CN105169418A - 一种乳糖酸修饰的超小型超顺磁四氧化三铁纳米颗粒的制备方法 - Google Patents

一种乳糖酸修饰的超小型超顺磁四氧化三铁纳米颗粒的制备方法 Download PDF

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CN105169418A CN201510655715.5A CN201510655715A CN105169418A CN 105169418 A CN105169418 A CN 105169418A CN 201510655715 A CN201510655715 A CN 201510655715A CN 105169418 A CN105169418 A CN 105169418A
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沈明武
胡勇
史向阳
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Abstract

本发明涉及一种乳糖酸修饰的超小型超顺磁四氧化三铁纳米颗粒的制备方法，包括：将三价铁盐与亚硫酸钠反应后加入超支化聚乙烯亚胺和氨水，反应后加入FI，得Fe3O4/PEI.NH2-FI；LA经EDS和NHS活化，加到COOH-PEG-NH2的溶液中，反应得COOH-PEG-LA；COOH-PEG-LA经EDC和NHS活化，加到Fe3O4/PEI.NH2-FI中，反应后经乙酰化即得。本发明的方法简单，反应条件温和，易于操作；制备的纳米颗粒粒径较小、弛豫率很高，并且具有良好的胶体稳定性、生物相容性和特定的去唾液酸糖蛋白受体高表达肿瘤细胞的靶向性，在体内肿瘤靶向MR成像诊断领域具有潜在的应用价值。

Description

一种乳糖酸修饰的超小型超顺磁四氧化三铁纳米颗粒的制备方法
技术领域
本发明属于四氧化三铁纳米颗粒的制备领域，特别涉及一种乳糖酸修饰的超小型超顺磁四氧化三铁纳米颗粒的制备方法。
背景技术
肝癌是我国常见的恶性肿瘤，在我国发病率较高，高发的年龄在40～50岁之间，是所有恶性肿瘤中的第二号杀手，严重影响广大人民群众的身体健康。一直以来，由于肝癌治疗效果较差，甚至曾被称为“癌中之王”。通过造影剂来增强造影，提高早期精确诊断水平，以便手术切除或者放化疗去除病灶，可以大大提高患者生存率。在医用肝脏增强造影中，常用的造影剂包括T1加权MR成像的含钆造影剂(Gd-DTPA和Gd-DOTA等)和T2加权MR成像的超顺磁性氧化铁颗粒。然而，前者有潜在的肾毒性和血液循环时间短等缺点；后者存在容易被网状内皮系统的巨噬细胞清除等不足。因此，研发生物相容性好且具有高效肝脏造影功能的新型造影剂迫在眉睫。
近年来，超顺磁性四氧化三铁纳米颗粒在生物医学领域有着越来越广泛的应用，特别是用作核磁共振(MR)成像的造影剂。本课题组已通过简易的温和还原法制备了两种不同癌细胞受体靶向能力的四氧化三铁纳米颗粒，并探索了其在MR成像诊断中应用的可行性(沈明武，李静超，胡勇，孙文杰，史向阳。一种叶酸修饰的超顺磁氧化铁纳米颗粒的制备方法。中国发明专利，专利申请号：2014101828211，申请日期：2014-04-03；J.Mater.Chem.B,2015,3,5720-5730。沈明武，胡勇，李静超，韦平，史向阳。一种RGD修饰的超小型超顺磁氧化铁纳米颗粒的制备方法。中国发明专利，专利申请号：2014106044681，申请日期：2014-10-30；Huetal.，Biomater.Sci.,2015,3,721-732)。这些制备的四氧化三铁纳米颗粒的弛豫率在400mM-1s-1以上，可有效减少造影剂的剂量并达到灵敏检测的目的。
