BRPI0517914B1

BRPI0517914B1 - Preparação estéreosseletiva de gama-lactonas

Info

Publication number: BRPI0517914B1
Application number: BRPI0517914-9A
Authority: BR
Inventors: Joseph Zucca; Jean Mane
Original assignee: V. Mane Fils
Priority date: 2004-11-03
Filing date: 2005-11-02
Publication date: 2019-07-16
Also published as: BRPI0517914A; PL1806978T3; FR2877340A1; US20080108116A1; WO2006048551A1; RU2007120503A; JP5055123B2; CN101056544A; IL182899A0; ATE536749T1; EP1806978B1; EP1806978A1; ES2379233T3; RU2406410C2; CA2586955A1; DK1806978T3; CA2586955C; FR2877340B1; JP2008518595A; CN101056544B

Abstract

preparação estéreo-seletiva de gama-lactonas. processo de preparação estéreo-seletiva de gama-lactona (r) ou (s), caracterizado pelo fato de que se efetua uma bio-síntese por via microbiana de gama-lactona, a bio-sintese sendo realizada a partir de pelo menos um substrato, escolhido dentre os ácidos graxos de c5 a c20 com o auxílio de uma cepa escolhida dentre aquelas que permitem uma hidroxilação estéreo-seletiva em c4 desse substrato, notadamente aspex-gillus sp ou mortiereila sp. bio-síntese dessa gama-lactona, e utilização em perfumaria e em aromática alimentícia.

Description

PREPARAÇÃO ESTEREOSSELETIVA DE GAMA-LACTONAS

A presente invenção tem por objeto um processo de síntese estereosseletiva de gama-lactonas, em particular de gama-lactonas naturais.

Os produtos naturais são cada vez mais consumidos pelo grande público e, dessa forma, as indústrias que utilizam compostos aromáticos ou odorantes empreendem seus esforços no desenvolvimento de substâncias e de preparados aromatizantes naturais. Só as substâncias que foram identificadas na natureza podem pretender esse rótulo; elas são, portanto, atualmente produzidas, seja a partir de plantas, seja a partir de microorganismos; estes últimos são cada vez mais empregados, processos biotecnológicos permitindo agora sintetizar moléculas naturais a custos razoáveis. É o caso das gama-lactonas.

As gama-lactonas são moléculas aromáticas constitutivas do aroma e do sabor de numerosos produtos naturais. Por exemplo, a gama-heptalactona é conhecida por seu aroma e seu gosto de avelã ou de caramelo, a gamanonalactona tem um aroma gordo, cremoso ou de coco; a gamadecalactona e a gama-undecenoalactona têm um aroma e um gosto de pêssego ou de damasco.

As gama-lactonas existem no estado natural, sob suas duas formas enantioméricas (R) e (S), o enantiômero (R) sendo, todavia, predominante.

As gama-lactonas podem ser produzidas por via sintética, ou por biossíntese por meio de microorganismos. Assim, EP 371 568 descreve um processo de produção de gamalactonas por meio de um microorganismo aceitável para fabricar produtos alimentícios, tais como Saccharomyces cerevisiae, Debaromyces hansenii ou Candida boidinii.

A US 5,112,803 indica que a gama-octalactona e, em particular, seus isômeros ópticos (R) e (S) são úteis

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2/19 para formar aromas e sabores de manteiga, e descreve um processo para aumentar o aroma ou o sabor de matérias consumíveis por acréscimo de quantidades significativas de gama-octalactonas opticamente ativas e de uma mistura de diferentes compostos que são subprodutos do processo biológico descrito. O processo descrito em US 5,112,803 indica que, a partir de ácido caprílico, é possível obter, por biossíntese, com o auxílio das cepas de bactérias do gênero Syncephalastratum sp. ou Mortierella sp. , os dois isômeros (R) e (S) da gama-octalactona; todavia, esse processo não é enantio-seletivo.

O interesse pelas gama-lactonas na indústria aromática alimentícia e na indústria da perfumaria é grande, e a obtenção de produtos que têm nuances organolépticas diferentes, representa um verdadeiro desafio industrial.

É conhecido que a quiralidade das moléculas voláteis pode induzir diferenças em nível da percepção olfativa, e que os isômeros ópticos das gama-lactonas não têm todos as mesmas notas organolépticas:

há, portanto, um grande interesse em se obter um isômero óptico particular de gama-lactona, em particular se essa obtenção for feita segundo um processo pelo menos tão eficaz, até mesmo mais eficaz, do que na técnica anterior e a um preço competitivo.

Até hoje,

Requerente, processo não existe, no conhecimento da estereosseletivo que permita obter diretamente um enantiômero de gama-lactonas naturais. Os processos conhecidos conduzem a misturas de enantiômeros, a separação do enantiômero desejado ocorrendo geralmente por cromatografia em fase gasosa sobre coluna capilar de ciclodextrina substituída, ou após derivatização.

Um objeto da invenção é, portanto, propor um

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3/19 processo, eficaz, econômico e estereosseletivo, de síntese de gama-lactonas por via biológica.

