CN104805135B - 一种全细胞催化合成香草醛的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种全细胞催化合成香草醛的方法，本发明的反应体系中，通过添加离子溶剂或无机氮源，使得香草醛的产率得到大幅提升，同时通过选用高特异性的菌株CGMCC1347，其高特异性地转化异丁香酚生成香草醛，减少了副产物的生成，降低了后期分离纯化的成本。

Description

一种全细胞催化合成香草醛的方法
技术领域
本发明涉及香料领域，尤其涉及一种全细胞催化合成香草醛的方法。
背景技术
香草醛（4-羟基3-甲氧基-苯甲醛），俗称香兰素、香草素、香兰醛、香茅醛，是全球最重要的香味物质之一，具有浓郁的香子兰花的气味，素有“香料皇后”的美誉。其以游离态和葡萄糖苷的形式广泛存在于自然植物中，如香荚兰豆、丁香油、天门冬、甜菜根、安息香、苏合香膏，较集中存在于香荚兰的豆荚中（含量1.5%-3%）。由于其特殊的香味及结构特征，被广泛应用于各个领域，其中约60%用作食品、糖果、饮料中的香味物质，约33%用作香料和化妆品中的成分，约7%作为药物中间体。
香草醛每年的需求量在10,000 t以上。目前市场上的香草醛绝大部分来自化学合成，主要以愈创木酚和木质素为合成原料，价格较低，每公斤约13美元。由香荚兰中提取的天然香草醛年产量仅20 t，约占0.2%的份额，价格昂贵，每公斤达4,000美元。而用微生物转化法生产的香草醛与植物提取的天然香草醛等同，被称为生物香草醛，符合EU和FDA对天然香精的食用安全要求，但目前其年产量只有数吨，每公斤价格600~1000美元。
随着人们对健康安全的愈发重视，天然香草醛的需求不断上升。微生物转化法生产香草醛在生产周期上和规模扩大方面要优于植物提取法，生产成本低于植物提取法，而产品品质优于化学合成的香草醛，且无污染、对环境友好，是一种极有前景的制备方法，因此越来越受到青睐。
但是现有技术中，微生物转化法制备香草醛仍然存在许多不足：
1、容易生成副产物，产率低。因为微生物本身是一个多酶体系，把它直接加入到反应中，微生物里的某些酶可能与目的酶竞争相同的底物，导致底物利用率下降、副产物的生成、产率低。再者，香草醛生成后也会被微生物中的酶进一步代谢为香草酸或其他代谢产物；
2. 底物在水溶液中的溶解度很低，并且底物会对微生物的生长或酶的活性有抑制作用；
3. 产物香草醛及其他副产物也会对微生物的生长或酶的活性有抑制作用。
因此，现有技术还有待于改进和发展。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种全细胞催化合成香草醛的方法，旨在解决现有技术中香草醛微生物转化合成产量低、容易生成副产物等问题。
本发明的技术方案如下：
一种全细胞催化合成香草醛的方法，其中，包括步骤：
S1、将保存的菌株CGMCC1347接入种子培养基中活化，32~40℃、100~300rpm振荡反应6~36h得到种子液；
S2、反应结束后，取2ml种子液接入30~70ml发酵培养基中，32~40℃、100~300rpm振荡反应12~36h得到菌液；
S3、取10ml菌液3000~6000rpm离心5~20min，弃上清，获得湿菌体；
S4、往湿菌体中加入5~15ml缓冲溶液，重悬菌体并转移至装有0.1~0.5g异丁香酚的锥形瓶中，盖上橡胶塞，25~35℃、100~300rpm振荡反应48~96h；
S5、反应结束后，加入5~15ml95%乙醇以终止反应，沉淀蛋白并溶解底物和产物，充分混匀后5000~8000rpm离心10min；
