CN101056544B - γ-内酯的立体选择性制备 - Google Patents

Abstract

用于立体选择性制备(R)或(S)γ-内酯的本发明方法为微生物生物合成γ-内酯，其中所述生物合成在菌株的作用下从选自C5-C20脂肪酸的底物进行，所述菌株选自那些能在C4位立体选择性羟基化所述底物的菌株，特别为曲霉或被孢霉。还公开了所述γ-内酯的生物合成及其在香料中的用途，以及用于食品调味剂的用途。

Description

γ-内酯的立体选择性制备

本发明涉及立体选择性合成γ-内酯，特别是天然的γ-内酯的方法。 

“天然”产品日益受到普通大众的喜爱，因此，使用芳香化合物或有气味化合物的行业关注于开发“天然”芳香物质和制品。只有已在自然界中被鉴别的物质能有望获得该标志；因此它们目前由植物或由微生物产生；后者日益得到广泛应用，目前生物技术方法使以合理的费用合成天然分子成为可能。γ-内酯正是上述这种情况。 

γ-内酯是芳香分子，其构成了许多天然产品的香气和香味。例如，γ-庚内酯因其榛子或焦糖香气和味道而众所周知，γ-壬内酯具有油脂、奶油或椰子香气；γ-癸内酯和γ-十一内酯具有桃子或杏香气和味道。 

γ-内酯以其两种对映异构体形式(R)和(S)天然存在，但是(R)对映异构体占优势。 

可通过合成产生或利用微生物通过生物合成产生γ-内酯。于是，EP371568描述了利用微生物产生γ-内酯的方法，该微生物对于制备食品是可接受的，例如，特别是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、汉森德巴利酵母(Debaromyces hansenii)或波氏假丝酵母(Candidaboidinii)。 

US5,112,803表明γ-辛内酯，特别是其(R)和(S)旋光异构体可用于形成黄油香气和香味，并描述了增加可被消费物质的香气或香味的方法，其通过加入显著量的具有光学活性的γ-辛内酯和多种化合物的混合物来实现，该多种化合物是所述专利中描述的用于获得γ-辛内酯的生物方法的副产物。US5,112,803中描述的方法表明可采用辛酸利用Syncephalastratum sp.属或被孢霉属(Mortierella sp.)通过生物合成获得γ-辛内酯的两种(R)和(S)异构体；但是，该方法不具有对映选择性。 

γ-内酯在食品调味品行业和香料行业中具有极大价值，以及实际的工业大投资关注于产生具有不同的感官细微差别的产品。 

公知挥发性分子的手性可引起不同的嗅觉，以及γ-内酯的旋光异 构体并不是都具有相同的感官香调：因此产生γ-内酯的特定旋光异构体具有重要优势，特别是采用与现有技术相比至少同样有效或甚至更有效的方法并以有竞争性的成本实现该生产。 

迄今为止，据申请人所知，还不存在用于直接得到天然的γ-内酯的对映异构体的立体选择性方法。公知的方法产生对映异构体的混合物，通常通过在取代的环糊精的毛细管柱上进行气相色谱或衍生化后来进行所要的对映异构体的分离。 

因此，本发明的目的是提供有效的、经济的并具有立体选择性的生物合成γ-内酯的方法。 

本发明涉及(R)-γ-内酯和(S)-γ-内酯的合成。出于本发明的目的，(R)和(S)表示在所述γ-内酯的4位上的不对称碳的位置。 

根据本发明所述方法优选合成的γ-内酯是对应于式(I)的本发明的C₅-C₂₀γ-内酯： 

其中内酯环可在2位碳和3位碳之间具有不饱和，且其中R1为C_1-16烯基、C_1-16炔基或C_1-16烷基基团，并除了5位碳以外任选地具有一个或多个取代的碳。措辞“取代的烯基或炔基或烷基”是指至少一个碳具有至少一个取代基基团的烯基或炔基或烷基。术语“取代基基团”特别是指羟基基团、酮基基团、硫醇基团、烷基基团或烯基基团。 

本发明因此涉及用于立体选择性制备γ-内酯的方法，其特征在于进行γ-内酯的微生物生物合成，尤其是以上通式(I)的γ-内酯的微生物生物合成，其中所述内酯环可在2位碳和3位碳之间具有不饱和，并优选是饱和的，且其中R1为任选取代的C_1-16烯基、C_1-16炔基或C_1-16烷基，所述生物合成采用菌株的生物培养物从至少一种底物、优选为脂肪酸来进行，该菌株选自能够在C4位立体选择性羟基化所述底物的菌株。 

