプリントオリゴヌクレオチドの濃度、前記第１のＲＮＡフラグメントの濃度、および前記第２のＲＮＡフラグメントの濃度が、ほぼ等しい、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記第１および第２のＲＮＡフラグメントをライゲーションすることが、１５℃～４５℃で実施される、請求項１～３０のいずれか一項に記載の方法。
  32. 前記第１および第２のＲＮＡフラグメントをライゲーションすることが、約３７℃で実施される、請求項３１に記載の方法。
  33. 前記第１および第２のＲＮＡフラグメントをライゲーションすることが、約０．１～約４８時間実施される、請求項１～３２のいずれか一項に記載の方法。
  34. 前記第１および第２のＲＮＡフラグメントをライゲーションすることが、プロテアーゼまたはキレート剤を使用することをさらに含む、請求項１～３３のいずれか一項に記載の方法。
  35. 前記キレート剤が、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、または両方の組み合わせである、請求項３４に記載の方法。
  36. 前記第１および第２のＲＮＡフラグメントをライゲーションすることが、１つ以上の混雑剤を使用することをさらに含む、請求項１～３５のいずれか一項に記載の方法。
  37. 前記１つ以上の混雑剤が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、フィコール（登録商標）、エチレングリコール、デキストラン、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項３６に記載の方法。
  38. 前記第１および第２のＲＮＡフラグメントをライゲーションすることが、少なくとも１０％の完了まで進行する、請求項１～３７のいずれか一項に記載の方法。
  39. 前記第１および第２のＲＮＡフラグメントをライゲーションすることが、少なくとも９０％の完了まで進行する、請求項３８に記載の方法。
  40. ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を合成する方法であって、前記方法が、
    （ａ）３’ヒドロキシル基を含む末端領域を含む第１のＲＮＡフラグメントと、
    （ｂ）５’リン酸部分を含む第１の末端領域、および３’ヒドロキシル基を含む第２の末端領域を含む第２のＲＮＡフラグメントと、
    （ｃ）５’リン酸基を含む末端領域を含む第３のＲＮＡフラグメントと、
    （ｄ）（ｉ）前記第１のＲＮＡフラグメントの前記３’ヒドロキシル基を含む前記末端領域に相補的な第１の部分、および（ｉｉ）前記第２のＲＮＡフラグメントの前記５’リン酸部分を含む前記第１の末端領域に相補的な第２の部分を含む第１のスプリントオリゴヌクレオチドと、
    （ｅ）（ｉ）前記第２のＲＮＡフラグメントの前記３’ヒドロキシル基を含む前記第２の末端領域に相補的な第１の部分、および（ｉｉ）前記第３のＲＮＡフラグメントの前記５’リン酸部分を含む前記末端領域に相補的な第２の部分を含む第２のスプリントオリゴヌクレオチドと、
    （ｆ）リガーゼと、を提供することを含み、
    前記第１、第２、および第３のＲＮＡフラグメント、ならびに前記第１および第２のスプリントオリゴヌクレオチドをハイブリダイズすることが、前記第１のＲＮＡフラグメントの前記３’ヒドロキシル基および前記第２のＲＮＡフラグメントの前記５’リン酸基間に存在する第１のライゲーション部位、ならびに前記第２のＲＮＡフラグメントの前記３’ヒドロキシル基および前記第３のＲＮＡフラグメントの前記５’リン酸基間に存在する第２のライゲーション部位を有する複合体の形成をもたらし、
    前記リガーゼが、前記第１のライゲーション部位での前記第１および第２のＲＮＡフラグメントと、前記第２のライゲーション部位での前記第２および第３のＲＮＡフラグメントとのライゲーションをもたらし、それによってｇＲＮＡを合成する、方法。
  41. 前記ｇＲＮＡが、５’から３’に、第１のホスホジエステル結合によって前記第２のＲＮＡフラグメントに連結した前記第１のＲＮＡフラグメント、および第２のホスホジエステル結合によって前記第３のＲＮＡフラグメントに連結した前記第２のＲＮＡフラグメントを含む、請求項４０に記載の方法。
  42. 前記第１のホスホジエステル結合が、前記第１のＲＮＡフラグメントの前記３’ヒドロキシル基と前記第２のＲＮＡフラグメントの前記５’リン酸基との間に形成され、前記第２のホスホジエステル結合が、前記第２のＲＮＡフラグメントの前記３’ヒドロキシル基と前記第３のＲＮＡフラグメントの前記５’リン酸基との間に形成される、請求項４１に記載の方法。
  43. 前記ｇＲＮＡが、単一分子ｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である、請求項４０～４２のいずれか一項に記載の方法。
  44. 前記ｇＲＮＡが、約３０～約１６０ヌクレオチドの長さである、請求項４０～４３のいずれか一項に記載の方法。
  45. 前記第１のライゲーション部位が、第１のステムループ構造の部位に対応し、前記第１のステムループ構造が、前記ｇＲＮＡにおける最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列および最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列のハイブリダイゼーションによって形成される、請求項４０～４４のいずれか一項に記載の方法。
  46. 前記第１のステムループ構造の前記部位が、テトラループ部分またはヘリックス部分にある、請求項４５に記載の方法。
  47. 前記第２のライゲーション部位が、第２のステムループ構造の部位に対応し、前記第２のステムループ構造が、前記ｇＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ配列に存在する、請求項４０～４６のいずれか一項に記載の方法。
  48. 前記第２のステムループ構造の前記部位が、テトラループ部分またはヘリックス部分にある、請求項４７に記載の方法。
  49. 前記第１のＲＮＡフラグメント、前記第２のＲＮＡフラグメント、および／または前記第３のＲＮＡフラグメントが、少なくとも１つの二次構造を含み、前記第１、第２、および第３のＲＮＡフラグメント、ならびに前記第１および第２のスプリントオリゴヌクレオチドをハイブリダイズすることによって形成された前記複合体が、最も低い自由エネルギーを有する前記二次構造のものよりも低い自由エネルギーを有する、請求項４０～４８のいずれか一項に記載の方法。
