KR100729172B1 - 담자균 배양물 유래의 신규물질, 그의 제조방법 및 용도 - Google Patents

담자균 배양물 유래의 신규물질, 그의 제조방법 및 용도 Download PDF

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Abstract

이소플라본류를 함유하는 재료가 존재하는 배지중에 β-글리코시다제 활성을 지닌 담자균을 배양시켜 얻어지는 이소플라본류 아글리콘과 담자균 배양생성물로부터 된 아글리콘의 생리활성과 담자균의 생리활성보다 상승적으로 강화된 신규한 물질 그의 제조방법 그 물질을 함유하는 식품 사료 및 약재.
본 발명의 물질은 이소플라본류 아글리콘이 지니는 생리활성 작용과 담자균 배양 생성물이 지니는 생리활성 작용보다 증강된 것으로 항종양제와 골다공증 치료 및/또는 예방제, 면역부활제로서 유용한 것이다.

이소플라본류, 아글리콘, 담자균, 항종양제

Description

담자균 배양물 유래의 신규물질, 그의 제조방법 및 용도{Novel substance originating in basidiomycete culture, process for producing the same and use thereof}
본 발명은 항종양 작용등의 생리활성을 지닌 물질에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 대두등의 이소플라본 류의 아글리콘의 생리활성 및 담자균(basidomycete) 배양물의 생리활성 보다 증강된 신규한 물질, 그 제조방법 및 그 물질의 용도를 지니는 건강식품 조성물, 동물용이거나 수산양식용 사료조성물 및 항종양제에 관한 것이다.
대두 등의 대두 가공물의 섭취가 발암의 리스크를 경감시키고, 원발성을 지닌 화학물질 등에 의해 유도되는 암을 방어한다는 것이 보고되고 있다. 이 작용은 대두에 포함된 이소플라본에 의한 것이다. 대두 이소플라본은 여성호르몬과 같은 효과를 지니고, 유방암, 대장암, 전립선암 등의 암, 심혈관질환, 뇌기능, 골다공증, 알코올중독증, 갱년기장애, 고지혈증 등에 대해 폭넓게 방어적인 생리활성작용을 지니는 것이 명백히 인정되고 있다.
대두 이소플라본은 제니스틴(genistin), 다이진(daidzin), 글리시틴(glycitin) 등이 알려지고 있다. 이들은 제니스테인(genistein), 다이제인(daidzein), 글리시테인(glycitein)을 아글리콘(aglycone)으로 지니는 글루코즈 배당체이다. 대두 이소플라본은 대두 종자 중에 글루코즈 배당체 또는 이의 유도체 형태로 존재하고 있다.
대두 이소플라본의 생리활성 작용은 주로 그 아글리콘에 의한 것으로 글루코즈 배당체의 형태는 그 생리활성에 그다지 중요하지 않다. 이것은 배당체가 그 형태로 소장에서 흡수되는 것이 어렵기 때문이다.
대두 이소플라본 배당체를 분해하여 이 아글리콘을 얻는 방법이 개시되어 있다. 예를 들면, 대두 중의 β-글루코시다제의 작용으로 이소플라본 배당체를 아글리콘으로 전환시키는 방법(특개평 1-258669호), 장유백 또는 장유유 중에 생성된 이소플라본 아글리콘을 추출하는 방법(특개평 5-170756호), 대두 단백에 아스퍼르질러스균을 작용시켜 아글리콘을 포함하는 이소플라본 화합물을 얻는 방법(특개평 8-214787호), 식물단백을 추출후 β-글리코시다제 또는 에스테라제에 의해 아글리콘화 시키는 방법(특표평 9-503781호 미국특허 제5,763,389호), 대두 하이포코틸에 미생물 유래의 효소를 작용시켜 함유된 이소플라본 화합물을 아글리콘화 시키는 방법(특개평 11-89589호) 등이 있다.
아글리콘중에서도 특히 제니스테인은 티록신키나제 저해, DNA 토포이소머라제 저해, 혈관신생억제 등의 생리활성을 나타내고 있다. 그러나 혈관신생억제 효과등의 생리활성효과를 얻기 위해서는 혈장 중에 고농도의 제니스테인이 필요하다. 그러나, 장관으로부터 흡수되기 어려운 배당체인 제니스틴의 섭취만으로는 제니스테인 필요량을 충족시키는 것은 곤란하기 때문에 충분한 생리활성 효과를 얻기 위해서는 아글리콘인 제니스테인의 형태로 필요량을 섭취하지 않을 수 없다.
한편, 담자균 예를 들면, 렌티너스 에도데스 또는 가노더마 어플라나텀 등의 균사체 배양물은 면역 부활작용과 항종양 작용 등의 생리활성 작용을 지니는 것으로 알려지고 있다.
이러한 항암제는 최근에 종양신생혈관저해작용을 하는 물질을 병용하는 경우가 많다. 이것은 동일한 치료 표적에 대해 작용기전이 다른 물질을 병용하는 것에 의해 높은 치료효과를 얻을 수 있기 때문이다.
종양신생혈관저해작용을 지니는 물질로서는 예를 들면, 뮤코 다당체의 혼합물인 상어연골을 원료로 한 것, 안지오스타틴 등이 알려져 있고, 그의 일부는 실제로 사용되고 있다.
종양신생혈관저해작용은 대개는 종양이 스스로 증식에 필요한 영향과 효소를 제공하기 위해서는 자기 스스로 혈관신생 촉진물질을 생성시켜 혈관을 새로이 생성하여 증식하는 것을 억제 저해하는 작용을 말한다. 종양신생혈관저해물질은 이러한 종양세포의 혈관신생을 방지하기 위해 비대화를 억제 저해하는 물질로서 이의 투여에 의해 종양을 축소하는 것이 가능하고 암치료에 유용한 것이다.
종양신생혈관저해물질은 경구섭취와 정맥주사에 의해 그 효과를 얻을 수 있는 바, 현재에는 경구로 섭취할 수 있는 물질은 매우 적고, 정맥주사는 환자의 부담이 큰 문제가 있다.
경구섭취에 사용되는 것으로는 상기 상어연골을 들 수 있으나, 종양신생혈관저해효과를 얻기 위해서는 1일 약 20g 이상의 대량섭취가 필요하고, 그 냄새가 불쾌하여 섭취하기가 어려운 문제가 있다. 이러한 불쾌한 냄새를 억제하고 또한, 강산성의 위속에서 용해되는 것을 막고, 장내까지 도달시키고 이 곳에서 용해흡수 되는 성질을 부여할 목적으로, 상어연골을 분취시켜 미분말 상태로 하고 미분말을 특히 유지류나 당류등으로 코팅시키는 등의 번잡한 처리가 행해지고 있다.
한편, 안지오스타틴은 아직 실용화 되지 않고 있는 바, 따라서, 경구투여가 가능하고 안전성이 우수한 종양신생혈관저해물질이 요구되고 있다.
본 발명의 과제는 상기 종래 기술의 문제점을 해결하고 담자균 배양물의 항종양작용 등의 생리활성 작용을 보강시키고, 대두 등의 이소플라본 류의 아글리콘의 생리활성을 활용시킨 신규한 물질을 제공하는 것이다.
특히, 본 발명의 과제는 상기 신규한 물질의 제조방법 및 이 물질의 용도로서 건강식품, 동물용 또는 수산양식용 사료 및 항종양제를 제공하는 것이다.
