CN113341058A - 一种三色高通量测序试剂及测序方法 - Google Patents
一种三色高通量测序试剂及测序方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113341058A CN113341058A CN202110640732.7A CN202110640732A CN113341058A CN 113341058 A CN113341058 A CN 113341058A CN 202110640732 A CN202110640732 A CN 202110640732A CN 113341058 A CN113341058 A CN 113341058A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sequencing
- base
- marked
- water
- color high
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 title claims abstract description 57
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 title claims abstract description 27
- 238000012165 high-throughput sequencing Methods 0.000 title claims abstract description 27
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims abstract description 37
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 35
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims abstract description 27
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 21
- HWCKGOZZJDHMNC-UHFFFAOYSA-M tetraethylammonium bromide Chemical compound [Br-].CC[N+](CC)(CC)CC HWCKGOZZJDHMNC-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 21
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 claims abstract description 15
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims abstract description 11
- 238000005336 cracking Methods 0.000 claims abstract description 10
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 claims abstract description 7
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 claims abstract description 6
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N ammonia Natural products N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 17
- DLYUQMMRRRQYAE-UHFFFAOYSA-N tetraphosphorus decaoxide Chemical compound O1P(O2)(=O)OP3(=O)OP1(=O)OP2(=O)O3 DLYUQMMRRRQYAE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 claims description 8
- XHXFXVLFKHQFAL-UHFFFAOYSA-N phosphoryl trichloride Chemical compound ClP(Cl)(Cl)=O XHXFXVLFKHQFAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- WVLBCYQITXONBZ-UHFFFAOYSA-N trimethyl phosphate Chemical compound COP(=O)(OC)OC WVLBCYQITXONBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 7
