CN105087545A - 碳酸镧分离富集核酸的方法及用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了碳酸镧分离富集核酸的方法及用途，该方法将碳酸镧固体高速剪切处理，制备成碳酸镧纳米颗粒；在缓冲溶液一中，将上述碳酸镧纳米颗粒与核酸结合生成碳酸镧纳米颗粒-核酸复合物沉淀，从而与其它溶于缓冲溶液一的非核酸成分分离，再用缓冲溶液二进行洗脱，得到纯度或浓度较高的核酸，从而实现核酸的分离富集；使用过的碳酸镧纳米颗粒经稀酸淋洗后可回收再利用；本发明提供的碳酸镧分离富集核酸的方法操作简便、快速有效、成本低且绿色环保，适用于核酸的大规模批量分离富集，有利于实现核酸分离富集的自动化和机械化；另外，本发明提供的碳酸镧分离富集核酸的用途开辟了碳酸镧的新用途，为碳酸镧在其它领域的理论及实际应用研究奠定了基础。

Description

碳酸镧分离富集核酸的方法及用途

技术领域

本发明涉及碳酸镧的用途，具体涉及碳酸镧分离富集核酸的方法及用途。

背景技术

随着现代生物学技术的不断发展，生物科学的研究成果得到了广泛应用，作为生物体遗传信息的携带者，核酸(包括DNA和RNA)及其分析在后基因组时代相关的生命分析化学、临床医学诊断、疾病预防、法医检验等应用中具有重要意义，核酸的纯度是保证这些分析顺利进行的前提和基础；在实际应用中，核酸往往是从活的生物体或组织样本中提取而来，多种机体组分如蛋白质、脂类、糖类等的存在会对核酸的分析产生严重干扰，因此从复杂的样品中获得较高纯度的核酸是进行后续分析操作的前提条件；

核酸的分离主要分为粗分离和精分离两个阶段，粗分离是指将核酸与其它非核酸组分(如蛋白质、脂类、糖类等)分离，精分离是指将粗分离得到的核酸样品根据不同分子量、电荷或构型进行分离，从而得到分子量在特定范围或特定构型的DNA或RNA片段；

核酸粗分离是核酸精分离的基础和前提，现有的核酸粗分离方法主要包括酚抽提法、玻棒缠绕法、甲酰胺解聚法、柱色谱法和固定相吸附法等等，其中固定相吸附法通过特定的固定相材料与核酸进行选择性结合，进而将核酸与其它非核酸组分分离，具有操作简便快速、分离效率高、对核酸结构破坏性小、适于批量操作等优点，现有技术中的固定相材料主要包括玻璃粉、玻璃珠、磁珠及表面修饰的磁珠等等，而固定相吸附法由于固定相材料成本高且回收操作复杂而难以广泛应用；

核酸的富集包括将核酸从浓度较低的核酸溶液中提取出来，或将核酸从一种溶液体系中转移至另一种不同的溶液体系中，现有技术中常采用玻棒缠绕法对核酸进行富集，但此方法仅适用于浓度较高的核酸溶液，对核酸稀溶液中核酸的富集效率较差，而实际生产或研究的过程中提取出的核酸往往为稀溶液，采用常规方法难以有效富集其中的核酸成分，因此，亟需开发一种适用于核酸稀溶液中核酸富集的方法。

碳酸镧可用于治疗高磷酸盐血症，其原理是碳酸镧可与磷酸盐结合，生成磷酸镧复合物，从而降低体内血清磷酸盐水平；

发明人据此推测碳酸镧与核酸基本组成单位中的磷酸基团具有亲和性，可能选择性结合核酸，从而作为固定相材料对核酸进行分离富集；

基于上述推测和现有问题的存在，本发明人对碳酸镧分离富集核酸进行研究，以便研究出碳酸镧分离富集核酸的方法及用途。

发明内容

为了克服上述问题，本发明人对碳酸镧与核酸的相互作用进行了锐意研究，结果发现：在合适的缓冲溶液中，碳酸镧可以凭借其表面所带的正电荷与核酸中带负电荷的磷酸基团通过静电力结合，生成难溶的碳酸镧-核酸复合物；难溶的碳酸镧-核酸复合物可用氨羧配合剂进行洗脱，使得核酸脱离碳酸镧的结合，重新溶解到缓冲溶液中，离心除去不溶的碳酸镧后，即可得到纯度较高的核酸溶液；洗脱后的碳酸镧用少量稀酸进行淋洗后可重复使用，其与核酸的结合能力不受影响；此外，可将碳酸镧制成粒径更小的纳米颗粒，以增大其比表面积，提高碳酸镧对核酸的结合能力。

