CN101535501A - 提取核酸的方法 - Google Patents

提取核酸的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN101535501A
CN101535501A CNA200780009268XA CN200780009268A CN101535501A CN 101535501 A CN101535501 A CN 101535501A CN A200780009268X A CNA200780009268X A CN A200780009268XA CN 200780009268 A CN200780009268 A CN 200780009268A CN 101535501 A CN101535501 A CN 101535501A
Authority
CN
China
Prior art keywords
nucleic acid
solid phase
rna
group
mixture
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CNA200780009268XA
Other languages
English (en)
Inventor
哈希姆·阿哈万-塔夫蒂
雷努卡·德席尔瓦
罗伯特·A·艾克霍尔特
迈克尔·E·马泽利斯
谢文华
理查德·S·汉德利
莫尼卡·A·布雷
米歇尔·L·马斯特罗纳尔迪
伊利莎白·A·奥康纳
萨拉达·西里普拉普
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nexgen Diagnostics LLC
Original Assignee
Nexgen Diagnostics LLC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nexgen Diagnostics LLC filed Critical Nexgen Diagnostics LLC
Publication of CN101535501A publication Critical patent/CN101535501A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/02—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with ribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

本发明公开了用于从生物样品中快速简便地提取和分离核酸、尤其是RNA的方法和材料，其涉及先使用碱性试剂、随后使用酸性溶液和固相结合材料，所述固相结合材料具有在不首先进行预裂解以破坏细胞或病毒的情况下释放生物样品中核酸的能力，所述生物样品包括全血。其中不需要或者不使用用于裂解细胞或病毒的去污剂或离液物质。可使用本发明方法获得病毒、细菌和哺乳动物基因组RNA。本发明方法所获得的RNA适用于下游过程例如RT－PCR。

