CN108403498A

CN108403498A - 一种纳豆提取液的制备方法及其应用

Info

Publication number: CN108403498A
Application number: CN201810337196.1A
Authority: CN
Inventors: 魏玉洁; 陆震; 石艳丽; 孙元军; 薛蔚; 郭学平
Original assignee: BLOOMAGE FREDA BIOPHARM Co Ltd; Shandong Bloomage Hyinc Biopharm Co Ltd
Current assignee: Huaxi Biotechnology Tianjin Co ltd; Bloomage Biotech Co Ltd
Priority date: 2018-04-16
Filing date: 2018-04-16
Publication date: 2018-08-17
Anticipated expiration: 2038-04-16
Also published as: CN108403498B

Abstract

本发明提供了一种纳豆提取液的制备方法，采用大豆作为主要原料，粉碎后经过酶解作为发酵底物，接种纳豆芽孢杆菌进行液态恒温发酵，发酵过程中通过流加酸或碱调节发酵液pH以控制γ‑聚谷氨酸的产量，发酵结束后发酵液再经过离心、除菌过滤即得到纳豆提取液。采用本发明提供的方法制备的纳豆提取液具有良好的保湿、抗炎、抗氧化、细胞修复效果。

Description

一种纳豆提取液的制备方法及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种纳豆提取液的制备方法及其应用。

背景技术

纳豆是传统的大豆发酵食品，由纳豆芽孢杆菌在一定温度湿度下发酵而成。大豆中含有大量的不饱和磷脂酸，多种微量元素、维生素及优质蛋白质，以及丰富的大豆异黄酮、卵磷脂、水解大豆蛋白，能够改善内分泌，消除活性氧和体内自由基，延迟女性细胞衰老、使皮肤保持光滑润泽、富有弹性。

纳豆提取液是利用纳豆芽孢杆菌进行发酵，通过发酵，可使不溶性的大豆蛋白质变得可溶并产生氨基酸，除此之外还会产生其他多种对人体有益的物质，如纳豆激酶，聚谷氨酸等。其中，聚谷氨酸是氨基酸的聚合物，溶于水，可食用，可降解，对人体和环境无毒性，是一种很有潜力的阴离子聚合物。作为一种生物高分子材料，γ-聚谷氨酸具有增稠、凝胶、成膜、保湿、缓释、助溶、粘结、防冻等功能，可应用于化妆品领域，用途广泛，具有极大开发价值和应用前景。

迄今为止关于发酵大豆的研究众多，如中国专利CN1718735A公开了“利用纳豆芽孢杆菌固体发酵生产多聚谷氨酸及产品应用”，其特征在于利用纳豆芽孢杆菌固体发酵预处理的大豆，再将γ-多聚谷氨酸粗品和维生素K2的混合液与纳豆激酶芽孢杆菌分离。其缺点在于如果用于化妆品中，其得到的混合液活性成分较单一，大豆中的其他活性成分如氨基酸、异黄酮、维生素等没有充分利用。

中国专利CN103053950A公开了“一种利用乳酸菌发酵大豆的方法”，其特征在于以大豆作为原料，将其与水混匀，进行预处理后，接种乳酸菌培养液，并在纤维素酶制剂存在下进行发酵，从而获得大豆发酵制品。其缺点在于乳酸菌发酵酸度较高，应用到食品领域中尚可，但是难以作为化妆品原料用到配方中，易对皮肤表皮造成损伤。

中国专利CN107259366A公布了“一种大豆酵素及其制备方法、应用”，其特征在于将熟大豆和纳豆菌混合后于40-50℃发酵15-30h，然后于15-25℃发酵7-10d得到发酵产物。缺点在于固体发酵周期较长致使生产效率低，两步发酵过程代谢难以精确控制发酵代谢途径，产品稳定性难以保证，而且固体发酵易造成大豆活性物质难以充分释放到水溶液中，用于化妆品中影响皮肤吸收。

中国专利CN1593199A公布了“利用大豆制品发酵生产大豆肽液体食品及益菌片的方法”，其特征在于利用纳豆杆菌为菌种，以大豆豆粉、大豆豆饼、大豆豆粕或大豆豆浆为培养基，经发酵、分离后，加入辅料，制成含有纳豆激酶的保健型大豆肽、低聚肽、短肽混合物的液体食品和富含纳豆杆菌及大豆纤维蛋白的益菌片。缺点在于发酵产物虽然可以得到充分利用，但如果作为化妆品原料，没有明确的功效成分，保湿效果不足，而且发酵过程中可能会用到氨水或尿素调节pH，易残留在提取液中，对皮肤具有刺激性。

