WO2007034586A1 - 光触媒性二酸化チタン微粒子、その分散液、およびその製造方法 - Google Patents

光触媒性二酸化チタン微粒子、その分散液、およびその製造方法 Download PDF

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fine particles
titanium dioxide
titanium
diacid
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Koki Kanehira
Shuji Sonezaki
Yumi Ogami
Toshiaki Banzai
Junji Kameshima
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Toto Ltd.
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Definitions

  • Photocatalytic titanium dioxide fine particles, dispersions thereof, and methods for producing the same are Photocatalytic titanium dioxide fine particles, dispersions thereof, and methods for producing the same
  • the present invention relates to photocatalytic diacid titanic fine particles whose surface is modified by a cationic hydrophilic polymer, a dispersion thereof, and a production method thereof.
  • the present invention also provides photocatalytic titanium dioxide composite fine particles that fix biomolecules such as antibodies capable of recognizing molecules against cancer cells, endocrine disrupting substances, etc., and exhibit their decomposing action by irradiation with ultraviolet rays. It also relates to a dispersion containing it and a method for its production.
  • Titanium dioxide is known to have strong photoactive resolution, is extremely chemically stable in the air and in solution, and is safe without toxicity in light-shielded animals. Therefore, application of titanium dioxide to the medical field is being studied.
  • JP-A-2002-31 6946, JP-A-2002-316950, and R. Cai et al .: Cancer Research, 52, 2346-2348 (1992) proposed cancer treatment using titanium dioxide. ing. In this method, metal particles such as gold carrying titanium dioxide and the like are shot into the target cancer cells, and then irradiated with light such as ultraviolet rays to kill the cancer cells.
  • titanium dioxide is useful for establishing therapeutic methods using site-specific control mechanisms because it can control the ON / OFF state of chemical reaction switches and the intensity of reaction regions and reactions. It is considered.
  • the isoelectric point of titanium dioxide is said to be around pH 6. Therefore, titanium dioxide particles are agglomerated in an aqueous solvent near neutrality, and this is uniformly dispersed. It was extremely difficult to do. Therefore, various attempts have been made so far to uniformly disperse the titanium dioxide particles in the aqueous dispersion medium. For example, Barbe Christophe et al: Journal of the American Ceramics Society, 80, 3157-3171 (1997) and Vorkapic Danijela et al: Journal of the American Ceramics Society, 81, 2815-2820 (1998).
  • a nitrate-acid-dioxide-titanium sol is produced by forming a precipitate of titanium oxide, which is peptized at a high temperature in the presence of acid. It has been proposed.
  • Japanese Patent Laid-Open No. 10-67516 discloses that ammonia water is dropped into a tetrasalt-titanium aqueous solution to form a hydroxide-titanium precipitate, and then hydrogen peroxide-hydrogen water is added.
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 1-319577 discloses a method of obtaining a dispersion of composite titanium dioxide fine particles dispersed and stabilized under alkaline conditions by coating the surface of titanium dioxide particles with porous silica.
  • Japanese Patent Laid-Open No. 02-212315 proposes a method for obtaining an aqueous solution of titanium dioxide with improved dispersibility by containing a polycarboxylic acid or a salt thereof as a dispersant.
  • the diacid titanium particles are aggregated under physiological conditions near neutrality, causing some damage to the living body and creating an unfavorable situation. It is difficult to apply titanium particles as a medical material in living bodies.
  • Cationic ribosomes are vesicles formed by phospholipids that are constituents of biological membranes that have positively charged functional groups such as quaternary amines on the surface of the ribosome membrane. Since ribosomes are vesicles with excellent biocompatibility, various drugs can be encapsulated in the vesicles. In addition, by having a positive charge on the outer surface of the liposome, the interaction with negatively charged cells can be enhanced, and the drug can be taken into the cells.
  • Ribosomes are morphologically classified into small single-walled ribosomes, large single-walled ribosomes, and multilamellar ribosomes.
  • Yoshida J et al .: Jpn J Cancer Res., 87, 1179-1183 (1996) describes a magneta that is about 10 nm fine particles of iron oxide FeO inside the cationic ribosome of this composition.
  • MCL magnetite cationic ribosome
  • the inventors of the present invention have recently performed neutral physiological physiology in vivo by surface-modifying a cationic hydrophilic high molecule by chemically binding to the surface of the photocatalytic di-titanium dioxide fine particles. It was found that the dispersibility in aqueous solvents in a wide range of pH as well as under specific conditions, as well as the affinity and uptake of cells, were significantly improved, making them extremely useful for medical applications such as cancer cell destruction.
  • the present invention is dispersible in an aqueous solvent in a wide range of P H area not neutral physiological conditions only in vivo, as well as excellent in affinity and uptake properties to cells, cancer cells
  • the object is to provide photocatalytic titanium dioxide fine particles and a method for producing the same that are extremely useful for medical applications such as destruction.
  • the photocatalytic titanium dioxide fine particles according to the present invention are:
  • Fine particles of photocatalytic titanium dioxide Fine particles of photocatalytic titanium dioxide
  • a cationic hydrophilic polymer modified on the surface of the photocatalytic titanium dioxide fine particles and
  • hydrophilic polymer is combined with the photocatalytic titanium dioxide.
  • the method for producing the photocatalytic titanium dioxide fine particles according to the present invention comprises:
  • a third step of mixing these dispersions A fourth step of heating the mixture;
  • FIG. 1 is a schematic view showing the photocatalytic titanium dioxide fine particles of the present invention.
  • FIG. 2 is a schematic view showing a dispersion containing the photocatalytic dioxide-titanium composite fine particles of the present invention.
  • FIG. 3 is a graph showing the results of measuring the photocatalytic activity (displayed as a decrease in absorbance associated with the decomposition of methylene blue) of the photocatalytic titanium dioxide fine particles of the present invention.
  • ⁇ and ⁇ represent polyethyleneimine-bonded diacid ⁇ titanium fine particles (anatase type) prepared in Example A1, ⁇ represents no ultraviolet irradiation, and ⁇ represents ultraviolet irradiation.
  • FIG. 4 is a graph showing the results of measuring the average dispersed particle size at each pH of the photocatalytic diacid titanium fine particles of the present invention.
  • FIG. 5 is a graph showing the results of measuring the average dispersed particle size at each salt concentration of the photocatalytic diacid titanium fine particles of the present invention.
  • FIG. 6 is a photographic diagram showing the results of confirming the uniformity (transparency) of the photocatalytic titanium dioxide fine particles of the present invention.
  • FIG. 7 is a graph showing the results of measuring the cytotoxicity at various concentrations of the photocatalytic titanium dioxide fine particles of the present invention.
  • FIG. 8 is a photographic diagram showing the results of confirming the cell uptake of the photocatalytic diacid titanium fine particles of the present invention.
  • FIG. 9 is a graph showing the result of aggregation (displayed as an increase in absorbance) of photocatalytic diacid-titanium composite fine particles to which streptavidin of the present invention is immobilized by a peotine dimer.
  • FIG. 10 is a photographic diagram showing the results of confirming the uniformity (transparency) of a dispersion containing the photocatalytic dioxide-titanium composite fine particles of the present invention.
  • Photocatalytic titanium dioxide fine particles comprise photocatalytic titanium dioxide fine particles and a cationic hydrophilic polymer modified on the surface of the photocatalytic titanium dioxide fine particles.
  • a hydrophilic polymer is combined with photocatalytic titanium dioxide.
  • FIG. 1 schematically shows an example of the photocatalytic diacid titanium fine particles of the present invention.
  • the photocatalytic diacid titanium fine particles of the present invention have a cationic hydrophilic polymer 12 on the surface of the photocatalytic diacid titanium fine particles 11.
  • the cationic polymer and titanium dioxide are bonded together, so that only the photocatalytic diacid titanium fine particles can be dispersed stably in an aqueous solution without adding other substances such as a dispersant. .
  • the photocatalytic diacid-titanium fine particles of the present invention have a positive charge near neutrality because a cationic hydrophilic polymer is bound to the surface thereof. For this reason, an electric repulsive force acts between the particles, so that it exhibits extremely good dispersibility without agglomeration even in an aqueous solvent in a wide pH range as well as near neutrality.
  • the dispersion of the photocatalytic titanium dioxide fine particles of the present invention can use various pH buffer solutions containing water or salt as a solvent due to the above characteristics, and can be used for other substances such as a dispersant under physiological conditions. Without addition, the dispersion is extremely good and a stable dispersion can be maintained over 24 hours.
  • the photocatalytic dioxide-titanium fine particles have a positive charge, they have the ability to capture a negatively charged substance and strongly decompose the target substance by ultraviolet irradiation.
  • the photocatalytic titanium dioxide particles have extremely high affinity for cells and good uptake. This can be used for medical purposes such as destruction of cancer cells.
  • the hydrophilic polymer is preferably a hydrophilic polymer amine. Since amine and titanium dioxide are strongly bonded, the photocatalytic titanium dioxide fine particles can be more stably dispersed in the aqueous solution. In addition, since the isoelectric point of ammine contained in the hydrophilic polymer is reflected in the isoelectric point of titanium dioxide fine particles, and an electric repulsive force acts between the particles even in a neutral aqueous solvent, it has good dispersibility. Indicates.
  • an anatase type or a rutile type crystal system can be used as the titanium dioxide dioxide used as the material of the photocatalytic titanium dioxide fine particles.
  • This is a chemical reaction in which hydroxyl groups are formed by hydration even if the crystal systems are different. This is because if the properties are the same, a cationic hydrophilic polymer can be bound, so that surface modification is possible.
  • An anatase type can be suitably selected if a strong photocatalytic activity is desired, or a rutile type can be suitably selected if a property such as a high refractive index is desired as in cosmetics.
  • composite titanium dioxide particles comprising titanium dioxide and a magnetic material, which are composed of only a single titanium dioxide particle, are also preferably used.
  • these dispersed particle sizes are desirably 2 to 200 nm. This is because when the particle size is larger than 2 OOnm, the effect of gravity acting on the fine particles is increased, so that the particles are more likely to settle.
  • the photocatalytic diacid titanium fine particles preferably have a dispersive power of 2 to 500 nm.
  • the dispersed particle size is 50 to 200 nm in terms of the accumulation effect on tumor cells. By setting this range, stable dispersion can be achieved over 24 hours under physiological conditions.
  • the dispersed particle size here is measured by the dynamic light scattering method and is used as a cumulant.
  • the legal analysis power is also an average value calculated.
  • the physiological conditions here are 25 ° C and 1 atm (137 mM NaCl, 8. ImM Na HPO, 2. 68
  • the hydrophilic polymer is preferably a water-soluble polymer.
  • a water-soluble polymer can be used as long as it is capable of firmly binding to titanium dioxide and has a weight average molecular weight in the range of 1000 to 100000.
  • polyamino acids, polypeptides, Examples include polyamines and copolymers having a plurality of amine units in the molecule.
  • polyamines such as polyethyleneimine, polybulamine, and polyallylamine are more preferably used. More specifically, basic polyamino acids such as polyorthotin and polylysine can be used. In this case, either one or both of amine carboxyl groups in the polymer is strongly bonded to titanium dioxide. By bonding, desired photocatalytic titanium dioxide fine particles can be obtained.
  • the surface potential of the photocatalytic titanium dioxide fine particles is +20 mV or more. Is generally +40 mV or more, which is a potential at which self-dispersion (state in which particles do not settle) can be sufficiently achieved.
  • a dispersion of photocatalytic titanium dioxide fine particles comprising photocatalytic titanium dioxide fine particles and an aqueous solvent in which the photocatalytic titanium dioxide fine particles are dispersed.
  • the positive charge preferably positive charge due to amin
  • the positive charge present on the surface of the photocatalytic titanium dioxide particles is stable over a long period of time without agglomeration due to the electric repulsion between the particles. By doing. In principle, it is extremely stable against pH fluctuations and inorganic salt additives.
  • the isoelectric point of the photocatalytic titanium dioxide fine particle reflects the isoelectric point of the hydrophilic polymer amine, and the pH of the aqueous dispersion medium is 9 or less.
  • the pH of the aqueous dispersion medium is 9 or less.
  • this dispersion can use a pH buffer as the aqueous solvent.
  • the photocatalytic titanium dioxide fine particles of the present invention exhibit good dispersibility even if the buffer component is contained in the aqueous dispersion medium as long as the pH is in the range of 3 to 9. .
  • the buffer include glycine buffer, acetate buffer, phosphate buffer (including PBS), carbonate buffer, pinequil bain buffer, Good's buffer, and borate buffer. Can be mentioned.
  • the ability to use near-neutral buffers is extremely advantageous for applications in the biotechnology and pharmaceutical fields.
  • the amino group Z diacid / titanium content ratio (mol / g) of the surface-modified titanium dioxide / titanium fine particles in the dispersion varies depending on the reaction conditions. generally 1. is preferably at 5 X 10- 2 or more.
  • the salt concentration of the aqueous solvent is preferably 1M or less.
  • a dispersion having such a concentration can be stabilized for at least 24 hours without agglomeration due to electrical repulsion between the photocatalytic titanium dioxide fine particles.
  • a more preferable salt concentration is about 100 mM to 300 mM. In this range, the living body It can be stably dispersed and exist even under neutral physiological conditions.
  • the dispersion of the photocatalytic diacid titanium fine particles preferably contains 20% by mass or less of the photocatalytic diacid titanium fine particles.
  • a dispersion having such a concentration can be stabilized for at least 24 hours without agglomeration due to electrical repulsion between the photocatalytic diacid-titanium fine particles.
  • a more preferred concentration of titanium dioxide fine particles is 0.0001-0. 1% by mass. Within this range, it is excellent in cell safety when considering application to a living body.
  • the dispersion containing the photocatalytic titanium dioxide fine particles of the present invention can be provided as a uniform and stable dispersion using water, various pH buffer solutions, infusion solutions, or physiological saline. It becomes.
  • ointments and sprays containing this dispersion can also be produced.
  • the ointment or spray containing the dispersion containing the photocatalytic dioxide-titanium fine particles of the present invention can be applied directly to the affected area such as the skin and treated with sunlight or an ultraviolet lamp.
  • the light source device for exciting and activating the photocatalytic titanium dioxide fine particles of the present invention need not be special, but the wavelength is 400 ⁇ m because of the band gap of titanium dioxide.
  • the following is desirable.
  • the affected part in the body may be irradiated with ultraviolet rays by attaching an ultraviolet fiber to the endoscope.
  • it contains the titanium dioxide-dioxide composite fine particles of the present invention as its action enhancer. It is also possible to apply a dispersion.
  • the photocatalytic diacid-titanium fine particles of the present invention have a positive surface charge due to the amine present on the surface, and therefore generally have an affinity for cells having a negative surface charge.
  • the photocatalytic titanium dioxide fine particles of the present invention which have a significantly high uptake, come into contact with cells, binding and uptake into the cells begins. From this, application to the skin surface of the living body or the surface layer part of the living body such as the trachea and digestive organs and various affected parts existing in the living body is very effective.
  • An ointment or spray containing a dispersion containing photocatalytic titanium dioxide particles was directly applied to skin cancer, laryngeal cancer, and other cancerous areas.
  • treatment can be performed with sunlight, an ultraviolet lamp or a light source used for medical purposes.
  • light irradiation at that time can be performed easily and with a high therapeutic effect using an endoscope.
