CN108362890B - 基于含硼梳形聚合物图案化靶板富集、除盐和鉴定糖肽的方法 - Google Patents

基于含硼梳形聚合物图案化靶板富集、除盐和鉴定糖肽的方法 Download PDF

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Abstract

一种基于含硼梳形聚合物图案化靶板富集、除盐和鉴定糖肽的方法，它是利用PPA‑EAPBA梳形分子刷形成图案化表面对生物样品进行一步富集和除盐净化的处理方法，这种图案化表面可以被广泛地应用于生物样品的预处理及检测。其步骤为：合成含硼酸PPA‑EAPBA梳形分子刷；在基底上构筑疏水‑亲水‑疏水区域的封闭图案化表面；将多肽或蛋白溶液滴在上述步骤制备的图案化表面上，自然晾干，得到干燥的样品点；将基质溶液滴在上述干燥的样品点上，自然晾干后，在图案化表面上形成样品和基质均匀的共结晶，从而实现对生物样品进行富集和除盐净化处理。利用本发明构筑的图案化表面，在MALDI‑TOF MS检测中，信噪比、灵敏度及耐盐能力都有很显著的提高，具有很大的实际应用价值。

Description

基于含硼梳形聚合物图案化靶板富集、除盐和鉴定糖肽的 方法
技术领域
本发明属于生化分析技术领域，具体涉及PPA-EAPBA梳形分子刷并利用其形成图案化表面对生物样品进行一步性的富集和除盐净化的处理方法，这种图案化表面可以被广泛地应用于生物样品的预处理及检测。
背景技术
基质辅助激光解吸/离子化飞行时间质谱法(MALDI-TOF MS)是一种有效的软电离方法，具有很高的灵敏度，适用于蛋白质组学中生物样品的分析检测。但是，在质谱分析过程中，由于样品沉积面积的不可控制以及基质和样品不均匀的共结晶会降低质谱分析的检测灵敏度及重现性。另外，生物样品中存在的盐及其它的一些试剂也会严重地干扰样品和基质的结晶，导致质谱信号微弱甚至淬灭质谱信号。因此，利用合适的样品预处理方法来富集和除盐净化对于MALDI分析和检测是非常重要的。
一些离线方法如HPLC，ZipTipC18以及一些功能化的纳米粒子都被用于预先分离复杂的生物样品。虽然样品得到纯化，但是由于其复杂的操作过程就不可避免会造成样品损失以及污染物的引进。为了克服离线方法的不足，在线样品富集及除盐的方法引起了广泛的关注。近几年，科学家利用旋涂或滴涂的方法将疏水聚合物如聚四氟乙烯、石蜡、尼龙等修饰在MALDI的样品板上(J.Mass Spectrom.2002，37，512；Anal.Chem.1997，69，4716；Anal.Biochem.2004，327，222；Anal.Chem.1998，70，750；J.Am.Soc.Mass Spectrom.1994，5，230)。在进行水洗除盐的时候由于盐与疏水聚合物的作用力很弱，盐会被溶解在水中而被除掉，但是额外的水洗步骤则会导致不可避免的样品损失，同时也不利于高通量的质谱检测。2007年，Jia首次利用大量的基质溶液推洗污染物的方法来实现免于水洗的在线样品富集及除盐(Proteomics 2007，7，2497；中国专利，公开号：CN1811407A)。但是这种方法需要大量基质溶液排盐，会导致部分分析物损失；另外，这种方法还需要严格控制样品溶液的沉积体积。
