CN103040857B - 叶下珠多糖组份在制备抗乙肝病毒的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种叶下珠多糖组份在制备抗乙肝病毒的药物中的应用，属于医药领域。所述叶下珠多糖组份为叶下珠多糖组份PUIPⅡ，由鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖和葡萄糖4个单糖组成，且鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖和葡萄糖的摩尔比为0.11:0.36:0.08:0.45。由药用植物叶下珠经人工提取、分离纯化而成。体外生物活性实验表明，所述叶下珠多糖组份PUIPⅡ具有抑制HepG2.2.2.15细胞培养中HBsAg、HBeAg的分泌和HBV-DNA的复制，具有一定的体外抗HBV活性作用；体内活性实验表明，PUIPⅡ在鸭体内对DHBVDNA有明显抑制作用，且反弹较小，可用于制备抗乙肝病毒的药物和保肝护肝保健品。

Description

叶下珠多糖组份在制备抗乙肝病毒的药物中的应用

技术领域

本发明涉及叶下珠多糖组份在制备抗乙肝病毒的药物中的应用，属于医药领域。

背景技术

乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus，HBV)从发现至今已有四十余年。1963年，Blumberg等发现澳大利亚血友病患者血清中含有一种能与美国血友病患者血清起反应的抗原，称其为澳大利亚抗原（即乙型肝炎病毒表面抗原，Hepatitis B Virus Surface Antigen，HBsAg）。1970年Dane等在乙肝病人血清中发现了42nm大小的HBV颗粒，其外膜成分中含有HBsAg，1986年国际病毒命名委员会正式将HBV归为嗜肝DNA病毒科。

乙型肝炎病毒（HBV）感染是一个世界性的健康问题，呈世界性分布，它不仅可以导致急、慢性HBV感染与75%―90%的原发性肝癌相关。全球慢性HBV感染约有3.5亿人，我国属HBV感染的高流行区。据我国传染病报告和疾病监测统计，乙肝占急性肝炎病例的25%左右，与HBV感染有关的肝病死亡率约23/10万，其中肝癌死亡率约13/10万，乙肝对人类健康危害最为严重，是我国最重要的公共卫生问题之一。由一些数据估计，我国慢性无症状HBV携带者（AsC）超过1.2亿，占全世界HBV感染的1/3，其中慢性乙型肝炎有3000万人，先、现患率约为2770/10万，这些患者10%―30%可发展为肝硬化，一部分可进一步发展为肝癌，累计现行的和既往的，我国已有一半以上人口经受HBV感染，所以慢性乙肝的治疗是亟待解决的问题。

目前临床上用于治疗HBV感染的药物除干扰素（Interferon，IFN）外，还有少数天然药物及众多化学合成药物如核苷类似物阿糖腺苷（adenine arabinside，Ara-A）、拉米夫定（lamivudine）、泛昔洛韦（famciclovir）、阿地福韦（adefovir）、恩他卡韦（ontacavir）等。这些药物已在实验室和临床应用中证实能显著抑制HBV DNA的复制或抑制HBsAg、HBeAg的表达与分泌。然而这些药物却存在一定的不足，干扰素的缺点主要表现在：①价格昂贵；②注射制剂；③对患者的选择有严格的限制性；④明显的不良反应，如发热、血小板减少、暂时性脱发等；⑤在失代偿性肝病患者中应用有一定的风险。核苷类药物的不足表现在：①需要长期治疗；②耐药性病毒变异的发生率高；③停药后发生ALT反跳，甚至发生重症肝炎。上述的种种不足都使得临床应用受到了极大的限制。因此，寻找和开发无污染、低毒副作用、价格低廉、安全有效的抗HBV药物具有十分重要的理论、经济和社会意义。

随着天然植物及其提取物或有效成分抗病毒、抗肿瘤、调节免疫等研究的不断深入，人们发现，天然药物具有对人体低毒副作用，不易产生耐药性等显著特点。针对目前病毒性肝炎治疗中的困难，寻找与证实有效天然药物已经成为临床治疗病毒性肝炎的希望与重要手段。传统中草药品种繁多，已广泛应用于临床治疗慢性乙型肝炎并取得一定疗效，积累了丰富的临床经验，但中草药抗HBV的作用机理还有待于深入研究，所以筛选中草药抗HBV这方面的工作尚有很大的潜力；而且传统中草药不良反应少，价格低，日益受到国内外研究者的普遍重视，寻求有抗病毒作用的天然药物是当前研究的热点。目前国内外对天然药物生物活性与功能的研究已发展为研究与分析天然药物的活性部位、活性成分及至活性成分的结构或构型，以进一步明确药物的作用机理，真正实现“天然药物现代化”这一目标。如美国Holk等在天然植物茜草抗HBV作用的深入研究中，发现其抑制HBsAg、HBeAg表达的具体有效成分为三种奈-氢醌化合物。日本学者Nin等研究证明治疗肝炎的传统药物甘草中起免疫调节作用的成分为一种糖类（甘草甜素）。

发明内容

本发明的目的是提供叶下珠多糖组份在制备抗乙肝病毒的药物中的应用。

本发明首先提供了一种叶下珠多糖组份在制备抗乙肝病毒的药物中的应用。该叶下珠多糖组份将其命名为叶下珠多糖组份PUIPⅡ。

所述叶下珠多糖组份PUIPⅡ由鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖和葡萄糖4个单糖组成，且鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖和葡萄糖的摩尔比为0.11:0.36:0.08:0.45。