A invenção refere-se tanto à síntese de (R) gamalactonas quanto de (S) gama-lactonas. (R) e (S) designam, no sentido da presente invenção, a configuração do carbono assimétrico em posição N° 4 da gama-lactona.

As gama-lactonas preferidas para serem sintetizadas, segundo o processo da invenção, são as C5-C20 gama-lactonas, de acordo com a invenção correspondem à fórmula (I):

na qual o anel lactônico pode portar uma insaturação entre o carbono N° 2 e o carbono N° 3, e na qual RI é um grupo C1-C16 alquenila, C1-C16 alquinila ou CiCi6 alquila, tendo eventualmente um ou vários carbonos substituídos além da posição N° 5. Por alquenila ou alquinila ou alquila substituído, entende-se uma alquenila ou alquinila ou alquila, da qual pelo menos um carbono porta pelo menos um grupo substituinte. Por grupo substituinte, entende-se notadamente um grupo hidroxila, um grupo ceto, um grupo tiol, um grupo alquila ou um grupo alquenila.

A invenção refere-se, portanto, a um processo de preparação estereosseletiva de gama-lactona, caracterizado pelo fato de que se efetua uma biossíntese por via microbiana de gama-lactona, em particular de gama-lactona de fórmula geral (I) acima, na qual o anel lactônico pode portar uma insaturação entre o carbono N° 2 e o carbono N° 3, e é, de preferência, saturado e na qual RI é um C1-C16 alquenila, C1-C16 alquinila ou C1-C16 alquila, eventualmente

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4/19 substituído, essa biossíntese sendo realizada a partir de pelo menos um substrato, de preferência um ácido graxo, com o auxílio de uma cultura microbiana de uma cepa escolhida dentre aquelas que permitem uma hidroxilação estereosseletiva em C4 desse substrato.

A invenção refere-se à preparação de gamalactonas por via biológica e, em particular, da biossíntese estereosseletiva de cada um dos isômeros ópticos (R) ou (S) de gama-lactonas, a partir de pelo menos um substrato, com o auxílio de uma cultura microbiana de uma cepa apropriada.

Essa preparação compreende as seguintes etapas:

a) seleção de uma cepa apropriada;

b) cultura dessa cepa em um meio de cultura apropriado, essa cultura sendo eventualmente precedida de uma etapa de pré-cultura da cepa;

c) acréscimo de um substrato capaz de ser transformado em gama-lactona;

d) bioconversão do substrato em gama-lactona;

e) recuperação da gama-lactona produzida.

As cepas microbianas apropriadas, visadas na etapa a) para a biossíntese da gama-lactona, de acordo com a invenção, são aquelas que permitem uma hidroxilação específica do substrato. De acordo com um modo de realização preferido da invenção, as cepas microbianas apropriadas, visadas na etapa a) para a biossíntese da gama-lactona, de acordo com a invenção, são aquelas que permitem uma hidroxilação estereosseletiva do substrato específico em C4. Assim, de acordo com a invenção, são obtidas gama-lactonas, cujo carbono C4 é de configuração (R) ou de configuração (S).

Quando o produto resultante da biossíntese é destinado à indústria alimentícia, as cepas de grau alimentício serão naturalmente preferidas. Dentre as cepas

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5/19 que permitem uma hidroxilação estereosseletiva, podem-se citar notadamente as cepas do gênero Aspergillus sp.,

Penicillium sp.,

Mucor sp.,

Mortierella sp. Essas cepas pertencendo todas classe de microorganismos, e determinadas sendo alimentícias, sua utilização não apresenta problema particular tanto para a produção industrial de lactonas, quanto para a sua utilização eventual em alimentícia. De acordo com um modo de realização particular da invenção, a cepa utilizada é do gênero Aspergillus sp., de preferência Aspergillus oryzae, da qual podem ser citadas as seguintes cepas de coleções:

Aspergillus oryzae DSMZ 1861, Aspergillus oryzae DSMZ 1864, Aspergillus oryzae DSMZ 1147, Aspergillus oryzae

DSMZ 63303,	Aspergill	us oryzae CBS	570.65	, Aspergillus
oryzae CBS	819.72,	Aspergillus	oryzae	CBS	110.27,
Aspergillus	oryzae VMF	88093.
Dentre elas,	Aspergillus	oryzae	DSMZ	1861 e
Aspergillus	oryzae CBS	110.27 são preferidas.

De acordo com um outro modo de realização particular, a cepa utilizada é do gênero Mortierella sp, da qual podem ser citadas as seguintes espécies de coleções:

Mortierella isabellina DSMZ 1414, Mortierella isabellina CBS 100559, Mortierella isabellina CBS 221.29, Mortierella isabellina CBS 194.28, Mortierella isabellina CBS 208.32, Mortierella isabellina CBS 224.35, Mortierella isabellina CBS 560.63, Mortierella isabellina CBS 167.80, Mortierella isabellina CBS 493.83, Mortierella isabellina CBS 309.93, Mortierella isabellina CBS 250.95, Mortierella isabellina CBS 109075, Mortierella ramanniana CBS 112.08, Mortierella ramanniana CBS 219.47, Mortierella ramanniana CBS 243.58, Mortierella ramanniana CBS 478.63, Mortierella ramanniana CBS 852.72, Mortierella ramanniana CBS 366.95, Mortierella ramanniana CBS 101226.