Description

提取核酸的方法
相关申请的交叉引用
本申请是2006年2月16日提交的共同未决美国临时申请No.60/773,881的部分继续申请。
技术领域
本发明涉及用于捕获和提取核糖核酸(特别是来自生物来源材料的核糖核酸)的简化方法中的材料。
背景技术
应用到临床研究、临床诊断测试和药物开发中的现代分子生物学方法越来越多地利用了核糖核酸(RNA)的研究。RNA以信使RNA(mRNA)、转运RNA(tRNA)和核糖体RNA(rRNA)的形式存在。一些现代分子生物学技术例如Northern印迹、核糖核酸酶保护测定和RT-PCR需要在分析之前分离纯的未降解的RNA。对特定mRNA序列的存在性以及mRNA表达水平的研究已经大量应用。分析mRNA(尤其是使用微阵列)是分子生物学研究中的有力工具。通过测定样品中mRNA序列的水平可以确定单个基因的上调或下调。mRNA水平可以作为外部刺激或疾病状态的函数而被评估。例如，p53mRNA水平的变化与多种细胞类型的癌症正相关。
另外，许多对人类健康有重大影响的病毒(包括HIV、HCV、西尼罗河病毒、马脑炎病毒和埃博拉病毒)具有RNA基因组。从体液或组织中快速且清洁地提取病毒RNA的能力对于病毒学研究和传染病诊断及治疗是重要的。
当前提取RNA的方法从多种方法之一开始，以破坏或裂解细胞、释放RNA进入溶液以及防止RNA被内源RNA酶降解。裂解将RNA与DNA和蛋白质一道释放出来，然后必须再从中分离RNA。之后，处理所述RNA以将其溶解或沉淀。Chirgwin等，Biochem，18，5294-5299(1979)公开了使用离液胍盐以同时裂解细胞、溶解RNA和抑制RNA酶。另一些方法通过在低pH下用苯酚/氯仿提取将溶解的RNA与蛋白质和DNA相分离(D.M.Wallace，Meth.Enzym.，15，33-41(1987))。常用的一步法RNA分离包括依次用4M胍盐、醋酸钠(pH4)、苯酚和氯仿/异戊醇处理细胞。将样品离心，通过加入乙醇将RNA从上层中沉淀出来(P.Chomczynski，Anal.Biochem.，162，156-159(1987))。美国专利4,843,155描述了一种方法，其中将酸性pH下的苯酚和胍盐稳定混合物加入到细胞。在使用氯仿进行相分离之后，通过用乙醇沉淀回收水相中的RNA。
另一些方法包括将热苯酚加入到细胞混悬液中，然后进行乙醇沉淀(T.Maniatis等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory(1982))；使用阴离子或非离子表面活性剂以裂解细胞并释放细胞质RNA；以及使用RNA酶抑制剂例如氧钒核糖核苷复合物(vanadyl riboside complex)和焦碳酸二乙酯(L.G.Davis等，“Guanidine Isothiocyanate Preparation of Total RNA”和“RNApreparation：Mini Method”in Basic Methods in Molecular Biology，Elsevier，New York，pp.130-138(1991))。
美国专利5,234,809(Boom等)中公开了通过结合于玻璃或其它固相之上从生物来源中同时分离DNA和RNA的技术。通过暴露于含EDTA和表面活性剂Triton X-100的Tris HCl(pH8.0)中的强(>5M)硫氰酸胍溶液来裂解生物来源(例如血清或尿)中的细胞。通过与硅藻土或二氧化硅颗粒(其与DNA和RNA形成可逆的复合物)一起孵育从生物材料中纯化DNA和RNA。
Gillespie的美国专利5,155,018提供了从生物来源中分离和纯化生物活性RNA的方法，所述生物来源还可以包括DNA、蛋白质、碳水化合物和其它细胞物质。通过在包含浓的酸性离液盐的结合溶液存在下使生物来源接触玻璃细粉或硅藻土来分离RNA。在这些条件下，其声称RNA选择性地结合颗粒化的硅材料，但是还公开了用乙醇盐溶液处理固体物质以除去DNA。其它研究人员后来的工作证实了确实有DNA污染。结合到所述颗粒的RNA很容易与样本中所含的其它生物物质相分离。优选地，清洗与颗粒结合的RNA以除去非特异性吸附的物质。通过用稀的盐缓冲液洗脱来释放结合的RNA，从而回收基本纯的生物活性RNA。还公开了加入核酸酶以除去洗脱液中的DNA，这带来了对选择性结合RNA的权利要求的进一步质疑。Kuroita等的US 5,990,302给出了Gillespie方法的变型，其通过将样品、离液剂、锂盐、酸溶液和核酸载体合并来分离RNA。Ekenberg的US 6,218,531提供了另一种改进，其中将含有RNA和杂质的溶液与稀释缓冲液混合以形成澄清的裂解液，然后将RNA与二氧化硅固相结合。通过沉淀DNA和蛋白质使之澄清。所述稀释缓冲液可以是水，但更优选是具有中性pH的缓冲液例如SSC，其中含有盐并且更优选含有去污剂例如SDS。
美国专利5,010,183和5,985,572描述了带一价电荷的单体阳离子表面活性剂裂解细胞并将RNA和DNA从溶液中同时沉淀下来的能力。在这些专利中，首先使RNA为不可溶的。在’183专利的方法中，季铵表面活性剂和40％尿素以及其它添加剂的溶液被加入到细胞混悬液中，将混合物离心。沉淀重悬于乙醇中，通过加入盐使核酸从其中沉淀下来。
Michelsen等的U.S.6,355,792公开了以下分离核酸的方法，即用pH小于6.5的缓冲液酸化液体样品，将所酸化的溶液与带羟基的无机氧化物材料接触，将结合有核酸的固相材料与液体分离，以及用pH在7.5至11(优选8-8.5)的碱性溶液洗脱。酸性溶液不含离子型去污剂，离液剂和任何离子<0.2M。已经完成的实例反映出，所述方法的使用具有下述前提，即核酸在被捕获之前已经释放到溶液中。
WO00/66783和EP1206571B1公开了分离样品中游离的细胞外核酸的方法，即通过使怀疑含有核酸的样品在pH小于7的条件下接触水溶性的弱碱性聚合物使得弱碱性聚合物与样品中所有核酸形成水不溶性沉淀，将水不溶性沉淀与样品分离，以及将所述沉淀与碱接触以提高溶液的pH至高于7，由此从弱碱性聚合物中释放核酸。所述聚合物含有在酸性pH下质子化但是通过升高pH可被中和的氨基。
Backus等的US5,582,988和EP 0707077 B1公开了提供了来自裂解物的核酸的方法，其包括以下步骤：在小于7的pH条件下，使怀疑含有核酸的裂解物与足量的水溶性弱碱性聚合物接触使得所述弱碱性聚合物与所述裂解物中的核酸形成水不溶性沉淀，从所述裂解物中分离所述水不溶性沉淀，将所述沉淀与碱接触以提高溶液pH至大于7，由此从所述弱碱性聚合物中释放所述核酸。
Heath的US 5,973,137公开了从生物样品中分离基本未降解的RNA的方法，即使用由阴离子去污剂、螯合剂和pH小于6的缓冲溶液组成的细胞裂解试剂处理样品。所述阴离子去污剂的作用据信是裂解细胞和/或溶解蛋白质和脂类以及使蛋白质变性。当用于从全血中分离RNA时，首先用含NH4Cl、NaHCO3和EDTA的试剂裂解红细胞。分离白细胞以及在蛋白质-DNA沉淀试剂存在下独立地裂解白细胞。所述沉淀试剂通常是高浓度的钠盐或钾盐(例如醋酸盐或盐酸盐)。最后的步骤是通过加入低级醇使含RNA的上清沉淀。从酵母和革兰氏阳性菌中分离RNA需要另外使用裂解酶、甘油和氯化钙以消化制备物中的细胞从而释放核酸。
Collis的US 5,973,138公开了用于使核酸与酸性溶液中顺磁颗粒混悬液可逆性结合。此方法中所公开的颗粒是裸露的铁氧化物、铁硫化物或铁氯化物。所述酸性溶液被认为增强所述颗粒铁部分的正电性，由此促进核酸的负电磷酸基团的结合。相关美国专利6,433,160公开了相似的方法，其中所述酸性溶液含有盐酸甘氨酸。
Bhikhabhai的U.S.6,410,274公开了通过在不溶性基质上进行分离来纯化质粒DNA的方法，其包括a)裂解细胞；b)用二价金属离子沉淀大多数染色体DNA和RNA；c)除去所述沉淀；d)用阴离子交换树脂纯化所述裂解液(使用pH4-6的酸性缓冲液，然后使用更为碱性的缓冲液)；和e)进一步用第二离子交换树脂纯化所述质粒。
Cros等的US 6,737,235公开了使用包含或包被了含阳离子基团的亲水交联聚丙烯酰胺聚合物的颗粒来分离核酸的方法。通过所述聚合物上胺基在低pH下的质子化形成阳离子基团。在低离子强度缓冲液中低pH条件下结合核酸，在更高离子强度缓冲液中释放。所述聚合物必须具有25-45℃的较低临界溶解温度。碱性pH和较高温度也促进解吸附。
Simms的U.S.6,875,857公开了从植物材料中分离RNA的方法和试剂，其使用了包含非离子表面活性剂IGEPAL、EDTA、阴离子表面活性剂SDS和高浓度2-巯基乙醇的试剂组合物。
Sprenger-Haussels的US 7,005,266公开了用于从含核酸加工酶抑制剂的样品(例如粪便)中纯化、稳定或分离核酸的方法，其通过匀浆样品，然后用pH2-7、盐浓度>100mM并且含苯酚中和物质(例如聚乙烯吡咯烷酮)并任选地含有去污剂和螯合剂的溶液处理所匀浆样品以形成裂解物。然后在基于二氧化硅的常规固相材料上处理所述裂解物。
例如US 6,270,970、6,310,199、US5,652,348、US 5,945,520、WO96/09116、WO99/029703、EP1234832A3、EP1036082B1、U.S.专利申请公开2001/0018513、2003/0008320和2003/0054395等的一些专利和申请公开了将核酸可逆地捕获到结合材料上，其是由结合和洗脱缓冲液之间pH变化改变结合材料上胺基的质子化状态来介导的。类似的，Bayer等的US6,447,764公开了从含水系统中分离阴离子有机物质(包括核酸)的方法，这是通过可逆地结合阳离子质子化形式的非交联聚合物纳米颗粒，将它们从介质中分离以及提高pH使所述颗粒去质子化以释放所述阴离子有机物质来实现的。
Kausch等的U.S.5,665,582公开了可逆地将生物材料锚定到固体支持物上的方法，其包括将可逆聚合物置于固体支持物上，将可逆接头连接到所述聚合物，以及使用结合组合物将生物材料连接到可逆接头，所述结合组合物包含核酸、抗体、抗独特型抗体或蛋白A，以使得所述生物材料可逆地锚定到固体支持物上，其中所述生物材料可以是核酸。
Burgoyne的US 5,756,126公开了用于保存遗传材料样品的干燥固体介质，所述介质包含固体基质和吸附到所述基质的组合物，所述组合物包含弱碱、螯合剂和阴离子去污剂。
Fomovskaia等的US6,746,841公开了纯化核酸的方法，其中一部分包括提供了包含由用于细胞裂解的阴离子表面活性剂所包被的固体基质的干燥基底，将样品施加到所述基底以及捕获核酸。捕获RNA的用途并未具体公开或举例说明。
Figure A200780009268D0009105234QIETU
等的美国申请2004/0014703公开了在酸性pH下用含季铵或季鏻盐化合物和质子供体(例如有机羧酸、硫酸铵或磷酸盐)的组合物稳定RNA。
GB2419594 A1公开了用氨基表面活性剂以及任选地用非离子表面活性剂稳定核酸。
Augello的美国专利6,602,718、6,617,170和6,821,789和美国专利申请公开2005/0153292公开了通过抑制或阻断基因诱导或核酸降解来保存生物样品(例如全血)和保存RNA和/或DNA的方法。所述基因诱导阻断剂可包含稳定剂和酸性物质。阳离子去污剂是优选的稳定剂。后者裂解细胞并造成核酸作为与所述去污剂的复合物而沉淀。
US 6,916,608公开了稳定核酸的方法和组合物，其包含与二甲亚砜相混合的醇和/或酮。
美国专利6,204,375和6,528,641公开了稳定细胞RNA成分的方法，其通过将例如pH4-8的硫酸铵盐溶液加入到细胞来进行。所述盐溶液使细胞透化，造成RNA与细胞蛋白质一起沉淀，使得RNA不能接近可能会使其降解的核酸酶。
分离RNA的上述方法麻烦的多步骤特征使得RNA在临床实践中的应用复杂化。方法必须克服在RNA被核酸酶(例如RNA酶)降解之前将RNA与细胞中的蛋白质和DNA分离开来的困难。这些核酸酶存在于血液中，其量足以快速破坏未保护的RNA。因此，从细胞分离RNA的成功方法必须能够阻止RNA酶的降解。本领域中仍然需要快速简便地从生物样品中提取RNA的方法。这些方法将使RNA的水解和降解最小化，使得其可用于多种分析和下游过程。
共同拥有的美国专利申请公开2005/0106576、2005/0106577、2005/0106589、2005/0106602、2005/0136477、2006/0234251和临时申请S/N60/771,510公开了用于从生物材料中提取核酸(包括RNA)的材料和方法。所述方法依赖于用于破坏细胞或病毒的独特类型的固体材料，并且不需要进行化学裂解处理。
发明内容
在一个方面，本发明提供了快速简便地从生物样品中提取和分离核酸的新方法，其包括先使用碱性试剂随后使用酸性溶液和固相结合材料。实施本发明中所用的固相结合材料具有快速捕获核酸的能力。所述固相结合材料可以包含季铵基团、季鏻基团或叔锍基团。
在另一个方面，本发明提供了从生物样品中提取和/或纯化DNA的方法，其包括先使用碱性试剂随后使用酸性溶液和固相结合材料，所述固相结合材料具有基质部分和鎓基(onium)并且另外还包含连接基质部分和鎓基的可切割接头，其中所述鎓基选自季铵基团、季鏻基团和叔锍基团。
在另一个方面，本发明提供了从生物样品中提取和/或纯化RNA的方法，其包括先使用碱性试剂随后使用酸性溶液和固相结合材料，所述固相结合材料具有基质部分和鎓基并且另外还包含连接基质部分和鎓基的可切割接头，其中所述鎓基选自季铵基团、季鏻基团和叔锍基团。
发明详述
定义
烷基：含有1-20个碳的支链、直链或者环状的烃基，所述烃基可以被1个或更多个除氢之外的取代基所取代。本文中所使用的低级烷基指含有可多达8个碳的烷基。
芳烷基：芳基取代的烷基。
芳基：含有1-5个碳环芳香环的含芳香环基团，其可被1个或更多个除氢之外的取代基所取代。
生物材料或生物样品：包括全血、抗凝全血、血浆、血清、组织、细胞、细胞成分和病毒。
细胞材料：完整细胞或包含动物、植物或细菌来源的完整细胞的材料(包括组织)。细胞可以是完整的活性代谢细胞、凋亡细胞或死细胞。
细胞核酸成分：指细胞材料内的核酸，其可以是基因组DNA和RNA以及其它核酸，例如来自传染性物质(例如病毒和质粒)的核酸。
磁性颗粒：对外部磁场有响应的颗粒、微颗粒或珠子。所述颗粒自身可以具有磁性、顺磁性或超顺磁性。当使用超顺磁或铁磁材料时它可被外部磁体或施加的磁场所吸引。颗粒可以具有固体核心部分，所述核心部分是磁响应的并且被一个或多个非磁响应层所包围。作为替代，所述磁响应部分可以是围绕非磁响应核心的层或者可以是置于非磁响应核心之中的颗粒。
