CN103740778B

CN103740778B - 从黄杞叶中提取二氢槲皮素和鼠李糖的方法

Info

Publication number: CN103740778B
Application number: CN201410004906.0A
Authority: CN
Inventors: 李送军; 杨文国; 宋云飞; 李元元; 李宇钰; 蒋治舟
Original assignee: GUILIN LAIYIN BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: Shanghai Biyan Biotechnology Co., Ltd
Priority date: 2014-01-06
Filing date: 2014-01-06
Publication date: 2016-03-23
Anticipated expiration: 2034-01-06
Also published as: CN103740778A

Abstract

本发明公开了一种从黄杞叶中提取二氢槲皮素和鼠李糖的方法，包括以下步骤：先用有机溶剂提取黄杞叶，提取液浓缩后再用水稀释至其中有机溶剂的含量为10～20％，得到稀释液；向稀释液中加入黑曲霉培养液，于40～50℃培养1～3h，过滤，分别收集滤液和沉淀；沉淀用有机溶剂溶解后上大孔树脂柱，先用水洗柱，再用60～100v/v％的甲醇、乙醇或丙酮洗脱，洗脱液浓缩，得到含量大于90％的二氢槲皮素；滤液用1％硅藻土过滤，所得滤液先过阴离子交换树脂柱，收集流出液再过阳离子交换树脂柱，收集流出液，浓缩后用80～90v/v％的甲醇、乙醇或丙酮加热溶解，过滤，滤液冷却析晶，得到含量大于99％的鼠李糖。

Description

从黄杞叶中提取二氢槲皮素和鼠李糖的方法

技术领域

本发明涉及从植物中提取活性成分的方法，具体涉及一种从黄杞叶中提取二氢槲皮素和鼠李糖的方法。

背景技术

黄杞叶为胡桃科植物黄杞Engelhardtiarox-burghianaWall.的干燥叶,具有清热止痛之功效,用于治疗感冒发热、疝气腹痛，在民间常用作保健茶饮用。动物实验表明黄杞叶在抗凝血、调血脂、血糖、抗氧化等方面都有一定的效果。

申请人之前申请的公开号为CN101054369的发明专利，公开了一种从黄杞叶中提取分离二氢槲皮素的方法，以黄杞叶为原料，通过提取、浓缩、柱层析、结晶、盐酸水解，得到一种针状结晶，类白色的二氢槲皮素，其中二氢槲皮素含量大于95％(HPLC测试)。但该发明中需要进行多次结晶才能得到纯度较高的二氢槲皮素。

公开号为CN102952108A的发明专利，公开了一种采用槐米制备槲皮素并利用其废弃液生产鼠李糖的方法，具体是用饱和澄清的石灰水对槐米提取芦丁，然后对提取的芦丁采用硫酸水解制取槲皮素，再将制取槲皮素的废弃液发酵制取鼠李糖粗品，最后用甲醇分离步骤C中鼠李糖粗品中的葡萄糖，以制得鼠李糖精品。但目前尚未见有采用黑曲霉培养液对黄杞叶的提取液进行水解同时制备得到二氢槲皮素和鼠李糖的方法的相关报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种从黄杞叶中提取二氢槲皮素和鼠李糖的方法。该方法采用黑曲霉培养液对黄杞叶的提取液进行水解可同时制备得到二氢槲皮素和鼠李糖，所得二氢槲皮素的含量大于90％(HPLC法)，鼠李糖的含量大于99％(HPLC法)。

本发明所述的从黄杞叶中提取二氢槲皮素和鼠李糖的方法，包括以下步骤：

1)取黄杞叶用有机溶剂进行提取，收集提取液，浓缩去除部分有机溶剂，得到浓缩液；浓缩液用水稀释至其中有机溶剂的含量为10～20％，得到稀释液；

2)向稀释液中加入黑曲霉培养液，于40～50℃培养1～3h，过滤，分别收集滤液和沉淀；其中，

所述的黑曲霉培养液是由黑曲霉接种于察式培养基中进行培养所得，所得的黑曲霉培养液中α-L-鼠李糖苷酶的酶活为1000～10000U/ml；

所述黑曲霉培养液的加入量为稀释液体积的0.5～1％；

3)取步骤2)收集的沉淀用30～50v/v％的甲醇、乙醇或丙酮溶解，然后上大孔树脂柱层析，水洗树脂柱至流出液澄清，再用60～100v/v％的甲醇、乙醇或丙酮洗脱，薄层层析跟踪检测，收集含目标成分的洗脱液，浓缩回收溶剂，冷却析晶，得到二氢槲皮素；

