CN114895021A - 基于链置换-表面临近杂交的多抗生素可视化检测试纸条及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于抗生素检测领域，涉及可视化检测试纸条，特别是指基于链置换‑表面临近杂交的多抗生素可视化检测试纸条及其制备方法和应用。检测试纸采用圆形设计，点样孔在圆心，可根据需要检测的抗生素种类分成多个检测区域。链置换探针与适配体预先退火杂交形成复合物，与光学纳米材料碳点标记的信号探针一同加入样品提取液，混匀，滴加到检测试纸中央样品区。在靶标存在的情况下，链置换探针被竞争下来与信号探针一起随着提取液沿试纸继续往外扩散迁移到达检测线。该检测方案中检测带的亮度与靶标的浓度成正比，是一种signal‑on检测模式。该方法经济快速、特异性较好、准确度高，有望用于土霉素、氯霉素的快速检测市场需求。

Description

基于链置换-表面临近杂交的多抗生素可视化检测试纸条及 其制备方法和应用
技术领域
本发明属于抗生素检测领域，涉及可视化检测试纸条，特别是指基于链置换-表面临近杂交的多抗生素可视化检测试纸条及其制备方法和应用。
背景技术
我国是世界上最大的畜禽产品生产消费国家，随着我国畜禽生产模式的发展，专业化、集约型生产经营模式逐渐得到普及。为了降低成本，许多工业化畜禽的饲养环境越发趋向更狭小的空间和更差的卫生条件，这样一来病菌的滋长将无法避免。所以，为了畜禽的健康、快速生长，大多数饲养者都会选择在饲养过程中长期使用抗生素。数据显示，2013年中国抗生素总使用量约为16.2万吨，超过了美国、英国、加拿大、丹麦等国的总和。事实上，被服用的抗生素大部分（约 30%~90%）以母体或代谢物的形式被排出体外，进而污染养殖场周围的水土环境，给附近的人民群众的饮水健康造成潜在威胁。人如果长期低剂量摄入含有抗生素的水、肉食会导致机体产生耐药性，诱导抗性基因，最终危及人类健康。
核酸适配体作为一类单链寡核苷酸，与靶分子发生特异性相互作用前后空间构象会发生相应的变化，与抗体相比具有可体外筛选获得、热稳定性好、易于化学合成和修饰等优点，甚至能区分单抗无法实现的单个取代基差别的靶分子。 各种基于核酸适配体的检测方法与技术已呈现出快速、灵敏、方便、低成本等优点，在生物医学应用中已经显示出广阔的应用前景，但在抗生素快检方面的应用却相对较少。2008年，Niazi等筛选到了四环素的特异性DNA核酸适配体。2010年，张娟琨教授基于该核酸适配体开发了电化学传感器用于牛奶中四环素的检测，检测限可达1ng·mL-1，检测时间5 min 。2010年，Kim等获得了土霉素的核酸适配体，开发了基于核酸适配体-聚苯乙烯微球的光散射凝集分析法用于土霉素的快速检测，整个检测过程只需3min，检测限可达100 ppb。在此基础上，2014年，Kim等又开发了酶联-核酸适配体生物传感技术用于饲料中土霉素的检测，该方法的IC 值约为59.7 ng·mL-1。2012年，Plehvar等开发了免标记型电化学核酸适配体生物传感技术用于牛奶中氯霉素的检测，检测限可达1.6 nM。本课题组前期在专利CN106680346A中，研究了一种基于链置换放大和表面临近杂交反应的AFB1电化学检测方法及应用，该方法检测起来操作步骤复杂、检测时需要结合在丝网印刷电极表面引入电活性探针，产生相应的电信号，对电信号进行检测，再代入标准曲线进行计算才能得出检测结果，而根据多年的农产品质量安全风险评估工作的调研情况来看，该方法虽然精确度高，但是在基层检验检测、监督抽查时，明显不能及时、快速、随时随地的实现检测，因此本课题组为了实现大量样品的现场快速筛查分析，拟开发一种定性、定量/半定量的可视化试纸生物传感技术，以便为实验室确证分析节省时间和费用，进而作出以下探索。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提出一种基于链置换-表面临近杂交的多抗生素可视化检测试纸条及其制备方法和应用。
本发明的技术方案是这样实现的：
基于链置换-表面临近杂交的多抗生素可视化检测试纸条的制备方法，步骤如下：
（1）分别设计土霉素和氯霉素的适配体、链置换探针、信号探针、检测探针和质控探针；
（2）制备碳点CD1与信号探针反应，得到碳点标记的信号探针；
（3）将检测探针和质控探针分别固定在NC膜上的检测线和质控线。
进一步，所述步骤（1）中土霉素的适配体的序列为5’-bio-(CH2)6-GATCGGGTGTGGTTGGCGTAAAGGGAGCATCGG-3’、链置换探针的序列为5’-CCGATGCTCCCTTTA-3’、信号探针的序列为5’-NH2-(CH2)12-TTTTTTTTTTAGCATCGGCCGTTAG-3’、检测探针的序列为5’-bio-(CH2)6-TTTTTTTTTTATGCTCTTAAAGGG-3’以及质控探针的序列为5’-bio- (CH2)6-TTTTTTTTTTGATGCTCCCTT-3’。