核酸：多核苷酸可以是DNA、RNA或合成的DNA类似物例如PNA。这三种链类型中任何类型的单链化合物和双链杂合物也包含在此术语的范围内。
释放、洗脱：通过与溶液或组合物相接触以移除绝大部分结合在固相材料表面或孔的材料。
RNA：包括但不限于信使RNA(mRNA)、转运RNA(tRNA)和核糖体RNA(rRNA)。
样品：含有或者怀疑含有核酸的液体。可用于本发明方法的典型样品包括体液，例如血液(其可以是如通常在收集血液样品中发现的抗凝血)、血浆、血清、尿、精液、唾液、细胞培养物、组织提取物等。其它类型的样品包括溶剂、海水、工业水样、食物样品和环境样品(例如土壤或水)、植物材料、真核生物、细菌、质粒和病毒、真菌、以及来自原核生物的细胞。
固相材料：具有能够吸引核酸分子之表面的材料。材料的形式可以是颗粒、微颗粒、纳米颗粒、纤维、珠子、膜、滤器(filter)和其它支持物(例如试管和微孔)。
取代：指基团上的至少一个氢原子被非氢基团所替代。应注意，关于取代基，除非另有明确指出，其意为可以存在多点取代。
本发明涉及用于从生物样品中快速简便地获得核酸(NA)的方法。所述方法利用碱性试剂随后使用酸性溶液和固相结合材料，所述固相结合材料从样品中吸收NA。优选具有在不首先实施任何预裂解以破坏细胞或病毒的情况下直接从生物样品释放NA之能力的固相结合材料。通过固相作用直接释放NA进入酸性环境和随后在酸性条件下将释放的RNA迅速捕获至所述固相，可使得降解最小化。另外，申请人发现有可能从具有RNA酶活性的样品中回收核糖核酸而不需要依靠加入RNA酶失活化合物或蛋白质，例如胍盐、高浓度离液剂或RNA酶抑制蛋白和抗体。
在本发明的一个实施方案中，通过用碱性试剂处理为起始的过程从生物样品中提取NA。在另一个实施方案中，可以首先用蛋白酶处理样品。暴露于碱性环境中释放生物样品的部分至所有NA成分。这可以，至少部分地，通过破坏细胞膜或病毒蛋白衣壳来实现。此外，碱性条件有助于降低核酸酶活性。人们普遍认为RNA在碱性环境中是非常不稳定的；认为在碱性催化条件下快速发生核苷酸间磷酸二酯键的自-水解。然而，令人惊奇的是，申请人已经发现短暂的碱处理，甚至没有表面活性剂存在时，有可能从细胞来源和病毒(包括DNA和RNA病毒)中释放核酸。然后将所释放的NA置于酸性环境中，并在其中被所述颗粒捕获。这些条件足以抑制或失活样品中存在的核酸酶，并允许回收NA。本发明认识到可以成功地将核酸(包括RNA)释放到碱性溶液中，用另一种碱性溶液捕获和使所述核酸从固相释放。尽管所述碱性溶液具有从生物样品中释放NA的能力，固相仍然可以施展其能力并从生物样品中释放额外的NA。在实施本发明的方法时，优选使用具有这种能力的固相。
实际上所述方法可用于从蛋白质-NA复合物、完整细胞和病毒中捕获和提取DNA、尤其是RNA。可以根据本发明的方法从任何含有核酸的生物样品(特别是完整细胞和病毒)中提取NA。这些材料的常见来源包括但不限于细菌培养物或沉淀、血液、尿、细胞、体液(例如尿、痰、精液、CSF、血液、血浆和血清)或者来自组织匀浆物。本发明的方法可以在不需要使它们经受其它预先步骤的情况下应用到包括下列的样品：活的、死的或凋亡的完整细胞和组织，或者培养的细菌、植物或动物细胞系。特别地，完全不需要使用任何预破坏或裂解。从混悬液(即来自生物流体或细胞培养物)中的细胞里提取RNA可以从例如低速离心沉淀细胞和弃去培养基开始。可以使用本领域公知的组织破坏法从完整组织或器官中提取RNA，所述方法例如通过使用手动匀浆器或自动匀浆器(例如Waring搅拌器)或其它组织匀浆器进行匀浆。所述匀浆物可以通过粗滤器(例如粗棉布)以除去大块物质或者可在低速下离心制备物以分离颗粒材料。
本发明方法是快速的，通常仅需要数分钟就可完成。重要的是，通过本方法得到的NA具有足够的纯度使得它可用于临床或其它下游应用。由本发明方法生产的DNA可以用于例如聚合酶链式反应(PCR)、测序、克隆、和Southern印迹等方法。通过本发明方法生产的RNA可以用于例如使用逆转录酶的方法中，以自身应用或接着进行聚合酶链式反应扩增(RT-PCR)，RNA印迹分析和体外翻译。有利地，在使用本方法之前不需要分离细胞，仅仅需要简单的设备以实施本方法。在根据本发明方法处理样品之前不需要预先的裂解或乙醇沉淀步骤。不需要也不使用用于裂解细胞或病毒的去污剂或离液物质。
在本发明的一个实施方案中，含有NA的所选生物样品(例如含细胞和/或病毒的流体)与碱性试剂简单混合以形成混合物。所述样品和混合物仅仅需要在混合物中相接触短短数秒钟。不需要进行其它的处理。然后将所述混合物和酸性溶液合并。所述样品和酸性溶液仅仅需要在混合物中接触短短数秒。在所述混合物形成的同时或之后，所述混合物与固相结合材料合并，选择这样的固相结合材料，其具有在不首先实施任何预裂解以破坏细胞或病毒的情况下直接从生物样品释放NA的能力。通过所述颗粒的作用直接释放RNA进入酸性环境和随后在酸性条件下将释放的RNA快速捕获至这些颗粒使得降解最小化。除去上清，以及任选地用一种或多种清洗溶液清洗含有核酸的固相。如果需要，可接着洗脱所述固相以从固相解离RNA。在一个实施方案中，使用碱性溶液从所述固相或颗粒洗脱RNA。通常，用于此目的的碱的理想浓度是至少10-4M，优选约1mM至约1M。
在另一个实施方案中，如果需要，本发明的方法可通过任选地使用RNA酶抑制剂(例如金精三羧酸(aurin tricarboxylic acid)、DTT或DEPC)来实施。本领域技术人员可选择其它的RNA酶抑制剂来用于此目的。
所有的所述步骤可在单个容器中或单个支持物上快速连续进行，而不需要专门的设备(例如离心机)。所述方法可改造用于以串行或并行方式处理大量样品的自动平台。所有结合和清洗步骤优选在短时间内完成，优选不超过1分钟。清洗步骤可优选在10秒钟内进行。洗脱优选在不超过1分钟内进行。在一个示例性方案中，含有RNA来源的100微升样品在1.5毫升微量离心管中与100微升碱性试剂混合，通过涡旋短暂混合。然后加入100微升酸性溶液并将离心管通过涡旋进行短暂混合。然后加入在酸性溶液中的磁性结合微颗粒，将混合物涡旋混匀30秒。在磁力台上将上清与所述颗粒分离。用200微升酸性溶液清洗颗粒两次，用200微升水清洗两次。将清洗后的颗粒在碱性洗脱液中涡旋混匀1分钟，以洗脱RNA。
碱性试剂
在一个实施方案中，本发明使用的碱性试剂可以是中强至强碱性水溶液。水溶性碱性化合物的溶液浓度至少10-4M、更优选至少10-3M、更优选至少10-2M是有效的。这种溶液应具有至少约为10的pH。代表性的化合物包括但不限于碱金属氧化物和氢氧化物、碱土金属氧化物和氢氧化物、碱金属碳酸盐、NH4OH、伯胺、仲胺和叔胺、季铵氢氧化物、季鏻氢氧化物和式为RS-M+的硫醇盐，其中M是碱金属离子，R是含有1-20个碳原子的有机基团。代表性的硫醇盐包括烷基硫醇盐、取代烷基硫醇盐、芳基硫醇盐、取代芳基硫醇盐、杂环硫醇盐、硫代羧酸盐/酯、二硫代羧酸盐/酯、黄原酸盐/酯、硫代氨基甲酸盐/酯和二硫代氨基甲酸盐酯。实例性化合物包括：
Figure A200780009268D00151
固相材料
在一个实施方案中，本发明的RNA提取方法使用固相结合材料以快速结合RNA，由此允许RNA与其它样品成分相分离。选择具有在不首先实施任何预裂解以破坏细胞或病毒的情况下直接从生物样品释放核酸的能力的固相结合材料。在本发明方法中用于结合核酸的材料包含确定其尺寸、形状、孔隙率和机械性能的基质。所述基质的形式可以是颗粒、微颗粒、纤维、珠子、膜和其它支持物(例如试管和微孔)。多种具体材料和其制备描述于申请人的共同未决美国专利申请公开2005/0106576、2005/0106577、2005/0106589、2005/0106602、2005/0136477和2006/0234251和临时申请S/N 60/771,510。
在一个实施方案中，所述材料还包含处于表面或其附近的共价连接的核酸结合部分，其允许捕获和结合不同长度的核酸分子。表面不仅仅指固相材料的外周，还指固相材料内任何可接近孔洞区的表面。
在另一个实施方案中，所述材料还包含处于表面或其附近的非共价连接的核酸结合部分，其允许捕获和结合不同长度的核酸分子。所述非共价连接的核酸结合部分通过与表面上带相反电荷残基的静电引力与所述固体基质相连，或者通过疏水引力与所述表面相连。
这些带有共价或非共价连接之核酸结合基团的材料的基质可以是任何适宜的物质。优选的基质材料选自：二氧化硅、玻璃、不溶性合成聚合物、不溶性多糖和金属材料以及用二氧化硅、玻璃、合成聚合物或不溶性多糖包被的磁响应材料，所述金属材料选自金属、金属氧化物和金属硫化物。示例性材料包括由共价相连的表面官能团包被或官能化的基于二氧化硅的材料，所述官能团用于破坏细胞和吸引核酸。还可以包括合适的表面官能化的基于碳水化合物的材料和具有此表面官能性的聚合物材料。用作核酸结合基团的表面官能团包括能够破坏细胞结构完整性以及使核酸吸引到固体支持物的任何基团。这样的基团包括但不限于下文描述的羟基、硅烷醇基、羧基、氨基、铵、季铵和季鏻盐以及叔锍盐类型的材料。其中，具有季铵、季鏻或叔锍盐基团的材料是优选的。
对于许多应用来说，优选所述固体材料是颗粒的形式。优选地，所述颗粒尺寸小于约50微米，更优选小于约10微米。小颗粒更易于分散在溶液中，具有更高的表面积/体积比。较大的颗粒和珠子也可用于使用重力沉淀或离心的方法中。两种或多种不同尺寸颗粒的混合物在一些应用中可以是优选的。
优选地所述固相还可包含磁响应部分，其通常是顺磁或超顺磁微颗粒的形式。所述磁响应部分允许借助磁场吸引和操纵。这样的磁性微颗粒通常包含磁性金属氧化物或金属硫化物核心，所述核心通常被吸附或共价结合的层所围绕以保护磁性成分。核酸结合基团可以与此层共价结合，由此包被所述表面。所述磁性金属氧化物核心优选是铁氧化物或铁硫化物，其中铁是Fe2+或Fe3+或二者皆有。包裹在有机聚合物层内的磁性颗粒已经公开，例如见美国专利4,654,267、5,411,730和5,091,206中和出版物(Tetrahedron Lett.，40(1999)，8137-8140)中。具有多种不同类型壳的包被磁性颗粒有商业供应。如美国专利申请公开2005/0106576、2005/0106577、2005/0106589、2005/0106602、2005/0136477和2006/0234251中所教导的，所述壳可以被官能化。
市售磁性二氧化硅或磁性聚合物颗粒可用作制备可用于本发明的磁性固相结合材料的起始材料。合适类型的具有表面羧基的聚合物颗粒已知有商品名为SeraMagTM(Seradyn)和BioMagTM(Polysciences andBangs Laboratories)的那些。合适类型的二氧化硅磁性颗粒已知有商品名为MagneSilTM(Promega)的那些。Chemicell GmbH(Berlin)提供表面具有羧基或氨基的二氧化硅磁性颗粒。
在一个末端含有三烷氧基硅烷基团的接头基团可以连接到金属材料或者包被的金属材料的表面，所述包被金属材料例如是包被二氧化硅或玻璃的磁性颗粒。优选的三烷氧基硅烷化合物具有下式R1-Si(OR)3，其中R是低级烷基，R1是选自直链、支链和环的有机基团并包含1-100个原子。所述原子优选地选自C、H、B、N、O、S、Si、P、卤素和碱金属。代表性R1基团是3-氨基丙基、2-氰乙基和2-羧乙基以及如下文更充分描述的含有可切割部分的基团。在一个优选实施方案中，三烷氧基硅烷基化合物包含可切割的中央部分和活性基团末端部分，其中所述反应性基团可以通过与叔胺、叔膦或有机硫的反应而一步转变为季鎓盐或叔鎓盐。
已发现可以在使用氟离子的过程中将这样的接头基团安置在金属颗粒以及包被玻璃或二氧化硅的金属颗粒的表面。所述反应可以在有机溶剂中进行，所述溶剂包括低级醇和芳香族溶剂(包括甲苯)。合适的氟来源在这些有机溶剂中有较好的溶解性，所述氟来源包括氟化铯和氟化四烷基铵盐。
在可用于本发明方法的一些固相结合材料中所含的核酸结合(nucleic acid binding，NAB)基团可用作双重目的。NAB基团吸引和结合具有各种长度以及碱基组成或序列的核酸、多核苷酸和寡核苷酸。它们还可具有一定的从细胞包膜中释放核酸的能力。核酸结合基团包括：例如，羧基、胺和季鎓或叔鎓基团或者多于一种这些基团的混合物。胺基可以是NH2、烷基胺和二烷基胺。优选的核酸结合基团是季鎓或叔鎓基团(-QR2 +或-QR3 +)，其包括三烷基季铵基团(-NR3+)、季鏻基(-PR3 +)，其包括三烷基鏻或三芳基鏻或者混合烷基芳基鏻基团，以及叔锍基(-SR2 +)。所述固相可含有多于一种的本文所述核酸结合基团。可使用多于一种尺寸的颗粒的混合物。还可以使用上述固相结合材料与多种其它具有或不具有NAB基团的固相结合材料的混合物。也可使用含有季鎓或叔鎓基团(-QR2 +或-QR3 +)的固相材料，其中R基是至少4个碳原子的烷基，其尤其可有效结合核酸，但是也可使用少至一个碳原子的烷基以及芳基。这些固相材料以很高强度保持结合的核酸，在现有技术已知的大多数洗脱条件下抵抗对所述核酸的移除或洗脱。低离子强度和高离子强度的大多数已知洗脱条件对于移除所结合的核酸是无效的。与含DEAE和PEI基团的常规阴离子交换树脂不同，不论反应介质的pH如何，季鎓或叔鎓固相材料都保持带正电。
优选实施方案使用这样的固相结合材料，其中所述核酸结合基团通过可选择性切割的连接键与所述基质相连。切断所述连接键有效地将任何结合核酸与固相“断开”。可以通过任何化学、酶、光化学或其它特异性切断可切割接头中的键但是不破坏目的核酸的方法切断所述连接键。这些可切割固相材料包含固体支持物部分，其包含如上所述的基质。用于吸引和结合核酸的核酸结合(NAB)部分通过可切割接头部分与所述固体支持物的表面相连。美国专利申请公开2005/0106576、2005/0106577、2005/0106589、2005/0106602、2005/0136477和2006/0234251和临时申请S/N 60/771,510描述了具有可切割连接键的合适材料，其中公开内容通过参考并入本文。