本发明还提供了所述叶下珠多糖组份PUIPⅡ在制备保肝护肝保健品中的应用。

本发明所述的叶下珠多糖组份PUIPⅡ的提取分离方法，包括如下步骤：

1）叶下珠全草用蒸馏水洗净，干燥后粉碎，粉碎的叶下珠全草粉末，用石油醚在70～90℃下回流提取2～4次，每次1～3小时，弃去回流液，药渣继续用50～100%乙醇在80～95℃下回流提取2～4次，每次1～3小时，弃去回流液，得到的药渣再用60～95 ℃水浸提3次，每次1～3小时，合并3次浸提液进行离心分离，离心速度2000～6000r/min，取清液浓缩至原体积1/4，加入4倍体积的90～100%乙醇，静置24h，离心，取醇沉物即为粗多糖。

2）除蛋白，采用Sevag法脱蛋白：将步骤1）得到的醇沉物用蒸馏水复溶得粗多糖溶液，在粗多糖溶液中加入氯仿和正丁醇混合液，粗多糖溶液：氯仿和正丁醇混合液体积为1～6：1～3，所述氯仿和正丁醇混合液中氯仿：正丁醇体积比=1～4:1～4，搅拌，充分静置分层，弃去沉淀，重复1～10次后直至界面无白色沉淀。

3）醇沉、洗涤：在除蛋白后的多糖溶液中加入3～6倍体积的75～100%乙醇，静置12～36h，离心，沉淀依次用无水乙醇、丙酮、乙醚清洗，重复2～5次。

4）透析、干燥：取醇沉、洗涤后的多糖加入蒸馏水，充分复溶后用蒸馏水透析，透析在磁力搅拌下进行，样品液与蒸馏水体积比为1:10～30，4～8h换一次水，透析12～120h，透析完毕后将糖溶液放入冷冻干燥机中干燥得叶下珠精总多糖，多糖含量在95%以上。

5）多糖各组分分离纯化：叶下珠精总多糖过DEAE-52阴离子交换树脂柱，用NaCl溶液梯度洗脱，NaCl溶液的浓度梯度分别为0、0.1、0.25、0.5、0.75mol/L。每种浓度NaCl溶液洗脱8小时，流速4mL/min ，用管收集洗脱液，每10min收集一管，绘制洗脱曲线。所述洗脱曲线以收集的管序为横坐标，溶液的光吸收度为纵坐标绘制而成。苯酚－硫酸法跟踪检测，得到的洗脱曲线上依次出现四个洗脱峰，分别代表四个多糖组分，按照出峰的顺序分别记为PULPⅠ、PULPⅡ、PULPⅢ和PULPⅣ，收集第2主峰组分，浓缩，重蒸水透析，冷冻干燥得叶下珠多糖PULPⅡ纯组分。

本发明所述的叶下珠多糖PUIPⅡ，为土黄色粉末，易吸潮，是一类不含有N、S元素酸性多糖，相对平均分子量为579962.6；PULPⅡ单糖组成及其比例为鼠李糖（Rha）: 阿拉伯糖（Ara）: 甘露糖（Man）:葡萄糖（Glc）为0.11:0.36:0.08:0.45；主链由Rha、Ara和Glc组成。各单糖通过呋喃糖苷键连接，糖苷键以1→6连接为主，同时还存在1→4和1→3连接方式。纯度在98%以上，符合生物活性试验要求，样品也可干燥后密封保存备用。

本发明的优点是：1、叶下珠多糖PULPⅡ目前未有报道具有抗乙肝病毒作用，本发明发现叶下珠多糖PULPⅡ能作为抗乙肝病毒药物，此药物其最大优点是天然产物，与现有抗病毒药相比，毒副小，无不良反应，且还有抗氧化、提高机体免疫力等作用，可长期使用；2、与直接使用中草药相比，叶下珠多糖PULPⅡ作为具体化学组分的物质直接作为抗病毒的药效成分，用药量少，无其它非药用组分，因而能减少其它成分可能对肌体的伤害（副作用），临床用药简单；3、叶下珠中草药原料易得，价廉，提取分离工艺简单，生产方便，开发价值高。

附图说明

图1为葡萄糖标准曲线。

图2为多糖梯度洗脱曲线。

图3为HepG2.2.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg的规律。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细说明：

实施例1 叶下珠多糖的提取

1 材料与方法

1.1材料（略）

1.2 实验方法

1.2.1叶下珠预处理

叶下珠全草蒸馏水洗涤去土，50℃低温干燥 后，粉碎，密封备用。其粉末为黄绿色。

1.2.2叶下珠多糖的提取方法

石油醚80 ℃回流脱脂→95%乙醇80 ℃回流脱小分子糖→90 ℃水回流提取3次，合并3次滤液4000r/min离心，浓缩至1/4体积→加入4倍体积的95%乙醇，静置24h，离心，蒸馏水复溶→sevag法除蛋白（氯仿：正丁醇=4:1，多糖溶液：混合液=3:1），磁力搅拌30min，充分静置分层，重复7～8次操作即可除去游离蛋白质→除蛋白后的多糖溶液加入4倍体积的95%乙醇沉淀24h→依次用无水乙醇、丙酮、乙醚清洗、重复三次→透析72h→冷冻干燥得叶下珠总多糖（PULP）。

1.2.3叶下珠总多糖含量的测定

1.2.3.1葡萄糖标准液和样品供试液的制备

精密称取葡萄糖标准品（在105℃下干燥到重量不再发生变化）10mg，用蒸馏水溶解后，置于100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，制成0.1mg/mL的葡萄糖标准液，备用。