进一步，所述步骤（1）中氯霉素的适配体序列为5’-bio-(CH2)6-ACTTCAGTGAGTTGTCCCACGGTCGGCGAGTCGGTGGTAG-3’、链置换探针的序列为5’-CTACCACCGACTCGCCGACCG-3’、信号探针的序列为5’-NH2-(CH2)12-TTTTTTTTTTGTCGGTGGTAGTAGCCGT-3’、检测探针的序列为5’-bio-(CH2)6-TTTTTTTTTTATGCTCTCGGTCGGCGA-3’和质控探针的序列为5’-bio-(CH2)6-TTTTTTTTTTCCACCGACTCGCCGA-3’。
进一步，所述步骤（2）中碳点CD1的制备方法为：取1.26 g柠檬酸和1608 µL EDA溶于30 mL双蒸水中，混合均匀后转移至水热反应釜中，180℃反应5h，所得产物经透析纯化得到碳点CD1。
进一步，所述步骤（2）中碳点标记的信号探针制备方法为：取5 mg碳点CD1溶于7.5mL的0.1M，pH 7.2 Tris-HCl缓冲液 中，加入3mg EDC和4.5 mg NHS反应30 min，再加入50µL检测探针/质控探针反应12 h，随后用透析膜透析纯化，获得碳点标记的信号探针。
进一步，所述步骤（3）中碳点标记的信号探针的固定机理为以EDC和NHS为交联剂将氨基修饰的信号探针固定到表面含有羧基的碳点上，形成酰胺键连接的碳点标记的信号探针。
进一步，上述的多抗生素可视化检测试纸条的使用方法，将链置换探针与适配体预先退火杂交形成复合物，与碳点标记的信号探针一同加入样品提取液，混匀，滴加到检测试纸中央样品区进行检测。
上述方法制备的基于链置换-表面临近杂交的多抗生素可视化检测试纸条，所述多抗生素可视化检测试纸条为圆形，点样孔在圆心，检测区域呈360°扇形分布，从圆心点样孔向外依次为固定有检测探针的检测线和固定有质控探针的质控线。
进一步，所述检测探针和质控探针分别以链霉亲和素为中间体形成链霉亲和素-生物素-DNA复合物固定在NC膜上相应的检测线和质控线上。
上述的多抗生素可视化检测试纸条可在非疾病诊断目的的自来水、农副产品中土霉素和/或氯霉素的检测中应用。
进一步，所述土霉素的检测灵敏度≥24.6μg/L；氯霉素的检测灵敏度＞10.26μg/L。
本发明具有以下有益效果：
1、本申请将抗生素核酸酸适配体作为分子识别元件，光学纳米材料碳点作为换能器，采用链置换的信号传导技术，再通过表面临近杂交反应进行信号输出。链置换探针与适配体预先退火杂交形成复合物，与光学纳米材料碳点标记的信号探针一同加入样品提取液，混匀，滴加到检测试纸中央样品区。在靶标存在的情况下，链置换探针被竞争下来与信号探针一起随着提取液沿试纸继续往外扩散迁移到达检测线。因此，该检测方案中检测带的亮度与靶标的浓度成正比。该方法建立的测定多抗生素的可视化检测试纸，具有经济、简单、便捷、高特异性的优点。
2、根据表面临近杂交原理，链置换探针和信号探针通过协同杂交作用与检测带上固定的检测探针形成杂交复合物并显色；靶标不存在的情况下，链置换探针不与适配体解离，检测带上不会发生表面临近杂交反应，从而不显色。因此，该检测方案中检测带的亮度与靶标的浓度成正比。该方法是一种signal-on检测模式。通过特异性实验及与LCMS仪器分析法，该方法经济快速、特异性较好、准确度高及便捷的优点，有望用于土霉素、氯霉素的快速检测市场需求。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为可实现多种抗生素同时检测的检测试纸设计图。
图2为碳点CD-1的透射电镜图。
图3为碳点溶液的激发波长图a、发射波长图b及溶液颜色照片（图a嵌图）。
图4为碳点CD1溶液在不同激发波长下的发光强度考察。
图5为本申请的可视化检测试纸的检测原理。
图6为试纸的特异性验证结果图，其中OTC-土霉素、CAP-氯霉素、土-土霉素、四-四环素。
图7为抗生素加标自来水的试纸检测结果图，其中土霉素加标自来水的浓度分别为：A，1.1μg/L；B，70.2μg/L；C，10.87μg/L；D，30.48μg/L；E，5.15μg/L；F，24.6μg/L。氯霉素加标自来水的浓度为：G，50.47μg/L；H，10.2μg/L；1、2、3表示同浓度样品的3次重复检验。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例