S6、取离心后的上清液，用乙醇稀释，过滤后得到香草醛。
所述的全细胞催化合成香草醛的方法，其中，所述步骤S4中，锥形瓶中还添加有50~150µl离子溶剂。
所述的全细胞催化合成香草醛的方法，其中，所述离子溶剂为离子液体或深度低共熔溶剂。
所述的全细胞催化合成香草醛的方法，其中，所述离子液体为咪唑型离子液体、铵盐离子液体或磷盐离子液体。
所述的全细胞催化合成香草醛的方法，其中，所述咪唑型离子液体为[MMIm][MeSO4]、[EMIm][MeSO4]、[BMIm][MeSO4]、[Me(OEt)3MIm][Tf2N]；所述铵盐离子液体为[Choline][Cl]、[Choline][H2PO4]、[NMe3][MeSO3]、[NBu4][MeSO3]、[NMe3][H2PO4]、 [ETM][Tf2N]；所述磷盐离子液体为[PBu4][Ac]。
所述的全细胞催化合成香草醛的方法，其中，所述深度低共熔溶剂为胆碱醋酸盐型DESs或胆碱氯盐型DESs。
所述的全细胞催化合成香草醛的方法，其中，所述胆碱醋酸盐型DESs为ChAc/U、ChAc/A、ChAc/G或ChAc/EG。
所述的全细胞催化合成香草醛的方法，其中，所述胆碱氯盐型DESs为ChCl/U、ChCl/A、ChCl/G或ChCl/EG。
所述的全细胞催化合成香草醛的方法，其中，所述步骤S4中，锥形瓶中还添加有无机氮源。
所述的全细胞催化合成香草醛的方法，其中，所述无机氮源为尿素。
有益效果：本发明的反应体系中，通过添加离子溶剂或无机氮源，使得香草醛的产率得到大幅提升，同时通过选用高特异性的菌株CGMCC1347，其高特异性地转化异丁香酚生成香草醛，减少了副产物的生成，降低了后期分离纯化的成本。
附图说明
图1为本发明中添加不同咪唑型离子液体对香草醛产率的影响对比图。
图2为本发明中添加不同铵盐离子液体对香草醛产率的影响对比图。
图3为本发明中添加磷盐离子液体对香草醛产率的影响对比图。
图4为本发明中添加不同胆碱醋酸盐型深度低共熔溶剂对香草醛产率的影响对比图。
图5为本发明中添加不同胆碱氯盐型深度低共熔溶剂对香草醛产率的影响对比图。
图6为本发明中添加不同含量尿素对香草醛产率的影响对比图。
图7为本发明中实施例4上清液的高效液相色谱图。
具体实施方式
本发明提供一种全细胞催化合成香草醛的方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明选取了一株高特异性的菌株，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号是：CGMCC1347，此菌株已于2005年4月8日保存于中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物保藏中心，此菌株属于纺锤芽孢杆菌Bacillus fusiformis，该菌株能够高特异性地转化异丁香酚生成香草醛，无副产物生成。
本发明所提供的全细胞催化合成香草醛的方法，其包括步骤：
S1、将保存的菌株CGMCC1347接入种子培养基中活化，32~40℃、100~300rpm振荡反应6~36h得到种子液；
S2、反应结束后，取2ml种子液接入30~70ml发酵培养基中，32~40℃、100~300rpm振荡反应12~36h得到菌液；
S3、取10ml菌液3000~6000rpm离心5~20min，弃上清，获得湿菌体；
S4、往湿菌体中加入5~15ml缓冲溶液，重悬菌体并转移至装有0.1~0.5g异丁香酚的锥形瓶中，盖上橡胶塞，25~35℃、100~300rpm振荡反应48~96h；