  50. ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼとともに使用するための単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を合成する方法であって、前記方法が、第１のＲＮＡフラグメント、第２のＲＮＡフラグメント、第３のＲＮＡフラグメント、第１のスプリントオリゴヌクレオチド、および第２のスプリントオリゴヌクレオチドの間で形成された複合体、ならびにリガーゼを提供することを含み、
    （ａ）前記第１のＲＮＡフラグメントが、（ｉ）３’ヒドロキシル基を含む末端領域を含み、
    （ｂ）前記第２のＲＮＡフラグメントが、（ｉ）５’リン酸部分を含む第１の末端領域、および（ｉｉ）３’ヒドロキシル基を含む第２の末端領域を含み、
    （ｃ）前記第３のＲＮＡフラグメントが、（ｉ）５’リン酸部分を含む末端領域を含み、
    （ｄ）前記第１のスプリントオリゴヌクレオチドが、（ｉ）前記第１のＲＮＡフラグメントの前記３’ヒドロキシル基を含む前記末端領域に相補的な第１の部分、および（ｉｉ）前記第２のＲＮＡフラグメントの前記５’リン酸部分を含む前記第１の末端領域に相補的な第２の部分を含み、
    （ｅ）前記第２のスプリントオリゴヌクレオチドが、（ｉ）前記第２のＲＮＡフラグメントの前記３’ヒドロキシル基を含む前記第２の末端領域に相補的な第１の部分、および（ｉｉ）前記第３のＲＮＡフラグメントの前記５’リン酸を含む前記末端領域に相補的な第２の部分を含み、
    前記複合体が、（ａ）（ｉ）および（ｄ）（ｉ）、（ｂ）（ｉ）および（ｄ）（ｉｉ）、（ｂ）（ｉｉ）および（ｅ）（ｉ）、ならびに（ｃ）（ｉ）および（ｅ）（ｉｉ）のハイブリダイゼーションによって形成され、
    前記複合体が、前記第１のＲＮＡフラグメントの前記３’ヒドロキシル基および前記第２のＲＮＡフラグメントの前記５’リン酸基間に存在する第１のライゲーション部位、ならびに前記第２のＲＮＡフラグメントの前記３’ヒドロキシル基および前記第３のＲＮＡフラグメントの前記５’リン酸基間に存在する第２のライゲーション部位を有し、
    前記リガーゼが、前記第１のライゲーション部位でのライゲーションおよび前記第２のライゲーション部位でのライゲーションをもたらして、５’から３’に、スペーサー配列およびＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼに結合する不変配列であって、前記不変配列が、ｃｒＲＮＡ反復配列とｔｒａｃｒＲＮＡ逆反復配列との間に形成されたステムループを含む、不変配列、ならびに少なくとも１つのステムループを含３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含むｓｇＲＮＡを形成し、それによって、前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼとともに使用するための前記ｓｇＲＮＡを合成する、方法。
  51. 第１のライゲーション部位が、ｃｒＲＮＡ反復配列とｔｒａｃｒＲＮＡ逆反復配列との間に形成されたステムループ内の部位に対応する、請求項５０に記載の方法。
  52. 前記第１のライゲーション部位が、前記ステムループの前記５’ステム、前記ステムループの前記テトラループ、または前記ステムループの前記３’ステムの部位に対応する、請求項５１に記載の方法。
  53. 前記３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列が、第１のステムループ、第２のステムループ、および第３のステムループを含む、請求項５０～５３のいずれか一項に記載の方法。
  54. 前記第２のライゲーション部位が、前記第１のステムループ、前記第２のステムループ、または前記第３のステムループの部位に対応する、請求項５３に記載の方法。
  55. 前記第２のライゲーション部位が、前記第２のステムループの部位に対応し、前記部位が、前記第２のステムループの前記５’ステム内、前記第２のステムループの前記テトラループ内の部位、または前記第２のステムループの前記３’ステム内の部位にある、請求項５３または５４に記載の方法。
  56. 前記第２のライゲーション部位が、前記第２のステムループの５’基部に隣接する部位、または前記第２のステムループの３’基部に隣接する部位に対応する、請求項５３または５４に記載の方法。
  57. 前記第１のＲＮＡフラグメントが、前記第１のライゲーション部位の５’であるヌクレオチド配列を含む、請求項５０～５６のいずれか一項に記載の方法。
  58. 前記第２のＲＮＡフラグメントが、前記第１のライゲーション部位と前記第２のライゲーション部位との間にあるヌクレオチド配列を含む、請求項５０～５７のいずれか一項に記載の方法。
  59. 前記第３のＲＮＡフラグメントが、前記第２のライゲーション部位に対して３’であるヌクレオチド配列を含む、請求項５０～５８のいずれか一項に記載の方法。
  60. （ａ）（ｉ）の前記末端領域が、前記第１のＲＮＡフラグメントの前記３’末端に位置する約１０～約３０ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む、請求項５０～５９のいずれか一項に記載の方法。
  61. （ａ）（ｉ）の前記末端領域が、前記ｓｇＲＮＡの前記スペーサー配列を含む、請求項６０に記載の方法。
  62. （ａ）（ｉ）の前記末端領域が、前記ｓｇＲＮＡの前記スペーサー配列を含まない、請求項６０に記載の方法。
  63. （ｄ）（ｉ）の前記第１の部分が、（ａ）（ｉ）の前記末端領域に完全に相補的であるか、または（ａ）（ｉ）の前記末端に対して１、２、もしくは３のミスマッチを有する、請求項５０～６２のいずれか一項に記載の方法。
  64. （ｂ）（ｉ）の前記第１の末端領域が、前記第２のＲＮＡフラグメントの前記５’末端に位置する約１０～約３０ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む、請求項５０～６３のいずれか一項に記載の方法。
  65. （ｄ）（ｉｉ）の前記第２の部分が、（ｂ）（ｉ）の前記第１の末端領域に完全に相補的であるか、または（ｄ）（ｉｉ）の前記末端に対して１、２、もしくは３のミスマッチを有する、請求項５０～６４のいずれか一項に記載の方法。
  66. （ｂ）（ｉｉ）の前記第２の末端領域が、前記第２のＲＮＡフラグメントの前記３’末端に位置する約１０～約３０ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む、請求項５０～６５のいずれか一項に記載の方法。
  67. （ｅ）（ｉ）の前記第１の部分が、（ｂ）（ｉｉ）の前記第２の末端領域に完全に相補的であるか、または（ｂ）（ｉｉ）の前記末端に対して１、２、もしくは３のミスマッチを有する、請求項５０～６６のいずれか一項に記載の方法。