  • the dispersion is a photocatalytic diacid-titanium composite fine particle in which a biomolecule is immobilized on an amine of the hydrophilic polymer.
  • a dispersion is preferred. That is, the dispersion according to this aspect has a hydrophilic polymer amine on the surface of titanium dioxide and the hydrophilic polymer amine and titanium dioxide are strongly bonded to each other.
  • the biomolecule can be immobilized on the molecular amine, and furthermore, it is a dispersion having extremely good dispersibility without adding other substances such as a dispersant.
  • the photocatalytic diacid-titanium composite fine particles obtained by modifying the surface of titanium diacid titanium with a hydrophilic polymer and then immobilizing biomolecules can achieve both selective adsorption ability and photocatalytic ability. Therefore, according to this embodiment, the selective adsorption ability can be stably dispersed and exist even under neutral physiological conditions in the living body.
  • the photocatalytic titanium dioxide fine particles are fine particles in which photocatalytic titanium dioxide is present on at least a part of the surface.
  • the photocatalytic titanium dioxide is preferably an anatase type having excellent photocatalytic activity.
  • the aqueous solvent is preferably an aqueous solution that is allowed to be introduced into a living body.
  • FIG. 2 schematically shows a dispersion of photocatalytic diacid-titanium composite fine particles on which the biomolecules of this embodiment are immobilized.
  • the dispersion containing the photocatalytic titanium dioxide composite fine particles of the present invention comprises anatase type titanium dioxide 21 and a hydrophilic polymer amine 22 that binds to biomolecules dispersed in an aprotic polar solvent, and is 90-180 °. After reacting with C for 1 to 12 hours to form a bond between the hydrophilic polymer and titanium dioxide, it is dispersed in an aqueous solution and the biomolecule 23 is immobilized on the hydrophilic polymer amine. It has been made.
  • the photocatalytic dioxide-titanium composite fine particles of the present invention alone can be stably dispersed in an aqueous solution without the addition of other substances such as a dispersant.
  • a dispersant for the immobilization of biomolecules, free amines are used in connection with the binding of titanium dioxide and titanium dioxide on the surface of the photocatalytic titanium dioxide composite fine particles.
  • the biomolecule side has an amino group, a carboxyl group, a thiol group, an aldehyde group derived from a sugar chain, etc., it is possible to covalently bond them together by using an appropriate crosslinking agent.
  • biomolecules that can be used in the present invention can be considered, and protein is most expected to be used.
  • immobilization can be suitably performed from antibodies, receptors to low molecular peptides as proteins.
  • the chemical composition of the protein, as well as the immobilization of the photocatalytic diacid-titanium composite fine particles, the amino group, the force lpoxyl group, the thiol group, and the aldehyde group in the case of glycoproteins are immobilized. It is possible to make it a target functional group. Furthermore, it is possible to fix the two using the interaction between piotin and avidin.
  • biomolecules include amino acids, peptides, simple proteins (eg, lectins), and complex proteins; nucleosides, nucleotides, and nucleic acids; monosaccharides, sugar chains, polysaccharides, and complex carbohydrates; simple Lipids, complex lipids, and ribosomes; and combinations thereof.
  • the binding between the photocatalytic titanium dioxide composite fine particle and the biomolecule is achieved by using a bifunctional linker reagent.
  • a bifunctional linker reagent with a homo-functional group it is possible to easily introduce a covalent bond between the amine on the surface of the photocatalytic diacid-titanium composite fine particle and the amino group derived from the biomolecule. is there.
  • a compound having a heterofunctional group is used, a biomolecule having a thiol group or a carboxy group on the biomolecule side can be introduced.
  • a homolinker reagent between amino groups b having N-hydroxysuccinimide ester
  • glutarate Bis (Sulfosuccmimidyl) sub eratate, and the like and imide ester, specifically, dimethyl adpimidate, dimethyl suberimidate, etc., which can be preferably used.
  • the combination of the hetero functional group is the above-mentioned N-hydroxysuccinimide ester, imide ester force against the amine on the surface of the photocatalytic titanium dioxide composite fine particles.
  • the thiol group on the material side one having a maleimide group, specifically, ⁇ - ( ⁇ -Malei midocaproyloxy) succinimide ester or the like can be used.
  • the same procedure can be performed by synthesizing modified DNA using an amination primer, thiolation primer, or piotinization primer during DNA amplification by polymerase chain reaction (PCR). It is possible to fix to photocatalytic titanium dioxide composite particles by the method.
  • PCR polymerase chain reaction
  • aminated DNA is used for immobilization
  • a bifunctional homolinker is used between the photocatalytic diacid-titanium composite fine particles and the amine
  • the immobilization can be achieved simply by mixing the two. It can be carried out.
  • thiol DNA it is possible to bond between amine and thiol by using the aforementioned -functional heterolinker.
  • biotinic DNA it is necessary to introduce streptavidin into the photocatalytic titanium dioxide composite fine particles. In this case, it can be easily introduced by using the above-mentioned bifunctional homolinker for the amino group. Is possible.
  • cis-diol is acidified to aldehyde with periodic acid, etc., and photocatalytic titanium dioxide composite fine particle amine and sodium cyanoborohydride It can be fixed by forming a Schiff base in the presence, but can also be crosslinked using a bifunctional linker.
  • a biomolecule side When a biomolecule side has a carboxyl group such as a protein or a part of a carbohydrate, it is activated with 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carpositimide (EDC) to produce a photocatalytic compound.
  • EDC 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carpositimide
  • Crosslinking between the two is possible by mixing with the acid-titanium composite fine particles.
  • the photocatalytic titanium dioxide composite fine particles in the dispersion containing the photocatalytic titanium dioxide composite fine particles of the present invention are generally negatively charged because the surface charge is positively charged by the amine present on the surface.
  • the affinity to and uptake of cells having the surface charge of the present invention is remarkably high, and as soon as the photocatalytic titanium dioxide composite microparticles of the present invention come into contact with the cells, binding and uptake into the cells starts. For this reason, it is particularly effective for application to the skin surface of the living body, the surface layer of the trachea, digestive organs, etc. or inside the living body, and various affected parts existing in the living body. This enables localization within cancer cells.
  • the photocatalytic diacid salt of the present invention Ointments and sprays containing titanium fine particle dispersions are applied directly to cancerous areas such as skin cancer and laryngeal cancer, or applied locally to solid cancers by injection, then used in sunlight, ultraviolet lamps and medical applications Treatment can be performed with a light source or the like.
  • light irradiation at that time can be easily performed with an endoscope, and a high therapeutic effect can be obtained.
  • biomolecules such as proteins, antibodies, and DNA having molecular recognition ability for cancer cells, endocrine disrupting substances, etc. are highly soluble in water.
  • photocatalytic action such as ultraviolet irradiation.
  • the photocatalytic dioxide-titanium composite fine particles in the dispersion containing the photocatalytic titanium dioxide composite fine particles of the present invention specifically recognizes and captures the target substance in water or an aqueous solution, and the target substance is irradiated by ultraviolet irradiation or the like. Has the ability to break down strongly. In particular, the ability to be used in an aqueous system, the ability to accurately capture a target substance, and a strong photocatalytic ability are extremely useful for medical applications such as decomposition treatment of aqueous endocrine disrupting substances and destruction of cancer cells.
  • the photocatalytic diacid-titanium fine particles of the present invention are used in the reaction of binding a hydrophilic polymer to the surface of the photocatalytic nitric acid-titanium fine particles (1) ⁇ A step of dispersing the titanium sol in a solvent; (2) a step of dispersing a cationic hydrophilic polymer in the solvent; (3) a step of mixing these dispersions; and (4) heating the mixture. And (5) a step of separating the photocatalytic titanium dioxide fine particles and the unbound hydrophilic polymer, and (6) a step of purifying the photocatalytic titanium dioxide fine particles.
  • the diacid titanium sol used in the present invention it is possible to synthesize titanium tetraisopropoxide or the like as a raw material, or to use an existing acidic diacid titanium sol peptized with an inorganic acid.
  • the solvent used in the steps (1) and (2) is preferably a solvent that can dissolve both the titanium dioxide sol and the hydrophilic polymer. This is because when titanium dioxide aggregates in a solvent, the surface area where a binding reaction with a hydrophilic polymer can occur is reduced. This is a force that increases the dispersed particle size with respect to the aqueous solvent after the completion and deteriorates the dispersibility.
  • a solvent having reactivity with the surface of titanium dioxide particles is not suitable as the solvent used here.
  • alcohols containing a hydroxyl group form an ether bond with the surface of the titanium dioxide particles when heated, thereby inhibiting the binding reaction with the target hydrophilic polymer.
  • the surface properties of the titanium dioxide particles depend on the properties of the alcohol used, and the dispersibility of the aqueous dispersion medium is significantly reduced.
  • the solvent used in the present invention is preferably an aprotic polar solvent from the viewpoint of the above-mentioned reactivity.
  • dimethylformamide, dioxane, or dimethyl sulfoxide can be used as a solvent, and further volatile. In view of the above, it is more preferable to use dimethylformamide as a solvent.
  • the mixed solution is heated to carry out a binding reaction.
  • the reaction proceeds without pressure.
  • the reaction is further promoted when pressure is applied, it is desirable to proceed the reaction under pressure.
  • the heating temperature is 80 to 220 ° C.
  • the heating temperature is lower than 80 ° C, the binding amount of the hydrophilic polymer is lowered and the dispersibility in an aqueous solvent is lowered.
  • the heating temperature exceeds 220 ° C, it is unsuitable due to the problem of sealing of the reaction vessel.
  • the reaction is allowed to proceed at a temperature above the boiling point of water, the titanium dioxide agglomerates when the water contained in the titanium dioxide sol is completely volatilized out of the reaction system. Is preferable.
  • the water content in the reaction solution is too high, the reaction will be hindered. Therefore, the water content in the reaction solution varies depending on the reaction conditions, but it is generally preferable to be 4% or less.
  • the photocatalytic titanium dioxide fine particles after production and the unbound hydrophilic polymer are separated.
  • a dialysis method, an ultrafiltration method, a gel filtration chromatography method, a precipitation method, or the like can be suitably used, but in the case of separation by a dialysis method or an ultrafiltration method, the hydrophilic polymer used is separated. It is necessary to use a dialysis membrane or ultrafiltration membrane that matches the molecular weight. That is, it can be separated by any of the above methods, but it is desirable to use an organic solvent precipitation method using an organic solvent because of the ease of operation.
  • the photocatalytic titanium dioxide fine particles as a precipitate are suspended in an aqueous solvent having a pH of 3 to 9, more preferably 5 to 8.
  • an aqueous solvent having a pH of 3 to 9, more preferably 5 to 8.
  • water can be suitably used a desired P H buffer solution.
  • this suspension is stirred or subjected to ultrasonic irradiation to uniformly disperse the surface-modified titanium dioxide fine particles, and after desalting and drying, a dry powder of the photocatalytic titanium dioxide fine particles can be obtained.
  • the production of a powder that is easy to handle and stable is extremely advantageous when the photocatalytic titanium dioxide fine particles are applied to various applications.
  • This dispersion was placed in a 100 ml vial and sonicated at 200 Hz for 30 minutes.
  • the average dispersed particle diameter before and after the ultrasonic treatment was 36.4 nm and 20.2 nm, respectively.
  • the solution was concentrated to prepare a titanium dioxide sol having a solid content of 20%. 0.75 ml of the obtained titanium dioxide sol was dispersed in 20 ml of dimethylformamide (DMF), and DMFlOml in which 450 mg of polyethyleneimine (average molecular weight: 10,000, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was dissolved was added and stirred to mix.
  • DMF dimethylformamide
  • the solution was transferred to a hydrothermal reactor (HU-50, Sanai Kagaku) and synthesized at 150 ° C for 6 hours. After completion of the reaction, the reaction vessel was cooled to 50 ° C or lower, and twice the amount of isopropanol (Wako Pure Chemical Industries) was added to the reaction solution. After standing at room temperature for 30 minutes, the precipitate was collected by centrifugation. The collected precipitate was washed with 70% ethanol, and 2.5 ml of water was added to obtain a dispersion of polyethyleneimine-bound titanium dioxide fine particles (anatase type).
  • the dispersion particle size of the prepared polyethyleneimine-bonded diacid-titanium fine particles was dispersed in a zeta potential measurement cell. 75 ml was charged, and various parameters of the solvent were set to the same values as in water.Measured by dynamic light scattering at 25 ° C, the average particle size of the polyethyleneimine-bonded titanium dioxide fine particles produced was 65. It was 6 nm.
  • the zeta potential was measured using the zeta sizer 1 nano ZS under the same conditions, the zeta potential of the produced polyethyleneimine-bonded titanium dioxide fine particles was +35.7 mV.
  • Polyethyleneimine-bonded titanium dioxide fine particles were synthesized in the same manner as in Example A1, except that polyethyleneimine having an average molecular weight of 7500 was used. Even when polyethylenimine with an average molecular weight of 7500 is used, polyethyleneimine-bonded titanium dioxide fine particles (ana The dispersion of the tase type was preferable because it showed good dispersibility.
  • Polyethyleneimine-bonded titanium dioxide fine particles were synthesized in the same manner as in Example A1, except that an alkaline titanium dioxide sol (Tynock AL-6, manufactured by Taki Chemical Co., Ltd.) was used instead of the acidic titanium dioxide sol. Even when an alkaline diacid-titanium sol was used, any dispersion of polyethyleneimine-bonded diacid-titanium fine particles (anatase type) showed good dispersibility and was suitable.
  • the reaction vessel was cooled to 50 ° C or lower, and twice the amount of isopropanol (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added to the reaction solution. After standing at room temperature for 30 minutes, the precipitate was collected by centrifugation. The recovered precipitate was washed with 70% ethanol, and 2.5 ml of water was added to obtain a dispersion of polyethyleneimine-bound magnetic material Z titanium dioxide composite fine particles (anatase type). This dispersion was not suitable for white turbidity, and the fine particles were well dispersed, and was a suitable dispersion as in the case of a single titanium dioxide-titanium.
  • a solution (A) was prepared by dissolving 200 mg of polyethyleneimine in 10 ml of DMF.
  • a solution (B) was prepared by dispersing 0.25 ml of a 20% titanium dioxide sol obtained in the process of Example A 1 in 10 ml of DMF.
  • a solution (C) was prepared by mixing 0.25 ml of a 20% solid component titanium dioxide sol obtained in the process of Example A1 and 200 mg of polyethyleneimine dissolved in 10 ml of DMF.
  • a dispersion of polyethyleneimine-bound titanium dioxide fine particles obtained by reacting solution (C) at 150 ° C. for 6 hours was used as solution (D).
  • ⁇ ⁇ Stability in neutral solution of polyethyleneimine-bonded diacid-titanium microparticles in neutral solution using each solution of the same composition as ( ⁇ ) to (D) used in Example ⁇ 5 The stability of each was evaluated. That is, each solution (ii) to (D) was diluted 10-fold with 200 mM phosphate buffer (pH 7.0), stirred and allowed to stand, and the presence or absence of precipitation was observed. As a result, the solutions (B) and (C) containing the titanium dioxide sol did not cause precipitation in the solutions (A) and (D).