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 claims description 6
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 claims description 5
- PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N TCEP Chemical compound OC(=O)CCP(CCC(O)=O)CCC(O)=O PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 abstract description 16
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 abstract description 5
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 14
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 14
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 14
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 9
- -1 azidomethyl Chemical group 0.000 description 8
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 6
- WRMXOVHLRUVREB-UHFFFAOYSA-N phosphono phosphate;tributylazanium Chemical compound OP(O)(=O)OP([O-])([O-])=O.CCCC[NH+](CCCC)CCCC.CCCC[NH+](CCCC)CCCC WRMXOVHLRUVREB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- IMFACGCPASFAPR-UHFFFAOYSA-N tributylamine Chemical compound CCCCN(CCCC)CCCC IMFACGCPASFAPR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 125000003903 2-propenyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])=C([H])[H] 0.000 description 5
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 5
- RLOWWWKZYUNIDI-UHFFFAOYSA-N phosphinic chloride Chemical compound ClP=O RLOWWWKZYUNIDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 2
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 2
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 2
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L disodium;(2',7'-dibromo-3',6'-dioxido-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-4'-yl)mercury;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Na+].O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(Br)=C([O-])C([Hg])=C1OC1=C2C=C(Br)C([O-])=C1 BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- JKANAVGODYYCQF-UHFFFAOYSA-N prop-2-yn-1-amine Chemical compound NCC#C JKANAVGODYYCQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 2