精密称取干燥至恒重的叶下珠多糖10mg，用蒸馏水溶解后，置于100mL容量瓶中加蒸馏水定容至刻度，摇匀，制成0.1mg/mL的样品供试液备用。

1.2.3.2吸收波长的确定

取葡萄糖标准液和样品溶液各1 mL，分别加入1mL 5%苯酚溶液（取5g重蒸苯酚于100mL棕色容量瓶中加蒸馏水定容），摇匀后，悬空垂直加入5mL浓硫酸，置沸水浴中加热15min，然后置冷水浴中冷却，在400～600 nm范围内全波长扫描，确定吸收波长。

1.2.3.3葡萄糖标准曲线制作

精密吸取葡萄糖标准液0.2、0.4、0.6、0.8、1mL于10mL具塞刻度试管中，依次添加水使终体积为1mL，空白对照为1mL水，然后加入1mL 5%苯酚溶液摇匀，迅速加入5mL浓硫酸（悬空垂直加入），置沸水浴中加热15min，然后置冷水浴中冷却，于490nm处测定吸光度。以吸光度为Y轴，葡萄糖质量为X轴，绘制标准曲线，并计算回归方程。

1.2.3.4糖含量的计算

精密吸取供试液1mL, 按“1.2.3.3”同法操作，于490nm处测定吸光度。

按照公式计算糖含量：

糖含量=C /（C₀× V）×100%

C：由标准曲线查得的葡萄糖微克数

C₀：样品溶液的浓度（0.1 mg/mL）

V：测定时用的样品溶液体积（1.0mL）

1.2.3.5 多糖的提取率

多糖的提取率=多糖的质量/原材料的质量×100 %

2. 结果与分析

2..1测定波长的确定

样品溶液和葡萄糖标准液的最大吸收峰波长都在490 nm左右处，所以选取490 nm作为多糖含量的测定波长。

2. 2 葡萄糖标准曲线

以吸光度为Y轴，葡萄糖微克数（??g）为X轴，绘制标准曲线，如图1,可以看出在20～100??g范围内，葡萄糖量与吸光度有良好的线性关系。

2.3 糖含量

测得样品液的吸光度A为0.388，根据回归方程计算其相应葡萄糖的微克数为28.27??g。根据公式得糖含量：

糖含量=C /（C₀× V）×100%=28.27/(0.1×1) ×100%=28.27%

2.4 多糖的提取率

多糖的提取率==1.5/100×100 %=1.5%

3 结论

本实验通过石油醚脱脂，再以95%的乙醇脱去低聚糖等小分子物质，然后以水提醇沉法从叶下珠中分离出多糖，并采用sevag法脱蛋白，苯酚－硫酸法测定其含量，其最大吸收波长为490nm，多糖提取率为1.5%，糖含量为28.27%。

实施例2叶下珠多糖的分离纯化

1 材料与方法

1.1 材料（略）

1.2.实验方法

1.2.1 DEAE-52柱分离

1.2.1.1 DEAE-52填料预处理

DEAE-52纤维素填料用蒸馏水浸泡48h，期间4～5h换一次水，并用倾泻法除去悬浮杂质，然后进行碱-酸-碱处理。先用0.5 mol/L的NaOH溶液浸泡30 min后蒸馏水洗至中性，再用0.5 mol/L的 HCl溶液浸泡30 min后蒸馏水洗至中性，最后用0.5 mol/L 的NaOH溶液浸泡30 min后蒸馏水洗至中性，得到OH^-型纤维素。湿法装柱（柱尺寸为500×50mm），蒸馏水平衡48h，装柱过程中避免气泡及断层现象。

1.2.1.2过DEAE-52层析柱分离纯化

称取640mg叶下珠总多糖溶于80mL重蒸水中（8 mg/mL），过0.45μm滤膜后上样。依次用0、0.1、0.25、0.5、0.75mol/L NaCl梯度洗脱，每10min收集一管，流速4mL/min；苯酚-硫酸法跟踪检测，收集各主峰组分，浓缩，重蒸水透析48h，冷冻干燥得叶下珠多糖各组分。

1.2.2. 纯度鉴定

1.2.2.1 SephadexG-200葡聚糖凝胶过滤法

SephadexG-200的预处理：SephadexG-200填料加适量蒸馏水浸泡24h，期间4～5h换一次水，并用倾泻法除去悬浮杂质，然后超声脱气直到凝胶液中没有气泡出现为止。湿法装柱（柱尺寸为500×25mm），用0.05 mol/L的NaCl溶液平衡48 h后备用。

SephadexG-200柱层析：将上面收集的各组分配制成25mg/mL的样品液，上样2mL，用0.05 mol/L的NaCl洗脱。自动部分收集器收集，每管5 mL，每30 min收集一管，苯酚-硫酸法跟踪检测。

1.2.2 2 HPLC高效液相色谱法

将纯化后的各组分多糖配制成1mg/mL的样品液，过0.45 μm的滤膜后进样。

色谱条件：色谱柱：PolySep-SEC 4000 Part No:00H-3144-K0 Column Size:300×7.8mm；

检测器：示差检测器；柱温：30℃；流动相：双蒸水；流速：0.8 mL/min；进样量：20 μL。

2 结果与分析

2.1 DEAE-52柱层析分离结果

经过脱蛋白，透析处理后的叶下珠精多糖（PULP），过DEAE－52离子交换柱，依次用0、0.1、0.25、0.5、0.75mol/L NaCl溶液梯度洗脱，苯酚－硫酸法跟踪检测，得如图2所示中洗脱曲线。由图2可以看出，PULP经DEAE-52柱层析分离后，能够明显分离出四个峰形对称的洗脱峰，分别代表四个组分，记为PULPⅠ、PULPⅡ、PULPⅢ和PULPⅣ。收集含量较大的组分PULPⅡ做进一步分析。