发明内容
本发明的目的是在于提供一种操作简单快速、高灵敏度、高通量的一步性样品除盐和富集的新方法。具体涉及在基底(硅)上构筑具有疏水-亲水-疏水区域结构的环形封闭图案化表面，使多肽或蛋白样品实现简单快速地靶上在线免水洗除盐和同步富集，避免了样品的损失，并进行MALDI-TOF MS的分析和检测的新方法。
一种利用疏水-亲水-疏水区域结构的封闭图案化表面对生物样品进行在线免水洗除盐和同步富集的方法，其特征是它包括如下步骤：
步骤1、合成PPA-EAPBA梳形分子刷；
步骤2、在基底上构筑疏水-亲水-疏水区域的封闭图案化表面；
步骤3、将1μL多肽或蛋白溶液滴在上述步骤制备的图案化表面上，在室温下自然晾干，从而得到干燥的样品点；在自然晾干的过程中，由于图案化表面的中央疏水区域对蛋白或多肽有很强的疏水相互作用而对无机盐等污染物的吸附很弱，从而使无机盐等污染物被大部分转移到亲水区域，而多肽或蛋白则被吸附到中央疏水区域；
步骤4、滴加0.5μL DHB(2，5-二羟基苯甲酸)基质(20mg/ml，ACN(乙腈)/WATER/H3PO4＝50/49/1，V/V)在上述干燥的样品点上，室温下自然晾干后，在图案化表面上形成样品和基质均匀的共结晶；在此过程中，少部分原先残留在中央疏水区域的无机盐等污染物会重新溶解在水溶液里，从而被进一步带到亲水区域，而蛋白或多肽仍能保留在中央疏水区域；
步骤5、无需额外的水洗除盐步骤也无需过量的基质溶液除盐，将上述步骤富集除盐后的样品直接进行MALDI-TOF MS的分析和检测。
上述利用疏水-亲水-疏水区域结构的封闭图案化表面对生物样品进行在线免水洗除盐和同步富集的方法，其中，步骤1中合成PPA-EAPBA梳形分子刷的合成路线为：
Figure BDA0001574039240000031
具体方法，包括如下步骤：
A.2，5-二碘对苯二酚(1.81g，5mmol)，2-丁酮(25ml)，碳酸钾(7.9g，50mmol)和溴乙酸乙酯(3.34g，20mmol)被放置在一个100毫升圆底烧瓶和回流加热24h，混合物冷却至室温，移除溶剂，粗产物从乙酸乙酯和正己烷的混合物重结晶，得到无色固体二碘单体2(1.8g，81.8％)；
B.将二碘单体2(1.07g，2mmol)，三甲基乙炔基硅(588mg，6.0mmol)溶解在四氢呋喃(10ml)和三乙胺(2.5ml)于50ml圆底烧瓶中，溶液用氩气吹扫15分钟，加入催化剂二(三苯基磷)二氯化钯(Ph3P)2PdCl2(14mg，0.02mmol)，和CuI(3.8mg，0.02mmol)，混合物在室温下搅拌24h，混合物过滤去除铵盐和真空除去溶剂，固体残渣溶解在四氢呋喃并加入四丁基氟化铵(1M)，反应混合物在室温下搅拌10分钟，在真空中移除溶剂，产品用硅胶柱(乙酸乙酯/己烷1∶3)分离，得淡黄色固体3(347mg，55％)；
C.将A步骤得到的固体2(0.107g，0.200mmol)和B步骤得到的固体3(0.072g，0.22mmol)溶解在氯仿(4ml)和三乙胺(1ml)于50ml圆底烧瓶中，将催化剂(Ph3P)2PdCl2(1.4mg，0.002mmol)和碘化铜(0.4mg，0.002mmol)添加到瓶中，反应混合物在50℃下氩气保护搅拌下72h，反应混合物慢慢的添加到乙醚中(100m1)，沉淀用热乙醚清洗，得到橙色固体4(130mg)产率89.7％；