本发明涉及采用合适菌株的微生物培养物，从至少一种底物生物 制备γ-内酯，特别是立体选择性合成γ-内酯的每一(R)或(S)光学异构体。 

所述制备包括如下步骤： 

a)选择合适的菌株， 

b)在合适的培养基中培养所述菌株，在进行所述培养之前任选地存在预培养该菌株的步骤， 

c)加入可被转化为γ-内酯的底物， 

d)将该底物生物转化为γ-内酯， 

e)回收所产生的γ-内酯。 

旨在生物合成本发明的γ-内酯的步骤a)中的合适的微生物菌株是那些能够特异性羟基化所述底物的菌株。根据本发明的优选实施方案，旨在生物合成本发明的γ-内酯的步骤a)中的合适的微生物菌株是那些能够在C₄位进行立体选择性羟基化所述底物的菌株。因此，根据本发明，得到C4位的碳为(R)构型或(S)构型的γ-内酯。 

当由生物合成产生的产物用于食品工业时，当然优选食品级的菌株。在能够进行立体选择性羟基化的菌株中，可特别提及曲霉属(Aspergillus sp.)、青霉属(Penicillium sp.)、毛霉菌属(Mucor sp.)、被孢霉属(Mortierella sp.)的菌株。因为这些菌株均属于1类微生物，且由于部分菌株是食用菌株，因此它们的应用不会对内酯的工业生产或对内酯在食品中的可能应用造成任何特殊问题。根据本发明的具体实施方案，所用的菌株为曲霉属，优选米曲霉(Aspergillus oryzae)，其中可提及如下菌株的集合：米曲霉DSMZ1861、米曲霉DSMZ1864、米曲霉DSMZ1147、米曲霉DSMZ63303、米曲霉CBS570.65、米曲霉CBS819.72、米曲霉CBS110.27、米曲霉VMF88093。 

其中，优选米曲霉DSMZ1861和米曲霉CBS110.27。 

根据另一具体实施方案，所用的菌株为被孢霉属，其中可提及如下种类的集合：深黄被孢霉(Mortierella isabellina)DSMZ1414、深黄被孢霉CBS100559、深黄被孢霉CBS221.29、深黄被孢霉CBS194.28、深黄被孢霉CBS208.32、深黄被孢霉CBS224.35、深黄被孢霉CBS560.63、深黄被孢霉CBS167.80、深黄被孢霉CBS493.83、深黄被孢霉CBS 309.93、深黄被孢霉CBS 250.95、深黄被孢霉CBS 109075、拉曼被孢霉(Mortierella ramanniana)CBS 112.08、拉曼被孢霉CBS219.47、拉曼被孢霉CBS 243.58、拉曼被孢霉CBS 478.63、拉曼被孢霉CBS 852.72、拉曼被孢霉CBS 366.95、拉曼被孢霉CBS 101226。 

事实上，发明人惊讶并出乎意料地发现使用曲霉属的菌株导致选择性产生(R)-γ-内酯，使用被孢霉属的菌株导致选择性产生(S)-γ-内酯。 

根据本发明的一个实施方案，由于其不能在C₄位引起羟基化，因此本发明将解脂耶罗威亚酵母(Yarrowia lipolytica)菌株排除在外。有利的是，本发明将不能特异地及立体选择性地在C₄位产生羟基化的所有菌株排除在外。 

不被任何理论所束缚，可预计培养所述菌株的条件在所观察到的立体选择性以及生物转化的数量方面具有重要性。 

本发明所述方法的步骤b)中进行的培养包括在合适的培养基中，例如通过细胞扩增制备所述菌株的培养物，优选半浓缩培养物。可在进行该培养之前，使所述菌株在更适于进行该菌株增殖的第一步骤的第一培养基中进行预培养。 

