CN101845430A - 有机-无机杂化整体材料及其在固定化酶反应器中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及整体材料固定化酶反应器，具体地说是一种有机-无机杂化整体材料及其在固定化酶反应器中的应用，以四甲氧或四乙氧基硅烷、2-缩水甘油氧丙基三甲氧基硅烷为前体分子，以亚氨基二乙酸为金属离子螯合剂，以十六烷基三甲基溴化氨为模板分子，以辛胺为催化剂，经由溶胶凝胶法制备得到一种表面带有金属离子螯合基团的整体材料载体，再先后连续通过过渡金属离子溶液及酶溶液，即可制备得到可再生型的整体材料固定化酶反应器。本发明的优点为：具有较好的可再生性，可反复使用，且制备方法简便，酶反应器的活性高、通透性好、反压小、机械强度好。
Description
技术领域
本发明涉及整体材料固定化酶反应器，具体地说是一种可再生型的有机-无机杂化整体材料固定化酶反应器，具有较好的可再生性及较高的酶活性。
背景技术
酶的固定化是指通过吸附、包埋、交联、共价接合等方法使目标酶分子固定于特定的载体上而发挥酶的生物催化作用。与自由溶液中的酶催化反应相比，固定化酶具有更高的酶/底物比、更快的酶解速率等优点。所以，固定化酶反应器技术近年来得到了许多研究人员的广泛关注(Svec，F.Electrophoresis 2006，27，947-961 & Ma，J.F.；Zhang，L.H.；et al.，Anal.Chem.Acta.2009，632，1-8)。
固定化酶的性能与载体材料和固定化方法密切相关。目前已有多种载体材料用于酶的固定化，主要有：毛细管内壁(Stigter，E.C.A.；de Jong，G.J.；et al.，Anal.Chim.acta 2008，619，231-238)、颗粒材料(Li，Y.；Zhang，X.M.；et al.，Proteomics 2007，7，2330-2339)和整体材料(Duan，J.C.；Zhang，L.H.；et al.，J.Chromatogr.，A 2006，1106，65-174 & Ma，J.F.；Zhang，L.H.；et al.，Anal.Chem.2008，80，2948-2956)等。多孔整体材料是近年发展起来的一种新型的色谱分离介质。通过优化合成条件，可以制备得到同时具有大的通孔和小的扩散孔的多孔结构整体材料载体，因此具有较好的通透性、较低的反压。对于基于整体材料的固定化酶反应器而言，传质速率得以显著提高，可以大大加快酶反应的速率。除了载体材料外，固定化方法也对固定化酶的性质有较大影响。酶固定化主要采用的方法有：共价键合法(Ma，J.F.；Zhang，L.H.；et al.，Anal.Chem.2008，80，2948-2956)和金属离子螯合法(Guo，Z.；Xu，S.Y.；et al.，Electrophoresis，2003，24，3633-3639 & Li，Y.；Zhang X.M.；et al.，J.Proteome Res.2007，6，2367-2375)。共价键合型酶反应器经过多次使用后，固定化酶的活性可能显著下降。然而由于共价键的稳定性，故很难对这类酶反应器进行再生。
发明内容
本发明的目的在于提供一种有机-无机杂化多孔整体材料及其在固定化酶反应器中的应用，制备的酶反应器是基于金属离子螯合作用的可再生型整体材料固定化酶反应器，其具有较好的可再生性，且通透性好、反压小、酶活性高。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种有机-无机杂化硅胶整体材料，可按如下过程制备获得：
1)将2-缩水甘油氧丙基三甲氧基硅烷(GLYMO)与含有N、S或O原子的金属离子螯合基团的试剂在水浴中进行反应，制备得到溶液A；其特征在于：所述GLYMO与带有螯合官能团的试剂的摩尔比为1/1--1/6；反应温度为20～100℃；反应时间为6～48小时；所述带有螯合官能团的试剂为亚氨基二乙酸、三羧甲基乙二胺、硝脑三乙酸或羧甲基天冬氨酸；
