CN104583235A - 含位点特异非天然氨基酸残基的抗体、其制备和使用方法 - Google Patents

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Abstract

本文提供包含在位点特异的位置的非天然氨基酸残基的抗体、包含所述抗体的组合物、它们的制备方法和它们的使用方法。所述抗体对于治疗和预防方法、检测方法和诊断方法是有用的。

Description

含位点特异非天然氨基酸残基的抗体、其制备和使用方法
技术领域
本文提供包含在位点特异(site-specific)的位置的非天然氨基酸残基的抗体、包含所述抗体的组合物、它们的制备方法和它们的使用方法。
背景技术
抗体是对它们靶抗原具有显著的亲和力的生物分子。自然提供抗体作为某些脊椎动物中的部分防御系统，用于消除或破坏外源蛋白、细胞和生物体(organisms)。如果对某脊椎动物提供在例如受感染的细胞或感染性细菌上的外源蛋白，则抗体能够结合它的靶外源蛋白，以引导该外源实体至消除或破坏该外源实体。
人类能够利用抗体的选择性的亲和力来靶向几乎任何所期望的抗原。所述抗原可以是受感染的细胞或感染性微生物上的蛋白质。它也可以是例如癌细胞上的蛋白质、靶组织的细胞上的蛋白质、血流中的蛋白质、发炎的或炎性细胞上的蛋白质、或其选择性结合是有用的的任意其它蛋白质。因此，已发现抗体用于治疗诸如癌症、炎性疾病、自身免疫性疾病和移植排斥等病症。抗体可以用信号通知免疫系统来破坏或消除病变细胞、或工程抗体可以携带分子有效载荷来破坏靶标。在某些应用中，治疗性抗体连接到分子屏(molecular shields)，以增加它们在生物体内的寿命。还发现抗体用作诊断工具(diagnostics)。这些抗体可以携带标记物，以指示在细胞上或组织中的靶抗原。这些标记物通常通过共价键与抗体连接。
迄今为止，用于连接抗体、分子实体(诸如分子有效载荷、分子屏和标记物的技术受限于它们连接到抗体的程度和位置的不均一性、受限于它们的低收率、以及受限于活性的降低。通常的偶联(conjugation)位点包括抗体链上的随机位置，例如，氨基酸侧链上的随机的胺和某些抗体链的N末端。在这样的技术中，一些抗体可能在一个位置连接到偶联物(conjugate)，而一些抗体在另一位置连接相同的偶联物，一些抗体可能根本不进行连接。
需要在位点特异的位置被修饰以针对均匀性、收率和/或活性进行优化的抗体，以促进抗体在例如治疗和诊断中的有前景的应用。
发明内容
本文提供在一个或多个位点特异的位置用一个或多个非天然氨基酸残基修饰的抗体。这些位点特异的位置对于用非天然氨基酸残基置换天然氨基酸残基是最佳的。在某些实施方案中，在这些位点特异的位置的置换产生置换均匀的(即，实质上在所选的位置中经修饰的)抗体。在某些实施方案中，在一个或多个这些位点特异的位置经置换的抗体具有有利的产品收率、有利的溶解度、有利的结合性和/或有利的活性。在以下的部分中详细描述了这些抗体的所述特性。
在一方面中，本文提供包括多肽的抗体，所述多肽在所述多肽链中的最佳可置换的位置具有至少一个非天然氨基酸残基。对本领域技术人员而言，所述抗体可以是被公认为抗体的任意多肽或多聚体多肽。所述多肽链可以是所述抗体的任意多肽链，包括任意重链和任意轻链。所述多肽链中的最佳可置换的位置是所述多肽链中的能够提供具有最佳收率、均匀性、溶解度、结合性和/或活性的置换的任意位置。以下的部分详细描述了这样的多肽链的最佳可置换的位置。以下还描述了有用的抗体、有用的非天然氨基酸。
在另一方面中，本文提供保护所述抗体的组合物。有利地，由于本文所提供的抗体的置换的均匀性，这样的组合物可以具有高的均匀性。在某些实施方案中，在以蛋白质的总重进行测量时或在以抗体的总重进行测量时，所述组合物包含实质量的所述抗体。在某些实施方案中，所述组合物以重量计包含至少80％的所述抗体、至少85％的所述抗体、至少90％的所述抗体、或至少95％的所述抗体。
在另一方面中，本文提供制备所述抗体的方法。所述抗体可以由对本领域技术人员而言是显而易见的、用于将非天然氨基酸并入抗体链的位点特异的位置的任意技术来制备。在某些实施方案中，所述抗体通过固相合成、半合成、活体内翻译、体外翻译或无细胞翻译而制备。
在另一方面中，本文提供使用所述抗体用于治疗的方法。根据本文的描述，针对治疗靶点的抗体可以并入一个或多个位点特异的非天然氨基酸。这些抗体可以用于治疗或预防与所述治疗靶点相关的疾病或病症。有利地，位点特异的非天然氨基酸可以用于将所述抗体连接到治疗性有效载荷(therapeutic payload)，以促进疗效。本文详细描述了示例性抗体、治疗靶点和疾病或病症。
在另一方面中，本文提供使用所述抗体用于检测的方法。根据本文的描述，针对检测靶点的抗体可以并入一个或多个位点特异的非天然氨基酸。这些抗体可以与标记物一起使用，以用信号通知与检测靶点的结合。有利地，位点特异的非天然氨基酸可以用于将所述抗体连接到标记物，以促进检测。本文详细描述了示例性抗体、检测靶点和标记物。
在另一方面中，本文提供改善(modifying)抗体稳定性的方法。抗体可以用如本文所描述的非天然氨基酸进行改性，以促进连接到能够改性所述抗体的稳定性的分子实体。例如，位点特异性的非天然氨基酸可以促进连接到分子屏，例如聚乙二醇，以增加抗体的稳定性。本文描述了示例性非天然氨基酸和连接部分。
附图说明
图1提供了示例性细胞毒试剂DBCO-MMAF。
图2提供了单峰疏水作用层析(HIC)测定轮廓曲线(profile)。
图3提供了没有精确解析的(not-well-resolved)(NWR)HIC测定曲线。
图4提供了精确解析的(WR)HIC测定曲线。
图5A和5B描述了两个变体(HC T110和HC S112))的示例性HIC痕迹(traces)，显示了对应于非偶联的、部分偶联的和完全偶联的IgGs的峰。
图6A-6E描述了显示位点特异性的偶联(conjugation)的示例性实施方案。
图7A和7B描述了包含不同的非天然氨基酸的抗体的抑制效率和可溶解的量(soluble yield)的对比数据。
图8描述了示例性的贝伦妥单抗(brentuximab)抗体药物偶联物对CD-30阳性细胞系的细胞杀伤。
图9提供了证明示例性的贝伦妥单抗抗体药物偶联物不能杀死不表达CD-30的细胞的实验结果。
图10描述了示例性的贝伦妥单抗()抗体药物偶联物与CD-30阳性细胞系的结合。
图11A、11B、11C和11D分别提供了示例性的细胞毒试剂DBCO-MMAF 2、DBCO-DM4、DBCO-DM42和DBCO-MMAE的结构。
图12提供了示例性scFv-Fc位点特异性的抗体药物偶联物的药代动力学的图示。
图13A和13B描述了示例性的位点特异性的抗体药物偶联物在动物模型中阻碍肿瘤生长和/或退化(regress)肿瘤尺寸的活体内的效力。
具体实施方式
本文提供在一个或多个位点特异性的位置具有非天然氨基酸的抗体、包含所述抗体的组合物、制备所述抗体的方法和它们的使用方法。
定义
当提及本文所提供的抗体时，下列术语具有以下含义，除非另有说明。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员所通常理解的相同的含义。如果对于本文的术语有多个定义，以该部分的定义为准，除非另有说明。
如本文所使用的，单数形式“a”、“an”、和“the”包括复数的提及，除非上下文明确地另有说明。因此，例如，提及“抗体”是提及一个或多个这样的抗体等。
对于包含抗体的组合物，术语“实质上纯的”是指组合物以重量计(例如干重)包含至少80％、85％、90％、或95％，在某些实施方案中，95％、98％、99％、或100％的相对于所述组合物的剩余部分的抗体。重量百分比可以相对于所述组合物中的蛋白质的总重或相对于所述组合物中的抗体的总重。纯度可以通过对本领域技术人员而言是显而易见的技术(例如SDS-PAGE)来测定。
术语“分离的(isolated)”是指实质上或基本上没有如在抗体的天然存在的环境或它的生产环境中，或这两种环境中所发现的、通常伴随着所述抗体或与所述抗体相互作用的组分的抗体。分离的抗体的制剂(preparations)以重量计(例如干重)具有小于约30％、小于约25％、小于约20％、小于约15％、小于约10％、小于约5％、小于约4％、小于约3％、小于约2％、小于约1％的污染蛋白质。
术语“抗体”是指本领域技术人员所公认为是抗体的任意大分子。抗体共享常见的性质，包括结合(binding)和至少一个多肽链，所述多肽链与能够由本领域技术人员所公认的任意的免疫球蛋白基因所编码的多肽链实质上是相同的。所述免疫球蛋白基因包括但不限于κ、λ、α、γ(IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)、δ、ε和μ恒定区基因、以及免疫球蛋白可变区基因。该术语包括本领域技术人员所公认的全长的抗体和抗体片段，以及它们的变体。该术语进一步包括糖基化的和非糖基化的(aglycosylated)抗体。
术语“抗体片段”是指除全长形式之外的任意形式的抗体。本文的抗体片段包括存在全长抗体内的为更小的组分的抗体、和已经被工程化的抗体。抗体片段包括但不限于Fv、Fc、Fab、和(Fab')2、单链Fv(scFv)、双体、三体、四体、双功能的杂交抗体、CDR1、CDR2、CDR3、CDR's的组合、可变区、构架区、恒定区等(Maynard&Georgiou,2000,Annu.Rev.Biomed.Eng.2:339-76；Hudson,1998,Curr.Opin.Biotechnol.9:395-402)。
术语“免疫球蛋白(Ig)”是指由一种或多种实质上由免疫球蛋白基因中的一种所编码的多肽所组成的蛋白质，或是指氨基酸序列与其实质上相同的蛋白质。免疫球蛋白包括但不限于抗体。免疫球蛋白可以具有许多结构形式，包括但不限于全长抗体、抗体片段和包括但不限于VH、Cγ1、Cγ2、Cγ3、VL和CL的个别免疫球蛋白域(immunoglobulin domain)。
术语“免疫球蛋白(Ig)域”是指由实质上由免疫球蛋白基因所编码的多肽组成的蛋白质结构域(protein domain)。Ig域包括但不限于VH、Cγ1、Cγ2、Cγ3、VL和CL。
术语抗体的“可变区”是指由VH免疫球蛋白域、VL免疫球蛋白域、或VH和VL免疫球蛋白域所组成的多肽。可变区可以是指分离的这个或这些多肽，如Fv片段、如scFv片段、如在更大的抗体片段环境中的该区、或如在全长的抗体片段或替代性的非抗体骨架分子环境中的该区。
术语“可变”是指这样的事实：抗体之间的可变区的某些部分的序列是普遍不同的，其是各个特定的抗体对它的特定的抗原的结合特异性的原因。然而，可变性并不是遍及抗体的可变区均匀分布的。在轻链和重链可变区中，它都集中在被称为互补性决定区(CDRs)的三个区段中。可变区的更高度保守的部分被称为构架区(FR)。天然的重链和轻链的可变区各包含四个FR区，所述四个FR区基本上采用β-折叠构型，通过三个或四个CDR进行连接，其形成连接β-折叠结构的环，在某些情况下形成β-折叠结构的一部分。各链中的多个CDR通过FR区很靠近地连在一起，且利用来自其它链的多个CDR有助于形成抗体的抗原结合位点(参见Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版.Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。
恒定区通常不直接参与抗体与抗原的结合，但显示了效应子功能。根据它们的重链的恒定区的氨基酸序列，抗体或免疫球蛋白可以被归属到不同的类别。有五种主要类别的免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，且这些中的一些可以进一步被划分成子类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、和IgG4；IgA1和IgA2。对应于免疫球蛋白的不同类别的重链恒定区分别被称为α、δ、ε、γ和μ。各种人类免疫球蛋白类别中，已知只有人类IgG1、IgG2、IgG3和IgM活化补体。
“变体蛋白质序列”是指具有一个或多个残基在氨基酸同一性(identity)上不同于另外的类似蛋白质序列的蛋白质序列。所述类似的蛋白质序列可以是天然的野生型蛋白质序列、或野生型序列的另外的变体。变体包括具有一个或多个氨基酸的插入、删除、或置换的蛋白质。变体还包括具有一个或多个翻译后修饰的氨基酸。
术语“亲本抗体”是指根据本文所提供的描述进行修饰的、本领域技术人员已知的抗体。所述修饰可以是确确实实的(physical)，即，以化学方法或生物化学方法置换或修饰亲本抗体的一个或多个氨基酸，以产生在本描述的范围内的抗体。所述修饰也可以是概念上的，即，使用亲本抗体的一个或多个多肽链的序列来设计包含根据本描述的一个或多个位点特异性的非天然氨基酸的抗体。亲本抗体可以是天然存在的抗体或在实验室中设计或开发的抗体。亲本抗体也可以是人工抗体或工程化的抗体，例如嵌合抗体或人源化抗体。
术语“保守性修饰的变体”是指通过氨基酸序列中的保守性置换而不同于相关的抗体的抗体。本领域技术人员将理解对在经编码的序列中改变、添加或删除单个氨基酸或小百分比的氨基酸的针对肽、多肽或蛋白质序列的个别置换、删除、或添加是“保守性修饰的变体”，其中所述改变引起以化学上类似的氨基酸进行氨基酸的置换。提供功能上类似的氨基酸的保守性置换表在本领域是公知的。这样的保守性修饰的变体是加上且不排除本发明的多态变体、物种间同源物和等位基因。
以下八个组各自包含彼此为保守性置换的氨基酸：
1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；
2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；
3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)、组氨酸(H)；
5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、缬氨酸(V)；
6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；
7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和
8)半胱氨酸(C)、蛋氨酸(M)
(参见例如，Creighton,Proteins:Structures and Molecular Properties(W HFreeman&Co.；第二版(1993年12月)。
术语“相同的”或“同一性”，在两个以上的多肽序列的情况中，是指是相同的两个以上序列或子序列。当在比较窗口或在利用以下的序列比较算法之一或通过手工对准和肉眼观察所测定的指定区针对最大一致性进行比较和对准时，如果它们具有一定百分比的相同的氨基酸残基或核苷酸(即，在特定的区域，约60％的同一性、任选地约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、或约95％的同一性)，则序列是“实质上相同的”。所述同一性可以存在于在长度上是至少约50个氨基酸或核苷酸的区，或存在于在长度上是75-100个氨基酸或核苷酸的区，或存在于非特定的、跨越(across)整个序列或多肽的区。在抗体的情况下，可以在可变的CDRs之外测定同一性。包括但不限于通过局部同源性算法(Smith和Waterman(1970)Adv.Appl.Math.2:482c)、通过同源性对准算法(Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443)、通过寻找相似法(Pearson和Lipman(1988)Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 85:2444)、通过这些算法的计算机化实施(Wisconsin Genetics Software Package,Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,Wis.中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)、或通过手工对准和肉眼观察(参见例如,Ausubel等，Current Protocols inMolecular Biology(1995年增刊))，而可以进行用于比较的序列的最佳对准。
适用于测定百分序列同一性和序列相似性百分比的算法的实例包括BLAST和BLAST 2.0算法，它们分别记载在Altschul等，(1977)Nuc.AcidsRes.25:3389-3402和Altschul等，(1990)J.Mol.Biol.215:403-410中。用于执行BLAST分析的软件通过国家生物技术信息中心是公开可利用的。BLAST算法参数W、T和X确定对准的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用的默认值：字长(W)为11、期望值(E)为10、M＝5、N＝-4和两条链的比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用的默认值：字长为3、期望值(E)为10、BLOSUM62打分矩阵(参见Henikoff和Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915)对准(B)为50、期望值为10、M＝5、N＝-4、和两条链的比较。BLAST算法通常用“低复杂度”的关闭的滤波器(filter)来执行。
BLAST算法也执行两种序列之间的相似性的统计学分析(参见例如，Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5787)。BLAST算法所提供的相似性的一种测定是最小加和概率(sum probability)(P(N))，其提供两种核苷酸或氨基酸序列之间偶然出现匹配的概率的指示。例如，如果在测试核苷酸与参考核苷酸的比较中，最小加和概率小于约0.2、更优选小于约0.01、最优选小于约0.001，那么则认为核苷酸与参考序列相似。
术语“氨基酸”是指天然存在和非天然存在的氨基酸的，以及诸如脯氨酸等亚氨基酸、氨基酸类似物和以类似于天然存在的氨基酸方式发挥作用的氨基酸模拟物。
天然编码的氨基酸是本领域技术人员已知的蛋白氨基酸。它们包括20种常见的氨基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸)和较不常见的吡咯赖氨酸和硒代半胱氨酸。天然编码的氨基酸包括22种天然存在的氨基酸的翻译后的变体，诸如戊二烯基化的氨基酸、异戊二烯基化的氨基酸、豆蔻酰化的氨基酸、棕榈酰化氨基酸、N-连接糖基化的氨基酸、O-连接糖基化的氨基酸、磷酸化的氨基酸和酰化的氨基酸。
术语“非天然氨基酸”是指不是蛋白氨基酸或其翻译后修饰的变体的氨基酸。特别是，该术语是指不是20种常见氨基酸、或吡咯赖氨酸或硒代半胱氨酸或其翻译后修饰的变体中的一种的氨基酸。
“功能的释放因子1(RF1)蛋白质”是指保留等于或实质上相似于野生型或未修饰的RF1蛋白质的活性的RF1。可以通过例如测定表达经修饰的RF1蛋白质的细菌的生长速率，并将该生长速率与表达野生型或未修饰的RF1的细菌的生长速率进行比较，来测试功能的RF1活性。也可以通过例如经修饰的RF1蛋白质的减少在mRNA中的特定位置的nnAA的正交tRNA的并入的能力，从而增加过早的链终止的量(即，增加截短型蛋白的量)，来测定功能的RF1活性，其中所述mRNA编码靶蛋白。
“减弱的释放因子1(RF1)蛋白质”是指相对于野生型或未修饰的RF1蛋白质保留降低的活性的经修饰的RF1。可以通过例如测定表达经修饰的RF1蛋白质的细菌的生长速率，并将该生长速率与表达野生型或未修饰的RF1的细菌的生长速率进行比较，来测试RF1活性。也可以通过例如经修饰的RF1蛋白质的减少在mRNA中的特定位置的nnAA的正交tRNA的并入的能力，从而增加过早的链终止的量(即，增加截短型蛋白的量)，来测定RF1活性，其中所述mRNA编码靶蛋白。在一些实施方案中，所述减弱的RF1蛋白质包含转录修饰；例如，可以降低RF1蛋白质(野生型或经修饰的)的表达水平以实现减弱。所述降低也可以通过利用RNAi技术来实现。在一些实施方案中，所述减弱的RF1蛋白质包含转录修饰；例如，可以降低合成的RF1蛋白质(野生型或经修饰的)的量以实现减弱，例如，通过经由将蛋白酶特异性序列插入到所述RF1序列增加蛋白酶消化蛋白质的速率。
抗体
本文提供在至少一个多肽链的氨基酸序列中的位点特异性位置包含一个或多个非天然氨基酸残基的抗体。
所述抗体可以与本领域技术人员所公认的任意抗体(即，亲本抗体)共享高序列同一性。在某些实施方案中，除了所述在位点特异性位置的非天然氨基酸外，抗体的氨基酸序列与亲本抗体的氨基酸序列是相同的。在进一步的实施方案中，本文提供的抗体相对于亲本抗体除了在位点特异性位置具有一个或多个非天然氨基酸之外，还可以具有一个或多个插入、删除、或突变。在某些实施方案中，本文提供的抗体可以具有独特的一级序列，只要其被本领域技术人员公认为是抗体即可。
所述抗体通常是包含多个肽链的蛋白质。在某些实施方案中，所述抗体是包含两个相同的轻(L)链和两个相同的重(H)链的异四聚体。各轻链可以通过一个共价的二硫键而连接到重链。各重链可以通过一个或多个共价的二硫键而连接到其它重链。各重链和各轻链也可以具有一个或多个链内二硫键。如本领域技术人员所已知的，各重链通常包含可变区(VH)，接着许多恒定区。各轻链通常包含在一端的可变区(VL)和恒定区。如本领域技术人员所已知的，抗体通常对它们的靶分子(即，抗原)具有选择性亲和力。
本文所提供的抗体可以具有本领域技术人员所已知的任意抗体形式。它们可以是全长或片段。示例性的全长抗体包括IgA、IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgG、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM等。示例性的片段包括Fv、Fab、Fc、sFv等。
本文所提供的抗体包括至少一个非天然氨基酸。所述非天然氨基酸可以是本领域技术人员所已知的任意非天然氨基酸。以下的部分中描述了示例性的非天然氨基酸。
所述非天然氨基酸位于抗体的多肽链中的精选的位置。这些位置被识别为向所述非天然氨基酸的置换提供最佳位点。各位点能够承受具有最佳结构、功能和/或用于制备所述抗体的方法的非天然氨基酸。
在某些实施方案中，用于置换的位点特异性位置提供稳定的抗体。稳定性可以通过对本领域技术人员而言是显而易见的任意技术来测定。
在某些实施方案中，用于置换的位点特异性位置提供具有最佳功能性质的抗体。例如，与不具有所述位点特异性非天然氨基酸的抗体相比，所述抗体可以显示对它的靶抗原的极小的降低或没有降低的结合亲和力。在某些实施方案中，与不具有所述位点特异性非天然氨基酸的抗体相比，所述抗体可以显示增强的结合。
在某些实施方案中，用于置换的位点特异性位置提供可以被有利地制备的抗体。例如，在某些实施方案中，所述抗体在下文论述的它的合成方法中显示了有利的性质。在某些实施方案中，与不具有所述位点特异性非天然氨基酸的抗体相比，所述抗体可以显示制备中的极小的降低或没有降低的收率。在某些实施方案中，与不具有所述位点特异性非天然氨基酸的抗体相比，所述抗体可以显示制备中的提高的收率。在某些实施方案中，与不具有所述位点特异性非天然氨基酸的抗体相比，所述抗体可以显示极小的降低或没有降低的下文所描述的tRNA抑制。在某些实施方案中，与不具有所述位点特异性非天然氨基酸的抗体相比，在制备中，所述抗体可以显示提高的下文所描述的tRNA抑制。
在某些实施方案中，用于置换的位点特异性位置提供具有有利的溶解度的抗体。在某些实施方案中，与不具有所述位点特异性非天然氨基酸的抗体相比，所述抗体可以显示极小的降低或没有降低的溶解度。在某些实施方案中，与不具有所述位点特异性非天然氨基酸的抗体相比，所述抗体可以显示提高的溶解度。
在某些实施方案中，用于置换的位点特异性位置提供具有有利的表达的抗体。在某些实施方案中，与不具有所述位点特异性非天然氨基酸的抗体相比，所述抗体可以显示极小的降低或没有降低的表达。在某些实施方案中，与不具有所述位点特异性非天然氨基酸的抗体相比，所述抗体可以显示提高的表达。
在某些实施方案中，用于置换的位点特异性位置提供具有有利的折叠的抗体。在某些实施方案中，与不具有所述位点特异性非天然氨基酸的抗体相比，所述抗体可以显示极小的降低或没有降低的适当的折叠。在某些实施方案中，与不具有所述位点特异性非天然氨基酸的抗体相比，所述抗体可以显示提高的折叠。
在某些实施方案中，用于置换的位点特异性位置提供能够有利的偶联的抗体。如下文所描述的，一些非天然氨基酸具有促进抗体直接或经由连接基团偶联到第二试剂的侧链或官能团。在某些实施方案中，与在其他位置不具有相同的或其他非天然氨基酸的抗体相比，所述抗体可以显示提高的偶联效率。在某些实施方案中，与在其他位置不具有相同的或其他非天然氨基酸的抗体相比，所述抗体可以显示提高的偶联收率。在某些实施方案中，与在其他位置不具有相同的或其他非天然氨基酸的抗体相比，所述抗体可以显示提高的偶联特异性。
一个或多个非天然氨基酸位于所述抗体的至少一个多肽链中的所选的位点特异性位置。所述多肽链可以是所述抗体的任意多肽链而没有限制，包括轻链或重链。所述位点特异性位置可以是所述抗体的任意区域，包括任意的可变区和任意的恒定区。
在某些实施方案中，本文提供的抗体包含在位点特异性位置的一个非天然氨基酸。在某些实施方案中，本文提供的抗体包含在位点特异性位置的两个非天然氨基酸。在某些实施方案中，本文提供的抗体包含在位点特异性位置的三个非天然氨基酸。在某些实施方案中，本文提供的抗体包含在位点特异性位置的多于三个的非天然氨基酸。
用于置换的位点特异性位置可以用本领域技术人员已知的任意抗体命名系统来描述。在Kabat编号系统中，这些位置在重链残基H005、H023、H042、H065、H074、H084、H118、H119、H132、H134、H135、H136、H137、H138、H139、H155、H160、H162、H165、H172、H174、H176、H177、H191、H194、H219、H238、H239、H241、H243、H246、H262、H264、H265、H267、H268、H269、H270、H271、H272、H274、H275、H278、H280、H281、H282、H283、H286、H289、H292、H293、H294、H295、H296、H297、H298、H299、H300、H301、H303、H305、H317、H320、H324、H326、H327、H329、H330、H332、H333、H334、H335、H337、H339、H340、H342、H344、H355、H356、H358、H359、H360、H375、H383、H384、H386、H389、H392、H398、H404、H420、H421、H436、和H438。换而言之，本文提供包含在选自以下Kabat残基的一个或多个位置的一个或多个非天然氨基酸的抗体：H005、H023、H042、H065、H074、H084、H118、H119、H132、H134、H135、H136、H137、H138、H139、H155、H160、H162、H165、H172、H174、H176、H177、H191、H194、H219、H238、H239、H241、H243、H246、H262、H264、H265、H267、H268、H269、H270、H271、H272、H274、H275、H278、H280、H281、H282、H283、H286、H289、H292、H293、H294、H295、H296、H297、H298、H299,H300、H301、H303、H305、H317、H320、H324、H326、H327、H329、H330、H332、H333、H334、H335、H337、H339、H340、H342、H344、H355、H356、H358、H359、H360、H375、H383、H384、H386、H389、H392、H398、H404、H420、H421、H436、和H438。
在某些实施方案中，本文提供包含在选自以下的Kabat残基的一个或多个位置的一个或多个非天然氨基酸的抗体：H005、H023、H074、H084、H118、H119、H132、H134、H135、H136、H137、H139、H160、H162、H165、H172、H191、H194、H239、H241、H246、H267、H268、H269、H270、H271、H272、H274、H275、H280、H281、H282、H283、H286、H289、H292、H293、H294、H295、H296、H297、H298、H299,H300、H301、H303、H305、H317、H320、H324、H326、H327、H329、H330、H332、H333、H334、H335、H337、H339、H340、H342、H344、H355、H359、H375、H386、H389、H392、H398、H404、H420、H421、和H438。
在某些实施方案中，本文提供包含在选自以下的Kabat残基的一个或多个位置的一个或多个非天然氨基酸的抗体：H005、H023、H084、H118、H119、H132、H134、H136、H137、H160、H162、H172、H239、H241、H267、H269、H270、H271、H272、H282、H286、H292、H293、H296、H298、H329、H330、H334、H335、H340、H355、H359、H386、H389、H404、H420、H421、H438、和H342。
在某些实施方案中，本文提供包含在选自以下的Kabat残基的一个或多个位置的一个或多个非天然氨基酸的抗体：H005、H084、H118、H132、H136、H239、H293、H334、H355、H359、和H389。
在某些实施方案中，本文提供包含在选自以下的Kabat残基的一个或多个位置的一个或多个非天然氨基酸的抗体：H023、H074、H119、H134、H135、H137、H139、H160、H162、H165、H172、H191、H194、H241、H246、H267、H268、H269、H270、H271、H272、H274、H275、H280、H281、H282、H283、H286、H289、H292、H294、H295、H296、H297、H298、H299、H300、H301、H303、H305、H317、H320、H324、H326、H327、H329、H330、H332、H333、H335、H337、H339、H342、H344、H355、H375、H386、H392、H398、H404、H420、H421、H340和H438。
在某些实施方案中，本文提供包含在选自以下的Kabat残基的一个或多个位置的一个或多个非天然氨基酸的抗体：H042、H065、H138、H155、H174、H176、H177、H219、H238、H243、H262、H264、H265、H278、H342、H356、H358、H360、H383、H384、H404、和H436。
在某些实施方案中，本文提供包含在选自相当于以下残基的Kabat残基的一个或多个位置的一个或多个非天然氨基酸的抗体：H292-H301、H303、和H305。
在Chothia编号系统中，这些位置在重链残基H005、H023、H042、H065、H074、H084、H118、H119、H132、H134、H135、H136、H137、H138、H139、H155、H160、H162、H165、H172、H174、H176、H177、H191、H194、H219、H238、H239、H241、H243、H246、H262、H264、H265、H267、H268、H269、H270、H271、H272、H274、H275、H278、H280、H281、H282、H283、H286、H289、H292、H293、H294、H295、H296、H297、H298、H299、H300、H301、H303、H305、H317、H320、H324、H326、H327、H329、H330、H332、H333、H334、H335、H337、H339、H340、H342、H344、H355、H356、H358、H359、H360、H375、H383、H384、H386、H389、H392、H398、H404、H420、H421、H436、和H438。换而言之，本文提供包含在选自以下Chothia残基的一个或多个位置的一个或多个非天然氨基酸的抗体：H005、H023、H042、H065、H074、H084、H118、H119、H132、H134、H135、H136、H137、H138、H139、H155、H160、H162、H165、H172、H174、H176、H177、H191、H194、H219、H238、H239、H241、H243、H246、H262、H264、H265、H267、H268、H269、H270、H271、H272、H274、H275、H278、H280、H281、H282、H283、H286、H289、H292、H293、H294、H295、H296、H297、H298、H299、H300、H301、H303、H305、H317、H320、H324、H326、H327、H329、H330、H332、H333、H334、H335、H337、H339、H340、H342、H344、H355、H356、H358、H359、H360、H375、H383、H384、H386、H389、H392、H398、H404、H420、H421、H436、和H438。
在某些实施方案中，本文提供包含在选自以下Chothia残基的一个或多个位置的一个或多个非天然氨基酸的抗体：H005、H023、H074、H084、H118、H119、H132、H134、H135、H136、H137、H139、H160、H162、H165、H172、H191、H194、H239、H241、H246、H267、H268、H269、H270、H271、H272、H274、H275、H280、H281、H282、H283、H286、H289、H292、H293、H294、H295、H296、H297、H298、H299、H300、H301、H303、H305、H317、H320、H324、H326、H327、H329、H330、H332、H333、H334、H335、H337、H339、H340、H342、H344、H355、H359、H375、H386、H389、H392、H398、H404、H420、H421、和H438。
在某些实施方案中，本文提供包含在选自以下Chothia残基的一个或多个位置的一个或多个非天然氨基酸的抗体：H005、H084、H118、H132、H136、H239、H293、H334、H342、H355、H359、H389和H404。
在某些实施方案中，本文提供包含在选自相当于以下残基的Kabat残基的一个或多个位置的一个或多个非天然氨基酸的抗体：H292-H301、H303、和H305。
在某些实施方案中，本文提供包含在选自以下Chothia残基的一个或多个位置的一个或多个非天然氨基酸的抗体：H023、H074、H119、H134、H135、H137、H139、H160、H162、H165、H172、H191、H194、H241、H246、H267、H268、H269、H270、H271、H272、H274、H275、H280、H281、H282、H283、H286、H289、H292、H294、H295、H296、H297、H298、H299、H300、H301、H303、H305、H317、H320、H324、H326、H327、H329、H330、H332、H333、H335、H337、H339、H342、H344、H355、H375、H386、H392、H398、H420、H421、H340、H404、和H438。
某些实施方案中，本文提供包含在选自以下Chothia残基的一个或多个位置的一个或多个非天然氨基酸的抗体：H042、H065、H138、H155、H174、H176、H177、H219、H238、H243、H262、H264、H265、H278、H342、H356、H358、H360、H383、H384、H404、和H436。
在某些实施方案中，本文提供包含在选自以下根据Kabat或Chothia编号方案的残基的一个或多个位置的一个或多个非天然氨基酸的抗体：H005、H023、H084、H118、H119、H132、H134、H136、H137、H160、H162、H172、H239、H241、H267、H269、H270、H271、H272、H282、H286、H292、H293、H296、H298、H329、H330、H334、H335、H340、H355、H359、H386、H389、H404、H420、H421、H438、和H342。
在某些实施方案中，本文提供包含在选自以下根据Kabat或Chothia编号方案的残基的一个或多个位置的一个或多个非天然氨基酸的抗体：L043、L049、L056、L057、L060、L067、L068、L109、L112、L114、L144、L153、L156、L157、L168、L184、L202、L203、和L206。在某些实施方案中，本文提供包含在选自以下根据Kabat或Chothia编号方案的残基的一个或多个位置的一个或多个非天然氨基酸的抗体：L043、L049、L056、L057、L060、L067、L068、L109、L112、L114、L144、L153、L156、L168、L184、L202、和L203。某些实施方案中，本文提供包含在选自以下根据Kabat或Chothia编号方案的残基的一个或多个位置的一个或多个非天然氨基酸的抗体：L043、L049、L056、L057、L060、L067、L068、L109、L144、L153、L156、L184、L202、和L203。某些实施方案中，本文提供包含在选自以下根据Kabat或Chothia编号方案的残基的一个或多个位置的一个或多个非天然氨基酸的抗体：L049、L056、L057、L060、L067、L109、L153、L202、和L203。
在某些实施方案中，本文提供包含在选自以下根据Kabat或Chothia编号方案的残基的一个或多个位置的一个或多个非天然氨基酸的抗体：H023、H084、H118、H119、H135、H136、H137、H160、H161、H162、H164、H195、H197、H219、H282、H289、H296、H330、H335、H361、H400、H404、H422、H440、H260、H267、H268、H272、H274、H292、H293、H297、H298、H303、H305、H332、H333、H334、H340、H341、H342、H343、H355、H362、H386、H392、H404、H424、H438、H442和H443。在某些实施方案中，本文提供包含在选自以下根据Kabat或Chothia编号方案的残基的一个或多个位置的一个或多个非天然氨基酸的抗体：H023、H084、H118、H119、H135、H136、H137、H160、H161、H162、H164、H195、H197、H219、H282、H296、H335、H361、H422、H440、H267、H272、H274、H293、H297、H298、H303、H305、H334、H340、H341、H342、H343、H355、H362、H392、H404、H424、H438、H442和H443。在某些实施方案中，本文提供包含在选自以下根据Kabat或Chothia编号方案的残基的一个或多个位置的一个或多个非天然氨基酸的抗体：H023、H084、H118、H119、H135、H136、H137、H160、H161、H162、H195、H197、H219、H282、H296、H422、H440、H267、H272、H293、H297、H298、H303、H305、H334、H340、H341、H342、H355、H392、H404、H424、H438、H442和H443。在某些实施方案中，本文提供包含在选自以下根据Kabat或Chothia编号方案的残基的一个或多个位置的一个或多个非天然氨基酸的抗体：H023、H084、H118、H119、H135、H136、H160、H162、H195、H219、H282、H296、H267、H293、H297、H298、H303、H305、H334、H340、H341、H392、和H438、H442。
在某些实施方案中，本文提供包含在选自以下根据Kabat或Chothia编号方案的残基的一个或多个位置的一个或多个非天然氨基酸的抗体：H042、H003、H007、H014、H016、H019、H025、H040、H043、H051、H052、H053、H056、H070、H082A、H098、H100、H110、H112、H121、H180、H184、H190、H192、H214、H216、H221、H222、H225、H227、H230、H231、H232、和H236。在某些实施方案中，本文提供包含在选自以下根据Kabat或Chothia编号方案的残基的一个或多个位置的一个或多个非天然氨基酸的抗体：H042、H003、H007、H014、H016、H019、H025、H040、H043、H052、H053、H056、H070、H082A、H100、H110、H112、H121、H180、H190、H192、H214、H216、H221、H222、H225、H227、H230、H231、H232、和H236。在某些实施方案中，本文提供包含在选自以下根据Kabat或Chothia编号方案的残基的一个或多个位置的一个或多个非天然氨基酸的抗体：H042、H003、H007、H014、H016、H019、H025、H040、H043、H052、H070、H082A、H100、H110、H112、H121、H180、H190、H192、H214、H216、H221、H222、H225、H227、H230、H231、H232、和H236。在某些实施方案中，本文提供包含在选自以下根据Kabat或Chothia编号方案的残基的一个或多个位置的一个或多个非天然氨基酸的抗体：H007、H014、H019、H025、H040、H043、H052、H070、H100、H110、H112、H121、H180、H214、H216、H222、H227、H230、H231、H232、和H236。
在某些实施方案中，本文提供包含在选自以下根据Kabat或Chothia编号方案的残基的一个或多个位置的一个或多个非天然氨基酸的抗体：(-)L001、L003、L005、L007、L008、L009、L010、L016、L017、L018、L020、L022、L026、L027、L045、L058、L063、L065、L066、L070、L077、L079、L107、L138、L142、L143、L152、L171、L182、L188、L199、和L201。在某些实施方案中，本文提供包含在选自以下根据Kabat或Chothia编号方案的残基的一个或多个位置的一个或多个非天然氨基酸的抗体：-1、L003、L005、L007、L008、L009、L010、L016、L017、L018、L020、L022、L026、L027、L045、L058、L063、L065、L066、L070、L077、L079、L107、L142、L143、L152、L171、L182、L188、L199、和L201。在某些实施方案中，本文提供包含在选自以下根据Kabat或Chothia编号方案的残基的一个或多个位置的一个或多个非天然氨基酸的抗体：(-)L001、L003、L005、L007、L008、L009、L016、L017、L018、L020、L022、L026、L027、L045、L058、L063、L065、L066、L070、L077、L079、L107、L142、L152、L171、L182、L188、和L199。在某些实施方案中，本文提供包含在选自以下根据Kabat或Chothia编号方案的残基的一个或多个位置的一个或多个非天然氨基酸的抗体：(-1)L005、L007、L008、L016、L017、L018、L020、L022、L027、L045、L058、L063、L077、L079、L107、L142、L152、L182、L188、和L199。在某些实施方案中，本文提供包含在选自以下根据Kabat或Chothia编号方案的残基的一个或多个位置的一个或多个非天然氨基酸的抗体：(-)L001、L016、L063、和L199。