在本发明的立体选择性方法中使用的培养条件应是导致菌丝体产生的条件，该菌丝体显示有充满内含物的膨胀(特别是有过氧化物酶体)。根据本发明的优选实施方案，所制备的细胞培养物具有“肿胀的(compoteux)”的菌丝体，该菌丝体由不带有分生孢子的区室化的菌丝组成，并显示出凸起结构，充满这些内含物(特别是过氧化物酶体)。该培养条件实际上特别适于防止该菌丝体的孢子形成。此外，发明人能够注意到所述菌丝体的生理状态，特别是由于使用本申请所述的培养条件而得到的菌丝体(区室化的菌丝体含有充满内含物、特别是充满过氧化物酶体的膨胀和凸起)的生理状态对反应收率具有相当大的影响，并使得能获得比现有技术更高的收率。菌丝体的生理状态还对反应的立体选择性有影响。 

因此，根据本发明的优选实施方案，本发明方法中的步骤b)是在合适培养基中培养菌株，以便得到含有充满内含物、特别是充满过氧 化物酶体的膨胀和凸起的区室化的菌丝体的步骤。有利地，本发明所用的培养基不含有蛋白胨，优选地，本发明所用的培养基包含麦芽和/或酵母提取物。根据优选实施方案，用于步骤c)的菌丝体是浓缩的。优选地，用于步骤c)的菌丝体的浓度为5-15g/l，优选6-12g/l，非常优选7-10g/l。 

尤其注意到通过使用上述的充满内含物的膨胀菌丝体，在立体选择性和收率方面特别促进了由被孢菌霉菌株产生(S)-γ-内酯；实际上，使用这种菌丝体可以得到具有以绝对值表示的比现有技术更大的旋光性的反应产物；此外，通过本发明所述方法得到的收率，特别是通过使用上述的充满内含物的膨胀菌丝体得到的收率能够比通过现有技术得到的收率更高。 

所述方法的步骤c)为向所述细胞培养物中加入所述底物。根据本发明，γ-内酯的生物合成涉及合适的底物。 

出于本发明的目的，术语“合适的底物”是指含有至少5个碳的饱和或不饱和的直链脂肪酸，且优选5至20个碳，除5位碳以外任选地分支或被取代，以及所述脂肪酸的酯；优选甲酯或乙酯。 

在优选的底物中，可提及：戊酸，其为产生γ-戊内酯的C₅酸；己酸，其为产生γ-己内酯的C₆酸；庚酸，其为产生γ-庚内酯的C₇酸；辛酸，其为产生γ-辛内酯的C₈酸；壬酸，其为产生γ-壬内酯的C₉酸；癸酸，其为产生γ-癸内酯的C₁₀酸；十一烷酸，其为产生γ-十一内酯的C₁₁酸；十一烯酸，其为产生γ-十一烯内酯的C₁₁酸；月桂酸，其为产生γ-十二内酯的C₁₂酸；肉豆蔻酸，其为产生γ-十四内酯的C₁₄酸；棕榈酸，其为产生γ-十六内酯的C₁₆酸；棕榈油酸，其为产生γ-十六烯内酯的不饱和C₁₆酸；硬脂酸，其为产生γ-十八内酯的C₁₈酸；油酸，其为产生γ-十八烯内酯的C₁₈酸；亚油酸，其为产生γ-十八碳二烯内酯的C₁₈酸；亚麻酸，其为产生γ-十八碳三烯酸内酯的C₁₈酸；以及花生酸，其为产生γ-二十内酯的C₂₀酸，以及上述酸的酯，优选其乙酯或甲酯。 

尽管它们是罕有的，但还可将C₁₃、C₁₅、C₁₇和C₁₉脂肪酸及其乙酯或甲酯氧化并分别产生C₁₃、C₁₅、C₁₇和C₁₉γ-内酯。

无需声明所述底物可以是任何合适的底物，或多种合适底物的混合物，特别是特定的酸与其一种或多种酯的混合物。 

根据本发明的有有益实施方案，采用分批发酵法或分批进料法将所述底物加入到所述菌丝体中。根据优选实施方案，在将所述底物与所述菌丝体接触前，以与辅助材料的混合物形式加入该底物，该辅助材料例如为油，特别是任何常规的食用油，如大豆油、玉米油、葵花子油等，或诸如miglyol的合成的短链脂肪酸甘油三酯，优选被氢化的或富含油酸的葵花子油。辅助材料的存在可以尤其极大地减少所述底物的腐蚀性或毒性作用。根据本发明的一个实施方案，使用深黄被孢霉菌株的本发明所述的合成在不含矿物油的培养基中进行。有利地，以0.3-2.5g/l/h的浓度加入所述底物。有利地，与所述底物混合物的油(优选植物油)的量为100-500g/l，优选150-300g/l。 