상기 과제에 의해 검토한 결과 본 발명자들은 대두 종자와 그 가공제품등의 이소플라본류를 함유하는 재료(이소플라본류 함유재료)의 존재하에서 담자균을 배양시키고, 담자균이 생산하는 β-글리코시다제의 작용에 의해 글루코즈 배당체의 이소플라본(제니스틴 등)을 글루코즈와 아글리콘(제니스테인 등)으로 분해시키고, 담자균의 배양에 의해 생산되는 물질과 함께 아글리콘 배양액 중에 축적시켜 신규한 물질이 생성됨을 인지하였으며, 이 물질의 생리활성이 이소플라본 류의 아글리콘의 생리활성과 담자균 배양물의 생리활성의 단독 또는 혼합한 경우보다도 증강된 생리활성을 지님을 발견하고, 본 발명을 완성한 것이다.
즉, 본 발명은 이하의 생리활성 작용물질, 그 제조방법, 및 그 물질을 이용한 건강식품 조성물, 동물용 또는 수산양식용 사료 조성물 및 항종양제에 관한 것 이다.
1) 이소플라본류를 함유하는 재료가 존재하는 배지중에서 β-글리코시다제활성을 지닌 담자균을 배양하여 얻어지며, 이소플라본류의 아글리콘 및 담자균의 배양생성물을 포함한 생리활성 작용을 지니는 물질
2) 이소플라본류를 함유하는 재료 및 β-글리코시다제가 존재하는 배지중에서 β-글리코시다제 활성을 지닌 담자균을 배양시켜 얻어지며, 이소플라본류의 아글리콘과 담자균의 배양생성물을 포함한 생리활성 작용을 지니는 물질
3) 이소플라본류의 아글리콘 생리활성 및 담자균의 배양 생성물의 생리활성보다 상승적으로 증가된 있는 상기 1 또는 2에 기재된 물질
4) 이소플라본류의 아글리콘이 제니스테인임을 특징으로 하는 상기 1 내지 3 중 어느 하나에 기재된 물질
5) 생리활성 작용이 항종양 작용을 지닌 상기 1 내지 4 중 어느 하나에 기재된 물질
6) 항종양작용이 종양신생혈관저해작용인 상기 5에 기재된 물질
7) 항종양작용이 종양세포증식억제작용인 상기 5에 기재된 물질
8) 종양세포증식억제작용이 종양세포의 세포사멸 유도작용인 상기 7에 기재된 물질
9) 이소플라본류를 함유하는 재료가 대두종자, 대두종자 유래의 가공제품 또는 애로우뿌리(arrowroot)인 상기 1 내지 4 중 어느 하나에 기재된 물질
10) β-글리코시다제 활성을 지니는 담자균이 영지균(Ganoderma lucidum) 또는 렌티너스 에도데스(Lentinus edodes)인 상기 1 또는 2에 기재된 물질
11) 이소플라본류를 함유하는 재료가 존재하는 배지 중에서 β-글리코시다제 활성을 지니는 담자균을 배양시키고, 이소플라본류의 아글리콘 및 담자균 배양생성물을 함유하는 성분을 취득하는 것을 특징으로 하는 생리활성 작용을 지닌 물질의 제조방법
12) 먼저 담자균을 배양시키고 β-글리코시다제 활성을 높인 후에 이소플라본류를 함유하는 재료를 배지에 투입시켜 배양하고, 이소플라본류의 아글리콘 및 담자균의 배양생성물을 함유하는 성분을 취득하는 상기 11 기재의 생리활성 작용을 지니는 물질의 제조방법
13) 이소플라본류를 함유하는 재료 및 β-글리코시다제가 존재하는 배지중에서 담자균을 배양하고, 이소플라본류의 아글리콘 및 담자균 배양생성물을 함유하는 성분을 취득하는 것을 특징으로 하는 생리활성 작용을 지니는 물질의 제조방법
14) 이소플라본류의 아글리콘이 제니스테인인 상기 11 내지 13 중 어느 하나 기재의 생리활성 작용을 지니는 물질의 제조방법
15) 생리활성 작용이 항종양작용인 상기 11 내지 14 중 어느 하나 기재의 생리활성 작용을 지니는 물질의 제조방법
16) 항종양작용이 종양신생혈관저해작용인 상기 15 기재의 제조방법
17) 항종양작용이 종양세포증식억제작용인 상기 15 기재의 제조방법
18) 종양세포증식억제작용이 종양세포의 세포사멸 유도작용인 상기 17 기재 의 제조방법
19) 이소플라본류를 함유하는 재료가 대두종자, 대두종자 유래의 가공제품 또는 애로우뿌리(arrowroot)인 상기 11 또는 12에 기재의 제조방법
20) β-글리코시다제 활성을 지니는 담자균이 영지균 또는 렌티너스 에도데스(Lentinus edodes)인 상기 11 또는 13에 기재의 제조방법
21) 상기 1 내지 10에 어느 하나에 기재의 생리활성 작용을 지니는 물질을 함유하는 건강식품
22) 상기 1 내지 10에 어느 하나에 기재의 생리활성 작용을 지니는 물질을 유효성분으로 하는 사료조성물
23) 상기 1 내지 10에 어느 하나에 기재의 생리활성 작용을 지니는 물질을 유효성분으로 하는 항종양제
[본 발명 화합물의 제조방법]
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 생리활성작용을 지니는 물질은 대표예로서 이하 방법에 의해 얻어질 수 있다.
즉, 말트(malt)엑기스, 효모엑기스, 셀룰로오스, 주석산 암모니움 등의 성분으로 된 배지에 담자균을 식균시키고, 일정조건하에서 배양하여 β-글리코시다제등 을 포함하는 각종 효소를 생성시켜 효소활성이 증가되는 단계에서, 대두 종자 및 그 가공품 등의 이소플라본 함유재료를 투입시키고, β-글리코시다제 활성이 높아지도록 온도, pH 조건하에서 교반 통기배양을 계속하여 이소플라본 배당체를 실질적으로 전부가 아글리콘으로 변환시킨 후, 배양계 전체를 가열시켜 계내의 효소를 실활시켜 효소반응을 정지시키고, 특히 필요에 의해 동결건조 등의 수단에 의한 건조 분말화 시켜 본 발명의 물질을 수득할 수 있다.
본 발명에 있어서 사용하는 이소플라본류 함유재료로서는 대두종자, 탈지대두 이들의 적정한 조직의 일부(표피, 배유, 하이퍼코틸 등)를 사용하고, 그것을 물, 알코올 또는 그들의 혼합물과 같은 추출물로서 사용할 수도 있다. 구체예로서는 두유를 포함할 수 있고, 대두종자 등으로부터 적절한 수단으로 분리시킨 이소플라본류 등도 바람직하게 사용할 수 있다.
한편, 본 발명에 있어서 「이소플라본류」는 글루코즈 배당체로서 이소플라본을 지니는 것으로 말로닐제니스틴, 아세틸제니스틴과 같은 글루코즈 배당체 유도체 및 글루코즈 배당체의 구성성분으로 아글리콘을 함유한 것을 뜻하고 이러한 물질을 함유하는 재료는 「이소플라본류 함유재료」로 한다.
본 발명에 있어서 이소플라본 함유재료로서는 대두, 탈지대두등으로부터 제조된 가공품, 예를 들면, 미증, 장유, 납두 등의 가공품등도 여기에서 이소플라본 류가 함유된 이소플라본류 함유재료로서 사용할 수 있다.