- 239000012099 Alexa Fluor family Substances 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 229910021380 Manganese Chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L Manganese chloride Chemical compound Cl[Mn]Cl GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LIQLLTGUOSHGKY-UHFFFAOYSA-N [B].[F] Chemical compound [B].[F] LIQLLTGUOSHGKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930014669 anthocyanidin Natural products 0.000 description 1
- 150000001452 anthocyanidin derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 235000008758 anthocyanidins Nutrition 0.000 description 1
- 239000012295 chemical reaction liquid Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- AFQIYTIJXGTIEY-UHFFFAOYSA-N hydrogen carbonate;triethylazanium Chemical compound OC(O)=O.CCN(CC)CC AFQIYTIJXGTIEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011565 manganese chloride Substances 0.000 description 1
- 235000002867 manganese chloride Nutrition 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 238000006303 photolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000015843 photosynthesis, light reaction Effects 0.000 description 1
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine Chemical compound C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C([O-])=O ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/96—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation using ion-exchange
Abstract
本发明属于高通量测序领域,公开了一种三色高通量测序试剂及测序方法,基于测序要求获取对应的待标记碱基以及质子海绵在不同的温度和环境下进行多次的搅拌,并将过滤得到的固体溶于水中;用TEAB梯度来做负离子交换柱对溶于水的固体进行纯化,然后再用HPLC纯化得到标记碱基;将所述标记碱基进行清洗后进行荧光标记测定,并在测定完成后,利用对应的化学试剂进行裂解,清洗后完成当前所述待标记碱基测序,对每一轮的测序过程均循环进行反应、清洗、读碱基、裂解和清洗这几个过程,使用的三色测序技术不但像2色测序技术一样加快了测序速度,而且碱基信号没有被分开检测,测序长度不但不受影响还会增加,从而提高了测序效率及测序通量。
Description
技术领域
本发明涉及高通量测序技术领域,尤其涉及一种三色高通量测序试剂及测序方法。
背景技术
目前最常用(80%的高通量DNA测序市场)的高通量DNA测序技术是4色测序技术和2色测序技术,Illumina和华大基因都是用4色测序技术和2色测序技术。4色测序技术是ACGT 4种碱基各用一种颜色的染料标记来检测进行测序相应的碱基,总共要用4种不同波长的荧光染料来分别测序。2色测序技术是第一色和第二色分别标记4种碱基中的两种碱基,用第一色和第二色分别标记第三个碱基上后混起来用,第四个碱基不标记。2色测序技术的第一色和第二色分别检测第一和第二种碱基,两种颜色同时出现时检测到第三个碱基,没有荧光信号就相当于第4种碱基。2色测序技术相对于4色测序技术虽然测序速度加快了,但2色混合标记的碱基信号被一分为二,信号只有原本的大约50%。信号的减弱会降低信嘈比,影响测序读长,导致测序效率和测序通量降低。
发明内容
本发明的目的在于提供一种三色高通量测序试剂及测序方法,提高测序效率和测序通量。
为实现上述目的,第一当面,本发明提供了一种三色高通量测序方法,包括以下步骤:
基于测序要求获取对应的待标记碱基以及质子海绵在不同的温度和环境下进行多次的搅拌,并将过滤得到的固体溶于水中;
