JP4975443B2 - 抗血栓活性を有する低分子量多糖 - Google Patents
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Description
−「K5」又は「K5多糖」は、発酵によって大腸菌から得られた莢膜多糖、すなわち、文献に記載された方法に従って、特に、「Vann 1981」に従って、Manzoni M.ら, Journal of Bioactive Compatible Polymers, 1996, 11, 301-311(「Manzoni 1996」)に従って、又は国際特許公開WO01/72848又は米国特許出願公開第2002/0062019号に記載された方法に従って調製及び精製された、上述のように、非還元末端に、任意に、二重結合を含有する二糖ユニット(A)からなる鎖混合物を意味する(後述の事項が各種のN-アセチルヘパロサンに適用されることは、当業者にとって明白である);
−「C5-エピメラーゼ」は、特に、「Campbell 1994」、国際特許公開WO98/48006、Jin-Ping L.ら, J. Biol. Chem., 2001, 276, 20069-20077(「Jin-Ping 2001」)又は「Crawford 2001」に記載されたようにして調製、単離及び精製された抽出又は組換えのD-グルクロニルC5-エピメラーゼを意味する;
−「K5-アミン」は、少なくとも95%N-脱アセチル化された、好ましくは充分にN-脱アセチル化された、すなわち、N-アセチル基が、通常のNMR装置によって検出されない状態のK5を意味する;
−「K5-N-硫酸」は、少なくとも95%、好ましくは100%N-脱アセチル化され、及びN-硫酸化されたK5(N-アセチル基が、通常のNMR装置によって検出されないため)を意味する;
−「エピK5」は、グルクロン酸ユニットの40〜60%が、イズロン酸ユニットにC5-エピマー化されているK5又はその誘導体を意味する;
−「エピK5-N-硫酸」は、グルクロン酸ユニットの40〜60%が、イズロン酸ユニットにC5-エピマー化されているK5-N-硫酸を意味する;
−「エピK5-アミン-O-過硫酸」は、硫酸化度少なくとも2をもつエピK5-アミン-O-硫酸を意味する;
−「エピK5-N,O-硫酸」は、グルクロン酸ユニットの40〜60%が、イズロン酸ユニットにC5-エピマー化されている、硫酸化度2.3〜2.9をもつK5-N,O-硫酸を意味する;
−定義した上記の一般的な用語及び表現は、発酵後に単離された、一般に、分子量分布約1,500〜約50,000、平均分子量約12,000〜25,000、有利には、15,000〜25,000を持つK5に関する;
−分子量を他に特定しない限り、定義した上記の一般的な用語及び表現は、頭文字「LMW(低分子量)」が先頭に付けられた場合(特に、LMW-エピK5-N-硫酸、LMW-エピK5-アミン-O-過硫酸、LMW-エピK5-N,O-硫酸)、平均分子量約1,500〜約12,000を有する低分子量生成物を表わす;
−後に「誘導体」が付けられた場合、定義した上記の一般的な用語及び表現は、全体として、本来のK5からの誘導体及び低分子量K5のものの両方を表わす;
−用語「解重合-LMW-エピK5-N-硫酸」は、後述するように、順序(i)→(ii)又は順序(ii)→(i)に従って得られたLMW-エピK5-N-硫酸を示し;同じように、用語「解重合-LMW-エピK5-アミン-O-過硫酸」及び「解重合-LMW-エピK5-N,O-硫酸」は、解重合-LMW-エピK5-N-硫酸を原料として得られた、それぞれ、LMW-エピK5-アミン-O-過硫酸及びLMW-エピK5-N,O-硫酸を示す;
−定義した上記の一般的な用語及び表現における「K5」の前にある接頭語「エピ」は、全体として、上記に定義したように、本来のK5からの生成物及びエピK5(40〜60%エピマー化されている)からのものの両方を示す。
−他に特に示さない限り、用語「分子量」又は「平均分子量」は、ヘパリンの標準物及び低分子量ヘパリンの基準物について、HPLCによって測定した分子量を示す;