本发明的目的在于提供以下方面：

(1)使用碳酸镧进行核酸分离富集的方法，其特征在于，该方法包括：

步骤1)，将碳酸镧固体高速剪切处理，制备成碳酸镧纳米颗粒；

步骤2)，将待分离富集的核酸样品溶于缓冲溶液一中，加入步骤1)中所述碳酸镧纳米颗粒，搅拌0.2～2.5小时，优选0.3～1.8小时，最优选0.3～1.5小时，离心分离，得到固相部分一，所述固相部分一为碳酸镧纳米颗粒-核酸复合物；

步骤3)，将步骤2)中所述固相部分一用蒸馏水清洗后加入到缓冲溶液二中，搅拌0.1～1.5小时，优选0.2～1.0小时，最优选0.2～0.5小时，离心分离，得到上清液和固相部分二，所述上清液为分离富集后的核酸溶液；

步骤4)，将步骤3)中所述固相部分二使用稀酸进行淋洗，蒸馏水清洗至中性，离心分离，得到固相部分三，所述固相部分三为回收的碳酸镧纳米颗粒。

(2)根据上述(1)所述的使用碳酸镧进行核酸分离富集的方法，其特征在于，步骤1)中所述碳酸镧为La₂(CO₃)₃·xH₂O，其中x值为0～8。

(3)根据上述(1)所述的使用碳酸镧进行核酸分离富集的方法，其特征在于，步骤1)中所述碳酸镧纳米颗粒的粒径为100～500nm。

(4)根据上述(1)所述的使用碳酸镧进行核酸分离富集的方法，其特征在于，步骤2)中所述核酸包括DNA和RNA。

(5)根据上述(1)所述的使用碳酸镧进行核酸分离富集的方法，其特征在于，步骤2)中所述缓冲溶液一的pH值为5.5～9.0，优选为5.5～6.5，最优选为5.5～6.0。

(6)根据上述(1)所述的使用碳酸镧进行核酸分离富集的方法，其特征在于，步骤3)中所述缓冲溶液二为氨羧配合剂或磷酸盐缓缓冲溶液，优选为磷酸钠、磷酸一氢钠、磷酸二氢钠、磷酸钾、磷酸一氢钾、磷酸二氢钾、EDTA或EGTA缓冲溶液，最优选为磷酸二氢钠、磷酸二氢钾或EDTA缓冲溶液；所述缓冲溶液二的pH值为5.5～9.0，优选为7.0～9.0，最优选为8.0～8.5。

(7)根据上述(1)所述的使用碳酸镧进行核酸分离富集的方法，其特征在于，步骤4)中所述稀酸优选使用乙酸、稀盐酸、稀硝酸、稀高氯酸，最优选使用稀盐酸、稀硝酸、稀高氯酸。

(8)根据上述(1)所述的使用碳酸镧进行核酸分离富集的方法，其特征在于，步骤4)中所述稀酸的pH值为0～3，优选为0.2～2.5，最优选为0.3～2.0。

(9)根据上述(1)所述的使用碳酸镧进行核酸分离富集的方法，其特征在于，步骤2)、步骤3)和步骤4)中所述离心分离的转速为15000～25000r/min，优选为17000～23000r/min，最优选为18000～22000r/min。

(10)碳酸镧在核酸分离富集中的应用，其特征在于，该应用采用如上述权利要求1至9所述的使用碳酸镧进行核酸分离富集的方法。

本发明所具有的有益效果包括：

(1)本发明提供的使用碳酸镧进行核酸分离富集的方法采用碳酸镧作为固定相材料，对核酸进行分离富集，碳酸镧制备简便，价格便宜，降低了核酸分离富集的成本；

(2)本发明提供的使用碳酸镧进行核酸分离富集的方法仅需使用少量温和无毒的缓冲溶液和有机酸碱，对使用者损害小且对环境友好；

(3)本发明提供的使用碳酸镧进行核酸分离富集的方法将碳酸镧固体粉末进行高速剪切处理，制备成粒径更小的纳米颗粒，增加了比表面积，从而提高碳酸镧对核酸的结合率，提高分离富集效果；

