CN101497879A - 一种多孔整体材料固定化酶微反应器的制备方法 - Google Patents

一种多孔整体材料固定化酶微反应器的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及蛋白质样品的酶解方法，具体地说是采用四乙氧基硅烷和氨丙基三乙氧基硅烷为前体分子，以十六烷基三甲基溴化氨为模板分子，以无水乙醇为共溶剂，经由溶胶－凝胶法和模板分子自组装法制备得到了一种多孔的有机－无机杂化硅胶整体材料载体载体；对杂化硅胶整体材料用戊二醛活化，固定上胰蛋白酶后即制备得到有机－无机杂化硅胶整体材料固定化酶反应器。本发明的优点为：制备方法简便，酶反应器的通透性好，反压小，机械强度高，具有高的酶解活性，与自由溶液酶解相比，大大缩短了反应时间，避免了酶的自降解，可反复使用，也可与HPLC－MS/MS或CE－MS/MS系统联用从而实现样品的在线分析。

Description

一种多孔整体材料固定化酶微反应器的制备方法
技术领域
本发明涉及蛋白质样品的酶解方法，具体地说是一种基于多孔整体材料的固定化酶微反应器，实现蛋白质样品的高效、快速酶解。
背景技术
作为化学酶工程的一个重要分支，酶的固定化是指通过吸附、包埋、交联、共价接合等方法使目标酶分子固定于特定的载体上而发挥酶的生物催化作用。与溶液中的蛋白质酶解反应相比，固定化的酶具有更高的酶/底物比、更高的酶解效率、可重复使用，并能减少酶的自身降解等优点。此外，使用固定化酶反应器还可以避免样品的手工处理，从而也就减少了蛋白样品被污染的可能性。
固定化酶的性能与载体材料和固定化方法密切相关。根据载体材料的不同，固定化酶反应器可以分为颗粒填充型和整体材料型两大类。颗粒填充型酶反应器的制备往往是先将表面带有某种官能团的颗粒进行活化而后固定上酶分子，再将颗粒填充到柱管中。对于填充型酶反应器而言，液流主要通过颗粒之间的空隙，从流动相向固定化酶的传质和从固定化酶向流动相的传质主要由扩散系数决定，与填料孔径大小、流速和底物的扩散系数等有关。蛋白质这类生物大分子的扩散系数较小，而填料颗粒之间往往有较大空隙，使得填充型酶反应器的传质速率较低，活性不高。因此，填充型颗粒载体通常并非理想的酶固定化载体材料。多孔整体材料是近年发展起来的一种新型的色谱分离介质。通过优化合成条件，可以制备得到同时具有大的通孔和小的扩散孔的多孔结构整体材料载体。对于基于多孔整体材料的固定化酶反应器而言，传质速率得以显著提高，较快的传质使得蛋白分子更容易接近固定化酶的活性位点，因此可以大大提高固定化酶反应的速度。
最近，Zare等采用光引发聚合法制备了一种硅胶整体材料共价键合型酶反应器，可使25mM BAEE(L-苯丙氨酸-精氨酸-乙酯)在2分钟内酶解(Dulay，M.T.；Baca，Q.J.；Zare，R.N.Anal.Chem.2005，77，4604-4610)。Sakai-Kato等采用溶胶-凝胶法制备了一种硅胶整体材料包埋型酶反应器，可使50mMBAEE在2秒钟内酶解(Sakai-Kato，K.；Kato，M.；Toyo’oka，T.Anal.Chem.2002，74，2943-2949)，然而该酶反应器却不能对大分子蛋白质进行有效酶解。
发明内容
本发明的目的在于提供一种多孔整体材料固定化酶反应器的制备方法，而且所制备的酶反应器可实现蛋白质样品的高效、快速的酶解。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
本发明采用四乙氧基硅烷(TEOS)和氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)为前体分子，以十六烷基三甲基溴化氨(CTAB)为模板分子，以无水乙醇为共溶剂，经由溶胶-凝胶法和模板分子自组装法制备得到了一种多孔的有机-无机杂化硅胶整体材料载体载体；对杂化硅胶整体材料用戊二醛活化，固定上胰蛋白酶后即制备得到有机-无机杂化硅胶整体材料固定化酶反应器。
具体为：
1)采用四乙氧基硅烷TEOS或四甲氧基硅烷TMOS与氨丙基三乙氧基硅烷APTES一起作为前体分子，以带有C8-C16烷基链的阳离子表面活性剂为模板分子，以无水乙醇或甲醇为共溶剂，加水后经由溶胶-凝胶法及超分子模板法制备得到了一种有机-无机杂化硅胶整体材料载体；
步骤1)中TEOS或TMOS与APTES的物质的量之比为3/7--7/3；水与前体分子(TEOS和APTES的物质的量的总和)物质的量之比为＝2.5/1—1.2/1，模板分子的质量mg与前体分子物质的量mmol之比为6—10；