乳糖酸本身即存在于人体中，有强力的抗氧化作用，使其早已应用在器官移植中以防止器官受到自由基的伤害，增加了器官的保存性。此外，乳糖酸作为一种半乳糖，也是一种引人注目的肿瘤靶向分子，能够通过与肝癌细胞表面特异性表达的去唾液酸糖蛋白受体(ASGPRs)结合。但是，乳糖酸修饰在四氧化三铁纳米颗粒表面的研究却鲜为报道。此外，纳米颗粒的PEG化修饰可延长其在血液中的循环时间，逃离网状内皮系统的吞噬，更有助于实现乳糖酸对ASGPRs高表达的肿瘤细胞的靶向。因此，制备具有更高弛豫率的四氧化三铁纳米颗粒实现对肝癌的靶向MR成像就显得尤为有意义。检索国内外文献，尚没有发现关于用温和还原法制备具有超高弛豫率的乳糖酸特异靶向能力的Fe3O4纳米探针用于体外和体内原位肝癌肿瘤模型的靶向MR成像诊断研究的相关报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种乳糖酸修饰的超小型超顺磁四氧化三铁纳米颗粒的制备方法，该方法操作简单，反应条件温和，易于操作，成本较低；制备的Fe3O4纳米颗粒能够长时间稳定地分散于水溶液中，不会出现团聚现象；所用的修饰剂PEI为廉价和环境友好材料，具有产业化实施的前景。
本发明的一种乳糖酸修饰的超小型超顺磁四氧化三铁纳米颗粒的制备方法，包括：
(1)将三价铁盐溶于超纯水中，氮气鼓吹，加入亚硫酸钠溶液，反应30～40分钟，依次加入超支化聚乙烯亚胺PEI水溶液和NH3·H2O，60～70℃下恒温搅拌反应30～40分钟；然后在室温下反应1.5～3小时，将产物磁分离，洗涤，得到PEI包裹的超小型超顺磁四氧化三铁纳米颗粒Fe3O4/PEI.NH2；其中，三价铁盐、亚硫酸钠和PEI的质量比为1.2～1.4：0.20～0.25：0.50～0.53；三价铁盐、超纯水和NH3·H2O的配比为1.2～1.4g：20～25mL：2～3mL；
(2)将步骤(1)中的Fe3O4/PEI.NH2洗涤，分散于溶剂中，然后加入FI溶液，搅拌，磁分离，洗涤，分散于水中，得到Fe3O4/PEI.NH2-FI纳米颗粒水溶液；其中，Fe3O4/PEI.NH2中的PEI和FI的摩尔比是1：10～15；
(3)将LA与EDS和NHS混合溶于磷酸盐缓冲溶液PBS中，搅拌活化，加入到COOH-PEG-NH2的PBS溶液中，搅拌2～4天，透析，真空冷冻干燥，得到COOH-PEG-LA；其中，LA与COOH-PEG-NH2的摩尔比是1～1.5：1；
(4)将步骤(3)中的COOH-PEG-LA与EDC和NHS混合溶于水中，搅拌活化，然后加入到步骤(2)中的得到Fe3O4/PEI.NH2-FI纳米颗粒水溶液中，搅拌2～4天，磁分离，洗涤，分散于水中，得到Fe3O4/PEI.NH2-FI-PEG-LA纳米颗粒水溶液；其中，COOH-PEG-LA和Fe3O4/PEI.NH2-FI中PEI的摩尔比是15～20：1；
(5)将三乙胺加入到步骤(4)中Fe3O4/PEI.NH2-FI-PEG-LA纳米颗粒水溶液中，搅拌20～40分钟，然后加入乙酸酐，搅拌20～30小时，磁分离，洗涤，得到Fe3O4/PEI.NHAc-FI-PEG-LA纳米颗粒；其中，三乙胺、乙酸酐和Fe3O4/PEI.NH2-FI-PEG-LA上PEI伯胺的摩尔比是5～10：5～10：1。
所述步骤(1)中三价铁盐为FeCl3·6H2O。
所述步骤(1)中的超支聚乙化烯亚胺PEI的分子量为25000。
所述步骤(1)中的NH3·H2O质量百分比浓度为25～28％。
所述步骤(2)中溶剂为DMSO，FI溶液的溶剂为DMSO。
所述步骤(2)中搅拌的时间为1～2天。
所述步骤(3)中LA、EDS和NHS的摩尔比为1～1.5：1～1.5：1～1.5。
所述步骤(3)中PBS溶液的pH值为6.0。
所述步骤(3)中COOH-PEG-NH2的分子量为2000。
所述步骤(3)中透析为用截留分子量1000的透析袋透析2～4天。
所述步骤(4)中COOH-PEG-LA、EDC和NHS的摩尔比是1：8～10：8～10。
所述步骤(3)和步骤(4)中搅拌活化的时间为2～4h。
所述步骤(5)中洗涤的次数为3～5次。