用0.1-1M TEAB梯度来做负离子交换柱对溶于水的固体进行纯化,然后再用HPLC纯化得到标记碱基;
将所述标记碱基进行清洗后进行荧光标记测定,并在测定完成后,利用对应的化学试剂进行裂解,清洗后完成当前所述待标记碱基测序。
其中,基于测序要求获取对应的待标记碱基以及质子海绵在不同的温度和环境下进行多次的搅拌,并将过滤得到的固体溶于水中,包括:
基于测序要求获取对应的待标记碱基和质子海绵,并在含有五氧化二磷的真空干燥器中进行干燥过夜;
在不同的温度和环境下进行多次的搅拌,并将过滤得到的固体溶于水中。
其中,在不同的温度和环境下进行多次的搅拌,并将过滤得到的固体溶于水中,包括:
在0℃下,向所述真空干燥器中滴加定量的三氯氧磷并搅拌2小时;
在室温下,想所述真空干燥器中加入50毫升0.1M TEAB后搅拌1小时,然后在室温下加50ml浓氨水后搅拌过夜,抽掉水和氨后,将得到的固体溶于15ml水中。
其中,基于测序要求获取对应的待标记碱基和质子海绵,并在含有五氧化二磷的真空干燥器中进行干燥过夜之后,所述方法还包括:
向干燥完成后的所述真空干燥器中加入2毫升的磷酸三甲酯。
其中,碱基的标记方式为3’-CL1-O-5-X-CL2 dNTP和3’-CL1-O-7-deaza-7-X-CL2dNTP中的任一种。
第二方面,本发明提供了一种三色高通量测序试剂,适用于如第一方面所述的一种三色高通量测序方法,所述三色高通量测序试剂包括三个待标记碱基、一个非荧光标记碱基、三种荧光染料和脱保护试剂,其中,三个所述待标记碱基和三种所述荧光染料任意组合标记,且三种所述荧光染料不重复使用,一个所述非荧光标记碱基为四种碱基中的任一种碱基。
其中,所述脱保护试剂为TCEP或THPP中的任一种。
其中,三种所述荧光染料为发绿光、黄光、红光、近红外光中的任意三种荧光染料的组合。
本发明的一种三色高通量测序试剂及测序方法,基于测序要求获取对应的待标记碱基以及质子海绵在不同的温度和环境下进行多次的搅拌,并将过滤得到的固体溶于水中;用0.1-1M TEAB梯度来做负离子交换柱对溶于水的固体进行纯化,然后再用HPLC纯化得到标记碱基;将所述标记碱基进行清洗后进行荧光标记测定,并在测定完成后,利用对应的化学试剂进行裂解,清洗后完成当前所述待标记碱基测序,对每一轮的测序过程均循环进行反应、清洗、读碱基、裂解和清洗这几个过程,使用的三色测序技术不但像2色测序技术一样加快了测序速度,而且碱基信号没有被分开检测,测序长度不但不受影响还会增加,从而提高了测序效率及测序通量。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明提供的一种三色高通量测序方法的步骤示意图。
图2是本发明提供的实施例1的合成示意图。
图3是本发明提供的实施例2的合成示意图。
图4是本发明提供的实施例3的合成示意图。
图5是本发明提供的实施例4的合成示意图。
图6是本发明提供的实施例5的合成示意图。
图7是本发明提供的实施例6的合成示意图。
图8是本发明提供的三种染料发射最大光谱峰。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例,所述实施例的示例在附图中示出,其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的,旨在用于解释本发明,而不能理解为对本发明的限制。
在本发明的描述中,“多个”的含义是两个或两个以上,除非另有明确具体的限定。
请参阅图,本发明提供一种三色高通量测序方法,包括以下步骤:
S101、基于测序要求获取对应的待标记碱基以及质子海绵在不同的温度和环境下进行多次的搅拌,并将过滤得到的固体溶于水中。
具体的,基于测序要求获取对应的待标记碱基和质子海绵,并在含有五氧化二磷的真空干燥器中进行干燥过夜,向干燥完成后的所述真空干燥器中加入2毫升的磷酸三甲酯进行溶解,在0℃下,向所述真空干燥器中滴加定量的三氯氧磷并搅拌2小时;随后将1.817克三丁铵焦磷酸盐和1.84毫升三丁胺在8毫升无水DMF里混匀后在室温下一次加完后搅拌30分钟。
在室温下,想所述真空干燥器中加入50毫升0.1M TEAB后搅拌1小时,然后在室温下加50ml浓氨水后搅拌过夜,抽掉水和氨后,将得到的固体溶于15ml水中。
S102、用0.1-1M TEAB梯度来做负离子交换柱对溶于水的固体进行纯化,然后再用HPLC纯化得到标记碱基。
具体的,用0.1-1M TEAB梯度来做负离子交换柱对溶于水的固体进行纯化,然后再用HPLC纯化得到标记碱基,其中,碱基的标记方式为3’-CL1-O-5-X-CL2dNTP和3’-CL1-O-7-deaza-7-X-CL2 dNTP中的任一种。碱基为DNA或者RNA中的任一种对应的4个碱基中的任一个或多个碱基。