无水乙醇或甲醇的体积μL与前体分子物质的量mmol之比为175—250；溶胶-凝胶法聚合反应温度为25℃～80℃，聚合时间为12～24小时；
所述模板分子最好为十六烷基三甲基溴化氨CTAB；其采用的前体分子之一是氨丙基三乙氧基硅烷，其同时也是溶胶-凝胶反应的催化剂。
2)对杂化硅胶整体材料载体用戊二醛活化，最后连续泵过含有胰蛋白酶、苄甲脒及的氰基硼氢化钠NaCNBH3的磷酸盐缓冲溶液，即可制备得到一种有机-无机杂化硅胶整体材料固定化酶微反应器。
步骤2)中载体用戊二醛活化过程为：将含有体积浓度5—20％戊二醛的pH＝7.5—8.5磷酸盐缓冲液浸泡整体材料，在室温下反应4—12小时；
步骤2)中酶的固定化过程为：含有1—5mg/mL胰蛋白酶、25—100mM苯甲脒及2.5—7.5mg/mL的氰基-硼氢化钠NaCNBH3的pH＝7.5—8.5磷酸盐缓冲溶液，在1—10℃下反应12—48小时；所制备得到的微反应器用含有体积浓度5—30％ACN的pH＝7.5—8.5磷酸盐缓冲溶液冲洗酶反应器2—6小时；最后，用0.5-1.25M的pH＝7.5—8.5Tris-HCl冲洗酶反应器2—6小时。
所述微反应器不使用时，用含有5—15mM CaCl2、质量浓度0.01—0.04％NaN3的50—100mM pH＝7.5—8.5Tris-HCl保护液保护起来，贮存于1—10℃下。
所述有机-无机杂化硅胶整体材料载体的制备可在10～300μm内径的毛细管中进行。
本发明的优点为：本发明在毛细管中以两种硅烷化试剂为前体分子，以表面活性剂为模板分子，经由溶胶-凝胶法和模板分子自组装法原位聚合得到一种连续的、均一的多孔有机无机杂化硅胶整体材料载体，对载体表面进行活化后即可用于酶的共价固定。其制备方法简便，成本低；制备得到的酶反应器的通透性好，反压小，机械强度好，酶活性高，与自由溶液酶解相比，大大缩短了反应时间，避免了酶的自降解(即降低了最终质谱谱图解析的复杂性)，可反复使用(减少了酶的消耗)，也可与HPLC-MS/MS或CE-MS/MS系统联用从而实现在线分析。
附图说明
图1有机-无机杂化硅胶整体材料固定化酶反应器的制备示意图；其中(a)有机-无机杂化硅胶整体材料载体的制备；(b)载体材料上酶的固定化。
图2有机-无机杂化硅胶整体材料固定化酶反应器的截面扫描电镜图(×600)。
图3BAEE经酶反应器酶解后的产物经HPLC-UV分析得到的色谱图；
当200mM BAEE经酶反应器5秒后几乎完全酶解，这说明本发明所制备的酶反应器可以对小分子底物进行高效、快速的酶解。
图4肌红蛋白经酶反应器酶解后的产物经HPLC-MS/MS分析得到的基峰色谱图；当200ng肌红蛋白经酶反应器30秒后即得以完全酶解，这说明本发明所制备的酶反应器可以对蛋白进行高效、快速的酶解。
具体实施方式
按照如下步骤制备有机-无机杂化硅胶整体材料固定化酶反应器。
1)按下述所列比例取一定量的TEOS、APTES、无水乙醇、水和CTAB充分混匀，而后经注射器引入预处理好的内径为10～300μm的毛细管中，引入过程在原料混合后的2分钟内完成。用硅橡胶封口，于25～80℃下聚合反应12～24小时；经由溶胶-凝胶法及超分子模板法制备得到了一种有机-无机杂化硅胶整体材料载体；合成实例具体参数如下表1所示；
2)活化：所制备的整体材料先经恒流泵先用乙醇冲洗去CTAB，再先后用水及100mM磷酸盐缓冲液(pH8.0)冲洗30min。而后，将含有体积浓度10％戊二醛的100mM磷酸盐缓冲液(pH8.0)泵入柱中，在室温下反应6小时。
酶的固定化：用缓冲液冲洗去多余的戊二醛，再连续泵入含有2.5mg/mL胰蛋白酶、50mM苯甲脒及5mg/mL的氰基-硼氢化钠NaCNBH3的100mM磷酸盐缓冲液(pH8.0)，在4℃下反应24小时。再用含有体积浓度20％ACN的100mM磷酸盐缓冲液(pH8.0)冲洗酶反应器4小时。最后，用1M的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)冲洗酶反应器4小时。载体活化及酶的固定化实例具体参数如下表2所示。
不使用时，用含有10mM CaCl2、质量浓度0.02％ NaN3的50mMTris-HCl缓冲液(pH7.5)保护液保护起来，贮存于4℃下。
表1.有机-无机杂化硅胶整体材料载体的合成实例。
 