在加入所述底物的同时，还向所述培养基中加入糖源，优选葡萄糖，以确保提供所述细胞需要的能量。有利地，加入的葡萄糖的浓度为0.3-0.4g/l/h。 

如果需要，在加入所述底物期间以及随后进行的生物转化期间，通过加入任何合适的碱来调节pH。有利地，pH应为4.5-8.5，优选5.5-8，且优选6-7.5。 

在生物转化期间，温度优选保持在27℃-30℃。生物转化的持续期为30-120小时，优选48-72小时。 

在本发明所述方法的步骤d)中涉及的所述底物向γ-内酯的生物转化是由所述菌株进行所述底物在C₄位的羟基化反应，随后进行内酯化所构成。为了可以进行该羟基化，需要氧源。该氧源优选含氧的气体，非常优选空气或氧气。将该气体以相对大的量溶解于所述反应培养基中。 

根据优选实施方案且是本领域公知的，消泡剂，特别是硅油或用脂肪酸酯化的聚乙二醇的聚合物用于控制在生物转化期间可能形成的泡沫。 

一旦完成生物转化，即完成在C4位完成特异性和立体选择性羟基化，之后的内酯化后，所述方法的步骤e)为通过提取回收所述γ-内 酯，通过任何合适的方法进行所述γ-内酯的提取。有利地，通过水蒸气蒸馏(hydrodistillation)进行γ-内酯的提取，任选地然后进行酯化，旨在随后去除未反应的所述底物。 

或者，在将所述培养基酸化后，通过溶剂(环己烷，乙酸乙酯)提取进行γ-内酯的提取。 

根据本发明方法的变体，不实施所述方法的的步骤e)，改为实施步骤e’)，该步骤为在步骤d)结束时，在提取前，通过将所得到的γ-内酯在原位还原来继续所述方法。步骤e’)可以获得更饱和的(R)-或(S)-γ-内酯，这取决于在步骤d)中得到γ-内酯的立体化学。 

根据第一实施方案，可进行还原直到获得饱和的内酯为止。根据第二实施方案，可停止还原，以便得到γ-内酯，该γ-内酯的侧链与来源于步骤d)的生物转化的γ-内酯的侧链相比具有较少的不饱和。根据此其它实施方案，在步骤d)结束时，在停止发酵罐的pH调节时，向所述反应器中加入活性干酵母和糖源来继续本发明所述方法，该干酵母可以为面包酵母、制酒酵母或啤酒酵母，该糖源尤其为葡萄糖。当pH值达到5.5时，用诸如氢氧化钠NaOH的合适的碱将pH调节在5.5。将所述混合物孵育，优选孵育12-24小时，然后提取γ-内酯。根据另一变体，可使用还原性微生物的新鲜培养物，或使用至少在还原条件下放置的微生物来将来源于步骤d)的γ-内酯还原，所述微生物例如为酿酒酵母或Pichia etchelsii、甲醇酵母(Pichia pastoris)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)或短乳杆菌(Lactobacillus brevis)。 

步骤e’)中的还原导致产生比来源于步骤d)的γ-内酯更饱和的γ-内酯。根据此特定实施方案得到的这些更饱和的γ-内酯在4位具有不对称碳，具有与衍生其的较少饱和的γ-内酯相同的构型，因为所述还原反应不改变所述分子的立体异构现象。 

根据本发明所述方法得到的γ-内酯具有气味和味觉特性，因此它们可用于所有的香料和食品调味料应用，特别用于产生香料、或有气味物质、或化妆品组合物或食品组合物，或用作食品添加剂。 

出于本发明的目的，术语“香料”不仅表示该术语通常意义上的 香料，而且表示其它领域，在该领域中产品的气味是重要的。这可以是该术语通常意义上的香料组合物，如芳香基质和浓缩物、古龙水、香水、香精和类似的产品；局部用组合物-特别是化妆用组合物，如面霜和体霜、滑石粉、发油、香波、发乳、浴盐和沐浴油、淋浴胶和沐浴胶、香皂、止汗剂和身体除臭剂、剃须液和剃须霜、肥皂、霜、牙膏、漱口剂、膏和类似的产品；以及保养产品，如软化剂、去污剂、洗衣粉、空气清新剂和类似的产品。 

