EP1567558A2 - Aldonsäure-ester, verfahren zu ihrer herstellung und verfahren zur herstellung von mit polysacchariden oder polysaccharid-derivaten an freien aminogruppen gekoppelten pharmazeutischen wirkstoffen - Google Patents

Aldonsäure-ester, verfahren zu ihrer herstellung und verfahren zur herstellung von mit polysacchariden oder polysaccharid-derivaten an freien aminogruppen gekoppelten pharmazeutischen wirkstoffen

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EP1567558A2
EP1567558A2 EP03780109A EP03780109A EP1567558A2 EP 1567558 A2 EP1567558 A2 EP 1567558A2 EP 03780109 A EP03780109 A EP 03780109A EP 03780109 A EP03780109 A EP 03780109A EP 1567558 A2 EP1567558 A2 EP 1567558A2
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EP
European Patent Office
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aldonic acid
acid ester
aldonic
starch
acid esters
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP03780109A
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English (en)
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Inventor
Klaus Sommermeyer
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Supramol Parenteral Colloids GmbH
Original Assignee
Supramol Parenteral Colloids GmbH
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Publication date
Application filed by Supramol Parenteral Colloids GmbH filed Critical Supramol Parenteral Colloids GmbH
Publication of EP1567558A2 publication Critical patent/EP1567558A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
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    • C08B31/00—Preparation of derivatives of starch
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
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    • A61K47/61—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or a derivative thereof
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    • C08B31/00—Preparation of derivatives of starch
    • C08B31/16—Ether-esters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C08B31/18—Oxidised starch
    • C08B31/185—Derivatives of oxidised starch, e.g. crosslinked oxidised starch
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C08B33/00—Preparation of derivatives of amylose
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B35/00—Preparation of derivatives of amylopectin
    • C08B35/02—Esters

Definitions

  • Aldonic acid esters process for their preparation and process for the preparation of active pharmaceutical ingredients coupled to polysaccharides or polysaccharide derivatives on free amino groups.
  • the present invention relates to aldonic acid esters, solids and solutions containing these esters and processes for their preparation. Furthermore, the present invention relates to processes for the preparation of active pharmaceutical ingredients coupled to free amino groups with polysaccharides or polysaccharide derivatives, which are carried out using the aldonic acid esters, and to the active pharmaceutical ingredients which can be obtained by these processes.
  • Such proteins often have a short biological half-life, which can be extended by coupling to the above-mentioned polymer compounds such as PEG or HES. Coupling can also have a positive effect on the antigenic properties of proteins. In the case of other active pharmaceutical ingredients, the water solubility can be increased considerably by the coupling.
  • DE 196 28 705 and DE 101 29 369 describe methods of coupling with hydroxyethyl starch in anhydrous dimethyl sulfoxide (DMSO) via the corresponding aldonic acid lactone of hydroxyethyl starch with free amino groups of hemoglobin or amphotericin B. Since it is often not possible to work in water-free, aprotic solvents, especially in the case of the proteins, either for reasons of solubility but also for reasons of denaturing the proteins, coupling processes with HES are also available in a water-containing environment.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • the coupling of the hydroxyethyl starch oxidized selectively to the aldonic acid at the reducing chain end succeeds by mediating water-soluble carbodiimide EDC (l-ethyl-3- (3-dimethylaminopro ⁇ yl) carbodiimide) (PCT / EP 02/02928).
  • EDC l-ethyl-3- (3-dimethylaminopro ⁇ yl) carbodiimide
  • the object of the invention was to provide compounds which, while avoiding the disadvantages described above, couple polysaccharides or their derivatives to active substances containing amino groups, in particular to proteins, in purely aqueous systems or else enable specifically in solvent mixtures with water.
  • such a compound should be such that the most quantitative possible binding of an active ingredient takes place by covalent binding to a polysaccharide or a polysaccharide derivative.
  • the invention was also based on the object of creating compounds which enable a polysaccharide or a derivative thereof to be linked as gently as possible to the active ingredient.
  • the structure, the activity and the tolerance of the active ingredient should be determined by the
  • T Tm ⁇ pt.n .n ⁇ n.n ⁇ 1.r. ⁇ Jt weni ⁇ to be changed Rei ⁇ nie.l ⁇ we.se should be intra- and intermolecular crosslinking reactions are avoided. In addition, it should also be possible to link active ingredients which have phosphate groups.
  • the object of the invention was to provide a process which is as simple and inexpensive as possible for the production of such compounds and coupling products of polysaccharides or polysaccharide derivatives with active compounds.
  • claims 18-27 provide a solution to the underlying problem.
  • Claims 28-32 describe processes for the preparation of polysaccharide-active substance conjugates and the pharmaceutical active substances obtainable by these processes.
  • esters which are derived from polysaccharides or polysaccharide derivatives which are selectively oxidized to aldonic acids at the reducing chain end, it is possible to provide compounds which solve the aforementioned tasks.
  • Such esters can be regarded as activated acids. They react in a watery environment with nucleophilic NH 2 groups to (more stable) amides.
  • aldonic acid esters according to the invention enable an active substance to be easily bound by covalent binding to a polysaccharide or a polysaccharide derivative.
  • the aldonic acid esters of the present invention can be reacted with an active ingredient under mild conditions.
  • the structure, the activity and the tolerance of the active ingredient are only changed to a small extent by the implementation.
  • intermolecular and intermolecular crosslinking reactions in particular, can be avoided.
  • active pharmaceutical ingredients that have phosphate groups can be coupled without changing these groups.
  • the aldonic acid esters according to the invention allow a very selective coupling to the active substance. Furthermore, for example, a targeted stoichiometry of the desired conjugate can be set, the production of 1: 1 conjugates in particular being made possible by using these compounds.
  • the present invention provides simple and inexpensive processes for the preparation of activated aldonic acid esters and coupling products of polysaccharides or polysaccharide derivatives with active ingredients.
  • the aldonic acid esters of the present invention are of polysaccharides can be selectively oxidized. Such polysaccharides, as well as derivatives obtainable therefrom, are widely known in the art and can be obtained commercially.
  • Polysaccharides are macromolecular carbohydrates, the molecules of which have a large number (at least> 10, but usually considerably more) of monosaccharide molecules (glycose) linked to one another by glycosides.
  • the weight average molecular weight of preferred polysaccharides is preferably in the range from 1500 to 1,000,000 daltons, particularly preferably 2,000 to 300,000 daltons and very particularly preferably in the range from 2,000 to 50,000 daltons.
  • the molecular weight Mw can be determined using conventional methods. These include, for example, aqueous GPC, HPLC, light scattering and the like.
  • the residence time in the body can be changed via the molecular weight of the polysaccharide residue.
  • the preferred polysaccharides include starch and the starch fractions obtainable by hydrolysis, which can be regarded as starch degradation products.
  • Starch is usually divided into atylose and amylopectin, which differ in the degree of branching. According to the invention, amylopectin is particularly preferred.
  • Amylopectins are initially understood to mean very generally branched starches or starch products with - (1-4) and ⁇ - (1-6) bonds between the glucose molecules.
  • the branches of the chain are made via the ⁇ - (1-6) bonds. These are present irregularly about every 15-30 glucose segments in naturally occurring amylopectins.
  • the molecular weight of natural amylopectin is very high in the range from 10 7 to 2x10 S daltons. It is believed that amylopectin also forms helices within certain limits.
  • a degree of branching can be defined for amylopectins.
  • the measure of branching is the ratio of the number of molecules of anhydroglucose, the branch points ( ⁇ - (1-6) bonds) contribute to the total number of molecules of the anhydroglucose of amylopectin, this ratio being expressed in mol%.
  • Amylopectin occurring in nature has degrees of branching of approximately 4 mol%.
  • Amylopectins used preferably for the preparation of the aldonic acid esters have an average branching in the range from 5 to 10 mol%.
