CN112444437A - 一种富集糖肽的磁性聚苯胺纳米材料的制备方法和应用 - Google Patents

一种富集糖肽的磁性聚苯胺纳米材料的制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种富集糖肽的磁性聚苯胺纳米材料的制备方法和应用，磁性聚苯胺纳米材料是先由六水合三氯化铁、乙二醇及无水乙酸钠高温加热制得磁性纳米材料后，再在其表面包覆聚苯胺制得。富集糖肽方法为：将磁性聚苯胺纳米材料分散液加入到糖蛋白胰酶酶切产物中，振荡富集；将富集液磁分离后，向富集糖肽的磁性聚苯胺纳米材料中加入洗脱液进行振荡洗脱，而后进行磁分离，得到糖肽富集溶液。本发明材料和方法不仅可以获得更丰富的蛋白糖基化修饰信息和更准确的聚糖糖型，并且在不破坏蛋白质糖基化修饰结构的条件下，实现低成本、环境友好、高特异性地富集分离，操作简便，为复杂样本中蛋白质糖基化修饰研究和相关肿瘤标志物的筛查等提供了新型材料和技术方法。

Description

一种富集糖肽的磁性聚苯胺纳米材料的制备方法和应用
技术领域
本发明涉及蛋白质及多肽富集技术领域，具体的说，涉及一种富集糖肽的磁性聚苯胺纳米材料的制备方法和应用。
背景技术
蛋白质糖基化是最重要的翻译后修饰之一，在细胞间相互作用、免疫防御、细胞生长和分化等多种生物过程中发挥着重要的结构和功能作用。一些重要蛋白上的异常糖基化与各种疾病如癌症和神经肌肉疾病高度相关。N-糖基化蛋白对疾病预后、诊断和药物治疗反应也很重要。因此，蛋白质糖基化分析不仅对生物医学研究有重要意义，对生物技术产业也有重要意义。目前，以质谱(MS)为基础的技术已成为表征蛋白质糖基化的最重要和强有力的工具。然而，糖蛋白的高动态范围、固有的低糖肽丰富度以及非糖基化肽共存所导致的严重离子抑制效应，使得糖肽/糖肽的直接质谱分析成为一个挑战。因此，在进行质谱分析之前，从高度复杂的混合物中有效地提取糖蛋白/糖肽是绝对必要的。
多种方法包括亲水性相互作用色谱(HILIC)、凝集素亲和层析、肼化学和硼酸化学已被用于富集糖蛋白/糖肽。其中，基于亲水性相互作用色谱的富集策略由于操作过程简单，重现性好，无偏置，避免聚糖组成的不可逆改变，近年来得到了较好的发展，并越来越受欢迎。近年来，磁分离法已成为一种有效的分离技术，与传统方法相比，磁分离法能取得更好的分离效果。将基于亲水性相互作用液相色谱的策略与磁分离技术相结合，同时利用两者的优点，可以快速高效地从复杂的生物样品中捕获糖肽，而后进行分析。
因此，提供一种能在不破坏糖肽结构的前提下，实现糖肽聚糖或糖苷的高效、低成本、特异性富集分离的磁性聚苯胺纳米材料的制备方法和应用是本领域技术人员亟需解决的技术问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种利用磁性聚苯胺纳米材料结构中大量亚胺基团可以与糖链O-H形成氢键的特性，以及共轭结构特有的π相互作用吸附性能，在不破坏糖肽结构的前提下，实现糖肽聚糖或糖苷的高效、低成本、特异性富集分离的材料及其应用方法。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种富集糖肽的磁性聚苯胺纳米材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)将六水合三氯化铁溶于乙二醇中并搅拌至溶液呈黄色，向溶液中加入无水乙酸钠并继续搅拌1小时，然后转移至反应釜于烘箱中200℃加热16小时，将产物清洗并在烘箱中60℃烘干，制得磁性纳米材料；