术语“有气味的”表示散发气味的化合物。 

术语“食品调味料”是指本发明所述化合物在任何人用食品或兽用食品、液体食品或固体食品中的调味料中的任何应用，特别是在饮料、乳制品、冰淇淋中的应用。 

(R)或(S)γ-内酯、或(R)和(S)γ-内酯的混合物可用于芳香组合物中，以便提供外来的、花的或水果香调。根据本申请，可使用所述(S)对映异构体或所述(R)对映异构体或由本领域技术人员确定比例的两种对映异构体的混合物。 

优选地，通过本发明所述方法得到的本发明的γ-内酯以相对于其所存在的组合物总重量的0.0025％-10％重量比的量使用。它们可用于构成固体或液体组合物，尤其是凝胶组合物、霜组合物、膏组合物和/或喷雾组合物。 

通过本发明所述方法得到γ-内酯还可用于本身具有气味的组合物中，或用于其中添味剂是用于掩盖或中和某些气味的组合物中。 

阅读下文所述的实施例之后，将清楚地了解本发明的其它特征和优点，所述实施例是示例性说明本发明，而不是限制本发明。 

实施例1，步骤a：-选择菌株 

将收集的所有菌株首先接种在MGY琼脂培养基上，并在27℃下孵育72小时；随后将这些菌株接种在含有100ml1x麦芽培养基的1升锥形瓶内，并在27℃下孵育24小时。然后将底物，十一烯酸，加入到该培养基(5g/l，分10份)中，并将该培养物在27℃下再保持48小时至120小时。

在嗅气味和分析所述培养基中的γ-十一烯内酯浓度后，选择最有利的菌株；该最有利的菌株为深黄被孢霉CBS100559、深黄被孢霉CBS221.29、米曲霉DSMZ1861和米曲霉CBS110.27菌株，随后这些菌株用于发酵罐优化试验。 

实施例1，步骤b：-制备细胞培养物 

将深黄被孢霉CBS100559、深黄被孢霉CBS221.29、米曲霉DSMZ1861和米曲霉CBS110.27菌株(起源＝在-80℃下冷冻的试管)接种在MGY琼脂上并在27℃下孵育30小时。 

将上述预培养物接种在61发酵罐内的51的1x麦芽培养基中： 

麦芽提取物：             165g 

酵母提取物：             25g 

H₂Oqs：                   51 

pH：                     6.5 

深黄被孢霉

在27℃下，500rpm，3.51/1/h的空气，pH自由(pH libre)的条件下孵育30小时。 

米曲霉

在20℃，500rpm，0.05vvm的空气，pH自由的条件下孵育30小时，然后在25℃，500rpm，0.05vvm的空气，pH自由的条件下孵育24小时。在两种情况下，应得到含有许多大的充满内含物(包括过氧化物酶体)的凸起的菌丝体。 

然后在3001发酵罐中制备1251的1.5x麦芽培养基： 

麦芽提取物：          6.188kg 

酵母提取物：          0.938kg 

H₂O qs：                1251 

将该培养基在121℃下灭菌40分钟。发酵罐及其零件是无菌和加 压的。温度是稳定的并调节在27℃。释放压力并保持3.51/l/h，即约0.6m³/h的空气流速。将碱(10N NaOH)、酸(85％H₃PO₄)、消泡剂和用作接种物的61发酵罐无菌地集合在一起。将搅拌速度调整至325rpm，开始加入该消泡剂，然后接种该接种物(51)，pH自由。将搅拌速度保持在325rpm，并将通气增加到2.2m³/h(0.3vvm)。让其继续生长24小时，以便基于干重有约10g/l的菌丝体：该菌丝体应是“肿胀的”并由包含多个凸起和膨胀的没有孢子的菌丝组成。 

实施例2，步骤c和d：用被孢霉菌株进行月桂酸的转化 

一旦达到一定数量和质量的菌丝体后，将底物(月桂酸)在mygliol中给料。将葡萄糖平行地以0.36g/l/h的流速持续给料55小时。在整个发酵期间，用5N NaOH将pH在7。将速度增加到900rpm并以1vvm，即12m³/h的流速进行通气。转化进行55小时。得到收率为12g/l的(S)-γ-十二内酯。为了进行比较，根据第5,457,036号美国专利(Han)所教导的，采用第5,457,036号美国专利中描述的被孢霉菌株制备γ-十二内酯。 