基于链置换-表面临近杂交的多抗生素可视化检测试纸条的制备方法，步骤为：
1、检测试纸的设计
抗生素检测试纸的设计如图1所示，点样孔在圆心，可根据需要检测的抗生素种类分成多个检测区域。圆形检测试纸设计的优点在于：能够保证样品提取液中靶标达到检测带或质控带所迁移的距离相同，消除因距离差引起的检测结果的不一致；中央加样孔中的样品可以同时向四周均匀扩散、迁移，少量样品即可实现多靶标的同时检测；围绕中央加样孔的检测条带和质控条带的长度可调，便于后期根据需要随时增加更多感兴趣的靶标条带，同时又不会增加太多成本。
2、检测步骤
（1）探针的设计
本发明设计的所有探针见下表：
表1 实验所用的适配体序列及相关探针序列
Figure DEST_PATH_IMAGE001
注：下划线序列相互匹配
（2）碳点表面的生物功能化修饰
a. 碳点CD1的制备方法
柠檬酸-乙二胺碳点：取1.26 g柠檬酸和1608 μl EDA溶于30 mL双蒸水中，混合均匀后转移至水热反应釜中，180℃反应5h。所得产物用截留分子量为300 Da的透析袋透析纯化，得表面富含羧基的碳点CD1，于4℃下保存。
碳点CD1的透射电镜图如图2所示，可知本申请的碳点CD1的平均粒径为10 nm，由图3a、b的可知，碳点CD1的激发波长为280 nm，发射波长分别为420nm，我们特意针对碳点CD1溶液采用不同波长的激发光照射，检测该溶液的发光强度及发光性能。结果如图4所示：本研究过程中利用水热合成法制备的碳点CD1的最大激发波长不随激发波长的移动而发生变化，因此适合作为信号探针的修饰碳点。
b. 取5 mg表面富含羧基的碳点CD1溶于7.5 mL的Tris-HCl缓冲液（0.1M，pH 7.2）中，加入3mg EDC和4.5 mg NHS反应30 min。再加入50 µL检测探针/质控探针反应12 h，随后用透析膜透析纯化，制备好的核酸功能化碳点（碳点标记的信号探针）4℃存储备用。
（3）探针在检测试纸上的固定
为了将相应的DNA（检测探针和质控探针）固定在NC膜上相应的检测线和质控线上，采用链霉亲和素作为中间体与生物素标记的DNA（bio-DNA）反应形成链霉亲和素-生物素-DNA复合物。
具体步骤为：在检测线和质控线上喷涂40uL10uM bio-DNA与40uL1mg/mL链霉亲和素混合液，4℃孵育2h，然后加入50uL PBS（0.6% PEG，1%sucrose，0.2% Tween 20，0.02%MgSO4，0.05%(NH4)2SO4和1% OVA，均为质量分数）。
本申请可视化试纸的检测原理（如图5所示）为：链置换探针（图中黑色探针）与核酸适配体（绿色探针）预先退火杂交形成复合物，与光学纳米材料标记的信号探针（图中橘红色探针）一同加入样品提取液，混匀，滴加到检测试纸中央样品区。因靶标与核酸适配体的结合力大于链置换探针与核酸适配体的结合力，在靶标存在的情况下，链置换探针会被靶标竞争下来，与信号探针一起随着提取液沿试纸继续往外扩散迁移到达检测线。此时，根据表面临近杂交原理，链置换探针和信号探针通过协同杂交作用与检测带上固定的检测探针（图中青蓝色探针）形成杂交复合物并显色。在靶标不存在的情况下，链置换探针不会与核酸适配体解离，检测带上不会发生表面临近杂交反应，因此信号探针将继续往外扩散迁移到达质控线，被上面固定的质控探针（图中深蓝色探针）捕获而固定下来并显色。因此，该检测方案中检测带的亮度与靶标的浓度成正比。
实施效果例
一、检测方法的特异性：
为了考察方法的特异性，我们采集含有100 μg/L（国家限量值）土霉素（OTC）、氯霉素（CAP）、左氧氟沙星、四环素的4份水样，简单过滤后进行检测。取100 μL待检水样，100 μL预混探针溶液（土霉素、氯霉素配套探针浓度分别为：1μM碳点标记的信号探针，1μM适配体，1μM链置换探针），300 μL纯净水，500 μL 2×反应缓冲溶液（200 mM NaCl，40 mM Tris-HCl，4 mM MgCl2，10 mM KCl，2 mM CaCl2，0.04 Tween20，pH 7.6。），混匀后反应室温反应5min，滴加到试纸条中央的圆心上，3 min后观察试纸条的颜色，结果如图6所示，该检测试纸能很好识别土霉素、氯霉素，且在此浓度下检测线和控制线清晰可见。
二、与LC-MS结果的对比
为了验证方法的可靠性，我们选择不同浓度的土霉素、氯霉素加标自来水分别用LCMS方法和本发明制备的试纸来检测：
表2 自来水加标标验证分析
Figure 768048DEST_PATH_IMAGE002
*注：仪器检测结果为每个样品3次结果的平均值；试纸检测结果的判断标准为：3次检测结果中2次以上检测结果为阳性判断为阳性。
