CN106432454A - 一种制备菜豆凝集素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种制备菜豆凝集素的方法，该方法它是以菜豆未成熟胚为外植体，经组织培养技术来产生大量愈伤组织，再将愈伤组织处理为浸提液，经过硫酸铵盐析，透析除盐，DEAE‑52阴离子交换层析，超滤浓缩，Superdex‑200凝胶过滤层析，冷冻干燥即可获得大量高纯度菜豆凝集素。该方法克服了菜豆凝集素的产量受菜豆种植周期和条件限制，且难以大量提取和杂质较多等缺陷；本方法系统性、综合性强；方法操作简便，适应性广，可助其他植物蛋白制备借鉴；可大量制备菜豆凝集素。

Description

一种制备菜豆凝集素的方法
技术领域
本发明涉及植物组织培养和蛋白质的提取、分离及纯化，具体地指一种制备菜豆凝集素的方法。
背景技术
菜豆(Phaseolus vulgaris Linn.)又名芸豆或四季豆，是豆科菜豆属一年生草本植物。菜豆营养价值高，蛋白质含量丰富，富含多种维生素及矿物质，其鲜荚可作蔬菜食用，口感上佳，深受人们的喜爱；其籽粒可作粮用，因其可以提高人体免疫力，缓解慢性疾病，常在煨汤时作为配料使用。菜豆不仅在我国各地广泛栽培，在亚洲、非洲及拉丁美洲的许多地区也作为一种主要的植物蛋白来源而被种植，是世界上种植面积仅次于大豆的食用豆类。
近年来，国内外因食用生的或烹饪不充分的菜豆而引起中毒的事件时有发生，但由于菜豆品种繁多，毒性成分各不相同，其中毒原因至今尚无全面阐述。目前，人们普遍认为菜豆凝集素(Phaseolus Vulgaris agglutinin,PHA)是菜豆中主要的毒性成分。菜豆凝集素作为一种蛋白质，在烹饪过程中产生的高温可以使其灭活，才不至于对人体产生危害。深入研究菜豆凝集素，一是研发低毒菜豆品种，解决菜豆食用中毒的实际问题。二是利用其毒性作用，开发植物源生物农药。我们注意到，菜豆凝集素还是菜豆植物体内主要的自我防卫机制之一。菜豆凝集素可以特异性的结合昆虫小肠表面的糖结合位点，阻碍昆虫对营养物质的吸收，并伴随着一系列的并发反应，进而导致细胞膜上电子压紊乱，最终导致昆虫停止生长及多种病变，严重时导致死亡；菜豆凝集素可以特异性的与真菌、细菌等菌类表面的各种糖结合蛋白相结合，进而干扰其细胞壁的合成，从而影响到其细胞的正常代谢，对菌类产生抑制作用；因此，菜豆凝集素具有作为一种高效又安全的生物农药的潜质，有很大的潜在商业价值。
目前国内外已经在抗虫、抗菌、抗肿瘤细胞、抗HIV、细胞凝集及促有丝分裂等多个方面对凝集素展开相关研究。并将其广泛运用于抗虫转基因、血型鉴定、亲和层析和靶向药物载体等多个领域。但上述研究中，其提取材料多为菜豆籽粒或鲜荚，依靠自然条件繁殖或人工栽培的菜豆受地理环境和季节的限制，生长周期较长，可收获季节较短，难以大量获得菜豆凝集素。因而需要一种可以大量而高效制备高纯度菜豆凝集素的方法。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供了一种制备菜豆凝集素的方法，该方法以高凝集素含量菜豆的未成熟胚为材料，经组织培养技术来产生大量愈伤组织，再将愈伤组织处理为浸提液，经过硫酸铵盐析，透析除盐，DEAE-52阴离子交换层析，超滤浓缩，Superdex-200凝胶过滤层析，冷冻干燥即可获得大量高纯度的菜豆凝集素。
为解决上述技术问题，本发明提供的一种制备菜豆凝集素的方法，包括以下步骤：
1)将选取的菜豆未成熟胚消毒和切段，接种于愈伤培养基上，培养得到愈伤组织；
2)将步骤1)得到愈伤组织加入磷酸盐缓冲液PBS中，冰浴研磨，然后置于摇床内震荡提取；最后置于离心机中离心得到上清液；
