CN102114414A - 一种固定化金属离子亲和色谱整体柱的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及固定化金属离子亲和色谱材料的制备,具体地说是一种固定化金属离子亲和色谱整体柱的制备方法,以表面带有醛基的有机-无机杂化硅胶整体材料为载体制成整体柱材料;于整体柱材料上连续通过含有胺甲基磷酸和氰基硼氢化钠NaCNBH3的磷酸盐缓冲溶液,制备得到表面带有磷酸螯合基团的整体材料载体;将过渡金属离子的水溶液通过材料载体,制备得到固定化金属离子亲和色谱整体柱。利用该固定化金属离子亲和色谱整体柱可以实现混合肽段中磷酸化肽的高选择性富集。本发明的优点为:对磷酸化肽具有较好的选择性,可反复使用,富集容量较大,回收率较高,且制备方法简便,通透性好、反压小、机械强度好、耐酸碱性强。
Description
技术领域
本发明涉及固定化金属离子亲和色谱材料的制备,具体地说是发明了一种基于有机-无机硅胶杂化基质的磷酸鳌合固定化金属离子亲和色谱柱,应用于磷酸化肽的高选择性富集。
背景技术
固定化金属离子亲和色谱是基于固定化的金属离子与磷酸化肽段的磷酸基团之间的亲和作用,选择性的富集磷酸化肽段的一种技术。相对于其他磷酸化肽富集方法,固定化金属离子亲和色谱应用最为广泛,对各种磷酸化氨基酸残基都可实现富集。固定化金属离子亲和色谱技术的发展得到了许多研究人员的广泛关注(Paradela,A.;Albar,J.P.J.Proteome Res.2007,7,1809-1818 & Han,G.H;Ye,M.L.;Zou,H.F.Analyst 2008,133,1128-1138)。
固定化金属离子亲和色谱的性能与载体和金属鳌合基团的种类密切相关。目前已有多种载体材料用于酶的固定化,主要有:毛细管内壁(Xue,Y.F.;Wei,J.Y.;Qian,X.H.;et al.,J.Chromatogr.B.2009,877,757-764)、颗粒材料(Feng,S.;Ye,M.L.;Zou,H.F.;et al.,Molecular & Cellular Proteomics2007,6,1656-1665)和整体材料(Dong,J.;Zhou H.J.;Zou,H.F.;et al.,J.Sep.Sci.2007,30,2917-2923)等。多孔整体材料是近年发展起来的一种新型的色谱分离介质。通过优化合成条件,可以制备得到同时具有大的通孔和小的扩散孔的多孔结构整体材料载体,因此具有较好的通透性、较低的反压。对于基于整体材料的固定化金属离子亲和色谱而言,可固载金属离子的比表面积大,耐酸碱性强,传质速率得以显著提高。除了载体材料外,金属离子鳌合基团也对固定化酶的性质有较大影响。金属离子鳌合基团主要有:亚氨基二乙酸(IDA)(Aprilita,N.H.;Huck,C.W.;Bonn,G.K.;et al.,J.Proteome Res.2005,4,2312-2319)、氨基三乙酸(NTA)(Dunn,J.D.;Igrisan,E.A;Bruening,M.L.;et al.,Anal.Chem.2008,80,5727-5735)和有机磷酸酸(Feng,S.;Ye,M.L.;Zou,H.F.;et al.,Molecular & Cellular Proteomics 2007,6,1656-1665)。传统的固定化金属离子亲和色谱材料,每个金属离子仅和一个IDA或NTA配体配位,所以容易在上样或洗脱过程中损失。而常用的金属离子,如Fe3+、Ga3+、Ni2+等也会结合羧基,造成其对酸性或含组氨酸的肽段的非特异性吸附。所以,我们尝试发展一种基于整体材料的固定化金属离子亲和色谱柱。该固定化金属离子亲和色谱柱对磷酸化肽具有较好的选择性性,且富集容量大、回收率高、可重复使用、耐酸碱性强。
发明内容
本发明的目的在于提供一种固定化金属离子亲和色谱柱的制备方法,制备的固定化金属离子亲和色谱柱应用于磷酸化肽的富集,具有较好的选择性及较高的富集容量。
为实现上述目的,本发明采用的技术方案为:
以表面带有醛基的多孔有机-无机杂化硅胶整体材料为载体;在杂化硅胶整体材料载体表面,再修饰带有胺基的有机磷酸作为金属离子鳌合基团;最后固定上过渡金属离子;即制备得到基于有机-无机杂化硅胶整体材料的磷酸鳌合固定化金属离子亲和色谱柱,可以实现磷酸化肽的高选择性富集。