  68. （ｃ）（ｉ）の前記末端領域が、前記第３のＲＮＡフラグメントの前記５’末端に位置する約１０～約４０ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む、請求項５０～６７のいずれか一項に記載の方法。
  69. （ｅ）（ｉｉ）の前記第２の部分が、（ｃ）（ｉ）の前記末端領域に完全に相補的であるか、または（ｃ）（ｉ）の前記末端に対して１、２、もしくは３のミスマッチを有する、請求項５０～６８のいずれか一項に記載の方法。
  70. 前記第１のＲＮＡフラグメント、前記第２のＲＮＡフラグメント、および前記第３のＲＮＡフラグメントが、それぞれ独立して、約１０～約９０ヌクレオチド、約１０～約６０ヌクレオチド、約１０～約５０ヌクレオチド、約１０～約４０ヌクレオチド、約２０～約４０ヌクレオチド、約３０～約４０のヌクレオチドの長さである、請求項４０～６９のいずれか一項に記載の方法。
  71. 前記リガーゼが、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼＩ、またはＴ４ ＲＮＡリガーゼＩＩである、請求項４０～７０のいずれか一項に記載の方法。
  72. 前記第１のスプリントオリゴヌクレオチドが、ＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドであり、前記第２のスプリントオリゴヌクレオチドが、ＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドである、請求項４０～７１のいずれか一項に記載の方法。
  73. 前記第１のスプリントオリゴヌクレオチドおよび前記第２のスプリントオリゴヌクレオチドが、それぞれ独立して、約２０～約１００ヌクレオチド、約２０～約９０ヌクレオチド、約２０～約８０ヌクレオチド、約２０～約７０ヌクレオチド、約２０～約６０ヌクレオチド、約３０～約６０ヌクレオチド、または約３０～約５０ヌクレオチドの長さである、請求項４０～７２のいずれか一項に記載の方法。
  74. 前記ｇＲＮＡまたは前記ｓｇＲＮＡが、標的ＤＮＡの配列に相補的であるスペーサー配列を含む、請求項４０～７３のいずれか一項に記載の方法。
  75. 前記標的ＤＮＡが、哺乳動物ＤＮＡまたはヒトＤＮＡである、請求項７４に記載の方法。
  76. 前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが、低分子Ｃａｓヌクレアーゼまたは低分子ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼである、請求項１～７５のいずれか一項に記載の方法。
  77. 前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１３、およびそれらのバリアントからなる群から選択される、請求項１～７５のいずれか一項に記載の方法。
  78. 前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９（ＳｐｙＣａｓ９）またはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＳａＣａｓ９）である、請求項７７に記載の方法。
  79. 前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ９のバリアントであり、前記Ｃａｓ９のバリアントが、低分子Ｃａｓ９、不活性型Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）、およびＣａｓ９ニッカーゼからなる群から選択される、請求項１～７５のいずれか一項に記載の方法。
  80. 前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９（ＳｐｙＣａｓ９）である、請求項５０～７５のいずれか一項に記載の方法。
  81. 前記不変配列が、配列番号１７のヌクレオチド配列、または配列番号１７に対して最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０ヌクレオチドの欠失、挿入、もしくは置換を有するヌクレオチド配列を含む、請求項８０に記載の方法。
  82. 前記第１のＲＮＡフラグメント、前記第２のＲＮＡフラグメント、および前記第３のＲＮＡフラグメントがそれぞれ、
    （ａ）（ｉ）Ｎ１５－３０ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧ（配列番号５６）（Ｎ１５－３０は前記スペーサ配列に対応する）、
    （ｉｉ）配列番号３、および
    （ｉｉｉ）配列番号４、
    （ｂ）（ｉ）Ｎ１５－３０ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡ（配列番号５７）（Ｎ１５－３０は前記スペーサー配列に対応する）、
    （ｉｉ）配列番号４０、および
    （ｉｉｉ）配列番号４２、
    （ｃ）（ｉ）Ｎ１５－３０ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧ（配列番号５６）（Ｎ１５－３０は前記スペーサー配列に対応する）、
    （ｉｉ）配列番号５８、および
    （ｉｉｉ）配列番号４２、または
    （ｄ）（ｉ）Ｎ１５－３０ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡ（配列番号５７）（Ｎ１５－３０は前記スペーサー配列に対応する）、
    （ｉｉ）配列番号５９、および
    （ｉｉｉ）配列番号４、を含む前記ヌクレオチド配列から選択される、請求項８０または８１に記載の方法。
  83. 前記第１のスプリントオリゴヌクレオチドが、配列番号６０、配列番号４４、または配列番号６１に示される前記ヌクレオチド配列を含む、請求項８０～８２のいずれか一項に記載の方法。
  84. 前記第１のスプリントオリゴヌクレオチドのどの部分も前記スペーサー配列に相補的ではない、請求項８３に記載の方法。
  85. 前記第１のスプリントオリゴヌクレオチドが、前記スペーサー配列または前記スペーサー配列の前記３’末端に存在する１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０ヌクレオチドに相補的である、ヌクレオチド配列を有する３’末端をさらに含む、請求項８３に記載の方法。
  86. 前記第２のスプリントオリゴヌクレオチドが、配列番号６、配列番号４５、または配列番号５３に示される前記ヌクレオチド配列を含む、請求項８１～８５のいずれか一項に記載の方法。
  87. 前記第１のＲＮＡフラグメント、前記第２のＲＮＡフラグメント、および前記第３のＲＮＡフラグメントを提供することが、酵素的合成またはホスホロアミダイト化学を使用する前記ＲＮＡフラグメントの合成を含み、任意選択で合成後に前記ＲＮＡフラグメントを精製することを含む、請求項４０～８６のいずれか一項に記載の方法。