在某些实施方案中，本文提供包含在选自以下根据Kabat或Chothia编号方案的残基的一个或多个位置的一个或多个非天然氨基酸的抗体：H019、H025、H051、H070、H098、H110、H112、H121、H136、H180、H187、H190、H214、H216、H221、和H222。
在某些实施方案中，本文提供包含在选自以下根据Kabat或Chothia编号方案的残基的一个或多个位置的一个或多个非天然氨基酸的抗体：(-)L001、L007、L008、L016、L022、L063、L014、L070、L138、L142、L143和L152。
在某些实施方案中，本文提供包含在选自以下根据Kabat或Chothia编号方案的残基的一个或多个位置的一个或多个非天然氨基酸的抗体：H019、H025、H051、H070、H077、H079、H098、H110、H112、H121、H136、H180、H187、H190、H214、H216、H221、和H222。
在某些实施方案中，本文提供包含在选自以下根据Kabat或Chothia编号方案的残基的一个或多个位置的一个或多个非天然氨基酸的抗体：(-)L001、L007、L008、L016、L022、L063、L070、L138、L142、L143、L152和L201。
也可以相对于参考抗体的多肽链的氨基酸序列来识别所述位点特异性位置。例如，在SEQ ID NO:1中提供了参考重链的氨基酸序列。在所述参考重链中，所述位点特异性位置位于残基5、23、42、66、75、88、121、122、135、137、138、139、140、141、142、158、163、165、168、175、177、179、180、194、197、222、241、242、244、246、249、265、267、268、270、271、272、273、274、275、277、278、281、283、284、285、286、289、292、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、306、308、320、323、327、329、330、332、333、335、336、337、338、340、342、343、345、347、358、359、361、362、363、378、386、387、389、392、395、401、407、423、424、439和441。换而言之，本文提供包含在一个或多个位置的一个或多个非天然氨基酸的抗体，所述一个或多个位置选自相当于以下根据SEQ ID NO:1的代表性重链多肽的残基的位置：5、23、42、66、75、88、121、122、135、137、138、139、140、141、142、158、163、165、168、175、177、179、180、194、197、222、241、242、244、246、249、265、267、268、270、271、272、273、274、275、277、278、281、283、284、285、286、289、292、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、306、308、320、323、327、329、330、332、333、335、336、337、338、340、342、343、345、347、358、359、361、362、363、378、386、387、389、392、395、401、407、423、424、439和441。
在某些实施方案中，本文提供包含在一个或多个位置的一个或多个非天然氨基酸的抗体，所述一个或多个位置选自相当于以下根据SEQ IDNO:1的代表性重链多肽的残基的位置：5、23、75、88、121、122、135、137、138、139、140、142、163、165、168、175、194、197、242、244、249、270、271、272、273、274、275、277、278、283、284、285、286、289、292、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、306、308、320、323、327、329、330、332、333、335、336、337、338、340、342、343、345、347、358、362、378、389、392、395、401、407、423、424、和441。
在某些实施方案中，本文提供包含在一个或多个位置的一个或多个非天然氨基酸的抗体，所述一个或多个位置选自相当于以下根据SEQ IDNO:1的代表性重链多肽的残基的位置：5、23、88、121、122、135、137、138、139、140、163、165、168、175、242、244、270、273、274、275、285、289、295、296、299、300、301、332、333、337、338、343、345、358、362、389、407、423、424、和441。
在某些实施方案中，本文提供包含在一个或多个位置的一个或多个非天然氨基酸的抗体，所述一个或多个位置选自相当于以下根据SEQ IDNO:1的代表性重链多肽的残基的位置：5、88、121、135、139、242、296、337、358、362、和392。
在某些实施方案中，本文提供包含在一个或多个位置的一个或多个非天然氨基酸的抗体，所述一个或多个位置选自相当于以下根据SEQ IDNO:1的代表性重链多肽的残基的位置：23、75、122、137、138、140、142、163、165、168、175、194、197、244、249、270、271、272、273、274、275、277、278、283、284、285、286、289、292、295、297、298、299、300、301、302、303、304、306、308、320、323、327、329、330、332、333、335、336、338、340、342、343、345、347、358、378、389、395、401、407、423、424、和441。
在某些实施方案中，本文提供包含在一个或多个位置的一个或多个非天然氨基酸的抗体，所述一个或多个位置选自相当于以下根据SEQ IDNO:1的代表性重链多肽的残基的位置：42、66、141、158、177、179、180、222、241、246、265、267、268、281、359、361、363、386、387、407、和439。
在某些实施方案中，本文提供包含在一个或多个位置的一个或多个非天然氨基酸的抗体，所述一个或多个位置选自相当于以下根据SEQ IDNO:1的代表性重链多肽的残基的位置：292-301、303、和305。
在某些实施方案中，本文提供包含在一个或多个位置的一个或多个非天然氨基酸的抗体，所述一个或多个位置选自相当于以下根据SEQ IDNO:1的代表性重链多肽的残基的位置：23、88、121、122、138、139、140、163、164、165、167、198、200、222、285、292、299、333、338、364、403、407、425、443、263、270、271、275、277、295、296、300、301、306、308、335、336、337、343、344、345、346、358、365、389、395、407、427、441、445、和446。
在某些实施方案中，本文提供包含在一个或多个位置的一个或多个非天然氨基酸的抗体，所述一个或多个位置选自相当于以下根据SEQ IDNO:1的代表性重链多肽的残基的位置：23、88、121、122、138、139、140、163、164、165、167、198、200、222、285、299、338、364、425、443、270、275、277、295、296、300、301、306、308、337、343、344、345、346、358、365、395、407、427、441、445、和446。
在某些实施方案中，本文提供包含在一个或多个位置的一个或多个非天然氨基酸的抗体，所述一个或多个位置选自相当于以下根据SEQ IDNO:1的代表性重链多肽的残基的位置：23、88、121、122、138、139、140、163、164、165、167、198、200、222、285、299、364、425、443、270、275、296、300、301、306、308、337、343、344、345、358、365、395、407、427、441、445、和446。
在某些实施方案中，本文提供包含在一个或多个位置的一个或多个非天然氨基酸的抗体，所述一个或多个位置选自相当于以下根据SEQ IDNO:1的代表性重链多肽的残基的位置：23、88、121、122、138、139、140、163、164、165、198、200、222、285、299、425、443、270、275、296、300、301、306、308、337、343、344、345、358、395、407、427、441、445、和446。
在某些实施方案中，本文提供包含在一个或多个位置的一个或多个非天然氨基酸的抗体，所述一个或多个位置选自相当于以下根据SEQ IDNO:1的代表性重链多肽的残基的位置：23、88、121、122、138、139、163、165、198、222、285、299、270、296、300、301、306、308、337、343、344、395、407、和441。
在某些实施方案中，本文提供包含在一个或多个位置的一个或多个非天然氨基酸的抗体，所述一个或多个位置选自相当于以下根据SEQ IDNO:1的代表性重链多肽的残基的位置：42、3、7、14、16、19、25、40、43、51、52、54、57、71、84、102、104、114、119、124、183、187、193、195、217、219、224、225、228、230、233、234、235和239。
在某些实施方案中，本文提供包含在一个或多个位置的一个或多个非天然氨基酸的抗体，所述一个或多个位置选自相当于以下根据SEQ IDNO:1的代表性重链多肽的残基的位置：42、3、7、14、16、19、25、40、43、52、54、57、71、84、104、114、119、124、183、193、195、217、219、224、225、228、230、233、234、235和239。
在某些实施方案中，本文提供包含在一个或多个位置的一个或多个非天然氨基酸的抗体，所述一个或多个位置选自相当于以下根据SEQ IDNO:1的代表性重链多肽的残基的位置：7、14、19、25、40、43、52、71、104、114、119、124、183、195、217、219、230、233、234、235、和239。
在某些实施方案中，本文提供包含在一个或多个位置的一个或多个非天然氨基酸的抗体，所述一个或多个位置选自相当于以下根据SEQ IDNO:2的代表性轻链多肽的残基的位置：-1、3、5、7、8、9、10、16、17、18、20、22、26、27、45、58、63、65、66、70、77、79、107、138、142、143、152、171、182、188、199、和201。
在某些实施方案中，本文提供包含在一个或多个位置的一个或多个非天然氨基酸的抗体，所述一个或多个位置选自相当于以下根据SEQ IDNO:2的代表性轻链多肽的残基的位置：-1、3、5、7、8、9、16、17、18、20、22、26、27、45、58、63、65、66、70、77、79、107、142、143、152、171、182、188、199、和201。
在某些实施方案中，本文提供包含在一个或多个位置的一个或多个非天然氨基酸的抗体，所述一个或多个位置选自相当于以下根据SEQ IDNO:2的代表性轻链多肽的残基的位置：-1、3、5、7、8、9、16、17、18、20、22、26、27、45、58、63、65、66、70、77、79、107、142、152、171、182、188、和199。
在某些实施方案中，本文提供包含在一个或多个位置的一个或多个非天然氨基酸的抗体，所述一个或多个位置选自相当于以下根据SEQ IDNO:2的代表性轻链多肽的残基的位置：-1、5、7、8、16、17、18、20、22、27、45、58、63、77、79、107、142、152、182、188、和199。
在某些实施方案中，本文提供包含在一个或多个位置的一个或多个非天然氨基酸的抗体，所述一个或多个位置选自相当于以下根据SEQ IDNO:2的代表性轻链多肽的残基的位置：-1、16、63和199。
在某些实施方案中，本文提供包含在一个或多个位置的一个或多个非天然氨基酸的抗体，所述一个或多个位置选自相当于以下根据SEQ IDNO:1的代表性重链多肽的残基的位置：19、25、51、71、102、114、119、124、139、183、187、193、217、219、224、和225。
在某些实施方案中，本文提供包含在一个或多个位置的一个或多个非天然氨基酸的抗体，所述一个或多个位置选自相当于以下根据SEQ IDNO:2的代表性轻链多肽的残基的位置：-1、7、8、16、22、63、14、70、138、142、143和152。
在某些实施方案中，本文提供包含在一个或多个位置的一个或多个非天然氨基酸的抗体，所述一个或多个位置选自相当于以下根据SEQ IDNO:1的代表性重链多肽的残基的位置：19、25、51、71、78、80、102、114、119、124、139、183、187、193、217、219、224、和225。
在某些实施方案中，本文提供包含在一个或多个位置的一个或多个非天然氨基酸的抗体，所述一个或多个位置选自相当于以下根据SEQ IDNO:2的代表性轻链多肽的残基的位置：-1、7、8、16、22、63、70、138、142、143、152、和201。
在某些实施方案中，本文提供包含在一个或多个位置的一个或多个非天然氨基酸的抗体，所述一个或多个位置选自相当于以下根据SEQ IDNO:2的代表性轻链多肽的残基的位置：43、49、56、57、60、67、68、109、112、114、144、153、156、157、168、184、202、203、和206。
在某些实施方案中，本文提供包含在一个或多个位置的一个或多个非天然氨基酸的抗体，所述一个或多个位置选自相当于以下根据SEQ IDNO:2的代表性轻链多肽的残基的位置：43、49、56、57、60、67、68、109、112、144、153、156、168、184、202、和203。
在某些实施方案中，本文提供包含在一个或多个位置的一个或多个非天然氨基酸的抗体，所述一个或多个位置选自相当于以下根据SEQ IDNO:2的代表性轻链多肽的残基的位置：43、49、56、57、60、67、68、109、144、153、156、184、202、和203。
在某些实施方案中，本文提供包含在一个或多个位置的一个或多个非天然氨基酸的抗体，所述一个或多个位置选自相当于以下根据SEQ IDNO:2的代表性轻链多肽的残基的位置：49、56、57、60、67、109、153、202、和203。
在某些实施方案中，所述抗体包含可以通过下述式(I)描述的多肽链：
Xaa1-...-(Naap(i))n-...-Xaaq(I)。
在式(I)中，各Xaa表示任意同一性的多肽链中的氨基酸。换而言之，各Xaa可以是通常为任意天然存在的氨基酸或其变体的任意氨基酸。各Xaa的右边的上标表示在多肽链的一级序列内的氨基酸的位置。Xaa1表示多肽链中的第一个或N末端的氨基酸，且Xaaq表示多肽链中的最后一个或C末端的氨基酸。变量q是等于多肽链中的氨基酸总数目的整数。各Naa表示在多肽链内的非天然氨基酸。在下文的部分中描述了有用的非天然氨基酸。整数n表示多肽链中的非天然氨基酸的数目。在典型的实施方案中，n是大于1的整数。各整数p(i)大于1且小于q，且变量i是从1到n变化的整数。各整数p(i)表示用于相应的Naa的氨基酸序列中的位点特异性位置。根据本文所描述的技术，各位点特异性位置p(i)对于以非天然氨基酸(诸如Naap(i))置换天然存在的氨基酸是最佳的。
如在实施例中所提供的、来自TAG筛选的数据分析使得能够进行位点选择，所述位点是用于基于细胞杀伤、表达水平、药物与抗体的比率、溶剂可及性和(如果有的话)热稳定性来制备ADC的理想的候选者。最优选的位点具有比其他受测试的变体更低的溶剂可及性、和更高的热稳定性。以下表I中列出了用于nnAA的并入的优选位点。
表I:用于nnAA的并入的优选位点
nnAA的位点 偏好
HC-F404 最优选的
HC-K121 最优选的
HC-S136 最优选的
HC-Y180 最优选的
HC-F241 最优选的
LC-T22 最优选的
LC-S7 最优选的
LC-N152 最优选的
HC-S25 更优选的
HC-A40 更优选的
HC-S119 更优选的
HC-S190 更优选的
HC-K222 更优选的
HC-R19 优选的
HC-Y52 优选的
HC-S70 优选的
相应地，在某些实施方案中，本文提供包含在一个或多个位置的一个或多个非天然氨基酸的抗体或其翻译后修饰的变体，所述一个或多个位置选自由以下的根据Kabat或Chothia编号方案的重链或轻链残基所构成的组：HC-F404、HC-K121、HC-Y180、HC-F241、LC-T22、LC-S7、LC-N152、HC-S136、HC-S25、HC-A40、HC-S119、HC-S190、HC-K222、HC-R19、HC-Y52、或HC-S70。
在某些实施方案中，本文提供包含在一个或多个位置的一个或多个非天然氨基酸的抗体或其翻译后修饰的变体，所述一个或多个位置选自由以下的根据Kabat或Chothia编号方案的重链或轻链残基所构成的组：HC-F404、HC-K121、HC-Y180、HC-F241、LC-T22、LC-S7、LC-N152、HC-S136、HC-S25、HC-A40、HC-S119、HC-S190、和HC-K222。
在某些实施方案中，本文提供包含在一个或多个位置的一个或多个非天然氨基酸的抗体或其翻译后修饰的变体，所述一个或多个位置选自由以下的根据Kabat或Chothia编号方案的重链或轻链残基所构成的组：HC-F404、HC-K121、HC-Y180、HC-F241、LC-T22、LC-S7、LC-N152、和HC-S136。
在某些实施方案中，本文进一步提供上述抗体的保守性修饰的变体。抗体的保守性修饰的变体包含一个或多个插入、删除或置换，所述插入、删除或置换在本领域技术人员进行评估时，不影响所述抗体的结构和/或功能。在某些实施方案中，保守性修饰的变体包含20个或更少的氨基酸的插入、删除或置换。在某些实施方案中，保守性修饰的变体包含15个或更少的氨基酸的插入、删除或置换。在某些实施方案中，保守性修饰的变体包含10个或更少的氨基酸的插入、删除或置换。在某些实施方案中，保守性修饰的变体包含9个或更少的氨基酸的插入、删除或置换。在某些实施方案中，保守性修饰的变体包含8个或更少的氨基酸的插入、删除或置换。在某些实施方案中，保守性修饰的变体包含7个或更少的氨基酸的插入、删除或置换。在某些实施方案中，保守性修饰的变体包含6个或更少的氨基酸的插入、删除或置换。在某些实施方案中，保守性修饰的变体包含5个或更少的氨基酸的插入、删除或置换。在某些实施方案中，保守性修饰的变体包含4个或更少的氨基酸的插入、删除或置换。在某些实施方案中，保守性修饰的变体包含3个或更少的氨基酸的插入、删除或置换。在某些实施方案中，保守性修饰的变体包含2个或更少的氨基酸的插入、删除或置换。在某些实施方案中，保守性修饰的变体包含1个氨基酸的插入、删除或置换。在特定的实施方案中，所述置换是保守性的，如以上所描述的，在相同的种类内置换氨基酸。
在某些实施方案中，可以修饰所述抗体以调整结构、稳定性和/或活性。在这样的实施方案中，所述修饰可以是保守性的或非保守性的。所述修饰只需要适于实践者执行所述方法和使用本文所描述的组合物。在某些实施方案中，所述修饰降低了但没有消除抗原结合亲和力。在某些实施方案中，所述修饰提高了抗原结合亲和力。在某些实施方案中，所述修饰增强了所述抗体的结构或稳定性。在某些实施方案中，所述修饰减弱了但没有消除所述抗体的结构或稳定性。在某些实施方案中，修饰的变体包括20个或更少的氨基酸的插入、删除或置换。在某些实施方案中，经修饰的变体包括20个或更少的氨基酸的插入、删除或置换。在某些实施方案中，经修饰的变体包括15个或更少的氨基酸的插入、删除或置换。在某些实施方案中，经修饰的变体包括10个或更少的氨基酸的插入、删除或置换。在某些实施方案中，经修饰的变体包括9个或更少的氨基酸的插入、删除或置换。在某些实施方案中，经修饰的变体包括8个或更少的氨基酸的插入、删除或置换。在某些实施方案中，经修饰的变体包括7个或更少的氨基酸的插入、删除或置换。在某些实施方案中，经修饰的变体包括6个或更少的氨基酸的插入、删除或置换。在某些实施方案中，经修饰的变体包括5个或更少的氨基酸的插入、删除或置换。在某些实施方案中，经修饰的变体包括4个或更少的氨基酸的插入、删除或置换。在某些实施方案中，经修饰的变体包括3个或更少的氨基酸的插入、删除或置换。在某些实施方案中，经修饰的变体包括2个或更少的氨基酸的插入、删除或置换。在某些实施方案中，经修饰的变体包括1个或更少的氨基酸的插入、删除或置换。
翻译后修饰的变体也在范围内。可以以本领域技术人员所公认的任意方式对本文所提供的任意抗体进行翻译后修饰。用于抗体的典型的翻译后修饰包括链间的二硫键、链内的二硫键、N-连接糖基化和蛋白酶解。本文还提供了其他翻译后修饰的抗体，所述翻译后修饰的抗体具有诸如磷酸化、O-连接糖基化、甲基化、乙酰化、脂化、GPI锚定、豆蔻酰化和异戊烯化等修饰。所述翻译后修饰可以在活体内、体外或其它方式的制备过程中发生。在某些实施方案中，所述翻译后修饰可以是实践者例如利用本文提供的方法的有意的修饰。
融合了进一步的肽或多肽的抗体进一步包括在该范围内。示例性的融合包括但不限于例如在其中蛋氨酸连接到来源于重组表达的抗体的N末端的甲硫氨酰基抗体，为了纯化目的的融合(包括但不限于融合到多组氨酸或亲和性抗原表位)、为了连接到其它生物活性分子目的的融合、与血清白蛋白结合肽的融合、以及与诸如血清白蛋白等血清蛋白质的融合。所述抗体可以包含蛋白酶切割序列、反应基团、抗体结合域(包括但不限于FLAG或多组氨酸)或其他基于亲和力的序列(包括但不限于FLAG、多组氨酸、GST等)。所述抗体也可以包含改善所述抗体的检测(包括但不限于GFP)、纯化或其他特征的连接分子(包括但不限于生物素)。在某些实施方案中，所述抗体包含促进全长抗体的纯化的C末端亲和性序列。在某些实施方案中，这样的C末端亲和性序列是多组氨酸序列，例如6-组氨酸序列。
所述抗体可以具有本领域技术人员所公认的任意抗体形式。所述抗体可以包含单个的多肽链—单个的重链或单个的轻链。所述抗体也可以形成本领域技术人员所公认的多聚体，所述多聚体包括同二聚体(homodimers)、异二聚体、同多聚体、和异多聚体。这些多聚体可以是连接的或未连接的。有用的连接(linkage)包括通常用于抗体分子的链间二硫键。所述多聚体还可以通过其他氨基酸(包括根据本描述所引入的非天然氨基酸)进行连接。所述抗体可以是诸如任意种类或子类的免疫球蛋白，包括IgA、IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgG、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4和IgM。所述抗体可以是包括Fv、Fc、Fab、以及(Fab')2和scFv的任意抗体片段的形式。
所述抗体可以进一步是糖基化的或非糖基化的。相应地，在某些实施方案中，所述抗体是糖基化的。在某些实施方案中，所述抗体是非糖基化的。例如，可以如本文所提供的实施例中所述地、或通过本领域技术人员已知的细菌表达系统来制备包含非天然氨基酸的非糖基化的抗体。例如，可以如Axup等，2012,Proc.Nat.Acad.Sci.USA 109(40):16101-16106中所描述地来制备包含非天然氨基酸的糖基化的抗体。
本文还提供偶联到一个或多个偶联部分的抗体。所述偶联部分可以是本领域技术人员认为有用的任意偶联部分。例如，所述偶联部分可以是能够改善体外或活体内的抗体的稳定性的聚合物，诸如聚乙二醇。所述偶联部分可以具有治疗活性，从而产生抗体-药物偶联物。所述偶联部分可以是对靶细胞有害的分子有效载荷。所述偶联部分可以是对检测或诊断有用的标记物。在某些实施方案中，所述偶联部分经由直接的共价键连接到所述抗体。在某些实施方案中，所述偶联部分经由连接基团连接到所述抗体。在有利的实施方案中，经由所述抗体的一个非天然氨基来附接(attached)所述偶联部分或所述连接基团。在下文的部分中论述了示例性的偶联部分和连接基团。
非天然氨基酸
所述非天然氨基酸可以是本领域技术人员已知的任意非天然氨基酸。在一些实施方案中，所述非天然编码的氨基酸包含官能团。所述官能团可以是本领域技术人员已知的任意官能团。在某些实施方案中，所述官能团是标记物、极性基团、非极性基团或反应基团。
对于在抗体链的位点特异性位置将官能团进一步连接到所述抗体，反应基团是特别有利的。在某些实施方案中，所述反应基团选择由氨基、羧基、乙酰基、肼基、酰肼基、半卡肼基(semicarbazido)、巯基(sulfanyl)、叠氮基和炔基构成的组。
在某些实施方案中，所述氨基酸残基是根据以下任一式：
本领域技术人员将理解抗体通常包含L-氨基酸。然而，利用非天然氨基酸，本发明的方法和组合物提供给实践者在位点特异性位置使用L-非天然氨基酸、D-非天然氨基酸、或外消旋非天然氨基酸的能力。在某些实施方案中，本文所描述的非天然氨基酸包括D-型天然氨基酸和外消旋型天然氨基酸。
在上述式中，波浪线表示连接到抗体的多肽链的剩余部分的键。这些非天然氨基酸可以并入到多肽链，正如天然氨基酸并入到相同的多肽链一样。在某些实施方案中，非天然氨基酸经由如式中所指示的酰胺键而并入到所述多肽链。
在上述式中，R表示任意官能团而没有限制，只要所述氨基酸残基不同于天然氨基酸残基即可。在某些实施方案中，R可以是疏水基团、亲水基团、极性基团、酸性基团、碱性基团、螯合基团、反应基团、治疗性部分或标记部分。在某些实施方案中，R选自由R1NR2R3、R1C(＝O)R2、R1C(＝O)OR2、R1N3、R1C(≡CH)所构成的组。在这些实施方案中，R1选自由键、亚烷基、亚杂烷基、亚芳基、亚杂芳基所构成的组。R2和R3各自独立地选自由氢、烷基和杂烷基所构成的组。
在一些实施方案中，所述非天然编码的氨基酸包括侧链官能团，所述侧链官能团有效和选择性地与在20种常见的氨基酸中不存在的官能团(包括但不限于叠氮基、酮、醛、和氨基氧基(aminooxy))反应，以形成稳定的偶联物。例如，包含含有叠氮基官能团的非天然编码的氨基酸的抗原结合多肽能够与聚合物(包括但不限于聚乙二醇)反应，或替代性地与含有炔部分的第二多肽反应，以形成稳定的偶联物，所述稳定的偶联物源于形成Huisgen[3+2]环加成产物的叠氮官能团与炔官能团的选择性反应。
适用于本发明的、且有助于与水溶性聚合物的反应的示例性的非天然编码的氨基酸包括但不限于具有羰基、氨基氧基、肼、酰肼、氨基脲、叠氮和炔官能团的非天然编码的氨基酸。在一些实施方案中，非天然编码的氨基酸包含糖部分。这样的氨基酸的实例包括N-乙酰基-L-氨基葡萄糖基-L-丝氨酸、N-乙酰基-L-氨基半乳糖基-L-丝氨酸、N-乙酰基-L-氨基葡萄糖基-L-苏氨酸、N-乙酰基-L-氨基葡萄糖基-L-天冬酰胺和O-甘露糖胺基-L-丝氨酸。这样的氨基酸的实例包括其中在氨基酸和糖之间的天然存在的N-或O-连接由共价连接进行替换的实例，所述共价连接是天然不常见的，包括但不限于亚烷基、肟、硫醚、酰胺等。这样的氨基酸的实例还包括在天然存在的蛋白质中不常见的糖类，诸如2-脱氧-葡萄糖、2-脱氧半乳糖等。
本文所提供的许多非天然编码的氨基酸是市场上可买到的，例如，自Sigma-Aldrich(St.Louis,Mo.,美国)、Novabiochem(EMD Biosciences的分公司,Darmstadt,德国)、或Peptech(Burlington,Mass.,美国)。如本文所提供地或利用本领域技术人员已知的标准方法来任选地合成市场上买不到的那些。对于有机合成技术，参见例如Fessendon和Fessendon的OrganicChemistry(1982,第二版,Willard Grant出版社,Boston Mass.)；March的Advanced Organic Chemistry(第三版,1985,Wiley和Sons,纽约)；和Carey和Sundberg的Advanced Organic Chemistry(第三版,Parts A和B,1990,Plenum出版社,纽约)。还可以参见美国专利申请出版物2003/0082575和2003/0108885，通过引用将其并入本文。除了含有新的侧链的非天然氨基酸之外，可以适用于本发明的非天然氨基酸还任选地包含经修饰的主链结构(backbone structure)，所述经修饰的主链结构包括但不限于如式II和III的结构所示出的：
其中，Z通常包括OH、NH2、SH、NH–R'、或S–R'；可以是相同或不同的X和Y通常包括S或O，且任选地是相同或不同的R和R'通常选自用于具有式I的非天然氨基酸的上述的R基团的相同的组成清单(list)以及氢。例如，本发明的非天然氨基酸任选地包含如式II和式III所示出的氨基或羧基的置换。这类的非天然氨基酸包括但不限于具有包括但不限于相当于常见的20种天然氨基酸的侧链或非天然的侧链的α-羟基酸、α-硫代酸、α-氨基硫代羧酸酯(α-aminothiocarboxylate)。此外，在α-碳上的置换包括但不限于L-氨基酸、D-氨基酸、或α-α-双取代的氨基酸，诸如D-谷氨酸、D-丙氨酸、D-甲基-O-酪氨酸、氨基丁酸等。其他结构的替换物包括环状氨基酸(诸如脯氨酸类似物、以及3、4、6、7、8和9元环脯氨酸类似物)、P和y氨基酸(诸如取代的β-丙氨酸和γ-氨基丁酸)。
许多非天然氨基酸是基于诸如酪氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸等天然氨基酸，并适合于在本发明中使用。酪氨酸类似物包括但不限于对位取代的酪氨酸、邻位取代的酪氨酸和间位取代的酪氨酸，其中所述取代的酪氨酸包括但不限于酮基(包括但不限于乙酰基)、苯甲酰基、氨基、肼、羟胺(hydroxyamine)、硫醇基、羧基、异丙基、甲基、C6-C20直链或支化的烃、饱和或不饱和的烃、O-甲基、聚醚基、硝基、炔基等。此外，还可以考虑多取代的芳环。适用于本发明的谷氨酰胺类似物包括但不限于α-羟基衍生物、γ-取代的衍生物、环状衍生物和酰胺取代的谷氨酰胺衍生物。适用于本发明的苯丙氨酸类似物的实例包括但不限于对位取代的苯丙氨酸、邻位取代的苯丙氨酸和间位取代的苯丙氨酸，其中所述取代基包括但不限于羟基、甲氧基、甲基、烯丙基、醛、叠氮基、碘、溴、酮基(包括但不限于乙酰基)、苯甲酰基、炔基等。适用于本发明的非天然氨基酸的具体的实例包括但不限于对乙酰基-L-苯丙氨酸、O-甲基-L-酪氨酸、L-3-(2-萘基)丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、O-4-烯丙基-L-酪氨酸、4-丙基-L-酪氨酸、三-O-乙酰基-GlcNAcβ-丝氨酸、L-多巴、氟化的苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸对叠氮基-L-苯丙氨酸、对酰基-L-苯丙氨酸、对苯甲酰-L-苯丙氨酸、L-磷酸丝氨酸、膦酰基丝氨酸(phosphonoserine)、膦酰基酪氨酸(phosphonotyrosine)、对碘-苯丙氨酸、对溴苯丙氨酸、对氨基-L-苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、和对炔丙基氧基-苯丙氨酸等。在例如标题为“Invivo incorporation of unnatural amino acids”的WO 2002/085923中提供了适用于本发明的各种非天然氨基酸的结构的实例。对于附加的蛋氨酸类似物，还可以参见Kiick等,(2002)Incorporation of azides into recombinant proteinsfor chemoselective modification by the Staudinger ligation,PNAS 99:19-24。
适用于本发明的许多非天然氨基酸是在市场上可买到的，例如自Sigma(美国)或Aldrich(Milwaukee,Wis.,美国)。如本文所提供地、或如各种出版物中所提供地、或利用本领域技术人员已知的标准方法来任选地合成市场上买不到的那些非天然氨基酸。对于有机合成技术，参见例如Fessendon和Fessendon的Organic Chemistry(1982,第二版,Willard Grant出版社,Boston Mass.)；March的Advanced Organic Chemistry(第三版,1985,Wiley和Sons,纽约)；以及Carey和Sundberg的Advanced OrganicChemistry(第三版,部分A和B,1990,Plenum出版社,纽约)。描述非天然氨基酸的合成的另外的出版物包括例如标题为“In vivo incorporation ofUnnatural Amino Acids”的WO 2002/085923；Matsoukas等，(1995)J.Med.Chem.,38,4660-4669；King,F.E.&Kidd,D.A.A.(1949)A New Synthesis ofGlutamine and ofγ-Dipeptides of Glutamic Acid from Phthylated Intermediates.J.Chem.Soc.,3315-3319；Friedman,O.M.&Chatterrji,R.(1959)Synthesisof Derivatives of Glutamine as Model Substrates for抗Tumor Agents.J.Am.Chem.Soc.81,3750-3752；Craig,J.C.等.(1988)Absolute Configuration ofthe Enantiomers of 7-Chloro-4[[4-(diethylamino)-1-methylbutyl]amino]quinoline(Chloroquine).J.Org.Chem.53,1167-1170；Azoulay,M.,Vilmont,M.&Frappier,F.(1991)Glutamine analogues as Potential Antimalarials,Eur.J.Med.Chem.26,201-5；Koskinen,A.M.P.&Rapoport,H.(1989)Synthesis of 4-Substituted Prolinesas Conformationally Constrained Amino Acid Analogues.J.Org.Chem.54,1859-1866；Christie,B.D.&Rapoport,H.(1985)Synthesis of Optically PurePipecolates from L-Asparagine.Application to the Total Synthesis of(+)-Apovincamine through Amino Acid Decarbonylation and Iminium IonCyclization.J.Org.Chem.1989:1859-1866；Barton等,(1987)Synthesis ofNovel a-Amino-Acids and Derivatives Using Radical Chemistry:Synthesis ofL-and D-a-Amino-Adipic Acids,L-a-aminopimelic Acid and AppropriateUnsaturated Derivatives.Tetrahedron Lett.43:4297-4308；以及Subasinghe等，(1992)Quisqualic acid analogues:synthesis of beta-heterocyclic2-aminopropanoic acid derivatives and their activity at a novelquisqualate-sensitized site.J.Med.Chem.35:4602-7。还参见2003年12月22日提交的标题为“Protein Arrays”的专利申请、Ser.No.10/744,899的专利申请、以及2002年12月22日提交的Ser.No.60/435,821的专利申请。
具有羰基反应基团的氨基酸允许经由亲核加成或羟醛缩合反应等而连接分子(包括但不限于PEG或其它水溶性分子)的各种反应。
示例性的含有羰基的氨基酸可以如下表示：
其中n是0-10；R1是烷基、芳基、取代的烷基或取代的芳基；R2是H、烷基、芳基、取代的烷基和取代的芳基；R3是H、氨基酸、多肽或氨基末端的修饰基团，且R4是H、氨基酸、多肽或羧基末端的修饰基团。在一些实施方案中，n是1，R1是苯基，且R2是简单的烷基(即，甲基、乙基或丙基)，以及酮部分位于相对于烷基侧链的对位。在一些实施方案中，R1是苯基，且R2是简单的烷基(即，甲基、乙基或丙基)，以及酮部分位于相对于烷基侧链的间位。
在本发明中，具有相邻的羟基和氨基的非天然编码的氨基酸可以并入到多肽，作为“掩蔽的(masked)”醛官能团(functionality)。例如，5-羟基赖氨酸具有与ε胺相邻的羟基。用于生成醛的反应条件通常包括在温和的条件下添加摩尔过量的高碘酸钠以避免在多肽内其他位点的氧化。该氧化反应的pH通常为约7.0。通常的反应包括相对于多肽的缓冲溶液，添加1.5摩尔过量的高碘酸钠，然后在暗处培养约10分钟，参见例如专利号为6,423,685的美国专利，通过引用将其并入到本文。
羰基官能团可以在温和条件下在水性溶液中，选择性地与含有肼、酰肼、羟胺、或氨基脲的试剂反应，以分别形成相应的在生理条件下稳定的腙、肟、或缩氨基脲键。参见例如Jencks,W.P.,J.Am.Chem.Soc.81,475-481(1959)；Shao,J.和Tam,J.P.,J.Am.Chem.Soc.117:3893-3899(1995)。此外，在其他氨基酸侧链的存在下，羰基的独特反应性允许选择性修饰。参见例如Cornish,V.W.,等J.Am.Chem.Soc.118:8150-8151(1996)；Geoghegan,K.F.&Stroh,J.G.,Bioconjug.Chem.3:138-146(1992)；Mahal,L.K.,等,Science 276:1125-1128(1997)。
含有诸如肼、酰肼、或氨基脲等亲核基团的非天然编码的氨基酸允许与各种亲电基团的反应以形成偶联物(包括但不限于与PEG或其他水溶性聚合物)。
示例性的含有肼、酰肼、或氨基脲的氨基酸可以以下式表示：
其中，n是0-10；R1是烷基、芳基、取代的烷基或取代的芳基，或是不存在的；X是O、N、或S，或是不存在的；R2是H、氨基酸、多肽或氨基末端的修饰基团，且R3是H、氨基酸、多肽或羧基末端的修饰基团。
在一些实施方案中，n是4，R1是不存在的，且X是N。在一些实施方案中，n是2，R1是不存在的，且X是不存在的。在一些实施方案中，n是1，R1是苯基，X是O，且所述氧原子位于芳环上的脂肪基团的对位。
含有肼、酰肼、或氨基脲的氨基酸可自商业来源购买。例如L-谷氨酸-γ-酰肼可自Sigma Chemical(St.Louis,Mo.)购买。市场上买不到的其他氨基酸可以由本领域技术人员制备。参见例如专利号为6,281,211的美国专利，通过引用将其并入本文。
含有具有肼、酰肼、或氨基脲官能团的非天然编码的氨基酸的多肽可以有效且选择性地与含有醛或具有相似化学反应性的其他官能团的各种分子反应。参见例如Shao,J.和Tam,J.,J.Am.Chem.Soc.117:3893-3899(1995)。与存在于20种常见氨基酸的亲核基团(包括但不限于丝氨酸或苏氨酸的羟基、或赖氨酸和N末端的氨基)相比，酰肼、肼、和氨基脲官能团的独特的反应性使它们对醛、酮和其他亲电基团是明显更具有活性的。
含有氨基氧(也称为羟胺)基的非天然编码的氨基酸允许与各种亲电基团的反应，以形成偶联物(包括但不限于与PEG或其他水溶性聚合物)。像肼、酰肼、和氨基脲一样，氨基氧基的提高的亲核性允许它有效且选择性地与含有醛或具有相似化学反应性的其他官能团的各种分子反应。参见例如Shao,J.和Tam,J.,J.Am.Chem.Soc.117:3893-3899(1995)；H.Hang和C.Bertozzi,Acc.Chem.Res.34:727-736(2001)。而与肼基团的反应结果是相应的腙，然而，肟通常由氨基氧基与诸如酮等含有羰基的基团的反应产生。
含有氨基氧基的示例性的氨基酸可以以下式表示：
其中，n是0-10；R1是烷基、芳基、取代的烷基或取代的芳基，或是不存在的；X是O、N、或S，或是不存在的；m是0-10；Y═Ｃ(O)或是不存在的；R2是H、氨基酸、多肽或氨基末端的修饰基团，且R3是H、氨基酸、多肽或羧基末端的修饰基团。在一些实施方案中，n是1，R1是苯基，X是O，m是1，且Y是存在的。在一些实施方案中，n是2，R1和X是不存在的，m是0，且Y是不存在的。
含有氨基氧基的氨基酸可以自容易获得的氨基酸前体制备(高丝氨酸、丝氨酸和苏氨酸)。参见例如M.Carrasco和R.Brown,J.Org.Chem.68:8853-8858(2003)。已经从天然来源中分离了某些含有氨基氧基的氨基酸，诸如L-2-氨基-4-(氨基氧基)丁酸(Rosenthal,G.等,Life Sci.60:1635-1641(1997))。其他含有氨基氧基的氨基酸可以由本领域技术人员制备。
叠氮和炔官能团的独特的反应性使得它们对于选择性修饰多肽的其他生物分子是极其有用的。有机叠氮化物，特别是脂肪族叠氮化物和炔烃通常对一般的反应化学条件是稳定的。特别是，叠氮官能团和炔官能团均对存在于天然存在的多肽中的20种常见的氨基酸的侧链(即，R基团)是惰性的。然而，当使它们紧密靠近时，则显示出叠氮和炔官能团的“弹簧承载的(spring-loaded)”的性质，它们经由Huisgen[3+2]环加成反应而选择性且有效地反应，以生成相应的三唑。参见例如Chin J.,等，Science301:964-7(2003)；Wang,Q.,等，J.Am.Chem.Soc.125,3192-3193(2003)；Chin,J.W.,等，J.Am.Chem.Soc.124:9026-9027(2002)。
由于Huisgen环加成反应涉及选择性环加成反应(参见例如，Padwa,A.,COMPREHENSIVE ORGANIC SYNTHESIS,第4卷,(ed.Trost,B.M.,1991),第1069-1109页；Huisgen,R.1,3-DIPOLAR CYCLOADDITIONCHEMISTRY,(ed.Padwa,A.,1984),第1-176页)而不是亲核取代，具有含有叠氮和炔的侧链的非天然编码的氨基酸的并入允许生成的肽在所述非天然编码的氨基酸的位置被选择性地修饰。涉及含有叠氮或炔的抗体的环加成反应可以通过在催化量的还原剂的存在下，添加Cu(II)(包括但不限于催化量的CuSO4的形式)在水性条件(aqueous conditions)下在室温进行，所述还原剂用于将Cu(II)原位还原至Cu(I)。参见例如Wang,Q.,等，J.Am.Chem.Soc.125,3192-3193(2003)；Tornoe,C.W.,等，J.Org.Chem.67:3057-3064(2002)；Rostovtsev,等,Angew.Chem.Int.Ed.41:2596-2599(2002)。示例性的还原剂包括但不限于抗坏血酸盐、金属铜、奎宁、对苯二酚、维生素K、谷胱甘肽、半胱氨酸、Fe2+、Co2+、和应用的电位。