  • ⁇ IAZ Measurement of Titanium Diacid Titanium Content of Polyethyleneimine Bonded Titanium Dioxide Titanium Fine Particle Dispersion
  • a dispersion of polyethyleneimine-bonded titanium dioxide fine particles obtained from Al was dried by heating at 110 ° C. for 1 hour and further ignited for 4 hours to completely incinerate. This was cooled in a silica gel desiccator, and the mass was measured as the net amount of titanium dioxide in the dispersion. As a result, the dispersion was shown to contain 0.25% (wZv) titanium dioxide.
  • Example A8 Determination of amino group content of polyethyleneimine-bonded diacid-titanium fine particle dispersion
  • the amino group of polyethyleneimine-bonded diacid-titanium fine particles obtained in Example A1 was converted to fluorescamine (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) Confirmation and quantification were carried out by reaction with the product. Since fluorescamine reacts with amino groups to produce fluorescent substances, confirmation and quantification can be carried out by measuring the fluorescence intensity of the product in the reaction of polyethyleneimine-linked diacid titanium fine particles with fluorescamine. it can.
  • a darcosamine solution prepared to a predetermined concentration with lOOmM borate buffer (pH 9.0) was prepared, and a calibration curve was created using the fluorescence intensity at an excitation wavelength of 395 nm and a fluorescence wavelength of 480 nm.
  • the amino group content on the polyethyleneimine-linked diacid titanium fine particles was determined.
  • the results showed that the dispersion contained amino groups at a concentration of 4.01 X 10 " 2 M. From the results of Example A7, the amount of amino groups Z titanium dioxide in the dispersion was 1. 63 It was X 10- 2 (mol / g) .
  • Example A9 Evaluation of photocatalytic activity of polyethyleneimine-linked diacid-titanium fine particles (anatase type)
  • the polyethyleneimine-bound diacid-titanium fine particles (anatase type) obtained in Example A1 were diluted with 50 mM phosphate buffer (pH 7.0) so that the solid content was 0.02%.
  • Methylene blue trihydrate manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • the aqueous solution was irradiated with ultraviolet light having a wavelength of 340 nm so as to have a wavelength of 1.5 mWZcm 2 , and absorption at a wavelength of 580 nm was measured with an ultraviolet-visible light spectrophotometer.
  • the results are shown in Figure 3.
  • Example A 1 Compared with a mixture that was not irradiated with ultraviolet light, the mixture that was irradiated with ultraviolet light showed a decrease in absorbance with the degradation of methylene blue over time, so the polyethyleneimine obtained in Example A 1 It is clear that the bound titanium dioxide fine particles (anatase type) retain photocatalytic activity.
  • Example A1 Thereafter, the average dispersed particle diameter was measured in the same manner as in Example A1 using a Zetasizer 1 nano ZS. The results are shown in Fig. 4. Although a change in particle size was observed between pH 3 and 10, it was about 70 to 85 nm, indicating stable dispersibility.
  • Example A1 Add the poly (ethyleneimine-bound) titanium dioxide fine particles obtained in Example A1 to a final concentration of 0.025% in a 10 mM phosphate buffer containing 0.05 to 5 mg of different sodium chloride, and leave it at room temperature for 1 hour. Left to stand. Thereafter, the average dispersed particle size was measured in the same manner as in Example A1 with a Zetasizer Nano ZS. The results are shown in FIG. When the salt concentration in the system was between 0.05 and 1M, almost no change in the average dispersed particle size was observed, and it became clear that stable dispersibility was exhibited.
  • Week A12 Evaluation of uniformity (transparency) of titanium dioxide fine particles
  • Example A1 Using a 10 mM phosphate buffer containing 1M sodium chloride sodium salt, the dispersion containing the polyethyleneimine-bound titanium dioxide fine particles obtained in Example A1 was adjusted to a final concentration of 0.1%, It was allowed to stand at room temperature for 1 hour.
  • P25 As a diacid-titanium fine particle was adjusted to a final concentration of 0.1% in the same manner using a 10 mM phosphate buffer containing 0.1 M sodium chloride. It was allowed to stand at room temperature for 1 hour. After that, 5ml was transferred to a petri dish and photographed from above. The result is shown in Fig. 6.
  • the dispersion containing the polyethyleneimine-bonded titanium dioxide fine particles in the P25 aqueous solution was clearly highly transparent and uniformly dispersed.
  • the P25 aqueous solution had an absorbance greatly exceeding 1 and could not be measured.
  • the dispersion containing the bound titanium dioxide fine particles had an absorbance of 0.044, and the formation of precipitates was strong.
  • the absorbance at a wavelength of 660 nm was measured in the same manner.
  • the absorbance of P25 aqueous solution was much higher than 1 and could not be measured.
  • the dispersion containing the polyethyleneimine-linked titanium dioxide fine particles had an absorbance of 0.051. From this, it was revealed that the dispersion of titanium dioxide-titanium composite fine particles in the aqueous solution has high transparency, uniform dispersibility, and is stable.
  • the dispersion containing the polyethyleneimine-bound titanium dioxide fine particles obtained in Example A1 was adjusted with RPMI1640 medium (GIBCO) containing 10% serum so that the solid content was 1.0%. Culturing the cultured cancer cells (Jurkat) in RPMI1640 medium (GIBCO) containing 10% serum at 37 ° C in a 5% diacid-carbon atmosphere to reach 5.0 X 10 4 cell count Zml Prepared. This was cultured again under the same conditions for 20 hours. In this cell culture solution, the dispersion containing the polyethyleneimine-bound titanium dioxide fine particles is adjusted to a final concentration of 0.1%, 0.01%, 0.001%, 0.0001% on a 96-well plate. 200 1 were used as test cell cultures.
  • This test cell culture was incubated at 37 ° C in a 5% carbon dioxide atmosphere for 20 hours, and then luminescence derived from living cells using the Celltiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (Promega3 ⁇ 4: 3 ⁇ 4) using 100 / zl each. After the reaction, cytotoxicity was evaluated by measuring the amount of luminescence using an image analyzer L AS-3000UVmini (Fuji Film). The results are shown in Fig. 7. Compared to the amount of luminescence in control cultured cells to which nothing was added, the same amount of luminescence was confirmed at any concentration of dispersion. It became clear that the dispersion was not cytotoxic.
  • Example A1 0.75 ml of the titanium dioxide sol obtained in Example A1 was dispersed in 20 ml of dimethylformamide (DMF), 10 ml of DMF in which 0.2 g of polyacrylic acid (average molecular weight: 5000, manufactured by Wako Pure Chemical Industries) was dissolved was added, Stir and mix. The solution was transferred to a hydrothermal reactor and hydrothermal synthesis was performed at 180 ° C for 6 hours. After completion of the reaction, the reaction vessel was cooled to a temperature of 50 ° C or lower, and after taking out the solution, 80 ml of water was added and mixed with stirring.
  • DMF dimethylformamide
  • 80 ml of water 80 ml of water was added and mixed with stirring.
  • the mixture was filtered through a 0.45 m filter to obtain a dispersion of polyacrylic acid-bonded titanium dioxide fine particles having a weight percentage of 0.25%.
  • Zetasizer Nano ZS manufactured by Sysmetas
  • 0.75 ml of a dispersion of polyethyleneimine-bonded titanium dioxide fine particles was charged into a zeta potential measurement cell, and various parameters of the solvent were set to the same values as water.
  • the average particle size of the prepared polyacrylic acid-bonded titanium dioxide fine particles was 45.9 nm.
  • the melanoma cell line T-24 was cultured in Fl 2 medium containing 10% serum (Gibconnet) until it became 100% confluent, and the flask was lOOmM phosphate buffered saline (pH 7.4). The plate was washed twice with 10 ml of lOOmM trypsin-ethylenediamin triacetic acid solution, allowed to stand for 10 minutes, and the detached cells were collected from the flask wall and diluted with 9 ml of F12 medium containing 10% serum.
  • the number of cells was counted with a hemocytometer, and 500 1 medium containing 5 ⁇ 10 4 cells was inoculated into a 24-well microtiter plate and dispensed to a final concentration of 0.01%. Then, the dispersion of the fluorescent dye-labeled polyacrylic acid-bonded titanium dioxide fine particles and the dispersion of the fluorescent dye-labeled polyethyleneimine-bonded titanium dioxide fine particles are each adjusted to a final concentration of 100%. In addition, it was cultured in a CO incubator for 24 hours
  • the adhesion of the cells to the flask was confirmed, the flask was washed with lOO mM phosphate buffered saline, F12 medium containing 10% serum of 2001 was added, and observation was performed with a fluorescence microscope. As a result, the image shown in FIG. 8 was obtained. As a result of observing the fluorescence field image, the fluorescent dye-labeled polyethylene imine-bonded diacid titanium dioxide fine particles clearly have higher affinity and cell uptake than the fluorescent dye-labeled polyacrylic acid-bonded titanium dioxide particles. It was confirmed to have.
  • Example A1 the dispersion of the polyethyleneimine-bonded diacid-titanium fine particles obtained in Example A1 was adjusted with lOOmM phosphate buffered saline (pH 7.4) so that the final concentrations were 0% and 0.01%. 1
  • UV light with a wavelength of 340 nm was irradiated with black light (manufactured by Toshiba) at 2.5 mWZcm 2 for 0 and 60 minutes, and cultured in a CO incubator for 24 hours.
  • Tested Cell counting kit- 8 Doujin Chemical Co., Ltd.
  • the relative survival rate was shown with the absorbance derived from living cells at 1% concentration of polyethyleneimine-conjugated titanium dioxide fine particles at 0% for 0 minutes after UV irradiation after subtracting the background value. From this result, the relative survival rate was decreased only in the experimental condition of 60 minutes of UV irradiation in the presence of 0.01% of polyethyleneimine-linked diacid titanium dioxide fine particles. ⁇ It was confirmed that titanium fine particles have high cell killing properties.
  • This dispersion was placed in a 100 ml vial and sonicated at 20 OHz for 30 minutes.
  • the average dispersed particle diameter before and after the ultrasonic treatment was 36.4 nm and 20.2 nm, respectively.
  • the solution was concentrated to prepare a titanium dioxide sol having a solid content of 20%. 0.75 ml of the obtained titanium dioxide sol was dispersed in 20 ml of dimethylformamide (DMF), and DMFlOml in which 450 mg of polyethyleneimine (average molecular weight: 10,000, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was dissolved was added and mixed by stirring. .
  • DMF dimethylformamide
  • the solution was transferred to a hydrothermal reaction vessel (HU-50, Sanai Kagaku Co., Ltd.), and synthesis was performed at 150 ° C for 6 hours. After completion of the reaction, cool until the reaction vessel temperature reaches 50 ° C or lower, add twice the amount of isopropanol, precipitate polyethyleneimine-bound diacid-titanium fine particles, and remove the supernatant after centrifugation. Was used to separate unreacted polyethyleneimine. After washing with 70% ethanol, the ethanol was removed after centrifugation. After adding 10 ml of distilled water, ultrasonic treatment was performed at 200 Hz for 30 minutes to disperse the polyethyleneimine bonded titanium dioxide fine particles. It was.
  • the mixture was filtered through a 0.45 m filter to obtain a dispersion of polyethyleneimine-bound titanium dioxide fine particles having a solid content of 1.5%.
  • the dispersion particle size of the polyethylene imine-bonded titanium dioxide fine particles produced in the polyethylene imine-bonded titanium dioxide fine particles was dispersed in the zeta potential measurement cell. 75ml was charged, and various parameters of the solvent were set to the same value as water, and measured by dynamic light scattering method at 25 ° C, the average particle size of polyethyleneimine-bonded diacid-titanium fine particles was 67.7 nm Met.
  • biotin dimers (EZ) with different concentrations diluted from ImM to ⁇ in 10-fold increments.
  • -Link PEO-Biotin Dimer (Pierce Co., Ltd.) is added to 0.01 ml and allowed to stand at 37 ° C for 10 minutes, and the absorbance at 595 nm is transferred to a microtiter plate reader (Bench Mark, BioRad Co., Ltd.). Measured. The results are shown in FIG. Apparently, the turbidity of the solution increased according to the concentration of piotin dimer, and it was found that streptavidin was efficiently immobilized on the photocatalytic diacid-titanium composite fine particles.
  • Example B1 The dispersion of polyethyleneimine-bonded titanium dioxide fine particles obtained in Example B1 was suspended in 30 mM acetate buffer (PH5.5) to give l (wZv)%. 10 ml of this solution, 500 mM EDC aqueous solution 250 1 and lml lmg / ml DBA (Dolichos Biflorus Agglutinin) -FITC (Made by VEC: molar binding ratio of FITC to DBA 2.5) Stirring was performed at room temperature for 2 hours. After the reaction, 20 ml of isopropanol was added, the mixture was allowed to stand at room temperature for 30 minutes, and then centrifuged at 4000 g for 20 minutes.
  • the precipitate was washed with 70% ethanol and suspended in a PBS buffer solution to prepare a dispersion of DBA-FITC-immobilized polyethyleneimine-bound diacid titanium dioxide fine particles.
  • the average dispersed particle size of the composite fine particles was 68.3 nm.
  • Fluorescein manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • the fluorescence intensity of the dispersion revealed that 600 ng Zml of FITC was bound. Further, this dispersion was heated to 400 ° C., and the titanium oxide content was measured. As a result, the concentration was 1 (wZv)%. Since the DBA: FITC binding ratio is 1: 2.5, it must be 2.5 X 10 " 7 (DBA-FITC) mol / TiO (g)
  • the dispersion containing the photocatalytic diacid-titanium composite fine particles in which streptavidin was immobilized on the P25 aqueous solution was clearly highly transparent and uniformly dispersed.
  • the absorbance of P25 aqueous solution was much higher than 1, whereas it was impossible to measure it.
  • the dispersion containing the photocatalytic diacid-titanium composite fine particles fixed with bismuth had an absorbance of 0.044, and no precipitate was formed.
  • the absorbance at a wavelength of 660 nm was measured in the same manner.
  • the absorbance of P25 aqueous solution was much higher than 1 and could not be measured.
  • the dispersion containing the photocatalytic diacid-titanium composite fine particles fixed with streptavidin had an absorbance of 0.051. This indicates that the dispersion containing the photocatalytic titanium dioxide composite fine particles in which streptavidin is immobilized in an aqueous solution has high transparency, uniform dispersibility, and is stable.
  • the number of cells was counted with a hemocytometer, and a medium 500 1 containing 5 ⁇ 10 4 cells was inoculated on a 24-well microtiter plate. Then, a dispersion containing photocatalytic diacid-titanium composite fine particles fixed with streptavidin obtained in Example B2 was adjusted with lOOmM phosphate buffered saline (PH7.4), and the final concentration was 0%. It was irradiated with UV light of wavelength 340 nm at 2.5 mWZcm 2 for 0 minutes and 60 minutes using a black light (manufactured by Toshiba), and cultured in a CO incubator for 24 hours. Cell counting
  • kit-8 manufactured by Doujin Chemical Co., Ltd. was added according to the reagent manual, and absorbance at a wavelength of 450 nm was measured using a Benchmark (manufactured by Bio-Rad) on a 96-well plate. The results are shown in Table 2. [0070] [Table 2]
  • the relative survival rate was shown by taking the absorbance derived from living cells as 1 at a photocatalytic diacid-titanium composite fine particle concentration of 0%, in which streptavidin was immobilized for 0 minutes after UV irradiation after subtracting the knock ground value. From this result, the relative survival rate decreased only when the photocatalytic titanium dioxide composite microparticles fixed with streptavidin were in the presence of 0.01% and in the experimental condition of 60 minutes of UV irradiation. It was confirmed that the dispersion containing the photocatalytic titanium dioxide composite microparticles with high cell killing ability is high.