더욱이 이소플라본류를 함유하는 대두이외의 식물, 예를 들면, 푸에라리아 썬베르기아나(Pueraria Thunbergiana), 레드클로버, 알팔파(alfalfa), 라티너스 우고엔시스(lathyrus ugoensis), 홀란드 아마란스(Holland Amaranth) 및 게니스타(Genista)등과 같은 콩과식물 또는 이러한 이소플라본류를 함유하는 식물조직을 물, 알코올 등에 의해 추출된 추출액등도 이소플라본류 함유재료로서 사용할 수 있다. 특히 제니스테인이 풍부하게 함유되어 있는 애로우뿌리가 바람직하게 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서 β-글리코시다제 활성을 지니는 담자균으로서는 예를 들면, 다음의 열거한 것등을 들 수 있다.
렌티너스 에도데스(Lentinus edodes), 영지(Ganoderma lucidum), 그리폴라 프론도사(Grifola frondosa), 가노더마 아플라나텀(Ganoderma applanatum), 플루로터스 오스트레아투스(Pleurotus ostreatus), 플람물리나 벨루티페스(Flammulina velutipes), 폴리오타 나메코(Pholiota nameko), 코리오러스 베르시콜라(Coriolus versicolor), 오리쿨라리아 오리쿨라(Auricularia auricula), 쉬죠필럼 콤뮤네(Schizophyllum commune), 그리포라 움벨라타(Grifora umbellata), 볼바리엘라 볼바세아(Volvariella volvacea), 아가리커스 비스포러스(Agaricus bisporus), 알바트렐러스 콘플루엔스(Albatrellus confluens), 트리코로마 기간테움(Tricholoma giganteum)
본 발명에 있어서는 상기 담자균을 이소플라본류를 함유하는 재료존재하에서 배양한다.
배지에는 상기 이소플라본류를 함유하는 재료와 그밖의 각종 탄소원과 질소원이 첨가되어 있는 것이 바람직하다. 탄소원의 예로서는 글루코즈, 설탕, 말토오즈, 사카로오즈, 상백당, 흑당, 당밀, 블랙스트랩당밀, 말트엑기스 등을 들 수 있다.
질소원의 예로서는 고기엑기스, 펩톤, 글루텐밀, 대두분, 건조효모, 효모엑기스, 황산암모니움, 주석산암모니움염, 요소 등을 들 수 있다.
기타 필요에 의하여 나트륨염, 마그네슘염, 망간염, 철염, 칼슘염, 인산염 등의 무기염류와 이노시톨, 비타민B1 염산염, L-아스파라긴, 비오틴 등의 비타민류를 첨가하는 것이 바람직하다.
배양은 통상의 중온균의 배양에 준하여 실시하는 것이 바람직하고, pH 2 ~ 6, 10 ~ 45℃ 바람직하게는 15 ~ 30℃의 온도에서 교반시켜 통기배양을 행한다. 배양은 이소플라본 배당체가 실질적으로 전부 아글리콘으로 변환할 때까지 계속되는 것이 바람직하다. 배양시간은 균의 양과 이소플라본 함유재료의 형태에 따라 통상 4 ~ 20일간 바람직하게는 6 ~ 12일간 정도이다.
배양종료후, 배양계 전체를 가열시킨 계내의 효소를 실활시켜 효소반응을 정지시킨다. 본 발명의 생리활성을 지니는 물질은 배양액과 균사체와의 혼합물을 농축건조시킨 후 분취한 것에 의해 분말상으로 얻어진다. 동결건조법을 채용하여 건조시킨 후 미분쇄하는 것인 바람직하다.
본 발명에 있어서는 상기의 담자균과 함께 β-글리코시다제 효소제를 병용하여 담자균의 효소활성을 증강하는 것도 가능하다.
이 목적에 사용하는 효소제로서는 아스피러질러스속, 바실러스속, 리조퍼스속 등의 미생물유래 효소제제, 즉, 대두 아몬드 등의 식물을 기원으로 한 효소제제를 열거할 수 있다. 대두 아몬드 등의 경우에는 이 종자의 분취물을 사용하는 것이 바람직하다.
이소플라본류 함유재료의 담자균배지에 대한 첨가비율은 이소플라본 배당체의 아글리콘과 당과의 변환량(제니스틴의 제니스테인에의 변환량)이 크게 영향을 미친다.
예를 들면, 대두 이소플라본제제(이소플라본 40% 함유)를 렌티너스 에도데스(Lentinus edodes)와 함께 말트엑기스, 효모엑기스 등을 함유하는 배지에 배양하는 경우 제니스테인으로 대부분 변환되는 대두제제의 배지에 적절한 첨가농도는 3 ~ 10%이고 바람직하게는 5% 이하이다.
배지중에 담자균에 의해 생성되는 β-글리코시다제 활성의 변화는 아글리콘 생성에 큰 영향을 미친다. 영지균을 사용할 때 상기에서 언급한 배지에서 10 ~ 60℃로 배양시키고, β-글리코시다제 활성의 변화, 배지의 pH변화 등을 조사하면, β-글리코시다제 활성은 배지 pH 2.0 ~ 6.0 사이가 최고로 높고, 온도를 40 ~ 70℃ 정도 일 때 효소활성이 높게 나타남이 판명되고 있다.
[약리활성]
본 발명의 생리활성물질은 종래의 항종양작용 및 면역부활작용을 지니는 것이 알려지고 있는 담자균 배양으로부터 생성되는 생리활성물질과 혈관신생억제작용을 지니는 것으로 알려지고 있는 이소플라본류의 아글리콘(제니스테인등)이 단순히 혼재되어있는 상태가 아니고, 양자가 어떠한 형태로 결합된 상태인 일체의 물질인 것으로 이것은 배양의 결과 생성되는 어떠한 미지물질의 존재가 추정되는 것이다. 그 이유는 담자균의 배양에서 얻어지는 물질과 제니스테인과의 단순한 혼합으로서 는 본 발명의 물질과 동등한 생리활성(종양혈관신생억제효과)을 얻을 수 없기 때문이다.
또한, 담자균의 배양에 의해 생성하는 물질은 항종양작용과 면역부활작용을 지니는 것으로 종양혈관신생억제작용은 아니다.
건조 분말화시킨 본 발명의 물질은 특유의 쓴맛과 기나고와 같은 향을 지니는 갈색분체이다. 이 화학성분 분석결과 생리학적 성질을 이하에 나타낸다.(측정방법은 후술하는 실시예 항 참조)
(1) 본 발명 물질의 화학성분
1) 수분 : 3%이하 2) 단백질 : 7.0 ~ 10.0 % 3) 지질 : 5.0 ~ 8.0% 4) 당질 : 75.0 ~ 85.0% 5) 식물섬유 : 0.5 ~ 2.0% 6) 회분 : 2.0 ~ 5.0%
7) 이소플라본류(동결건조분말 1g당)
다이진 0.00 ~ 0.60mg 다이제인 28.00 ~ 30.00mg 제니스틴 0.00 ~0.40mg
제니스테인 55.00 ~ 65.00mg 글리시틴 0.00 ~ 0.05mg
글리시테인 12.00 ~ 15.00mg
(2) 생리학적 성질
1) 종양세포의 증식억제작용 : 마우스 멜라노마(melanoma)세포, 마우스 대장 암세포, 마우스 폐암세포, 마우스 혈관 내피세포, 래트 유방암세포, 인간 전립선암 세포, 인간 방광암세포 등의 증식을 억제한다.
2) 종양혈관신생억제작용 : 마우스의 종양혈관신생을 억제한다. 상기한 본 발명의 물질의 종양혈관신생억제작용은 후술할 실시예에 나타낸 바와 같이 마우스 종양세포를 이용하여 인비트로(in vitro) 및 인비보(in vivo)시험, 계란막을 이용한 액소오버(ex ovo)시험(CAM법 : chorioallantoic membrane)에 의해 확인하였다.