本发明合成了一种基于乳糖酸修饰的超小型超顺磁四氧化三铁纳米颗粒。为了克服裸露Fe3O4普遍存在的磁学特性导致的聚集现象，并提高其在生物医学成像领域的可应用性，在反应过程中加入聚乙烯亚胺PEI用于介导Fe3O4的合成，从而实现简易“一步”还原法制备了胶体稳定性良好的PEI包覆的Fe3O4/PEI.NH2。为了使制备的该种Fe3O4/PEI.NH2能有效地应用到生物体内，在其表面接上异硫氰酸荧光素(FI)用于纳米颗粒的示踪；为实现特定肿瘤部位的成像检测，在其表面修饰聚乙二醇-乳糖酸复合物(Polyethyleneglycol-LA,COOH-PEG-LA)；最后通过乙酰化中和PEI表面剩余的氨基，降低纳米颗粒的表面电势，从而进一步提高其生物相容性。此外，实验数据表明，制备的Fe3O4/PEI.NHAc-FI-PEG-LA纳米颗粒有很显著的T2加权成像效果，其r2弛豫率分别高达579.89mM-1s-1。最后以ASGPRs高表达的HepG2细胞(一种肝癌细胞)为模型细胞和肝癌原位肿瘤模型对制备的乳糖酸靶向的多功能纳米探针的性质进行一一评价。本发明制备的Fe3O4纳米探针在生物医学方面表现出良好特性，特别是超高的r2弛豫率，有望实现在不同疾病系统的准确和灵敏诊断，为Fe3O4纳米探针用作临床造影剂提供可靠的依据。
本发明操作简便易行，原材料成本低。制备的纳米颗粒具有良好的分散性、胶体稳定性和生物相容性。与ASGPRs低表达的HepG2细胞(被LA阻断)的实验组相比，乳糖酸修饰的Fe3O4纳米颗粒使得ASGPRs高表达的HepG2细胞或肿瘤部位(未被LA阻断)信号更低，表明本发明制备的纳米颗粒对ASGPRs高表达细胞具有更好靶向性。从而说明该方法制备的乳糖酸修饰的Fe3O4纳米颗粒在MR分子影像诊断领域有着潜在的应用。
紫外可见吸收光谱(UV-Vis)、核磁共振分析(1HNMR)、热重分析(TGA)、电感耦合等离子体原子发射光谱法(ICP-OES)、Zeta电势及动态光散射(DLS)和透射电子显微镜(TEM)等方法表征制备的磁性纳米颗粒，并通过磁共振成像仪测定纳米颗粒的T2弛豫性能，然后利用CCK-8法评价纳米颗粒的细胞毒性，再利用ICP-OES、流式细胞仪以及体外和体内核磁共振成像实验检测乳糖酸修饰的纳米材料对肿瘤细胞的靶向诊断效果。
有益效果
(1)本发明采用简单的还原法制备水溶性良好的PEI包覆的Fe3O4纳米颗粒，然后在纳米颗粒表面先后连接荧光素FI分子和COOH-PEG-LA，最后对纳米颗粒的表面氨基进行乙酰化处理，即得到用于MR成像的多功能Fe3O4纳米颗粒；
(2)本发明的方法操作工艺简单，反应条件温和，易于操作分离，所用均为廉价的和环境友好的材料，具有实施商业化的前景；
(3)本发明制备的Fe3O4纳米颗粒能够长时间地稳定分散于水溶液中，没有出现团聚现象，PEI的包覆增加了Fe3O4纳米颗粒的稳定性，COOH-PEG-LA的表面修饰增加了Fe3O4纳米颗粒的生物相容性和亲水性，而且COOH-PEG-LA的表面修饰赋予纳米颗粒对肿瘤细胞或者肿瘤部位的特异性靶向能力；这些优点使制备的乳糖酸修饰的Fe3O4纳米颗粒可以有效地用作体内靶向MR成像的阴性造影剂。
(4)本发明制备的超小型超顺磁氧化铁纳米颗粒粒径较小、弛豫率很高，并且具有良好的胶体稳定性、生物相容性和特定的去唾液酸糖蛋白受体(ASGPRs)高表达肿瘤细胞的靶向性，在体内肿瘤靶向MR成像诊断领域具有潜在的应用价值。
附图说明
图1为实施例2中Fe3O4/PEI.NH2(1)和Fe3O4/PEI.NH2-FI(2)的紫外吸收图谱；
图2为实施例3中COOH-PEG-LA核磁共振分析(1HNMR)图；
图3为实施例4中Fe3O4/PEI.NH2-FI(a)和Fe3O4/PEI.NH2-FI-PEG-LA(b)的热重分析图；
图4为实施例5中Fe3O4/PEI.NHAc-FI-PEG-LA的透射电镜图片(a)和尺寸分布直方图(b)；
图5为实施例6中Fe3O4/PEI.NHAc-FI-PEG-LA纳米颗粒的T2加权MR成像图片和T2弛豫时间倒数与Fe浓度的线性关系图；
图6为实施例7中CCK-8法测试的HepG2细胞经过PBS缓冲液(对照)和本发明制备的Fe3O4/PEI.NHAc-FI-PEG-LA纳米颗粒的MEM培养基(Fe的浓度范围在0.25～2.0mM)处理24小时后的细胞活力；
