JPH0856679A - Ｒｎａ切断性又はｒｎａ結合性オリゴヌクレオチド - Google Patents

Ｒｎａ切断性又はｒｎａ結合性オリゴヌクレオチド

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JPH0856679A
JPH0856679A JP7179937A JP17993795A JPH0856679A JP H0856679 A JPH0856679 A JP H0856679A JP 7179937 A JP7179937 A JP 7179937A JP 17993795 A JP17993795 A JP 17993795A JP H0856679 A JPH0856679 A JP H0856679A
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rna
imidazole
lysine
antisense oligonucleotide
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JP7179937A
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Anuschirwan Peyman
アヌーシルヴアーン・パイマン
Eugen Dr Uhlmann
オイゲン・ウールマン
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Hoechst AG
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Abstract

(57)【要約】 【構成】 約６〜１００のヌクレオチドを含む２つのア
ンチセンスオリゴヌクレオチドＡＯ−１及びＡＯ−２を
含み、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは標的ＲＮ
Ａの隣接位置に結合し、そして５′末端又は３′末端に
おいて適当なスペーサーを経て共役分子Ａ及びＢに連結
しており、共役分子Ａ及びＢは各々それ自身は非反応性
であるが、空間的近傍に接近させるとユニットを形成し
その結果ＲＮＡを接触的に切断することができるか、又
は空間的近接により活性化されるとその結果ＲＮＡの共
有結合を生じるタンパク質合成抑制するための治療組成
物。 【効果】 本組成物はタンパク質合成を抑制するための
治療組成物として有用である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】本発明は標的ＲＮＡの隣接位置に結合し、
そして５′末端又は３′末端において適当なスペーサー
を介して共役分子に連結している２つのアンチセンスオ
リゴヌクレオチドを含むタンパク質合成を抑制するため
の治療組成物に関する。アンチセンスオリゴヌクレオチ
ドはタンパク質合成を抑制するため広く使用されている
（例えばE. Uhlmann, A. Peyman, Chem. Rev. 90 (199
0) 543が参照される）。それらの作用様式は抑制される
タンパク質をコードするプレ−ｍＲＮＡ又はＲＮＡの相
補的配列とのハイブリッド形成に基づく。このハイブリ
ッド形成の結果として、種々の機作、例えば転写の遮
断、スプライシング過程又はｍＲＮＡ熟成の阻害、又は
ＲＮエースＨによるｍＲＮＡの分解などがおそらく影響
を与えることにより、このタンパク質の生合成は抑制さ
れる。しかしながら、後者はヌクレアーゼ分解に対する
アンチセンスオリゴヌクレオチドの安定化に必要な小数
の化学変種の場合にのみ実現される。先行技術の概観は
例えばJ.F. Milligan,M.D. Matteucci及びJ.C. Martin,
J. Med. Chem. 36 (1993) 1923及びS.T. Crooke, Ann
u. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32 (1992) 329によって
与えられる。ＲＮＡを破壊し、その結果タンパク質生合
成を抑制する別の可能性は化学的ヌクレアーゼによりも
たらされる。ＲＮＡを切断することができるあらゆる系
列の化学的ヌクレアーゼが存在する（D.S. Sigman等、C
hem. Rev. 93 (1993) 2295；D.S. Sigman等、Acc. Che
m. Res. 26 (1992) 98が参照される）。
【０００２】１） 例えば、２つのイミダゾール誘導体
の空間的近接のみを要求し、これはサイクロデキストリ
ン環系への共役により実現されるＲＮＡ切断酵素リボヌ
クレアーゼＡのモデルが記述されている（Breslow, Ac
c. Chem. Res. 24 (1991) 317も参照される）。サイク
ロデキストリン上にイミダゾールが１つのみの場合は反
応性が極めて乏しい。
【０００３】２） 別のリボヌクレアーゼモデルは J.
Smith 等 (J. Am. Chem. Soc. 115(1993) 362) により
記述されており、これは式Ａ
【化２】 の化合物の存在下におけるイミダゾールにより、高度に
促進されたＲＮＡの切断に成功している。
【０００４】３） 式Ｂ又はＣ
【化３】 の分子、１,１０−フェナントロリン−２−カルビノー
ル又はＮ−ドデシル−２−（アミノメチル）−１,１０
−フェナントロリンの亜鉛錯体を使用するもう１つのＲ
Ｎエースのモデルが記述されている（D.S. Sigman等、C
hem. Rev. 93（1993) 2295）。
【０００５】４） 消去機構によりＤＮＡを切断するこ
とができるＬ−リジル−Ｌ−トリプトファニル−Ｌ−リ
ジンのようなトリペプチドがD.S. Sigman等（Chem. Re
v. 93(1993) 2295）により記述されている。 ５） ＲＮＡ又はＤＮＡを酸化的に切断することができ
る多数のさらに別の金属錯体、例えばＲＮＡ切断のため
の１,１０−フェナントロリン（ＯＰ）及び銅の２：１
錯体又は八面体(ＯＰ)3Ｒｕ2＋錯体又は金属キレート化
トリペプチド、例えばグリシル−グリシル−Ｌ−ヒスチ
ジンのＣｕ（II）又はＮｉ（II）との錯体又はグリシル
−Ｌ−ヒスチジル−Ｌ−リジンのＣｕ（II）との錯体が
記述されている（D.S. Sigman等、Chem. Rev. 93 (199
3) 2295）。
【０００６】これらの化学的ヌクレアーゼの欠点はそれ
らがＤＮＡ又はＲＮＡ配列を特異的に認識することがで
きず、従って極端に非選択的なことである。そこで、Ｒ
ＮＡとの錯体が、例えばオリゴヌクレオチドと架橋剤例
えばソラレン又はアクリジンのようなインターカレータ
ーとの共役により安定化されるという事実に基づく種々
のアンチセンスオリゴヌクレオチドの作用を増大させる
ための出発点がある（J.Goodchild, Bioconjugate Che
m. 1 (1990) 165）。他の出発点はアンチセンスオリゴ
ヌクレオチドと化学的ヌクレアーゼとの連結である。こ
のためにはオリゴヌクレオチドを、ＲＮＡを切断するこ
とができる分子、例えばＥＤＴＡ−Ｆｅ（II）又はｏ−
フェナントロリン−Ｃｕ（Ｉ）又はポルフィリン−Ｆｅ
（II）のような金属錯体（E. Uhlmann及びA. Peyman, C
hemical Reviews90 (1990) 543）、又はＷＯ ９１／１
９７３０に記述されているようなターピリジン−Ｃｕ
（II）、ビピリジン−Ｃｕ（II）など、又は ＷＯ ９３
／０２６８９に記述されているようなオリゴヌクレオチ
ド−トリペプチド共役体と連結させる。オリゴヌクレオ
チドと酵素例えばブドウ状球菌ヌクレアーゼとの共役体
も記述されている（E. Uhlmann及びA. Peyman, Chemica
l Reviews 90 (1990) 543)。J.K. Bashkin等（J. Org.