−分子量に関して、用語「約」は、粘度によって測定された分子量±二糖ユニットの理論質量を意味する(ナトリウムの重量を含み、エピK5-N-硫酸誘導体の場合461として、硫酸化度2.8をもつエピ-K5-N,O-硫酸誘導体の場合644として算定される);
−表現「主な化学種」は、LMW-エピK5-N-硫酸、LMW-エピK5-アミン-O-過硫酸又はLMW-エピK5-N,O-硫酸を構成する混合物において、HPLCによって測定された分子量曲線のピークによって決定された最も代表的な化学種である化合物を意味する;
−他に特別に述べない限り、「硫酸化度」は、Casu B.らによりCarbohydrate Research, 1975, 39, 168-176(「Casu 1975」)に開示された導電率法にて測定された比SO3 -/COO-(二糖ユニット当たりの硫酸基の数としても表示される)を意味する;
−「O-過硫酸化条件」は、例えば、B. CasuらによってCarbohydrate Research, 1994, 263, 271-284(「Casu 1994」)に開示された方法Cに従って行われる過激なO-硫酸化を意味する;
−用語「アルキル」は、直鎖状又は分枝状のアルキルを意味し、「テトラブチルアンモニウム」は、テトラ(n-ブチル)アンモニウム基を示す。
−酸性形の(エピ)K5-N-硫酸誘導体を、第3級又は第4級有機塩基にて処理し、反応混合物を30〜60分間放置し、前記第3級又は第4級塩基の添加によって、溶液のpHを約7に維持し、及び前記塩基との塩を単離し;及び
−前記(エピ)K5-N-硫酸誘導体の有機塩基との塩を、O-過硫酸化条件下、O-硫酸化剤にて処理し、及び(エピ)K5-アミン-O-過硫酸誘導体を単離する
ことを包含する方法によって得られる(エピ)K5-アミン-O-過硫酸誘導体又はその薬学上許容される塩を、有効成分として含有する医薬組成物を開示している。
(a)解重合-LMW-エピK5-N-硫酸の第3級又は第4級有機塩基塩を、O-過硫酸化条件下、硫酸化剤にて処理して、解重合-LMW-エピK5-アミン-O-過硫酸を生成し;
(b)このようにして得られた解重合-LMW-エピK5-アミン-O-過硫酸を、選択的O-脱硫酸化に供して、解重合-LMW-エピK5-アミン-O-硫酸を生成し;
(c)このようにして得られた解重合-LMW-エピK5-アミン-O-硫酸の第3級又は第4級有機塩基塩を、O-硫酸化剤にて処理して、6-O-硫酸少なくとも80%を含有する解重合-LMW-エピK5-アミン-O-硫酸を生成し;
(d)このようにして得られた6-O-硫酸少なくとも80%を含有する解重合-LMW-エピK5-アミン-O-硫酸をN-硫酸化反応に供し、このようにして得られた解重合-LMW-エピK5-N,O-硫酸を、好ましくは、そのナトリウム塩(任意に、他の薬学上許容されるその塩に変換される)として単離する、
ことを包含することを特徴とする新規な解重合-LMW-エピK5-N,O-硫酸又はその薬学上許容される塩の製法を提供することにある。
(i)単離し、精製し、固体支持体上に不動化した又は溶液中のD-グルクロニルC5-エピメラーゼによる、カルシウム、マグネシウム、バリウム及びマンガンの中から選ばれる少なくとも1つの2価イオンの存在下、pH約7、温度約30℃、時間12〜24時間でのC5-エピマー化に供し;及び
(ii)亜硝酸解重合に供し、続いて、通常、水素化ホウ素ナトリウムによる還元を行う
ことを包含する方法によって調製される。
(a1)酸性形の前記解重合-LMW-エピK5-N-硫酸を、第3級又は第4級有機塩基にて処理し、反応混合物を30〜60分間静置し、前記第3級又は第4級有機塩基の添加によって、溶液のpHを約7に維持し、及び、その前記有機塩基との塩を単離し;
(a2)前記解重合-LMW-エピK5-N-硫酸の前記有機塩基との塩を、O-過硫酸化条件下、O-硫酸化剤にて処理し、解重合-LMW-エピK5-アミン-O-過硫酸を単離する
