EA023360B1 - Линейный ацилазидный пегилирующий агент, способ его получения и способ получения пегилированного интерферона - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к пегилирующему агенту, способному присоединяться к свободным аминогруппам белков с образованием амидной связи посредством реакции азидной конденсации, а также к способу его получения и способу пегилирования биологически активных белков, например интерферонов. Изобретение обеспечивает способы получения линейного ацилазидного пегилирующего агента и соответствующие способы пегилирования интерферонов (IFN), в частности IFN α-2b. Техническим результатом изобретения является пегилирующий агент - производное ПЭГ-фенилаланина, способный присоединяться к свободным аминогруппам белков с образованием амидной связи посредством азидной конденсации, не вызывая рацемизации субстрата, который может быть легко качественно идентифицирован в УФ-области по ароматическому фрагменту и количественно определён.

Description

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к пегилирующему агенту, способному присоединяться к свободным аминогруппам белков с образованием амидной связи посредством реакции азидной конденсации, а также к способу его получения и способу пегилирования биологически активных белков, например интерферонов. Пегилированные интерфероны могут найти применение для приготовления противовирусных лекарственных средств.

Предшествующий уровень техники

Полиэтиленоксид (полиэтиленгликоль, ПЭГ) является широко распространенным полимером для ковалентной модификации (пегилирования) биологических макромолекул, например полипептидов, что имеет большое значение в современной медицине. Цель пегилирования - предотвращение деградации белков протеолитическими ферментами и защита от антигенных и иммуногенных эпитопов. Кроме того, пегилирование увеличивает размеры полипептидов, уменьшая почечную фильтрацию, а также изменяет объем биораспределения. Всё это способствует удлинению времени пребывания модифицированных физиологически активных белков в организме пациента, что повышает их ценность в качестве лекарственных средств.

Молекула ПЭГ не способна непосредственно взаимодействовать с молекулами белков, поскольку не содержит реакционноспособных функциональных групп, которые могут реагировать с какими-либо функциональными группами протеинов. Поэтому в молекулу данного полимера требуется ввести такие реакционноспособные группы или их предшественники, которые переводят в активную форму незадолго до проведения реакции с белками.

Наибольшее значение при пегилировании полипептидов имеет выбор пегилирующего агента и способа конъюгации, от которых зависит вид и структура конечного конъюгата, а, следовательно, его биологическая активность, стабильность и время циркуляции в крови.

Так, например, противовирусная активность пэгилированных интерферонов (ИНФ) в значительной степени зависит как от размера и геометрии молекулы ПЭГ, так и от места и способа присоединения полимера к молекуле белка, т.е. от функциональной группы ИНФ, с которой непосредственно взаимодействует соответствующий пегилирующий агент (КоЬейк М.1. е( а1. СНетМгу Тот рерНйе аий ρτοΐθίη РЕСу1а1юи. Αάν. Игид ИеНуету Кеу, νοί. 54 (2002), р. 459-476).

Введение различных активных функциональных групп, способных взаимодействовать с функциональными группами протеинов в мягких условиях с получением соответствующих ковалентных конъюгатов, описано, в частности, ΚοζΙονκΗ А. е( а1. Иеуе1ортеи1 оГ Реду1а1е4 1и1егГегои5 ίοτ (Не Тгеа1теШ оГ СНтоше НераННк С. ВюИтидк, № 15(7) (2001), р. 419-29.

Из химии пептидов (Гринштейн Дж., Виниц М. Химия аминокислот и пептидов. М.: Мир. 1965) известно, что при образовании амидной связи с оптически активными α-аминокислотами, как правило, в той или иной мере наблюдается рацемизация субстрата, причем в наименьшей степени рацемизация наблюдается при использовании азидного метода, который заключается во взаимодействии ацилазида соответствующей защищенной амнокислоты или пептида со свободной аминогруппой соответствующего аминного субстрата. Основным недостатком ацилазидов является их низкая стабильность, ацилазиды получают из соответствующих стабильных гидразидов обработкой азотистой кислотой или ее эфирами непосредственно перед применением (Гершкович А., Кибирев В. Химический синтез пептидов. Киев: Наукова Думка, 1992).

В настоящее время известен достаточно широкий ассортимент гидразидных производных ПЭГ, которые используются в качестве пэгилирующих агентов, при этом, как правило, именно в гидразидной форме без переведения в ацилазид и применения азидной конденсации.

В патенте ЕР 0605963 (опубл. 13.07.1994) раскрыты, в частности, гидразидные производные ПЭГ с молярной массой от 2 до 12 кДа, имеющие структуры

Ρ-Ο-αμ-εΟ-ΝΗΝΗι Ρ-ΝΗ-Ο8-ΝΗΝΗ₂

Р-О-СО-ΝΙΙΝΉ, ΡΚΙΚ'Ο-ΝΙΙΝΗΟΟ-ΝΗΝΗ,

Ρ-ΝΙΙΝΗΟΟ-ΝΗΝΙΤ

Ρ-ΝΗΝΗΟ8-ΝΗΝΗ₂

Ρ-ΝΙΙ-ΤΟ-ΝΙΙΝΙΙ,

РЮ-СО-СНгСЩ-СО-МЛЧЩ ρ-ΝΗ-εο-ε₆Η4-ΝΗΝΗ₂, где Р представляет ПЭГ, а также способы их получения и применения. Указанными производными ПЭГ модифицируют, например, эритропоэтин, предварительно окисленный периодатом, с образованием гидразонной связи между полимерным и белковым доменами.

В заявке И8 2005118227 (опубл. 02.06.2005) описаны гидразидные соединения с ангиогенной активностью, которые получают взаимодействием дигидразида ПЭГ с соответствующими производными карбоновых кислот, активированных, например, 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимидом. В свою очередь, дигидразид ПЭГ получают обработкой полиэтиленгликоля (молярная масса около 2 кДа) избытком фосгена, а затем Ν-гидроксисукцинимидом в присутствии триэтиламина. Полученный дисукцинимидилкарбонат ПЭГ переводят в дигидразид ПЭГ избытком гидразина.

В патенте И8 4101380 (опубл. 18.07.1978) раскрыт пегилирующий агент, который способен взаимодействовать с протеином посредством азидной конденсации. Например, таким пегилирующим агентом является сшиваюший агент (молярная масса около 2,5 кДа), представляющий собой диацилазид полиэтиленгликоля. Указанный агент получают непосредственно перед сшиванием белков из дигидразида

- 1 023360

ПЭГ. Дигидразид ПЭГ, в свою очередь, получают обработкой дигликолята полиэтиленоксида тионилхлоридом с последующим переведением образовавшегося диацилхлорида в гидразид действием гидразингидрата. Данный сшивающий агент применяют при получении белковых мембран.

В патенте ϋδ 4179337 (опубл. 18.12.1979) описан ПЭГ-азид (молярная масса около 0,75 кДа), который получают из ПЭГ-гидразида обработкой нитритом натрия в солянокислом растворе непосредственно перед конъюгацией с уриказой. Необходимый ПЭГ-гидразид получают взаимодействием полиэтиленгликоля с метиловым эфиром хлоруксусной кислоты в среде жидкого аммиака в присутствии металлического натрия, что приводит к образованию метилового эфира ПЭГ-гликолевой кислоты, который далее переводят в соответствующий гидразид гидразинолизом сложноэфирной группы.

В качестве ближайшего аналога настоящего изобретения авторы рассматривают ПЭГ-гидразид с молярной массой 5 кДа, раскрытый в заявке СО 1992/016555 (опубл. 01.10.1992), являющийся производным β-аланина. Указанный ПЭГ-гидразид получают способом, включающим стадии (а) обработки монометоксиполиэтиленгликоля фосгеном с образованием ПЭГ-хлорформиата, (б) обработки полученного продукта избытком гидрохлорида этилового эфира β-аланина в присутствии избытка триэтиламина с образованием этилового эфира ПЭГ-в-аланина и (в) обработки этилового эфира ПЭГ-в-аланина гидразином с образованием гидразида ПЭГ-β-аланина сГ

Пегилирование белков (Рго1ет) осуществляют взаимодействием ПЭГ-гидразида с карбоксильной группой белка, активированной 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимидом, с образованием ацилгидразинового линкера

или с углеводным фрагментом гликозилированного белка (О1усорго1еш), окисленным периодатом, с последующим закреплением образовавшейся гидразонной связи восстановлением цианборогидридом натрия в соответствующий амин

Возможность применения данного ПЭГ-агента в реакции азидной конденсации в известном изобретении не предполагается.

Основными недостатками рассматриваемого пегилирующего агента является наличие относительно легко гидролизуемой карбаматной связи, применение в качестве линкера нефизиологичной βаминокислоты (β-аланина) и использование при получении ПЭГ-агента в качестве одного из промежуточных реагентов высокотоксичного фосгена. Кроме того, к недостаткам можно отнести отсутствие в его структуре фрагментов, по которым можно было бы легко произвести качественное и количественное определение ПЭГ-агента, что значительно упрощает анализ и очистку как самого ПЭГ-агента, так и реакционной смеси при конъюгации с белками.

Таким образом, технической задачей настоящего изобретения является разработка пегилирующих агентов, пригодных для получения стабильных производных белков и расширение арсенала пегилирующих агентов и способов пегилирования биологически активных белков, например интерферонов.

Техническим результатом изобретения является пегилирующий агент - производное ПЭГ- 2 023360 фенилаланина, способный присоединяться к свободным аминогруппам белков с образованием амидной связи посредством азидной конденсации, не вызывая рацемизации субстрата, который может быть легко качественно идентифицирован в УФ-области по ароматическому фрагменту и количественно определён, и способы его получения.

Сущность изобретения

В результате обширных исследований авторы установили, что недостатки известного уровня техники могут быть преодолены созданием и применением линейного ацилазидного пегилирующего агента общей формулы (I)

где а - целое число от 100 до 1800 и Ь - целое число от 1 до 9, имеющего молекулярную массу от 5 до 80 кДа.

Настоящее изобретение также представляет способ получения линейного ацилазидного пегилирующего агента общей формулы (I)

О

где а - целое число от 100 до 1800 и Ь - целое число от 1 до 9, с молекулярной массой от 5 до 80 кДа, характеризующийся тем, что монометоксиполиэтиленгликоль (а1) алкилируют соответствующим алкиловым эфиром (Ь1) ω -галоген-карбоновой кислоты в среде безводного органического растворителя, выбранного из группы, состоящей из бензола, толуола, ксилола, тетрагидрофурана, диоксана, безводного третбутанола, в присутствии основания В, выбранного из группы, состоящей из щелочного металла, амида щелочного металла, алкоголята щелочного металла или бутиллития, в атмосфере азота или аргона в диапазоне температур от 0 до 100°С или при кипении органического растворителя с образованием соответствующего ПЭГ-карбоксиэфира (аЬ2)

где А1к выбран из метила, этила, пропила, изопропила, бутила, втор-бутила или трет-бутила, а уходящей группой X является С1, Вг или I, и продукт выделяют осаждением диэтиловым эфиром;

сложноэфирную группу ПЭГ-карбоксиэфира (аЬ2) подвергают щелочному гидролизу в атмосфере азота или аргона водным раствором щелочи, выбранной из гидроксидов щелочных или щелочноземельных металлов или их смесей ^ь 0А1к н₃с-(о-сн_гсн_г-)-о-(снХ (аЬ2) н₃с-(о-сн-сн₂-)-о-(сн₂|^ (аЬЗ) полученный продукт подкисляют для получения ПЭГ-карбоновой кислоты (аЬ4) н₃с-^о-сн—сн^оЦн,-^ -% (аЬЗ)

О /

ь он • н₃с-(о-сн-сн₂-)-о-{сн₂Х (аЬ4) и образовавшуюся ПЭГ-карбоновую кислоту выделяют из водного раствора экстракцией хлорсодержащим растворителем, выбранным из группы, состоящей из дихлорметана, трихлорэтилена, хлороформа, тетрахлорметана, с последующим осаждением диэтиловым эфиром;

ПЭГ-карбоновую кислоту (аЬ4) в атмосфере азота или аргона в диапазоне температур от -10 до 30°С в среде безводного органического растворителя, выбранного из группы, состоящей из диоксана, тетрагидрофурана, дихлорметана, хлороформа, трихлорэтилена, тетрахлорида углерода, диметилформамида, этилацетата, действием гидроксилсодержащего соединения К-ОН, выбранного из Νгидроксисукцинимида, 4-нитрофенола, 2,4-динитрофенола, пентахлорфенола или пентафторфенола, в присутствии карбодиимида (СО), выбранного из циклогексилкарбодиимида или диизопропилкарбодии- 3 023360 мида, превращают в активированный эфир (аЪ5-1) ПЭГ-карбоновой кислоты н₂с4о-сн₂—снАо/снА/ ^к'^он' ^а ь он (аЬ4) —* н_с4о-СН;—снХ о4сн₂-К ^{ν /а} ' ^/ь ок (аЬ5«1) который выделяют осаждением диэтиловым эфиром;