Chem. 55 (1990) 5125）及びN.N. Polushin等 (J. Org.
Chem. 58 (1993) 4606) はヌクレオシドモノマー−イミ
ダゾール共役体をオリゴヌクレオチドに組み入れそして
イミダゾールのＲＮＡ切断活性を組み合わせることを目
的とする前記共役体の合成及びオリゴヌクレオチドの特
異的結合を記述している。
【０００７】この技術の大きな欠点はそのような共役体
の特異性の欠除である。架橋又はＲＮＡ切断はオリゴヌ
クレオチドが標的ＲＮＡに特異的に結合する前において
さえ起こる危険がある。このためWebb及びMatteucci (N
ucl. Acids Res. 14 (1986)7661; J. Am. Chem. Soc. 1
08 (1986) 2764) は「ハイブリッド形成がひきがねとな
る架橋（hybridization-triggered crosslinking）」な
る用語を導入し、ハイブリッド形成が起こった後におい
てのみ標的ＲＮＡと反応することができる５−メチル−
Ｎ4,Ｎ4−エタノシトシン含有オリゴヌクレオチドを使
用した。
【０００８】ＲＮＡ切断については、補助試薬又は照射
の助けによることなく生理的条件下において可能ならば
望まれるところであるが、そのような考え方はない。従
ってこの研究の目的はそのような化学的ヌクレアーゼの
選択性又は特異性を改良することである。従って、本発
明は約６〜１００、好ましくは約１０〜４０、特に約１
２〜２５のヌクレオチドを含む２つのアンチセンスオリ
ゴヌクレオチドＡＯ−１及びＡＯ−２を含むタンパク質
合成を抑制するための治療組成物であって、前記アンチ
センスオリゴヌクレオチドは標的ＲＮＡの隣接位置に結
合し、そして５′末端又は３′末端（化学的ヌクレアー
ゼの解裂により得られる）において適当なスペーサーを
経て共役分子Ａ及びＢに連結しており、共役分子Ａ及び
Ｂは各々それ自身は非反応性であるが、空間的近傍に接
近させるとＲＮＡを接触的に切断することができるユニ
ットを形成するか、又は空間的近接により活性化される
とその結果ＲＮＡの共有結合を生じる治療組成物に関す
る。
【０００９】図１に示すように、Ａ及びＢの反応性ユニ
ットは両アンチセンスオリゴヌクレオチドが標的ＲＮＡ
の隣接位置に特異的に結合している場合にのみ形成され
る。架橋又はＲＮＡ切断はアンチセンスオリゴヌクレオ
チドが標的ＲＮＡに特異的に結合した後においてのみ起
こる。従って、反応性基の導入は顕著な特異性の獲得に
結び付き、そしてそうでない場合通常起こる特異性の喪
失に結び付かない。
【００１０】好ましくは、 ａ） Ａ＝Ｂ＝イミダゾール、 ｂ） Ａ＝イミダゾール、Ｂ＝式Ｉの分子、
【化４】 ｃ） Ａ＝Ｂ＝１,１０−フェナントロリン、 ｄ） Ａ＝Ｌ−リジン、Ｂ＝Ｌ−トリプトファニル−Ｌ
−リジン、 ｅ） Ａ＝Ｌ−リジル−Ｌ−トリプトファン、Ｂ＝Ｌ−
リジン、 ｆ） Ａ＝グリシン、Ｂ＝グリシル−Ｌ−ヒスチジン、 ｇ） Ａ＝グリシル−グリシン、Ｂ＝Ｌ−ヒスチジン、 ｈ） Ａ＝グリシン、Ｂ＝Ｌ−ヒスチジル−Ｌ−リジ
ン、 ｉ） Ａ＝グリシル−Ｌ−ヒスチジン、Ｂ＝Ｌ−リジン である、適当なスペーサーを経て結合する共役分子Ａ及
びＢを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドＡＯ−１及
びＡＯ−２であって、ｃ）及びｆ）〜ｉ）からの共役分
子は各々の場合、銅（II）錯体形成のため適当なスペー
サーを経てオリゴヌクレオチドに結合するアンチセンス
オリゴヌクレオチドを使用する。共役分子Ａ＝Ｂ＝イミ
ダゾールが特に好ましい。
【００１１】アンチセンスオリゴヌクレオチドは修飾さ
れなくても又は修飾されてもよく、当業者によく知られ
た修飾法を使用することが可能である。特にこれらはオ
リゴヌクレオチドの特性、例えばヌクレアーゼ安定性及
び細胞利用性を改善する化学修飾を意味するものとして
理解され、そして当業者が精通しているそれである（例
えば E. Uhlmann及びA. Peyman, Chem. Rev. 90 (1990)
543; P.D. Cook, Anti-Cancer Drug Design 6 (1991)
585; J. Goodchild, Bioconjugate Chem. 1 (1990) 16
5; S.L. Beaucage及びR.P. Iyer, Tetrahedron 49 (199
3) 6123; F. Eckstein編集、「オリゴヌクレオチド及び
類似体−実際的な研究方法（Oligonucleotides and Ana
logues-A Practical Approach）」，IRL Press 1991が
参照される）。
【００１２】そのような修飾法とは、例えば ａ） ホスフェートブリッジの修飾、例えばホスホロチ
オエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネー
ト、ホスホロアミデート、ボラノホスフェート、ホスフ
ェートメチルエステル、ホスフェートエチルエステル、
フェニルホスフェート、好ましくはホスホロチオエート
及びメチルホスホネートのような修飾、この修飾により
アンチセンスオリゴヌクレオチドのすべてのホスフェー
トブリッジの置換を排除することを意図するものであ
り、 ｂ） ホスフェートブリッジの置換、例えばホルムアセ
タール、３′−チオホルムアセタール、メチルヒドロキ
シルアミン、オキシム、メチレンジメチルヒドラゾ、ジ
メチレンスルホン又はシリル基、好ましくはホルムアセ
タール及び３′−チオホルムアセタールによる置換、
【００１３】ｃ） 糖の修飾、例えばα−アノマー糖、
２′−Ｏ−メチルリボース、２′−Ｏ−ブチルリボー
ス、２′−Ｏ−アリルリボース、２′−フルオロ−２′
−デオキシリボース、２′−アミノ−２′−デオキシリ
ボース、α−アラビノフラノース及び炭素環式糖類似
体、好ましくは２′−Ｏ−メチルリボースのような修
飾、 ｄ） ワトソン−クリック塩基対の特異性を変更しない
