CN101497879B - 一种多孔整体材料固定化酶微反应器的制备方法 - Google Patents
一种多孔整体材料固定化酶微反应器的制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101497879B CN101497879B CN2008100103479A CN200810010347A CN101497879B CN 101497879 B CN101497879 B CN 101497879B CN 2008100103479 A CN2008100103479 A CN 2008100103479A CN 200810010347 A CN200810010347 A CN 200810010347A CN 101497879 B CN101497879 B CN 101497879B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- reactor
- immobilized enzyme
- preparation
- integral material
- material immobilized
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 239000000463 material Substances 0.000 title claims abstract description 44
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 title claims abstract description 27
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 16
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 45
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 45
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 27
- WYTZZXDRDKSJID-UHFFFAOYSA-N (3-aminopropyl)triethoxysilane Chemical compound CCO[Si](OCC)(OCC)CCCN WYTZZXDRDKSJID-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 13
- BOTDANWDWHJENH-UHFFFAOYSA-N Tetraethyl orthosilicate Chemical compound CCO[Si](OCC)(OCC)OCC BOTDANWDWHJENH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 12
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims abstract description 12
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 11
- 238000003980 solgel method Methods 0.000 claims abstract description 9
- 239000006184 cosolvent Substances 0.000 claims abstract description 4
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 claims description 21
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 claims description 21
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 9
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 6
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 claims description 6
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 6
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 claims description 6
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 claims description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 6
- -1 benzenyl amidine Chemical class 0.000 claims description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 4
- LFQCEHFDDXELDD-UHFFFAOYSA-N tetramethyl orthosilicate Chemical compound CO[Si](OC)(OC)OC LFQCEHFDDXELDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- XQQSWXUDAPLMKD-UHFFFAOYSA-N N,N-dimethylheptadecan-1-amine hydrobromide Chemical group Br.CCCCCCCCCCCCCCCCCN(C)C XQQSWXUDAPLMKD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 3