(산업상이용가능성)
[의약품에의 적용]
본 발명에 따른 이소플라본을 함유한 낮은 가격의 재료를 사용함에 있어서 안전하고 용이하게 경구투여가 가능하다. 우수한 생리활성작용을 지닌 물질을 용이하게 제조할 수 있다.
본 발명의 물질은 이소플라본류의 아글리콘이 지니는 생리활성작용 및 담자균 배양생성물이 지니는 생리활성작용이 상승적으로 강화된 것으로, 실험에 의해 확인된 효과에 근거하여 암의 치료 및 예방제(항종양제) 뿐만 아니라 골다공증, 갱년기장애, 신혈관질환, 뇌기능장애, 알코올의존증, 고지혈증 등의 치료 및 예방제 또는 면역부활제 여성호르몬 유사물질로의 사용도 고려할 수 있다.
더욱이 본 발명의 물질은 종래보다 장기간 식용으로 공급되어도 송이버섯 및 대두등과 같은 원료를 사용한 것으로 다량섭취시에도 안전상에 문제가 없다. 상기 이소플라본류의 아글리콘이 지닌 생리활성작용과 담자균 배양생성물이 지닌 생리활성작용이 증강된 동물 또는 수산용 양식의 사료 및 건강식품 등으로도 이용할 수 있다.
본 발명의 물질은 식품, 의약품으로서 주로 경구로 사용되고, 이 섭취량은 연령, 체중, 증상, 목적하는 치료효과, 투여방법 등에 의해 달라지지만 통상 성인 1인당 1회 복용으로서 100mg ~ 5g 정도(건조물환산)이다.
본 발명의 물질을 투여하는 경우에는 일반적으로 정제, 환제, 캅셀제, 산제, 과립제, 시럽제 등으로서 사용할 수 있다. 조립, 정제 또는 시럽제, 도포제인 경우에는 필요에 의해 적정한 보조재료(전분류, 덱스트린, 감미제, 색소, 향료등)를 사용할 수 있다.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
이하 본 발명을 실시예 및 비교예에 의해 설명한다. 그러나, 본 발명은 이 기재된 사항에 의해 한정되는 것은 아니다.
(실시예 1) 이소플라본류 함유재료 존재배지에서 담자균의 배양(1)
(1) 원료
a. 이소플라본류 함유재료
이소플라본 40% 함유 대두제품(미국 AHD사 제). 함유이소플라본 성분(제제 1g에 있어서)은 다음과 같다.
다이진 80.25mg 다이제인 2.20mg 제니스틴 103.94mg
제니스테인 2.48mg 글리시틴 30.60mg 글리시테인 3.67mg
b. 담자균
주식회사 아미노업 케미칼에서 말트엑기스 액체 배지중에 25℃로 보관시킨 영지균(Ganoderma lucidum).
(2) 배양조건
a. 배지
말트엑기스(오리엔탈 효모 주식회사 제조) 10.00g
효모엑기스(아지노모도 사 제조) 1.25g
물 1.0리터
b. 배양방법
배지는 오토클레이브에서 멸균시킨 후, 4℃에서 보관한 것을 사용하였다. 이 배지(pH 5.5)에 영지균을 식균하여 25℃, 130rpm으로 배양하였다. 이 배양기간중에 이틀 단위로 β-글리코시다제 활성을 측정하였다. 효소활성이 배양시작때 보다도 높았던 시점에 분말대두제제(이소플라본류 함유재료)를 배지의 2.5% 농도가 되도록 배지에 첨가시키고 배양을 계속한다. 제니스테인 및 제니스틴 함량을 측정하고 제니스틴이 전부 제니스테인으로 변환됐는가를 확인한 시점에 배양을 종료시킨다. 배양 종료후, 배양액전체를 121℃로 30분간 가열처리하여 효소반응의 정지 및 살균처리를 완료시킨다. 그리고 동결건조시켜 건조분말화시킨다.
또한, 배양액의 β-글리코시다제 활성은 β-글리코시다제 표준품(오리엔탈 효모사 제조, 효모유래)을 사용하여, p-니트로페닐-β-D-글루코피라노시드(시그마사 제조)와 반응시켜 400nm 흡광도를 사용하여 측정한다.
한편, 배양액 중의 이소플라본 생성량은 이소플라본 표준품(제니스틴, 제니스테인, 시그마사 제조)을 사용하고, Franke, A.A의 방법(J. Agric. Food Chem. 42: 1905-1913, 1994)에 준거하여 ODS 컬럼(TSK겔-80Tm, 4.5×150mm)에 의해 용리액으로서 아세토니트릴/물/초산 (10/90/0.1→40/60/0.1)을 사용하여 용출시키고 (0.8ml/분), 260nm의 흡수를 측정하였다.
이상과 같이 얻어진 본 발명의 물질(발명물질 1)은 갈색미분말로서 하기 특성을 지닌다. 이하 분석에 있어서 수분은 70℃ 감압건조법, 단백질은 케달법, 지질은 산분해법, 식물섬유는 효소-중량법, 회분은 직접회화법에 의해 측정하고, 당질은 그 나머지를 빼어 구하였다.
a. 화학적 성질
1) 수분 : 0.7% 2) 단백질 : 8.8 % 3) 지질 : 6.2%
4) 당질 : 80.6% 5) 식물섬유 : 1.0% 6) 회분 : 2.7%
7) 이소플라본류(동결건조분말 1g당)
다이진 (추적) 다이제인 28.47mg 제니스틴 (추적)
제니스테인 59.11mg 글리시틴 (추적) 글리시테인 13.53mg
b. 생리학적 성질
ⅰ) 종양세포증식억제작용(인비트로)
B16/BL6 마우스멜라노마세포, Colon 26 마우스대장암세포, SST-2 랫트유방암세포, T24 인간방광암세포 및 Du145 인간전립선암세포를 사용하여 종양세포증식억제실험을 행하였다. 실시예 1의 물질(발명물질 1)을 증류수에 현탁시켜 고압증기멸균처리하고, 100㎍/ml부터 0.1㎍/ml까지 연속적인 농도로 세포에 가한다. 0.1% 에탄올에 용해된 제니스테인 표준품(시그마사 제조)을 양성대조군으로 사용한다. 종양세포현탁액을 10% FBS를 함유한 DMEM 배지에서 1 ~ 2×106 세포/well로 조정시켜 37℃에서 24시간 배양시키고, 여기에 발명물질 1 또는 제니스테인 표준품을 가하여 또한 48시간 배양시킨다. MTT (3-(4,5-dimethylthyazol-2-yl) 2,5-diphenyl tetrasodium bromide)법에 의해 마이크로플레이트 리더를 사용하여 세포증식을 조사하였다. 발명물질 1의 각종 배양암 세포에 대한 증식억제효과를 미처리 대조군의 종양증식에 대한 증식억제율로서 표 1에 나타내었다. 수치가 높을수록 세포암 증식억제 효과가 높음을 나타낸다.
표 1 : 발명물질 1의 각종배양암세포에 대한 증식억제율(%)
발명물질 1 농도(㎍/ml) B-16 Colon 26 SST-2 Du145 T-24
12.5 53.7 11.4 39.6 27.0 4.3
25.0 72.0 48.7 36.2 60.0 31.2
50.0 78.5 78.3 52.9 85.5 77.9
100.0 86.4 78.8 61.3 87.4 98.5