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6/19

Com efeito, os inventores observaram que, de maneira surpreendente e inesperada, a utilização de uma cepa do gênero Aspergillus sp. leva à produção seletiva de (R) gama-lactona e que a utilização de uma cepa do gênero Mortíerella sp. leva à produção seletiva de (S) gamalactona.

De acordo com um modo de realização da invenção, estão excluídas da invenção as cepas Yarrowia lipolytica, pois elas não são capazes de provocar uma hidroxilação em C4. Vantajosamente, todas as cepas que não são capazes de produzir, de maneira específica, e de maneira estereosseletiva, uma hidroxilação em C4 estão excluídas da presente invenção.

Sem querer estar ligado por uma teoria qualquer, é previsível que as condições de cultura das cepas possam ter uma importância na estereosseletividade observada, assim como no aspecto quantitativo da bioconversão.

A cultura visada na etapa b) do processo, de acordo com a invenção, compreende a realização de uma cultura, de preferência semi-concentrada, de cepas, por exemplo, por amplificação celular, em um meio de cultura apropriado. Essa cultura pode ser precedida por uma précultura das cepas em um primeiro meio de cultura mais adaptado às primeiras etapas de multiplicação da cepa.

As condições de cultura utilizadas no processo estereosseletivo da invenção devem ser tais que elas levem à produção de um micélio que apresenta bolhas ou vesículas cheias de inclusões (peroxissomas em particular). De acordo com o modo de realização preferido da invenção, a cultura celular realizada apresenta um micélio compotoso (compoteux) composto de filamentos divididos, sem conidiósporos e apresentando estruturas intumescidas, cheias dessas inclusões (em particular peroxissomas). As

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7/19 condições de cultura devem ser, com efeito, particularmente adaptadas para evitar a esporulação do micélio.

Por outro lado, os inventores puderam constatar que o estado fisiológico do micélio, obtido notadamente devido à utilização das condições de culturas descritas no presente pedido, dividido, comportando bolhas intumescências cheias de inclusões, notadamente de peroxissomas) poderia ter uma grande influência sobre rendimento da reação permitiria obter rendimentos superiores àqueles da técnica anterior.

O estado fisiológico do micélio poderia também ter uma influência sobre a estereosseletividade da reação.

Assim, de acordo com um modo de realização preferido da invenção, a etapa b) do processo da invenção é uma etapa de cultura da cepa em um meio de cultura apropriado, permitindo a obtenção de um micélio dividido, comportando bolhas e intumescências cheias de inclusões, notadamente de peroxissomas. Vantajosamente, o meio de cultura utilizado, de acordo com a invenção, não contém peptona. Preferencialmente, o meio de cultura utilizado, de acordo com a invenção, compreende malte e/ou extrato de levedura. De acordo com um modo de realização preferido, o micélio utilizado para a etapa c) é concentrado. De preferência, a concentração do micélio utilizado para a etapa c) está compreendida entre 5 e 15 g/l, de preferência a 12 g/l, muito preferencialmente 7 a 10 g/l.

Foi particularmente observado que a produção de (S) gama-lactona pela cepa Mortierella é particularmente favorecida, em termos de estereosseletividade e em termos de rendimento, pela utilização de um micélio inchado ou empolado e cheio de inclusão, tal como descrito acima; com efeito, a utilização desse micélio permitiria a obtenção de um produto de reação que tem um poder rotatório superior,

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8/19 em valor absoluto, àqueles da técnica anterior; por outro lado, o rendimento obtido pelo processo, de acordo com a invenção, e, em particular, pela utilização de um micélio empolado e cheio de inclusões, tal como descrito acima, permite a obtenção de rendimentos superiores àqueles da técnica anterior.

A etapa c) do processo consiste em acrescentar o substrato à cultura celular. De acordo com a invenção, a síntese por via biológica de gama-lactona faz intervir qualquer substrato apropriado.

Por substrato apropriado no sentido da presente invenção, são entendidos os ácidos graxos lineares, insaturados ou não, compreendendo pelo menos 5 carbonos, e, de preferência, de 5 a 20 carbonos, eventualmente ramificados ou substituídos além da posição N^o 5 e os ésteres desses ácidos graxos; os ésteres metílicos ou etílicos são preferidos.