具体为:一种固定化金属离子亲和色谱整体柱的制备方法,
1)以表面带有醛基的有机-无机杂化硅胶整体材料为载体制成整体柱材料;
2)于整体柱材料上连续泵过含有金属离子鳌合基团的胺甲基磷酸和氰基硼氢化钠NaCNBH3的磷酸盐缓冲溶液,制备得到表面带有磷酸螯合基团的整体材料载体;
整体材料载体表面与金属离子螯合的反应基团是磷酸基团;金属离子螯合基团经过整体材料表面醛基和带有胺基的胺甲基磷酸反应修饰到整体材料基质表面;
步骤2)中修饰金属离子鳌合基团的具体过程为:将含有1-5mg/mL胺甲基磷酸或胺乙基磷酸、及2.5-7.5mg/mL的氰基-硼氢化钠NaCNBH3的pH=7.5-8.5磷酸盐缓冲溶液通过整体柱,在室温下反应6-24小时。
3)将过渡金属离子的水溶液通过材料载体,制备得到固定化金属离子亲和色谱整体柱;
步骤3)中固定化金属离子的过程为:将含有20-100mM Ti(SO4)2或ZrOCl2的水溶液通过整体柱材料,在室温下反应6-24小时;所制备得到的整体柱用水冲洗0.5-6小时。
4)将制备得到的固定化金属离子亲和色谱柱应用于磷酸化肽的富集,可以高选择性的结合磷酸化肽;
步骤4)中富集磷酸化肽的过程为:肽段混合物在酸性条件下上样到整体材料上,经过乙腈和NaCl溶液的冲洗洗去非特异性吸附的肽段,最后在碱性条件下将亲和富集的磷酸化肽洗脱下来。
本发明固定化金属离子亲和色谱整体柱对磷酸化肽有特异性亲和作用,应用于混合肽段中磷酸化肽的高选择性富集。
步骤1)中,金属离子的固定化载体是表面带有醛基的有机-无机杂化硅胶整体材料,可以制备在毛细管中,或制备在金属管中,或制备成块状。
本发明的优点为:本发明以表面带有醛基的多孔有机-无机杂化硅胶整体材料为载体,在载体表面修饰磷酸基团鳌合过渡金属离子即可用于磷酸化肽的选择性富集。其制备方法简便,成本低;制备获得的固定化金属离子亲和色谱柱的对磷酸化肽的选择性好,可重复使用,且富集容量加大, 回收率较高,耐酸碱性强,反压低。
附图说明
图1 有机-无机杂化硅胶整体材料固定化金属离子亲和色谱柱的制备示意图。其中(a)有机-无机杂化硅胶整体材料载体的制备;(b)载体材料上金属离子的固定化。
图2 α-酪蛋白酶解后的产物经固定化金属离子亲和色谱柱富集前(a)和富集后(b)MALDI-TOF MS分析得到的质谱图;2pmol的α-酪蛋白酶解后的产物经过经固定化金属离子亲和色谱柱富集,可以明显去除非磷酸化肽的干扰,增加检测到的磷酸化肽的数目。这说明本发明所制备的固定化金属离子亲和色谱柱对磷酸化肽的富集的选择性好性,可以对有效的富集肽段混合物中的磷酸化肽。
图3 α-酪蛋白酶解后的产物经固定化金属离子亲和色谱柱连续富集七次所鉴定到的磷酸化肽数目。同一固定化金属离子亲和色谱柱连续富集七次所鉴定到的磷酸化肽数目均在11左右,说明本发明所制备的固定化金属离子亲和色谱柱可重复使用,重现性好。
具体实施方式
本发明表面带有醛基的有机-无机杂化硅胶整体材料的制备可参照文献:中国专利,专利申请号:200810010347.9进行。
具体操作过程为:采用四乙氧基硅烷TEOS或四甲氧基硅烷TMOS与氨丙基三乙氧基硅烷APTES一起作为前体分子,以带有C8-C16烷基链的阳离子表面活性剂为模板分子,以无水乙醇或甲醇为共溶剂,加水后经由溶胶-凝胶法及超分子模板法制备得到了一种有机-无机杂化硅胶整体材料载体;其中TEOS或TMOS与APTES的物质的量之比为3/7--7/3;水与前体分子(TEOS和APTES的物质的量的总和)物质的量之比为=2.5/1-1.2/1,模板分子的质量mg与前体分子物质的量mmol之比为6-10;无水乙醇或甲醇的体积μL与前体分子物质的量mmol之比为175-250;溶胶-凝胶法聚合反应温度为25℃-80℃,聚合时间为12-24小时;所述模板分子最好为十六烷基三甲基溴化氨CTAB;其采用的前体分子之一是氨丙基三乙氧基硅烷,其同时也是溶胶-凝胶反应的催化剂。载体用戊二醛活化过程为:将含有体积浓度5-20%戊二醛的pH=7.5-8.5磷酸盐缓冲液浸泡整体材料,在室温下反应4-12小时。
实施例1
按照如下步骤制备固定化金属离子亲和色谱柱。