  • hyperbranched amylopectins can be used which have a degree of branching which goes significantly beyond the degree of branching known from nature for amylopectins.
  • the degree of branching is in any case an average (mean degree of branching), since amylopectins are polydisperse substances.
  • hyperbranched amylopectins have significantly higher degrees of branching, expressed as mol% of the branching anhydroglucoses, compared to unchanged amylopectin or hydroxyethyl starch and are therefore more similar in structure to glycogen.
  • the average degree of branching of the hyperbranched amylopectins is usually in the range between> 10 and 25 mol%. This means that these amylopectins have on average approximately every 10 to 4 glucose units an ⁇ - (1-6) bond and thus a branch point.
  • An amylopectin type which can preferably be used in the medical field is characterized by a degree of branching between 11 and 16 mol%.
  • hyperbranched amylopectins have a degree of branching in the range between 13 and 16 mol%.
  • amylopectins which can be used in the invention preferably have a value for the weight average molecular weight Mw in the range of 2,000 up to 800,000 daltons, in particular 2,000 to 300,000 and particularly preferably 2,000 to 50,000 daltons.
  • starch can be obtained from potatoes, tapioca, cassava, rice, wheat or corn.
  • the starches obtained from these plants are often first subjected to a hydrolytic degradation reaction.
  • the molecular weight is reduced from about 20,000,000 daltons to several million daltons, and a further reduction in the molecular weight to the values mentioned above is also known.
  • waxy maize starch degradation fractions can particularly preferably be used to prepare the aldonic acid esters according to the invention.
  • Derivatives of polysaccharides can also be used to prepare the aldonic acid esters according to the invention.
  • These include in particular hydroxyalkyl starches, for example hydroxyethyl starch and hydroxypropyl starch, which can be obtained by hydroxyalkylation from the starches set out above, in particular from amylopectin.
  • hydroxyethyl starch HES is preferred.
  • HES hydroxethylated derivative of the amylopectin glucose polymer which is present in waxy maize starch to an extent of over 95%.
  • Amylopectin consists of glucose units which are present in ⁇ -1,4-glycosidic bonds and have ⁇ -1,6-glycosidic branches.
  • HES has advantageous rheological properties and is currently used clinically as a volume substitute and for hemodilution therapy (Sommermeyer et al., I rankenhauspharmazie, Vol. 8 (8, 1987) pages 271-278 and Weidler et. Al., Arzneistoffforschung / Drug Res., 41, (1991) pages 494-498).
  • HES is essentially characterized by the weight average molecular weight Mw, the number average molecular weight Mn, the molecular weight distribution and the degree of substitution. Substitution with hydroxyethyl groups in ether linkage is possible at the carbon atoms 2, 3 and 6 of the anhydroglucose units.
  • the degree of substitution can be described as DS ("degree of substitution"), which refers to the proportion of substituted glucose molecules of all glucose units, or as MS (“molar substitution”), which denotes the average number of hydroxyethyl groups per glucose unit.
  • the degree of substitution MS (molar substitution) is defined as the average number of hydroxyethyl groups per anhydroglucose unit. It is determined from the total number of hydroxyethyl groups in a sample, for example according to Morgan, by ether cleavage and subsequent quantitative determination of ethyl iodide and ethylene, which are formed here.
  • a hydroxyethyl starch residue preferably has a degree of substitution MS of 0.1 to 0.8.
  • the hydroxyethyl starch residue particularly preferably has a degree of substitution MS of 0.4 to 0.7.
  • the reactivity of the individual hydroxy groups in the unsubstituted anhydroglucose unit with respect to hydroxyethylation differs depending on the reaction conditions.
  • the substitution pattern ie the individual, differently substituted anhydroglucoses, which are statistically distributed among the individual polymer molecules, can be influenced within certain limits.
  • the C 2 and C 6 positions are advantageously hydroxyethylated, the C 6 position being substituted more frequently because of its easier accessibility.
  • Hydroxyethyl starches which are substituted in the C 2 position and are substituted as homogeneously as possible are preferably used in the context of this invention.
  • HES Hydroxyethyl starches
  • the production of such HES is described in EP 0402 724 B2. They are completely biodegradable within a physiologically reasonable time and still have controllable elimination behavior on the other hand.
  • the predominant C 2 substitution makes the hydroxyethyl starch relatively difficult to break down for ⁇ -amylase. It is advantageous that, as far as possible, there are no anhydroglucose units which are substituted one after the other within the polymer molecules, in order to ensure complete degradability.
  • such hydroxyethyl starches have a sufficiently high solubility in an aqueous medium so that the solutions are stable even over long periods of time and no agglomerates or gels form.
  • a hydroxyethyl starch residue preferably has a ratio of C 2 : C 6 substitution in the range from 2 to 15.
  • the ratio of C 2 : C 6 substitution is particularly preferably 3 to 11.
  • aldonic acid The selective oxidation of the aldehyde group of the polysaccharides or polysaccharide derivatives described above to form aldonic acid is known per se. This can be done by mild oxidizing agents, for example iodine / potassium hydroxide according to DE 196 28 705 AI, or by enzymes.
  • the free aldonic acid can be used for the reaction.
  • Salts can also be used. These include, in particular, the alkali salts, such as the sodium and / or the potassium salt of the aldonic acids.
  • Alcohols are used to prepare the aldonic acid esters according to the invention.
  • the term alcohol includes compounds that have HO groups. These HO groups can be bound, inter alia, to a nitrogen atom or to a phenyl radical.
  • Acidic alcohols which are known in the technical field are preferably used. These include, inter alia, N-hydroxy imides, for example N-hydroxy succinimide and sulfo-N-hydroxysuccinimide, substituted phenols and hydroxy azoles, for example hydroxy-benzotriazole, N-hydroxy succinimides and sulfo-N-hydroxysuccinimide being particularly preferred ,
  • alcohols are used whose HO group has a pk s value in the range from 6 to 12, preferably in the range from 7 to 11. This value refers to the acid dissociation constant determined at 25 ° C, and this value is often listed in the literature.
  • the molecular weight of the alcohol is preferably in the range from 80 to 500 g / mol, in particular 100 to 200 g / mol.
  • the alcohol can be added as the free one to a reaction mixture. Furthermore, it is also possible to use compounds for the reaction which release alcohol when water is added, if appropriate with acid catalysis.
  • carbonic acid diesters are used for the reaction with the aldonic acid or an aldonic acid salt. These compounds enable a particularly rapid and gentle reaction, with only carbonic acid or carbonates, alcohols and the desired aldonic acid ester being formed.
  • Preferred carbonic diesters include N'N-succinimidyl carbonate and sulfo-N'N-succinimidyl carbonate.
  • carbonic acid diesters can be used in relatively small amounts.
  • the carbonic acid diester can be used in a 1 to 3 molar excess, preferably 1 to 1.5 molar excess, based on the aldonic acid and / or the aldonic acid salt.
  • the reaction time when using carbonic acid diesters is relatively short. The reaction can often be terminated after 2 hours, preferably after 1 hour.
  • the conversion to the aldonic ester preferably takes place in an anhydrous aprotic solvent.
  • the water content should preferably be at most 0.5% by weight, particularly preferably at most 0.1% by weight.
  • Suitable solvents include dimethyl sulfoxide (DMSO), N-methylpyrrolidone, dimethylacetamide (DMA) and / or dimethylformamide (DMF).
  • the esterification reaction is known per se, and any method can be used.
  • the conversion to the aldonic acid ester can be carried out, inter alia, using activating compounds.
  • activating compounds include in particular carbodiimide, for example Dicyclohexylcarbodiimide (DCC) and l-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC).
  • DCC Dicyclohexylcarbodiimide
  • EDC l-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide
  • the free alcohol can be used in a molar excess.
  • the alcohol component is preferably in a 5 to 50-fold molar excess, particularly preferably an 8 to 20-fold excess based on the aldonic acid and / or the aldonic acid derivative. used.