  88. ホスホロアミダイト化学を使用する前記ＲＮＡフラグメントの合成が、
    （ｉ）５’から３’もしくは３’から５’の方向の前記第１のＲＮＡフラグメントの合成、前記第２のＲＮＡフラグメントの合成、および前記第３のＲＮＡフラグメントの合成、または
    （ｉｉ）５’から３’もしくは３’から５’の方向の前記第１のＲＮＡフラグメントの合成、ならびに３’から５’の方向の前記第２のＲＮＡフラグメントの合成および前記第３のＲＮＡフラグメントの合成、を含む、請求項８７に記載の方法。
  89. 前記第１および第２のスプリントオリゴヌクレオチドを提供することが、酵素的合成またはホスホロアミダイト化学を使用する前記オリゴヌクレオチドの合成を含み、任意選択で合成後に前記オリゴヌクレオチドを精製することを含む、請求項４０～８８のいずれか一項に記載の方法。
  90. 前記第１のＲＮＡフラグメント、前記第２のＲＮＡフラグメント、および／または前記第３のＲＮＡフラグメントが、ＲＮＡ骨格に少なくとも１つの修飾を含む、請求項４０～８９のいずれか一項に記載の方法。
  91. 前記修飾が、２’メトキシ（２’ＯＭｅ）、２’フッ素（２’フルオロ）、２’－Ｏ－メトキシ－エチル（ＭＯＥ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、アンロックド核酸（ＵＮＡ）、架橋核酸、２’デオキシ核酸（ＤＮＡ）、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）からなる群から選択される、請求項９０に記載の方法。
  92. 前記第１のＲＮＡフラグメント、前記第２のＲＮＡフラグメント、および／または前記第３のＲＮＡフラグメントが、少なくとも１つの塩基修飾を含む、請求項４０～９１のいずれか一項に記載の方法。
  93. 前記塩基修飾が、２－アミノプリン、イノシン、チミン、２，６－ジアミノプリン、２－ピリミジノン、および５－メチルシトシンからなる群から選択される、請求項９２に記載の方法。
  94. 前記第１のＲＮＡフラグメント、前記第２のＲＮＡフラグメント、および／または前記第３のＲＮＡフラグメントが、少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含む、請求項４０～９３のいずれか一項に記載の方法。
  95. ハイブリダイズすることが、溶液中で行われ、前記ハイブリダイズすることが、アニーリングステップの有無にかかわらず行われる、請求項４０～９４のいずれか一項に記載の方法。
  96. 前記アニーリングステップが、（ｉ）約１０分未満の期間、前記溶液を約８０℃～約９５℃に加熱することと、（ｉｉ）約０．１℃～約２℃／秒の速度で、前記ライゲーションに使用される温度まで前記溶液を冷却することと、を含む、請求項９５に記載の方法。
  97. 前記溶液中の前記第１のスプリントオリゴヌクレオチドの濃度、前記第２のスプリントオリゴヌクレオチドの濃度、前記第１のＲＮＡフラグメントの濃度、前記第２のＲＮＡフラグメントの濃度、および前記第３のＲＮＡフラグメントの濃度が、ほぼ等しい、請求項９５または９６に記載の方法。
  98. 前記ライゲーションが、約１５℃～約４５℃、または約３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、もしくは４０℃で実行される、請求項４０～９７のいずれか一項に記載の方法。
  99. 前記ライゲーションが、約０．１～約４８時間、または約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０時間実行される、請求項４０～９８のいずれか一項に記載の方法。
  100. 前記ライゲーションが、プロテアーゼまたはキレート剤を使用することをさらに含む、請求項４０～９９のいずれか一項に記載の方法。
  101. 前記キレート剤が、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、または両方の組み合わせである、請求項１００に記載の方法。
  102. 前記ライゲーションが、１つ以上の混雑剤を使用することをさらに含む、請求項４０～１０１のいずれか一項に記載の方法。
  103. 前記１つ以上の混雑剤が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、フィコール（登録商標）、エチレングリコール、デキストラン、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１０２に記載の方法。
  104. 前記ライゲーションが、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％の完了まで進行する、請求項４０～１０３のいずれか一項に記載の方法。
  105. 合成後に前記ｇＲＮＡまたは前記ｓｇＲＮＡを精製することをさらに含む、請求項１～１０４のいずれか一項に記載の方法。
  106. 前記ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを精製することが、クロマトグラフィー法を使用して精製することを含む、請求項１０５に記載の方法。
  107. 前記クロマトグラフィー法が、逆相ＨＰＬＣ、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、もしくはポリアクリルアミドゲル精製、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項１０６に記載の方法。
  108. ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む二重分子ｇＲＮＡを生成する方法であって、前記方法が、
    ５’リン酸部分を含む末端領域を含む第１のＲＮＡフラグメント、および３’ヒドロキシル基を含む末端領域を含む第２のＲＮＡフラグメントを提供することであって、前記第１のＲＮＡフラグメント、前記第２のＲＮＡフラグメント、またはその両方が、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼに結合することができる配列の少なくとも一部分を含む、提供することと、
    ５’リン酸部分を含む前記末端領域で前記第１のＲＮＡフラグメントに相補的な第１の部分、および３’ヒドロキシル基を含む前記末端領域で前記第２のＲＮＡフラグメントに相補的な第２の部分を含むスプリントオリゴヌクレオチドを提供することと、
    前記第１のＲＮＡフラグメント、前記第２のＲＮＡフラグメント、および前記スプリントオリゴヌクレオチドを一緒にハイブリダイズして複合体を形成することと、