在某些情况中，叠氮化物和炔烃之间的Huisgen[3+2]环加成反应是所期望的，结合抗原的多肽包含含有炔部分的非天然编码的氨基酸，将要附接到所述氨基酸的水溶性聚合物包含叠氮部分。替代性地，也可以进行相反的反应(即，利用在氨酸酸上的叠氮部分和存在于水溶性聚合物上的炔基部分)。
叠氮官能团也可以选择性地与含有芳基酯和以芳基膦部分适当官能化的水溶性聚合物进行反应，以生成酰胺键。芳基膦基团原位还原叠氮化物，然后生成的胺有效地与邻近的酯键反应，以生成相应的酰胺。参见例如E.Saxon和C.Bertozzi,Science 287,2007-2010(2000)。含有叠氮的氨基酸可以是烷基叠氮化物(包括但不限于2-氨基-6-叠氮基-1-己酸)或芳基叠氮化物(对叠氮基-苯丙氨酸)。
含有芳基酯和膦部分的示例性水溶性聚合物可以以下式表示：
其中，X可以是O、N、S或是不存在的，Ph是苯基，W是水溶性聚合物，且R可以是H、烷基、芳基、取代的烷基和取代的芳基。示例性的R基团包括但不限于-CH2、-C(CH3)3、-OR'、-NR'R″、-SR'、-卤素、-C(O)R'、-CONR'R″、-S(O)2R'、-S(O)2NR'R″、-CN和-NO2。R'、R″、R″'和R″″各自独立地指氢、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基(包括但不限于以1-3个卤素取代的芳基)、取代或未取代的烷基、取代或未取代的烷氧基、取代或未取代的硫代烷氧基、或烷基芳基。当本发明的化合物包括多于一个的R基团时，例如，当存在多于一个的R'、R″、R″'和R″″基团时，各R基团独立选择为各R'、R″、R″'和R″″。当R'和R″连接到相同的氮原子时，它们可以与氮原子一起形成5、6、7元环。例如-NR'R″是指包括但不限于1-吡咯烷基和4-吗啉基。从取代基的上述论述，本领域技术人员将理解术语“烷基”意指包括包括与非氢的基团连接的碳原子的基团，诸如卤代烷基(包括但不限于-CF3和-CH2CF3)和酰基(包括但不限于-C(O)CH3、-C(O)CF3、-C(O)CH2OCH3等)。
叠氮官能团也可以选择性地与含有硫酯和以芳基膦部分适当官能化的水溶性聚合物进行反应，以生成酰胺键。芳基膦基团原位还原叠氮化物，然后生成的胺有效地与硫酯键反应，以生成相应的酰胺。含有硫酯和膦部分的示例性水溶性聚合物可以以下式表示：
其中，n是1-10；X可以是O、N、S或是不存在的，Ph是苯基，且W是水溶性聚合物。
含有炔的氨基酸可以以下式表示：
其中，n是0-10；R1是烷基、芳基、取代的烷基或取代的芳基，或是不存在的；X是O、N、或S，或是不存在的；m是0-10；R2是H、氨基酸、多肽或氨基末端的修饰基团，且R3是H、氨基酸、多肽或羧基末端的修饰基团。在一些实施方案中，n是1，R1是苯基，X是不存在的，m是0，且乙炔部分相对于烷基侧链位于对位。在一些实施方案中，n是1，R1是苯基，X是O，m是1，且炔丙基氧基相对于烷基侧链位于对位(即，O-炔丙基-酪氨酸)。在一些实施方案中，n是1，R1和X是不存在的，且m是0(即，炔丙基甘氨酸)。
含有炔的氨基酸在市场上是可买到的。例如，炔丙基甘氨酸可以商购自Peptech(Burlington,Mass.)。替代性地，含有炔基的氨基酸可以根据标准的方法制备。例如，对炔丙基氧基苯丙氨酸可以按照例如在Deiters,A.,等,J.Am.Chem.Soc.125:11782-11783(2003)中所描述的来合成，4-炔基-L-苯丙氨酸可以按照在Kayser,B.,等,Tetrahedron 53(7):2475-2484(1997)中所描述的来合成。其他的含有炔的氨基酸可以由本领域技术人员来制备。
示例性的含有叠氮的氨基酸可以以下式表示：
其中，n是0-10；R1是烷基、芳基、取代的烷基、取代的芳基，或是不存在的；X是O、N、S、或是不存在的；m是0-10；R2是H、氨基酸、多肽或氨基末端的修饰基团，且R3是H、氨基酸、多肽或羧基末端的修饰基团。在一些实施方案中，n是1，R1是苯基，X是不存在的，m是0，且叠氮部分相对于烷基侧链位于对位。在一些实施方案中，n是0-4，R1和X是不存在的，且m是0。在一些实施方案中，n是1，R1是苯基，X是O，m是2，且对叠氮基乙氧基部分对于烷基侧链位于对位。
含有叠氮的氨基酸可自商业来源购买。例如，4-叠氮基苯丙氨酸可以自Chem-Impex International,Inc.(Wood Dale,Ill.)获得。对于在市场上买不到的那些含有叠氮的氨基酸，利用本领域技术人员已知的标准方法，包括但不限于经由置换合适的离去基团(包括但不限于卤化物、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯)或经由打开合适当保护的内酯，可以较容易地来制备叠氮基团。参见例如，March的Advanced Organic Chemistry(第三版,1985,Wiley和Sons,纽约)。
β-取代的氨基硫醇官能团的独特的反应性使得它们对于经由形成噻唑烷而选择性修饰含有醛基团的多肽和其他生物分子是极其有用的。参见例如J.Shao和J.Tam,J.Am.Chem.Soc.1995,117(14)3893-3899。在一些实施方案中，β-取代的氨基硫醇氨基酸可以并入到抗体，然后与含有醛官能团的水溶性聚合物反应。在一些实施方案中，水溶性聚合物、药物偶联物或其他有效载荷可以与含有β-取代的氨基硫醇的氨基酸的抗体多肽经由形成噻唑烷而进行偶联。
有用的非天然氨基酸的特定实例包括但不限于对乙酰基-L-苯丙氨酸、O-甲基-L-酪氨酸、L-3-(2-萘基)丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、O-4-烯丙基-L-酪氨酸、4-丙基-L-酪氨酸、三-O-乙酰基-GlcNAc b-丝氨酸、L-多巴、氟化的苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、对叠氮基-L-苯丙氨酸、对酰基-L-苯丙氨酸、对苯甲酰基-L-苯丙氨酸、L-磷酸丝氨酸、膦酰基丝氨酸、膦酰基酪氨酸、对碘-苯丙氨酸、对溴苯丙氨酸、对氨基-L-苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、和对炔丙基氧基-苯丙氨酸。进一步有用的实例包括N-乙酰基-L-氨基葡萄糖基-L-丝氨酸、N-乙酰基-L-氨基半乳糖基-L-丝氨酸、N-乙酰基-L-氨基葡萄糖基-L-苏氨酸、N-乙酰基-L-氨基葡萄糖基-L-天冬酰胺和O-甘露糖胺基-L-丝氨酸。
在特定的实施方案中，所述非天然氨基酸选自对乙酰基-苯丙氨酸、p-乙炔基-苯丙氨酸、对炔丙基氧基-苯丙氨酸、和对叠氮基-苯丙氨酸。一个特别有用的非天然氨基酸是对叠氮基-苯丙氨酸。对本领域技术人员而言已知的是，该氨基酸残基促进与例如具有炔基的化合物的Huisgen[3+2]环加成反应(所谓的“点击”化学反应)。该反应能够使本领域技术人员容易且快速地在非天然氨基酸的位点特异性位置进行与抗体的偶联。
在某些实施方案中，第一反应基团是炔基部分(包括但不限于在非天然氨基酸对炔丙基氧基-苯丙氨酸中，其中炔丙基有时也称为乙炔部分)，且第二反应基团是叠氮基部分，且可以使用[3+2]环加成化学反应。在某些实施方案中，第一反应基团是叠氮基部分(包括但不限于在非天然氨基酸对叠氮基-L-苯丙氨酸中)，且第二反应基团是炔基部分。
在上述式中，各L表示二价的连接基团。所述二价的连接基团可以是本领域技术人员已知的任意的二价的连接基团。一般而言，所述二价的连接基团能够与非天然氨基酸的官能部分R和α碳形成共价键。有用的二价连接基团包括键、亚烷基、取代的亚烷基、亚杂烷基、取代的亚杂烷基、亚芳基、取代的亚芳基、亚杂芳基和取代的亚杂芳基。在某些实施方案中，L是C1-10亚烷基或C1-10亚杂烷基。
在本文所描述的方法和组合物所使用的非天然氨基酸具有以下四种性质的至少一种：(1)在所述非天然氨基酸的侧链上的至少一个官能团具有与20种常见的、基因编码的氨基酸(即，丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、和缬氨酸)正交的、或至少与存在于包含所述非天然氨基酸的多肽中的天然存在的氨基酸的化学反应性正交的、至少一种特性和/或活性和/或反应性；(2)所引入的非天然氨基酸对20种常见的、基因编码的氨基酸实质上是化学惰性的；(3)所述非天然氨基酸可以稳定地并入多肽，优选地以与天然存在的氨基酸相当的稳定性或在通常的生理条件下，以及进一步优选地，这样并入可以经由活体内系统发生；以及(4)所述非天然氨基酸包含肟官能团、或能够优选地在以下条件下通过与试剂反应转化成肟基团的官能团：不破坏包含所述非天然氨基酸的多肽的生物学特性(除非这样的生物学特性的破坏的目的是进行修饰/转化)、或所述转化能够在pH在约4和约8之间的水性条件下发生、或所述非天然氨基酸上的所述反应位点是亲电的位点。对于可以与本文所描述的组合物和方法一起使用的非天然氨基酸，满足这四种特性的说明性的、非限定性的氨基酸的实例存在于图2、3、35和40-43中。可以引入任意数目的非天然氨基酸酯多肽中。非天然氨基酸也可以包含经保护的或经掩蔽的肟或在对经保护的基团进行脱保护之后或对经掩蔽的基团进行去掩蔽之后能够转化成肟的经保护的或经掩蔽的基团。非天然氨基酸也可以包含经保护的或经掩蔽的羰基或二羰基，所述经保护的或经掩蔽的羰基或二羰基能够在对经保护的基团进行脱保护之后或对经掩蔽的基团进行去掩蔽之后转变成羰基或二羰基，从而能够与羟胺或肟反应以形成肟基团。
在进一步的实施方案中，可以在本文所描述的方法和组合物中使用的非天然氨基酸包括但不限于包含光激活的交联剂、自旋标记的氨基酸、荧光氨基酸、金属结合氨基酸、含有金属的氨基酸、放射性氨基酸、具有新的官能团的氨基酸、与其他分子共价或非共价地相互作用的氨基酸、光笼蔽和/或可光异构的氨基酸、含有生物素或生物素类似物的氨基酸、诸如糖取代的丝氨酸等糖基化的氨基酸、其它碳水化合物修饰的氨基酸、含酮的氨基酸、含醛的氨基酸、含有聚乙二醇或其他聚醚的氨基酸、重原子取代的氨基酸、可化学切割或可光切割的氨基酸、与天然氨基酸相比具有延长的侧链的氨基酸(包括但不限于聚醚或长链烃(包括但不限于大于约5或大于约10个碳等))、含有碳-连接糖的氨基酸、具有氧化还原活性的氨基酸、含有氨基硫代酸的氨基酸和含有一种或多种有毒部分的氨基酸。
在一些实施方案中，非天然氨基酸包含糖部分。这样的氨基酸的实例包括N-乙酰基-L-氨基葡萄糖基-L-丝氨酸、N-乙酰基-L-氨基半乳糖基-L-丝氨酸、N-乙酰基-L-氨基葡萄糖基-L-苏氨酸、N-乙酰基-L-氨基葡萄糖基-L-天冬酰胺和O-甘露糖胺基-L-丝氨酸。这样的氨基酸的实例还包括其中在氨基酸和糖之间的天然存在的N-或O-连接由共价连接进行替换的实例，所述共价连接是天然不常见的，包括但不限于烯烃、肟、硫醚、酰胺等。这样的氨基酸的实例还包括在天然存在的蛋白质中不常见的糖类，诸如2-脱氧-葡萄糖、2-脱氧半乳糖等。
经由非天然氨基酸的并入而并入到抗体的化学部分提供了多肽的各种优势和操作(manipulations)。例如，羰基或双羰基官能团的独特反应性(包括酮或醛官能团)允许用多种含肼或羟胺试剂中的任一种在活体内或体外选择性修饰抗体。重原子非天然氨基酸，例如，可以用于相位测定(phasing)X射线结构数据。利用非天然氨基酸位点特异性引入重原子也在选择重原子位置方面提供了选择性和灵活性。光敏非天然氨基酸(包括但不限于具有二苯甲酮和芳基叠氮化物(包括但不限于，苯基叠氮化物)侧链的氨基酸)，例如，允许多肽在活体内和体外进行有效的光交联。光敏非天然氨基酸的实例包括但不限于，例如，对-叠氮基-苯丙氨酸和对-苯甲酰基-苯丙氨酸。然后，可以通过激发光敏基团提供的时序控制(temporal control)，而任意交联具有光敏非天然氨基酸的抗体。在非限制性实例中，可以用同位素标记的、包括但不限于甲基来取代非天然氨基酸的甲基，以在包括但不限于使用核磁共振和振动光谱中，作为局部结构和动力学的探针。炔基或叠氮基官能团，例如，允许通过[3+2]环加成反应用分子选择性修饰蛋白质。
具有亲电反应基团的氨基酸允许经由各种化学反应(包括但不限于亲核加成反应)而连接分子的各种反应。这样的亲电反应基团包括羰基或二羰基(包括但不限于酮或醛基团)、类似于羰基或二羰基的基团(其具有类似于羰基或二羰基基团的反应性，且结构上类似于羰基或二羰基基团)、经掩蔽的羰基或经掩蔽的二羰基(其可以很容易转化成羰基或二羰基基团)、或经保护的羰基或经保护的二羰基(其一旦去保护具有类似于羰基或二羰基基团的反应性)。这样的氨基酸包括具有式(I)结构的氨基酸：
其中A是任选的，且当其存在时是低级亚烷基、取代的低级亚烷基、低级亚环烷基、取代的低级亚环烷基、低级亚烯基、取代的低级亚烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、取代的亚杂烷基、低级亚杂环烷基、取代的低级亚杂环烷基、亚芳基、取代的亚芳基、亚杂芳基、取代的亚杂芳基、亚烷芳基(alkarylene)、取代的亚烷芳基、亚芳烷基(aralkylene)或取代的亚芳烷基。B是任选的，且当其存在时是选自由以下连接基团所构成的组的连接基团：低级亚烷基、取代的低级亚烷基、低级亚烯基、取代的低级亚烯基、低级亚杂烷基、取代的低级亚杂烷基、-O-、-O-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-S(O)k-(其中k是1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、-C(O)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R')-、-NR'-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R')CO-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R')C(O)O-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N═、-C(R')═N-、-C(R')═N-N(R')-、-C(R')═N-N═、-C(R')2-N═N-、和-C(R')2-N(R')-N(R')-，其中各R'独立地是H、烷基或取代的烷基；J是
R是H、烷基、取代的烷基、环烷基、或取代的环烷基；各R″独立地是H、烷基、取代的烷基、或保护基、或当多于一个的R″基团存在时，两个R″任选地形成杂环烷基；R1是H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽、或多核苷酸；且R2是OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽、或多核苷酸；R3和R4各自独立地是H、卤素、低级烷基、或取代的低级烷基、或R3和R4或两个R3基团任选地形成环烷基或杂环烷基；或-A-B-J-R基团一起形成双环或三环环烷基或杂环烷基，所述双环或三环环烷基或杂环烷基含有至少一个羰基(包括二羰基)、经保护的羰基(包括经保护的二羰基)、或经掩蔽的羰基(包括经掩蔽的二羰基)；或-J-R基团一起形成单环或双环环烷基或杂环烷基，所述单环或双环环烷基或杂环烷基含有至少一个羰基(包括二羰基)、经保护的羰基(包括经保护的二羰基)、或经掩蔽的羰基(包括经掩蔽的二羰基)；条件是：当A是亚苯基，且各R3是H时，B是存在的；以及当A是-(CH2)4-，且各R3是H时，B不是-NHC(O)(CH2CH2)-；当A和B是不存在的，且各R3是H时，R不是甲基。这样的非天然氨基酸可以是盐的形式，或可以并入到非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖、或多核苷酸中，以及可以被任选地翻译后修饰。
在某些实施方案中，式(I)的化合物在偏酸性(mildly acidic)条件下、在水性条件中至少1个月是稳定的。在某些实施方案中，式(I)的化合物在偏酸性条件下至少2周是稳定的。在某些实施方案中，式(I)的化合物在偏酸性条件下至少5天是稳定的。在某些实施方案中，这样的酸性条件是pH2至8。
在式(I)的化合物的某些实施方案中，B是低级亚烷基、取代的低级亚烷基、-O-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(R')═N-N(R')-、-N(R')CO-、-C(O)-、-C(R')═N-、-C(O)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-CON(R')-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-S(亚烷基或取代的亚烷基)-、-S(O)(亚烷基或取代的亚烷基)-、or-S(O)2(亚烷基或取代的亚烷基)-。在式(I)的化合物的某些实施方案中，B是-O(CH2)-、-CH═N-、-CH═N-NH-、-NHCH2-、-NHCO-、-C(O)-、-C(O)-(CH2)-、-CONH-(CH2)-、-SCH2-、-S(═O)CH2-、或-S(O)2CH2-。在式(I)的化合物的某些实施方案中，R是C1-6烷基或环烷基。在式(I)的化合物的某些实施方案中，R是-CH3、-CH(CH3)2、或环丙基。在式(I)的化合物的某些实施方案中，R1是H、叔丁氧羰基(Boc)、9-芴甲氧羰基(Fmoc)、N-乙酰基、四氟乙酰基(tetrafluoroacetyl)(TFA)、或苄氧羰基(Cbz)。在式(I)的化合物的某些实施方案中，R1是树脂、氨基酸、多肽、或多核苷酸。在式(I)的化合物的某些实施方案中，R2是OH、O-甲基、O-乙基或O-叔丁基。在式(I)的化合物的某些实施方案中，R2是树脂、氨基酸、多肽、或多核苷酸。在式(I)的化合物的某些实施方案中，R2是多核苷酸。在式(I)的化合物的某些实施方案中，R2是核醣核酸(RNA)。在式(I)的化合物的某些实施方案中，R2是tRNA。在式(I)的化合物的某些实施方案中，所述tRNA特定地识别选择密码子(selector codon)。在式(I)的化合物的某些实施方案中，所述选择密码子选自由琥珀密码子、赭石密码子、卵白石密码子、独特密码子(unique codon)、罕用密码子、非天然密码子、五碱基密码子和四碱基密码子所构成的组。在式(I)的化合物的某些实施方案中，R2是阻抑tRNA。
在式(I)的化合物的某些实施方案中，
上式选自以下所构成的组：(i)A是取代的低级亚烷基、C4-亚芳基、取代的亚芳基、亚杂芳基、取代的亚杂芳基、亚烷芳基、取代的亚烷芳基、亚芳烷基、或取代的亚芳烷基；B是任选的，且当其存在时是二价连接基团，所述二价连接基团选自由低级亚烷基、取代的低级亚烷基、低级亚烯基、取代的低级亚烯基、-O-、-O-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(S)-、-N(R')-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-CSN(R')-、-N(R')CO-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R')C(O)O-、-N(R')C(S)-、-S(O)N(R')、-S(O)2N(R')、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)N(R')-、-N(R')S(O)2N(R')-、-N(R')-N═、-C(R')═N-N(R')-、-C(R')═N-N═、-C(R')2-N═N-、和-C(R')2-N(R')-N(R')-所构成的组；(ii)A是任选的，且当其存在时是取代的低级亚烷基、C4-亚芳基、取代的亚芳基、亚杂芳基、取代的亚杂芳基、亚烷芳基、取代的亚烷芳基、亚芳烷基、或取代的亚芳烷基；B是二价连接基团，所述二价连接基团选自由低级亚烷基、取代的低级亚烷基、低级亚烯基、取代的低级亚烯基、-O-、-O-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(S)-、-N(R')-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-CSN(R')-、-N(R')CO-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R')C(O)O-、-N(R')C(S)-、-S(O)N(R')、-S(O)2N(R')、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)N(R')-、-N(R')S(O)2N(R')-、-N(R')-N═、-C(R')═N-N(R')-、-C(R')═N-N═、-C(R')2-N═N-、和-C(R')2-N(R')-N(R')-所构成的组；(iii)A是低级亚烷基；B是任选的，且当其存在时是二价连接基团，所述二价连接基团选自由低级亚烷基、取代的低级亚烷基、低级亚烯基、取代的低级亚烯基、-O-、-O-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(S)-、-N(R')-、-C(O)N(R')-、-CSN(R')-、-CON(R')-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R')C(O)O-、-N(R')C(S)-、-S(O)N(R')、-S(O)2N(R')、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)N(R')-、-N(R')S(O)2N(R')-、-N(R')-N═、-C(R')═N-N(R')-、-C(R')═N-N═、-C(R')2-N═N-、和-C(R')2-N(R')-N(R')-所构成的组；以及(iv)A是亚苯基；B是二价连接基团，所述二价连接基团选自由低级亚烷基、取代的低级亚烷基、低级亚烯基、取代的低级亚烯基、-O-、-O-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(S)-、-N(R')-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-CSN(R')-、-N(R')CO-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R')C(O)O-、-N(R')C(S)-、-S(O)N(R')、-S(O)2N(R')、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)N(R')-、-N(R')S(O)2N(R')-、-N(R')-N═、-C(R')'N-N(R')-、-C(R')═N-N═、-C(R')2-N═N-、和-C(R')2-N(R')-N(R')-所构成的组；J是
各R'独立地是H、烷基、或取代的烷基；R1是任选的，且当其存在时是H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽、或多核苷酸；且R2是任选的，且当其存在时是OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽、或多核苷酸；且R3和R4各自独立地是H、卤素、低级烷基、或取代的低级烷基；且R是H、烷基、取代的烷基、环烷基或取代的环烷基。
此外，包括具有式(II)的结构的氨基酸：
其中A是任选的，且当其存在时是低级亚烷基、取代的低级亚烷基、低级亚环烷基、取代的低级亚环烷基、低级亚烯基、取代的低级亚烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、取代的亚杂烷基、低级亚杂环烷基、取代的低级亚杂环烷基、亚芳基、取代的亚芳基、亚杂芳基、取代的亚杂芳基、亚烷芳基、取代的亚烷芳基、亚芳烷基或取代的亚芳烷基；B是任选的，且当其存在时是选自由以下连接基团所构成的组的连接基团：低级亚烷基、取代的低级亚烷基、低级亚烯基、取代的低级亚烯基、低级亚杂烷基、取代的低级亚杂烷基、-O-、-O-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-S(O)k-(其中k是1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、-C(O)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R')-、-NR'-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R')CO-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R')C(O)O-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N═、-C(R')═N-、-C(R')═N-N(R')-、-C(R')═N-N═、-C(R')2-N═N-、和-C(R')2-N(R')-N(R')-，其中，各R'独立地是H、烷基或取代的烷基；R是H、烷基、取代的烷基、环烷基、或取代的环烷基；R1是H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽、或多核苷酸；且R2是OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽、或多核苷酸。在某些实施方案中，当A是亚苯基时，B是存在的；和当A是-(CH2)4-时，B不是-NHC(O)(CH2CH2)-；和当A和B是不存在的时，R不是甲基。这样的非天然氨基酸可以是盐的形式，或可以并入到非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖、或多核苷酸中，以及可以被任选地翻译后修饰。
此外，包括具有式(III)的结构的氨基酸：
其中：B选自由以下连接基团所构成的组的连接基团：低级亚烷基、取代的低级亚烷基、低级亚烯基、取代的低级亚烯基、低级亚杂烷基、取代的低级亚杂烷基、-O-、-O-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-S(O)k-(其中k是1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、-C(O)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R')-、-NR'-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R')CO-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R')C(O)O-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N═、-C(R')═N-、-C(R')═N-N(R')-、-C(R')═N-N═、-C(R')2-N═N-、和-C(R')2-N(R')-N(R')-，其中各R'独立地是H、烷基或取代的烷基；R是H、烷基、取代的烷基、环烷基、或取代的环烷基；R1是H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽、或多核苷酸；且R2是OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽、或多核苷酸；各Ra独立地选自由H、卤素、烷基、取代的烷基、-N(R')2、-C(O)kR'(其中k是1、2或3)、-C(O)N(R')2、-OR'、和-S(O)kR'所构成的组，其中各R'独立地是H、烷基或取代的烷基。这样的非天然氨基酸可以是盐的形式，或可以并入到非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖、或多核苷酸中，以及可以被任选地翻译后修饰。
此外，包括以下的氨基酸：
这样的非天然氨基酸可以任选地是氨基保护的基团、羧基经保护的、和/或盐的形式，或可以并入到非天然氨基多肽、聚合物、多糖、或多核苷酸中，以及可以被任选地翻译后修饰。
此外，包括具有式(IV)的结构的氨基酸：
其中-NS(O)2-、-OS(O)2-、任选的，且当其存在时是选自由以下连接基团所构成的组的连接基团：低级亚烷基、取代的低级亚烷基、低级亚烯基、取代的低级亚烯基、低级亚杂烷基、取代的低级亚杂烷基、-O-、-O-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-S(O)k-(其中k是1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R')-、-NR'-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R')CO-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R')C(O)O-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N═、-C(R')═N-、-C(R')═N-N(R')-、-C(R')═N-N═、-C(R')2-N═N-、和-C(R')2-N(R')-N(R')-，其中各R'独立地是H、烷基或取代的烷基；R是H、烷基、取代的烷基、环烷基、或取代的环烷基；R1是H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽、或多核苷酸；且R2是OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽、或多核苷酸；各Ra独立地选自由H、卤素、烷基、取代的烷基、-N(R')2、-C(O)kR'(其中k是1、2或3)、-C(O)N(R')2、-OR'、和-S(O)kR'所构成的组，其中各R'独立地是H、烷基或取代的烷基；且n是0至8。在某些实施方案中，当A是-(CH2)4-时，B不是-NHC(O)(CH2CH2)-。这样的非天然氨基酸可以是盐的形式，或可以并入到非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖、或多核苷酸中，以及可以被任选地翻译后修饰。
此外，包括以下的氨基酸：
其中，这样的化合物是任选地氨基经保护的、任选地羧基经保护的、任选地氨基经保护的和羧基经保护的、或它们的盐，或可以并入到非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖、或多核苷酸中，以及可以被任选地翻译后修饰。
此外，包括具有式(VIII)的结构的以下氨基酸：
其中，A是任选的，且当其存在时是低级亚烷基、取代的低级亚烷基、低级亚环烷基、取代的低级亚环烷基、低级亚烯基、取代的低级亚烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、取代的亚杂烷基、低级亚杂环烷基、取代的低级亚杂环烷基、亚芳基、取代的亚芳基、亚杂芳基、取代的亚杂芳基、亚烷芳基、取代的亚烷芳基、亚芳烷基或取代的亚芳烷基；B是任选的，且当其存在时是选自由以下连接基团所构成的组的连接基团：低级亚烷基、取代的低级亚烷基、低级亚烯基、取代的低级亚烯基、低级亚杂烷基、取代的低级亚杂烷基、O-、-O-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-S(O)k-(其中k是1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、-C(O)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R')-、-NR'-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R')CO-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R')C(O)O-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N═、-C(R')═N-、-C(R')═N-N(R')-、-C(R')═N-N═、-C(R')2-N═N-、和-C(R')2-N(R')-N(R')-，其中各R’独立地是H、烷基或取代的烷基；R1是H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽、或多核苷酸；且R2是OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽、或多核苷酸。这样的非天然氨基酸可以是盐的形式，或可以并入到非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖、或多核苷酸中，以及可以被任选地翻译后修饰。
此外，包括具有式(IX)的结构的以下氨基酸：
其中，B是任选的，且当其存在时是选自由以下连接基团所构成的组的连接基团：低级亚烷基、取代的低级亚烷基、低级亚烯基、取代的低级亚烯基、低级亚杂烷基、取代的低级亚杂烷基、-O-、-O-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-S(O)k-(其中k是1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、-C(O)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R')-、-NR'-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R')CO-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R')C(O)O-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N═、-C(R')═N-、-C(R')═N-N(R')-、-C(R')═N-N═、-C(R')2-N═N-、和-C(R')2-N(R')-N(R')-，其中各R'独立地是H、烷基或取代的烷基；R是H、烷基、取代的烷基、环烷基、或取代的环烷基；R1是H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽、或多核苷酸；且R2是OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽、或多核苷酸；其中各Ra独立地选自由H、卤素、烷基、取代的烷基、-N(R')2、-C(O)kR'(其中k是1、2或3)、-C(O)N(R')2、-OR'、和-S(O)kR'所构成的组，其中各R'独立地是H、烷基或取代的烷基。这样的非天然氨基酸可以是盐的形式，或可以并入到非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖、或多核苷酸中，以及可以被任选地翻译后修饰。
此外，包括以下的氨基酸：
注：“and”为和(下同)。
其中这样的化合物是任选地氨基经保护的、任选地羧基经保护的、任选地氨基经保护的和羧基经保护的、或它们的盐，或可以并入到非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖、或多核苷酸中，以及可以被任选地翻译后修饰。
此外，包括具有式(X)的结构的以下氨基酸：
其中，B是任选的，且当其存在时是选自由以下连接基团所构成的组的连接基团：低级亚烷基、取代的低级亚烷基、低级亚烯基、取代的低级亚烯基、低级亚杂烷基、取代的低级亚杂烷基、-O-、-O-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-S(O)k-(其中k是1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、-C(O)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R')-、-NR'-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R')CO-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R')C(O)O-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N═、-C(R')═N-、-C(R')═N-N(R')-、-C(R')═N-N═、-C(R')2-N═N-、和-C(R')2-N(R')-N(R')-，其中各R'独立地是H、烷基或取代的烷基；R是H、烷基、取代的烷基、环烷基、或取代的环烷基；R1是H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽、或多核苷酸；且R2是OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽、或多核苷酸；各Ra独立地选自由H、卤素、烷基、取代的烷基、-N(R')2、-C(O)kR'(其中k是1、2或3)、-C(O)N(R')2、-OR'、和-S(O)kR'所构成的组，其中各R'独立地是H、烷基或取代的烷基；且n是0至8。这样的非天然氨基酸可以是盐的形式，或可以并入到非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖、或多核苷酸中，以及可以被任选地翻译后修饰。
此外，包括以下的氨基酸：
其中，这样的化合物是任选地氨基经保护的、任选地羧基经保护的、任选地氨基经保护的和羧基经保护的、或它们的盐，或可以并入到非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖、或多核苷酸中，以及可以被任选地翻译后修饰。
除了单羰基结构之外，本文所描述的非天然氨基酸可以包含诸如二羰基、类羰基、经掩蔽的二羰基、和经保护的二羰基等基团。例如，包括具有式(V)的结构的以下氨基酸：
其中，A是任选的，且当其存在时是低级亚烷基、取代的低级亚烷基、低级亚环烷基、取代的低级亚环烷基、低级亚烯基、取代的低级亚烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、取代的亚杂烷基、低级亚杂环烷基、取代的低级亚杂环烷基、亚芳基、取代的亚芳基、亚杂芳基、取代的亚杂芳基、亚烷芳基、取代的亚烷芳基、亚芳烷基或取代的亚芳烷基；B是任选的，且当其存在时是选自由以下连接基团所构成的组的连接基团：低级亚烷基、取代的低级亚烷基、低级亚烯基、取代的低级亚烯基、低级亚杂烷基、取代的低级亚杂烷基、-O-、-O-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-S(O)k-(其中k是1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、-C(O)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R')-、-NR'-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R')CO-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R')C(O)O-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N═、-C(R')═N-、-C(R')═N-N(R')-、-C(R')═N-N═、-C(R')2-N═N-、和-C(R')2-N(R')-N(R')-，其中各R'独立地是H、烷基或取代的烷基；R是H、烷基、取代的烷基、环烷基、或取代的环烷基；R1是H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽、或多核苷酸；且R2是OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽、或多核苷酸。这样的非天然氨基酸可以是盐的形式，或可以并入到非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖、或多核苷酸中，以及可以被任选地翻译后修饰。
此外，包括具有式(VI)的结构的以下氨基酸：
其中，B是任选的，且当其存在时是选自由以下连接基团所构成的组的连接基团：低级亚烷基、取代的低级亚烷基、低级亚烯基、取代的低级亚烯基、低级亚杂烷基、取代的低级亚杂烷基、-O-、-O-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-S(O)k-(其中k是1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、-C(O)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R')-、-NR'-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R')CO-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R')C(O)O-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N═、-C(R')═N-、-C(R')═N-N(R')-、-C(R')═N-N═、-C(R')2-N═N-、和-C(R')2-N(R')-N(R')-，其中各R'独立地是H、烷基或取代的烷基；R是H、烷基、取代的烷基、环烷基、或取代的环烷基；R1是H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽、或多核苷酸；且R2是OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽、或多核苷酸；其中各Ra独立地选自由H、卤素、烷基、取代的烷基、-N(R')2、-C(O)kR'(其中k是1、2或3)、-C(O)N(R')2、-OR'、和-S(O)kR'所构成的组，其中各R'独立地是H、烷基或取代的烷基。这样的非天然氨基酸可以是盐的形式，或可以并入到非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖、或多核苷酸中，以及可以被任选地翻译后修饰。
此外，包括以下的氨基酸：
其中，这样的化合物是任选地氨基经保护的和羧基经保护的、或它们的盐。这样的非天然氨基酸可以是盐的形式，或可以并入到非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖、或多核苷酸中，以及可以被任选地翻译后修饰。
此外，包括具有式(VII)的结构的以下氨基酸：
其中，B是任选的，且当其存在时是选自由以下连接基团所构成的组的连接基团：低级亚烷基、取代的低级亚烷基、低级亚烯基、取代的低级亚烯基、低级亚杂烷基、取代的低级亚杂烷基、-O-、-O-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-S(O)k-(其中k是1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、-C(O)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R')-、-NR'-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R')CO-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R')C(O)O-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N═、-C(R')═N-、-C(R')═N-N(R')-、-C(R')═N-N═、-C(R')2-N═N-、和-C(R')2-N(R')-N(R')-，其中各R'独立地是H、烷基或取代的烷基；R是H、烷基、取代的烷基、环烷基、或取代的环烷基；R1是H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽、或多核苷酸；且R2是OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽、或多核苷酸；各Ra独立地选自由H、卤素、烷基、取代的烷基、-N(R')2、-C(O)kR'(其中k是1、2或3)、-C(O)N(R')2、-OR'、和-S(O)kR'所构成的组，其中各R'独立地是H、烷基或取代的烷基；且n是0至8。这样的非天然氨基酸可以是盐的形式，或可以并入到非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖、或多核苷酸中，以及可以被任选地翻译后修饰。