ことによって行うことによって、より大きい硫酸基/カルボキシル基の比、すなわち、少なくとも3.4、有利には少なくとも3.5、さらに有利には3.55〜4、好ましくは3.55〜3.8を有する解重合-LMW-エピK5-アミン-O-過硫酸が得られる。
(ii)K5-N-硫酸を亜硝酸解重合に供して、平均分子量4,000以上、有利には約5,000〜約7,500、好ましくは約6,000〜約7,500を有する解重合-LMW-K5-N-硫酸を得る工程;
(i)このようにして得られた解重合-LMW-K5-N-硫酸を、D-グルクロニル-C5-エピメラーゼによるC5-エピマー化に供して、イズロン酸ユニット40〜60%を含有する対応の解重合-LMW-エピK5-N-硫酸を得る工程;
(a)このようにして得られた解重合-LMW-エピK5-N-硫酸の第3級又は第4級有機塩基塩を、O-過硫酸化条件下、硫酸化剤にて処理して、解重合-LMW-エピK5-アミン-O-過硫酸を得る工程;
(b)このようにして得られた解重合-LMW-エピK5-アミン-O-過硫酸を、選択的O-脱硫酸化に供して、解重合-LMW-エピK5-アミン-O-硫酸を得る工程;
(c)このようにして得られた解重合-LMW-エピK5-アミン-O-硫酸の第3級又は第4級有機塩基塩を、O-硫酸化剤にて処理して、6-O-硫酸少なくとも80%を含有する解重合-LMW-エピK5-アミン-O-硫酸を得る工程;
(d)このようにして得られた6-O-硫酸少なくとも80%を含有する解重合-LMW-エピK5-アミン-O-硫酸を、N-硫酸化反応に供し、このようにして、そのナトリウム塩として得られた解重合-LMW-エピK5-N,O-硫酸を単離し、前記塩を、任意に、他の薬学上許容される塩に変換する工程を包含することを特徴とする硫酸化度2.3〜2.9を有する解重合-LMW-エピK5-N,O-硫酸又はその薬学上許容される塩の製法を提供するものである。
(i)K5-N-硫酸を、単離し、精製し、固体支持体上に不動化した又は溶液中のD-グルクロニル-C5-エピメラーゼによる、カルシウム、マグネシウム、バリウム及びマンガンの中から選ばれる少なくとも1つの2価イオンの存在下、pH約7、温度約30℃における12〜24時間のC5-エピマー化に供して、イズロン酸ユニット40〜60%を含有するエピK5-N-硫酸を生成する工程;
(ii)このようにして得られたエピK5-N-硫酸を、亜硝酸解重合、続く、通常、水素化ホウ素ナトリウムによる還元に供して、解重合-LMW-K5-N-硫酸を得る工程;
(a)このようにして得られた解重合-LMW-エピK5-N-硫酸の第3級又は第4級有機塩基塩を、O-過硫酸化条件下、硫酸化剤にて処理して、解重合-LMW-エピK5-アミン-O-過硫酸を得る工程;
(b)このようにして得られた解重合-LMW-エピK5-アミン-O-過硫酸を、選択的O-脱硫酸化に供して、解重合-LMW-エピK5-アミン-O-硫酸を得る工程;
(c)このようにして得られた解重合-LMW-エピK5-アミン-O-硫酸の第3級又は第4級有機塩基塩を、O-硫酸化剤にて処理して、6-O-硫酸少なくとも80%を含有する解重合-LMW-エピK5-アミン-O-硫酸を得る工程;
(d)このようにして得られた6-O-硫酸少なくとも80%を含有する解重合-LMW-エピK5-アミン-O-硫酸を、N-硫酸化反応に供し、このようにして、ナトリウム塩として得られた解重合-LMW-エピK5-N,O-硫酸を単離し、前記塩を、任意に、他の薬学上許容される塩に変換する工程を包含する。
(a1')酸性形の(エピ)K5-N-硫酸誘導体を、第3級又は第4級有機塩基にて処理し、第3級又は第4級有機塩基との塩を、その生成直後に、pH約5〜約9において単離すること;
(a2')前記(エピ)K5-N-硫酸誘導体の前記第3級又は第4級有機塩基との塩を、O-過硫酸化条件下、O-硫酸化剤にて処理し、(エピ)K5-アミン-O-過硫酸誘導体を、ナトリウム塩(続いて、他の塩に変換される)として単離すること
によって得られる。
(i)エピK5-N-硫酸へのエピマー化