или ПЭГ-карбоновую кислоту (аЪ4) в атмосфере азота или аргона при температуре от -10 до 100°С обработкой избытком тионилхлорида в органическом безводном растворителе, выбранном из группы, состоящей из дихлорметана, хлороформа, трихлорэтилена, тетрахлорида углерода, или без такового превращают в хлорангидрид (аЪ5-2) н₃с-^о-сн₂—сн₂^-о-^сн₂·^ ^80С1’ (аЬ4) :-^о-сн—сн₂^-о-^сн₂Ь С1 который выделяют осаждением диэтиловым эфиром; эфир фенилаланина (аЬ5-2)

в котором А1к' обозначает алифатический алкил, выбранный из метила или этила, в атмосфере азота или аргона при температуре от -10 до 30°С в присутствии органического основания, выбранного из группы, состоящей из триэтиламина, Ν-метилморфолина, в среде безводного органического растворителя, выбранного из из группы, состоящей из дихлорметана, хлороформа, трихлорэтилена, тетрахлорида углерода, этилацетата, диметилформамида, диоксана, тетрагидрофурана, ацилируют активированным эфиром (аЪ5-1) ПЭГ-карбоновой кислоты, в котором К обозначает остаток гидроксилсодержащего соединения, выбранного из Ν-гидроксисукцинимида, 4-нитрофенола, 2,4-динитрофенола, пентахлорфенола или пентафторфенола

и соединение (аЪ6) выделяют осаждением диэтиловым эфиром;

или соответствующий эфир фенилаланина в среде безводного диметилформамида в присутствии основания, выбранного из триэтиламина, метилдиэтиламина или Ν-метилморфолина, ацилируют хлорангидридом (аЪ5-2) ПЭГ-карбоновой кислоты

и соединение (аЪ6) выделяют осаждением диэтиловым эфиром;

или соответствующий эфир фенилаланина в атмосфере азота или аргона в среде безводного органического растворителя, выбранного из группы, состоящей из дихлорметана, хлороформа, трихлорэтилена, тетрахлорида углерода, этилацетата, диметилформамида, диметилсульфоксида, диоксана, тетрагидрофурана, ацетонитрила, при температуре от -30 до 30°С в присутствии органического основания, выбранного из группы, состоящей из триэтиламина, Ν-метилморфолина, в присутствии карбодиимида, выбранного из циклогексилкарбодиимида или диизопропилкарбодиимида, ацилируют ПЭГ-карбоновой кислотой (аЪ4)

и соединение (аЪ6) выделяют осаждением диэтиловым эфиром;

- 4 023360 эфир (аЬ6) ПЭГ-фенилаланина действием избытка гидразингидрата в среде спиртового растворителя, выбранного из метанола, этанола или их смеси, в атмосфере азота или аргона в диапазоне температур от 10 до 100°С при повышенном давлении или при температуре кипения растворителя при атмосферном давлении превращают в соединение (II)

О

которое выделяют экстракцией хлорированным растворителем, выбранным из группы, состоящей из дихлорметана, хлороформа, трихлорэтилена, тетрахлорида углерода, с последующим осаждением диэтиловым эфиром; и соединение (II) превращают в линейный ацилазидный пегилирующий агент общей формулы (I) обработкой избытком азотистой кислоты, полученной смешением нитрита щелочного или щелочно-земельного металла и кислоты, выбранной из группы, состоящей из серной кислоты, хлористоводородной кислоты, бромисто-водородной кислоты, фосфорной кислоты, лимонной кислоты, уксусной кислоты, при пониженной температуре в интервале от -5 до 10°С с удалением избытка азотистой кислоты добавлением азида щелочного металла по окончании реакции.

Далее изобретение предоставляет способ получения линейного ацилазидного пегилирующего агента общей формулы (I)

где а - целое число от 100 до 1800 и Ь - целое число от 1 до 9, с молекулярной массой от 5 до 80 кДа, характеризующийся тем, что монометоксиполиэтиленгликоль (а1) алкилируют соответствующим алкиловым эфиром (Ь1) ω-галогенкарбоновой кислоты в среде безводного органического растворителя, выбранного из группы, состоящей из бензола, толуола, ксилола, тетрагидрофурана, диоксана, безводного третбутанола, в присутствии основания В, выбранного из группы, состоящей из щелочного металла, амида щелочного металла, алкоголята щелочного металла или бутиллития, в атмосфере азота или аргона в диапазоне температур от 0 до 100°С или при кипении органического растворителя с образованием соответствующего ПЭГ-карбоксиэфира (аЬ2) н,с4о-сн,—сн,4-он + Х-ГснЗА (а1) (Ы)^{Ь 0А|к}

- н,с4о-сн—снХо/снЗА ' 'а ' 'ь X.

где А1к выбран из метила, этила, пропила, изопропила, бутила, втор-бутила или трет-бутила, а уходящей группой X является С1, Вг или I, и продукт выделяют осаждением диэтиловым эфиром; сложноэфирную группу ПЭГ-карбоксиэфира (аЬ2) подвергают щелочному гидролизу в атмосфере азота или аргона водным раствором щелочи, выбранной из гидроксидов щелочных или щелочно-земельных металлов или их смесей

полученный продукт подкисляют для получения ПЭГ-карбоновой кислоты (аЬ4) н₃с-^о-сн-сн₂^о-(сн₂-^ -4(аЬЗ) ° —► н₃с)о-сн₂— СН₂)-о(сН₂-Л (аЬ4) °^Н и образовавшуюся ПЭГ-карбоновую кислоту выделяют из водного раствора экстракцией хлорсодержащим растворителем, выбранным из группы, состоящей из дихлорметана, трихлорэтилена, хлороформа, тетрахлорметана, с последующим осаждением диэтиловым эфиром;

ПЭГ-карбоновую кислоту (аЬ4) в атмосфере азота или аргона в диапазоне температур от -10 до 30°С в среде безводного органического растворителя, выбранного из группы, состоящей из диоксана, тетрагидрофурана, дихлорметана, хлороформа, трихлорэтилена, тетрахлорида углерода, диметилформа- 5 023360 мида, этилацетата, действием гидроксилсодержащего соединения К-ОН, выбранного из Νгидроксисукцинимида, 4-нитрофенола, 2,4-динитрофенола, пентахлорфенола или пентафторфенола, в присутствии карбодиимида (СЭ), выбранного из циклогексилкарбодиимида или диизопропилкарбодиимида, превращают в активированный эфир (аЬ5-1) ПЭГ-карбоновой кислоты н₃с-(о-сн—сн4-о4снД-^ -^к'°й»' ^а ' 'ь ОН (аЬ4) —·- н₃с4о-сн₂— сн4-о+сн₂А ' '· ' 'он (аЬ5-1) который выделяют осаждением диэтиловым эфиром;

или ПЭГ-карбоновую кислоту (аЬ4) в атмосфере азота или аргона при температуре от -10 до 100°С обработкой избытком тионилхлорида в органическом безводном растворителе, выбранном из группы, состоящей из дихлорметана, хлороформа, трихлорэтилена, тетрахлорида углерода, или без такового превращают в хлорангидрид (аЬ5-2)

Н₃С-^О—СН—СН₂·^—О-^СНр ^{Ζ/ 50С1г} (аЬ4) ^ь он . о

Д-о-{сн₂-)^

С-^О-СН— С

-^о-сн₂(аЬ5-2) который выделяют осаждением диэтиловым эфиром; фенилаланин в водной или водно-органической среде, которая является смесью органической среды, выбранной из группы, состоящей из ацетонитрила, метанола, этанола, изопропанола, с водой в любых соотношениях в атмосфере азота или аргона в диапазоне температур от -10 до 30°С ацилируют активированным эфиром (аЬ5-1) ПЭГ-карбоновой кислоты, в котором К обозначает остаток гидроксилсодержащего соединения, выбранного из Ν-гидроксисукцинимида, 4-нитрофенола, 2,4-динитрофенола, пентахлорфенола или пентафторфенола

и продукт осаждают диэтиловым эфиром, или фенилаланин в атмосфере азота или аргона в диапазоне температур от -10 до 30°С в водной, водно-органической или в органической среде, где органическая среда выбрана из группы, состоящей из диметилформамида, диметилсульфоксида, ацетонитрила, метанола, этанола, изопропанола, а водноорганическая среда является смесью органической среды с водой в любых соотношениях, в присутствии основания, выбранного из гидроксидов, карбонатов или гидрокарбонатов щелочных и щелочноземельных металлов, оксида или гидроксида магния, триэтиламина или их смесей, ацилируют хлорангидридом (аЬ5-2) ПЭГ-карбоновой кислоты

и продукт осаждают диэтиловым эфиром, соединение (аЬ6') действием избытка гидразингидрата в водной среде в присутствии водорастворимого карбодиимида (СЭ), выбранного из группы, состоящей из 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида, Ациклогексил-Ы-(2-морфолинил-(4)-этил)карбодиимида, Мциклогексил-'Ы-(4диметиламиноциклогексил)карбодиимида, превращают в соединение (II)

которое выделяют экстракцией хлорированным растворителем, выбранным из группы, состоящей из дихлорметана, хлороформа, трихлорэтилена, тетрахлорида углерода, с последующим осаждением диэтиловым эфиром, или соединение (аЬ6') действием гидроксилсодержащего соединения К-ОН, выбранного из Ν- 6 023360 гидроксисукцинимида, 4-нитрофенола, 2,4-динитрофенола, пентахлорфенола или пентафторфенола, в присутствии карбодиимида (СО), такого как циклогексилкарбодиимид или диизопропилкарбодиимид, переводят в соответствующий активированный эфир (аЬ7-1), в котором К обозначает остаток гидроксилсодержащего соединения, выбранного из Ν-гидроксисукцинимида, 4-нитрофенола, 2,4-динитрофенола, пентахлорфенола или пентафторфенола

и активированный эфир (аЬ7-1) выделяют осаждением диэтиловым эфиром.

или соединение (аЬ6') в атмосфере азота или аргона при температуре от -10 до 100°С обработкой избытком тионилхлорида в органическом безводном растворителе, выбранном из группы, состоящей из дихлорметана, хлороформа, трихлорэтилена, тетрахлорида углерода, или без такового превращают в хлорангидрид (аЬ7-2)

который выделяют осаждением диэтиловым эфиром;

соединения (аЬ7-1) или (аЬ7-2) подвергают гидразинолизу избытком гидразингидрата в водной, водно-органической или органической среде с образованием соединения общей формулы (II) н₃с4о-сн—снХо-йзнАХ V^-ов ' а 'ь _ΝΗ—/ _ΝΗ (аЬ7-1) } -► (II) о

или

соединение (II) выделяют экстракцией хлорированным растворителем, выбранным из группы, состоящей из дихлорметана, хлороформа, трихлорэтилена, тетрахлорида углерода, с последующим осаждением диэтиловым эфиром, или действием на соединение (аЬ6') избытком гидразингидрата в водной среде получают в присутствии водорастворимого карбодиимида (СО), выбранного из группы, состоящей из 1-этил-3-(3диметиламинопропил)карбодиимид, ^циклогексил-^(2-морфолинил-(4)-этил)карбодиимид, Νциклогексил-№(4-ди-метиламиноциклогексил)карбодиимид, получают соединение (II) н₃с4о-сн—снХсТснД^ V- он ' а 'ь ΝΗ-Ζ _ΝΛ (аЬб·) N -► (II)

О которое выделяют экстракцией хлорированным растворителем, выбранным из дихлорметана, хлороформа, трихлорэтилена, тетрахлорида углерода или их смесей, с последующим осаждением диэтиловым эфиром; и соединение (II) превращают в линейный ацилазидный пегилирующий агент общей формулы (I) обработкой избытком азотистой кислоты, полученной смешением нитрита щелочного или щелочно-земельного металла и кислоты, выбранной из серной кислоты, хлористо-водородной кислоты, бромисто-водородной кислоты, фосфорной кислоты, лимонной кислоты, уксусной кислоты или их смесей, при пониженной температуре в интервале от -5 до 10°С с удалением избытка азотистой кислоты добавлением азида щелочного металла по окончании реакции.