2.2 SephadexG-200柱和HPLC纯度鉴定

2.2.1 SephadexG-200柱结果

取叶下珠多糖组分PULPⅡ过SephadexG-200凝胶柱，NaCl洗脱，苯酚－硫酸法跟踪检测，用吸光度值与洗脱管数作洗脱曲线，PULPⅡ在Sephadex G-200柱上的洗脱曲线是对称的单一峰，说明PULPⅡ组分是分子量相对均一的多糖组分。

2.2.2 HPLC法纯度鉴定

利用HPLC法检测叶下珠多糖组分PULPⅡ的纯度时，结果显示，经DEAE-52纤维素柱分离纯化后的多糖组分PULPⅡ，在高效液相图谱上峰型比较对称，且经过面积归一法计算其纯度达到95%以上，与Sephadex G-200凝胶色谱图结果相吻合，说明纯度比较高，可以用来做结构鉴定。

3 结论

水提醇沉脱蛋白后的叶下珠多糖经过DEAE-52纤维素柱分离纯化后得到四个组分，分别记为PULPⅠ、PULPⅡ、PULPⅢ和PULPⅣ。收集含量较大的组分PULPⅡ，用SephadexG-200凝胶柱层析法和高效液相色谱法（HPLC）两种方法进行纯度鉴定，证明其组分相对均一，可以进一步做结构分析。

实施例3 PULPⅡ的理化性质及结构分析

1、理化性质

PULPⅡ为土黄色粉末，易吸湿。易溶于水，不溶于乙醇、丙酮等有机溶剂。Molish反应、苯酚-硫酸反应、硫酸- 咔唑反应阳性，茚三酮反应、碘-碘化钾反应、斐林反应、三氯化铁反应和硫酸基反应为阴性。

由理化性质，糖醛酸含量测定，元素分析、红外和紫外，HPLC综合分析表明PULPⅡ中是一类不含有N、S元素酸性多糖，相对平均分子量为579962.6。

2、PULPⅡ的红外吸收图谱

红外图谱表明，PULPⅡ在3100～3500 cm^-1，2800～2900 cm^-1，1400～1530 cm^-1，1000～1100 cm^-1处有明显的多糖的特征吸收峰。且PULPⅡ在1010～1100 cm^-1有两个强吸收峰，说明有呋喃型糖苷键存在。

由单糖组成和部分酸水解结果分析，PULPⅡ单糖组成及其比例为Rha:Ara:

Man:Glc为0.11:0.36:0.08:0.45；主链主要由Rha、Ara和Glc组成。

综合高碘酸氧化和Smith降解结果分析，PULPⅡ糖苷键以1→6连接为主，同时还存在1→4和1→3连接方式。

实施例4叶下珠多糖PUIPⅡ的体外抗氧化活性初步研究

1 材料与方法

1.1材料与试剂（略）

1.2 实验方法

1.2.1多糖还原力的测定

实验参考Oyaizu 方法，略做稍微改动。取1 mL不同浓度（1、2、3、4、5mg/mL）的多糖溶液于具塞试管中，然后分别加入2.5 mL 0.2 mol/L pH 6.6 磷酸缓冲溶液及1%铁氰化钾溶液，50 ℃水浴反应20 min 后冰浴迅速冷却，加入2.5 mL 10%的三氯乙酸溶液，摇匀，离心（3000 r/min，10 min）。取上清液2.5 mL，加2.5 mL双蒸水和0.5 mL 0.1% FeCl₃，摇匀，反应10 min后，测定700 nm 处的吸光度。

1.2..2多糖体外羟基自由基（﹒OH）清除率的测定

在Fenton 反应体系中，H₂O₂ 与Fe^{2 +} 混合产生﹒OH。由于﹒OH反应活性强，存活时间很短，加入水杨酸，就能有效地捕捉到﹒OH，并生成在510 nm 处有强吸收的有色物质。同时，若在此体系中加入与水杨酸有竞争作用的能够清除﹒OH的物质，则有色物质的生成量变少，吸光度变低，吸光度越低，证明该物质清除﹒OH的能力越强。

在具塞试管中分别加入2 mL 9 mmol/L 的FeSO₄ 溶液、2 mL 9 mmol/L 的水杨酸乙醇溶液，不同浓度（1、2、3、4、5mg/mL）的多糖溶液，最后加入2 mL 8.8mmol/L 的H₂O₂ 溶液启动反应，室温下反应30 min，测定510 nm 处的吸光度，以蒸馏水代替多糖溶液做空白对照。

自由基清除率计算公式：P=（A₀-A_i）/A₀×100%

A₀：空白吸光度，A_i：样品吸光度

1.2.3抗脂质过氧化能力

吸取0.4 mL卵黄悬液[V（卵黄）:V（PBS）=1:25]，1 mL 不同浓度（1、2、3、4、5mg/mL）的多糖溶液，0.4 mL 25 mmol/L的FeSO₄，于具塞试管中，加入0.1 mol/LpH7.45的PBS溶液至总体积为4.0 mL，37℃水浴恒温振荡15 min。取出后加入1.0 mL 20%的TCA，静置10 min后，离心(3500 r/min,10 min)。吸取4.0 mL上清液，加入2.0 mL 0.8%的硫代巴比妥酸，加塞，沸水浴15 min，冷却后，以PBS做参比，测定532 nm处的吸光值。