其中,CL1可以是叠氮甲基(-OCH2N3),也可以是烯丙基(-OCH2CH=CH2)或其他可裂解基团。CL2也是可裂解基团,比如含-S-S-键,酯键,取代烯丙基(-OCH2CH=CH-),叠氮基乙氧基团(-OCH(N3)CH2-的链接链,和可光解链接链等等。在实际测序应用中,会按不同比例每步测序加入非荧光标记的碱基来增加读长:3’-CL1-O-dNTP,其中CL1可以是叠氮甲基(-OCH2N3),也可以是烯丙基(-OCH2CH=CH2)或其他可裂解基团。
一种非荧光标记的碱基是3’-CL1-O-dNTP,其中CL1可以是叠氮甲基(-OCH2N3),也可以是烯丙基(-OCH2CH=CH2)或其他可裂解基团。如果是G,就是3’-CL1-O-dGTP,再如果CL1是叠氮甲基(-OCH2N3),非荧光标记的碱基就是3’-N3CH2O-dGTP。
在实际测序应用中,会按不同比例每步测序加入非荧光标记的碱基来增加读长:3’-CL1-O-dNTP,其中CL1可以是叠氮甲基(-OCH2N3),也可以是烯丙基(-OCH2CH=CH2)或其他可裂解基团。
S103、将所述标记碱基进行清洗后进行荧光标记测定,并在测定完成后,利用对应的化学试剂进行裂解,清洗后完成当前所述待标记碱基测序。
具体的,将所述标记碱基进行清洗后进行荧光标记测定,并在测定完成后,利用对应的化学试剂进行裂解,清洗后完成当前所述待标记碱基测序,具体的:
形成的3’-CL1-O-dN-(引物),3’-CL1-O-5-X-CL2(荧光染料)dN(引物)或3’-CL1-O-7-deaza-7-X-CL2(荧光染料)dN(引物)被化学试剂(或光解)形成3’-HO-dN-(引物),3’-HO-5-X’-dN(引物)或3’-HO-7-deaza-7-X’-dN(引物),脱保护了的3’-HO-又可进行下一轮测序。其中X’是带疤痕的X,如果X是PA(炔丙基胺),X’是带疤痕的PA(炔丙基胺)。脱保护试剂是TCEP,或THPP。带疤痕的意思是有片段留在碱基上了,不是天然的碱基了。
通过以下实施例来说明不同的碱基的标记过程。
实施例1合成3’-O-叠氮甲基dATP
如图2所示,410.4毫克(FW 410.4,1豪摩尔)的待标记碱基和质子海绵(254毫克,1.17豪摩尔)在有五氧化二磷的真空干燥器中干燥过夜后溶于2毫升磷酸三甲酯里。在0℃滴加134微升新鲜蒸馏的三氯氧磷(1.17豪摩尔)后再在0℃搅拌2小时。随后将1.817克三丁铵焦磷酸盐(FW 363.33,5豪摩尔)和1.84毫升三丁胺(185.35,d=0.778,7.7豪摩尔)在8毫升无水DMF(二甲基甲酰胺)里混匀后在室温下一次加完后搅拌30分钟。室温下加入50毫升0.1M TEAB(碳酸氢三乙胺)(pH8.0)后搅拌1小时。在室温下加50ml浓氨水后搅拌过夜,抽掉水和氨后剩余固体溶于15ml水中。用0.1-1M TEAB梯度来做负离子交换柱纯化后再用HPLC(高效液相色谱)纯化得3’-O-叠氮甲基dATP。
实施例2合成3’-O-叠氮甲基dCTP
如图3所示,386.4毫克(FW 386.4,1豪摩尔)的反应物(待标记碱基)和质子海绵(254毫克,1.17豪摩尔)在有P2O5的真空干燥器中干燥过夜后溶于2毫升磷酸三甲酯里。在0℃滴加134微升新鲜蒸馏的POCl3(1.17豪摩尔)后再在0℃搅拌2小时。随后将1.817克三丁铵焦磷酸盐(FW 363.33,5豪摩尔)和1.84毫升三丁胺(185.35,d=0.778,7.7豪摩尔)在8毫升无水DMF里混匀后在室温下一次加完后搅拌30分钟。室温下加入50毫升0.1M TEAB(pH8.0)后搅拌1小时。在室温下加50ml浓氨水后搅拌过夜,抽掉水和氨后剩余固体溶于15ml水中。用0.1-1M梯度TEAB来做负离子交换柱纯化后再用HPLC纯化得3’-O-叠氮甲基dCTP。
实施例3合成3’-O-叠氮甲基dGTP
如图4所示,587.6毫克(FW 587.6,1豪摩尔)的反应物和质子海绵(254毫克,1.17豪摩尔)在有P2O5的真空干燥器中干燥过夜后溶于2毫升磷酸三甲酯里。在0℃滴加134微升新鲜蒸馏的POCl3(1.17豪摩尔)后再在0℃搅拌2小时。随后将1.817克三丁铵焦磷酸盐(FW363.33,5豪摩尔)和1.84毫升三丁胺(185.35,d=0.778,7.7豪摩尔)在8毫升无水DMF里混匀后在室温下一次加完后搅拌30分钟。室温下加入50毫升0.1M TEAB(pH8.0)后搅拌1小时。在室温下加50ml浓氨水后搅拌过夜,抽掉水和氨后剩余固体溶于15ml水中。用0.1-1M梯度TEAB来做负离子交换柱纯化后再用HPLC纯化得3’-O-叠氮甲基dGTP。
实施例4合成3’-O-叠氮甲基dTTP
如图5所示,297.3毫克(FW 297.3,1豪摩尔)的反应物(碱基)和质子海绵(254毫克,1.17豪摩尔)在有P2O5的真空干燥器中干燥过夜后溶于2毫升磷酸三甲酯里。在0℃滴加134微升新鲜蒸馏的POCl3(1.17豪摩尔)后再在0℃搅拌2小时。随后将1.817克三丁铵焦磷酸盐(FW 363.33,5豪摩尔)和1.84毫升三丁胺(185.35,d=0.778,7.7豪摩尔)在8毫升无水DMF里混匀后在室温下一次加完后搅拌30分钟。室温下加入50毫升0.1M TEAB(pH8.0)后搅拌1小时。在室温下加50ml浓氨水后搅拌过夜,抽掉水和氨后剩余固体溶于15ml水中。用0.1-1M梯度TEAB来做负离子交换柱纯化后再用HPLC纯化得3’-O-叠氮甲基dTTP。
