CN115227828A - 一种基于四氧化三铁的磁靶向蛋白递送纳米组装体的制备方法及应用 - Google Patents
一种基于四氧化三铁的磁靶向蛋白递送纳米组装体的制备方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种基于四氧化三铁的磁靶向蛋白递送纳米组装体的制备方法,具体步骤为:(1)四氧化三铁纳米颗粒的合成,(2)合成含苯硼酸基团的小分子配体,(3)苯硼酸修饰的四氧化三铁材料制备,(4)胞外响应纳米组装体的制备,(5)胞内响应纳米组装体的制备。本发明还公开了该制备方法制备的纳米组装体在蛋白递送中的应用,可以实现肿瘤部位胞内或胞外响应性蛋白递送。本发明制备的纳米组装体具有磁靶向性,可增加摄取,能够应用于肿瘤细胞内外响应性递送蛋白质并保持蛋白质活性,具有良好的生物相容性。同时还可用于递送功能蛋白,具有肿瘤治疗前景。
Description
技术领域
本发明涉及纳米材料制备和生物医药领域,具体涉及一种基于四氧化三铁的磁靶向蛋白递送纳米组装体的制备方法及应用。
背景技术
蛋白质递送是指将外源蛋白质或多肽等生物分子递送进体内,从而实现细胞生物学功能的调控、疾病的治疗等作用。相比于基因治疗,蛋白质疗法能够快速响应,不会引起永久性的基因改变和严重的毒副作用;而与小分子化药相比,蛋白质具有高特异性、低毒性等优势。迄今为止,蛋白质疗法已经在医学领域发挥了重要作用。基于蛋白质的作用位点可以将它们分为两类,一类是作用于胞外或细胞膜上的蛋白质疗法,蛋白质在细胞外即可起作用,如糖尿病治疗中用到的胰岛素是一种蛋白质类激素,与靶细胞膜上的特异受体结合从而起到降低血糖的作用;另一类的作用靶点则位于胞内,蛋白质在胞质中发挥作用,进行治疗,如肿瘤治疗中常用的RNase A是一种核糖核酸酶,能够催化核糖核酸(RNA)的降解,导致细胞死亡。
胞内或胞外作用的蛋白质直接递送进入体内的过程中遇到许多障碍。对于细胞外靶点的蛋白质治疗,其疗效由于易在血清中聚集、被酶解等因素而受到影响;而靶点位于胞质中的蛋白质治疗,治疗效果则受到蛋白质的许多物理化学性质限制,如易被酶解、分子尺寸大、细胞膜渗透性差、易丧失活性等。为了解决胞内外蛋白递送遇到的问题,人们设计并利用各种纳米颗粒(如脂质体、高分子载体、无机纳米颗粒载体等)进行蛋白递送,以增强其稳定性或改善膜渗透性,从而实现蛋白质递送。其中,相比于其他众多的递送方式,无机纳米颗粒由于尺寸可控、易于功能化、生物相容性好等优势在蛋白质及多肽递送领域具有广阔的应用前景。目前的大多数工作会对蛋白质进行共价修饰,将其偶联在纳米颗粒表面,从而实现蛋白递送。然而化学修饰会严重影响蛋白质的活性,不利于后续发挥作用。且大部分纳米颗粒在病灶部位的聚集较低,使治疗效果大打折扣。与此同时,循环积聚在正常部位发挥作用的纳米制剂会影响正常细胞的功能,造成严重的毒副作用。因此需要开发一种能够保持蛋白活性的、具有靶向性以及肿瘤微环境响应性的蛋白质递送载体。
发明内容
发明目的:针对现有技术不足,本发明提供一种基于四氧化三铁的磁靶向蛋白递送纳米组装体的制备方法,本发明所制得的纳米组装体具有磁靶向性,在外部磁场作用下聚集于肿瘤部位,可增加摄取,应用于肿瘤部位胞内或胞外响应释放蛋白,减少对正常组织的毒副作用,并且不需对蛋白进行化学修饰,能够保持释放蛋白的活性。
本发明的另一目的是提供一种基于四氧化三铁的磁靶向蛋白递送纳米组装体的制备方法所制备的纳米组装体在蛋白递送中的应用。
技术方案:为了实现上述目的,本发明所述的一种基于四氧化三铁的磁靶向蛋白递送纳米组装体的制备方法,包括如下步骤:
(1)四氧化三铁纳米颗粒的合成:将乙酰丙酮铁与油胺、油酸混合,加热并通入惰性气体,保温30~60min,再迅速升温,持续反应后程序升温至250~300℃,保温30~60min后降温,以极性溶剂沉淀纳米颗粒,离心,除去上清液得到四氧化三铁纳米颗粒。
(2)合成含苯硼酸基团的响应性小分子:将含有苯硼酸基团的化合物、频哪醇溶于四氢呋喃(THF),加入醋酸溶液,在室温下搅拌反应后,旋蒸提纯后得化合物1,将化合物1、盐酸多巴胺、2-乙氧基-1-乙氧碳酰基-1,2-二氢喹啉(EEDQ)加入甲醇(THF)溶液中,在惰性气体保护下搅拌过夜,旋蒸除去溶剂,得到化合物2,即为含苯硼酸基团的响应性小分子。
(3)苯硼酸修饰的四氧化三铁纳米颗粒:对步骤(1)制备的四氧化三铁纳米颗粒进行配体交换,将盐酸多巴胺和化合物2分散在四氢呋喃中,冷凝回流,升温至30~60℃,加入步骤(1)制备的四氧化三铁纳米颗粒,反应后离心,加入去离子水,随后加入甲基硼酸,并调节溶液至酸性,反应脱去频哪醇保护,得到苯硼酸修饰的四氧化三铁纳米颗粒(IONP)。
(4)胞外响应纳米组装体的制备:将步骤(3)制备的苯硼酸修饰的四氧化三铁纳米颗粒与蛋白质混合,室温下涡旋,静置后离心,获得胞外响应性纳米组装体;
(5)胞内响应纳米组装体的制备:将蛋白质与天然多酚共孵育,随后与步骤(3)制备的苯硼酸修饰的四氧化三铁纳米颗粒混合,室温下涡旋,静置,得到纳米颗粒,后加入聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺,涡旋,静置后离心,获得胞内响应的纳米组装体。
其中,步骤(1)中制备的四氧化三铁纳米颗粒粒径为8~10nm。
进一步地,步骤(2)中含苯硼酸基团的化合物为4-羧基苯硼酸或4-羧基-3-氟苯硼酸任一一种。
进一步地,步骤(3)中,盐酸多巴胺与化合物2的摩尔比为1:0.2~2,化合物2与甲基硼酸的摩尔比为1:3~7。
进一步地,步骤(4)中,蛋白质与四氧化三铁纳米颗粒的质量比为1:0.5~2所述蛋白质为牛血清白蛋白。
进一步地,步骤(5)中,天然多酚为表没食子儿茶素没食子酸酯,蛋白质与表没食子儿茶素没食子酸酯的摩尔比为1:10~100,蛋白质与四氧化三铁纳米颗粒的质量比为1:0.5~2;所述蛋白质为牛血清白蛋白或者葡萄糖氧化酶。
本发明所述的基于四氧化三铁的磁靶向蛋白递送纳米组装体的制备方法制备的纳米组装体在胞内或胞外蛋白递送中的应用。
进一步地,纳米组装体在蛋白递送中的应用为在胞内或胞外磁靶向性递送功能蛋白。具体地,所述纳米组装体用于磁靶向性递送蛋白质,增加摄取。同时还可用于递送功能蛋白,保持蛋白活性。
进一步地,该纳米组装体能够在胞外或胞内响应性释放所负载的蛋白质。具体地,在肿瘤细胞外部条件pH 6.3~6.8,0.1~0.4mM ATP下,所释放的蛋白质包括但不限于牛血清白蛋白;肿瘤细胞胞内条件pH 4.5~5.5下,所释放的蛋白质包括但不限于牛血清白蛋白、葡萄糖氧化酶。
本发明所述的基于四氧化三铁的磁靶向蛋白递送纳米组装体的制备方法制备的纳米组装体在制备肿瘤治疗药物中的应用。
作为优选,所述胞内响应的纳米组装体在制备肿瘤治疗药物中的应用。
发明机理:本发明基于苯硼酸改性的四氧化三铁纳米材料,可以实现肿瘤部位胞内或胞外的响应性蛋白递送。胞外响应的纳米组装体由苯硼酸改性的四氧化三铁纳米颗粒(IONP)和蛋白质组成,IONP在正常生理条件下显示出正电性,与带负电荷的蛋白质通过静电吸附作用结合。在肿瘤细胞外部微环境pH 6.3~6.8,0.1~0.4mM ATP的条件下,IONP发生电荷翻转,变为带负电荷,与蛋白质相互排斥,释放所负载的蛋白质,所释放的蛋白质包括但不限于牛血清白蛋白(BSA)。