塩基の修飾、例えば５−プロピン−２′−デオキシウリ
ジン、５−プロピン−２′−デオキシシチジン、５−フ
ルオロ−２′−デオキシシチジン、５−フルオロ−２′
−デオキシウリジン、５−ヒドロキシメチル−２′−デ
オキシウリジン、５−メチル−２′−デオキシシチジ
ン、５−ブロモ−２′−デオキシシチジン、好ましくは
５−プロピン−２′−デオキシウリジン及び５−プロピ
ン−２′−デオキシシチジンのような修飾、 ｅ） 糖リン酸主鎖の置換、例えば「モルホリノヌクレ
オシド」オリゴマーによる置換（E.P. Stirchak等、Nuc
leic Acids Res. 17 (1989) 6129）、又は「ペプチド核
酸」による置換（例えばHarvey等、Science 258 (1992)
1481）、 ｆ） ５′−及び３′−ホスフェート、並びに５′−及
び３′−チオホスフェート、 ｇ） 共役体、例えば３′末端又は５′末端への共役体
（３′−誘導体化についてはＤＥ−Ｐ ４４ ２０ ７３
７.９ (ＨＯＥ ９４／Ｆ １６１）も参照される）、例
えばポリリジンとの、インターカレーター例えばピレ
ン、アクリジン、フェナジン及びフェナントリジンと
の、蛍光性化合物例えばフルオレセインとの、架橋剤例
えばソラレン及びアジドプロフラビンとの、親油性分子
例えば（Ｃ12〜Ｃ20）−アルキルとの、脂質例えば１,
２−ジヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールとの、ステ
ロイド例えばコレステロール及びテストステロンとの、
ビタミン例えばビタミンＥとの、ポリ又はオリゴエチレ
ングリコールとの、（Ｃ12〜Ｃ18）−アルキルホスフェ
ートエステルとの、又は−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ（ＯＨ）−
Ｏ−（Ｃ12〜Ｃ18）−アルキルとの共役体、 ｈ） ３′−３′−及び５′−５′−逆位（例えばM. K
oga等、J. Org. Chem.56 (1991) 3757）である。
【００１４】好ましい修飾は： ａ） ホスフェートブリッジのホスホロチオエート、ホ
スホロジチオエート又はメチルホスホネートによる置
換、この修飾によりアンチセンスオリゴヌクレオチドの
すべてのホスフェートブリッジの置換を排除することを
意図するものであり、そして ｂ） 親油性分子例えば（Ｃ12〜Ｃ20）−アルキルと
の、ステロイド例えばコレステロール及びテストステロ
ンとの、ポリ又はオリゴエチレングリコールとの、ビタ
ミンＥとの、インターカレーター例えばピレンとの、
（Ｃ14〜Ｃ18）−アルキルホスフェートジエステルと
の、そして−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ（ＯＨ）−Ｏ−（Ｃ12〜
Ｃ16）−アルキルとの共役体である。
【００１５】特に好ましい修飾は ａ） ５′末端及び／又は３′末端における１つ、２つ
又は３つのホスフェートブリッジのホスホロチオエート
による置換、及び ｂ） ５′末端及び／又は３′末端における１つ、２つ
又は３つのホスフェートブリッジのホスホロチオエート
による置換、そしてさらに中心における１〜５つのホス
フェートブリッジのホスホロチオエートによる置換であ
る。
【００１６】本発明はさらに約６〜１００、好ましくは
約１０〜４０、特に約１２〜２５のヌクレオチドを含む
２つのアンチセンスオリゴヌクレオチドＡＯ−１及びＡ
Ｏ−２であって、標的ＲＮＡの隣接位置に結合し、そし
て５′末端又は３′末端において適当なスペーサーを経
て共役分子Ａ及びＢに連結しており、共役分子Ａ及びＢ
は各々それ自身は非反応性であるアンチセンスオリゴヌ
クレオチドを、共役分子Ａ及びＢがユニットを形成し、
そしてＲＮＡを接触的に切断するか、又は活性化されそ
してその結果ＲＮＡの共有結合を生じるように空間的近
傍に接近させることを含むＲＮＡの切断又は架橋の方法
に関する。
【００１７】本発明はさらにアンチセンスオリゴヌクレ
オチドＡＯ−１及びＡＯ−２、特に３′及び５′が上述
のように共役分子Ａ及びＢに連結したオリゴヌクレオチ
ド、特に好ましくは式 及び の３′及び５′がイミダ
ゾールに連結したオリゴヌクレオチドである。
【００１８】
【化５】 本発明はさらに当業者によく知られた方法（例えばE. U
hlmann及びA. Peyman,Chem. Rev. 90 (1990) 543；「ア
ンチセンスの研究及びその応用（Antisense Research a
nd Applications）」、Crooke及びLebleu 編集、CRC Pr
ess, Boca Raton, 1993）によるアンチセンスオリゴヌ
クレオチドＡＯ−１及びＡＯ−２の調製方法に関し、こ
の方法は上述の共役分子Ａ及びＢのオリゴヌクレオチド
への適当なスペーサーを経る連結を含む。
【００１９】スペーサーの長さ及び化学構造は大きく変
化することが可能である。このスペーサーは、例えば
（Ｃ1〜Ｃ18）−アルキルであることが可能であり、こ
れは任意にアミノ、（Ｃ1〜Ｃ4）−アルキルアミノ、ジ
−（Ｃ1〜Ｃ4）−アルキルアミノ、ヒドロキシル、オキ
シ、（Ｃ1〜Ｃ4）−アルコキシ、ハロゲン例えばフッ
素、塩素又は臭素、シアノ、カルボキシル、（Ｃ6〜Ｃ
12）−アリール、（Ｃ6〜Ｃ 12）−ヘテロアリール又は
Ｏ、Ｎ及びＳの系列からのヘテロ原子により１回又は複
数回置換されてよく、そして任意に１回又は複数回不飽
和であることができ、そして枝分かれしても又はしなく
てもよい。ここで前記ヘテロ原子は各々の場合１〜８回
出現することがあり得る。アルキル鎖の１つ又は複数の
原子がＯ、Ｎ及びＳの系列からのヘテロ原子により置換
されることも可能であり、そしてスペーサーはさらに１
〜３つのホスフェート、チオホスフェート、ジチオホス
フェート、カルボキサミド、カルボン酸エステル、アリ
ール又はヘテロアリールブリッジを含むことができる。
好ましくは、スペーサーは（Ｃ1〜Ｃ18）−アルキルで
あり、そのアルキル鎖の１〜６原子をＯ又はＮで置換す