S5、反应结束后，加入5~15ml95%乙醇以终止反应，沉淀蛋白并溶解底物和产物，充分混匀后5000~8000rpm离心10min；
S6、取离心后的上清液，用乙醇稀释，过滤后得到香草醛。
所述步骤S4中，锥形瓶中还添加有50~150µl离子溶剂，本发明中所采用的离子溶剂分为离子液体(ILs)和深度低共熔溶剂(DESs)两大类。
其中的离子液体(ILs)是由特定的有机阳离子和无机或有机阴离子构成的在室温或近室温下呈液态的熔盐体系，具有蒸汽压低、熔点低、不易挥发、溶解性能优良、可设计性高等优点，在生物催化领域具有很高的应用价值。
其中的深度低共熔溶剂(DESs)是由季铵盐和氢键供体按照一定的摩尔比混合而成的低熔点混合物，是一种新型的离子溶剂，与传统的离子液体性质相近，而且具有原料成本更低、制备更简单、生物相容性更高、溶剂设计选择范围更广等优点。酶在含有DES的体系中催化转酯化、脱氨基等反应时，其催化活性和稳定性要比在传统的有机溶剂中高。
具体来说，本发明所涉及的离子液体(ILs)有3型共35种(咪唑型离子液体17种、铵盐离子液体17种、磷盐离子液体1种)，深度低共熔溶剂(DESs)有2型共24种(胆碱醋酸盐深度低共熔溶剂12种、胆碱氯盐深度低共熔溶剂12种)。通过添加一定量不同的离子溶剂，筛选出多种离子溶剂，它们的少量添加即可提高香草醛的产率。本发明还可通过添加结构简单的无机氮源，例如尿素，来提高香草醛的产率。
实施例1
a、将保存的菌株CGMCC1347接入种子培养基中活化，37℃、220rpm振荡反应12h得到种子液，种子培养基(1L)的配方是：蛋白胨 10g、酵母膏 5g、NaCl 10g，调整pH至7.0；
b、反应结束后，取2ml种子液接入50ml发酵培养基中，37℃、220rpm振荡反应16h得到菌液，发酵培养基(1L)：蛋白胨 5g、KH2PO4 5.2g、K2HPO4.3H2O 14g、MgSO4.7H2O 1g（pH7.0）；
c、取10ml菌液5000rpm离心10min，弃上清，获得湿菌体；
d、往湿菌体中加入10ml缓冲溶液，重悬菌体并转移至装有0.246g异丁香酚和100ul离子液体的锥形瓶中，盖上橡胶塞，30℃、200rpm振荡反应72h；其中的缓冲溶液为磷酸缓冲溶液(1L)：KH2PO4 5.2g、K2HPO4·3H2O 14g；pH7.0（下同）；
e、反应结束后，加入10ml 95%（质量分数，下同）乙醇以终止反应，沉淀蛋白并溶解底物和产物，充分混匀后7000rpm离心10min；
f、取离心后的上清液，用95%乙醇稀释10倍，过滤后进行HPLC检测。
HPLC检测采用甲醇和0.01%乙酸水溶液混合梯度洗脱（0-5min，20%-60%；5-15min，60%；15-20min，60%-20%)，流速1ml/min，进样量10ul，波长270nm。
如图1所示，CONTROL为空白对照组（下同），在17种咪唑型离子液体中，有4种能够提高香草醛的产率，分别是[MMIm][MeSO4]、[EMIm][MeSO4]、[BMIm][MeSO4]、[Me(OEt)3MIm][Tf2N]，它们相对于空白对照组的产率分别是115.6%、107.7%、105.5%、111.2%。这4种咪唑型离子液体中，有3种都是以[MeSO4]作为阴离子的，说明[MeSO4]对香草醛产率的提高起了主导作用；另外，香草醛的产率还与咪唑阳离子的侧链长度呈反比关系，即咪唑阳离子的侧链长度越长，产率越低。