    前記ＲＮＡ複合体の間に存在するライゲーション部位でリガーゼを使用して前記第１および第２のＲＮＡフラグメントをライゲーションし、それによってｔｒａｃｒＲＮＡを合成することと、
    標的ＤＮＡ中の配列に相補的である配列を含むｃｒＲＮＡを提供することと、
    前記ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡがハイブリダイズすることを可能にし、それによって二重分子ｇＲＮＡを生成することと、を含む、方法。
  109. 前記ｃｒＲＮＡを提供することが、酵素的合成またはホスホロアミダイト化学を介して前記ｃｒＲＮＡを合成することを含む、請求項１０８に記載の方法。
JP2022531065A 2019-11-27 2020-11-25 Ｒｎａ分子を合成する方法 Pending JP2023503635A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962941174P 2019-11-27 2019-11-27
US62/941,174 2019-11-27
PCT/US2020/062342 WO2021108647A1 (en) 2019-11-27 2020-11-25 Methods of synthesizing rna molecules

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2023503635A true JP2023503635A (ja) 2023-01-31
JPWO2021108647A5 JPWO2021108647A5 (ja) 2023-12-04

Family

ID=73856352

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2022531065A Pending JP2023503635A (ja) 2019-11-27 2020-11-25 Ｒｎａ分子を合成する方法

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20220411841A1 (ja)
EP (1) EP4065711A1 (ja)
JP (1) JP2023503635A (ja)
CN (1) CN115335521A (ja)
AU (1) AU2020391215A1 (ja)
CA (1) CA3159501A1 (ja)
WO (1) WO2021108647A1 (ja)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023047340A1 (en) * 2021-09-24 2023-03-30 Crispr Therapeutics Ag HIGH PURITY gRNA SYNTHESIS PROCESS
WO2024048684A1 (ja) * 2022-08-31 2024-03-07 株式会社ジーンデザイン 核酸分子の製造方法
CN117660374A (zh) * 2022-09-08 2024-03-08 凯莱英医药集团（天津）股份有限公司 Rna连接酶在寡核苷酸制备上的应用

Family Cites Families (79)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5264A (en) 1847-08-28 Apparatus for operating carriage-brakes
US5177A (en) 1847-06-26 Wade haworth
US253A (en) 1837-07-05 Improvement in machines for thinning cotton-plants
US196A (en) 1837-05-15 Machine for mowing and heaping grain
US562A (en) 1838-01-09 Scale beam and weight
US233A (en) 1837-06-14 Improvement in plows
US5455A (en) 1848-02-22 Spinning-machine
US5563A (en) 1848-05-09 John drummond
US3687808A (en) 1969-08-14 1972-08-29 Univ Leland Stanford Junior Synthetic polynucleotides
US4469863A (en) 1980-11-12 1984-09-04 Ts O Paul O P Nonionic nucleic acid alkyl and aryl phosphonates and processes for manufacture and use thereof
US5023243A (en) 1981-10-23 1991-06-11 Molecular Biosystems, Inc. Oligonucleotide therapeutic agent and method of making same
US4476301A (en) 1982-04-29 1984-10-09 Centre National De La Recherche Scientifique Oligonucleotides, a process for preparing the same and their application as mediators of the action of interferon
US5550111A (en) 1984-07-11 1996-08-27 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education Dual action 2',5'-oligoadenylate antiviral derivatives and uses thereof
US5367066A (en) 1984-10-16 1994-11-22 Chiron Corporation Oligonucleotides with selectably cleavable and/or abasic sites
FR2575751B1 (fr) 1985-01-08 1987-04-03 Pasteur Institut Nouveaux nucleosides de derives de l'adenosine, leur preparation et leurs applications biologiques
US5166315A (en) 1989-12-20 1992-11-24 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US5185444A (en) 1985-03-15 1993-02-09 Anti-Gene Deveopment Group Uncharged morpolino-based polymers having phosphorous containing chiral intersubunit linkages