ることができ、そしてこのスペーサーはさらにホスフェ
ートブリッジ又はカルボキサミドブリッジを含むことも
可能である。
【００２０】式II及びIIIの化合物の例は式IV及びＶ
【化６】 （式中、ｎ及びｍ２〜１８、特に好ましくは３〜８の値
である）の化合物である。
【００２１】式IVのアンチセンスオリゴヌクレオチドは
最初にオリゴヌクレオチドを既知の方法により合成し、
たいていはジメトキシトリチル基である５′−保護基を
除き、次いで式VI
【化７】 （式中、ＭＭＴｒはモノメトキシトリチル基である）の
化合物とオリゴヌクレオチド化学において慣用的な方法
（S. Agrawal編集、「オリゴヌクレオチド及び類似体の
プロトコル（Protocols for Oligonucleotides and Ana
logs）」, Methods in Molecular Biology, Vol. 20, H
umana Press 1993）により反応させ、次いで保護基を公
知の方法、例えばジクロロ酢酸及びＮＨ3水を用いる処
理により除去することにより得られる。もしくは、VIの
類似の誘導体をＨ−ホスホネート法を用いることにより
又はトリエステル法により導入することもでき、又は代
替物であるホスホロアミダイト誘導体を使用することが
できる。ＭＭＴｒの代わりに、他の適当な保護基、例え
ばトリチル、ジメトキシトリチル及びピキシル（９−
（９−フェニル）−キサンテニル）を使用することもで
きる。
【００２２】式VIの化合物はJ. March（Advanced Organ
ic Chemistry, 3rd Ed., J. Wiley,New York 1985）及
びS. Agrawal（編集、「オリゴヌクレオチド及び類似体
のプロトコール」、Methods in Molecular Biology, Vo
l. 20, Humana Press 1993）に記載された方法により合
成することができる。
【００２３】式Ｖのアンチセンスオリゴヌクレオチドは
最初に公知の方法により３′−アミノスペーサーを持つ
オリゴヌクレオチドを合成し、次いでそれを式VII
【化８】 （式中、ＭＭＴｒはモノメトキシトリチルである）の化
合物と既知の方法、例えばS. Agrawal（編集、「オリゴ
ヌクレオチド及び類似体のプロトコール」、Methods in
Molecular Biology, Vol. 20, Humana Press 1993）に
記載された方法により反応させ、次いでＭＭＴｒ保護基
を除くことにより得られ、このＭＭＴｒ基は好ましくは
酢酸で処理して除く。ＭＭＴｒの代わりに、他の適当な
保護基例えばトリチル、ジメトキシトリチル及びピキシ
ルも使用することができる。
【００２４】本発明はさらに本発明のオリゴヌクレオチ
ドを生理的に許容される賦形剤及び適切ならば、さらに
添加剤及び／又は補助剤を使用して適当な製剤形体にす
ることを含む治療組成物の製造方法に関する。本発明の
治療組成物は、例えば、ウィルス例えばＨＩＶ、ＨＳＶ
−１、ＨＳＶ−２、インフルエンザ、ＶＳＶ、Ｂ型肝炎
又は乳頭腫ウィルスによりひき起こされる病気の治療、
又は癌の治療に使用することができ、後者の場合、例え
ば癌の形成又は癌の生長の原因である標的に向けられる
オリゴヌクレオチド配列を使用することが可能である。
そのような標的とは、例えば １） 核腫瘍タンパク質、例えばｃ−ｍｙｃ、Ｎ−ｍｙ
ｃ、ｃ−ｍｙｂ、ｃ−ｆｏｓ、ｃ−ｆｏｓ／ｊｕｎ、Ｐ
ＣＮＡ．ｐ１２０、 ２） 細胞質／膜関連腫瘍タンパク質、例えばＥＪ−ｒ
ａｓ、ｃ−Ｈａ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ、ｒｒｇ、ｂｃｌ
−２、ｃｄｃ−２、ｃ−ｒａｆ−１、ｃ−ｍｏｓ、ｃ−
ｓｒｃ、ｃ−ａｂｌ、 ３） 細胞受容体、例えばＥＧＦ−受容体、ｃ−ｅｒｂ
Ａ、レチノイド受容体、プロティンキナーゼ調節サブユ
ニット、ｃ−ｆｍｓ、 ４） サイトカイン、生長因子、細胞外マトリックスタ
ンパク質、例えばＣＳＦ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−１ａ、
ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ｂＦＧＦ、ミエロブ
ラスチン又はフィブロネクチンである。
【００２５】本発明の治療組成物はその上、例えばイン
テグリン又は細胞間接着受容体、例えばＶＬＡ−４、Ｖ
ＬＡ−２、ＩＣＡＭ又はＥＬＡＭにより影響される病気
の治療に適している。この治療組成物は経口的に投与す
ることができる医薬製剤の形で、例えば錠剤、コート錠
剤、硬又は軟ゼラチンカプセル、溶液、乳濁液又は懸濁
液の形で使用することができる。それらは直腸内に、例
えば坐薬の形で、又は非経口的に、例えば注射溶液の形
で投与することもできる。医薬製剤の製造のため、オリ
ゴヌクレオチドは治療的に不活性の有機及び無機賦形剤
で加工処理することができる。錠剤、被覆錠剤及び硬ゼ
ラチンカプセルに用いるそのような賦形剤の例は乳糖、
コーンスターチ又はその誘導体、獣脂、及びステアリン
酸又はその塩である。溶液の製造のための適当な賦形剤
は水、ポリオール、蔗糖、転化糖及びブドウ糖である。
注射溶液の適当な賦形剤は水、アルコール、ポリオー
ル、グリセロール及び植物油である。坐薬の適当な賦形
剤は植物油及び硬化油、ワックス、脂肪及び半流動性ポ
リオールである。医薬製剤は保存料、溶媒、安定剤、湿
潤剤、乳化剤、甘味料、着色剤、着香料、浸透圧改変用
塩、緩衝剤、コーティング組成物、抗酸化剤、及び適当
なら他の治療活性物質を含むこともできる。
【００２６】好ましい投与のしかたは注射である。この
ためには、本発明のオリゴヌクレオチドを液体溶液、好
ましくは生理的に許容される緩衝液、例えばハンクス溶
液又リンゲル溶液を用いて調剤する。しかしながら、本
発明のオリゴヌクレオチドは固体形体に調剤しそして使
用前溶解するか又は懸濁することもできる。全身系投与
のための好ましい用量は１日当たり体重kg当たり約０.