4)取步骤2)收集的滤液用硅藻土过滤，滤液先过阴离子交换树脂柱，收集流出液再过阳离子交换树脂柱，收集流出液，浓缩，所得浓缩液用80～90v/v％的甲醇、乙醇或丙酮加热溶解，过滤，滤液冷却析晶，得到鼠李糖。

本发明采用黑曲霉所产生的α-L-鼠李糖苷酶对黄杞叶提取液进行酶解，酶解率高且酶解几乎无副产品生成，酶解液中的沉淀经大孔树脂纯化后只进行一次结晶即可获得含量大于90％的二氢槲皮素，酶解液中的上清液经离子交换树脂柱除杂后只进行一次结晶即可获得含量大于99％的鼠李糖。

上述技术方案中，

步骤1)中，优选是用30～75v/v％的甲醇、乙醇或丙酮对黄杞叶进行提取，采用上述浓度范围内的提取溶剂进行提取相对于采用高浓度的甲醇、乙醇或丙酮进行提取，所得提取液中的叶绿素含量大幅减少，更有利于后续纯化操作。更为优选地是采用30～50v/v％的甲醇、乙醇或丙酮对黄杞叶进行提取，这样所得提取液中的杂质含量更低。在进行提取时，通常是采用煮沸提取的方式，提取的次数通常为1～3次，每次提取的时间通常1～3h，每次提取时溶媒的加入量通常为原料重量的5～8倍。该步骤中，在将提取液浓缩去除部分有机溶剂的操作中，通常是浓缩去除提取溶媒加入量的50～80％较为合适。

步骤2)中，所述的黑曲霉培养液是由黑曲霉接种于察式培养基中进行摇床培养所得，其中培养的温度为30～40℃，培养的时间为36～48h，摇床的转数为60～250rpm。所述黑曲霉培养液的加入量优选为稀释液体积的0.5～0.8％。该步骤中，所述的察式培养基配方与现有技术相同，具体为：

步骤3)中，所述大孔树脂柱的型号具体可以是LS-40、LS-303B、D101、D102、AB-8、HPD400或HPD500等。该步骤，用于溶解沉淀的30～50v/v％甲醇、乙醇或丙酮的用量通常为沉淀重量的5～6倍。

步骤4)中，所述的阴离子交换树脂可以是D941、700B或717型阴离子交换树脂，阳离子交换树脂可以是732或D001型阳离子交换树脂。该步骤中，收集的流出液通常是浓缩至其中固形物含量为40～50％；所得的浓缩液加入分析纯甲醇、乙醇或丙酮至80～90v/v％并加热至40～60℃搅拌溶解；该步骤中，上清液通常用1％(质量)硅藻土进行过滤。

与现有技术相比，本发明的特点在于：

1、本发明采用黑曲霉所产生的α-L-鼠李糖苷酶对黄杞叶提取液进行酶解，酶解率高且酶解几乎无副产品生成，酶解液中的沉淀经大孔树脂纯化后只进行一次结晶即可获得含量大于90％的二氢槲皮素，收率为1.4～1.7％；酶解液中的上清液经离子交换树脂柱除杂后只进行一次结晶即可获得含量大于99％的鼠李糖，收率为0.6～0.85％；

2、应用微生物酶转化而得的α-L-鼠李糖苷酶对黄杞叶提取液进行酶解，反应条件温和，没有废弃物质排放，生产工艺简便，成本低。

具体实施方式

下面以具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不局限于这些实施例。

以下各实施例中所述的察式培养基配方为：

实施例1

1)取500kg黄杞叶置于提取罐中，以30v/v％甲醇为溶媒煮沸提取2次(第一次加入原料6倍量的30v/v％甲醇提取2h，第二次加入原料5倍量的30v/v％甲醇提取1h)，收集提取液，浓缩除去部分溶媒(去除甲醇总加入量的60％)，得到浓缩液；浓缩液加水稀释至其中甲醇的含量为15％(质量)，得到稀释液；