  • the conversion to the aldonic acid ester succeeds under mild conditions.
  • the reactions described above can thus be carried out at temperatures preferably in the range from 0 ° C. to 40 ° C., particularly preferably 10 ° C. to 30 ° C.
  • the implementation takes place with a low base activity.
  • the low base activity can be measured by adding the reaction mixture in a 10-fold excess of water.
  • the water has a pH of 7.0 at 25 ° C. before addition, the water containing essentially no buffer.
  • the base activity of the reaction mixture is obtained by measuring the pH at 25 ° C. after adding the reaction mixture.
  • this mixture preferably has a pH of at most 9.0, particularly preferably of at most 8.0 and particularly preferably of at most 7.5.
  • the reaction with HES-aldonic acids succeeds in dry DMA with exclusion of water with EDC in a smooth reaction at room temperature to the HES-acid-N-hydroxy-succinimide ester. It is particularly surprising that no side reaction of the HES molecules occurs via the reaction of the OH groups of the anhydroglucoses in extreme excess with EDC and the rearrangement reaction of the primarily formed O-acyl isourea from EDC and the aldonic acid to give the corresponding N-acyl Urea is suppressed.
  • the solutions obtained by the reaction described above can be used in the coupling reactions without isolating the aldonic acid esters.
  • Preferred solutions comprise at least 10% by weight of aldonic acid esters, preferably at least 30% by weight of aldonic acid esters and particularly preferably at least 50% by weight of aldonic acid esters.
  • the aldonic acid esters can be precipitated from the solution in aprotic solvent, for example DMA, using known precipitants, such as, for example, dry ethanol, isopropanol or acetone, and can be purified by repeating the process several times.
  • Preferred solids comprise at least 10% by weight of aldonic acid esters, preferably at least 30% by weight of aldonic acid esters and particularly preferably at least 50% by weight of aldonic acid esters.
  • aldonic acid esters can then be used in bulk for coupling, for example for HESylation. There are then no side reactions as described above with EDC-activated acid.
  • a solution of the activated aldonic acid can be added to an aqueous solution of the active pharmaceutical ingredient, which is preferably buffered, at a suitable pH for coupling.
  • the active pharmaceutical ingredients comprise at least one amino group which can be converted to the aldonic acid amide.
  • the preferred active ingredients include proteins and peptides.
  • the pH of the reaction depends on the properties of the active ingredient. Preferably, if this is possible, the pH is in the range from 7 to 9, particularly preferably 7.5 to 8.5.
  • the coupling generally takes place at temperatures in the range from 0 ° C. to 40 ° C., preferably from 10 ° C. to 30 ° C., without any intention that this should impose a restriction.
  • the reaction time can easily be determined by suitable methods. In general, the reaction time is in the range of 1 hour to 100 hours, preferably 20 hours to 48 hours.
  • the aldonic acid ester can be used in excess with respect to the active pharmaceutical ingredient.
  • the aldonic acid ester is preferably used in a 1 to 5-fold molar excess, particularly preferably a 1.5 to 2-fold excess based on the active pharmaceutical ingredient.
  • Fig. 1 MALLS-GPC chromatogram of the unreacted bovine albumin (BSA). Monomeric and dimeric albumin are clearly separated.
  • bovine serum albumin (BSA corresponding to 0.7 ⁇ mol) are dissolved in 6 mL of a 0.3 molar bicarbonate solution with pH 8.4. The solution according to Example 3 is added to the solution and the mixture is left to react for 2 hours with stirring at room temperature.
  • Figures 1 to 4 show the chromatograms of the unreacted HES 10 / 0.4 succinimidyl esters, the starting product BSA and the reaction mixture.
  • the successful reaction results from a significant decrease in the BSA peak and the appearance of a higher molecular weight peak, which is detected at 280 nm.
  • bovine serum albumin BSA 50 mg bovine serum albumin BSA (0.7 ⁇ mol) are dissolved in 6 ml of a 0.3 molar bicarbonate solution with pH 8.4. The solution of the activated HES 50 / 0.7 acid according to Example 5 is added to the solution and allowed to react for 2 hours with stirring at room temperature.
  • the analytical control of the reaction mixture is carried out using low-pressure HPGPC with triple detection as described in Example 4.
  • the successful reaction results from a decrease in the signal at 280 nm of the unreacted BSA and the corresponding occurrence of the signal for the coupling product which has been shifted to higher molecular weights.
  • the shift is increased in accordance with the higher molecular weight of the HES acid compared to Example 4.

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Aldonsäure-Ester von selektiv am reduzierenden Kettenende zu Aldonsäuren oxidierten Stärkefraktionen oder Stärkefraktions-Derivaten, Feststoff und Lösungen, die diese Aldonsäure-Ester enthalten. Des weiteren beschreibt die vorliegende Erfindung Verfahren zur Herstellung dieser Aldonsäure-Ester, Verfahren zur Herstellung von mit Polysacchariden oder Polysaccharid-Derivaten an freien Aminofunktionen gekoppelten pharmazeutischen Wirkstoffen sowie hierdurch erhärltliche pharmazeutische Wirkstoffe.

Description

Aldonsäure-Ester, Verfahren zu ihrer Herstellung und Verfahren zur Herstellung von mit Polysacchariden oder Polysaccharid-Derivaten an freien Aminogruppen gekoppelten pharmazeutischen Wirkstoffen.
Die vorliegende Erfindung betrifft Aldonsäure-Ester, Feststoffe und Lösungen, die diese Ester enthalten sowie Verfahren zu ihrer Herstellung. Des weiteren betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zur Herstellung von mit Polysacchariden oder Polysaccharid-Derivaten an freien Aminogruppen gekoppelten pharmazeutischen Wirkstoffen, die unter Verwendung der Aldonsäure-Ester durchgeführt werden, sowie die pharmazeutischen Wirkstoffe, die durch diese Verfahren erhältlich sind.
Die Konjugation von pharmazeutischen Wirkstoffen insbesondere von Proteinen mit Polyethylenglycol-Derivaten ("PEGylierung") oder Polysacchariden wie Dextrane oder insbesondere Hydroxyethylstärke ("HESylierung") hat in den letzten Jahren an Bedeutung gewonnen mit der Zunahme an pharmazeutischen Proteinen aus der biotechnologischen Forschung.
Oft haben solche Proteine eine zu kurze biologische Halbwertszeit, welche durch Kopplung an die oben angeführten Polymeren-Verbindungen wie PEG oder HES gezielt verlängert werden kann. Durch die Kopplung können aber auch die antigenen Eigenschaften von Proteinen positiv beeinflusst werden. Im Falle von anderen pharmazeutischen Wirkstoffen kann durch die Kopplung die Wasserlöslichkeit erheblich vergrößert werden.
In DE 196 28 705 und DE 101 29 369 werden Verfahren beschrieben, wie die Kopplung mit Hydroxyethylstärke in wasserfreiem Dimethylsulfoxid (DMSO) über das entsprechende Aldonsäurelacton der Hydroxyethylstärke durchgeführt werden kann mit freien Aminogruppen von Hämoglobin bzw. Amphotericin B. Da in wasserf eien, aprotischen Lösungsmitteln gerade im Falle der Proteine oft nicht gearbeitet werden kann, entweder aus Löslichkeitsgründen aber auch Gründen der Denaturierung der Proteine, stehen auch Kopplungsverfahren mit HES im wasserhaltigen Milieu zur Verfügung. Z.B. gelingt die Kopplung der am reduzierenden Kettenende selektiv zur Aldonsäure oxidierten Hydroxyethylstärke durch Vermittlung von wasserlöslichem Carbodiimid EDC (l-Ethyl-3-(3- dimethylaminoproρyl)-carbodiimid) (PCT/EP 02/02928). Sehr oft jedoch ist der Einsatz von Carbodiimiden mit Nachteilen behaftet, da Carbodiimide sehr häufig inter- oder intramolekulare Vernetzungsreaktionen der Proteine verursachen als Nebenreaktionen.