如图2所示，在17种铵盐离子液体中，有6种能提高香草醛的产率，分别是[Choline][Cl]、[Choline][H2PO4] 、[NMe3][MeSO3]、[NBu4][MeSO3]、[NMe3][H2PO4]及[ETM][Tf2N]，它们相对于空白对照组的产率分别是118.5%、110.2%、105.2%、112.0%、116.4%、114.8%。
如图3所示，磷盐离子液体[PBu4][Ac]能够提高香草醛的产率 ，它相对于空白对照组的产率为105.7%。
实施例2
a、将保存的菌株CGMCC1347接入种子培养基中活化，37℃、220rpm振荡反应12h得到种子液，种子培养基(1L)的配方是：蛋白胨 10g、酵母膏 5g、NaCl 10g，调整pH至7.0；
b、反应结束后，取2ml种子液接入50ml发酵培养基中，37℃、220rpm振荡反应16h得到菌液，发酵培养基(1L)：蛋白胨 5g、KH2PO4 5.2g、K2HPO4.3H2O 14g、MgSO4.7H2O 1g（pH7.0）。
c、取10ml菌液5000rpm离心10min，弃上清，获得湿菌体；
d、往湿菌体中加入10ml缓冲溶液，重悬菌体并转移至装有0.246g异丁香酚和100ul深度低共熔溶剂的锥形瓶中，盖上橡胶塞，30℃、200rpm振荡反应72h；
e、反应结束后，加入10ml 95%乙醇以终止反应，沉淀蛋白并溶解底物和产物，充分混匀后7000rpm离心10min；
f、取离心后的上清液，用95%乙醇稀释10倍，过滤后进行HPLC检测。
HPLC检测采用甲醇和0.01%乙酸水溶液混合梯度洗脱（0-5min，20%-60%；5-15min，60%；15-20min，60%-20%)，流速1ml/min，进样量10ul，波长270nm。
如图4和图5所示，除了1种DES（ChCl/U (1:1，摩尔比，下同)）的产率略低于空白对照组外，其余23种DESs都能明显提高香草醛产率。其中，可提高香草醛产率的胆碱醋酸盐型DESs为ChAc/U (2:1)、ChAc/U (1:1)、ChAc/U (1:2)、ChAc/A (2:1)、ChAc/A (1:1)、ChAc/A(1:2)、ChAc/G (2:1)、ChAc/G (1:1)、ChAc/G (1:2)、ChAc/EG (2:1) 、ChAc/EG (1:1) 或ChAc/EG (1:2)，并且大部分的胆碱醋酸盐型DESs使相对产率达到120%以上，最高可达140%以上；添加胆碱氯盐型DESs的产率普遍在120%左右， 可提高香草醛产率的胆碱氯盐型DESs为ChCl/U (2:1)、ChCl/U (1:2)、ChCl/A (2:1)、ChCl/A (1:1)、ChCl/A (1:2)、ChCl/G (2:1)、ChClG (1:1)、ChCl/G (1:2)、ChCl/EG (2:1) 、ChCl/EG (1:1) 或ChCl/EG (1:2)。说明在使用CGMCC1347全细胞催化异丁香酚生成香草醛的应用上，DESs的少量添加即可提高香草醛的产率，胆碱醋酸盐型DESs明显优于胆碱氯盐型DESs。
实施例3
a、将保存的菌株CGMCC1347接入种子培养基中活化，37℃、220rpm振荡反应12h得到种子液，种子培养基(1L)的配方是：蛋白胨 10g、酵母膏 5g、NaCl 10g，调整pH至7.0；
b、反应结束后，取2ml种子液接入50ml发酵培养基中，37℃、220rpm振荡反应16h得到菌液，发酵培养基(1L)：蛋白胨 5g、KH2PO4 5.2g、K2HPO4.3H2O 14g、MgSO4.7H2O 1g（pH7.0）；
c、取10ml菌液5000rpm离心10min，弃上清，获得湿菌体；