1)鳌合基团的修饰:将含有2mg/mL AMPA和5mg/mL氰基-硼氢化钠NaCNBH3的100mM磷酸盐缓冲液(pH8.0)泵入柱中,在室温下反应6小时。即可制备得到表面修饰磷酸鳌合基团的整体柱载体。合成实例具体参数如下表1所示。
2)金属离子的固载:含有20-100mM Ti(SO4)2的水溶液,在室温下反 应6-24小时;所制备得到的整体柱用水冲洗0.5-6小时。即制备得到固定化金属离子亲和色谱柱(具体参数如下表1所示)。
表1.整体材料表面鳌合基团的修饰及金属离子的固定化参数。
实例 序号 | AMPA 浓度 mg/mL | NaCNBH3 浓度 mg/mL | 修饰鳌合 基团的反 映时间h | Ti(SO4)2浓 度mM | ZrOCl2 浓度 mM | 金属离子 固定化时 间h |
1 | 2.5 | 5 | 6 | 100 | 50 | 6 |
2 | 2.5 | 5 | 6 | 50 | 25 | 12 |
3 | 2.5 | 5 | 6 | 20 | 20 | 24 |
4 | 2.5 | 7.5 | 6 | 100 | 50 | 6 |
5 | 2.5 | 2.5 | 24 | 50 | 25 | 12 |
6 | 2.5 | 5 | 12 | 20 | 20 | 24 |
7 | 2 | 5 | 6 | 100 | 50 | 6 |
8 | 1.8 | 7.5 | 16 | 50 | 25 | 12 |
9 | 1.5 | 4.5 | 18 | 80 | 40 | 10 |
10 | 1 | 2.5 | 24 | 80 | 40 | 10 |
11 | 5 | 7.5 | 12 | 20 | 20 | 24 |
具体应用:
富集磷酸化肽的过程为:肽段混合物溶解于含有6%TFA、80%乙腈的溶液中,按照1μL/min的流速上样到整体材料上;经过两步冲洗洗去非特异性吸附的肽段,冲洗所用溶液分别为200mM NaCl、6%TFA、50%乙腈的溶液和0.1%TFA、30%乙腈的溶液;最后用12.5%的氨水溶液将亲和富集的磷酸化肽洗脱下来。
由图2可以看出,当2pmol的α-酪蛋白酶解后的产物不经富集时,非磷酸化肽的信号严重干扰磷酸化肽的检测;而经过固定化金属离子亲和色谱柱富集,可以明显去除非磷酸化肽的干扰,增加检测到的磷酸化肽的数目。这说明本发明所制备的固定化金属离子亲和色谱柱可以对磷酸化肽进行高选择性的富集。
由图3可以看出,当2pmol的α-酪蛋白酶解后的产物经固定化金属离子亲和色谱柱连续富集七次所鉴定到的磷酸化肽数目保持在11左右,说明本发明所制备的固定化金属离子亲和色谱柱可重复使用,重现性好。
实施例2
与实施例1不同之处在于,步骤3)金属离子的固载过程中采用ZrOCl2的水溶液替代Ti(SO4)2的水溶液。合成实例具体参数如表1所示。
本发明的优点为:对磷酸化肽具有较好的选择性,可反复使用,富集容量较大,回收率较高,且制备方法简便,通透性好、反压小、机械强度好、耐酸碱性强。
Claims (4)
1.一种固定化金属离子亲和色谱整体柱的制备方法,其特征在于:
1)以表面带有醛基的有机-无机杂化硅胶整体材料为载体制成整体柱材料;
2)于整体柱材料上连续通过含有胺甲基磷酸和氰基硼氢化钠NaCNBH3的磷酸盐缓冲溶液,制备得到表面带有磷酸螯合基团的整体材料载体;
3)将过渡金属离子的水溶液通过材料载体,制备得到固定化金属离子亲和色谱整体柱。
2.按照权利要求1所述的制备方法,其特征在于:
步骤2)中修饰金属离子鳌合基团的具体过程为:将含有1-5mg/mL胺甲基磷酸或胺乙基磷酸、及2.5-7.5mg/mL的氰基-硼氢化钠NaCNBH3的pH=7.5-8.5磷酸盐缓冲溶液通过整体柱,在室温下反应6-24小时。
3.按照权利要求1所述的制备方法,其特征在于:
步骤3)中固定化金属离子的过程为:将含有20-100mM Ti(SO4)2或20-50mM ZrOCl2的水溶液通过整体柱材料,在室温下反应6-24小时;所制备得到的整体柱用水冲洗0.5-6小时。
4.按照权利要求1所述的制备方法,其特征在于:
步骤1)中,金属离子的固定化载体是表面带有醛基的有机-无机杂化硅胶整体材料,可以制备在毛细管中,或制备在金属管中,或制备成块状。
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