CN102344920B

CN102344920B - 一种用金磁微粒纯化植物种子基因组dna的方法

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Publication number: CN102344920B
Application number: CN 201110314976
Authority: CN
Inventors: 崔亚丽; 魏旭旭; 晁旭; 张景阁; 赵稳操; 李谭杰
Original assignee: Xi'an Goldmag Nanobiotech Co Ltd
Current assignee: Xi'an Goldmag Nanobiotech Co Ltd
Priority date: 2011-10-17
Filing date: 2011-10-17
Publication date: 2013-08-14
Anticipated expiration: 2031-10-17
Also published as: CN102344920A

Abstract

本发明提供一种利用磁性纳米复合材料进行简便、快速纯化多种植物种子基因组DNA的方法。本发明样品裂解是取植物种子样本，加入200～800μl含有质量体积比为2％～5％的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、2％～5％的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和体积分数为0.5％～2％β-巯基乙醇的裂解液；混匀后于水浴中充分裂解5～30min，再加入10～50μl的10mg/ml RNase溶液，得到含有基因组DNA的样品裂解液。本发明采用的裂解液，适用于所有植物种子。得到的基因组DNA不含有抑制下游PCR反应的抑制剂；DNA质量高、得率高，DNA完整性好。

Description

一种用金磁微粒纯化植物种子基因组DNA的方法

技术领域

本发明涉及一种提取植物种子基因组DNA的方法。

背景技术

转基因技术自70年代问世以来，已在多种作物品种改良得到应用。利用该项技术，不仅在品种间，而且在不同科属种间可以进行性状转移；克服远缘杂交的不亲合性；改良作物品质；提高作物抗逆性；从而实现多种目标性状的转移。实践证明，该项技术在作物品种改良方面具有广阔的应用前景，是一种行之有效的育种新途径。在该技术实现过程中，对植物种子基因组DNA提取及纯化非常关键。

核酸纯化方法大体上可分为两种，一种是酚氯仿抽提液相纯化法，一种是固相纯化法。酚氯仿抽提法主要通过有机相-水相分配来除去杂质达到纯化核酸的目的。固相纯化法则通过核酸与固相介质的非特异可逆性结合，从而达到纯化核酸的目的，其结合方式主要包括吸附结合和离子交换结合。

传统的几种植物种子基因组DNA提取方法存在一些缺点。如CTAB法和SDS法需要酚氯仿反复抽提与离心，耗费大量的时间，人力、物力。此外，现有的植物种子基因组DNA纯化的文献报道基本上都是针对一种植物，如针对含多糖较高的植物如水稻、含脂质较多的植物如棉花籽或含蛋白较多的植物如黄豆等开发的有针对性的方法。因为不同植物的组织材料，由于其化学成分、组织结构等差异，在提取基因组DNA时需选择不同的方法或作一些特殊的处理，这为实验带来极大的不便。目前，从植物种子样本中纯化DNA的试剂盒还较少，其中又以离心柱法为其主流的手动操作方法，价格昂贵且步骤繁琐，不利于广大科研系统使用，纯化效果也不理想。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用磁性纳米复合材料进行简便、快速纯化多种植物种子基因组DNA的方法，以解决背景技术操作不便、成本较高、纯度低、纯化率低等问题。

本发明的技术方案：

一种用金磁微粒纯化植物种子基因组DNA的方法，包括以下步骤：

1)制备含有基因组DNA的样品裂解液

取植物种子样本，加入200～800μl含有质量体积比为2％～5％的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、2％～5％的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和体积分数为0.5％～2％β-巯基乙醇的裂解液；混匀后于水浴中充分裂解5～30min，再加入10～50μl的10mg/ml RNase溶液，得到含有基因组DNA的样品裂解液；(“质量体积比”的单位即g/ml，表示该溶质的质量与该种裂解液的体积的比)

2)用氯仿抽提后离心

用0.6ml～1.2ml氯仿在所述样品裂解液中进行样本抽提，然后8000rpm～13000rpm离心5min，得到含有基因组DNA的上清；

3)结合

取400～1000μg金磁微粒与含有基因组DNA的上清混合，在结合缓冲液的作用下，形成含有金磁微粒-基因组DNA复合物的溶液；

4)清洗

对含有金磁微粒-基因组DNA复合物的溶液进行磁性分离，弃去上清液，再加入清洗液混匀，磁性分离，弃上清，得到金磁微粒-基因组DNA复合物；

5)洗脱

将洗脱液与金磁微粒-基因组DNA复合物混匀，使基因组DNA从金磁微粒上转到洗脱液中，磁性分离直至上清澄清，收集上清液，所得上清液即为纯化得到的基因组DNA溶液。

上述步骤1)中所述裂解液含有质量体积比为2％～5％的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、2％～5％的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和体积分数为0.5％～2％β-巯基乙醇、0.005～0.01M乙二胺四乙酸(EDTA)、0.5～2M NaCl和0.05～0.2MTris-HCl。