(2)将盐酸水溶液与苯胺溶液混合，并避光冰浴10分钟，然后加入磁性纳米材料，继续避光冰浴搅拌10分钟；向混合液中加入过硫酸铵水溶液，再次避光冰浴搅拌4小时，将产物清洗并在烘箱中60℃烘干，得富集糖肽的磁性聚苯胺纳米材料。
本发明技术方案的有益效果在于：本发明中磁性聚苯胺纳米材料对糖肽和/或聚糖和/或糖苷具有很好的富集效果，富集产物纯度接近100％，回收率100％。
进一步，上述步骤(1)中六水合三氯化铁与无水乙酸钠的质量比为1：1.8-3.6；
所述清洗方法为依次采用无水乙醇、50％乙醇、超纯水和体积分数80％乙腈水溶液及乙腈进行振荡洗涤。
采用上述进一步的有益效果在于：在本发明限定的比例下制得的磁性纳米材料大小合适且尺寸均一。
此外，依次采用无水乙醇、50％乙醇和超纯水洗涤，能有效洗去反应副产物；依次采用体积分数80％乙腈水溶液和乙腈，能有效去除可能存在或易溶于富集溶液的杂质，避免杂质的引入。
进一步，上述步骤(2)中盐酸水溶液浓度为0.1％；所述过硫酸铵水溶液浓度为0.38g/mL；
所述盐酸水溶液中与苯胺溶液的体积比为100:1；
所述盐酸水溶液中与过硫酸铵水溶液体积比为30:1；
所述盐酸水溶液的体积与磁性纳米材料的质量比为1ml:6mg。
采用上述进一步的有益效果在于：在本发明限定的比例的反应体系下制得的磁性聚苯胺纳米材料中聚苯胺包覆厚度和其富集糖肽或聚糖的效果最佳。
本发明还提供了采用上述原料的用于富集糖肽的试剂盒，包括上述磁性聚苯胺纳米材料、60-80％的乙腈水溶液、0.025％的氨水溶液和0.1％的三氟乙酸水溶液。
本发明还提供了采用上述用于富集糖肽的试剂盒的富集糖肽的方法，其包括以下步骤：
1)将磁性聚苯胺纳米材料分散液加入到糖蛋白胰酶酶切产物中，振荡富集糖肽；
2)将富集液进行磁分离，然后向富集糖肽的磁性聚苯胺纳米材料中加入洗脱液进行振荡洗脱并进行磁分离，得到糖肽富集溶液。
进一步，上述步骤1)中所述磁性聚苯胺纳米材料分散液的制备方法为：将磁性聚苯胺纳米材料分散于60-80％的乙腈水溶液中，得到浓度为0.5-2mg/mL的磁性聚苯胺纳米材料分散液。
采用上述进一步的有益效果在于：在本发明限定的上述比例范围内的乙腈水溶液中，聚苯胺磁珠均能很好地分散，且更有利于糖肽或聚糖的富集；同时，在本发明限定浓度的聚苯胺磁珠中糖肽或聚糖的富集能力最佳。
进一步，步骤1)中所述糖蛋白胰酶酶切产物为牛胎球蛋白、转铁蛋白、免疫球蛋白G、白蛋白、核糖核酸酶B和触珠蛋白中的一种或几种胰酶酶切产物混合。
采用上述进一步的有益效果在于：本发明从多种不同糖基化修饰蛋白或无糖基化修饰蛋白的角度考察聚苯胺磁珠富集糖肽或聚糖的高特异性富集、高抗干扰能力和较广的应用范围。
进一步，上述步骤1)中所述振荡富集时间为0.5-2小时；
步骤2)中所述振荡洗脱时间为0.5-2小时。
更进一步，上述洗脱液为0.025％的氨水溶液或0.1％的三氟乙酸水溶液；
所述洗脱液的pH为2.0～3.6或9.8～11.2。
采用上述进一步的有益效果在于：在本发明限定的振荡时间范围和洗脱溶剂酸碱度下，糖肽或聚糖的富集到的唾液酸化修饰糖肽数量最多、质谱信号最佳。
进一步，上述步骤2)中磁分离方法为采用具有磁性物体对磁性聚苯胺纳米材料进行吸附分离。