此外，包括以下的氨基酸：
其中，这样的化合物是任选地氨基经保护的和羧基经保护的、或它们的盐，或可以并入到非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖、或多核苷酸中，以及可以被任选地翻译后修饰。
此外，包括具有式(XXX)的结构的以下氨基酸：
其中，A是任选的，且当其存在时是低级亚烷基、取代的低级亚烷基、低级亚环烷基、取代的低级亚环烷基、低级亚烯基、取代的低级亚烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、取代的亚杂烷基、低级亚杂环烷基、取代的低级亚杂环烷基、亚芳基、取代的亚芳基、亚杂芳基、取代的亚杂芳基、亚烷芳基、取代的亚烷芳基、亚芳烷基或取代的亚芳烷基；R是H、烷基、取代的烷基、环烷基、或取代的环烷基；R1是H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽、或多核苷酸；且R2是OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽、或多核苷酸；X1是C、S、或S(O)；且L是亚烷基、取代的亚烷基、N(R')(亚烷基)或N(R')(取代的亚烷基)，其中R'是H、烷基、取代的烷基、环烷基、或取代的环烷基。这样的非天然氨基酸可以是盐的形式，或可以并入到非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖、或多核苷酸中，以及可以被任选地翻译后修饰。
此外，包括具有式(XXX-A)的结构的以下氨基酸：
其中，A是任选的，且当其存在时是低级亚烷基、取代的低级亚烷基、低级亚环烷基、取代的低级亚环烷基、低级亚烯基、取代的低级亚烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、取代的亚杂烷基、低级亚杂环烷基、取代的低级亚杂环烷基、亚芳基、取代的亚芳基、亚杂芳基、取代的亚杂芳基、亚烷芳基、取代的亚烷芳基、亚芳烷基或取代的亚芳烷基；R是H、烷基、取代的烷基、环烷基、或取代的环烷基；R1是H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽、或多核苷酸；且R2是OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽、或多核苷酸；L是亚烷基、取代的亚烷基、N(R')(亚烷基)或N(R')(取代的亚烷基)，其中R'是H、烷基、取代的烷基、环烷基、或取代的环烷基。这样的非天然氨基酸可以是盐的形式，或可以并入到非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖、或多核苷酸中，以及可以被任选地翻译后修饰。
此外，包括具有式(XXX-B)的结构的以下氨基酸：
其中：A是任选的，且当其存在时是低级亚烷基、取代的低级亚烷基、低级亚环烷基、取代的低级亚环烷基、低级亚烯基、取代的低级亚烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、取代的亚杂烷基、低级亚杂环烷基、取代的低级亚杂环烷基、亚芳基、取代的亚芳基、亚杂芳基、取代的亚杂芳基、亚烷芳基、取代的亚烷芳基、亚芳烷基或取代的亚芳烷基；R是H、烷基、取代的烷基、环烷基、或取代的环烷基；R1是H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽、或多核苷酸；且R2是OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽、或多核苷酸；L是亚烷基、取代的亚烷基、N(R')(亚烷基)或N(R')(取代的亚烷基)，其中R'是H、烷基、取代的烷基、环烷基、或取代的环烷基。这样的非天然氨基酸可以是盐的形式，或可以并入到非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖、或多核苷酸中，以及可以被任选地翻译后修饰。
此外，包括具有式(XXXI)的结构的以下氨基酸：
其中：A是任选的，且当其存在时是低级亚烷基、取代的低级亚烷基、低级亚环烷基、取代的低级亚环烷基、低级亚烯基、取代的低级亚烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、取代的亚杂烷基、低级亚杂环烷基、取代的低级亚杂环烷基、亚芳基、取代的亚芳基、亚杂芳基、取代的亚杂芳基、亚烷芳基、取代的亚烷芳基、亚芳烷基或取代的亚芳烷基；R是H、烷基、取代的烷基、环烷基、或取代的环烷基；R1是H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽、或多核苷酸；且R2是OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽、或多核苷酸；X1是C、S、或S(O)；且n是0、1、2、3、4或5；且各CR8R9基团上的各R8和R9独立地选自由H、烷氧基、烷基胺、卤素、烷基、芳基所构成的组，或任意R8和R9可以一起形成═O或环烷基，或任意相邻的R8基团可以一起形成环烷基。这样的非天然氨基酸可以是盐的形式，或可以并入到非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖、或多核苷酸中，以及可以被任选地翻译后修饰。
此外，此外，包括具有式(XXXI-A)的结构的以下氨基酸：
其中：A是任选的，且当其存在时是低级亚烷基、取代的低级亚烷基、低级亚环烷基、取代的低级亚环烷基、低级亚烯基、取代的低级亚烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、取代的亚杂烷基、低级亚杂环烷基、取代的低级亚杂环烷基、亚芳基、取代的亚芳基、亚杂芳基、取代的亚杂芳基、亚烷芳基、取代的亚烷芳基、亚芳烷基或取代的亚芳烷基；R是H、烷基、取代的烷基、环烷基、或取代的环烷基；R1是H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽、或多核苷酸；且R2是OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽、或多核苷酸；n是0、1、2、3、4或5；且各CR8R9基团上的各R8和R9独立地选自由H、烷氧基、烷基胺、卤素、烷基、芳基所构成的组，或任意R8和R9可以一起形成═O或环烷基，或任意相邻的R8基团可以一起形成环烷基。这样的非天然氨基酸可以是盐的形式，或可以并入到非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖、或多核苷酸中，以及可以被任选地翻译后修饰。
此外，包括具有式(XXXI-B)的结构的以下氨基酸：
其中：A是任选的，且当其存在时是低级亚烷基、取代的低级亚烷基、低级亚环烷基、取代的低级亚环烷基、低级亚烯基、取代的低级亚烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、取代的亚杂烷基、低级亚杂环烷基、取代的低级亚杂环烷基、亚芳基、取代的亚芳基、亚杂芳基、取代的亚杂芳基、亚烷芳基、取代的亚烷芳基、亚芳烷基或取代的亚芳烷基；R是H、烷基、取代的烷基、环烷基、或取代的环烷基；R1是H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽、或多核苷酸；且R2是OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽、或多核苷酸；n是0、1、2、3、4或5；且各CR8R9基团上的各R8和R9独立地选自由H、烷氧基、烷基胺、卤素、烷基、芳基所构成的组，或任意R8和R9可以一起形成═O或环烷基，或任意相邻的R8基团可以一起形成环烷基。这样的非天然氨基酸可以是盐的形式，或可以并入到非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖、或多核苷酸中，以及可以被任选地翻译后修饰。
此外，包括具有式(XXXII)的结构的以下氨基酸：
其中：A是任选的，且当其存在时是低级亚烷基、取代的低级亚烷基、低级亚环烷基、取代的低级亚环烷基、低级亚烯基、取代的低级亚烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、取代的亚杂烷基、低级亚杂环烷基、取代的低级亚杂环烷基、亚芳基、取代的亚芳基、亚杂芳基、取代的亚杂芳基、亚烷芳基、取代的亚烷芳基、亚芳烷基或取代的亚芳烷基；R是H、烷基、取代的烷基、环烷基、或取代的环烷基；R1是H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽、或多核苷酸；且R2是OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽、或多核苷酸；X1是C、S、或S(O)；且L是亚烷基、取代的亚烷基、N(R')(亚烷基)或N(R')(取代的亚烷基)，其中R'是H、烷基、取代的烷基、环烷基、或取代的环烷基。这样的非天然氨基酸可以是盐的形式，或可以并入到非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖、或多核苷酸中，以及可以被任选地翻译后修饰。
此外，包括具有式(XXXII-A)的结构的以下氨基酸：
其中，A是任选的，且当其存在时是低级亚烷基、取代的低级亚烷基、低级亚环烷基、取代的低级亚环烷基、低级亚烯基、取代的低级亚烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、取代的亚杂烷基、低级亚杂环烷基、取代的低级亚杂环烷基、亚芳基、取代的亚芳基、亚杂芳基、取代的亚杂芳基、亚烷芳基、取代的亚烷芳基、亚芳烷基或取代的亚芳烷基；R是H、烷基、取代的烷基、环烷基、或取代的环烷基；R1是H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽、或多核苷酸；且R2是OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽、或多核苷酸；L是亚烷基、取代的亚烷基、N(R')(亚烷基)或N(R')(取代的亚烷基)，其中R'是H、烷基、取代的烷基、环烷基、或取代的环烷基。样的非天然氨基酸可以是盐的形式，或可以并入到非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖、或多核苷酸中，以及可以被任选地翻译后修饰。
此外，包括具有式(XXXII-B)的结构的以下氨基酸：
其中：A是任选的，且当其存在时是低级亚烷基、取代的低级亚烷基、低级亚环烷基、取代的低级亚环烷基、低级亚烯基、取代的低级亚烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、取代的亚杂烷基、低级亚杂环烷基、取代的低级亚杂环烷基、亚芳基、取代的亚芳基、亚杂芳基、取代的亚杂芳基、亚烷芳基、取代的亚烷芳基、亚芳烷基或取代的亚芳烷基；R是H、烷基、取代的烷基、环烷基、或取代的环烷基；R1是H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽、或多核苷酸；且R2是OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽、或多核苷酸；L是亚烷基、取代的亚烷基、N(R')(亚烷基)或N(R')(取代的亚烷基)，其中R'是H、烷基、取代的烷基、环烷基、或取代的环烷基。这样的非天然氨基酸可以是盐的形式，或可以并入到非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖、或多核苷酸中，以及可以被任选地翻译后修饰。
此外，包括具有式(XXXX)的结构的氨基酸：
其中：A是任选的，且当其存在时是低级亚烷基、取代的低级亚烷基、低级亚环烷基、取代的低级亚环烷基、低级亚烯基、取代的低级亚烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、取代的亚杂烷基、低级亚杂环烷基、取代的低级亚杂环烷基、亚芳基、取代的亚芳基、亚杂芳基、取代的亚杂芳基、亚烷芳基、取代的亚烷芳基、亚芳烷基或取代的亚芳烷基；
其中(a)表示与A基团键合，(b)表示与各个羰基键合，R3和R4独立地选自H、卤素、烷基、取代的烷基、环烷基、或取代的环烷基，或R3和R4或两个R3基团或两个R4基团任选地形成环烷基或杂环烷基；R是H、卤素、烷基、取代的烷基、环烷基、或取代的环烷基；T3是键、C(R)(R)、O或S，且R是H、卤素、烷基、取代的烷基、环烷基、或取代的环烷基；R1是H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽、或多核苷酸；且R2是OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽、或多核苷酸。这样的非天然氨基酸可以是盐的形式，或可以并入到非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖、或多核苷酸中，以及可以被任选地翻译后修饰。
此外，包括具有式(XXXXI)的结构的氨基酸：
其中：
其中(a)表示与A基团键合，(b)表示与各个羰基键合，R3和R4独立地选自H、卤素、烷基、取代的烷基、环烷基、或取代的环烷基，或R3和R4或两个R3基团或两个R4基团任选地形成环烷基或杂环烷基；R是H、卤素、烷基、取代的烷基、环烷基、或取代的环烷基；T3是键、C(R)(R)、O或S，且R是H、卤素、烷基、取代的烷基、环烷基、或取代的环烷基；R1是H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽、或多核苷酸；且R2是OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽、或多核苷酸；各Ra独立地选自由H、卤素、烷基、取代的烷基、-N(R')2、-C(O)kR'(其中k是1、2或3)、-C(O)N(R')2、-OR'、和-S(O)kR'所构成的组，其中各R'独立地是H、烷基或取代的烷基。这样的非天然氨基酸可以是盐的形式，或可以并入到非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖、或多核苷酸中，以及可以被任选地翻译后修饰。
此外，包括具有式(XXXXII)的结构的以下氨基酸：
其中：R是H、卤素、烷基、取代的烷基、环烷基、或取代的环烷基；且T3是O或S。这样的非天然氨基酸可以是盐的形式，或可以并入到非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖、或多核苷酸中，以及可以被任选地翻译后修饰。
此外，包括具有式(XXXXIII)的结构的氨基酸：
其中：R是H、卤素、烷基、取代的烷基、环烷基、或取代的环烷基。
此外，包括具有式(XXXXIII)的结构的以下氨基酸：
这样的非天然氨基酸可以是盐的形式，或可以并入到非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖、或多核苷酸中，以及可以被任选地翻译后修饰。
含有羟胺(也称为氨基氧基)基团的非天然氨基酸允许与各种亲电基团的反应，以形成偶联物(包括但不限于与PEG或其他水溶性聚合物)。像肼、酰肼、和氨基脲一样，氨基氧基的提高的亲核性允许它与有效且选择性地与含有羰基或二羰基(包括但不限于酮或醛)或具有相似化学反应性的其他官能团的各种分子反应。参见，例如，Shao,J.和Tam,J.,J.Am.Chem.Soc.117:3893-3899(1995)；H.Hang和C.Bertozzi,Acc.Chem.Res.34(9):727-736(2001)。而与肼基团的反应结果是相应的腙，然而，肟通常由氨基氧基与含有羰基或二羰基的基团(诸如，例如酮、醛)或具有相似化学反应性的其他官能团的反应产生。
因此，在某些实施方案中，本文描述了具有包含以下基团的侧链的非天然氨基酸：羟胺基团、类羟胺基团(其具有类似于羟胺基团的反应性，且结构上类似于羟胺基团)、经掩蔽的羟胺基团(其可以很容易转化成羟胺基团)、或经保护的羟胺基团(其一旦去保护具有类似于羟胺基团的反应性)。这样的氨基酸包括具有式(XIV)结构的氨基酸：
其中A是任选的，且当其存在时是低级亚烷基、取代的低级亚烷基、低级亚环烷基、取代的低级亚环烷基、低级亚烯基、取代的低级亚烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、取代的亚杂烷基、低级亚杂环烷基、取代的低级亚杂环烷基、亚芳基、取代的亚芳基、亚杂芳基、取代的亚杂芳基、亚烷芳基、取代的亚烷芳基、亚芳烷基或取代的亚芳烷基；B是任选的，且当其存在时是选自由以下连接基团所构成的组的连接基团：低级亚烷基、取代的低级亚烷基、低级亚烯基、取代的低级亚烯基、低级亚杂烷基、取代的低级亚杂烷基、-O-、-O-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-S(O)k-(其中k是1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、-C(O)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R')-、-NR'-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R')CO-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R')C(O)O-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N═、-C(R')═N-、-C(R')═N-N(R')-、-C(R')═N-N═、-C(R')2-N═N-、和-C(R')2-N(R')-N(R')-，其中各R'独立地是H、烷基或取代的烷基；K是-NR6R7或-N═CR6R7；R1是H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽、或多核苷酸；且R2是OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽、或多核苷酸；R3和R4各自独立地是H、卤素、低级烷基、或取代的低级烷基、或R3和R4或两个R3基团任选地形成环烷基或杂环烷基；R6和R7各自独立地选自由H、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、烷氧基、取代的烷氧基、聚亚烷基氧化物(polyalkylene oxide)、取代的聚亚烷基氧化物、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、烷芳基、取代的烷芳基、芳烷基、和取代的芳烷基、-C(O)R″、-C(O)2R″、-C(O)N(R″)2所构成的组，其中各R″独立地是H、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、烷氧基、取代的烷氧基、芳基、取代的芳基、杂芳基、烷芳基、取代的烷芳基、芳烷基、和取代的芳烷基；或R6或R7是L-X，其中X选自由以下所构成的组：标记物；染料；聚合物；水溶性聚合物；聚乙二醇衍生物；光交联剂；细胞毒化合物；药物；亲和标记物；光亲和标记物；反应化合物；树脂；第二蛋白或多肽或多肽类似物；抗体或抗体片段；金属螯合剂；辅因子；脂肪酸；碳水化合物；多核苷酸；DNA；RNA；反义多核苷酸；糖；水溶性树枝形聚合物；环糊精；生物材料；纳米粒子；自旋标记物；荧光团；含金属的部分；放射性部分；新官能团；与其他分子共价或非共价地相互作用的基团、光笼蔽部分；可光异构的部分；生物素；生物素类似物；并入重原子的部分；可化学切割的基团；可光切割的基团；延长的侧链；碳连接的糖；氧化还原活性剂；氨基硫代酸；有毒部分；同位素标记的部分；生物物理探针；磷光基团；化学发光基团；电子致密基团；磁性基团；嵌入基团；发色团；能量转移剂；生物活性剂；可检测的标记物；以及其任意组合；且L是任选的，且当其存在时是选自由以下连接基团所构成的组的连接基团：亚烷基、取代的亚烷基、亚烯基、取代的亚烯基、-O-、-O-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-S(O)k-(其中k是1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R')-、-NR'-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R')CO-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R')C(O)O-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N═、-C(R')═N-、-C(R')═N-N(R')-、-C(R')═N-N═、-C(R')2-N═N-、和-C(R')2-N(R')-N(R')-，其中各R'独立地是H、烷基或取代的烷基；这样的非天然氨基酸可以是盐的形式，或可以并入到非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖、或多核苷酸中，以及可以被任选地翻译后修饰。
在式(XIV)的化合物的某些实施方案中，A是亚苯基或取代的亚苯基。在式(XIV)的化合物的某些实施方案中，B是-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-O-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-S-(亚烷基或取代的亚烷基)-、或-C(O)-(亚烷基或取代的亚烷基)-。在式(XIV)的化合物的某些实施方案中，B是O(CH2)2-、-S(CH2)2-、-NH(CH2)2-、-CO(CH2)2-、或-(CH2)n-，其中n是1至4。在式(XIV)的化合物的某些实施方案中，R1是H、叔丁氧羰基(Boc)、9-芴甲氧羰基(Fmoc)、N-乙酰基、四氟乙酰基(TFA)、或苄氧羰基(Cbz)。在式(XIV)的化合物的某些实施方案中，R1是树脂、氨基酸、多肽、或多核苷酸。在式(XIV)的化合物的某些实施方案中，R2是OH、O-甲基、O-乙基或O-叔丁基。在式(XIV)的化合物的某些实施方案中，R2是树脂、氨基酸、多肽、或多核苷酸。在式(XIV)的化合物的某些实施方案中，R2是多核苷酸。在式(XIV)的化合物的某些实施方案中，R2是核醣核酸(RNA)。在式(XIV)的化合物的某些实施方案中，R2是tRNA。在式(XIV)的化合物的某些实施方案中，所述tRNA特定地识别密码子，所述密码子选自由以下密码子所构成的组：琥珀密码子、赭石密码子、卵白石密码子、独特密码子、罕用密码子、非天然密码子、五碱基密码子和四碱基密码子。在式(XIV)的化合物的某些实施方案中，R2是阻抑tRNA。在式(XIV)的化合物的某些实施方案中，R6和R7各自独立地选自由H、烷基、取代的烷基、烷氧基、取代的烷氧基、聚亚烷基氧化物、取代的聚亚烷基氧化物、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、烷芳基、取代的烷芳基、芳烷基、和取代的芳烷基。在式(XIV)的化合物的某些实施方案中，R6和R7各自独立地选自由H、甲基、苯基、和-[(亚烷基或取代的亚烷基)-O-(氢、烷基或取代的烷基)]x，其中x是1-50。在式(XIV)的化合物的某些实施方案中，K是-NR6R7。
在式(XIV)的化合物的某些实施方案中，X是生物活性剂，所述生物活性剂选自由肽、蛋白质、酶、抗体、药物、染料、脂质、核苷、寡核苷酸、细胞、病毒、质脂体、微粒、和胶束所构成的组。在式(XIV)的化合物的某些实施方案中，X是药物，所述药物选自由抗生素、杀真菌剂、抗病毒剂、抗炎剂、抗肿瘤剂、心血管剂、抗焦虑剂、激素、生长因子和甾体剂所构成的组。在式(XIV)的化合物的某些实施方案中，X是酶，所述酶选自由辣根过氧化酶、碱性磷酸酶、β半乳糖苷酶、和葡萄糖氧化酶所构成的组。在式(XIV)的化合物的某些实施方案中，X是可检测的标记物，所述可检测的标记物选自由荧光部分、磷光部分、化学发光部分、螯合部分、电子致密部分、磁性部分、嵌入部分、放射性部分、发色部分、和能量转移部分所构成的组。
在某些实施方案中，式(XIV)的化合物在偏酸性条件下、在水性条件中至少1个月是稳定的。在某些实施方案中，式(XIV)的化合物在偏酸性条件下至少2周是稳定的。在某些实施方案中，式(XIV)的化合物在偏酸性条件下至少5天是稳定的。在某些实施方案中，这样的酸性条件是pH 2至8。
这样的氨基酸包括具有式(XV)结构的氨基酸：
其中，A是任选的，且当其存在时是低级亚烷基、取代的低级亚烷基、低级亚环烷基、取代的低级亚环烷基、低级亚烯基、取代的低级亚烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、取代的亚杂烷基、低级亚杂环烷基、取代的低级亚杂环烷基、亚芳基、取代的亚芳基、亚杂芳基、取代的亚杂芳基、亚烷芳基、取代的亚烷芳基、亚芳烷基或取代的亚芳烷基；B是任选的，且当其存在时是选自由以下连接基团所构成的组的连接基团：低级亚烷基、取代的低级亚烷基、低级亚烯基、取代的低级亚烯基、低级亚杂烷基、取代的低级亚杂烷基、O-、-O-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-S(O)k-(其中k是1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、-C(O)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R')-、-NR'-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R')CO-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R')C(O)O-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N═、-C(R')═N-、-C(R')═N-N(R')-、-C(R')═N-N═、-C(R')2-N═N-、和-C(R')2-N(R')-N(R')-，其中各R'独立地是H、烷基或取代的烷基；R1是H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽、或多核苷酸；且R2是OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽、或多核苷酸；R3和R4各自独立地是H、卤素、低级烷基、或取代的低级烷基、或R3和R4或两个R3基团任选地形成环烷基或杂环烷基。这样的非天然氨基酸可以是盐的形式，或可以并入到非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖、或多核苷酸中，以及可以被任选地翻译后修饰。
非限制性、代表性氨基酸具有以下结构：
这样的非天然氨基酸可以是盐的形式，或可以并入到非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖、或多核苷酸中，以及可以被任选地翻译后修饰。
含有肟基团的非天然氨基酸允许与含有某些反应的羰基或二羰基基团(包括但不限于酮、醛或其他具有类似反应性的基团)的各种试剂的反应，以形成含有新的肟基团的新的非天然氨基酸。这样的肟交换反应允许非天然氨基酸的进一步的多功能化。进一步，含有肟基团的初始非天然氨基酸凭它们本身的条件可以是有用的，只要该肟连接在将氨基酸并入到多肽(例如本文所描述的活体内、体外、和化学合成方法)所必需的条件下是稳定的即可。
因此，在某些实施方案中，本文描述了具有含有以下基团的侧链的非天然氨基酸：肟基团、类肟基团(其具有类似于肟基团的反应性，且结构上类似于肟基团)、经掩蔽的肟基团(其可以很容易转化成肟基团)、或经保护的肟基团(其一旦去保护具有类似于肟基团的反应性)。这样的氨基酸包括具有式(XI)结构的氨基酸：
其中：A是任选的，且当其存在时是低级亚烷基、取代的低级亚烷基、低级亚环烷基、取代的低级亚环烷基、低级亚烯基、取代的低级亚烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、取代的亚杂烷基、低级亚杂环烷基、取代的低级亚杂环烷基、亚芳基、取代的亚芳基、亚杂芳基、取代的亚杂芳基、亚烷芳基、取代的亚烷芳基、亚芳烷基或取代的亚芳烷基；B是任选的，且当其存在时是选自由以下连接基团所构成的组的连接基团：低级亚烷基、取代的低级亚烷基、低级亚烯基、取代的低级亚烯基、低级亚杂烷基、取代的低级亚杂烷基、-O-、-O-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-S(O)k-(其中k是1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、-C(O)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R')-、-NR'-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R')CO-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R')C(O)O-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N═、-C(R')═N-、-C(R')═N-N(R')-、-C(R')═N-N═、-C(R')2-N═N-、和-C(R')2-N(R')-N(R')-，其中各R'独立地是H、烷基或取代的烷基；R是H、卤素、烷基、取代的烷基、环烷基、或取代的环烷基；R1是H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽、或多核苷酸；且R2是OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽、或多核苷酸；R3和R4各自独立地是H、卤素、低级烷基、或取代的低级烷基、或R3和R4或两个R3基团任选地形成环烷基或杂环烷基；R5是H、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、烷氧基、取代的烷氧基、烷基烷氧基、取代的烷基烷氧基、聚亚烷基氧化物、取代的聚亚烷基氧化物、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、烷芳基、取代的烷芳基、芳烷基、取代的芳烷基、-(亚烷基或取代的亚烷基)-ON(R″)2、-(亚烷基或取代的亚烷基)-C(O)SR'、-(亚烷基或取代的亚烷基)-S-S-(芳基或取代的芳基)、-C(O)R″、-C(O)2R″、或-C(O)N(R″)2，其中各R″独立地是H、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、烷氧基、取代的烷氧基、芳基、取代的芳基、杂芳基、烷芳基、取代的烷芳基、芳烷基、和取代的芳烷基；或R5是L-X，其中X选自由以下所构成的组：标记物；染料；聚合物；水溶性聚合物；聚乙二醇衍生物；光交联剂；细胞毒化合物；药物；亲和标记物；光亲和标记物；反应化合物；树脂；第二蛋白或多肽或多肽类似物；抗体或抗体片段；金属螯合剂；辅因子；脂肪酸；碳水化合物；多核苷酸；DNA；RNA；反义多核苷酸；糖；水溶性树枝形聚合物；环糊精；生物材料；纳米粒子；自旋标记物；荧光团；含金属的部分；放射性部分；新官能团；与其他分子共价或非共价地相互作用的基团、光笼蔽部分；可光异构的部分；生物素；生物素类似物；并入重原子的部分；可化学切割的基团；可光切割的基团；延长的侧链；碳连接的糖；氧化还原活性剂；氨基硫代酸；有毒部分；同位素标记的部分；生物物理探针；磷光基团；化学发光基团；电子致密基团；磁性基团；嵌入基团；发色团；能量转移剂；生物活性剂；可检测的标记物；以及其任意组合；且L是任选的，且当其存在时是选自由以下连接基团所构成的组的连接基团：亚烷基、取代的亚烷基、亚烯基、取代的亚烯基、-O-、-O-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-S(O)k-(其中k是1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R')-、-NR'-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R')CO-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R')C(O)O-、-(亚烷基或取代的亚烷基)-O-N═CR'-、-(亚烷基或取代的亚烷基)-C(O)NR'-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-(亚烷基或取代的亚烷基)-S(O)k-(亚烷基或取代的亚烷基)-S-、-(亚烷基或取代的亚烷基)-S-S-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N═、-C(R')═N-、-C(R')═N-N(R')-、-C(R')═N-N═、-C(R')2-N═N-、和-C(R')2-N(R')-N(R')-，其中，其中各R'独立地是H、烷基或取代的烷基；条件是当A和B不存在时，R是甲基。这样的非天然氨基酸可以是盐的形式，或可以并入到非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖、或多核苷酸中，以及可以被任选地翻译后修饰。
在式(XI)的化合物的某些实施方案中，B是-O-(亚烷基或取代的亚烷基)-。在式(XI)的化合物的某些实施方案中，B是O(CH2)-。在式(XI)的化合物的某些实施方案中，R是C1-4烷基。在式(XI)的化合物的某些实施方案中，R是-CH3。在式(XI)的化合物的某些实施方案中，R1是H、叔丁氧羰基(Boc)、9-芴甲氧羰基(Fmoc)、N-乙酰基、四氟乙酰基(TFA)、或苄氧羰基(Cbz)。在式(XI)的化合物的某些实施方案中，R1是树脂、氨基酸、多肽、或多核苷酸。在式(XI)的化合物的某些实施方案中，R2是OH、O-甲基、O-乙基或O-叔丁基。在式(XI)的化合物的某些实施方案中，R2是树脂、氨基酸、多肽、或多核苷酸。在式(XI)的化合物的某些实施方案中，R2是多核苷酸。在式(XI)的化合物的某些实施方案中，R2是核醣核酸(RNA)。在式(XI)的化合物的某些实施方案中，R2是tRNA。在式(XI)的化合物的某些实施方案中，所述tRNA特定地识别选择密码子。在式(XI)的化合物的某些实施方案中，所述密码子选自由以下密码子所构成的组：琥珀密码子、赭石密码子、卵白石密码子、独特密码子、罕用密码子、非天然密码子、五碱基密码子和四碱基密码子。在式(XI)的化合物的某些实施方案中，R2是阻抑tRNA。在式(XI)的化合物的某些实施方案中，R5是烷氧基、取代的烷氧基、聚亚烷基氧化物、取代的聚亚烷基氧化物或-C(O)2R″。在式(XI)的化合物的某些实施方案中，R5是-[(亚烷基或取代的亚烷基)-O-(氢、烷基或取代的烷基)]x，其中，x是1-50。在式(XI)的化合物的某些实施方案中，R5是-(CH2CH2)-O-CH3或-COOH。
在某些实施方案中，式(XI)的化合物在偏酸性条件下、在水性条件中至少1个月是稳定的。在某些实施方案中，式(XI)的化合物在偏酸性条件下至少2周是稳定的。在某些实施方案中，式(XI)的化合物在偏酸性条件下至少5天是稳定的。在某些实施方案中，这样的酸性条件是pH 2至8。
式(XI)的氨基酸包括具有式(XII)的结构的氨基酸：
其中，B是任选的，且当其存在时是选自由以下连接基团所构成的组的连接基团：低级亚烷基、取代的低级亚烷基、低级亚烯基、取代的低级亚烯基、低级亚杂烷基、取代的低级亚杂烷基、O-、-O-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-S(O)k-(其中k是1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、-C(O)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R')-、-NR'-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R')CO-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R')C(O)O-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N═、-C(R')═N-、-C(R')═N-N(R')-、-C(R')═N-N═、-C(R')2-N═N-、和-C(R')2-N(R')-N(R')-，其中各R'独立地是H、烷基或取代的烷基；R是H、烷基、取代的烷基、环烷基、或取代的环烷基；R1是H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽、或多核苷酸；且R2是OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽、或多核苷酸；R5是H、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、烷氧基、取代的烷氧基、烷基烷氧基、取代的烷基烷氧基、聚亚烷基氧化物、取代的聚亚烷基氧化物、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、烷芳基、取代的烷芳基、芳烷基、取代的芳烷基、-(亚烷基或取代的亚烷基)-ON(R″)2、-(亚烷基或取代的亚烷基)-C(O)SR'、-(亚烷基或取代的亚烷基)-S-S-(芳基或取代的芳基)、-C(O)R″、-C(O)2R″、或-C(O)N(R″)2，其中各R″独立地是H、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、烷氧基、取代的烷氧基、芳基、取代的芳基、杂芳基、烷芳基、取代的烷芳基、芳烷基、和取代的芳烷基；或R5是L-X，其中X选自由以下所构成的组：标记物；染料；聚合物；水溶性聚合物；聚乙二醇衍生物；光交联剂；细胞毒化合物；药物；亲和标记物；光亲和标记物；反应化合物；树脂；第二蛋白或多肽或多肽类似物；抗体或抗体片段；金属螯合剂；辅因子；脂肪酸；碳水化合物；多核苷酸；DNA；RNA；反义多核苷酸；糖；水溶性树枝形聚合物；环糊精；生物材料；纳米粒子；自旋标记物；荧光团；含金属的部分；放射性部分；新官能团；与其他分子共价或非共价地相互作用的基团、光笼蔽部分；可光异构的部分；生物素；生物素类似物；并入重原子的部分；可化学切割的基团；可光切割的基团；延长的侧链；碳连接的糖；氧化还原活性剂；氨基硫代酸；有毒部分；同位素标记的部分；生物物理探针；磷光基团；化学发光基团；电子致密基团；磁性基团；嵌入基团；发色团；能量转移剂；生物活性剂；可检测的标记物；以及其任意组合；且L是任选的，且当其存在时是选自由以下连接基团所构成的组的连接基团：亚烷基、取代的亚烷基、亚烯基、取代的亚烯基、-O-、-O-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-S(O)k-(其中k是1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R')-、-NR'-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R')CO-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R')C(O)O-、-(亚烷基或取代的亚烷基)-O-N═CR'-、-(亚烷基或取代的亚烷基)-C(O)NR'-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-(亚烷基或取代的亚烷基)-S(O)k-(亚烷基或取代的亚烷基)-S-、-(亚烷基或取代的亚烷基)-S-S-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N═、-C(R')═N-、-C(R')═N-N(R')-、-C(R')═N-N═、-C(R')2-N═N-、和-C(R')2-N(R')-N(R')-，其中，其中各R'独立地是H、烷基或取代的烷基。这样的非天然氨基酸可以是盐的形式，或可以并入到非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖、或多核苷酸中，以及可以被任选地翻译后修饰。
这样的氨基酸包括具有式(XIII)结构的氨基酸：
其中，R是H、烷基、取代的烷基、环烷基、或取代的环烷基；R1是H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽、或多核苷酸；且R2是OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽、或多核苷酸；R5是H、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、烷氧基、取代的烷氧基、烷基烷氧基、取代的烷基烷氧基、聚亚烷基氧化物、取代的聚亚烷基氧化物、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、烷芳基、取代的烷芳基、芳烷基、取代的芳烷基、-(亚烷基或取代的亚烷基)-ON(R″)2、-(亚烷基或取代的亚烷基)-C(O)SR'、-(亚烷基或取代的亚烷基)-S-S-(芳基或取代的芳基)、-C(O)R″、-C(O)2R″、或-C(O)N(R″)2，其中各R″独立地是H、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、烷氧基、取代的烷氧基、芳基、取代的芳基、杂芳基、烷芳基、取代的烷芳基、芳烷基、和取代的芳烷基；或R5是L-X，其中X选自由以下所构成的组：标记物；染料；聚合物；水溶性聚合物；聚乙二醇衍生物；光交联剂；细胞毒化合物；药物；亲和标记物；光亲和标记物；反应化合物；树脂；第二蛋白或多肽或多肽类似物；抗体或抗体片段；金属螯合剂；辅因子；脂肪酸；碳水化合物；多核苷酸；DNA；RNA；反义多核苷酸；糖；水溶性树枝形聚合物；环糊精；生物材料；纳米粒子；自旋标记物；荧光团；含金属的部分；放射性部分；新官能团；与其他分子共价或非共价地相互作用的基团、光笼蔽部分；可光异构的部分；生物素；生物素类似物；并入重原子的部分；可化学切割的基团；可光切割的基团；延长的侧链；碳连接的糖；氧化还原活性剂；氨基硫代酸；有毒部分；同位素标记的部分；生物物理探针；磷光基团；化学发光基团；电子致密基团；磁性基团；嵌入基团；发色团；能量转移剂；生物活性剂；可检测的标记物；以及其任意组合；且L是任选的，且当其存在时是选自由以下连接基团所构成的组的连接基团：亚烷基、取代的亚烷基、亚烯基、取代的亚烯基、-O-、-O-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-S(O)k-(其中k是1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R')-、-NR'-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R')CO-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R')C(O)O-、-(亚烷基或取代的亚烷基)-O-N═CR'-、-(亚烷基或取代的亚烷基)-C(O)NR'-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-(亚烷基或取代的亚烷基)-S(O)k-(亚烷基或取代的亚烷基)-S-、-(亚烷基或取代的亚烷基)-S-S-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N═、-C(R')═N-、-C(R')═N-N(R')-、-C(R')═N-N═、-C(R')2-N═N-、和-C(R')2-N(R')-N(R')-，其中，其中各R'独立地是H、烷基或取代的烷基；这样的非天然氨基酸可以是盐的形式，或可以并入到非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖、或多核苷酸中，以及可以被任选地翻译后修饰。
