JP7281140B2 - 生体関連物質とブロックポリマーとの結合体、および前記結合体を得るためのブロックポリマー誘導体 - Google Patents

生体関連物質とブロックポリマーとの結合体、および前記結合体を得るためのブロックポリマー誘導体 Download PDF

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Description

本発明は、生体関連物質とアニオン性のブロックポリマーとの結合体、および前記結合体を得るためのブロックポリマー誘導体に関する。
ホルモンやサイトカイン、抗体、酵素などの生体関連物質を用いた医薬品は、通常生体内へ投与されると、腎臓における糸球体濾過や肝臓や脾臓などにおけるマクロファージによる取り込みによって、生体内から速やかに排出されてしまう。そのため血中半減期が短く、十分な薬理効果を得ることが困難であることが多い。
かかる問題を解決するため、生体関連物質を、糖鎖、ポリエチレングリコールなどの親水性高分子、アルブミンなどによって化学修飾する試みが行われている。その結果、分子量の増大や水和層の形成などにより、生体関連物質の血中半減期を延長することが可能となる。
また、ポリエチレングリコールで修飾することで、生体関連物質の毒性や抗原性の低下、難水溶性薬物の溶解性向上などの効果が得られることも良く知られている。
ポリエチレングリコールで修飾された生体関連物質は、ポリエチレングリコールのエーテル結合と水分子との水素結合により形成される水和層で覆われ、分子サイズが増大する。そのため腎臓における糸球体濾過を回避することができる。さらにオプソニンや、各組織を構成する細胞の表面との相互作用が低下し、各組織への移行が減少することが知られている。
ポリエチレングリコールは、生体関連物質の血中半減期を延長させ得る優れた素材であり、ポリエチレングリコールで修飾した生体関連物質の研究が多数行なわれ、それらの血中半減期を有意に延長できるという結果が得られている。
しかしながら、さらに血中半減期を延長できる新たな素材が求められている。
生体関連物質の血中半減期を延長させる他の方法としては、負の電荷を生体関連物質に付与する方法が挙げられる。腎臓の糸球体毛細血管壁には、負に帯電したグリコカリックスが存在するため、負の電荷を複数有する分子は、グリコカリックスとの静電反発により糸球体からの排出が抑制されることが知られている。
非特許文献１では、酵素であるペルオキシダーゼに負電荷を付与したところ、腎臓からの排出が有意に抑制されたことが報告されている。また非特許文献２では、負電荷を付与したデキストランポリマーにおいて、腎臓からの排出が抑制されたことが確認されている。
生体関連物質の血中半減期を延長させるために、ポリエチレングリコールの修飾による分子サイズの増大効果と、負電荷を付与する効果の両方を併せ持つ素材があれば、生体関連物質の血中半減期のさらなる延長が期待できる。ポリエチレングリコール誘導体に負電荷を付与する方法はいくつかあるが、ポリエチレングリコールに複数の負電荷を効率よく導入し得る方法として、ポリエチレングリコールとアニオン性のポリアミノ酸を組み合わせたブロックポリマーが考えられる。一般的なポリエチレングリコールとアニオン性のポリアミノ酸のブロックポリマーの応用例としては、以下のようなものが挙げられる。
たとえば、特許文献１には、ポリエチレングリコール、ポリサッカライド、ポリアクリルアミド等と、ポリアスパラギン酸等のポリアミノ酸とのブロックポリマーに、疎水性の薬物を結合させてなる水溶性高分子医薬が記載されている。特許文献２には、ポリエチレ
ングリコール類とポリグルタミン酸とのブロックポリマーに、抗癌剤を結合させた水溶性高分子抗癌剤が記載されている。特許文献３には、ポリエチレングリコールとポリアスパラギン酸またはポリグルタミン酸とのブロックポリマーからなる薬物の担体が記載されている。
上記特許文献に記載されたブロックポリマーは、総じて自己会合により高分子ミセルを形成し、ミセル内部に取り込まれた薬物の送達に用いられる。ブロックポリマーのポリアミノ酸部分の側鎖に存在するカルボキシル基は、薬物を共有結合させるのに利用され、高分子ミセルが形成された際には、ミセルの内部に取り込まれることになる。それゆえ、これらポリアミノ酸部分におけるカルボキシル基が負電荷を有するとしても、腎臓からの排出は抑制されない。また、これらブロックポリマーは、ポリアミノ酸部分のカルボキシル基以外に官能基を有しないことから、生体関連物質を修飾することができない。さらに、前記ブロックポリマーは、水溶液中ではミセルを形成してしまうため、生体関連物質の修飾には適していない。
従って、血中半減期がさらに延長され、生体の血中での安定性がより向上された生体関連物質の修飾体が求められている。
特許第２６９４９２３号公報 特許第３３１００００号公報 特許第３２６８９１３号公報
H.G. Rennke, Y. Patel, M.A, Venkatachalam; Kidney Int. 13 (1978) 324-328 R.L.S. Chang, W.M. Deen, C.R. Robertson, B.M. Brenner; Kidney Int. 8 (1975) 212-218
そこで、本発明の課題は、血中半減期がさらに延長され、生体の血中での安定性がより向上された、アニオン性を有するブロックポリマーにより修飾された生体関連物質を提供することにある。より具体的には、アニオン性のポリアミノ酸と親水性のポリエチレングリコールのブロックポリマー誘導体で修飾され、生体内の血中での安定性が向上した生体関連物質を提供することにある。
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、アニオン性のポリアミノ酸と親水性のポリエチレングリコールのブロックポリマー誘導体と、生体関連物質との結合体とすることにより、生体関連物質の血中半減期をさらに延長することができ、生体の血中での安定性を向上させ得ることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は以下に示す通りである。
［１］下記式（１）で表される、ブロックポリマーと生体関連物質との結合体。
Figure 0007281140000001
（式中、Ａは生体関連物質を示し、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３はそれぞれ独立して単結合または２価のリンカーを示し、Ｑは２個または３個の活性水素を有する化合物の残基を示す。ｍは１０～１４００であり、ｎは２～１００である。ｘは１または２であり、Ｒは水素原子またはアシル基を示し、ｐは１または２であり、ｙは１～４０である。）
［２］式（１）において、ｙが１である、［１］に記載の結合体。
［３］式（１）において、ｍが４０～１２００であり、ｎが５～５０である、［１］または［２］に記載の結合体。
［４］式（１）において、Ｑが、エチレングリコール、グリセリン、リシン、アスパラギン酸およびグルタミン酸からなる群より選択される化合物の残基である、［１］～［３］のいずれかに記載の結合体。
［５］式（１）において、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３が、それぞれ独立して、単結合、フェニレン基、アミド結合、エーテル結合、チオエーテル結合、ウレタン結合、第２級アミノ基、カルボニル基、ウレア結合、トリアジン基、チオールの付加されたマレイミド基、オキシム結合、ならびに、単結合、フェニレン基、アミド結合、エーテル結合、チオエーテル結合、ウレタン結合、第２級アミノ基、カルボニル基、ウレア結合、トリアジン基、チオールの付加されたマレイミド基およびオキシム結合からなる群より選択される１種以上を含んでいてもよいアルキレン基からなる群より選択される、［１］～［４］のいずれかに記載の結合体。
［６］式（１）において、Ａが、サイトカイン、ホルモン、酵素、抗体および核酸からなる群より選択される生体関連物質である、［１］～［５］のいずれかに記載の結合体。
［７］［１］～［６］のいずれかに記載の結合体を得るための中間体であって、下記式（２）で表される、ブロックポリマー誘導体。
Figure 0007281140000002
（式中、Ｘは生体関連物質と化学反応可能な官能基を示し、Ｌ2、Ｌ３、Ｌ４はそれぞれ
独立して単結合または２価のリンカーを示し、Ｑは２個または３個の活性水素を有する化合物の残基を示す。ｍは１０～１４００であり、ｎは２～１００である。ｘは１または２であり、Ｒは水素原子またはアシル基を示し、ｐは１または２である。）
［８］式（２）において、Ｑが、エチレングリコール、グリセリン、リシン、アスパラギン酸およびグルタミン酸からなる群より選択される化合物の残基である、［７］に記載のブロックポリマー誘導体。
［９］式（２）において、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４が、それぞれ独立して、単結合、フェニレン基、アミド結合、エーテル結合、チオエーテル結合、ウレタン結合、第２級アミノ基、カルボニル基、ウレア結合、ならびに、単結合、フェニレン基、アミド結合、エーテル結合
、チオエーテル結合、ウレタン結合、第２級アミノ基、カルボニル基およびウレア結合からなる群より選択される１種以上を含んでいてもよいアルキレン基からなる群より選択される、［７］または［８］に記載のブロックポリマー誘導体。
［１０］式（２）において、Ｘが、活性エステル基、活性カーボネート基、アルデヒド基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、エポキシ基、カルボキシル基、チオール基、マレイミド基、置換マレイミド基、ヒドラジド基、ピリジルジチオ基、置換スルホ基、アミノ基、オキシアミノ基、ヨードアセトアミド基、アルキルカルボニル基、アルケニル基、アルキニル基、アジド基、アクリロイル基、スルホニルオキシ基、α－ハロアセチル基、アリル基およびビニル基からなる群より選択される反応性官能基である、［７］～［９］のいずれかに記載のブロックポリマー誘導体。
本発明により、アニオン性を有するブロックポリマーで修飾された生体関連物質を得ることができる。
上記の修飾された生体関連物質は、ブロックポリマーを構成するポリエチレングリコールによる分子サイズの増大効果と、アニオン性のポリアミノ酸による負電荷の付与効果により、血中半減期が延長され、生体の血中での安定性が向上される。
図１は、実施例１（２）のブロックポリマー誘導体（１８）のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ分析の結果を示す図である。 図２は、実施例９（１）のブロックポリマー誘導体（２３）とＧＣＳＦとの結合体（２８）の反応液のＲＰ－ＨＰＬＣ分析の結果を示す図である。 図３は、実施例９（１）のブロックポリマー誘導体（２３）とＧＣＳＦとの結合体（２８）の陽イオン交換クロマトグラフィー精製の結果を示す図である。 図４は、実施例９（１）のブロックポリマー誘導体（２３）とＧＣＳＦとの結合体（２８）のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ分析の結果を示す図である。 図５は、実施例９（１）のブロックポリマー誘導体（２３）とＧＣＳＦとの結合体（２８）のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析の結果を示す図である。 図６は、実施例９（４）のブロックポリマー誘導体（２６）とＧＣＳＦとの結合体（３１）の反応液のＲＰ－ＨＰＬＣ分析の結果を示す図である。 図７は、実施例９（４）のブロックポリマー誘導体（２６）とＧＣＳＦとの結合体（３１）のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ分析の結果を示す図である。 図８は、実施例１０（１）のブロックポリマー誘導体（１９）とＧＣＳＦとの結合体（３３）の反応液のＲＰ－ＨＰＬＣ分析の結果を示す図である。 図９は、比較例１のメトキシＰＥＧ－ＧＣＳＦ結合体（３６）のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ分析の結果を示す図である。 図１０は、試験例１において、ＧＣＳＦ、ブロックポリマー誘導体（２６）とＧＣＳＦとの結合体（３１）、メトキシＰＥＧ－ＧＣＳＦ結合体（３６）について、ラットを用いた薬物動態評価の結果を示す図である。 図１１は、実施例１１（１）のブロックポリマー誘導体（２６）とｈＧＨとの結合体（３７）の反応液のＲＰ－ＨＰＬＣ分析の結果を示す図である。 図１２は、実施例１１（１）のブロックポリマー誘導体（２６）とｈＧＨとの結合体（３７）の反応液の陽イオン交換クロマトグラフィー精製の結果を示す図である。 図１３は、実施例１１（１）のブロックポリマー誘導体（２６）とｈＧＨとの結合体（３７）のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析の結果を示す図である。 図１４は、比較例２のメトキシＰＥＧ－ｈＧＨ結合体（３９）の反応液のＲＰ－ＨＰＬＣ分析の結果を示す図である。 図１５は、試験例２において、各グループの下垂体摘出ラットの体重測定の結果を示す図である。 図１６は、試験例２において、各グループの下垂体摘出ラットについて、初期の体重で補正した頚骨長の増加量を示す図である。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、アニオン性ブロックポリマーと、生体関連物質との結合体（以下、本明細書にて「本発明の結合体」ともいう）を提供する。