2)向稀释液中加入相当于稀释液重量0.8％黑曲霉培养液，于40℃培养2h，过滤，分别收集上清液和沉淀；其中，

所述的黑曲霉培养液是由黑曲霉接种于察式培养基中进行摇床培养所得，其中培养的温度为35℃，培养的时间为40h，摇床的转数为200rpm，培养所得的黑曲霉培养液中α-L-鼠李糖苷酶的酶活为9000U/ml；

3)取步骤2)收集的沉淀用相当于沉淀5倍的40v/v％甲醇溶解，然后上D101大孔树脂柱层析，水洗树脂柱至流出液澄清，再用80v/v％甲醇洗脱，薄层层析跟踪检测，收集含目标成分的洗脱液，减压浓缩回收溶剂，冷却析晶，得到二氢槲皮素8.5kg，HPLC法检测纯度为91.2％，收率为1.7％；

4)取步骤2)收集的滤液用1％硅藻土过滤，滤液先过717阴离子交换树脂柱，收集的流出液再过732阳离子交换树脂柱，收集流出液，浓缩至固含量为40％，所得浓缩液加入分析纯甲醇至85v/v％甲醇并加热至50℃直至浓缩液溶解，过滤，滤液冷却析晶，得到鼠李糖4.25g，HPLC法检测纯度为99.4％，收率为0.85％。

实施例2

1)取500kg黄杞叶置于提取罐中，以50v/v％乙醇为溶媒煮沸提取2次(第一次加入原料8倍量的50v/v％乙醇提取2h，第二次加入原料5倍量的50v/v％乙醇提取2h)，收集提取液，浓缩除去部分溶媒(去除乙醇总加入量的80％)，得到浓缩液；浓缩液加水稀释至其中甲醇的含量为10％，得到稀释液；

2)向稀释液中加入相当于稀释液重量0.5％黑曲霉培养液，于45℃培养3h，过滤，分别收集上清液和沉淀；其中，

所述的黑曲霉培养液是由黑曲霉接种于察式培养基中进行摇床培养所得，其中培养的温度为40℃，培养的时间为36h，摇床的转数为160r/min，培养所得的黑曲霉培养液中α-L-鼠李糖苷酶的酶活为7000U/ml；

3)取步骤2)收集的沉淀用相当于沉淀6倍的30v/v％乙醇溶解，然后上LS-40大孔树脂柱层析，水洗树脂柱至流出液澄清，再用90v/v％乙醇洗脱，薄层层析跟踪检测，收集含目标成分的洗脱液，减压浓缩回收溶剂，冷却析晶，得到二氢槲皮素7.8kg，HPLC法检测纯度为90.6％，收率为1.56％；

4)取步骤2)收集的滤液用1％硅藻土过滤，滤液先过700B阴离子交换树脂柱，收集的流出液再过732阳离子交换树脂柱，收集流出液，浓缩至固含量为45％，所得浓缩液加入分析纯乙醇至90v/v％乙醇并加热至60℃使浓缩液溶解，过滤，滤液冷却析晶，得到鼠李糖3.5kg，HPLC法检测纯度为99.6％，收率为0.7％。

实施例3

1)取500kg黄杞叶置于提取罐中，加入相当于原料重量8倍的75v/v％丙酮，煮沸提取为3h，收集提取液，浓缩除去部分溶媒(去除丙酮加入量的50％)，得到浓缩液；浓缩液加水稀释至其中甲醇的含量为20％，得到稀释液；

2)向稀释液中加入相当于稀释液重量1％黑曲霉培养液，于50℃培养1h，过滤，分别收集上清液和沉淀；其中，

所述的黑曲霉培养液是由黑曲霉接种于察式培养基中进行摇床培养所得，其中培养的温度为30℃，培养的时间为48h，摇床的转数为90rpm，培养所得的黑曲霉培养液中α-L-鼠李糖苷酶的酶活为6000U/ml；