统计结果如表2所示，试纸检测结果如图7所示。土霉素加标自来水的浓度分别为：A，1.1 μg/L；B，70.2 μg/L；C，10.87 μg/L；D，30.48 μg/L；E，5.15 μg/L；F，24.6 μg/L。氯霉素加标自来水的浓度为：G，50.47 μg/L；H，10.2 μg/L。通过对比试验我们发现，OTC浓度≥24.6 μg/L的加标自来水样品的试纸检测结果与LCMS仪器分析法的结果匹配度较高；OTC浓度＜24.6 μg/L的加标自来水样品，该试纸无法检出。CAP浓度≥50.47 μg/L的加标自来水样品的试纸检测结果与LCMS仪器分析法的结果一致；CAP浓度≤10.26 μg/L的加标自来水样品，该试纸无法检出。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.基于链置换-表面临近杂交的多抗生素可视化检测试纸条的制备方法，其特征在于，步骤如下：
（1）分别设计土霉素和氯霉素的适配体、链置换探针、信号探针、检测探针和质控探针；
（2）制备碳点CD1与信号探针反应，得到碳点标记的信号探针；
（3）将检测探针和质控探针分别固定在NC膜上的检测线和质控线。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中土霉素的适配体的序列为5’-bio-(CH2)6-GATCGGGTGTGGTTGGCGTAAAGGGAGCATCGG-3’、链置换探针的序列为5’-CCGATGCTCCCTTTA-3’、信号探针的序列为5’-NH2-(CH2)12-TTTTTTTTTTAGCATCGGCCGTTAG-3’、检测探针的序列为5’-bio-(CH2)6-TTTTTTTTTTATGCTCTTAAAGGG-3’以及质控探针的序列为5’-bio-(CH2)6-TTTTTTTTTTGATGCTCCCTT-3’。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中氯霉素的适配体序列为5’-bio-(CH2)6-ACTTCAGTGAGTTGTCCCACGGTCGGCGAGTCGGTGGTAG-3’、链置换探针的序列为5’-CTACCACCGACTCGCCGACCG-3’、信号探针的序列为5’-NH2-(CH2)12-TTTTTTTTTTGTCGGTGGTAGTAGCCGT-3’、检测探针的序列为5’-bio-(CH2)6-TTTTTTTTTTATGCTCTCGGTCGGCGA-3’和质控探针的序列为5’-bio-(CH2)6-TTTTTTTTTTCCACCGACTCGCCGA-3’。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中碳点CD1的制备方法为：取1.26 g柠檬酸和1608 μl EDA溶于30 mL双蒸水中，混合均匀后转移至水热反应釜中，180℃反应5h，所得产物经透析纯化得到碳点CD1。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中碳点标记的信号探针制备方法为：取5 mg碳点CD1溶于7.5 mL的0.1M，pH 7.2 Tris-HCl缓冲液 中，加入3mg EDC和4.5 mg NHS反应30 min，再加入50 µL信号探针反应12 h，随后用透析膜透析纯化，得碳点标记的信号探针。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中碳点标记的信号探针的固定机理为以EDC和NHS为交联剂将氨基修饰的信号探针固定到表面含有羧基的碳点上，形成酰胺键连接的碳点标记的信号探针。
7.权利要求1-6任一项所述的方法制备的基于链置换-表面临近杂交的多抗生素可视化检测试纸条，所述多抗生素可视化检测试纸条为圆形，点样孔在圆心，检测区域呈360°扇形分布，其特征在于：从圆心点样孔向外依次为固定有检测探针的检测线和固定有质控探针的质控线。
8.权利要求7所述的多抗生素可视化检测试纸条的使用方法，其特征在于：将链置换探针与适配体预先退火杂交形成复合物，与碳点标记的信号探针一同加入样品提取液，混匀，滴加到检测试纸中央样品区进行检测。
9.权利要求7所述的多抗生素可视化检测试纸条在非疾病诊断目的的自来水、农副产品中土霉素和/或氯霉素的检测中应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述土霉素的检测灵敏度≥24.6μg/L；氯霉素的检测灵敏度＞10.26μg/L。
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