实施例5合成3’-O-叠氮甲基-7-脱氮-7-PA-dATP
如图6所示,558.5毫克(FW 558.5,1豪摩尔)的反应物和质子海绵(254毫克,1.17豪摩尔)在有P2O5的真空干燥器中干燥过夜后溶于2毫升磷酸三甲酯里。在0℃滴加134微升新鲜蒸馏的POCl3(1.17豪摩尔)后再在0℃搅拌2小时。随后将1.817克三丁铵焦磷酸盐(FW363.33,5豪摩尔)和1.84毫升三丁胺(185.35,d=0.778,7.7豪摩尔)在8毫升无水DMF里混匀后在室温下一次加完后搅拌30分钟。室温下加入50毫升0.1M TEAB(pH8.0)后搅拌1小时。在室温下加50ml浓氨水后搅拌过夜,抽掉水和氨后剩余固体溶于15ml水中。用0.1-1M梯度TEAB来做负离子交换柱纯化后再用HPLC纯化得3’-O-叠氮甲基-7-脱氮-7-PA-dATP。
实施例6合成3’-O-叠氮甲基-7-脱氮-7-PA(N3-linker-R6G)-dATP
如图7所示,NHS-N3-linker-R6G 14.8毫克(FW 739.4,0.02豪摩尔)在2.5毫升DMF里滴加到12.0毫克3’-O-叠氮甲基-7-脱氮-7-PA-dATP(FW598.3,0.02豪摩尔)在0.5毫升0.1M NaHCO3(pH8.7)里。在室温下搅拌3小时后用0.1-1M梯度TEAB来做负离子交换柱纯化后再用HPLC纯化得3’-O-叠氮甲基-7-脱氮-7-PA(N3-linker-R6G)-dATP。
实施例7合成3’-O-叠氮甲基-7-脱氮-7-PA-dGTP,3’-O-叠氮甲基-5-PA-dCTP,及3’-O-叠氮甲基-5-PA-dUTP,参考实施例5的合成方法。
实施例8,合成3’-O-叠氮甲基-5-PA-(N3-linker-Dye)-dCTP,3’-O-叠氮甲基-7-脱氮-7-PA(N3-linker-Dye)-dGTP,及3’-O-叠氮甲基-5-PA-(N3-linker-Dye)-dUTP,参考实施例6的合成方法。
实施例9测序:用3’-O-叠氮甲基-7-脱氮-7-PA(N3-linker-R6G)-dATP进行酶延伸实验来用质谱或荧光检测效果。
20微升总体积里有120皮摩尔的3’-O-叠氮甲基-7-脱氮-7-PA(N3-linker-R6G)-dATP,60皮摩尔的自启动DNA模板,1xThermopol II反应缓冲液,40纳摩尔的MnCl2,1单位的9°N DNA聚合酶(exo-)A485L/Y409V。在95℃5分钟,4℃5分钟,65℃20分钟。HPLC纯化后用质谱或荧光来检测碱基延伸效果。
本发明提供了一种三色高通量测序试剂,适用于如第一方面所述的一种三色高通量测序方法,所述三色高通量测序试剂包括三个待标记碱基、一个非荧光标记碱基、三种荧光染料和脱保护试剂,其中,三个所述待标记碱基和三种所述荧光染料任意组合标记,且三种所述荧光染料不重复使用,一个所述非荧光标记碱基为四种碱基中的任一种碱基。这里的碱基并不限定是DNA,还可以测定RNA的碱基。
在本实施方式中,4种碱基中的三种碱基用三种不同波长(颜色)的荧光染料来标记,第4种碱基不做荧光染料标记,比如G碱基不做荧光染料标记。测序时通过三种颜色来得出三种碱基的序列,如果不发光就当作是第4种碱基(比如G),这样就可以得出DNA的序列信息。三种荧光染料可以是发绿光,黄光,红光,或近红外光中的任意三种荧光染料的组合,有四种组合方式。三种荧光染料和三种待标记碱基也可以任意组合,共有6种组合方式。如图8所示,相邻两种荧光染料的荧光发射波长差大约50nm+5nm,也可以是40nm+5nm,不建议发射波长差小于30nm(相邻信号渗透会增加检测难度),荧光波长差也可以是50到100nm+5nm,但不建议大于120nm(染料发射光会延伸到远红外光,检测范围太宽不利于检测,而且选择三种染料也会增加难度)。
三种荧光染料和三种待标记碱基可以任意组合
比如把dG作为非荧光染料标记的碱基时,但不局限于dG:
三种荧光染料可以是发绿光,黄光,红光,近红外光中的任意三种荧光染料的组合,但不局限于此:
荧光染料可以是罗丹明类染料,比如CR110,CRG6,TAMRA,ROX,一些ATTO系列染料,等等;花青素类染料,比如Cy2,Cy3,CY3B,Cy3.5,CY5,Cy5.5,Cy7,Hilyte Fluor系列染料,AlexaFluor系列,等等;类罗丹明染料,比如一些ATTO系列染料等。还有其他类型的荧光染料,比如,含硅类罗丹明染料,氟硼类荧光染料等等。
第一轮的测序完成后,要把碱基上的荧光标记去掉,去干净荧光标记才能进行下一轮测序,如果荧光标记没除干净,背景荧光会高,信号噪音比低,会影响读长。所有荧光染料标记的三个碱基都是要通过可裂解基团来链接到荧光染料上,同时4种碱基的3’-OH也要被可裂解基团保护住。碱基的3’-OH被可裂解基团保护住后延申被停住,每轮只上一个碱基,清洗掉反应液后从加上的碱基的荧光染料的颜色来定是A,C,G,T。裂解掉碱基上的荧光标记,同时也裂解掉3’-OH保护基后清洗干净就可以进行下一轮测序。每一轮测反应/清洗/读碱基/裂解/清洗的流程测一个碱基,100轮反应/清洗/读碱基/裂解/清洗的流程测序就是读100个碱基。