3)取步骤2)收集的沉淀用相当于沉淀6倍的50v/v％丙酮溶解，然后上HPD-400大孔树脂柱层析，水洗树脂柱至流出液澄清，再用85v/v％丙酮洗脱，薄层层析跟踪检测，收集含目标成分的洗脱液，减压浓缩回收溶剂，冷却析晶，得到二氢槲皮素7kg，HPLC法检测纯度为90.3％，收率为1.4％；

4)取步骤2)收集的滤液用1％硅藻土过滤，滤液先过D941阴离子交换树脂柱，收集的流出液再过D001阳离子交换树脂柱，收集流出液，浓缩至固含量为42％，所得浓缩液加入分析纯酮丙80v/v％丙酮加热至40℃直至浓缩液溶解，过滤，滤液冷却析晶，得到鼠李糖3.2kg，HPLC法检测纯度为99.1％，收率为0.64％。

实施例4

1)取500kg黄杞叶置于提取罐中，以40v/v％乙醇为溶媒煮沸提取3次(第一次加入原料7倍量的50v/v％乙醇提取2h，第二次加入原料5倍量的50v/v％乙醇提取2h，第二次加入原料5倍量的50v/v％乙醇提取1h)，收集提取液，浓缩除去部分溶媒(去除乙醇总加入量的70％)，得到浓缩液；浓缩液加水稀释至其中甲醇的含量为12％，得到稀释液；

2)向稀释液中加入相当于稀释液重量0.6％黑曲霉培养液，于45℃培养2h，过滤，分别收集上清液和沉淀；其中，

所述的黑曲霉培养液是由黑曲霉接种于察式培养基中进行摇床培养所得，其中培养的温度为32℃，培养的时间为45h，摇床的转数为120rpm，培养所得的黑曲霉培养液中α-L-鼠李糖苷酶的酶活为9000U/ml；

3)取步骤2)收集的沉淀用相当于沉淀6倍的45v/v％乙醇溶解，然后上AB-8大孔树脂柱层析，水洗树脂柱至流出液澄清，再用100v/v％乙醇洗脱，薄层层析跟踪检测，收集含目标成分的洗脱液，减压浓缩回收溶剂，冷却析晶，得到二氢槲皮素7.6kg，HPLC法检测纯度为92.4％，收率为1.52％；

4)取步骤2)收集的滤液用1％硅藻土过滤，滤液先过700B阴离子交换树脂柱，收集的流出液再过732阳离子交换树脂柱，收集流出液，浓缩至固含量为50％，所得浓缩液加入分析纯乙醇至85v/v％乙醇并加热至45℃直至浓缩液溶解，过滤，滤液冷却析晶，得到鼠李糖3.4kg，HPLC法检测纯度为99.5％，收率为0.68％。

Claims

1.从黄杞叶中提取二氢槲皮素和鼠李糖的方法，包括以下步骤：

1)取黄杞叶用有机溶剂进行提取，收集提取液，浓缩去除部分有机溶剂，得到浓缩液；浓缩液用水稀释至其中有机溶剂的含量为10～20％，得到稀释液；其中，是用30～75v/v％的甲醇、乙醇或丙酮对黄杞叶进行提取；

所述黑曲霉培养液的加入量为稀释液体积的0.5～1％；

2.根据权利要求1所述的从黄杞叶中提取二氢槲皮素和鼠李糖的方法，其特征在于：步骤2)中，所述黑曲霉在察式培养基中进行培养的温度为30～40℃，培养的时间为36～48h。

3.根据权利要求1所述的从黄杞叶中提取二氢槲皮素和鼠李糖的方法，其特征在于：步骤3)中，所述大孔树脂柱的型号为LS-40、LS-303B、D101、D102、AB-8、HPD400或HPD500。

4.根据权利要求1所述的从黄杞叶中提取二氢槲皮素和鼠李糖的方法，其特征在于：步骤4)中，所述的阴离子交换树脂为D941、700B或717型阴离子交换树脂，阳离子交换树脂为732或D001型阳离子交换树脂。

5.根据权利要求1所述的从黄杞叶中提取二氢槲皮素和鼠李糖的方法，其特征在于：步骤4)中，收集的流出液浓缩至其中固形物含量为40～50％。