Im Falle von phosphatgruppenhaltigen Verbindungen wie Nukleinsäuren gelingt die Kopplung oft gar nicht, da die Phosphatgruppen mit EDC ebenfalls reagieren können (S.S. Wong, Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking, CRC- Press, Boca Raton, London, New York, Washington D.C., 1993, Seite 199) .
In Anbetracht des diskutierten Standes der Technik lag der Erfindung die Aufgabe zugrunde, Verbindungen zur Verfügung zu stellen, die unter Vermeidung der zuvor beschriebenen Nachteile die Kopplung von Polysacchariden oder deren Derivate an Aminogruppen-haltige Wirkstoffe, insbesondere an Proteine, in rein wässrigen Systemen oder auch in Lösungsmittelgemischen mit Wasser gezielt ermöglichen.
Ferner sollte eine solche Verbindung so beschaffen sein, dass eine möglichst quantitative Anbindung eines Wirkstoffes durch kovalente Bindung an ein Polysaccharid oder ein Polysaccharid-Derivat stattfindet.
Der Erfindung lag weiterhin die Aufgabe zugrunde, Verbindungen zu schaffen, die eine möglichst schonende Verknüpfung von einem Polysaccharid oder eines Derivats hiervon an den Wirkstoff ermöglichen. So sollte insbesondere die Struktur, die Aktivität und die Verträglichkeit des Wirkstoffes durch die
T Tmςpt.n .nσ n.nσ1.r .<jt weniσ verändert werden Reiςnie.lςwe.se sollten intra- und intermolekulare Vernetzungsreaktionen vermieden werden. Darüber hinaus sollten auch Wirkstoffe verknüpft werden können, die Phosphatgruppen aufweisen.
Des weiteren war es mithin Aufgabe der vorliegenden Erfindung Verbindungen anzugeben, die eine möglichst selektive Kopplung an den Wirkstoff erlauben. So sollte insbesondere eine gezielte Stöchiometrie des Konjugats eingestellt werden können, wobei speziell die Herstellung von 1:1 Konjugate durch den Einsatz dieser Verbindungen ermöglicht werden sollte.
Schließlich lag der Erfindung die Aufgabe zugrunde ein möglichst einfaches und kostengünstiges Verfahren zur Herstellung solcher Verbindungen und Kopplungsprodukte von Polysacchariden oder Polysaccharid-Derivaten mit Wirkstoffen zur Verfügung zu stellen.
Gelöst werden diese Aufgaben sowie weitere, die zwar nicht wörtlich genannt werden, sich aber aus den hierin diskutierten Zusammenhängen wie selbstverständlich ableiten lassen oder sich aus diesen zwangsläufig ergeben, mit den in Anspruch 1 beschriebenen Aldonsäure-Estern. Zweckmäßige Abwandlungen dieser erfindungsgemäßen Aldonsäure-Ester sowie haltbare und in Verfahren zur Herstellung von Konjugaten einsetzbare Aldonsäure-Ester werden in den auf Anspruch 1 rückbezogenen Unteransprüchen 2-17 unter Schutz gestellt.
Hinsichtlich eines Verfahrens zur Herstellung der Aldonsäure-Ester liefern die Ansprüche 18-27 eine Lösung der zugrunde liegenden Aufgabe.
Die Ansprüche 28-32 beschreiben Verfahren zur Herstellung Polysaccharid- Wirkstoff-Konjugate und die durch diese Verfahren erhältlichen pharmazeutischen Wirkstoffe.
Durch die Bereitstellung von Aldonsäure-Ester, die von selektiv am reduzierenden Kettenende zu Aldonsäuren oxidierten Polysacchariden oder Polysaccharide- Derivaten abgeleitet sind, gelingt es Verbindungen zur Verfügung zu stellen, die die zuvor genannten Aufgaben lösen. Solche Ester können als aktivierte Säuren aufgefasst werden. Sie setzen sich im wässrigen Milieu mit nukleophilen NH2- Gruppen zu (stabileren) Amiden um.
Des weiteren werden durch die vorliegende Erfindung unter anderem folgende Vorteile erzielt:
Die erfindungsgemäßen Aldonsäure-Ester ermöglichen eine leichte Anbindung eines Wirkstoffes durch kovalente Bindung an ein Polysaccharid oder ein Polysaccharid-Derivat stattfindet.
Die Aldonsäure-Ester der vorliegenden Erfindung können unter schonenden Bedingungen mit einem Wirkstoff umgesetzt werden. Hierbei wird insbesondere die Sfruktur, die Aktivität und die Verträglichkeit des Wirkstoffes durch die Umsetzung nur in einem geringen Umfang verändert. Hierdurch können unter anderem insbesondere intra- und intermolekulare Vernetzungsreaktionen vermieden werden. Des weiteren können pharmazeutische Wirkstoffe gekoppelt werden, die Phosphatgruppen aufweisen, ohne dass diese Gruppen verändert werden.
Die erfindungsgemäßen Aldonsäure-Ester erlauben eine sehr selektive Kopplung an den Wirkstoff. Des weiteren kann beispielsweise eine gezielte Stöchiometrie des gewünschten Konjugats eingestellt werden, wobei speziell die Herstellung von 1 :1 Konjugate durch den Einsatz dieser Verbindungen ermöglicht wird.
Darüber hinaus stellt die vorliegende Erfindung einfache und kostengünstige Verfahren zur Herstellung aktivierter Aldonsäure-Ester und Kopplungsprodukte von Polysacchariden oder Polysaccharid-Derivaten mit Wirkstoffen zur Verfügung.
Die Aldonsäure-Ester der vorliegenden Erfindung sind von Polysacchariden selektiv oxidiert werden können. Derartige Polysaccharide, sowie hieraus erhältliche Derivate, sind in der Fachwelt weithin bekannt und können kommerziell erhalten werden. Polysaccharide sind makromolekulare Kohlenhydrate, deren Moleküle eine große Zahl (mind. >10, gewöhnlich jedoch erheblich mehr) glykosidisch miteinander verknüpfter Monosaccharid- Moleküle (Glykose) aufweisen. Das Gewichtsmittel des Molekulargewichts bevorzugter Polysaccharide liegt vorzugsweise im Bereich von 1500 bis 1000000 Dalton, besonders bevorzugt 2000 bis 300000 Dalton und ganz besonders bevorzugt im Bereich von 2000 bis 50000 Dalton. Das Molekulargewicht Mw mit üblichen Verfahren bestimmt werden. Hierzu gehören beispielsweise wässrige GPC, HPLC, Lichtstreuung und dergleichen.
Über das Molekulargewicht des Polysaccharidrests kann unter anderem die Verweilzeit im Körper verändert werden.
Zu den bevorzugten Polysacchariden gehören Stärke sowie die durch Hydrolyse erhältlichen Stärkefraktionen, die als Abbauprodukte von Stärke aufgefasst werden können. Stärke wird üblich in Atnylose und Amylopektin unterteilt, die sich im Verzweigungsgrad unterscheiden. Erfindungsgemäß ist Amylopektin besonders bevorzugt.
Unter Amylopektinen versteht man dabei zunächst ganz allgemein verzweigte Stärken oder Stärkeprodukte mit -(l-4)- und α-(l-6)-Bindungen zwischen den Glucosemolekülen. Die Verzweigungen der Kette erfolgen dabei über die α-(l- 6)-Bindungen. Diese sind bei natürlich vorkommenden Amylopektinen etwa alle 15-30 Glucosesegmente unregelmäßig vorhanden. Das Molekulargewicht von natürlichem Amylopektin liegt sehr hoch im Bereich von 107 bis zu 2x10S Dalton. Man geht davon aus, dass auch Amylopektin in gewissen Grenzen Helices bildet.