可切割的接头部分优选是选自直链、支链和环的有机基团，并包含1-100个原子。所述原子优选选自C、H、B、N、O、S、Si、P、卤素和碱金属。示例性接头基团是可水解切割的基团。实例包括羧酸酯和酸酐、硫酯、碳酸酯、硫代碳酸酯、氨基甲酸酯、酰亚胺、磺酰胺、磺酰亚胺和磺酸酯。在一个优选实施方案中，用碱性水溶液处理所述可切割连接键。另一种示例性接头基团类型是经受还原性切割的基团，例如被包括膦和硫醇(例如乙硫醇、巯基乙醇和DTT)在内的多种试剂切割的二硫键(S-S)。另一种代表性的基团是含有过氧键(O-O)的有机基团。过氧键可以被硫醇、胺和膦切割。另一种代表性的可切割基团是可酶促切割的接头基团。示例性基团包括酯(其可被酯酶和水解酶所切割)、酰胺和肽(其可被蛋白酶和肽酶所切割)、糖苷基(其可被糖苷酶所切割)。另一种代表性可切割基团是可切割的1，2-二氧环丁烷(dioxetane)部分。这些材料含有二氧环丁烷部分，其可以被热分解或者被化学或酶试剂引发而片段化。除去保护基团产生氧阴离子促进了二氧环丁烷环的分解。根据公知方法通过切割过氧O-O键和C-C键发生片段化。在多个专利和出版物中描述了可切割的二氧环丁烷类。代表性实例包括美国专利4,952,707、5,707,559、5,578,253、6,036,892、6,228,653和6,461,876。
Figure A200780009268D00191
另一种可切割的接头基团是富含电子的C-C双键，其可被转变成不稳定的1，2二氧环丁烷部分。双键上的至少一个取代基通过O、S或N原子连接到所述双键。富电子双键与单线态氧(singlet oxygen)反应产生不稳定的1，2二氧环丁烷环基团，其在常温下快速片段化产生两个羰基片段。
Figure A200780009268D00192
具有可切割接头基团的另一类固相材料具有烯酮二硫缩醛(ketenedithioacetal)作为可切割部分，如美国专利6,858,733和6,872,828所公开的。通过过氧化物酶和过氧化氢的酶促氧化，烯酮二硫缩醛经历双键的氧化性切割。
Figure A200780009268D00193
所述可切割部分可以具有所示结构，包括在吖啶(acridan)环上具有取代的类似物，其中Ra、Rb和Rc都是有机基团，其各自含有1至约50个选自C、N、O、S、P、Si和卤素原子的非氢原子，其中Ra和Rb可以相连接形成环。另一组具有可切割接头基团的固相材料具有可光切割的接头基团，例如硝基取代的芳香醚和酯。根据公知反应，邻硝基苄酯被紫外光切割。
很多其他可切割基团对于本领域技术人员而言是显而易见的。
酸性溶液
用于本发明方法的酸性溶液一般包括具有低于中性pH的任何水溶液，优选所述溶液具有1-5范围内的pH，更优选约2-4。所述酸可以是有机或无机酸。可以使用无机酸例如盐酸、硫酸和高氯酸。可使用包括单羧酸、二羧酸、三羧酸和氨基酸的有机酸，以及所述酸的盐。代表性酸包括甲酸、乙酸、三氟乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸以及柠檬酸、甘氨酸和丙氨酸。盐可以具有任何水溶性反离子，优选碱金属或碱土金属离子。包含过渡金属盐的酸性溶液也可用于实施本发明。优选的过渡金属包括Fe、Mn、Co、Cu和Zn盐。
不像通过化学裂解提取RNA的其它方法，本方法中所用的酸性溶液不含去污剂或化学裂解剂例如离液物质(如胍盐)。没有使用用于任意这些功用的有机溶剂，例如DMF或DMSO。在不存在其它可溶性添加剂的情况下，所述酸性介质和所述固相结合材料的组合足以允许从样品中提取完整的RNA，甚至是含有RNA酶的样品也是如此。
可以将所述样品和所述酸性溶液相混合，同时通过在该酸性溶液中提供固相而将混合物与所述固相合并。作为替代，所述样品可以首先与所述酸性溶液混合以形成混合物，然后将所述混合物与所述固相合并。
清洗溶液
如果使用的话，可用于实施本发明的清洗溶液可以有助于从结合RNA中除去其它成分。在一个实施方案中，清洗溶液可包含与结合步骤所用相同或相似的酸性溶液。已经发现用酸性溶液清洗是有利的，这可能是为了除去残余的RNA酶活性。使用中性pH的水或缓冲液进一步清洗可用于在洗脱之前中和所述酸。应制备或处理水和缓冲液以确保它们不具有RNA酶活性。
洗脱试剂
在一个实施方案中，通过将所述固相材料与释放所结合RNA进入溶液的试剂相接触来从所述固相中洗脱所结合RNA。所述溶液应溶解并足以保存释放的RNA。洗脱在释放溶液中的RNA应与下游分子生物学过程相容。在另一个实施方案中，用于从固相结合材料上释放核酸的试剂是通过切割固相结合材料中存在的可切割接头基团来起作用。一种优选试剂是至少10-4M的强碱性水溶液。浓度为至少10-4M的碱金属氢氧化物、氢氧化铵、四烷基氢氧化铵、碱金属碳酸盐和碱金属氧化物的溶液可有效地从所切割固相上快速切割和洗脱RNA。当所述可切割基团是二硫(S-S)基团时，洗脱/切割试剂将含有二硫键还原剂，例如膦或硫醇(如乙硫醇、巯基乙醇或DTT)。当所述可切割基团是过氧(O-O)键时，洗脱/切割试剂将含有还原剂，例如硫醇、胺或膦。当所述可切割基团可酶促切割时，洗脱/切割试剂将含有合适的酶。酯需要酯酶或水解酶；酰胺或肽键需要蛋白酶或肽酶；糖苷基团需要糖苷酶。当所述可切割基团是1，2-二氧环丁烷部分时，可以热切割所述二氧环丁烷，洗脱试剂可以是上述的碱性溶液。当所述可切割基团是可诱发的1，2-二氧环丁烷部分时，洗脱/切割试剂将含有化学或酶试剂以通过去除保护基团产生不稳定氧阴离子来诱导所述基团的切割。当所述可切割基团是可转变成不稳定1，2-二氧环丁烷的富电子C-C双键时，洗脱/切割试剂将含有单线态氧来源(例如光敏染料)。本领域已知与可见光和分子氧反应产生氧单线态激发态的这些染料，包括例如孟加拉玫瑰红(RoseBengal)、伊红Y(Eosin Y)、茜素红S(Alizarin Red S)、刚果红(CongoRed)和橙G(Orange G)、荧光素染料、罗丹明染料、赤藓红B、叶绿酸三钠盐、氯高铁血红素盐、血卟啉、亚甲基蓝、结晶紫、孔雀石绿(Malachite Green)和富勒烯。
在另一个实施方案中，用于从固相结合材料释放RNA的包含季鎓NAB基团的试剂选自申请人的共同未决美国专利申请公开2005/0106589中公开的组合物。
所述释放步骤可以在室温下实施，但是可使用任何适宜的温度。洗脱温度对于本发明的分离核酸方法的成功似乎不是关键的。优选室温，但是在一些情况下升高温度可以增加洗脱速率。
本发明的试剂盒
在另一个实施方案中，提供用于实施本发明方法的试剂盒。根据本发明从样品中分离核糖核酸的试剂盒包含至少一种固相结合材料、碱性试剂以及酸性溶液，所选的固相结合材料被选择成具有在不首先进行任何预裂解的情况下从生物样品中直接释放核酸的能力。所述固相结合材料包含基质，其可以是颗粒、微颗粒、磁性颗粒、纤维、珠子、膜、试管和微孔的形式。所述基质与核酸结合部分共价或非共价连接，任选地通过可切割接头。
所述核酸结合部分包含至少一种类型的基团，其选自羧基、NH2、烷基胺、二烷基胺基、季铵基(包括三烷基铵基)、季鏻基(包括三烷基鏻、三芳基鏻或者混合烷基芳基鏻基)以及叔锍基。
所述碱性试剂可以是中强至强碱性水溶液。水溶性化合物的溶液浓度至少10-4M、更优选至少10-3M、更优选至少10-2M是有效的。代表性的化合物包括但不限于碱金属氧化物和氢氧化物、碱土金属氧化物和氢氧化物、碱金属碳酸盐、NH4OH、伯胺、仲胺和叔胺、季铵氢氧化物、季鏻氢氧化物和式为RS-M+的硫醇盐，其中M是碱金属离子，R是含有1-20个碳原子的有机基团。代表性的硫醇盐包括烷基硫醇盐、取代烷基硫醇盐、芳基硫醇盐、取代芳基硫醇盐、杂环硫醇盐、硫代羧酸盐/酯、二硫代羧酸盐/酯、黄原酸盐/酯、硫代氨基甲酸盐/酯和二硫代氨基甲酸盐/酯。
作为本发明试剂盒中一种要素的所述酸性溶液一般地包括pH低于中性的任何水溶液。优选地，所述溶液具有1-5范围内的pH，更优选约2-4。所述酸可以是有机或无机酸。无机酸例如盐酸、硫酸和高氯酸是可用的。可使用包括单羧酸、二羧酸、三羧酸和氨基酸的有机酸，以及所述酸的盐。代表性酸包括甲酸、乙酸、三氟乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸以及柠檬酸、甘氨酸和丙氨酸。盐可以具有任何水溶性反离子，优选碱金属或碱土金属离子。包含过渡金属盐的酸性溶液在实施本发明中也是可用的。优选的过渡金属包括Fe、Mn、Co、Cu和Zn盐。
试剂盒还可以包含洗脱试剂，以及一种或多种任选的清洗缓冲液和其它试剂盒常规组分，例如使用手册、实验方案、缓冲液和稀释剂。洗脱试剂可以选自强碱性水溶液，例如浓度至少为10-4M(优选约1mM至约1M)的碱金属氢氧化物或氢氧化铵溶液；二硫键还原剂，例如膦或硫醇(包括乙硫醇、巯基乙醇或DTT)；过氧化物还原剂(例如硫醇、胺或膦)以及酶(例如酯酶、水解酶、蛋白酶、肽酶、糖苷酶或过氧化物酶)。在一个实施方案中，其中固相结合材料含有可切割接头，例如可通过与单线态氧来源反应而被切割的富电子烯基，所述试剂盒可包含如上所述的光敏染料。
实施例
实施例1.用于分离RNA的固相材料。合成由三丁基鏻NAB基团和可切割芳基硫酯连接键官能化的磁性颗粒。
Figure A200780009268D00231
a)制备磁铁。在1小时中将气氩吹入5升瓶中的3升I型水中。在氩气下加入浓NH4OH(28％，180毫升)。通过滴液漏斗在约1小时里加入50毫升在1M HCl中的2M FeCl2和200毫升在1M HCl中的1MFeCl3的混合物。通过下述步骤将固体收集在两个烧瓶中，每次以500-600毫升份倒入带有外部盘状磁体的烧瓶中，并倒出上清。通过用超声分散在500-600毫升I型水中然后吸引到磁体并倒出上清来清洗所述固体。重复所述过程直至上清的pH大约为8.5。合并两个瓶中的内容物使得所述磁铁以约500毫升的总体积保存。
b)将3-甲基氨丙基三甲氧基硅烷(149.8克)加入到500毫升烧瓶中，通入氩气。将所述烧瓶置于冰浴中之后，用注射器缓慢加入丙烯酰氧基三甲基硅烷(119.6克)。搅拌所述反应5分钟，除去冰浴，继续搅拌2个小时。不经进一步纯化即使用产物。
c)磁铁包被。用I型水将来自步骤a)的含有5.0克磁铁的一定量磁铁浆稀释至140毫升，对混合物进行超声。15分钟后加入乙醇(1.25升)。30-45分钟后加入浓NH4OH(28％，170毫升)。将来自步骤b)的1.5克甲硅烷酯的溶液和13.5克Si(OEt)4的乙醇溶液以90分钟间隔分三份加入到反应中。90分钟后，加入20-30毫升乙醇中3.75克甲硅烷酯化合物的溶液，搅拌混合物并再超声90分钟。搅拌过夜。将混合物以每份500毫升转移进两个1升烧瓶中，依靠磁性分离所述颗粒。依次用4×250毫升甲醇、2×250毫升I型水、1×250毫升pH1的稀释于I型水中的HCl(在将混合物放回磁体上之前保持10分钟)、4×250毫升I型水、4×250毫升甲醇以及2×250毫升丙酮清洗所述固体。过夜风干固体。在此步骤过程中，甲硅烷酯发生水解导致产生羧酸基团。
d)将来自前一步骤的磁性羧酸官能化颗粒(1.0克)置于30毫升亚硫酰氯中，回流4小时。过量亚硫酰氯从磁性固体中倒出。用CH2Cl2清洗所述颗粒数次，继续下一步骤。
e)用0.22克1，4-苯二硫酚和0.52毫升二异丙基乙基胺处理悬于50毫升CH2Cl2中的来自步骤d的酰氯官能化颗粒。对混合物超声5分钟，用轨道摇床搅拌过夜。利用磁性分离依次用CH2Cl2、1:1CH2Cl2/CH3OH、CH3OH、1:1 CH2Cl2/CH3OH和CH2Cl2清洗所述固体。将固体风干过夜。
f)用0.81克三丁基膦处理前一步骤颗粒(约0.9克)和25毫升CH2Cl2的混合物。对所述混合物超声5分钟，用轨道摇床搅拌过夜。利用磁性分离依次用CH2Cl2、1:1 CH2Cl2/CH3OH、CH3OH、1:1 CH2Cl2/CH3OH和CH2Cl2清洗所述固体。将固体风干过夜。
g)用0.25克4-氯甲基苯甲酰氯和0.52毫升二异丙基乙胺处理前一步骤颗粒(约0.8克)和25毫升CH2Cl2的混合物。对所述混合物超声5分钟，用轨道摇床搅拌过夜。利用磁性分离依次用CH2Cl2、1:1CH2Cl2/CH3OH、CH3OH、1:1 CH2Cl2/CH3OH和CH2Cl2清洗所述固体。收集固体并干燥过夜。
h)用0.41克三丁基膦处理前一步骤颗粒(约0.7克)和25毫升CH2Cl2的混合物。对所述混合物超声5分钟，用轨道摇床搅拌共7天。利用磁性分离依次用1:1 CH2Cl2/CH3OH和CH3OH清洗所述固体。收集并干燥固体。
实施例2.较大颗粒尺寸的固相材料。合成三丁基鏻NAB基团和可切割芳基硫酯连接键官能化的磁性颗粒。
Figure A200780009268D00241
a)将3-甲基氨丙基三甲氧基硅烷(149.8克)加入到500毫升烧瓶，充入氩气。将所述烧瓶置于冰浴中之后，用注射器缓慢加入丙烯酰氧基三甲基硅烷(119.6克)。搅拌所述反应5分钟，除去冰浴，继续搅拌2个小时。不经进一步纯化即使用产物。
b)用140毫升I型水和1.25升乙醇稀释5.0克商品磁铁(Strem目录号93-2616，1-5微米)。30-45分钟后加入浓NH4OH(28％，170毫升)。将来自步骤a)的1.5克甲硅烷酯和13.5克Si(OEt)4的乙醇溶液以90分钟间隔分三部分加入到反应中。90分钟后，加入20-30毫升乙醇中的3.75克甲硅烷酯化合物溶液，搅拌混合物并再超声90分钟。搅拌维持过夜。将混合物以每份500毫升转移进两个1升的烧瓶中，依靠磁性分离所述颗粒。依次用4×250毫升甲醇、2×250毫升I型水、1×250毫升pH1的稀释于I型水中的HCl(在将混合物放回磁体上之前保持10分钟)、4×250毫升I型水、4×250毫升甲醇以及2×250毫升丙酮清洗所述固体。过夜风干固体。在此步骤过程中，甲硅烷酯发生水解而导致羧酸基团的产生。
d)将来自前一步骤的磁性羧酸官能化颗粒(1.0克)置于30毫升亚硫酰氯中，回流4小时。过量亚硫酰氯从磁性固体中倒出。用CH2Cl2清洗所述颗粒数次，继续下一步骤。
e)用0.22克1，4-苯二硫酚和0.52毫升二异丙基乙基胺处理悬于50毫升CH2Cl2中的来自步骤d)的酰氯官能化颗粒。对混合物超声5分钟，用轨道摇床搅拌过夜。利用磁性分离依次用CH2Cl2、1:1的CH2Cl2/CH3OH、CH3OH、1:1的CH2Cl2/CH3OH和CH2Cl2清洗所述固体。将固体风干过夜。
f)用0.81克三丁基膦处理前一步骤颗粒(约0.9克)和25毫升CH2Cl2的混合物。对所述混合物超声5分钟，用轨道摇床搅拌过夜。利用磁性分离依次用CH2Cl2、1:1 CH2Cl2/CH3OH、CH3OH、1:1 CH2Cl2/CH3OH和CH2Cl2清洗所述固体。将固体风干过夜。
g)用0.25克4-氯甲基苯甲酰氯和0.52毫升的二异丙基乙胺处理前一步骤颗粒(约0.8克)和25毫升CH2Cl2的混合物。对所述混合物超声5分钟，用轨道摇床搅拌过夜。利用磁性分离依次用1:1CH2Cl2/CH3OH和CH3OH清洗所述固体。收集固体并干燥过夜。
h)用0.41克三丁基膦处理前一步骤颗粒(约0.7克)和25毫升CH2Cl2的混合物。对所述混合物超声5分钟，用轨道摇床搅拌共7天。利用磁性分离依次用CH2Cl2、1:1 CH2Cl2/CH3OH、CH3OH、1:1CH2Cl2/CH3OH和CH2Cl2清洗所述固体。收集并干燥固体。