更进一步，上述具有磁性物体可以为钕铁硼强磁、软磁条、吸铁石等。
采用上述进一步的有益效果在于：不仅在操作上更加简便，不受大型仪器(如高速离心机)的限制，且实现了材料与溶液的彻底分离，更有利于后续实验的进行。
本发明技术方案的有益效果在于：与二氧化钛富集法相比，本发明提供的方法中富集条件温和、材料廉价易得，富集的特异性高，效果显著。采用本发明提供的方法进行富集，可以保持糖链和/或聚糖的结构信息，保留完整的特定肽段信息，有利于后续的质谱分析，且反映了蛋白质在体内天然的糖基化状态，对生物标志物筛查研究及重大疾病的预警、疾病发展、预后评估等均具有重要的意义；为复杂样本中糖肽的检测和相关肿瘤标志物的筛查等提供了新思路和新方法。
附图说明
图1为胎球蛋白酶解液(a)、富集液(b)、富集剩余液(c)、唾液酸酶处理后的富集液(d)和N-糖酰胺酶Fase酶处理后的富集液(e)的质谱图。
图2为转铁蛋白酶解液(a)、富集液(b)、富集剩余液(c)、唾液酸酶处理后的富集液(d)和N-糖酰胺酶Fase酶处理后的富集液(e)的质谱图。
图3为磁性聚苯胺纳米材料对不同上样量胎球蛋白糖肽的富集效果质谱图。
图4为不同洗脱条件对于磁性聚苯胺纳米材料富集糖肽的影响，。
图5为二氧化钛富集胎球蛋白糖肽的质谱图。
图6为磁性聚苯胺纳米材料材料的扫描电镜照片。
图7为磁性聚苯胺纳米材料材料X射线光电子能谱图。
图8为磁性聚苯胺纳米材料材料拉曼光谱图。
图9为磁性聚苯胺纳米材料材料Zeta电位图。
附图中，质量/电荷是指分子质量与电荷数之比。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下实施例中的试验结果，均设置三次重复实验，结果取平均值。以下说明书中的“％”，如无特殊说明，均代表体积百分含量。
在本发明实施例中：移液器吸头(最大上样体积为200μL)购自Axygen Scientific公司，产品目录号为T-200-Y。
牛胎球蛋白、转铁蛋白、牛白蛋白、碳酸氢铵、碘乙酰胺、甲酸、2，5二羟基苯甲酸、二氧化钛均购自Sigma-Aldrich公司，产品目录号依次为F3004、T3309、A5503、09830、V900355、14265、85707、798517。
二硫苏糖醇购自Merck公司，产品目录号为8011。乙腈购自Thermo Fisher公司，产品目录号为A998。
三氟乙酸购自Tedia公司，产品目录号为TS 4295。胰蛋白酶购自Roche公司，产品目录号为11418025001。
唾液酸酶、N-糖酰胺酶Fase F酶购自New Englan Biolabs公司，产品目录号分别是P0720S、P0704S。
超纯水为娃哈哈纯净水。
实施例1
应用磁性聚苯胺纳米材料富集糖肽
一、磁性聚苯胺纳米材料材料的制备
(1)称取1.35g六水合三氯化铁于烧杯中，量取75mL乙二醇溶液搅拌溶解0.5小时。拌至黄色溶液后，加入3.6g无水乙酸钠无水乙酸钠无水乙酸钠粉末，继续搅拌1小时。将所得溶液倒入反应釜中且不超过反应釜总体积的2/3，于烘箱中200℃加热16小时，然后将产物转移至烧杯中采用无水乙醇、50％乙醇、超纯水和体积分数80％乙腈水溶液及乙腈进行振荡洗涤，置于烘箱中60℃烘干，得磁性纳米材料。