本発明の結合体は、ポリエチレングリコールとポリアミノ酸とが直接またはリンカーを介して結合されたブロックポリマー誘導体と、生体関連物質とが結合されて形成され、下記の式（１）で示される。
Figure 0007281140000003
（式中、Ａは生体関連物質を示し、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３はそれぞれ独立して単結合または２価のリンカーを示し、Ｑは２個または３個の活性水素を有する化合物の残基を示す。ｍは１０～１４００であり、ｎは２～１００である。ｘは１または２であり、Ｒは水素原子またはアシル基を示し、ｐは１または２であり、ｙは１～４０である。）
式（１）中、ｍはエチレングリコールの重合度を示し、通常１０～１４００であり、好ましくは４０～１２００であり、さらに好ましくは１００～１０００である。
式（１）中、ｎはアミノ酸の重合度を示し、通常２～１００であり、好ましくは５～５０であり、さらに好ましくは５～３０である。
式（１）中のエチレングリコールの重合度と、アミノ酸の重合度との比（ｍ／ｎ）は、通常１～５００であり、好ましくは２～２４０であり、さらに好ましくは５～２００である。
ｍ／ｎ値が１よりも小さい、つまりエチレングリコールの重合度がアミノ酸の重合度よりも小さいと、ポリエチレングリコールによる分子サイズの増大効果が十分に得られない可能性がある。また、ｍ／ｎ値が５００よりも大きい、つまりアミノ酸の重合度が小さい場合、アニオン性のポリアミノ酸による負電荷の付与効果が十分に得られない可能性がある。
式（１）中、ｘは１または２である。ｘが１である場合、式（１）中のポリアミノ酸部を構成するアミノ酸はアスパラギン酸であり、ｘが２である場合、式（１）中のポリアミノ酸部を構成するアミノ酸はグルタミン酸である。
ポリアミノ酸部を構成するアミノ酸としては、グルタミン酸（式（１）中、ｘ＝２）がより好ましい。
また、ポリアミノ酸部を構成するアミノ酸としては、Ｌ体、Ｄ体、ＤＬ体のいずれでもよいが、より好ましくはＬ体である。
式（１）中、Ｒで示される基は、水素原子またはアシル基であり、好ましくはアシル基である。
アシル基としては、炭素数２～４の飽和アシル基が好ましく、具体的な例としてはアセチル基、プロピオニル基などが挙げられ、好ましくはアセチル基である。
本発明の結合体を形成するブロックポリマー誘導体の１分子あたりの分子量は、通常５，０００～１００，０００であり、好ましくは１０，０００～８０，０００であり、更に好ましくは２０，０００～６０，０００である。ここでいう分子量とは、ゲル浸透クロマトグラフィーにより測定され、算出される数平均分子量（Ｍｎ）をいう。
本発明において、上記したブロックポリマー誘導体と生体関連物質は、２個または３個の活性水素を有する化合物を介して、または前記化合物と２価のリンカーを介して結合される。
従って、式（１）中、Ｑは、２個または３個の活性水素を有する化合物の残基を示す。
ここで、「活性水素」とは、有機化合物の分子内水素のうち、反応性の高い水素をいい、たとえば、水酸基、カルボキシル基、アミノ基、チオール基等の水素が挙げられる。なお、本発明においては、第１級アミノ基の場合は、活性水素は１個と数える。
本発明において、２個または３個の活性水素を有する化合物としては、好ましくはエチレングリコール、グリセリン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸等が挙げられ、より好ましくはエチレングリコールおよびグリセリンが挙げられる。
それゆえ、「２個の活性水素を有する化合物の残基」としては、エチレングリコールなどの残基が挙げられ、「３個の活性水素を有する化合物の残基」としては、グリセリン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸などの残基が挙げられる。
本発明の結合体において、式（１）中のｐが１である場合、本発明の結合体におけるブロックポリマー誘導体部は直鎖型であり、ｐが２である場合、本発明の結合体におけるブロックポリマー誘導体部は２分岐鎖型である。
本発明の結合体において、生体関連物質に結合するブロックポリマー誘導体の分子数は、式（１）中のｙで示され、通常１～４０であり、好ましくは１～２０であり、さらに好ましくは１～１０である。生体関連物質に結合するブロックポリマー誘導体の分子数ｙを増やすことで得られる効果としては、血中半減期の延長、抗原性の低減などが挙げられる。生体関連物質の種類によっては、ブロックポリマー誘導体の結合量が多くなると、活性が低下する可能性がある。そのような生体関連物質については、ブロックポリマー誘導体分子の結合数ｙを１とすることが好ましい。
なお、酵素などの生体関連物質においては、複数のポリマー誘導体を結合させても活性が低下しないことが知られている。
式（１）中、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３は、それぞれ独立して、単結合または２価のリンカーであり、共有結合を形成し得る結合または基であれば特に制限されないが、好ましくは、単結合、フェニレン基、アミド結合、エーテル結合、チオエーテル結合、ウレタン結合、第２級アミノ基、カルボニル基、ウレア結合、トリアジン基、チオールの付加されたマレイミド基、オキシム結合、前記結合および基からなる群より選択される１種以上を含んでいてもよいアルキレン基であり、より好ましくは、単結合、アミド結合、エーテル結合、チオエーテル結合、ウレタン結合、第２級アミノ基、トリアジン基、チオールの付加されたマレイミド基、オキシム結合、前記結合および基からなる群より選択される１種以上と１個または２個のアルキレン基とが結合して形成される基であり、特に好ましい態様は、下記の群（Ｉ）に示されるものである。なお、エステル結合とカーボネート結合は、生体の血中で徐々に分解するため適さない。
群（Ｉ）：
Figure 0007281140000004
群（Ｉ）のリンカー（ｚ１）～（ｚ１１）において、式中のｓは０～１０の整数を示し、好ましくは０～６の整数を示し、更に好ましくは０～３の整数を示す。また、リンカー（ｚ２）～（ｚ１１）において、式中の２個のｓは同一であってもよく、異なっていてもよい。
式（１）中、Ｌ１で示されるリンカーとしては、上記の群（Ｉ）の（ｚ３）、（ｚ４）、（ｚ５）、（ｚ６）、（ｚ７）、（ｚ８）、（ｚ１０）、（ｚ１１）が好ましく、（ｚ３）、（ｚ４）、（ｚ５）、（ｚ６）、（ｚ１０）、（ｚ１１）がより好ましく、（ｚ３）、（ｚ５）、（ｚ１０）が特に好ましい。
式（１）中、Ｌ２またはＬ３で示されるリンカーとしては、上記の群（Ｉ）の（ｚ１）、（ｚ２）、（ｚ３）、（ｚ４）、（ｚ５）、（ｚ６）、（ｚ９）が好ましく、（ｚ１）、（ｚ２）、（ｚ３）、（ｚ４）、（ｚ６）がより好ましい。
式（１）中、Ａで示される生体関連物質は、ヒトまたは他の動物の疾患の診断、治療または予防に関わる物質であれば、特に制限されない。具体的にはタンパク質、ペプチド、核酸、細胞、ウィルスなどが挙げられ、タンパク質、ペプチドおよび核酸が好ましく用いられる。
タンパク質またはペプチドとしては、サイトカイン、成長因子、血液凝固因子、ホルモン、抗体、抗体フラグメント、酵素などが挙げられる。
より具体的には、サイトカインとしては、免疫を調節するインターフェロンタイプＩ、タイプＩＩ、タイプＩＩＩ、インターロイキン、リンフォカイン；造血因子であるエリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）；細胞増殖因子である上皮成長因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）；細胞傷害因子である腫瘍壊死因子（ＴＮＦ－α）、リンフォトキシン（ＴＮＦ－β）；アディポカイン；神経栄養
因子である神経成長因子（ＮＧＦ）；それらの受容体アンタゴニストなどが挙げられる。
成長因子としては、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、トロンボポエチン、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）などが挙げられる。
血液凝固因子としては、フィブリノーゲン、フィブリン、血液凝固第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩＩ因子などが挙げられる。
ホルモンとしては、カルシトニン、インスリン、そのアナログ、グルカゴン様ペプチド（ＧＬＰ－１）、エクセナチド（ＧＬＰ－１受容体アゴニスト）、ソマトスタチン、ヒト成長ホルモンなどが挙げられる。
抗体としては、完全長抗体、また抗体フラグメントとして、ＦａｂやｓｖＦＶ、ナノボディなどが挙げられる。
酵素としては、アスパラギナーゼ、スーパーオキシドディスムターゼ、尿酸オキシダーゼなどが挙げられる。
これらタンパク質は、血中での安定性が低く、本発明の結合体として修飾することにより、血中半減期の延長が期待される。
本発明において、タンパク質としては、好ましくはインターフェロン、インターロイキン、エリスロポエチン、ＧＣＳＦ、血液凝固第ＶＩＩＩ因子、血液凝固第ＩＸ因子、ヒト成長ホルモン、抗体フラグメントが用いられ、より好ましくは、ヒト成長ホルモン、インターフェロン、ＧＣＳＦ、エリスロポエチン、抗体フラグメント（特にＦａｂ）が用いられ、さらに好ましくは、ヒト成長ホルモン、ＧＣＳＦが用いられる。
本発明において、ペプチドとしては、好ましくはインスリン、ビバリルジン、テリパラチド、エクセナチド、エンフビルチド、デガレリクス、ミファムルチド、ネシリチド、ゴセレリン、グラチラマー、オクトレオチド、ランレオチド、イカチバント、ジコチニド、プラムリンチド、ロミプロスチム、カルシトニン、オキシトシン、リュープロレリン、グルカゴンが用いられ、より好ましくは、インスリン、エクセナチド、カルシトニンが用いられる。
核酸としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＲＮＡのキメラ核酸、ＤＮＡ／ＲＮＡのハイブリッド、アプタマー、ｓｉＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ等を挙げることができるがこれらに限定されない。
また、核酸は１～３本鎖のいずれも用いることができるが、好ましくは１本鎖又は２本鎖である。
さらに、本発明において用いられる核酸は、他のタイプのヌクレオチド（たとえば、プリンまたはピリミジン塩基と、リボース、デオキシリボース以外の糖とのＮ－グリコシド等）、あるいは非ヌクレオチド骨格を有するオリゴマー（たとえば、市販のペプチド核酸（ＰＮＡ）等）などであってもよい。さらにまた、該核酸は、たとえば、公知の修飾の付加された核酸、当該分野で知られた標識のされた核酸、キャップの付加された核酸、メチル化された核酸、１個以上の天然ヌクレオチドを類縁物で置換した核酸等であってもよい。
より好適な核酸としては、血中で作用するアプタマーが挙げられる。
本発明の結合体の好ましい態様として、式（１）中、ｙで示される生体関連物質Ａに対するブロックポリマー誘導体の結合数が１である結合体、すなわち、生体関連物質Ａに、１分子のブロックポリマー誘導体が結合してなる結合体が挙げられる。