Man kann für Amylopektine einen Verzweigungsgrad definieren. Das Maß für die Verzweigung ist das Verhältnis der Zahl von Molekülen Anhydroglucose, die Verzweigungspunkte (α-(l-6)-Bindungen) tragen, zur Gesamtzahl Moleküle der Anhydroglucose des Amylopektins, wobei dieses Verhältnis in mol-% ausgedrückt wird. In der Natur auftretendes Amylopektin weist Verzweigungsgrade von ca. 4 mol-%. Bevorzugt zur Herstellung der Aldonsäure-Ester eingesetzte Amylopektine weisen eine mittlere Verzweigung im Bereich von 5 bis 10 mol% auf.
Des weiteren können hyperverzweigte Amylopektine eingesetzt werden, die einen über den aus der Natur für Amylopektine bekannten Verzweigungsgrad signifikant hinausgehenden Verzweigungsgrad aufweisen. Dabei handelt es sich beim Verzweigungsgrad in jedem Falle um einen Mittelwert (mittleren Verzweigungsgrad), da Amylopektine polydisperse Substanzen sind.
Solche hyperverzweigte Amylopektine weisen signifikant höhere Verzweigungsgrade, ausgedrückt als mol-% der Verzweigungsanhydroglucosen, auf im Vergleich zu unverändertem Amylopektin bzw. Hydroxyethylstärke und sind demzufolge in ihrer Struktur dem Glycogen ähnlicher.
Der mittlere Verzweigungsgrad der hyperverzweigten Amylopektine liegt üblich im Bereich zwischen > 10 und 25 mol%. Dies bedeutet, dass diese Amylopektine im Mittel etwa alle 10 bis 4 Glucoseeinheiten eine α-(l-6)- Bindung und damit einen Verzweigungspunkt aufweisen. Eine bevorzugt im medizinischen Bereich einsetzbare Amylopektintype kennzeichnet sich durch einen Verzweigungsgrad zwischen 11 und 16 mol-%.
Weitere bevorzugte hyperverzweigte Amylopektine besitzen einen Verzweigungsgrad im Bereich zwischen 13 und 16 mol-%.
Die in der Erfindung einsetzbaren Amylopektine besitzen vorzugsweise einen Wert für das Gewichtsmittel des Molekulargewichts Mw im Bereich von 2.000 bis 800.000 Dalton, insbesondere 2.000 bis 300.000 und besonders bevorzugt 2.000 bis 50.000 Dalton.
Die zuvor dargelegten Stärken können kommerziell erhalten werden. Des weiteren ist deren Gewinnung literaturbekannt. So kann Stärke, insbesondere aus Kartoffeln, Tapioka, Maniok, Reis, Weizen oder Mais gewonnen werden. Die aus diesen Pflanzen erhaltenen Stärken werden vielfach zunächst einer hydrolytischen Abbaureaktion unterworfen. Dabei wird das Molekulargewicht von etwa 20.000.000 Dalton auf mehrere Millionen Dalton reduziert, wobei ein weiterer Abbau des Molekulargewichts auf die zuvor genannten Werte ebenfalls bekannt ist. Besonders bevorzugt können unter anderem Wachsmaisstärke- Abbaufraktionen zur Herstellung der erfindungsgemäßen Aldonsäure-Ester eingesetzt werden.
Die zuvor dargelegten hyperverzweigten Stärkefraktionen werden unter anderem in der deutschen Patentanmeldung 102 17994 beschrieben.
Des weiteren können auch Derivate von Polysacchariden zur Herstellung der erfindungsgemäßen Aldonsäure-Ester eingesetzt werden. Zu diesen gehören insbesondere Hydroxyalkylstärken, beispielsweise Hydroxyethylstärke und Hydroxypropylstärke, die durch Hydroxyalkylierung aus den zuvor dargelegten Stärken, insbesondere aus Amylopektin gewonnen werden können. Hiervon ist Hydroxyethylstärke (HES) bevorzugt.
Vorzugsweise wird erfindungsgemäß eine HES eingesetzt, die das hydroxethylierte Derivat des in Wachsmaisstärke zu über 95 % vorkommenden Glucosepolymers Amylopektin ist. Amylopektin besteht aus Glucoseeinheiten, die in α-l,4-glykosidischen Bindungen vorliegen und α-l,6-glykosidische Verzweigungen aufweisen.
HES weist vorteilhafte rheologische Eigenschaften auf und wird zur Zeit als Volumenersatzmittel und zur Hämodilutionstherapie klinisch eingesetzt (Sommermeyer et al., i rankenhauspharmazie, Vol. 8 (8, 1987) Seite 271 - 278 und Weidler et. al., Arzneimittelforschung / Drug Res., 41, (1991) Seite 494 - 498).
HES wird im wesentlichen über das gewichtsgemittelte mittlere Molekulargewicht Mw , das Zahlenmittel des mittleren Molekulargewichts Mn, die Molekulargewichtsverteilung und den Substitutionsgrad gekennzeichnet. Die Substitution mit Hydroxyethylgruppen in Ätherbindung ist dabei an den Kohlenstoffatomen 2, 3 und 6 der Anhydroglucoseeinheiten möglich. Der Substitutionsgrad kann dabei als DS ("degree of Substitution"), welcher auf den Anteil der substituierten Glucosemoleküle aller Glucoseeinheiten Bezug nimmt, oder als MS ("molar substituition") beschrieben werden, womit die mittlere Anzahl von Hydroxyethylgruppen pro Glucoseeinheit bezeichnet wird.
Der Substitutionsgrad MS (molar Substitution) ist definiert als die durchschnittliche Anzahl von Hydroxyethylgruppen pro Anhydroglucoseeinheit. Er wird ermittelt aus der Gesamtanzahl der Hydroxyethylgruppen in einer Probe, beispielsweise nach Morgan, durch Ätherspaltung und anschließender quantitativer Bestimmung von Ethyliodid und Ethylen, die hierbei gebildet werden.
Hingegen ist der Substitutionsgrad DS (degree of Substitution) definiert als der Anteil der substituierten Anhydroglucoseeinheiten aller Anhydroglucoseeinheiten. Ihn kann man bestimmen aus der gemessenen Menge der unsubstituierten Glucose nach Hydrolyse einer Probe. Aus diesen Definitionen ergibt sich, dass MS > DS. Für den Fall, dass nur Monosubstitution vorliegt, also jede substituierte Anhydroglucoseeinheit nur eine Hydroxyethylgruppe trägt, ist MS = DS.
Ein Hydroxyethylstärkerest weist bevorzugt einen Substitutionsgrad MS von 0,1 bis 0,8 auf. Besonders bevorzugt weist der Hydroxyethylstärkerest einen Substitutionsgrad MS von 0,4 bis 0,7 auf. Die Reaktivität der einzelnen Hydroxygruppen in der unsubstituierten Anhydroglucoseeinheit gegenüber Hydroxyethylierung ist je nach Reaktionsbedingungen unterschiedlich. Innerhalb gewisser Grenzen ist dadurch das Substitutionsmuster, also die einzelnen, unterschiedlich substituierten Anhydroglucosen, die statistisch auf die einzelnen Polymermoleküle verteilt sind, beeinflussbar. Vorteilhaft werden überwiegend die C2- und die C6-Position hydroxyethyliert, wobei die C6-Position aufgrund ihrer leichteren Zugänglichkeit häufiger substituiert wird.
Vorzugsweise verwendet werden im Rahmen dieser Erfindung überwiegend in C2- Position substituierte Hydroxyethylstärken (HES), die möglichst homogen substituiert sind. Die Herstellung solcher HES wird in EP 0402 724 B2 beschrieben. Sie sind innerhalb einer physiologisch vernünftigen Zeit restlos abbaubar und weisen auf der anderen Seite dennoch ein steuerbares Eliminationsverhalten auf. Die überwiegende C2-Substitution macht die Hydroxyethylstärke relativ schwierig abbaubar für α-Amylase. Es ist von Vorteil, dass möglichst keine innerhalb der Polymermoleküle hintereinander substituieren Anhydroglucoseeinheiten auftreten, um die restlose Abbaubarkeit zu gewährleisten. Weiterhin besitzen solche Hydroxyethylstärken trotz der niedrigen Substitution eine ausreichend hohe Löslichkeit in wässrigem Medium, so dass die Lösungen auch über längere Zeiträume stabil sind und sich keine Agglomerate bzw. Gele bilden.