3)向步骤2)得到的上清液中加入硫酸铵粉末，使上清液中的硫酸铵饱和度达到30％，冰浴1～3h，离心得到一级沉淀物和一级盐析液，向一级盐析液中继续加入硫酸铵粉末，使一级盐析液中的硫酸铵饱和度达到90％，冰浴1～3h，离心得到二级沉淀物和二级盐析液，收集二级沉淀物并用磷酸盐缓冲液PBS重溶；得到盐析样品溶液；
4)将步骤3)得到的盐析样品溶液用10KD透析袋透析除盐，使用磷酸盐缓冲液PBS透析，每5～7h换液一次，直到析出液用BaCl2检测不出白色沉淀，然后继续用蒸馏水透析，透析时间及换液次数与此前对PBS缓冲液透析一致；得到除盐样品；
5)将透析除盐后样品加入预处理过的DEAE-52阴离子交换柱中，洗脱并收集洗脱液体，然后将有活性的洗脱液体用超滤管浓缩，得到浓缩液；
6)将浓缩液滤膜过滤得到滤液，再将滤液加入平衡好的凝胶柱中，洗脱并收集洗脱液，将有活性的洗脱液冷冻干燥，得到干粉即凝集素。
进一步地，所述步骤1)中，菜豆未成熟胚选自花后12～15d的菜豆未成熟胚，0.1％升汞消毒6～10min，再加入无菌水洗涤5～8次，，菜豆未成熟胚切段的长度为1～2cm。
再进一步地，所述步骤1)中，固体培养基为MS培养基+500mg/L的脯氨酸+500mg/L的谷氨酰胺+300mg/L的水解酪蛋白+0.1～3mg/L的2，4-D+0.5mg/L的6-BA+0.1～0.5mg/L的KT，培养条件为白昼交替培养，培养时间20～24d，且每天25℃光照培养8～10h。
再进一步地，所述步骤2)中，愈伤组织与磷酸盐缓冲液的料液比为1:2～4，且磷酸盐缓冲液的摩尔浓度为0.2mol/L，pH 6～8；
再进一步地，所述步骤2)中，摇床温度为4℃，转速为100～120r/min，震荡提取时间为8～20h；离心机的温度为4℃，转速为8000～10000r/min，离心时间8～15min。
再进一步地，所述步骤3)中，离心机的温度为4℃，转速为8000～10000r/min，离心时间8～15min。
再进一步地，所述步骤4)中，透析袋为10KD透析袋。
再进一步地，所述步骤5)中，阴离子交换柱是填料为DEAE-52的阴离子交换柱，超滤管为30KD超滤管；洗脱过程中，用pH 8.0，0.01mol/L的Tris-HCl缓冲液洗脱至流出液于280nm除吸光度测定值小于0.001，调节流速为3ml/min；分别用含0.05mol/L、0.15mol/LNaCl的0.01mol/L、pH为8.0Tris-HCl缓冲液洗脱，用全自动部分收集器收集洗脱液体，设置流速为3ml/min，收集时间为3min/tube，将峰2收集起来。
再进一步地，所述步骤6)中，凝胶柱是填料为Superdex-200的凝胶柱；洗脱过程中，用pH 8.0，0.01mol/L的Tris-HCl缓冲液洗脱，调整流速为0.3ml/min，收集速度为5min/tube，将峰1收集起来。
本发明的有益效果在于：
本发明的该方法克服了菜豆凝集素的产量受菜豆种植周期和条件限制，且难以大量提取和杂质较多等缺陷；本方法系统性、综合性强；方法操作简便，适应性广，可助其他植物蛋白制备借鉴；可大量制备菜豆凝集素。
具体实施方式
为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。
实施例1
菜豆凝集素的活性检测及纯度检验：(1)参照《用考马斯亮蓝染色方法测定蛋白质含量》测定蛋白质浓度；(2)参照《蛋白质技术手册》使用Native-PAGE检测菜豆凝集素的纯度；(3)参照《大豆凝集素含量测定》使用血凝法检测菜豆凝集素的血凝活性。