かかる結合体は、下記式（１’）で表され、上述したように、ブロックポリマー誘導体分子の結合数の増大により、活性が低下する可能性のある生体関連物質の修飾体として、好ましい。
Figure 0007281140000005
（式中、Ａは生体関連物質を示し、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３はそれぞれ独立して単結合または２価のリンカーを示し、Ｑは２個または３個の活性水素を有する化合物の残基を示す。ｍは１０～１４００であり、ｎは２～１００である。ｘは１または２であり、Ｒは水素原子またはアシル基を示し、ｐは１または２である。）
本発明はまた、上記した本発明の結合体を製造するための中間体（以下、本明細書にて「本発明の中間体」とも称する）を提供する。
本発明の中間体は、下記式（２）で示されるブロックポリマー誘導体である。
Figure 0007281140000006
（式中、Ｘは生体関連物質と化学反応可能な官能基を示し、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４はそれぞれ独立して単結合または２価のリンカーを示し、Ｑは２個または３個の活性水素を有する化合物の残基を示す。ｍは１０～１４００であり、ｎは２～１００である。ｘは１または２であり、Ｒは水素原子またはアシル基を示し、ｐは１または２である。）
本発明の中間体において、式（２）中、ｍで示されるエチレングリコールの重合度、ｎで示されるアミノ酸の重合度、ブロックポリマー誘導体の総分子量、Ｌ２またはＬ３で示される２価のリンカー、Ｑで示される残基、ｘ、Ｒで示される基、およびｐについては、本発明の結合体において上記した通りである。
式（２）中、Ｌ４は、単結合または２価のリンカーであり、本発明の結合体におけるＬ２、Ｌ３と同様である。
式（２）中、Ｘで示される官能基は、化学修飾の対象となる生体関連物質、たとえば生理活性を有するタンパク質、ペプチド、抗体、核酸などに存在する官能基、たとえばアミノ基、チオール基、アルデヒド基、カルボキシル基、不飽和結合またはアジド基などの官能基と反応して、共有結合を形成し得る官能基であれば、特に制限されない。
たとえば、「Harris, J. M. Poly(Ethylene Glycol) Chemistry; Plenum Press: New York, 1992」、「Hermanson, G. T. Bioconjugate Techniques, 2nd ed.; Academic Press: San Diego, CA, 2008」および「PEGylated Protein Drugs: Basic Science and Clinical Applications; Veronese, F. M., Ed.; Birkhauser: Basel, Switzerland,2009」などに記載されている官能基が挙げられる。
式（２）中、Ｘで示される「生体関連物質と化学反応可能な官能基」として、具体的には、活性エステル基、活性カーボネート基、アルデヒド基、イソシアネート基、イソチオ
シアネート基、エポキシ基、カルボキシル基、チオール基、マレイミド基、置換マレイミド基、ヒドラジド基、ピリジルジチオ基、置換スルホ基、アミノ基、オキシアミノ基、ヨードアセトアミド基、アルキルカルボニル基、アルケニル基、アルキニル基、アジド基、アクリロイル基、スルホニルオキシ基、α－ハロアセチル基、アリル基、ビニル基等が挙げられる。
上記において、活性エステル基とは、脱離能の高いアルコキシ基を有するエステル基である。脱離能の高いアルコキシ基としては、ニトロフェノール、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、ペンタフルオロフェノールなどから誘導されるアルコキシ基が挙げられる。活性エステル基としては、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドから誘導されるアルコキシ基を有するエステル基が好ましい。
上記において、活性カーボネート基とは、脱離能の高いアルコキシ基を有するカーボネート基である。脱離能の高いアルコキシ基としては、ニトロフェノール、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、ペンタフルオロフェノール等から誘導されるアルコキシ基が挙げられる。活性カーボネート基としては、ニトロフェノールまたはＮ－ヒドロキシスクシンイミドから誘導されるアルコキシ基を有するカーボネート基が好ましい。
上記において、置換マレイミド基とは、マレイミド環の二重結合の一端の炭素原子に結合した１個の水素原子が炭化水素基で置換されたマレイミド基である。炭化水素基としては、具体的には、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、第３級ブチル基などが挙げられ、メチル基、エチル基が好ましい。
上記において、置換スルホ基とは、スルホ基の水酸基が、フッ素原子を含んでいてもよい炭化水素基で置換された基である。フッ素原子を含んでいてもよい炭化水素基としては、具体的には、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、第３級ブチル基、ヘキシル基、ノニル基、ビニル基、フェニル基、ベンジル基、４－メチルフェニル基、トリフルオロメチル基、２，２，２－トリフルオロエチル基、４－（トリフルオロメトキシ）フェニル基等が挙げられ、メチル基、ビニル基、４－メチルフェニル基、２，２，２－トリフルオロエチル基が好ましい。
Ｘで示される官能基としては、活性エステル基、活性カーボネート基、アルデヒド基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、エポキシ基、カルボキシル基、チオール基、マレイミド基、ヒドラジド基、ピリジルジチオ基、ビニルスルホ基（ビニル基で置換されたスルホ基）、アミノ基、オキシアミノ基、アルキニル基、アジド基、アクリロイル基、スルホニルオキシ基、α－ハロアセチル基、アリル基およびビニル基が好ましく、活性エステル基、活性カーボネート基、アルデヒド基、マレイミド基およびアミノ基がより好ましく、アルデヒド基およびアミノ基が特に好ましい。
本発明の好適な実施形態において、式（２）中、Ｘで示される官能基は、下記の群（ＩＩ）、群（ＩＩＩ）、群（ＩＶ）、群（Ｖ）、群（ＶＩ）および群（ＶＩＩ）に分類することができる。
群（ＩＩ）：生体関連物質が有するアミノ基と反応可能な官能基
下記の (a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(j)、または(k)で示される基が挙げられる。
群（ＩＩＩ）：生体関連物質が有するチオール基と反応可能な官能基
下記の(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、または(l)で示される基が挙げられる。
群（ＩＶ）：生体関連物質が有するアルデヒド基と反応可能な官能基
下記の(h)、(m)、(n)、または(p)で示される基が挙げられる。
群（Ｖ）：生体関連物質が有するカルボキシル基と反応可能な官能基
下記の(h)、(m)、(n)、または(p)で示される基が挙げられる。
群（ＶＩ）：生体関連物質が有する不飽和結合と反応可能な官能基
下記の(h)、(m)、または(o)で示される基が挙げられる。
群（ＶＩＩ）：生体関連物質が有するアジド基と反応可能な官能基
下記の(l)で示される基が挙げられる。
Figure 0007281140000007
官能基(j)において、式中のＷ１は、塩素原子（Ｃｌ）、臭素原子（Ｂｒ）、ヨウ素原
子（Ｉ）などのハロゲン原子を示し、好ましくは臭素原子およびヨウ素原子であり、より好ましくはヨウ素原子である。
また、官能基(e)及び官能基(l)において、式中のＹ１、Ｙ３は、それぞれ独立して、水素原子または炭素数１～５の炭化水素基を示し、好ましくは炭素数１～５の炭化水素基である。
炭素数１～５の炭化水素基としては、具体的には、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、第３級ブチル基などが挙げられ、好ましくはメチル基およびエチル基である。
また、官能基(k)において、式中のＹ２は、フッ素原子を含んでいてもよい炭素数が１
～１０の炭化水素基を示し、具体的には、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、第３級ブチル基、ヘキシル基、ノニル基、ビニル基、フェニル基、ベンジル基、４－メチルフェニル基、トリフルオロメチル基、２，２，２－トリフルオロエチル基、４－（トリフルオロメトキシ）フェニル基等が挙げられ、好ましくはメチル基、ビニル基、４－メチルフェニル基および２，２，２－トリフルオロエチル基である。
式（２）中、Ｘで示される官能基として、好ましくは(a)、(b)、(c)、(d) 、(e)、(m)
、(n)および(o)であり、より好ましくは(d)、(e)および(m)であり、特に好ましくは(d)および(m)である。
上記した本発明の中間体であるブロックポリマー誘導体は、親水性のポリエチレングリコールと親水性のポリアミノ酸とが、リンカーを介して結合した構造を有する。そのため、本発明の中間体は、通常、ミセルを形成しない。
上記した本発明の中間体は、タンパク質、ペプチド、抗体、核酸等、上記した生体関連物質の修飾に好適に用いられる。
従って、本発明は、生体関連物質の修飾方法（以下、本明細書にて「本発明の修飾方法」ともいう）をも提供する。
本発明の修飾方法において、本発明の中間体は、式（２）中、Ｘで示される官能基を介して生体関連物質と結合される。それゆえ、生体関連物質に結合したブロックポリマー誘導体のポリアミノ酸部分の側鎖に存在するカルボキシル基は遊離の状態で存在するため、ポリアミノ酸部分による負電荷を生体関連物質に十分に付与することができる。
本発明の修飾方法において、本発明の中間体を生体関連物質と反応させるには、ｐＨ＝５～５．５程度の緩衝液（たとえば酢酸ナトリウム緩衝液）またはｐＨ＝８程度の緩衝液（たとえばリン酸ナトリウム緩衝液）に、生体関連物質および本発明の中間体を２０℃～２５℃にて溶解する等して行うことができる。
生体関連物質の有する官能基と、本発明の中間体におけるＸで示される官能基との反応は、後述する通り、一般的な反応条件および方法にて、たとえば縮合剤や還元剤を加えて反応させる等により、行うことができる。
本発明の結合体は、例えば、式（１）中、Ｑがエチレングリコール残基であり、Ｌ２が単結合である場合、次の工程図（Ｉ）に示すルートにより製造することができる。
工程図（Ｉ）
Figure 0007281140000008
（工程図（Ｉ）中、Ｘ１は官能基を示し、ＰｒｏはＸ１の保護基を示し、Ｌ５は２価のリンカーを示し、Ｒ１はアシル基を示す。Ａ、Ｘ、Ｌ１、Ｌ３、Ｌ４、ｍ、ｎ、ｘについては、上記と同義である）
工程図（Ｉ）中、Ｘ１で示される官能基は、基本的には式（２）中、Ｘで示される官能基と同様であるが、アルデヒド基、マレイミド基、水酸基、カルボキシル基、チオール基、アミノ基、オキシアミノ基、ヒドラジド基などであり、好ましくはアルデヒド基、マレイミド基、水酸基、アミノ基、オキシアミノ基であり、特に好ましくはアルデヒド基、マレイミド基およびアミノ基である。
工程図（Ｉ）中、Ｐｒｏは、官能基Ｘ１の保護基である。
ここで「保護基」とは、ある反応条件下で分子中の特定の化学反応可能な官能基の反応を防止または阻止する基である。保護基は、保護される化学反応可能な官能基の種類、使用される条件および分子中の他の官能基もしくは保護基の存在により変化する。保護基の具体的な例は多くの一般的な成書に見出すことができるが、例えば「Wuts, P. G. M.; Greene, T. W. Protective Groups in Organic Synthesis, 4th ed.; Wiley－Interscience: New York, 2007」に記載されている。
また、保護基で保護された官能基は、それぞれの保護基に適した反応条件にて脱保護、すなわち化学反応させることで、元の官能基を再生させることができる。保護基の代表的な脱保護条件は前述の文献に記載されている。