０１mg〜約５０mgである。
【００２７】
【実施例】
１） β−シアノエチルＮ,Ｎ−ジイソプロピル−１−
（６−〔３′−（４″−メトキシトリフェニルメチル）
イミダゾール−５′−イルメチル〕オキシ）ヘキシル−
Ｏ−ホスホロアミダイト １ａ．１−第三ブチルジメチルシルオキシ−６−ブロモ
ヘキサン ５ｇ（２７.８ミリモル）の６−ブロモ−１−ヘキサノ
ールを１０mlの無水ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に
溶解し、この溶液を４.７３ｇ（６９ミリモル）のイミ
ダゾール及び５.０２ｇ（３３ミリモル）の第三ブチル
ジメチルクロロシランで処理しそして３５℃で１０時間
攪拌した。５０mlの水を添加し、次いで反応混合物を室
温で３０分間攪拌した。その後水とジクロロメタン（Ｄ
ＣＭ）との間で分配し、有機層をＮａ2ＳＯ4で乾燥しそ
して溶媒を真空下で蒸発させた。生成物をシリカゲルク
ロマトグラフィー（ｎ−ヘプタン／酢酸エチル（ＥＡ）
１：１）により精製した。 収得量：5.02ｇ（62％)；1 H-NMR(DMSO, 200MHz): 0.02(s, 6H, Si-CH3); 0.86(s,
9H, Si-tBu); 1.21-1.57(m, 4H, (CH2)2); 1.60-1.85
(m, 2H, CH2); 3.48-3.70(m, 4H, CH2-Br及びCH 2-O)
【００２８】１ｂ．３−（４′−メトキシトリフェニル
メチル）−５−ヒドロキシメチルイミダゾール ３ｇ（２２.３ミリモル）の５−ヒドロキシメチルイミ
ダゾール塩酸塩を無水アセトニトリルと一緒に２回同時
蒸発させ、次いで１００mlの無水ピリジンに懸濁した。
７.２７ｇ（６７ミリモル）のトリメチルクロロシラン
を氷冷しながら添加した。混合物を室温で３０分間攪拌
し、次いで１０.３４ｇ（３３.５ミリモル）の４−メト
キシトリフェニルクロロメタンを添加し、混合物を室温
で３時間攪拌した。氷冷しながら、最初に水２５ml、次
に濃アンモニア５０mlを滴加し、混合物を室温で３０分
間攪拌し、次いで溶媒を真空下で溜去した。残留物を水
とＤＣＭとの間で分配し、有機相をＮａ2ＳＯ4で乾燥
し、そして溶媒を真空下で蒸発させた。残留物をエーテ
ルと一緒に攪拌し、吸引しながら濾別しそしてエーテル
で洗浄した。 収得量：6.33ｇ（77％)； MS(FAB): m／e＝377.3（Ｍ＋Li+, 30％)；1 H-NMR(DMSO, 200MHz): 3.77(s, 3H, OCH3); 4.33(d, 2
H, CH2-O); 4.85(t, 1H, OH); 6.64-7.50(m, 16H, Ar-
H, イミダゾール-H)
【００２９】１ｃ．１−第三ブチルジメチルシルオキシ
−６−（３′−（４″−メトキシトリフェニルメチル）
イミダゾール−５′−イルメチル）オキシ）ヘキサン １２９.３mg（２.９ミリモル）の水素化ナトリウム（５
５〜６５％、油性分散物）を１０mlのｎ−ヘプタンで洗
浄しそして１５mlの無水ＤＭＦに懸濁した。次に１ｇ
（２.７ミリモル）の３−（４′−メトキシトリフェニ
ルメチル）−５−ヒドロキシメチルイミダゾール（実施
例１ｂ）を添加し、混合物を室温で１時間攪拌した。次
いで１０mlの無水ＤＭＦに溶解した０.８７７ｇ（２.９
ミリモル）の１−第三ブチルジメチルシルオキシ−６−
ブロモヘキサン（実施例１ａ）を１０分間の間に滴下
し、そして混合物を室温で１２時間攪拌した。次に５０
mlの水を添加し、反応混合物を室温で１０分間攪拌し、
水と酢酸エチル（ＥＡ）との間で分配し、有機相をＮａ
2ＳＯ4で乾燥し、そして溶媒を真空下で蒸発させた。生
成物をシリカゲルクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＥＡ／
トリエチルアミン（ＴＥＡ）９０：９：１）により精製
した。 収得量：1200mg（70％)； MS(FAB): m／e＝591.5（Ｍ＋Li+, 30％)；1 H-NMR(DMSO, 200MHz): 0.01(s, 6H, Si-CH3); 0.83(s,
9H, Si-tBu); 1.19-1.35(m, 4H, (CH2)3); 1.36-1.54
(m, 4H, (CH2)2); 3.35(t, 2H, CH2-O); 3.35(t, 2H, C
H2-Br); 3.76(s, 3H, OCH3); 4.25(s, 2H, CH2-O); 6.7
5-7.48(m, 16H,Ar-H, イミダゾール-H）
【００３０】１ｄ．１−〔６−（３′−（４″−メトキ
シトリフェニルメチル）イミダゾール−５′−イルメチ
ル）オキシ〕ヘキサノール １２００mg（２.１ミリモル）の１−第三ブチルジメチ
ルシロキシ−６−（３′−（４″−メトキシトリフェニ
ルメチル）イミダゾール−５′−イルメチル）オキシ）
ヘキサン（実施例１ｃから）を５mlの無水テトラヒドロ
フラン（ＴＨＦ）及び３mlの無水ＤＭＦに溶解し、そし
てこの溶液をフッ化テトラブチルアンモニウム（無水Ｄ
ＭＦ中１.１Ｍ）３.７３ml（４.１ミリモル）の溶液で
０℃で処理し、室温で２時間攪拌した。反応混合物を蒸
発させそしてシリカゲルクロマトグラフィー（ＤＣＭ／
ＥＡ／ＴＥＡ ９５：４：１）により精製した。 収率：100％； MS(FAB): m／e＝477.3（Ｍ＋Li+)；1 H-NMR(DMSO, 200MHz): 1.15-1.58(m, 8H, (CH2)4); 3.