Abstract

　生体内での中性な生理的条件下のみならず幅広いｐＨ領域における水系溶媒への分散性、ならびに細胞に対する親和性および取込み性に優れた光触媒性二酸化チタン微粒子が開示されている。 この光触媒性二酸化チタン微粒子は、光触媒性二酸化チタンの表面が、カチオン性の親水性高分子により修飾された光触媒性二酸化チタン微粒子であって、該親水性高分子と光触媒性二酸化チタンが結合しているものである。この光触媒性二酸化チタン微粒子は、癌細胞の破壊等の医療用途に極めて有用である。

Description

光触媒性二酸化チタン微粒子、その分散液、およびその製造方法 発明の背景
[0001] 発明の分野
本発明は、カチオン性の親水性高分子により表面改質された光触媒性二酸ィ匕チタ ン微粒子、その分散液、およびその製造方法に関する。また、本発明は、癌細胞、内 分泌撹乱物質などに対する分子認識能を有する抗体などの生体分子を固定ィ匕し、 紫外線の照射などによってこれらの分解作用を示す光触媒性二酸化チタン複合微 粒子を含む分散液およびその製造方法にも関する。
[0002] 普晋 術
二酸化チタンは、強い光活性分解能を有するとともに、大気中や溶液中でも化学 的に極めて安定であり、遮光された動物体内では毒性もなく安全なことが知られてい る。そのため、二酸化チタンの医療分野への応用が検討されている。特開 2002-31 6946号公報、特開 2002— 316950号公報、および R. Caiら： Cancer Research, 52, 2346-2348 (1992)には、二酸ィ匕チタンを用いた癌治療が提案されている。こ れは、標的とするガン細胞に二酸ィ匕チタンを担持した金などの金属粒子を撃ち込ん で取り込ませた後、紫外線等の光を照射してガン細胞を死滅させるというものである。 特に、二酸ィ匕チタンは、光によって化学反応スィッチの ON ' OFFや、反応領域およ び反応の強弱を制御できるため、部位特異的な制御機構による治療法の確立に有 用であると考えられている。
[0003] 従来、二酸ィ匕チタンの等電点は pH6前後といわれており、そのため中性付近の水 系溶媒中では二酸ィ匕チタン粒子は凝集を生じてしまい、これを均一に分散させること は極めて困難であった。それ故、二酸化チタン粒子を水系の分散媒に均一分散させ るため、現在までに種々の工夫がなされてきた。例えば、 Barbe Christopheら: Jou rnal of the American Ceramics Society, 80, 3157- 3171 (1997)および Vorkapic Danijelaら： Journal of the American Ceramics Society, 81, 2815- 2820 (1998)では、チタンイソプロポキシドから水酸化チタンの沈殿を生成さ せ、これを硝酸酸性下にお ヽて高温で解膠した硝酸酸性の二酸ィ匕チタンゾルが提 案されている。また、特開平 10-67516号公報には、四塩ィ匕チタン水溶液にアンモ ユア水を滴下して水酸ィ匕チタンの沈殿を生成させた後、過酸ィ匕水素水を添加して 10 0°Cで 6時間反応させ、二酸ィ匕チタン粒子表面をペルォキソ基で修飾したペルォキソ 基修飾二酸ィ匕チタンゾルを得る方法が提案されている。特開平 1卜 319577号公報 には、二酸ィ匕チタン粒子表面を多孔質シリカにより表面被覆することにより、アルカリ 条件下に分散させて安定化させた複合型二酸化チタン微粒子の分散液を得る方法 が提案されている。特開平 02-212315号公報には、分散剤としてポリカルボン酸ま たはその塩を含有することによって、分散性を高めた二酸ィ匕チタンの水溶液を得る方 法が提案されている。しかしながら、これらの技術にあっては、中性付近の生理的条 件下で二酸ィ匕チタン粒子が凝集を生じ、生体に何らかのダメージを与え、好ましくな い状況を作り出すため、二酸ィ匕チタン粒子を医療材料として生体において適用する ことは難しい。
[0004] WO2004Z087577には、酸化チタン微粒子に、ポリアクリル酸等の親水性高分 子を、カルボキシル基を介してエステル結合させた、表面改質酸ィ匕チタン微粒子によ り、中性付近での分散性が実現されることが開示されている。この技術は、ポリアタリ ル酸等といったァ-オン性ポリマーの使用を念頭としたものである。
[0005] 一方、近年、カチォニックリボソーム力 遺伝子の細胞への非ウィルス性導入用キヤ リア一として広く用いられて 、る。カチォニックリボソームとはリボソーム膜の表面に 4 級ァミンなどの正電荷官能基を持つ、生体膜の構成成分であるリン脂質により形成さ れる小胞である。リボソームは、生体適合性に優れた小胞であるため、その小胞内に 様々な薬物を封入できることから、薬剤のキャリア一として利用されている。そして、リ ポソームの外面に正電荷を持たせることによって、負電荷を帯びた細胞との相互作 用を増強させ、細胞内に薬剤を取り込ませることができる。リボソームは形態学的には 小さな 1枚膜リボソームと大きな 1枚膜リボソームと多重層リボソームに分類されている 。 Yoshida Jら: Jpn J Cancer Res. , 87, 1179- 1183 (1996)には、この組成 のカチォニックリボソームの内部に酸化鉄 Fe Oの 10nm程の微粒子であるマグネタ
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イトを封入する方法、および腫瘍局所投与による腫瘍へのターゲティングを行う試み が開示されている。この方法にあっては、クロ口ホルムに溶解した前述の組成脂質を 含む溶液をロータリーエバポレーターにより蒸発留去して、形成された脂質フィルム を減圧乾燥後にマグネタイトをカ卩えて、ボルテックスで処理し、さらに超音波処理する ことでマグネタイトカチォニックリボソーム（MCL)を得る。この MCLの in vitroでの T -9 rat glioma細胞への導入効率は、電荷を持たない中性のリボソームに封入した マグネタイト（マグネトリポソーム）と比較して 10倍以上高カゝつたとされている。しかしな がら、リボソームに微粒子を封入することで、元の微粒子サイズの数十倍程度に大き くなり、また、リボソームの作製工程が複雑で均質な生産物を提供するのが難しいも のと考えられる。
発明の概要
[0006] 本発明者らは、今般、光触媒性二酸ィヒチタン微粒子表面にカチオン性の親水性高 分子をィ匕学的に結合させて表面改質することにより、生体内での中性な生理的条件 下のみならず幅広い pH領域における水系溶媒への分散性、ならびに細胞に対する 親和性および取込み性が顕著に向上し、癌細胞の破壊等の医療用途に極めて有用 となるとの知見を得た。
[0007] したがって、本発明は、生体内での中性な生理的条件下のみならず幅広い PH領 域における水系溶媒への分散性、ならびに細胞に対する親和性および取込み性に 優れ、癌細胞の破壊等の医療用途に極めて有用となる、光触媒性二酸化チタン微 粒子およびその製造方法の提供をその目的としている。
[0008] すなわち、本発明による光触媒性二酸ィ匕チタン微粒子は、
光触媒性二酸化チタンの微粒子と、
該光触媒性二酸ィヒチタン微粒子の表面に修飾されるカチオン性の親水性高分子 と
を含んでなり、前記親水性高分子が前記光触媒性二酸化チタンと結合されてなるも のである。
[0009] また、本発明による上記光触媒性二酸化チタン微粒子の製造方法は、
二酸化チタンゾルを溶媒に分散させる第 1工程と、
カチオン性の親水性高分子を溶媒に分散させる第 2工程と、
これらの分散液を混合する第 3工程と、 この混合液を加熱する第 4工程と、
光触媒性二酸化チタン微粒子と未結合親水性高分子とを分離する第 5工程と、 光触媒性二酸化チタン微粒子を精製する第 6工程と
からなる。
図面の簡単な説明
[0010] [図 1]本発明の光触媒性二酸ィ匕チタン微粒子を示す模式図である。
[図 2]本発明の光触媒性二酸ィ匕チタン複合微粒子を含む分散液を示す模式図であ る。
[図 3]本発明の光触媒性二酸化チタン微粒子の光触媒活性 (メチレンブルーの分解 にともなう吸光度の減少として表示）を測定した結果を示す図である。図中〇および 參は、例 A1で作製したポリエチレンィミン結合二酸ィ匕チタン微粒子 (アナターゼ型） を用いて、〇が紫外線照射なし、參が紫外線照射ありをそれぞれ表している。
[図 4]本発明の光触媒性二酸ィ匕チタン微粒子の各 pHにおける平均分散粒径を測定 した結果を示す図である。
[図 5]本発明の光触媒性二酸ィ匕チタン微粒子の各塩濃度における平均分散粒径を 測定した結果を示す図である。
[図 6]本発明の光触媒性二酸ィ匕チタン微粒子の均一性 (透明度)を確認した結果を 示す写真図である。
[図 7]本発明の光触媒性二酸ィ匕チタン微粒子の各濃度における細胞毒性を測定した 結果を示す図である。
[図 8]本発明の光触媒性二酸ィ匕チタン微粒子の細胞取込み性を確認した結果を示 す写真図である。
[図 9]本発明のストレプトアビジンを固定ィ匕した光触媒性二酸ィ匕チタン複合微粒子の ピオチンダイマーによる凝集（吸光度の増加として表示）の結果を示す図である。
[図 10]本発明の光触媒性二酸ィ匕チタン複合微粒子を含む分散液の均一性 (透明度 )を確認した結果を示す写真図である。
発明の具体的説明
[0011] 光触媒件二酸化チタン微粒子 本発明の光触媒性二酸ィ匕チタン微粒子は、光触媒性二酸化チタンの微粒子と、光 触媒性二酸化チタン微粒子の表面に修飾されるカチオン性の親水性高分子とを含 んでなる。そして、親水性高分子が光触媒性二酸化チタンと結合されてなる。図 1〖こ 、本発明の光触媒性二酸ィ匕チタン微粒子の一例を模式的に示す。図 1に示されるよ うに、本発明の光触媒性二酸ィ匕チタン微粒子は、光触媒性二酸ィ匕チタン微粒子 11 の表面にカチオン性の親水性高分子 12を有する。カチオン性高分子と二酸化チタ ンは結合し、これにより光触媒性二酸ィ匕チタン微粒子のみで分散剤等の他物質の添 加無しに、水溶液中にぉ 、て安定して分散することができる。
[0012] すなわち、本発明の光触媒性二酸ィ匕チタン微粒子は、その表面にカチオン性の親 水性高分子が結合されているため、中性付近で正電荷を有する。そのため、粒子間 に電気的斥力が働くため、中性付近はもとより幅広い pH領域の水系溶媒中におい ても、凝集することなく極めて良好な分散性を示す。さらに、本発明の光触媒性二酸 化チタン微粒子の分散液は、上記特性により水または塩を含む各種 pH緩衝液を溶 媒として利用可能であり、生理的条件下、分散剤等の他物質の添加無しに、分散性 が極めて良好で、 24時間以上にわたって安定な分散液を維持することができる。ま た、光触媒性二酸ィ匕チタン微粒子は正電荷を帯びていることから、負電荷を帯びる 物質を捕捉し、紫外線照射などにより目的物質を強力に分解する能力を有する。一 般に細胞はその表面が負電荷を帯びて ヽることから、本光触媒性二酸化チタン微粒 子は細胞に対して極めて親和性が高ぐまた取込み性もよい。このことを利用して、特 に癌細胞の破壊などの医療用途に応用することができる。
[0013] 本発明の好ましい態様によれば、親水性高分子が、親水性高分子ァミンであるの が好ましい。ァミンと二酸ィ匕チタンは強く結合することから、光触媒性二酸化チタン微 粒子を水溶液中により一層安定に分散させることができる。また、親水性高分子に含 まれるァミンの等電点が二酸ィヒチタン微粒子の等電点に反映され、中性の水系溶媒 中においても粒子間に電気的斥力が働くため、良好な分散性を示す。
[0014] 本発明の好ま 、態様によれば、光触媒性二酸化チタン微粒子の材料として用い る二酸ィ匕チタンとして、結晶系がアナターゼ型またはルチル型のいずれも使用可能 である。これは、結晶系が異なっていても水和されて水酸基が生成するという化学的 性質が同一であれば、カチオン性の親水性高分子が結合できるため、表面改質が 可能なためである。強い光触媒能が所望であればアナターゼ型を、あるいは化粧料 のように高屈折率等の性質が所望であればルチル型を、適宜好適に選択できる。ま た、同様な理由から、単一の二酸ィ匕チタン粒子だけでなぐ二酸化チタンと磁性材と からなる複合二酸化チタン粒子も好適に使用される。さらに、その使用形態の自由度 の観点から、これらの分散粒経は 2〜200nmであることが望ましい。これは、粒径が 2 OOnmよりも大きくなると微粒子に作用する重力の効果も大きくなるため、より沈降し やすくなるためである。
[0015] 本発明の好ま 、態様によれば、光触媒性二酸ィ匕チタン微粒子は、分散性の観点 力 分散粒経が 2〜500nmであることが好ましい。癌治療用として体内への適用の 場合、腫瘍細胞への蓄積効果の観点力も分散粒経が 50〜200nmであることがより 好ましい。このような範囲とすることで、生理的条件下で 24時間以上にわたって、安 定した分散が可能となる ^尚、ここでいう分散粒径とは、動的光散乱法によって測定 を行い、キュムラント法解析力も算出される平均値のことを示している。また、ここでい う生理的条件下とは 25°C、 1気圧で（137mM NaCl, 8. ImM Na HPO , 2. 68
2 4 mM KCl, 1. 47mM KH PO )の組成であるリン酸緩衝食塩水（pH7. 4)存在下
2 4
のことを示す。
[0016] 本発明の好ましい態様によれば、親水性高分子が水溶性高分子であることが好ま しい。これは、本発明が光触媒性二酸化チタン微粒子を水溶液中に分散した状態で 使用することを想定しているためである。水溶性高分子としては、二酸化チタンに強 固に結合することができ、かつ重量平均分子量が 1000から 100000の範囲にあるァ ミンであればいずれも使用可能である力 例えばポリアミノ酸、ポリペプチド、ポリアミ ン類、および分子中に複数のァミン単位を有する共重合体などが挙げられる。具体 的には、水溶性高分子の加水分解性および溶解度の観点から、ポリエチレンィミン、 ポリビュルァミン、ポリアリルアミン等のポリアミン類がより好適に使用される。より具体 的には、ポリオル-チン、ポリリジン等の塩基性ポリアミノ酸を用いることができ、この 場合には、二酸ィ匕チタンにポリマー中のアミンゃカルボキシル基のどちらかまたは両 方が強固に結合し、所望の光触媒性二酸ィ匕チタン微粒子を得ることができる。 [0017] 本発明の好ましい態様によれば、良好な分散性と細胞取込み性の実現の観点から 、光触媒性二酸ィ匕チタン微粒子の表面電位が + 20mV以上であるのが好ましぐより 好ましくは、一般に自主分散 (粒子が沈殿しな 、状態)が十分に達成できる電位とさ れる +40mV以上である。