Bezogen auf die Hydroxyethylgruppen der Anhydroglucoseeinheiten weist ein Hydroxyethylstärkerest bevorzugt ein Verhältnis von C2:C6-Substitution im Bereich von 2 bis 15 auf. Besonders bevorzugt beträgt das Verhältnis von C2:C6- Substitution 3 bis 11.
Die selektive Oxidation der Aldehydgruppe der zuvor dargelegten Polysaccharide bzw. Polysaccharid-Derivate zur Aldonsäure ist an sich bekannt. Diese kann durch milde Oxidationsmittel, beispielsweise lod/Kaliumhydroxid entsprechend DE 196 28 705 AI, oder durch Enzyme erfolgen. Zur Umsetzung kann die freie Aldonsäure eingesetzt werden. Des weiteren können auch Salze eingesetzt werden. Hierzu gehören insbesondere die Alkalisalze, wie beispielsweise das Natrium- und/oder das Kaliumsalz der Aldonsäuren.
Zur Herstellung der erfindungsgemäßen Aldonsäure-Ester werden Alkohole eingesetzt. Der Begriff Alkohol umfasst Verbindungen, die HO-Gruppen aufweisen. Diese HO-Gruppen können unter anderem an ein Stickstoffatom oder an einen Phenylrest gebunden sein.
Bevorzugt werden azide Alkohole eingesetzt, die in der Fachwelt bekannt sind. Hierzu gehören unter anderem N-Hydroxy-Imide, beispielsweise N-Hydroxy- Succinimid und Sulfo-N-Hydroxysuccinimid, substituierte Phenole und Hydroxy- Azole, beispielseweise Hydroxy-Benzotriazol, wobei N-Hydroxy-Succinimide und Sulfo-N-Hydroxysuccinimid besonders bevorzugt sind.
Weitere geeignete azide Alkohole zur Herstellung der erfindungsgemäßen Aldonsäure-Ester sind in der Literatur aufgeführt. (V.H.L. Lee. Ed. Peptide and Protein Drug Delivery, Marcel Dekker, 1991, S. 65).
Gemäß einem besonderen Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Alkohole eingesetzt, deren HO-Gruppe einen pks-Wert im Bereich von 6 bis 12, bevorzugt im Bereich von 7 bis 11 aufweist. Dieser Wert bezieht sich auf die bei 25 °C bestimmte Säure-Dissoziationskonstante, wobei dieser Wert vielfach in der Literatur aufgeführt ist.
Das Molekulargewicht des Alkohols liegt vorzugsweise im Bereich von 80 bis 500 g/mol, insbesondere 100 bis 200 g/mol. Der Alkohol kann als freier einer Reaktionsmischung zugegeben werden. Des weiteren können auch Verbindungen zur Reaktion verwendet werden, die bei Zugabe von Wasser, ggf. unter Säurekatalyse, Alkohol freisetzen.
Gemäß einem besonderen Aspekt der vorliegenden Erfindung werden zur Umsetzung mit der Aldonsäure oder einem Aldonsäuresalz Kohlensäurediester eingesetzt. Diese Verbindungen ermöglichen eine besonders schnelle und schonende Reaktion, wobei lediglich Kohlensäure bzw. Carbonate, Alkohole und der gewünschte Aldonsäure-Ester gebildet werden.
Bevorzugte Kohlensäurediester sind unter anderem N'N-Succinimidylcarbonat und Sulfo-N'N-Succinimidylcarbonat.
Diese Kohlensäurediester können in relativ geringen Mengen eingesetzt werden. So kann der Kohlensäurediester in 1- bis 3 -molarem Überschuss, bevorzugt 1 bis 1,5 molarem Überschuss, bezogen auf die Aldonsäure und/oder das Aldonsäuresalz, eingesetzt werden. Die Reaktionsdauer bei Verwendung von Kohlensäurediestern ist relativ gering. So kann die Reaktion vielfach nach 2 Stunden, bevorzugt nach 1 Stunde beendet werden.
Die Umsetzung zum Aldonsäureester findet bevorzugt in einem wasserfreien aprotischen Lösungsmittel statt. Der Wassergehalt sollte vorzugsweise höchstens 0,5 Gew.-%, besonders bevorzugt höchstens 0,1 Gew.-% betragen. Geeignete Lösungsmittel sind unter anderem Dimethylsulfoxid (DMSO), N - Methylpyrrolidon, Dimethylacetamid (DMA) und/oder Dimethylformamid (DMF).
Die Veresterungsreaktion ist an sich bekannt, wobei jedes Verfahren eingesetzt werden kann. Die Umsetzung zum Aldonsäure-Ester kann unter anderem unter Verwendung aktivierenden Verbindungen erfolgen. Bei Einsatz des freien Alkohols ist eine derartige Vorgehensweise empfehlenswert. Zu den aktivierenden Verbindungen gehören insbesondere Carbodiimid, wie beispielsweise Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) und l-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)- carbodiimid (EDC).
Bei Verwendung des freien Alkohols kann dieser in einem molaren Überschuss eingesetzt werden. Gemäß einem besonderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird die Alkoholkomponente vorzugsweise in 5 bis 50-fachem molaren Überschuss, besonders bevorzugt 8 bis 20-fachen Überschuss bezogen auf die Aldonsäure und/oder das Aldonsäure-Derivat. eingesetzt.
Die Umsetzung zum Aldonsäure-Ester gelingt unter schonenden Bedingungen. So können die zuvor beschriebenen Reaktionen bei Temperaturen vorzugsweise im Bereich von 0°C bis 40°C, besonders bevorzugt 10°C bis 30°C durchgeführt werden.
Gemäß einem besonderen Aspekt der vorliegenden Erfindung erfolgt die Umsetzung bei einer geringen Basenaktivität. Die geringe Basenaktivität kann durch Zugabe der Reaktionsmischung in einen 10-fachen Überschuss Wasser gemessen werden. Hierbei weist das Wasser vor Zugabe einen pH- Wert von 7,0 bei 25°C auf, wobei das Wasser im wesentlichen keinen Puffer enthält. Durch Messung des pH- Wertes bei 25°C nach Zugabe der Reaktionsmischung erhält man die Basenaktivität der Reaktionsmischung. Vorzugsweise weist diese Mischung nach Zugabe einen pH- Wert von höchstens 9,0, besonders bevorzugt von höchstens 8,0 und besonders bevorzugt von höchstens 7,5 auf.
Die Umsetzung mit HES-Aldonsäuren, z.B. mit N-Hydroxy-Succinimid, gelingt in trockenem DMA unter Wasserausschluss mit EDC in glatter Reaktion bei Raumtemperatur zum HES-Säure-N-Hydroxy-Succinimid-Ester. Dabei ist insbesondere überraschend, dass keine Nebenreaktion der HES-Moleküle eintritt über die Reaktion der im extremen Überschuss vorliegenden OH-Gruppen der Anhydroglucosen mit EDC sowie die Umlagerungsreaktion des primär gebildeten O-Acyl-Isoharnstoffs aus EDC und der Aldonsäure zum entsprechenden N-Acyl- Harnstoff unterdrückt wird. Die durch die zuvor beschriebene Umsetzung erhaltenen Lösungen können ohne Isolation der Aldonsäure-Ester in den Kopplungsreaktionen eingesetzt werden. Da in der Regel das Volumen der voraktivierten Aldonsäure im aprotischen Lösungsmittel klein ist im Vergleich mit dem im Puffervolumen gelösten Zielprotein wirken sich die Mengen an aprotischem Lösungsmittel meistens nicht störend aus. Bevorzugte Lösungen umfassen mindestens 10 Gew.-% Aldonsäure- Ester, bevorzugt mindestens 30 Gew.-% Aldonsäure-Ester und besonders bevorzugt mindestens 50 Gew.-% Aldonsäure-Ester.