实施例3.合成官能化磁性聚合物
Figure A200780009268D00261
a)借助磁力将含有25毫克固体的珠子Dynal MyOne TM磁性COOH珠倒出。然后用3×1毫升水和3×1毫升CH3CN清洗珠子，之后干燥4小时。所述珠子悬于加入了28.8毫克EDC的1mL CH2Cl2中，振摇30分钟。将1，4-苯二硫酚(30毫克)溶液加入到混合物。对管子超声1分钟，振摇过夜。除去上清，依靠磁力用4×1毫升的CH2Cl2、1毫升1:1甲醇:CH2Cl2、4×1毫升甲醇和4×1毫升CH2Cl2清洗所述珠子。
b)将所述珠子悬于1毫升加入了140微升三丁基膦的CH2Cl2中。将反应混合物涡旋1分钟，总共振摇3天。通过保持在磁体上倒出溶剂。依靠磁力用4×1毫升CH2Cl2、1毫升1:1甲醇:CH2Cl2、4×1毫升甲醇、1毫升1:1甲醇:CH2Cl2和4×1毫升CH2Cl2清洗所述珠子。
c)用20毫克4-氯甲基苯甲酰氯和52微升二异丙基乙胺处理1毫升CH2Cl2中前一步骤颗粒(约25毫克)的混合物。对所述混合物涡旋10秒，超声5分钟，用轨道摇床搅拌过夜。利用磁力分离依次用4×1毫升CH2Cl2、1毫升1:1甲醇:CH2Cl2、4×1毫升甲醇、1毫升1:1甲醇:CH2Cl2和4×1毫升CH2Cl2清洗所述固体。
d)用30毫克三丁基膦处理1毫升CH2Cl2和前一步骤颗粒(25毫克)的混合物。对所述混合物超声2分钟，用轨道摇床搅拌共6天。利用磁力分离依次用4×1毫升CH2Cl2、3×1毫升甲醇、2×1毫升水清洗所述固体。通过加入1毫升水制成珠子贮备溶液(25毫克/毫升)。
实施例4.合成官能化磁性聚合物
Figure A200780009268D00271
a)接头的制备：将1，4-二巯基苯(11.97克)溶于300ml CH2Cl2中。溶液冷却至-78℃。在1小时中逐滴加入100毫升CH2Cl2中8.86克4-氯甲基苯甲酰氯和3.8毫升吡啶的溶液。使反应溶液升温至室温，维持过夜。完成后用任一种清洗液清洗1克的不纯固体产物得到200毫克纯产物。通过色谱法可以从滤出液中分离更多的量。
Figure A200780009268D00272
b)用磁力收集来自1.07毫升Sera-MagTM磁性羧酸酯修饰微颗粒悬液(Seradyn)(其含有共50毫克颗粒)的磁性颗粒，将上清倒出。然后用3×1毫升水、3×1毫升CH3CN和3×1毫升CH2Cl2清洗珠子。所述珠子悬于加入了60毫克EDC的3.6毫升CH2Cl2中，振摇30分钟。
c)将400微升DMF中来自步骤a)的接头(60毫克)溶液加到所述混合物中。对所述管超声1分钟，振摇过夜。将所述珠子分为两份各25毫克的部分，分别进行处理。除去上清，利用磁力分离依次用4×1毫升CH2Cl2、1毫升1:1甲醇:CH2Cl2、4×1毫升甲醇、1毫升1:1甲醇:CH2Cl2和4×1毫升CH2Cl2清洗所述珠子。
d)在添加了75微升三丁基膦的10毫升CH2Cl2中悬浮来自步骤c)的所述颗粒。将所述反应混合物涡旋1分钟，振摇共7天。借助磁力，将所述溶剂倒出。利用磁力分离依次用3×1毫升CH2Cl2、1毫升1:1甲醇:CH2Cl2、4×1毫升甲醇和2×1毫升水清洗珠子。通过向各部分加入1毫升水制得珠子贮备溶液(25毫克/毫升)。
实施例5.碱性试剂的制备。
典型的制备方法。上述钠盐化合物1-6是从相应的中性硫醇通过下述合成方法制备而得的。
1的合成.在250毫升烧瓶中放置50毫升干燥的THF，其中所述THF用氩气净化20分钟。然后加入2.00克(0.0130mol)DTT，随后加入0.471克(0.0118mol)NaH(矿物油中的60％悬液)。所述混合物在氩气氛中搅拌过夜。过滤反应混合物，经THF(3×50毫升)清洗之后又经己烷(3×100毫升)清洗的固体在真空下进行干燥，得到1.12克的白色固体1。1H NMR(400MHz，D2O)：δ 2.38(m，2H)，2.50(m，2H)，3.45(t，2H)ppm.
2，1H NMR(400MHz，d6-DMSO)：δ 6.28(t，1H)，6.79(m，1H)，6.88(d，1H)，7.73(d，1H)ppm
3，1H NMR(400MHz，d6-DMSO)：δ 2.97(t，2H)，3.78(t，2H)ppm.
4，1H NMR(400MHz，d6-DMSO)：δ 3.29(s，3H)，6.32(s，1H)，6.60(s，1H)ppm.
5，1H NMR(400MHz，d6-DMSO)：δ 2.24(t，4H)，3.08(t，4H)ppm.
6，1H NMR(400MHz，D2O)：δ 2.57(t，2H)，3.52(t，2H)ppm.
实施例6.所用的其他碱性试剂。
Figure A200780009268D00282
实施例7.回收荧光素酶RNA。利用简单的测试系统用于说明本发明的方法用于回收RNA上的用途以及用于评价各种条件和试剂的相对效率。制备100微升碱性试剂和100微升胎牛血清(FBS)的混合物。加入2微升1微克/微升的荧光素酶RNA，将所述混合物用涡旋混合5秒。加入100微升酸性溶液，将所述混合物用涡旋混合10秒。将所述混合物同2毫克实施例1的颗粒合并，并涡旋混合30秒。在磁力台上将液体从颗粒中除去，依次用2×200微升柠檬酸钠、0.3M pH3的清洗液以及2×200微升0.1％DEPC处理的水清洗所述颗粒。依次通过下列步骤提取RNA，将50微升50mM NaOH与所述颗粒合并，涡旋混匀1分钟并移除洗脱液。在乙锭染色凝胶上分析初始结合反应的上清，通过荧光染色确定从溶液中除去并结合至所述颗粒的RNA的量。在乙锭染色凝胶上分析洗脱液，通过荧光染色确定由所述方法提取的RNA的量和品质。使用下述溶液导致RNA的定量结合，洗脱绝大部分所结合的RNA。
碱性试剂                    酸性溶液
Bu4P+OH-0.05M               乙酸0.1M
Bu4P+OH-0.1M                乙酸0.15M
Bu4P+OH-0.2M                乙酸0.3M
化合物30.2M                 乙酸0.3M
化合物40.2M                 乙酸0.3M
化合物70.2M                 乙酸0.3M
化合物80.2M                 乙酸0.3M
化合物90.2M                 乙酸0.3M
实施例8.从大肠杆菌培养物提取RNA。使用简单的测试系统以证明本发明方法在从培养物中培养的大肠杆菌里回收RNA的效用，以及用于评价各种条件和试剂的相对效率。
沉淀200微升份的大肠杆菌培养物，并除去培养基。将所述沉淀与100微升碱性试剂合并，反复吹吸10次。将获得的溶液同100微升酸性测试溶液合并并涡旋10秒。将所述溶液同100微升柠檬酸钠(0.3M，pH3)中2毫克实施例1的颗粒合并，并将混合物涡旋30秒。在磁力台上从颗粒中除去液体，然后依次用2×200微升柠檬酸钠(0.3M，pH3)清洗溶液和2×200微升0.1％DEPC处理的水清洗所述颗粒。通过下列步骤分离RNA，将50微升50mM NaOH和20mM tris pH8.8的溶液与所述颗粒合并，涡旋混匀1分钟并移除所述溶液。在乙锭染色凝胶上分析初始结合反应的上清，通过荧光染色确定已经从溶液中除去并结合至所述颗粒的RNA的量。在乙锭染色凝胶上分析洗脱液，通过荧光染色确定由所述方法提取的RNA的量和品质。使用下述溶液导致回收到绝大部分量的完整RNA以及基因组DNA。相比之下，在0.1％DEPC处理水中结合沉淀和清洗颗粒仅仅产生降解的RNA。
碱性试剂                 酸性溶液
NaOH 0.05M               柠檬酸钠0.3M      pH3.0
NaOH 0.05M               乙酸   0.1M
Bu4P+OH- 0.05M           柠檬酸钠0.3M      pH3.0
Bu4P+OH- 0.05M           乙酸   0.1M
Bu4P+OH- 0.1M            乙酸   0.15M
Bu4P+OH- 0.2M            乙酸   0.3M
实施例9.从血浆中的Armored RNA中提取RNA。Armored 
Figure A200780009268D0030110256QIETU
(Asuragen Inc.，Austin，TX)是蛋白质包裹的ssRNA，其表现为假病毒颗粒。一种HIV-B序列的Armored RNA包含来自gag区的片段和病毒衣壳蛋白，其用于测试本发明用于从复杂样品中分离RNA的方法。
从血浆中的Armored RNA中提取RNA的典型步骤如下。本领域一般技术人员将对特定参数做出改进，其也应考虑在本发明的范围之内。100微升柠檬酸盐抗凝血浆或EDTA抗凝血浆(Equitech-Bio，Inc.，Kerrville，TX)与5微升Armored RNA(含有50,000个拷贝)组成的105微升溶液与100微升碱性试剂(例如50mMNaOH)合并，短暂涡旋混匀所述混合物。1分钟后，将所述混合物与100微升酸性溶液(如0.3M KOAc，pH4.0)中的2毫克实施例1颗粒合并，对所得浆液涡旋混匀30秒。在磁力台上分离所述颗粒，然后依次用2×200微升酸性溶液(如0.3M KOAc，pH4.0)和2×200微升0.1％DEPC处理水清洗。通过与50微升50mM NaOH涡旋混合1分钟并移除所述溶液来洗脱RNA。与对照进行比较，在对照中105微升血浆/Armored RNA与2毫克颗粒和代替测试溶液的200微升0.1％DEPC处理水合并。
使用引物对对含有RNA的洗脱液进行RT-PCR扩增以扩增gag基因片段。使用iScriptTM一步法RT-PCR试剂盒和SYBR
Figure A200780009268D0031110329QIETU
Green(Bio-Rad)利用iCycler设备(Bio-Rad)进行扩增反应以进行扩增和检测。
下述条件允许回收可扩增的RNA。
碱性试剂                  测试溶液
Bu4P+OH- 0.1M              戊二酸盐0.3M    pH3.2
Bu4P+OH- 0.1M              琥珀酸盐0.3M    pH3.8
NaOH0.05M+tris0.02M，pH8  乙酸   0.1M
NaOH0.05M+tris0.02M，pH8  乙酸锌 0.05M    pH4
实施例10.从血清中的Armored RNA中提取RNA。在血清中从Armored RNA提取RNA的典型步骤如下。100微升胎牛血清(FBS，Invitrogen)与5微升Armored RNA(含有50,000个拷贝)组成的105微升溶液与100微升碱性试剂(例如50mM NaOH)合并，短暂涡旋混匀所述混合物。1分钟后，将所述混合物与100微升酸性溶液(如0.3MKOAc，pH4.0)中的2毫克实施例1颗粒合并，对所得浆液涡旋混匀30秒。在磁力台上分离所述颗粒，然后依次用2×200微升酸性溶液(如0.3M KOAc，pH4.0)和2×200微升0.1％DEPC处理水清洗。通过与50微升50mM NaOH涡旋混合1分钟并移除所述溶液来洗脱RNA。与对照进行比较，在对照中105微升血清/Armored RNA与2毫克颗粒和代替测试溶液的200微升0.1％DEPC处理水合并。
使用引物对对含有RNA的洗脱液进行RT-PCR扩增以扩增gag基因片段。使用iScriptTM一步法RT-PCR试剂盒和SYBR
Figure A200780009268D0031110329QIETU
Green(Bio-Rad)利用iCycler设备(Bio-Rad)进行扩增反应以进行扩增和检测。
下述条件允许回收可扩增的RNA。(MES＝HOCH2CH2S-Na+，化合物6)
碱性试剂           测试溶液
NaOH 0.05M          甘氨酸0.3M     pH2.5
NaOH 0.05M          KOAc0.3M       pH4.0
NaOH 0.01M          柠檬酸钠0.3M   pH3.0
NaOH 0.02M          柠檬酸钠0.3M   pH3.0
NaOH 0.03M          柠檬酸钠0.3M   pH3.0
NaOH 0.04M          柠檬酸钠0.3M   pH3.0
NaOH 0.05M          柠檬酸钠0.3M   pH3.0
Bu4N+OH- 0.05M      柠檬酸钠0.3M   pH3.0
Bu4N+OH- 0.1M       柠檬酸钠0.3M   pH3.0
MES 0.05M          柠檬酸钠0.3M   pH3.0
Bu4P+OH- 0.04M      柠檬酸钠0.3M   pH3.0
Bu4P+OH- 0.05M      柠檬酸钠0.3M   pH3.0
Bu4P+OH- 0.05M      柠檬酸钠0.3M   pH3.5
Bu4P+OH- 0.1M       柠檬酸钠0.3M   pH3.5
Bu4P+OH- 0.2M       柠檬酸钠0.3M   pH3.5
Bu4P+OH- 0.5M       柠檬酸钠0.3M   pH3.5
NaOH 0.05M          柠檬酸钠0.3M   pH3.5
NaOH 0.1M           柠檬酸钠0.3M   pH3.5
NaOH 0.2M           柠檬酸钠0.3M   pH3.5
Bu4N+OH- 0.05M      柠檬酸钠0.3M   pH3.5
Bu4N+OH- 0.1M       柠檬酸钠0.3M   pH3.5
Bu4N+OH- 0.2M       柠檬酸钠0.3M   pH3.5
Bu4P+OH- 0.1M       KOAc0.3M       pH4.0
Bu4P+OH- 0.1M       戊二酸钠0.3M   pH3.2
Bu4P+OH- 0.1M       琥珀酸钠0.3M   pH3.8
实施例11.从Armored RNA提取RNA。对前述实施例中方法的多种参数做出改变。
1.血浆/血清样品和碱性试剂的接触可以是短短10秒或长达5分钟。
2.实施例2的颗粒可以替代实施例1的颗粒来使用。
3.可以用50mM NaOH+20mM Tris(pH8.8)洗脱RNA。
实施例12.可以利用实施例1、2、3和4的固相材料以及各种碱性试剂和酸性溶液来成功实现实施例7-11各实施例中用于提取RNA的方法。