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 claims description 2
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 2
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 claims description 2
- BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N sodium cyanoborohydride Chemical compound [Na+].[B-]C#N BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 8
- 230000008901 benefit Effects 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 238000000589 high-performance liquid chromatography-mass spectrometry Methods 0.000 abstract description 3
- 238000001338 self-assembly Methods 0.000 abstract description 3
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 abstract description 2
- 238000000738 capillary electrophoresis-mass spectrometry Methods 0.000 abstract description 2
- 230000035699 permeability Effects 0.000 abstract description 2
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 abstract 3
- 239000013590 bulk material Substances 0.000 abstract 2
- SWLVFNYSXGMGBS-UHFFFAOYSA-N ammonium bromide Chemical compound [NH4+].[Br-] SWLVFNYSXGMGBS-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- RLGQACBPNDBWTB-UHFFFAOYSA-N cetyltrimethylammonium ion Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C RLGQACBPNDBWTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 229960000587 glutaral Drugs 0.000 abstract 1
- 230000007281 self degradation Effects 0.000 abstract 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 6
- YQDHCCVUYCIGSW-LBPRGKRZSA-N ethyl (2s)-2-benzamido-5-(diaminomethylideneamino)pentanoate Chemical compound NC(=N)NCCC[C@@H](C(=O)OCC)NC(=O)C1=CC=CC=C1 YQDHCCVUYCIGSW-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 2
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000012876 carrier material Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 229960005190 phenylalanine Drugs 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 230000013777 protein digestion Effects 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000007420 reactivation Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Abstract
本发明涉及蛋白质样品的酶解方法，具体地说是采用四乙氧基硅烷和氨丙基三乙氧基硅烷为前体分子，以十六烷基三甲基溴化氨为模板分子，以无水乙醇为共溶剂，经由溶胶-凝胶法和模板分子自组装法制备得到了一种多孔的有机-无机杂化硅胶整体材料载体载体；对杂化硅胶整体材料用戊二醛活化，固定上胰蛋白酶后即制备得到有机-无机杂化硅胶整体材料固定化酶反应器。本发明的优点为：制备方法简便，酶反应器的通透性好，反压小，机械强度高，具有高的酶解活性，与自由溶液酶解相比，大大缩短了反应时间，避免了酶的自降解，可反复使用，也可与HPLC-MS/MS或CE-MS/MS系统联用从而实现样品的在线分析。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白质样品的酶解方法，具体地说是一种基于多孔整体材料的固定化酶微反应器，实现蛋白质样品的高效、快速酶解。
