CN101303342B - 用于细胞识别与分离的抗体-金壳铁核磁纳米粒子合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供用于细胞识别与分离的抗体-金壳铁核磁纳米粒子合成方法。用肽链表面修饰法使肽链稳定包裹磁纳米粒子，结合表皮生长因子受体抗体与特定肿瘤细胞膜中过表达的表皮生长因子受体相互作用，实现细胞识别。几乎所有特定的肿瘤细胞都被金纳米粒子覆盖，呈现出紫红色。在磁场作用下实现正常细胞与肿瘤细胞分离，分离效果达到90％。与细胞载体传统检测手段的电子显微镜、荧光显微镜等相比较，抗体-磁纳米粒子与细胞作用可由普通光学显微镜观察。样品不需预处理，细胞种类可根据颜色判断；纳米粒子显色性稳定，不会淬灭的性质可使检测样品长时间保存，并且纳米粒子表面表皮生长因子受体抗体的含量可以通过反应液中物质的配比调控。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于细胞识别与分离的抗体-金壳铁核磁纳米粒子合成方法。
技术背景
相对于单一金属纳米粒子，双金属纳米粒子同时具有两种材料的优点，因而有更广泛的应用领域。其中生物分子修饰的金壳铁核磁纳米粒子以其独特的生物相容性、光学和磁学性质可以对细胞进行实时、动态的观测，因此已有一些研究将DNA，蛋白、抗体通过多聚物分子与金壳铁核磁纳米粒子连接利用纳米粒子的光学与磁学性质来实现特定细胞识别与分离(科学，Science，2006，312，1027-1030；生物聚合体化学，Bioconjugate Chem.2004，15，482-490)。然而，在这些研究中，主要利用聚赖氨酸或牛血清蛋白复合物等来稳定纳米粒子，再进一步通过共价键反应结合DNA，蛋白、抗体等功能分子，合成过程复杂，需要较长的反应时间(生物聚合体化学，Bioconjugate Chem.2004，15，482-490)，并且难以克服非特异性吸附使检测的选择性降低。应用多肽修饰的金纳米粒子，可以使纳米粒子在水溶液中保持高稳定性(美国化学会志，J.Am.Chem.Soc.，2004，126，10076-10084)，并容易通过修饰生物素应用生物素-亲和素反应结合DNA，蛋白、抗体等功能分子，实现特异性识别(美国国家科学院院刊，Proc.Natl.Acad.Sc.U.S.A.2006，103，1215-1220)。表皮生长因子受体抗体能通过特异性识别与肿瘤细胞膜中过表达的表皮生长因子受体作用而区分正常细胞与病变细胞。因此，将表皮生长因子受体抗体与胱氨酰丙氨酰亮氨酰天门冬氨酰天门冬氨酰甘氨酰赖氨酰-生物素-甘氨酸修饰的金壳铁核磁纳米粒子相结合获得抗体-金壳铁核磁纳米粒子对实现细胞识别与分离有一定意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有细胞识别与分离功能的抗体-金壳铁核磁纳米粒子合成方法。
生物素修饰的胱氨酰丙氨酰亮氨酰天门冬氨酰天门冬氨酰甘氨酰赖氨酰-生物素-甘氨酸与金原子有很强的亲和性，能够在金壳铁核磁纳米粒子形成致密的保护层，使磁纳米粒子溶于水溶液并保持长期的稳定性且能与亲和素反应。表皮生长因子受体抗体能与特定肿瘤细胞膜中过表达的抗原表皮生长因子受体相互作用，实现细胞识别。本发明结合这两种生物分子的优势，优化合成条件，成功实现了对细胞识别与分离的抗体-金壳铁核磁纳米粒子。并且纳米粒子表面表皮生长因子受体抗体的含量可以通过反应液中表皮生长因子受体抗体和蛋白A的配比调控。