Dentre os substratos preferidos, podem ser citados: o ácido valérico, que é um ácido em C5 conduzindo a uma gama-valerolactona; o ácido capróico, que é um ácido em C6 conduzindo a uma gama-hexalactona; o ácido enântico, que é um ácido em C7 conduzindo a uma gama-heptalactona; o ácido caprílico, que é um ácido em C8 conduzindo a uma gama-octalactona; o ácido pelargônico, que é um ácido em C9 conduzindo a uma gama-nonalactona; o ácido decanóico, que é um ácido em C10 conduzindo a uma gama-decalactona; o ácido undecanóico, que é um ácido em C11 conduzindo a uma gamaundecalactona; o ácido undecilênico, que é um ácido em C11 conduzindo a uma gama-undecenolactona; o ácido láurico, que é um ácido em C12 conduzindo a uma gama-dodecalactona; o ácido mirístico, que é um ácido em C14 conduzindo a uma gama-tetradecalactona; o ácido palmítico, que é um ácido em C16 conduzindo a uma gama-hexadecalactona; o ácido

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9/19 palmitoléico, que é um ácido em C16 insaturado conduzindo a uma gama-hexadecenolactona; o ácido esteárico, que é um ácido em C18 conduzindo a uma gama-octadecalactona; o ácido oléico, que é um ácido em C18 conduzindo a uma gamaoctadecenolactona; o ácido linoléico, que é um ácido em C18 conduzindo a uma gama-octadecadienolactona; o ácido linolênico, que é um ácido em C18 conduzindo a uma gamaoctadecatrienolactona; o ácido eicosanóico que é um ácido em C20 conduzindo a uma gama-eicosanolactona e seus ésteres, de preferência seus ésteres etílicos ou metílicos.

Os ácidos graxos em C13, C15, C17 e C19 e seus ésteres etílicos ou metílicos, embora raros, podem também ser oxidados e conduzir, respectivamente, às gama-lactonas em C13, C15, C17 e C19.

É evidente que o substrato pode ser qualquer substrato apropriado, ou uma mistura de diferentes substratos apropriados, em particular uma mistura de um ácido determinado e de um ou vários de seus ésteres.

De acordo com um modo de realização vantajoso da invenção, o substrato é acrescentado ao micélio, segundo um processo batch ou fed-batch. De acordo com um modo de realização preferido, o substrato é acrescentado em mistura com um auxiliar, por exemplo um óleo, notadamente qualquer óleo clássico alimentar, tal como soja, milho, girassol ou outro ou triglicerídeos de síntese de ácidos graxos com cadeias curtas, tais como o migliol, de preferência o óleo de girassol hidrogenado ou rico em ácido oléico, previamente à sua colocação em contato com o micélio. A presença do auxiliar permite notadamente diminuir muito o efeito corrosivo ou tóxico do substrato. Segundo o modo de realização da invenção, a síntese, de acordo com a invenção, utilizando a cepa Mortíerella ísabellína é efetuada em um meio isento de óleo mineral. Vantajosamente,

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10/19 o substrato é acrescentado em concentrações de 0,3 a 2,5 g/l/h. Vantajosamente, a quantidade de óleo, de preferência de óleo vegetal, misturada ao substrato é de 100 a 500 g/l, de preferência 150 a 300 g/l.

Uma fonte de açúcar, de preferência glicose, é também acrescentada ao meio, ao mesmo tempo que o substrato de maneira a assegurar a cobertura das necessidades energéticas das células. Vantajosamente, a concentração em glicose acrescentada é de 0.3 a 0.4 g/l/h.

O pH pode ser regulado, segundo as necessidades, durante a adição do substrato e por toda a duração da bioconversão que vai ser feita a seguir, por meio da adição de qualquer base apropriada. Vantajosamente, o pH está compreendido entre 4,5 e 8,5, de preferência entre 5,5 e 8 e, de preferência entre 6 e 7,5.

A temperatura é, de preferência, mantida entre 27 e 30^oC, durante a bioconversão. A duração da bioconversão pode ser de 30 a 120 horas, de preferência de 48 a 72 horas.

A bioconversão do substrato em gama-lactona visada na etapa d) do processo da invenção é uma etapa de lactonização precedida por uma reação de hidroxilação em C4 do substrato, realizada pela cepa. Para que essa hidroxilação possa ocorrer, uma fonte de oxigênio é requerida. Essa fonte de oxigênio é, de preferência, um gás contendo oxigênio, muito preferencialmente o ar ou o oxigênio. O gás é dissolvido em relativamente grande quantidade no meio reacional.

De acordo com um modo de realização preferido, e como é conhecido no estado da técnica, agentes antiespuma, notadamente óleos siliconados ou polímeros de polietileno glicol esterificados por ácidos graxos, são utilizados para controlar a espuma capaz de se formar, quando da

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11/19 bioconversão.

Uma vez a bioconversão efetuada, isto é, a hidroxilação específica e estereosseletiva em C4, seguida da lactonização, a etapa e) do processo consiste em recuperar a gama-lactona por extração, a extração da gamalactona se efetuando por qualquer meio apropriado. Vantajosamente, a extração da gama-lactona é efetuada por hidrodestilação, eventualmente seguida de uma esterificação destinada à eliminação posterior do substrato que não reagiu.

Alternativamente, a extração da gama-lactona é feita por extração por solvente, após acidificação do meio.