背景技术
作为化学酶工程的一个重要分支，酶的固定化是指通过吸附、包埋、交联、共价接合等方法使目标酶分子固定于特定的载体上而发挥酶的生物催化作用。与溶液中的蛋白质酶解反应相比，固定化的酶具有更高的酶/底物比、更高的酶解效率、可重复使用，并能减少酶的自身降解等优点。此外，使用固定化酶反应器还可以避免样品的手工处理，从而也就减少了蛋白样品被污染的可能性。
固定化酶的性能与载体材料和固定化方法密切相关。根据载体材料的不同，固定化酶反应器可以分为颗粒填充型和整体材料型两大类。颗粒填充型酶反应器的制备往往是先将表面带有某种官能团的颗粒进行活化而后固定上酶分子，再将颗粒填充到柱管中。对于填充型酶反应器而言，液流主要通过颗粒之间的空隙，从流动相向固定化酶的传质和从固定化酶向流动相的传质主要由扩散系数决定，与填料孔径大小、流速和底物的扩散系数等有关。蛋白质这类生物大分子的扩散系数较小，而填料颗粒之间往往有较大空隙，使得填充型酶反应器的传质速率较低，活性不高。因此，填充型颗粒载体通常并非理想的酶固定化载体材料。多孔整体材料是近年发展起来的一种新型的色谱分离介质。通过优化合成条件，可以制备得到同时具有大的通孔和小的扩散孔的多孔结构整体材料载体。对于基于多孔整体材料的固定化酶反应器而言，传质速率得以显著提高，较快的传质使得蛋白分子更容易接近固定化酶的活性位点，因此可以大大提高固定化酶反应的速度。
最近，Zare等采用光引发聚合法制备了一种硅胶整体材料共价键合型酶反应器，可使25mM BAEE(L-苯丙氨酸-精氨酸-乙酯)在2分钟内酶解(Dulay，M.T.；Baca，Q.J.；Zare，R.N.Anal.Chem.2005，77，4604-4610)。Sakai-Kato等采用溶胶-凝胶法制备了一种硅胶整体材料包埋型酶反应器，可使50mMBAEE在2秒钟内酶解(Sakai-Kato，K.；Kato，M.；Toyo’oka，T.Anal.Chem.2002，74，2943-2949)，然而该酶反应器却不能对大分子蛋白质进行有效酶解。
发明内容
本发明的目的在于提供一种多孔整体材料固定化酶反应器的制备方法，而且所制备的酶反应器可实现蛋白质样品的高效、快速的酶解。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
本发明采用四乙氧基硅烷(TEOS)和氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)为前体分子，以十六烷基三甲基溴化氨(CTAB)为模板分子，以无水乙醇为共溶剂，经由溶胶-凝胶法和模板分子自组装法制备得到了一种多孔的有机-无机杂化硅胶整体材料载体载体；对杂化硅胶整体材料用戊二醛活化，固定上胰蛋白酶后即制备得到有机-无机杂化硅胶整体材料固定化酶反应器。
具体为：
1)采用四乙氧基硅烷TEOS或四甲氧基硅烷TMOS与氨丙基三乙氧基硅烷APTES一起作为前体分子，以带有C8-C16烷基链的阳离子表面活性剂为模板分子，以无水乙醇或甲醇为共溶剂，加水后经由溶胶-凝胶法及超分子模板法制备得到了一种有机-无机杂化硅胶整体材料载体；
步骤1)中TEOS或TMOS与APTES的物质的量之比为3/7--7/3；水与前体分子(TEOS和APTES的物质的量的总和)物质的量之比为＝2.5/1-1.2/1，模板分子的质量mg与前体分子物质的量mmol之比为6-10；
无水乙醇或甲醇的体积μL与前体分子物质的量mmol之比为175-250；溶胶-凝胶法聚合反应温度为25℃～80℃，聚合时间为12～24小时；
所述模板分子最好为十六烷基三甲基溴化氨CTAB；其采用的前体分子之一是氨丙基三乙氧基硅烷，其同时也是溶胶-凝胶反应的催化剂。
2)对杂化硅胶整体材料载体用戊二醛活化，最后连续泵过含有胰蛋白酶、苄甲脒及的氰基硼氢化钠NaCNBH3的磷酸盐缓冲溶液，即可制备得到一种有机-无机杂化硅胶整体材料固定化酶微反应器。
步骤2)中载体用戊二醛活化过程为：将含有体积浓度5-20％戊二醛的pH＝7.5-8.5磷酸盐缓冲液浸泡整体材料，在室温下反应4-12小时；
步骤2)中酶的固定化过程为：含有1-5mg/mL胰蛋白酶、25-100mM苯甲脒及2.5-7.5mg/mL的氰基-硼氢化钠NaCNBH3的pH＝7.5-8.5磷酸盐缓冲溶液，在1-10℃下反应12-48小时；所制备得到的微反应器用含有体积浓度5-30％ACN的pH＝7.5-8.5磷酸盐缓冲溶液冲洗酶反应器2-6小时；最后，用0.5-1.25M的pH＝7.5-8.5Tris-HCl冲洗酶反应器2-6小时。
所述微反应器不使用时，用含有5-15mM CaCl2、质量浓度0.01-0.04％NaN3的50-100mM pH＝7.5-8.5 Tris-HCl保护液保护起来，贮存于1-10℃下。
所述有机-无机杂化硅胶整体材料载体的制备可在10～300μm内径的毛细管中进行。
本发明的优点为：本发明在毛细管中以两种硅烷化试剂为前体分子，以表面活性剂为模板分子，经由溶胶-凝胶法和模板分子自组装法原位聚合得到一种连续的、均一的多孔有机无机杂化硅胶整体材料载体，对载体表面进行活化后即可用于酶的共价固定。其制备方法简便，成本低；制备得到的酶反应器的通透性好，反压小，机械强度好，酶活性高，与自由溶液酶解相比，大大缩短了反应时间，避免了酶的自降解(即降低了最终质谱谱图解析的复杂性)，可反复使用(减少了酶的消耗)，也可与HPLC-MS/MS或CE-MS/MS系统联用从而实现在线分析。
附图说明