胞内响应性纳米组装体通过将蛋白质与天然多酚孵育结合后,多酚与IONP形成硼酸酯键制得,硼酸酯键具有酸敏感性,在肿瘤细胞胞内条件pH 4.5~5.5下断裂,释放多酚结合的蛋白质。为了提高循环稳定性及细胞摄取效率,外层用聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺(PEI-PEG)保护,同时提高稳定性及促进摄取。该纳米颗粒被内吞进细胞后,PEI-PEG附着到溶酶体膜上,破坏溶酶体,进行溶酶体逃逸,溶酶体脱离。而在胞内酸性环境下,进行胞内酸响应的主体部分是IONP/BSA-EGCG组装体解体,释放蛋白,所释放的蛋白质包括但不限于牛血清白蛋白(BSA)、葡萄糖氧化酶(GOx)。
本发明递送系统未对蛋白质进行化学修饰,最大限度的保持其生物活性,且由于四氧化三铁纳米颗粒独特的磁学性质,可以实现蛋白质的靶向递送,并增强摄取。在肿瘤部位特异性释放蛋白,减少对正常组织的毒副作用,具有良好的生物相容性。
本发明提出一类基于四氧化三铁的磁靶向蛋白递送纳米组装体。该类组装体基于苯硼酸改性的四氧化三铁纳米材料,可以实现肿瘤部位胞内或胞外的响应性蛋白递送。胞外响应的纳米组装体由苯硼酸改性的四氧化三铁无机材料和蛋白质组成,二者通过静电吸附作用结合。在肿瘤微环境pH 6.3~6.8,0.1~0.4mM ATP的条件下,四氧化三铁纳米颗粒发生电荷翻转,释放所负载的蛋白质。胞内响应性纳米组装体通过将蛋白质与天然多酚共孵育,再通过硼酸酯键与四氧化三铁结合,外层用聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺保护制得,具有酸响应解体特性。该递送系统未对蛋白质进行化学修饰,最大限度的保持其生物活性,且由于四氧化三铁纳米颗粒独特的磁学性质,可以实现蛋白质的靶向递送,并增强摄取。在肿瘤部位特异性释放蛋白,减少对正常组织的毒副作用,能够应用于肿瘤细胞内外响应性递送蛋白质并保持蛋白质活性,具有良好的生物相容性。同时还可用于递送功能蛋白,具有肿瘤治疗前景。
有益效果:本发明与现有技术相比,具有如下优势:
1、本发明制备的纳米组装体,制备方法简单、效果显著,该纳米组装体能够在胞外或胞内响应性释放所负载的蛋白质。
2、本发明制备的纳米组装体可以在外部磁场的作用下聚集于肿瘤部位,增加细胞摄取,具备磁靶向能力;
3、本发明的纳米组装体组装过程不需要有机溶剂,递送系统不需要对蛋白进行化学修饰,最大限度的保留了蛋白活性,并且在肿瘤细胞内外进行响应性解体,从而释放所负载的蛋白,降低毒副作用,具有良好的生物相容性;
4、利用该纳米组装体尝试递送葡萄糖氧化酶,抑制肿瘤细胞生长,在蛋白含量为4μg/ml时,细胞存活率约为70%,高于8μg/ml时,细胞存活率仅为20%,具有肿瘤治疗前景。
附图说明
图1为四氧化三铁纳米颗粒的透射电镜图;
图2为化合物2的核磁共振谱图;
图3胞外响应性纳米组装体的粒径分布图(A)及透射电镜图(B);
图4胞外响应性纳米组装体在模拟胞外环境下的粒径分布图(A)及透射电镜图(B);
图5为胞外响应性纳米组装体在模拟胞外环境下的蛋白释放曲线,横坐标为释放时间,纵坐标为释放百分率;
图6胞内响应性纳米组装体的粒径分布图(A)及透射电镜图(B);
图7胞内响应性纳米组装体在模拟胞内环境下的粒径分布图(A)及透射电镜图(B);
图8为胞内响应性纳米组装体在模拟胞内环境下的蛋白释放曲线,横坐标为释放时间,纵坐标为释放百分率;
图9纳米组装体的胞内蛋白递送效果图(A)及磁场条件下的递送效果图(B);