愈伤组织培养：选取开花14d后的‘Bean Saint esprit a oeil rouge’菜豆未成熟胚为外植体，使用0.1％升汞消毒8min，无菌水洗涤5～8次，切成1～2cm小段，接种于MS+500mg/L脯氨酸+500mg/L谷氨酰胺+300mg/L水解酪蛋白+3mg/L 2，4-D+0.5mg/L 6-BA+0.5mg/L KT的培养基上，25℃光照8h培养，培养21d后取长势较好的愈伤组织进行提取纯化。经检测‘Bean Saint esprit a oeil rouge’菜豆愈伤组织的菜豆凝集素含量为0.65mg/g。
菜豆凝集素的粗提及硫酸铵分级沉淀：将愈伤组织加入0.2mol/L pH 7.2的磷酸盐缓冲液(PBS)，料液比1:3，冰浴研磨，置于4℃摇床120r/min震荡提取12h，在4℃条件下使用冷冻离心机8000r/min离心10min，收集上清液，加入硫酸铵粉末，使上清液中的硫酸铵饱和度达到30％，冰浴2h后，在4℃条件下使用冷冻离心机10000r/min离心30min，去除沉淀，取上清液继续加入硫酸铵粉末，使上清液中的硫酸铵饱和度达到90％，冰浴中静置2h，在4℃条件下以10000r/min使用冷冻离心机离心30min，收集沉淀用PBS缓冲液重溶至原体积，用10KD透析袋透析除盐，使用PBS缓冲液透析，每6h换液一次，直到析出液用BaCl2检测不出白色沉淀。然后对蒸馏水透析，透析时间及换液次数与此前对PBS缓冲液透析一致。
DEAE-52阴离子交换层析纯化：将透析除盐后样品加入预处理DEAE-52阴离子交换柱中，用pH 8.0，0.01mol/L的Tris-HCl缓冲液洗脱至流出液于280nm处吸光度测定值小于0.001，调节流速为3ml/min。分别用含0.05mol/L，0.15mol/L NaCl的0.01mol/L的Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)洗脱，用全自动部分收集器收集洗脱液体，设置流速为3ml/min，收集时间为3min/tube，将峰2收集起来，使用30KD超滤管浓缩。
Superdex-200凝胶过滤层析纯化：将处理好样品过0.22μm滤膜，加入平衡好的Superdex-200凝胶柱中(样品体积不可超过5ml，如超过可适当浓缩)，用pH 8.0，0.01mol/L的Tris-HCl缓冲液洗脱，调整流速为0.3ml/min，收集速度为5min/tube，将峰1样品收集起来，使用血凝法检测有血凝活性，Native-PAGE检测为单一条带，冷冻干燥，即可得凝集素干粉。
实施例2
选取开花14d后的‘Cobra’菜豆未成熟胚为外植体，使用0.1％升汞消毒8min，无菌水洗涤5～8次，切成1～2cm小段，接种于MS+500mg/L脯氨酸+500mg/L谷氨酰胺+300mg/L水解酪蛋白+3mg/L 2，4-D+0.5mg/L 6-BA+0.5mg/L KT的培养基上，25℃光照8h培养，培养21d后取长势较好的愈伤组织进行提取纯化。经检测‘Cobra’菜豆愈伤组织的菜豆凝集素含量为0.169mg/g。根据前面方法纯化菜豆凝集素。
实施例3
选取开花14d后的‘金龙王’菜豆未成熟胚为外植体，使用0.1％升汞消毒8min，无菌水洗涤5～8次，切成1～2cm小段，接种于MS+500mg/L脯氨酸+500mg/L谷氨酰胺+300mg/L水解酪蛋白+3mg/L 2，4-D+0.5mg/L 6-BA+0.5mg/L KT的培养基上，25℃光照8h培养，培养21d后取长势较好的愈伤组织进行提取纯化。经检测‘金龙王’菜豆愈伤组织的菜豆凝集素含量为0.65mg/g。根据前面方法纯化菜豆凝集素。
其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (9)

