CN102350326A

CN102350326A - 一种砷酸锆键合磁性硅球的制备方法

Info

Publication number: CN102350326A
Application number: CN2011102018449A
Authority: CN
Inventors: 冯钰锜; 李小水
Original assignee: Wuhan University WHU
Current assignee: Wuhan University WHU
Priority date: 2011-07-19
Filing date: 2011-07-19
Publication date: 2012-02-15

Abstract

本发明涉及一种砷酸锆键合磁性硅球的制备方法。本方法首先合成了含氨基的磁性硅球，然后通过戊二醛的桥联作用，将对氨基苯砷酸键合到磁性硅球上，最后将锆离子通过砷酸根的螯合作用固载到磁性硅球上，并用于磷酸化肽段的富集。此方法使用的原材料价格低廉，制备方法简单，所制备的材料可有效地应用于磷酸化肽段的富集。

Description

一种砷酸锆键合磁性硅球的制备方法

技术领域

本发明一种砷酸锆键合磁性硅球的制备方法，属于有机合成领域，也属于仪器分析领域。

背景技术

蛋白质磷酸化修饰是指在蛋白质激酶的催化下把ATP上的磷酸基团转移到蛋白质氨基酸残基上的过程。它是生物界普遍存在的一种调控机制，调节着许多生命过程，如细胞间的信号传导，细胞生长、增殖、分化及凋亡等。鉴于它在细胞活动中起着至关重要的作用，探索蛋白质磷酸化修饰过程的奥秘及其对蛋白质功能的影响已经成为众多生物化学家及蛋白质组学家所关心的内容。其中，磷酸化位点的鉴定和定量是首要任务。

蛋白质磷酸化具有暂时性和可逆性，在一个特定时间点，并不是所有的氨基酸位点都处于磷酸化状态。并且，相对于非磷酸化蛋白，磷酸化蛋白的丰度较低。因此，进行磷酸化组学研究时，需要采用高灵敏度的技术。目前，质谱是蛋白质磷酸化分析最有力的工具。然而，由于高丰度非磷酸化肽段的干扰，磷酸化肽段的电离效率降低，导致信号强度较弱。因此，在质谱分析之前，通常需要从蛋白酶解产物中选择性地富集磷酸化肽段。

目前已发展出多种磷酸化蛋白质和肽段的预富集方法，主要包括：（1）免疫亲和富集法；（2）化学衍生法；（3）离子交换色谱法；（4）固定金属亲和色谱法（IMAC）；（5）金属氧化物亲和色谱法（MOAC）；（6）SIMAC技术；（7）磷酸钙沉淀法等。其中，IMAC和MOAC是目前应用最为广泛的两种方法。IMAC技术是利用固载在基底上的金属离子对磷酸基团的亲和力来选择性地富集磷酸化蛋白质或肽段。其中，金属离子的固载一般是通过键合到基底上的配体（又称为螯合剂）的配位作用实现的，常见的配体有三羟甲基乙二胺（TED）、亚氨基二乙酸（IDA）、次氮基三乙酸（NTA）等。在这种方法中，螯合剂与金属离子的作用力强弱对磷酸化多肽的富集效率有着很大的影响；螯合剂的作用力太弱容易导致金属离子的流失，从而导致富集效率下降。因此，新配体的研究对于提高磷酸化多肽的富集效率具有重要意义。

2006年，有人报道了以磷酸根作为固载金属离子的配体，将所得材料用来富集磷酸化肽段，并获得很好的富集效果。此后，基于磷酸根为配体的IMAC技术得到了广泛的关注和研究。然而，此过程中，磷酸根的获得往往需要利用一些对人体毒性较大的物质。因此，仍有必要去寻找制备方法简单，合成原料安全廉价的固定相。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供了一种制备简单、原料安全廉价的IMAC的固定相及其制备方法。

本发明提供的IMAC的固定相是：砷酸锆键合磁性硅球。

其制备方法是：

首先合成含氨基的磁性硅球，然后通过戊二醛的桥联作用，将对氨基苯砷酸键合到磁性硅球上，然后将亚胺还原为较稳定的仲胺，最后将锆离子通过砷酸根的螯合作用固载到磁性硅球上。