d、用缓冲溶液重悬菌体并转移至装有0.246g异丁香酚和一定量尿素的锥形瓶中，添加缓冲溶液使反应体系达到10ml。盖上橡胶塞，30℃、200rpm振荡反应72h；
e、反应结束后，加入10ml 95%乙醇以终止反应，沉淀蛋白并溶解底物和产物，充分混匀后7000rpm离心10min；
f、取离心后的上清液，用95%乙醇稀释10倍，过滤后进行HPLC检测。
HPLC检测采用甲醇和0.01%乙酸水溶液混合梯度洗脱（0-5min，20%-60%；5-15min，60%；15-20min，60%-20%)，流速1ml/min，进样量10ul，波长270nm。
如图6所示，香草醛的产率与反应体系中尿素的含量有关，体系中含有5.4%（质量分数）的尿素时，香草醛的产率最高，相对产率可达170%以上。另外，在实施例3中的无机氮源同样可以是除尿素之外的其他氮源。
实施例4
a、将保存的菌株CGMCC1347接入种子培养基中活化，37℃、220rpm振荡反应12h得到种子液，种子培养基(1L)的配方是：蛋白胨 10g、酵母膏 5g、NaCl 10g，调整pH至7.0；
b、反应结束后，取2ml种子液接入50ml发酵培养基中，37℃、220rpm振荡反应16h得到菌液，发酵培养基(1L)：蛋白胨 5g、KH2PO4 5.2g、K2HPO4.3H2O 14g、MgSO4.7H2O 1g（pH7.0）；
c、取10ml菌液5000rpm离心10min，弃上清，获得湿菌体；
d、用10ml缓冲溶液重悬菌体并转移至装有0.246g异丁香酚的锥形瓶中。盖上橡胶塞，30℃、200rpm振荡反应72h；
e、反应结束后，加入10ml 95%乙醇以终止反应，沉淀蛋白并溶解底物和产物，充分混匀后7000rpm离心10min；
f、取离心后的上清液，用95%乙醇稀释10倍，过滤后进行HPLC检测。
HPLC检测采用甲醇和0.01%乙酸水溶液混合梯度洗脱（0-5min，20%-60%；5-15min，60%；15-20min，60%-20%)，流速1ml/min，进样量10ul，波长270nm。
如图7所示，图谱的基线平稳，只有两个明显的峰，分别是产物—香草醛（6.645min）和底物—异丁香酚（11.859min），且区分度高、峰型好。说明CGMCC1347确实能够高特异性地转化异丁香酚生成香草醛。
本发明中，各专用名词的简称及全称如下：
离子液体 ILs
1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐 [BMIm][PF6]
1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐 [BMIm][BF4]
1,3-二甲基咪唑硫酸甲酯盐 [MMIm][MeSO4]
1-乙基-3-甲基咪唑硫酸甲酯盐 [EMIm][MeSO4]
1-丁基-3-甲基咪唑硫酸甲酯盐 [BMIm][MeSO4]
1-乙基-3-甲基咪唑双三氟甲磺酰亚胺盐 [EMIm][Tf2N]
1-丁基-3-甲基咪唑双三氟甲磺酰亚胺盐 [BMIm][Tf2N]
1-庚基-3-甲基咪唑双三氟甲磺酰亚胺盐 [C7-MIm][Tf2N]
1-十二烷基-3-甲基咪唑双三氟甲磺酰亚胺盐 [C12-MIm][Tf2N]
1-十六烷基-3-甲基咪唑双三氟甲磺酰亚胺盐 [C16-MIm][TF2N]
1-甲氧三甘醚基-3-甲基咪唑双三氟甲磺酰亚胺盐 [Me(OEt)3MIm][Tf2N]
1-乙基-3-甲基咪唑三氟甲磺酸盐 [EMIm][TFO]