国際特許公開WO02/068477の実施例2の工程(i)及び(ii)に記載されているようにして得られたK5-N-硫酸(その1H-NMRスペクトルは、アセチル基又はNH2に関連するシグナルを示さない)10gを、CaCl2を濃度50mMで含有するpH7の25mM HEPES緩衝液600 mlに溶解し、このようにして得られた溶液を、国際特許公開WO01/72848の実施例1に記載されているようにして不動化した組換えC5-エピメラーゼ(国際特許公開WO96/14425)5gを含有するSepharose 4B樹脂を充填した50mlカラムを通して循環させる。30℃、pH7、流量200 ml/hにおいて、24時間反応を行う。得られた生成物を、限外濾過及びエタノールによる沈殿によって精製する。このようにして、イズロン酸含量54%を有するエピK5-N-硫酸を得る。
蒸留水25ml中に、上記のようにして得られた生成物1gを含有する溶液に、蒸留水115 mlに溶解した亜硝酸ナトリウム230 mgを添加する。ついで、溶液を4℃とし、0.1N HClにてpHを2に調整し、30分間維持する。反応終了時、溶液を室温とし、0.1N NaOHにてpHを7とする。ついで、溶液に、NaBH4 450 mgを添加し、4時間反応させる。4℃のアセトン3容での沈殿、濾過ロートでの濾過によって生成物を回収し、真空オーブン内において40℃で乾燥して、イズロン酸含量54%及び分子量分布(HPLC法で測定)1,000〜4,000をもつ解重合-LMW-エピK5-N-硫酸900 mgを得る。
平均分子量約5,000をもつ解重合-LMW-エピK5-N-硫酸:順序(ii)→(i)
(ii)K5-N-硫酸の解重合
国際特許公開WO02/068477の実施例2の工程(i)及び(ii)に記載されているようにして得られたK5-N-硫酸2gを、亜硝酸ナトリウム100 mg及び水素化ホウ素ナトリウム300 mgを使用して、上記調製Iの工程(ii)に記載のようにして解重合する。平均分子量5,000をもつ解重合-LMW-K5-N-硫酸1.8gを得る。
上記工程(ii)で得られた解重合-LMW-K5-N-硫酸1gを、上記調製Iの工程(i)に記載のようにして処理する。イズロン酸/グルクロン酸の比44/56(原料物質における比0/100に対して)、分子量分布2,000〜10,000及び平均分子量5,000Dをもつエピマー化生成物を得る。解重合-LMW-エピK5-N-硫酸の収率(カルバゾール法(Bitter及びMuir, Anal. Biochem. 1971, 39, 88-92)にて、標準物に対して、ウロン酸含量を測定することによって算定)は90%である。
解重合-LMW-K5-N-硫酸:順序(i)→(ii)
(i)エピK5-N-硫酸へのエピマー化
国際特許公開WO02/068477の実施例2の工程(i)及び(ii)に記載のようにして得られたK5-N-硫酸2gを、50mM CaCl2を含有するpH7の25mM HEPES緩衝液125 mlに溶解する。得られた溶液を、国際特許公開WO96/14425に記載のようにして得られた不動化酵素を含有する樹脂を充填した50mlカラムを通して循環させる。30℃において、流量200 ml/hで、操作を24時間実施する。得られた生成物を、1000D膜を介する限外濾過及びIR 120 H+イオン交換樹脂上の通過、1N NaOHでの溶離液の中和によって精製する。エタノール又はアセトンでの沈殿によってサンプルを回収する。イズロン酸/グルクロン酸の比55/45(原料物質における比0/100に対して)をもつエピマー化生成物を得る。エピマー化率(%)を、国際特許公開WO96/14425に記載の方法に従って1H-NMRにて算定する。エピK5-N-硫酸の収率(カルバゾール法(Bitter及びMuir, Anal. Biochem. 1971, 39, 88-92)にて、標準物に対して、ウロン酸含量を測定することによって算定)は90%である。