(2)向30mL 0.1％盐酸水溶液中加入0.3mL苯胺溶液，避光冰浴10分钟。加入180mg上述磁性纳米材料，避光冰浴搅拌10分钟，加入1mL 0.38g/mL过硫酸铵水溶液，继续避光冰浴搅拌4小时，将产物清洗置于烘箱中60℃烘干即得磁性聚苯胺纳米材料。
二、酶解样本的制备
将10μL标准蛋白(2μg/μL)与10μL十二烷基磺酸钠上样缓冲液混合后煮沸10分钟使蛋白变性，采用12％十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法使蛋白进入胶内，电泳参数为60v，电泳45分钟，然后改为120v，电泳1小时，考马斯亮蓝染色后，将含标准蛋白的胶条切下。
用18.2MΩ超纯水清洗胶条后将胶条破碎成约1mm3胶粒，加入200μL等比例的乙腈与碳酸氢铵配制的脱色液，碳酸氢铵浓度为25mM，脱色两次至胶粒完全无色后吸出脱色液，再加入100μL乙腈至胶粒中使其完全脱水，吸出上清液，将装有胶粒的离心管置于室内通风处挥发干燥；待残留乙腈完全挥发后，在胶粒中加入10μL 12.5ng/μL胰酶溶液(25mM碳酸氢铵配制)，置于4℃冰箱中1小时使胰酶充分进入胶粒内部，补加25mM的碳酸氢铵至没过胶粒，于37℃水浴反应8-12小时。酶消化液吸出至新的0.6mL离心管，得到蛋白酶解原液，经真空冷冻干燥后，得到用于糖肽富集的蛋白酶解物。
三、从样本溶液中富集糖肽
1)取磁性聚苯胺纳米材料粉末，分别用无水乙醇、超纯水和80％乙腈水溶液50KHz超声洗涤5分钟。
2)将2mg的磁性聚苯胺纳米材料分散于1mL乙腈水溶液中，得到磁性聚苯胺纳米材料分散液，乙腈水溶液乙腈的体积分数为80％。
3)分装酶解样本，取2μg蛋白酶解物，冷冻干燥后向其中加入100μL磁性聚苯胺纳米材料分散液。不断振荡富集糖肽，振荡富集时间为1小时。
4)将富集完成后的磁性聚苯胺纳米材料分散液进行磁分离。分离完成后取出上清液即富集萃余液。得到磁性聚苯胺纳米材料沉淀，即吸附糖肽后的磁性聚苯胺纳米材料富集材料。
5)向吸附糖肽的磁性聚苯胺纳米材料沉淀中加入洗脱液，不断振荡将吸附在磁性聚苯胺纳米材料表面的糖肽洗脱下来；洗脱液氨水的浓度为0.025％，洗脱液的体积为80μL，振荡洗脱时间为45分钟。
6)将洗脱完成后的溶液进行磁分离，分离完成后取出上清液即富含糖肽的洗脱液。
7)将洗脱液冷冻抽干，进行质谱分析。
对比试验
1、对步骤二中，得到胎球蛋白酶解原液用十八烷基硅烷键合硅胶柱填料(1.7μm)除盐。
2、步骤三中4得到的富集剩余液，用十八烷基硅烷键合硅胶柱填料(1.7μm)除盐。
3、直接对步骤三得到的富集液进行分析。
4、步骤二得到的蛋白酶解原液，每20μg蛋白，用16μL水重溶，加入2μL 10×G1反应缓冲液和2μL唾液酸酶，37℃孵育16小时。酶解完，按照步骤三的1-6进行富集。
5、步骤二得到的蛋白酶解原液，每20μg蛋白，用16μL水重溶，加入2μL反应缓冲液和2μL 10×NP-40，0.5μL N-糖酰胺酶F，37℃孵育16小时。酶解完，按照步骤三中1-6进行富集。
检测限试验不同上样浓度
1)取磁性聚苯胺纳米材料粉末，分别用无水乙醇、超纯水和80％乙腈水溶液50KHz超声洗涤5分钟。
2)将2mg的磁性聚苯胺纳米材料分散于1mL乙腈水溶液中，得到磁性聚苯胺纳米材料分散液，乙腈水溶液(乙腈的体积分数为80％)。