[0018] 分散液
本発明の好ましい態様によれば、光触媒性二酸化チタン微粒子と、該光触媒性二 酸化チタン微粒子が分散される水系溶媒とを含んでなる、光触媒性二酸化チタン微 粒子の分散液が提供される。水系の分散媒体中では、光触媒性二酸化チタン微粒 子表面上に存在する正電荷 (好ましくはァミンによる正電荷）により、粒子間に電気的 斥力が働くために凝集することなぐ長期間にわたって安定に存在することによる。し 力も、基本的に pHの変動や無機塩類の添カ卩に対しても極めて安定である。さらに、 親水性高分子が親水性高分子ァミンの場合、光触媒性二酸化チタン微粒子の等電 点は、該親水性高分子のァミンの等電点を反映しており、 pH9以下の水系分散媒中 では pHが減少するにつれて粒子間に働く電気的斥力が増大するため、 pHが 3〜9 の水系分散媒中で極めて良好な分散性を示すものである。これらのことから、本分散 液は前記水系溶媒として pH緩衝液を利用することが可能である。すなわち、本発明 の光触媒性二酸ィ匕チタン微粒子は、 pHが 3〜9の範囲であれば 、かなる緩衝成分 が水系分散媒に含有されて 、ても良好な分散性を示すものである。緩衝液の好まし い例としては、グリシン緩衝液、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液 (PBSを含む）、炭酸緩衝 液、マツキルべインの緩衝液、グッドの緩衝液、ホウ酸緩衝液などが挙げられる。中性 付近の緩衝液が使用できるということは、バイオテクノロジー分野や医薬医療分野に おける応用に対して極めて有利である。なお、上記の良好な分散性を維持するため に、分散液中の表面改質ニ酸ィ匕チタン微粒子のアミノ基 Z二酸ィ匕チタン量比 (mol /g)は、反応条件により異なるが概ね 1. 5 X 10—2以上であるのが好ましい。
[0019] 本発明の好ましい態様によれば、水系溶媒の塩濃度が 1M以下であるのが好まし い。この程度の濃度の分散液であれば、光触媒性二酸化チタン微粒子間の電気的 斥力のために、凝集することなぐ少なくとも 24時間以上にわたって安定することがで きる。より好ましい塩濃度は 100mM〜300mM程度である。この範囲であると、生体 内での中性な生理的条件下においても安定して分散し、存在することができる。
[0020] 本発明の好ま 、態様によれば、光触媒性二酸ィ匕チタン微粒子の分散液が、前記 光触媒性二酸ィ匕チタン微粒子を 20質量％以下含んでなるのが好ま 、。この程度 の濃度の分散液であれば、光触媒性二酸ィ匕チタン微粒子間の電気的斥力のために 、凝集することなぐ少なくとも 24時間以上にわたって安定することができる。より好ま しい二酸ィ匕チタン微粒子濃度は、 0. 0001-0. 1質量％である。この範囲であると、 生体への適用を考えた場合に細胞に対する安全性に優れる。
[0021] このように、本発明の光触媒性二酸化チタン微粒子を含む分散液を水、種々の pH 緩衝液、輸液、あるいは生理食塩水を用いた、均一で安定な分散液として提供する ことが可能となる。また、本分散液を含む軟膏やスプレー剤等も製造が可能である。 また、本発明の光触媒性二酸ィ匕チタン微粒子を含む分散液を含む軟膏やスプレー 剤を皮膚等の患部に直接塗布し、太陽光や紫外線ランプ等により治療を施すことが 可能となる。
[0022] 本発明の光触媒性二酸ィ匕チタン微粒子を励起、活性化させるための光源装置は 特別である必要はな 、が、二酸ィ匕チタンのバンドギャップの関係上その波長は 400η m以下であることが望ましい。皮膚等の外用用途では、太陽光や通常の紫外線ラン プ、あるいはブラックライトを好適に使用できる。また、体内の患部に対しては内視鏡 に紫外線ファイバーを装着することにより紫外線を照射すれば良い。さらに、特に 28 Onm付近の紫外線を局所的に患部に照射して病変部を破壊しょうとする光療法を想 定した場合では、その作用増強剤として本発明の二酸ィ匕チタン複合微粒子を含む分 散液を適用することも可能である。
[0023] 本発明の光触媒性二酸ィ匕チタン微粒子は、表面上に存在するァミンによって表面 電荷が正に帯電していることから、一般的に負の表面電荷をもつ細胞への親和性、 取込み性が著しく高ぐ本発明の光触媒性二酸ィ匕チタン微粒子と細胞とが接触する と直ちに細胞への結合や取込みが始まる。このことから、特に生体の皮膚表面や、あ るいは気管、消化器などの生体内の表層部や、生体内に存在する様々な患部への 適用が非常に有効であり、例えば、本発明の光触媒性二酸化チタン微粒子を含む 分散液を含む軟膏やスプレー剤を皮膚癌や喉頭癌と 、つた癌患部に直接塗布した り、あるいは注射により固形ガンに局所投与した後に、太陽光や紫外線ランプや医療 用途で使用される光源等により治療を施すことができる。また、その際の光照射は内 視鏡を用いてもよぐ簡便でかつ高い治療効果を得ることができる。
[0024] 牛.体分子が岡定化された光触媒件二酸化チタン複合微粒子の分散液
本発明の好ましい態様によれば、上記分散液は、光触媒性二酸ィ匕チタン微粒子が 、前記親水性高分子のァミンに生体分子が固定化されてなる光触媒性二酸ィ匕チタン 複合微粒子である分散液であるのが好ましい。すなわち、この態様による分散液は、 二酸ィ匕チタン表面に親水性高分子アミンを有し、該親水性高分子のァミンと二酸ィ匕 チタンが強く結合しているとともに、前記親水性高分子のァミンに生体分子を固定ィ匕 することを可能とし、さらに、分散剤等の他物質の添加無しに、分散性が極めて良好 で安定な分散液である。これにより、二酸ィヒチタン表面を親水性高分子で修飾した 後に生体分子を固定ィ匕した光触媒性二酸ィ匕チタン複合微粒子が、選択的吸着能と 光触媒能を両立できる。したがって、本態様によれば、選択的吸着能生体内での中 性な生理的条件下においても安定して分散し、存在することができる。この態様にお いて、選択的吸着能と光触媒能との両立を好ましく実現するために、光触媒性二酸 化チタン微粒子が少なくとも表面の一部に光触媒性二酸ィ匕チタンが存在する微粒子 であるのが好ましぐまた、光触媒性二酸化チタンは光触媒能に優れるアナターゼ型 であるのが好ましい。また、水系溶媒は、生体への導入が許容される水溶液であるの が好ましい。
[0025] 図 2に、本態様の生体分子が固定化された光触媒性二酸ィ匕チタン複合微粒子の 分散液を模式的に示す。本発明の光触媒性二酸化チタン複合微粒子を含む分散液 はアナターゼ型ニ酸ィ匕チタン 21と、生体分子と結合する親水性高分子ァミン 22を非 プロトン性極性溶媒に分散させて、 90〜180°Cで 1〜12時間反応を行い、親水性高 分子と二酸ィ匕チタンとの間で結合を生成させた後、水溶液に分散し、親水性高分子 のァミンに生体分子 23を固定ィ匕させたものである。これにより、本発明の光触媒性二 酸ィ匕チタン複合微粒子のみで分散剤等の他物質の添加無しに、水溶液中において 安定して分散可能となる。生体分子の固定化には、光触媒性二酸化チタン複合微粒 子表面の二酸ィ匕チタンと親水性高分子の結合に関与して 、な 、フリーのアミンを用 いることができる。生体分子側は、アミノ基、カルボキシル基、チオール基、糖鎖に由 来するアルデヒド基等を持つ為、適切な架橋剤を用いることにより両者を共有結合さ せることが可能である。
[0026] 本発明に使用可能な生体分子としては多種多様なものが考えられるが、最も利用 が期待されるものとしてタンパク質が挙げられる。本発明によれば、タンパク質として 抗体、レセプターから低分子ペプチドまで好適に固定ィ匕が可能である。また、タンパ ク質の化学組成力ゝら光触媒性二酸ィ匕チタン複合微粒子への固定ィ匕にはァミノ基、力 ルポキシル基ゃチオール基、糖タンパクの場合ではアルデヒド基を固定ィ匕の際の標 的官能基にすることが可能である。更には両者間をピオチンとアビジンの相互作用を 利用して固定ィ匕することも可能である。
[0027] 好ま 、生体分子の例としては、アミノ酸、ペプチド、単純タンパク質 (例えばレクチ ン）、および複合タンパク質;ヌクレオシド、ヌクレオチド、および核酸;単糖、糖鎖、多 糖、および複合糖質;単純脂質、複合脂質、およびリボソーム;ならびにこれらの組合 せが挙げられる。
[0028] 本発明の好ましい態様によれば、二官能性のリンカ一試薬を用いることで、光触媒 性二酸化チタン複合微粒子と生体分子間の結合は達成される。二官能性のリンカ一 試薬としてホモ官能基のものを用いれば、光触媒性二酸ィ匕チタン複合微粒子表面の ァミンと生体分子に由来するァミノ基間に容易に共有結合を導入することが可能であ る。また、ヘテロ官能基を持つものを用いれば、生体分子側にチオール基、カルボキ シル基を持つ生体分子が導入可能である。
[0029] また、生体分子に限らず、蛍光色素や検出用プローブ物質等も適当な官能基の導 入により光触媒性二酸ィ匕チタン複合微粒子への固定ィ匕が可能である。
[0030] アミノ基同士のホモリンカ一試薬としては、 N-ヒドロキシスクシンイミドエステルを持 つ bの、
Figure imgf000011_0001
glutarateや Bis (Sulfosuccmimidyl) sub eratate等およびイミドエステルを持つもの、具体的には Dimethyl adpimidateや Dimethyl suberimidate等があり、好適に用いることができる。
[0031] また、ヘテロ官能基の組み合わせは、光触媒性二酸化チタン複合微粒子表面のァ ミンに対しては上述の N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、イミドエステル力 生体物 質側のチオール基に対しては、マレイミド基を有するもの、具体的には Ν- ( ε -Malei midocaproyloxy) succinimide ester等を用 ヽ こと力できる。
[0032] 核酸の固定ィ匕を行う場合にはポリメラーゼチェインリアクション (PCR)による DNA 増幅の際に、アミノ化プライマー、チオール化プライマー、ピオチン化プライマーを用 いて修飾 DNAを合成することにより、同様の方法で光触媒性二酸化チタン複合微粒 子へ固定ィ匕することが可能である。例えば、アミノ化 DNAを固定ィ匕に用いる場合、光 触媒性二酸ィ匕チタン複合微粒子表面のァミンとの間に二官能性ホモリンカ一を用い れば、両者を混合するだけで固定ィ匕を行うことができる。また、チオールィ匕 DNAを用 いる場合、上述の-官能性へテロリンカ一を用いれば、ァミン-チオール間を結合す ることができる。ピオチンィ匕 DNAを用いる場合には、光触媒性二酸化チタン複合微 粒子にストレプトアビジンを導入することが必要である力 この場合には、上述のァミノ 基に対する二官能性ホモリンカ一を用いることで容易に導入が可能である。
[0033] 複合タンパク質や糖質などに由来する糖鎖の固定を行う場合は、シス-ジオールを 過ヨウ素酸などによりアルデヒドに酸ィ匕し、光触媒性二酸化チタン複合微粒子のアミ ンと Sodium cyanoborohydrideの存在下でシッフ塩基を形成させることにより固 定ィ匕が可能であるが、二官能性リンカ一を用いて架橋形成することも可能である。
[0034] タンパク質や糖質の一部など、生体分子側がカルボキシル基を持つ場合、 1-ェチ ル -3- (3-ジメチルァミノプロピル)カルポジイミド (EDC)により活性化を行い、光触媒 性二酸ィ匕チタン複合微粒子と混合することにより両者間の架橋が可能である。
[0035] 本発明の光触媒性二酸化チタン複合微粒子を含む分散液における光触媒性二酸 化チタン複合微粒子は、表面上に存在するァミンによって表面電荷が正に帯電して いることから、一般的に負の表面電荷をもつ細胞への親和性、取込み性が著しく高く 、本発明の光触媒性二酸化チタン複合微粒子と細胞とが接触すると直ちに細胞への 結合や取込みが始まる。このことから、特に生体の皮膚表面や、あるいは気管、消化 器などのあるいは生体内部の表層部や、生体内に存在する様々な患部への適用が 非常に有効であり、さらに、生体分子を固定化させることで癌細胞内での局在化を可 能にする。例えば、核内への移行シグナルを結合することで、核内 DNAへの接近を 容易にし、より高い治療効果を得ることができる。例えば、本発明の光触媒性二酸ィ匕 チタン微粒子を含む分散液を含む軟膏やスプレー剤を皮膚癌や喉頭癌といった癌 患部に直接塗布したり、あるいは注射により固形ガンに局所投与した後に、太陽光や 紫外線ランプや医療用途で使用される光源等により治療を施すことができる。また、 その際の光照射は内視鏡を用いてもよぐ簡便でかつ高い治療効果を得ることがで きる。
[0036] 特に、本発明による光触媒性二酸化チタン複合微粒子を含む分散液にあっては、 癌細胞、内分泌撹乱物質などに対する分子認識能を有するタンパク質、抗体、 DNA などの生体分子を、水溶性高分子で修飾したアナターゼ型ニ酸化チタンに固定する ことにより、これらに対する分子認識能を有し、かつ紫外線の照射などの光触媒作用 によりこれら物質の分解反応を示すことができる。本発明の光触媒性二酸化チタン複 合微粒子を含む分散液における光触媒性二酸ィ匕チタン複合微粒子は水、または水 溶液中で目的とする物質を特異的に認識捕捉し、紫外線照射などにより目的物質を 強力に分解する能力を有する。特に水系で使用できること、目的物質を正確に捕捉 できること、強力な光触媒能を有することは、例えば水系の内分泌攪乱物質の分解 処理や癌細胞の破壊などの医療への応用に極めて有用である。
[0037] 観告 法
本発明の好ましい態様によれば、本発明の光触媒性二酸ィ匕チタン微粒子は、光触 媒性ニ酸ィ匕チタン微粒子表面に親水性高分子を結合させる反応において、 (1)二 酸ィ匕チタンゾルを溶媒に分散させる工程と、 (2)カチオン性の親水性高分子を溶媒 に分散させる工程と、（3)これらの分散液を混合する工程と、（4)この混合液を加熱 する工程と、 (5)光触媒性二酸化チタン微粒子と未結合親水性高分子とを分離する 工程と、 (6)光触媒性二酸化チタン微粒子を精製する工程とからなる方法により製造 することができる。