25-3.42(m, 4H, CH2-O及びCH2-OH); 3.78(s, 3H, OC
H3); 4.21-4.36(m, 3H, イミダゾール-CH2-O及びOH);
6.75-7.49(m, 16H, Ar-H, イミダゾール-H）
【００３１】１ｅ．β−シアノエチルＮ,Ｎ−ジイソプ
ロピル−１−（６−〔３′−（４″−メトキシトリフェ
ニルメチル）イミダゾール−５′−イルメチル〕オキ
シ）ヘキシル−Ｏ−ホスホロアミダイト １.０５２８ｇ（２.２４ミリモル）の１−〔６−（３′
−（４″−メトキシトリフェニルメチル）イミダゾール
−５′−イルメチル）オキシ〕ヘキサノール（実施例１
ｄから）を７mlの無水ＴＨＦに溶解し、そして７７８ml
（４.４７ミリモル）のジイソプロピルエチルアミン
（ＤＩＰＥＡ）で保護ガス下で処理した。３mlの無水Ｔ
ＨＦ中６３５.４mg（２.６８ミリモル）の２−シアノエ
チルＮ,Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト
の溶液を５分の間滴加し、混合物を室温で２時間攪拌し
た。沈澱を吸引濾去し、濾液をＥＡで希釈し、そして有
機層を０.１ＭのＮａＨ2ＰＯ4緩衝液（pH７）で２回抽
出した。有機層をＮａ2ＳＯ4で乾燥し、溶媒を真空下で
蒸発させた。生成物をシリカゲルクロマトグラフィー
（ＥＡ／ＴＥＡ ９９：１）により精製した。 収得量：933mg（62％)； MS(FAB): m／e＝693.4（Ｍ＋Na+)； 677.4（Ｍ＋Li+)；1 H-NMR(DMSO, 200MHz): 1.04-1.60(m, 20H, CH(CH 3)2及
び(CH2)4); 2.75(t, 2H, CH2-CN); 3.36(t, CH 2-O-CH2-
Imi); 3.42-3.77(m, 6H, CH2-O-P及びCH2-CH2-CN及びCH
(CH3)2); 3.79(s, 3H, OCH3); 4.225(s, 2H, イミダゾ
ール-CH2-); 6.75-7.48(m, 16H, Ar-H, イミダゾール-
H）31 P-NMR(DMSO): 147.1
【００３２】２） ６−〔５′−メチル−３′−（４″
−メトキシトリフェニルメチル）イミダゾールエーテ
ル〕へキサン酸 ２ａ． ６−〔（３′−（４″−メトキシトリフェニル
メチル）イミダゾール−５′−イルメチル）オキシ〕ヘ
キサナール １.１５mg（９.１ミリモル）の塩化オキザリルを５０ml
の無水ＤＣＭに溶解し、そして１.４８４ｇ（１９ミリ
モル）のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を−７８℃
で５分の間に滴加した。次いで、１０mlの無水ＤＣＭに
溶解した１.８６ｇの１−〔６−（３′−（４″−メト
キシトリフェニルメチル）イミダゾール−５′−イルメ
チル）オキシ〕ヘキサノール（実施例１ｄから）を１５
分の間に滴加し、温度は−６０℃を上回らなかった。混
合物を−７８℃で１.５時間攪拌し、次に１１mlのＴＥ
Ａを滴下し、温度は−６０℃を上回らなかった。混合物
を室温まで加温し、水で抽出し、そして水層をＤＣＭで
もう２回洗浄した。有機層を合併し、飽和ＮａＣｌ溶液
で３回洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥しそして溶媒を真空下
で蒸発させた。生成物のシリカゲルクロマトグラフィー
を行った（ＥＡ／ＴＥＡ ９９：１）。 収得量：1034mg； MS(FAB): 507.3（Ｍ＋Na+)；475.3（Ｍ＋Li+)；1 H-NMR(DMSO, 200MHz): 1.19-1.60(m, 8H, (CH2)4); 2.