当使用Han方法时，得到的收率为4-6.5g/l的等级；作为比较，当使用本发明所述的方法，使用具有内含物的凸起的“肿胀的”菌丝体时，收率为12-15g/l。 

实施例3：步骤c和d：用被孢霉菌株进行辛酸的转化 

一旦达到一定数量和质量的菌丝体后，将底物以0.75g/l/h的流速给料6小时。将葡萄糖平行地以0.36g/l/h的流速持续给料。在整个发酵期间，用5N NaOH将pH在6.5。将速度增加到600rpm并以3.51/min的流速进行通气。转化进行48-74小时。得到收率为15-25g/l，通常约9g/l的(S)-辛内酯。 

为了进行比较，根据第519481号欧洲专利(Farbood)所教导的，采用第519481号欧洲专利中描述的被孢霉菌株制备γ-辛内酯；根据Farbood方法得到的产物的旋光度为-28°，这表明该产物是(R)和(S)的混合物，且(S)非常轻微地占优势；根据本发明所述方法得到的产物的 旋光度为-42°，这显示了产生(S)-γ-内酯的所述反应的选择性。 

当使用Farbood方法，得到的收率为7.5-10g/l；作为比较，当使用本发明所述方法，使用具有内含物的凸起的“肿胀的”菌丝体时，收率为15-25g/l。 

实施例4：步骤c和d：用被孢霉菌株进行己酸的转化 

一旦达到一定数量和质量的菌丝体后，将底物以0.3g/l/h的流速给料6小时。将葡萄糖平行地以0.36g/l/h的流速持续给料。在整个发酵期间，用5N NaOH将pH调节在6.5。将速度增加到600rpm并以3.51/min的流速进行通气。转化进行48-74小时。得到收率为6g/l的(S)-己内酯。 

实施例5：步骤c和d：用曲霉菌株进行十一烯酸的转化 

一旦达到一定数量和质量的菌丝体后，将十一烯酸以0.3g/l/h的流速给料6小时，然后以0.53g/l/h的流速给料72小时：即总共为40g/l。该十一烯酸作为与氢化的葵花子油(1/4酸-3/4油)的混合物形式给料；因此该油以0.9g/l/h的流速，然后以1.53g/l/h的流速进行给料。将葡萄糖平行地以0.36g/l/h的流速连续给料72小时。在整个发酵期间，用5N NaOH将pH调节在7.5。将速度增加到505rpm并以1vvm，即12m³/h的流速进行通气。转化进行72小时。 

得到6.5g/l(S)立体异构的γ-十一烯内酯。 

实施例6：步骤c和d：用被孢霉菌株进行十一烷酸的转化 

一旦达到一定数量和质量的菌丝体后，将十一烷酸以0.3g/l/h的流速给料6小时，随后以0.53g/l/h的流速给料3.5小时，然后以0.75g/1/h给料3.5小时，以1g/l/h给料18小时。将该十一烷酸作为与氢化的葵花子油的混合物(1/4酸-3/4油)形式给料。将葡萄糖平行地以0.36g/l/h的流速持续给料24小时。在整个发酵期间，用5N NaOH将pH调节在7.5。将速度增加到505rpm并以1vvm，即12m³/h的流速进行通气。转化进行48小时。

得到19g/l(S)立体异构的γ-十一内酯。 

实施例7：步骤c和d：用曲霉菌株进行十一烯酸的转化 

一旦达到一定数量和质量的菌丝体后，将十一烯酸以0.3g/l/h的流速给料6小时，然后以0.53g/l/h的流速给料72小时：即总共为40g/l。该十一烯酸作为与氢化的葵花子油(1/4酸-3/4油)的混合物形式给料。将葡萄糖平行地以0.36g/l/h的流速连续给料72小时。在整个发酵期间，用5N NaOH将pH调节在6.5。以0.5vvm，即6m³/h的流速进行通气。转化进行80小时。得到0.5g/l(R)立体异构的γ-十一烯内酯。 

实施例8：步骤c和d：用曲霉菌株进行己酸的转化 

一旦达到一定数量和质量的菌丝体后，将己酸以1.64g/l/h的流速给料24小时，然后以2g/l/h的流速给料72小时：即总共为183g/l。将该己酸作为与氢化的葵花子油的混合物(1/2酸-1/2油)形式给料。将葡萄糖平行地以0.36g/l/h的流速持续地给料。在整个发酵期间，用5NNaOH将pH调节在6.5。以0.5vvm，即6m³/h的流速进行通气。在72小时-96小时后，得到15g/l(R)立体异构的γ-己内酯。 