这样的氨基酸的进一步的非限定性实例包括具有以下结构的氨基酸：
这样的非天然氨基酸可以是盐的形式，或可以并入到非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖、或多核苷酸中，以及可以被任选地翻译后修饰。
此外，这样的氨基酸的包括具有式(XIV)的结构的氨基酸：
其中：A是任选的，且当其存在时是低级亚烷基、取代的低级亚烷基、低级亚环烷基、取代的低级亚环烷基、低级亚烯基、取代的低级亚烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、取代的亚杂烷基、低级亚杂环烷基、取代的低级亚杂环烷基、亚芳基、取代的亚芳基、亚杂芳基、取代的亚杂芳基、亚烷芳基、取代的亚烷芳基、亚芳烷基或取代的亚芳烷基；B是任选的，且当其存在时是选自由以下连接基团所构成的组的连接基团：低级亚烷基、取代的低级亚烷基、低级亚烯基、取代的低级亚烯基、低级亚杂烷基、取代的低级亚杂烷基、-O-、-O-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-S(O)k-(其中k是1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、-C(O)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R')-、-NR'-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R')CO-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R')C(O)O-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N═、-C(R')═N-、-C(R')═N-N(R')-、-C(R')═N-N═、-C(R')2-N═N-、和-C(R')2-N(R')-N(R')-，其中各R'独立地是H、烷基或取代的烷基；K是-NR6R7或-N═CR6R7；R1是H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽、或多核苷酸；且R2是OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽、或多核苷酸；R3和R4各自独立地是H、卤素、低级烷基、或取代的低级烷基、或R3和R4或两个R3基团任选地形成环烷基或杂环烷基；R6和R7各自独立地选自由H、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、烷氧基、取代的烷氧基、聚亚烷基氧化物、取代的聚亚烷基氧化物、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、烷芳基、取代的烷芳基、芳烷基、和取代的芳烷基、-C(O)R″、-C(O)2R″、-C(O)N(R″)2所构成的组，其中各R″独立地是H、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、烷氧基、取代的烷氧基、芳基、取代的芳基、杂芳基、烷芳基、取代的烷芳基、芳烷基、和取代的芳烷基；或R6或R7是L-X，其中X选自由以下所构成的组：标记物；染料；聚合物；水溶性聚合物；聚乙二醇衍生物；光交联剂；细胞毒化合物；药物；亲和标记物；光亲和标记物；反应化合物；树脂；第二蛋白或多肽或多肽类似物；抗体或抗体片段；金属螯合剂；辅因子；脂肪酸；碳水化合物；多核苷酸；DNA；RNA；反义多核苷酸；糖；水溶性树枝形聚合物；环糊精；生物材料；纳米粒子；自旋标记物；荧光团；含金属的部分；放射性部分；新官能团；与其他分子共价或非共价地相互作用的基团、光笼蔽部分；可光异构的部分；生物素；生物素类似物；并入重原子的部分；可化学切割的基团；可光切割的基团；延长的侧链；碳连接的糖；氧化还原活性剂；氨基硫代酸；有毒部分；同位素标记的部分；生物物理探针；磷光基团；化学发光基团；电子致密基团；磁性基团；嵌入基团；发色团；能量转移剂；生物活性剂；可检测的标记物；以及其任意组合；且L是任选的，且当其存在时是选自由以下连接基团所构成的组的连接基团：亚烷基、取代的亚烷基、亚烯基、取代的亚烯基、-O-、-O-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-S(O)k-(其中k是1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R')-、-NR'-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R')CO-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R')C(O)O-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N═、-C(R')═N-、-C(R')═N-N(R')-、-C(R')═N-N═、-C(R')2-N═N-、和-C(R')2-N(R')-N(R')-，其中各R'独立地是H、烷基或取代的烷基；这样的非天然氨基酸可以是盐的形式，或可以并入到非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖、或多核苷酸中，以及可以被任选地翻译后修饰。
这样的氨基酸进一步包括具有式(XVI)的结构的氨基酸：
其中A是任选的，且当其存在时是低级亚烷基、取代的低级亚烷基、低级亚环烷基、取代的低级亚环烷基、低级亚烯基、取代的低级亚烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、取代的亚杂烷基、低级亚杂环烷基、取代的低级亚杂环烷基、亚芳基、取代的亚芳基、亚杂芳基、取代的亚杂芳基、亚烷芳基、取代的亚烷芳基、亚芳烷基或取代的亚芳烷基；B是任选的，且当其存在时是选自由以下连接基团所构成的组的连接基团：低级亚烷基、取代的低级亚烷基、低级亚烯基、取代的低级亚烯基、低级亚杂烷基、取代的低级亚杂烷基、-O-、-O-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-S(O)k-(其中k是1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、-C(O)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R')-、-NR'-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R')CO-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R')C(O)O-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N═、-C(R')═N-、-C(R')═N-N(R')-、-C(R')═N-N═、-C(R')2-N═N-、和-C(R')2-N(R')-N(R')-，其中各R'独立地是H、烷基或取代的烷基；R1是H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽、或多核苷酸；且R2是OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽、或多核苷酸；R3和R4各自独立地是H、卤素、低级烷基、或取代的低级烷基、或R3和R4或两个R3任选地形成环烷基或杂环烷基；R6和R7各自独立地选自由H、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、烷氧基、取代的烷氧基、聚亚烷基氧化物、取代的聚亚烷基氧化物、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、烷芳基、取代的烷芳基、芳烷基、和取代的芳烷基、-C(O)R″、-C(O)2R″、-C(O)N(R″)2所构成的组，其中各R″独立地是H、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、烷氧基、取代的烷氧基、芳基、取代的芳基、杂芳基、烷芳基、取代的烷芳基、芳烷基、和取代的芳烷基；或R6或R7是L-X，其中X选自由以下所构成的组：标记物；染料；聚合物；水溶性聚合物；聚乙二醇衍生物；光交联剂；细胞毒化合物；药物；亲和标记物；光亲和标记物；反应化合物；树脂；第二蛋白或多肽或多肽类似物；抗体或抗体片段；金属螯合剂；辅因子；脂肪酸；碳水化合物；多核苷酸；DNA；RNA；反义多核苷酸；糖；水溶性树枝形聚合物；环糊精；生物材料；纳米粒子；自旋标记物；荧光团；含金属的部分；放射性部分；新官能团；与其他分子共价或非共价地相互作用的基团、光笼蔽部分；可光异构的部分；生物素；生物素类似物；并入重原子的部分；可化学切割的部分；可光切割的基团；延长的侧链；碳连接的糖；氧化还原活性剂；氨基硫代酸；有毒部分；同位素标记的部分；生物物理探针；磷光基团；化学发光基团；电子致密基团；磁性基团；嵌入基团；发色团；能量转移剂；生物活性剂；可检测的标记物；以及其任意组合；且L是任选的，且当其存在时是选自由以下连接基团所构成的组的连接基团：亚烷基、取代的亚烷基、亚烯基、取代的亚烯基、-O-、-O-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-S(O)k-(其中k是1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R')-、-NR'-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R')CO-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R')C(O)O-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N═、-C(R')═N-、-C(R')═N-N(R')-、-C(R')═N-N═、-C(R')2-N═N-、和-C(R')2-N(R')-N(R')-，其中各R'独立地是H、烷基或取代的烷基；这样的非天然氨基酸可以是盐的形式，或可以并入到非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖、或多核苷酸中，以及可以被任选地翻译后修饰。
进一步，这样的氨基酸包括具有式(XVII)的结构的氨基酸：
B是任选的，且当其存在时是选自由以下连接基团所构成的组的连接基团：低级亚烷基、取代的低级亚烷基、低级亚烯基、取代的低级亚烯基、低级亚杂烷基、取代的低级亚杂烷基、O-、-O-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-S(O)k-(其中k是1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、-C(O)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R')-、-NR'-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R')CO-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R')C(O)O-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N═、-C(R')═N-、-C(R')═N-N(R')-、-C(R')═N-N═、-C(R')2-N═N-、和-C(R')2-N(R')-N(R')-，其中各R'独立地是H、烷基或取代的烷基；R1是H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽、或多核苷酸；且R2是OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽、或多核苷酸；R6和R7各自独立地选自由H、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、烷氧基、取代的烷氧基、聚亚烷基氧化物、取代的聚亚烷基氧化物、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、烷芳基、取代的烷芳基、芳烷基、和取代的芳烷基、-C(O)R″、-C(O)2R″、-C(O)N(R″)2所构成的组，其中各R″独立地是H、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、烷氧基、取代的烷氧基、芳基、取代的芳基、杂芳基、烷芳基、取代的烷芳基、芳烷基、和取代的芳烷基；或R6或R7是L-X，其中X选自由以下所构成的组：标记物；染料；聚合物；水溶性聚合物；聚乙二醇衍生物；光交联剂；细胞毒化合物；药物；亲和标记物；光亲和标记物；反应化合物；树脂；第二蛋白或多肽或多肽类似物；抗体或抗体片段；金属螯合剂；辅因子；脂肪酸；碳水化合物；多核苷酸；DNA；RNA；反义多核苷酸；糖；水溶性树枝形聚合物；环糊精；生物材料；纳米粒子；自旋标记物；荧光团；含金属的部分；放射性部分；新官能团；与其他分子共价或非共价地相互作用的基团、光笼蔽部分；可光异构的部分；生物素；生物素类似物；并入重原子的部分；可化学切割的基团；可光切割的基团；延长的侧链；碳连接的糖；氧化还原活性剂；氨基硫代酸；有毒部分；同位素标记的部分；生物物理探针；磷光基团；化学发光基团；电子致密基团；磁性基团；嵌入基团；发色团；能量转移剂；生物活性剂；可检测的标记物；以及其任意组合；且L是任选的，且当其存在时是选自由以下连接基团所构成的组的连接基团：亚烷基、取代的亚烷基、亚烯基、取代的亚烯基、-O-、-O-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-S(O)k-(其中k是1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R')-、-NR'-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R')CO-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R')C(O)O-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N═、-C(R')═N-、-C(R')═N-N(R')-、-C(R')═N-N═、-C(R')2-N═N-、和-C(R')2-N(R')-N(R')-，其中各R'独立地是H、烷基或取代的烷基。
这样的氨基酸的非限定性实例包括具有以下结构的氨基酸：
这样的非天然氨基酸可以是盐的形式，或可以并入到非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖、或多核苷酸中，以及可以被任选地翻译后修饰。
此外，这样的氨基酸包括具有式(XVIII)结构的氨基酸：
其中：B是任选的，且当其存在时是选自由以下连接基团所构成的组的连接基团：低级亚烷基、取代的低级亚烷基、低级亚烯基、取代的低级亚烯基、低级亚杂烷基、取代的低级亚杂烷基、-O-、-O-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-S(O)k-(其中k是1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、-C(O)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R')-、-NR'-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R')CO-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R')C(O)O-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N═、-C(R')═N-、-C(R')═N-N(R')-、-C(R')═N-N═、-C(R')2-N═N-、和-C(R')2-N(R')-N(R')-，其中各R'独立地是H、烷基或取代的烷基；R1是H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽、或多核苷酸；且R2是OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽、或多核苷酸；R6和R7各自独立地选自由H、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、烷氧基、取代的烷氧基、聚亚烷基氧化物、取代的聚亚烷基氧化物、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、烷芳基、取代的烷芳基、芳烷基、和取代的芳烷基、-C(O)R″、-C(O)2R″、-C(O)N(R″)2所构成的组，其中各R″独立地是H、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、烷氧基、取代的烷氧基、芳基、取代的芳基、杂芳基、烷芳基、取代的烷芳基、芳烷基、和取代的芳烷基；或R6或R7是L-X，其中X选自由以下所构成的组：标记物；染料；聚合物；水溶性聚合物；聚乙二醇衍生物；光交联剂；细胞毒化合物；药物；亲和标记物；光亲和标记物；反应化合物；树脂；第二蛋白或多肽或多肽类似物；抗体或抗体片段；金属螯合剂；辅因子；脂肪酸；碳水化合物；多核苷酸；DNA；RNA；反义多核苷酸；糖；水溶性树枝形聚合物；环糊精；生物材料；纳米粒子；自旋标记物；荧光团；含金属的部分；放射性部分；新官能团；与其他分子共价或非共价地相互作用的基团、光笼蔽部分；可光异构的部分；生物素；生物素类似物；并入重原子的部分；可化学切割的基团；可光切割的基团；延长的侧链；碳连接的糖；氧化还原活性剂；氨基硫代酸；有毒部分；同位素标记的部分；生物物理探针；磷光基团；化学发光基团；电子致密基团；磁性基团；嵌入基团；发色团；能量转移剂；生物活性剂；可检测的标记物；以及其任意组合；且L是任选的，且当其存在时是选自由以下连接基团所构成的组的连接基团：亚烷基、取代的亚烷基、亚烯基、取代的亚烯基、-O-、-O-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-S(O)k-(其中k是1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R')-、-NR'-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R')CO-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R')C(O)O-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N═、-C(R')═N-、-C(R')═N-N(R')-、-C(R')═N-N═、-C(R')2-N═N-、和-C(R')2-N(R')-N(R')-，其中各R'独立地是H、烷基或取代的烷基；且各Ra独立地选自由H、卤素、烷基、取代的烷基、-N(R')2、-C(O)kR'(其中k是1、2或3)、-C(O)N(R')2、-OR'、和-S(O)kR'所构成的组，其中各R'独立地是H、烷基或取代的烷基，且n是0至8。这样的非天然氨基酸可以是盐的形式，或可以并入到非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖、或多核苷酸中，以及可以被任选地翻译后修饰。
这样的氨基酸的非限制性实例包括具有以下结构的氨基酸：
这样的非天然氨基酸可以是盐的形式，或可以并入到非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖、或多核苷酸中，以及可以被任选地翻译后修饰。
在某些实施方案中，所述非天然氨基酸可以根据式XIX：
或其盐，其中：D是-Ar-W3-或-W1-Y1-C(O)-Y2-W2-；Ar是
W1、W2、和W3各自独立地是单键或低级亚烷基；各X1独立地是-NH-、-O-、或-S-；各Y1独立地是单键、-NH-、或-O-；各Y2独立地是单键、-NH-、-O-、或N-连接的或C-连接的亚吡咯烷基；Z1、Z2、和Z3中的一个是-N-，且Z1、Z2、和Z3中的其他的独立地是-CH-。在某些实施方案中，所述非天然酸根据式XIXa：
其中D是在式XIX的情况中被定义的。在某些实施方案中，所述非天然氨基酸根据式XIXb：
或其盐，其中W4是C1-C10亚烷基。在进一步的实施方案中，W4是C1-C5亚烷基。在某些实施方案中，W4是C1-C3亚烷基。在实施方案中，W4是C1亚烷基。在特定的实施方案中，所述非天然氨基酸选自由以下氨基酸所构成的组：
或它们的盐。这样的非天然氨基酸可以是盐的形式，或可以并入到非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖、或多核苷酸中，以及可以被任选地翻译后修饰。
连接基团和有效载荷
在某些实施方案中，所述抗体包含如上所描述的具有反应基团的非天然氨基酸。本领域技术人员可以使用反应基团来直接地或间接地经由连接基团将抗体连接到能够与所述非天然氨基酸形成共价键的任意分子实体。
有用的连接基团包括在以上的部分中所描述的那些。在某些实施方案中，所述连接基团是本领域技术人员已知的任意二价或多价连接基团。一般而言，所述连接基团能够与所述非天然氨基酸的官能部分R和α碳形成共价键。有用的二价连接基团包括键、亚烷基、取代的亚烷基、亚杂烷基、取代的亚杂烷基、亚芳基、取代的亚芳基、亚杂芳基和取代的亚杂芳基。在某些实施方案中，所述连接基团是C1-10亚烷基或C1-10亚杂烷基。
所述分子有效载荷可以是本领域技术人员期望偶联到抗体的任意分子实体。在某些实施方案中，所述有效载荷是治疗性部分。在这样的实施方案中，所述抗体偶联物可以用于将所述治疗性部分靶向它的分子靶标。在某些实施方案中，所述有效载荷是标记部分。在这样的实施方案中，所述抗体偶联物可以用于检测所述抗体与它的靶标的结合。在某些实施方案中，所述有效载荷是细胞毒部分。在这样的实施方案中，所述抗体偶联物可以用于将所述细胞毒部分靶向病变细胞，例如癌细胞，以引发对该细胞进行破坏或消除。对本领域技术人员而言是显而易见的、包含其他分子有效载荷的偶联物在本文所描述的偶联物的范围内。
在某些实施方案中，偶联物可以具有选自由以下所构成的组的有效载荷：标记物、染料、聚合物、水溶性聚合物、聚乙二醇、聚乙二醇衍生物、光交联剂、细胞毒化合物、放射性核素、药物、亲和标记物、光亲和标记物、反应化合物、树脂、第二蛋白或多肽或多肽类似物、抗体或抗体片段、金属螯合剂、辅因子、脂肪酸、碳水化合物、多核苷酸、DNA、RNA、反义多核苷酸、肽、水溶性树枝形聚合物、环糊精、抑制性核醣核酸、生物材料、纳米粒子、自旋标记物、荧光团、含金属的部分、放射性部分、新官能团、与其他分子共价或非共价地相互作用的基团、光笼蔽部分、可光异构的部分、生物素、生物素衍生物、生物素类似物、并入重原子的部分、可化学切割的基团、可光切割的基团、延长的侧链、碳连接的糖、氧化还原活性剂、氨基硫代酸、有毒部分、同位素标记的部分、生物物理探针、磷光基团、化学发光基团、电子致密基团、磁性基团、嵌入基团、发色团、能量转移剂、生物活性剂、可检测的标记物、小分子、或其任意组合。
有用的药物有效载荷包括任意细胞毒、抑制细胞生长的或免疫调节药物。有用的细胞毒或免疫调节剂种类包括例如抗微管蛋白剂、阿里他汀(auristatin)、DNA小沟结合剂、DNA复制抑制剂、烷化剂(例如，诸如顺铂、单(铂)、双(铂)和三核铂配合物和卡铂等铂配合物)、蒽环类、抗生素、叶酸拮抗剂、抗代谢物、钙调蛋白抑制剂、化疗增敏剂、倍癌霉素(duocarmycins)、依托泊苷、氟化的嘧啶、离子载体、莱希特平(lexitropsins)、类美坦素(maytansinoids)、亚硝基脲、氨氯铂、成孔化合物、嘌呤抗代谢物、嘌呤霉素、放疗增敏剂、雷帕霉素、类固醇、拓朴异构酶抑制剂、长春花生物碱等。
单个的细胞毒或免疫调节剂包括例如雄性激素、安曲霉素(AMC)、天冬酰胺酶、5-氮胞苷、硫唑嘌呤、博莱霉素、白消安、丁硫氨酸亚砜亚胺、卡里奇霉素(calicheamicin)、卡里奇霉素衍生物、喜树碱、卡铂、卡莫司汀(BSNU)、CC-1065、苯丁酸氮芥、顺铂、秋水仙碱、环磷酰胺、阿糖胞苷、胞苷阿拉伯糖苷(cytidine arabinoside)、细胞松弛素B、达卡巴嗪、放线菌素D(原名放线菌素)、柔红霉素、氨烯咪胺(decarbazine)、DM1、DM4、多西紫杉醇、阿霉素、依托泊苷、雌性激素、5-氟脱氧尿苷、5-氟尿嘧啶、吉西他滨、短杆菌肽D、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、伊立替康、洛莫司汀(CCNU)、美登素、氮芥、米尔法兰、6-巯基嘌呤、甲氨蝶呤、光辉霉素、丝裂霉素C、米托蒽醌、硝基咪唑、紫杉醇、岩沙海葵毒素、普卡霉素、甲基苄肼(procarbizine)、利索新(rhizoxin)、链脲佐菌素、替尼泊苷(tenoposide)、6-硫代鸟嘌呤、噻替哌、拓扑替康、长春碱、长春新碱、长春瑞滨、VP-16和VM-26。
在一些实施方案中，合适的细胞毒剂包括例如DNA小沟结合剂(例如烯二炔类和莱希特平，CBI化合物；还参见专利号为6,130,237的美国专利)、倍癌霉素、紫杉烷(例如紫杉醇和多西紫杉醇)、嘌呤霉素、长春花生物碱、CC-1065、SN-38、拓扑替康、吗啉代阿霉素、利索新、氰基吗啉代阿霉素、棘霉素、康普瑞汀、纺锤菌素、埃博霉素A和B、雌莫司汀、念珠藻素(cryptophycins)、西马多丁(cemadotin)、类美坦素、圆皮海绵内酯、艾榴塞洛素(Eleutherobin)、和米托蒽醌。
在一些实施方案中，所述有效载荷是抗微管蛋白剂。抗微管蛋白剂的实例包括但不限于紫杉烷(例如(紫杉醇)、(多西紫杉醇))、T67(Tularik)、和长春花生物碱(vinca alkyloids)(例如，长春新碱、长春碱、长春地辛、和长春瑞滨)。其他的抗微管蛋白剂包括例如巴卡丁衍生物、紫杉烷类似物、埃博霉素(例如埃博霉素A和B)、诺考达唑、秋水仙碱和colcimid、雌莫司汀、念珠藻素、西马多丁、类美坦素、康普瑞汀、圆皮海绵内酯和艾榴塞洛素。
在某些实施方案中，所述细胞毒剂是类美坦素、另一抗微管蛋白剂组。例如，在特定的实施方案中，所述类美坦素可以是美登素或DM-1(ImmunoGen公司；还参见Chari等，1992,Cancer Res.52:127-131)。
在一些实施方案中，所述有效载荷是阿里他汀，诸如阿里他汀E或其衍生物。例如，阿里他汀E衍生物可以是阿里他汀E和酮酸之间形成的酯。例如，阿里他汀E可以与对乙酰基苯甲酸或苯甲酰基戊酸反应以分别生成AEB和AEVB。其他典型的阿里他汀衍生物包括AFP、MMAF和MMAE。阿里他汀衍生物的合成和结构在以下文献中有描述：公开号为2003-0083263、2005-0238649和2005-0009751的美国专利申请；公开号为WO 04/010957的国际专利、公开号为WO 02/088172的国际专利、以及专利号为以下的美国专利：6,323,315；6,239,104；6,034,065；5,780,588；5,665,860；5,663,149；5,635,483；5,599,902；5,554,725；5,530,097；5,521,284；5,504,191；5,410,024；5,138,036；5,076,973；4,986,988；4,978,744；4,879,278；4,816,444；和4,486,414。
在一些实施方案中，所述有效载荷不是放射性同位素。在一些实施方案中，所述有效载荷不是放射性的。
在一些实施方案中，所述有效载荷是抗代谢物。所述抗代谢物可以是例如嘌呤拮抗剂(例如硫唑嘌呤或霉酚酸酯)、二氢叶酸还原酶抑制剂(例如甲氨蝶呤)、阿昔洛韦、更昔洛韦、齐多夫定、阿糖腺苷、利巴伟林(ribavarin)、叠氮胸苷、胞苷阿拉伯糖苷、金刚烷胺、二脱氧尿苷、碘脱氧尿苷、膦甲酸(poscarnet)、三氟尿苷。
在其他实施方案中，所述有效载荷是他克莫司、环孢菌素、FU506或雷帕霉素。在进一步的实施方案中，所述药物是阿地白介素、阿仑单抗、阿利维A酸(alitretinoin)、别嘌呤醇、六甲蜜胺、氨磷汀、阿那曲唑、三氧化二砷、蓓萨罗丁、蓓萨罗丁、卡鲁睾酮(calusterone)、卡培他滨、塞来昔布、克拉屈滨、阿法达贝泊汀、地尼白介素(Denileukin diftitox)、右丙亚胺、屈他雄酮丙酸酯、表阿霉素、阿法依伯汀、雌莫司汀、依西美坦、非格司亭、氟尿苷、氟达拉滨、氟维司群、吉西他滨、吉妥珠单抗奥唑米星(gemtuzumab ozogamicin)(MYLOTARG)、戈舍瑞林、伊达比星、异环磷酰胺、甲磺酸伊马替尼、干扰素α-2a中、伊立替康、来曲唑、亚叶酸、左旋咪唑、双氯乙基甲胺(meclorethamine)或氮芥、甲地孕酮、美司钠、甲氨蝶呤、甲氧沙林、丝裂霉素C、米托坦、苯丙酸诺龙、奥普瑞白介素、奥沙利铂、帕米膦酸盐(pamidronate)、培加酶(pegademase)、培门冬酶(pegaspargase)、培非格司亭(pegfilgrastim)、喷司他丁、哌泊溴烷、普卡霉素、卟菲尔钠、甲基苄肼、阿的平、拉布立酶、利妥昔单抗、沙格司亭、链脲霉素、他莫昔芬、替莫唑胺、替尼泊苷、睾内酯、硫鸟嘌呤、托瑞米芬、托西莫单抗、曲妥珠单抗(赫赛汀)、维甲酸、尿嘧啶氮芥、戊柔比星、长春碱、长春新碱、长春瑞滨或唑来膦酸盐。
在一些实施方案中，所述有效载荷是是免疫调节剂。所述免疫调节剂可以是例如更昔洛韦、依那西普、他克莫司、环孢菌素、雷帕霉素、环磷酰胺、硫唑嘌呤、霉酚酸酯或甲氨蝶呤。替代性地，所述免疫调节剂可以是，例如，糖皮质激素(如皮质醇或醛固酮)或糖皮质激素类似物(例如，泼尼松或地塞米松)。
在一些实施方案中，所述免疫调节剂是抗炎剂，诸如芳基羧基衍生物，含吡唑衍生物，昔康类衍生物和烟酸衍生物。抗炎剂的种类包括例如环氧合酶抑制剂、5-脂氧合酶抑制剂、白三烯受体拮抗剂。
合适的环氧合酶抑制剂包括甲氯芬那酸、甲芬那酸、卡洛芬、双氯芬酸、二氟尼柳、芬布芬(fenbufen)、非诺洛芬、吲哚美辛、酮洛芬、萘丁美酮、舒林酸、替诺昔康和托美丁。
合适的脂氧合酶抑制剂包括氧化还原抑制剂(例如，儿茶酚丁烷衍生物、去甲二氢愈创木酸(NDGA)、马索罗酚(masoprocol)、菲尼酮、Ianopalen、吲唑啉酮(indazolinones)、naphazatrom、苯并呋喃、烷基羟胺)和非氧化还原抑制剂(例如，羟基噻唑、甲氧基烷基噻唑、苯并吡喃及其衍生物、甲氧基四氢吡喃、乳香酸和乳香酸的乙酰化了的衍生物，和用环烷基取代的喹啉甲氧基苯乙酸)，以及氧化还原抑制剂的前体。
其它合适的脂氧合酶抑制剂包括抗氧化剂(例如，酚类、没食子酸丙酯、黄酮类和/或天然存在的底物，所述天然存在的底物含有黄酮类，黄酮类的羟基化的衍生物、黄酮醇、二氢槲皮素、木犀草素、高良姜素、奥洛波尔(orobol)、查耳酮的衍生物、4,2',4'-三羟基查耳酮、邻氨基苯酚、N-羟基脲、苯并呋喃、依布硒和增加还原含硒酶的活性的物种)、铁螯合剂(例如，异羟肟酸及其衍生物、N-羟基脲、2-苄基-1-萘酚、儿茶酚、羟胺、鼠尾草酚trolox C、儿茶酚、萘酚、柳氮磺胺吡啶、zyleuton、5-羟基邻氨基苯甲酸和4-(ω-芳烷基)苯基烷酸)、含咪唑化合物(例如，酮康唑和伊曲康唑)、吩噻嗪、和苯并吡喃衍生物。
还有其他的合适的脂氧合酶抑制剂包括类花生酸抑制剂(例如，十八碳四烯酸、二十碳四烯酸、二十二碳五烯酸、二十碳六烯酸和二十二碳六羧酸及其酯、PGE1(前列腺素E1)、PGA2(前列腺素A2)、维前列醇(viprostol)、15-单羟基二十碳四烯酸、15-单羟基-二十碳三烯酸、和15-单羟基-二十碳五烯酸、和白三烯B5、C5和D5)、干扰钙流的化合物、吩噻嗪、二苯基丁胺、维拉帕米、fuscoside、姜黄素、绿原酸、咖啡酸干扰，5,8,11,14-eicosatetrayenoic酸(ETYA)、羟基苯基维甲酰胺(hydroxyphenylretinamide)、Ionapalen、七叶苷、乙胺嗪、菲咯啉(phenantroline)、黄芩素、普昔罗米、硫醚、二烯丙基硫醚和二-(1-丙烯基)硫醚。
白三烯受体拮抗剂包括骨化三醇、昂唑司特(ontazolast)、BayerBay-x-1005、Ciba-Geigy CGS-25019C、依布硒、Leo Denmark ETH-615、Lilly LY-293111、Ono ONO-4057、Terumo TMK-688、Boehringer IngleheimBI-RM-270、Lilly LY213024、Lilly LY264086、Lilly LY292728、Ono ONOLB457、Pfizer 105696、Perdue Frederick PF10042、Rhone-Poulenc RorerRP66153、SmithKline Beecham SB-201146、SmithKline Beecham SB-201993、SmithKline Beecham SB-209247、Searle SC-53228、Sumitamo SM15178、American Home Products WAY 121006、Bayer Bay-o-8276、Warner-LambertCI-987、Warner-Lambert CI-987BPC-15LY 223982、Lilly LY 233569、LillyLY-255283、MacroNex MNX-160、Merck and Co.MK-591、Merck and Co.MK-886、Ono ONO-LB-448、Purdue Frederick PF-5901、Rhone-Poulenc RorerRG14893、Rhone-Poulenc Rorer RP 66364、Rhone-Poulenc Rorer RP 69698、Shionoogi S-2474、Searle SC-41930、Searle SC-50505、Searle SC-51146、Searle SC-52798、SmithKline Beecham SK&F-104493、Leo Denmark SR-2566、Tanabe T-757和Teijin TEI-1338。
其他有用的药物有效载荷包括可用于癌症的治疗的化学化合物。化学治疗剂的实例包括厄洛替尼(基因泰克/OSI制药公司)、硼替佐米(Millennium Pharm)、氟维司群(阿斯利康)、舒尼替尼(SU11248，辉瑞)、来曲唑(诺华)、甲磺酸伊马替尼(诺华)、PTK787/ZK222584(诺华)、奥沙利铂(赛诺菲)、5-FU(5-氟尿嘧啶)、醛氢叶酸(Leucovorin)、雷帕霉素(西罗莫司，惠氏)、拉帕替尼(GSK572016，葛兰素史克)、洛那法尼(Lonafarnib)(SCH66336)、索拉非尼(BAY43-9006，拜耳实验室)、和吉非替尼(阿斯利康)、AG1478、AG1571(SU5271；SUGEN)、诸如塞替派和环磷酰胺等烷基化剂；诸如白消安、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)等烷基磺酸盐；氮丙啶，如苯并多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替派；乙撑亚胺类和甲基蜜胺类(methylamelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三亚乙基蜜胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲基蜜胺；乙酰类(acetogenins)(尤其是布拉它辛(bullatacin)和布拉它辛酮(bullatacinone))；喜树碱(包括合成的类似物拓扑替康)；苔藓抑素；海绵多烯酮类物(callystatin)；CC-1065(包括它的阿多来新、卡折来新和比折来新合成的类似物)；念珠藻素(cryptophycin)(尤其是念珠藻素1和念珠藻素8)；海兔毒素；倍癌霉素(duocarmycin)(包括合成性类似物KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；水鬼蕉碱；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海绵素(spongistatin)；氮芥类如苯丁酸氮芥、萘氮芥(chlomaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀、异环磷酰胺、双氯乙基甲胺、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仓、新氮芥、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀、曲磷胺、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲类如卡莫司汀、氯脲霉素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、和雷莫司汀；抗生素如烯二炔类抗生素(例如，卡奇霉素(calicheamicin)，尤其刺孢霉素λll和刺孢霉素ωll(Angew Chem.Intl.Ed.Engl.(1994)33:183-186)；达内霉素，包括达内霉素A；二膦酸盐类如氯膦酸盐；埃斯培拉霉素(esperamicin)；以及新制癌菌素发色团和相关的色蛋白烯二炔抗生素发色团、阿克拉霉素、放线菌素、安曲霉素(anthramycin)、偶氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、卡柔比星(carabicin)、去甲柔红霉素(caminomycin)、嗜癌霉素、色霉素(chromomycinis)、放线菌素D、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、(阿霉素)、吗啉代-阿霉素、氰基吗啉代-阿霉素、2-吡咯啉代-阿霉素和去氧阿霉素、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素类如丝裂霉素C、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、培洛霉素、泊非霉素、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑霉素、链佐星、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星；抗代谢物如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物如二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤、曲美沙特；嘌呤类似物如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤(thiamniprine)、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷；雄激素类如卡普睾酮(calusterone)、屈他雄酮丙酸酯、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯；抗肾上腺类如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充物如亚叶酸(frolinic acid)；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；嗯尿嘧啶；安吖啶；bestrabucil；比生群；依达曲沙；地磷酰胺(defofamine)；秋水仙胺；地吖醌(diaziquone)；依氟鸟氨酸(delformithine)；依利醋铵(elliptinium acetate)；埃博霉素；依托格鲁；硝酸镓；羟脲；香菇多糖；氯尼达明(lonidainine)；类美坦素(maytansinoid)类如美登素和安丝菌素(ansamitocin)；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇(mopidanmol)；尼曲吖啶(nitraerine)；喷司他丁；苯来美特(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼酸(podophyllinicacid)；2-乙基酰肼(2-ethylhydrazide)；丙卡巴肼；多糖复合物(JHSNatural Products,Eugene,Oreg.)；丙亚胺(razoxane)；利索新；西佐喃(sizofuran)；锗螺胺(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2',2″-三氯三乙胺；单端孢霉烯族毒素(trichothecenes)(尤其是T-2毒素、疣孢菌素A(verracurin A)、杆孢菌素A(roridin A)和蛇形菌素(anguidine))；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；塞替派；紫杉烷类，例如，paclitaxel；Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton,N.J.)、(无乳浮(Cremophor))、紫杉醇的白蛋白工程化纳米粒子制剂((AmericanPharmaceutical Partners,Schaumberg,Ill.)和(多西他赛(doxetaxel)；Rhone-Poulenc Rorer,Antony,France)；苯丁酸氮芥(chloranmbucil)；(吉西他滨)；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物如顺铂和卡铂；长春碱；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；(长春瑞滨)；诺安托(novantrone)；替尼泊苷；依达曲沙；道诺霉素；氨基蝶呤；卡培他滨()；伊班膦酸盐；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类维生素A(retinoids)如维甲酸；以及以上任意药物的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