US5405938A (en) 1989-12-20 1995-04-11 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US5034506A (en) 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
US5235033A (en) 1985-03-15 1993-08-10 Anti-Gene Development Group Alpha-morpholino ribonucleoside derivatives and polymers thereof
US5264423A (en) 1987-03-25 1993-11-23 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US5276019A (en) 1987-03-25 1994-01-04 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
JP2828642B2 (ja) 1987-06-24 1998-11-25 ハワード フローレイ インスティテュト オブ イクスペリメンタル フィジオロジー アンド メディシン ヌクレオシド誘導体
US4924624A (en) 1987-10-22 1990-05-15 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education 2,',5'-phosphorothioate oligoadenylates and plant antiviral uses thereof
US5188897A (en) 1987-10-22 1993-02-23 Temple University Of The Commonwealth System Of Higher Education Encapsulated 2',5'-phosphorothioate oligoadenylates
JPH03503894A (ja) 1988-03-25 1991-08-29 ユニバーシィティ　オブ　バージニア　アランミ　パテンツ　ファウンデイション オリゴヌクレオチド　ｎ‐アルキルホスホラミデート
US5278302A (en) 1988-05-26 1994-01-11 University Patents, Inc. Polynucleotide phosphorodithioates
US5216141A (en) 1988-06-06 1993-06-01 Benner Steven A Oligonucleotide analogs containing sulfur linkages
US5175273A (en) 1988-07-01 1992-12-29 Genentech, Inc. Nucleic acid intercalating agents
US5134066A (en) 1989-08-29 1992-07-28 Monsanto Company Improved probes using nucleosides containing 3-dezauracil analogs
US5399676A (en) 1989-10-23 1995-03-21 Gilead Sciences Oligonucleotides with inverted polarity
US5264564A (en) 1989-10-24 1993-11-23 Gilead Sciences Oligonucleotide analogs with novel linkages
US5130302A (en) 1989-12-20 1992-07-14 Boron Bilogicals, Inc. Boronated nucleoside, nucleotide and oligonucleotide compounds, compositions and methods for using same
US5587361A (en) 1991-10-15 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having phosphorothioate linkages of high chiral purity
US5681941A (en) 1990-01-11 1997-10-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted purines and oligonucleotide cross-linking
US5587470A (en) 1990-01-11 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. 3-deazapurines
US5459255A (en) 1990-01-11 1995-10-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. N-2 substituted purines
US5321131A (en) 1990-03-08 1994-06-14 Hybridon, Inc. Site-specific functionalization of oligodeoxynucleotides for non-radioactive labelling
US5470967A (en) 1990-04-10 1995-11-28 The Dupont Merck Pharmaceutical Company Oligonucleotide analogs with sulfamate linkages
US5614617A (en) 1990-07-27 1997-03-25 Isis Pharmaceuticals, Inc. Nuclease resistant, pyrimidine modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression
US5618704A (en) 1990-07-27 1997-04-08 Isis Pharmacueticals, Inc. Backbone-modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through radical coupling
US5608046A (en) 1990-07-27 1997-03-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated 4'-desmethyl nucleoside analog compounds