实例序号 TEOSμL(mmol) APTESμL(mmol) EtOHμL H2OμL CTABmg 聚合温度℃ 聚合时间h
1 68(0.30) 164(0.70) 175 24 6 25 24
2 68(0.30) 164(0.70) 215 24 10 30 24
3 68(0.30) 164(0.70) 215 40 6 35 20
4 68(0.30) 164(0.70) 215 40 10 40 20
5 112(0.50) 118(0.50) 215 24 6 45 18
6 112(0.50) 118(0.50) 215 24 10 50 18
7 112(0.50) 118(0.50) 215 40 6 55 18
8 112(0.50) 118(0.50) 215 40 10 60 18
9 178(0.70) 70(0.30) 215 24 6 65 16
10 178(0.70) 70(0.30) 215 24 10 70 16
11 178(0.70) 70(0.30) 215 40 6 75 14
12 178(0.70) 70(0.30) 250 40 10 80 12
按照上表所示比例制备得到有机-无机杂化硅胶整体材料载体后，先后用无水乙醇和水冲洗掉模板分子，再经活化后即可用于酶的固定化。
表2.整体材料活化及酶的固定化合成参数。
 
实例序号 戊二醛浓度％活化时间h 胰蛋白酶浓度mg/mL 苯甲脒浓度mM NaCNBH3浓度mg/mL 酶固定化温度℃时间h ACN浓度％，冲洗时间h Tris-HCl缓冲液浓度M，冲洗时间h
1 12，6 2.5 50 5 4，24 20，4 1，4
2 12，6 2.5 50 5 4，24 10，5 0.8，5
3 12，6 2.5 50 5 4，24 20，3 0.9，4
4 12，6 2.5 50 4 4，24 15，4.5 1，4
5 12，6 2.5 50 5 4，24 25，2.5 1.1，3
6 12，6 2.5 50 6 4，24 20，4 1.2，2.5
7 12，6 2.5 50 3 8，15 18，4 1，4
8 12，4 1.8 50 7 6，18 20，4 1，5
 