将C反应步骤得到的固体4(75mg)和氢氧化钠(0.225g)溶解在甲醇(12.5ml)中，搅拌回流24h，在冰箱里冷却过夜，沉淀过滤后，用甲醇和乙醚洗涤，用稀盐酸调节pH至4左右，有沉淀析出，水洗干燥后，得到黄色粉末5(75mg)；
将D得到的黄色粉末5(50mg)和3-氨基苯硼酸(50mg)溶解在DMF中，室温下搅拌反应24h，加入大量的水，沉淀过滤，得黄色粉末状聚1，4-苯乙炔-2，5-苯乙酰胺苯硼酸基醚梳形分子刷，PPA-EAPBA梳形分子刷(50mg)。
上述利用疏水-亲水-疏水区域结构的封闭图案化表面对生物样品进行在线免水洗除盐和同步富集的方法，其中，步骤2中构筑的疏水-亲水-疏水区域结构的封闭图案化表面的具体方法，包括如下几个步骤：
步骤A.选取1.0*1.0cm2正方形的单面抛光N(100)型硅片为基底，放置于体积比为7∶3的浓硫酸/H2O2混合溶液中，在80℃下将硅片浸泡1h以使其亲水化，将上述的硅片依次放入丙酮、氯仿、乙醇和水中各超声5min，并吹干；
步骤B.用毛细管蘸取浓度为7.5％(wt％)聚甲基丙烯酸甲酯PMMA的甲苯溶液，然后接触并滴涂在步骤A得到的基底上，在基底的表面上形成半径为600～800μm的PMMA小点；
步骤C.以步骤B构筑的硅片基底与1H，1H，2H，2H-全氟葵烷基三氯硅烷(FDTS)分子放在密闭的容器内共同加热，在250℃下保持3h，PMMA挡层以外的亲水区域就被修饰上了含氟的疏水单分子层；
步骤D.将步骤C得到的基底将修饰好的硅片依次放入丙酮、氯仿、乙醇和水中各超声5min除去表面的PMMA挡层，从而在表面上形成半径为600～800μm的空白亲水区域，并吹干；
步骤E.在步骤D得到的基底的空白亲水区域中央制备半径为300～500μm的PPA-EAPBA梳形分子刷来作为中央疏水区域，从而在基底表面上构筑出疏水-亲水-疏水的表面图案化样品板。
上述利用疏水-亲水-疏水区域结构的封闭图案化表面对生物样品进行在线免水洗除盐和同步富集的方法，其中，步骤2中构筑的疏水-亲水-疏水区域结构的封闭图案化表面的具体方法中的A步骤，用如下方法替代：硅片基底首先用氧等离子体系统对基底表面进行处理，目的是除去表面残留有机物并使表面羟基化，成为亲水表面，氧气流速60～140ml/min，功率100～300W，处理时间1～10min；再用高纯水对基底表面超声清洗2～3次，每次时间为2～5min，使表面彻底清洁并羟基化。
上述利用疏水-亲水-疏水区域结构的封闭图案化表面对生物样品进行在线免水洗除盐和同步富集的方法，其中，步骤2中构筑的疏水-亲水-疏水区域结构的封闭图案化表面的具体方法中的步骤B和E步骤中对于疏水层的制备可以利用毛细管滴涂完成：毛细管滴涂和蘸笔技术是用毛细管或聚二甲基硅氧烷(PDMS)蘸取一定浓度的聚合物(PMMA或PS和PPA-EAPBA梳形分子刷，2.5～7.5(wt％)，溶于甲苯溶液，然后接触并滴涂在基底上。