Die Aldonsäure-Ester können aus der Lösung in aprotischem Lösungsmittel, beispielsweise DMA durch bekannte Fällungsmittel, wie beispielsweise trockenes Ethanol, Isopropanol oder Aceton gefallt und durch mehrfaches wiederholen des Vorganges gereinigt werden. Bevorzugte Feststoffe umfassen mindestens 10 Gew.-% Aldonsäure-Ester, bevorzugt mindestens 30 Gew.-% Aldonsäure-Ester und besonders bevorzugt mindestens 50 Gew.-% Aldonsäure-Ester.
Solche Aldonsäure-Ester können dann in Substanz isoliert zur Kopplung, beispielsweise zur HESylierung verwendet werden. Dabei treten dann keine Nebenreaktionen wie oben beschreiben mit EDC-aktivierter Säure auf.
Des weiteren kann zur Kopplung eine Lösung der aktivierten Aldonsäure zu einer wässrigen Lösung des pharmazeutischen Wirkstoffs, die vorzugsweise gepuffert ist, bei einem geeigneten pH- Wert zugegeben werden. Die pharmazeutischen Wirkstoffe umfassen mindestens eine Aminogruppe, die zum Aldonsäureamid umgesetzt werden kann. Zu den bevorzugten Wirkstoffen gehören Proteine und Peptide.
Der pH- Wert der Umsetzung ist von den Eigenschaften des Wirkstoffs abhängig. Vorzugsweise, falls dies möglich ist, liegt der pH- Wert im Bereich von 7 bis 9, besonders bevorzugt 7,5 bis 8,5. Die Kopplung findet im allgemeinen bei Temperaturen im Bereich von 0°C bis 40°C, bevorzugt 10°C bis 30°C statt, ohne dass hierdurch eine Beschränkung erfolgen soll. Die Reaktionsdauer kann durch geeignete Verfahren leicht ermittelt werden. Im allgemeinen liegt die Reaktionszeit im Bereich von 1 Stunde bis 100 Stunden, vorzugsweise 20 Stunden bis 48 Stunden.
Der Aldonsäure-Ester kann in einem Überschuss in Bezug auf den pharmazeutischen Wirkstoff eingesetzt werden. Vorzugsweise wird der Aldonsäure-Ester in 1 bis 5-fachem molaren Überschuss, besonders bevorzugt 1,5 bis 2-fachen Überschuss bezogen auf den pharmazeutischen Wirkstoff eingesetzt.
Als Nebenprodukt fällt bei der oben genannten Umsetzung im wesentlichen nur der Alkohol, beispielsweise N-Hydroxy-Succinimid an, welches leicht vom Kopplungsprodukt abgetrennt werden kann, z. B. durch Ultrafiltration. Als Nebenreaktion kann eine Verseifung mit Wasser auf zur freien Säure und zum freien Alkohol auftreten. Besonders überraschend ist daher, dass die erfindungsgemäßen Aldonsäure-Ester zu einem großen Teil eine Kopplungsreaktion mit einem pharmazeutischen Wirkstoff eingeht. Dies ergibt sich aus den Beispielen, insbesondere durch die in den Figuren dargestellten Chromatogramme.
Abb. 1 MALLS-GPC-Chromatogramm des nicht umgesetzten bovinen Albumins (BSA). Monomeres und dimeres Albumin sind klar getrennt.
Abb. 2 MALLS-GPC-Chromatogramm von der nicht umgesetzten HES- 10/0,4-succinimidylester.
Abb. 3 MALLS-GPC-Chromatogramm des Reaktionsproduktes von HES-
10/0,4-succinimidylester und BSA. Gezeigt werden die Signale der 3- fach Detektion von Refraktionsindex (RI), UV-Detektor sowie das Lichtstreusignal bei 90°. Abb. 4 MALLS-GPC-Chromatogramm des Reaktionsproduktes von HES- 10/0,4-succinimidylester und BSA, in der Darstellung molekular Masse gegen Zeit.
Nachfolgend wird die Erfindung durch Beispiele und Vergleichsbeispiele eingehender erläutert, ohne dass die Erfindung auf diese Beispiele beschränkt werden soll.
Beispiele und Herstellverfahren
Beispiel 1
Herstellung von HES 10/0,4 - Säureester mit N-Hydroxy-Succinimid
5 g getrocknete, am terminalen reduzierenden Kettenende selektiv nach DE 196 28 705 oxidierte Hydroxyethylstärke mit einem mittleren Molekulargewicht Mw = 10.000 Dalton und einem Substitutionsgrad MS = 0,4 werden in 30 ml trockenem Dimethylacetamid bei 40 °C gelöst und nach Abkühlen der Lösung mit der lOfachen molaren Mengen N-Hydroxy-Succinimid versetzt unter Feuchtigkeitsausschluß. Danach wird die zur HES-Säure äquimolare Menge EDC portionsweise zugegeben und 24 Stunden nach Zugabe der Reaktionsansatz ausreagieren gelassen. Das Reaktionsprodukt wird anschließend mit trockenem Aceton gefallt und zur Reinigung mehrfach umgefällt.
Beispiel 2
Herstellung von Hes 10/0,4 - Säure gekoppeltem Myoglobin
15 mg Myoglobin werden in 20 ml destilliertem Wasser gelöst und der pH- Wert mit Natronlauge auf 7,5 eingestellt. Zu der Lösung werden 1,5 g HES 10/0,4 - Säure N-Hydroxy-Succinimid, hergestellt nach Beispiel 1, über 1 Stunde portionsweise zugegeben und der pH- Wert konstant bei 7,5 gehalten durch
Zugabe von Natronlauge.
Der Ansatz wird über Nacht rühren gelassen.
Die Bildung von hesyliertem Myoglobin wird über Gel-
Permeationschromatographie mit einer Ausbeute von 70 %, bezogen auf das eingesetzte Myoglobin, bestimmt.
Beispiel 3
Hestellung von HES 10/0,4 - Säureester mit N'N-Disuccinimidylcarbonat
0,02 mmol (entsprechend 0,14 g) getrocknete HES 10/0,4 - Säure werden in 2 mL getrocknetem Dimethylformamid gelöst unter Feuchtigkeitsausschluß. Zur Lösung werden 0,02 mmol N'N-Disuccinimidylcarbonat gegeben und 1 Stunde bei Raumtemperatur unter Rühren ausreagieren lassen.
Beispiel 4
Herstellung des Kopplungsproduktes von HES 10/0,4 - Säure mit bovinem Serumalbumin
50 mg bovines Serumalbumin (BSA entsprechend 0,7 μmol) werden in 6 mL einer 0,3 molaren Bicarbonatlösung mit pH 8,4 gelöst. Zur Lösung wird der Ansatz gemäß Beispiel 3 gegeben und 2 Stunden unter Rühren bei Raumtemperatur ausreagieren gelassen.
Der Nachweis der gelungenen Reaktion erfolgt durch Niederdruck-HPGPC mit Mehrfachdetektion (UV 280 nm, MALLS-Lichtstreudetektor (MALLS = ulti angle laser light scattering), RI-Detektor).
Die Abbildungen 1 bis 4 zeigen im Vergleich die Chromatogramme der nicht umgesetzten HES 10/0,4 - succinimidylester, das Ausgangsprodukt BSA sowie den Reaktionsansatz. Die gelungene Reaktion ergibt sich durch eine signifikante Abnahme des BSA- Peaks und das Auftreten eines höhermolekularen Peaks, welcher bei 280 nm detektiert wird.