图10为不同组别纳米颗粒对人肝癌细胞HepG2的毒性结果图。
具体实施方案
以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
下述实施例中所使用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
甲醇:上海凌峰化学试剂有限公司;二氯甲烷:无锡市亚盛化工有限公司;BSA:北京索莱宝科技有限公司;异硫氰酸荧光素:西安瑞禧生物科技有限公司;Cy3-NHS:西安瑞禧生物科技有限公司。
实施例1
四氧化三铁纳米颗粒的合成
将700mg乙酰丙酮铁溶于4mL油酸和6mL油胺的混合溶液中,加热至120℃,通入惰性气体氮气,除去体系中的水蒸气和氧气,并保温30分钟。随后,迅速将体系温度升温至220℃,保持30分钟,溶液由红色变为棕黑色。然后以2℃/min的速度将体系温度升温至300℃,并保持30分钟。随后将体系温度降温至120℃,保持90分钟后用50mL无水乙醇沉淀纳米颗粒,8000rpm离心5分钟,弃去上清,得到棕黑色沉淀,将所得沉淀溶解于3mL正己烷,再用50mL无水乙醇沉淀,8000rpm离心5min,得到四氧化三铁纳米颗粒。
将1mg四氧化三铁纳米颗粒分散于1mL正己烷中,取20μL滴在铜网上,晾干后进行透射电子显微镜扫描。结果如图1所示,得到了粒径为8~10nm的均匀分散的四氧化三铁纳米颗粒。
实施例2
合成含苯硼酸基团的响应性小分子
将4-羧基-3-氟苯硼酸(367.86mg,2mmol)和频哪醇(236.34mg,2mmol)溶于四氢呋喃(THF,10mL)中,并向混合液中加入冰醋酸(2mL),在室温下搅拌反应4小时。随后旋蒸除去溶剂,得到化合物1。将化合物1(399mg,1.5mmol)、盐酸多巴胺(189mg,1mmol)与2-乙氧基-1-乙氧碳酰基-1,2-二氢喹啉(EEDQ,247mg,1mmol)溶于50mL无水甲醇(MeOH)中,氮气保护条件下过夜搅拌。随后旋蒸除去溶剂,用8mL有机混合溶剂(二氯甲烷:甲醇=8:1)复溶,取8mL有机混合溶剂(二氯甲烷:甲醇=8:1)在薄层硅胶板上样,用30mL展开剂(二氯甲烷:甲醇=8:1)展开,将产物条带刮下,用100mL有机溶剂(二氯甲烷:甲醇=10:1)的冲洗。旋蒸将溶剂除去,即得到化合物2。
化合物2的合成路线如下:
化合物2的核磁数据:1H NMR(300MHz,D2O)δ~1.2(12H,s),~2.78(2H,t),~3.47(2H,t),6.52~6.61(3H,m),7.29~7.6(3H,m)。
化合物2的核磁共振氢谱如图2所示,表示含苯硼酸基团的响应性小分子的成功合成。
实施例3
苯硼酸修饰的四氧化三铁纳米颗粒制备
分别称取15mg盐酸多巴胺和15mg实施例2制备的化合物2,溶于10mL四氢呋喃(THF),加入三颈烧瓶中,升温至50℃,冷凝回流3h,向三颈烧瓶内加入10mg实施例1制备的四氧化三铁纳米颗粒,反应3h,反应体系保持在50℃。然后冷却至室温,离心(8000rpm,3min),弃去上清,沉淀用5mL THF反复洗3次后溶于1mL去离子水。取1mL该溶液并向内加入11mg甲基硼酸,加入盐酸调节溶液为酸性(pH 6)反应3h后得到苯硼酸修饰的四氧化三铁材料水溶液,离心(8000rpm,3min),得到了纳米颗粒(IONP)。取纳米颗粒(IONP)用去离子水稀释至1μg/mL后用纳米粒度仪检测,粒径约为37nm。
实施例4
胞外响应纳米组装体的制备及表征