표 1로부터 각종 배양암세포에 있어서 발명물질 1은 농도의존적인 암세포증식을 억제하였으며, 높은 암세포증식억제효과를 지니는 것으로 판명되었다.
ⅱ) 혈관 내피세포 증식억제시험(인비트로)
마우스 뇌혈관 내피세포 LE-1 세포를 1% 젤라틴으로 코팅하여 96웰 마이크로플레이트에서 24시간 예비배양시키고, 10 ~ 0.1 ㎍/ml 의 농도에서 발명물질 1로 처리시킨 후, 또한 24시간 배양시켰다. 세포증식은 MTT 법에 의해 검출하였다. 표 2에 나타난 바와 같이, 발명물질 1은 마우스 뇌혈관 내피세포에 대해 농도의존적으로 높은 증식억제효과를 나타내었다. 이런 점에서 발명물질 1은 혈관내피세포증식억제작용 즉 혈관신생억제작용을 지니는 것으로 판명되었다.
표 2 : 발명물질 1의 마우스 뇌혈관 내피세포에 대한 증식억제율(%)
발명물질 1 농도(㎍/ml) LE-1
12.5 52.4
25.0 63.5
50.0 67.6
100.0 76.9

ⅲ) 각종 종양세포의 50% 증식억제농도(IC50)(인비트로) : 발명물질 1, 제니 스테인 표준품 및 담자균 배양물의 비교
3LL 마우스 폐암세포, Colon 26 마우스 대장암세포, PC 3 인간 전립선암세포, Du145 인간 전립선암세포 및 LNCaP 인간 전립선암세포를 사용하여, 이들에 대한 발명물질 1, 제니스테인 표준품(시그마사 제조) 및 담자균 배양물(실시예 1과 동일한 조건에서 담자균을 배양시켜 얻어진 생성물)의 50% 증식억제농도(IC50)를 조사하였다.
즉, 발명물질 1, 제니스테인 표준품 또는 담자균 배양물질을 증류수에 현탁시켜 고압증기 멸균처리하고, 1000㎍/ml부터 0.1㎍/ml까지 연속적인 농도로 세포에 가하였다. 종양세포현탁액은 10% FBS를 포함하는 DMEM 배지에서 1 ~ 2 ×105 세포/well로 조정시키고 37℃에서 24시간 배양시킨다. 발명물질 1 또는 제니스테인 표준품을 가하여 48시간 더 배양시키고, MTT 법에 의해 마이크로플레이트 리더를 사용하여 세포증식을 조사하였다. 그 결과를 표 3에 나타내었다. 수치가 낮을수록 저농도에서 배양암세포증식의 50% 억제효과가 가능한 것을 나타낸다.
표 3 : 각종암세포에 대한 발명물질 1, 제니스테인 표준품, 담자균 배양물의 IC50 (㎍/ml)
3LL Colon 26 PC3 Du145 LNCaP
발명물질 1 11.03 1.44 26.09 19.60 23.52
제니스테인 표준품 31.79 51.22 35.77 55.28 69.40
담자균배양물 >1000 3.32 >1000 >1000 377.78