40(dt, 2H, CH2-CHO);3.36(t, 2H, CH2-O); 3.78(s, 3
H, OCH3); 4.25(s, イミダゾール-CH2-); 6.78-7.50(m,
16H, Ar-H, イミダゾール-H); 9.63(t, 1H, CHO)
【００３３】２ｂ． ６−〔（３′−（４″−メトキシ
トリフェニルメチル）イミダゾール−５′−イルメチ
ル）オキシ〕ヘキサン酸９２.７ｇ（０.５４ミリモル）
の硝酸銀を４００mlの水に溶解し、そしてこの溶液を
３.６mlのエタノール中１００mg（０.２１ミリモル）の
６−〔（３′−（４″−メトキシトリフェニルメチル）
イミダゾール−５′−イルメチル）オキシ〕ヘキサナー
ル（実施例２ａから）の溶液に滴下した。次いで４.２m
lの水中２５５mg（４.５４ミルモル）のＫＯＨの溶液を
添加し、混合物を室温で２時間攪拌した。沈澱を濾別
し、水とメタノールで洗浄した。次に濾液を３.５％シ
ュウ酸溶液でpH５の酸性にした。これを水とＤＣＭとの
間で分配し、有機相をＮａ2ＳＯ4で乾燥し、そして溶媒
を真空下で蒸発させた。 収得量：115mg（92％)； MS(FAB): m／e＝485.2（Ｍ＋Ｈ+）
【００３４】３） ６−〔（３′−（４″−メトキシト
リフェニルメチル）イミダゾール−５′−イルメチル）
オキシ〕ヘキサン酸のＯ−Ｎ−スクシンイミジルエステ
ル １mlの無水ＤＭＦ中２０mg（３４.２ミリモル）の実施
例２からの６−〔（３′−（４″−メトキシトリフェニ
ルメチル）イミダゾール−５′−イルメチル）オキシ〕
ヘキサン酸を６.４ml（３７ミリモル）のジイソプロピ
ルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）及び１２.３mg（３７.６
ミリモル）のＯ−（Ｎ−スクシンイミジル）−Ｎ,Ｎ,
Ｎ′,Ｎ′−テトラメチルウロニウム・テトラフルオロ
ボレート（ＴＳＴＵ）と一緒に５時間インキュベートし
た。その後さらに３mgのＴＳＴＵ及び２mlのジイソプロ
ピルエチルアミンを添加した。反応混合物を蒸発させ、
残留物を水に懸濁し、懸濁液をクロロホルムで抽出し
た。次いで有機相を蒸発させた。 収得量：20.6mg（90％）
【００３５】４） オリゴヌクレオチドの合成 修飾してないオリゴヌクレオチドをＤＮＡ自動合成装置
（Applied BiosystemsModel 380B又は394）で標準のホ
スホロアミダイトの化学作用及びヨウ素による酸化を使
用して合成した。ホスホロチオエート及びホスホジエス
テルの混合物を用いてホスホロチオエートブリッジを導
入するため、オリゴヌクレオチドをヨウ素の代わりに二
硫化テトラエチルチウラムジスルフィド（ＴＥＴＤ）を
用いて酸化した（Applied Biosystems User Bulletin 6
5）。濃ＮＨ3で５５℃で１８時間処理して固体支持体
（ＣＰＧ又はTentagel）から分離しそして保護基を除去
した後、オリゴヌクレオチドを最初にブタノール沈澱に
より精製した（Sawadogo, Van Dyke, Nucl. Acids Res.
19 (1991) 674）。次いで２.５容量部のエタノールを
使用して０.５Ｍ ＮａＣｌ溶液からの沈澱によりナトリ
ウム塩を得た。
【００３６】オリゴヌクレオチドは ａ） 分析用ゲル電気泳動（２０％アクリルアミド、８
Ｍウレア、４５４Ｍトリス−ホウ酸緩衝液、pH７.０使
用）、及び／又は ｂ） ＨＰＬＣ分析（Waters GenPak FAX，ＣＨ3ＣＮ
（４００ml）、Ｈ2Ｏ（１.６ｌ）、ＮａＨ2ＰＯ4（３.
１ｇ）、ＮａＣｌ（１１.７ｇ）、pH６.８（ＮａＣｌ
０.１Ｍ）からＣＨ3ＣＮ（４００ml）、Ｈ2Ｏ（１.６
ｌ）、ＮａＨ2ＰＯ4（３.１ｇ）、ＮａＣｌ（１７５.３
ｇ）、pH６.８（ＮａＣｌ １.５Ｍ）に至るグラジエン
ト）、及び／又は ｃ） 毛管ゲル電気泳動（Beckmann Capillary eCAPTM,
U100Pゲルカラム、長さ６５cm、内径１００mm、一端か
ら１５cmに窓、緩衝液：１４０mMトリス、３６０mMホウ
酸、７Ｍウレア）、及び／又は ｄ） エレクトロスプレー質量分光分析により分析し
た。オリゴヌクレオチドの分析により、これらは各々９
０％より高い純度で存在することが示された。次のオリ
ゴヌクレオチドを合成した。
【００３７】４ａ．〔５′−イミダゾール〕−Ｇ＊Ｃ＊
ＡＧＧＡＧＧＡＴＧＣＴＧＡＧＧＡ＊Ｇ＊Ｇ−３′
【化９】 〔５′−イミダゾール〕基導入のため、オリゴヌクレオ
チドを最初に固相上で合成し、次いで５′−ジメトキシ
トリチル基を除いた。次いでβ−シアノエチルＮ,Ｎ−
ジイソプロピル−１−（６−〔３′−（４″−メトキシ
トリフェニルメチル）イミダゾール−５′−イルメチ
ル〕オキシ）ヘキシル−Ｏ−ホスホロアミダイト（実施
例１から）及びテトラゾールとの反応を実行し、その後
生成物をヨウ素で酸化しそしてモノメトキシトリチル保
護基を除いた。使用した手順は標準のホスホロアミダイ
トプロトコールである（Applied Biosystems Model 392
/394, USER MANUAL, June 1992）。標準のヌクレオシド
ホスホロアミダイトのみをβ−シアノエチルＮ,Ｎ−ジ
イソプロピル−１−（６−〔３′−（４″−メトキシト
リフェニルメチル）イミダゾール−５′−イルメチル〕
オキシ）ヘキシル−Ｏ−ホスホロアミダイトで置き換え
た。
【００３８】４ｂ．〔５′ーイミダゾール〕−Ａ＊Ｃ＊
ＧＴＴＣＣＴＣＣＴＧＣＧＧＧＡＡ＊Ｇ＊Ｇ−３′ ４ｃ．〔５′−イミダゾール〕−Ｇ＊Ｃ＊ＧＧＧＧＣＴ
ＣＣＡＴＧＧＧＧＧＴ＊Ｃ＊Ｇ−３′ ４ｄ．〔５′−イミダゾール〕−ＣＧＣＴＴＧＴＧＧＡ