[0038] 本発明で用いる二酸ィ匕チタンゾルとしては、チタンテトライソプロボキシド等を原料と して合成することも、無機酸で解膠した既存の酸性二酸ィ匕チタンゾルを使用すること も可能である。一方、（1)および（2)の工程で用いる溶媒は、二酸ィ匕チタンゾルおよ び親水性高分子共に溶解できるものが好適である。これは、二酸化チタンが溶媒中 で凝集すると親水性高分子との結合反応が起こりうる表面積が減少するため、反応 終了後の水系溶媒に対する分散粒径が増大して分散性も悪ィ匕する力 である。さら に、ここで用いる溶媒として二酸ィ匕チタン粒子表面と反応性を有するものは不適であ る。特に、水酸基を含有するアルコール類は加熱すると二酸化チタン粒子表面とェ 一テル結合を形成するため、目的とする親水性高分子との結合反応を阻害する。こ の場合、二酸ィ匕チタン粒子の表面特性は使用するアルコールの特性に依存し、水系 の分散媒に対する分散性が著しく低下する。本発明で使用する溶媒は上記反応性 の点から、非プロトン性極性溶媒を使用することが好ましいが、具体的にはジメチル ホルムアミド、ジォキサン、もしくはジメチルスルホキシドを溶媒として使用可能であり 、さらに揮発性の観点力ゝらジメチルホルムアミドを溶媒として使用することがより好適 である。このような条件で反応させることにより、二酸ィ匕チタンと親水性高分子とがィ匕 学的に結合し、高度な分散安定性を発現することができる。
[0039] 次に、 (3)前記溶媒の二酸化チタン分散液と、親水性高分子分散液とを混合して 攪拌を行い、二酸化チタンと親水性高分子が均一に分散した分散液を作製する。こ の際、二酸ィ匕チタン分散液に直接親水性高分子を添加すると二酸ィ匕チタンの凝集を 引き起こす場合があるので、各分散液をそれぞれ作製してから混合することが望まし い。
[0040] 次いで、（4)この混合液を加熱して結合反応を行うが、この際二酸ィ匕チタンと親水 性高分子との比率を適宜選択すれば加圧しなくとも反応は進行する。しかしながら、 加圧すると反応がより促進されるため、加圧下で反応を進行させる方が望ましい。こ の際、親水性高分子としてポリエチレンィミン (平均分子量： 10000)を用いた場合で は、分散性をより好適にするためポリエチレンィミンの終濃度を lOmgZml以上とす るのが好ましい。本発明の製造方法においては、前記加熱温度が 80〜220°Cであ ることを特徴として 、る。加熱温度が 80°Cよりも低 、場合は親水性高分子の結合量 が低下して水系溶媒への分散性が低下する。また、加圧下で反応を行う場合では、 加熱温度が 220°Cを超えると反応容器の密閉性の問題から不適である。さら〖こ、水 の沸点以上の温度で反応を進行させる場合では、二酸化チタンゾルに含まれる水分 が完全に反応系外に揮散されると二酸化チタンが凝集するので、加圧下で反応を進 行させる方が望ましい。一方、反応液中の水分含量が高すぎると逆に反応を阻害す る場合があることから、反応液中の水分含量は反応条件によって異なるが概ね 4%以 下が望ましい。
[0041] 次に、 (5)生成後の光触媒性二酸化チタン微粒子と未結合親水性高分子を分離 する。分離する手段としては、透析法、限外濾過法、ゲル濾過クロマトグラフィー法、 あるいは沈殿法などが好適に使用できるが、透析法や限外濾過法で分離する場合 では使用した親水性高分子の分子量に合致した透析膜または限外濾過膜を使用す る必要がある。すなわち、上記のいずれの方法でも分離可能であるが、操作の簡便 性力も有機溶媒を用いた有機溶媒沈殿法を利用することが望まし 、。
[0042] 有機溶媒沈殿法を利用する場合には、反応終了後に反応液に対して 2倍量のイソ プロパノールを添カ卩し、室温で 30分間静置する。適量のイソプロパノールを添加する ことで、溶解度の低下により粒子は沈殿するが、粒子と結合していない親水性高分子 は凝集せずに溶液中に残存するため、この溶液を遠心して未結合親水性高分子を 除去することが可能となる。回収した沈殿を 70%エタノールで洗浄し、洗浄液は遠心 分離により除去する。
[0043] 次 、で、（6)沈殿物である光触媒性二酸ィ匕チタン微粒子を pH3〜9、より好ましくは pH5〜8の水系溶媒に懸濁する。ここで使用する水系溶媒としては、水、所望の PH 緩衝液等を好適に利用できる。また、この懸濁液を攪拌または超音波照射により表 面改質ニ酸ィヒチタン微粒子を均一に分散させ、脱塩後乾燥すると光触媒性二酸ィ匕 チタン微粒子の乾燥粉体を得ることができる。取扱 、が簡便で安定な粉体を製造出 来ることは、光触媒性二酸ィ匕チタン微粒子を種々の用途に応用する際極めて有利で ある。
[0044] さら〖こ、二酸ィ匕チタンと磁性材とからなる複合二酸ィ匕チタン微粒子の場合も、二酸 化チタンが微粒子の表面に露出していれば、溶媒中での特性は単一の二酸ィ匕チタ ンと近似しているために、上記と同一の製造法、精製法を適用することができる。この 光触媒性二酸ィ匕チタン微粒子は磁性を有しているため、例えば水中の有害物質の 分解処理等への応用に際し、処理後に磁石によって該微粒子を容易に回収できる ため、極めて有用である。
実施例 [0045] :二酸化チタン粒子へのポリエチレンィミンの導入（その 1)
チタンテトライソプロポキシド 3. 6gとイソプロパノール 3. 6gを混合し、氷冷下で 60 mlの超純水に滴下して加水分解を行った。滴下後に室温で 30分間攪拌した。攪拌 後、 12N硝酸 lmlを滴下して 80°Cで 8時間攪拌を行い、ぺプチゼーシヨンした。ぺプ チゼーシヨン終了後 0. 45 mのフィルターで濾過し、さらに脱塩カラム PD-10 (アマ シャム'フアルマシア'バイオサイエンス社製)を用いて溶液交換して固形成分 1%の 酸性二酸ィ匕チタンゾルを調製した。この分散液を 100ml容のバイアル瓶に入れ、 20 0Hzで 30分間超音波処理を行った。超音波処理を行う前後の平均分散粒経はそれ ぞれ、 36. 4nm、 20. 2nmであった。超音波処理後、溶液を濃縮して固形成分 20 %の二酸化チタンゾルを調製した。得られた二酸化チタンゾル 0. 75mlを 20mlのジ メチルホルムアミド (DMF)に分散させ、ポリエチレンィミン（平均分子量： 10000、和 光純薬) 450mgを溶解した DMFlOmlを添加後、攪拌して混合した。水熱反応容器 (HU-50、三愛科学）に溶液を移し変え、 150°Cで 6時間合成を行った。反応終了 後、反応容器温度が 50°C以下になるまで冷却し、反応液に対して 2倍量のイソプロ パノール (和光純薬)を添加した。室温で 30分間静置後、遠心分離により沈殿を回収 した。回収した沈殿を 70%エタノールで洗浄後、 2. 5mlの水を加えてポリエチレンィ ミン結合二酸ィ匕チタン微粒子 (アナターゼ型)の分散液を得た。作製したポリエチレン ィミン結合二酸ィ匕チタン微粒子の分散粒径を、ゼータサイザ一ナノ ZS (シスメッタス 社製)を用いて、ゼータ電位測定セルにポリエチレンィミン結合二酸ィ匕チタン微粒子 の分散液 0. 75mlを仕込み、溶媒の各種パラメーターを水と同値に設定し、 25°Cに て動的光散乱法により測定したところ、作製したポリエチレンィミン結合二酸ィ匕チタン 微粒子の平均粒径は 65. 6nmであった。また、同様の条件でゼータサイザ一ナノ ZS を用いてゼータ電位を測定したところ、作製したポリエチレンィミン結合二酸ィ匕チタン 微粒子のゼータ電位は + 35. 7mVであった。
[0046] !Α2:二酸化チタン粒子へのポリエチレンィミンの導入（その 2)
平均分子量 7500のポリエチレンイミンを用いたこと以外、例 A1と全く同様の方法 でポリエチレンィミン結合二酸ィ匕チタン微粒子を合成した。平均分子量 7500のポリ エチレンイミンを用いた場合でも、ポリエチレンィミン結合二酸ィ匕チタン微粒子 (アナ ターゼ型）の分散液は 、ずれも良好な分散性を示し好適であった。
[0047] 二酸化チタン粒子へのポリエチレンィミンの導入（その 3)
酸性二酸化チタンゾルの代わりにアルカリ性二酸化チタンゾル（タイノック AL— 6、 多木化学社製)を用いたこと以外、例 A1と全く同様の方法でポリエチレンィミン結合 二酸化チタン微粒子を合成した。アルカリ性二酸ィ匕チタンゾルを用いた場合でも、ポ リエチレンィミン結合二酸ィ匕チタン微粒子 (アナターゼ型）の分散液はいずれも良好 な分散性を示し好適であった。
[0048] ^I :磁性材/酸ィ匕チタン複合微粒子へのポリエチレンィミンの導入
セパラブルフラスコ内にポリオキシエチレン (15)セチルエーテル (C-15 :日本サーフ ァクタント工業社製)を 45. 16gを溶解させて 5分間窒素置換した後、シクロへキセン（ 和光純薬社製） 75mlを添加、 0. 67Mの FeC12 (和光純薬社製）水溶液 3. 6mlを添 加し、 250rpmで攪拌しながら 30%アンモニア水溶液 5. 4mlを添カ卩し、 1時間反応 させた。その後、 50mMテトラエチルオルソシリケイト水溶液 (和光純薬社製)を 0. 4 ml滴下して 1時間反応させた。その後、チタンテトライソプロボキシド (和光純薬社製） を最終濃度 5mMになるように加えた。 50% (wZv)エタノール水溶液 10mlを lmlず つ 10分間隔で添加した。水溶液を遠心分離し、沈殿物を 350°Cで 2時間焼成した。 焼成後、 10mM硝酸水溶液に分散させて超音波処理後、 0. 1 mのフィルターでろ 過した。得られた磁性材 Z酸化チタン複合体ゾル 0. 75mlを 20mlのジメチルホルム アミド (DMF)に分散させ、ポリエチレンィミン (平均分子量： 10000、和光純薬社製) 4 50mgを溶解した DMFlOmlを添加後、攪拌して混合した。水熱反応容器 (HU-50 、三愛科学社製）に溶液を移し変え、 150°Cで 6時間合成を行った。反応終了後、反 応容器温度が 50°C以下になるまで冷却し、反応液に対して 2倍量のイソプロパノー ル (和光純薬社製)を添加した。室温で 30分間静置後、遠心分離により沈殿を回収 した。回収した沈殿を 70%エタノールで洗浄後、 2. 5mlの水を加えてポリエチレンィ ミン結合磁性材 Z二酸化チタン複合微粒子 (アナターゼ型)の分散液を得た。本分 散液は白濁も生ぜず、微粒子が良好に分散しており単一の二酸ィ匕チタンの場合と同 様に好適な分散液であった。
[0049] :ポリエチレンィミン結合二酸ィ匕チタン微粒子のイソプロパノールに対する溶 解性
ポリエチレンィミン 200mgを 10mlの DMFに溶解したものを、溶液 (A)とした。例 A 1の工程中で得られた固形成分 20%の二酸化チタンゾル 0. 25mlを 10mlの DMF に分散させたものを、溶液 (B)とした。また、例 A1の工程中で得られた固形成分 20 %の二酸化チタンゾル 0. 25mlとポリエチレンィミン 200mgを 10mlの DMFに溶解し たものを混合させたものを、溶液 (C)とした。さらに、溶液 (C)を 150°Cで 6時間反応 させたポリエチレンィミン結合二酸ィ匕チタン微粒子の分散液を、溶液 (D)とした。 (A) 〜（D)の各溶液に 2倍量のイソプロパノールを添加して撹拌後静置し、沈殿の生成 を確認した。その結果、溶液 (A)〜（C)は 、ずれもイソプロパノール中で沈殿のな ヽ 透明な分散体であつたが、溶液 (D)のみが沈殿を生じたことが確認され、単にポリェ チレンィミンと二酸ィ匕チタン微粒子を混合した状態に比べてポリエチレンィミン結合 二酸ィ匕チタン微粒子は、ポリエチレンィミンと二酸ィ匕チタン微粒子の間により強い結 合を有して 、るためにイソプロパノールによる影響を受けて沈殿を形成したことが示 唆された。
[0050] ： ^Αβ:ポリエチレンィミン結合二酸ィ匕チタン微粒子の中性溶液における安定性 例 Α5で用いた (Α)〜（D)と同組成の各溶液を用いて、中性溶液におけるそれぞ れの安定性を評価した。すなわち、（Α)〜（D)の各溶液を 200mMリン酸緩衝液 (p H7. 0)で 10倍に希釈して撹拌後静置し、沈殿生成の有無を観察した。その結果、 二酸化チタンゾルを含む溶液 (B)と（C)は沈殿を生じた力 溶液 (A)と (D)では沈殿 を生じな力つた。これは二酸ィ匕チタンの等電点が中性付近にあるため、溶液 (B)と (C )では二酸ィ匕チタンが凝集してしまい沈殿を生じたと考えられる。一方、溶液 (D)では 、二酸ィ匕チタン表面は無数のァミンにより修飾されているため、中性付近では粒子全 体が正電荷を帯びており、均一に分散された状態を保持している。すなわち、溶液（ C)と（D)の比較にぉ 、て例 A7と A8の結果から、ポリエチレンィミン結合二酸ィ匕チタ ン微粒子は、ポリエチレンィミンの添加で単に分散性を高められた状態の二酸ィ匕チタ ン微粒子とは、全く異なる物性を示すことが分かった。
[0051] ^IAZ:ポリエチレンィミン結合二酸ィ匕チタン微粒子分散液の二酸ィ匕チタン含量の 測定 例 Alで得られたポリエチレンィミン結合二酸ィ匕チタン微粒子の分散液を 110°Cで 1 時間加熱乾燥し、さらに 4時間強熱して完全に灰化した。これをシリカゲルデシケー タ中で冷却し、前記分散液中の正味の二酸化チタン量として質量を測定した。その 結果、前記分散液は、 0. 25% (wZv)の二酸ィ匕チタンを含むことが示された。
[0052] 例 A8：ポリエチレンィミン結合二酸ィ匕チタン微粒子分散液のアミノ基含量の測定 例 A1で得られたポリエチレンィミン結合二酸ィ匕チタン微粒子のアミノ基をフルォレ スカミン (東京化成工業社製）との反応により確認と定量を行った。フルォレスカミンは ァミノ基と反応し、蛍光物質を生成するので、ポリエチレンィミン結合二酸ィ匕チタン微 粒子とフルォレスカミンとの反応での生成物の蛍光強度を測定することにより確認と 定量を行うことができる。 lOOmMホウ酸緩衝液 (pH9. 0)によって所定濃度に調製 したダルコサミン溶液を作製して、励起波長 395nmおよび蛍光波長 480nmでの蛍 光強度にっ 、て検量線を作成し、この検量線を用いてポリエチレンィミン結合二酸ィ匕 チタン微粒子上のアミノ基含量を求めた。その結果、前記分散液は 4. 01 X 10"2M の濃度でアミノ基を含むことが示された。例 A7の結果から、前記分散液のアミノ基 Z 二酸化チタン量比は、 1. 63 X 10— 2 (mol/g)であった。
[0053] 例 A9：ポリエチレンィミン結合二酸ィ匕チタン微粒子 (アナターゼ型）の光触媒活性 の評価