本发明的一种三色高通量测序试剂及测序方法,基于测序要求获取对应的待标记碱基以及质子海绵在不同的温度和环境下进行多次的搅拌,并将过滤得到的固体溶于水中;用0.1-1M TEAB梯度来做负离子交换柱对溶于水的固体进行纯化,然后再用HPLC纯化得到标记碱基;将所述标记碱基进行清洗后进行荧光标记测定,并在测定完成后,利用对应的化学试剂进行裂解,清洗后完成当前所述待标记碱基测序,对每一轮的测序过程均循环进行反应、清洗、读碱基、裂解和清洗这几个过程,使用的三色测序技术不但像2色测序技术一样加快了测序速度,而且碱基信号没有被分开检测,测序长度不但不受影响还会增加,从而提高了测序效率及测序通量。
以上所揭露的仅为本发明一种较佳实施例而已,当然不能以此来限定本发明之权利范围,本领域普通技术人员可以理解实现上述实施例的全部或部分流程,并依本发明权利要求所作的等同变化,仍属于发明所涵盖的范围。
Claims (8)
1.一种三色高通量测序方法,其特征在于,包括以下步骤:
基于测序要求获取对应的待标记碱基以及质子海绵在不同的温度和环境下进行多次的搅拌,并将过滤得到的固体溶于水中;
用0.1-1M TEAB梯度来做负离子交换柱对溶于水的固体进行纯化,然后再用HPLC纯化得到标记碱基;
将所述标记碱基进行清洗后进行荧光标记测定,并在测定完成后,利用对应的化学试剂进行裂解,清洗后完成当前所述待标记碱基测序。
2.如权利要求1所述的三色高通量测序方法,其特征在于,基于测序要求获取对应的待标记碱基以及质子海绵在不同的温度和环境下进行多次的搅拌,并将过滤得到的固体溶于水中,包括:
基于测序要求获取对应的待标记碱基和质子海绵,并在含有五氧化二磷的真空干燥器中进行干燥过夜;
在不同的温度和环境下进行多次的搅拌,并将过滤得到的固体溶于水中。
3.如权利要求2所述的三色高通量测序方法,其特征在于,在不同的温度和环境下进行多次的搅拌,并将过滤得到的固体溶于水中,包括:
在0℃下,向所述真空干燥器中滴加定量的三氯氧磷并搅拌2小时;
在室温下,想所述真空干燥器中加入50毫升0.1M TEAB后搅拌1小时,然后在室温下加50ml浓氨水后搅拌过夜,抽掉水和氨后,将得到的固体溶于15ml水中。
4.如权利要求2所述的三色高通量测序方法,其特征在于,基于测序要求获取对应的待标记碱基和质子海绵,并在含有五氧化二磷的真空干燥器中进行干燥过夜之后,所述方法还包括:
向干燥完成后的所述真空干燥器中加入2毫升的磷酸三甲酯。
5.如权利要求1所述的三色高通量测序方法,其特征在于,
碱基的标记方式为3’-CL1-O-5-X-CL2 dNTP和3’-CL1-O-7-deaza-7-X-CL2dNTP中的任一种。
6.一种三色高通量测序试剂,适用于如权利要求1至权利要求5任一项所述的三色高通量测序方法,其特征在于,
所述三色高通量测序试剂包括三个待标记碱基、一个非荧光标记碱基、三种荧光染料和脱保护试剂,其中,三个所述待标记碱基和三种所述荧光染料任意组合标记,且三种所述荧光染料不重复使用,一个所述非荧光标记碱基为四种碱基中的任一种碱基。
7.如权利要求6所述的三色高通量测序试剂,其特征在于,
所述脱保护试剂为TCEP或THPP中的任一种。
8.如权利要求6所述的三色高通量测序试剂,其特征在于,
三种所述荧光染料为发绿光、黄光、红光、近红外光中的任意三种荧光染料的组合。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202110640732.7A CN113341058A (zh) | 2021-06-09 | 2021-06-09 | 一种三色高通量测序试剂及测序方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202110640732.7A CN113341058A (zh) | 2021-06-09 | 2021-06-09 | 一种三色高通量测序试剂及测序方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN113341058A true CN113341058A (zh) | 2021-09-03 |
Family
ID=77475657
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202110640732.7A Pending CN113341058A (zh) | 2021-06-09 | 2021-06-09 | 一种三色高通量测序试剂及测序方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN113341058A (zh) |
Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102264917A (zh) * | 2008-06-11 | 2011-11-30 | 激光基因公司 | 核苷酸和核苷以及将其用于dna测序的方法 |
CN103866010A (zh) * | 2014-02-28 | 2014-06-18 | 郭诚 | 一种基因测序的方法 |
CN104024269A (zh) * | 2011-09-13 | 2014-09-03 | 激光基因公司 | 5-甲氧基,3’-oh未阻断,可快速光切割的终止核苷酸以及用于核酸测序的方法 |
CN105219865A (zh) * | 2015-10-22 | 2016-01-06 | 东南大学 | 一种基于三色荧光标记的核酸测序方法 |
CN109476694A (zh) * | 2015-11-06 | 2019-03-15 | 奇根科学有限责任公司 | 核苷酸类似物 |
EP3702474A1 (en) * | 2019-02-26 | 2020-09-02 | QIAGEN GmbH | Sequencing method and kit |
-
2021
- 2021-06-09 CN CN202110640732.7A patent/CN113341058A/zh active Pending
Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102264917A (zh) * | 2008-06-11 | 2011-11-30 | 激光基因公司 | 核苷酸和核苷以及将其用于dna测序的方法 |
CN104024269A (zh) * | 2011-09-13 | 2014-09-03 | 激光基因公司 | 5-甲氧基,3’-oh未阻断,可快速光切割的终止核苷酸以及用于核酸测序的方法 |
CN103866010A (zh) * | 2014-02-28 | 2014-06-18 | 郭诚 | 一种基因测序的方法 |
CN105219865A (zh) * | 2015-10-22 | 2016-01-06 | 东南大学 | 一种基于三色荧光标记的核酸测序方法 |
CN109476694A (zh) * | 2015-11-06 | 2019-03-15 | 奇根科学有限责任公司 | 核苷酸类似物 |
EP3702474A1 (en) * | 2019-02-26 | 2020-09-02 | QIAGEN GmbH | Sequencing method and kit |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
陈长宝 等: "6-氯-2-氨基嘌呤核苷酸合成、光谱性质及生化评价", 《应用化学》 * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN109715825B (zh) | 用于检测样品中目标核酸的方法 | |
US7157572B2 (en) | UV excitable energy transfer reagents | |
JP3066984B2 (ja) | 汎用スペーサー/エネルギー遷移染料 | |
AU692230B2 (en) | Probes labelled with energy transfer coupled dyes | |
US5863727A (en) | Energy transfer dyes with enhanced fluorescence | |
CN110691854A (zh) | 一种核酸测序方法以及一种核酸测序试剂盒 | |
WO2020093261A1 (zh) | 对多核苷酸进行测序的方法 | |
JP3949378B2 (ja) | ポリヌクレオチド配列の変異を決定するための方法 | |
US6218124B1 (en) | Method for detecting oligonucleotides using UV light source | |
CN113341058A (zh) | 一种三色高通量测序试剂及测序方法 | |
CN115323045A (zh) | 一种基因测序试剂及基因测序方法 | |
EP4267765A1 (en) | Methods and compositions for nucleic acid sequencing | |
CN112390839B (zh) | 三氮烯四色荧光可逆终止核苷酸测序试剂及dna单分子测序系统与测序方法 | |
WO2023186815A1 (en) | Labeled avidin and methods for sequencing | |
USRE43096E1 (en) | Tagged extendable primers and extension products | |
CN115803457A (zh) | 用于核酸测序的方法、系统和组合物 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20210903 |