De acordo com uma variante da invenção, a etapa

e) do processo não é realizada, e no lugar é efetuada uma etapa e') que consiste em prosseguir o processo no fim da etapa d) por uma redução in situ da gama-lactona obtida, antes da extração. A etapa e') permite obter uma gamalactona mais saturada (R) ou (S), segundo a estereoquímica da gama-lactona obtida na etapa d).

De acordo com um primeiro modo de realização, a redução pode ser feita até à obtenção de uma lactona saturada. De acordo com um segundo modo de realização, a redução pode ser parada para se obter uma gama-lactona, cuja cadeia lateral porta menos insaturações que aquela oriunda da bioconversão da etapa d). De acordo com esse outro modo de realização, o processo, de acordo com a invenção, prossegue no final da etapa d), parando a regulagem do pH do fermentador, e acrescentando-se uma levedura seca ativa que pode ser uma levedura de padaria, uma levedura de vinificação ou uma levedura de cervejaria e uma fonte de açúcar, notadamente de glicose, no reator. Quando o pH atinge o valor de 5,5, ele é regulado em 5,5 com uma base apropriada, por exemplo soda NaOH. Deixa-se

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12/19 incubar, de preferência, durante um tempo de 12 a 24 horas, depois se extrai a gama-lactona. Segundo uma outra variante, a gama-lactona oriunda da etapa d) pode ser reduzida por uma cultura fresca de um microorganismo redutor ou pelo menos colocado em condições redutoras, por exemplo, Saccharomyces cerevisiae ou Pichia etchelsii ou Pichia pastoris ou Hansenula polymorpha ou Bacillus subtilis ou Lactobacillus brevis.

A redução da etapa e') leva à produção de gamalactonas mais saturadas que aquelas oriundas da etapa d). Essas gama-lactonas mais saturadas, obtidas segundo esse modo de realização particular, apresentam, em posição 4, um carbono assimétrico de mesma configuração que aquele da gama-lactona menos saturada da qual ela deriva, a reação de redução não modificando a estereoisomeria da molécula.

As gama-lactonas obtidas, de acordo com o processo da invenção, têm propriedades odorantes e gustativas tais que elas podem ser utilizadas em todas as aplicações de perfumaria e de aromática alimentícia, em particular para a fabricação de perfumes, de matérias odorantes, de composições cosméticas ou alimentícias, ou como aditivo alimentar.

No sentido da presente invenção, o termo perfumaria designa não somente a perfumaria no sentido habitual do termo, mas também os outros campos nos quais o odor dos produtos é importante. Pode-se tratar de composições de perfumaria no sentido habitual do termo, tais como bases e concentrados perfumados, águas de Colônia, águas de toilette, perfumes e produtos similares; de composições tópicas - em particular cosméticos - tais como cremes para o rosto e o corpo, pós de talco, óleos para cabelos, shampoos, loções capilares, sais e óleos de banho, géis de banho e de banheira, sabonetes,

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13/19 antitranspirantes e desodorantes corporais, loções e cremes de barbear, sabões, cremes, dentifrícios, enxaguatórios bucais, pomadas e produtos similares; e produtos de limpeza, tais como amaciantes, detergentes, lixívias, desodorizantes de ambiente e produtos similares.

O termo odorante é utilizado para designar um composto que exala um odor.

Por aromática alimentícia, entende-se qualquer utilização dos compostos da invenção para a aromatização de qualquer produto alimentar líquida ou sólida, humana ou animal notadamente bebidas, produtos lácteos, sorvetes.

As gama-lactonas, (R) ou (S) ou uma mistura de (R) e (S) são utilizáveis em composições perfumantes para contribuir para dar notas exóticas, florais ou frutadas. Segundo as aplicações, utilizar-se-á o enantiômero (S) ou o enantiômero (R) ou ainda uma mistura dos 2 enantiômeros em proporções determinadas pelo versado na técnica.

De preferência, as gama-lactonas obtidas pelo processo da invenção, de acordo com a invenção, são utilizadas em quantidades compreendidas entre 0,0025 % e 10 % em peso em relação ao peso total da composição na qual elas estão presentes. Elas podem entrar na composição de sólidos ou de líquidos e notadamente na composição de géis, cremes, pomadas e/ou sprays.

As gama-lactonas obtidas pelo processo da invenção, de acordo com a invenção, podem também ser utilizadas na própria composição odorante, ou em uma composição na qual o agente odorante é utilizado para mascarar ou neutralizar certos odores.

Outras características e vantagens da presente invenção aparecerão claramente com a leitura dos exemplos dados a seguir que vêm ilustrar a invenção, sem, todavia, limitá-la.

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Exemplo 1, Etapa a: Seleção das cepas

Todas as cepas da coleção são inicialmente inoculadas sobre meio de gel MGY e incubadas durante 72 horas a 27^oC; na seqüência, essas cepas são inoculadas em Erlenmeyers de 1 Litro, contendo 100 ml de meio no malte 1x e incubadas durante 24 horas a 27^oC. O substrato, o ácido undecilênico, é então acrescentado ao meio de cultura (5 g/l em 10 doses) e a cultura é mantida durante ainda 48 horas a 120 horas a 27^oC.