实现本发明的方法的具体的技术方案如下：
按照Lyon方法，先利用10毫升浓度为3.0摩尔/升的氢氧化钠与10毫升浓度均为10毫摩尔/升氯化亚铁和氯化铁混合液相互作用获得四氧化三铁，进一步用10毫升0.02摩尔/升的硝酸在100℃下反应1小时获得三氧化二铁，冷却。在室温下将10毫升溶液含有质量浓度为1％氯金酸，5毫摩尔/升的柠檬酸钠和0.2摩尔/升的盐酸羟氨的混合液分10次，每次间隔10分钟加入所制备的三氧化二铁溶液，获得金壳铁核磁性纳米粒子。其粒径为60纳米。
将多肽胱氨酰丙氨酰亮氨酰天门冬氨酰天门冬氨酰甘氨酰赖氨酰-生物素-甘氨酸与金壳铁核磁性纳米粒子按摩尔比1×105至5×106的配比范围配制成水溶液，在室温下静置反应1小时后，10000rpm离心后抛弃上清液，获得多肽修饰的金壳铁核磁性纳米粒子。
配制亲和素修饰表皮生长因子受体抗体和亲和素修饰的蛋白A摩尔比为1∶0.111-99.9的混合物，将多肽修饰的金壳铁核磁性纳米粒子与亲和素修饰表皮生长因子受体抗体和亲和素修饰的蛋白A的混合物，按摩尔比为1∶1×103-5×104配制成pH值为7的磷酸缓冲溶液，在室温下静置反应1小时后，10000rpm离心后抛弃上清液，再加入1000微升pH值为7磷酸缓冲溶液，获得表皮生长因子受体抗体-磁纳米粒子溶液，再10000rpm离心后抛弃上清液，真空冻干，获得用于细胞识别与分离的抗体-金壳铁核磁纳米粒子。
该纳米粒子可以在-80℃存储6个月不变性。
通过改变亲和素修饰的表皮生长因子受体抗体和亲和素修饰的蛋白A混合物中两种物质的配比，即亲和素修饰表皮生长因子受体抗体和亲和素修饰的蛋白A的摩尔配比范围为1∶0.111-99.9，即可调节用于细胞识别与分离的抗体-金壳铁核磁纳米粒子表面表皮生长因子受体抗体的含量为6％至100％。
本发明提供的一种用于细胞识别与分离的抗体-金壳铁核磁纳米粒子的用法：将培养好的细胞离心富集，用0.1M PBS缓冲溶液1000rpm离心，去除上清液，将10微升1.0纳摩尔/升的用于细胞识别与分离的抗体-金壳铁核磁纳米粒子溶液与1×104个细胞混合均匀，加入40微升培养基在体积比为5％CO2，37℃环境下共培养。30分钟后，即可观察纳米粒子对相应细胞识别作用。作用强度可用细胞颜色判断，颜色越深作用越强。
本发明的有益效果：
(1)、用于细胞识别与分离的抗体-金壳铁核磁纳米粒子合成方法简单，所需时间短。利用生物素修饰的胱氨酰丙氨酰亮氨酰天门冬氨酰天门冬氨酰甘氨酰赖氨酰-生物素-甘氨酸稳定金壳铁核磁性纳米粒子，利用生物素与亲和素的相互作用将表皮生长因子受体抗体修饰到纳米粒子表面实现纳米粒子的细胞识别功能。
(2)、细胞识别具有特异性。表皮生长因子受体抗体能与特定肿瘤细胞膜中过表达的抗原表皮生长因子受体相互作用，实现细胞识别。在我们的实验中，用于细胞识别与分离的抗体-金壳铁核磁纳米粒子一旦与细胞混合，纳米粒子即与相应细胞作用。30分钟后，几乎所有的特定的肿瘤细胞都被纳米粒子覆盖，呈现出紫红色。
(3)、分离效率高。在磁场的作用下实现了正常细胞与肿瘤细胞的分离。分离效果达到90％。