中国专利CN103536477公布了“一种豆乳护肤乳及其制备方法”，其特征在于以大豆为主要原料，将大豆经过灭酶、粉碎、分离、杀菌、脱臭，形成豆乳，再与其他原料复配得到成品。缺点在于采用普通磨浆法，大豆中的大分子蛋白等物质不利于皮肤吸收。

综上所处目前市场上的豆类原料主要存在以下不足：

1、豆类发酵往往涉及食品保健品领域，化妆品领域涉及极少。

2、应用于化妆品中的豆类多是经过普通处理的豆粉、豆浆、豆乳、大豆蛋白等，分子量较大，且水不溶性物质较多，不利于活性成分的皮肤吸收。

3、发酵纳豆多采用固体发酵，造成大豆活性物质难以充分释放到水溶液中，经过滤分离应用于化妆品领域易造成原料的浪费，而且发酵周期普遍较长，效率较低。

4、多数纳豆产品常采用食品领域评价手段仅从外观状态等物理特性为导向来评价发酵过程，而忽略了最为重要的以产品的活性成分为导向特别是γ-聚谷氨酸含量来指导发酵过程，致使保湿效果欠佳，而这些是应用到化妆品领域十分重要方面。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种纳豆提取液的制备方法，采用大豆作为主要原料，先酶解再接种纳豆芽孢杆菌发酵，发酵后离心、过滤即得纳豆提取液。采用本发明提供的方法制备的纳豆提取液具有良好的保湿、抗炎、抗氧化、细胞修复效果。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

一种纳豆提取液的制备方法，包括以下步骤：

（1）大豆经粉碎，过筛得大豆粉；

（2）大豆粉加水混匀，然后加入酶，酶解至终点，升温灭酶，得大豆粉酶解液；

（3）将纳豆芽孢杆菌（Bacillus subtilis natto）种子液接种到含大豆粉酶解液的发酵培养基上，发酵至终点，获得发酵液；

（4）发酵液除杂、除菌获得成品。

所述步骤（2）中，大豆粉的质量百分含量为1%-5%。

所述步骤（2）中，酶的添加量为大豆粉的0.1%-1%。

所述步骤（2）中，酶为蛋白酶，酶活优选为10万-50万U/g。所述蛋白酶优选为木瓜蛋白酶，1398蛋白酶，菠萝蛋白酶，胰蛋白酶，胃蛋白酶和风味蛋白酶中的至少一种。

所述步骤（2）中，酶解pH为6.0-9.0，酶解温度45℃-60℃，酶解时间2-5h。

所述步骤（2）中，酶解终点为间隔0.5h粗蛋白含量不再变化。

所述步骤（2）中，升温灭活过程为升温至90-100℃，保持10-20min。

所述步骤（3）中，纳豆芽孢杆菌种子液接种量为0.1%-1%。

所述步骤（3）中，发酵培养基组成为1%-5%酶解后的大豆粉、1%-3%谷氨酸钠、1%-3%碳源、0.1%-0.5%无机盐、其余为水。所述碳源优选自蔗糖、葡萄糖、果糖、乳糖、甘露醇、甘油、半乳糖或麦芽糖醇。无机盐优选自K₂HPO₄，KH₂PO₄，MgSO₄，MnSO₄和CaCl₂中的至少一种。

所述步骤（3）中，发酵温度为33℃-38℃；发酵时间为20-40h；设发酵初始溶氧量为100%，发酵过程中随着菌体增多和γ-聚谷氨酸的产生，溶氧量下降，通过不断提高通气量和搅拌速度，将溶氧量控制在40-100%。

所述步骤（3）中，发酵pH为6.0-7.0，作为优选，通过添加柠檬酸溶液来控制pH。

所述步骤（3）中，发酵终点为无残留葡萄糖。

所述步骤（4）中，所述除杂、除菌为发酵液经离心、取上清液，调pH至5.0-7.0，加入0.5-1%活性炭（w/v），将混合液升温至50-80℃，保温1-3h，再经过1.2μm精细过滤纸板、0.22μm滤芯过滤除菌即可得到成品。

一种采用上述制备方法获得的纳豆提取液。

一种上述纳豆提取液在化妆品中的应用。所述纳豆发酵提取液在化妆品中可作为保湿、抗炎、抗氧化、细胞修复的成分。

本发明具有以下优点：

本发明提供的纳豆提取液制备方法基于传统发酵技术进行改进，通过纳豆芽孢杆菌发酵，将大豆中不溶性的蛋白等大分子物质转化成了可溶性小分子氨基酸等，而且产生γ-聚谷氨酸等多种活性成分，制备出具有保湿效果的发酵液；本发明使用γ-聚谷氨酸的前体物质柠檬酸来控制发酵过程pH，有利于γ-聚谷氨酸的产生，使发酵提取液的保湿功效得到显著提高，同时具有抗炎、抗氧化、细胞修复的功能。本发明所提供的方法为液体发酵，可将原料及产物纳豆提取液全部充分利用，工艺简单，操作简便，成本低，能实现大规模生产。