표 3에 나타난 바와 같이, 발명물질 1은 어느 배양암세포에 있어서도 높은 암세포증식억제효과를 나타내었다. 발명물질 1에 의해 각종배양암세포에 대한 증식억제 IC50 는 제니스테인 표준품, 담자균 배양물과 비교하여도 의미있게 낮은 것이 명백하다. 이런 사실은 발명물질 1이 제니스테인 표준품, 담자균 배양물과는 전적으로 상이한 물질이라는 것이다.
발명물질 1의 종양세포 증식억제작용은 종양세포의 세포사멸(apoptosis)을 유도하는 것으로 판단되어지는 바, T24세포를 챔버 슬라이드 내에서 세포수를 50,000 정도로 24시간 배양하고, 발명물질 1을 200㎍/ml 농도로 배지에 가하여 더욱 48시간 배양시킨 후, 슬라이드 상에 세포를 고정시켜 TUNEL 염색키트로 염색하고 발명물질 1의 처리에 의해 암세포의 세포사멸이 명백함을 확인하였다.
ⅳ) 종양세포의 세포사멸 유도작용
발명물질 1에 의한 종양세포의 세포사멸 유도작용을 DNA 레벨로 확인하기 위해, 세포사멸을 야기하는 세포의 유전자의 특이적으로 보이는 DNA 래더를 전기영동법으로 검색하였다.
방법 : SHR/NCrj 랫트(수컷 6주령)의 피하에 SST-2(인간 유방암)을 접종시키 고, 종양형성이 확인된 후 발명물질 1을 1% 함유하는 물을 자유섭취시켜 2주간 투여시켰다. 더욱이 1주간은 발명물질 1을 10% 함유하는 물을 강제경구투여시켰다. 대조군에는 0.05% NaHCO3 수용액을 3주간 자유섭취시켰다. 이 후, 종양조직으로부터 DNA를 추출하여 전기영동을 행하고, DNA 래더를 검색한 결과, 발명물질 1을 투여시킨 군에는 DNA 래더가 명백히 인지되었으며, 발명물질 1은 DNA 레벨에 있어서, 세포사멸을 유도시키는 것이 명백해졌다.
한편, 발명물질 1을 투여시킨 랫트의 유방암세포 성장, 분열 및 분화의 정도(세포주기)에 대해 세포수를 핵 DNA 염색에 의해 분석하는 플로우 사이토메트리법에 의해 발명물질 1에 의한 종양세포의 세포사멸 유도작용을 조사하였다.
세포배양 : 10% FBS(소태아혈청)함유 DMEM 배지중에 배양시킨 SST-2 랫트 유방암세포(10 ×106/ml) 10ml를 내경 10cm의 배양 디쉬에 넣고, 1시간 배양시킨 후 그 후에 시료를 가하였다.
대조 : DMSO(10㎕, 최종농도로서 0.1%이하)
발명물질 1 처리 : 발명물질 1을 100mg/ml의 농도에서 DMSO에 용해시키고, 10㎕를 10ml의 세포배양액 중에 가한다. 발명물질 1의 최종농도는 100㎍/ml이였 다. 시료의 첨가후 더욱 48시간 배양시키고, 배양종료후 세포를 회수하여 세포현탁액을 70% 에탄올에 24시간 고정시키고, 0.1% 글루코즈 및 RNase(100U/ml)을 포함하는 PBS(인산완충 생리식염수)에 실온에서 30분간 재현탁시킨다. 세포는 플로우 사이토메트리 직전에 프로피디움 아이오다이드(PI:50㎍/ml)을 사용하여 10분간 염색시킨다. 발명물질 1을 처리한 SST-2세포의 세포주기를 플로우 사이토메트리에 의해 분석한다.
그 결과, 발명물질 1로 처리된 SST-2 세포는 세포주기에 있어 DNA 합성과 세포분열간의 갭(G1기)과 DNA 합성기(S기)로의 기간(G1/S기)을 정지시키고, 세포가 DNA를 합성할 수 없는 상태를 나타낸다. G1/S기의 DNA 함유량은 전체 65.48%로부터 55.91%로 감소되고, 발명물질 1에 의해 처리시킨 SST-2 세포의 세포사멸을 야기하는 세포는 1.94%부터 5.20%로 증가한다. 그 결과로부터 SST-2 세포는 G1/S기의 정지에 의해 세포사멸을 유도시키는 것이 명확하다.
대두 이소플라본류, 제니스테인, 담자균 추출물 등이 세포의 세포사멸을 유도하는 것은 널리 알려져 있으나, (예를 들면, Cancer Res. 58, 5231-38,1998, Jpn. J. Cancer Res. 91, 164-173, 2000, Biochem. Biophys. Res. Commun., 194, 944-950, 1992, J. Nat. Prod. 1998, 61,485-487 등), 전술한 것을 통해 발명물질 1은 명백하게 제니스테인 또는 담자균 배양물과는 완전히 상이한 물질인 것으로, 발명물질 1의 암세포에 대한 세포사멸 유도작용은 본 발명자가 최초로 인식한 것이 다.
ⅴ) 종양혈관신생억제시험(인비트로)
더블챔버법에 의해 혈관신생억제시험을 행하였다. 본 시험에서는 세포배양 플레이트에 마우스 대장암세포 Colon 26을 배양시키고, 이 웰의 내측에 직경 8㎛ 의 구멍이 열려진 웰을 삽입하고, 내측웰에 놓인 콜라겐겔 위에서 마우스 뇌혈관 내피세포 LE-1을 배양시킨다. 내측의 웰의 하부의 구멍으로부터 외측의 웰의 내부의 대장암세포로부터 생성된 혈관내피세포 자극인자에 의해 자극을 받는 신생혈괄이 형성된다. 혈관의 신생이 확인되는 곳에서 발명물질 1을 외측웰에 가하고 더욱 3일간 배양한다. 배양 후 콜라겐겔 상의 세포를 사진촬영하고 컴퓨터에 의해 영상처리를 통해 영상분석 소프트웨어 NIH 이미지(NIH Image)를 사용하여 형성된 혈관 내피세포에 의한 관공의 길이의 합계 및 내피세포 수를 계측하고, 정상세포의 관공길이에 대한 비율로부터 혈관신생억제율을 계산하였다. 결과는 표 4에 나타난대로 발명물질 1로 처리한 것은 신생혈관이 대부분 소실되었다.
표 4 : 발명물질 1의 종양혈관신생억제효과(인비트로)
세포수 관공길이 혈관신생억제율(%)
무처리세포 22 1593 -
발명물질 1 1 70 95.6

ⅵ) 종양혈관신생억제시험(인비보)
배부피하법에 의해 인비보에서 종양혈관신생억제시험을 행하였다. 양면에 포아사이즈 0.45㎛ 의 필터(밀리포아사제)를 부착시킨 밀리포아 링을 마우스 대장암 Colon 26 (1×107cell)으로 채우고, BALB/c 마우스 피하 밑에 이식시켰다. 발명물질을 1일에 1g을 강제 경구투여하고 챔버에 이식한 후 5일째에 챔버를 적출시켜 혈관분석을 사진에 기록하였다. 사진은 컴퓨터에 투입시키고 영상해석 소프트웨어 NIH 이미지를 사용하여 그린 필터 처리시키고, 분석혈관을 이식화 처리한 후 이식부위에 있어서 혈관면적으로부터 면적율을 계산하였다. 결과를 표5에 나타내었다. 종양세포 처리시킨 마우스는 Colon 26 유도 피하 혈관의 면적은 정상마우스의 약 2배정도인데 반해, 발명물질 1 섭취 마우스는 정상마우스와 변화가 없었고, 발명물질 1의 경구섭취에 의해 종양혈관신생이 현저히 억제되는 것이 명백하였다.
표 5 : 발명물질 1의 종양혈관신생억제효과(인비보)
면적 면적율(%)
정상(무처리) 3854 12.8
종양세포처리 7200 26.9
발명물질 1 처리 3018 10.8