(4)、检测简单直观。相比较细胞载体传统检测手段——电子显微镜，荧光显微镜等，用于细胞识别与分离的抗体-金壳铁核磁纳米粒子与细胞作用可由普通光学显微镜观察。样品不需其他预处理，细胞种类可根据颜色判断：能与纳米粒子相互作用的细胞显现紫红色，明显区别于无作用细胞。纳米粒子的显色性稳定，不会淬灭的性质可使检测样品长时间保存。
(5)用于细胞识别与分离的抗体-金壳铁核磁纳米粒子表面表皮生长因子受体抗体的含量可以通过反应液中物质的配比调控。
附图说明
图1是用本发明中所合成用于细胞识别与分离的抗体-金壳铁核磁纳米粒子水溶液图，简称：抗体-金壳铁核磁纳米粒子溶液图。其具有很好的分散性。
图2在磁场作用下抗体-金壳铁核磁纳米粒子沉积于试管壁的图。其具有很好的磁学性质。
图3纳米粒子表面表皮生长因子受体抗体的百分含量与溶液中表皮生长因子受体抗体的百分含量的关系图。
图4是与抗体-金壳铁核磁纳米粒子作用后的人肾胚胎细胞的明场显微镜照片。细胞为无色。
图5是与抗体-金壳铁核磁纳米粒子作用后的人肾胚胎瘤细胞的明场显微镜照片。细胞呈现淡紫红色。
图6是与抗体-金壳铁核磁纳米粒子作用后的人宫颈癌细胞的明场显微镜照片。细胞呈现深紫红色。
图7是抗体-金壳铁核磁纳米粒子与人宫颈癌细胞与人肾胚胎细胞混合液相互作用后明场显微镜照片。
图8是抗体-金壳铁核磁纳米粒子与人宫颈癌细胞与人肾胚胎细胞混合液相互作用后，磁场下分离后的获得的人肾胚胎细胞图。
图9是抗体-金壳铁核磁纳米粒子与人宫颈癌细胞与人肾胚胎细胞混合液相互作用后，磁场下分离后的获得的人宫颈癌细胞图。
图10是抗体-金壳铁核磁纳米粒子与细胞相互作用后，平均单细胞的暗场散射光强度图。1为293细胞；2为293T细胞；3为HeLa细胞。每种细胞的采集个数为200。
具体实施方式
制备实施例1：表面含100％表皮生长因子受体用于细胞识别与分离的抗体-金壳铁核磁纳米粒子，以下简称为抗体-金壳铁核磁纳米粒子的合成
按照Lyon方法，先利用10毫升浓度为3.0摩尔/升的氢氧化钠与10毫升浓度均为10毫摩尔/升氯化亚铁和氯化铁混合液相互作用获得四氧化三铁，进一步用10毫升0.02摩尔/升的硝酸在100℃下反应1小时获得三氧化二铁，冷却。在室温下将10毫升溶液含有质量浓度为1％氯金酸，5毫摩尔/升的柠檬酸钠和0.2摩尔/升的盐酸羟氨的混合液分10次，每次间隔10分钟加入所制备的三氧化二铁溶液，获得金壳铁核磁性纳米粒子。其粒径为60纳米。
将胱氨酰丙氨酰亮氨酰天门冬氨酰天门冬氨酰甘氨酰赖氨酰(生物素)甘氨酸肽链溶和金壳铁核磁性纳米粒子按摩尔比5×106配制1毫升溶液，在室温下静置反应1小时后，10000rpm离心后抛弃上清液，获得多肽修饰的金壳铁核磁性纳米粒子。
配制亲和素修饰表皮生长因子受体抗体和亲和素修饰的蛋白A摩尔比为1∶99的混合物，简称其为：混合物。将多肽修饰的金壳铁核磁性纳米粒子与混合物按摩尔比1∶5×104配制成1000微升pH值为7的磷酸缓冲溶液，在室温下静置反应1小时后，10000rpm离心后抛弃上清液，再加入1000微升pH值为7磷酸缓冲溶液，获得表皮生长因子受体抗体-磁纳米粒子溶液，再10000rpm离心后抛弃上清液，真空冻干后获得表面含100％表皮生长因子受体抗体的抗体-金壳铁核磁性纳米粒子。
制备实施例2：表面含80％表皮生长因子受体抗体的抗体-金壳铁核磁性纳米粒子合成