图1有机-无机杂化硅胶整体材料固定化酶反应器的制备示意图；其中(a)有机-无机杂化硅胶整体材料载体的制备；(b)载体材料上酶的固定化。
图2有机-无机杂化硅胶整体材料固定化酶反应器的截面扫描电镜图(×600)。
图3BAEE经酶反应器酶解后的产物经HPLC-UV分析得到的色谱图；
当200mM BAEE经酶反应器5秒后几乎完全酶解，这说明本发明所制备的酶反应器可以对小分子底物进行高效、快速的酶解。
图4肌红蛋白经酶反应器酶解后的产物经HPLC-MS/MS分析得到的基峰色谱图；当200ng肌红蛋白经酶反应器30秒后即得以完全酶解，这说明本发明所制备的酶反应器可以对蛋白进行高效、快速的酶解。
具体实施方式
按照如下步骤制备有机-无机杂化硅胶整体材料固定化酶反应器。
1)按下述所列比例取一定量的TEOS、APTES、无水乙醇、水和CTAB充分混匀，而后经注射器引入预处理好的内径为10～300μm的毛细管中，引入过程在原料混合后的2分钟内完成。用硅橡胶封口，于25～80℃下聚合反应12～24小时；经由溶胶-凝胶法及超分子模板法制备得到了一种有机-无机杂化硅胶整体材料载体；合成实例具体参数如下表1所示；
2)活化：所制备的整体材料先经恒流泵先用乙醇冲洗去CTAB，再先后用水及100mM磷酸盐缓冲液(pH8.0)冲洗30min。而后，将含有体积浓度10％戊二醛的100mM磷酸盐缓冲液(pH8.0)泵入柱中，在室温下反应6小时。
酶的固定化：用缓冲液冲洗去多余的戊二醛，再连续泵入含有2.5mg/mL胰蛋白酶、50mM苯甲脒及5mg/mL的氰基-硼氢化钠NaCNBH3的100mM磷酸盐缓冲液(pH8.0)，在4℃下反应24小时。再用含有体积浓度20％ACN的100mM磷酸盐缓冲液(pH8.0)冲洗酶反应器4小时。最后，用1M的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)冲洗酶反应器4小时。载体活化及酶的固定化实例具体参数如下表2所示。
不使用时，用含有10mM CaCl2、质量浓度0.02％ NaN3的50mMTris-HCl缓冲液(pH7.5)保护液保护起来，贮存于4℃下。
表1.有机-无机杂化硅胶整体材料载体的合成实例。
| 实例序号 | TEOSμL(mmol) | APTESμL(mmol) | EtOHμL | H2OμL | CTABmg | 聚合温度℃ | 聚合时间h |
| 1 | 68(0.30) | 164(0.70) | 175 | 24 | 6 | 25 | 24 |
| 2 | 68(0.30) | 164(0.70) | 215 | 24 | 10 | 30 | 24 |
| 3 | 68(0.30) | 164(0.70) | 215 | 40 | 6 | 35 | 20 |
| 4 | 68(0.30) | 164(0.70) | 215 | 40 | 10 | 40 | 20 |
| 5 | 112(0.50) | 118(0.50) | 215 | 24 | 6 | 45 | 18 |
| 6 | 112(0.50) | 118(0.50) | 215 | 24 | 10 | 50 | 18 |
| 7 | 112(0.50) | 118(0.50) | 215 | 40 | 6 | 55 | 18 |
| 8 | 112(0.50) | 118(0.50) | 215 | 40 | 10 | 60 | 18 |
| 9 | 178(0.70) | 70(0.30) | 215 | 24 | 6 | 65 | 16 |
| 10 | 178(0.70) | 70(0.30) | 215 | 24 | 10 | 70 | 16 |
| 11 | 178(0.70) | 70(0.30) | 215 | 40 | 6 | 75 | 14 |
| 12 | 178(0.70) | 70(0.30) | 250 | 40 | 10 | 80 | 12 |
按照上表所示比例制备得到有机-无机杂化硅胶整体材料载体后，先后用无水乙醇和水冲洗掉模板分子，再经活化后即可用于酶的固定化。
表2.整体材料活化及酶的固定化合成参数。
| 实例序号 | 戊二醛浓度％活化时间h | 胰蛋白酶浓度mg/mL | 苯甲脒浓度mM | NaCNBH3浓度mg/mL | 酶固定化温度℃时间h | ACN浓度％，冲洗时间h | Tris-HCl缓冲液浓度M，冲洗时间h |
| 1 | 12，6 | 2.5 | 50 | 5 | 4，24 | 20，4 | 1，4 |
| 2 | 12，6 | 2.5 | 50 | 5 | 4，24 | 10，5 | 0.8，5 |
| 3 | 12，6 | 2.5 | 50 | 5 | 4，24 | 20，3 | 0.9，4 |
| 4 | 12，6 | 2.5 | 50 | 4 | 4，24 | 15，4.5 | 1，4 |
| 5 | 12，6 | 2.5 | 50 | 5 | 4，24 | 25，2.5 | 1.1，3 |
| 6 | 12，6 | 2.5 | 50 | 6 | 4，24 | 20，4 | 1.2，2.5 |
| 7 | 12，6 | 2.5 | 50 | 3 | 8，15 | 18，4 | 1，4 |
| 8 | 12，4 | 1.8 | 50 | 7 | 6，18 | 20，4 | 1，5 |
| 9 | 15，5 | 1.5 | 60 | 4.5 | 4，24 | 22，4 | 1，4 |
| 10 | 8，8 | 2 | 40 | 5 | 2，26 | 20，4 | 1，4 |
| 11 | 5，10 | 1 | 25 | 2.5 | 1，48 | 5，6 | 0.5，6 |
| 12 | 20，4 | 5 | 100 | 7.5 | 10，12 | 30，2 | 1.25，2 |
具体应用：