本工程においては、アルデヒド基の保護基、マレイミド基の保護基、水酸基の保護基、カルボキシル基の保護基、チオール基の保護基、アミノ基の保護基、オキシアミノ基の保護基、ヒドラジド基の保護基などであり、好ましくはアルデヒド基の保護基、マレイミド基の保護基、水酸基の保護基、アミノ基の保護基、オキシアミノ基の保護基であり、特に好ましくはアルデヒド基の保護基、マレイミド基の保護基およびアミノ基の保護基である。
工程図（Ｉ）中、Ｌ５で示されるリンカーは、式（２）中、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４で示される２価のリンカーと同様である。
工程図（Ｉ）中、Ｒ１で示されるアシル基は、好ましくはアセチル基、プロピオニル基であり、より好ましくはアセチル基である。
工程図（Ｉ）における反応Ａは、片末端に保護基を有するポリエチレングリコールのアミン誘導体（３）を開始剤とし、α－アミノ酸Ｎ－カルボキシ無水物をモノマーとした開環重合反応である。この反応により、片末端に保護基を有するポリエチレングリコール－ポリアミノ酸ブロックポリマー誘導体（４）を得ることができる。
工程図（Ｉ）における反応Ｂは、反応Ａにて得られたブロックポリマー誘導体（４）のポリアミノ酸の末端アミノ基と酸無水物との反応である。この反応によりポリアミノ酸の末端アミノ基をアシル基で封鎖したブロックポリマー誘導体（５）を得ることができる。
工程図（Ｉ）における反応Ｃは、反応Ｂにて得られたブロックポリマー誘導体（５）のポリアミノ酸の側鎖カルボキシル基の保護基であるベンジル基を脱保護する反応である。この反応によりポリアミノ酸の側鎖カルボキシル基がフリーであるブロックポリマー誘導体（６）を得ることができる。
工程図（Ｉ）における反応Ｄは、反応Ｃにて得られたブロックポリマー誘導体（６）のポリエチレングリコール末端の保護基を脱保護する反応である。この反応により末端に官能基を有するブロックポリマー誘導体（７）を得ることができる。また、反応Ｄは前記の反応Ｃと同時に実施することもできる。
工程図（Ｉ）における反応Ｅは、反応Ｄにて得られたブロックポリマー誘導体（７）の
末端の官能基を、必要に応じて異なる官能基に変換し、ブロックポリマー誘導体(８)とする反応である。本工程は、必ずしも実施する必要はない。
工程図（Ｉ）における反応Ｆは、反応Ｄまたは反応Ｅにて得られたブロックポリマー誘導体（７）または（８）を生体関連物質に結合させ、ブロックポリマー結合体（９）を得る反応である。反応Ｆにおいてブロックポリマー誘導体を生体関連物質に結合させる方法としては、特に制限は無いが、例えば「Hermanson, G. T. Bioconjugate Techniques, 3rd ed.;Academic Press: San Diego, CA, 2013」や「Mark, Sonny S. Bioconjugate protocols, strategies and methods; 2011」に記載の方法を用いることができる。
また、本発明の結合体は、例えば、式（１）中、Ｑがグリセリン残基であり、Ｌ２が単結合である場合、次の工程図（ＩＩ）に示すルートにより製造することができる。
工程図（ＩＩ）
Figure 0007281140000009
（工程図（ＩＩ）中、Ｌ6は２価のリンカーを示し、Ｘ１、Ｐｒｏ、Ｒ１、Ａ、Ｘ、Ｌ１
、Ｌ３、Ｌ４、ｍ、ｎ、ｘは上記と同義である）
工程図（ＩＩ）中、Ｌ6で示される２価のリンカーは、式（２）および工程図（Ｉ）中
、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５で示される２価のリンカーと同様である。
工程図（ＩＩ）中における反応Ｇは、グリセリン骨格の３位に保護基、１位と２位にポリエチレングリコール鎖を有する２分岐鎖型のポリエチレングリコールアミン誘導体（１０）を開始剤とし、α－アミノ酸Ｎ－カルボキシ無水物をモノマーとした開環重合反応である。この反応により保護基を有する２分岐鎖型のポリエチレングリコール－ポリアミノ酸ブロックポリマー誘導体（１１）を得ることができる。
工程図（ＩＩ）における反応Ｈは、反応Ｇにて得られたブロックポリマー誘導体（１１
）のポリアミノ酸の末端アミノ基と酸無水物との反応である。この反応によりポリアミノ酸の末端アミノ基をアシル基で封鎖したブロックポリマー誘導体（１２）を得ることができる。
工程図（ＩＩ）における反応Ｉは、反応Ｈにて得られたブロックポリマー誘導体（１２）のポリアミノ酸の側鎖カルボキシル基の保護基であるベンジル基を脱保護する反応である。この反応によりポリアミノ酸の側鎖カルボキシル基がフリーであるブロックポリマー誘導体（１３）を得ることができる。
工程図（ＩＩ）における反応Ｊは、反応Ｉにて得られたブロックポリマー誘導体（１３）の保護基を脱保護する反応である。この反応により官能基を有するブロックポリマー誘導体（１４）を得ることができる。また、反応Ｊは前記の反応Ｉと同時に実施することもできる。
工程図（ＩＩ）における反応Ｋは、反応Ｊにて得られたブロックポリマー誘導体（１４）の末端の官能基を、必要に応じて異なる官能基に変換し、ブロックポリマー誘導体(１
５)とする反応である。本工程は必ずしも実施する必要はない。
工程図（ＩＩ）の反応Ｌは、反応Ｊまたは反応Ｋにて得られたブロックポリマー誘導体（１４）または（１５）を生体関連物質に結合させ、ブロックポリマー結合体（１６）を得る反応である。反応Ｌにおいてブロックポリマー誘導体を生体関連物質に結合させる方法としては、特に制限は無いが、例えば「Hermanson, G. T. Bioconjugate Techniques, 3rd ed.;Academic Press: San Diego, CA, 2013」や「Mark, Sonny S. Bioconjugate protocols, strategies and methods; 2011」に記載の方法を用いることができる。
ブロックポリマー誘導体は、一般的な方法として公知の精製方法、たとえば晶析、透析、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）などにより精製することができる。
また、得られたブロックポリマー誘導体は、一般的な分析方法、たとえばＧＰＣ、ＩＥＣ、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析計（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ）を用いた測定、逆相クロマトグラフィー（ＲＰＬＣ）、核磁気共鳴（ＮＭＲ）などの分析方法により評価することができる。
本発明の結合体は、一般的な方法として公知の精製方法、たとえば透析、ＧＰＣ、ＩＥＣなどにより精製することができる。
また、得られた本発明の結合体は、一般的な分析方法、たとえばＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）、ＲＰＬＣ、サイズ排除クロマトグラフィー、円偏光二色性測定などの分析方法により評価することができる。
ブロックポリマー誘導体が結合した生体関連物質の血中半減期を評価するための試験方法については、特に制限は無いが、例えば、投与した動物から定期的に採血し、投与した生体関連物質の血中の濃度を適切な分析機器を用いて測定することにより評価できる。具体的にはＥＬＩＳＡ（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay）等を用いてモニタリングす
る方法等が挙げられる。
ブロックポリマー誘導体が結合した生体関連物質の生理活性を評価する方法については、特に制限は無いが、例えば生体関連物質がインスリンであれば血中糖濃度、カルシトニンであれば血中カルシウム濃度など、投与した動物から定期的に採血し、血中の物質を適切な分析機器を用いて測定することにより評価できる。具体的には、インスリンの生理活性は、グルコース測定キットを使用して、投与後のグルコース濃度の低下をモニタリングし、カルシトニンの生理活性は、カルシウム測定キットを使用して、投与後のカルシウム濃度の低下をモニタリングすることにより評価することができる。また、成長ホルモンなどの場合は、脳下垂体を切除した動物に投与し、その体重増加や骨の伸長などを評価することにより生理活性を評価することができる。
以下、本発明について、実施例によりさらに詳細に説明する。
下記実施例にて、１Ｈ－ＮＭＲは、日本電子データム株式会社製核磁気共鳴装置「ＪＮＭ－ＥＣＰ４００」または「ＪＮＭ－ＥＣＡ６００」を用いて取得した。測定にはφ５ｍｍチューブを用い、重水素化溶媒として、重水（Ｄ２Ｏ）または、内部標準物質としてテトラメチルシラン（ＴＭＳ）を含有する重水素化クロロホルム（ＣＤＣｌ３）およびジメチルスルホキシドｄ６（ｄ６－ＤＭＳＯ）を用いた。
得られたブロックポリマー誘導体および本発明の結合体の分子量は、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ（ブルカー社製「ＡｕｔｏｆｌｅｘＩＩＩ）を用いて測定した。前記ＭＳのマトリックスとしては、フェルラ酸およびシナピン酸を使用し、必要に応じて添加剤としてジイソプロピルエチレンアミンを添加した。
［実施例１］ブロックポリマー誘導体（１９）；NH2-050GL10-AC (NH2-PEG-poly(γ-glutamate)-acetyl, m1 = ca. 105, n1 = ca. 10)の合成
Figure 0007281140000010
（１）ブロックポリマー誘導体（１７）；BO-050BG10-AC (Boc-NH-PEG-poly(γ-benzyl
glutamate)-acetyl, m1 = ca. 105, n1 = ca. 10)の合成
Figure 0007281140000011
200mLの3つ口フラスコに、α-2-アミノエチル-ω-3-(N-t-ブトキシカルボニルアミノ)
プロピルオキシ-ポリオキシエチレン(日油株式会社製「SUNBRIGHT BO-050EA」、数平均
分子量=4,635 Da)5gを入れ、脱水ジメチルホルムアミド（ DMF ）75g に溶解させた。こ
れにγ-ベンジル-N-カルボキシ-L-グルタミン酸無水物(BLG-NCA) 2.64 g (10当量)を加えて、窒素雰囲気下40℃で6時間重合反応を行なった。その後、無水酢酸950μL (10当量)を添加し、6時間攪拌し、アセチルキャッピングにより重合を停止させた。停止反応終了後
、反応溶液を室温まで冷却し、酢酸エチルとヘキサンの混合溶液に加え、結晶を析出させた。結晶を吸引ろ過によってろ別した後、酢酸エチルとヘキサンの混合溶液で数回結晶の洗浄を行い、真空にて乾燥を行なうことで、上記ブロックポリマー誘導体（１７）BO-050
BG10-ACを得た（収量5.5g）。
1H-NMR(d6-DMSO) δ(ppm)：1.37 (9H, s, -OC(CH 3 ) 3 )、1.59(2H, m, NH-CH2CH 2 CH2-PEG)
、1.70-2.60(br, [CO-CH(CH 2 CH 2 COOCH2Ph)NH]m)、2.95(2H, t, -NHCH2CH 2 CH2-PEG)、3.10-3.30 (br, PEG-OCH2CH 2 NH)、 3.40-3.80 (br, PEG)、3.80-4.00(br, [CO-CH(CH2CH2COOCH2Ph)NH]m)、4.90-5.20(br, [CO-CH(CH2CH2COOCH 2 Ph)NH]m)、7.15-7.50(br, Ph) 、7.90-8.45(br, NH)
ポリグルタミン酸の平均重合度:10 (ＮＭＲのピーク積分値より下式を用いて算出)
平均重合度 ＝Ph基(δ7.15-7.50ppm）のピーク積分値※/5
※ポリエチレングリコール鎖(3.4-3.8ppm)のピーク積分値を分子量=4,635 Daの理論プロ
トン数である421に設定した際の値
（２）ブロックポリマー誘導体（１８）；BO-050GL10-AC (Boc-NH-PEG-poly(γ-glutamate)-acetyl, m1 = ca. 105, n1 = ca. 10)の合成
Figure 0007281140000012
200mLの3つ口フラスコに、（１）で得られたブロックポリマー誘導体（１７）（BO-050BG10-AC）5gを入れ、水 40g に分散させた。これに2.5mol/L 水酸化ナトリウム水溶液10gを加え、室温で48時間加水分解反応を行なった。その後、反応溶液を24時間室温にて透析し(透析膜：Spectra /Por （登録商標）7、分画分子量（MWCO）＝ 1,000、外液：水)、内液を凍結乾燥することによって上記ブロックポリマー誘導体（１８）（BO-050GL10-AC）