附图说明

图1为γ-聚谷氨酸含量测定的HPLC图谱；

图2为纳豆提取液细胞划痕实验图；

图3为纳豆提取液保湿精华使用前后皮肤含水量变化；

图4为纳豆提取液保湿精华使用前后皮肤水分散失量变化。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。

称取10万-50万U/g的复合蛋白酶配制成酶液，活力均为5万U/mL，供实施例与对比例中使用，复合蛋白酶为市购。

实施例1 纳豆提取液的制备

取5kg大豆作为原料，经碾磨式粉碎机充分粉碎后，再过80目筛，筛下大豆粉备用。称量筛下大豆粉约4.7kg，混匀于100L饮用水中，调pH为7.5，添加复合蛋白酶30mL，50℃保温，每隔0.5h测粗蛋白含量，4.5h后不再变化，然后升温至90℃，保持20min进行灭酶，再添加3kg葡萄糖、2kg谷氨酸钠，0.1kg K₂HPO₄，充分混匀后作为发酵培养基，灭菌后冷却至36℃时，接入0.5%纳豆芽孢杆菌种子液，36℃培养24h，溶氧量为40-100%。发酵过程中通过流加柠檬酸或碱调节发酵液pH为6.5±0.1，无残糖后，结束发酵。8000rpm离心除去杂质，调pH至6.0，加入0.5kg活性炭（w/v），将混合液升温至65℃，保温3h，再经过1.2μm精细过滤纸板、0.22μm聚醚砜滤芯过滤除菌即可得到纳豆提取液S1。

对比例1

取1kg大豆作为原料，经碾磨式粉碎机充分粉碎后，再过80目筛，筛下大豆粉备用。称量筛下大豆粉约0.9kg，混匀于20L饮用水中，调pH为7.5，添加复合蛋白酶6mL，50℃保温，每隔0.5h测粗蛋白含量，4.5h后不再变化，然后升温至90℃，保持20min进行灭酶，8000rpm离心除去杂质，得到上清液为未经过纳豆杆菌发酵的大豆提取液C1。

实施例2 理化性质检测

1. 游离氨基酸含量

以实施例1中样品S1与对比例1中样品C1为实验样品，进行氨基酸含量测定，采用氨基酸自动分析仪进行，结果如表1所示。

表1 不同样品中氨基酸含量对比

从表1中可以看出，本发明制备的纳豆提取液S1中的小分子氨基酸含量绝大部分及总含量明显高于未经过纳豆芽孢杆菌发酵的大豆提取液C1。

2. γ-聚谷氨酸含量

以实施例1中样品S1、与对比例1中样品C1为实验样品，采用凝胶渗透色谱法（GPC）进行γ-聚谷氨酸含量测定，HPLC条件：色谱柱：Shodex SB-806（8.0×300 mm），柱温：35℃；流动相：0.2 mol/L硫酸钠，流速：1.0 mL/min，检测波长：210 nm；色谱图如图1所示，其中，a）为标准品（γ-聚谷氨酸含量浓度为2g/L），b）为S1，c）为C1；结果如表2所示。

表2 发酵前后提取液中γ-聚谷氨酸含量比较

由表2中数据可以看出，γ-聚谷氨酸是由纳豆芽孢杆菌发酵产生的，未经过发酵的大豆提取液中不含γ-聚谷氨酸。

3. 维生素B1含量

以实施例1中样品S1、与对比例1中样品C1为实验样品，采用GB5009.84-2016进行维生素B1含量测定，结果如表3所示。

表3 发酵前后提取液中维生素B1含量比较

由表3中数据可以看出，本发明制备的纳豆提取液S1中的维生素B1的含量明显高于未经过纳豆芽孢杆菌发酵的大豆提取液C1。

实施例3 抗氧化、抗炎、促进愈合、保湿效果评价

本实施例旨在对实施例1制得的纳豆提取液进行抗氧化、抗炎、促进愈合、保湿效果评价。

1. 抗氧化活性

分别精密量取DPPH溶液5.0mL和不同浓度S1样品溶液5.0mL置具塞试管中，混匀。以等体积的水与95%乙醇混合溶液为空白对照。室温放置30分钟，于523nm处分别测定溶液吸光度值。另设一组分别精密量取DPPH溶液5.0mL和纯化水5.0mL混合，操作同上。计算方法如下：