US5610289A (en) 1990-07-27 1997-03-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogues
US5489677A (en) 1990-07-27 1996-02-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleoside linkages containing adjacent oxygen and nitrogen atoms
US5623070A (en) 1990-07-27 1997-04-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5677437A (en) 1990-07-27 1997-10-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5541307A (en) 1990-07-27 1996-07-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogs and solid phase synthesis thereof
US5602240A (en) 1990-07-27 1997-02-11 Ciba Geigy Ag. Backbone modified oligonucleotide analogs
MY107332A (en) 1990-08-03 1995-11-30 Sterling Drug Inc Compounds and methods for inhibiting gene expression.
US5214134A (en) 1990-09-12 1993-05-25 Sterling Winthrop Inc. Process of linking nucleosides with a siloxane bridge
US5561225A (en) 1990-09-19 1996-10-01 Southern Research Institute Polynucleotide analogs containing sulfonate and sulfonamide internucleoside linkages
US5596086A (en) 1990-09-20 1997-01-21 Gilead Sciences, Inc. Modified internucleoside linkages having one nitrogen and two carbon atoms
US5432272A (en) 1990-10-09 1995-07-11 Benner; Steven A. Method for incorporating into a DNA or RNA oligonucleotide using nucleotides bearing heterocyclic bases
US5719262A (en) 1993-11-22 1998-02-17 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having amino acid side chains
US5714331A (en) 1991-05-24 1998-02-03 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having enhanced binding affinity, sequence specificity and solubility
US5539082A (en) 1993-04-26 1996-07-23 Nielsen; Peter E. Peptide nucleic acids
US5571799A (en) 1991-08-12 1996-11-05 Basco, Ltd. (2'-5') oligoadenylate analogues useful as inhibitors of host-v5.-graft response
US5484908A (en) 1991-11-26 1996-01-16 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotides containing 5-propynyl pyrimidines
TW393513B (en) 1991-11-26 2000-06-11 Isis Pharmaceuticals Inc Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified pyrimidines
US5633360A (en) 1992-04-14 1997-05-27 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs capable of passive cell membrane permeation
US5434257A (en) 1992-06-01 1995-07-18 Gilead Sciences, Inc. Binding compentent oligomers containing unsaturated 3',5' and 2',5' linkages
US5476925A (en) 1993-02-01 1995-12-19 Northwestern University Oligodeoxyribonucleotides including 3'-aminonucleoside-phosphoramidate linkages and terminal 3'-amino groups
GB9304618D0 (en) 1993-03-06 1993-04-21 Ciba Geigy Ag Chemical compounds
JPH08508491A (ja) 1993-03-31 1996-09-10 スターリング ウインスロップ インコーポレイティド ホスホジエステル結合をアミド結合に置き換えたオリゴヌクレオチド
US5502177A (en) 1993-09-17 1996-03-26 Gilead Sciences, Inc. Pyrimidine derivatives for labeled binding partners
US5457187A (en) 1993-12-08 1995-10-10 Board Of Regents University Of Nebraska Oligonucleotides containing 5-fluorouracil