样品对卵黄脂蛋白脂质过氧化的抑制率表示样品的抗氧化活性的能力，即：

抑制率I=（A₀-A）/A₀×100%

A₀-对照管的吸光度；A-样品的吸光度

2 结果与分析

2.1 PULPⅡ的还原力

实验结果表明各浓度下的PULPⅡ多糖溶液都具有一定的还原能力，并且在1～5mg/mL的浓度范围内，其还原力随浓度的增高而增强。

2.2 PULPⅡ体外羟基自由基清除率

实验结果表明各浓度下的PULPⅡ多糖溶液对体外羟基自由基都有一定的清除能力，并且在1～5mg/mL的浓度范围内，其清除率随浓度的增高而增强。5mg/mL时，PULPⅡ的清除率为35.5%。

2.3 PULPⅡ抗脂质过氧化能力

实验结果表明各浓度下的PULPⅡ多糖溶液对LPO均具有一定的抑制作用，并且在1～5mg/mL的浓度范围内存在量效关系，其抑制率随浓度的增高而增强。5mg/mL时，PULPⅡ的抑制率为10.7%。

3 结论

叶下珠多糖PULPⅡ具有一定的还原力、清除体外羟基自由基能力和抗脂质过氧化能力，并且随着多糖浓度的增大而增强。在5mg/mL时，PULPⅡ的还原力为0.538，对体外羟基自由的清除率达到35.5%，对LPO的抑制率分别为10.7%。这说明叶下珠多糖具有一定的抗氧化活性并且其抗氧化活性主要表现在清除体外羟基自由基上。

实施例5 叶下珠多糖PUIPⅡ体外抗乙肝病毒研究

本试验采用目前应用最广泛的体外抗乙肝病毒药物筛选模型HepG2.2.2.15细胞模型，从、叶下珠提取分离得到PUIPⅡ与HepG2.2.2.15细胞作用，取其细胞上清液，分别测定其乙肝表面抗原(HBsAg)、e抗原(HBeAg)的滴度变化，来判断该药物是否有效，并采用MTT法测定各部分的细胞毒性。综合这二个指标，对叶下珠多糖PUIPⅡ进行体外抗乙肝药效学试验，并选用临床上已证实的具有抗乙肝病毒作用的阿昔洛韦（ACV）作为阳性对照药物，以评价各部位抗乙肝病毒的效果，以此筛选有效部位或有效成分。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂（略）

1.2实验方法

1.2.1 细胞的复苏

基本步骤： 调配37℃～40℃的温水；从液氮罐中取出HepG2.2.2.15细胞冻存管，立即投入37℃～40℃的温水中快速晃动，直至冻存液完全融解，融解过程在1-2min内完成；将细胞冻存悬液移入离心管，加入约5mL培养液，轻轻吹匀；将细胞悬液800r-1000r/min离心5min，弃上清液；给细胞沉淀加入完全培养液，轻轻吹吸打匀，将细胞悬液移入培养瓶，加足培养液进行培养，置于37℃，5%CO₂细胞培养箱培养。

1.2.2 细胞的传代培养

HepG2.2.2.15细胞置于5%CO₂，37℃培养。培养基为DMEM，添加10%的胎牛血清，3% L-谷氨酰胺1%，G418 200ug/mL，青霉素100u/mL，链霉素 100u/mL。2.2.15细胞长满培养瓶后，先用EDTA消化10-30秒，再用0.25%胰酶37℃消化3-10min，加培养液吹打，1：3或1：4传代，8天长满，采用细胞记数板记数，配制成10⁵个/mL接种细胞培养板，96孔板每孔0.1mL；24孔板每孔1mL，5%CO₂，37℃培养24小时进行实验。

1.2.3 细胞计数方法

一般用血细胞计数板，按白细胞计数法进行计数。

取待稀释的细胞悬液1mL加生理盐水做5倍稀释，用10×10的倍数进行计数，中央为红细胞计数用，四角大格为白细胞计数用，计数时仅统计完整的细胞，若聚成一团的细胞按一个细胞进行计数，在一个方格中，如果有细胞位于线上，一般计上线不计下线，计左线不计右线，计数误差不超过±5%，计数后需计算每mL悬液中的细胞数，由于计数板中的每一方格的面积为0.1cm²，高为0.01cm，体积为0.0001cm³。每mL细胞数按式1计算：

每mL细胞数=(n/4)×10000×5 （1）

式中：n为四大格细胞总数

1.2.4 MTT比色法测细胞存活率

HepG2.2.2.15细胞培养于96孔培养板，每孔80μl培养液；加入20μlMTT，继续培养3-4h；吸去100μl培养液，加入等量0.04-0.1mol/L盐酸异丙醇溶液，室温下约10min（或将平板置于微型震荡器震荡），使结晶物溶解；在酶标仪上测定光吸收，测定波长为570nm。

1.2.5 MTT法测药物毒性

将HepG2.2.2.15细胞按10⁵ 个/mL接种于96孔培养板中，0.1 mL/孔，次日用培养液将待测药物分别配成几种不同的浓度，加入细胞孔，每孔浓度加3孔，0.1mL/孔，并设无药细胞对照及阳性对照药。加药后培养4天，弃上清用MTT染色，每孔加1mg/mL的MTT无血清培养液0.1mL，孵育4小时，弃上清，加入0.04mol/L盐酸异丙醇0.1mL溶解后，用570nm波长比色测定OD值，实验重复3次。