例 A1で得られたポリエチレンィミン結合二酸ィ匕チタン微粒子 (アナターゼ型）を固 形成分が 0. 02%になる様に 50mMリン酸緩衝液 (pH7. 0)で希釈した。メチレンブ ルー三水和物（和光純薬社製)を 40 μ Μになる様に水溶液に添加した。攪拌しなが ら、本水溶液に波長 340nmの紫外光を 1. 5mWZcm2になるように照射し、 580nm における波長の吸収を紫外-可視光分光光度計により測定した。結果を図 3に示す。 紫外線を照射しなカゝつた混合液に比べ、紫外線照射を行った混合液は照射時間の 経過と共にメチレンブルーの分解にともなう吸光度の減少が認められることから、例 A 1で得られたポリエチレンィミン結合二酸ィ匕チタン微粒子 (アナターゼ型）が光触媒活 性を保持していることは明らかである。
[0054] ポリエチレンイミンニ酸化チタン微粒子の PH安定性の評価
50mMの異なる pHを持つ緩衝液 (pH3 =グリシン塩酸緩衝液、 pH4および 5 =酢 酸緩衝液、 pH6 = 2-モルフオリノエタンスルホン酸緩衝液）、 pH7および 8 = 2- [4- ( 2-ヒドロキシェチル） -1-ピペラジ -ル]エタンスルホン酸緩衝液、 pH9 =ホウ酸緩衝 液、 pH10 =グリシン水酸ィ匕ナトリウム緩衝液)を作成し、終濃度 0. 025(wZv) %に なるように例 A1で得られたポリエチレンィミン結合二酸ィ匕チタン微粒子を含む分散液 を添加し、 1時間室温にて静置した。その後、ゼータサイザ一ナノ ZSにて例 A1と同様 に平均分散粒径の測定を行った。結果を図 4に示す。 pHが 3から 10の間で粒径の 変化は認められるものの 70から 85nm程度であり、安定した分散性を示した。
[0055] All:ポリエチレンイミンニ酸ィ匕チタン微粒子の塩強度安定性の評価
0. 05〜5Μの異なる塩化ナトリウムを含む 10mMリン酸緩衝液に例 A1で得られたポ リエチレンィミン結合二酸化チタン微粒子を終濃度 0. 025%になるように添加し、 1 時間室温にて静置した。その後、ゼータサイザ一ナノ ZSにて例 A1と同様に平均分 散粒径の測定を行った。結果を図 5に示す。系中の塩濃度が 0. 05から 1Mの間はほ とんど平均分散粒径の変化は認められず、安定した分散性を示すことが明らかにな つた o
[0056] 週 A12:二酸ィ匕チタン複合微粒子の均一性 (透明度)の評価
0. 1Mの塩ィ匕ナトリウムを含む 10mMリン酸緩衝液を用いて、例 A1で得られたポリ エチレンィミン結合二酸化チタン微粒子を含む分散液を終濃度 0. 1 %〖こなるように 調整し、 1時間室温にて静置した。また、二酸ィ匕チタン微粒子として P25 (日本ァエロ ジル)を 0. 1Mの塩ィ匕ナトリウムを含む 10mMリン酸緩衝液を用いて、同様に終濃度 0. 1%になるように調整し、 1時間室温にて静置した。その後、シャーレに 5ml移し上 方から撮影し、確認した。その結果を図 6に示す。 P25水溶液に対してポリエチレンィ ミン結合二酸化チタン微粒子を含む分散液は明らかに透明度が高ぐ均一に分散し ていることが確認された。また、分光光度計 (UV-1600、島津製作所)を用いて波長 660nmにおける吸光度の測定を行った結果、 P25水溶液は吸光度が 1を大きく上 回り測定不能であつたのに対して、ポリエチレンィミン結合二酸ィ匕チタン微粒子を含 む分散液は吸光度が 0. 044であり、また沈殿の形成は起きていな力つた。更に、こ れらの溶液を室温暗所にて 2週間静置した後に、同様に波長 660nmにおける吸光 度の測定を行った結果、 P25水溶液は吸光度が 1を大きく上回り測定不能であった のに対して、ポリエチレンィミン結合二酸ィ匕チタン微粒子を含む分散液は吸光度が 0 . 051であった。このことから、水溶液中において二酸ィ匕チタン複合微粒子の分散液 が透明度の高い、均一な分散性を示し、かつ安定していることが明らかになった。
[0057] ^:ポリエチレンイミンニ酸化チタン微粒子の細胞毒性の評価
例 A1で得られたポリエチレンィミン結合二酸ィ匕チタン微粒子を含む分散液を、固 形分が 1. 0%になるように 10%血清を含む RPMI1640培地（GIBCO社製)で調整 した。培養ガン細胞 (Jurkat)を、 10%血清を含む RPMI1640培地（GIBCO社製） で 37°C、 5%二酸ィ匕炭素雰囲気下で培養し、 5. 0 X 104細胞数 Zmlとなるように調 製した。これを再度 20時間同条件で培養した。この細胞培養液に、上記ポリエチレン ィミン結合二酸化チタン微粒子を含む分散液を終濃度で 0. 1%、0. 01%、 0. 001 %、 0. 0001%になるように 96穴プレート上で調整し、 200 1の試験用細胞培養液 とした。この試験用細胞培養液を 37°C、 5%二酸化炭素雰囲気下で 20時間培養し た後、それぞれ 100 /z lを用いて Celltiter- Glo Luminescent Cell Viability Assay (Promega¾:¾)により生細胞由来の発光反応を行い、イメージアナライザ L AS-3000UVmini (富士フィルム社製）を用いてその発光量測定を行うことで細胞 毒性の評価を行った。その結果を図 7に示す。何も添加していないコントロールの培 養細胞における発光量に比べ、どの分散液濃度においても同等の発光量を確認し たことから、この濃度域のポリエチレンィミン結合二酸ィ匕チタン微粒子を含む分散液 は細胞毒性が認められないことが明らかになった。
[0058] ポリエチレンイミンニ酸化チタン微粒子の細胞取込み性の評価
例 A1で得られた二酸化チタンゾル 0. 75mlを 20mlのジメチルホルムアミド（DMF )に分散させ、ポリアクリル酸 (平均分子量: 5000、和光純薬社製) 0. 2gを溶解した DMFを 10ml添加後、攪拌して混合した。水熱反応容器に溶液を移し変え、 180°C で 6時間水熱合成を行った。反応終了後、反応容器温度が 50°C以下になるまで冷 却し、溶液を取り出した後に水 80mlを添加して攪拌混合した。エバポレータで DMF および水を除去した後に、再度、水 20mlを添加してポリアクリル酸結合二酸ィ匕チタン 微粒子の水溶液とした。 2N塩酸 lmlを添加して二酸ィ匕チタン粒子を沈殿させて、遠 心後に上清を除去することにより未反応のポリアクリル酸を分離した。再度水を添カロ して洗浄を行い、遠心後に水を除去した。 50mMリン酸緩衝液 (pH7. 0)を 10ml添 加後、 200Hzで 30分間超音波処理を行い、二酸ィ匕チタン粒子を分散させた。超音 波処理後、 0. 45 mのフィルターで濾過し、重量百分率で 0. 25%のポリアクリル酸 結合二酸ィ匕チタン微粒子の分散液を得た。ゼータサイザ一ナノ ZS (シスメッタス社製 )を用いて、ゼータ電位測定セルにポリエチレンィミン結合二酸ィ匕チタン微粒子の分 散液 0. 75mlを仕込み、溶媒の各種パラメーターを水と同値に設定し、 25°Cにて動 的光散乱法により測定したところ、作製したポリアクリル酸結合二酸ィ匕チタン微粒子 の平均粒径は 45. 9nmであった。このポリアクリル酸結合二酸化チタン微粒子の分 散液 2mlに対して、 0. 8M l-Ethyl-3- [3-Dimethylaminopropyl] Carbodiimi de Hydrochlorideを 250 μ 1および N— Hydroxysuccinimideを 250 μ 1加えて、撹 拌しながら室温で 1時間反応させた。 10mM 酢酸緩衝液 (pH5. 0)で平衡ィ匕した 脱塩カラム NAP- 10 (アマシャム ·フアルマシア ·バイオサイエンス社製）を用いてゲル 濾過を行って溶液交換し、その後に 10mM酢酸緩衝液 (pH5. 0)を用いて全量を 9 . 5mlとした。そこへ、 DMFに溶解させた lOOmM 5- amino fluorescein (NCI社 製)を 5 /z lカ卩え、遮光下で撹拌しながら室温で 1時間反応させた。次に、 0. 1Mのェ タノールァミン (和光純薬工業社製)水溶液を 500 1加え、遮光下で撹拌しながら室 温で 30分間反応させた。この溶液を lOOmMリン酸緩衝食塩水 (pH7. 5)で平衡ィ匕 した脱塩カラム PD-10を用いてゲル濾過を行って溶液交換し、未反応の 5-amino fluoresceinを分離し、その後、溶液を 2mlにまで濃縮した。これを蛍光色素標識ポリ アクリル酸結合二酸ィ匕チタン微粒子の分散液とした。
また、例 A1で得られたポリエチレンィミン結合二酸ィ匕チタン微粒子の分散液を 500 1を、 lOOmMリン酸緩衝食塩水（pH7. 5)で平衡化した脱塩カラム NAP-10を用 いてゲル濾過を行って溶液交換し、そこへ、最終濃度が 0. 8mMになるように DMS Oに溶解したフルォレセインイソチオシァネート (ピアース社製)を加え、 30分間室温 で穏やかに攪拌した。反応終了後、あら力じめ PBSにて平衡ィ匕した PD-10 (アマシ ャム.フアルマシア'バイオサイエンス社製）により溶液交換を行い、その後、溶液を 2 mlにまで濃縮した。これを蛍光標識ポリエチレンィミン結合二酸ィ匕チタン微粒子の分 散液とした。 [0060] 次に、メラノーマ細胞株 T-24を 10%血清を含む Fl 2培地（ギブコネ土製)で 100%コ ンフルェントにになるまで培養し、フラスコを lOOmMリン酸緩衝食塩水（pH7. 4)で 2回洗浄し、 lOOmMトリプシン-エチレンジァミン三酢酸溶液を lml添カ卩し、 10分静 置後、フラスコ壁面より剥離した細胞を回収し、 9mlの 10%血清を含む F12培地で 希釈した。細胞数を血球計算盤により計測し、 5 X 104個の細胞を含む培地 500 1 をそれぞれ 24穴マイクロタイタープレートに接種し、最終濃度 0. 01%になるように分 注した。そこに、先の蛍光色素標識ポリアクリル酸結合二酸化チタン微粒子の分散液 および蛍光色素標識ポリエチレンィミン結合二酸ィ匕チタン微粒子の分散液をそれぞ れ最終濃度 0. 01%となるよう 100 1加え、 24時間 COインキュベータ内で培養した
2
。その後、細胞のフラスコへの接着を確認し、フラスコを lOOmMリン酸緩衝食塩水に て洗浄し、 200 1の 10%血清を含む F12培地を添加し、蛍光顕微鏡により観察を 行った。その結果、図 8に示される画像が得られた。蛍光視野像を観察した結果、蛍 光色素標識ポリアクリル酸結合二酸化チタン微粒子よりも蛍光色素標識ポリエチレン ィミン結合二酸ィ匕チタン微粒子のほうが明らかに細胞に対して高い親和性と細胞取 込み性をもつことが確認された。
[0061] 週 ポリエチレンイミンニ酸ィ匕チタン微粒子の細胞殺傷性の評価
メラノーマ細胞株 T-24を 10%血清を含む F12培地（ギブコネ土製)で 100%コンフ ルェントにになるまで培養し、フラスコを lOOmMリン酸緩衝食塩水（pH7. 4)で 2回 洗浄し、 lOOmMトリプシン-エチレンジァミン三酢酸溶液を lml添カ卩し、 10分静置後 、フラスコ壁面より剥離した細胞を回収し、 9mlの 10%血清を含む F12培地で希釈し た。細胞数を血球計算盤により計測し、 5 X 104個の細胞を含む培地 500 1をそれ ぞれ 24穴マイクロタイタープレートに接種した。そこに、例 A1で得られたポリエチレン ィミン結合二酸ィ匕チタン微粒子の分散液を lOOmMリン酸緩衝食塩水（pH7. 4)で 調整し、最終濃度 0%および 0. 01%となるよう 100 1加え、ブラックライト (東芝社製 )により波長 340nmの紫外光を 2. 5mWZcm2で 0分間および 60分間照射し、 24時 間 COインキュベータ内で培養した。 Cell counting kit- 8 (同人化学社製）を試
2
薬のマニュアルに従 、調整して加え、 96穴プレート上にて吸光度計 Benchmark (B io-Rad社製)を用い、波長 450nmの吸光度測定を行った。その結果を表 1に示す。 [0062] [表 1]
Figure imgf000024_0001
[0063] バックグラウンドの値を差し引いた紫外線照射 0分間、ポリエチレンィミン結合二酸 化チタン微粒子濃度 0%における生細胞由来の吸光度を 1として相対生存率を示し た。この結果から、ポリエチレンィミン結合二酸ィ匕チタン微粒子が 0. 01%存在下で 紫外線照射 60分間の実験条件における場合のみ、相対生存率が減少しており、こ れによりポリエチレンイミンニ酸ィ匕チタン微粒子は細胞殺傷性が高いことが確認され た。
[0064] 二酸化チタンへのポリエチレンィミンの導入
チタンテトライソプロポキシド 3. 6gとイソプロパノール 3. 6gを混合し、氷冷下で 60 mlの超純水に滴下して加水分解を行った。滴下後に室温で 30分間攪拌した。攪拌 後、 12N硝酸 lmlを滴下して 80°Cで 8時間攪拌を行い、ぺプチゼーシヨンした。ぺプ チゼーシヨン終了後 0. 45 mのフィルターで濾過し、さらに脱塩カラム PD-10 (アマ シャム'フアルマシア'バイオサイエンス社製)を用いて溶液交換して固形成分 1%の 酸性二酸ィ匕チタンゾルを調製した。この分散液を 100ml容のバイアル瓶に入れ、 20 OHzで 30分間超音波処理を行った。超音波処理を行う前後の平均分散粒経はそれ ぞれ、 36. 4nm、 20. 2nmであった。超音波処理後、溶液を濃縮して固形成分 20 %の二酸化チタンゾルを調製した。得られた二酸化チタンゾル 0. 75mlを 20mlのジ メチルホルムアミド (DMF)に分散させ、ポリエチレンィミン（平均分子量： 10000、和 光純薬社製) 450mgを溶解した DMFlOmlを添加後、攪拌して混合した。水熱反応 容器 (HU-50、三愛科学社製）に溶液を移し変え、 150°Cで 6時間合成を行った。 反応終了後、反応容器温度が 50°C以下になるまで冷却し、 2倍量のイソプロパノー ルを添加し、ポリエチレンィミン結合二酸ィ匕チタン微粒子を沈殿させ、遠心後に上清 を除去することにより未反応のポリエチレンイミンを分離した。 70%エタノールを添カロ して洗浄を行い、遠心後にエタノールを除去した。蒸留水を 10ml添加後、 200Hzで 30分間超音波処理を行 、、ポリエチレンィミン結合二酸ィ匕チタン微粒子を分散させ た。超音波処理後、 0. 45 mのフィルターで濾過して、固形成分 1. 5%のポリェチ レンイミン結合二酸ィ匕チタン微粒子の分散液を得た。作製したポリエチレンイミン結 合二酸ィ匕チタン微粒子の分散粒径を、ゼータサイザ一ナノ ZS (シスメッタス社製)を 用いて、ゼータ電位測定セルにポリエチレンィミン結合二酸ィ匕チタン微粒子の分散 液 0. 75mlを仕込み、溶媒の各種パラメーターを水と同値に設定し、 25°Cにて動的 光散乱法により測定したところ、ポリエチレンィミン結合二酸ィ匕チタン微粒子の平均 粒径は 67. 7nmであった。