Claims (20)

1.从含有至少一个细胞或病毒的生物样品中提取核糖核酸的方法，其包括：
a)使所述样品与碱性试剂接触以形成第一混合物；
b)使第一混合物与酸性溶液接触以形成第二混合物；
b)将所述第二混合物与选定的具有在不首先进行任何预裂解情况下从生物样品中直接释放核糖核酸之能力的固相结合材料合并，其中不使用离液剂或去污剂来实现裂解，由此所述固相结合材料引起细胞和病毒的裂解以释放核糖核酸；和
c)将核糖核酸结合到所述固相上。
2.权利要求1的方法，其还包括：
d)将所述样品与在其上结合了核糖核酸的所述固相相分离；
e)任选地用至少一种清洗溶液清洗所述固相；和
f)通过将所述固相材料与释放所结合RNA进入溶液的试剂相接触来从所述固相上洗脱所结合的核糖核酸。
3.权利要求1的方法，其中形成所述第二混合物的步骤与将所述第二混合物与所述固相合并的步骤同时进行。
4.权利要求1的方法，其中在将第二混合物和固相合并的步骤之前形成第二混合物。
5.权利要求1的方法，其中所述固相选自颗粒、微颗粒、纤维、珠子、膜、试管和微孔。
6.权利要求1的方法，其中所述固相包含基质部分和核酸结合部分，其中所述基质部分选自二氧化硅、玻璃、不溶性合成聚合物、不溶性多糖、金属、金属氧化物以及金属硫化物。
7.权利要求6的方法，其中所述基质部分选自用二氧化硅、玻璃、合成聚合物或不溶性多糖包被的磁响应微颗粒，并且直径小于10微米。
8.权利要求7的方法，其中所述固相材料还包含共价连接的核酸结合部分，该核酸结合部分允许捕获和结合核糖核酸。
9.权利要求8的方法，其中所述固相材料还包含基于二氧化硅的或聚合物材料，所述材料被共价引入的表面官能团所官能化，所述官能团用于破坏细胞和吸引核酸，并且所述官能团选自羟基、硅烷醇基、羧基、氨基、铵、季铵和季鏻盐以及叔鋶盐。
10.权利要求9的方法，其中所述核酸结合部分包含多个核酸结合基团，其选自三烷基季铵、三烷基季鏻、三芳基季鏻、混合烷基芳基季鏻基团以及叔锍基。
11.权利要求10的方法，其中所述核酸结合基团选自三烷基季铵、三烷基季鏻基团，其中每个所述烷基基团具有至少4个碳原子，其中所述核酸结合基团导致细胞和病毒的裂解以释放核糖核酸。
12.权利要求6的方法，其中所述固相结合材料包含通过可选择性切割之连接键结合到基质上的核酸结合基团。
13.权利要求11的方法，其中所述固相结合材料包含通过可选择性切割之连接键结合到基质上的核酸结合基团。
14.权利要求13的方法，其中所述固相材料包含具有三丁基鏻核酸结合基团的磁性颗粒，所述基团通过可切割的芳基硫酯连接键而连接到磁性颗粒基质上。
15.权利要求14的方法，其中所述固相材料具有下式
其中
Figure A200780009268C00032
代表被共价连接的接头基团官能化的基于二氧化硅的磁性颗粒。
16.权利要求1的方法，其中所述碱性试剂包含水溶性碱性化合物的溶液，所述溶液浓度至少10-4M，pH至少约10，并且其中所述酸性溶液包含pH在1-5范围内的水溶液。
17.权利要求16的方法，其中所述碱性化合物选自碱金属氧化物、碱金属氢氧化物、碱土金属氧化物、碱土金属氢氧化物、碱金属碳酸盐、NH4OH、伯胺、仲胺和叔胺、季铵氢氧化物、季鏻氢氧化物和式为RS-M+的硫醇盐，其中M是碱金属离子，R含有1-20个碳原子，其中所述硫醇盐选自烷基硫醇盐、取代烷基硫醇盐、芳基硫醇盐、取代芳基硫醇盐、杂环硫醇盐、硫代羧酸盐/酯、二硫代羧酸盐/酯、黄原酸盐/酯、硫代氨基甲酸盐/酯和二硫代氨基甲酸盐/酯，并且其中所述酸性溶液包含有机或无机酸的水溶液，其中所述有机或无机酸选自吡啶盐、无机酸、单羧酸、二羧酸、三羧酸和氨基酸、及其碱金属、碱土金属、过渡金属、NH4 +、季铵和季鏻盐。
18.权利要求1的方法，其中在步骤a)之前使所述样品与蛋白酶接触。
19.权利要求1的方法，其中所述生物样品选自细菌培养物、细菌培养物的沉淀细胞、血液、血浆、血清、尿、痰、精液、CSF、植物细胞、动物细胞和组织匀浆物。
20.权利要求18的方法，其中所述生物样品包括病毒。
CNA200780009268XA 2006-02-16 2007-02-16 提取核酸的方法 Pending CN101535501A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US77388106P 2006-02-16 2006-02-16
US60/773,881 2006-02-16