1.2.6 测HBsAg、HBeAg分泌规律

将HepG2.2.2.15细胞10⁵/mL接种于24孔细胞培养板，每孔1.0mL，共10孔，第3、5、8、11、13天收集上清250μl，培养液补足原量至第13天，培养上清于-20℃冻存，最后集中按试剂盒说明书，用ELISA法测定HBsAg、HBeAg。

1.2.7 药物对HBV抑制试验

将HepG2.2.2.15细胞按10⁵/mL接种于24孔板，每孔1.0mL，次日弃培养液，以待测药物的HepG2.2.2.15细胞的半数毒性浓度为起始浓度用培养液进行倍比稀释，另设无药对照及阳性对照药，培养于37℃、5%CO₂培养箱中。每4天收取上清，并换加原浓度药液继续培养，将收集的上清-20℃冻存，于第12天收集完，集中用ELISA法测定HBsAg、HBeAg，实验重复3次。

1.2.8 ELISA法测HBsAg、HBeAg

（1）将试剂盒各组分从盒中取出，平衡至室温（18～25℃）。

（2）浓缩洗涤液配制前充分摇匀如有晶体应充分融解，浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水按1：19稀释后使用。

（3）将微孔板条固定于支架，按序编号。

（4）每孔加入待测标本50μl，设阴、阳对照各2孔，每孔加入阴、阳对照各50μl，并设空白对照一孔；

（5）每孔加入酶标记抗体50μl（除空白对照外）、充分混匀后封板，置于37℃环境中孵育30min；

（6）手工洗板；弃去孔内液体，洗涤液贮满各孔，静置5秒后甩干，重复5次后拍干；

（7）每孔加显色剂A液、B液各50μl，充分混匀，封板，置37℃环境中孵育15min；

（8）每孔加入终止液50μl，混匀；

（9）用酶标仪读数，取波长450nm，先用空白空校零。然后读取各孔OD值。（阴性对照OD值低于0.05作为0.05计算，高于0.05按实际OD值计算。）

1.3 数据分析

1.3.1 MTT法测药物毒性后可得：

1.3.2 采用ELISA法，显色反应完成后用自动酶标仪读取OD值，计算抑制率，以抑制率大于50%为有抑制作用。根据测定数据计算药物抑制抗原百分率；药物抑制抗原半数有效浓度IC₅₀，即HBsAg和HBeAg抑制率为50%时的药物浓度；选择治疗指数TI,TI大于1以上者为有效，在1～2之间说明药物有效，但有一定毒性；大于2则效果较好，毒性较小；指数越大，则疗效越好，安全范围越大。统计学处理，采用t检验作组间均数比较，数据统计分析由SPSS11.5软件处理，P<0.05表示差异有显著性。

2 结果分析

2.1 HepG2.2.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg的规律

在试验方法所述的培养条件下，本试验所用的HepG2.2.2.15细胞于第3天开始测到有HBsAg、HBeAg分泌，在第8天达到高峰，以后逐渐减弱，持续到第13天，HBsAg、HBeAg分泌的规律如图3所示。

2.2 阳性药物（ACV）的体外抗乙肝病毒试验结果

2.2.1 阳性药物（ACV）对HepG2.2.2.15细胞的毒性

不同浓度ACV处理培养后，MTT试验结果显示对HepG2.2.2.15细胞生长有抑制作用，且其作用具有一定的浓度依赖性，浓度越大，抑制作用越明显。在浓度为0.3125mg/mL时的细胞抑制率为3.51%，此浓度下的细胞存活率为96.49%(>95%)，由此可知ACV的TC₀为0.3125mg/mL。根据公式（3）可得TC₅₀为4.56 mg/mL。ACV的细胞毒性测定结果见表2-1。

表2-1 ACV在HepG2.2.2.15细胞培养中的毒性

2.2.2 阳性药物（ACV）抑制HepG2.2.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg的作用

不同浓度ACV处理培养4天和8天后收集细胞上清液，ELISA法测HBsAg、HBeAg水平显示ACV对HBsAg、HBeAg均有抑制作用，且随着ACV浓度的增加，其抑制作用增强，抑制率增加，显示出一定的量效关系。并且随着培养时间的推移抑制作用也逐渐增强。不同浓度ACV在HepG2.2.2.15细胞培养中对HBsAg、HBeAg的抑制作用结果见表2-2和2-3

表2-2 ACV在HepG2.2.2.15细胞培养中对HBsAg的抑制作用

表2-3 ACV在HepG2.2.2.15细胞培养中对HBeAg的抑制作用

2.2.3 阳性药物（ACV）体外抗乙肝病的治疗指数（TI）

根据公式（5），我们可以得到ACV在第8天抑制HepG2.2.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg的时的IC₅₀分别为0.58mg/mL 和0.49mg/mL。根据公式（6）可以得到ACV对HBsAg、HBeAg的治疗指数TI分别为7.86和9.31。具体结果见表2-4。