上述步骤3)中的结合缓冲液优选聚乙二醇与氯化钠的混合溶液，其中氯化钠的终浓度为1M～3M，聚乙二醇(PEG)的分子量在6000～10000之间，浓度为10％～30％；也可以采用公知的其他结合缓冲液。

上述步骤5)中所述洗脱液优选含有10mM Tris-HCl和1mM EDTA、pH＝8.0的TE溶液或无核酶水。

上述步骤2)采用氯仿只需进行一次样本抽提。

上述步骤4)中所述清洗液是50％～85％的乙醇。

上述步骤1)中所述水浴的最佳温度为50～65℃。

本发明的优点：

1、本发明采用的裂解液，适用于所有植物种子。

2、得到的基因组DNA不含有抑制下游PCR反应的抑制剂；DNA质量高、得率高，DNA完整性好。

3、不需要反复抽提与离心，减少了机械使用中的物理性剪切，亦避免了离心过程对基因组DNA的破坏。

4、不需要分步裂解，步骤简便，时间短，全部过程只需要45～60min左右(根据不同种子，只需调整裂解时间即可)，从而大大缩短了提取DNA的时间。

5、该纯化方法操作简便，纯化过程快速，成本低廉。

附图说明

图1是从种子中提取的基因组DNA的电泳图；

其中泳道M：λHind III；

泳道1：从黄豆中提取的基因组DNA；

泳道2：从油菜籽中提取的基因组DNA；

泳道3：从玉米中提取的基因组DNA。

具体实施方式

利用磁性载体进行核酸纯化是近年来发展起来的一种DNA纯化的思路，即利用具有超顺磁性的纳米或微米级球形颗粒作为固相介质来非特异性的吸附核酸，在外加磁场的作用下将DNA-磁性微粒复合体与蛋白质、多糖等杂质分离开来，可省去反复离心、过滤等繁杂的操作，减少了过多的机械剪切作用对核酸造成的损伤，而当撤去磁场后，磁性微粒很快均匀分散于溶液中。由于它具有操作简便、纯度高等特点，越来越受到人们的亲睐，并且它易于实现自动化，满足了样本中大规模建库等高通量操作的需求。

金磁微粒是指采用以磁性纳米粒子或磁性纳米粒子的聚集体为核，在核表面包裹单质金、银等贵金属壳层形成的磁性复合微粒，也指以磁性纳米粒子或磁性纳米粒子的聚集体为核，在核表面组装纳米金、银等贵金属粒子形成的磁性复合微粒。所述磁性纳米粒子包括Fe₃O₄、γ-Fe₂O₃等铁的氧化物粒子，单质Fe、Co、Ni粒子，或由Fe与其它金属元素形成的正铁酸盐粒子；磁性纳米粒子的聚集体是指经修饰后形成的Fe3O4、γ-Fe2O3等铁的氧化物粒子聚集体，经修饰后形成的单质Fe、Co、Ni粒子聚集体，或经修饰后形成的Fe与其它金属元素形成的正铁酸盐粒子聚集体。

以下结合实施例对本发明即金磁微粒纯化植物种子基因组DNA的方法进一步的说明。

实施例1：用金磁微粒从黄豆中纯化基因组DNA的方法

1)植物样本裂解

1.1)称取大于100mg的黄豆，用研钵研磨至细粉状，后准确称取100mg置于2ml离心管中，加入300μl裂解液1【2％～5％聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、2％～5％十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、0.5％～2％β-巯基乙醇、0.005～0.01M乙二胺四乙酸(EDTA)、0.5～2M NaCl，0.05～0.2M Tris-HCl】，涡旋混匀，于65℃水浴25min(期间每隔5min颠倒离心管1次)，取出离心管，室温静置1min；

1.2)在离心管中加入30μl 10mg/ml的RNase溶液，吹吸混匀，于37℃水浴5min，取出离心管。

2)氯仿抽提

在离心管中加入0.7ml氯仿，轻摇5min充分混匀离心管中成分，于室温，8000rpm～13000rpm离心5min。

3)结合

3.1)充分摇匀金磁微粒，用移液器移取100μl金磁微粒于2ml离心管中，磁性分离1min，弃上清。从磁性分离器上取出离心管，加入200μl结合液，吹吸混匀。

3.2)从离心机中取出离心管，吸取上清(此步骤尽量小心吸取上清约300μl，勿吸取到有机相)于步骤3.1)的离心管中，吹吸混匀，于室温充分结合，室温静置5min，磁性分离2min，弃上清。