3)分装酶解样本，分别取0.2μg、0.5μg、1μg、2μg、4μg和8μg蛋白酶解物，加入磁性聚苯胺纳米材料分散液，不断振荡富集糖肽，振荡富集时间为1小时。
4)将富集完成后的磁性聚苯胺纳米材料分散液进行磁分离。分离完成后取出上清液即富集萃余液。得到磁性聚苯胺纳米材料沉淀，即吸附糖肽后的磁性聚苯胺纳米材料富集材料。
5)向吸附糖肽的磁性聚苯胺纳米材料沉淀中加入洗脱液，不断振荡将吸附在磁性聚苯胺纳米材料表面的糖肽洗脱下来；洗脱液氨水的浓度为0.025％，洗脱液的体积为80μL，振荡洗脱时间为45分钟。
6)将洗脱完成后的溶液进行磁分离，分离完成后取出上清液即富含糖肽的洗脱液。
7)将洗脱液冷冻抽干，进行质谱分析。
对照试验洗脱条件选择
1)取磁性聚苯胺纳米材料粉末，分别用无水乙醇、超纯水和80％乙腈水溶液50KHz超声洗涤5分钟。
2)将2mg的磁性聚苯胺纳米材料分散于1mL乙腈水溶液中，得到磁性聚苯胺纳米材料分散液，乙腈水溶液乙腈的体积分数为80％。
3)分装酶解样本，分别取0.2μg、0.5μg、1μg、2μg、4μg和8μg蛋白酶解物，加入磁性聚苯胺纳米材料分散液，不断振荡富集糖肽，振荡富集时间为1小时。
4)将富集完成后的磁性聚苯胺纳米材料分散液进行磁分离。分离完成后取出上清液即富集萃余液。得到磁性聚苯胺纳米材料沉淀，即吸附糖肽后的磁性聚苯胺纳米材料富集材料。
5)分别用0.1％三氟乙酸、0.2％甲酸、超纯水、5mM碳酸氢铵水溶液和0.025％氨水溶液洗脱，分别收集流出液，得到五个不同富集液，进行质谱分析。
对照试验二氧化钛富集
用100％乙腈清洗二氧化钛三次。将纯净的二氧化钛材料保存于100％乙腈中。
富集方法为：
1)将10mg二氧化钛分散于1mL乙腈中超声10分钟，吸取6μL分散液加入到600μL的EP管中，真空抽干乙腈溶剂。
2)将10μg蛋白酶解物重溶于10μL碳酸氢铵水溶液中，将溶液加入真空抽干后的二氧化钛管中，并向其中加入100μL上样缓冲液(1mol/L的乙醇酸溶于80％乙腈/水溶液，5％三氟乙酸(v/v))，振荡30分钟。
3)将振荡完成的混合液放入离心机中，1000g离心3分钟，弃去上清液，并向沉淀中加入50μL上样缓冲液a(1mol/L的乙醇酸溶于80％乙腈/水溶液，5％三氟乙酸(v/v))，涡旋1分钟后1000g离心，弃去上清液。
4)向沉淀中加入400μL富集缓冲液a(80％乙腈/水溶液，5％三氟乙酸(v/v))涡旋15秒，1000g离心3分钟后弃去上清液。
5)向沉淀中加入50μL富集缓冲液b(20％乙腈/水溶液，0.1％三氟乙酸(v/v))涡旋15秒，1000g离心3分钟后弃去上清液。
6)将剩余的二氧化钛真空干燥10分钟，向干燥的二氧化钛中加入洗脱缓冲液(0.25％的氨水溶液，pH＝11.6)振荡20分钟。混合液15000g离心后，吸取上清液，冷冻抽干，保存在-80℃备用。
富集效果比较
质谱图谱见图1。图1a是用十八烷基硅烷键合硅胶柱填料(1.7μm)除盐后的蛋白酶解原液质谱图，蛋白酶解原液的质谱图中可以检测到25个糖肽质谱峰，且糖肽的峰强度较弱。图1b是磁性聚苯胺纳米材料富集蛋白富集洗脱液的质谱图，磁性聚苯胺纳米材料富集后的洗脱液中发现了40个糖肽质谱峰，糖肽峰非常强。图1c是磁性聚苯胺纳米材料富集后的富集剩余液，磁性聚苯胺纳米材料富集后剩余的溶液中只有非糖肽信号和响应非常弱的少量糖肽信号，表明磁性聚苯胺纳米材料可以特异性地富集唾液酸化修饰糖肽。图1d和e是蛋白酶解后，分别用唾液酸酶和N-糖酰胺酶F处理，进行磁性聚苯胺纳米材料富集。N-糖酰胺酶F处理后N糖被切掉，得到的信号全部来自非糖肽。