取4mg实施例3制备的苯硼酸修饰的四氧化三铁纳米颗粒(IONP)与8mg牛血清白蛋白(BSA)(固体纯蛋白,纯度97%)混合,室温涡旋10分钟后静置2小时,离心(8000rpm,3min),用1mL去离子水清洗两次,弃去上清,沉淀为胞外响应的纳米组装体(IONP/BSA)。
纳米组装体的表征:将胞外响应纳米组装体用去离子水配置成1μg/mL的溶液,用纳米粒度仪进行检测;将该反应液取20μL滴在铜网上,晾干后进行透射电子显微镜扫描。
胞外响应组装体结果见图3所示,从图3(A)中可以看出,单分散的苯硼酸改性的四氧化三铁纳米颗粒(IONP)粒径大约为37nm,而胞外响应的纳米组装体(IONP/BSA),粒径变大至164nm,表明形成了粒径均一的胞外响应纳米组装体;从图3(B)中看出,四氧化三铁纳米颗粒与蛋白质形成了尺寸均匀的纳米组装体,粒径约为150nm,与粒径分布结果相符。
实施例5
胞外响应性验证
取实施例4制得的胞外响应纳米组装体(IONP/BSA)50μg,置于1mL pH 6.5,且含有0.1mM ATP的溶液中过夜,随后将该反应液稀释至1μg/mL,用纳米粒度仪检测;取20μL该反应液滴在铜网上,晾干后进行透射电子显微镜扫描。
如图4所示,从图4(A)中可以看出,在模拟胞外环境的溶液(pH 6.5,0.1mM ATP)中过夜后,该纳米组装体的粒径发生了明显的变化,由164nm减小为44nm左右,证明该纳米组装体在模拟的胞外环境中能够发生解体,释放所负载的蛋白;图4(B)中的TEM图像也证实了这一点,在pH 6.5,0.1mM ATP的作用下,由粒径均一的胞外响应的纳米组装体(IONP/BSA)变为单分散的四氧化三铁纳米颗粒。
实施例6
胞外响应性纳米组装体的蛋白释放曲线
取5mg牛血清白蛋白(BSA)(固体纯蛋白,纯度97%)与1mg异硫氰酸荧光素溶于1mL蒸馏水中,室温下避光振荡过夜,随后用1000Da的透析袋透析2天除去游离的异硫氰酸荧光素,冻干,得到异硫氰酸荧光素标记的牛血清白蛋白(BSA-FITC),采用实施例4的制备方法制备得到异硫氰酸荧光素标记的胞外响应的纳米组装体(IONP/BSA)。取300μg BSA-FITC和IONP制得异硫氰酸荧光素标记的胞外响应的纳米组装体(IONP/BSA),溶于100μL去离子水中,分别取50μL加入200μL pH 6.5,0.1mM ATP溶液及200μL pH 7.4,不含ATP的PBS缓冲溶液中。将该溶液均等的分装于8个微型离心管内,在37℃下孵育,随后分别在0、0.5、1、1.5、2、4、8、10h取出并离心,取上清测定荧光。根据BSA-FITC含量与荧光强度之间的线性关系,计算得到在该时间点的蛋白释放量。
结果见图5所示,从图5中可以看出,在pH 7.4的正常条件下,2h内的蛋白释放量只有大约20%,而pH 6.5,0.1mM ATP的胞外模拟条件下,2h内的蛋白释放量可以达到73%左右,证明该纳米组装体的肿瘤部位胞外特异性响应。
实施例7
胞内响应纳米组装体的制备及表征
称取1mg聚乙烯亚胺(PEI,MW:25000)、23μg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)、14μg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶于1mL无水氯仿中,室温下搅拌30min后,加入720μg聚乙二醇(PEG-COOH,MW:2000),室温下反应过夜。将1mL反应液滴加至50mL无水乙醚溶液中,离心(12000rpm,5min)后,得到白色沉淀,用50mL无水乙醚洗3次,置于37℃烘箱内过夜,烘干得到PEI-PEG。