(4)本发明提供的使用碳酸镧进行核酸分离富集的方法优选采用乙二胺四乙酸(EDTA)缓冲溶液作为洗脱剂，使核酸脱离碳酸镧的结合并重新溶解核酸，所述EDTA缓冲溶液为常用的核酸保存液，无需再对分离富集后的核酸进行二次分离，从而简化了操作步骤，便于应用实施；

(5)本发明提供的使用碳酸镧进行核酸分离富集的方法将使用过的碳酸镧用少量稀酸进行淋洗，即可重复使用，回收的碳酸镧对核酸的结合能力不受影响，从而进一步降低了使用成本；

(6)本发明提供的使用碳酸镧进行核酸分离富集的方法具有操作简便、快速有效、成本低等特点，适用于传统方法不适用的核酸的大规模批量分离富集和稀溶液中核酸的分离富集，有利于实现核酸分离富集的自动化和机械化；

(7)本发明提供的碳酸镧在核酸分离富集中的应用，开辟了碳酸镧的新用途，为碳酸镧在其它领域的理论及实际应用研究奠定了基础。

附图说明

图1示出八水合碳酸镧固体粉末的XRD图谱；

图2示出八水合碳酸镧纳米颗粒的XRD的图谱；

图3示出八水合碳酸镧固体粉末-DNA复合物的XRD图谱；

图4示出八水合碳酸镧纳米颗粒-DNA复合物的XRD图谱；

图5示出八水合碳酸镧固体粉末的红外光谱；

图6示出八水合碳酸镧固体粉末的SEM图；

图7示出八水合碳酸镧纳米颗粒的SEM图；

图8示出实施例3中反应前后溶液的紫外吸收光谱；

图9示出实施例4中反应后溶液的紫外吸收光谱；

图10示出实施例6中反应前后溶液的紫外吸收光谱；

图11示出实施例7中反应后溶液的紫外吸收光谱；

图12示出对比例1中反应前后溶液的紫外吸收光谱；

图13示出对比例2中反应前后溶液的紫外吸收光谱；

图14示出对比例3中反应前后溶液的紫外吸收光谱。

具体实施方式

下面通过附图和实施例对本发明进一步详细说明。通过这些说明，本发明的特点和优点将变得更为清楚明确。

在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。尽管在附图中示出了实施例的各种方面，但是除非特别指出，不必按比例绘制附图。

在根据本发明的优选实施方式中，提供一种使用碳酸镧进行核酸分离富集的方法，该方法包括：

步骤1)，将碳酸镧固体高速剪切处理，制备成碳酸镧纳米颗粒；

步骤2)，将待分离富集的核酸样品溶于缓冲溶液一中，加入步骤1)中所述碳酸镧纳米颗粒，搅拌0.2～2.5小时，优选0.3～1.8小时，最优选0.3～1.5小时，离心分离，得到固相部分一，所述固相部分一为碳酸镧纳米颗粒-核酸复合物；

步骤3)，将步骤2)中所述固相部分一用蒸馏水清洗后加入到缓冲溶液二中，搅拌0.1～1.5小时，优选0.2～1.0小时，最优选0.2～0.5小时，离心分离，得到上清液和固相部分二，所述上清液为分离富集后的核酸溶液；

步骤4)，将步骤3)中所述固相部分二使用稀酸进行淋洗，蒸馏水清洗至中性，离心分离，得到固相部分三，所述固相部分三为回收的碳酸镧纳米颗粒。

所述使用碳酸镧进行核酸分离富集的方法操作简便、快速有效、成本低且对环境友好，适用于核酸的大规模批量分离富集和稀溶液中核酸的分离富集，有利于实现核酸分离富集的自动化和机械化。

在根据本发明的优选实施方式中，所述碳酸镧的制备方法如下：

采用氯化镧水溶液，其中La³⁺的浓度为0.5～5mol/L，优选1～3mol/L，更优选2mol/L，pH值为0～3，然后分两个阶段向所述氯化镧水溶液中加入碳酸氢钠水溶液；

在第一阶段，快速一次加入少量碳酸氢钠水溶液，所述碳酸氢钠水溶液的浓度为0.2～4mol/L，优选0.3～3mol/L，更优选1mol/L，所述碳酸氢钠水溶液占所述氯化镧水溶液体积的0.05～0.4，优选0.1～0.3，更优选0.15～0.25，最优选0.2，此时反应液的pH值出现一个升到3左右的突越，同时出现絮状的碳酸镧沉淀；