图7为实施例8中ASGPRs高低表达的HepG2细胞分别经过PBS缓冲液和本发明制备的Fe3O4/PEI.NHAc-FI-PEG-LA纳米颗粒的MEM培养基(Fe的浓度为0.15、0.3和0.6mM)共培养4小时后用ICP-OES测定的细胞铁元素的吞噬量；
图8为实施例9中ASGPRs高低表达的HepG2细胞分别与PBS缓冲液和本发明制备的Fe3O4/PEI.NHAc-FI-PEG-LA纳米颗粒的MEM培养基(Fe的浓度为0.3mM)共培养4小时后的流式分析图(a，其中1，2分别代表ASGPRs低表达和高表达的HepG2细胞分别与PBS缓冲液共培养后的流式荧光强度分析；3和4分别代表ASGPRs低表达和高表达的HepG2细胞分别与本发明制备的Fe3O4/PEI.NHAc-FI-PEG-LA纳米颗粒共培养后的流式荧光强度分析)和细胞的平均荧光强度(b)；
图9为实施例10中ASGPRs高低表达的HepG2细胞分别与本发明制备的Fe3O4/PEI.NHAc-FI-PEG-LA纳米颗粒的MEM培养基(Fe浓度范围在0.1～0.4mM)共培养6小时后的细胞T2加权MR成像图片(a)和相应的MR图像信号值变化(b)；
图10为实施例11中两组患有肝癌的裸鼠分别尾静脉注射本发明制备的Fe3O4/PEI.NHAc-FI-PEG-LA纳米颗粒和混有游离LA(1mM)的Fe3O4/PEI.NHAc-FI-PEG-LA纳米颗粒PBS溶液(Fe：500μg，0.1mL)后不同时间点肿瘤(*)的T2加权MR成像图片(a)和相应的MR图像信号值变化(b)。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
将1.30gFeCl3·6H2O溶解于20mL超纯水中，移入250mL三口瓶中搅拌；氮气鼓吹15分钟后，将0.2g亚硫酸钠溶于10mL超纯水后加入到三口瓶中，持续搅拌反应30分钟；然后依次将0.5g超支化聚乙烯亚胺PEI的水溶液和2mL的NH3·H2O也加入到三口瓶中，60～70℃下恒温搅拌反应30分钟；接着在室温下反应1.5小时；反应结束后，将所得到的黑色产物磁分离，除去上清液，再加适量超纯水超声分散，再磁分离，如此重复超纯水洗涤三次，以除去杂质，然后重新分散于20mL超纯水中，即得PEI包覆的Fe3O4(Fe3O4/PEI.NH2)纳米颗粒水溶液。
实施例2
取10mLFe3O4/PEI.NH2(77mg)水溶液(实施例1)用DMSO洗涤后，重新分散于10mLDMSO溶液中。接着，将2mLDMSO溶解的FI溶液(1.79mg)加入到Fe3O4/PEI.NH2的DMSO溶液中，搅拌反应1天，产物Fe3O4/PEI.NH2-FI磁分离并用超纯水洗涤，然后分散到水中。分别取25μLFe3O4/PEI.NH2(实施例1)、Fe3O4/PEI.NH2-FI的水溶液于2mL离心管中，再向其中加700μL超纯水，超声均匀，测紫外吸收(见图1)。从图中可以看出，Fe3O4/PEI.NH2(曲线1)在400到600nm处没有明显的紫外吸收峰，而Fe3O4/PEI.NH2-FI(曲线2)在500nm处有一个明显的紫外吸收峰，从而说明FI成功修饰到Fe3O4/PEI.NH2纳米颗粒表面。
实施例3
将5.4mgLA与2.9mgEDC、1.7mgNHS混合溶于磷酸盐缓冲液PBS(pH＝6.0)中，搅拌活化2～4h，活化LA的羧基。然后，将上述混合溶液加入到20mgCOOH-PEG-NH2的PBS(pH＝6.0)溶液中，继续搅拌反应3天，用截留分子量1000的透析袋透析3天，然后真空冷冻干燥，即得COOH-PEG-LA。取3mg合成的COOH-PEG-LA于氘代D2O中进行核磁共振分析(1HNMR)(见图2)。从图中可以看出，在3.8和4.3ppm处出现的谱峰证明乳糖酸成功连接到PEG上，并通过峰面积积分可知，每一个PEG上连接0.7个乳糖酸。
实施例4