其他有用的有效载荷包括：(i)起到调节或抑制针对肿瘤的激素作用的抗激素剂，如抗雌激素剂和选择性雌激素受体调节剂(SERMs)，包括例如他莫昔芬(包括枸橼酸他莫昔芬)、雷洛昔芬、屈洛昔芬、4-羟他莫昔芬、曲沃昔芬、雷洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮和(枸橼酸托瑞米芬(toremifine citrate))；(ii)抑制酶芳香酶的芳香酶抑制剂，所述芳香酶调节肾上腺中的雌激素产生，诸如，例如4(5)-咪唑类、氨鲁米特、醋酸甲地孕酮、(依西美坦，辉瑞)、福美司坦(formestanie)、法倔唑(fadrozole)、伏氯唑(vorozole)、(来曲唑，诺华)和(阿那曲唑；阿斯利康)；(iii)抗雄激素剂如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林；以及曲沙他滨(troxacitabine)(1,3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；(iv)蛋白激酶抑制剂；(v)脂质激酶抑制剂；(vi)反义寡核苷酸，尤其抑制了涉及异常细胞增殖的信号通路中的基因(例如PKC-α、Ralf、H-Ras)的表达的那些反义寡核苷酸；(vii)核酶，如VEGF表达抑制剂(例如，)和HER2表达抑制剂；(viii)疫苗，如基因治疗疫苗，例如，和拓扑异构酶1抑制剂如rmRH；和(ix)抗血管生成剂，如贝伐单抗(Genentech)，和(x)上述药物中任意者的药学上可接受的盐、酸或衍生物。其他抗血管生成剂包括MMP-2(基质金属蛋白酶2)抑制剂、MMP-9(基质-金属蛋白酶9)抑制剂、COX-II(环氧合酶II)抑制剂、及VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂。这样的有用的、可与本发明的化合物/组合物联合使用的基质金属蛋白酶抑制剂的实例在以下文献中有描述：WO 96/33172、WO 96/27583、EP 818442、EP 1004578、WO 98/07697、WO 98/03516、WO 98/34918、WO 98/34915、WO 98/33768、WO 98/30566、EP 606,046、EP 931,788、WO 90/05719、WO 99/52910、WO 99/52889、WO 99/29667、WO 99/07675、EP 945864、U.S.Pat.No.5,863,949、U.S.Pat.No.5,861,510、和EP 780,386，将它们全部通过引用以其整体并入到本文中。VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂的实例包括4-(4-溴-2-氟苯胺基)-6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉(ZD6474；WO01/32651中的实施例2)、4-(4-氟-2-甲基吲哚-5-基氧基)-6-甲氧基-7-(3-吡咯烷-1-基丙氧基)-喹唑啉(AZD2171；WO00/47212中的实施例240)、瓦他拉尼(PTK787；WO 98/35985)和SU11248(舒尼替尼；WO01/60814)，和诸如在PCT公开号为以下的专利申请中所公开的化合物：WO97/22596、WO 97/30035、WO 97/32856和WO 98/13354。
在某些实施方案中，所述有效载荷是抗体或抗体片段。在某些实施方案中，所述有效载荷抗体或抗体片段可以通过由本领域技术人员所公认的任意免疫球蛋白基因进行编码。所述免疫球蛋白基因包括，但不限于，κ、λ、α、γ(IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)、δ、ε和μ恒定区基因，以及免疫球蛋白可变区基因。该术语包括本领域技术人员所公认的全长抗体和抗体片段、以及它们的变体。示例性的片段包括但不限于的Fv、Fc的、Fab和(Fab')2、单链Fv(scFv)、双体、三体、四体、双功能杂交抗体、CDR1、CDR2、CDR3、CDR's的组合、可变区、构架区、恒定区、和类似物。
在某些实施方案中，有效载荷是一种或多种水溶性聚合物。多种大分子聚合物和其它分子可以连接到本发明的抗原结合的多肽，以调节抗体的生物学特性，和/或向抗体提供新的生物学特性。这些大分子聚合物可经由天然编码的氨基酸、经由非天然编码的氨基酸、或天然或非天然氨基酸的任意官能取代基、或附加到天然或非天然氨基酸的任意取代基或官能团，而连接到抗体。聚合物的分子量可以是宽范围的，包括但不限于，在约100Da和100,000Da之间，或更大。
所选的聚合物可以是水溶性的，以使其所附接的蛋白质在水性环境(诸生理环境)中不沉淀。该聚合物可以是支化的或非支化的。优选地，用于治疗用途的最终产品的制备，该聚合物将是药学上可接受的。
聚乙二醇分子与抗体分子的比例将变化，如同在反应混合物中它们的浓度将变化一样。一般而言，最佳比例(在有最低的过量的未反应的蛋白质或聚合物的反应效率方面)可通过所选择的聚乙二醇的分子量和可用的反应基团的数目来确定。当涉及分子量，通常聚合物的分子量越高，可以附接到蛋白质的聚合物分子的数目越少。同样地，当优化这些参数时，应当考虑聚合物的支化。一般而言，分子量越大(或分枝越多)，聚合物：蛋白质的比率越高。
水溶性聚合物可以为任意结构形式，包括但不限于线性、叉状或分支的。典型地，所述水溶性聚合物是聚(亚烷基二醇)，例如聚(乙二醇)(PEG)，但也可使用其他的水溶性聚合物。举例来说，使用PEG来描述本发明的某些实施方案。
PEG是众所周知的水溶性聚合物，其是可商购的或可以按照本领域公知的方法(Sandler和Karo,Polymer Synthesis,Academic Press,纽约，第3卷，138-161页)通过乙二醇的开环聚合来制备。术语“PEG”广泛用于涵盖任意聚乙二醇分子，而不考虑大小或在所述PEG末端的修饰，并且可以通过式被表示为连接到抗体：XO-(CH2CH2O)＝n-CH2CH2-Y，其中n为2到10,000，且X为H或末端修饰，所述末端修饰包括但不限于C1-4烷基。
在一些情况下，本发明中所用的PEG在一端用羟基或甲氧基进行终止，即，X是H或CH3(“甲氧基PEG”)。替代性地，所述PEG可以用反应性基团来终止，从而形成双官能聚合物。典型反应基团可以包括通常用于与以下官能团进行反应的那些反应基团：存在于20种常见氨基酸中的官能团(包括但不限于，马来酰亚胺基团、活化的碳酸酯(包括但不限于，对硝基苯基酯)、活化的酯(包括但不限于，N-羟基琥珀酰亚胺、对硝基苯酯)和醛)；以及对20种常见氨基酸是惰性的、但与存在于非天然编码氨基酸中的增补的官能团特异性反应的官能团(包括但不限于，叠氮基、炔基)。应注意的是，在上式中由Y表示的、所述PEG的另一端，将通过天然存在或非天然编码的氨基酸直接或间接地附接到抗原结合的多肽。举例来说，Y可以是多肽的胺基团(包括但不限于，赖氨酸的ε胺或N末端)的酰胺、氨基甲酸酯或脲连接。替代性地，Y可以是硫醇基团(包括但不限于，半胱氨酸的硫醇基团)的马来酰亚胺连接。替代性地，Y可以是经由20种常见氨基酸通常不可获得的残基的连接。例如，PEG上的叠氮基团可以与抗体上炔基团进行反应，以形成Huisgen[3+2]环加成产物。替代性地，PEG上的炔基可以与存在于非天然编码的氨基酸中的叠氮基团反应，以形成类似产物。在一些实施方案中，如适用，强亲核试剂(包括但不限于，肼、酰肼、羟胺、氨基脲)可与存在于非天然编码的氨基酸中的醛或酮基团反应以形成腙、肟或缩氨基脲，所述腙、肟或缩氨基脲在某些情况下，可以通过用适当的还原剂处理被进一步还原。替代性地，所述强亲核试剂可以经由非天然编码的氨基酸并入到抗体，并用于与存在于水溶性聚合物中的酮或醛基团进行优先反应。
根据实际所需，可以使用任何分子质量的PEG，包括但不限于，根据所需从约100道尔顿(Da)至100,000Da或更大(包括但不限于有时0.1-50kDa或10-40kDa)。支链PEG包括但不限于，其中各个链具有从1-100kDa(包括但不限于，1-50kDa或5-20kDa)的范围的分子量的PEG分子。广泛的PEG分子描述于，包括但不限于，Shearwater Polymers公司的产品目录、Nektar Therapeutics Nektar Therapeutics的产品目录，其通过引用并入本文。
通常，PEG分子的至少一个末端可用于与非天然编码的氨基酸反应。例如，具有用于与氨基酸侧链反应的炔和叠氮部分的PEG衍生物可以用于将PEG附接到如本文所述的非天然编码的氨基酸。如果所述非天然编码的氨基酸包含叠氮，那么PEG通常将要么含有炔部分以实现形成[3+2]环加成产物，或要么含有含有膦基团的活化的PEG物种(即，酯，碳酸酯)以实现形成酰胺连接。替代性地，如果非天然编码氨基酸包含炔，那么PEG通常将含有叠氮部分以实现形成[3+2]Huisgen环加成产物。如果非天然编码的氨基酸包含羰基，所述PEG通常将包含有效的亲核试剂(包括但不限于，酰肼、肼、羟胺、或氨基脲官能团)，以便实现分别形成相应的腙、肟、和缩氨基脲键。在其它替代性方案中，可以使用上述反应基团的相反的定位，即，非天然编码的氨基酸中的叠氮基部分可以与含有炔的PEG衍生物反应。
在一些实施方案中，具有PEG衍生物的抗体变体包含化学官能团，所述化学官能团与存在于非天然编码的氨基酸的侧链上的化学官能团反应。
在某些实施方案中，所述有效载荷是含有叠氮化物或乙炔的、包含水溶性聚合物主链的聚合物，其具有从约800Da至约100,000Da的平均分子量。所述水溶性聚合物的聚合物主链可以是聚(乙二醇)。然而，应该理解，包括但不限于聚乙二醇和其它相关聚合物(包括聚(葡聚糖)(poly(dextran))和聚(丙二醇))的多种水溶性聚合物，也适合于在本发明的实践中使用，并且术语PEG或聚(乙二醇)的使用旨在涵盖和包括所有这样的分子。术语PEG包括但不限于，任一种形式的聚(乙二醇)，包括双官能的PEG、多臂的PEG、衍生化的PEG、叉状的PEG、支化的PEG、悬垂的PEG(即，具有悬垂于聚合物主链的一个或多个官能团的PEG或相关聚合物)，或其中具有可降解的键的PEG。
所述聚合物主链可以是线型的或支化的。支化的聚合物主链在本领域中通常是已知的。通常，支化的聚合物具有中央分支核部分和连接到该中央分支核的多个线型聚合物链。PEG通常以支化的形式使用，所述支化的形式可以通过将环氧乙烷加成至各种多元醇，例如甘油、甘油寡聚物、季戊四醇和山梨糖醇来制备。所述中央分支部分也可源自于数个氨基酸，例如赖氨酸。所述支化的聚(乙二醇)可以通式的形式表示为R(-PEG-OH)m，其中R源自核部分，例如甘油、甘油寡聚物、或季戊四醇，且m表示臂的数目。多臂的PEG分子，例如在以下文献中所描述的那些，也可以用作所述聚合物主链：专利号为5,932,462、5,643,575、5,229,490、4,289,872的美国专利；美国专利申请2003/0143596；WO 96/21469；和WO 93/21259，通过引用将其每一个以其整体的形式并入本文。
支化的PEG也可以是由PEG(-YCHZ2)n表示的叉状的PEG的形式，其中Y是连接基团，且Z是以限定长度的原子链连接于CH的活化的末端基团。
为另一种支化的形式的悬垂的PEG，具有反应基团，如羧基，该羧基是沿所述PEG主链而不是在PEG链的末端。
除了这些形式的PEG之外，所述聚合物还可以用在主链中的弱的或可降解的键来制备。例如，PEG可以用聚合物主链中的受到水解的酯键来制备。如下所示，该水解导致聚合物裂解成较低分子量的片段：-PEG-CO2-PEG-+H2O→PEG-CO2H+HO-PEG-。本领域技术人员理解，术语聚(乙二醇)或PEG表示或包括本领域中已知的所有形式，包括但不限于本文所公开的那些。
许多其它聚合物也适用于本发明。在一些实施方案中，具有从2至约300个末端的、水溶性的聚合物主链在本发明中是特别有用的。合适的聚合物的实例包括但不限于，其他聚(亚烷基二醇)(如聚(丙二醇)(“PPG”))、它们的共聚物(包括但不限于乙二醇和丙二醇的共聚物)、它们的三元共聚物、它们的混合物等。尽管聚合物主链的各链的分子量可以变化，但通常在约800Da至约100,000Da的范围内，通常为约6,000Da至约80,000Da。
本领域的普通技术人员将认识到，实质上水溶性的主链的前述清单决不是详尽无遗的，其仅仅是说明性的，具有上述性质的所有聚合物材料都被认为适合于在本发明中使用。
在本发明的一些实施方案中，聚合物衍生物是“多官能”，意味着聚合物主链具有至少两个末端，并可能多达约300个末端用官能团进行官能化或活化。多官能聚合物衍生物包括但不限于，具有两个末端的线型聚合物，其中各末端被与结合到可以是相同或不同的官能团。
在一个实施方案中，所述聚合物衍生物具有以下结构：X-A-POLY-B-N═N═N，其中：N═N═N为叠氮部分；B是连接部分，其可以是存在或不存在的；POLY是水溶性非抗原性聚合物；A是连接部分，其可以是存在或不存在的，并且其是可以与B相同或不同；且X为第二官能团。用于A和B的连接部分的实例包括但不限于，含有至多18个、且更优选为1-10个碳原子的多官能化的烷基。如氮、氧或硫等杂原子可以与烷基链一起被包括在内。所述烷基链也可以在杂原子处是支化的。用于A和B的连接部分的其它实例包括但不限于，含有至多10个、且更优选为5-6个碳原子的多官能化的芳基。所述芳基可以以一个或多个碳原子、氮、氧或硫原子进行取代。合适的连接基团的其它实例包括在以下文献中描述的那些连接基团：专利号为5,932,462；5,643,575的美国专利；以及美国申请公开2003/0143596，通过引用将其每一个并入本文。本领域普通技术人员将认识到，连接部分的前述清单决不是详尽无遗的，其仅仅是说明性的，具有上述性质的所有连接部分都被认为适合于在本发明中使用。
用作X的合适的官能团的实例包括但不限于，羟基、经保护的羟基、烷氧基、活性酯(例如N-羟基琥珀酰亚胺基酯和1-苯并三唑基酯)、活性碳酸酯(例如N-羟基琥珀酰亚胺基碳酸酯和1-苯并三唑基碳酸酯)、缩醛、醛、醛水合物、烯基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、活性砜、胺、氨基氧基、经保护的胺、酰肼、经保护的酰肼、经保护的硫醇、羧酸、经保护的羧酸、异氰酸酯、异硫氰酸酯、马来酰亚胺、乙烯基砜、二硫代吡啶、乙烯基吡啶、碘乙酰胺、环氧化物、乙二醛、二酮、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯、三氟乙基磺酸酯(tresylate)、烯烃、酮和叠氮化物。如本领域技术人员所理解的，所选的X部分应与叠氮基团相兼容，以便与叠氮基团的反应不会发生。所述含叠氮的聚合物衍生物可以是同双官能的，这意味着第二官能团(即，X)也为叠氮部分，或异双官能的，意味着第二官能团为不同的官能团。
“经保护的”术语是指防止在某些反应条件下化学反应性官能团的反应的保护基或部分的存在。该保护基将根据被保护的化学反应性基团的类型而变化。举例来说，如果化学反应性基团为胺或酰肼，那么保护基可以选自由叔丁氧羰基(t-Boc)和9-芴甲氧羰基(Fmoc)所构成的组。如果化学反应性基团为硫醇，那么保护基可以为邻吡啶基二硫化物(orthopyridyldisulfide)。如果化学反应性基团是羧酸(如丁酸或丙酸)、或羟基，那么保护基可以是苄基或烷基，如甲基、乙基或叔丁基。本领域中已知的其他保护基也可在本发明中使用。
在文献中的末端官能团的具体实例包括但不限于，N-琥珀酰亚胺基碳酸酯(参见例如，专利号为5281698、5468478的美国专利)、胺(参见例如，Buckmann等，Makromol.Chem.182:1379(1981),Zaplipsky等Eur.Polym.J.19:1177(1983))、酰肼(参见例如，Andresz等，Makromol.Chem.179:301(1978))、丙酸琥珀酰亚胺酯和丁酸琥珀酰亚胺酯(参见例如，Olson等，Poly(ethylene glycol)Chemistry&Biological Applications中,第170-181页，Harris&Zaplipsky编，ACS，华盛顿，1997；还参见专利号为5,672,662的美国专利)。琥珀酰亚胺琥珀酸酯(参见例如，Abuchowski等，C CancerBiochem.Biophys.7:175(1984)和Joppich等，Macrolol.Chem.180:1381(1979))，琥珀酰亚胺基酯(参见例如，专利号为4670417的美国专利)、苯并三唑碳酸酯(参见例如，专利号为5650234的美国专利)，缩水甘油醚(参见例如，Pitha等Eur.J Biochem.94:11(1979)、Elling et al.,Biotech.Appl.Biochem.13:354(1991))、氧羰基咪唑(参见例如，Beauchamp等，Anal.Biochem.131:25(1983)、Tondelli等，J.Controlled Release 1:251(1985))、对-硝基苯基碳酸酯(参见例如，Veronese等，Appl.Biochem.Biotech.,11:141(1985)；和SARTORE等，Appl.Biochem.Biotech.,27:45(1991))、醛(参见例如，Harris等，Polym.Sci.Chem.Ed.22:341(1984)、专利号为5824784的美国专利、专利号为5252714的美国专利)、马来酰亚胺(参见例如，Goodson等，Bio/Technology 8:343(1990)、Romani等，in Chemistry ofPeptides and Proteins 2:29(1984))、和Kogan,Synthetic Comm.22:2417(1992))、邻吡啶基二硫化物(参见例如，Woghiren,等，Bioconj.Chem.4:314(1993))、丙烯酰氧(acrylol)(参见例如，Sawhney等,Macromolecules,26:581(1993))、乙烯砜(参见例如，专利号为5,900,461的美国专利)。以上所有的文献和专利通过引用并入本文。
在本发明的某些实施方案中，本发明的聚合物衍生物包含具有以下结构的聚合物主链：X-CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-N═N═N，其中：X是如以上所述的官能团；且n是约20到约4000。在另一个实施方案中，本发明的聚合物衍生物包含具有以下结构的聚合物主链：X-CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-O-(CH-2)m-W-N═N═N，其中：W是包含1-10个碳原子的脂肪族或芳香族连接部分；n为约20到约4000；X是如以上所述的官能团；且m为1-10。
本发明的含叠氮的PEG衍生物可以通过本领域已知的和/或本文中所公开的各种方法来制备。在如下所示的一种方法中，具有从约800Da至约100,000Da的平均分子量、具有键合到第一官能团的第一末端和键合到合适的离去基团的第二末端的的水溶性聚合物主链与叠氮阴离子(其可与任意数目的合适的反荷离子，包括钠、钾、叔丁基铵等配对)反应。所述离去基团经历亲核置换，被叠氮部分取代，得到了所需的含叠氮的PEG聚合物，如以下所示：X-PEG-L+N3 -→X-PEG-N3。
如所示的，用于在本发明中使用的合适的聚合物主链具有式X-PEG-L，其中PEG为聚(乙二醇)，且X为不与叠氮基团反应的官能团，且L为合适的离去基团。合适的官能团的实例包括但不限于，羟基、经保护的羟基、缩醛、烯基、胺、氨基氧基、经保护的胺、经保护的酰肼、经保护的硫醇、羧酸、经保护的羧酸、马来酰亚胺、二硫代吡啶、和乙烯基吡啶、和酮。合适的离去基团的实例包括但不限于，氯、溴、碘、甲磺酸酯、三氟乙基磺酸酯、和甲苯磺酸酯。
在用于制备本发明的含叠氮的聚合物衍生物的另一种方法中，具有叠氮官能团的连接剂与具有平均分子量为约800Da至约100,000Da的水溶性聚合物主链接触，其中所述连接剂具有将选择性地与PEG聚合物上的化学官能团进行反应的化学官能团，以形成含叠氮的聚合物衍生物产物，其中所述叠氮基团通过连接基团与所述聚合物骨架隔开。
示例性的反应方案如下所示：X-PEG-M+N-连接基团-N═N═N→PG-X-PEG-连接基团-N═N═N，其中：PEG为聚(乙二醇)，且X为封端基团如烷氧基或以上所描述的官能团；且M是不与叠氮官能团反应、但将有效地和选择性地与N官能团进行反应的官能团。
合适的官能团的实例包括但不限于，如果N为胺，则M为羧酸、碳酸酯或活性酯；如果N为酰肼或氨基氧基部分，则M为酮；如果N是亲核试剂，则M是离去基团。
粗产物的纯化可以通过已知方法实现，所述已知的方法包括但不限于，对产物进行沉淀，如果需要的话，随后进行层析。
更具体的例子如下所示，在PEG二胺的情况下，其中胺中的一个通过保护基部分(如叔丁基-Boc)进行保护，且所得到的单保护的PEG二胺与具有叠氮官能团的连接部分进行反应：BocHN-PEG-NH2+HO2C-(CH2)3-N═N═N。
在该实例中，可以利用各种活化剂，如亚硫酰氯或碳化二亚胺试剂和N-羟基琥珀酰亚胺或N-羟基苯并三唑，将胺基团结合到羧酸基团，以创建在单胺PEG衍生物与具有叠氮的连接基团部分之间的酰胺键。成功形成酰胺键后，所得的N-叔丁基-Boc-保护的、含叠氮基的衍生物可以直接用于修饰生物活性分子，或者其可以被进一步设计，以设置其他有用的官能团。例如，N-t-Boc基团可以通过用强酸处理来进行水解，以产生ω-氨基-PEG-叠氮化物。所得的胺可以用作合成把手(synthetic handle)来设置其它有用的官能团，例如马来酰亚胺基团、活化的二硫化物、活性酯等，用于形成有价值的异双功能剂。
当希望将不同的分子附接到聚合物的各个末端时，异双官能的衍生物是特别有用的。例如，ω-N-二氨基-N-叠氮基PEG将允许具有活化的亲电基团的分子(如醛、酮、活化的酯，活化的碳酸酯等)，附接到PEG的一个末端，以及允许具有乙炔基团的分子附接到PEG的另一末端。
在本发明的另一实施方案中，所述聚合物衍生物具有以下结构：X-A-POLY-B-C═C-R，其中：R可以是H或烷基、烯烃(alkene)、烷氧基、或芳基或取代的芳基；B是连接部分，其可以是存在或不存在的；POLY是水溶性非抗原性聚合物；A是连接部分，其可以是存在或不存在的，且其可以是与B相同或不同的；且X为第二官能团。
用于A和B的连接部分的实例包括但不限于，含有多至18个、更优选为1-10个碳原子的多官能的烷基。如氮、氧或硫等杂原子可以与烷基链一起被包括在内。所述烷基链也可以在杂原子处是支化的。用于A和B的连接部分的其它实例包括但不限于，含有至多10个、且更优选为5-6个碳原子的多官能化的芳基。所述芳基可以以一个或多个碳原子、氮、氧或硫原子进行取代。合适的连接基团的其它实例包括在以下文献中描述的那些连接基团：专利号为5,932,462；5,643,575的美国专利；以及美国申请公开2003/0143596，通过引用将其每一个并入本文。本领域普通技术人员将认识到，连接部分的前述清单决不是详尽无遗的，其仅仅是说明性的，具有上述性质的各种连接部分都被认为在本发明中是有用的。
用作X的合适的官能团的实例包括但不限于，羟基、经保护的羟基、烷氧基、活性酯(例如N-羟基琥珀酰亚胺基酯和1-苯并三唑基酯)、活性碳酸酯(例如N-羟基琥珀酰亚胺基碳酸酯和1-苯并三唑基碳酸酯)、缩醛、醛、醛水合物、烯基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、活性砜、胺、氨基氧基、经保护的胺、酰肼、经保护的酰肼、经保护的硫醇、羧酸、经保护的羧酸、异氰酸酯、异硫氰酸酯、马来酰亚胺、乙烯基砜、二硫代吡啶、乙烯基吡啶、碘乙酰胺、环氧化物、乙二醛、二酮、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯、三氟乙基磺酸酯、烯烃、酮和叠氮化物。如本领域技术人员所理解的，所选的X部分应与乙炔基团相兼容，以便与乙炔基团的反应不会发生。所述含乙炔的聚合物衍生物可以是同双官能的，这意味着第二官能团(即，X)也为乙炔部分，或异双官能的，意味着第二官能团为不同的官能团。
在本发明的另一实施方案中，本发明的聚合物衍生物包含具有以下结构的聚合物主链：X-CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-O-(CH2)m-C═CH，其中：X是如以上所述的官能团；且n是约20到约4000；且m为1-10。下文显示了各异双官能的PEG聚合物的具体实例。
本发明的含乙炔的PEG衍生物可以利用本领域技术人员已知的和/或本文中所公开的方法来制备。在一种方法中，具有从约800Da至约100,000Da的平均分子量、具有键合到第一官能团的第一末端和键合到合适的亲核基团的第二末端的水溶性聚合物主链，与同时具有乙炔官能团和离去基团的化合物反应，所述离去基团适合用于与PEG上的亲核基团反应。当具有亲核部分的PEG聚合物和具有离去基团的分子相结合时，所述离去基团经历亲核置换，被叠亲核部分取代，得到了所需的含乙炔的聚合物：X-PEG-Nu+L-A-C→X-PEG-Nu-A-C═CR'。
如所显示的，用于在反应中使用的优选的聚合物主链具有式X-PEG-NU，其中PEG为聚(乙二醇)，Nu为亲核部分，且X为不与Nu、L或乙炔官能团反应的官能团。
Nu的实例包括但不限于，将主要经由SN2型机理进行反应的胺、烷氧基、芳氧基、巯基、亚氨基、羧酸、酰肼、氨基氧基。Nu基团的其它实例包括将主要经由亲核加成反应进行反应的那些官能团。L基团的实例包括氯、溴、碘、甲磺酸酯、三氟乙基磺酸酯、和甲苯磺酸酯和预期经历亲核置换的其它基团，以及酮、醛、硫酯、烯烃、α-β不饱和羰基、碳酸酯和预期经历亲核试剂的加成的其它亲电基团。
在本发明另一个实施方案中，A为碳原子数在1-10之间的脂肪族连接基团或碳原子数在6-14之间的取代的芳基环。X为不与叠氮基团和L反应的官能团，且L是合适的离去基团。
在用于制备本发明的含乙炔的聚合物衍生物的另一种方法中，具有为约800Da至约100,000Da的平均分子量的、在一末端具有经保护的官能团或封端剂且在另一末端具有合适的离去基团的PEG聚合物，与乙炔阴离子接触。
水溶性聚合物可以被连接到本发明的抗体。可以经由并入到所述抗体的非天然编码的氨基酸、或非天然编码的或天然编码的氨基酸的任意官能团或取代基，或附加到非天然编码的或天然编码的氨基酸中的任意官能团或取代基，而连接所述水溶性聚合物。替代性地，所述水溶性聚合物被连接到抗原结合的多肽，所述抗原结合的多肽经由天然存在的氨基酸(包括但不限于，半胱氨酸、赖氨酸或N末端残基的胺基)并入非天然编码的氨基酸。在一些情况下，本发明的抗体包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个非天然氨基酸，其中一个或多个非天然编码的氨基酸(多个)连接到水溶性聚合物(包括但不限于，PEG和/或寡糖)。在一些情况下，本发明的抗体还包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个连接到水溶性聚合物的非天然编码的氨基酸。在一些情况下，本发明的抗体包含连接到水溶性聚合物的一种或多种非天然编码的氨基酸和连接到水溶性聚合物的一种或多种天然存在的氨基酸的。在一些实施方案中，相对于未偶联的形式，本发明中使用的水溶性聚合物提高了抗体的血清半衰期。
可以调节连接到本发明的抗原结合的多肽的水溶性聚合物的数目(即，聚乙二醇化或糖基化的程度)，以提供改变的(包括但不限于，提高的或降低的)的药理学、药代动力学或药效学特性，如活体内半衰期。在一些实施方案中，相对于未修饰的多肽，抗体的半衰期增加至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、2倍、5倍、10倍、50倍、或至少约100倍。
在本发明的一个实施方案中，包含含有羰基的非天然编码的氨基酸的抗原结合的多肽用PEG衍生物进行修饰，所述PEG衍生物包含直接连接到PEG主链的末端肼、羟胺、酰肼或氨基脲部分。
在一些实施方案中，羟胺末端PEG衍生物将具有以下结构：RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-O-NH2，其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m是2-10，且n是100-1,000(即，平均分子量在5-40kDa之间)。
在一些实施方案中，含有肼或酰肼的PEG衍生物将具有以下结构：RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-X-NH-NH2，其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等。)，m是2-10，且n是100-1,000，且X任选地是羰基(C═O)，其可以存在或不存在。
在一些实施方案中，含有氨基脲的PEG衍生物将具有以下结构：氨RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-NH-C(O)-NH-NH2，其中R是简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m是2-10且n是100-1,000。
在本发明的另一实施方案中，包含含有羰基的氨基酸的抗原结合的多肽用PEG衍生物进行修饰，所述PEG衍生物含有经由酰胺键连接到PEG主链的末端的羟胺、酰肼、肼或氨基脲部分。
在一些实施方案中，羟胺末端的PEG衍生物具有以下结构：RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)m-O-NH2，其中R是简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10且n为100-1,000(即，平均分子量在5-40kDa之间)。
在一些实施方案中，含有肼或酰肼的PEG衍生物具有以下结构：RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)m-X-NH-NH2，其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10，n为100-1,000，且X任选地是羰基(C═O)，其可以存在或不存在。
在一些实施方案中，含氨基脲的PEG衍生物具有以下结构：RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)m-NH-C(O)-NH-NH2，其中R是简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10，n为100-1,000。
在本发明的另一实施方案中，包含含有羰基的氨基酸的抗体用支化的PEG衍生物进行修饰，所述支化的PEG衍生物含有末端肼、羟胺、酰肼或氨基脲部分，其中所述支化的PEG的各链具有10kDa-40kDa、更优选5kDa-20kDa的分子量范围。
在本发明另一实施方案中，包含非天然编码的氨基酸的抗体用具有支化结构的PEG衍生物进行修饰。例如，在一些实施方案中，肼或酰肼末端PEG衍生物将具有以下结构：[RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)]2CH(CH-2)m-X-NH-NH2，其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10，且n为100-1,000，且X任选地是羰基(C═O)，其可以存在或不存在。
在一些实施方案中，含有氨基脲基团的的PEG衍生物将具有以下结构：[RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-C(O)-NH-CH2-CH2]2CH-X-(CH2)m-NH-C(O)-NH-NH2，其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，X任选地是NH、O、S、C(O)或是不存在的，m为2-10，且n为100-1,000。
在一些实施方案中，含有羟胺基团的的PEG衍生物将具有以下结构：[RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-C(O)-NH-CH2--CH2]2CH-X-(CH2)m-O-NH2，其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，X任选地是NH、O、S、C(O)或是不存在的，m为2-10且n为100-1,000。
水溶性聚合物连接到抗体的程度和位点可以调节抗体对抗原或受体的结合。
用于聚合物的活化以及用于肽的偶联的方法和化学反应在文献中有描述，且在本领域中是已知的。用于活化聚合物的常用方法包括但不限于，用溴化氰、高碘酸盐、戊二醛、双环氧化物、表氯醇、二乙烯基砜、碳化二亚胺、磺酰卤、三氯三嗪等活化官能团。(参见，R.F.Taylor,(1991),PROTEIN IMMOBILISATION.FUNDAMENTAL AND APPLICATIONS,Marcel Dekker,N.Y.；S.S.Wong,(1992),CHEMISTRY OF PROTEINCONJUGATION AND CROSSLINKING,CRC出版社,Boca Raton；G.T.Hermanson等,(1993),IMMOBILIZED AFFINITY LIGAND TECHNIQUES,Academic出版社,N.Y.；Dunn,R.L.等,Eds.POLYMERIC DRUGS ANDDRUG DELIVERY SYSTEMS,ACS Symposium Series Vol.469,AmericanChemical Society,华盛顿，1991)。
关于PEG的功能化和偶联的一些综述和论文是可以获得的。参见例如Harris,Macronol.Chem.Phys.C25:325-373(1985)；Scouten,Methods inEnzymology 135:30-65(1987)；Wong等，Enzyme Microb.Technol.14:866-874(1992)；Delgado等，Critical Reviews in Therapeutic Drug CarrierSystems 9:249-304(1992)；Zalipsky,Bioconjugate Chem.6:150-165(1995)。
也可以在以下文献中找到用于活化聚合物的方法：WO 94/17039、专利号为5,324,844,的美国专利、WO 94/18247、WO 94/04193、专利号为5,219,564的美国专利、专利号为5,122,614的美国专利、WO 90/13540、专利号为5,281,698的美国专利、和WO 93/15189，以及用于活化的聚合物和酶之间的偶联，所述酶包括但不限于凝血因子VIII(WO 94/15625)、血红蛋白(WO 94/09027)、载氧分子(专利号为4,412,989的美国专利)、核糖核酸酶和超氧化物歧化酶(Veronese等,App.Biochem.Biotech.11:141-45(1985))。所引用的所有文献和专利通过引用并入本文中。
通过任意方便的方法，进行含有非天然编码氨基酸(诸如对叠氮基-L-苯丙氨酸)的抗原结合的多肽的PEG化(即，任意水溶性聚合物的附加)。例如，抗体用炔末端mPEG衍生物进行PEG化。简言之，在室温下，在搅拌下，向含对叠氮基-L-苯丙氨酸的抗体的水性溶液中向添加过量的固体mPEG(5000)-O-CH2-C═CH。通常，该水性溶液是以缓冲剂进行缓冲，所述缓冲剂具有接近要进行该反应所需的pH值(通常约为pH 4-10)的pKa。用于在pH 7.5进行PEG化的合适的缓冲剂的实例，例如，包括但不限于，HEPES、磷酸盐、硼酸盐、TRIS-HCl、EPPS和TES。持续监测pH值，并在必要时进行调整。通常使该反应持续进行约1-48小时。
随后对反应产物进行疏水层析，以从游离的mPEG(5000)-O-CH2-C═CH和聚乙二醇化的抗体的任意高分子量的复合物中分离聚乙二醇化的抗体变体，所述聚乙二醇化的抗体的任意高分子量的复合物在未封端的PEG在分子的两端被活化时，可以形成，从而将抗体变体分子进行交联。在疏水层析过程中的条件是这样的：游离的mPEG(5000)-O-CH2-C═CH流经柱，而在所需的形式(包含偶联到一种或多种PEG基团的一种抗体变体分子)之后，洗脱出任意的交联的聚乙二醇化的抗体变体复合物。合适的条件根据交联复合物相对于所需的偶联物的相对尺寸而变化，并且容易被本领域技术人员确定。含有所需结偶联物的洗脱液通过超滤而浓缩并通过渗滤进行脱盐。
如果需要的话，从疏水层析得到的聚乙二醇化的抗体可以进一步通过本领域技术人员已知的一种或多种程序进行纯化，包括但不限于，亲和层析；阴离子或阳离子交换色谱(使用，包括但不限于，DEAE琼脂糖凝胶)；硅胶上的层析；反相HPLC；凝胶过滤(使用，包括但不限于，SEPHADEXG-75)；疏水层析；尺寸排阻色谱法、金属螯合物色谱；超滤/渗滤；乙醇沉淀；硫酸铵沉淀；聚焦层析；置换色谱；电泳程序(包括但不限于制备型等电聚焦)、差别性溶解度(differential solubility)(包括但不限于硫酸铵沉淀)，或萃取。表观分子量可以通过GPC通过与球状蛋白质标准(PROTEIN PURIFICATION METHODS,A PRACTICAL APPROACH(Harris&Angal,编)IRL出版社1989,293-306)进行比较来估算。抗体-PEG偶联物的纯度可以通过蛋白水解降解进行评估(包括但不限于，胰蛋白酶裂解)，随后进行质谱分析。Pepinsky B.,等,J.Pharmcol.&Exp.Ther.297(3):1059-66(2001)。
连接到本发明的抗体的氨基酸的水溶性聚合物可以进一步被衍生化或取代，而没有限制。
在本发明的另一个实施方案中，抗原结合的多肽用包含叠氮部分的PEG衍生物进行修饰，所述叠氮部分将与存在于非天然编码的氨基酸的侧链上的炔部分进行反应。一般而言，所述PEG衍生物将具有从1kDa-100kDa、且在一些实施方案中，从10kDa-40kDa的平均分子量范围。
在一些实施方案中，叠氮末端的PEG衍生物将具有以下结构：RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-N3，其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10且n为100-1,000(即，平均分子量在5kDa-40kDa之间)。
在另一实施方案中，叠氮末端的PEG衍生物将具有以下结构：RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-NH-C(O)-(CH2)p-N3，其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10，p为2-10且n为100-1,000(即，平均分子量在5kDa-40kDa之间)。
在本发明的另一实施方案中，包含含炔的氨基酸的抗体用含有叠氮末端部分的支化的PEG衍生物进行修饰，其中所述支化的PEG的各链具有的分子量范围为从10kDa-40kDa，且更优选地，从5kDa-20kDa。例如，在一些实施方案中，叠氮末端的PEG衍生物将具有以下结构：[RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)]2CH(CH-2)m-X-(CH2)p-N3，其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10，p为2-10，且n为100-1000，并且X任选地为O、N、S或羰基(C═O)，在每一种情况下，其可以是存在或不存在的。
在本发明的另一个实施方案中，抗原结合的多肽用包含炔部分的PEG衍生物进行修饰，所述炔部分将与存在于非天然编码的氨基酸的侧链上的叠氮部分进行反应。
在一些实施方案中，炔末端PEG衍生物将具有以下结构：RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-C═CH，其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10，且n为100-1,000(即，平均分子量在5kDa-40kDa之间)。
在本发明另一实施方案中，包含含有炔的非天然编码的氨基酸的抗体用PEG衍生物进行修饰，所述PEG衍生物含有经由酰胺键连接到PEG主链的末端叠氮或末端炔部分。
在一些实施方案中，炔末端PEG衍生物将具有以下结构：RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-NH-C(O)-(CH2)p-C═CH，其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10，p为2-10且n为100-1,000。
在本发明另一实施方案中，包含含叠氮的氨基酸的抗原结合的多肽用含有末端炔部分的支化的PEG衍生物进行修饰，其中所述支化的PEG的各链具有的分子量范围为从10kDa-40kDa，且更优选地，从5kDa-20kDa。例如，在一些实施方案中，炔末端PEG衍生物将具有以下结构：[RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)]2CH(CH-2)m-X-(CH2)pC═CH，其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10，p为2-10，且n为100-1000，并且X任选地为O、N、S或羰基(C═O)，或是不存在的。
在本发明另一实施方案中，抗体用含有活化的官能团(包括但不限于，酯、碳酸酯)的PEG衍生物进行修饰，所述活化的官能团进一步含有芳基膦基团，所述芳基膦基团将与存在于非天然编码的氨基酸的侧链上的叠氮部分反应。一般而言，般而言，所述PEG衍生物将具有从1kDa-100kDa、且在一些实施方案中，从10kDa-40kDa的平均分子量范围。
可以连接到抗体的其它示例性的PEG分子，以及聚乙二醇化方法包括在以下专利中描述的那些：例如，美国专利公开号2004/0001838；2002/0052009；2003/0162949；2004/0013637；2003/0228274；2003/0220447；2003/0158333；2003/0143596；2003/0114647；2003/0105275；2003/0105224；2003/0023023；2002/0156047；2002/0099133；2002/0086939；2002/0082345；2002/0072573；2002/0052430；2002/0040076；2002/0037949；2002/0002250；2001/0056171；2001/0044526；2001/0027217；2001/0021763；美国专利号6,646,110；5,824,778；5,476,653；5,219,564；5,629,384；5,736,625；4,902,502；5,281,698；5,122,614；5,473,034；5,516,673；5,382,657；6,552,167；6,610,281；6,515,100；6,461,603；6,436,386；6,214,966；5,990,237；5,900,461；5,739,208；5,672,662；5,446,090；5,808,096；5,612,460；5,324,844；5,252,714；6,420,339；6,201,072；6,451,346；6,306,821；5,559,213；5,612,460；5,747,646；5,834,594；5,849,860；5,980,948；6,004,573；6,129,912；WO 97/32607、EP 229,108、EP 402,378、WO 92/16555、WO 94/04193、WO 94/14758、WO 94/17039、WO 94/18247、WO 94/28024、WO 95/00162、WO 95/11924、W095/13090、WO 95/33490、WO 96/00080、WO 97/18832、WO 98/41562、WO 98/48837、WO 99/32134、WO 99/32139、WO 99/32140、WO 96/40791、WO 98/32466、WO 95/06058、EP 439508、WO 97/03106、WO 96/21469、WO 95/13312、EP 921131、、WO 98/05363、EP 809996、WO 96/41813、WO 96/07670、EP 605 963、EP 510 356、EP 400 472、EP 183 503和EP 154 316，通过引用将它们并入本文中。可以以任意形式使用本文所描述的任一PEG分子，包括但不限于，单链、支链、多臂链、单官能、双官能、多官能、或其任意组合。