在第二阶段，向所述反应液中缓慢滴加所述碳酸氢钠水溶液，滴加速度为0.01～10mL/s，优选0.05～5mL/s，更优选0.08～2mL/s，最优选0.1～1mL/s，直至反应液的pH值出现一个升到4左右的突越，以此判断反应终点，停止加入碳酸氢钠水溶液，在第二阶段滴加碳酸氢钠水溶液的过程中，不断生成絮状的碳酸镧沉淀；

将反应液减压过滤，滤饼用蒸馏水冲洗三次，置于通风处室温下自然晾干，得到八水合碳酸镧固体粉末。

将八水合碳酸镧固体粉末放在烘箱中，在常压下，在温度为40～120℃下保持0～24小时，得到碳酸镧水合物La₂(CO₃)₃·xH₂O,其中x值为0～8。

在根据本发明的优选实施方式中，所述碳酸镧纳米颗粒的制备方法如下：

将所述碳酸镧固体粉末放入高速剪切机中，高速剪切处理10～60分钟，优选20～60分钟，最优选40分钟，得到粒径为100～500nm的碳酸镧纳米颗粒；

如图4所示，碳酸镧固体颗粒为片状结构，其长、宽分别为3～4μm，厚度为80～120nm；如图5所示，经高速剪切处理制备的碳酸镧纳米颗粒为片状结构，其长、宽分别为100～500nm，厚度为80～120nm；由此可见，通过高速剪切处理后，碳酸镧颗粒的粒径明显减小，所述碳酸镧纳米颗粒的粒径越小，其比表面积越大，与核酸的结合能力越强，因此，在不加大制备难度的前提下，制备粒径尽量小的碳酸镧纳米颗粒有利于提高碳酸镧对核酸的分离富集效果。

在根据本发明的优选实施方式中，步骤2)中的缓冲溶液一为能完全溶解核酸、不损坏核酸结构功能、不含有磷酸基团且不影响碳酸镧与核酸相互作用的溶液，可以是本领域中常用的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液、六次甲基四胺-盐酸缓冲溶液等等；所述缓冲溶液一为弱酸性、中性或弱碱性，其pH值为5.5～9.0，优选为5.5～6.5，最优选为5.5～6.0；

基于上述条件，本发明优选地选用pH值为5.5～6.0的六次甲基四胺-盐酸缓冲溶液，使得核酸能不被损坏地完全溶解于其中，且碳酸镧与核酸的结合效果相对较好，从而更好地实现核酸的分离富集。

在根据本发明的优选实施方式中，步骤2)中为保证样品中的所有核酸均与碳酸镧纳米颗粒结合，碳酸镧纳米颗粒应为过量，使得样品中的所有核酸均得到分离富集。

在根据本发明的优选实施方式中，步骤2)中搅拌时间为保证核酸与碳酸镧纳米颗粒完全结合的最短时间，可以是0.2～2.5小时，优选0.3～1.8小时，最优选0.3～1.5小时，在保证较高的核酸分离富集效果的同时提高效率。

在根据本发明的优选实施方式中，步骤3)中的缓冲溶液二为能使碳酸镧纳米颗粒-核酸复合物分解出核酸，且不损坏核酸结构功能的缓冲溶液，可以是本领域中常用的氨羧配合剂缓冲溶液如EDTA(乙二胺四乙酸)缓冲溶液、EGTA(乙二醇二乙醚二胺四乙酸)缓冲溶液等等，也可以是磷酸盐缓冲溶液如磷酸钠、磷酸一氢钠、磷酸二氢钠、磷酸钾、磷酸一氢钾或磷酸二氢钾缓冲溶液等等；所述缓冲溶液二为弱酸性、中性或弱碱性，其pH值为5.5～9.0，优选为7.0～9.0，最优选为8.0～8.5；

基于上述条件，本发明优选地选用pH值为8.0～8.5的磷酸二氢钠、磷酸二氢钾或EDTA缓冲溶液，其中，EDTA可与核酸竞争性结合碳酸镧纳米颗粒，生成更加稳定的碳酸镧纳米颗粒-EDTA络合物沉淀，从而有效地洗脱核酸，使得核酸与碳酸镧纳米颗粒分离并重新溶解；同时，本领域中常用所述EDTA缓冲溶液保存核酸，因此，无需再对分离富集后的核酸进行二次分离，从而简化了操作步骤，便于应用实施。