を得た（収量3.3g）。
1H-NMR(D2O) δ(ppm)：1.45 (9H, s, -OC(CH 3 ) 3 )、1.77(2H, m, NH-CH2CH 2 CH2-PEG)、1.85-2.6(br, [CO-CH(CH 2 CH 2 COOH)NH]m)、3.16(2H, t, -NHCH2CH 2 CH2-PEG)、 3.50-3.80 (br, PEG)、4.10-4.45(br, [CO-CH(CH2 CH2COOH)NH]m)
TOF-MS：分子量6,292 （図１）
（３）ブロックポリマー誘導体（１９）；NH2-050GL10-AC (NH2-PEG-poly(γ-glutamate)-acetyl, m1 = ca. 105, n1 = ca. 10)の合成
Figure 0007281140000013
200mLの3つ口フラスコに、（２）で得られたブロックポリマー誘導体（１８）（BO-050GL10-AC）1gを入れ、54容量%ジクロロメタン/45容量%トリフルオロ酢酸/1容量%水の混合
溶液１０mLに溶解し、室温で1時間脱保護反応を行なった。濃縮にて溶剤とトリフルオロ
酢酸を除去後、濃縮物を水に溶解し、10mM炭酸アンモニウム水溶液にて中和した。その後、24時間室温にて透析し(透析膜：Spectra /Por （登録商標）7、MWCO＝ 1,000、外液：
水)、内液を凍結乾燥することによって、上記ブロックポリマー誘導体（１９）（NH2-050GL10-AC）を得た（収量0.7g）。
1H-NMR(D2O) δ(ppm)：1.77(2H, m, NH-CH2CH 2 CH2-PEG)、1.85-2.6(br, [CO-CH(CH 2 CH 2 COOH)NH]m)、3.16(2H, t, -NHCH2CH 2 CH2-PEG)、 3.50-3.80 (br, PEG)、4.10-4.45(br, [CO-CH(CH2CH2COOH)NH]m)
アミノ基含量：0.124×10-3 mmol/mg (TNBS（2,4,6-トリニトロベンゼンスルホン酸）ア
ッセイ)
［実施例２］ブロックポリマー誘導体（２０）；NH2-050GL50-AC (NH2-PEG-poly(γ-glutamate)-acetyl, m1 = ca. 105, n2 = ca. 46)の合成
Figure 0007281140000014
原料であるBLG-NCA添加量を50当量とし、実施例１と同様に、PEG鎖の末端にポリグルタミン酸を導入し、脱保護を行うことで上記ブロックポリマー誘導体（２０）（NH2-050GL50-AC）を得た（収量0.9g）。
1H-NMR(D2O) δ(ppm)：1.77(2H, m, NH-CH2CH 2 CH2-PEG)、1.85-2.6(br, [CO-CH(CH 2 CH 2 COOH)NH]m)、3.16(2H, t, -NHCH2CH 2 CH2-PEG)、 3.50-3.80 (br, PEG)、4.10-4.45(br, [CO-CH(CH2CH2COOH)NH]m)
ポリグルタミン酸の平均重合度:46 (対PEG鎖基準(421H))
TOF-MS：分子量12,731
アミノ基含量：0.0532×10-3 mmol/mg (TNBSアッセイ)
［実施例３］ブロックポリマー誘導体（２１）；NH2-050GL100-AC (NH2-PEG-poly(γ-glutamate)-acetyl, m1 = ca. 105, n3 = ca. 92)の合成
Figure 0007281140000015
原料であるBLG-NCA添加量を100当量とし、実施例１と同様に、PEG鎖の末端にポリグル
タミン酸を導入し、脱保護を行うことで上記ブロックポリマー誘導体（２１）（NH2-050GL100-AC）を得た（収量0.7g）。
1H-NMR(D2O) δ(ppm)：1.77(2H, m, NH-CH2CH 2 CH2-PEG)、1.85-2.6(br, [CO-CH(CH 2 CH 2 COOH)NH]m)、3.16(2H, t, -NHCH2CH 2 CH2-PEG)、 3.50-3.80 (br, PEG)、4.10-4.45(br, [CO-CH(CH2CH2COOH)NH]m)
ポリグルタミン酸の平均重合度：92 (対PEG鎖基準(421H))
TOF-MS：分子量17,569
アミノ基含量：0.0402×10-3 mmol/mg (TNBSアッセイ)
［実施例４］ブロックポリマー誘導体（２３）；AL-050GL10-AC (Aldehyde-PEG-poly(
γ- glutamate)-acetyl, m1 = ca. 103, n1 = ca. 10)の合成
Figure 0007281140000016
（１）ブロックポリマー誘導体（２２）；DE-050BG10-AC (Diethylacetal-PEG-poly(γ- glutamate)-acetyl, m1 = ca. 103, n1 = ca. 10)の合成
Figure 0007281140000017
200mLの3つ口フラスコに、α-3-アミノプロピル-ω-3,3-ジエトキシプロピルオキシ-ポリオキシエチレン(日油株式会社製「SUNBRIGHT PA-050DE」、数平均分子量=4,544 Da) 5.0gを入れ、脱水 DMF 75 g に溶解させた。これにγ-ベンジル-N-カルボキシ-L-グルタミン酸無水物(BLG-NCA) 2.64 g (10当量)を加えて、窒素雰囲気下40℃で6時間重合反応を行なった。その後、トリエチルアミン3.49mL(25当量)及び無水酢酸950μL (10当量)を添加
し、6時間攪拌し、アセチルキャッピングにより重合を停止させた。停止反応終了後、反
応溶液を室温まで冷却し、酢酸エチルとヘキサンの混合溶液に加え、結晶を析出させた。結晶を吸引ろ過によってろ別した後、酢酸エチルとヘキサンの混合溶液で数回結晶の洗浄を行い、真空にて乾燥を行なうことで、上記ブロックポリマー誘導体（２２）（DE-050BG10-AC）を得た（収量6.0g）。
1H-NMR(d6-DMSO) δ(ppm)：1.11 (6H, t, -CH(OCH2CH 3 ) 2 )、1.65(2H, m, NH-CH2CH 2 CH2-PEG)、1.74(2H, m, PEG-CHCH 2 CH(OCH2CH3)2)、1.80-2.62(br, [CO-CH(CH 2 CH 2 COOCH2Ph)NH]m)、3.40-3.80 (br, PEG)、3.80-4.40(br, [CO-CH(CH2CH2COOCH2Ph)NH]m)、4.55(1H, m, PEG-CHCH2CH(OCH2CH3)2)、4.90-5.20(br, [CO-CH(CH2CH2COOCH 2 Ph)NH]m)、7.15-7.50(br,
Ph) 、7.90-8.50(br, NH)
ポリグルタミン酸の平均重合度:10 (ＮＭＲのピーク積分値より下式を用いて算出)
平均重合度 ＝Ph基(δ7.15-7.50ppm）のピーク積分値※/5
※ポリエチレングリコール鎖(3.4-3.8ppm)のピーク積分値を分子量=4,544 Daの理論プロ
トン数である413に設定した際の値
（２）ブロックポリマー誘導体（２３）；AL-050GL10-AC (Aldehyde-PEG- poly(γ- glutamate)-acetyl, m1 = ca. 103, n1 = ca. 10)の合成
Figure 0007281140000018
200mLの3つ口フラスコに、（１）で得られたブロックポリマー誘導体（２２）（DE-050BG10-AC）5gを入れ、水 40g に分散させた。これに2.5mol/L 水酸化ナトリウム水溶液10gを加え、室温で48時間加水分解反応を行なった。次に、リン酸を添加しpHを2.0に調節し
た後、3時間室温で攪拌し、アセタール基の脱保護反応を行なった。その後、反応溶液を
水酸化ナトリウム水溶液で中和し、反応溶液を24時間室温にて透析し(透析膜：Spectra /Por（登録商標）7、MWCO＝ 1,000、外液：水)、内液を凍結乾燥することによって、上記
ブロックポリマー誘導体（２３）（AL-050GL10-AC）を得た（収量4.2g）。
1H-NMR(D2O) δ(ppm)：1.7-2.6(br, [CO-CH(CH 2 CH 2 COOH)NH]m)、2.76 (t, - CH2CH 2 CHO)
、3.40-4.00 (br, PEG)、3.15-3.3(br)、4.20-4.40(br, [CO-CH(CH2CH2COOH)NH]m)、5.11(t, -CH(OH)2) 、9.66 (s, -CHO)
TOF-MS：分子量6,319
アルデヒド化率：64% (ＮＭＲのピーク積分値より下式を用いて算出)
アルデヒド化率 ＝ アルデヒド基(δ7.15-7.50ppm）のピーク積分値※/1×100
※ポリエチレングリコール鎖(9.66ppm)のピーク積分値を分子量=4,544 Daの理論プロトン数である413に設定した際の値
［実施例５］ブロックポリマー誘導体（２４）；AL-050GL50-AC (Aldehyde-PEG-poly(
γ- glutamate)-acetyl, m1 = ca. 103, n2 = ca. 48)の合成
Figure 0007281140000019
 原料であるBLG-NCA添加量を50当量とし、実施例４と同様に、PEG鎖の末端にポリグルタミン酸を導入し、脱保護を行うことで、上記ブロックポリマー誘導体（２４）（AL-050GL50-AC）を得た（収量3.4g）。
1H-NMR(D2O) δ(ppm)：1.7-2.6(br, [CO-CH(CH 2 CH 2 COOH)NH]m)、2.76 (t, - CH2CH 2 CHO)
、3.40-4.00 (br, PEG)、3.15-3.3(br)、4.20-4.40(br, [CO-CH(CH2CH2COOH)NH]m)、5.11(t, -CH(OH)2) 、9.66 (s, -CHO)
ポリグルタミン酸の平均重合度：48 (対PEG鎖基準(413H))
TOF-MS：分子量12,998
アルデヒド化率：75% (対PEG鎖基準(413H))
［実施例６］ブロックポリマー誘導体（２５）；AL-050GL100-AC (Aldehyde-PEG-poly(γ- glutamate)-acetyl, m1 = ca. 103, n3 = ca. 94)の合成
Figure 0007281140000020
原料であるBLG-NCA添加量を100当量とし、実施例４と同様に、PEG鎖の末端にポリグル
タミン酸を導入し、脱保護を行うことで、上記ブロックポリマー誘導体（２５）（AL-050GL100-AC）を得た（収量3.4g）。
1H-NMR(D2O) δ(ppm)：1.7-2.6(br, [CO-CH(CH 2 CH 2 COOH)NH]m)、2.76 (t, - CH2CH 2 CHO)
、3.40-4.00 (br, PEG)、3.15-3.3(br)、4.20-4.40(br, [CO-CH(CH2CH2COOH)NH]m)、5.11(t, -CH(OH)2) 、9.66 (s, -CHO)
ポリグルタミン酸の平均重合度：94 (対PEG鎖基準(413H))
TOF-MS：分子量17,918
アルデヒド化率：63% (対PEG鎖基準(413H))
［実施例７］ブロックポリマー誘導体（２６）；AL-200GL10-AC (Aldehyde-PEG-poly(
γ- glutamate)-acetyl, m2 = ca. 461, n1 = ca. 9)の合成
Figure 0007281140000021
原料としてα-3-アミノプロピル-ω-3,3-ジエトキシプロピルオキシ-ポリオキシエチレン(日油株式会社製「SUNBRIGHT PA-200DE」、数平均分子量=20,270 Da)を使用し、BLG-NCAを11当量加えて、実施例４と同様に、PEG鎖の末端にポリグルタミン酸を導入し、脱保
護を行うことで、上記ブロックポリマー誘導体（２６）（AL-200GL10-AC）を得た（収量4.9g）。
1H-NMR(D2O) δ(ppm)：1.7-2.6(br, [CO-CH(CH 2 CH 2 COOH)NH]m)、2.76 (t, - CH2CH 2 CHO)
、3.40-4.00 (br, PEG)、3.15-3.3(br)、4.20-4.40(br, [CO-CH(CH2CH2COOH)NH]m)、5.11(t, -CH(OH)2) 、9.66 (s, -CHO)