[0065] M:ポリエチレンィミン結合二酸ィ匕チタン微粒子へのタンパク質の固定ィ匕
0. lmgのストレプトアビジン（ピアース社製）を含む 50mMの 2[4- (2-ヒドロキシェ チル） - 1-ピペラジ -ル]エタンスルホン酸（HEPES)緩衝液（pH8. 0) 1mlに 20mM の 1-ェチル - 3- (3-ジメチルァミノプロピル）カルボジイミド（EDC)と 5mMの N-ヒドロ キシこはく酸イミド (NHS)の混合液 0. 1mlを添カ卩して 5分間攪拌を行い、ストレプトァ ビジンのもつカルボキシル基を活性ィ匕した。攪拌終了後、 10mM酢酸緩衝液 (pH5 . 0)で平衡化した脱塩カラム NAP- 10 (アマシャム'フアルマシア'バイオサイエンス 社製）を用いてゲル濾過を行い、未反応の EDCおよび NHSを除去した。ストレプトァ ビジンを含む溶液 0. 1mlを例 B1で得られたポリエチレンィミン結合二酸ィ匕チタン微 粒子を含む分散液 2mlに添加し、 10分間、 4°Cにて穏やかに攪拌した。この溶液を 透析チューブ (分画分子量： 100000、ピアース社製)に移し、 20mMトリスヒドロキシメ チルァミノメタン-塩酸緩衝液 (PH8. 0)に対して 12時間透析を行った。透析チュー ブ内の溶液を回収し、 2倍量のイソプロパノールを添カ卩し、 10分間、 4000gにて遠心 分離し、沈殿を 70%エタノールで洗浄後、 lOOmMリン酸緩衝食塩水 (pH7. 5、 日 本ジーン社製） 1mlに溶解した。これにより、ストレプトアビジンを固定ィ匕した光触媒性 二酸化チタン複合微粒子の分散液を得た。この分散液の粒径を、ゼータサイザーナ ノ ZS (シスメッタス社製）を用いて、ゼータ電位測定セルにこの分散液 0. 75mlを仕込 み、溶媒の各種パラメーターを水と同値に設定し、 25°Cにて動的光散乱法により測 定したところ、作製した光触媒性二酸ィ匕チタン複合微粒子の平均粒径は 68. 2nmで めつに。
[0066] ストレプトアビジンを固定ィ匕した光触媒性二酸ィ匕チタン複合微粒子の生体分 子機能性の確認
例 B2で得られたストレプトアビジンを固定ィ匕した光触媒性二酸ィ匕チタン複合微粒 子の分散液 0. 1mlに対し、それぞれ ImMから ΙΟΟηΜまで 10倍刻みで希釈した異 なる濃度のビォチンダイマー（EZ- Link PEO- Biotin Dimer、ピアース社製）を 0 . 01ml添カ卩し、 37°Cにて 10分間静置し、 595nmの吸光度をマイクロタイタープレー トリーダー（Bench Mark,バイオラッド社製）にて測定した。結果を図 9に示す。明ら かにピオチンダイマーの濃度に応じて溶液の濁度が上昇しており、光触媒性二酸ィ匕 チタン複合微粒子にストレプトアビジンが効率的に固定ィ匕されていることが判明した。
[0067] :ポリエチレンィミン結合二酸化チタン微粒子へのレクチンの固定化
例 B1で得られたポリエチレンィミン結合二酸ィ匕チタン微粒子の分散液を 30mM酢 酸緩衝液 (PH5. 5)に懸濁し、 l (wZv) %になるようにした。この溶液 10ml〖こ、 500 mMの EDC水溶液 250 1と lmlの lmg/mlの DBA(Dolichos Biflorus Agglu tinin) -FITC (VEC社製： FITCの DBAに対するモル結合比 2. 5)をカ卩え、室温にて 2時間攪拌を行った。反応後、 20mlのイソプロパノールを加え、室温で 30分静置後 、 4000gにて 20分間遠心分離を行った。沈殿を 70%エタノールで洗浄し、 PBS緩 衝液に懸濁し DBA-FITC固定ィ匕ポリエチレンィミン結合二酸ィ匕チタン微粒子の分 散液を作成した。この複合体微粒子の平均分散粒子径は 68. 3nmであった。フルォ レセイン（和光純薬工業社製）を PBS緩衝液で希釈し、励起波長 595nm蛍光波長 6 25nmにて蛍光光度計で測定し、検量線を作成した。分散液の蛍光強度から 600ng Zmlの FITCが結合していることが明らかになった。さらに本分散液を 400°Cに加熱 し、酸ィ匕チタン含量を測定したところ、 1 (wZv) %の濃度であった。 DBA:FITCの 結合比が 1 : 2. 5であることから 2. 5 X 10"7 (DBA-FITC) mol/TiO (g)であること
2
が半 lj明した。
[0068] :光触媒性二酸化チタン複合微粒子を含む分散液の均一性 (透明度)の評価
0. 1Mの塩ィ匕ナトリウムを含む 10mMリン酸緩衝液を用いて、例 B2で得られたスト レプトアビジンを固定ィ匕した光触媒性二酸ィ匕チタン複合微粒子を含む分散液を終濃 度 0. 1%になるように調整し、 1時間室温にて静置した。また、二酸ィ匕チタン微粒子と して P25 (日本ァエロジル）を 0. 1Mの塩化ナトリウムを含む 10mMリン酸緩衝液を用 いて、同様に終濃度 0. 1%になるように調整し、 1時間室温にて静置した。その後、 シャーレに 5ml移し上方カゝら撮影し、確認した。その結果を図 10に示す。 P25水溶 液に対してストレプトアビジンを固定ィ匕した光触媒性二酸ィ匕チタン複合微粒子を含む 分散液は明らかに透明度が高ぐ均一に分散していることが確認された。また、分光 光度計 (UV-1600、島津製作所)を用いて波長 660nmにおける吸光度の測定を行 つた結果、 P25水溶液は吸光度が 1を大きく上回り測定不能であつたのに対して、ス トレブトアビジンを固定ィ匕した光触媒性二酸ィ匕チタン複合微粒子を含む分散液は吸 光度が 0. 044であり、また沈殿の形成は起きていな力つた。更に、これらの溶液を室 温暗所にて 2週間静置した後に、同様に波長 660nmにおける吸光度の測定を行つ た結果、 P25水溶液は吸光度が 1を大きく上回り測定不能であつたのに対して、スト レプトアビジンを固定ィ匕した光触媒性二酸ィ匕チタン複合微粒子を含む分散液は吸光 度が 0. 051であった。このこと力ら、水溶液中においてストレプトアビジンを固定化し た光触媒性二酸化チタン複合微粒子を含む分散液が透明度の高! ヽ、均一な分散性 を示し、かつ安定していることが明らかになった。
週 :光触媒性二酸化チタン複合微粒子を含む分散液の細胞殺傷性の評価 メラノーマ細胞株 T-24を 10%血清を含む F12培地（ギブコネ土製)で 100%コンフ ルェントにになるまで培養し、フラスコを lOOmMリン酸緩衝食塩水（pH7. 4)で 2回 洗浄し、 lOOmMトリプシン-エチレンジァミン三酢酸溶液を lml添カ卩し、 10分静置後 、フラスコ壁面より剥離した細胞を回収し、 9mlの 10%血清を含む F12培地で希釈し た。細胞数を血球計算盤により計測し、 5 X 104個の細胞を含む培地 500 1をそれ ぞれ 24穴マイクロタイタープレートに接種した。そこに、例 B2で得られたストレブトァ ビジンを固定ィ匕した光触媒性二酸ィ匕チタン複合微粒子を含む分散液を lOOmMリン 酸緩衝食塩水 (PH7. 4)で調整し、最終濃度 0%および 0. 01%となるよう 100 1カロ え、ブラックライト (東芝社製）により波長 340nmの紫外光を 2. 5mWZcm2で 0分間 および 60分間照射し、 24時間 COインキュベータ内で培養した。 Cell counting
2
kit-8 (同人化学社製）を試薬のマニュアルに従い調整して加え、 96穴プレート上に て吸光度計 Benchmark (Bio-Rad社製)を用い、波長 450nmの吸光度測定を行つ た。その結果を表 2に示す。 [0070] [表 2]
Figure imgf000028_0001
[0071] ノックグラウンドの値を差し引いた紫外線照射 0分間、ストレプトアビジンを固定化し た光触媒性二酸ィ匕チタン複合微粒子濃度 0%における生細胞由来の吸光度を 1とし て相対生存率を示した。この結果から、ストレプトアビジンを固定ィ匕した光触媒性二 酸化チタン複合微粒子が 0. 01%存在下で紫外線照射 60分間の実験条件における 場合のみ、相対生存率が減少しており、これによりストレプトアビジンを固定ィ匕した光 触媒性二酸化チタン複合微粒子を含む分散液は細胞殺傷性が高いことが確認され

Claims

請求の範囲
[I] 光触媒性二酸化チタンの微粒子と、
該光触媒性二酸ィヒチタン微粒子の表面に修飾されるカチオン性の親水性高分子 と
を含んでなり、前記親水性高分子が前記光触媒性二酸化チタンと結合されてなる、 光触媒性二酸化チタン微粒子。
[2] 前記親水性高分子が、親水性高分子ァミンである、請求項 1に記載の光触媒性二 酸化チタン微粒子。
[3] 前記光触媒性二酸化チタンが、アナターゼ型またはルチル型である、請求項 1また は 2に記載の光触媒性二酸ィ匕チタン微粒子。
[4] 前記光触媒性二酸化チタンの粒径力 2〜200nmである、請求項 1〜3のいずれ か一項に記載の光触媒性二酸ィヒチタン微粒子。
[5] 前記光触媒性二酸ィ匕チタンが、光触媒性二酸ィ匕チタンと磁性材とからなる複合二 酸ィ匕チタンである、請求項 1〜4のいずれか一項に記載の光触媒性二酸ィ匕チタン微 粒子。
[6] 前記親水性高分子が、水溶性高分子である、請求項 1〜5のいずれか一項に記載 の光触媒性二酸ィ匕チタン微粒子。
[7] 前記水溶性高分子が、ポリアミノ酸、ポリペプチド、ポリアミン類、およびァミン単位 を有する共重合体からなる群から選択される、請求項 6に記載の光触媒性二酸化チ タン微粒子。
[8] 前記水溶性高分子が、ポリエチレンィミン、ポリビニルァミン、およびポリアリルアミン 力 なる群力 選択される、請求項 6に記載の光触媒性二酸ィ匕チタン微粒子。
[9] 前記水溶性高分子が、ポリエチレンイミンを含む、請求項 6に記載の光触媒性二酸 化チタン微粒子。
[10] 前記水溶性高分子が、分子中に複数のァミン単位を有する共重合体を含む、請求 項 6に記載の光触媒性二酸ィ匕チタン微粒子。
[II] 前記光触媒性二酸ィ匕チタン微粒子の表面電位が + 20mV以上である、請求項 1〜 10のいずれか一項に記載の光触媒性二酸ィ匕チタン微粒子。
[12] 請求項 1〜11のいずれか一項に記載の光触媒性二酸ィ匕チタン微粒子と、該光触 媒性ニ酸ィ匕チタン微粒子が分散される水系溶媒とを含んでなる、光触媒性二酸ィ匕チ タン微粒子の分散液。
[13] 前記水系溶媒の pHが、 3〜9である、請求項 12に記載の光触媒性二酸ィ匕チタン微 粒子の分散液。
[14] 前記水系溶媒が、 pH緩衝液である、請求項 12または 13に記載の光触媒性二酸 化チタン微粒子の分散液。
[15] 前記水系溶媒の塩濃度が 1M以下である、請求項 12〜 14のいずれか一項に記載 の光触媒性二酸ィ匕チタン微粒子の分散液。
[16] 前記水系溶媒が、生理食塩水である、請求項 15に記載の光触媒性二酸ィ匕チタン 微粒子の分散液。
[17] 前記光触媒性二酸ィ匕チタン微粒子の分散液が、前記光触媒性二酸ィ匕チタン微粒 子を 0. 0001〜0. 1質量％含んでなる、請求項 12〜16のいずれか一項に記載の 光触媒性二酸ィ匕チタン微粒子の分散液。
[18] 請求項 1〜11のいずれか一項に記載の光触媒性二酸ィ匕チタン微粒子の製造方法 であって、
二酸化チタンゾルを溶媒に分散させる第 1工程と、
カチオン性の親水性高分子を溶媒に分散させる第 2工程と、
これらの分散液を混合する第 3工程と、
この混合液を加熱する第 4工程と、
光触媒性二酸化チタン微粒子と未結合親水性高分子とを分離する第 5工程と、 光触媒性二酸化チタン微粒子を精製する第 6工程と
力 なる、方法。
[19] 前記第 1工程および第 2工程の溶媒が、非プロトン系溶媒である、請求項 18に記載 の方法。
[20] 前記非プロトン系溶媒力 ジメチルホルムアミド，ジォキサン、ジメチルスルホキシド いずれかである、請求項 19に記載の方法。
[21] 前記第 4工程の加熱温度が、 80〜220°Cである、請求項 18〜20のいずれか一項 に記載の方法。
[22] 前記第 6工程の精製する工程が、光触媒性二酸化チタン微粒子を水系溶媒に分 散させた後に、有機溶媒沈殿により光触媒性二酸ィ匕チタン微粒子を沈降させる工程 を含む、請求項 18〜21のいずれか一項に記載の方法。
[23] 前記光触媒性二酸化チタン微粒子が、前記親水性高分子のァミンに生体分子が 固定ィ匕されてなる光触媒性二酸ィ匕チタン複合微粒子である、請求項 12〜 17のいず れか一項に記載の分散液。
[24] 前記光触媒性二酸ィ匕チタン微粒子が、少なくとも表面の一部に光触媒性二酸ィ匕チ タンが存在する微粒子である、請求項 23に記載の分散液。
[25] 前記水系溶媒が、生体への導入が許容される水溶液である、請求項 23または 24 に記載の分散液。
[26] 前記光触媒性二酸化チタンが、アナターゼ型である、請求項 23〜25のいずれか 一項に記載の分散液。
[27] 前記生体分子が、アミノ酸、ペプチド、単純タンパク質、および複合タンパク質から なる群力も選択される、請求項 23〜26の 、ずれか一項に記載の分散液。
[28] 前記単純タンパク質が、レクチンである、請求項 27に記載の分散液。
[29] 前記生体分子が、ヌクレオシド、ヌクレオチド、および核酸からなる群から選択される
、請求項 23〜26の 、ずれか一項に記載の分散液。
[30] 前記生体分子が、単糖、糖鎖、多糖、および複合糖質からなる群から選択される、 請求項 23〜26の 、ずれか一項に記載の分散液。
[31] 前記生体分子が、単純脂質、複合脂質、およびリボソームからなる群から選択され る、請求項 23〜26のいずれか一項に記載の分散液。
[32] 前記生体分子の代わりに、前記親水性高分子のァミンに蛍光色素が固定化された
、請求項 23〜26の 、ずれか一項に記載の分散液。
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