在根据本发明的优选实施方式中，步骤4)中将步骤3)得到的固相部分二(碳酸镧纳米颗粒-EDTA络合物)用稀酸淋洗，洗去与碳酸镧纳米颗粒络合的EDTA，重新得到碳酸镧纳米颗粒，所述碳酸镧纳米颗粒可重复使用，其分离富集核酸的能力不受影响，从而降低了成本；

所述稀酸为本领域中常用的不与碳酸镧发生反应且不溶解碳酸镧的有机酸或无机酸，可以是稀盐酸、稀硝酸、稀高氯酸等等；所述稀酸可快速有效地洗脱EDTA，其pH值为0～3，优选为0.2～2.5，最优选为0.3～2.0；

基于上述条件，本发明优选地选用pH值为0.3～2.0的稀盐酸，洗脱效果好，且价格便宜。

在根据本发明的优选实施方式中，步骤2)、步骤3)和步骤4)中的离心方法为本领域中常用的分离固相和液相物质的方法，可以是离心、过滤等等，本发明优选地选用离心方法，操作简便，且有利于实现自动化。

本发明所具有的有益效果包括：

(1)本发明提供的使用碳酸镧进行核酸分离富集的方法采用碳酸镧作为固定相材料，对核酸进行分离富集，碳酸镧制备简便，价格便宜，降低了核酸分离富集的成本；

(2)本发明提供的使用碳酸镧进行核酸分离富集的方法仅需使用少量温和无毒的缓冲溶液和有机酸碱，对使用者损害小且对环境友好；

(3)本发明提供的使用碳酸镧进行核酸分离富集的方法将碳酸镧固体粉末进行高速剪切处理，制备成粒径更小的纳米颗粒，增加了比表面积，从而提高碳酸镧对核酸的结合率，提高分离富集效果；

(4)本发明提供的使用碳酸镧进行核酸分离富集的方法优选采用乙二胺四乙酸(EDTA)缓冲溶液作为洗脱剂，使核酸脱离碳酸镧的结合并重新溶解核酸，所述EDTA缓冲溶液为常用的核酸保存液，无需再对分离富集后的核酸进行二次分离，从而简化了操作步骤，便于应用实施；

(5)本发明提供的使用碳酸镧进行核酸分离富集的方法将使用过的碳酸镧用少量稀酸进行淋洗，即可重复使用，回收的碳酸镧对核酸的结合能力不受影响，从而进一步降低了使用成本；

(6)本发明提供的使用碳酸镧进行核酸分离富集的方法具有操作简便、快速有效、成本低等特点，适用于传统方法不适用的核酸的大规模批量分离富集和稀溶液中核酸的分离富集，有利于实现核酸分离富集的自动化和机械化；

(7)本发明提供的碳酸镧在核酸分离富集中的应用，开辟了碳酸镧的新用途，为碳酸镧在其它领域的理论及实际应用研究奠定了基础。

实施例

实施例1八水合碳酸镧的制备

将50mL氯化镧水溶液置于烧瓶中，其中La³⁺的浓度为2mol/L，pH值为0～2，然后快速一次向上述氯化镧水溶液中加入10mL1mol/L的碳酸氢钠水溶液，此时反应液的pH值出现一个升到3左右的突越，同时出现絮状的碳酸镧沉淀；然后以0.08mL/s的速度向上述反应液中缓慢滴加1mol/L的碳酸氢钠水溶液，同时监测反应液的pH值，至反应液的pH值出现一个升到4左右的突越，即为反应终点，停止加入碳酸氢钠水溶液，在此过程中共加入320mL1mol/L的碳酸氢钠水溶液，反应液中不断生成絮状的碳酸镧沉淀；

将上述反应液减压过滤，滤饼用蒸馏水冲洗三次，置于通风处室温下自然晾干，得到八水合碳酸镧固体粉末。

实施例2碳酸镧纳米颗粒的制备

将按照实施例1所述方法制备的八水合碳酸镧固体粉末放入高速剪切机中，高速剪切处理40分钟，得到粒径为100～500nm的碳酸镧纳米颗粒。

实施例3碳酸镧纳米颗粒与核酸结合(一)