上述利用疏水-亲水-疏水区域结构的封闭图案化表面对生物样品进行在线免水洗除盐和同步富集的方法，其中，步骤2中构筑的疏水-亲水-疏水区域结构的封闭图案化表面的具体方法中的步骤C中疏水层的构筑：主要有以下两种方法：第一种方法是利用1H，1H，2H，2H-全氟癸烷基三氯硅烷(FDTS)分子放在密闭的容器内共同加热，在250℃下保持3h，从而在基底上得到疏水层；第二种是利用遮挡板蒸镀技术在挡层以外的基底表面上进行金或银的蒸镀，从而在基底上得到疏水层。
本发明可以非常有效地一步实现样品的除盐和富集的效果，无需洗脱和额外的水洗步骤，也无需过量的基质溶液。本发明所采用的图案化表面具有不同的亲疏水区域，首先当多肽或蛋白溶液沉积在此表面上时，由于最外圈的疏水层的存在，会将样品溶液有效地局限在该疏水层形成的环形区域里，起到富集的作用。在溶剂蒸发的过程中，对于含盐样品，由于图案化表面的中央疏水区域对蛋白或多肽有很强的疏水相互作用，从而使无机盐等和样品会被分别地转移到两疏水区域中间的环形亲水区域和中央疏水区域，达到样品除盐净化的目的。
本发明中由于样品在制备的基底上的沉积面积小于传统的不锈钢靶板点样的方法，所以样品与基质容易形成更加细小、均匀的共结晶，在激光的激发下就会有更多的样品分子被解析离子化，从而提高了MALDI-TOF MS的灵敏度和重现性。
利用本发明构筑的图案化表面，在MALDI-TOF MS检测中，信噪比、灵敏度及耐盐能力都有很显著的提高。我们研究发现，利用这种方法构筑的疏水-亲水-疏水区域结构的图案化表面，具有很强的样品富集及除盐能力。如图6所示，我们在传统的不锈钢靶板上辣根过氧化物酶酶解液能够得到其最低检测限是2.27×104fmol.μL-1，而在本发明的这种图案化表面上所测试得到的最低检测限是118.5fmol.μL-1，质谱检测的灵敏度提高了两个数量级。另外，如图7所示，即使样品里含有很高浓度的盐，例如：碳酸氢铵(100mM)，在图案化的表面上由于盐能够有效地被排除，因此仍然能检测到很好的质谱信号。而在传统的不锈钢靶板上由于盐会干扰到基质和样品的共结晶，所以检测不到样品信号。以上证实了这种疏水-亲水-疏水相间的环形图案化表面能有效地富集和除盐净化分析物样品，具有很大的实际应用价值。
附图说明
图1：聚1，4-苯乙炔-2，5-苯乙酰胺苯硼酸基醚梳形分子红外谱图
图2：聚1，4-苯乙炔-2，5-苯乙酰胺苯硼酸基醚梳形分子氢核磁谱图
图3：本发明所述疏水-亲水-疏水的环形图案化表面的构筑示意图；
图4：含盐样品在图案化表面上一步除盐和富集方法流程示意图；
图5：辣根过氧化物酶(HRP)酶解产物在不同样品板上测试所得质谱图：(a)MALDI不锈钢板(HRP浓度为2.27×104fmol·μL-1)，可以看出样品的信号很弱甚至无法检测到信号；(b)在图案化样品板在修饰有PPA-EAPBA梳形分子刷(HRP浓度为118.5fmol·μL-1)，可以看出样品的信号被显著地增强，说明图案化表面具有很好的样品富集效果。
图6：辣根过氧化物酶(HRP)和牛血清白蛋白(BSA)的酶解混合液的质谱图：a图在传统不锈钢板上，HRP∶BSA＝1∶1，可以看出样品的信号很弱甚至无法检测到信号。b图和c图是在图案化表面上所得的质谱图，b图中HRP∶BSA＝1∶1；c图中HRP∶BSA＝1∶10.