将实施例3中制备的15mgCOOH-PEG-LA与12.4mgEDC、7.4mgNHS混合溶解于5mL水后，搅拌活化3h；然后将活化的COOH-PEG-LA溶液逐滴加入到Fe3O4/PEI.NH2-FI纳米颗粒水溶液(实施例2)中，搅拌反应3天，再磁分离洗涤，即得Fe3O4/PEI.NH2-FI-PEG-LA纳米颗粒，并分散于10mL水中。取1mLFe3O4/PEI.NH2-FI-PEG-LA纳米颗粒水溶液(实施例4)冷冻干燥，然后进行热重分析(见图3)。从图中可以看出，修饰COOH-PEG-LA后，Fe3O4/PEI.NH2-FI-PEG-LA纳米颗粒的失重为14.9％(见图3b)，通过比较Fe3O4/PEI.NH2-FI纳米颗粒在700℃时的失重量(见图3a，Fe3O4/PEI.NH2-FI在温度升至700℃时，重量为原来的89.4％)，经过计算，PEI和FI的总上载率为10.6％，COOH-PEG-LA上载率为4.3％。再结合实施例2，说明PEI、FI和COOH-PEG-LA均已成功连接到Fe3O4纳米颗粒的表面。
实施例5
向实施例4中制备的Fe3O4/PEI.NH2-FI-PEG-LA纳米颗粒水溶液(10mL)中分别加入177μL三乙胺(密度为0.726～0.729g/mL，浓度为99.0％)，并搅拌20～40分钟；然后向上述两种溶液中再分别加入120μL乙酸酐(密度为1.08g/mL，浓度为98.5％)，继续搅拌反应24小时；产物磁分离并加入适量超纯水超声分散，如此重复3次，最终分散到5mL超纯水中，即制得乙酰化的Fe3O4/PEI.NHAc-FI-PEG-LA纳米颗粒水溶液。取Fe3O4/PEI.NH2-FI-PEG-LA(实施例4)和Fe3O4/PEI.NHAc-FI-PEG-LA(实施例5)纳米颗粒悬浮液各100μL，用超纯水分别配制成1.5mL的水溶液用于测表面电势和水动力直径(见表1)。电势结果显示乙酰化前后纳米颗粒的表面电势是+44.7mV和+19.5mV，而其分散于水中的水动力粒径分别是271.1nm和332.1nm，由此表明Fe3O4纳米颗粒乙酰化成功。
取本发明制备的Fe3O4/PEI.NHAc-FI-PEG-LA纳米颗粒水溶液(实施例5)5μL，然后用超纯水配制成100μL的纳米颗粒悬浮液。并取5μL纳米颗粒悬浮液滴在铜网表面，在空气中晾干后用于TEM测试(见图4)。TEM结果显示Fe3O4/PEI.NHAc-FI-PEG-LA纳米颗粒的形貌均为球形或准球形(见图4a)。通过分别随机测量300个纳米颗粒的直径计算得到Fe3O4/PEI.NHAc-FI-PEG-LA纳米颗粒的直径是8.9±1.9nm(见图4b)。
表1纳米颗粒分散于水中的电势和水动力粒径
材料 电势(mV) 水动力粒径(nm)
Fe3O4/PEI.NH2-FI-PEG-LA +44.7 271.1
Fe3O4/PEI.NHAc-FI-PEG-LA +19.5 332.1
实施例6
将本发明制备的Fe3O4/PEI.NHAc-FI-PEG-LA纳米颗粒水溶液(实施例5)通过ICP-OES测试法测定Fe元素的浓度，接着在EP管中用超纯水配制Fe浓度依次为0.0025、0.005、0.01、0.02和0.04mM的水溶液2mL，通过磁共振成像仪(NMR分析系统(0.5T))测定材料在不同的Fe浓度下的T2加权MR成像图(见图5a)和T2弛豫效应(见图5b)。由图5a可以看出，随着铁浓度的升高(在0.0025-0.04mM浓度范围内)，样品的信号逐渐降低，图像变暗。r2弛豫率反映Fe3O4纳米颗粒作为MR成像造影剂的效率，为单位摩尔浓度铁的横向弛豫时间(T2)，可通过不同浓度下的T2的倒数拟合计算得到。图5b为本发明制备的Fe3O4/PEI.NHAc-FI-PEG-LA纳米颗粒的T2弛豫时间倒数与Fe浓度的线性拟合图，可以看出这种Fe3O4纳米探针的弛豫时间倒数随着铁浓度的增加具有很好的线性关系。并且通过计算可得本发明制备的探针的r2弛豫率高达579.89mM-1s-1。因此，本发明所制备的Fe3O4/PEI.NHAc-FI-PEG-LA纳米颗粒可作为MR成像的优良T2信号衰减造影剂。