所述的含氨基的磁性硅球的制备方法是：首先通过二价铁和三价铁共沉淀合成磁性四氧化三铁，然后通过Stöber方法合成磁性硅球，最后通过含氨基的硅烷偶联剂在硅球表面键合氨基。

对氨基苯砷酸键合到磁性硅球上的方法是：首先利用氨基与醛的亲核反应，将戊二醛键合到氨基磁性硅球上，接着利用上述原理，将对氨基苯砷酸键合到磁性硅球。

还原过程的反应条件是：氰基硼氢化钠在室温下，将亚胺还原为仲胺，反应时间3 h。

锆离子螯合作用的反应条件是：室温下，磁性硅球在0.1 mol/L的氧氯化锆溶液中浸泡12小时。

本发明方法使用的原材料价格低廉无毒，制备方法简单，所制备的材料可有效地应用于磷酸化肽段的富集。

本发明制备砷酸锆键合磁性硅球的路线如下所示。

首先利用二价铁离子和三价铁离子的共沉淀作用合成四氧化三铁纳米颗粒，然后利用Stöber方法合成磁性硅球。将含氨基的硅烷偶联剂键合到磁性硅球表面之后，利用氨基与醛的亲核反应，在磁性硅球的表面引入醛基。最后仍根据上述原理，将对氨基苯砷酸键合到材料上，氰基硼氢化钠将亚胺还原为仲胺，并且将锆离子固载到砷酸上。将上述材料用于富集磷酸化多肽时，可获得非常好的富集效果。此方法使用的原材料价格低廉，制备方法简单。

附图说明

图1实施例6 β-酪蛋白胰蛋白酶解液经砷酸锆键合磁性微球富集后的MALDI-TOF-MS质谱图。

图2实施例7 α-酪蛋白胰蛋白酶解液经砷酸锆键合磁性微球富集后的MALDI-TOF-MS质谱图。

图3实施例8 α-酪蛋白和BSA的胰蛋白酶解液（α-酪蛋白与BSA的摩尔比为1:50）经砷酸锆键合磁性微球富集后的MALDI-TOF-MS质谱图。

具体实施方式

实施例1 磁性硅球的制备

(1) 2 g FeCl₂·4H₂O和5.4 g FeCl₃·6H₂O 溶于25 mL 2 mol/L的盐酸后，在N₂保护下，加入30 mL 25%（v/v）的浓氨水，搅拌30 min后，得到黑色悬浊液，用外磁体将黑色固体从溶液中分离出来。将上述固体用去离子水清洗三次后，分散于50 mL去离子水中，浓度约为40 mg/mL。

(2) 取10 mL上述制备好的磁流体，用10 mL无水乙醇清洗两次后，分散于40 mL的无水乙醇中，超声1 h。依次加入1.5 mL 25%（v/v）的浓氨水、6 mL去离子水和1.5 mL四乙氧基硅烷（TEOS），40℃搅拌下反应2 h后即可得到磁性硅球。用去离子水清洗数次后，用乙醇清洗三次，60℃真空干燥箱中烘干后储存备用。

实施例2 氨基键合磁性硅球的制备

取0.5 g磁性硅球，用25 mL1 mol/L的HCl浸泡1 h，并洗至中性。然后将其分散于50 mL的乙醇中。往上述悬浊液中滴加2 mL的γ-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES），室温搅拌3 h，即得氨基键合磁性硅球。分别用去离子水和乙醇清洗反应产物，待用。

实施例3 醛基键合磁性微球的制备

将以上制备获得的氨基键合的磁性硅球分散于50 mL 0.1 mol/L的磷酸盐缓冲液（pH 7.4，含10 mL 25wt%的戊二醛）中，搅拌6 h，即得醛基键合磁性微球。反应结束后，分别用去离子水和乙醇清洗反应产物，待用。