图2a是用C18柱除盐后的转铁蛋白酶解原液质谱图，转铁蛋白酶解原液的质谱图中可以检测到28个糖肽质谱峰，且糖肽的峰强度较弱。图2b是磁性聚苯胺纳米材料富集蛋白洗脱液的质谱图，磁性聚苯胺纳米材料富集后的洗脱液中发现了30个糖肽质谱峰，糖肽峰非常强，几乎没有非糖肽的干扰。图2c是磁性聚苯胺纳米材料富集后的富集剩余液，磁性聚苯胺纳米材料富集后剩余的溶液中只有不含唾液酸化修饰的糖肽和非糖肽的信号。图2d和e是转铁蛋白酶解后，再分别用唾液酸酶和N-糖酰胺酶F酶处理，进行磁性聚苯胺纳米材料富集，得到的信号全部来自非糖肽。与图1中蛋白的富集规律相似，磁性聚苯胺纳米材料也能够对转铁蛋白糖肽进行特异性的富集。说明对于糖基化修饰较少的转铁蛋白，磁性聚苯胺纳米材料对糖肽依然有很强的的富集能力。
对比磁性聚苯胺纳米材料对不同量的蛋白酶解液的富集质谱(图3)，可以发现：50fmol时，仍然出现了糖肽的信息，但是其信噪比和峰强度不太高。0.4pmol时已经具有较丰富的糖肽信息，0.8pmol时糖肽峰达到很高的强度。而继续增大蛋白酶解液的量，与0.8pmol的蛋白酶解液富集后糖肽峰强和峰的数量相比没有明显变化。表明磁性聚苯胺纳米材料富集的最低检出限可达50fmol，0.8pmol是最佳蛋白上样量。
对比利用不同洗脱液富集磁性聚苯胺纳米材料上的糖肽的质谱图(图4a、4b、4c、4d和4e)可以发现：碱性洗脱液能将糖肽洗脱下来，随着洗脱液酸碱度(pH)的升高，得到的唾液酸化修饰糖肽峰数量越来越多，峰强也逐渐增加。最优条件为0.025％的氨水溶液洗脱。说明碱性环境有利于唾液酸化修饰糖肽的洗脱。
二氧化钛法富集胎球蛋白酶解液的质谱图中(图5)，可以发现二氧化钛富集到的糖肽对高分子量端的糖肽富集效率不佳。相比之下，磁性聚苯胺纳米材料不仅在可以特异性富集糖肽，而且条件温和，效果显著优于常规的二氧化钛富集法。
实施例2磁性聚苯胺纳米材料富集材料的形貌和结构表征
本实施例中对磁性聚苯胺纳米材料富集材料进行形貌和结构表征，进一步推测磁性聚苯胺纳米材料富集糖肽的机理。
图6：磁珠(a和b)和磁性聚苯胺纳米材料(c和d)的透射电镜图，可以发现磁珠和磁性聚苯胺纳米材料材料均为大小约500nm的球状结构，尺寸较为均一，聚苯胺均匀地包覆在磁珠表面。
图7：XPS揭示了磁性聚苯胺纳米材料的元素组成。在282.19、397、529.97和708.73ev处观察到C1s、N1s、O1s和Fe2p峰，说明了该材料主要以C、N、O和Fe元素组成的。
图8：磁性聚苯胺纳米材料材料和包覆材料聚苯胺的拉曼光谱均在880～680cm-1处指示苯环面外C-H弯曲振动，1156、1213、1478、1587cm-1分别指示C-H、C-N、C＝C和C-C的弯曲振动，而磁珠本身没有拉曼信号响应。此外，在2900-3000cm-1出现了指示N-H弯曲振动的宽峰，说明该材料具有苯环和亚胺基团，大量的苯环和亚胺基团可以与糖链O-H形成氢键，这对糖肽的富集是很有利的。