ⅶ) 혈관신생억제시험(엑스 오보)
계란 수정란을 사용하여 CAM법(chorioallantoic membrane)에 의해 엑스 오보 혈관신생억제시험을 행하였다. 계란 황막상의 혈관신생을 관찰하는 방법으로서 계란 황상에 혈관신생억제물질을 투여시키고, 혈관신생억제를 계란 껍질을 열고 직접 관찰할 수 있다. 10일된 계란을 37℃, 습도 60%에서 3일간 배양시킨 후 계란 껍질에 작은 구멍을 열고 주사침으로 3ml의 난백을 흡출시켜 구멍을 방수테이프로 폐쇄시킨다. 더욱이 이 구멍의 반대측에 1.0 ×1.0 cm의 창을 열고 배에 혈관이 형성되는지를 확인하고 창을 닫는다. 더욱이 3일간 배양시킨다. 그 후, 발명물질 1을 멸균시켜 인산완충식염수용액으로서 창으로부터 계란에 투입하고 더욱 4일간 배양시킨 후 계란을 열어 난황막상의 혈관분석을 사진으로 기록한다.
이 사진을 컴퓨터에 투입하여 화상해석 소프트웨어 NIH 이미지를 사용하여 그린 필터 처리하고, 분포혈관을 이직화처리한 후 이식부위에 있어서 혈관면적으로부터 면적율을 계측한다. 결과를 표 6에 나타내었다. 발명물질 1로 처리된 난황막상에 분포한 혈관의 면적은 감소하였고, 정상란에 대해 억제율은 86.4%로 높은 수치를 나타내었고, 혈관신생억제효과가 명백하였다.
표 6 : 발명물질 1의 혈관신생억제효과(엑스 오보)
면적 면적율(%) 억제율(%)
정상란(무처리) 87167 38.3 -
발명물질 1 처리 11862 5.2 86.4

(실시예 2) 이소플라본류 함유재료 존재 배지에서 담자균의 배양 (2)
하기 원료를 사용하여 실시예 1과 동일한 조건에서 배양을 행하고, 본 발명의 물질(발명물질 2)을 얻었다.
(1) 원료
a. 이소플라본류 함유재료
북해도산 전립대두(제니스틴 0.73mg/g, 제니스테인 0.041mg/g 함유 이것들은 무수물 환산)를 수돗물에 침적시켜 흡수한 후, 10배량의 물을 가하여 약 100℃에서 30분 증류시킨 후 고형분을 제거시킨 두유. 이소플라본 함유량은 다음과 같다.
이소플라본 함유량 (㎍/ml)
다이진 11.68 다이제인 2.51 제니스틴 45.22
제니스테인 3.51 글리시틴 5.62 글리시테인 11.33
b. 담자균
주식회사 아미노업 케미칼에서 말트엑기스 액체 배지중에 25℃로 보관시킨 균(Lentinus edodes).
(2) 얻어진 본 발명의 물질(발명물질 2)은 발명물질 1과 같은 갈색의 미분말이고, 하기의 화학적 생리학적 특성을 지닌다.(측정방법은 실시예 1과 동일하다)
a) 화학적 특성
1) 수분 : 0.9% 2) 단백질 : 12.9 % 3) 지질 : 1.3%
4) 당질 : 73.9% 5) 식물섬유 : 3.1% 6) 회분 : 7.5%
7) 이소플라본류(동결건조분말 1g당)
다이진 (추적) 다이제인 20.50mg 제니스틴 (추적)
제니스테인 37.20mg 글리시틴 (추적) 글리시테인 8.49mg
b) 생리학적 특성
실시예 1에 기재방법과 동일한 방법에 의해 발명물질 2에 있어서 종양세포 증식억제시험(인비트로), 혈관내피세포증식억제시험(인비트로), 종양혈관신생억제시험(인비트로), 종양혈관신생억제시험(인비보), 종양혈관신생억제시험(엑스 오보)을 행하였다. 결과를 표 7~11에 나타내었다.
표 7 : 발명물질 2의 각종 배양암세포에 대한 증식억제율(%)(인비트로)
발명물질 2 농도(㎍/ml) B-16 Colon 26 SST-2 Du145 T-24
12.5 23.2 7.9 20.8 17.1 0.0
25.0 52.2 23.9 58.5 30.0 9.6
50.0 75.4 41.8 65.4 37.1 28.1
100.0 86.0 73.3 84.6 69.8 54.5

표 7로부터 명확한 것은 발명물질 2는 각종 배양암세포에 있어서 높은 억제율을 지니고, 암세포 증식억제효과가 높은 것이 명확하다.
표 8 : 발명물질 2의 마우스 뇌혈관 내피세포에 대한 증식억제율(%)
발명물질 2 농도(㎍/ml) LE-1
12.5 39.6
25.0 36.2
50.0 52.9
100.0 61.3

표 8로부터 명확한 것은 발명물질 2에는 농도의존적으로 높은 뇌혈관 내피세포 증식억제효과가 인정되고 있고, 혈관신생억제작용을 지니는 것이 명백하다.
표 9 : 발명물질 2의 종양혈관신생억제효과(인비트로)
세포수 관공길이 신생혈관억제율(%)
정상세포(무처리) 22 1593 -
발명물질 2 처리 16 1366 14.3

표 9로부터 명백한 것은 발명물질 2로 처리한 것은 신생혈관이 감소하고 있고, 14.3%의 높은 억제율을 지닌다.
표 10 : 발명물질 2의 종양혈관신생억제효과(인비보)
면적 면적율(%)
정상(무처리) 3854 12.8
종양세포처리 7200 26.9
발명물질 2 처리 2494 10.6

표 10으로부터 명백한 것은 종양세포처리된 마우스는 Colon 26 유도피하혈관의 면적은 정상마우스의 약 2배임에 반해, 발명물질 2를 투여한 마우스는 정상마우스와 변화가 없었다. 따라서, 발명물질 2의 섭취로 인해 종양혈관신생이 억제되는 것이 명백하다.
표 11 : 혈관신생억제효과(엑스 오보)
면적 면적율(%) 억제율(%)
정상세포(무처리) 97167 38.3 -
발명물질 2 처리 34300 14.8 61.3