ポリグルタミン酸の平均重合度：9 (対PEG鎖基準(1843H))
TOF-MS：分子量26,346
アルデヒド化率：67% (対PEG鎖基準(1843H))
［実施例８］ブロックポリマー誘導体（２７）；AL-200GL20-AC (Aldehyde-PEG-poly(
γ- glutamate)-acetyl, m2 = ca. 461, n4 = ca. 19)の合成
Figure 0007281140000022
原料としてα-3-アミノプロピル-ω-3,3-ジエトキシプロピルオキシ-ポリオキシエチレン(日油株式会社製「SUNBRIGHT PA-200DE」、数平均分子量=20,270 Da)を使用し、BLG-NCAを22当量加えて、実施例４と同様に、PEG鎖の末端にポリグルタミン酸を導入し、脱保
護を行うことで、上記ブロックポリマー誘導体（２７）（AL-200GL20-AC）を得た（収量4.6g）。
1H-NMR(D2O) δ(ppm)：1.7-2.6(br, [CO-CH(CH 2 CH 2 COOH)NH]m)、2.76 (t, - CH2CH 2 CHO)
、3.40-4.00 (br, PEG)、3.15-3.3(br)、4.20-4.40(br, [CO-CH(CH2CH2COOH)NH]m)、5.11(t, -CH(OH)2) 、9.66 (s, -CHO)
ポリグルタミン酸の平均重合度：19 (対PEG鎖基準(1843H))
TOF-MS：分子量27,753
アルデヒド化率：66% (対PEG鎖基準(1843H))
［実施例９］顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）のＮ末端とブロックポリマー誘導体との反応
（１）ブロックポリマー誘導体（２３）とＧＣＳＦとの結合体（２８）の合成
ＧＣＳＦ（アミノ酸配列：下記の通り）（ヒト由来、大腸菌を用いた一般的な形質導入方法に従って調製）を３ｍｇ含有する１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝５．５、５（ｗ／ｖ）％ソルビトール含有）に、実施例４で得たアルデヒド基を有するブロックポリマー誘導体（２３）を３当量添加し、ＧＣＳＦ濃度を３．０ｍｇ／ｍＬに調整し、２５℃にて１時間撹拌した。次いで、還元剤であるシアノ水素化ホウ素ナトリウム１００当量を添加し、２５℃にて２４時間撹拌した。さらに、グリシルグリシンを１００当量添加し、２５℃にて１時間撹拌することで反応を停止した。逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）を用いて、下記分析条件にて分析を行い、図２に示すように、反応が進行したことを確認した。
＜ＧＣＳＦのアミノ酸配列＞
ＴＰＬＧＰＡＳＳＬＰ ＱＳＦＬＬＫＣＬＥＱ ＶＲＫＩＱＧＤＧＡＡ ＬＱＥＫＬＣＡＴＹＫ ＬＣＨＰＥＥＬＶＬＬ ＧＨＳＬＧＩＰＷＡＰ ＬＳＳＣＰＳＱＡＬＱ ＬＡＧＣＬＳＱＬＨＳ ＧＬＦＬＹＱＧＬＬＱ ＡＬＥＧＩＳＰＥＬＧ ＰＴＬＤＴＬＱＬＤＶ ＡＤＦＡＴＴＩＷＱＱ ＭＥＥＬＧＭＡＰＡＬ ＱＰＴＱＧＡＭＰＡＦ ＡＳＡＦＱＲＲＡＧＧ ＶＬＶＡＳＨＬＱＳＦ ＬＥＶＳＹＲＶＬＲＨ ＬＡＱＰ（配列番号：１）
＜ＲＰ－ＨＰＬＣ分析条件＞
装置：アジレント・テクノロジー株式会社製「Agilent 1200 Infinity」
検出器：ＵＶ（２２６ｎｍ）
カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｊｕｐｉｔｅｒ ５μｍ Ｃ１８ ３００Å ｃｏｌｕｍｎ、４．６×２５０ｍｍ
移動相Ａ：水＋０．１（ｖ／ｖ）％トリフルオロ酢酸
移動相Ｂ：アセトニトリル＋０．１（ｖ／ｖ）％トリフルオロ酢酸
流速：１ｍＬ／ｍｉｎ
グラジエント条件：表１に示す通り。
Figure 0007281140000023
ＲＰ－ＨＰＬＣ分析の結果、反応２４時間後の反応率はおよそ８０％であった。
得られた反応液を２４時間室温にて透析し（透析膜：Delchimica Scientific glassware社製（分画分子量＝３．５ｋＤａ）、外液：１０ｍＭリン酸ナトリウム水溶液（ｐＨ＝
４．５））、その後、陽イオン交換クロマトグラフィーにて、下記に示す条件で精製し、図３に示す結合体（２８）を含む画分を分取した。
＜精製条件＞
カラム：ＴＳＫｇｅｌ ＳＰ－ＳＴＡＴ ７μｍ ｃｏｌｕｍｎ、４．６×１００ｍｍ
移動相Ａ：１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ＝４．５
移動相Ｂ：１００ｍＭリン酸ナトリウム＋１００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ＝５．７５
流速：０．７ｍＬ／分
検出波長：２８０ｎｍ
グラジエント条件：表２に示す通り。
Figure 0007281140000024
上記イオン交換クロマトグラフィー精製にて分取した目的物を含む溶液を、限外ろ過（遠心式限外ろ過フィルター；「アミコン」、分画分子量＝１０ｋＤａ、５０００×ｇ、４℃）にて濃縮した後、２４時間室温にて透析した（透析膜：Delchimica Scientific glassware社製（分画分子量＝３．５ｋＤａ）、外液：１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
＝４．６、５（ｗ／ｖ）％ソルビトール含有））。得られた溶液のＧＣＳＦ濃度は、２８０ｎｍにおける吸光度を測定することで算出した（吸光係数ε＝０．８８ ｍＬ／ｍｇ・ｃｍ）。
得られたブロックポリマー誘導体（２３）と、ＧＣＳＦとの結合体（２８）の同定は、上述したようにＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳにより分子量を測定し、また、下記に示す通り、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、円偏光二色性測定およびサイズ排除クロマトグラフィーによる分析にて行い、目的物が得られたことを確認した。
（ｉ）ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳによる分子量の測定
測定結果を図４に示した。図４より、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳにより測定される分子量は２４，４３８Ｄａであり、結合体（２８）の生成が示唆された。
（ｉｉ）ＳＤＳ－ＰＡＧＥ
ＳＤＳ－ＰＡＧＥキットとして「４－１５％ミニプロティアン（登録商標）ＴＧＸ（商標）プレキャストゲル（バイオラッド（ＢＩＯ－ＲＡＤ）社」を用い、キットの推奨測定条件に従い、結合体（２８）の評価を行った。
染色液としては、クマシーブリリアントブルー溶液（ＣＢＢ溶液）およびヨウ素染色溶
液（塩化バリウム溶液＋ヨウ素溶液）を用いた。
ＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を図５に示す。図５中、レーンＭは分子量マーカーを、レーン１はＧＣＳＦを、レーン２は結合体（２８）を示す。左図はクマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色によるタンパク質の検出結果を示し、右図は、ヨウ素染色によるＰＥＧの検出結果を示す。
結合体（２８）の分析結果（レーン２）においては、タンパク質やペプチドを選択的に染色するＣＢＢ染色でバンドが検出され、さらに、ポリエチレングリコールを染色するヨウ素染色でもバンドが検出された。両方の染色でバンドが検出されたことから、ブロックポリマー誘導体（２３）とＧＣＳＦとが結合した目的物が得られたことが確認された。
（ｉｉｉ）円偏光二色性の測定
円偏光二色性の測定は、タンパク質の変性状態を調べるのに有効な手段として知られている。下記の装置を用い、下記波長にて、円偏光二色性を測定した。
装置：Ｊａｓｃｏ Ｊ－７００ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｏｌａｒｉｍｅｔｅｒ
波長：２００－２５０ｎｍ
測定により得られたＧＣＳＦのスペクトルと、結合体（２８）のスペクトルとを重ね合わせたところ、形状が一致していたことから、ブロックポリマー誘導体（２３）による修飾により、ＧＣＳＦが変性していないことが確認された。
（ｉｖ）サイズ排除クロマトグラフィー分析
下記の分析条件で実施した。
＜分析条件＞
装置：Ｊａｓｃｏ ＬＣ１５００－２０００
カラム：Ｚｏｒｂａｘ ＧＦ－２５０ Ｂｉｏ ｓｅｒｉｅｓ，粒子径＝４μｍ，１５０オングストローム，４．６ｍｍ×２５０ｍｍ（アジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ)社）
移動相：２０ｍＭリン酸ナトリウム＋１３０ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ＝７．０）＋２０容量％アセトニトリル
流速：０．３ｍＬ／分
検出波長：２２６ｎｍ
ＧＣＳＦおよび結合体（２８）について得られたクロマトグラムを比較したところ、結合体（２８）のピークが、ＧＣＳＦのピークと比べて、高分子量側にシフトしていること、つまりブロックポリマー誘導体（２３）がＧＣＳＦに結合し、分子量が増大したことが確認された。
（２）ブロックポリマー誘導体（２４）とＧＣＳＦとの結合体（２９）の合成
原料としてブロックポリマー誘導体（２４）を使用し、陽イオン交換クロマトグラフィーによる精製の際のグラジエント条件を表３に示す条件とした他は、実施例９（１）と同様に、ブロックポリマー誘導体（２４）とＧＣＳＦとの結合体（２９）を合成した。
Figure 0007281140000025
得られたブロックポリマー誘導体（２４）とＧＣＳＦとの結合体（２９）の同定は、実施例９（１）と同様に、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳによる分子量の測定、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、円偏光二色性測定、サイズ排除クロマトグラフィーによる分析にて行い、目的物が得られたことを確認した。
（３）ブロックポリマー誘導体（２５）とＧＣＳＦとの結合体（３０）の合成
原料としてブロックポリマー誘導体（２５）を使用し、陽イオン交換クロマトグラフィーによる精製の際のグラジエント条件を表４に示す条件とした他は、実施例９（１）と同様にして、ブロックポリマー誘導体（２５）とＧＣＳＦとの結合体（３０）を合成した。
Figure 0007281140000026
得られたブロックポリマー誘導体（２５）とＧＣＳＦとの結合体（３０）の同定は、実施例９（１）の場合と同様に、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳによる分子量の測定、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、円偏光二色性測定、サイズ排除クロマトグラフィーによる分析にて行い、目的物が得られたことを確認した。
（４）ブロックポリマー誘導体（２６）とＧＣＳＦとの結合体（３１）の合成
原料としてブロックポリマー誘導体（２６）を使用し、実施例９（１）と同様に、ブロックポリマー誘導体（２６）とＧＣＳＦとの結合体（３１）を合成した。ＲＰ－ＨＰＬＣを用いて分析を行い、図６に示すように、反応が進行したことを確認した。
次いで、陽イオン交換クロマトグラフィーを用い、下記精製条件にて精製した。
＜精製条件＞
カラム：ＴＳＫｇｅｌ ＳＰ－ＳＴＡＴ ７μｍ ｃｏｌｕｍｎ、４．６×１００ｍｍ
移動相Ａ：１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ＝４．５
移動相Ｂ：１００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ＝５．７５
流速：０．７ｍＬ／分
検出波長：２８０ｎｍ
グラジエント条件：表５に示す通り。
Figure 0007281140000027
得られたブロックポリマー誘導体（２６）とＧＣＳＦとの結合体（３１）の同定は、実施例９（１）の場合と同様に、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳによる分子量の測定（図７）、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、円偏光二色性測定、サイズ排除クロマトグラフィーによる分析にて行い、目的物が得られたことを確認した。