将0.100gDNA样品(购自Sigma公司的鲑鱼精DNA)溶于100mlpH为5.8的10mmol/L六次甲基四胺-盐酸缓冲溶液中，完全溶解后取上述DNA溶液200μL于10.00ml容量瓶，蒸馏水定容，然后加入10.00g碳酸镧纳米颗粒，搅拌0.5小时，20000r/min下离心10分钟，得到上清液一与固相部分一，所述上清液一中含有未被碳酸镧纳米颗粒结合的游离DNA，所述固相部分一即为碳酸镧纳米颗粒-DNA复合物沉淀。

实施例4碳酸镧-核酸复合物洗脱(一)

分离实施例3中得到的上清液一和固相部分一，蒸馏水洗涤固相部分一、离心分离，重复三次，然后将所述固相部分一加入50.0mLpH为8.0的10mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸的含50mmol/LEDTA的缓冲溶液中，搅拌15分钟，20000r/min下离心10分钟，得到上清液二和固相部分二，所述上清液二中含有分离富集后的DNA，所述固相部分二为洗脱后的碳酸镧纳米颗粒-EDTA络合物沉淀。

实施例5碳酸镧纳米颗粒回收

分离实施例4中得到的上清液二和固相部分二，蒸馏水洗涤固相部分二、离心分离，重复三次，然后将所述固相部分二加入50.0mLpH为1的稀盐酸中，搅拌15分钟，20000r/min下离心10分钟，得到上清液三和固相部分三，所述上清液三中含有洗脱后的EDTA，所述固相部分三为洗脱后的碳酸镧纳米颗粒，蒸馏水洗涤上述固相部分三、离心分离，重复三次，得到回收的碳酸镧纳米颗粒。

实施例6碳酸镧纳米颗粒与核酸结合(二)

将0.100gDNA样品(购自Sigma公司的鲑鱼精DNA)溶于少量蒸馏水中，用0.01ml/L的NaHCO₃溶液调节pH，配成100.00mlpH为5.5的DNA溶液，向上述DNA溶液中加入5.00g碳酸镧纳米颗粒，搅拌0.5小时，离心分离，得到上清液一与固相部分一，所述上清液一中含有未被碳酸镧纳米颗粒结合的游离DNA，所述固相部分一即为碳酸镧纳米颗粒-DNA复合物沉淀。

实施例7碳酸镧-核酸复合物洗脱(二)

分离实施例6中得到的上清液一和固相部分一，蒸馏水洗涤固相部分一、抽滤，重复三次，然后将所述固相部分一加入50.0mL浓度为0.115mmol/L的KH₂PO₄溶液中，搅拌30分钟后离心分离，得到上清液二和固相部分二，所述上清液二中含有分离富集后的DNA，所述固相部分二为洗脱后的碳酸镧纳米颗粒-KH₂PO₄络合物沉淀。

实验例

实验例1X-射线衍射(XRD)实验

X射线多晶衍射仪(XRD，RigakuDmax-2000)：CuK单色辐射源，加速电压40kV，电流150mV，用于测定样品的晶型及其变化、结晶度、结晶完善程度；扫描范围：5～60°，采用连续扫描方式，分别测定碳酸镧固体粉末、碳酸镧纳米颗粒、碳酸镧固体粉末-DNA复合物和碳酸镧纳米颗粒-DNA复合物的XRD图谱，结果如图1、图2、图3和图4所示。

实验例2IR(红外光谱)测定

使用ThermoScientific公司NICOLETiN10MX显微红外光谱仪测定八水合碳酸镧的红外光谱，检测器：MCT/A；分束器：KBr/Ge；扫描次数：64；分辨率：4cm^-1，结果如图5所示。

实验例3SEM(扫描电子显微镜)观察

使用JEOL公司生产的JSM-6700F型场发射扫描电子显微镜进行，加速电压为5kV，分别观察碳酸镧固体粉末和碳酸镧纳米颗粒的形态，结果如图6和图7所示。

实验例4UV-vis(紫外-可见)分光光度法测定反应前后溶液的紫外吸收光谱，并计算碳酸镧纳米颗粒与核酸的结合率和核酸的洗脱率，

分别取实施例3中反应前的DNA溶液和反应、离心后得到的上清液一200μL于10.00mL容量瓶，蒸馏水定容；

分别取实施例4中反应、离心后得到的上清液二200μL于10.00mL容量瓶，蒸馏水定容；

分别取实施例6中反应前的DNA溶液和反应、离心后得到的上清液一1000μL于10.00mL容量瓶，蒸馏水定容；

分别取实施例4中反应、离心后得到的上清液二500μL于10.00mL容量瓶，蒸馏水定容；

使用紫外-可见光光谱仪(LAMBDA35，美国Perkinelmer)进行光谱测定，扫描波长范围为220～320nm，分别测定蒸馏水稀释后的上述溶液的紫外吸收光谱，结果如图8-11所示；