工程(i)において得られた生成物1gを、亜硝酸による減成法及び続く、生成されたアルデヒドの還元によって解重合する。詳しくは、生成物を蒸留水25mlに溶解し、得られた溶液に、蒸留水115 mlに溶解した亜硝酸ナトリウム230 mgを添加することによって操作を行う。ついで、溶液を4℃とし、0.1N HClにてpHを2とし、30分間維持する。反応終了時、溶液を室温とし、0.1N NaOHにてpHを7とする。ついで、溶液に、NaBH4 450 mgを添加し、4時間反応させる。4℃のアセトン3容での沈殿、濾過ロートでの濾過によって生成物を回収し、真空オーブン内において40℃で乾燥して、分子量分布(HPLC法で測定)1,000〜4,000及びグルクロン酸含量45%及びイズロン酸含量54%をもつ解重合-LMW-エピK5-N-硫酸900 mgを得る。
平均分子量約2,000を有する解重合-LMW-エピK5-N-硫酸
蒸留水200 ml中に、米国特許出願公開第2002/0061019号の実施例12、パラグラフ[0251]〜[0265]に記載のようにして得られたエピK5-N-硫酸1gを含有する溶液に、蒸留水240 mlに溶解した亜硝酸ナトリウム480 mgを添加する。ついで、溶液を4℃とし、0.1N HClにてpHを2に調整し、30分間維持した。反応終了後、0.1N NaOHにてpH7とし、ついで、室温とする。ついで、溶液にNaBH4 450 mgを添加し、4時間反応させる。HClにてpHを5〜6に調整することによって、過剰のNaBH4を除去する。0.1N NaOHにて中和した後、生成物を、4℃のアセトン3容での沈殿、濾過ロートでの濾過によって回収し、真空オーブン内において40℃で乾燥する。鎖混合物からなり、前記鎖混合物において、優勢な化学種が式I'b(ここで、mが4である)で表される化合物である平均分子量約2,000の解重合-LMW-エピK5-N-硫酸900 mgが得られる。
平均分子量約6,000をもつ解重合-LMW-エピK5-N-硫酸
原料のK5-N-硫酸
2N NaOH 800 ml中に、純度95%のK5 8gを含有する溶液を60℃に24時間加熱する。冷却後、6N HClによって、溶液をpH7とする。このようにして中和した溶液に、初めに、炭酸ナトリウム12.8g、ついで、固状のピリジン-SO3付加物12.8gを少量ずつ添加する。反応混合物を40℃に24時間維持する。1000Dカットオフの膜Millipore Prepscale TFF上での限外濾過によって塩を除去した後、得られた生成物を、アセトン3容での沈殿によって回収する。このようにして、K5-N-硫酸8gが得られる。その1N-NMRスペクトルは、N-硫酸化が100%であること(NH2及びアセチル基によるシグナルが存在しない)を示す。
(i)エピマー化
上記のようにして得られたK5-N-硫酸8gを、50mM CaCl2を含有するpH7の0.25M HEPES緩衝液200 mlに溶解し、溶液中、30℃、pH7において、組換えC5-エピメラーゼ9.6×1010 cpmにて24時間処理する。反応終了後、Millipore Prepscale TFF 1000Dカットオフ膜上での限外濾過による塩の除去によって生成物を精製し、アセトン3容にて沈殿させる。このようにして、エピK5-N-硫酸7.5gが得られる。エピマー化率(実際には、国際特許公開WO96/4425に記載された方法に従って、1H-NMRにて算定されたグルクロン酸ユニットに対するイズロン酸ユニットの量)は52%である。
上記のようにして得られたエピK5-N-硫酸7.5gを水150 mlに溶解し、溶液を4℃で恒温とし、ついで、予め冷却した1M HClにてpHを2.2とする。溶液に、亜硝酸ナトリウム431.2 mg(2%亜硝酸ナトリウム溶液21.56 mlに相当する)を添加する。pHを再度2.2とし、反応混合物を、攪拌下、4℃に20分間維持する。6N HClにてpH7.0に中和した後、溶液に、水素化ホウ素ナトリウム1.35gを添加する。反応混合物を室温に4時間維持することによって還元を行い、ついで、発泡が消失するまで攪拌しながら、1N HClにてpHを5とすることによって過剰の還元剤を分解する。1M NaOHにて、pHを再度7〜7.2とした。解重合生成物を、Millipore TFF 1000Dカットオフ膜での限外濾過及び続くアセトン3容での沈殿によって回収する。このようにして、解重合-LMW-エピK5-N-硫酸7gが得られる。この生成物の平均分子量(HPLCを介して算定)は6,000Dである。