称取8mg牛血清白蛋白(BSA)与0.6mg表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)溶于100μL水中,室温下共孵育3小时。随后,与4mg实施例3制备的IONP混合,涡旋10分钟后静置2小时,得到纳米颗粒(IONP/BSA-EGCG)。取12mg纳米颗粒(IONP/BSA-EGCG,200μL)加入4mg聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺(PEI-PEG,100μL),室温涡旋后静置,离心(8000rpm,3min),弃去上清,1mL去离子水清洗两次为胞内响应的装载PEI-PEG@IBE的纳米组装体。
纳米组装体的表征:将纳米颗粒IONP/BSA-EGCG与胞内响应纳米组装体(PEI-PEG@IBE)分别用去离子水配置成1μg/mL的溶液,用纳米粒度仪进行检测;将该反应液取20μL滴在铜网上,晾干后进行透射电子显微镜扫描。
胞内响应组装结果见图6所示,从图6(A)中可以看出,四氧化三铁纳米颗粒与蛋白质混合组装后,形成了142nm的纳米颗粒(IONP/BSA-EGCG),而在外层包裹聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺后,该纳米组装体的粒径增加到220nm左右。图6(B)的结果与粒径分布图相符,PEI-PEG@IBE的粒径约为200nm,证明胞内响应纳米组装体的成功合成。
实施例8
胞内响应性验证
将实施例7中制得的100μg胞内响应纳米颗粒(IONP/BSA-EGCG)置于1mL pH 5的PBS缓冲溶液中过夜,随后将该反应液稀释至1μg/mL,用纳米粒度仪检测;将20μL该反应液滴在铜网上,晾干后进行透射电子显微镜扫描。
结果见图7所示,从图7(A)中可以看出,在pH 5的环境下过夜,该胞内响应纳米组装颗粒(IONP/BSA-EGCG)粒径由142nm变为33nm;图7(B)中的胞内响应纳米组装颗粒(IONP/BSA-EGCG)由粒径均一的不规则形状变为分散的球形四氧化三铁纳米颗粒,证明该胞内响应纳米组装体中的纳米组装颗粒(IONP/BSA-EGCG)在胞内环境中能够解体,释放蛋白。
实施例9
胞内响应性纳米组装体的蛋白释放曲线
取5mg牛血清白蛋白与1mgCy3-NHS溶于1mL蒸馏水中,室温下避光振荡过夜,随后用1000Da的透析袋透析2天除去游离的异硫氰酸荧光素,冻干,得到Cy3标记的牛血清白蛋白(BSA-Cy3),采用实施例7的制备方法制备得到异硫氰酸荧光素标记的胞内响应的纳米组装颗粒(IONP/BSA-EGCG)。取300μg BSA-Cy3和IONP制得胞内响应的纳米颗粒(IONP/BSA-EGCG),溶于100μL去离子水中,分别取50μL溶于200μL pH5及pH 7.4的PBS缓冲溶液中。将该溶液均等的分装于8个微型离心管内,在37℃下孵育,随后分别在0、0.5、1、1.5、2、4、8、10h取出并离心,取上清测定荧光。根据BSA-FITC含量与荧光强度之间的线性关系,计算得到在该时间点的蛋白释放量。
结果见图8所示,图8中的胞内溶酶体酸性模拟环境中,2h内的蛋白释放量达到了65%左右,与正常生理条件下的20%相比,证明了该胞内响应纳米组装体中的纳米组装颗粒(IONP/BSA-EGCG)在胞内pH 5的条件下会解体释放蛋白质,具有胞内响应特异性。
实施例10
胞内蛋白递送实验