表2-4 ACV在HepG2.2.2.15细胞培养中对HBsAg和HBeAg的IC₅₀和TI

2.3 叶下珠多糖PUIPⅡ的体外抗乙肝病毒作用

2.3.1 叶下珠多糖PUIPⅡ对HepG2.2.2.15细胞的毒性

不同浓度叶下珠多糖PUIPⅡ处理组培养后，MTT试验结果显示对HepG2.2.2.15细胞生长有抑制作用，且其作用具有一定的浓度依赖性，浓度越大，抑制作用越明显。在浓度为0.156mg/mL时的细胞抑制率为5.76%，此浓度下的细胞存活率为94.24%(≈95%)，由此可知叶下珠多糖PUIPⅡ的TC₀<0.156mg/mL。在试验浓度范围内最大抑制率<50%,故只能推算TC₅₀>10mg/mL。叶下珠多糖PUIPⅡ的细胞毒性测定结果见表2-5。

表2-5 叶下珠多糖PUIPⅡ在HepG2.2.2.15细胞培养中的毒性

2.3.2 叶下珠多糖PUIPⅡ抑制HepG2.2.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg的作用

不同浓度叶下珠多糖PUIPⅡ处理培养4天和8天后收集细胞上清液，ELISA法测HBsAg、HBeAg水平显示叶下珠多糖PUIPⅡ对HBsAg、HBeAg均有抑制作用，且随着叶下珠多糖PUIPⅡ浓度的增加，其抑制作用增强，抑制率增加，显示出一定的量效关系。并且随着培养时间的推移抑制作用也逐渐增强。不同浓度叶下珠多糖PUIPⅡ在HepG2.2.2.15细胞培养中对HBsAg、HBeAg的抑制作用结果见表2-6和2-7

表2-6 叶下珠多糖PUIPⅡ在HepG2.2.2.15细胞培养中对HBsAg的抑制作用

表2-7 叶下珠多糖PUIPⅡ在HepG2.2.2.15细胞培养中对HBeAg的抑制作用

2.3.3 叶下珠多糖PUIPⅡ体外抗乙肝病的治疗指数（TI）

根据公式（5），我们可以得到叶下珠多糖PUIPⅢ在第8天抑制HepG2.2.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg的时的IC₅₀分别为1.59mg/mL 和0.49mg/mL。根据公式（6）可以得到叶下珠多糖PUIPⅢ对HBsAg、HBeAg的治疗指数TI分别>6.29为和>20.41。具体结果见表2-8。

表2-8 叶下珠多糖PUIPⅡ在HepG2.2.2.15细胞培养中对HBsAg和HBeAg的IC₅₀和TI

3 讨论

本试验采用了MTT法进行细胞毒性检测，结果显示叶下珠多糖PUIPⅡHepG2.2.2.15细胞的最大无毒浓度(TC₀) <0.156 mg/mL；半数有毒浓度(TC₅₀) >10 mg/mL。

本试验采用ELISA技术分析了叶下珠多糖PUIPⅡ在HepG2.2.2.15细胞培养中对HBsAg、HBeAg的抑制作用，结果显示叶下珠多糖PUIPⅡ在无毒浓度下设定的7个浓度中，除最低浓度外，其它各浓度组与细胞对照组相比均显示明显的抑制作用，且随着叶下珠多糖PUIPⅡ浓度的增加，其抑制作用增强，抑制率增加，显示出一定的量效关系。目前临床上用于评价药物的治疗效果指标为治疗指数(TI)，当TI<1时为药物无效，当1<TI<2时药物低效有毒，当TI>2时药物有效低毒。由此可知，叶下珠多糖PUIPⅡ对HBsAg、HBeAg的治疗指数有效低毒(TI分别为≥6.29和20.41)；阳性对照药物阿昔洛韦对HBsAg、HBeAg的治疗指数有效低毒(TI分别为7.86和9.31)。

综上所述，叶下珠多糖Ⅱ在HepG2.2.2.15细胞培养中对HBsAg、HBeAg均有一定的抑制作用。

实施例6 叶下珠多糖PUIPⅡ的体内抗病毒作用

——叶下珠多糖PUIPⅡ的抗鸭乙型肝炎病毒作用

鸭乙型肝炎病毒 (DHBV) 与人乙型肝炎病毒(HBV)同属嗜肝DNA 病毒科，两者的病毒大分子结构与复制有很多相似之处。先天感染DHBV 的鸭因其病毒血症持续时间较长且较稳定 ,无明显的自然 转阴现象 ，是研究人类乙型肝炎发病机制、病毒复制过程及筛选有效治疗药物的理想动物模型。

叶下珠多糖PUIPⅡ是由鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖和葡萄糖4个单糖组成，鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖和葡萄糖的摩尔比为0.11:0.36:0.08:0.45，分子量为579962.6。由药用植物叶下珠经人工提取、分离纯化而成。具有抑制HepG2.2.15细胞培养中HBsAg、HBeAg的分泌和HBV-DNA的复制，具有一定的体外抗HBV活性和抗氧化等作用。我们采用先天感染鸭乙型肝炎病毒（duck Hepatitis Bvirus,DHBV）的龙岩麻鸭为模型，以实验室提取分离的叶下珠多糖PUIPⅡ为实验药物，研究了其体内抗乙肝病毒的作用。

1 　材料（略）

2 　方法

2.1 　动物筛选与分组 　1 日龄龙岩麻鸭购回后适应性喂养2 d ,于 4 日龄胫静脉取血 ,离心 ,收集血清 ,斑点杂交法检测DHBV DNA，第13 天出结果，筛选出先天自然感染鸭。将DHBV DNA阳性鸭随机分为3 组：模型对照组、拉米呋啶组和多糖组，每组10只。