−３′ ４ｅ．５′−ＧＧＡＣＣＧＡＡＧＧ−〔３′−イミダゾ
ール〕
【化１０】 〔３′−イミダゾール基〕の導入には、６−アミノヘキ
シル３′−ホスフェート基を含むオリゴヌクレオチドを
最初に、C.R. Petrie等（Bioconj, Chem. 3 (1992) 8
5）に記述されているように合成した。次に実施例３か
らのＯ−Ｎ−スクシンイミジルエステルと反応させた。
このため、２０ ＯＤのオリゴヌクレオチドを５００ml
中で７mgの−Ｏ−Ｎ−スクシンイミジルエステル、５０
０mlのＤＭＦ及び１００mlの緩衝液（１Ｍ ＮａＨＣＯ3
及び１Ｍ Ｎａ2ＣＯ3、pH９）で処理し、そして室温で
一晩インキュベートした。精製は RSephadex G25M PD10
カラム（Pharmacia）を用いて実行した。溶離液を蒸発
させ、そしてモノメトキシトリチル保護基を５００mlの
酢酸（８０％）と室温で１時間インキュベートして除い
た。次に混合物を再び蒸発させ、生成物を１mlの水に溶
解し、そして溶液を０.５mlのクロロホルムで抽出し
た。生成物を０.５Ｍの塩化アンモニウム及びエタノー
ル／ｉ−プロパノールを使用して沈澱させた。
【００３９】５） ＲＮＡの合成及び切断 次のＲＮＡ配列
【化１１】 をJ.F. Milligan等（Methods Enzymol 180 (1989) 51）
の方法により調製した。下線部分（ＡＯ−２）又は二重
下線部分（ＡＯ−１）が実施例４ｅ又は４ｄからのイミ
ダゾール誘導体化オリゴヌクレオチドと相補的である。
第一の結果はこのＲＮＡが２つのオリゴヌクレオチドと
一緒にインキュベートすることにより有効に切断される
が、これに対して１つのオリゴヌクレオチドのみとイン
キュベートした場合は、各々の場合同一条件下で切断に
至らなかった。
【図面の簡単な説明】
【図１】Ａ及びＢの反応性ユニットは両アンチセンスオ
リゴヌクレオチドが標的ＲＮＡの隣接位置に特異的に結
合している場合に形成されることを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｚ

Claims (8)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 約６〜１００のヌクレオチドを含む２つ
    のアンチセンスオリゴヌクレオチドＡＯ−１及びＡＯ−
    ２を含み、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは標的
    ＲＮＡの隣接位置に結合し、そして５′末端又は３′末
    端において適当なスペーサーを経て共役分子Ａ及びＢに
    連結しており、共役分子Ａ及びＢは各々それ自身は非反
    応性であるが、空間的近傍に接近させるとＲＮＡを接触
    的に切断することができるユニットを形成するか、又は
    空間的近接により活性化されるとその結果ＲＮＡの共有
    結合を生じるタンパク質合成を抑制するための治療組成
    物。
  2. 【請求項２】 アンチセンスオリゴヌクレオチドが１０
    〜４０のヌクレオチドからなる請求項１記載の治療組成
    物。
  3. 【請求項３】 ａ） Ａ＝Ｂ＝イミダゾール、 ｂ） Ａ＝イミダゾール、Ｂ＝式Ｉの分子、 【化１】 ｃ） Ａ＝Ｂ＝１,１０−フェナントロリン、 ｄ） Ａ＝Ｌ−リジン、Ｂ＝Ｌ−トリプトファニル−Ｌ
    −リジン、 ｅ） Ａ＝Ｌ−リジル−Ｌ−トリプトファン、Ｂ＝Ｌ−
    リジン、 ｆ） Ａ＝グリシン、Ｂ＝グリシル−Ｌ−ヒスチジン、 ｇ） Ａ＝グリシル−グリシン、Ｂ＝Ｌ−ヒスチジン、 ｈ） Ａ＝グリシン、Ｂ＝Ｌ−ヒスチジル−Ｌ−リジ
    ン、 ｉ） Ａ＝グリシル−Ｌ−ヒスチジン、Ｂ＝Ｌ−リジン である共役分子Ａ及びＢを使用し、ｃ）及びｆ）〜ｉ）
    からの共役分子は各々の場合、銅（II）錯体の形成のた
    め適当なスペーサーを経てオリゴヌクレオチドに連結す
    る請求項１又は２に記載の治療組成物。
  4. 【請求項４】 アンチセンスオリゴヌクレオチドが修飾
    されていないか又は修飾されている請求項１〜３に記載
    の治療組成物。
  5. 【請求項５】 標的ＲＮＡの隣接位置に結合し、そして
    ５′末端又は３′末端において適当なスペーサーを経
    て、その各々がそれ自身は非反応性である共役分子Ａ及
    びＢに結合している約６〜１００のヌクレオチドを含む
    ２つのアンチセンスオリゴヌクレオチドＡＯ−１及びＡ
    Ｏ−２を、それらがユニットを形成しそして接触的にＲ
    ＮＡを切断するか、又は活性化されそしてその結果ＲＮ
    Ａの共有結合を生じるように空間的近傍に接近させるこ
    とを含むＲＮＡの切断又は架橋のための方法。
  6. 【請求項６】 ５′末端及び３′末端において適当なス
    ペーサーを経て共役分子Ａ及びＢに連結している約６〜
    １００のヌクレオチドからなるアンチセンスオリゴヌク
    レオチドＡＯ−１又はＡＯ−２。
  7. 【請求項７】 共役分子Ａ及びＢの各々を適当なスペー
    サーを経てオリゴヌクレオチドに連結させることを含む
    請求項６記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドＡＯ−
    １及びＡＯ−２の製造方法。
  8. 【請求項８】 生理的に許容される賦形剤及び適当なら
    ば、さらに添加剤及び／又は補助物質を使用して、オリ
    ゴヌクレオチドを適当な製剤形体にすることを含む請求
    項１〜４に記載の治療組成物の製造方法。
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