Изобретение также обеспечивает способ получения пегилированного интерферона а-2Ь (ΖΡΝ а-2Ь), характеризующийся тем, что способом по п.2 или 3 готовят раствор линейного ацилазидного пегили- 7 023360 рующего агента общей формулы (I);

к раствору ΙΡΝ а-2Ь в фосфатном буфере с рН 8,0-8,7 при 0-5°С добавляют 4-5-кратный мольный избыток раствора линейного ацилазидного пегилирующего агента общей формулы (I)

где а - целое число от 100 до 1800 и

Ь - целое число от 1 до 9, с молекулярной массой от 5 до 80 кДа; по достижении степени превращения ΙΡΝ а-2Ь 70-85% реакцию останавливают прибавлением избытка глицина; реакционную смесь разбавляют в 5-15 раз, устанавливают значение рН 4,5-5,5, требуемое для хроматографического разделения продуктов на СМ-сефарозе, после чего проводят градиентное элюирование от 0,1 до 0,8М №С1; отбирают фракции, которые анализируют обращенно-фазовой ВЭЖХ на содержание моно-ПЭГ-ΙΡΝ а-2Ь, по результатам которого определяют целевые фракции, которые далее очищают до степени, достаточной для приготовления лекарственного препарата.

Выражение выбранный из группы, состоящей из помимо индивидуальных альтернатив также включает возможные и рациональные комбинации двух или более таких альтернатив. Например, выражение хлорированный растворитель, выбранный из группы, состоящей из дихлорметана, хлороформа, трихлорэтилена, тетрахлорида углерода включает, в частности, смеси дихлорэтана и хлороформа, хлороформа и тетрахлорида углерода, ирихлорэтилена и тетрахлорида углерода.

Далее способы получения линейного ацилазидного пегилирующего агента общей формулы (I) будут подробно описаны со ссылками на маршруты синтеза и схемы превращений на каждой стадии маршрутов. В контексте настоящего изобретения термин маршрут синтеза определяет направления химических превращений от исходных веществ до конечного продукта посредством условных обозначений промежуточных продуктов с указанием стадий синтеза, их связывающих.

Маршрут синтеза 1.

(аЬ5-1 [5в] [4а] /

-<аЬ2)-Ё!«-<аМ)Ф2Ь-<аЬ4),

А.·*-,/⁸ [5а] (аЬ6>-!

[56]

-(II)

Условные обозначения соединений, данные в круглых скобках, указывают на присутствие в их молекулах полимерного фрагмента -(О-СН₂-СН₂)_а- (а), -(СН₂)_Ь- (Ь) или обоих фрагментов (аЬ). Число после буквенного обозначения определяет номер стадии, на которой соединение или соединения являются исходными веществами. Второе число, если указано, определяет вариант промежуточного соединения. Обозначения в квадратных скобках указывают стадии синтеза.

В соответствии с изобретением пегилирующий агент общей формулы (I) может быть получен из монометоксиполиэтиленгликоля с применением нескольких синтетических подходов. В первом варианте способа получения синтез начинают с алкилирования гидроксильной группы монометоксиполиэтиленгликоля соответствующим эфиром ω-галогенкарбоновой кислоты (стадия [1]) ^нз^с4^0-сн~^сн2К^н+хЬК (а1) <Ь1> ^0А|к

Стадия [1]

-н₃с-(о·

-сн—сн₂^-о ьк (аЬ2) ^ь ОА!к

На стадии [1] монометоксиполиэтиленгликоль (а1) обрабатывают алкиловым эфиром (Ь1) соответствующей ω-галогенкарбоновой кислоты в среде безводного органического растворителя в присутствии основания В с образованием соответствующего ПЭГ-карбоксиэфира (аЬ2).

Основание выбирают из металлического лития, металлического натрия или металлического калия, амида лития, амида натрия или амида калия, бутиллития, третбутилата лития, третбутилата натрия или третбутилата калия, уходящей группой X является С1, Вг или I, А1к выбран из метила, этила, пропила, изопропила, бутила, втор-бутила или трет-бутила.

Мольное соотношение основания к монометоксиполиэтиленгликолю составляет от 1:1 до 50:1. Мольное соотношение Ω-галогенкарбоновой кислоты к монометоксиполиэтиленгликолю составляет от 1:1 до 50:1.

Реакцию ведут в атмосфере азота или аргона в диапазоне температур от 0 до 100°С или при кипении в среде безводного органического растворителя, выбранного из бензола, толуола, ксилола, тетрагидрофурана, диоксана, безводного третбутанола или их смеси. Продукт реакции осаждают диэтиловым эфиром.

Количество сложноэфирных групп, содержащихся в ПЭГ-карбоксиэфире, устанавливают либо микроопределением числа омыления, либо спектрофотометрически в видимой области с реагентом РеС1₃

- 8 023360 после предварительного переведения в форму соответствующей гидроксамовой кислоты.

Далее сложноэфирную группу ПЭГ-карбоксиэфира (аЪ2) подвергают щелочному гидролизу (стадия [2]) н₃с-(о-сн₂-сн₂)-о-(сн₂Ц (аЬ2)

Стадия [2]

- Н.сфз-СН—ΟΗ.)-θ)θΗ₂-Υ (аЬЗ) для получения ПЭГ-карбоновой кислоты (стадия [3]) н_эс-(о-сн₂-сн₂^о-(сн₂·^ н⁺ (аЬЗ)

Стадия [3]

Н,Цо-СН₂— ΟΗ₂-|-θ)θΗ,Υ (аЬ4) ^ь он

Щелочной гидролиз ПЭГ-карбоксиэфира (аЪ2) (стадия [2]) проводят в атмосфере азота или аргона, водным раствором щелочи, выбранной из гидроксидов щелочных или щелочно-земельных металлов или их смесей.

Последующим подкислением реакционной массы после завершения стадии 2 получают соответствующую ПЭГ-карбоновую кислоту (аЪ4) (стадия [3]). Для подкисления применяют водный раствор кислоты, выбранной из серной кислоты, хлористо-водородной кислоты, хлорной кислоты, бромистоводородной кислоты, фосфорной кислоты, лимонной кислоты, уксусной кислоты или их смесей.

Образовавшуюся ПЭГ-карбоновую кислоту (аЪ4) выделяют из водного раствора экстракцией хлорсодержащим растворителем, выбранным из дихлорметана, трихлорэтилена, хлороформа, тетрахлорметана или их смесей, с последующим осаждением диэтиловым эфиром.

Количество карбоксильных групп в (аЪ4) определяют либо потенциометрическим микротитрованием раствором сильного основания, либо спектрофотометрически в видимой области в виде соли с бриллиантовым зеленым или метиленовым синим.

Далее ПЭГ-карбоновую кислоту (аЪ4) превращают в активированный эфир (аЪ5-1) ПЭГ-карбоновой кислоты (стадия [4а])

н.с-(о-сн₂-ск₂-)-о^сн₂Ц

Стадия [4а] <аЬ4) н,с-^о-сн—сн₂^-о-[сн₂Ц (аЬ5-1)

ОК или хлорангидрид (аЪ5-2) (стадия [4б]) н₃Цо-сн₂-сн₂^о-(сн₂-}-^ 5ОС1, (аЬ4)

Стадия [4б] н₃Цо-сн—сн₂^-о)сн₂-Ц (аЬ5-2)

Превращение ПЭГ-карбоновой кислоты (аЪ4) в соответствующий активированный эфир (аЪ5-1) на стадии 4а проводят действием гидроксилсодержащего соединения К.-ОН в присутствии карбодиимида (ΟΌ) в среде безводного органического растворителя. Реакцию ведут в атмосфере азота или аргона в диапазоне температур от -10 до 30°С. Безводный органический растворитель выбирают из диоксана, тетрагидрофурана, дихлорметана, хлороформа, трихлорэтилена, тетрахлорида углерода, диметилформамида, этилацетата или их смесей. Карбодиимидом является циклогексилкарбодиимид или диизопропилкарбодиимид. Гидроксилсодержащее соединение выбрано из Ν-гидроксисукцинимида, 4-нитрофенола, 2,4динитрофенола, пентахлорфенола или пентафторфенола.

Мольное соотношение гидроксилсодержашего соединения К.-ОН к ПЭГ-карбоновой кислоте (аЪ4) составляет от 1:1 до 50:1. Мольное соотношение карбодиимида (ΟΌ) к ПЭГ-карбоновой кислоте (аЪ4) составляет от 1:1 до 50:1.

Активированный эфир (аЪ5-1) ПЭГ-карбоновой кислоты выделяют осаждением диэтиловым эфиром. Количество сложноэфирных групп, содержащихся в (аЪ5-1), устанавливают либо микроопределением числа омыления, либо спектрофотометрически в УФ-области или в видимой области с реагентом РеС1₃ после предварительного переведения в форму соответствующей гидроксамовой кислоты.

Получение хлорангидрида (аЪ5-2) ПЭГ-карбоновой кислоты осуществляют обработкой ПЭГкарбоновой кислоты избытком тионилхлорида в органическом безводном растворителе или без такового. Безводный органический растворитель выбирают из дихлорметана, хлороформа, трихлорэтилена, тетра- 9 023360 хлорида углерода или их смесей. Реакцию ведут в атмосфере азота или аргона при температуре от -10 до 100°С. Продукт выделяют осаждением диэтиловым эфиром.

Количество хлорангидридных групп, содержащихся в (аЬ5-2), определяют либо потенциометрическим микротитрованием либо спектрофотометрически в видимой области с реагентом РеС1₃ после предварительного переведения в форму соответствующей гидроксамовой кислоты.

Далее соответствующий эфир фенилаланина, в котором А1к' обозначает алифатический алкил, выбранный из метила или этила, ацилируют, применяя в качестве ацилирующего агента активированный эфир (аЬ5-1) ПЭГ-карбоновой кислоты, в котором К обозначает остаток гидроксилсодержащего соединения, выбранного из Ν-гидроксисукцинимида, 4-нитрофенола, 2,4-динитрофенола, пентахлорфенола или пентафторфенола (стадия [5а])

ОА1к‘

Стадия [5а]

Эфир фенилаланина ацилируют в присутствии основания в среде безводного органического растворителя, выбранного из дихлорметана, хлороформа, трихлорэтилена, тетрахлорида углерода, этилацетата, диметилформамида, диоксана, тетрагидрофурана или их смесей. Реакцию ведут в атмосфере азота или аргона при температуре от -10 до 30°С. Органическим основанием является триэтиламин, Νметилморфолин или их смесь. Мольное соотношение эфира фенилаланина к активированному эфиру (аЬ5-1) ПЭГ-карбоновой кислоты составляет от 1:1 до 50:1. Продукт реакции выделяют осаждением диэтиловым эфиром.

Количество фрагментов эфира фенилаланина, присоединённых к активированному эфиру (аЬ5-1), устанавливают либо микроопределением числа омыления, либо спектрофотометрически в УФ-области или в видимой обрасти с реагентом РеС1 после предварительного переведения в форму соответствующей гидроксамовой кислоты.

Альтернативно, в качестве ацилирующего агента применяют хлорангидрид (аЬ5-2) ПЭГ-карбоновой кислоты в присутствии в качестве основания алифатического амина, выбранного из триэтиламина, метилдиэтиламина или Ν-метилмлрфолина. Реакцию предпочтительно проводят в среде диметилформамида (стадия [5в])

Стадия [5в]

Выделение и характеризацию продукта проводят, как описано для стадии [5а].

Альтернативно ацилирование метилового или этилового эфира фенилаланина ведут непосредственно ПЭГ-карбоновой кислотой (аЬ4) в присутствии карбодиимида и органического основания в среде безводного органического растворителя (стадия [5б])

Стадия [5б]

Безводный органический растворитель выбирают из дихлорметана, хлороформа, трихлорэтилена, тетрахлорида углерода, этилацетата, диметилформамида, диметилсульфоксида, диоксана, тетрагидрофурана, ацетонитрил или их смесей. Органическим основанием является триэтиламин, Ν-метилморфолин или их смесь. Карбодиимидом является циклогексилкарбодиимид или диизопропилкарбодиимид.

Реакцию ведут в атмосфере азота или аргона при температуре от -30 до 30°С. Мольное соотношение эфира фенилаланина к ПЭГ-карбоновой кислоте (аЬ4) составляет от 1:1 до 50:1. Мольное соотношение карбодиимида к ПЭГ-карбоновой кислоте (аЬ4) составляет от 1:1 до 50:1. Продукт выделяют осаждением диэтиловым эфиром.