1-丁基-3-甲基咪唑三氟甲磺酸盐 [BMIm][TFO]
1-己基-3-甲基咪唑三氟甲磺酸盐 [HMIm][TFO]
1-庚基-3-甲基咪唑三氟甲磺酸盐 [C7-MIm][TFO]
1-十二烷基-3-甲基咪唑三氟甲磺酸盐 [C12-MIm][TFO]
1-十六烷基-3-甲基咪唑三氟甲磺酸盐 [C16-MIm][TFO]
胆碱氯盐 [Choline][Cl]
胆碱醋酸盐 [Choline][Ac]
胆碱硝酸盐 [Choline][NO3]
胆碱甲磺酸盐 [Choline][MeSO3]
胆碱磷酸二氢盐 [Choline][H2PO4]
四甲基铵醋酸盐 [NMe4][Ac]
四乙基铵醋酸盐 [NEt4][Ac]
四丁基铵醋酸盐 [NBu4][Ac]
四丁基磷醋酸盐 [PBu4][Ac]
三甲基铵甲磺酸盐 [NHMe3][MeSO3]
四丁基铵甲磺酸盐 [NBu4][MeSO3]
三甲基铵磷酸二氢盐 [NHMe3][H2PO4]
三乙基铵磷酸二氢盐 [NHEt3][H2PO4]
三丁基铵磷酸二氢盐 [NHBu3][H2PO4]
四甲基铵磷酸二氢盐 [NHMe4][H2PO4]
三甲基乙铵双三氟甲磺酰亚胺盐 [ETM][Tf2N]
三甲基丁铵双三氟甲磺酰亚胺盐 [BTM][Tf2N]
三甲基己铵双三氟甲磺酰亚胺盐 [HTM][Tf2N]
深度低共熔溶剂 DESs
胆碱醋酸盐/尿素 ChAc/U
胆碱醋酸盐/乙酰胺 ChAc/A
胆碱醋酸盐/甘油 ChAc/G
胆碱醋酸盐/乙二醇 ChAc/EG
胆碱氯盐/尿素 ChCl/U
胆碱氯盐/乙酰胺 ChCl/A
胆碱氯盐/甘油 ChCl/G
胆碱氯盐/乙二醇 ChCl/EG
综上所述，本发明的反应体系中，通过添加离子溶剂或无机氮源，使得香草醛的产率得到大幅提升，同时通过选用高特异性的菌株CGMCC1347，其高特异性地转化异丁香酚生成香草醛，并且减少了副产物的生成，降低了后期分离纯化的成本。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (2)

1.一种全细胞催化合成香草醛的方法，其特征在于，包括步骤：
S1、将保存的菌株CGMCC1347接入种子培养基中活化，32~40℃、100~300rpm振荡反应6~36h得到种子液；
S2、反应结束后，取2ml种子液接入30~70ml发酵培养基中，32~40℃、100~300rpm振荡反应12~36h得到菌液；
S3、取10ml菌液3000~6000rpm离心5~20min，弃上清，获得湿菌体；
S4、往湿菌体中加入5~15ml缓冲溶液，重悬菌体并转移至装有0.1~0.5g异丁香酚的锥形瓶中，盖上橡胶塞，25~35℃、100~300rpm振荡反应48~96h；
S5、反应结束后，加入5~15ml95%乙醇以终止反应，沉淀蛋白并溶解底物和产物，充分混匀后5000~8000rpm离心10min；
S6、取离心后的上清液，用乙醇稀释，过滤后得到香草醛；
所述步骤S4中，锥形瓶中还添加有50~150ul离子溶剂；
所述离子溶剂为深度低共熔溶剂；
所述深度低共熔溶剂为胆碱醋酸盐型DESs或胆碱氯盐型DESs；
所述胆碱醋酸盐型DESs为ChAc/U、ChAc/A、ChAc/G或ChAc/EG；
所述胆碱氯盐型DESs为ChCl/U、ChCl/A、ChCl/G或ChCl/EG。
2.根据权利要求1所述的全细胞催化合成香草醛的方法，其特征在于，所述步骤S4中，锥形瓶中还添加有无机氮源；
所述无机氮源为尿素。
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