按照Lyon方法，先利用10毫升浓度为3.0摩尔/升的氢氧化钠与10毫升浓度均为10毫摩尔/升氯化亚铁和氯化铁混合液相互作用获得四氧化三铁，进一步用10毫升0.02摩尔/升的硝酸在100℃下反应1小时获得三氧化二铁，冷却。在室温下将10毫升溶液含有质量浓度为1％氯金酸，5毫摩尔/升的柠檬酸钠和0.2摩尔/升的盐酸羟氨的混合液分10次，每次间隔10分钟加入所制备的三氧化二铁溶液，获得金壳铁核磁性纳米粒子。其粒径为60纳米。
将胱氨酰丙氨酰亮氨酰天门冬氨酰天门冬氨酰甘氨酰赖氨酰(生物素)甘氨酸肽链溶和金壳铁核磁性纳米粒子按摩尔比1×106配制1毫升溶液，在室温下静置反应1小时后，10000rpm离心后抛弃上清液，获得多肽修饰的金壳铁核磁性纳米粒子。
配制亲和素修饰表皮生长因子受体抗体和亲和素修饰的蛋白A摩尔比为3的混合物，简称其为：混合物。将多肽修饰的金壳铁核磁性纳米粒子将混合物与多肽修饰的金壳铁核磁性纳米粒子按摩尔比1∶1×104配制成1000微升pH值为7的磷酸缓冲溶液，在室温下静置反应1小时后，10000rpm离心后抛弃上清液，再加入1000微升pH值为7磷酸缓冲溶液，获得表皮生长因子受体抗体-磁纳米粒子溶液，再10000rpm离心后抛弃上清液，真空冻干后获得表面含80％表皮生长因子受体抗体的抗体-金壳铁核磁性纳米粒子。
制备实施例3：表面含50％表皮生长因子受体抗体的抗体-金壳铁核磁性纳米粒子合成
按照Lyon方法，先利用10毫升浓度为3.0摩尔/升的氢氧化钠与10毫升浓度均为10毫摩尔/升氯化亚铁和氯化铁混合液相互作用获得四氧化三铁，进一步用10毫升0.02摩尔/升的硝酸在100℃下反应1小时获得三氧化二铁，冷却。在室温下将10毫升溶液含有质量浓度为1％氯金酸，5毫摩尔/升的柠檬酸钠和0.2摩尔/升的盐酸羟氨的混合液分10次，每次间隔10分钟加入所制备的三氧化二铁溶液，获得金壳铁核磁性纳米粒子。其粒径为60纳米。
将胱氨酰丙氨酰亮氨酰天门冬氨酰天门冬氨酰甘氨酰赖氨酰(生物素)甘氨酸肽链溶和金壳铁核磁性纳米粒子按摩尔比5×105配制1毫升溶液，在室温下静置反应1小时后，10000rpm离心后抛弃上清液，获得多肽修饰的金壳铁核磁性纳米粒子。
配制亲和素修饰表皮生长因子受体抗体和亲和素修饰的蛋白A摩尔比为1的混合物，简称混合物。将多肽修饰的金壳铁核磁性纳米粒子将混合物与多肽修饰的金壳铁核磁性纳米粒子按摩尔比1∶2×104配制成1000微升pH值为7的磷酸缓冲溶液，在室温下静置反应1小时后，10000rpm离心后抛弃上清液，再加入1000微升pH值为7磷酸缓冲溶液，获得表皮生长因子受体抗体-磁纳米粒子溶液，再10000rpm离心后抛弃上清液，，真空冻干后获得表面含50％表皮生长因子受体抗体的抗体-金壳铁核磁性纳米粒子。
制备实施例4：表面含10％表皮生长因子受体抗体的抗体-金壳铁核磁性纳米粒子合成
按照Lyon方法，先利用10毫升浓度为3.0摩尔/升的氢氧化钠与10毫升浓度均为10毫摩尔/升氯化亚铁和氯化铁混合液相互作用获得四氧化三铁，进一步用10毫升0.02摩尔/升的硝酸在100℃下反应1小时获得三氧化二铁，冷却。在室温下将10毫升溶液含有质量浓度为1％氯金酸，5毫摩尔/升的柠檬酸钠和0.2摩尔/升的盐酸羟氨的混合液分10次，每次间隔10分钟加入所制备的三氧化二铁溶液，获得金壳铁核磁性纳米粒子。其粒径为60纳米。