- 10 023360

Количество фрагментов эфира фенилаланина, присоединённых к ПЭГ-карбоновой кислоте (аЬ4), устанавливают либо микроопределением числа омыления, либо спектрофотометрически в УФ-области или в видимой обрасти с реагентом РеС1 после предварительного переведения в форму соответствующей гидроксамовой кислоты.

На стадии [6] метиловый или этиловый эфир (аЬ6) ПЭГ-фенилаланина гидразинолизом превращают в соединение (II)

Н₃сфэ-СН—снф о-^сн (аЬ6)

Стадия [6]

Гидразинолиз проводят действием избытка гидразингидрата в среде спиртового растворителя, выбранного из метанола, этанола или их смеси. Реакцию ведут в атмосфере азота или аргона в диапазоне температур от 10 до 100°С при повышенном давлении или при температуре кипения растворителя при атмосферном давлении. Соединение (II) выделяют экстракцией хлорированным растворителем, выбранным из дихлорметана, хлороформа, трихлорэтилена, тетрахлорида углерода или их смесей, с последующим осаждением диэтиловым эфиром.

Количество гидразидных групп, введенных в (аЬ6), определяют спектрофотометрически в видимой области с реагентом 4-диметиламинобензальдегидом.

В другом альтернативном варианте способа получения соединения общей формулы (II) применяют последовательность химических реакций, описываемую маршрутом синтеза 2.

Маршрут синтеза 2.

Стадии синтеза [1]-[3], [4а], [4б] и условия их проведения аналогичны маршруту синтеза 1, раскрытому выше.

В настоящем варианте способа синтеза в качестве промежуточного соединения применяют непосредственно фенилаланин, который ацилируют активированным эфиром (аЬ5-1) ПЭГ-карбоновой кислоты, в котором К обозначает остаток гидроксилсодержащего соединения, выбранного из Νгидроксисукцинимида, 4-нитрофенола, 2,4-динитрофенола, пентахлорфенола или пентафторфенола (стадия [5г])

ОН

Стадия [5г]

Ацилирование проводят в водной или водно-органической среде. Водно-органической средой является смесь органической среды, выбранной из ацетонитрила, метанола, этанола, изопропанола или их смесей, с водой в любых соотношениях. Мольное соотношение фенилаланина к активированному эфиру (аЬ5-1) ПЭГ-карбоновой кислоты составляет от 1:1 до 50:1. Реакцию ведут в атмосфере азота или аргона в диапазоне температур от -10 до 30°С. Продукт осаждают диэтиловым эфиром.

Альтернативно, ацилирование фенилаланин осуществляют действием хлорангидрида (аЬ5-2) ПЭГкарбоновой кислоты в водной, водно-органической или в органической среде в присутствии основания (стадия [5д]) он

Стадия [5д]

Органической средой являются диметилформамид, диметилсульфоксид, ацетонитрил, метанол, этанол, изопропанол или их смеси. Водно-органической средой являются смесь органической среды с водой в любых соотношениях. Основанием являются гидроксиды, карбонаты или гидрокарбонаты щелочных и щелочно-земельных металлов, оксид или гидроксид магния, триэтиламин или их смеси.

Мольное соотношение фенилаланина к активированному эфиру (аЬ5-1) ПЭГ-карбоновой кислоты составляет от 1:1 до 50:1. Реакцию ведут в атмосфере азота или аргона в диапазоне температур от -10 до

- 11 023360

30°С. Продукт осаждают диэтиловым эфиром.

В обоих вариантах количество присоединённых фенилаланин-карбоксильных групп определяют либо потенциометрическим микротитрованием, либо спектрофотометрически в видимой области в виде соли с бриллиантовым зеленым или метиленовым синим. Присутствие ароматического остатка фенилаланина доказывают спектрофотометрически по характерному поглощению в УФ-области.

Далее соединение (аЬ6') превращают в соединение (II) действием избытка гидразингидрата в присутствии водорастворимого карбодиимида (СЭ) в водной среде (стадия [6в])

Стадия [6в]

Реакцию ведут в атмосфере азота или аргона при температуре от -10 до 30°С. Водорастворимым карбодимидом является 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)-карбодиимид, Ы-циклогексил-К-(2морфолинил-(4)-этил)карбодиимид, Ы-циклогексил-К-(4-диметиламиноциклогексил)карбодиимид или их смесь. Мольное соотношение карбодиимида к (аЬ6') составляет от 1:1 до 50:1.

Соединение (II) выделяют экстракцией хлорированным растворителем, выбранным из дихлорметана, хлороформа, трихлорэтилена, тетрахлорида углерода или их смесей с последующим осаждением диэтиловым эфиром.

Количество введенных в (аЬ6') гидразидных групп определяют спектрофотометрически в видимой области с реагентом 4-диметиламинобензальдегидом. Присутствие ароматического остатка фенилаланина доказывают спектрофотометрически в УФ-области по характерному поглощению.

В альтернативном варианте гидразинолизу предшествует переведение соединения (аЬ6') в соответствующий активированный эфир (аЬ7-1), в котором К обозначает остаток гидроксилсодержащего соединения, выбранного из Ν-гидроксисукцинимида, 4-нитрофенола, 2,4-динитрофенола, пентахлорфенола или пентафторфенола (стадия [6а])

Стадия [6а] действием гидроксилсодержащего соединения К-ОН, выбранного из Ν-гидроксисукцинимида, 4нитрофенола, 2,4-динитрофенола, пентахлорфенола или пентафторфенола, в присутствии карбодиимида (СЭ), такого как циклогексилкарбодиимид или диизопропилкарбодиимид.

Реакцию ведут в атмосфере азота или аргона в диапазоне температур от -10 до 20°С в среде безводного органического растворителя, выбранного из диоксана, тетрагидрофурана, дихлорметана, хлороформа, трихлорэтилена, тетрахлорида углерода, диметилформамида, этилацетата или их смеси. Активированный эфир (аЬ7-1) ПЭГ-карбоновой кислоты выделяют осаждением диэтиловым эфиром.

Мольное соотношение гидроксилсодержашего соединения К-ОН к соединению (аЬ6') составляет от 1:1 до 50:1. Мольное соотношение карбодиимида СЭ к соединению (аЬ6') составляет от 1:1 до 50:1.

Количество сложноэфирных групп, содержащихся в соединении (аЬ7-1), устанавливают либо микроопределением числа омыления, либо спектрофотометрически в УФ-области или в видимой области с реагентом РеС1 после предварительного переведения в форму соответствующей гидроксамовой кислоты.

В другом альтернативном варианте гидразинолизу предшествует переведение соединения (аЬ6') в соответствующий хлорангидрид (аЬ7-2) (стадия [6б])

Стадия [6б] обработкой соединения (аЬ6')избытком тионилхлорида в органическом безводном растворителе или без такового. Безводный органический растворитель выбирают из дихлорметана, хлороформа, трихлорэтилена, тетрахлорида углерода или их смесей. Реакцию ведут в атмосфере азота или аргона при температу- 12 023360 ре от -10 до 100°С. Продукт выделяют осаждением диэтиловым эфиром.

Количество хлорангидридных групп, содержащихся в хлорангидриде ПЭГ-фенилаланина, определяют либо потенциометрическим микротитрованием, либо спектрофотометрически в видимой области с реагентом РеС1₃ после предварительного переведения в форму соответствующей гидроксамовой кислоты. Присутствие ароматического остатка фенилаланина доказывают спектрофотометрически в УФобласти по характерному поглощению.

Далее на стадиях [7а] или [7б] соединения (аЬ7-1) или (аЬ7-2) подвергают гидразинолизу с образованием соединения общей формулы (II) / \ 0 0 н_эс-(о-сн—сн_г4-о-(снй-^ ОК ' а ь _ΝΗ—/ ν₂Η₄ (аЬ7-1) } -- (II)

О

Стадия [7 а]

Стадия[7б]

Для этого активирований эфир (аЬ7-1), в котором К обозначает остаток гидроксилсодержащего соединения, выбранного из Ν-гидроксисукцинимида, 4-нитрофенола, 2,4-динитрофенола, пентахлорфенола или пентафторфенола, или хлорангидрид (аЬ7-2) обрабатывают избытком гидразингидрата в водной, водно-органической или органической среде.

Реакцию ведут в атмосфере азота или аргона при температуре от -10 до 30°С. Органической средой является метанол, этанол, ацетонитрил, диоксан, тетрагидрофуран, диметилформамид, диметилсульфоксид или их смеси. Водно-органической средой является смесь органической среды с водой в любых соотношениях.

Соединение (II) выделяют экстракцией хлорированным растворителем, выбранным из дихлорметана, хлороформа, трихлорэтилена, тетрахлорида углерода или их смесей, с последующим осаждением диэтиловым эфиром.

Количество введенных гидразидных групп определяют спектрофотометрически в видимой области с реагентом 4-диметиламинобензальдегидом. Присутствие ароматического остатка фенилаланина доказывают спектрофотометрически в УФ-области по характерному поглощению.

Альтернативно, соединение (II) может быть непосредственно получено гидразинолизом ПЭГкарбоновой кислоты (аЬ6') в присутствии водорастворимого карбодиимида (СИ), такого как 1-этил-3-(3диметиламинопропил)карбодиимид, №циклогексил-]№(2-морфолинил-(4)-этил)карбодиимид, Νциклогексил-Ы-(4-диметиламиноциклогексил)карбодиимид или их смеси, в водной среде (стадия [6в]) н₃с4о-сн—снАо+сн₂4/ 7— он ' а Ь _ΝΗ-Ζ _{Ν н} (аЬб) 6 -- (II)

О

Стадия [6в]

Реакцию ведут в атмосфере азота или аргона при температуре от -10 до 30°С. Мольное соотношение карбодиимида к соединению (аЬ6') составляет от 1:1 до 50:1. Выделение и характеризацию продукта проводят, как описано для стадии (7а) или (7б).

Основной целью изобретения является получение стабильно пегилированных белков, обладающих полезными биологическими свойствами, особенно интерферонов, и в частности интерферона а-2Ь (ΖΡΝ аа-2Ь). Для этого соединение (II) непосредственно перед пегилированием белка превращают в линейный ацилазидный пегилирующий агент (I) обработкой избытком азотистой кислоты при пониженной температуре в интервале от -5 до 10°С. Источником азотистой кислоты является смесь нитрита щелочного или щелочно-земельного металла и кислоты, выбранной из серной кислоты, хлористо-водородной кислоты, бромисто-водородной кислоты, фосфорной кислоты, лимонной кислоты, уксусной кислоты или их смесей. По окончании реакции избыток азотистой кислоты удаляют добавлением азида щелочного металла, после чего образовавшееся соединение (I) без выделения используют для конъюгации с белком

По достижении степени превращения белка 70-85% реакцию останавливают прибавлением избытка

- 13 023360 глицина. Реакционную смесь разбавляют устанавливают значение рН 4,5-5,5, требуемое для хроматографического разделения продуктов на СЫ-сефарозе, после чего проводят градиентное элюирование от 0,1 до 0,8М ЫаС1. Отобранные фракции анализируют обращенно-фазовой ВЭЖХ на содержание моно-ПЭГΙΡΝ а-2Ь, по результатам которого отбирают целевые для последующей очистки и приготовления лекарственного препарата.

Далее достижение технического результата изобретения будет показано на предпочтительных примерах осуществления. Все примеры были воспроизведены для двух фракций монометоксиполиэтиленгликоля ПЭГ₂₀ и ПЭГ₃₀ с молекулярными массами 20 и 30 кДа соответственно. Присутствие фрагмента фенилаланина в соединениях (аЬ5-1), (аЬ6), (аЬ6'), (аЬ7-1) и (II) было подтверждено спектрофотометрически по наличию полосы поглощения с максимумами при 251, 257 и 263 нм, имеющей выраженную колебательную структуру, характер которой совпадает с описанным в публикации 1пд1е РВ.. Ви8сй К.Щ., Ви8сй М А. С1йга1 аиа1у818 Ьу тиШуапаЮ гедгеккюп тойеНпд о£ 8ресДа1 йа1а икшд сус1ойе\тш днеЧ-НоЧ сотр1ехе8-Ме1йоЙ8 £ог йеЮтиптд епапйотепс сотромйоп \νί11ι уагушд сЫга1 апа1у1е сопсейгайоп. Та1айа, уо1. 75 (2) Арг. 2008, р. 572-584.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения.

Пример 1. Получение ПЭГ-карбоксиэфира (стадия [1]).

В атмосфере аргона при нагревании в 50 мл толуола растворяют 100 мкмоль монометоксиполиэтиленгликоля. Полученный раствор кипятят 15 мин и отгоняют около 25 мл растворителя, после чего раствор охлаждают до комнатной температуры и приливают раствор 1000 мкмоль третбутоксида калия в 20 мл абсолютного третбутанола.