1×105个HepG2细胞接种于48孔板中,在37℃,5%二氧化碳条件下培养过夜。当细胞生长至80%,带培养基整个细胞液3ml时,加入实施例7中制得的胞内响应的纳米组装体(PEI-PEG@IBE)25μg。分别在有磁场和无磁场的条件下与HepG2细胞在37℃共孵育8h后,弃去培养基,用台盼蓝孵育5min,使吸附在细胞表面的荧光物质淬灭,用PBS清洗2次,置于显微镜下观察。
结果见图9所示,图9(A)为不加磁场条件下的细胞摄取荧光图,图9(B)为加磁场条件下的细胞摄取荧光图。观察图9(A)可知,在孵育8h后,细胞内部出现弥散状绿色荧光,该纳米组装体将标记有FITC的BSA递送进入细胞,且蛋白成功从溶酶体中逃逸出来,证明该纳米组装体的胞内蛋白递送效果良好。而图9(B)则证明加磁场组的荧光强于不加磁场组,说明该纳米组装体具有一定的磁靶向性,磁场有助于细胞增加摄取。
实施例11
制备装载葡萄糖氧化酶的胞内响应纳米组装体
采用实施例7的方法,称取8mg葡萄糖氧化酶(GOx)与0.6mg表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)溶于100μL水中,室温下共孵育3小时。随后,与4mg实施例4制备的IONP混合,涡旋10分钟后静置2小时,得到纳米颗粒(IONP/GOx-EGCG)。取12mg纳米颗粒(IONP/GOx-EGCG)加入4mg聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺(PEI-PEG),室温涡旋后静置,离心(8000rpm,3min),弃去上清,1mL去离子水清洗两次,沉淀溶于水中,得到胞内响应的装载PEI-PEG@IGE的纳米组装体。
实施例12
细胞毒性试验
1×104个HepG2细胞接种于96孔板中,在37℃,5%二氧化碳条件下培养过夜。当细胞生长至80%时加入不同组别(IONP、BSA、PEI-PEG@IBE、PEI-PEG@IGE)的纳米颗粒,每个组别中相同浓度下含有等量的蛋白或IONP,每个浓度三个复孔,以空白培养基作为对照。培养24h后移除含有纳米颗粒的培养基,将预配制好的MTT溶液(1mg/ml)加入到各孔中,每孔100μl继续在37℃,5%二氧化碳条件下孵育4h;小心除去MTT溶液,每孔加100μl二甲基亚砜(DMSO),充分震荡3分钟,用酶标仪检测各孔在491nm处的吸光度OD值,将三个复孔的平均OD值作为目标样品的OD值,计算细胞存活率:细胞存活率=样品OD/空白对照组OD×100%
结果见图10所示,孵育不同浓度的四氧化三铁纳米颗粒(IONP)、牛血清白蛋白(BSA)、负载牛血清白蛋白的纳米组装体(PEI-PEG@IBE)的细胞存活率为100%左右,即这三种纳米颗粒对细胞均没有毒性,证明了该纳米载体的生物安全性;而采用递送葡萄糖氧化酶的胞内响应纳米组装体(PEI-PEG@IGE)时,在蛋白含量为4μg/ml时,细胞存活率约为70%,高于8μg/ml时,细胞存活率仅为20%左右,证实了该纳米组装体对肿瘤细胞的生长增殖有抑制作用。同时证明该纳米组装体并不会影响递送蛋白的生物活性,且具有一定的肿瘤治疗应用前景。
实施例13
实施例13与实施例3制备方法相同,不同之处在于:盐酸多巴胺与化合物2的摩尔比为1:0.2,化合物2与甲基硼酸的摩尔比为1:3。
实施例14
实施例14与实施例3制备方法相同,不同之处在于:盐酸多巴胺与化合物2的摩尔比为1:1,化合物2与甲基硼酸的摩尔比为1:7。
实施例15
实施例15与实施例4制备方法相同,不同之处在于:牛血清白蛋白质与苯硼酸修饰的四氧化三铁纳米颗粒的质量比为1:1。
实施例16
实施例16与实施例4制备方法相同,不同之处在于:牛血清白蛋白质与苯硼酸修饰的四氧化三铁纳米颗粒的质量比为1:2。
实施例17