实施例7
以HepG2细胞为模型细胞评价本发明制备的Fe3O4/PEI.NHAc-FI-PEG-LA纳米颗粒(实施例5)对细胞活力的影响。用无菌PBS配置不同浓度纳米颗粒的PBS溶液，并用紫外照射过夜杀菌。将HepG2细胞种植于96孔板，培养过夜贴壁，与含本发明制备的Fe3O4/PEI.NHAc-FI-PEG-LA纳米颗粒(实施例5)的MEM培养液(Fe浓度为0、0.25、0.5、1.0、1.5和2.0mM)在37℃和5％CO2下共培养24小时。然后，向培养板孔中加入20μLCCK-8试剂盒溶液，继续在37℃下培养4小时，在450nm处测量吸光值，并根据此值计算细胞的活力(见图6)。不同浓度的纳米颗粒对细胞增殖的影响以PBS缓冲液处理的细胞为对照进行比较。与PBS对照组相比，Fe3O4/PEI.NHAc-FI-PEG-LA纳米颗粒在Fe的实验浓度为0到2.0mM范围内对HepG2细胞存活率的影响没有显著性差异，细胞存活率均在80％以上。这充分说明本发明制备的Fe3O4/PEI.NHAc-FI-PEG-LA纳米颗粒具有良好的生物相容性，可以应用到生物体内MR成像检测。
实施例8
ASGPRs高低表达的HepG2细胞经过含不同浓度的本发明制备的Fe3O4/PEI.NHAc-FI-PEG-LA纳米颗粒(实施例5)的MEM培养液处理后，通过ICP-OES检测细胞中Fe元素的含量，以此评估HepG2细胞对材料的吞噬量，并评价乳糖酸修饰的Fe3O4的靶向效果(见图7)。将2×105个ASGPRs高低表达的HepG2细胞分别种植于12孔细胞培养板中，在37℃和5％CO2下培养过夜，使细胞贴壁，然后弃去培养基，与Fe3O4/PEI.NHAc-FI-PEG-LA纳米颗粒的MEM培养液(Fe浓度为0.15、0.3和0.6mM)在37℃和5％CO2下培养4小时。培养结束后用PBS清洗3次，再胰酶消化、离心，最后用2mL王水消化(硝酸和盐酸体积比1：3)，通过ICP-OES检测细胞对铁的平均吞噬量。结果表明，Fe3O4/PEI.NHAc-FI-PEG-LA纳米颗粒培养的ASGPRs高表达(未被LA阻断)的HepG2细胞的铁的吞噬量明显高于ASGPRs低表达(被LA阻断)的HepG2细胞(p<0.05)，说明乳糖酸的修饰赋予了Fe3O4纳米颗粒(Fe3O4/PEI.NHAc-FI-PEG-LA)对HepG2细胞的特异靶向能力。
实施例9
ASGPRs高低表达的HepG2细胞用本发明制备的Fe3O4/PEI.NHAc-FI-PEG-LA纳米颗粒(实施例5)处理后，通过流式细胞仪检测细胞的平均荧光强度，进一步评估乳糖酸对ASGPRs高表达的HepG2细胞的靶向效果(见图8)。将2×105个ASGPRs高低表达的HepG2细胞分别种植于12孔细胞培养板中，在37℃和5％CO2下培养过夜，使细胞贴壁，然后弃去培养基，与含Fe3O4/PEI.NHAc-FI-PEG-LA纳米颗粒(实施例5)的MEM培养液(Fe浓度为0.3mM)在37℃和5％CO2下培养4小时。培养结束后用PBS清洗3次，再胰酶消化、离心、过滤，最后分散在1mLPBS中，通过流式细胞仪检测细胞的平均荧光强度。结果表明Fe3O4/PEI.NHAc-FI-PEG-LA纳米颗粒培养的ASGPRs低表达的HepG2细胞(如图8a，曲线3)和ASGPRs高表达的HepG2细胞(如图8a，曲线4)的荧光强度明显高于PBS培养的ASGPRs高低表达的HepG2细胞(如图8a，曲线1和2)，并且Fe3O4/PEI.NHAc-FI-PEG-LA纳米颗粒培养的ASGPRs高表达的HepG2细胞的荧光强度明显高于纳米颗粒培养的ASGPRs低表达的HepG2细胞的荧光强度。定量分析结果进一步表明(如图8b所示)，Fe3O4/PEI.NHAc-FI-PEG-LA纳米颗粒培养的ASGPRs高表达的HepG2细胞的平均荧光强度明显高于ASGPRs低表达的HepG2细胞的平均荧光强度(p<0.001)，说明乳糖酸的修饰赋予了Fe3O4纳米颗粒对ASGPRs高表达的HepG2细胞有特异靶向能力。