分别读取图8和图9中260nm处的吸光度数值，其中实施例3中反应前溶液的吸光度为A_260-1，反应、离心后上清液一的吸光度为A_260-2，实施例4中反应、离心后上清液二的吸光度为A_260-3，实施例6中反应前溶液的吸光度为A_260-4，反应、离心后上清液一的吸光度为A_260-5，实施例7中反应、离心后上清液二的吸光度为A_260-6，然后按如下公式计算碳酸镧纳米颗粒与DNA的结合率以及DNA的洗脱率：

结合率＝(A_260-1－A_260-2)/A_260-1×100％

洗脱率＝(0.5×A_260-3)/(A_260-1－A_260-2)×100％

经计算，实施例3中碳酸镧纳米颗粒与DNA的结合率为51.6％，实施例4中DNA的洗脱率为100％。

分别读取图10和图11中260nm处的吸光度数值，其中实施例6中反应前溶液的吸光度为A_260-4，反应、离心后上清液一的吸光度为A_260-5，实施例7中反应、离心后上清液二的吸光度为A_260-6，然后按如下公式计算碳酸镧纳米颗粒与DNA的结合率以及DNA的洗脱率：

结合率＝(A_260-4－A_260-5)/A_260-4×100％

洗脱率＝A_260-6/(A_260-4－A_260-5)×100％

经计算，实施例6中碳酸镧纳米颗粒与DNA的结合率为48.4％，实施例7中DNA的洗脱率为68％。

实验例5回收的碳酸镧纳米颗粒重复利用

将实施例5中回收的碳酸镧纳米颗粒按照与实施例3、实施例4相同的方法用于分离富集DNA，然后按照与实验例4相同的方法计算回收的碳酸镧纳米颗粒与DNA的结合率，结果显示，回收的碳酸镧纳米颗粒与DNA的结合率为51.6％。

对比例

对比例1

按照类似于本发明实施例3中所述方法将碳酸镧纳米颗粒与DNA结合，区别在于，将实施例3所述方法中的pH为5.8的10mmol/L六次甲基四胺-盐酸缓冲溶液替换为pH为7.2的10mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液，然后按照与实验例4相同的方法测定碳酸镧纳米颗粒与DNA的结合率，结果显示，结合率为29.9％。

对比例2

按照类似于本发明实施例3中所述方法将碳酸镧纳米颗粒与DNA结合，区别在于，将实施例3所述方法中的pH为5.8的10mmol/L六次甲基四胺-盐酸缓冲溶液替换为pH为6.2的10mmol/L六次甲基四胺-盐酸缓冲溶液，然后按照与实验例4相同的方法测定碳酸镧纳米颗粒与DNA的结合率，结果显示，结合率为36.4％。

对比例3

按照类似于本发明实施例3中所述方法将碳酸镧固体粉末与DNA结合，区别在于，将实施例3所述方法中的碳酸镧纳米颗粒替换为碳酸镧固体粉末，然后按照与实验例4相同的方法测定碳酸镧与DNA的结合率，结果显示，结合率为36.9％。

对比例4

按照类似于本发明实施例3中所述方法将碳酸镧纳米颗粒与DNA结合，区别在于，将实施例3所述方法中粒径为100～500nm的碳酸镧纳米颗粒替换为粒径为600～1000nm的碳酸镧纳米颗粒，所述粒径为600～1000nm的碳酸镧纳米颗粒为按照类似于本发明实施例2中所述方法制备得到，区别在于，高速剪切处理时间为15分钟，然后按照与实验例4相同的方法测定碳酸镧纳米颗粒与DNA的结合率，结果显示，结合率为43.5％。