图7所示的在不同种类盐的存在下样品在不锈钢靶板上和图案化表面上测试所得的质谱图。a和c图分别表示含有氯化钠，碳酸氢铵的样品在不锈钢靶板上所得的质谱图，(a)NaCl(1M)，(c)NH4HCO3(100mM)；可以看出在不锈钢靶板上，质谱的信号被严重地抑制。这是因为当样品中含有很高浓度的盐，会严重影响基质与样品的结晶，降低质谱测试的性能。b和d图分别表示在图案化表面上所得的质谱图，(b)NaCl(1M)，(d)NH4HCO3(100mM)，可以看出在图案化表面上能获得很好的质谱信号，主要是因为样品中的盐被有效排除。
图8所示的是人免疫球蛋白G(Human Ig G)酶解液和血清(稀释100倍)按1∶1混合在不锈钢靶板上和图案化表面上测试的质谱图。a图在不锈钢靶板上所得的质谱图，可以看出样品的信号很弱甚至无法检测到信号。b图表示在图案化表面上所得的质谱图，可以看出在图案化表面上能获得很好的质谱信号。
具体实施方法
下面通过实施例进一步阐明本发明方法及应用，而不是要用这些实施例来限制本发明。本发明主要是在基底上构筑疏水-亲水-疏水区域结构的封闭图案化表面，利用此表面对生物样品进行在线富集和除盐净化，从而更好地进行质谱测试。
实施例1
如图3所示，将单晶硅[n type，(100)]放置于体积比为7∶3的浓硫酸/H2O2混合溶液中，在80℃下将硅片浸泡1h。再放入丙酮、氯仿、乙醇、水中各超声5min，使表面彻底清洁并羟基化；
用毛细管蘸取浓度为7.5％(wt％)的PMMA甲苯溶液，然后接触并滴涂在的基底上，在基底的表面上形成半径约为800μm的PMMA小点；将基底与1H，1H，2H，2H-全氟葵烷基三氯硅烷(FDTS)分子放在密闭的容器内共同加热，在250℃下保持3h。PMMA挡层以外的亲水区域就被修饰上了含氟的疏水单分子层；
将修饰好的硅片依次放入丙酮、氯仿、乙醇、水中各超声5min除去表面的PMMA挡层，从而在表面上形成半径约为800μm的空白亲水区域，并吹干；
随后在此环形的亲水裸硅区域的中间滴涂上厚度约为60μm、半径约为500μm的PPA-EAPBA梳形分子刷，便得到疏水-亲水-疏水相间的环形图案化表面；
将多肽或蛋白样品溶液滴于此表面上，当溶剂蒸发完全，样品中的盐被排除到中间环形的亲水区域，基质溶液加入到图案化表面上，在室温下晾干；如图4所示，含盐样品在图案化表面上一步除盐和富集方法流程示意图。利用图3所得的基底，将含有盐的样品溶液沉积在基底上，由于最外圈含氟疏水层的憎水性，样品溶液会局限沉积在面积较小的环形区域从而改善了样品在表面分散的均匀性；当溶剂蒸发时，样品中的盐由于其水溶性会被富集在中间环形的亲水的裸硅区域，而多肽或蛋白由于和中央疏水聚合物之间通过疏水-疏水相互作用被保留在中央的聚合物的表面上，实现了样品的一步富集和除盐。待溶剂挥发完全后，基质溶液被滴加在疏水聚合物的表面，原来少量遗留在中央的聚合物表面上的盐又会重新的溶解从而被基质带到聚合物的外围即中间亲水的裸硅区域达到二次除盐的目的。
调整多肽混合物(辣根过氧化物酶)浓度为2.27×104fmol·μL-1，118.5fmol·μL-1来评测疏水-亲水-疏水相间的环形图案化表面对于多肽和蛋白的富集效率。采用实施例1所得的疏水-亲水-疏水相间的环形图案化表面和传统的不锈钢靶板做为样品载板。将2μL蛋白酶解稀释液滴加到样品板上，孵育富集30分钟，接着滴加2，5-二羟基苯甲酸溶液(20mg·ml-1DHB/(ACN-water-TFA，50/49.9/0.1％(v/v/v)))洗涤。最后，在样品点上添加0.5μL 400mM的氨水溶液使磷酸化肽从四价钛离子上解除吸附。滴加0.5μL 2，5-二羟基苯甲酸基质溶液(20mg·ml-1DHB/ACN-Water-H3PO4，50/49/1％(v/v/v))形成结晶物。制备好的样品送入MALDI-TOF MS(Kratos Axima CFRplus，Shimadzu Biotech，Manchester，UK)检测。