结果如表4所示。由表中数据可知，在添加2%-8%的浓度梯度下，样品S1具有较高的清除自由基的能力，8%浓度下可达36%，有较好的抗氧化性。

表4 清除DPPH自由基活性

2．划痕实验

以5×10⁵个细胞/mL的密度将HaCaT细胞接种于24孔板，每孔1mL，37℃、5% CO₂条件下培养24h。用10µL枪头垂直方向在细胞内划线，拍照记录划线后细胞分布与形态。弃去板中液体，加入样品S1溶液，每孔1ml，浓度分别为2%和4%（用血清含量0.25%的细胞培养液配制），对照组用DMEM培养基代替（血清含量0.25%），继续培养24h后拍照观察。

结果如图2所示，随着培养液中纳豆提取液含量的增加，细胞向创面内迁移的距离增加，创面愈合加快，表明纳豆提取液有促进皮肤机械损伤愈合的作用。

3．抗炎实验

将Raw264.7细胞以5×10⁴/ml接种于24孔板，在 37℃、5% CO₂条件下培养24h，加入样品S1，同时以LPS（sigma，025M4040V，1万单位/mL）作为模型对照，继续培养24h，用ELISA试剂盒检测炎性因子。

在LPS的刺激下，小鼠巨噬细胞的TNF-α和IL-1β这两种促炎性因子的分泌量有所增加，经过2.0%和4.0%纳豆提取液处理之后，与未经样品处理的LPS模型组相比，TNF-α和IL-1β的分泌量显著降低，其中IL-1β甚至低于正常对照组，说明纳豆提取液对TNF-α和IL-1β具有明显的抑制作用。

表5 纳豆提取液对TNF-α分泌的影响

	正常组	模型组	2.0%	4.0%
					浓度（pg/mL）	86.13	324.03	7.67	6.00
TNF-α抑制率（%）	--	--	97.63	98.15

表6 纳豆提取液对IL-1β分泌的影响

	正常组	模型组	2.0%	4.0%
					浓度（pg/mL）	6.14	6.47	1.71	3.07
IL-1β抑制率（%）	--	--	73.57	52.55

4．保湿效果

保湿效果评价方法：在受试者左、右前臂屈侧标记4×4cm2试验区域5个，使用皮肤水分测试仪Corneometer CM825、皮肤水分流失测试仪Corneometer TM300测试皮肤含水量和水分散失量的初始值，之后按2.0±0.1 mg样品/cm2剂量，分别将样品（添加2%纳豆提取物的保湿精华）及空白对照品（未添加纳豆提取物的保湿精华）均匀涂布于试验区内，再使用Corneometer CM825、Corneometer TM300测定涂抹后30min、1h、3h、6h时各区域内的皮肤水分含量和皮肤水分散失量：

按照上述方法分别对实施例1制得的纳豆提取液及对照组进行保湿率计算，结果如图所示。图3是本发明实施例2提供的使用前后皮肤含水量变化柱状图，图4是本发明实施例2提供的使用前后皮肤水分散失量变化柱状图。

实施例4 纳豆提取液的制备

取2.1kg大豆作为原料，经碾磨式粉碎机充分粉碎后，再过80目筛，筛下大豆粉备用。称量筛下大豆粉约2kg，混匀于200L饮用水中，调pH为8.0，添加复合蛋白酶2mL，50℃保温，每隔0.5h测粗蛋白含量，5h后不再变化，然后升温至95℃，保持15min进行灭酶，再添加4kg蔗糖、2kg谷氨酸钠，0.2kg KH₂PO₄，充分混匀后作为发酵培养基，灭菌后冷却至37℃时，接入0.7%纳豆芽孢杆菌种子液，37℃培养22h，溶氧量为40%-100%。发酵过程中通过流加柠檬酸或碱调节发酵液pH为6.2±0.1，无残糖后，结束发酵。8000rpm离心除去杂质，调pH至6.0，加入1.0kg活性炭（w/v），将混合液升温至60℃，保温3h，再经过1.2μm精细过滤纸板、0.22μm聚醚砜滤芯过滤除菌即可得到纳豆提取液S2，其中，γ-聚谷氨酸含量为1.81g/L。