4)清洗

4.1)在离心管中加入200μl清洗液1，移液器吹吸混匀，磁性分离2min，尽量弃上清。

4.2)在离心管中加入200μl清洗液2，移液器吹吸混匀，磁性分离2min，尽量弃上清。重复此步骤一次。

5)洗脱

打开离心管盖，将离心管置于磁性分离器上室温晾干5min。在离心管中加入100μl洗脱液(10mM Tris-HCl、1mM EDTA、pH＝8.0)，移液器吹打混匀，于60℃水浴5min。磁性分离直至上清澄清，上清即为纯化的基因组DNA，将上清转移到另一离心管中，可直接用于后续实验或于-20℃低温保存。

根据紫外测得结果显示，从100mg的黄豆中可以得到15～25μg的基因组DNA，纯度在1.7～1.9之间。

实施例2：用金磁微粒从油菜籽中纯化基因组DNA的方法

1)植物样本裂解

1.1)称取大于100mg的油菜籽，用研钵研磨至细粉状，后准确称取100mg置于2ml离心管中，加入200μl裂解液1【2％～5％聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、2％～5％十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、0.5％～2％β-巯基乙醇、0.005～0.01M乙二胺四乙酸(EDTA)、0.5～2M NaCl，0.05～0.2M Tris-HCl】，涡旋混匀，于65℃水浴25min(期间每隔5min颠倒离心管1次)，取出离心管，室温静置1min；

1.2)在离心管中加入40μl 10mg/ml的RNase溶液，吹吸混匀，于37℃水浴5min，取出离心管。

2)氯仿抽提

在离心管中加入0.6ml氯仿，轻摇5min充分混匀离心管中成分，于室温，8000rpm～13000rpm离心5min。

3)结合

4)清洗

5)洗脱

根据紫外测得结果显示，从100mg的油菜籽中可以得到10～20μg的基因组DNA，纯度在1.7～1.9之间。

实施例3：用金磁微粒从玉米中纯化基因组DNA的方法

1)植物样本裂解

1.1)称取大于100mg的玉米，用研钵研磨至细粉状，后准确称取100mg置于2ml离心管中，加入200μl裂解液1【2％～5％聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、2％～5％十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、0.5％～2％β-巯基乙醇、0.005～0.01M乙二胺四乙酸(EDTA)、0.5～2M NaCl，0.05～0.2M Tris-HCl】，涡旋混匀，于65℃水浴30min(期间每隔5min颠倒离心管1次)，取出离心管，室温静置1min；

1.2)在离心管中加入50μl 10mg/ml的RNase溶液，吹吸混匀，于37℃水浴5min，取出离心管。

2)氯仿抽提

在离心管中加入0ml氯仿，轻摇5min充分混匀离心管中成分，于室温，8000rpm～13000rpm离心5min。

3)结合

4)清洗

5)洗脱

根据紫外测得结果显示，从100mg的玉米中可以得到5～10μg的基因组DNA，纯度在1.7～1.9之间。

Claims

1.一种用金磁微粒纯化植物种子基因组DNA的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

1)制备含有基因组DNA的样品裂解液

取植物种子样本，加入裂解液；混匀后于水浴中充分裂解5～30min，再加入10～50μl的10mg/ml RNase溶液，得到含有基因组DNA的样品裂解液；

2)用氯仿抽提后离心

3)结合

4)清洗

5)洗脱

将洗脱液与金磁微粒-基因组DNA复合物混匀，使基因组DNA从金磁微粒上转到洗脱液中，磁性分离直至上清澄清，收集上清液，所得上清液即为纯化得到的基因组DNA溶液；

上述步骤1)中所述裂解液的成分是：质量体积比为2%～5%的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、2%～5%的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和体积分数为0.5%～2%β-巯基乙醇、0.005～0.01M乙二胺四乙酸(EDTA)、0.5～2M NaCl和0.05～0.2M Tris-HCl；

上述步骤3)中的结合缓冲液是聚乙二醇与氯化钠的混合溶液，其中氯化钠的终浓度为1M～3M，聚乙二醇（PEG）的分子量在6000～10000之间，浓度为10%～30%；

步骤5）中所述洗脱液是TE溶液或者无核酶水；其中，TE溶液的成分是10mM Tris-HCl、1mM EDTA，pH=8.0；

步骤2）采用氯仿只进行一次样本抽提；

步骤4）中所述清洗液是50%～85%的乙醇；

步骤1）中所述水浴的温度为50～65℃。