质谱条件：激光器为氮气激光器，波长355nm；加速电压20kV，正离子模式，得到的质谱图如图5所示。图5所示的在传统的不锈钢靶板上所得到的最低检测限是2.27×104fmol·μL-1(a)，而在这种图案化表面上所得到的最低检测限是118.5fmol·μL-1(b)。
实施例2
调整样品溶液为不同比例的辣根过氧化物酶与BSA的酶解产物，分别采用疏水-亲水-疏水相间的环形图案化表面和传统的不锈钢靶板做为样品载板，其他条件与实施例1一样，所得到的质谱图如图6所示。
实施例3
调整样品溶液为加入氯化钠(1M)，碳酸氢铵(100mM)的118.5fmolμL-1多肽混合液，分别采用疏水-亲水-疏水相间的环形图案化表面和传统的不锈钢靶板做为样品载板，其他条件与实施例1一样，所得到的质谱图如图7所示。
实施例4
调整人免疫球蛋白G(Human Ig G)酶解液和血清(稀释100倍)按1∶1混合溶液分别采用疏水-亲水-疏水相间的环形图案化表面和传统的不锈钢靶板做为样品载板，其他条件与实施例1一样，所得到的质谱图如图8所示。

Claims (6)

1.一种利用疏水—亲水—疏水区域结构的封闭图案化表面对生物样品进行在线免水洗除盐和同步富集的方法，其特征是它包括如下步骤：
步骤1、合成1，4-苯乙炔-2，5-苯乙酰苯硼酸基醚梳形分子刷；
步骤2、在基底上构筑疏水—亲水—疏水区域的封闭图案化表面；
步骤3、将1μL多肽或蛋白溶液滴在上述步骤制备的图案化表面上，在室温下自然晾干，从而得到干燥的样品点；在自然晾干的过程中，由于图案化表面的中央疏水区域对蛋白或多肽有很强的疏水相互作用而对无机盐污染物的吸附很弱，从而使无机盐污染物被大部分转移到亲水区域，而多肽或蛋白则被吸附到中央疏水区域；
步骤4、滴加0.5μL 2，5-二羟基苯甲酸和基质在上述干燥的样品点上，基质室温下自然晾干后，在图案化表面上形成样品和基质均匀的共结晶；在此过程中，少部分原先残留在中央疏水区域的无机盐污染物会重新溶解在水溶液里，从而被进一步带到亲水区域，而蛋白或多肽仍能保留在中央疏水区域；
其中2，5-二羟基苯甲酸的浓度为20mg/ml，基质的组成为乙腈、水和H3PO4，它们的体积比为50/49/1；
步骤5、无需额外的水洗除盐步骤也无需过量的基质溶液除盐，将上述步骤富集除盐后的样品直接进行MALDI-TOF MS的分析和检测。
2.根据权利要求1所述利用疏水-亲水-疏水区域结构的封闭图案化表面对生物样品进行在线免水洗除盐和同步富集的方法，其特征是：其中，步骤1中合成1，4-苯乙炔-2，5-苯乙酰苯硼酸基醚梳形分子刷包括如下步骤：
A.将2，5-二碘对苯二酚、2-丁酮、碳酸钾和溴乙酸乙酯被放置在一个圆底烧瓶中回流加热24h，混合物冷却至室温，移除溶剂，粗产物从乙酸乙酯和正己烷的混合物重结晶，得到无色固体二碘单体2；
B.将二碘单体2和三甲基乙炔基硅溶解在四氢呋喃和三乙胺置于圆底烧瓶中，溶液用氩气吹扫15分钟，加入催化剂二(三苯基磷)二氯化钯和CuI，混合物在室温下搅拌24h，混合物过滤去除铵盐和真空除去溶剂，固体残渣溶解在四氢呋喃中，加入四丁基氟化铵，反应混合物在室温下搅拌10分钟，在真空中移除溶剂，产品用硅胶柱分离，洗脱液为1︰3乙酸乙酯/己烷，得淡黄色固体3；
C.将A步骤得到的固体2和B步骤得到的固体3溶解在氯仿和三乙胺中，加入催化剂(Ph3P)2PdCl2和碘化铜，反应混合物在50℃下氩气保护中搅拌72h，反应结束后，将反应混合物慢慢地添加到乙醚中，过滤析出的沉淀，用热乙醚洗涤，得到橙色固体4；