Após olfação e análises da concentração de gama undecenolactona nos meios, as cepas mais importantes são retidas; este foi o caso para cepas de Mortierella isabellina CBS 100559, Mortierella isabellina CBS 221.29, Aspergillus oryzae DSMZ 1861 e Aspergillus oryzae CBS 110.27 que foram na seqüência utilizadas para os testes de otimização em fermentadores.

Exemplo 1, etapa b: Preparação das culturas celulares

Inocula-se a cepa Mortíerella isabellina CBS 100559 ou Mortierella isabellina CBS 221.29 ou Aspergillus oryzae DSMZ 1861 ou Aspergillus oryzae CBS 110.27 origine = tubo congelado a -80^oC sobre gel MGY, e incuba-se a 27^oC durante 30 horas.

Inocula-se a pré-cultura precedente em 5 l de meio no malte 1x com fermentador de 6 l:

Extrato de malte:

Extrato de levedura:

H2O q.s.p.:

pH

Mortierella isabellina

Incuba-se, a 27^oC, 500 livre, durante 30 horas.

Aspergillus oryzae

Incuba-se, a 20^oC, 500

165 g g

l

6,5 rpm, 3,5 l/l/h de ar, pH rpm, 0,05 vvm de ar, pH

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15/19 livre, durante 30 horas, depois a 25^oC, 500 rpm, 0,05 vvm de ar, pH livre, durante 24 horas. Deve-se obter nos dois casos um micélio contendo muitas bolhas grossas e cheias de inclusões (das quais peroxissomas).

Preparam-se, em seguida, 125 l de meio ao malte 1,5x em um fermentador de 300 l:

Extrato de malte: 6,188 kg

Extrato de levedura: 0,938 kg

H2O q.s.p: 125 l

Esteriliza-se o meio durante 40 minutos a 121^oC. O fermentador e suas utilidades são estéreis e sob pressão. A temperatura é estável e regulada a 27 ^oC. Expulsa-se a pressão e mantém-se uma vazão de ar de 3,5 l/l/h, seja aproximadamente 0,6 m³/h. Liga-se esterilmente a base (NaOH 10 N), o ácido (H3PO4 85 %) e a antiespuma e o fermentador de 6 l que serve de inóculo. Ajusta-se a velocidade de agitação a 325 rpm, atrai-se a antiespuma, depois se inocula o inóculo (5 l), pH livre. Mantém-se a velocidade de agitação a 325 rpm e aumenta-se a aeração a 2,2 m³/h (0,3 vvm). Deixa-se crescer durante 24 horas, de forma a ter aproximadamente 10 g/l de peso seco de micélio: esse micélio deve ser “compotoso e constituído de filamentos que comportam numerosas intumescências e bolhas, sem esporas.

Exemplo 2, Etapas c e d: Conversão do ácido láurico pelas cepas de Mortierella sp

Uma vez a quantidade e a qualidade de micélio atingidas, distribui-se o substrato (ácido láurico) em migliol. Distribui-se, paralelamente, a glicose em contínuo, à vazão de 0,36 g/l/h, durante 55 horas. Regulase o pH em 7, durante toda a fermentação com NaOH 5 N. Aumenta-se a velocidade a 900 rpm e aera-se a vazão de 1 vvm, seja 12 m³/h. Prossegue-se a conversão durante 55

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16/19 horas. Obtém-se um rendimento de 12 g/l de gamadodecalactona (S). A título comparativo, gamadodecalactonas são preparadas segundo o ensinamento da patente US5457036 (Han), utilizando-se as cepas Mortierella descritas na patente US5457036.

Quando o processo Han é utilizado, os rendimentos obtidos são da ordem de 4 a 6,5 g/l; em comparação, quando se utiliza o processo da invenção, utilizando um micélio compotoso e cheio de inclusões, o rendimento é da ordem de 12 a 15 g/l.

Exemplo 3, etapas c e d: Conversão do ácido caprílico pelas cepas de Mortierella sp

Uma vez a quantidade e a qualidade de micélio atingidas, distribui-se o substrato à vazão de 0,75 g/l/h durante 6 horas. Distribui-se, paralelamente, glicose em contínuo à vazão de 0,36 g/l/h. Regula-se o pH em 6,5 durante toda a fermentação com NaOH 5 N. Aumenta-se a velocidade a 600 rpm e aera-se a vazão de 3,5 l/min. Prossegue-se a conversão durante 48 a 74 horas. Obtém-se um rendimento de 15 a 25, em geral aproximadamente 19 g/l de gama-octalactona (S).

A título comparativo, gama-octalactonas são preparadas, segundo o ensinamento da patente EP 519481 (Farbood), utilizando-se as cepas Mortierella descritas na patente EP 519481; o poder rotatório do produto obtido segundo o processo Farbood é de -28 ^o, o que significa que esse produto é uma mistura (R) e (S) que tem uma pequena superioridade em (S); o poder rotatório do produto obtido, segundo o processo da invenção é de -42 ^o, o que mostra uma seletividade da reação para a produção de (S) gama lactona.