Реакционную смесь перемешивают 1 ч в атмосфере аргона при комнатной температуре и приливают раствор 1000 мкмоль метилового эфира ω-бромкарбоновой кислоты с числом атомов Ь от 1 до 9 в 10 мл толуола и перемешивают в течение ночи при комнатной температуре. Затем раствор выпаривают при пониженном давлении и ПЭГ-карбоксиэфир осаждают диэтиловым эфиром, отфильтровывают и дважды переосаждают из дихлорметанового раствора диэтиловым эфиром и высушивают в вакуум-эксикаторе.

Выход: 94-98%. Содержание сложноэфирных групп в полимере по данным титриметрических и спектрофотометрических анализов составляет 96-102%.

Пример 2. Получение ПЭГ-карбоновой кислоты (стадии [2] и [3]).

ПЭГ-карбоксиэфир, полученный в примере 1, растворяют в 50 мл 2М ЫаОН и перемешивают в течение ночи в атмосфере аргона, после чего подкисляют 10%-ной серной кислотой до рН 1-2 и трижды экстрагируют дихлорметаном порциями по 20 мл. Объединенные экстракты промывают 10%-ным сульфатом натрия до нейтральной реакции и высушивают над безводным сульфатом натрия в течение ночи. Высушенный раствор фильтруют, упаривают и ПЭГ-карбоновую кислоту осаждают диэтиловым эфиром и отфильтровывают.

Полученный осадок дважды переосаждают диэтиловым эфиром из раствора в абсолютном изопропаноле и высушивают в вакуум-эксикаторе.

Выход: 90-96%. Содержание сложноэфирных групп в полимере по данным титриметрических и спектрофотометрических анализов составляет 98-103%.

Пример 3. Получение нитрофенилового эфира ПЭГ-карбоновой кислоты (стадия [4а]).

К охлажденному до 0°С раствору 100 мкмоль ПЭГ-карбоновой кислоты, полученной в примере 3, в 80 мл этилацетата приливают этилацетатный раствор 500 мкмоль 4-нитрофенола, перемешивают и добавляют 500 мкмоль дициклогексилкарбодиимида, растворенного в 10 мл этилацетата. Реакционную смесь перемешивают в течение ночи при комнатной температуре в атмосфере аргона.

Раствор фильтруют и продукт выделяют добавлением диэтилового эфира, отфильтровывают, дважды переосаждают эфиром из раствора в дихлорметане и высушивают в вакуум-эксикаторе.

Выход: 97-100%. Содержание нитрофенильных групп в полимере по данным титриметрических и спектрофотометрических анализов составляет 93-101%.

Пример 4. Получение хлорангидрида ПЭГ-карбоновой кислоты (стадия [4б]).

К раствору 100 мкмоль ПЭГ-карбоновой кислоты, полученной в примере 3, в 50 мл дихлорметана приливают 10 мл свежеперегнанного тионилхлорида и перемешивают в атмосфере аргона в течение ночи при комнатной температуре. Затем реакционную смесь выпаривают при пониженном давлении, остаток растворяют в 20 мл метиленхлорида и продукт выделяют добавлением диэтилового эфира.

Хлорангидрид ПЭГ-карбоновой кислоты отфильтровывают, дважды переосаждают эфиром из раствора в дихлорметане и высушивают в вакуум-эксикаторе.

Выход: 97-100%. Содержание хлорангидридных групп в полимере по данным титриметрических и спектрофотометрических анализов составляет 89-94%.

Пример 5. Получение метилового эфира ПЭГ-фенилаланина (стадия [5а]).

В 40 мл дихлорметана расторяют 100 мкмоль нитрофенилового эфира ПЭГ-карбоновой кислоты, полученного в примере 3. Параллельно готовят раствор, содержащий по 1000 мкмоль гидрохлорида метилового эфира Ζ-фенилаланина и триэтиламина в 10 мл диметилформамида. Растворы смешивают и оставляют на ночь в атмосфере аргона.

- 14 023360

Продукт осаждают добавлением диэтилового эфира, отфильтровывают и дважды переосаждают эфиром из раствора в изопропаноле. Полученный метиловый эфир ПЭГ-фенилаланина высушивают в вакууме.

Выход: 92-98%. Содержание эфирных групп в полимере по данным титриметрических и спектрофотометрических анализов составляет 92-97%.

Пример 6. Получение метилового эфира ПЭГ-фенилаланина (стадия [5в]).

В 40 мл дихлорметана расторяют 100 мкмоль хлорангидрида ПЭГ-карбоновой кислоты, полученного в примере 4. Параллельно готовят раствор, содержащий по 1000 мкмоль гидрохлорида метилового эфира Ь-фенилаланина и триэтиламина в 10 мл диметилформамида. Растворы смешивают и оставляют на ночь в атмосфере аргона.

Продукт осаждают добавлением диэтилового эфира, отфильтровывают и дважды переосаждают эфиром из раствора в изопропаноле. Полученный метиловый эфир ПЭГ-фенилаланина высушивают в вакууме.

Выход: 94-98%. Содержание эфирных групп в полимере по данным титриметрических и спектрофотометрических анализов составляет 88-95%.

Пример 7. Получение метилового эфира ПЭГ-фенилаланина (стадия [5б]).

К охлажденному до 0°С раствору 100 мкмоль ПЭГ-карбоновой кислоты, полученной в примере 2, в 50 мл этилацетата приливают диметилформамидный раствор 500 мкмоль гидрохлорида метилового эфира Ь-фенилаланина, содержащего 500 мкмоль триэтиламина, перемешивают и добавляют 500 мкмоль дициклогексилкарбодиимида, растворенного в 10 мл этилацетата. Реакционную смесь перемешивают в течение ночи при комнатной температуре в атмосфере аргона. Затем раствор фильтруют и продукт выделяют добавлением диэтилового эфира, отфильтровывают, дважды переосаждают эфиром из раствора в изопропаноле и высушивают в вакуум-эксикаторе.

Выход: 95-99%. Содержание эфирных групп в полимере по данным титриметрических и спектрофотометрических анализов составляет 92-100%.

Пример 8. Получение ПЭГ-фенилаланина (стадия [5г]).

100 мкмоль нитрофенилового эфира ПЭГ-карбоновой кислоты, полученной в примере 3, растворяют в 50 мл водного раствора, содержащего по 1000 мкмоль Ь-фенилаланина и 1000 мкмоль триэтиламина. Раствор перемешивают в течение ночи при комнатной температуре в атмосфере аргона. Затем желтую реакционную смесь трижды экстрагируют дихлорметаном порциями по 50 мл. Объединенные экстракты промывают 10%-ным сульфатом натрия в 1% ЫаНСО₃, затем 10%-ным сульфатом натрия, подкисленным до рН 1-2 серной кислотой и в конце - чистым 10% сульфатом натрия до нейтральной реакции и высушивают над безводным сульфатом натрия в течение ночи.

Высушенный раствор фильтруют, выпаривают и ПЭГ-фенилаланин осаждают диэтиловым эфиром и отфильтровывают. Полученный осадок полимера дважды переосаждают диэтиловым эфиром из раствора в абсолютном изопропаноле и высушивают в вакууме.

Выход: 87-96%. Содержание карбоксильных групп в полимере по данным титриметрических и спектрофотометрических анализов составляет 90-97%.

Пример 9. Получение ПЭГ-фенилаланина (стадия [5д]).

100 мкмоль хлорангидрида ПЭГ-карбоновой кислоты, полученного в примере 4, расторяют в 40 мл дихлорметана. Параллельно готовят раствор, содержащий по 1000 мкмоль Ь-фенилаланина и триэтиламина в 10 мл диметилформамида. Растворы смешивают и оставляют на ночь в атмосфере аргона. Продукт осаждают добавлением диэтилового эфира, отфильтровывают и дважды переосаждают эфиром из раствора в изопропанола. Полученный ПЭГ-фенилаланин высушивают в вакуум-эксикаторе.

Выход: 93-98%. Содержание эфирных групп в полимере по данным титриметрических и спектрофотометрических анализов составляет 89-94%.

Пример 10. Получение гидроксисукцинимидного эфира ПЭГ-фенилаланина(стадия [6а]).

К охлажденному до 0°С раствору 100 мкмоль ПЭГ-фенилаланина, полученного в примере 8 или 9, в 80 мл этилацетата приливают этилацетатный раствор 500 мкмоль Ν-гидроксисукцинимида, перемешивают и добавляют 500 мкмоль дициклогексилкарбодиимида, растворенного в 10 мл этилацетата. Реакционную смесь перемешивают в течение ночи при комнатной температуре в атмосфере аргона. Затем раствор фильтруют, и продукт выделяют добавлением диэтилового эфира, отфильтровывают, дважды переосаждают эфиром из раствора в дихлорметане и высушивают в вакуум-эксикаторе.

Выход: 96-99%. Содержание гидроксисукцинимидных групп в полимере по данным титриметрических и спектрофотометрических анализов составляет 95-103%.

Пример 11. Получение хлорангидрида ПЭГ-фенилаланина (стадия [6б]).

К раствору 100 мкмоль ПЭГ-фенилаланина, полученного в примере 8 или 9, в 50 мл дихлорметана приливают 10 мл свежеперегнанного тионилхлорида и перемешивают в атмосфере аргона в течение ночи при комнатной температуре. После реакционную смесь выпаривают при пониженном давлении, остаток растворяют в 20 мл метиленхлорида и продукт выделяют добавлением диэтилового эфира.

Хлорангидрид ПЭГ-фенилаланина отфильтровывают, дважды переосаждают эфиром из раствора в дихлорметане и высушивают в вакуум-эксикаторе над твердым КОН или конц. Н₂§О₄.

- 15 023360

Выход: 98-100%. Содержание хлорангидридных групп в полимере по данным титриметрических и спектрофотометрических анализов составляет 88-98%.

Пример 12. Получение гидразида ПЭГ-фенилаланина (II) (стадия [6]).

К раствору 100 мкмоль метилового эфира ПЭГ-фенилаланина, полученного в примерах 5, 6 или 7, в 30 мл метанола приливают 10 мл гидразингидрата и кипятят с обратным холодильником в атмосфере аргона 24 ч. Далее раствор выпаривают при пониженном давлении, остаток растворяют в 30 мл 10% сульфата натрия, подкисляют 5%-ной серной кислотой до рН 1-2 и 5-кратно экстрагируют дихлорметаном порциями по 30 мл.

Органический слой промывают 10%-ным сульфатом натрия до нейтральной реакции и высушивают над безводным сульфатом натрия в течение ночи. Высушенный дихлорметановый раствор ПЭГгидразида фильтруют, выпаривают при пониженном давлении, и продукт осаждают добавлением диэтилового эфира. Осадок отфильтровывают и трижды переосаждают эфиром из раствора в изопропаноле.

Выход: 91-96%. Содержание гидразидных групп в полимере по данным спектрофотометрического анализа составляет 83-92%.

Пример 13. Получение гидразида ПЭГ-фенилаланина (II) (стадия [7а]).

В 30 мл охлажденного до 0°С 1%-ного водного раствора гидразингидрата растворяют 100 мкмоль гидроксисукцинимидного эфира ПЭГ-фенилаланина, полученного в примере 10. Смесь перемешивают 5 ч в атмосфере аргона при комнатной температуре, подкисляют 5%-ной серной кислотой до рН 1-2 и 5кратно экстрагируют дихлорметаном порциями по 30 мл.

Органический слой промывают 10%-ным сульфатом натрия до нейтральной реакции и высушивают над безводным сульфатом натрия в течение ночи. Высушенный дихлорметановый раствор ПЭГгидразида фильтруют, выпаривают при пониженном давлении, и продукт осаждают добавлением диэтилового эфира. Осадок отфильтровывают и трижды переосаждают эфиром из раствора в изопропаноле.

Выход: 92-95%. Содержание гидразидных групп в полимере по данным спектрофотометрического анализа составляет 91-94%.

Пример 14. Получение гидразида ПЭГ-фенилаланина (II) (стадия [7б]).

В 25 мл охлажденного до 0°С диметилфлормамида, содержащего 10 ммоль гидразингидрата, растворяют 100 мкмоль хлорангидрида ПЭГ-фенилаланина, полученного в примере 11. Смесь перемешивают в атмосфере аргона 2 ч при комнатной температуре, выпаривают при пониженном давлении, растворяют в 30 мл воды, подкисляют 5%-ной серной кислотой до рН 1-2 и 5-кратно экстрагируют дихлорметаном порциями по 30 мл.