D.将C步骤得到的固体4和氢氧化钠溶解在甲醇中，搅拌回流24h，在冰箱里冷却过夜，沉淀过滤后，用甲醇和乙醚洗涤，用稀盐酸调节pH至4左右，有沉淀析出，水洗干燥后，得到黄色粉末5；
E.将D步骤得到的黄色粉末5和3-氨基苯硼酸溶解在DMF中，室温下搅拌反应24h，加入大量的水，沉淀过滤，得黄色粉末状聚1，4-苯乙炔-2，5-苯乙酰胺苯硼酸基醚梳形分子刷，PPA-EAPBA梳形分子刷。
3.根据权利要求1所述利用疏水-亲水-疏水区域结构的封闭图案化表面对生物样品进行在线免水洗除盐和同步富集的方法，其特征是：其中，步骤2中构筑的疏水—亲水—疏水区域结构的封闭图案化表面的具体方法包括如下步骤：
步骤A.选取1.0*1.0cm2正方形的单面抛光N100型硅片为基底，放置于体积比为7:3的浓硫酸/H2O2混合溶液中，在80℃下将硅片浸泡1h以使其亲水化，将上述的硅片依次放入丙酮、氯仿、乙醇和水中各超声5min，并吹干；
步骤B.用毛细管蘸取质量百分浓度为7.5％的聚甲基丙烯酸甲酯的甲苯溶液，然后接触并滴涂在步骤A得到的基底上，在基底的表面上形成半径为600～800μm的PMMA小点；
步骤C.以步骤B构筑的硅片基底与1H，1H，2H，2H-全氟葵烷基三氯硅烷分子放在密闭的容器内共同加热，在250℃下保持3h，聚甲基丙烯酸甲酯挡层以外的亲水区域就被修饰上了含氟的疏水单分子层；
步骤D.将步骤C得到的修饰好的硅片基底依次放入丙酮、氯仿、乙醇和水中各超声5min除去表面的聚甲基丙烯酸甲酯挡层，从而在表面上形成半径为600～800μm的空白亲水区域，并吹干；
步骤E.在步骤D得到的基底的空白亲水区域中央用PPA-EAPBA梳形分子刷制备半径为300～500μm的来作为中央疏水区域，从而在基底表面上构筑出疏水-亲水-疏水的表面图案化样品板。
4.根据权利要求1所述利用疏水-亲水-疏水区域结构的封闭图案化表面对生物样品进行在线免水洗除盐和同步富集的方法，其特征是：其中，步骤2中构筑的疏水—亲水—疏水区域结构的封闭图案化表面的具体方法中的A步骤，用如下方法替代：硅片基底首先用氧等离子体系统对基底表面进行处理，目的是除去表面残留有机物并使表面羟基化，成为亲水表面，氧气流速60～140ml/min，功率100～300W，处理时间1～10min；再用高纯水对基底表面超声清洗2～3次，每次时间为2～5min，使表面彻底清洁并羟基化。
5.根据权利要求3所述利用疏水—亲水—疏水区域结构的封闭图案化表面对生物样品进行在线免水洗除盐和同步富集的方法，其特征是：其中，步骤2中构筑的疏水—亲水—疏水区域结构的封闭图案化表面的具体方法中的步骤B和E步骤中对于疏水层的制备利用毛细管滴涂完成:毛细管滴涂和蘸笔技术是用毛细管或聚二甲基硅氧烷(PDMS)蘸取分别配置PMMA和PPA-EAPBA梳形分子刷的2.5～7.5wt％甲苯溶液，溶于甲苯溶液，然后接触并滴涂在基底上。
6.根据权利要求3所述利用疏水—亲水—疏水区域结构的封闭图案化表面对生物样品进行在线免水洗除盐和同步富集的方法，其特征是：其中，步骤2中构筑的疏水—亲水—疏水区域结构的封闭图案化表面的具体方法中的步骤C中疏水层的构筑：有以下两种方法：第一种方法是利用1H，1H，2H，2H-全氟癸烷基三氯硅烷(FDTS)分子放在密闭的容器内共同加热，在250℃下保持3h，从而在基底上得到疏水层；第二种方法是利用遮挡板蒸镀技术在挡层以外的基底表面上进行金或银的蒸镀，从而在基底上得到疏水层。
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