在某些实施方案中，用一个或多个能够与非天然氨基酸反应的连接基团可以将抗体连接到有效载荷。所述一个或多个连接基团可以是对本领域技术人员而言是显而易见的任意连接基团。术语“连接基团”在本文中用于指通常作为化学反应的结果而形成的、且通常是共价键的基团或键。水解稳定的键是指在水中实质上是稳定的、且在有用pH值下(包括但不限于，在生理条件下)，在延长的时间段内，或许甚至无限期地不与水反应的键。水解不稳定或可降解的键是指该键在水中或在水性溶液中(包括例如血液)是可降解的。酶促不稳定或可降解的键是指该可被一种或多种酶降解。如本领域理解的，PEG和相关聚合物可以在聚合物主链中或聚合物主链与聚合物分子的一个或多个末端官能团之间的连接基团中包含可降解的键。例如，通过PEG羧酸或活化的PEG羧酸与生物活性剂上的醇基团的反应而形成的酯键一般在生理条件下水解以释放所述试剂。其它水解可降解的键包括但不限于碳酸酯键；源自胺和醛的反应的亚胺键；通过醇与磷酸基团的反应形成的磷酸酯键；为酰肼和醛的反应产物的腙键；为醛和醇的反应产物的缩醛键；为甲酸盐和醇的反应产物的原酸酯键；通过胺基团(包括但不限于在诸如PEG等聚合物的末端)和肽的羧基而形成的肽键；以及通过亚磷酰胺基团(包括但不限于在聚合物的末端)和寡核苷酸的5'羟基而形成的寡核苷酸键。可以在本发明的抗体中使用支化的连接基团。许多不同的可断裂的连接基团对本领域技术人员而言是已知的。参见专利号为4,618,492；4,542,225和4,625,014的美国专利。用于从这些连接基团释放的试剂的机制包括，例如，照射对光不稳定的键、和酸催化水解。专利号为4,671,958的美国专利，例如包括对包含连接基团的免疫偶联物的描述，所述连接基团通过患者补体系统的蛋白水解酶在活体内的靶位点处被切断。可以根据抗体和连接到该抗体的分子之间的所需的空间关系来预先确定或选择连接基团的长度。鉴于已报道了大量的用于将各种放射性诊断化合物、放射治疗化合物、药物、毒素、和其它试剂附接到抗体的方法，本领域技术人员将能够确定用于将给定试剂附接到抗体的合适方法。
可以使用任意异双官能或同双官能的连接基团来所述偶联物。所述连接体可以具有宽范围的分子量或分子长度。更大或更小分子量的连接基团可以用来提供所述抗体和所述连接的实体之间所需的空间关系或构型。具有更长或更短的分子长度的连接基团也可以用来提供所述抗体和所述连接的实体之间的所需的空间或灵活性。类似地，在所述抗体到达它的靶标之前或之后，具有特定形状或构型的连接基团可以用于对所述抗体或所述连接的实体赋予特定的形状或构型。可以选择存在于所述连接基团的各个端部的官能团，以在所需的条件下调节抗体或有效载荷的释放。抗体和连接的实体之间的空间关系的这种优化可以对分子提供新的、经调节的，或所需的性质。
在一些实施方案中，本发明提供具有哑铃结构的水溶性双官能连接基团，所述哑铃结构包含：a)在聚合物主链的至少第一端的叠氮、炔、肼、酰肼、羟胺、或含羰基的部分；和b)在聚合物主链的第二端的至少第二官能团。所述第二官能团可以与所述第一官能团是相同或不同的。在一些实施方案中，所述第二个官能团是不与所述第一官能团反应的。在一些实施方案中，本发明提供了水溶性化合物，所述水溶性化合物包含支化的分子结构的至少一个臂。例如，所述支化的分子结构可以是树枝状。
亲本抗体
所述亲本抗体可以是本领域技术人员已知的、或后来发现的任意抗体，而没有限制。所述亲本抗体可以实质上由来自任意生物体的抗体基因进行编码，所述生物体包括但不限于人类、小鼠、大鼠、兔、骆驼、美洲驼、单峰骆驼、猴子、特别是哺乳动物、以及特别是人类、以及特别是小鼠和大鼠。在一个实施方案中，所述亲本抗体可以是全人源的，例如通过使用转基因小鼠或其他动物而获得自患者或受试者(Bruggemann&Taussig,1997,Curr.Opin.Biotechnol.8:455-458)，或获得自与筛选方法结合的人抗体库(Griffiths&Duncan,1998,Curr.Opin.Biotechnol.9:102-108)。所述亲本抗体可以来自任何来源，包括人造或天然存在的。例如所述亲本抗体可以是工程抗体，包括但不限于嵌合抗体和人源化抗体(Clark,2000,Immunol.Today 21:397-402)，或源自组合文库。此外，所述亲本抗体可以是实质上由一种或多种天然的抗体基因所编码的抗体的工程变体。例如，在一个实施方案中，所述亲本抗体是通过亲和力成熟而被识别的抗体。
所述亲本抗体可以对本领域技术人员已知的、或后来发现的任意抗原具有亲和性。几乎任何物质都可以是亲本抗体、或本描述的抗体的抗原，或本说明书的抗体。有用的抗原的实例包括但不限于，α-1抗胰蛋白酶、血管抑素、抗溶血因子、抗体、载脂蛋白、脱辅基蛋白、心房利钠因子、心房利钠多肽、心房肽、C-X-C趋化因子(例如，T39765、NAP-2、ENA-78、Gro-a、Gro-b、Gro-c、IP-10、GCP-2、NAP-4、SDF-1、PF4、MIG)、降钙素、CC趋化因子(例如、单核细胞趋化蛋白-1、单核细胞趋化蛋白2、单核细胞趋化蛋白-3、单核细胞炎性蛋白-1α、单核细胞炎性蛋白-1β、RANTES、I309、R83915、R91733、HCC1、T58847、D31065、T64262)、CD40配体、C-kit配体、胶原蛋白、集落刺激因子(CSF)、补体因子5a、补体抑制剂、补体受体1、细胞因子、(例如、上皮中性粒细胞活化肽-78、GRO/MGSA、GRO、GRO、MIP-1、MIP-1、MCP-1)、表皮生长因子(EGF)、促红细胞生成素(“EPO”)、去角质毒素A和B、因子IX、因子VII、因子VIII、因子X、成纤维细胞生长因子(FGF)、纤维蛋白原、纤连蛋白、G-CSF、GM-CSF、葡糖脑苷脂酶、促性腺激素、生长因子、刺猬蛋白(例如、Sonic、Indian、Deser)、血红蛋白、肝细胞生长因子(HGF)、水蛭素、人血清白蛋白、胰岛素、胰岛素样生长因子(IGF)、干扰素(例如、IFN-α、IFN-、IFN-γ)、白介素(例如、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8的、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12等)、角质细胞生长因子(KGF)、乳铁蛋白、白血病抑制因子、荧光素酶、神经生长因子(neurturin)、中性粒细胞抑制因子(NIF)、制瘤素M、成骨蛋白、甲状旁腺激素、PD-ECSF、PDGF、肽激素(例如人生长激素)、多效生长因子(pleiotropin)、蛋白A、蛋白G、致热外毒素A、B和C、松弛素、肾素、SCF、可溶性补体受体I、可溶性I-CAM 1、可溶性白介素受体(IL-1、2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、14、15)、可溶性TNF受体、生长调节素、生长抑素、生长激素、链激酶、超抗原、即、葡萄球菌肠毒素(SEA、SEB、SEC1、SEC2、SEC3、SED、SEE)、超氧化物歧化酶、中毒性休克综合征毒素(TSST-1)、胸腺素α1、组织型纤溶酶原激活物、肿瘤坏死因子(TNFβ)、肿瘤坏死因子受体(TNFR)、肿瘤坏死因子α(TNFα)、血管内皮生长因子(VEGF)、尿激酶等。这些抗原可以通过本领域技术人员已知的方法，从例如商业来源或已公开的多肽或多核苷酸序列(例如Gen基因库)来获得。
附加的抗原包括但不限于，转录和表达激活物。示例性的转录和表达激活物包括调节细胞生长，分化，调控等的基因和蛋白质。表达和转录激活物存在于原核生物、病毒、和真核生物(包括真菌、植物和包括哺乳动物的动物)，提供了广泛的治疗靶标。应该理解的是，表达和转录激活物通过以下的许多机制来调控转录：例如，通过结合到受体、刺激信号转导级联、调控转录因子的表达、结合到启动子和增强子、结合到结合于启动子和增强子的蛋白质、解旋DNA，剪接前体mRNA、聚腺苷酸化RNA和降解RNA。抗原包括但不限于，表达激活物，诸如细胞因子、炎症分子、生长因子、它们的受体、和致癌基因产物，例如，白介素(例如、IL-1、IL-2、IL-8等)、干扰素、FGF、IGF-I、IGF-II、FGF、PDGF、TNF、TGF-α、TGF-β、EGF、KGF、SCF/c-Kit、CD40L/CD40、VLA-4VCAM-1、ICAM-1/LFA-1、和透明质酸苷(hyalurin)/CD44；信号转导分子和相应的癌基因产物，例如，Mos、Ras、Raf和Met；以及转录激活物和抑制因子，例如，p53、Tat、Fos、Myc、Jun、Myb、Rel和类固醇激素受体如雌激素、孕酮、睾酮、醛固酮、LDL受体配体和皮质酮受体。
疫苗蛋白质可以是抗原，该抗原包括但不限于在来自感染性真菌，例如，曲霉、念珠菌属；细菌，特别是提供病原菌模型的大肠杆菌，和医学上重要的细菌如葡萄球菌属(例如，金黄色(葡萄球菌))或链球菌属(例如，肺炎链球菌)；原生动物如孢子虫纲(例如疟原虫)、根足虫类(例如内变形虫属)和鞭毛虫类(锥虫属、利什曼虫属、毛滴虫属、贾第虫属等)；病毒如(+)RNA病毒(例子包括痘病毒，如牛痘；小核糖核酸病毒，例如脊髓灰质炎病毒；披膜病毒，例如风疹病毒；黄病毒，例如HCV；和冠状病毒)，(-)RNA病毒(例如，弹状病毒，例如VSV；副粘病毒，例如RSV；正粘病毒，例如流感病毒；布尼亚病毒(Bunyaviruses)和沙粒病毒)，dsDNA病毒(例如呼肠弧病毒)，RNA至DNA病毒，即逆转录病毒，如HIV和HTLV，以及某些DNA至RNA病毒，如乙肝病毒。
抗原可以是酶，包括但不限于，例如，酰胺酶、氨基酸消旋酶、酰化酶(acylases)、脱卤酶、加双氧酶、二芳基丙烷过氧化物酶、差向异构酶、环氧化物水解酶、酯酶、异构酶、激酶、葡萄糖异构酶、糖苷酶、糖基转移酶、卤代过氧化物酶、单加氧酶(如p450s)、脂肪酶、木质素过氧化物酶、腈水合酶、腈水解酶、蛋白酶、磷酸酶、枯草杆菌蛋白酶、转氨酶和核酸酶。
农业相关蛋白，如昆虫抗性蛋白(例如，Cry蛋白)、淀粉和脂质生产酶、植物和昆虫毒素、毒素抗性蛋白、真菌毒素解毒蛋白、植物生长酶(例如，核酮糖1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶，“RUBISCO”)、脂肪氧合酶(LOX)和磷酸烯醇丙酮酸(PEP)羧化酶，也可以是抗原。
例如，所述抗原可以是疾病相关的分子，如肿瘤表面抗原(如B细胞独特型、恶性B细胞上的CD20、白血病原始细胞上的CD33、和乳腺癌上的HER2/neu)。替代性地，所述抗原可以是生长因子受体。生长因子的实例包括但不限于，表皮生长因子(EGFs)、转铁蛋白、胰岛素样生长因子、转化生长因子(TGFs)，白细胞介素-1，和白细胞介素-2。例如，在多种人类上皮原发性肿瘤已经发现EGF受体的高表达。已经发现TGF-α在癌细胞中介导自分泌刺激途径。已证明几种鼠单克隆抗体能够结合EGF受体，阻断配体结合到EGF受体，以及抑制培养中的和异种移植模型中的多种人类癌细胞系的增殖。Mendelsohn和Baselga(1995)Antibodies to growthfactors and receptors,in Biologic Therapy of Cancer,第2版，J B Lippincott,Philadelphia,第607-623页。因此，本发明的抗体可以用来治疗多种癌症。
所述抗原还可以是与以下疾病有关的细胞表面蛋白或受体：冠状动脉疾病(诸如血小板糖蛋白IIb/IIIa受体)、自身免疫性疾病(如CD4、CAMPATH-1和革兰氏阴性细菌脂多糖的脂质A区)。针对CD4的人源化抗体已经在治疗患有蕈样肉芽肿、泛发性脓疱性银屑病(generalizedpostular psoriasis)、重度银屑病和类风湿性关节炎的患者的临床试验中进行了测试。针对抗脂质革兰氏阴性细菌脂多糖的脂质A区的抗体已经在脓毒症休克的治疗中进行了临床测试。针对CAMPATH-1的抗体也已经在针对难治性类风湿性关节炎的治疗中进行了临床测试。因此，本文所提供的抗体可以用来治疗各种自身免疫疾病。
有用的抗原还包括与人类过敏性疾病，如炎性介体的蛋白质，例如，相关联的蛋白或肽白细胞介素-1(IL-1)，肿瘤坏死因子(TNF)，白三烯受体和5-脂氧合酶，和粘附分子如V-CAM/VLA-4。有用的抗原也可以包括与人类过敏疾病相关的蛋白或肽，例如炎性介导蛋白，例如白细胞介素-1(IL-1)、肿瘤坏死因子(TNF)、白三烯受体及5-脂氧合酶，和粘附分子，例如V-CAM/VLA-4。此外，因为IgE在诸如哮喘等的I型立即过敏过敏反应(immediate hypersensitive allergic reactions)中起至关重要的作用，所以IgE也可以充当抗原。研究表明，总血清IgE的水平趋向于与疾病(尤其是在哮喘中)的严重程度相关。Burrows等人(1989)“Association of asthma withserum IgE levels and skin-test reactivity to allergens”New Engl.L.Med.320:271-277。因此，在治疗过敏疾病中针对IgE所选择的抗体可以用于降低IgE水平或阻断IgE与肥大细胞和嗜碱细胞的结合，而不实质地影响正常免疫功能。
所述抗原也可以是可以充当引发宿主免疫应答的抗原的病毒表面或核心蛋白。这些病毒蛋白的实例包括但不限于糖蛋白(或表面抗原，例如GP120和GP41)和衣壳蛋白(或结构蛋白，例如P24蛋白)；表面抗原或甲、乙、丙、丁或戊型肝炎病毒的核心蛋白(例如乙型肝炎病毒的小乙型肝炎表面抗原(small hepatitis B surface antigen,SHBsAg)和丙型肝炎病毒的核心蛋白，NS3、NS4和NS5抗原)；呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)的糖蛋白(G-蛋白)或融合蛋白(F-蛋白)；单纯疱疹病毒HSV-l和HSV-2的表面和核心蛋白(例如来自HSV-2的糖蛋白D)。
所述抗原也可以是丧失其肿瘤抑制功能且可以使细胞更易患癌症的突变肿瘤抑制基因产物。肿瘤抑制基因是有抑制细胞生长和分裂周期并因此阻止新生瘤发育作用的基因。肿瘤抑制基因中的突变引起细胞忽视抑制信号网络中的一种或多种组分，从而克服细胞周期检查点并导致较高的受控细胞生长(癌症)速率。肿瘤抑制基因的实例包括但不限于DPC-4、NF-l、NF-2、RB、p53、WTl、BRCAl和BRCA2。DPC-4涉及胰腺癌并且参与抑制细胞分裂的细胞质途径。NF-l编码抑制Ras的蛋白(其是细胞质抑制蛋白)。NF-l涉及到神经系统和髓系白血病的神经纤维瘤和嗜铬细胞瘤。NF-2编码涉及到神经系统的脑膜瘤、神经鞘瘤(schwanoma)和室管膜瘤(ependymoma)的核蛋白。RB编码pRB蛋白，pRB蛋白是细胞周期的主要抑制剂的核蛋白。RB涉及到视网膜母细胞瘤以及骨癌、膀脱癌、小细胞肺癌和乳腺癌。p53编码调控细胞分裂且可以诱导细胞凋亡的p53蛋白。在许多癌症中发现p53的突变和/或不活动。WTl涉及肾脏的肾母细胞瘤(Wilms tumor)。BRCA1涉及到乳腺癌和卵巢癌，而BRCA2涉及到乳腺癌。因此，抗体可以用于阻断基因产物与肿瘤发生和发展途径中其它蛋白和生物化学物质的相互作用。
所述抗原可以是CD分子，所述CD分子包括但不限于，CD1a、CD1b、CD1c、CD1d、CD2、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8α、CD8β、CD9、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CDw12、CD13、CD14、CD15、CD15s、CD16a、CD16b、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD26、CD27、CD28、CD29、CD30、CD31、CD32、CD33、CD34、CD35、CD36、CD37、CD38、CD39、CD40、CD41、CD42a、CD42b、CD42c、CD42d、CD43、CD44、CD45、CD45R、CD46、CD47、CD48、CD49a、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、CD50、CD51、CD52、CD53、CD54、CD55、CD56、CD57、CD58、CD59、CDw60、CD61、CD62E、CD62L、CD62P、CD63、CD64、CD65、CD66a、CD66b、CD66c、CD66d、CD66e、CD66f、CD67、CD68、CD69、CDw70、CD71、CD72、CD73、CD74、CDw75、CDw76、CD77、CD79α、CD79β、CD80、CD81、CD82、CD83、CD84、CD85、CD86、CD87、CD88、CD89、CD90、CD91、CDw92、CD93、CD94、CD95、CD96、CD97、CD98、CD99、CD100、CD101、CD102、CD103、CD104、CD105、CD106、CD107a、CD107b、CDw108、CDw109、CD110-113、CD114、CD115、CD116、CD117、CD118、CD119、CD120a、CD120b、CD121a、CD121b、CD122、CD123、CDw124、CD125、CD126、CDw127、CDw128a、CDw128b、CD129、CDw130、CD131、CD132、CD133、CD134、CD135、CD136、CDw137、CD138、CD139、CD140a、CD140b、CD141、CD142、CD143、CD144、CDw145、CD146、CD147、CD148、CDw149、CD150、CD151、CD152、CD153、CD154、CD155、CD156、CD157、CD158a、CD158b、CD161、CD162、CD163、CD164、CD165、CD166、和TCRζ。所述抗原可以是VEGF、VEGF受体、EGFR、Her2、TNFa、TNFRI受体、GPIIb/IIIa、IL-2Rα链、IL-2Rβ链、RSV F蛋白、α4整合素、IgE、IgE受体、地高辛(digoxin)、锯鳞蝰蛇毒(carpetviper venom)、补体C5、OPGL、CA-125肿瘤抗原、葡萄球菌蛋白、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)蛋白、金黄色葡萄球菌蛋白、葡萄球菌感染相关蛋白(包括但不限于金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌)、IL-6受体、CTLA-4、RSV、IL-2受体的Tac亚单位、IL-5和EpCam。在某些实施方案中，所述抗原是CD74。所述抗原可以是分子片段。
亲本抗体可以是本领域已知的任意抗体或本领域技术人员所开发的任意抗体而没有限制。实例包括但不限于：抗TNF抗体(美国专利号6,258,562)、抗IL-12和/或抗IL-12p40抗体(美国专利号6,914,128)；抗IL-18抗体(美国专利号2005/0147610)、抗05、抗CBL、抗CD147、抗gp120、抗VLA-4、抗CD11a、抗CD18、抗VEGF、抗CD40L、抗CD-40(例如，参见PCT公开号WO 2007/124299)抗Id、抗ICAM-1、抗CXCL13、抗CD2、抗EGFR、抗TGF-β2、抗HGF、抗cMet、抗DLL-4、抗NPR1、抗PLGF、抗ErbB3、抗E-选择素、抗Fact VII、抗Her2/neu、抗F gp、抗CD11/18、抗CD14、抗ICAM-3、抗RON、抗SOST、抗CD-19、抗CD80(例如参见，PCT公开号WO 2003/039486、抗CD4、抗CD3、抗CD23、抗β2-整合素、抗α4β7、抗CD52、抗HLA DR、抗CD22(例如参见美国专利号5,789,554)、抗CD20、抗MIF、抗CD64(FcR)、抗TCRαβ、抗CD2、抗Hep B、抗CA 125、抗EpCAM、抗gp120、抗CMV、抗gpIIbIIIa、抗IgE、抗CD25、抗CD33、抗HLA、抗IGF1,2、抗IGFR、抗VNR整合素、抗IL-1α、抗IL-1β、抗IL-1受体、抗IL-2受体、抗IL-4、抗IL-4受体、抗IL5、抗IL-5受体、抗IL-6、抗IL-8、抗IL-9、抗IL-13、抗IL-13受体、抗IL-17、抗IL-6R、抗RANKL、抗NGF、抗DKK、抗αVβ3、抗IL-17A、抗IL23p19和抗IL-23(参见Presta，L.G.(2005)J.Allergy Clin.Immunol.116:731-6和www<dot>path<dot>cam<dot>ac<dot>uk</><dot>about<dot>mrc<7></>humanisation</>antibodies<dot>html)。
亲本抗体也可以选自在临床试验中或用于临床使用的开发中所批准使用的各种治疗性抗体。这样的治疗性抗体包括但不限于，利妥昔单抗(IDEC/Genentech/罗氏)(参见，例如，美国专利号5,736,137)、批准用于治疗非何杰金淋巴瘤的嵌合抗CD20抗体；HuMax-CD20、目前正由Genmab开发的CD20，在专利号为5,500,362的美国专利中描述的抗CD20抗体、AME-133(Applied Molecular Evolution)、hA20(Immunomedics,Inc.)、HumaLYM(Intracel)、和PRO70769(PCT申请号PCT/US2003/040426)，曲妥珠单抗(Genentech)(参见例如，美国专利号5,677,171)，批准用于治疗乳腺癌的人源化抗Her2/neu抗体；帕妥珠单抗(rhuMab-2C4，)，目前正在开发由Genentech；抗Her2抗体(美国专利号4753894)；西妥昔单抗(Imclone)(美国专利号4,943,533；PCT公开号WO96/40210)，是用于多种癌症的、处于临床试验中的嵌合抗EGFR抗体；BX-EGF(美国专利号6,235,883)，目前正由Abgenix-Immunex-Amgen开发；HUMAX-EGFR(美国专利号7,247,301)，目前正由Genmab开发；425、EMD55900、EMD62000和EMD72000(Merck KGaA)(美国专利号5,558,864；Murthy等(1987)Arch.Biochem.Biophys.252(2):549-60；Rodeck等，(1987)J.Cell.Biochem.35(4):315-20；Kettleborough等，(1991)Protein Eng.4(7):773-83)；CR62(Institute of Cancer Research)(PCT公开号WO 95/20045；Modjtahedi等，(1993)J.Cell.Biophys.22(I-3):129-46；Modjtahedi等，(1993)Br.J.Cancer 67(2):247-53；Modjtahedi等，(1996)Br.J.Cancer 73(2):228-35；Modjtahedi等(2003)Int.J.Cancer 105(2):273-80)；TheraCIM hR3(YMBiosciences,Canada和Centro de Immunologia Molecular,Cuba(美国专利号5,891,996；美国专利号6,506,883；Mateo等，(1997)Immunotechnol.3(1):71-81)；mAb-806(Ludwig Institue for Cancer Research,MemorialSloan-Kettering)(Jungbluth等(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.100(2):639-44)；KSB-102(KS Biomedix)；MR1-1(IVAX,美国国家癌症研究所)(PCT公开号WO 01/62931A2)；和SC100(Scancell)(PCT公开号WO01/88138)；阿仑单抗(Millenium)，目前批准用于治疗B细胞慢性淋巴细胞白血病的人源化的mAb；莫罗单抗CD3()，其是由Ortho Biotech/强生公司开发的抗CD3抗体；替伊莫单抗()，其是由IDEC/Schering AG开发的抗CD20抗体；吉妥珠单抗奥唑米星()，其是由Celltech/Wyeth研制开发的抗CD33(P67蛋白)抗体；阿法赛特()，由Biogen开发的抗LFA-3Fc融合)；阿昔单抗()，由Centocor/礼来开发；巴利昔单抗()，由诺华公司开发；帕利珠单抗(由Medimmune公司开发；英夫利昔单抗()，由Centocor公司开发的抗TNFα抗体，阿达木单抗()，由Abbott开发的抗TNFα抗体；由Celltech公司开发的抗TNFα抗体；戈利木单抗(CNTO-148)，由Centocor公司开发的全人源的TNF抗体；依那西普()，由Immunex/Amgen开发的p75TNF受体Fc融合；Ienercept，由罗氏先前开发的p55TNF受体Fc融合；ABX-CBL，正由Abgenix开发的抗CD147抗体；ABX-IL8，正由Abgenix开发的抗IL8抗体；ABX-MA1，正由Abgenix开发的抗MUC18抗体；Pemtumomab(R1549,90Y-muHMFG1)，Abgenix的开发中的抗MUC1；Therex(R1550)，正由Antisoma开发的抗MUC1抗体；AngioMab(AS1405)，正由Antisoma开发；HuBC-1，正由Antisoma开发；正由Antisoma开发的Thioplatin(AS1407)；(那他珠单抗)，正由Biogen开发的抗α-4-β-1(VLA-4)和α-4-β-7抗体；VLA-1mAb，正由Biogen开发的抗VLA-1整合素抗体；LTBR mAb，正由Biogen开发的抗淋巴毒素β受体(LTBR)抗体；CAT-152，正由Cambridge抗体Technology公司开发的抗TGF-β抗体；ABT 874(J695)，正由Abbott公司开发的抗IL-12p40抗体；CAT-192，正由Cambridge抗体Technology和Genzyme开发的抗TGFβ1抗体；CAT-213，正由Cambridge抗体Technology公司开发的抗Eotaxin1抗体；正由Cambridge抗体Technology和Human Genome Sciences Inc.开发的抗Blys抗体；TRAIL-R1mAb，正由Cambridge抗体Technology和HumanGenome Sciences Inc.开发的抗TRAIL-R1抗体；贝伐单抗；rhuMAb-VEGF，正由Genentech开发的抗VEGF抗体；正由Genentech开发的抗HER受体家族抗体；抗组织因子(ATF)，正由Genentech开发的抗组织因子抗体；(奥马珠单抗)，正由Genentech开发的抗IgE抗体；(依法利珠单抗)，正由Genentech和Xoma开发的抗CD11a抗体；MLN-02抗体(原名LDP-02)，正由Genentech和Millenium Pharmaceuticals开发；HuMaxCD4，其是正由Genmab开发的抗CD4抗体；HuMax-IL15，其是正由Genmab和Amgen开发的抗IL15抗体；HuMax-Inflam，其正由Genmab和Medarex开发；HuMax-Cancer，其是正由Genmab和Medarex和Oxford GcoSciences开发的抗乙酰肝素酶I抗体；HuMax-Lymphoma，正由Genmab和Amgen开发；HuMax-TAC，正由Genmab开发；正由IDEC Pharmaceuticals开发的IDEC-131和抗CD40L抗体；IDEC-151(克立昔单抗(Clenoliximab))，正由IDECPharmaceuticals开发的抗CD4抗体；IDEC-114，正由IDEC Pharmaceuticals开发的抗CD80抗体；IDEC-152，正由IDEC Pharmaceuticals开发的抗CD23；正由IDEC Pharmaceuticals开发的抗巨噬细胞移动因子(MIF)抗体；BEC2，其是正由Imclone开发的抗独特型抗体；IMC-1C11，其是正由Imclone开发的抗KDR抗体；DC101，其是正由Imclone开发的抗flk-1抗体；正由Imclone开发的抗VE钙粘蛋白抗体；(拉贝珠单抗(Iabetuzumab))、正由Immunomedics开发的抗VE钙粘蛋白抗体；正由Immunomedics开发的抗癌胚抗原(CEA)抗体；(依帕珠单抗)，其是正由Immunomedics开发的抗CD22抗体；正由Immunomedics开发的AFP-Cide；正由Immunomedics开发的MyelomaCide；正由Immunomedics开发的MyelomaCide；正由Immunomedics开发的LkoCide；正由Immunomedics开发的ProstaCide；正由Medarex开发的抗CTLA4抗体；MDX-060，其是正由Medarex开发的抗CD30抗体；正由Medarex开发的MDX-070；正由Medarex开发的MDX-018；正由Medarex和Immuno-Designed Molecules开发的(IDM-1)和抗Her2抗体；其是正由Medarex和Genmab开发的抗CD4抗体；HuMax-IL15，其是正由Medarex和Genmab开发的抗IL15抗体；CNTO 148，其是正由Medarex和Centocor/J&J开发的抗TNFα抗体；CNTO 1275，其是正由Centocor/J&J开发的抗细胞因子抗体；MOR101和MOR102，正由MorphoSys开发的抗细胞间黏附分子-1(ICAM-1)(CD54)抗体；MOR201，其是正由MorphoSys开发的抗成纤维细胞生长因子受体3(FGFR-3)抗体；(维西珠单抗)，其是正由Protein Design Labs开发的抗CD3抗体；其是正由Protein Design Labs开发的抗γ干扰素抗体；正由Protein Design Labs开发的抗α5β1干扰素抗体；正由ProteinDesign Labs开发的抗IL-12；ING-1，其是正由Xoma开发的抗Ep-CAM抗体；(奥马珠单抗)，其是正由Genentech和诺华开发的人源化抗IgE抗体；以及MLN01，其是正由Xoma开发的人源化抗β2整合素抗体。在另一实施方案中，所述治疗剂包括KRN330(Kirin)；huA33抗体(A33，路德维格癌症研究所)；CNTO95(αV整合素，Centocor)；MEDI-522(αVβ3integrin，Medimmune)；伏洛昔单抗(αVβ1整合素，Biogen/PDL)；人类mAb 216(B细胞糖基化抗原表位，NCL)；BiTE MT103(双特异性CD19×CD3，MedImmune公司)；4G7×H22(双特异性B细胞×FcγR1，Medarex/Merck KGa)；rM28(双特异性CD28×MAPG，欧洲专利号EP1444268)；MDX447(EMD82633)(双特异性CD64×EGFR，Medarex)；卡妥索单抗(removab)(双特异性的EpCAM×抗CD3，Trion/Fres)；厄妥索单抗(双特异性HER2/CD3,Fresenius Biotech)；奥戈伏单抗(oregovomab)(OvaRex)(CA-125，ViRexx)；(WX G250)(碳酸酐酶IX，Wilex)；CNTO888(CCL2，Centocor)；TRC105(CD105(内皮糖蛋白)，Tracon)；BMS-663513(CD137激动剂，Brystol Myers Squibb)；MDX-1342(CD19，Medarex公司)；希普利珠单抗(Siplizumab)(MEDI-507)(CD2，Medimmune)；奥法木单抗(Humax-CD20)(CD20，Genmab公司)；利妥昔单抗(Rituxan)(CD20，Genentech)；维妥珠单抗(veltuzumab)(hA20)(CD20,Immunomedics)；依帕珠单抗(CD22，Amgen)；鲁昔单抗(IDEC 152)(CD23,Biogen)；莫罗莫那-CD3(CD3，邻位)；HuM291(CD3fc受体，PDL Biopharma)；HeFi-1，CD30，NCL)；MDX-060(CD30，Medarex)；MDX-1401(CD30，Medarex)；SGN-30(CD30，西雅图Genentics)；SGN-33(林妥珠单抗)(CD33，西雅图Genentics)；Zanolimumab(HUMAX-CD4)(CD4，Genmab)；HCD122(CD40，诺华)；SGN-40(CD40，Seattle Genentics)；Campath1h(阿仑单抗)(CD52，Genzyme)；MDX-1411(CD70，Medarex)；hLL1(EPB-1)(CD74.38，Immunomedics)；Galiximab(IDEC-144)(CD80，Biogen)；MT293(TRC093/D93)(断裂的胶原蛋白，Tracon)；HuLuc63(CS1，PDL Pharma)；易普利单抗(ipilimumab)(MDX-010)(CTLA4,BrystolMyers Squibb)；Tremelimumab(Ticilimumab，CP-675,2)(CTLA4，辉瑞)；HGS-ETR1(马帕木单抗)(DR4TRAIL-R1激动剂，Human GenomeScience/Glaxo Smith Kline)；AMG-655(DR5，Amgen)；Apomab(DR5，Genentech)；CS-1008(DR5，Daiichi Sankyo)；HGS-ETR2(来沙木单抗)(DR5TRAIL-R2激动剂，HGS)；西妥昔单抗(爱必妥)(EGFR，Imclone)；IMC-11F8，(EGFR，Imclone)；尼妥珠单抗(EGFR，YM Bio)；帕尼单抗(Vectabix)(EGFR，Amgen)；扎妥木单抗(Zalutumumab)(HuMaxEGFr)(EGFR，Genmab公司)；CDX-110(EGFRvIII,AVANT Immunotherapeutics)；阿德木单抗(adecatumumab)(MT201)(Epcam,Merck)；依决洛单抗(Panorex，17-1A)(Epcam,Glaxo/Centocor)；MORAb-003(叶酸受体a，Morphotech)；KW-2871(神经节苷脂GD3，Kyowa)；MORAb-009(GP-9，Morphotech)；CDX-1307(MDX-1307)(hCGb，Celldex)；曲妥珠单抗(赫赛汀)(HER2,Celldex)；帕妥珠单抗(rhuMAb 2C4)(HER2(DI),Genentech)；阿泊珠单抗(apolizumab)(HLA-DRβ链，PDL Pharma)；AMG-479(IGF-1R，Amgen)；抗-IGF-1R R1507(IGF1-R，Roche)；CP751871(IGF1-R，辉瑞)；IMC-A12(IGF1-R，Imclone)；BIIB022(IGF-1R，Biogen)；MIK-β-1(IL-2Rb(CD122)，Hoffman LaRoche)；CNTO328(IL6，Centocor)；抗KIR(1-7F9)(杀伤细胞Ig样受体(KIR)，Novo)；Hu3S193(Lewis(y)，惠氏，癌症研究路德维格研究所)；hCBE-11(LTβR,Biogen)；HuHMFG1(MUC1，Antisoma/NCL)；RAV12(N-连接的碳水化合物抗原表位，Raven)；CAL(甲状旁腺激素相关蛋白(PTH-RP)，加利福尼亚大学)；CT-011(PD1，CureTech)；MDX-1106(ONO-4538)(PD1，PD1,Medarex/Ono)；MAb CT-011(PD1,Curetech)；IMC-3G3(PDGFRa,Imclone)；巴维昔单抗(bavituximab)(磷脂酰丝氨酸，Peregrine)；huJ591(PSMA，Cornell Research Foundation)；muJ591(PSMA，Cornell Research Foundation)；GC1008(TGFb(泛)抑制剂(IgG4)，Genzyme)；英夫利昔单抗(Remicade)(TNFa,Centocor)；A27.15(转铁蛋白受体，Salk Institute,INSERN WO 2005/111082)；E2.3(转铁蛋白受体，Salk Institute)；贝伐单抗(Avastin)(VEGF，Genentech)；HuMV833(VEGF，Tsukuba Research Lab,PCT公开号WO/2000/034337,University of Texas)；IMC-18F1(VEGFR1，Imclone)；IMC-1121(VEGFR2，Imclone)。
有用的双特异性亲本抗体的实例包括但不限于，具有针对肿瘤细胞抗原的一种抗体和针对细胞毒触发分子的另一种抗体的那些双特异性亲本抗体，诸如抗FcγRI/抗CD15、抗p185HER2/FcγRIII(CD16)、抗CD3/抗恶性B细胞(1D10)、抗CD3/抗p185HER2，抗CD3/抗P97，抗CD3/抗肾细胞癌，抗FcγRI/抗CD15、抗p185HER2/FcγRIII(CD16)、抗CD3/抗恶性B细胞(1D10)、抗CD3/抗p185HER2、抗CD3/抗P97、抗CD3/抗肾细胞癌、抗CD3/抗OVCAR-3、抗CD3/L-D1(抗结肠癌)、抗CD3/抗黑色素细胞刺激激素类似物、抗EGF受体/抗CD3、抗CD3/抗CAMA1、抗CD3/抗CD19、抗CD3/MoV18、抗神经细胞粘附分子(NCAM)/抗CD3、抗叶酸结合蛋白(FBP)/抗CD3、防泛癌相关抗原(AMOC-31)/抗CD3；具有特异性与肿瘤抗原结合的一种抗体和与毒素结合的另一种抗体的双特异性抗体，诸如抗皂草素/抗Id-1、抗CD22/抗皂草素、抗CD7/抗皂草素、抗CD38/抗皂草素、抗CEA/抗蓖麻毒蛋白A链、抗干扰素α(IFN-α)/抗杂交瘤独特型、抗CEA/抗长春花生物碱；用于转化酶激活前药的双特异性抗体，诸如抗CD30/抗碱性磷酸酶(其将磷酸丝裂霉素(mitomycin phosphate)前药催化转化成丝裂霉素醇)；可被用作纤维蛋白溶解剂的双特异性抗体，诸如抗血纤维蛋白/抗组织纤溶酶原激活剂(tPA)、抗血纤维蛋白/抗尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)；用于靶向细胞表面受体的免疫复合物双特异性抗体，如抗低密度脂蛋白(LDL)/抗Fc受体(例如FcγRI、FcγRII或FcγRIII)；用于治疗感染性疾病的双特异性抗体，如抗CD3/抗单纯疱疹病毒(HSV)、抗T细胞受体：CD3复合物/抗流感、抗FcγR/抗HIV；用于体外或活体内的肿瘤检测的双特异性抗体，如抗CEA/抗EOTUBE、抗CEA/抗DPTA，抗抗p185HER2/抗半抗；作为疫苗佐剂的双特异性抗体(参见Fanger,M W等，Crit Rev Immunol.1992；12(34):101-24，通过引用将其并入本文)；和作为诊断工具的双特异性抗体，诸如抗兔IgG/抗铁蛋白、抗辣根过氧化物酶(HRP)/抗激素、抗促生长素抑制素/抗物质P、抗HRP/抗FITC、抗CEA/抗β半乳糖苷酶(参见Nolan,O etR.O'Kennedy,Biochim Biophys Acta.1990Aug.1；1040(1):1-11，通过引用将其并入本文)。三特异性抗体的实例包括抗CD3/抗CD4/抗CD37、抗CD3/抗CD5/抗CD37和抗CD3/抗CD8/抗CD37。
在某些实施方案中，所述包含在位点特异性的位置的一个或多个非天然氨基酸残基的抗体与本文所描述的任何亲本抗体具有高序列同一性。在某些实施方案中，所述抗体实质上与本文所描述的亲本抗体相同。在某些实施方案中，所述抗体与本文所描述的亲本抗体具有约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、或约95％的同一性。在某些实施方案中，所述抗体与本文所描述的亲本抗体具有大于约65％、大于约70％、大于约75％、大于约80％、大于约85％、大于约90％、或大于约95％的同一性。如果一种抗体的至少一个多肽链与另一抗体的相应多肽链具有序列同一性，则抗体是实质上相同的。在某些实施方案中，所述包含在位点特异性的位置的一个或多个非天然氨基酸残基的抗体与SEQ ID NOS:1-6中的任一个在至少一个域、至少两个域、或至少三个域具有大于约65％、大于约70％、大于约75％、大于约80％、大于约85％、大于约90％、或大于约95％的同一性。
抗体组合物
利用本领域中可得的方法和本文所公开的那些方法可以将本文中所描述的抗体配制成组合物。本文公开的任何化合物都可以以合适的药物组合物提供，并且由合适的施用途径施用。
在某些实施方案中，本文中提供的抗体的组合物进一步包含药学上可接受的载体。所述载体可以是与药物组合物一起施用的稀释剂、赋形剂或媒介物(vehicle)。这样的药物载体可以是无菌液体，如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的油，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。盐水溶液和水性葡萄糖和甘油溶液也可以用作液体载体，特别是用于可注射的溶液。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。如果需要，组合物也可以包含少量的润湿剂或乳化剂、或pH缓冲剂。这些组合物可以采用溶液、混悬剂、乳剂、片剂、丸剂、胶囊剂、散剂、缓释制剂等形式。口服制剂可以包括标准载体，如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。合适的药物载体的实例在.W.Martin,1990,Remington'sPharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co中有描述。
在一些实施方案中，药物组合物以适于施用给人类受试者的形式提供。在一些实施方案中，药物组合物将包含预防或治疗有效量的抗体以及合适量的载体，以便提供用于适当地施用给患者的形式。所述制剂应该适合施用方式。
在一些实施方案中，以适合于静脉内施用的形式提供所述药物组合物。通常情况下，适用于静脉内施用的组合物是在无菌等渗水性缓冲液中的溶液。必要时，组合物也可以包括增溶剂和缓解注射部位疼痛的局部麻醉剂如利诺卡因(lignocamne)。然而，这样的组合物可以通过除静脉内施用以外的途径施用。