（５）ブロックポリマー誘導体（２７）とＧＣＳＦとの結合体（３２）の合成
原料としてブロックポリマー誘導体（２７）を使用し、実施例９（４）と同様に、ブロックポリマー誘導体（２７）とＧＣＳＦとの結合体（３２）を合成した。
得られたブロックポリマー誘導体（２７）とＧＣＳＦとの結合体（３２）の同定は、実施例９（１）の場合と同様に、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳによる分子量の測定、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、円偏光二色性測定、サイズ排除クロマトグラフィーによる分析にて行い、目的物が得られたことを確認した。
［実施例１０］トランスグルタミナーゼを触媒として用いた顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）のグルタミン残基とブロックポリマー誘導体の反応
（１）ブロックポリマー誘導体（１９）とＧＣＳＦとの結合体（３３）の合成
ＧＣＳＦを３ｍｇ含有する１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝８．０、５（ｗ／ｖ）％ソルビトール含有）に、実施例１で得たアミノ基を有するブロックポリマー誘導体（１９）を３当量添加し、ＧＣＳＦ濃度を２．０ｍｇ／ｍＬに調整した。次いで、微生物由来のトランスグルタミナーゼ（ＴＧａｇｅ、「Ａｃｔｉｖａ（登録商標）ＷＭ」（味の素株式会社製））を０．０６ｍｇ（２重量％／ＧＣＳＦ）加え、２５℃にて４時間撹拌した。さらに、Ｎ－エチルマレイミドをＴＧａｇｅに対して０．８当量添加し、２５℃にて１時間撹拌することで反応を停止した。
ＲＰ－ＨＰＬＣを用いて分析を行い、図８に示すように、反応が進行したことを確認した。ＲＰ－ＨＰＬＣの分析条件は、上記実施例９（１）における分析条件と同じである。
ＲＰ－ＨＰＬＣ分析の結果、反応４時間後の反応率はおよそ８４％であった。
反応液を１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ＝４．５）にて５倍に希釈し、陽イオン交換クロマトグラフィーにて精製した。精製条件を以下に示す。
＜精製条件＞
カラム：ＴＳＫｇｅｌ ＳＰ－ＳＴＡＴ ７μｍ ｃｏｌｕｍｎ、４．６×１００ｍｍ
移動相Ａ：１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ＝４．５
移動相Ｂ：１００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ＝５．７５
流速：０．７ｍＬ／分
検出波長：２８０ｎｍ
グラジエント条件：表６に示す通り。
Figure 0007281140000028
イオン交換クロマトグラフィー精製にて分取した目的物を含有する溶液を、限外ろ過（遠心式限外ろ過フィルター；「アミコン」（分画分子量＝１０ｋＤａ）、５０００×ｇ、４℃）にて濃縮した後、２４時間室温にて透析した（透析膜：Delchimica Scientific glassware社製（分画分子量＝３．５ｋＤａ）、外液：１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ＝４．６、５（ｗ／ｖ）％ソルビトール含有））。得られた溶液のＧＣＳＦ濃度は、２８０ｎｍにおける吸光度を測定することで算出した（吸光係数ε＝０．８８ｍＬ／ｍｇ・ｃｍ）。
得られたブロックポリマー誘導体（１９）とＧＣＳＦとの結合体（３３）の同定は、実施例９（１）の場合と同様に、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳによる分子量の測定、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、円偏光二色性測定、サイズ排除クロマトグラフィーによる分析にて行い、目的物が得られたことを確認した。
（２）ブロックポリマー誘導体（２０）とＧＣＳＦとの結合体（３４）の合成
原料としてブロックポリマー誘導体（２０）を使用し、陽イオン交換クロマトグラフィーによる精製の際のグラジエント条件を表７に示す条件とした他は、実施例１０（１）と同様に、ブロックポリマー誘導体（２０）とＧＣＳＦとの結合体（３４）を合成した。
Figure 0007281140000029
得られたブロックポリマー誘導体（２０）とＧＣＳＦとの結合体（３４）の同定は、実施例９（１）の場合と同様に、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳによる分子量の測定、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、円偏光二色性測定、サイズ排除クロマトグラフィーによる分析にて行い、目的物が得られたことを確認した。
（３）ブロックポリマー誘導体（２１）とＧＣＳＦとの結合体（３５）の合成
原料としてブロックポリマー誘導体（２１）を使用し、陽イオン交換クロマトグラフィーによる精製の際のグラジエント条件を表８に示す条件とした他は、上記（１）と同様に、ブロックポリマー誘導体（２１）とＧＣＳＦとの結合体（３５）を合成した。
Figure 0007281140000030
得られたブロックポリマー誘導体（２１）とＧＣＳＦとの結合体（３５）の同定は、実施例９（１）の場合と同様に、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳによる分子量測定、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、円偏光二色性測定、サイズ排除クロマトグラフィーによる分析にて行い、目的物が得られたことを確認した。
［比較例１］顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）のＮ末端とメトキシＰＥＧ誘導体との反応：メトキシＰＥＧアルデヒド（分子量＝２０ｋＤａ）とＧＣＳＦとの結合体（３６）の合成
ＧＣＳＦを３ｍｇ含有する１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝４．６、５（ｗ／ｖ）％ソルビトール含有）にメトキシＰＥＧアルデヒド(日油株式会社製「SUNBRIGHT ME-200AL」、数平均分子量＝約２０ｋＤａ)を３当量添加し、ＧＣＳＦ濃度を３．０ｍｇ／ｍ
Ｌに調整し、４℃にて１時間撹拌した。次いで、還元剤であるシアノ水素化ホウ素ナトリウム１００当量を添加し、４℃にて２４時間撹拌した。さらに、グリシルグリシンを１００当量添加し、４℃にて１時間撹拌することで反応を停止した。ＲＰ－ＨＰＬＣを用いて分析を行い、反応が進行したことを確認した。ＲＰ－ＨＰＬＣの分析条件は、実施例９（１）における分析条件と同じである。
ＲＰ－ＨＰＬＣ分析の結果、反応２４時間後の反応率はおよそ７８％であった。
得られた反応液を２４時間室温にて透析し（透析膜：Delchimica Scientific glassware社製（分画分子量＝３．５ｋＤａ）、外液：１０ｍＭリン酸ナトリウム水溶液（ｐＨ＝
４．７））、その後、下記に示す精製条件にて、陽イオン交換クロマトグラフィーにより精製した。
＜精製条件＞
カラム：ＴＳＫｇｅｌ ＳＰ－５ＰＷ １０μｍ ｃｏｌｕｍｎ、７．５×７５ｍｍ
移動相Ａ：１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ＝４．７
移動相Ｂ：１００ｍＭリン酸ナトリウム＋１００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ＝４．８５
流速：１．０ｍＬ／分
検出波長：２８０ｎｍ
グラジエント条件：表９に示す通り。
Figure 0007281140000031
陽イオン交換クロマトグラフィー精製にて分取した目的物を含む溶液を、限外ろ過（遠心式限外ろ過フィルター；「アミコン」（分画分子量＝１０ｋＤａ）、５０００×ｇ、４℃）にて濃縮した後、２４時間室温にて透析した（透析膜：Delchimica Scientific glassware社製（分画分子量＝３．５ｋＤａ）、外液：１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
＝４．６、５（ｗ／ｖ）％ソルビトール含有））。得られた溶液のＧＣＳＦ濃度は、２８０ｎｍにおける吸光度を測定することで算出した。
得られたメトキシＰＥＧ－ＧＣＳＦ結合体（３６）の同定は、実施例９（１）の場合と同様に、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳによる分子量の測定（図９）、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、円偏光二色性測定、サイズ排除クロマトグラフィーによる分析にて行い、目的物が得られたことを確認した。
［試験例１］動物モデルにおける薬物動態の評価
ＧＣＳＦ、実施例９（４）で得たブロックポリマー誘導体（２６）とＧＣＳＦとの結合体（３１）、および比較例１で得たメトキシＰＥＧ－ＧＣＳＦ結合体（３６）を使用し、Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラット（体重２００ｇ～２７０ｇ）を用いて、薬物動態試験を行った（３匹／グループ）。
ＧＣＳＦサンプルは、２００μＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ＝７．４）を用いて調製した後、０．２２μｍのフィルターにてろ過した。調製したサンプル溶液を尾静脈注射（ＧＣＳＦとして１００μｇ／ｋｇ）した後、投与前（ｔ＝０）および投与後の任意の時間に血液サンプルを採取した。動物実験の全ての作業はイソフルランによる麻酔下で行った。
血液サンプルを遠心分離（１５００×ｇ、２０分）し、得られた血清に含まれるＧＣＳＦ量をＥＬＩＳＡキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）により測定した。結果はｐｒｏｇｒａｍ ２．０ ＰＫ ｓｏｌｖｅｒシステムにより、２コンパートメントモデルを用いて
評価し、血中濃度曲線下面積（ＡＵＣ）を比較した（表１０、図１０）。
Figure 0007281140000032
図１０に示されるように、ＧＣＳＦが投与後６時間でほぼ血中から消失してしまう（（Ａ））のに対し、実施例９（４）で得たブロックポリマー誘導体（２６）とＧＣＳＦとの結合体（３１）は、有意にＧＣＳＦの血中滞留性を延長させることができた（（Ｂ））。
また、表１０および図１０に示されるように、比較例１で得たメトキシＰＥＧ－ＧＣＳＦ結合体（３６）と比べても、有意に血中滞留性を改善できることが確認できた。
ブロックポリマー誘導体（２６）とＧＣＳＦとの結合体（３１）と、メトキシＰＥＧ－ＧＣＳＦ結合体（３６）のＰＥＧ部分は、同分子量（２０ｋＤａ）であることから、ブロックポリマー誘導体（２６）とＧＣＳＦとの結合体（３１）にて観察される血中滞留性の向上は、ＰＥＧ鎖の末端にポリアニオンであるポリグルタミン酸（平均重合度＝９）を導入したことに起因するものであることが示唆された。
［実施例１１］ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）のＮ末端とブロックポリマー誘導体との反応
（１）ブロックポリマー誘導体（２６）とｈＧＨとの結合体（３７）の合成
ｈＧＨ（アミノ酸配列：下記の通り）（シェナンドー（Ｓｈｅｎａｎｄｏａｈ）社）を２ｍｇ含有する１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝５．５）に実施例４で得たアルデヒド基を有するブロックポリマー誘導体（２６）を５当量添加し、ｈＧＨ濃度を１．０ｍｇ／ｍＬに調整し、４℃にて１時間撹拌した。次いで、還元剤であるシアノ水素化ホウ素ナトリウム５０当量を添加し、２５℃にて２４時間撹拌した。さらに、グリシルグリシンを１００当量添加し、２５℃にて１時間撹拌することで反応を停止した。逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）を用いて、下記に示す条件にて分析を行い、図１１に示すように、反応が進行したことを確認した。