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN101535501A true CN101535501A (zh) 2009-09-16

Family

ID=38369021

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNA200780009268XA Pending CN101535501A (zh) 2006-02-16 2007-02-16 提取核酸的方法

Country Status (9)

Country Link
US (1) US20070190526A1 (zh)
EP (1) EP1989332A4 (zh)
JP (1) JP2009527228A (zh)
KR (1) KR20090003219A (zh)
CN (1) CN101535501A (zh)
AU (1) AU2007217092A1 (zh)
CA (1) CA2642883A1 (zh)
IL (1) IL193411A0 (zh)
WO (1) WO2007098379A2 (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106520522A (zh) * 2016-12-06 2017-03-22 厦门华厦学院 一种dna萃取装置及方法
CN106607013A (zh) * 2016-12-27 2017-05-03 谭淼 一种纳米多向层析核酸提取介质及其制备方法
CN111148834A (zh) * 2017-09-27 2020-05-12 凯杰有限公司 以高收率分离rna的方法

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20150054844A (ko) * 2012-09-19 2015-05-20 베크만 컬터, 인코포레이티드 핵산 추출에서의 2가 이온, 프로테아제, 계면활성제, 및 낮은 pH의 사용
JP2015159754A (ja) * 2014-02-27 2015-09-07 セイコーエプソン株式会社 核酸増幅方法、核酸抽出用デバイス、核酸増幅反応用カートリッジ、及び核酸増幅反応用キット
WO2017017461A1 (en) * 2015-07-30 2017-02-02 Arcis Biotechnology Holdings Limited Method and composition
WO2017216270A1 (de) 2016-06-15 2017-12-21 Grabmayr Heinrich Einzelmolekülnachweis bzw. -quantifizierung durch dna-nanotechnologie
KR101995257B1 (ko) * 2017-07-24 2019-07-02 소프트팩(주) 항산화물질을 이용한 식품용 포장지
KR102094079B1 (ko) * 2018-07-27 2020-03-27 전남대학교산학협력단 실리카 코팅 자성 비드를 이용한 바이러스 rna 추출용 조성물 및 이를 이용한 바이러스 rna 추출 방법
KR102136695B1 (ko) * 2018-08-22 2020-07-22 주식회사 인퓨전텍 현장 진단용 장치를 이용한 병원체 농축 및 핵산 추출 방법