Органический слой промывают 10%-ным сульфатом натрия до нейтральной реакции и высушивают над безводным сульфатом натрия в течение ночи. Высушенный дихлорметановый раствор ПЭГгидразида фильтруют, выпаривают при пониженном давлении, и продукт осаждают добавлением диэтилового эфира. Осадок отфильтровывают и трижды переосаждают эфиром из раствора в изопропаноле.

Выход: 89-94%. Содержание гидразидных групп в полимере по данным спектрофотометрического анализа составляет 86-92%.

Пример 15. Получение гидразида ПЭГ-фенилаланина (II) (стадия [6в]).

К 30 мл охлажденного до 3°С водного раствора 100 мкмоль ПЭГ-фенилаланина, полученного в примере 8 или 9, содержащему 10 ммоль гидразингидрата, приливают водный раствор 1-этил-3-(3диметиламинопропил)-карбодиимида (500 мкмоль/10 мл).

Смесь перемешивают при охлаждении в течение 3 ч и далее в течение ночи при комнатной температуре в атмосфере аргона, подкисляют 5%-ной серной кислотой до рН 1-2 и 5-кратно экстрагируют дихлорметаном порциями по 30 мл.

Органический слой промывают 10%-ным сульфатом натрия до нейтральной реакции и высушивают над безводным сульфатом натрия в течение ночи. Высушенный дихлорметановый раствор ПЭГгидразида фильтруют, выпаривают при пониженном давлении, и продукт осаждают добавлением диэтилового эфира. Осадок отфильтровывают и трижды переосаждают эфиром из раствора в изопропаноле.

Выход: 92-98%. Содержание гидразидных групп в полимере по данным спектрофотометрического анализа составляет 82-89%.

Пример 16. Получение пегилирующего линейного ацилазидного агента общей формулы (II).

К охлажденному до 0°С раствору 5 мкмоль гидразида ПЭГ-фенилаланина, полученного в примере 13, 14 или 15, в 3 мл 0,5М НС1 приливают раствор 50 мкмоль ΝαΝΟ₂ в 1 мл воды. Смесь перемешивают при охлаждении в течение 20 мин, далее избыток азотистой кислоты удаляют прибавлением 50 мкмоль ΝαΝ в 0,5 мл воды и сразу же используют для конъюгации с белком.

Пример 17. Получение пегилированного интерферона (ПЭГ-ΙΡΝ а-2Ь).

Раствор 5 мкмоль азида ПЭГ-фенилаланина, полученного в примере 16, приливают к охлажденному до 0-5°С раствору 1 мкмоль ΓΕΝ а-2Ь в фосфатном буфере с рН 8,5. Реакционную смесь при охлаждении перемешивают в течение 3 ч. Далее реакцию останавливают прибавлением избытка глицина.

Реакционную смесь разбавляют в 10 раз, добавлением СН₃СООН устанавливают рН 5,0 и наносят на С^сефарозу, предварительно уравновешенную 20 мМ ацетатным буфером с рН 5,0. После нанесения

- 16 023360 реакционной смеси элюируют уравновешивающим буфером, а затем - градиентом от 0,1 до 0,8М №С1. Отобранные фракции анализируют обращенно-фазовой ВЭЖХ на содержание моно-ПЭГ-ΙΡΝ а-2Ь. Целевые фракции объединяют и повторно анализируют, определяя чистоту и содержание моно-ПЭГ-ΙΡΝ α2Ь.

Выход очищенного продукта (в пересчете на ΙΡΝ а-2Ь): для ПЭГ-ΙΡΝ а-2Ь составляет 54% при чистоте 95,5%; для ПЭГ^-ΙΡΝ а-2Ь составляет 42% при чистоте 97,3%.

Claims (9)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Линейный ацилазидный пегилирующий агент общей формулы (Ι) где а - целое число от 100 до 1800 и

   Ь - целое число от 1 до 9, имеющий молекулярную массу от 5 до 80 кДа.
2. 2. Способ получения линейного ацилазидного пегилирующего агента общей формулы (Ι) по п.1, характеризующийся тем, что монометоксиполиэтиленгликоль (а1) алкилируют соответствующим алкиловым эфиром (Ь1) ω-галогенкарбоновой кислоты в среде безводного органического растворителя, выбранного из группы, состоящей из бензола, толуола, ксилола, тетрагидрофурана, диоксана, безводного трет-бутанола, в присутствии основания В, выбранного из группы, состоящей из щелочного металла, амида щелочного металла, алкоголята щелочного металла или бутиллития, в атмосфере азота или аргона в диапазоне температур от 0 до 100°С или при кипении органического растворителя с образованием соответствующего ПЭГ-карбоксиэфира (аЬ2) где А1к выбран из метила, этила, пропила, изопропила, бутила, втор-бутила или трет-бутила, а уходящей группой X является С1, Вг или Ι, при этом продукт выделяют осаждением диэтиловым эфиром;

   сложноэфирную группу ПЭГ-карбоксиэфира (аЬ2) подвергают щелочному гидролизу в атмосфере азота или аргона водным раствором щелочи, выбранной из гидроксидов щелочных или щелочноземельных металлов или их смесей полученный продукт подкисляют для получения ПЭГ-карбоновой кислоты (аЬ4) образовавшуюся ПЭГ-карбоновую кислоту выделяют из водного раствора экстракцией хлорсодержащим растворителем, выбранным из группы, состоящей из дихлорметана, трихлорэтилена, хлороформа, тетрахлорметана, с последующим осаждением диэтиловым эфиром;

   ПЭГ-карбоновую кислоту (аЬ4) в атмосфере азота или аргона в диапазоне температур от -10 до 30°С в среде безводного органического растворителя, выбранного из группы, состоящей из диоксана, тетрагидрофурана, дихлорметана, хлороформа, трихлорэтилена, тетрахлорида углерода, диметилформамида, этилацетата, действием гидроксилсодержащего соединения К-ОН, выбранного из Νгидроксисукцинимида, 4-нитрофенола, 2,4-динитрофенола, пентахлорфенола или пентафторфенола, в присутствии карбодиимида (СИ), выбранного из циклогексилкарбодиимида или диизопропилкарбодиимида, превращают в активированный эфир (аЬ5-1) ПЭГ-карбоновой кислоты который выделяют осаждением диэтиловым эфиром;

   - 17 023360 эфир фенилаланина

   ОА1к в котором А1к' обозначает алифатический алкил, выбранный из метила или этила, в атмосфере азота или аргона при температуре от -10 до 30°С в присутствии органического основания, выбранного из группы, состоящей из триэтиламина, Ν-метилморфолина, в среде безводного органического растворителя, выбранного из группы, состоящей из дихлорметана, хлороформа, трихлорэтилена, тетрахлорида углерода, этилацетата, диметилформамида, диоксана, тетрагидрофурана, ацилируют активированным эфиром (аЪ5-1) ПЭГ-карбоновой кислоты, в котором К обозначает остаток гидроксилсодержащего соединения, выбранного из Ν-гидроксисукцинимида, 4-нитрофенола, 2,4-динитрофенола, пентахлорфенола или пентафторфенола и соединение (аЪ6) выделяют осаждением диэтиловым эфиром;

   эфир (аЪ6) ПЭГ-фенилаланина действием избытка гидразингидрата в среде спиртового растворителя, выбранного из метанола, этанола или их смеси, в атмосфере азота или аргона в диапазоне температур от 10 до 100°С при повышенном давлении или при температуре кипения растворителя при атмосферном давлении превращают в соединение (II) которое выделяют экстракцией хлорированным растворителем, выбранным из группы, состоящей из дихлорметана, хлороформа, трихлорэтилена, тетрахлорида углерода, с последующим осаждением диэтиловым эфиром; и соединение (II) превращают в линейный ацилазидный пегилирующий агент общей формулы (I) обработкой избытком азотистой кислоты, полученной смешением нитрита щелочного или щелочноземельного металла и кислоты, выбранной из группы, состоящей из серной кислоты, хлористоводородной кислоты, бромисто-водородной кислоты, фосфорной кислоты, лимонной кислоты, уксусной кислоты, при пониженной температуре в интервале от -5 до 10°С с удалением избытка азотистой кислоты добавлением азида щелочного металла по окончании реакции;

   при этом в указанных выше формулах (а1), (Ъ1), (аЪ2)-(аЪ6) и (II) значения а и Ъ такие, как определено в п.1.
3. 3. Способ получения линейного ацилазидного пегилирующего агента общей формулы (I) по п.1, характеризующийся тем, что монометоксиполиэтиленгликоль (а1) алкилируют соответствующим алкиловым эфиром (Ъ1) ω-галогенкарбоновой кислоты в среде безводного органического растворителя, выбранного из группы, состоящей из бензола, толуола, ксилола, тетрагидрофурана, диоксана, безводного трет-бутанола, в присутствии основания В, выбранного из группы, состоящей из щелочного металла, амида щелочного металла, алкоголята щелочного металла или бутиллития, в атмосфере азота или аргона в диапазоне температур от 0 до 100°С или при кипении органического растворителя с образованием соответствующего ПЭГ-карбоксиэфира (аЪ2) н_эс-^о—СН—СН₂-^ОН+ х-^сн₂-^ -А (а1) (М) ^0А|к

   - н₃с-^о-сн-сн₂-)--о{сн₂-)^ (аЬ2) где А1к выбран из метила, этила, пропила, изопропила, бутила, втор-бутила или трет-бутила, а уходящей группой X является С1, Вг или I, при этом продукт выделяют осаждением диэтиловым эфиром;

   сложноэфирную группу ПЭГ-карбоксиэфира (аЪ2) подвергают щелочному гидролизу в атмосфере азота или аргона, водным раствором щелочи, выбранной из гидроксидов щелочных или щелочноземельных металлов или их смесей

   - 18 023360

   С-^О-СН—С( —- н₃с-^оΈΗξ (аЬ2)

   ЗН—СН

   ОА1к (аЬЗ) полученный продукт подкисляют для получения ПЭГ-карбоновой кислоты (аЬ4) ^-(о-снг-сн^о^сн^ (аЬЗ)

   О’ н* —- Н₃С-^О-СН—СН₂-^-О-(сН₂А <аЬ4) образовавшуюся ПЭГ-карбоновую кислоту выделяют из водного раствора экстракцией хлорсодержащим растворителем, выбранным из группы, состоящей из дихлорметана, трихлорэтилена, хлороформа, тетрахлорметана, с последующим осаждением диэтиловым эфиром;

   ПЭГ-карбоновую кислоту (аЬ4) в атмосфере азота или аргона при температуре от -10 до 100°С обработкой избытком тионилхлорида в органическом безводном растворителе, выбранном из группы, состоящей из дихлорметана, хлороформа, трихлорэтилена, тетрахлорида углерода, или без такового превращают в хлорангидрид (аЬ5-2)

   ЗОС1₂ он з-^о-сн—С

   Н.С-Ю-СН—СН₂-^-о{^сн2А (аЬ4) ^<

   С-^О-СН—СН₂-^-о{с^н2А

   Η,ΟήΟ-ΌΗ—СН₂-)-О-(-СН.(аЬ5-2) ³ который выделяют осаждением диэтиловым эфиром; эфир фенилаланина в котором А1к' обозначает алифатический алкил, выбранный из метила или этила, в среде безводного диметилформамида в присутствии основания, выбранного из триэтиламина, метилдиэтиламина или Νметилморфолина, ацилируют хлорангидридом (аЬ5-2) ПЭГ-карбоновой кислоты и соединение (аЬ6) выделяют осаждением диэтиловым эфиром;

   эфир (аЬ6) ПЭГ-фенилаланина действием избытка гидразингидрата в среде спиртового растворителя, выбранного из метанола, этанола или их смеси, в атмосфере азота или аргона в диапазоне температур от 10 до 100°С при повышенном давлении или при температуре кипения растворителя при атмосферном давлении превращают в соединение (II) которое выделяют экстракцией хлорированным растворителем, выбранным из группы, состоящей из дихлорметана, хлороформа, трихлорэтилена, тетрахлорида углерода, с последующим осаждением диэтиловым эфиром; и соединение (II) превращают в линейный ацилазидный пегилирующий агент общей формулы (I) обработкой избытком азотистой кислоты, полученной смешением нитрита щелочного или щелочноземельного металла и кислоты, выбранной из группы, состоящей из серной кислоты, хлористоводородной кислоты, бромисто-водородной кислоты, фосфорной кислоты, лимонной кислоты, уксусной кислоты, при пониженной температуре в интервале от -5 до 10°С с удалением избытка азотистой кислоты добавлением азида щелочного металла по окончании реакции;