Beispiel 5
Herstellung von HES 50/0,7 - Säureester mit N'N-Disuccinimidylcarbonat
0,02 mmol (0,5 g) getrocknete HES 50/0,7 - Säure werden in 2 mL getrocknetem Dimethylformamid gelöst unter Feuchtigkeitsausschluss. Zur Lösung werden 0,02 mmol N'N-Disuccinimidylcarbonat gegeben und 1 Stunde bei Raumtemperatur unter Rühren ausreagieren gelassen.
Beispiel 6
Herstellung von HES 50/0,7 Kopplungsprodukt mit BSA
50 mg bovines Serumalbumin BSA (0,7 μmol) werden in 6 ml einer 0,.3 molaren Bicarbonatlösung mit pH 8,4 gelöst. Zur Lösung wird die Lösung der aktivierten HES 50/0,7 - Säure gemäß Beispiel 5 gegeben und 2 Stunden unter Rühren bei Raumtemperatur ausreagieren gelassen.
Die analytische Kontrolle des Reaktionsansatzes erfolgt über Niederdruck- HPGPC mit Dreifachdetektion wie im Beispiel 4 beschrieben.
Die gelungene Reaktion ergibt sich aus einer Abnahme des Signals bei 280 nm des nicht umgesetzten BSA's und das entsprechende Auftreten des zu höheren Molekulargewichten versetzten Signals für das Kopplungsprodukt. Die Verschiebung ist entsprechend dem höheren Molekulargewicht der HES-Säure verglichen mit dem Beispiel 4 vergrößert.

Claims

Patentansprüche
1. Aldonsäure-Ester von selektiv am reduzierenden Kettenende zu Aldonsäuren oxidierten Polysacchariden oder Polysaccharid-Derivaten.
2. Aldonsäure-Ester gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Polysaccharide oder Polysaccharid-Derivate Stärkefraktione oder Stärkefraktions-Derivate sind.
3. Aldonsäure-Ester gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Stärkefraktionen Abbaufraktionen des Amylopektins sind.
4. Aldonsäure-Ester gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Abbaufraktionen des Amylopektins durch Säureabbau und/oder Abbau durch α-Amylase von Wachsmaisstärke gewonnen werden.
5. Aldonsäure-Ester gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Stärkefraktionen ein mittleres Molekulargewicht Mw von 2.000 - 50.000 Dalton aufweisen und eine mittlere Verzweigung von 5 - 10 mol% α-1,6- glykosidischen Bindungen.
6. Aldonsäure-Ester gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Stärkefraktionen ein mittleres Molekulargewicht Mw von 2.000 - 50.000 Dalton aufweisen und eine mittlere Verzweigung im Bereich von >10 bis 25 mol% α-l,6-glykosidischen Bindungen.
7. Aldonsäure-Ester gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Stärkefraktions-Derivate Hydroxyethyl-Derivate von Abbaufraktionen der Wachsmaisstärke sind.
8. Aldonsäure-Ester gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das mittlere Molekulargewicht Mw der Hydroxyethylstärke-Fraktionen im Bereich von 2 - 300.000 Dalton liegt und der Substitionsgrad MS zwischen 0,1 und 0,8 liegt sowie das C2/C6-Verhältnis der Substituenten an den Kohlenstoffatomen C2 und C6 der Anhydroglucosen zwischen 2 und 15 liegt.
9. Aldonsäure-Ester gemäß mindestens einem der Ansprüchen 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Alkohol, von dem die Alkoholkomponente des Aldonsäure-Esters abgeleitet ist, ein Molekulargewicht im Bereich von 80 bis 500 g/mol aufweist.
10. Aldonsäure-Ester gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Alkohol, von dem die Alkoholkomponente des Aldonsäure-Esters abgeleitet ist, einen pks-Wert im Bereich von 6 bis 12 aufweist.
11. Aldonsäure-Ester gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Alkohol, von dem die Alkoholkomponente des Aldonsäure-Esters abgeleitet ist, des Aldonsäure-Esters eine HO-N-Gruppe oder eine Phenolgruppe umfasst.
12. Aldonsäure-Ester gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass der Alkohol, von dem die Alkoholkomponente des Aldonsäure-Esters abgeleitet ist, ausgewählt ist aus N-Hydroxy-Succinimid, Sulfo-N-Hydroxysuccinimid, substituierte Phenole und Hydroxy- Benzotriazol.
13. Aldonsäure-Ester gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass der Alkohol, von dem die Alkoholkomponente des Aldonsäure-Esters abgeleitet ist, N-Hydroxy-Succinimid und Sulfo-N-Hydroxysuccinimid ist.
14. Feststoff umfassend mindestens einen Aldonsäure-Ester gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 13.
15. Lösung umfassend mindestens einen Aldonsäure-Ester gemäß einem mindestens der Ansprüche 1 bis 13.
16. Lösung gemäß Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Lösung mindestens ein organisches Lösungsmittel umfasst.
17. Lösung gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Lösung höchstens 0,5 Gew.-% Wasser umfasst.
18. Lösung gemäß mindestens einem der Ansprüche 15 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Lösung mindestens ein aprotisches Lösungsmittel umfasst.
19. Lösung gemäß Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass das Lösungsmittel Dimethylsulfoxid (DMSO), N -Methylpyrrolidon, Dimethylacetamid (DMA) und/oder Dimethylformamid (DMF) umfasst.
20. Verfahren zur Herstellung von Aldonsäure-Ester gemäß mindestens einem der Anspruch 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine Aldonsäure und/oder ein Aldonsäure-Derivat mit mindestens einer Alkoholkomponenten in aprotischen Lösungsmittel umgesetzt wird.
21. Verfahren gemäß Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Alkoholkomponente in 5 bis 50-fachem molaren Überschuss, bezogen auf die Aldonsäure und/oder das Aldonsäure-Derivat, eingesetzt wird.
22. Verfahren gemäß Anspruch 20 oder 21, dadurch gekennzeichnet, dass die Umsetzung unter Verwendung von mindestens einem aktivierenden Reagenz erfolgt.
23. Verfahren gemäß Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass das aktivierende Reagenz mindestens ein Carbodiimid umfasst.
24. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 22 oder 23, dadurch gekennzeichnet, dass das aktivierende Reagenz in 1- bis 3 -molarem Überschuss, bezogen auf die Aldonsäure und/oder das Aldonsäure-Derivat, eingesetzt wird.
25. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 20 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass eine Verbindung eingesetzt wird, die eine Alkoholkomponente zur Umsetzung mit der Aldonsäure oder dem Aldonsäurederivat freisetzt.
26. Verfahren gemäß Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass ein Kohlensäurediester eingesetzt wird.
27. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 20 bis 26, dadurch gekennzeichnet, dass die Umsetzung bei einer Temperatur im Bereich von 0 bis 40°C erfolgt.
28. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 20 bis 27, dadurch gekennzeichnet, dass die Umsetzung bei einer geringen Basenaktivität erfolgt.
29. Verfahren zur Herstellung von mit Polysacchariden oder Polysaccharid- Derivaten an freien Aminofunktionen gekoppelten pharmazeutischen Wirkstoffen, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Aldonsäure-Ester gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13 mit einem pharmazeutischen Wirkstoff umsetzt, der mindestens eine Aminogruppe aufweist.
30. Verfahren gemäß Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass die Umsetzung in wässrigem Medium erfolgt.
31. Verfahren gemäß Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, dass der pH- Wert des wässrigen Mediums im Bereich von 7 bis 9 liegt.
32. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 29 bis 31 , dadurch gekennzeichnet, dass die Umsetzung bei einer Temperatur im Bereich von 0°C bis 40°C erfolgt.
33. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 29 bis 32, dadurch gekennzeichnet, dass der pharmazeutische Wirkstoff ein Polypeptid oder ein Protein ist.
34. Pharmazeutischer Wirkstoff erhältlich durch ein Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 29 bis 33.
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