US5596091A (en) 1994-03-18 1997-01-21 The Regents Of The University Of California Antisense oligonucleotides comprising 5-aminoalkyl pyrimidine nucleotides
US5625050A (en) 1994-03-31 1997-04-29 Amgen Inc. Modified oligonucleotides and intermediates useful in nucleic acid therapeutics
US5525711A (en) 1994-05-18 1996-06-11 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Pteridine nucleotide analogs as fluorescent DNA probes
JP3756313B2 (ja) 1997-03-07 2006-03-15 武 今西 新規ビシクロヌクレオシド及びオリゴヌクレオチド類縁体
NZ503765A (en) 1997-09-12 2002-04-26 Exiqon As Bi-cyclic and tri-cyclic nucleotide analogues
US20030158403A1 (en) 2001-07-03 2003-08-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Nuclease resistant chimeric oligonucleotides
US8697359B1 (en) 2012-12-12 2014-04-15 The Broad Institute, Inc. CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products
CN107208086A (zh) * 2014-10-17 2017-09-26 霍华德休斯医学研究所 基因组探针
US10059940B2 (en) * 2015-01-27 2018-08-28 Minghong Zhong Chemically ligated RNAs for CRISPR/Cas9-lgRNA complexes as antiviral therapeutic agents
JP2018515142A (ja) * 2015-05-15 2018-06-14 ダーマコン，インコーポレイテッド． Ｃａｓ９介在遺伝子編集用の合成シングルガイドｒｎａ
WO2017180711A1 (en) * 2016-04-13 2017-10-19 Editas Medicine, Inc. Grna fusion molecules, gene editing systems, and methods of use thereof
CA3029121A1 (en) 2016-06-29 2018-01-04 Crispr Therapeutics Ag Compositions and methods for gene editing
KR20190089175A (ko) * 2016-11-18 2019-07-30 진에딧 인코포레이티드 표적 핵산 변형을 위한 조성물 및 방법

Also Published As

Publication number Publication date
US20220411841A1 (en) 2022-12-29
CN115335521A (zh) 2022-11-11
AU2020391215A1 (en) 2022-06-02
EP4065711A1 (en) 2022-10-05
WO2021108647A1 (en) 2021-06-03
CA3159501A1 (en) 2021-06-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20230159919A1 (en) Modified crispr rna and modified single crispr rna and uses thereof
JP6932698B2 (ja) アルファ１アンチトリプシン欠乏症の治療のための材料および方法
EP3356529B1 (en) Compositions and methods for inhibiting gene expression of lpa
Gryaznov Oligonucleotide N3′→ P5′ phosphoramidates as potential therapeutic agents
JP5805088B2 (ja) 遺伝子発現を阻害する組成物およびその使用
JP2023503635A (ja) Ｒｎａ分子を合成する方法
JP2023036613A (ja) 第ｘｉｉ因子遺伝子発現を阻害するための組成物および方法
JP7197463B2 (ja) Ｓｍｎ２の調節のための化合物及び方法
CN115397436A (zh) 用于抑制PNPLA3表达的RNAi剂、其药物组合物和使用方法
CA3067333A1 (en) Enzymatic replacement therapy and antisense therapy for pompe disease
TW202020152A (zh) 調節rtel1表現之寡核苷酸
US20200318103A1 (en) Stereodefined sub-motif optimisation methods
JP2023526090A (ja) オリゴヌクレオチド
US20230220379A1 (en) HIGH PURITY gRNA SYNTHESIS PROCESS
IL159759A (en) History of oligoribonucleotide for deliberate inhibition of gene expression, medicinal preparations containing them, methods for their preparation and use
US20230105319A1 (en) PRODRUG INCORPORATED sgRNA SYNTHESIS
JP7246304B2 (ja) ポンペ病用アンチセンスオリゴマー化合物
TWI836693B (zh) 抑制ｌｐａ之基因表現之組合物及方法
WO2024046937A1 (en) Threose nucleic acid antisense oligonucleotides and methods thereof
TW202329983A (zh) Ｒｎａ編輯
CN114929336A (zh) 用于调节基因剪接的化合物和方法

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20231124

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20231124