将胱氨酰丙氨酰亮氨酰天门冬氨酰天门冬氨酰甘氨酰赖氨酰(生物素)甘氨酸肽链溶和金壳铁核磁性纳米粒子按摩尔比1×105配制1毫升溶液，在室温下静置反应1小时后，10000rpm离心后抛弃上清液，获得多肽修饰的金壳铁核磁性纳米粒子。
配制亲和素修饰表皮生长因子受体抗体和亲和素修饰的蛋白A摩尔比为0.176的混合物，简称混合物。将多肽修饰的金壳铁核磁性纳米粒子将混合物与多肽修饰的金壳铁核磁性纳米粒子按摩尔比1∶5×104配制成1000微升pH值为7的磷酸缓冲溶液，在室温下静置反应1小时后，10000rpm离心后抛弃上清液，再加入1000微升pH值为7磷酸缓冲溶液，获得表皮生长因子受体抗体-磁纳米粒子溶液，再10000rpm离心后抛弃上清液，真空冻干后获得表面含10％表皮生长因子受体抗体的抗体-金壳铁核磁性纳米粒子。
制备实施例5：表面含6％表皮生长因子受体抗体的抗体-金壳铁核磁性纳米粒子合成
按照Lyon方法，先利用10毫升浓度为3.0摩尔/升的氢氧化钠与10毫升浓度均为10毫摩尔/升氯化亚铁和氯化铁混合液相互作用获得四氧化三铁，进一步用10毫升0.02摩尔/升的硝酸在100℃下反应1小时获得三氧化二铁，冷却。在室温下将10毫升溶液含有质量浓度为1％氯金酸，5毫摩尔/升的柠檬酸钠和0.2摩尔/升的盐酸羟氨的混合液分10次，每次间隔10分钟加入所制备的三氧化二铁溶液，获得金壳铁核磁性纳米粒子。其粒径为60纳米。
将胱氨酰丙氨酰亮氨酰天门冬氨酰天门冬氨酰甘氨酰赖氨酰(生物素)甘氨酸肽链溶和金壳铁核磁性纳米粒子按摩尔比1×106配制1毫升溶液，在室温下静置反应1小时后，10000rpm离心后抛弃上清液，获得多肽修饰的金壳铁核磁性纳米粒子。
配制亲和素修饰表皮生长因子受体抗体和亲和素修饰的蛋白A摩尔比为0.111的混合物，简称混合物。将多肽修饰的金壳铁核磁性纳米粒子将混合物与多肽修饰的金壳铁核磁性纳米粒子按摩尔比1∶1×103配制成1000微升pH值为7的磷酸缓冲溶液，在室温下静置反应1小时后，10000rpm离心后抛弃上清液，再加入1000微升pH值为7磷酸缓冲溶液，获得表皮生长因子受体抗体-磁纳米粒子溶液，再10000rpm离心后抛弃上清液，真空冻干后获得表面含6％表皮生长因子受体抗体的抗体-金壳铁核磁性纳米粒子。
用法实施例1：细胞特异性识别
将培养好的293，293T和HeLa细胞分别离心富集，用0.1摩尔/升PBS缓冲溶液1000rpm离心，去除上清液。将10微升1.0纳摩尔/升的抗体-金壳铁核磁纳米粒子溶液与1×104个细胞混合均匀，加入40微升培养基在5％CO2，37℃环境下共培养。在明场显微镜下，作用强度可用细胞颜色判断，颜色越深作用越强(图3)。在暗场显微镜下，作用强度可用细胞散射光判断，散射光越强作用越强(图4)。实验结果表明HeLa细胞与抗体-金壳铁核磁性纳米粒子存在强作用；293T细胞与抗体-金壳铁核磁性纳米粒子存在弱作用；293细胞与抗体-金壳铁核磁性纳米粒子无作用。
用法实施例2：细胞分离
将培养好的293和HeLa细胞混合液离心富集，用0.1摩尔/升PBS缓冲溶液1000rpm离心，去除上清液。将10微升1.0纳摩尔/升的抗体-金壳铁核磁纳米粒子溶液与1×104个细胞混合均匀，加入40微升培养基在5％CO2，37℃环境下共培养。30分钟后，在磁场作用下实现细胞分离(图5)。