2)将四乙氧基硅烷或四甲氧基硅烷、甲醇或乙醇、盐酸和H2O混合物于水浴中反应，形成溶液B；其特征在于：TEOS或TMOS和水的体积比为8/1--1/1；TEOS或TMOS与水的体积之和与HCl的体积比为：30/1--150/1；所用HCl的摩尔浓度1--2000mM；TEOS或TMOS与水的体积之和与甲醇或乙醇的体积比为10/1-1/1；反应温度为20～80℃；反应时间为：0.5～8小时；
3)将溶液A和溶液B混合，加入模板分子十六烷基三甲基溴化氨及催化剂辛胺，经由溶胶凝胶法制备得到一种表面带有金属离子螯合基团的整体材料载体；其具体过程为：所述溶液A与溶液B的体积之比为3/1--1/3；模板分子的质量mg与溶液A和溶液B的体积之和μL之比为1/50-1/20；催化剂的体积μL与溶液A和溶液B的体积之和μL之比为1/200-1/40；溶胶-凝胶法聚合反应温度为20℃～80℃，聚合时间为12～48小时。
有机-无机杂化硅胶整体材料在固定化酶反应器中的应用，其具体过程为：
1)用过渡金属离子Cu2+、Ni2+、Zn2+或Fe3+对有机-无机杂化整体材料进行活化，活化过程为：采用含有20--200mM过渡金属离子溶液冲洗整体材料，在室温下冲洗0.1--6小时。
2)再将酶溶液通过活化后的整体材料载体，即可制备得到固定化酶反应器；酶的固定化过程为：将含有1--10mg/mL酶的磷水溶液连续通过整体材料，在4--25℃下反应0.1--12小时。
3.所述的固定化酶反应器进行使用或放置，酶反应器的活性降低后，采用乙二胺四乙酸二钠(EDTA)溶液冲洗酶反应器，而后按所述步骤2进行重新操作处理，即可实现酶反应器的再生。
本发明的优点为：本发明先制备得到一种表面带有金属离子螯合基团的硅胶整体材料载体，对载体表面用金属离子进行活化后即可用于酶的固定。其制备方法简便，成本低；制备获得的酶反应器具有较好的再生性，且通透性好，反压小，有较高的酶活性。
附图说明
图1为按表1的实例序号5、表2的序号4、表3的序号9和表4的序号5，酶解产物进行μHPLC-MS/MS分析得到的基峰色谱图；
图2为将0.1μg/μL的牛血清白蛋白以恒定的流速0.3μL/min通过再生前后酶反应器，酶解产物进行μHPLC-MS/MS分析得到的基峰色谱图。
具体实施方式
按照如下步骤制备可再生型的整体材料固定化酶反应器。
1.整体材料载体的制备，具体过程为：
1)将2-缩水甘油氧丙基三甲氧基硅烷(GLYMO)与含有N、S或O原子的金属离子螯合基团的试剂在水浴中进行反应，制备得到溶液A。合成实例具体参数如下表1所示。
2)将四乙氧基硅烷(TEOS)或四甲氧基硅烷(TMOS)、甲醇或乙醇、盐酸和H2O混合物于水浴中反应，形成溶液B。合成实例具体参数如下表2所示。
3)将溶液A和溶液B混合，加入模板分子十六烷基三甲基溴化氨(CTAB)及催化剂辛胺，经由溶胶凝胶法制备得到一种表面带有金属离子螯合基团的整体材料载体。合成实例具体参数如下表3所示。
表1.溶液A的制备实例。
表2.溶液B的制备实例。
表3.有机-无机杂化硅胶整体材料载体的合成实例。
按照上表所示比例制备得到有机-无机杂化硅胶整体材料载体后，先后用无水乙醇和水冲洗掉模板分子，再经活化后即可用于酶的固定化。
2.载体的活化及酶的固定化，具体过程为：
1)用过渡金属离子Cu2+、Ni2+、Zn2+或Fe3+对有机-无机杂化整体材料进行活化；具体参数如下表4所示。
2)将酶溶液通过活化后的整体材料载体，即可制备得到固定化酶反应器；具体参数如下表4所示。
表4.整体材料的活化及酶的固定化参数。
具体应用：
将0.1μg/μL的肌红蛋白以恒定的流速0.3μL/min通过酶反应器(按表1的实例序号5、表2的序号4、表3的序号9和表4的序号5)，收集酶解产物而后进行μHPLC-MS/MS分析，得到的基峰色谱图如图1所示。
实验条件为：酶反应器：100-μm i.d.×3cm；流速：0.3μL/min；温度：37℃；HPLC-MS/MS条件：分离柱：300μm i.d.×5cm，填料：ODS，5μ，300流动相：(A)2％ACN(含0.1％formic acid)，(B)98％ACN(含0.1％formic acid)；流速：5μL/min；梯度：0min，2％B；10min，2％B；85min，40％B；95min，80％B；100min，80％B；进样量：2μL；MS conditions：电压：3kV，加热毛细管温度：150℃，碰撞能：35％.)