实施例10
在体内实验之前，评价了本发明制备的Fe3O4/PEI.NHAc-FI-PEG-LA纳米颗粒(实施例5)的细胞MR成像效果(见图9)。将2×106个ASGPRs高低表达的HepG2细胞(2.0mL培养基)分别接种在六孔板中，培养过夜使其贴壁，弃去培养基，再与含Fe3O4/PEI.NHAc-FI-PEG-LA纳米颗粒的MEM培养液(Fe浓度为0.1、0.2和0.4mM)在37℃和5％CO2下共培养4小时，并且以PBS处理的细胞作为对照组。培养结束后用PBS清洗5次，再胰酶消化、离心，最后分散在1mLPBS(含0.5％琼脂糖)中，用临床核磁共振成像体系(3.0T)评价肿瘤部位的MR成像效果。在图9a中，随着Fe浓度的增加，Fe3O4/PEI.NHAc-FI-PEG-LA纳米颗粒处理后的细胞均表现出MR图像信号衰减的趋势，说明随着Fe浓度的增加，细胞对纳米颗粒的吞噬量也增加。需要指出的是，在相同的Fe浓度下，Fe3O4/PEI.NHAc-FI-PEG-LA纳米颗粒处理后的ASGPRs高表达的HepG2细胞(见图9a(1))比ASGPRs低表达的HepG2细胞(见图9a(2))的MR图像信号降低更明显，说明ASGPRs高表达的HepG2细胞对Fe3O4/PEI.NHAc-FI-PEG-LA纳米颗粒的吞噬量要大大高于ASGPRs低表达的HepG2细胞对纳米颗粒的吞噬量。图9b是细胞经过不同浓度的纳米颗粒处理后的ASGPRs高低表达的HepG2细胞的MR图像信号值，从图中明显看出，随着Fe浓度的增加，细胞的MR图像信号值均逐渐降低。而在相同的Fe浓度下，Fe3O4/PEI.NHAc-FI-PEG-LA纳米颗粒处理后ASGPRs高表达的HepG2细胞的MR图像信号值要明显低于ASGPRs低表达的HepG2细胞的MR图像信号值(p<0.001)。这些结果不仅说明本发明制备的Fe3O4/PEI.NHAc-FI-PEG-LA纳米颗粒具有很好的细胞MR成像效果，而且证明了Fe3O4/PEI.NHAc-FI-PEG-LA纳米颗粒对ASGPRs高表达的HepG2细胞的特异靶向能力。
实施例11
年龄4～6周的雄性裸鼠麻醉后，将HepG2细胞以3×106细胞/只的密度种植于裸鼠的后肢部位。3～4周后，将肿瘤取出切成1mm3的碎片，通过手术将其种植于其他裸鼠的肝脏部位。再经过3-4周的饲养，荷瘤鼠建模形成(形成体积为0.8-1.4cm3的肝肿瘤)，并将其分成两组，用于验证本发明制备的Fe3O4/PEI.NHAc-FI-PEG-LA纳米颗粒(实施例5)对肿瘤的靶向特异性。两组肝癌裸鼠分别直接尾静脉注射本发明制备的Fe3O4/PEI.NHAc-FI-PEG-LA纳米颗粒(见附图10a,Group1)和混有游离LA(1mM)的Fe3O4/PEI.NHAc-FI-PEG-LA纳米颗粒(见附图10a,Group2)(Fe的质量为500μg，0.1mL)的PBS溶液，然后用临床核磁共振成像体系(3.0T)评价肿瘤部位的MR成像效果。与注射前的对照组相比较，在注射后0.5小时，两组肿瘤部位均开始变暗，2个小时达到最暗。在注射4小时后，两个实验组的裸鼠肿瘤部位明暗程度都逐渐恢复，说明此时纳米材料随着血液循环已经从肿瘤部位逐渐代谢出去(图10a)。图10b表示相应注射时间的肿瘤MR图像信号值变化，在注射0.5小时后，两组裸鼠肿瘤部位的信号强度均降低，2个小时信号强度候达到最低。在注射4小时后，两组裸鼠肿瘤部位MR图像信号值均有所增加，这与图10a的结果一致。值得一提的是，图10a和图10b均表明：随着时间的推移，仅注射Fe3O4/PEI.NHAc-FI-PEG-LA纳米颗粒的裸鼠肿瘤MR图像信号强度(Group1)一直低于注射混有游离的LA的Fe3O4/PEI.NHAc-FI-PEG-LA纳米颗粒的裸鼠肿瘤MR图像信号强度(Group2)(p<0.01)。这些结果说明本发明制备的Fe3O4/PEI.NHAc-FI-PEG-LA纳米颗粒具有很好的肿瘤靶向能力，能成功应用于体内靶向MR肿瘤成像诊断。