Quando o processo Farbood é utilizado, os rendimentos obtidos são da ordem de 7,5 a 10 g/l; em comparação, quando se utiliza o processo da invenção,

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17/19 utilizando-se um micélio compotoso e cheio de inclusões, o rendimento é da ordem de 15 a 25 g/l.

Exemplo 4, etapas c e d: Conversão do ácido capróico pelas cepas de Mortierella sp

Uma vez a quantidade e a qualidade de micélio atingidas, distribui-se o substrato à vazão de 0,3 g/l/h durante 6 horas. Distribui-se, paralelamente, glicose em contínuo à vazão de 0,36 g/l/h. Regula-se o pH em 6,5 durante toda a fermentação com NaOH 5 N. Aumenta-se a velocidade a 600 rpm e aera-se à vazão de 3,5 l/min. Prossegue-se a conversão durante 48 a 74 horas. Obtém-se um rendimento de 6 g/l de gama hexalactona (S).

Exemplo 5, etapas c e d: Conversão do ácido undecilênico pelas cepas de Mortierella sp

Uma vez a quantidade e a qualidade de micélio atingidas, distribui-se o ácido undecilênico à vazão de 0,3 g/l/h durante 6h, em seguida, à vazão de 0,53 g/l/h durante 72h: seja um total de 40 g/l. Esse ácido undecilênico é distribuído em mistura com o óleo de girassol hidrogenado (1/4 ácido - ¾ óleo); esse óleo é, portanto, distribuído às vazões de 0,9 g/l/h, depois de 1,53 g/l/h. Distribui-se, paralelamente, glicose em contínuo à vazão de 0,36 g/l/h durante 72 horas. Regula-se o pH a 7,5 durante toda a fermentação com NaOH 5 N. Aumenta-se a velocidade a 505 rpm e aera-se à vazão de 1 vvm, seja 12 m³/h. Prossegue-se a conversão durante 72 horas.

Obtém-se uma produção de 6,5 g/l de gama undecenolactona, cuja estereoisomeria é (S).

Exemplo 6, etapas c e d: Conversão do ácido undecanóico pelas cepas de Mortierella sp

Uma vez a quantidade e a qualidade de micélio atingidas, distribui-se o ácido undecanóico à vazão de 0,3 g/l/h, durante 6h, depois à vazão de 0,53 g/l/h durante 3,5

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18/19 horas, depois 0,75 g/l/h durante 3,5 horas, depois 1 g/l/h durante 48 horas. Esse ácido undecanóico é distribuído em mistura com o óleo de girassol hidrogenado (1/4 ácido - ¾ óleo). Distribui-se, paralelamente, glicose em contínuo à vazão de 0,36 g/l/h, durante 24 horas. Regula-se o pH em 7,5, durante toda a fermentação com NaOH 5 N. Aumenta-se a velocidade em 505 rpm e aera-se à vazão de 1 vvm, seja 12 m³/h. Prossegue-se a conversão durante 48 horas.

Obtém-se uma produção de 19 g/l de gama undecalactona, cuja estereoisomeria é (S).

Exemplo 7, etapas c e d: Conversão do ácido undecilênico pelas cepas de Aspergillus sp

Uma vez a quantidade e a qualidade de micélio atingidas, distribui-se o ácido undecilênico à vazão de 0,3 g/l/h, durante 6 horas, depois de 0,53 g/l/h durante 72 horas: seja um total de 40 g/l. Esse ácido undecilênico é distribuído em mistura com o óleo de girassol hidrogenado (1/4 ácido - ¾ óleo). Distribui-se, paralelamente, glicose em contínuo à vazão de 0,36 g/l/h durante 72 horas. Regulase o pH a 6,5 durante toda a fermentação com NaOH 5 N. Aera-se à vazão de 0,5 vvm, seja 6 m³/h. Prossegue-se a conversão durante 80 horas. Obtém-se uma produção de 0,5 g/l de gama undecenolactona, cuja estereoisomeria é (R).

Exemplo 8, etapas c e d: conversão do ácido capróico pelas cepas de Aspergillus sp

Uma vez a quantidade e a qualidade de micélio atingidas, distribui-se o ácido capróico à vazão de 1,64 g/l/h, durante 24 horas, depois de 2 g/l/h durante 72 horas: seja um total de 183 g/l. Esse ácido capróico é distribuído em mistura com óleo de girassol hidrogenado (1/2 ácido U óleo). Distribui-se, paralelamente, glicose em contínuo à vazão de 0,36 g/l/h. Regula-se o pH em 6,5 durante toda a fermentação com NaOH 5 N. Aera-se à vazão de

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0,5 vvm, seja 6 m³/h. Ao cabo de 72h a 96 horas, obtém-se uma produção de 15 g/l de gama hexalactona, cuja estereoisomeria é (R).