   при этом в указанных выше формулах (а1), (Ь1), (аЬ2)-(аЬ6) и (II) значения а и Ь такие, как опреде- 19 023360 лено в п.1.
4. 4. Способ получения линейного ацилазидного пегилирующего агента общей формулы (I) по п.1, характеризующийся тем, что монометоксиполиэтиленгликоль (а1) алкилируют соответствующим алкиловым эфиром (Ь1) ω-галогенкарбоновой кислоты в среде безводного органического растворителя, выбранного из группы, состоящей из бензола, толуола, ксилола, тетрагидрофурана, диоксана, безводного трет-бутанола, в присутствии основания В, выбранного из группы, состоящей из щелочного металла, амида щелочного металла, алкоголята щелочного металла или бутиллития, в атмосфере азота или аргона в диапазоне температур от 0 до 100°С или при кипении органического растворителя с образованием соответствующего ПЭГ-карбоксиэфира (аЬ2)

   Н₃С-^О-СН—СН^ОН + Х-)сН_гХ -2» (а1) (Ы) ^ОА|к ?° ^ь ОА!к

   - н₃с-(о-сн₂-сн₂-)-о{сн₂(аЬ2) где А1к выбран из метила, этила, пропила, изопропила, бутила, втор-бутила или трет-бутила, а уходящей группой X является С1, Вг или I, при этом продукт выделяют осаждением диэтиловым эфиром; сложноэфирную группу ПЭГ-карбоксиэфира (аЬ2) подвергают щелочному гидролизу в атмосфере азота или аргона водным раствором щелочи, выбранной из гидроксидов щелочных или щелочно-земельных металлов или их смесей полученный продукт подкисляют для получения ПЭГ-карбоновой кислоты (аЬ4)

   Н₃С-^О-СН—СН₂-^-О-^СН₂-^ -б* (аЬЗ) ° —- н₃с4о-сн₂—снХо/снА/' ' '^а ' он (аЬ4>

   образовавшуюся ПЭГ-карбоновую кислоту выделяют из водного раствора экстракцией хлорсодержащим растворителем, выбранным из группы, состоящей из дихлорметана, трихлорэтилена, хлороформа, тетрахлорметана, с последующим осаждением диэтиловым эфиром;

   эфир фенилаланина в котором А1к' обозначает алифатический алкил, выбранный из метила или этила, в атмосфере азота или аргона, в среде безводного органического растворителя, выбранного из группы, состоящей из дихлорметана, хлороформа, трихлорэтилена, тетрахлорида углерода, этилацетата, диметилформамида, диметилсульфоксида, диоксана, тетрагидрофурана, ацетонитрила, при температуре от -30 до 30°С в присутствии органического основания, выбранного из группы, состоящей из триэтиламина, Ν-метилморфолина, в присутствии карбодиимида, выбранного из циклогексилкарбодиимида или диизопропилкарбодиимида, ацилируют ПЭГ-карбоновой кислотой (аЬ4) и соединение (аЬ6) выделяют осаждением диэтиловым эфиром;

   эфир (аЬ6) ПЭГ-фенилаланина действием избытка гидразингидрата в среде спиртового растворителя, выбранного из метанола, этанола или их смеси, в атмосфере азота или аргона в диапазоне температур от 10 до 100°С при повышенном давлении или при температуре кипения растворителя при атмосферном давлении превращают в соединение (II)

   - 20 023360 которое выделяют экстракцией хлорированным растворителем, выбранным из группы, состоящей из дихлорметана, хлороформа, трихлорэтилена, тетрахлорида углерода, с последующим осаждением диэтиловым эфиром; и соединение (II) превращают в линейный ацилазидный пегилирующий агент общей формулы (I) обработкой избытком азотистой кислоты, полученной смешением нитрита щелочного или щелочноземельного металла и кислоты, выбранной из группы, состоящей из серной кислоты, хлористоводородной кислоты, бромисто-водородной кислоты, фосфорной кислоты, лимонной кислоты, уксусной кислоты, при пониженной температуре в интервале от -5 до 10°С с удалением избытка азотистой кислоты добавлением азида щелочного металла по окончании реакции;

   при этом в указанных выше формулах (а1), (Ь1), (аЬ2)-(аЬ6) и (II) значения а и Ь такие, как определено в п.1.
5. 5. Способ получения линейного ацилазидного пегилирующего агента общей формулы (I) по п.1, характеризующийся тем, что монометоксиполиэтиленгликоль (а1) алкилируют соответствующим алкиловым эфиром (Ь1) ω-галогенкарбоновой кислоты в среде безводного органического растворителя, выбранного из группы, состоящей из бензола, толуола, ксилола, тетрагидрофурана, диоксана, безводного трет-бутанола, в присутствии основания В, выбранного из группы, состоящей из щелочного металла, амида щелочного металла, алкоголята щелочного металла или бутиллития, в атмосфере азота или аргона в диапазоне температур от 0 до 100°С или при кипении органического растворителя с образованием соответствующего ПЭГ-карбоксиэфира (аЬ2) где А1к выбран из метила, этила, пропила, изопропила, бутила, втор-бутила или трет-бутила, а уходящей группой X является С1, Вг или I, и продукт выделяют осаждением диэтиловым эфиром;

   сложноэфирную группу ПЭГ-карбоксиэфира (аЬ2) подвергают щелочному гидролизу в атмосфере азота или аргона водным раствором щелочи, выбранной из гидроксидов щелочных или щелочноземельных металлов или их смесей полученный продукт подкисляют для получения ПЭГ-карбоновой кислоты (аЬ4) и образовавшуюся ПЭГ-карбоновую кислоту выделяют из водного раствора экстракцией хлорсодержащим растворителем, выбранным из группы, состоящей из дихлорметана, трихлорэтилена, хлороформа, тетрахлорметана, с последующим осаждением диэтиловым эфиром;

   ПЭГ-карбоновую кислоту (аЬ4) в атмосфере азота или аргона в диапазоне температур от -10 до 30°С в среде безводного органического растворителя, выбранного из группы, состоящей из диоксана, тетрагидрофурана, дихлорметана, хлороформа, трихлорэтилена, тетрахлорида углерода, диметилформамида, этилацетата, действием гидроксилсодержащего соединения К-ОН, выбранного из Νгидроксисукцинимида, 4-нитрофенола, 2,4-динитрофенола, пентахлорфенола или пентафторфенола, в присутствии карбодиимида (СЭ), выбранного из циклогексилкарбодиимида или диизопропилкарбодиимида, превращают в активированный эфир (аЬ5-1) ПЭГ-карбоновой кислоты

   - 21 023360

   /)~о{сн₂-}^а ь он <аЬ4>

   —- н,с-(о-сн—сн₂(аЬ5-1) ' который выделяют осаждением диэтиловым эфиром;

   фенилаланин в водной или водно-органической среде, которая является смесью органической среды, выбранной из группы, состоящей из ацетонитрила, метанола, этанола, изопропанола, с водой в любых соотношениях в атмосфере азота или аргона в диапазоне температур от -10 до 30°С ацилируют активированным эфиром (аЪ5-1) ПЭГ-карбоновой кислоты, в котором К обозначает остаток гидроксилсодержащего соединения, выбранного из Ν-гидроксисукцинимида, 4-нитрофенола, 2,4-динитрофенола, пентахлорфенола или пентафторфенола и продукт осаждают диэтиловым эфиром, затем соединение (аЪ6') действием избытка гидразингидрата в водной среде в присутствии водорастворимого карбодиимида (СЮ), выбранного из группы, состоящей из 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида, ^циклогексил-^(2-морфолинил-(4)-этил)карбодиимида, ^циклогексил-^(4-диметиламиноциклогексил)карбодиимида, превращают в соединение (II) которое выделяют экстракцией хлорированным растворителем, выбранным из группы, состоящей из дихлорметана, хлороформа, трихлорэтилена, тетрахлорида углерода, с последующим осаждением диэтиловым эфиром, после чего соединение (II) превращают в линейный ацилазидный пегилирующий агент общей формулы (I) обработкой избытком азотистой кислоты, полученной смешением нитрита щелочного или щелочно-земельного металла и кислоты, выбранной из серной кислоты, хлористоводородной кислоты, бромисто-водородной кислоты, фосфорной кислоты, лимонной кислоты, уксусной кислоты или их смесей, при пониженной температуре в интервале от -5 до 10°С с удалением избытка азотистой кислоты добавлением азида щелочного металла по окончании реакции;

   при этом в указанных выше формулах (а1), (Ъ1), (аЪ2)-(аЪ6') и (II) значения а и Ъ такие, как определено в п.1.
6. 6. Способ получения линейного ацилазидного пегилирующего агента общей формулы (I) по п.1, характеризующийся тем, что монометоксиполиэтиленгликоль (а1) алкилируют соответствующим алкиловым эфиром (Ъ1) ω-галогенкарбоновой кислоты в среде безводного органического растворителя, выбранного из группы, состоящей из бензола, толуола, ксилола, тетрагидрофурана, диоксана, безводного трет-бутанола, в присутствии основания В, выбранного из группы, состоящей из щелочного металла, амида щелочного металла, алкоголята щелочного металла или бутиллития, в атмосфере азота или аргона в диапазоне температур от 0 до 100°С или при кипении органического растворителя с образованием соответствующего ПЭГ-карбоксиэфира (аЪ2) . о ч^он+х-НЛ <Ь1) °н,с-^о-сн—снДун (а1) н,с-^о-сн—сн₂)-о(сн_г-р/ (аЬ2) °‘ где А1к выбран из метила, этила, пропила, изопропила, бутила, втор-бутила или трет-бутила, а уходящей группой X является С1, Вг или I, и продукт выделяют осаждением диэтиловым эфиром;

   сложноэфирную группу ПЭГ-карбоксиэфира (аЪ2) подвергают щелочному гидролизу в атмосфере азота или аргона водным раствором щелочи, выбранной из гидроксидов щелочных или щелочноземельных металлов или их смесей

   - 22 023360

   НзС-^О-СН—¹

   Н^снК ^{а в} Ολικ (аЬ2) он^- —► н₃с-[о—сн—сн₂(аЬЗ) полученный продукт подкисляют для получения ПЭГ-карбоновой кислоты (аЬ4) н₃с-^о-сн—сн₂^-о(-сн₂-^ -б» (аЬЗ) ° —- н,с-^о-сн₂— сн₂^-о(сн₂-р( (аЬ4) °^Н и образовавшуюся ПЭГ-карбоновую кислоту выделяют из водного раствора экстракцией хлорсодержащим растворителем, выбранным из группы, состоящей из дихлорметана, трихлорэтилена, хлороформа, тетрахлорметана, с последующим осаждением диэтиловым эфиром, затем ПЭГ-карбоновую кислоту (аЬ4) в атмосфере азота или аргона при температуре от -10 до 100°С обработкой избытком тионилхлорида в органическом безводном растворителе, выбранном из группы, состоящей из дихлорметана, хлороформа, трихлорэтилена, тетрахлорида углерода, или без такового превращают в хлорангидрид (аЬ5-2) н₃с-(о-сн—снХо/снДУ - —^1;' ^а ' 'ь он (аЬ4) —- н,,с4о-сн—снХо^сн,' а Ь С1 (аЬ5-2) _? который выделяют осаждением диэтиловым эфиром;

   фенилаланин в атмосфере азота или аргона в диапазоне температур от -10 до 30°С в водной, водноорганической или в органической среде, где органическая среда выбрана из группы, состоящей из диметилформамида, диметилсульфоксида, ацетонитрила, метанола, этанола, изопропанола, а водноорганическая среда является смесью органической среды с водой в любых соотношениях, в присутствии основания, выбранного из гидроксидов, карбонатов или гидрокарбонатов щелочных и щелочноземельных металлов, оксида или гидроксида магния, триэтиламина или их смесей, ацилируют хлорангидридом (аЬ5-2) ПЭГ-карбоновой кислоты и продукт осаждают диэтиловым эфиром;

   соединение (аЬ6') действием избытка гидразингидрата в водной среде в присутствии водорастворимого карбодиимида (СИ), выбранного из группы, состоящей из 1-этил-3-(3диметиламинопропил)карбодиимида, ^циклогексил-№-(2-морфолинил-(4)-этил)карбодиимида, Νциклогексил-№-(4-диметиламиноциклогексил)карбодиимида, превращают в соединение (ΙΙ) которое выделяют экстракцией хлорированным растворителем, выбранным из группы, состоящей из дихлорметана, хлороформа, трихлорэтилена, тетрахлорида углерода, с последующим осаждением диэтиловым эфиром; и соединение (ΙΙ) превращают в линейный ацилазидный пегилирующий агент общей формулы (Ι) обработкой избытком азотистой кислоты, полученной смешением нитрита щелочного или щелочноземельного металла и кислоты, выбранной из серной кислоты, хлористо-водородной кислоты, бромистоводородной кислоты, фосфорной кислоты, лимонной кислоты, уксусной кислоты или их смесей, при пониженной температуре в интервале от -5 до 10°С с удалением избытка азотистой кислоты добавлением азида щелочного металла по окончании реакции;

   при этом в указанных выше формулах (а1), (Ь1), (аЬ2)-(аЬ6') и (ΙΙ) значения а и Ь такие, как определено в п.1.