2.2 　给药方法 　PUIPⅡ组和拉米呋啶组每天按 50 mg·kg^{- 1} 剂量口服给药，给药体积为 1 mL/次，模型组以生理盐水代替。开始给药时鸭体重115～125 g/只。每5 d称体重1 次，按体重调整给药量，连续给药 10 d。血样采集为13 日龄用药前(T₀) 、用药第5 天(T₅)、用药第10 天(T₁₀)及停药后第3 天(P₃ ) ，自鸭胫静脉取血，分离血清，- 70 ℃冻存待检。

2. 3　鸭血清 DHBV DNA 的检测 　采用 DHBV DNA Dot Blot 法测定^[5] 。取上述鸭血清，每批同时点膜 ,测定鸭血清中 DHBV DNA 水平 ,观察其动态变化。按缺口翻译试剂盒说明书方法,用³²P 标记 DHBV DNA探针，将40μL 血清点于硝酸纤维膜上，然后杂交，放射自显影，在酶标检测仪上测定 OD 值(滤光片波长为490 nm)，计算血清DHBV DNA密度。

2.4　统计学处理 　用 PEMS 3.1对实验数据进行多因素方差分析及 Ridit 分析。

3 　结果

3.1　 PUIPⅡ对鸭血清 DHBV DNA 的抑制作用 　各组用药后不同时间点光密度值与同组给药前光密度值的比较，结果见表3-1。PUIPⅡ组在给药后第 5 天，鸭血清DHBV DNA水平开始下降，第 10 天继续下降，与To 值比较，差异非常显著( P < 0.01) 。拉米呋啶组在给药后第 5 天鸭血清 DHBV DNA 水平明显下降，与给药前自身比较，差异非常显著( P<0.01) 。

表3-1 　 PUIPⅡ对DHBVDNA的抑制作用(x ±s ,n =10)

注：药物组给药不同时间与给药前(T₀) 比较¹⁾P < 0.05， ²⁾P < 0.01；与模型组相同时间比较³⁾P<0.05 ， ⁴⁾P<0.01

实验结果显示，阳性药物拉米呋啶灌胃 50 mg·kg^-1 ·d^-1 ,连续10 d给药，可显著抑制血清DHBV DNA ，停药 3 d(P₃)DHBV DNA 显著回升，与临床结果相吻合，说明本次实验的有效性。受试药物PUIPⅡ 10 d疗程各时点血清DHBV DNA变化差异也有显著性意义( P <0.01)，停药3 d(P3)DHBV DNA基本不变，提示PUIPⅡ在鸭体内对 DHBV DNA 有明显抑制作用，且反弹较小。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (1)

1. 一种叶下珠多糖作为唯一活性成分在制备抗乙肝病毒的药物中的应用，其特征在于：所述叶下珠多糖为叶下珠多糖组份PUIPⅡ；

所述叶下珠多糖组份PUIPⅡ由鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖和葡萄糖4个单糖组成，且鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖和葡萄糖的摩尔比为0.11:0.36:0.08:0.45；

所述的叶下珠多糖组份PUIPⅡ的提取分离方法，包括如下步骤：

1）叶下珠全草用蒸馏水洗净，干燥后粉碎，粉碎的叶下珠全草粉末，用石油醚在70～90℃下回流提取2～4次，每次1～3小时，弃去回流液，药渣继续用50～100%乙醇在80～95℃下回流提取2～4次，每次1～3小时，弃去回流液，得到的药渣再用60～95 ℃水浸提3次，每次1～3小时，合并3次浸提液进行离心分离，离心速度2000～6000r/min，取清液浓缩至原体积1/4，加入4倍体积的90～100%乙醇，静置24h，离心，取醇沉物即为粗多糖；

2）除蛋白，采用Sevag法脱蛋白：将步骤1）得到的醇沉物用蒸馏水复溶得粗多糖溶液，在粗多糖溶液中加入氯仿和正丁醇混合液，粗多糖溶液：氯仿和正丁醇混合液体积为1～6：1～3，所述氯仿和正丁醇混合液中氯仿：正丁醇体积比=1～4:1～4，搅拌，充分静置分层，弃去沉淀，重复1～10次后直至界面无白色沉淀；

3）醇沉、洗涤：在除蛋白后的多糖溶液中加入3～6倍体积的75～100%乙醇，静置12～36h，离心，沉淀依次用无水乙醇、丙酮、乙醚清洗，重复2～5次；

4）透析、干燥：取醇沉、洗涤后的多糖加入蒸馏水，充分复溶后用蒸馏水透析，透析在磁力搅拌下进行，样品液与蒸馏水体积比为1:10～30，4～8h换一次水，透析12～120h，透析完毕后将糖溶液放入冷冻干燥机中干燥得叶下珠精总多糖，多糖含量在95%以上；

5）多糖各组分分离纯化：叶下珠精总多糖过DEAE-52阴离子交换树脂柱，用NaCl溶液梯度洗脱，NaCl溶液的浓度梯度分别为0、0.1、0.25、0.5、0.75mol/L；每种浓度NaCl溶液洗脱8小时，流速4mL/min，用管收集洗脱液，每10min收集一管，绘制洗脱曲线；所述洗脱曲线以收集的管序为横坐标，溶液的光吸收度为纵坐标绘制而成；苯酚－硫酸法跟踪检测，得到的洗脱曲线上依次出现四个洗脱峰，分别代表四个多糖组分，按照出峰的顺序分别记为PUIPⅠ、PUIPⅡ、PUIPⅢ和PUIPⅣ，收集第2主峰组分，浓缩，重蒸水透析，冷冻干燥得叶下珠多糖PUIPⅡ纯组分。