9 15，5 1.5 60 4.5 4，24 22，4 1，4
10 8，8 2 40 5 2，26 20，4 1，4
11 5，10 1 25 2.5 1，48 5，6 0.5，6
12 20，4 5 100 7.5 10，12 30，2 1.25，2
具体应用：
如图3所示，当200mM BAEE经酶反应器5秒后几乎完全酶解，这说明本发明所制备的酶反应器可以对小分子底物进行高效、快速的酶解。
如图4所示，当200ng肌红蛋白经酶反应器30秒后即得以完全酶解，这说明本发明所制备的酶反应器可以对蛋白进行高效、快速的酶解。

Claims (8)

1.一种多孔整体材料固定化酶微反应器的制备方法，其特征在于：
1)采用四乙氧基硅烷TEOS或四甲氧基硅烷TMOS与氨丙基三乙氧基硅烷APTES一起作为前体分子，以带有C8-C16烷基链的阳离子表面活性剂为模板分子，以无水乙醇或甲醇为共溶剂，加水后经由溶胶-凝胶法及超分子模板法制备得到了一种有机-无机杂化硅胶整体材料载体；
2)对杂化硅胶整体材料载体用戊二醛活化，最后连续泵过含有胰蛋白酶、苄甲脒及的氰基硼氢化钠NaCNBH3的磷酸盐缓冲溶液，即可制备得到一种有机-无机杂化硅胶整体材料固定化酶微反应器。
2.按照权利要求1所述多孔整体材料固定化酶微反应器的制备方法，其特征在于：所述步骤1)中TEOS或TMOS与APTES的物质的量之比为3/7--7/3；水与前体分子物质的量之比为＝2.5/1—1.2/1，模板分子的质量mg与前体分子物质的量mmol之比为6—10；
无水乙醇或甲醇的体积μL与前体分子物质的量mmol之比为175—250；溶胶-凝胶法聚合反应温度为25℃～80℃，聚合时间为12～24小时。
3.按照权利要求1或2所述多孔整体材料固定化酶微反应器的制备方法，其特征在于：所述模板分子为十六烷基三甲基溴化氨CTAB。
4.按照权利要求1所述多孔整体材料固定化酶微反应器的制备方法，其特征在于：所述步骤2)中载体用戊二醛活化的过程为：将含有体积浓度5—20％戊二醛的pH＝7.5—8.5磷酸盐缓冲液浸泡整体材料，在室温下反应4—12小时。
5.按照权利要求1所述多孔整体材料固定化酶微反应器的制备方法，其特征在于：所述步骤2)中含有1—5mg/mL胰蛋白酶、25—100mM苯甲脒及2.5—7.5mg/mL的氰基-硼氢化钠NaCNBH3的pH＝7.5—8.5磷酸盐缓冲溶液，在1—10℃下反应12—48小时。
6.按照权利要求1所述多孔整体材料固定化酶微反应器的制备方法，其特征在于：所述制备得到的微反应器用含有体积浓度5—30％ACN的pH＝7.5—8.5磷酸盐缓冲溶液冲洗酶反应器2—6小时；最后，用0.5-1.25M的pH＝7.5—8.5Tris-HCl冲洗酶反应器2—6小时。
7.按照权利要求1所述多孔整体材料固定化酶微反应器的制备方法，其特征在于：所述微反应器不使用时，用含有5—15mM CaCl2、质量浓度0.01—0.04％NaN3的50—100mM pH＝7.5—8.5Tris-HCl保护液保护起来，贮存于1—10℃下。
8.按照权利要求1所述多孔整体材料固定化酶微反应器的制备方法，其特征在于：有机-无机杂化硅胶整体材料载体的制备可在10～300μm内径的毛细管中进行。
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