如图3所示，当200mM BAEE经酶反应器5秒后几乎完全酶解，这说明本发明所制备的酶反应器可以对小分子底物进行高效、快速的酶解。
如图4所示，当200ng肌红蛋白经酶反应器30秒后即得以完全酶解，这说明本发明所制备的酶反应器可以对蛋白进行高效、快速的酶解。
Claims (7)
1.一种多孔整体材料固定化酶微反应器的制备方法，其特征在于：
1)采用四乙氧基硅烷TEOS或四甲氧基硅烷TMOS与氨丙基三乙氧基硅烷APTES一起作为前体分子，以带有C8-C16烷基链的阳离子表面活性剂为模板分子，以无水乙醇或甲醇为共溶剂，加水后经由溶胶-凝胶法及超分子模板法制备得到了一种有机-无机杂化硅胶整体材料载体；所述模板分子为十六烷基三甲基溴化氨CTAB；
2)对杂化硅胶整体材料载体用戊二醛活化，最后连续泵过含有胰蛋白酶、苄甲脒以及氰基硼氢化钠NaCNBH3的磷酸盐缓冲溶液，即可制备得到一种有机-无机杂化硅胶整体材料固定化酶微反应器。
2.按照权利要求1所述多孔整体材料固定化酶微反应器的制备方法，其特征在于：所述步骤1)中TEOS或TMOS与APTES的物质的量之比为3/7--7/3；水与前体分子物质的量之比为＝2.5/1-1.2/1，模板分子的质量mg与前体分子物质的量mmol之比为6-10；
无水乙醇或甲醇的体积μL与前体分子物质的量mmol之比为175-250；溶胶-凝胶法聚合反应温度为25℃～80℃，聚合时间为12～24小时。
3.按照权利要求1所述多孔整体材料固定化酶微反应器的制备方法，其特征在于：所述步骤2)中载体用戊二醛活化的过程为：将含有体积浓度5-20％戊二醛的pH＝7.5-8.5磷酸盐缓冲液浸泡整体材料，在室温下反应4-12小时。
4.按照权利要求1所述多孔整体材料固定化酶微反应器的制备方法，其特征在于：所述步骤2)中含有1-5mg/mL胰蛋白酶、25-100mM苯甲脒及2.5-7.5mg/mL的氰基-硼氢化钠NaCNBH3的pH＝7.5-8.5磷酸盐缓冲溶液，在1-10℃下反应12-48小时。
5.按照权利要求1所述多孔整体材料固定化酶微反应器的制备方法，其特征在于：所述制备得到的微反应器用含有体积浓度5-30％ACN的pH＝7.5-8.5磷酸盐缓冲溶液冲洗酶反应器2-6小时；最后，用0.5-1.25M的pH＝7.5-8.5Tris-HCl冲洗酶反应器2-6小时。
6.按照权利要求1所述多孔整体材料固定化酶微反应器的制备方法，其特征在于：所述微反应器不使用时，用含有5-15mM CaCl2、质量浓度0.01-0.04％NaN3的50-100mM pH＝7.5-8.5Tris-HCl保护液保护起来，贮存于1-10℃下。
7.按照权利要求1所述多孔整体材料固定化酶微反应器的制备方法，其特征在于：有机-无机杂化硅胶整体材料载体的制备在10～300μm内径的毛细管中进行。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2008100103479A CN101497879B (zh) | 2008-02-03 | 2008-02-03 | 一种多孔整体材料固定化酶微反应器的制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2008100103479A CN101497879B (zh) | 2008-02-03 | 2008-02-03 | 一种多孔整体材料固定化酶微反应器的制备方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101497879A CN101497879A (zh) | 2009-08-05 |
| CN101497879B true CN101497879B (zh) | 2012-03-21 |
Family
ID=40945151
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2008100103479A Expired - Fee Related CN101497879B (zh) | 2008-02-03 | 2008-02-03 | 一种多孔整体材料固定化酶微反应器的制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101497879B (zh) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103387938A (zh) * | 2013-07-28 | 2013-11-13 | 桂林理工大学 | 一种可再生性固定化酶反应器的制备方法及应用 |
| CA2919942C (en) * | 2013-07-30 | 2023-04-04 | Inofea Gmbh | Methods and compositions to protect enzymes using organo silane monomers |
| CN104762344B (zh) * | 2015-04-22 | 2018-04-03 | 南京工业大学 | 利用固定化酶微反应器连续制备低聚果糖的方法 |
| CN108088933A (zh) * | 2016-11-21 | 2018-05-29 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种高通量体液蛋白质样品预处理装置及其应用 |
| CN109439189B (zh) * | 2018-11-21 | 2020-12-18 | 中国船舶重工集团公司第七二五研究所 | 一种防污酶在无机涂层表面的固定化方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1291016C (zh) * | 2005-06-20 | 2006-12-20 | 浙江大学 | 一种基于双功能基团硅烷的溶胶－凝胶酶固定法 |