实施例5 纳豆提取液的制备

取10.7kg大豆作为原料，经碾磨式粉碎机充分粉碎后，再过80目筛，筛下大豆粉备用。称量筛下大豆粉约10kg，混匀于200L饮用水中，调pH为7.5，添加复合蛋白酶100mL，55℃保温，每隔0.5h测粗蛋白含量，2h后不再变化，然后升温至100℃，保持10min进行灭酶，再添加6kg麦芽糖醇、6kg谷氨酸钠，0.5kg MgSO₄，充分混匀后作为发酵培养基，灭菌后冷却至38℃时，接入0.5%纳豆芽孢杆菌种子液，38℃培养27h，溶氧量为40%-100%。发酵过程中通过流加柠檬酸或碱调节发酵液pH为6.0±0.1，无残糖后，结束发酵。8000rpm离心除去杂质，调pH至5.8，加入1.2kg活性炭（w/v），将混合液升温至70℃，保温2h，再经过1.2μm精细过滤纸板、0.22μm聚醚砜滤芯过滤除菌即可得到纳豆提取液S3，其中，γ-聚谷氨酸含量为2.21g/L。

实施例6 纳豆提取液的制备

取5kg大豆作为原料，经碾磨式粉碎机充分粉碎后，再过80目筛，筛下大豆粉备用。称量筛下大豆粉约4.7kg，混匀于200L饮用水中，调pH为6.0，添加复合蛋白酶30mL，60℃保温，每隔0.5h测粗蛋白含量，4.5h后不再变化，然后升温至90℃，保持20min进行灭酶，再添加6kg蔗糖、3kg谷氨酸钠，0.4kg CaCl₂，充分混匀后作为发酵培养基，灭菌后冷却至33℃时，接入1%纳豆芽孢杆菌种子液，33℃培养40h，溶氧量为40%-100%。发酵过程中通过流加柠檬酸或碱调节发酵液pH为7.0±0.1，无残糖后，结束发酵。8000rpm离心除去杂质，调pH至5.0，加入1.5kg活性炭（w/v），将混合液升温至50℃，保温2h，再经过1.2μm精细过滤纸板、0.22μm聚醚砜滤芯过滤除菌即可得到纳豆提取液S4，其中，γ-聚谷氨酸含量为2.42g/L。

实施例7 纳豆提取液的制备

取6kg大豆作为原料，经碾磨式粉碎机充分粉碎后，再过80目筛，筛下大豆粉备用。称量筛下大豆粉约5.6kg，混匀于200L饮用水中，调pH为9.0，添加复合蛋白酶45mL，45℃保温，每隔0.5h测粗蛋白含量，4.5h后不再变化，然后升温至90℃，保持20min进行灭酶，再添加2kg葡萄糖、3.7kg谷氨酸钠，1kg K₂HPO₄，充分混匀后作为发酵培养基，灭菌后冷却至37℃时，接入0.1%纳豆芽孢杆菌种子液，37℃培养20h，溶氧量为40%-100%。发酵过程中通过流加柠檬酸或碱调节发酵液pH为6.1±0.1，无残糖后，结束发酵。8000rpm离心除去杂质，调pH至7.0，加入2kg活性炭（w/v），将混合液升温至80℃，保温1h，再经过1.2μm精细过滤纸板、0.22μm聚醚砜滤芯过滤除菌即可得到纳豆提取液S5，其中，γ-聚谷氨酸含量为1.79g/L。

Claims

1.一种纳豆提取液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）大豆经粉碎，过筛得大豆粉；

（3）将纳豆芽孢杆菌（Bacillus subtilis natto）种子液接种到大豆粉酶解液的发酵培养基上，发酵至终点，获得发酵液；

（4）发酵液除杂、除菌获得成品。

2. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，大豆粉的质量百分含量为1%-5%；酶的添加量为大豆粉的0.1%-1%；；酶为蛋白酶，酶活优选为10万-50万U/g。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，酶解pH为6.0-9.0，酶解温度45℃-60℃，酶解时间2-5h；酶解终点为间隔0.5h粗蛋白含量不再变化。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，纳豆芽孢杆菌种子液接种量为0.1%-1%。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，发酵培养基组成为1%-5%酶解后的大豆粉、1%-3%谷氨酸钠、1%-3%碳源、0.1%-0.5%无机盐、其余为水。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，发酵温度为33℃-38℃；发酵时间为20-40h；溶氧量为40-100%。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，发酵pH为6.0-7.0，作为优选，通过添加柠檬酸控制pH。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，发酵终点为无残留葡萄糖。

9.一种采用如权利要求1-8任一所述的制备方法获得的纳豆提取液。

10.一种如权利要求9所述的纳豆提取液在化妆品中的应用，其特征在于，所述纳豆发酵提取液在化妆品中可作为抗炎、保湿、抗氧化、细胞修复的成分。