＜ｈＧＨのアミノ酸配列＞
ＭＦＰＴＩＰＬＳＲＬ ＦＤＮＡＭＬＲＡＨＲ ＬＨＱＬＡＦＤＴＹＱ ＥＦＥＥＡＹＩＰＫＥ ＱＫＹＳＦＬＱＮＰＱ ＴＳＬＣＦＳＥＳＩＰ ＴＰＳＮＲＥＥＴＱＱ ＫＳＮＬＥＬＬＲＩＳ ＬＬＬＩＱＳＷＬＥＰ ＶＱＦＬＲＳＶＦＡＮ ＳＬＶＹＧＡＳＤＳＮ ＶＹＤＬＬＫＤＬＥＥ ＧＩＱＴＬＭＧＲＬＥ ＤＧＳＰＲＴＧＱＩＦ ＫＱＴＹＳＫＦＤＴＮ ＳＨＮＤＤＡＬＬＫＮ ＹＧＬＬＹＣＦＲＫＤ ＭＤＫＶＥＴＦＬＲＩ ＶＱＣＲＳＶＥＧＳＣ ＧＦ（配列番号：２）
＜ＲＰ－ＨＰＬＣ分析条件＞
装置：アジレント・テクノロジー株式会社製「Agilent 1200 Infinity」
検出器：ＵＶ（２２６ｎｍ）
カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｊｕｐｉｔｅｒ ５μｍ Ｃ１８ ３００Å ｃｏｌｕｍｎ、４．６×２５０ｍｍ
移動相Ａ：水＋０．１（ｖ／ｖ）％トリフルオロ酢酸
移動相Ｂ：アセトニトリル＋０．１（ｖ／ｖ）％トリフルオロ酢酸
流速：１ｍＬ／ｍｉｎ
グラジエント条件：表１１に示す通り。
Figure 0007281140000033
ＲＰ－ＨＰＬＣ分析の結果、反応２４時間後の反応率はおよそ６４％であった。
得られた反応液を２４時間室温にて透析し（透析膜：Delchimica Scientific glasswar
e社製（分画分子量＝３．５ｋＤａ）、外液：１０ｍＭ酢酸ナトリウム水溶液（ｐＨ＝４
．７））、その後、陽イオン交換クロマトグラフィーにより、下記精製条件にて精製し、図１２に示す結合体（３７）の画分を分取した。
＜精製条件＞
カラム：ＴＳＫｇｅｌ ＳＰ－ＳＴＡＴ ７μｍ ｃｏｌｕｍｎ、４．６×１００ｍｍ
移動相Ａ：１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ＝４．７
移動相Ｂ：１０ｍＭ酢酸ナトリウム＋５００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ＝４．８５
流速：０．７ｍＬ／分
検出波長：２８０ｎｍ
グラジエント条件：表１２に示す通り。
Figure 0007281140000034
イオン交換クロマトグラフィー精製にて分取した目的物を含む溶液を、限外ろ過（遠心式限外ろ過フィルター；「アミコン」（分画分子量＝１０ｋＤａ）、５０００×ｇ、４℃）にて濃縮した後、２４時間室温にて透析した（透析膜：Delchimica Scientific glassware社製（分画分子量＝３．５ｋＤａ）、外液：１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝
４．６、５（ｗ／ｖ）％ソルビトール含有））。得られた溶液のｈＧＨ濃度は、２８０ｎｍにおける吸光度を測定することで算出した。
得られたブロックポリマー誘導体（２６）とｈＧＨとの結合体（３７）の同定は、実施例９（１）の場合と同様に、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳによる分子量の測定、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、円偏光二色性測定、サイズ排除クロマトグラフィーによる分析にて行い、目的物が得られたことを確認した。
なお、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる分析結果を図１３に示した。図１３中、レーンＭは分子量マーカーを示し、レーン１はブロックポリマー誘導体（２６）とｈＧＨとの結合体（３７）を示し、レーン２はｈＧＨを示す。
また、左図はクマシーブリリアントブルー染色によるタンパク質の検出結果を示し、右図はヨウ素染色によるＰＥＧの検出結果を示す。
図１３において、ブロックポリマー誘導体（２６）とｈＧＨとの結合体（３７）については、タンパク質とＰＥＧの双方のバンドが検出された（レーン１）。
（２）ブロックポリマー誘導体（２７）とｈＧＨとの結合体（３８）の合成
原料としてブロックポリマー誘導体（２７）を使用した他は、実施例１１（１）と同様にして、ブロックポリマー誘導体（２７）とｈＧＨとの結合体（３８）を合成した。
得られたブロックポリマー誘導体（２７）とｈＧＨとの結合体（３８）の同定は、実施例１１（１）の場合と同様に、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳによる分子量測定、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、円偏光二色性測定、サイズ排除クロマトグラフィーによる分析にて行い、目的物が得られたことを確認した。
［比較例２］ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）のＮ末端とメトキシＰＥＧ誘導体との反応：メトキシＰＥＧアルデヒド（分子量＝２０ｋＤａ）とｈＧＨとの結合体（３９）の合成
原料として、メトキシＰＥＧアルデヒド(日油株式会社製「SUNBRIGHT ME-200AL」、数平均分子量約＝20kDa) を使用した他は、実施例１１（１）と同様にして、メトキシＰＥ
Ｇ－ｈＧＨ結合体（３９）を合成した。ＲＰ－ＨＰＬＣ分析の結果、反応２４時間後の反
応率はおよそ７７％であった（図１４）。
得られたメトキシＰＥＧ－ｈＧＨ結合体（３９）の同定は、実施例１１（１）の場合と同様に、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳによる分子量の測定、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、円偏光二色性測定、サイズ排除クロマトグラフィーによる分析にて行い、目的物が得られたことを確認した。
［試験例２］下垂体摘出ラットを用いたｈＧＨの薬学的評価
下垂体を摘出したＯＶＡラット（オス、体重＝約９０ｇ）はＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅ
ｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ (Ｌｅｃｃｏ, Ｉｔａｌｙ)より購入した。ラットを無作為に６グループ（４匹／グループ）に分け、実験前に動物施設にて２週間飼育した。
ＰＢＳコントロールグループには、ＰＢＳ溶液２００μＬを尾静脈より投与した。ｈＧＨ投与グループには、ネイティブのｈＧＨを６日間尾静脈より投与した（０．３ｍｇ／ｋｇ／日、約２７μｇ／ラット／日、合計約１６２μｇ／ラット）。実施例１１（１）で得たブロックポリマー誘導体（２６）とｈＧＨとの結合体（３７）を投与するグループ、実施例１１（２）で得たブロックポリマー誘導体（２７）とｈＧＨとの結合体（３８）を投与するグループ、および比較例２で得たメトキシＰＥＧ－ｈＧＨ結合体（３９）を投与するグループには、各結合体をそれぞれＰＢＳに溶解し、単回で尾静脈より投与した（１．８ｍｇ／ｋｇ、約１６２μｇ／ラット）。ラットは１１日間、同時刻にモニターおよび体重測定を行い、結果を図１５に示した。また、各ラットの頚骨長を１１日間測定し、ラットの初期の体重で補正した頚骨長の増加量を図１６に示した。
図１５および１６に示されるように、ｈＧＨを投与したグループと比較して、ブロックポリマー誘導体（２６）とｈＧＨとの結合体（３７）、ブロックポリマー誘導体（２７）とｈＧＨとの結合体（３８）をそれぞれ投与したグループでは、体重増加および頚骨の伸びが大きく、ｈＧＨの薬効が有意に向上され、また延長されたことが認められた。また、結合体（３７）および結合体（３８）中に含まれるＰＥＧと同じ分子量（２０ｋＤａ）のＰＥＧを有するメトキシＰＥＧ－ｈＧＨ結合体（３９）を投与したグループと比べても、高い体重増加効果および頚骨伸張効果が得られることが認められた。
上記の通り、本発明により、生体関連物質をアニオン性ブロックポリマー誘導体と結合させた修飾体を提供することができ、生体関連物質の血中半減期を延長し、生体の血中での生体関連物質の安定性を向上させることができる。

Claims (10)

  1. 下記式（１）で表される、ブロックポリマーと生体関連物質との結合体であって、生体関連物質Ａがタンパク質、ペプチド（ただし、オクトレオチドを除く）、核酸、細胞およびウイルスからなる群より選択される１種以上である、結合体。
    Figure 0007281140000035
    （式中、Ａは生体関連物質を示し、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３はそれぞれ独立して単結合または２価のリンカーを示し、Ｑは２個または３個の活性水素を有する化合物の残基を示す。ｍは１０～１４００であり、ｎは２～１００である。ｘは１または２であり、Ｒは水素原子またはアシル基を示し、ｐは１または２であり、ｙは１～４０である。）
  2. 式（１）において、ｙが１である、請求項１に記載の結合体。
  3. 式（１）において、ｍが４０～１２００であり、ｎが５～５０である、請求項１または２に記載の結合体。
  4. 式（１）において、Ｑが、エチレングリコール、グリセリン、リシン、アスパラギン酸およびグルタミン酸からなる群より選択される化合物の残基である、請求項１～３のいずれか１項に記載の結合体。
  5. 式（１）において、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３が、それぞれ独立して、単結合、フェニレン基、アミド結合、エーテル結合、チオエーテル結合、ウレタン結合、第２級アミノ基、カルボニル基、ウレア結合、トリアジン基、チオールの付加されたマレイミド基、オキシム結合、ならびに、単結合、フェニレン基、アミド結合、エーテル結合、チオエーテル結合、ウレタン結合、第２級アミノ基、カルボニル基、ウレア結合、トリアジン基、チオールの付加されたマレイミド基およびオキシム結合からなる群より選択される１種以上を含んでいてもよいアルキレン基からなる群より選択される、請求項１～４のいずれか１項に記載の結合体。
  6. 式（１）において、Ａが、サイトカイン、ホルモン、酵素、抗体および核酸からなる群より選択される生体関連物質である、請求項１～５のいずれか１項に記載の結合体。
  7. 請求項１～６のいずれか１項に記載の結合体を得るための中間体であって、下記式（２）で表される、ブロックポリマー誘導体。
    Figure 0007281140000036
     （式中、Ｘは生体関連物質と化学反応可能な官能基を示し、Ｌ2、Ｌ３、Ｌ４はそれぞれ
    独立して単結合または２価のリンカーを示し、Ｑは２個または３個の活性水素を有する化合物の残基を示す。ｍは１０～１４００であり、ｎは２～１００である。ｘは１または２であり、Ｒは水素原子またはアシル基を示し、ｐは１または２である。）
  8. 式（２）において、Ｑが、エチレングリコール、グリセリン、リシン、アスパラギン酸およびグルタミン酸からなる群より選択される化合物の残基である、請求項７に記載のブロックポリマー誘導体。
  9. 式（２）において、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４が、それぞれ独立して、単結合、フェニレン基、アミド結合、エーテル結合、チオエーテル結合、ウレタン結合、第２級アミノ基、カルボニル基、ウレア結合、ならびに、単結合、フェニレン基、アミド結合、エーテル結合、チオエーテル結合、ウレタン結合、第２級アミノ基、カルボニル基およびウレア結合からなる群より選択される１種以上を含んでいてもよいアルキレン基からなる群より選択される、請求項７または８に記載のブロックポリマー誘導体。
  10. 式（２）において、Ｘが、活性エステル基、活性カーボネート基、アルデヒド基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、エポキシ基、カルボキシル基、チオール基、マレイミド基、置換マレイミド基、ヒドラジド基、ピリジルジチオ基、置換スルホ基、アミノ基、オキシアミノ基、ヨードアセトアミド基、アルキルカルボニル基、アルケニル基、アルキニル基、アジド基、アクリロイル基、スルホニルオキシ基、α－ハロアセチル基、アリル基およびビニル基からなる群より選択される反応性官能基である、請求項７～９のいずれか１項に記載のブロックポリマー誘導体。
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