图9：通过电动电势(ζ电位)分析进一步探讨磁性聚苯胺纳米材料富集机理分散在不同的富集溶液和洗脱液中。如图所示，电动电势在+50和-40mV之间波动。磁性聚苯胺纳米材料的电动电势随着分散体酸碱度的增加而降低，且涵盖较宽的正负电性范围。一方面，该材料可能实现在不同酸碱环境下对不同带电状态糖肽的依次洗脱；另一方面，已知唾液酸化修饰糖肽呈电负性，磁性聚苯胺纳米材料更倾向于在碱性环境中排斥唾液酸化修饰糖肽。因此，洗脱液被优化为0.025％氨水溶液。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种富集糖肽的磁性聚苯胺纳米材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将六水合三氯化铁溶于乙二醇中并搅拌至溶液呈黄色，向溶液中加入无水乙酸钠后继续搅拌1小时，然后转移至反应釜于烘箱中200℃加热反应16小时，将产物清洗并在烘箱中60℃烘干得磁性纳米材料；
(2)将盐酸水溶液与苯胺溶液混合，并避光冰浴10分钟，然后加入磁性纳米材料，继续避光冰浴搅拌10分钟；向混合液中加入过硫酸铵水溶液，再次避光冰浴搅拌4小时，将产物清洗并在烘箱中60℃烘干，得富集糖肽的磁性聚苯胺纳米材料。
2.根据权利要求1所述一种富集糖肽的磁性聚苯胺纳米材料的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述六水合三氯化铁与无水乙酸钠的质量比为1：1.8-3.6；
步骤(1)和步骤(2)所述清洗方法均为依次采用无水乙醇、50％乙醇、超纯水和体积分数80％乙腈水溶液及乙腈进行振荡洗涤。
3.根据权利要求1所述一种富集糖肽的磁性聚苯胺纳米材料的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述盐酸水溶液浓度为0.1％；所述过硫酸铵水溶液浓度为0.38g/mL；
所述盐酸水溶液与苯胺溶液的体积比为100:1；
所述盐酸水溶液与过硫酸铵水溶液体积比为30:1；
所述盐酸水溶液的体积与磁性纳米材料的质量比为1:6。
4.一种富集糖肽的磁性聚苯胺纳米材料，其特征在于，由权利要求1-3任一项所述制备方法制备得到。
5.一种用于富集糖肽的试剂盒，其特征在于，包括权利要求4所述磁性聚苯胺纳米材料、60-80％的乙腈水溶液、0.025％的氨水溶液和0.1％的三氟乙酸水溶液。
6.一种富集糖肽的方法，其特征在于，采用权利要求5所述用于富集糖肽的试剂盒进行富集，其包括以下步骤：
1)将磁性聚苯胺纳米材料分散液加入到糖蛋白胰酶酶切产物中，振荡富集糖肽；
2)将富集液进行磁分离，然后向富集糖肽的磁性聚苯胺纳米材料中加入洗脱液进行振荡洗脱并进行磁分离，得到糖肽富集溶液。
7.根据权利要求6所述一种富集糖肽的方法，其特征在于，步骤1)中所述磁性聚苯胺纳米材料分散液的制备方法为：将磁性聚苯胺纳米材料分散于60-80％的乙腈水溶液中，得到浓度为0.5-2mg/mL的磁性聚苯胺纳米材料分散液。
8.根据权利要求6所述一种富集糖肽的方法，其特征在于，步骤1)中所述振荡富集时间为0.5-2小时；
步骤2)中所述振荡洗脱时间为0.5-2小时。
9.根据权利要求6或8所述一种富集糖肽的方法，其特征在于，所述洗脱液为0.025％的氨水溶液或0.1％三氟乙酸水溶液。
10.根据权利要求6所述一种富集糖肽的方法，其特征在于，步骤2)中磁分离方法为采用具有磁性物体对磁性聚苯胺纳米材料进行吸附分离。
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