표 11로부터 명백한 것은 발명물질 2의 처리로 인해 난황막상에 분포하는 혈관의 면적이 감소하고 정상란에 비해 61.3% 높은 억제율을 나타내는 혈관신생억제효과를 확인할 수 있었다.
(비교예) 담자균의 단독배양물과 제니스테인의 혼합물의 생리작용
담자균으로서 실시예 1과 동일한 영지균을 사용하였다. 이소플라본 함유재료의 첨가를 생략한 것 외에는 실시예 1과 동일한 조건으로 배양 동결건조하여 갈색의 건조분말(비교물질 1)을 얻는다. 비교물질 1의 화학적 특성은 다음과 같다. (분석법은 실시예 1과 같다)
화학적 특성
수분 : 1.6% 단백질 : 12.9 % 지질 : 1.6%
당질 : 71.4% 식물섬유 : 3.8% 회분 : 8.7%
그리고, 비교물질 1의 94g을 1L의 물에 분산시켜 전체를 60℃로 가온시키고, 제니스테인(시그마사 제) 6g을 가하여 30분간 교반을 계속한 후, 전체를 진공 동결건조시켜 건조분말(비교물질 2)을 얻는다.
발명물질 1, 발명물질 2, 비교물질 1 및 비교물질 2에 있어서, 엑스 오보에 의한 혈관신생억제시험 및 암마우스를 사용하여 인비보 항종양시험을 행하였다. 엑스 오보에 의해 혈관신생억제시험을 실시예 1과 동일하게 행하였고, 암마우스에 의한 인비보 종양억제시험은 하기 방법으로 행하였다.
B-16 멜라노마세포(1×105cell)를 C57/BL 마우스에 피하이식시키고 발명물질 1, 2 및 비교물질 1, 2를 각각 5%의 농도로 분말 사료에 혼합시키고, 종양을 이식하여 동시에 21일간 자유섭취시켰다. 21일간에 종양을 적출하고 질량을 측정하였 다. 이것으로부터 시험결과를 표 12 및 13에 나타내었다.
표 12 : 혈관신생억제효과의 비교(엑스 오보)
면적율(%) 억제율(%)
대조(무처리) 38.3 -
발명물질 1 5.2 86.4
발명물질 2 14.8 61.3
비교물질 1 27.0 29.5
비교물질 2 23.0 40.0

표 13 : 암마우스의 종양증식억제효과의 비교(인비보)
종양중량(평균치g) 표준편차
대조(무처리) 1.44 0.59
발명물질 1 0.28 0.32 대조에 비해 0.1%이하임을 유의
발명물질 2 0.68 0.34 대조에 비해 1%이하임을 유의
비교물질 1 1.35 0.56 대조군과 유의차 없음
비교물질 2 0.83 0.59 대조군과 유의차 없음

표 12 및 표 13으로부터 명백한 것은 엑스 오보에 의해 혈관신생억제효과 및 암마우스에 의한 종양증식억제효과는 비교물질 1 및 비교물질 2에는 명확한 변화가 없었는데 반해, 발명물질 1 및 발명물질 2에는 높은 억제효과를 나타내는 것을 확인하였다.

Claims (23)

  1. 대두종자, 대두종자 유래의 가공제품 또는 칡뿌리(arrowroot)에서 추출된 이소플라본류 함유 추출물이 존재하는 배지중에서 β-글리코시다제 활성을 지닌 영지균(Ganoderma lucidum) 또는 렌티너스 에도데스(Lentinus edodes)를 배양하여 얻어지는 이소플라본류의 아글리콘 및 영지균 또는 렌티너스 에도데스 배양생성물을 포함하는 항종양 작용, 종양신생혈관 저해작용, 종양세포 증식억제작용의 생리활성 작용을 지니는 물질
  2. 대두종자, 대두종자 유래의 가공제품 또는 칡뿌리(arrowroot)에서 추출된 이소플라본류 함유 추출물 및 β-글리코시다제가 존재하는 배지중에서 β-글리코시다제 활성을 지닌 영지균(Ganoderma lucidum) 또는 렌티너스 에도데스(Lentinus edodes)를 배양시켜 얻어지는 이소플라본류의 아글리콘과 영지균 또는 렌티너스 에도데스의 배양생성물을 포함하는 항종양 작용, 종양신생혈관 저해작용, 종양세포 증식억제작용의 생리활성 작용을 지니는 물질
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 물질의 생리활성은 이소플라본류의 아글리콘 생리활성 및 영지균 또는 렌티너스 에도데스의 배양 생성물의 생리활성보다 상승적으로 증가된 것임을 특징으로 하는 생리활성 작용을 지니는 물질
  4. 제 3항에 있어서, 상기 이소플라본류의 아글리콘이 제니스테인임을 특징으로 하는 생리활성 작용을 지니는 물질
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 종양세포 증식억제작용이 종양세포의 세포사멸 유도작용인 생리활성 작용을 지니는 물질
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. ⅰ) 대두종자, 대두종자 유래의 가공제품 또는 칡뿌리(arrowroot)에서 추출된 이소플라본류를 함유하는 추출물이 존재하는 배지 중에서 β-글리코시다제 활성을 지니는 영지균(Ganoderma lucidum) 또는 렌티너스 에도데스(Lentinus edodes)를 배양시키는 단계; 및 ⅱ) 이소플라본류의 아글리콘과 영지균 또는 렌티너스 에도데스 배양생성물을 함유하는 성분을 수득하는 단계로 구성된 항종양 작용, 종양신생혈관 저해작용, 종양세포 증식억제작용의 생리활성 작용을 지닌 물질의 제조방법
  12. 제 11항에 있어서, 먼저 영지균(Ganoderma lucidum) 또는 렌티너스 에도데스(Lentinus edodes)를 배양시키고 β-글리코시다제 활성을 높인 후에 대두종자, 대두종자 유래의 가공제품 또는 칡뿌리(arrowroot)에서 추출된 이소플라본류를 함유하는 추출물을 배지에 투입시켜 배양하고, 이소플라본류의 아글리콘 및 영지균 또는 렌티너스 에도데스의 배양생성물을 함유하는 성분을 수득함을 특징으로 하는 항종양 작용, 종양신생혈관 저해작용, 종양세포 증식억제작용의 생리활성 작용을 지니는 물질의 제조방법
  13. ⅰ) 대두종자, 대두종자 유래의 가공제품 또는 칡뿌리(arrowroot)에서 추출된 이소플라본류를 함유하는 추출물 및 β-글리코시다제가 존재하는 배지중에서 β-글리코시다제 활성을 지니는 영지균(Ganoderma lucidum) 또는 렌티너스 에도데스(Lentinus edodes)를 배양시키는 단계; 및 ⅱ) 이소플라본류의 아글리콘과 영지균 또는 렌티너스 에도데스 배양생성물을 함유하는 성분을 수득하는 단계로 구성된 항종양 작용, 종양신생혈관 저해작용, 종양세포 증식억제작용의 생리활성 작용을 지니는 물질의 제조방법
  14. 제 11항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, 이소플라본류의 아글리콘이 제니스테인인 생리활성 작용을 지니는 물질의 제조방법
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 제 11항 또는 제 13항에 있어서, 종양세포 증식억제작용이 종양세포의 세포사멸 유도작용인 제조방법
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 제 1항에 기재된 생리활성 작용을 지니는 물질을 함유하는 건강식품
  22. 제 1항에 기재된 생리활성 작용을 지니는 물질을 유효성분으로 하는 사료조성물
  23. 제 1항에 기재된 생리활성 작용을 지니는 물질을 유효성분으로 하는 항종양제
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