Claims (5)
1.用于细胞识别与分离的抗体-金壳铁核磁纳米粒子合成方法，其特征在于步骤和条件为：按照Lyon方法，先利用10毫升浓度为3.0摩尔/升的氢氧化钠与10毫升浓度均为10毫摩尔/升氯化亚铁和氯化铁混合液相互作用获得四氧化三铁，进一步用10毫升0.02摩尔/升的硝酸在100℃下反应1小时获得三氧化二铁，冷却，在室温下将10毫升溶液含有质量浓度为1％氯金酸，5毫摩尔/升的柠檬酸钠和0.2摩尔/升的盐酸羟氨的混合液分10次，每次间隔10分钟加入所制备的三氧化二铁溶液，获得金壳铁核磁性纳米粒子；
将多肽胱氨酰丙氨酰亮氨酰天门冬氨酰天门冬氨酰甘氨酰赖氨酰-生物素-甘氨酸与金壳铁核磁性纳米粒子按摩尔比1×105至5×106的配比范围配制成水溶液，在室温下静置反应1小时后，10000rpm离心后抛弃上清液，获得多肽修饰的金壳铁核磁性纳米粒子；
配制亲和素修饰表皮生长因子受体抗体和亲和素修饰的蛋白A摩尔比为1∶0.111-99.9的混合物，将多肽修饰的金壳铁核磁性纳米粒子与亲和素修饰表皮生长因子受体抗体和亲和素修饰的蛋白A的混合物，按摩尔比为1∶1×103-5×104配制成pH值为7的磷酸缓冲溶液，在室温下静置反应1小时后，10000rpm离心后抛弃上清液，再加入1000微升pH值为7磷酸缓冲溶液，获得表皮生长因子受体抗体-磁纳米粒子溶液，再10000rpm离心后抛弃上清液，真空冻干，获得用于细胞识别与分离的抗体-金壳铁核磁纳米粒子。
2.如权利要求1所述的用于细胞识别与分离的抗体-金壳铁核磁纳米粒子合成方法，其特征在于，所述的多肽修饰的金壳铁核磁性纳米粒子与与亲和素修饰的表皮生长因子受体抗体和亲和素修饰的蛋白A的混合物的摩尔比为1∶5×104。
3.如权利要求1所述的用于细胞识别与分离的抗体-金壳铁核磁纳米粒子合成方法，其特征在于，所述的多肽修饰的金壳铁核磁性纳米粒子与亲和素修饰的表皮生长因子受体抗体和亲和素修饰的蛋白A的混合物的摩尔为1∶1×104。
4.如权利要求1所述的用于细胞识别与分离的抗体-金壳铁核磁纳米粒子合成方法，其特征在于，所述的多肽修饰的金壳铁核磁性纳米粒子与亲和素修饰的表皮生长因子受体抗体和亲和素修饰的蛋白A的混合物的摩尔为1∶2×104。
5.如权利要求1所述的用于细胞识别与分离的抗体-金壳铁核磁纳米粒子合成方法，其特征在于，所述的多肽修饰的金壳铁核磁性纳米粒子与亲和素修饰的表皮生长因子受体抗体和亲和素修饰的蛋白A的混合物的摩尔为1∶1×103。
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|---|
| Jie Bao et al.Bifunctional Au-Fe3O4 Nanoparticles for Protein Separation.《ACS NANO》.2007,第1卷(第4期),293-298. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN101303342A (zh) | 2008-11-12 |
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