1.一种制备菜豆凝集素的方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)将选取的菜豆未成熟胚消毒和切段，接种于愈伤培养基上，培养得到愈伤组织；
2)将步骤1)得到愈伤组织加入磷酸盐缓冲液PBS中，冰浴研磨，然后置于摇床内震荡提取；最后置于离心机中离心得到上清液；
3)向步骤2)得到的上清液中加入硫酸铵粉末，使上清液中的硫酸铵饱和度达到30％，冰浴1～3h，离心得到一级沉淀物和一级盐析液，向一级盐析液中继续加入硫酸铵粉末，使一级盐析液中的硫酸铵饱和度达到90％，冰浴1～3h，离心得到二级沉淀物和二级盐析液，收集二级沉淀物并用磷酸盐缓冲液PBS重溶至原体积；得到盐析样品溶液；
4)将步骤3)得到的盐析样品溶液用10KD透析袋透析除盐，使用磷酸盐缓冲液PBS透析，每5～7h换液一次，直到析出液用BaCl2检测不出白色沉淀，然后继续用蒸馏水透析，得到除盐样品；
5)将透析除盐后样品加入预处理过的DEAE-52阴离子交换柱中，洗脱并收集洗脱液体，然后将有活性的洗脱液体用超滤管浓缩，得到浓缩液；
6)将浓缩液滤膜过滤得到滤液，再将滤液加入平衡好的凝胶柱中，洗脱并收集洗脱液体，将有活性的洗脱液体冷冻干燥，得到干粉即凝集素。
2.根据权利要求1所述一种制备菜豆凝集素的方法，其特征在于：所述步骤1)中，菜豆未成熟胚选自花后12～15d的菜豆未成熟胚，0.1％升汞消毒6～10min，再加入无菌水洗涤5～8次，菜豆未成熟胚切段的长度为1～2cm。
3.根据权利要求1所述一种制备菜豆凝集素的方法，其特征在于：所述步骤1)中，固体培养基为MS培养基+500mg/L的脯氨酸+500mg/L的谷氨酰胺+300mg/L的水解酪蛋白+0.1～3mg/L的2，4-D+0.5mg/L的6-BA+0.1～0.5mg/L的KT，培养条件为白昼交替培养，培养时间20～24d，且每天25℃光照培养8～10h。
4.根据权利要求1或2所述一种制备菜豆凝集素的方法，其特征在于：所述步骤2)中，愈伤组织与磷酸盐缓冲液的料液比为1:2～4，且磷酸盐缓冲液的摩尔浓度为0.2mol/L，pH 6～8。
5.根据权利要求1或2所一种述制备菜豆凝集素的方法，其特征在于：所述步骤2)中，摇床温度为4℃，转速为100～120r/min，震荡提取时间为8～20h；离心机的温度为4℃，转速为8000～10000r/min，离心时间8～15min。
6.根据权利要求1或2所述一种制备菜豆凝集素的方法，其特征在于：所述步骤3)中，离心机的温度为4℃，转速为8000～10000r/min，离心时间8～15min。
7.根据权利要求1或2所述一种制备菜豆凝集素的方法，其特征在于：所述步骤4)中，透析袋为10KD透析袋。
8.根据权利要求1或2所述一种制备菜豆凝集素的方法，其特征在于：所述步骤5)中，阴离子交换柱是填料为DEAE-52的阴离子交换柱，超滤管为30KD超滤管；洗脱过程中，用pH8.0，0.01mol/L的Tris-HCl缓冲液洗脱至流出液于280nm除吸光度测定值小于0.001，调节流速为3ml/min；分别用含0.05mol/L、0.15mol/L NaCl的0.01mol/L、pH为8.0Tris-HCl缓冲液洗脱，用全自动部分收集器收集洗脱液体，设置流速为3ml/min，收集时间为3min/tube，将峰2收集起来。
9.根据权利要求1或2所述制备菜豆凝集素的方法，其特征在于：所述步骤6)中，凝胶柱是填料为Superdex-200的凝胶柱；洗脱过程中，用pH 8.0，0.01mol/L的Tris-HCl缓冲液洗脱，调整流速为0.3ml/min，收集速度为5min/tube，将峰1收集起来。
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