由图1可以看出，当200ng肌红蛋白经酶反应器50秒后即得以完全酶解，这说明本发明所制备的酶反应器可以对蛋白进行高效、快速的酶解。
3.固定化酶反应器的再生，用乙二胺四乙酸二钠(EDTA)溶液冲洗固定化酶反应器(具体参数如下表5所示)，而后按所述步骤2(表4的序号5)进行整体材料载体的活化和蛋白酶的固定化。
表5.酶反应器再生过程中EDTA处理参数。
具体应用：
将0.1μg/μL的牛血清白蛋白以恒定的流速0.3μL/min通过再生前后酶反应器，收集酶解产物而后进行μHPLC-MS/MS分析，得到的基峰色谱图如图2(a)和(b)所示。
实验条件为：酶反应器：100-μm i.d.×3cm；流速：0.3μL/min；温度：37℃；HPLC-MS/MS条件：分离柱：300μm i.d.×5cm，填料：ODS，5μ，300流动相：(A)2％ACN(含0.1％formic acid)，(B)98％ACN(含0.1％formic acid)；流速：5μL/min；梯度：0min，2％B；10min，2％B；85min，40％B；95min，80％B；100min，80％B；进样量：2μL；MS conditions：电压：3kV，加热毛细管温度：150℃，碰撞能：35％.)
由图2可以看出，当200ng牛血清白蛋白经酶反应器50秒后酶解后产物的峰形较为相似且蛋白质都得以完全酶解，说明本发明所制备的酶反应器有较好的可再生性。
Claims (5)
1.一种有机-无机杂化硅胶整体材料，其特征在于：其为一种表面带有金属离子螯合基团的整体材料载体，可按如下过程制备获得：
1)将2-缩水甘油氧丙基三甲氧基硅烷与含有N、S或O原子的金属离子螯合基团的试剂在水浴中进行反应，制备得到溶液A；其特征在于：所述GLYMO与带有螯合官能团的试剂的摩尔比为1/1--1/6；反应温度为20～100℃；反应时间为6～48小时；所述带有螯合官能团的试剂为亚氨基二乙酸、三羧甲基乙二胺、硝脑三乙酸或羧甲基天冬氨酸；
2)将四乙氧基硅烷或四甲氧基硅烷、甲醇或乙醇、盐酸和H2O混合物于水浴中反应，形成溶液B；其特征在于：TEOS或TMOS和水的体积比为8/1--1/1；TEOS或TMOS与水的体积之和与HCl的体积比为：30/1--150/1；所用HCl的摩尔浓度1--2000mM；TEOS或TMOS与水的体积之和与甲醇或乙醇的体积比为10/1-1/1；反应温度为20～80℃；反应时间为：0.5～8小时；
3)将所述溶液A和溶液B混合，加入模板分子十六烷基三甲基溴化氨及催化剂辛胺，经由溶胶凝胶法制备得到一种表面带有金属离子螯合基团的整体材料载体；其特征在于：所述溶液A与溶液B的体积之比为3/1--1/3；模板分子的质量mg与溶液A和溶液B的体积之和μL之比为1/50-1/20；催化剂的体积μL与溶液A和溶液B的体积之和μL之比为1/200-1/40；溶胶-凝胶法聚合反应温度为20℃～80℃，聚合时间为12～48小时。
2.一种权利要求1所述有机-无机杂化硅胶整体材料在固定化酶反应器中的应用，其特征在于：所述有机-无机杂化整体材料用于制备可再生型的整体材料固定化酶反应器，其具体过程为：
1)用过渡金属离子Cu2+、Ni2+、Zn2+或Fe3+对有机-无机杂化整体材料进行活化，活化过程为：采用含有20--200mM过渡金属离子溶液冲洗整体材料，在室温下冲洗0.1--6小时；
2)再将酶溶液通过活化后的整体材料载体，即可制备得到固定化酶反应器；酶的固定化过程为：将含有1--10mg/mL酶的磷水溶液连续通过整体材料，在4--25℃下反应0.1--12小时；固定化的酶为蛋白质水解酶。
3.按照权利要求2所述的应用，其特征在于：所述蛋白质水解酶为胰蛋白酶、V8蛋白酶或胰凝乳蛋白酶。
4.按照权利要求2所述的应用，其特征在于：所述固定化酶反应器进行使用或放置，酶反应器的活性降低后，采用乙二胺四乙酸二钠(EDTA)溶液冲洗酶反应器，而后按所述步骤2)进行重新操作处理，即可实现酶反应器的再生。
5.按照权利要求4所述的应用，其特征在于：采用乙二胺四乙酸二钠溶液冲洗酶反应器的过程为：用20--200mM乙二胺四乙酸二钠溶液连续通过酶反应器，在4--25℃下冲洗0.1--6小时。
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| CN103881999A (zh) * | 2012-12-19 | 2014-06-25 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 低残留无机-有机杂化整体基质固定化酶反应器及其制备 |
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