Exemplo 9, etapa e: Extração - purificação

Acidifica-se com pH 1,5 com 3 l de ácido fosfórico a 85 %. Aquece-se a mais de 100^oC, durante 30 minutos para que a lactona se apresente essencialmente sob sua forma ciclizada e não sob sua forma aberta de hidroxiácido. Dosa-se a lactona, acrescenta-se solvente de extração (ciclo-hexano, de preferência), agita-se durante 1 hora à temperatura ambiente. Centrifuga-se e recupera-se a fase orgânica. Dosa-se a lactona. Concentra-se o solvente e obtém-se, assim, um bruto oleoso. Destila-se sob vácuo. Obtém-se lactona desresinada e um óleo esgotado. Purifica-se em seguida, fracionando-se a lactona sob vácuo. Obtém-se um produto puro a > 99 %, que é seja a gama undecenolactona (> 99 % S), caso se tenha utilizado uma cepa de Mortierella sp, seja a gama undecenolactona (> 99 % R), caso se tenha utilizado uma cepa de Aspergillus sp.

A gama undecenolactona, (R) ou (S), ou uma mistura de (R) e (S), assim como a gama-undecenolactona (R) ou (S), ou uma mistura de (R) e (S) são utilizáveis em composições perfumantes para contribuir para dar notas exóticas, florais ou frutadas, o que levou a Requerente a depositar o nome de marca Tropicalone® dado à gama undecenolactona. Segundo as aplicações, utilizar-se-á o enantiômero (S) ou o enantiômero (R) ou ainda uma mistura dos 2 enantiômeros em proporções determinadas pelo versado na técnica.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Processo para a preparação estereosseletiva de uma gama-lactona caracterizado pelo fato de ser realizada uma biossíntese microbiana de uma gama-lactona, em particular, de uma gama-lactona de fórmula geral (I):

na qual o anel o carbono

N° 2 alquenila de lactona pode

C1-C16, opcionalmente realizada a preferência, microbiana da

Mortierella substrato no as seguintes o carbono N° alquinila portar uma insaturação entre

3, e na qual RI é um grupo substituído, a partir de pelo

C1-C16 dita menos ou alquila C1-C16, biossíntese sendo um substrato, de um ácido graxo, utilizando uma cultura cepa sp. que carbono etapas:

escolhida dentre Aspergillus sp. ou permite hidroxilação especifica do

C4, em que o dito processo compreende selecionar uma cepa apropriada, escolhida dentre aquelas que permitem hidroxilação do substrato no carbono C4;

b) cultivar a dita cepa em um meio de cultura apropriado livre de peptonas, a cultura celular resultante possuindo um micélio compotoso composto por filamentos compartimentalizados sem conidiósporos exibindo estruturas intumescidas, preenchidas com essas inclusões, o dito cultivo sendo opcionalmente precedido de uma etapa consistindo em um pré-cultivo da cepa;

em gama-lactona, em particular, em uma gama-lactona da fórmula (I);

d) bioconverter o substrato em gama-lactona, em

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2/3 particular, em uma gama-lactona da fórmula (I); e

e) recuperar a gama-lactona produzida.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a gama-lactona é (R)-gamalactona e a cepa microbiana alvejada na etapa (a) é Aspergillus oryzae.
3. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a gama-lactona é (S)-gamalactona e a cepa microbiana alvejada na etapa (a) é

Mortierella isabellina.
4. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o substrato é escolhido dentre ácidos graxos lineares saturados ou insaturados, opcionalmente substituídos, contendo pelo menos 5 carbonos e, de preferência, de 5 a carbonos, e os ésteres dos ditos ácidos graxos, de preferência, ésteres metílicos ou etílicos.
5.

Processo, de acordo com a reivindicação

4, caracterizado pelo fato de que o substrato é escolhido partir do grupo compreendendo ácido valérico, ácido capróico, ácido enântico, ácido caprílico, ácido pelargônico, ácido decanóico, ácido undecanóico, ácido undecilênico, ácido láurico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido oléico, ácido linoléico, ácido linolênico, ácido eicosanóico e ésteres destes, de preferência, ésteres etílicos ou metílicos destes, ou uma mistura destes.
6. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o substrato é adicionado na etapa (c) como uma mistura com pelo menos um produto auxiliar de fabricação, de preferência escolhido dentre óleos, em particular, óleo de girassol que é hidrogenado ou rico em ácido oléico, migliol

Petição 870190028384, de 25/03/2019, pág. 33/38 ou glicose, ou uma mistura desses ingredientes.

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7. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a etapa (e) é uma extração da gama-lactona por hidrodestilação, opcionalmente seguida por esterificação e eliminação do substrato que não reagiu.
8. Processo, reivindicações 1 a 7, de acordo com qualquer uma das caracterizado pelo fato de que a etapa (e) é uma extração por solvente da gama-lactona obtida no final da etapa (d).
9. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a etapa (e) é substituída por uma etapa (e') que consiste na redução in situ da lactona obtida no final da etapa (d).
10. Uso de uma cultura de Aspergillus oryzae caracterizado pelo fato de ser na biossíntese estereoespecífica de (R)-gama-lactona.
11. Uso de uma cultura de Mortierella isabellina caracterizado pelo fato de ser na biossíntese estereoespecífica de (S)-gama-lactona.