   - 23 023360
7. 7. Способ получения линейного ацилазидного пегилирующего агента общей формулы (I) по п.1, характеризующийся тем, что монометоксиполиэтиленгликоль (а1) алкилируют соответствующим алкиловым эфиром (Ь1) ω-галогенкарбоновой кислоты в среде безводного органического растворителя, выбранного из группы, состоящей из бензола, толуола, ксилола, тетрагидрофурана, диоксана, безводного трет-бутанола, в присутствии основания В, выбранного из группы, состоящей из щелочного металла, амида щелочного металла, алкоголята щелочного металла или бутиллития, в атмосфере азота или аргона в диапазоне температур от 0 до 100°С или при кипении органического растворителя с образованием соответствующего ПЭГ-карбоксиэфира (аЬ2) н₃с4о-сн₂—сн₂-^он + х-^сн₂-^ —► <а1) (Ы) ^0А1к н₃с-(о-сн₂-сн₂-)-о{сн₂-)^ ^ь ОА1к где А1к выбран из метила, этила, пропила, изопропила, бутила, втор-бутила или трет-бутила, а уходящей группой X является С1, Вг или I, и продукт выделяют осаждением диэтиловым эфиром;

   сложноэфирную группу ПЭГ-карбоксиэфира (аЬ2) подвергают щелочному гидролизу в атмосфере азота или аргона, водным раствором щелочи, выбранной из гидроксидов щелочных или щелочноземельных металлов или их смесей н₃с-^о-сн—сн₂-^-о-^сн₂<аЬ2) н₃с-(о-сн₂-сн_г-)-о{сн₂-)(аЬЗ) полученный продукт подкисляют для получения ПЭГ-карбоновой кислоты (аЬ4) н₃с-^о-сн_г-сн₂^о{сн₂-)^ -ϋ* (аЬЗ) .0 ь он • н₃с-(о-сн₂-сн₂-)-о-(сн₂-)^ (аЬ4) и образовавшуюся ПЭГ-карбоновую кислоту выделяют из водного раствора экстракцией хлорсодержащим растворителем, выбранным из группы, состоящей из дихлорметана, трихлорэтилена, хлороформа, тетрахлорметана, с последующим осаждением диэтиловым эфиром;

   ПЭГ-карбоновую кислоту (аЬ4) в атмосфере азота или аргона в диапазоне температур от -10 до 30°С в среде безводного органического растворителя, выбранного из группы, состоящей из диоксана, тетрагидрофурана, дихлорметана, хлороформа, трихлорэтилена, тетрахлорида углерода, диметилформамида, этилацетата, действием гидроксилсодержащего соединения К-ОН, выбранного из Νгидроксисукцинимида, 4-нитрофенола, 2,4-динитрофенола, пентахлорфенола или пентафторфенола, в присутствии карбодиимида (СО), выбранного из циклогексилкарбодиимида или диизопропилкарбодиимида, превращают в активированный эфир (аЬ5-1) ПЭГ-карбоновой кислоты н₃с-(о-сн₂-сн₂-)-о{сн₂(аЬ4) н₃с^о-сн—сн₂-^-о-£сн₂-|^ (аЬ5-1) ° который выделяют осаждением диэтиловым эфиром;

   фенилаланин в водной или водно-органической среде, которая является смесью органической среды, выбранной из группы, состоящей из ацетонитрила, метанола, этанола, изопропанола, с водой в любых соотношениях в атмосфере азота или аргона в диапазоне температур от -10 до 30°С ацилируют активированным эфиром (аЬ5-1) ПЭГ-карбоновой кислоты, в котором К обозначает остаток гидроксилсодержащего соединения, выбранного из Ν-гидроксисукцинимида, 4-нитрофенола, 2,4-динитрофенола, пентахлорфенола или пентафторфенола продукт осаждают диэтиловым эфиром;

   соединение (аЬ6') действием гидроксилсодержащего соединения К-ОН, выбранного из Νгидроксисукцинимида, 4-нитрофенола, 2,4-динитрофенола, пентахлорфенола или пентафторфенола, в

   - 24 023360 присутствии карбодиимида (СЭ), такого как циклогексилкарбодиимид или диизопропилкарбодиимид, переводят в соответствующий активированный эфир (аЬ7-1), в котором К обозначает остаток гидроксилсодержащего соединения, выбранного из Ν-гидроксисукцинимида, 4-нитрофенола, 2,4-динитрофенола, пентахлорфенола или пентафторфенола и активированный эфир (аЬ7-1) выделяют осаждением диэтиловым эфиром;

   соединение (аЬ7-1) подвергают гидразинолизу избытком гидразингидрата в водной, водноорганической или органической среде с образованием соединения общей формулы (II) соединение (II) выделяют экстракцией хлорированным растворителем, выбранным из группы, состоящей из дихлорметана, хлороформа, трихлорэтилена, тетрахлорида углерода, с последующим осаждением диэтиловым эфиром; и соединение (II) превращают в линейный ацилазидный пегилирующий агент общей формулы (I) обработкой избытком азотистой кислоты, полученной смешением нитрита щелочного или щелочноземельного металла и кислоты, выбранной из серной кислоты, хлористо-водородной кислоты, бромистоводородной кислоты, фосфорной кислоты, лимонной кислоты, уксусной кислоты или их смесей, при пониженной температуре в интервале от -5 до 10°С с удалением избытка азотистой кислоты добавлением азида щелочного металла по окончании реакции;

   при этом в указанных выше формулах (а1), (Ь1), (аЬ2)-(аЬ7-1) и (II) значения а и Ь такие, как определено в п.1.
8. 8. Способ получения линейного ацилазидного пегилирующего агента общей формулы (I) по п.1, характеризующийся тем, что монометоксиполиэтиленгликоль (а1) алкилируют соответствующим алкиловым эфиром (Ь1) ω-галогенкарбоновой кислоты в среде безводного органического растворителя, выбранного из группы, состоящей из бензола, толуола, ксилола, тетрагидрофурана, диоксана, безводного трет-бутанола, в присутствии основания В, выбранного из группы, состоящей из щелочного металла, амида щелочного металла, алкоголята щелочного металла или бутиллития, в атмосфере азота или аргона в диапазоне температур от 0 до 100°С или при кипении органического растворителя с образованием соответствующего ПЭГ-карбоксиэфира (аЬ2)

   Η,Ο^Ο-ΟΗ,-ΟΗ^ΟΗ + Х-[сН₂-)®/ (а1) (Ы) н₃с-(о-снХо-{сн₂-Ц '^а Ь 0А1к <аЬ2) где А1к выбран из метила, этила, пропила, изопропила, бутила, втор-бутила или трет-бутила, а уходящей группой X является С1, Вг или I, и продукт выделяют осаждением диэтиловым эфиром;

   сложноэфирную группу ПЭГ-карбоксиэфира (аЬ2) подвергают щелочному гидролизу в атмосфере азота или аргона водным раствором щелочи, выбранной из гидроксидов щелочных или щелочноземельных металлов или их смесей н₃с-(о-сн₂-сн₂^о{сн₂-|-^ — (аЬ2) —► н₃с-^о—сн—сн₂-^-о/сн₂-Ц^ (аЬЗ) ° полученный продукт подкисляют для получения ПЭГ-карбоновой кислоты (аЬ4)

   - 25 023360 ;-^о-сн₂—сн₂)-с н,с-}о-сн_ снД-о(сн₂(аЬЗ) °

   - Н₃с4о-СН—СнД-о4снЛ1 \ 'а ' Х| (аЬ4) и образовавшуюся ПЭГ-карбоновую кислоту выделяют из водного раствора экстракцией хлорсодержащим растворителем, выбранным из группы, состоящей из дихлорметана, трихлорэтилена, хлороформа, тетрахлорметана, с последующим осаждением диэтиловым эфиром, затем ПЭГ-карбоновую кислоту (аЬ4) в атмосфере азота или аргона при температуре от -10 до 100°С обработкой избытком тионилхлорида в органическом безводном растворителе, выбранном из группы, состоящей из дихлорметана, хлороформа, трихлорэтилена, тетрахлорида углерода, или без такового превращают в хлорангидрид (аЬ5-2) н₃с-(о-сн₂-сн^о{сн₂-^ ^4(аЬ4) —- н,с)о-сн—сн₂)-о(сн₂)-( (аЬ5-2) ’ ^{Ь 01} который выделяют осаждением диэтиловым эфиром;

   фенилаланин в атмосфере азота или аргона в диапазоне температур от -10 до 30°С в водной, водноорганической или в органической среде, где органическая среда выбрана из группы, состоящей из диметилформамида, диметилсульфоксида, ацетонитрила, метанола, этанола, изопропанола, а водноорганическая среда является смесью органической среды с водой в любых соотношениях, в присутствии основания, выбранного из гидроксидов, карбонатов или гидрокарбонатов щелочных и щелочноземельных металлов, оксида или гидроксида магния, триэтиламина или их смесей, ацилируют хлорангидридом (аЬ5-2) ПЭГ-карбоновой кислоты и продукт осаждают диэтиловым эфиром;

   соединение (аЬ6') в атмосфере азота или аргона при температуре от -10 до 100°С обработкой избытком тионилхлорида в органическом безводном растворителе, выбранном из группы, состоящей из дихлорметана, хлороформа, трихлорэтилена, тетрахлорида углерода, или без такового превращают в хлорангидрид (аЬ7-2) который выделяют осаждением диэтиловым эфиром, соединение (аЬ7-2) подвергают гидразинолизу избытком гидразингидрата в водной, водно-органической или органической среде с образованием соединения общей формулы (II) соединение (II) выделяют экстракцией хлорированным растворителем, выбранным из группы, состоящей из дихлорметана, хлороформа, трихлорэтилена, тетрахлорида углерода, с последующим осаждением диэтиловым эфиром, которое выделяют экстракцией хлорированным растворителем, выбранным из дихлорметана, хлороформа, трихлорэтилена, тетрахлорида углерода или их смесей, с последующим осаждением диэтиловым эфиром; и соединение (II) превращают в линейный ацилазидный пегилирующий агент общей формулы (I) обработкой избытком азотистой кислоты, полученной смешением нитрита щелочного или щелочно- 26 023360 земельного металла и кислоты, выбранной из серной кислоты, хлористо-водородной кислоты, бромистоводородной кислоты, фосфорной кислоты, лимонной кислоты, уксусной кислоты или их смесей, при пониженной температуре в интервале от -5 до 10°С с удалением избытка азотистой кислоты, добавлением азида щелочного металла по окончании реакции;

   при этом в указанных выше формулах (а1), (Ь1), (аЬ2)-(аЬ7-2) и (II) значения а и Ь такие, как определено в п.1.
9. 9. Способ получения пегилированного интерферона а-2Ь (ΙΡΝ а-2Ь), характеризующийся тем, что способом по любому из пп.2-8 готовят раствор линейного ацилазидного пегилирующего агента общей формулы (I), затем к раствору ΙΡΝ а-2Ь в фосфатном буфере с рН 8,0-8,7 при 0-5°С добавляют 4-5кратный мольный избыток раствора линейного ацилазидного пегилирующего агента общей формулы (I) где а - целое число от 100 до 1800 и Ь - целое число от 1 до 9, с молекулярной массой от 5 до 80 кДа, по достижении степени превращения П-'Ν а-2Ь 70-85% реакцию останавливают прибавлением избытка глицина, реакционную смесь разбавляют в 5-15 раз, устанавливают значение рН 4,5-5,5, требуемое для хроматографического разделения продуктов на СА-сефарозе, после чего проводят градиентное элюирование от 0,1 до 0,8М №С1, отбирают фракции, которые анализируют обращенно-фазовой ВЭЖХ на содержание моно-ПЭГ-IΡN а-2Ь, по результатам которого определяют целевые фракции, которые далее очищают до степени, достаточной для приготовления лекарственного препарата.