实施例4 砷酸根键合磁性微球的制备

将以上制备获得的醛基键合磁性微球分散于50 mL 0.1 mol/L的磷酸盐缓冲液（pH 7.4）中，然后加入0.2 g的对氨基苯砷酸和0.04 g的氰基硼氢化钠，搅拌3 h，即得砷酸根键合磁性微球。反应结束后，分别用去离子水和乙醇清洗反应产物，真空干燥，待用。

实施例5 砷酸锆键合磁性微球的制备

取0.1 g砷酸根键合磁性微球分散于100 mL 0.1 mol/L的氧氯化锆溶液中，搅拌过夜。用去离子水将多余的锆离子洗掉，真空干燥，待用。

实施例6 β-酪蛋白中磷酸化多肽的选择性富集

称取30 mg 砷酸锆键合磁性微球，分散于1 mL的去离子水中。吸取5 μL上述悬浊液加入30 μL用上样溶液稀释至特定浓度的β-酪蛋白的胰蛋白酶解液中，涡旋10 min后用外磁体分离固体颗粒和溶液，去掉上清液。经40 μL上样溶液清洗两次后，用30 μL NH₃·H₂O (2.5 %, v/v)对富集在材料上的多肽进行解吸，涡旋10 min，收集解吸液，加入1 μL人工合成肽段（内标）后旋干分析。质谱谱图显示含有三个β-酪蛋白酶解液中的磷酸化多肽及六个α-酪蛋白酶解液中的磷酸化多肽（如图1所示，图中内标以“#”表示）。

实施例7 α-酪蛋白中磷酸化多肽的选择性富集

称取30 mg 砷酸锆键合磁性微球，分散于1 mL的去离子水中。吸取5 μL上述悬浊液加入30 μL用上样溶液稀释至特定浓度的α-酪蛋白的胰蛋白酶解液中，涡旋10 min后用外磁体分离固体颗粒和溶液，去掉上清液。经40 μL上样溶液清洗两次后，用30 μL NH₃·H₂O (2.5 %, v/v)对富集在材料上的多肽进行解吸，涡旋10 min，收集解吸液，加入1 μL人工合成肽段（内标）后旋干分析。质谱谱图显示有14个磷酸化多肽被成功富集到材料上，并且其它非磷酸化多肽的干扰很少（如图2所示，图中内标以“#”表示）。

实施例8 复杂样品中磷酸化多肽的选择性富集

称取30 mg 砷酸锆键合磁性微球，分散于1 mL的去离子水中。吸取5 μL上述悬浊液加入30 μL用上样溶液稀释至特定浓度的α-酪蛋白与BSA（非磷酸化蛋白）混合的胰蛋白酶解液中，涡旋10 min后用外磁体分离固体颗粒和溶液，去掉上清液。经40 μL上样溶液清洗两次后，用30 μL NH₃·H₂O (2.5 %, v/v)对富集在材料上的多肽进行解吸，涡旋10 min，收集解吸液，加入1 μL人工合成肽段（内标）后旋干分析。质谱谱图显示有14个磷酸化多肽被成功富集到材料上，并且其它非磷酸化多肽的干扰很少（如图3所示，图中内标以“#”表示）。

Claims

1.一种砷酸锆键合磁性硅球的制备方法，其特征在于，首先合成含氨基的磁性硅球，然后通过戊二醛的桥联作用，将对氨基苯砷酸键合到磁性硅球上，然后将亚胺还原为仲胺，最后将锆离子通过砷酸根的螯合作用固载到磁性硅球上。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的含氨基的磁性硅球的制备方法是：首先通过二价铁和三价铁共沉淀合成磁性四氧化三铁，然后通过Stöber方法合成磁性硅球，最后通过含氨基的硅烷偶联剂在硅球表面键合氨基。

3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，对氨基苯砷酸键合到磁性硅球上的方法是：首先利用氨基与醛的亲核反应，将戊二醛键合到氨基磁性硅球上，接着将对氨基苯砷酸键合到磁性硅球上。

4.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，还原过程的反应条件是：氰基硼氢化钠在室温下，将亚胺还原为仲胺。

5.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，锆离子螯合作用的反应条件是：室温下，磁性硅球在0.1 mol/L的氧氯化锆溶液中浸泡12小时。