-
2008
- 2008-02-03 CN CN2008100103479A patent/CN101497879B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1291016C (zh) * | 2005-06-20 | 2006-12-20 | 浙江大学 | 一种基于双功能基团硅烷的溶胶－凝胶酶固定法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| A.S.Maria Chong et al..Functionalization of SBA-15 with APTES and characterization of functionalized materials.J.Phys.Chem.B.2003,107(46),12650-12657. * |
| 程凡亮等.氨基化二氧化硅颗粒固定木瓜蛋白酶研究.生物工程学报.2004,20(2),287-289. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN101497879A (zh) | 2009-08-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101497879B (zh) | 一种多孔整体材料固定化酶微反应器的制备方法 | |
| Ma et al. | Monolith‐based immobilized enzyme reactors: recent developments and applications for proteome analysis | |
| CN104402003B (zh) | 用于偶联含伯氨基生物配基的磁性微球及其制备方法 | |
| CN102000550B (zh) | 一种高碘酸盐氧化制备用于清除致病抗体吸附剂的合成方法 | |
| CN102114414B (zh) | 一种固定化金属离子亲和色谱整体柱的制备方法 | |
| CN103484445A (zh) | 一种球形酶制品及其制备方法 | |
| WO2007050100A9 (en) | Immobilized enzymes and processes for preparing and using same | |
| CN104277111A (zh) | 用于制备固定化蛋白质、多肽或寡肽的复合载体、制法及用途 | |
| CN102179238A (zh) | 一种固载纳米碳的硅胶固定相及其制备方法 | |
| CN102796723A (zh) | 肝素酶i的固定化方法 | |
| CN116640757A (zh) | 基于人工抗体-抗原的固定化酶体系的构建方法与应用 | |
| Banu et al. | Microfabricated bioreactor chips for immobilised enzyme assays | |
| KR101661154B1 (ko) | 효소-모노리식 컬럼 및 그 제조방법 | |
| CN108187367B (zh) | 巯基衍生化l-脯氨酸型有机-无机杂化整体柱及其制备方法 | |
| Nie et al. | Immobilized enzyme reactor in on-line LC and its application in drug screening | |
| Slegers et al. | Enzymatic synthesis of C-11 formaldehyde: concise communication | |
| CN101260395A (zh) | 一种双孔酶固定化反应器的制备方法 | |
| CN1982431A (zh) | 一种微型快速蛋白水解酶反应器及其制备 | |
| JP2005065632A (ja) | 多段階酵素反応方法及び多段階酵素反応用マイクロリアクター | |
| Henriksson et al. | Chiral separation based on immobilized intact and fragmented cellobiohydrolase II (CBH II): A comparison with cellobiohydrolase I (CBH I) | |
| WO2006065767A8 (en) | Activation of enzymes by lyophilization in the presence of solid inorganic support | |
| Godjevargova et al. | Influence of matrix on external mass transfer resistance in immobilized urease membranes | |
| CN101845430A (zh) | 有机-无机杂化整体材料及其在固定化酶反应器中的应用 | |
| CN1291016C (zh) | 一种基于双功能基团硅烷的溶胶－凝胶酶固定法 | |
| US20090275743A1 (en) | Method of preparing carrier to separate nucleic acids, carrier and micro channel to separate nucleic acids, and method and apparatus for separating nucleic acids |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20120321 |