Family Cites Families (54)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4935342A (en) * 1986-12-01 1990-06-19 Syngene, Inc. Method of isolating and purifying nucleic acids from biological samples
US5599667A (en) * 1987-03-02 1997-02-04 Gen-Probe Incorporated Polycationic supports and nucleic acid purification separation and hybridization
US4921805A (en) * 1987-07-29 1990-05-01 Life Technologies, Inc. Nucleic acid capture method
US4843155A (en) * 1987-11-19 1989-06-27 Piotr Chomczynski Product and process for isolating RNA
US5756126A (en) * 1991-05-29 1998-05-26 Flinders Technologies Pty. Ltd. Dry solid medium for storage and analysis of genetic material
US5234809A (en) * 1989-03-23 1993-08-10 Akzo N.V. Process for isolating nucleic acid
US5010183A (en) * 1989-07-07 1991-04-23 Macfarlane Donald E Process for purifying DNA and RNA using cationic detergents
US5665582A (en) * 1990-10-29 1997-09-09 Dekalb Genetics Corp. Isolation of biological materials
US5155018A (en) * 1991-07-10 1992-10-13 Hahnemann University Process and kit for isolating and purifying RNA from biological sources
JP3615545B2 (ja) * 1993-02-01 2005-02-02 キアゲン・エヌ・ブイ 第四級アンモニウム塩界面活性剤及びそのｒｎａの単離剤
US5582988A (en) * 1994-09-15 1996-12-10 Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc. Methods for capture and selective release of nucleic acids using weakly basic polymer and amplification of same
US5652348A (en) * 1994-09-23 1997-07-29 Massey University Chromatographic resins and methods for using same
US5973137A (en) * 1996-02-13 1999-10-26 Gentra Systems, Inc. Low pH RNA isolation reagents, method, and kit
EP0842184B1 (fr) * 1996-03-20 2003-01-29 Bio Merieux Isolement de l'acide nucleique
EP0818461B1 (en) * 1996-07-12 2005-09-28 Toyo Boseki Kabushiki Kaisha Method for isolating ribonucleic acid
US5900481A (en) * 1996-11-06 1999-05-04 Sequenom, Inc. Bead linkers for immobilizing nucleic acids to solid supports
US6060246A (en) * 1996-11-15 2000-05-09 Avi Biopharma, Inc. Reagent and method for isolation and detection of selected nucleic acid sequences
EP0975795A1 (en) * 1997-02-24 2000-02-02 TM Technologies Inc. Process for selecting anti-sense oligonucleotides
JP2002507121A (ja) * 1997-06-25 2002-03-05 プロメガ コーポレイション Ｒｎａの単離方法
DE19736366A1 (de) * 1997-08-21 1999-02-25 Ernst Prof Dr Bayer Verfahren zur Isolierung von anionischen organischen Verbindungen aus wäßrigen Systemen mit kationischen Polymernanopartikeln
SE9703532D0 (sv) * 1997-09-30 1997-09-30 Pharmacia Biotech Ab A process for the purification of plasmid DNA
US6914137B2 (en) * 1997-12-06 2005-07-05 Dna Research Innovations Limited Isolation of nucleic acids
DE59912604D1 (de) * 1998-02-04 2005-11-03 Merck Patent Gmbh Verfahren zur isolierung und aufreinigung von nucleinsäuren
US6204375B1 (en) * 1998-07-31 2001-03-20 Ambion, Inc. Methods and reagents for preserving RNA in cell and tissue samples
US6746841B1 (en) * 1999-04-14 2004-06-08 Whatman Inc. FTA- coated media for use as a molecular diagnostic tool
US5973138A (en) * 1998-10-30 1999-10-26 Becton Dickinson And Company Method for purification and manipulation of nucleic acids using paramagnetic particles
DE19900638C2 (de) * 1999-01-11 2002-12-19 Max Planck Gesellschaft Methode zur Isolierung von DNA aus biologischen Materialien
US6270970B1 (en) * 1999-05-14 2001-08-07 Promega Corporation Mixed-bed solid phase and its use in the isolation of nucleic acids
US6310199B1 (en) * 1999-05-14 2001-10-30 Promega Corporation pH dependent ion exchange matrix and method of use in the isolation of nucleic acids
DE19943374A1 (de) * 1999-09-10 2001-03-29 Max Planck Gesellschaft Verfahren zum Anbinden von Nukleinsäuren an eine Festphase
US6916608B2 (en) * 1999-09-10 2005-07-12 Becton, Dickinson And Company Composition for providing long term stability to cells for diagnostic testing
JP4776133B2 (ja) * 2000-02-04 2011-09-21 キアゲン ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 阻害物質に富む糞便試料及び他の生物学的材料からの核酸の単離
DE10031236A1 (de) * 2000-06-27 2002-01-10 Qiagen Gmbh Verwendung von Carbonsäuren und anderen Additiven in Kombination mit kationischen Verbindungen zur Stabilisierung von Nukleinsäuren in biologischen Materialien
DK1356302T3 (da) * 2000-11-08 2008-06-02 Becton Dickinson Co Fremgangsmåde og anordning til at indsamle og stabilisere en biologisk pröve
US6602718B1 (en) * 2000-11-08 2003-08-05 Becton, Dickinson And Company Method and device for collecting and stabilizing a biological sample
WO2002055727A2 (en) * 2001-01-09 2002-07-18 Whitehead Biomedical Inst Methods and reagents for the isolation of nucleic acids
EP1399459B1 (en) * 2001-01-16 2006-04-26 Invitrogen Corporation Reagent for the isolation of rna
US6908963B2 (en) * 2001-10-09 2005-06-21 Nektar Therapeutics Al, Corporation Thioester polymer derivatives and method of modifying the N-terminus of a polypeptide therewith
EP1329506A1 (en) * 2002-01-18 2003-07-23 Cypro S.A. Method to quantify in vivo RNA levels
US20060160085A1 (en) * 2002-11-08 2006-07-20 Timo Hillebrand Novel buffer formulations for isolating purifying and recovering long-chain and short-chain nucleic acids
US20040157219A1 (en) * 2003-02-06 2004-08-12 Jianrong Lou Chemical treatment of biological samples for nucleic acid extraction and kits therefor
CA2523501A1 (en) * 2003-04-25 2004-11-11 Janssen Pharmaceutica N.V. Preservation of rna in a biological sample
US20050136477A1 (en) * 2003-11-17 2005-06-23 Hashem Akhavan-Tafti Methods for isolating nucleic acids from biological and cellular materials
US20050106577A1 (en) * 2003-11-17 2005-05-19 Hashem Akhavan-Tafti Cleavable solid phases for isolating nucleic acids
US20050106589A1 (en) * 2003-11-17 2005-05-19 Hashem Akhavan-Tafti Compositions and methods for releasing nucleic acids from solid phase binding materials
US20050106602A1 (en) * 2003-11-17 2005-05-19 Hashem Akhavan-Tafti Simplified methods for isolating nucleic acids from cellular materials
US20050106576A1 (en) * 2003-11-17 2005-05-19 Hashem Akhavan-Tafti Methods of using cleavable solid phases for isolating nucleic acids
US20050208501A1 (en) * 2004-03-16 2005-09-22 Ambion, Inc. Process and reagents for extraction of RNA from fractionated blood leukocytes
US20060024712A1 (en) * 2004-06-25 2006-02-02 Invitrogen Corporation Separation of nucleic acid
US20060008320A1 (en) * 2004-06-30 2006-01-12 Triple-T Designs, Inc. Scrapbook rack organizer
US7527929B2 (en) * 2004-07-30 2009-05-05 Agencourt Bioscience Corporation Methods of isolating nucleic acids using multifunctional group-coated solid phase carriers
KR100647306B1 (ko) * 2004-12-23 2006-11-23 삼성전자주식회사 아미노기와 카르복실기를 포함하고 제1 ｐＨ에서 양전하를띠는 물질을 이용하여 핵산을 분리하는 방법
EP2243832A3 (en) * 2005-02-18 2011-01-05 Gen-Probe Incorporated Sample preparation method incorporating an alkaline shock
US20060234251A1 (en) * 2005-04-19 2006-10-19 Lumigen, Inc. Methods of enhancing isolation of RNA from biological samples

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106520522A (zh) * 2016-12-06 2017-03-22 厦门华厦学院 一种dna萃取装置及方法
CN106607013A (zh) * 2016-12-27 2017-05-03 谭淼 一种纳米多向层析核酸提取介质及其制备方法
CN106607013B (zh) * 2016-12-27 2019-04-12 苏州海苗生物科技有限公司 一种纳米多向层析核酸提取介质及其制备方法
CN111148834A (zh) * 2017-09-27 2020-05-12 凯杰有限公司 以高收率分离rna的方法
US11725200B2 (en) 2017-09-27 2023-08-15 Qiagen Gmbh Method for isolating RNA with high yield

Also Published As

Publication number Publication date
EP1989332A4 (en) 2010-03-17
IL193411A0 (en) 2009-05-04
JP2009527228A (ja) 2009-07-30
WO2007098379A3 (en) 2008-11-20
WO2007098379A2 (en) 2007-08-30
EP1989332A2 (en) 2008-11-12
KR20090003219A (ko) 2009-01-09
AU2007217092A1 (en) 2007-08-30
CA2642883A1 (en) 2007-08-30
US20070190526A1 (en) 2007-08-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101535501A (zh) 提取核酸的方法
JP4271663B2 (ja) 固相に対する核酸の吸着
EP1668127B1 (en) Method for magnetic bead isolation of nucleic acids
AU732756B2 (en) Methods of isolating biological target materials using silica magnetic particles
JP3950478B2 (ja) 磁性色素
CN101203758A (zh) 增强生物样品中rna分离的方法
JP2009525761A (ja) Ｒｎａの抽出方法
CN102421898B (zh) 核酸纯化方法
US20050136477A1 (en) Methods for isolating nucleic acids from biological and cellular materials
EP1520041A2 (en) Remanent magnetic paricles capable of binding a target substance, their production and uses thereof
JP6684868B2 (ja) 核酸の精製のための１工程法
CN101400689A (zh) 提取rna的方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20090916