(a1)解重合-LMW-エピK5-N-硫酸のテトラブチルアンモニウム塩
水350 ml中に、調製Vにおいて得られた解重合-LMW-エピK5-N-硫酸7gを含有する溶液を、IR-120 H+のカラムを通過させた。溶出液のpHは2.91である。透過溶液を、15%水酸化テトラブチルアンモニウム溶液(42.2 ml)にてpH7とし、pHを7に維持するため制御しながら、室温に1時間維持した。回転蒸発器においてテトラブチルアンモニウム塩を濃縮した後、サンプルを冷凍し、凍結乾燥させた。このようにして、原料の解重合-LMW-エピK5-N-硫酸のテトラブチルアンモニウム塩10.9gが得られた。
上記のようにして得られたテトラブチルアンモニウム塩を、ジメチルホルムアミド158 mlに溶解し、ついで、DMF 158 mlに溶解したピリジン-SO3 28.8gを添加し、反応混合物を45℃に18時間維持した。反応を停止させるため水316 mlを添加し、30%NaOHにてpHを7とした。NaClにて飽和したアセトン3容(1.896 L)での沈殿及び続くMillipore TFF 1,000D膜での膜分離精製(塩が除去されるまで)によって、解重合-LMW-エピK5-アミン-O-過硫酸を回収した。
工程(a)で得られた解重合-LMW-エピK5-アミン-O-過硫酸を含有する溶液を、室温において、イオン交換樹脂IR-120 H+上を通過させ、pHをピリジンにて6.7とした。ついで、溶液を冷凍し、凍結乾燥に供した。このようにして得られたピリジン塩(10.73g)を、ジメチルスルホキシド97ml及びメタノール11mlを含有する溶液に溶解した。溶媒が65℃で恒温となった時点で、解重合-LMW-エピK5-アミン-O-過硫酸のピリジン塩を添加した。溶媒が65℃となった時点を反応開始時点とみなし、この時点から開始して、反応混合物を、この温度に2時間半維持した(調製において、終了時のpHは2.24であった)。氷水を使用することによって反応混合物を冷却して約30℃とし、ついで、水4.5mlを添加した。溶液にアセトン5容を導入することによってサンプルを回収し、生成した沈殿物をguch G4上での濾過によって回収した。ついで、濾過ケーキをアセトンにて洗浄し、水に再度溶解した。2N NaOHにてpHを7.5とした。このようにして得られた解重合-LMW-エピK5-アミン-O-硫酸の300 MHz 13C-NMRスペクトルを図1に示す。
溶液をIR-120 H+樹脂上を通過させ、15%水酸化テトラブチルアンモニウム溶液にて中和した。このようにして得られた塩を凍結乾燥して、上記解重合-LMW-エピK5-アミン-O-硫酸のテトラブチルアンモニウム塩からなる部分的O-脱硫酸化生成物12.34gを得た。このようにして得られたテトラブチルアンモニウム塩を、DMF 150 mlに溶解し、この溶液に、DMF75mlに溶解したピリジン-SO3付加物14gを添加した。反応混合物を0℃に90分間維持し、ついで、これに水110 mlを添加して、反応を停止させた。反応終了後、2N NaOHによって、混合物のpH(調製時には3.4)を7.2とした。NaClにて飽和したアセトン3容での沈殿によってサンプルを回収した。沈殿を促進するため、NaClにて飽和したアセトン数滴を添加した。白色沈殿が形成された。調製において、6-O-硫酸化グルコサミン含量80%、3-O-硫酸化グルコサミン含量50%、3-O-硫酸化グルクロン酸含量40%及び2-O-硫酸化イズロン酸含量20%をもつ解重合-LMW-エピK5-アミン-O-硫酸6.8gを得るため、操作を2回繰返し行った。
13C-NMRスペクトルを図2に示す。