实施例17与实施例7制备方法相同,不同之处在于:牛血清白蛋白质与表没食子儿茶素没食子酸酯的摩尔比为1:50,蛋白质与苯硼酸修饰的四氧化三铁纳米颗粒的质量比为1:1.5。
实施例18
实施例18与实施例7制备方法相同,不同之处在于:牛血清白蛋白质与表没食子儿茶素没食子酸酯的摩尔比为1:100,蛋白质与苯硼酸修饰的四氧化三铁纳米颗粒的质量比为1:2。
Claims (10)
1.一种基于四氧化三铁的磁靶向蛋白递送纳米组装体的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)四氧化三铁纳米颗粒的合成:将乙酰丙酮铁与油胺、油酸混合,加热并通入惰性气体,加入极性溶剂离心,得到四氧化三铁纳米颗粒。
(2)合成含苯硼酸基团的响应性小分子:将含有苯硼酸基团的化合物和频哪醇溶于四氢呋喃,加入醋酸溶液,在室温下搅拌反应,旋蒸提纯后得化合物1,将化合物1、盐酸多巴胺、2-乙氧基-1-乙氧碳酰基-1,2-二氢喹啉(EEDQ)溶于甲醇溶液中,在惰性气体保护下搅拌过夜,旋蒸除去溶剂,得到化合物2,即为含苯硼酸基团的响应性小分子;
(3)苯硼酸修饰的四氧化三铁纳米颗粒:将盐酸多巴胺和步骤(2)制备的化合物2溶于四氢呋喃中,升温,冷凝回流,加入步骤(1)制备的四氧化三铁纳米颗粒,离心,加入去离子水,随后加入甲基硼酸,离心,得到苯硼酸修饰的四氧化三铁纳米颗粒(IONP);
(4)胞外响应纳米组装体的制备:将步骤(3)制备的苯硼酸修饰的四氧化三铁纳米颗粒与蛋白质混合,静置后离心,获得胞外响应性纳米组装体;
(5)胞内响应纳米组装体的制备:将蛋白质与天然多酚共孵育,随后与步骤(3)制备的苯硼酸修饰的四氧化三铁纳米颗粒混合,静置,得到纳米颗粒,后加入聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺混合,静置后离心,获得胞内响应的纳米组装体。
2.根据权利要求1所述的纳米组装体的制备方法,其特征在于,所述步骤(1)中制备的四氧化三铁纳米颗粒粒径为8~10nm。
3.根据权利要求1所述的纳米组装体的制备方法,其特征在于,所述步骤(2)中含苯硼酸基团的化合物为4-羧基苯硼酸或4-羧基-3-氟苯硼酸。
4.根据权利要求1所述的纳米组装体的制备方法,其特征在于,所述步骤(3)中盐酸多巴胺与化合物2的摩尔比为1:0.2~2,化合物2与甲基硼酸的摩尔比为1:3~7。
5.根据权利要求1所述的纳米组装体的制备方法,其特征在于,所述步骤(4)中蛋白质与苯硼酸修饰的四氧化三铁纳米颗粒的质量比为1:0.5~2;所述蛋白质为牛血清白蛋白。
6.根据权利要求1所述的纳米组装体的制备方法,其特征在于,所述步骤(5)中天然多酚为表没食子儿茶素没食子酸酯,蛋白质与表没食子儿茶素没食子酸酯的摩尔比为1:10~100,蛋白质与苯硼酸修饰的四氧化三铁纳米颗粒的质量比为1:0.5~2,所述蛋白质为牛血清白蛋白或者葡萄糖氧化酶。
7.一种利用权利要求1所述的基于四氧化三铁的磁靶向蛋白递送纳米组装体的制备方法制备的纳米组装体在胞内或胞外蛋白递送中的应用。
8.根据权利要求7所述的纳米组装体的应用,其特征在于,所述纳米组装体在胞内或胞外蛋白递送中的蛋白质为磁靶向性递送功能蛋白质。
9.根据权利要求7所述的纳米组装体的应用,其特征在于,所述纳米组装体通过在胞外或胞内响应性释放所负载的蛋白质。
10.一种利用权利要求1所述的基于四氧化三铁的磁靶向蛋白递送纳米组装体的制备方法制备的纳米组装体在制备肿瘤治疗药物中的应用。
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