Claims (8)

1.一种乳糖酸修饰的超小型超顺磁四氧化三铁纳米颗粒的制备方法，包括：
(1)将三价铁盐溶于超纯水中，氮气鼓吹，加入亚硫酸钠溶液，反应30～40分钟，依次加入超支化聚乙烯亚胺PEI水溶液和NH3·H2O，60～70℃下恒温搅拌反应30～40分钟；然后在室温下反应1.5～3小时，将产物磁分离，洗涤，得到PEI包裹的超小型超顺磁四氧化三铁纳米颗粒Fe3O4/PEI.NH2；其中，三价铁盐、亚硫酸钠和PEI的质量比为1.2～1.4：0.20～0.25：0.50～0.53；三价铁盐、超纯水和NH3·H2O的配比为1.2～1.4g：20～25mL：2～3mL；
(2)将步骤(1)中的Fe3O4/PEI.NH2洗涤，分散于溶剂中，然后加入FI溶液，搅拌，磁分离，洗涤，分散于水中，得到Fe3O4/PEI.NH2-FI纳米颗粒水溶液；其中，Fe3O4/PEI.NH2中的PEI和FI的摩尔比是1：10～15；
(3)将LA与EDS和NHS混合溶于磷酸盐缓冲溶液PBS中，搅拌活化，加入到COOH-PEG-NH2的PBS溶液中，搅拌2～4天，透析，真空冷冻干燥，得到COOH-PEG-LA；其中，LA与COOH-PEG-NH2的摩尔比是1～1.5：1；
(4)将步骤(3)中的COOH-PEG-LA与EDC和NHS混合溶于水中，搅拌活化，然后加入到步骤(2)中的得到Fe3O4/PEI.NH2-FI纳米颗粒水溶液中，搅拌2～4天，磁分离，洗涤，分散于水中，得到Fe3O4/PEI.NH2-FI-PEG-LA纳米颗粒水溶液；其中，COOH-PEG-LA和Fe3O4/PEI.NH2-FI中PEI的摩尔比是15～20：1；
(5)将三乙胺加入到步骤(4)中Fe3O4/PEI.NH2-FI-PEG-LA纳米颗粒水溶液中，搅拌20～40分钟，然后加入乙酸酐，搅拌20～30小时，磁分离，洗涤，得到Fe3O4/PEI.NHAc-FI-PEG-LA纳米颗粒；其中，三乙胺、乙酸酐和Fe3O4/PEI.NH2-FI-PEG-LA上PEI伯胺的摩尔比是5～10：5～10：1。
2.根据权利要求1所述的一种乳糖酸修饰的超小型超顺磁四氧化三铁纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中三价铁盐为FeCl3·6H2O。
3.根据权利要求1所述的一种乳糖酸修饰的超小型超顺磁四氧化三铁纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中溶剂为DMSO，FI溶液的溶剂为DMSO。
4.根据权利要求1所述的一种乳糖酸修饰的超小型超顺磁四氧化三铁纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中搅拌的时间为1～2天。
5.根据权利要求1所述的一种乳糖酸修饰的超小型超顺磁四氧化三铁纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中LA、EDS和NHS的摩尔比为1～1.5：1～1.5：1～1.5。
6.根据权利要求1所述的一种乳糖酸修饰的超小型超顺磁四氧化三铁纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中PBS溶液的pH值为6.0。
7.根据权利要求1所述的一种乳糖酸修饰的超小型超顺磁四氧化三铁纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中COOH-PEG-LA、EDC和NHS的摩尔比是1：8～10：8～10。
8.根据权利要求1所述的一种乳糖酸修饰的超小型超顺磁四氧化三铁纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)和步骤(4)中搅拌活化的时间为2～4h。
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