实施例9：步骤e：提取-纯化 

用31的85％磷酸完成在pH1.5的酸化。在大于100℃下加热30分钟以便使内酯基本上为其环状形式，而不为其开链的羟基酸形式。定量测定所述内酯，加入提取溶剂(优选环己烷)，并在环境温度下搅拌混合物1小时。进行离心分离并回收有机相。定量地测定所述内酯。将溶剂浓缩，因此得到油状的“粗品”。进行真空蒸馏。得到“脱胶脂的”内酯和废油(exhausted oil)。随后通过真空分馏该内酯来进行纯化。得到纯度>99％的产物，如果使用被孢霉菌株，则产物为γ-十一烯内酯(>99％S)，如果使用曲霉菌株，则产物为γ-十一烯内酯(>99％R)。 

(R)或(S)γ-十一烯内酯、或(R)和(S)γ-十一烯内酯的混合物，以及(R)或(S)γ-十一内酯、或(R)和(S)γ-十一内酯的混合物可用于芳香组合物中，以便提供外来的、花的或水果香调，这使申请人已将γ-十一烯 内酯注册为商标

。根据本申请，可使用所述(S)对映异构体或所述(R)对映异构体或由本领域技术人员确定比例的两种对映异构体的混合物。

Claims (11)

1.立体选择性制备通式(I)的γ-内酯的方法，其特征在于进行通式(I)的γ-内酯的微生物生物合成：

其中内酯环可在2位碳和3位碳之间具有不饱和，且其中R1为C_2-16烯基、C_2-16炔基或C_1-16烷基基团，所述生物合成采用菌株的微生物培养物从选自脂肪酸和脂肪酸的甲酯或乙酯的底物进行，所述菌株选自能够在C₄位上特异性羟基化所述底物的曲霉属或被孢霉属菌株，所述方法包括如下步骤：

a)选择合适的菌株，所述菌株选自能够在C₄位上特异性羟基化所述底物的曲霉属或被孢霉属菌株，

b)在合适的培养基中培养所述菌株，所述培养基不含蛋白胨，得到的细胞培养物具有“肿胀的”的菌丝体，所述菌丝体由不带有分生孢子的区室化的菌丝组成，并显示出充满内含物的凸起结构，

c)加入可被转化为式(I)的γ-内酯的底物，

d)将所述底物生物转化为式(I)的γ-内酯，

e)回收所产生的γ-内酯。

2.权利要求1所述的立体选择性制备通式(I)的γ-内酯的方法，其特征在于步骤a)中的所述微生物菌株选自曲霉属菌株，以及产生的γ-内酯是(R)-γ-内酯。

3.权利要求2所述的立体选择性制备通式(I)的γ-内酯的方法，其特征在于步骤a)中的所述微生物菌株是米曲霉菌株。

4.权利要求1所述的立体选择性制备通式(I)的γ-内酯的方法，其特征在于步骤a)中的所述微生物菌株选自被孢霉属菌株，以及产生的内酯为(S)-γ-内酯。

5.权利要求4所述的立体选择性制备通式(I)的γ-内酯的方法，其特征在于步骤a)中的所述微生物菌株是深黄被孢霉菌株。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述底物选自含有5至20个碳的饱和或不饱和的直链脂肪酸以及所述脂肪酸的酯。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于所述底物选自戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸、十一烷酸、十一烯酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸和花生酸，及上述酸的酯。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于所述底物选自戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸、十一烷酸、十一烯酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸和花生酸的乙酯或甲酯。

9.如权利要求1-8中任一权利要求所述的方法，其特征在于所述底物是作为与至少一种生产辅助材料的混合物的形式加入到步骤c)中，所述生产辅助材料选自被氢化的或富含油酸的葵花子油、miglyol或葡萄糖，或这些成分的混合物。

10.如权利要求1-8中任一权利要求所述的方法，其特征在于步骤e)是通过水蒸气蒸馏来提取所述γ-内酯。

11.如权利要求1-8中任一权利要求所述的方法，其特征在于步骤e)是对步骤d)结束时得到的所述γ-内酯进行溶剂提取。