工程(c)の終了時に得られた解重合-LMW-エピK5-アミン-O-硫酸を水500 mlに溶解し、ついで、溶液に、水500 mlに溶解した炭酸ナトリウム12.8gを添加した。炭酸塩を添加した後の溶液のpHは10.51であった。溶液を40℃で恒温とした後、固体のピリジン-SO3 12.8gを、少量ずつ、4時間で添加した。調製において、溶液の最終pHは7.2であった。NaClの存在下、ついで、水にて、サンプルを膜分離精製した。硫酸化度2.83及びN-硫酸化グルコサミン含量95〜100%、6-O-硫酸化グルコサミン含量80%、3-O-硫酸化グルコサミン含量50%、3-O-硫酸化グルクロン酸含量40%及び2-O-硫酸化イズロン酸含量20%をもつ解重合-LMW-エピK5-N,O-硫酸8.0gを得た。
Claims (14)
- ウロン酸ユニットの40〜60%がイズロン酸ユニットであり、グルコサミンユニットの少なくとも40%が3-O-硫酸化されており、硫酸化度が2.3〜2.9であり、かつ下記式:
(a) ウロン酸ユニットの40〜60%がイズロン酸ユニットであり、平均分子量が1,500〜12,000であり、かつ下記式:
(b) このようにして得られた解重合-LMW-エピK5-アミン-O-過硫酸を、第3級又は第4級有機塩基塩に転化した後、選択的O-脱硫酸化に供して、解重合-LMW-エピK5-アミン-O-硫酸を生成し;
(c) このようにして得られた解重合-LMW-エピK5-アミン-O-硫酸を、第3級又は第4級有機塩基塩に転化した後、0℃の温度で60〜120分間O-硫酸化剤にて処理して、グルコサミンユニットの少なくとも80%が6-O-硫酸化された解重合-LMW-エピK5-アミン-O-硫酸を生成し;
(d) このようにして得られたグルコサミンユニットの少なくとも80%が6-O-硫酸化された解重合-LMW-エピK5-アミン-O-硫酸をN-硫酸化反応に供し、このようにして得られた解重合-LMW-エピK5-N, O-硫酸を単離する工程を有することを特徴とする、解重合-LMW-エピK5-N, O-硫酸の製法。 - 得られた解重合-LMW-エピK5-N, O-硫酸をナトリウム塩として単離し、ナトリウム塩を、任意に、他の薬学上許容される塩に変換する、請求項1記載の製法。
- 他の塩が、他のアルカリ金属、アルカリ土類金属、アルミニウム又は亜鉛との塩である、請求項2記載の製法。
- 原料の解重合-LMW-エピK5-N-硫酸が、K5-N-硫酸を、いずれかの順序で、
(i) 単離し、精製し、固体支持体上に不動化した又は溶液中のD-グルクロニルC5-エピメラーゼによる、カルシウム、マグネシウム、バリウム及びマンガンの中から選ばれる少なくとも1つの2価イオンの存在下、pH7、温度30℃、時間12〜24時間でのC5-エピマー化に供し;及び
(ii) 亜硝酸解重合に供し、続いて、通常、水素化ホウ素ナトリウムによる還元を行うことによって得られたものである、請求項1〜3のいずれかに記載の製法。 - 原料の解重合-LMW-エピK5-N-硫酸が、順序(i)→(ii)に従って得られたものである、請求項4記載の製法。
- 前記原料の解重合-LMW-エピK5-N-硫酸の平均分子量が1,500〜7,500である、請求項5記載の製法。
- 請求項1〜9のいずれかに記載の製法によって得られた、解重合-LMW-エピK5-N, O-硫酸。
- 平均分子量1,500〜8,000及び硫酸化度2.5〜2.9を有する、請求項11記載の解重合-LMW-エピK5-N, O-硫酸。
- 平均分子量6,000、硫酸化度2.7〜2.9、グルコサミン6-O-硫酸含量80〜95%、グルコサミンN-硫酸含量95〜100%、グルコサミン3-O-硫酸含量45〜55%、グルクロン酸3-O-硫酸含量35〜45%、イズロン酸2-O-硫酸含量15〜25%を有し、その鎖の大部分の還元末端において前記硫酸化2, 5-アンヒドロマンニトールユニットを有する、請求項10〜12のいずれかに記載の解重合-LMW-エピK5-N, O-硫酸。
- 有効成分として、請求項10〜13のいずれかに記載の解重合-LMW-エピK5-N, O-硫酸又はその薬学上許容される塩を、医薬用キャリヤーとの混合物の形で、薬学上有効な量で含有する、医薬組成物。
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