对比例5

按照类似于本发明实施例3中所述方法将碳酸钙颗粒与DNA结合，区别在于，将实施例3所述方法中的碳酸镧纳米颗粒替换为碳酸钙颗粒，然后按照与实验例4相同的方法测定碳酸钙与DNA的结合率，结果显示，结合率为9.87％。

对比例6

按照类似于本发明实施例3中所述方法将二氧化硅颗粒与DNA结合，区别在于，将实施例3所述方法中的碳酸镧纳米颗粒替换为二氧化硅颗粒，然后按照与实验例4相同的方法测定二氧化硅与DNA的结合率，结果显示，结合率为0.00％。

在本发明的描述中，需要说明的是，术语“上”、“下”、“内”、等指示的方位或位置关系为基于本发明工作状态下的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。

以上结合优选实施方式和范例行实例对本发明进行了详细说明。不过需要声明的是，这些具体实施方式仅是对本发明的阐述性解释，并不对本发明的保护范围构成任何限制。在不超出本发明精神和保护范围的情况下，可以对本发明技术内容及其实施方式进行各种改进、等价替换或修饰，这些均落入本发明的保护范围内。本发明的保护范围以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.使用碳酸镧进行核酸分离富集的方法，其特征在于，该方法包括：

步骤1)，将碳酸镧固体高速剪切处理，制备成碳酸镧纳米颗粒；

步骤2)，将待分离富集的核酸样品溶于缓冲溶液一中，加入步骤1)中所述碳酸镧纳米颗粒，搅拌0.2～2.5小时，优选0.3～1.8小时，最优选0.3～1.5小时，离心分离，得到固相部分一，所述固相部分一为碳酸镧纳米颗粒-核酸复合物；

步骤3)，将步骤2)中所述固相部分一用蒸馏水清洗后加入到缓冲溶液二中，搅拌0.1～1.5小时，优选0.2～1.0小时，最优选0.2～0.5小时，离心分离，得到上清液和固相部分二，所述上清液为分离富集后的核酸溶液；

步骤4)，将步骤3)中所述固相部分二使用稀酸进行淋洗，蒸馏水清洗至中性，离心分离，得到固相部分三，所述固相部分三为回收的碳酸镧纳米颗粒。

2.根据权利要求1所述的使用碳酸镧进行核酸分离富集的方法，其特征在于，步骤1)中所述碳酸镧为La₂(CO₃)₃·xH₂O，其中x值为0～8。

3.根据权利要求1所述的使用碳酸镧进行核酸分离富集的方法，其特征在于，步骤1)中所述碳酸镧纳米颗粒的粒径为100～500nm。

4.根据权利要求1所述的使用碳酸镧进行核酸分离富集的方法，其特征在于，步骤2)中所述核酸包括DNA和RNA。

5.根据权利要求1所述的使用碳酸镧进行核酸分离富集的方法，其特征在于，步骤2)中所述缓冲溶液一的pH值为5.5～9.0，优选为5.5～6.5，最优选为5.5～6.0。

6.根据权利要求1所述的使用碳酸镧进行核酸分离富集的方法，其特征在于，步骤3)中所述缓冲溶液二为氨羧配合剂或磷酸盐缓冲溶液，优选为磷酸钠、磷酸一氢钠、磷酸二氢钠、磷酸钾、磷酸一氢钾、磷酸二氢钾、EDTA或EGTA缓冲溶液，最优选为磷酸二氢钠、磷酸二氢钾或EDTA缓冲溶液；所述缓冲溶液二的pH值为5.5～9.0，优选为7.0～9.0，最优选为8.0～8.5。

7.根据权利要求1所述的使用碳酸镧进行核酸分离富集的方法，其特征在于，步骤4)中所述稀酸优选使用乙酸、稀盐酸、稀硝酸、稀高氯酸，最优选使用稀盐酸、稀硝酸、稀高氯酸。

8.根据权利要求1所述的使用碳酸镧进行核酸分离富集的方法，其特征在于，步骤4)中所述稀酸的pH值为0～3，优选为0.2～2.5，最优选为0.3～2.0。

9.根据权利要求1所述的使用碳酸镧进行核酸分离富集的方法，其特征在于，步骤2)、步骤3)和步骤4)中所述离心分离的转速为15000～25000r/min，优选为17000～23000r/min，最优选为18000～22000r/min。

10.碳酸镧在核酸分离富集中的应用，其特征在于，该应用采用如上述权利要求1至9所述的使用碳酸镧进行核酸分离富集的方法。