在特定的实施方案中，药物组合物适合于皮下施用。在特定的实施方案中，药物组合物适合于肌肉内施用。
药物组合物的成分可以以单位剂型(例如，作为干燥的冻干粉剂或无水浓缩物提供)分开地或混合在一起提供。当组合物通过输注施用时，可以用包含无菌药物级水或盐水的输液瓶来分配。当组合物通过注射施用时，可以提供注射用无菌水或盐水的安瓿，以便可以在施用之前混合成分。
在一些实施方案中，药物组合物作为干燥灭菌的冻干粉末被提供，其能够被重新配制至适当浓度，用于施用给受试者。在一些实施方案中，抗体作为无水浓缩物被提供。在一些实施方案中，抗体作为干燥灭菌的冻干粉末以以下的单位剂量被提供：至少0.5mg、至少1mg、至少2mg、至少3mg、至少5mg、至少10mg、至少15mg、至少25mg、至少30mg、至少35mg、至少45mg、至少50mg、至少60mg、或至少75mg。
在一些实施方案中，药物组合物以液体形式提供。在一些实施方案中，药物组合物以液体形式提供，并且实质上不含表面活性剂和/或无机盐。在一些实施方案中，以以下单位剂量以液体形式提供抗体：至少0.1mg/ml、至少0.5mg/ml、至少1mg/ml、至少2.5mg/ml、至少3mg/ml、至少5mg/ml、至少8mg/ml、至少10mg/ml、至少15mg/ml、至少25mg/ml、至少30mg/ml、或至少60mg/ml。
在一些实施方案中，将药物组合物配制成盐的形式。药学上可接受的盐包括用如来自盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的那些阴离子形成的盐，以及用如来自氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等。
在治疗应用中，医生将根据预防性疗法或根治疗法并且根据年龄、体重、感染阶段和对待治疗的受试者是特有的其它因素决定他认为是最合适的剂量。在某些实施方案中，对于成人，剂量为约1-约1000mg/天，或对于成人为约5-约250mg/天或约10-50mg/天。在某些实施方案中，剂量为约5-约400mg/天或25-200mg/天/成人。在某些实施方案中，还考虑了约50-约500mg/天的剂量率。
用于治疗或预防的方法
本文所提供的某些抗体可用于治疗或预防本领域医生认为合适的任何疾病或病症。通常，治疗或预防的方法，包括将治疗或预防有效量的抗体或抗体组合物的施用给需要其进行治疗或预防疾病或病症的受试者。
抗体或组合物的治疗有效量是能有效降低特定的疾病或病症的严重程度、持续时间和/或症状的量。可以通过标准临床技术来确定在特定疾病的预防、控制、治疗和/或改善中将是治疗有效的抗体或组合物的量。待施用的抗体或组合物的确切量，在某种程度上取决于施用途径、特定的疾病或病症的严重性，并应根据医生的判断和各受验试者的情况来决定。
在一些实施方案中，本文提供的抗体的有效量为约0.025mg/kg至约1000mg/kg体重的人类受试者。在某些实施方案中，以以下量将抗体施用给人类受试者：约1000mg/kg体重或更少、约950mg/kg体重或更少、约900mg/kg体重或更少、约850mg/kg体重或更少、约800mg/kg体重或更少、约750mg/kg体重或更少、约700mg/kg体重或更少、约650mg/kg体重或更少、约600mg/kg体重或更少、约550mg/kg体重或更少、约500mg/kg体重或更少、约450mg/kg体重或更少、约400mg/kg体重或更少、约350mg/kg体重或更少、约300mg/kg体重或更少、约250mg/kg体重或更少、约200mg/kg体重或更少、约150mg/kg体重或更少、约100mg/kg体重或更少、约95mg/kg体重或更少、约90mg/kg体重或更少、约85mg/kg体重或更少、约80mg/kg体重或更少、约75mg/kg体重或更少、约70mg/kg体重或更少、或约65mg/kg体重或更少。
在一些实施方案中，本文提供的抗体的有效量为约0.025mg/kg至约60mg/kg体重的人类受试者。在某些实施方案中，本文提供的药物组合物中的抗体的有效量是约0.025mg/kg或更少、约0.05mg/kg或更少、约0.10mg/kg或更少、约0.20mg/kg或更少、约0.40mg/kg或更少、约0.80mg/kg或更少、约1.0mg/kg或更少、约1.5mg/kg或更少、约3mg/kg或更少、约5mg/kg或更少、约10mg/kg或更少、约15mg/kg或更少、约20mg/kg或更少、约25mg/kg或更少、约30mg/kg或更少、约35mg/kg或更少、约40mg/kg或更少、约45mg/kg或更少、约50mg/kg或约60mg/kg或更少。
可以利用本领域技术人员已知的的任何方法施用所述方法的药物组合物。例如，可以于肌内、皮内、腹膜内、静脉内、皮下给药，或它们的任意组合施用药物组合物。在一些实施方案中，于皮下施用药物组合物。在一些实施方案中，于静脉施用药物组合物。在一些实施方案中，于肌内施用药物组合物。
用于检测或诊断的方法
本文提供的抗体可用于任意靶标的检测或本领域医生认为适合的任意疾病或病症的诊断。该方法包括检测抗体与在合适部位(例如，合适的身体、组织或细胞)的靶抗原的结合。在这些方法中，抗体和抗原之间的复合物的形成可以通过本领域技术人员已知的任意方法来检测。实例包括使用用于检测的二级试剂的测定法、ELISA以及免疫沉淀和凝集测定法。这些测定法的详细描述，例如提供于Harlow和Lane，Antibodies:：(ColdSpring Harbor Laboratory,纽约1988555-612)、Maertens和Stuyver的WO96/13590、Zrein等.(1998)和WO96/29605。
对于原位诊断，可以通过本领域中已知的方法，诸如，例如，静脉内、鼻内、腹膜内、脑内、动脉内注射等，而将抗体施用给受试者，以使根据本发明的抗体与淀粉样蛋白的表位区域之间的特定结合可以发生。可以通过附接到抗体的标记物或任意其它本领域公知的检测方法而方便地检测抗体/抗原复合物。
本文还提供用于检测或诊断的试剂盒。示例性试剂盒包含连同一种或多种试剂一起的一种或多种抗体，所述一种或多种试剂可用于检测一种或多种抗体和它们的靶抗原之间的复合物。
抗体的制备
本文所描述的抗体可通过对本领域技术人员而言是显而易见的任意技术来制备。而没有限制。用于制备的有用的技术包括活体内合成(例如利用修饰的tRNA和tRNA合成酶)、无细胞合成(例如利用修饰的tRNA和tRNA合成酶)、固相多肽合成和液相多肽合成。本部分和下文的实例描述了示例性技术。
在某些方法中，自编码抗体多肽链的一种或多种多核苷酸翻译和/或转录抗体。因此，本文提供能够编码在一个或多个多肽链中具有在位点特异性位置的一个或多个非天然氨基酸的抗体的多核苷酸。在某些实施方案中，所述多核苷酸包含通常与对应于非天然氨基酸的位点特异性多肽位置的核苷酸位置处的氨基酸不相关联的密码子。这样的密码子的实例包括终止密码子、4碱基密码子、5碱基密码子等等。反应混合物通常包括能够制备补充(抑制)所述密码子的tRNA的tRNA合成酶。将这些抑制型tRNA连接到非天然氨基酸，以促进其在抑制型密码子的位点并入到多肽。
抗体可以通过本领域技术人员以知的技术来制备，所述抗体用于表达将非天然氨基酸并入到多肽链的位点特异性位置的这样的多核苷酸。这样的技术描述于例如以下专利中：美国专利号7,045,337和7,083,970；在美国公布的专利申请号US 2008/0317670、US 2009/0093405、US 2010/0093082、US 2010/0098630、US 2008/0085277；以及国际专利公开号WO 2004/016778A1和WO 2008/066583A2,，其内容通过引用以其整体并入本文。
在某些实施方案中，抗体可以在无细胞反应混合物中制备，所述无细胞反应混合物包含至少一种用非天然氨基酸氨酰化的正交tRNA，其中，所述正交tRNA的碱基对具有通常与氨基酸不相关联的密码子，例如，终止密码子；4碱基密码子等。该反应混合物还包含tRNA合成酶，所述tRNA合成酶能够用非天然氨基酸氨酰化正交tRNA。通常外源合成易于被存在于细菌细胞提取物中的蛋白酶降解的正交tRNA合成酶，并在引发多肽合成之前将其加入到反应混合物中。正交tRNA可以在自其中获得细胞提取物的细菌细胞中合成、可以在多肽合成反应过程中从头合成、或可以外源添加到反应混合物中。
在某些实施方案中，任选地向反应混合物中添加影响非天然氨基酸插入和蛋白质插入或折叠的组分。这样的组分包括提高的浓度的翻译因子，以减小释放因子1和2的影响，并进一步优化正交组分的浓度。蛋白伴侣(氧化还原酶和异构酶的Dsb系统、GroES、GroEL、DNAJ、DNAK、Skp等)可以外源加入到反应混合物中，或可以在用于制备细胞提取物的源细胞中过表达。该反应可以利用大规模反应器、小规模反应器或可以多路进行多个同时合成。连续反应使用进料机构(feed mechanism)以引入试剂流，并且可以将终产物作为过程的一部分而分离。分批体系也是有利的，其中可以引入附加的试剂以延长有效合成期。可以以任何模式运行反应器，如分批模式、扩展分批模式、半分批(semi-batch)模式、半连续模式、分批补料模式以及连续模式，根据应用目的来选择使用何种方式。该反应可以是任意体积的，可以是小规模的(通常至少约1μl且不大于约15μl)，或规模增加的(其中反应体积为至少约15μl、通常至少约50μl，更通常至少约100μl，并且可以是500μl、1000μl、或更大)。原则上，反应可以以任何规模进行，只要在需要时提供足够的氧(或其它电子受体)即可。
用于在伸长期间其中至少一个非天然氨基酸引入到多肽链的合成的方法，包括但不限于：(I)向无细胞反应中添加外源纯化的正交合成酶、非天然氨基酸、和正交tRNA，(II)向反应混合物中添加外源纯化的正交合成酶和非天然氨基酸，但其中正交tRNA在无细胞反应过程中被转录；(III)添加外源纯化的正交合成酶和非天然氨基酸到反应混合物中，但其中正交tRNA由细胞提取物源生物体合成。在某些实施方案中，正交的组分通过可调节的启动子驱动，以便可以控制合成水平，尽管可以使用其他措施，如通过添加或特定的消化而控制相关的DNA模板的水平。
在一些实施方案中，细菌无细胞表达系统用于利用非天然氨基酸(nnAA)来制备蛋白质或肽的变体。相对于常规体内蛋白质表达方法，用于体外蛋白质合成的细菌无细胞提取物的使用提供了一些优点。无细胞系统可以将大部分(如果不是全部)细胞代谢资源引导向一种蛋白质的独自的生产。此外，体外细胞壁和细胞膜组分的缺乏是有利的，因为它允许控制合成环境。然而，通过抑制蛋白质合成的细菌蛋白质可以直接或间接降低无细胞提取物的效率。因此，使降低蛋白质合成效率的不期望的蛋白质失活应该增加无细胞提取物中期望蛋白的产率。例如，使降低蛋白质合成效率的蛋白质失活，应当会增加在限定的氨基酸残基具有并入的非天然氨基酸的多肽的产率。将nnAA引入到多肽对于提高蛋白质的生物多样性和功能是有用的。用于制备在限定的氨基酸残基具有并入的nnAA的多肽的一种方法是使用nnAA、氨酰化的正交CUA，所述氨酰化的正交CUA含有用于在蛋白质的翻译过程中在琥珀(停止)密码子处将nnAA并入到新生多肽的tRNA。然而，在琥珀密码子处的nnAA的并入可被原生细菌终止复合物抑制，所述原生细菌终止复合物通常识别终止密码子和终止翻译。释放因子1(RF1)是终止复合物蛋白质，其通过识别mRNA序列中的琥珀密码子而促进翻译的终止。琥珀终止密码子的RF1识别可以促进在非天然氨基酸并入部位的过早截断产物(pre-mature truncation product)，并因此降低蛋白质产率。因此，减弱RF1的活性可以增加nnAA并入到重组蛋白中。
先前已经表明可以通过以以下3种方式减弱RF1活性来增加nnAA的并入：1)RF1的中和抗体失活，2)RF1的基因组敲除(在RF2支撑株中)，以及3)使用工程菌株来表达RF1而位点特异性去除RF1，所述RF1含有用于通过亲和层析进行去除的蛋白质标签(几丁质结合域和His标签)。用于使RF1失活的另一种方法包括将蛋白水解切割位点引入到RF1氨基酸序列。所述切割位点在细菌细胞生长的过程中对于蛋白酶是不可接近的，但细菌细胞裂解而产生无细胞提取物时，被蛋白酶切割。因此，在表达这样的修饰的RF1变体的细菌细胞提取物中提高了在琥珀密码子处具有并入的nnAA的全长多肽的产率。
在一些实施方案中，为了产生包含非天然氨基酸的抗体，人们需要核酸模板。用于无细胞蛋白质合成的模板可以是mRNA或DNA。所述模板可以包含用于感兴趣的任意特定抗体的序列，并可以编码全长抗体或其任何长度的片段。用作蛋白质合成模板核酸任选源自天然来源，或者它们可以是合成的或重组的。例如，DNA可以是重组的DNA，例如，质粒、病毒等。
在一些实施方案中，一旦产生抗体的核酸模板，该模板即可用于在无细胞翻译系统合成所述抗体。例如，在足以将所述模板翻译成蛋白质的条件下，可以将所述该模板添加到细胞裂解物。所述细胞裂解物可以来自细菌细胞或真核细胞。然后如下文所描述的，可以使用本领域中已知的方法纯化所表达的蛋白质。
在一些实施方案中，翻译系统(例如，体外蛋白质合成系统)，用于制备具有并入其中的一个或多个nnAA的抗体。示例性翻译系统包含无细胞提取物、细胞裂解物、或重组的翻译系统，以及用于合成在预选的(限定的)位置具有非天然氨基酸的所需的多肽或蛋白质的核酸模板。反应混合物将进一步包含用于要合成的大分子的单体(例如氨基酸、核苷酸等)、以及这样的辅因子、酶和合成所必需的其他试剂，例如核糖体、tRNA、聚合酶、转录因子等。除了上述组分(诸如无细胞提取物、核酸模板和氨基酸)之外，还可以向该反应中添加蛋白质合成特定所需的材料。所述材料包括盐、亚叶酸、环AMP、蛋白质或核酸降解酶抑制剂、蛋白合成抑制剂或调节剂、氧化/还原电位调节剂、非变性表面活性剂、缓冲液组分、精胺、亚精胺、腐胺等。各种无细胞合成反应系统在本领域是众所周知的。参见例如，Kim,D.M.和Swartz,J.R.Biotechnol.Bioeng.66:180-8(1999)；Kim,D.M.和Swartz,J.R.Biotechnol.Prog.16:385-90(2000)；Kim,D.M.和Swartz,J.R.Biotechnol.Bioeng.74:309-16(2001)；Swartz等，Methods MoL Biol.267:169-82(2004)；Kim,D.M.和Swartz,J.R.Biotechnol.Bioeng.85:122-29(2004)；Jewett,M.C.和Swartz,J.R.,Biotechnol.Bioeng.86:19-26(2004)；Yin,G.和Swartz,J.R.,Biotechnol.Bioeng.86:188-95(2004)；Jewett,M.C.和Swartz,J.R.,Biotechnol.Bioeng.87:465-72(2004)；Voloshin,A.M.和Swartz,J.R.,Biotechnol.Bioeng.91:516-21(2005)。用于无细胞合成所需的多肽的附加的条件描述在WO2010/081110中，其内容通过引用以其整体并入本文。
在一些实施方案中，DNA模板用于体外驱动蛋白质合成，且添加RNA聚合酶至反应混合物中，以提供DNA模板的增强的转录。适合用于本文的RNA聚合酶包括在细菌提取物所来源于的细菌中发挥作用的任何RNA聚合酶。在其它实施方案中，RNA模板用于体外驱动蛋白质合成，可以以任何方便的顺序将反应混合物的组分混合在一起，但是优选以最后添加RNA模板的顺序混合，从而将核酸酶对RNA模板的潜在的降解最小化。
在一些实施方案中，无细胞翻译系统用于制备具有并入其中的一个或多个nnAA的抗体。无细胞蛋白质合成利用细胞机器(cellular machinery)的催化能力。在体外获得最大蛋白收率需要足量的诸如三磷酸核苷和氨基酸等底物供给、稳态环境、催化剂稳定性以及除去或避免抑制性副产物。体外合成反应的优化受益于快速生长的生物体的体内状态的再造。因此，在本发明的一些实施方案中，无细胞合成在氧化磷酸化被激活的反应中进行。其它细节描述在专利号为7,338,789的美国专利中，其内容通过引用以其整体并入本文。
相对于常规活体内蛋白质表达方法，体外或无细胞的蛋白质合成提供了一些优点。无细胞系统能将大部分(如果不是全部)细胞代谢资源引导向一种蛋白的独自产生。此外，在体外缺少细胞壁和细胞膜组分是有利的，因为这允许控制合成环境。例如，能够改变tRNA水平以反映正在表达的基因的密码子的使用。由于不需要考虑细胞生长或生存力，因此也能够比活体内的蛋白合成更灵活地改变氧化还原电位、pH或离子强度。此外，能容易地实现直接回收纯化的、正确折叠的蛋白质产物。在一些实施方案中，近几年，已经将无细胞系统的生产率提高了2个数量级，从约5μg/ml-hr提高到约500μg/ml-hr。
在某些实施方案中，外源合成tRNA合成酶，并将其添加到无细胞反应混合物。在某些实施方案中，自细菌细胞制备反应混合物，其中在所述细菌细胞中ompT已经失活或是天然失活的。认为OmpT降解反应混合物的组分(包括tRNA合成酶)。
除了上述组分(诸如无细胞提取物、基因模板和氨基酸)之外，还可以向该反应中添加蛋白质合成特定所需的材料。所述材料包括盐、亚叶酸、环AMP、蛋白质或核酸降解酶抑制剂、蛋白合成抑制剂或调节剂、氧化/还原电位调节剂、非变性表面活性剂、缓冲液组分、精胺、亚精胺、腐胺等。
所述盐优选包括钾盐、镁盐和铵盐(例如乙酸或谷氨酸的)。一种或多种这样的盐可以具有供选择的氨基酸作为抗衡阴离子。在最适浓度的离子种类之间存在互相依赖性。通常就蛋白质的产量对这些离子种类进行优化。当改变反应介质的特定组分的浓度时，可以相应地改变另一种组分的浓度。例如，若干组分(诸如核苷酸和能量源化合物)的浓度，可以根据其它组分的浓度的变化同时进行调整。另外，反应器中的组分的浓度水平可随时间而变化。氧化/还原电位的调节剂可以是二硫苏糖醇、抗坏血酸、谷胱甘肽和/或它们的氧化形式。
在某些实施方案中，反应可以以透析模式、以分批透析方式、以半连续操作模式中的分批补料模式进行。在某些实施方案中，进料溶液可以通过膜或通过注射单元(unit)而供给到反应器中。合成的抗体可以在反应器中累积，随后在系统操作完成之后，进行分离或纯化。例如在将反应流体泵送通过吸附基质时，可以通过自反应混合物的原位或在循环回路中的亲和吸附，而连续地分离含有抗体的囊泡。
在蛋白质在反应器中合成的过程中，用于选择性地分离所需的蛋白质的该蛋白质分离装置可以包括填充有微粒的单元，所述微粒涂覆有抗体分子或用于吸附所合成的所需的蛋白质的其他分子。优选地，所述蛋白分离装置包括两根用于交替使用的柱。
可以通过标准技术将所得抗体进行纯化或分离。在下面的实施例中提供了示例性技术。
测定方法
根据对本领域技术人员而言是显而易见的的任意测定法，可以针对抗体的预期活性、或针对新的活性对抗体进行测定。所得抗体的活性可以在功能性测定中进行测定，或通过定量非功能性测定中存在的蛋白的量(例如免疫染色、ELISA、考马斯亮蓝或银染凝胶定量等)，以及测定生物活性蛋白与总蛋白的比率进行测定。
在翻译反应中产生的蛋白质的量可以以各种方式进行测量。一种方法依赖于测量正被翻译的特定蛋白质的活性的测定法的可用性。用于测量蛋白质活性的测定法的实例是荧光素酶测定系统，或氯霉素乙酰转移酶测定系统。这些测定法测量从翻译反应产生的功能活性蛋白质的量。活性测定法将不能测量因不正确的蛋白质折叠或缺乏蛋白质活性所必需的其它翻译后修饰而无活性的全长蛋白。
测量组合的体外转录和翻译反应中所产生的蛋白质的量的另一种方法是通过以下方法进行：使用已知量的放射性标记的氨基酸，诸如35S-蛋氨酸、3H-亮氨酸或14C-亮氨酸，并随后测量并入到新翻译的蛋白质的放射性标记的氨基酸的量。并入测定法将测量在体外翻译反应中所产生的所有蛋白质(包括截短蛋白质产物)中放射性标记的氨基酸的量。放射性标记的蛋白质可进一步在蛋白凝胶上分离，并经放射自显影证实该产物具有合适的尺寸，以及证实次级蛋白产物尚未生产。
实施列
如本文使用的，在这些方法、方案和实施例中使用的符号和约定，不论是否是具体定义特定的缩写，都与当代科学文献(例如生物化学杂志(Journal of Biological Chemistry))中使用的那些一致。
对于所有下述实施例，可以使用本领域技术人员已知的标准后处理和纯化方法。除非另有说明，否则所有的温度都以℃(摄氏度)表示。除非另有说明，所有的方法都在室温下进行。
实施例1
示例性的包含非天然氨基酸的抗体的合成和与
与示例性细胞毒剂的偶联
以下实施例描述了在限定的位置含有非天然氨基酸的示例性的抗体、以及它们的构建和表达的方法。如以下所阐明的，针对表达、抑制效率、与细胞杀伤剂的偶联效率、细胞结合、和细胞杀伤对抗体进行评估。在该实施例中，示例性的抗体是基于亲本抗体曲妥珠单抗(美国专利号6,165,464和2006/0018899A1；Carter等，1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA10:4285-4289)。
首先，在曲妥珠单抗的重链中的规定位置并入TAG琥珀密码子而制备构建体(construct)。利用含有具有C-末端(His)6标签(SD02005)的曲妥珠单抗的编码区的pYD质粒作为DNA模板、以及利用含有在正义和反义方向的目标突变的合成寡核苷酸(Eurofins MWS Operon；Huntsville,AL)，进行定点突变。将各突变的寡核苷酸添加到DNA模板和聚合酶((New England Biolabs；伊普斯威奇，MA)中至20μL的终体积。在含有1.5mM MgCl2和200μM dNTP的HF缓冲液中，各组分的最终浓度为0.16μM的各寡核苷酸，0.5ng/μL的模板DNA，0.02U/μL聚合酶。将混合液于98℃5m、18个PCR循环(98℃30s、55℃1min、72℃4min)、在72℃(10min)进行孵育，并在4℃储存。将DPNI(新英格兰生物实验室；伊普斯威奇，MA)添加到该混合物中至0.6U/μL的终浓度，并在37℃孵育1小时以消化亲本DNA(parent DNA)。
然后利用MultiShotTM96孔板TOP10(MultiShotTM96-Well PlateTOP10)，根据制造商的程序(Invitrogen；卡尔斯巴德,CA)，将5μL的各混合物转化成50μL的化学感受态大肠杆菌细胞。在37℃以1小时将转化的细胞回收(recovered)在200μL的SOC(Invitrogen公司；卡尔斯巴德，CA)中，并接种到补充有50μg/mL卡那霉素(Teknova；Hollister,CA)的Luria-BERTANI(LB)琼脂中。24小时后在37℃，将菌落采集到具有7.5％甘油和50μg/mL卡那霉素的200μL的LB中，并在37℃生长24小时。将20μL的培养物用于滚环扩增(RCA)并通过使用T7(5’TAATACGACTCACTATAGG 3’)引物和T7项(term)(5’GCTAGTTATTGCTCAGCG3’)引物的引物延伸进行定序。序列用软件(Gene Codes Corp；Ann Arbor,MI)进行分析，以及挑取含有突变的克隆并排列到96孔板中。使所选择的变体的过夜培养物生长，并利用根据制造商(Qiagen；Germantown,MD)的标准96孔小量制备方案而用于制备质粒DNA。小量制备的DNA的浓度用260nm(和280nm)处的吸光度进行测定。
然后利用下文所描述的修饰(modifications)，在如在Zawada等2011,Biotechnol.Bioeng.108(7)1570-1578中所描述的、如下的无细胞蛋白质合成反应中表达所述变体。还制备了未置换的曲妥珠单抗，作为对照。在室温(20℃)，用50μM碘乙酰胺处理无细胞提取物30min，并添加到含有除了来自目标变体的重链DNA之外的所有其它组分的预混合物中。无细胞反应通过添加重链DNA变体的质粒DNA而引发，并在96深孔板中，在450rpm的混合器上在30℃孵育12小时。将反应物在4℃进一步孵育5h。在蛋白质合成反应中的终浓度为30％的细胞提取物、1mM对-叠氮基苯丙氨酸(pAzF)(RSP氨基酸)、0.125mg/mL詹氏甲烷球菌(M jannaschi)琥珀抑制型tRNA、0.37mg/mL詹氏甲烷球菌pAzF特定的氨基酰基-tRNA合成酶(FRS)、2mM的GSSG、0.29mg/mL的PDI(Mclab)、100μg/mL大肠杆菌DsbC、8mM二谷氨酸镁、10mM谷氨酸铵、130mM谷氨酸钾、35mM丙酮酸钠、1.2mM AMP、各自0.86mM的GMP、UMP、和CMP、2mM氨基酸(除了0.5mM的酪氨酸和苯丙氨酸外)、4mM草酸钠、1mM腐胺、1.5mM亚精胺、15mM磷酸钾、100nM T7RNAP、2μg/mL曲妥珠单抗轻链DNA、8μg/mL曲妥珠单抗-(His)6重链DNA。以1mL的规模在96深孔板中重复两次地制备各曲妥珠单抗(Trastuzumab)变体。使用总共三个板来表达变体，将每一个与未置换的曲妥珠单抗进行比较，以标准化在整个板上的表达。应当注意的是，如此产生的所有的曲妥珠单抗变体均是未糖基化的。
为了监测蛋白质的合成，各无细胞蛋白质合成反应的一部分被取出，并掺入3.33％(v/v)l-[U-14C]-亮氨酸(300mCi/mmole；GE Life Sciences,Piscataway,NJ)中。在重链的不同位点的琥珀密码子的抑制通过还原性SDS-PAGE凝胶的[14C]-放射自显影来确定。全长曲妥珠单抗重链和抑制的曲妥珠单抗重链变体在SDS-PAGE上以50kD运行(run)。非抑制的(截短的)曲妥珠单抗变体以较低的分子量运行。重链中的琥珀抑制由下式确定：
带强度通过ImageQuant(Amersham Biosciences Corp.；Piscataway,NJ)测定。应当指出，该14C凝胶测定法不能用于评估对从第425(EU索引编号)的位置至C末端的重链的TAG变体的抑制，因为该截短的变体不能与全长产物区分开。
合成之后，各1mL的反应物用1mL的pH7.4的PBS进行稀释。在4℃将混合物以5000x g离心15分钟。用含有40μL树脂的IMAC Phytip(PhyNexus公司；San Jose,CA)通过吸量管以4.2μl/min的流速缓慢上下吸移4次而捕获上清液。用925μL IMAC结合缓冲液(50mM的pH 8.0的Tris、300mM NaCl、10mM咪唑)通过吸量管以8.3μL/min的流速上下吸移两次来洗涤树脂。用附加的925μL IMAC结合缓冲液重复该过程一次。结合的蛋白质用250μL IMAC洗脱缓冲液(50mM的pH 8.0的Tris、300mMNaCl、500mM咪唑)通过吸量管以4.2μL/min的流速上下吸移4次而进行洗脱。由于构建体的(his)6标签是C末端，该过程允许全长蛋白质的分离。为了定量纯化后的变体，将IMAC纯化的样品与通过4-15％Stain-FreeTM凝胶(Bio-Rad CriterionTMTGX#567-8085)进行解析(resolved)的2×凝胶加样缓冲液(Bio-Rad#161-0737)进行混合。在加样到凝胶的孔中之前不对样品进行加热。蛋白带通过利用Image Lab软件(v3)的Bio-Rad Gel Doc EZ系统而显现和定量。基于加样在同一凝胶上的的质量标准测定样品的带强度。
接着，将曲妥珠单抗变体偶联到示例性的细胞毒剂MMAF，使用约束的(constrained)环辛炔试剂。简言之，将DBCO-MMAF(结构如图1所示；ACME Bioscience；Palo Alto,CA)溶解在DMSO中至5mM的终浓度。将化合物用PBS稀释到1mM，然后加入到在IMAC洗脱缓冲液中的曲妥珠单抗-(His)6变体至100μM的最终药物浓度。混合物在室温(20℃)孵育17小时。通过添加叠氮化钠至100mM的终浓度、以及添加利用在1XPBS中平衡的Zeba板(Thermo Scientific；Waltham,MA)进行交换的缓冲液，而停止反应。然后使滤液通过板(Pall Corp.；华盛顿港，NY)以除去内毒素。
实施例2
示例性的抗体-药物偶联物的表征
进行疏水作用层析(HIC)以定量样品和确定如下的曲妥珠单抗变体药物偶联物的药物-抗体比率。样品和标准物在3M硫酸铵(EMD Chemical)、在在MilliQ水中制备的50mM的pH 7.0磷酸钠(Mallinckrodt)中进行1：2的稀释。对Agilent 1100二元泵HPLC系统装配具有30℃的柱温箱温度的Tosoh Bioscience LLC TSK-gel(4.6mm x 3.5cm)柱。流动相A为1.5M硫酸铵、50mM的pH 7.0的磷酸钠。流动相B为在80:20的水：异丙醇(霍尼韦尔)中的50mM的pH 7.0的磷酸钠。以1.0mL/分钟的流速递送流动相。以15％流动相B至100％流动相B的线性梯度在10分钟内进行分离。在210nm和280nm两处获得UV数据。使用ChemStation软件(安捷伦)来定量峰面积，并从总峰面积的百分比计算出药物抗体比率(DAR)。
为了评估偶联的曲妥珠单抗变体的结合，以下进行了与表达HER2的细胞的结合的测定。将纯化的偶联变体与SKBR3细胞上的HER2的结合，与临床级通过无细胞蛋白质合成所产生的非糖基化的曲妥珠单抗、或作为阴性对照的人血清的IgG1(Sigma-Aldrich；St.Louis,MO)进行比较，其中所述SKBR3细胞过量表达具有每细胞超过150万个受体拷贝数(ATCC#HTB-30,Manassas,VA)的HER2/c-erb-2基因产物。在DMEM:Ham's F-12(50:50)、补充有10％热灭活的胎牛血清(Hyclone；Thermo Scientific；Waltham,MA)、2mM的glutamax(Invitrogen；Carlsbad,CA)和1×青霉素/链霉素(Cellgro-Mediatech；Manassas,VA)的高葡萄糖(Cellgro-Mediatech；Manassas,VA)中培养SKBR3细胞。粘附细胞用无钙和镁的Hanks平衡盐溶液(HBSS)洗涤两次，并用TASETM(Hyclone；Thermo Scientific；Waltham,MA)进行收集。将10μL的总体积中的每个样品的总共200,000个细胞与偶联的曲妥珠单抗变体、临床级或者在10μL FACS缓冲液(补充有1％牛血清白蛋白的DPBS缓冲液)中制成的无糖基化的曲妥珠单抗的连续稀释液一起进行孵育。将细胞加抗体或ADC在冰上孵育60分钟。将未染色的细胞、人IgG1(同型对照)和第二抗体(山羊抗人IgG)用作对照。细胞用冰冷的FACS缓冲液洗涤两次，并用任一5μg/ml Alexa647标记的山羊抗人IgG第二抗体(Invitrogen；Carlsbad,CA)在冰上孵育1小时。所有样品用FACS缓冲液洗涤并使用BD FACSCalibur系统(BD Biosciences；San Jose,CA)进行分析。
平均荧光强度使用具有利用GraphPad Prism(GraphPad v 5.00,软件；San Diego,CA)的一个位点特异性结合方程的非线性回归分析进行拟合。数据表示为相对的MFI对μg/ml的抗体或抗体变体的浓度。
接着，偶联的曲妥珠单抗的细胞杀伤效果用如下的细胞增殖试验进行测量。自ATCC获得SKBR3和MDA-MB-468，并保持在DMEM:Ham’s F-12(50:50)、补充有10％热灭活的胎牛血清(Hyclone；Thermo Scientific；Waltham,MA)、2mM的glutamax(Invitrogen；Carlsbad,CA)和1×青霉素/链霉素(Cellgro-Mediatech；Manassas,VA)的高葡萄糖(Cellgro-Mediatech；Manassas,VA)中。粘附细胞用无钙和镁的Hanks平衡盐溶液(HBSS)洗涤两次，并用TASETM(Hyclone；Thermo Scientific；Waltham,MA)进行收集。将共103个细胞接种在96孔半区平底白色聚苯乙烯板的40μl体积中。在CO2培养箱中在37℃使细胞附着过夜。在DMEM/F12培养基中以2倍浓度配制ADC变体，并通过MultiScreen HTS96孔过滤板(Millipore；Billerica,MA)过滤。将过滤灭菌的偶联的曲妥珠单抗变体、赫赛汀、或未糖基化的曲妥珠单抗加入到处理孔中，并将板在CO2培养箱中在37℃培养120小时。对于细胞活力测定，将80μl的Cell试剂(Promega Corp.；Madison,WI)加入到各孔中，并按照每个产品的说明对板进行处理。相对发光在板检测仪(Perkin-Elmer；Waltham,MA)上进行测定。使用未经处理的细胞作为对照将相对发光读数转换为％活力。用非线性回归分析，使用log(抑制剂)对(vs.)响应-可变斜率(Variable slope)、使用GraphPad Prism的4参数拟合方程(GraphPad v 5.00,Software；San Diego,CA)来拟合数据。将数据表示为相对细胞活力、ATP含量％对μg/ml的ADC剂量。
这些表征实验的阳性结果示于表1、2和3(分别为板1、2和3)。在表中，显示了变体的下列性质：等级次序(rank order)和所制备的蛋白质的浓度、与野生型进行比较的全长产物的表达效率(抑制效率)、结合HER-2表达细胞的能力、药物-抗体比率(表示为每抗体的细胞毒剂的数目)、关于HIC曲线的评论、以及从上述的细胞杀伤测定中观察到的IC50。在关于HIC测定的评价中，单峰对应于被较好解析为单峰的曲线(这样的曲线的实例如图2所示)，NWR对应于解析较差的曲线(这样的曲线的实例如图3所示)，以及WR对应于较好解析的HIC曲线(这样的曲线的实例如图4所示)。若干显示单峰曲线的变体也表现出强效杀伤，这表明该变体确实与药物偶联，但不能在HIC柱上解析。
一般而言，优选的变体显示出的IC50为约20ng/ml或更低，甚至更优选为低于约10ng/ml，甚至更优选为低于约5ng/ml。优选地，该变体是是表达的前50％，且甚至更优选地，是表达的前25％。具有至少约1.0的DAR的变体也是优选的。优选的变体包括具有置换以下位置的非天然氨基酸的那些变体：V005、A023、G042、G065、S074、A084、A118、S119、S132、S134、T135、S136、G137、G138、T139、T155、S160、A162、S165、A172、L174、S176、S177、S191、G194、S219、P238、S239、F241、F243、K246、E356、M358、K360、V262、V264、D265、S267、H268、E269、D270、P271、E272、K274、F275、Y278,D280、G281、V282、E283、N286、T289、R292、E293、E294、Q295、Y296、N297、S298、T299,Y300、R301、V303、V305、K317、K320、S324、K326、A327、P329、A330、I332、E333、K334、T335、S337、A339、R344、R355、T359、L398、S375、S383、N384、Q386、N389、K392、G420、K340、Q342、F404、Q438、N421、和Y436。甚至更优选的是包括具有置换以下位置的非天然氨基酸的那些变体的变体：V005、A023、S074、A084、A118、S119、S132、S134、T135、S136、G137、T139、S160、A162、S165、A172、S191、G194、S239、F241、K246、S267、H268、E269、D270、P271、E272、K274、F275、D280、G281、V282、E283、N286、T289、R292、E293、E294、Q295、Y296、N297、S298、T299,Y300、R301、V303、V305、K317、K320、S324、K326、A327、P329、A330、I332、E333、K334、T335、S337、A339、R344、R355、T359、L398、S375、Q386、N389、K392、G420、K340、Q342、Q438、和N421。还更优选的是包括具有置换以下位置的非天然氨基酸的那些变体的变体：V005、A023、A084、A118、S119、S132、S134、S136、G137、S160、A162、A172、S239、F241、S267、E269、D270、P271、E272、V282、N286、R292、E293、Y296、S298、P329、A330、K334、T335、K340、R355、T359、Q386、N389、F404、G420、N421、Q438、和Q342。具有置换以下位置的非天然氨基酸的变体被认定为是特别优选的：V005、A084、A118、S132、S136、S239、E293、K334、R355、Q342、T359、和N389。
还要指出的是，表达、抑制效率、偶联效率、细胞结合、和细胞杀伤基于公开的Fc的晶体结构并不是可预测的。例如，基于E293和K334在Fc结构内的位置，预测它们不会接受芳香族苯丙氨酸衍生物的取代，但二者都表达良好，是有效的杀伤剂，分别具有2.7ng/ml和3.0ng/ml的IC50值。相反地，S131基于其在重链表面上的可用性，被预测是用于偶联的很好的位置，然而在该位置具有置换的衍生物是较差的偶联物(0.65DAR)和较差的杀伤剂(27.1ng/mL的IC50)。因此，得出的结论是，需要实验来确定针对表达、抑制、偶联、和细胞杀伤的最佳位点。
还应当注意的是，发现靠近曲妥珠单抗的N-连接糖基化位点、N297的位点非常适合于偶联。特别是，发现从R292至R301、V303和V305的位点显示出所期望的细胞杀伤和/或偶联性质。由于在如上所描述的无细胞蛋白质合成反应中所产生的曲妥珠单抗变体的未糖基化的形式，所以可以评估这些位点。
表1
表2
表3
实施例3
在示例性抗体-药物偶联物中并入非天然氨基酸的保真性
本实施例描述了对在示例性抗体-药物偶联物中并入非天然氨基酸的保真性的评价。偶联有DBCO-MMAF的、在S136以取代的对-叠氮基-苯丙氨酸置换的曲妥珠单抗用胰蛋白酶消化，并在配有纳米电喷雾ChipCube源的Agilent 6520Accurate Mass Q-TOF LC-MS系统上进行分析。含有可能的错误并入(misincorporated)的氨基酸和它们的野生型对应部分(counterparts)的肽使用从LC-MS数据提取的离子色谱进行搜索，所述LC-MS数据在此肽的z＝1-4电荷态的理论m/z的±10ppm内。如果所发现的峰的m/z在理论m/z的±10ppm内且是正确的电荷态，则认为它们是可能的匹配，直到MS/MS验证。在没有错误并入信号时，则假定该信号为等于或小于质谱中的噪声。将最小保真性比率计算为噪声信号比。将信号测量为最丰富的电荷态的整个肽洗脱曲线的所有单一同位素离子的平均值，并在邻近显示的最小量的信号的区域中的相同的谱中估算噪声。当发现包含错误并入事件的观察的肽时，使用其平均信号代替噪声测量。
在测试的抗体-药物偶联物的肽图中，检测到处于电荷态2和3的具有nnAA+偶联的药物的肽，其中误差小于4ppm。在位置136，显示没有酪氨酸的并入，且pAzPhe的并入效率经测定为98.3％。在整个经检测的IgG序列的Phe位置处没有检测到酪氨酸的错误并入。总体而言，Phe的并入效率经测定最低为99.7％。
实施例4
示例性的抗体-药物偶联物的热稳定性评估
该实施例描述了设计用于测量未糖基化的曲妥珠单抗和曲妥珠单抗的变体的热稳定性(Tm)的实验。通过在缓冲液(PBS)中将待测定的蛋白质(Sutroceptin和变体)与环境敏感染料(SYPRO橙,Life TechnologiesCat#S-6650)混合，然后在混合物经受受控的热变性时实时监测混合物的荧光，来进行热转移测定。测定的混合物中的蛋白质的最终浓度为100μg/m-250μg/m，且该染料为自初始原料(原料染料是在DMSO中的5000x)以1：1000稀释所得。在将5μL的蛋白质-染料混合物的等分试样分注在384孔微孔板(Bio-Rad Cat#MSP-3852)中之后，将板用光学透明的密封膜(Bio-Rad公司目录号MSB-1001)进行密封，并放置在384孔板实时热循环仪((Bio-Rad CFX384实时系统)中。将蛋白质-染料混合物以每循环0.1℃的增量(～每分钟1.5℃)从25℃加热至95℃，在进行荧光测定之前允许在每个温度平衡3秒。在实验结束时，使用Bio-Rad CFX管理软件测定熔融温度(Tm)。对于具有复杂的热转化曲线(hermal transition profiles)的蛋白质样品，自荧光强度(Y轴)对温度(X轴)的负一阶导数图，或通过拟合数据到玻尔兹曼S形模型，来计算熔融温度(Tm)。与野生型蛋白质相比，IgG变体的熔融温度的不同，是对正测定的蛋白质的热转移的的测量。
某些变体的该测定的结果示于表4。通常，显著低于未置换的曲妥珠单抗的Tm(尤其是Tm1)的偏差(deflections)，表明稳定性的不希望的降低和/或聚集倾向。这样，显示出在未置换的曲妥珠单抗的约5℃内的Tm1和/或Tm2的曲妥单抗变体是优选的。更优选的是显示出在未置换的曲妥珠单抗的约3℃内的Tm1和/或Tm2的那些变体。进一步更优选的是显示出在未置换的曲妥珠单抗的约2℃内的Tm1和/或Tm2的那些变体。进一步更优选的是显示出在未置换的曲妥珠单抗的约1℃内的Tm1和/或Tm2的那些变体。可以在未偶联的或偶联的形式中测量Tm1和Tm2。
表4
实施例5
示例性的抗体-药物偶联物的表征：轻链置换
使用如实施例9中所描述的方法来创建和分析具有轻链置换的变体。这些表征实验的结果示于表5中。
表5:所选择的LC变体
优选的变体包括以非天然氨基酸置换该轻链(LC)的以下这些位置的那些变体：A043、Y049、S056、G057、S060、S067、G068、T109、A112、S114、A144、A153、S156、G157、S168、A184、S202、S203、和T206。
具有至少约1.0的DAR的变体也是优选的。还更优选的变体包括以非天然氨基酸置换该轻链的以下这些位置的那些变体：A043、Y049、S056、G057、S060、S067、G068、T109、A112、A144、A153、S156、S168、A184、S202、和S203。
具有至少约1.2的DAR的变体也是优选的。还更优选的变体包括以非天然氨基酸置换该轻链的以下这些位置的那些变体：A043、Y049、S056、G057、S060、S067、G068、T109、A144、A153、S156、A184、S202、和S203。
具有至少约1.5的DAR的变体也是优选的。还更优选的变体包括以非天然氨基酸置换该轻链的以下这些位置的那些变体：Y049、S056、G057、S060、S067、T109、A153、S202、和S203。
实施例6
在RF-1衰减的提取物中的HC-F404的表达的评估
为了初步评估使用RF-1衰减的大肠杆菌菌株对非天然氨基酸的并入的影响，在RF-1阳性菌株较差表达的12种变体在RF-1衰减的菌株中被表达并放大(scaled up)。一个这样的变体HC-F404，显示出格外理想的性能，如下面所论述的。
用于无细胞蛋白质合成反应的无细胞提取物自OmpT敏感的RF-1衰减的大肠杆菌菌株制备，所述OmpT敏感的RF-1衰减的大肠杆菌菌株也被工程化，以产生用于在琥珀终止密码子处插入非天然氨基酸的正交CUA编码的tRNA。在添加编码HC-F404和WT LC的DNA模板后，在Flower板(m2p-labs#MTP-48-B)中，以1ml的规模X 6(总共9ml)，在650rpm的混合器上将无细胞反应在30℃孵育12小时。然后。然后利用蛋白标志物(Protein Maker)(Emerald Bio)用蛋白A和Capto Adhere树脂纯化蛋白质。
如先前所描述的，进行与药物(DBCO-MMAF)的偶联，以及进行用于进一步的分析的抗体药物偶联物的(ADC的)制备。
如先前所描述的，进行变体的热荧光(Thermofluor)分析。
在TAG扫描过程中以及在中等规模(intermediate scale)中所生成的HC变体F404均显示出良好的细胞杀伤能力(TAG扫描I：IC 50＝0.018nM；中等放大:IC50＝0.023nM)，但由于可能是由于HIC分析过程中药物无法进入到分析柱所造成的峰的低分辨率，基于其HIC曲线的DAR估计被证明是存在问题的。然而，质谱分析表明，它具有1.74的DAR。另外，热荧光分析表明，与只有抗体相比，HC-F404的ADC变体(version)具有改善的(较高的热稳定性)Tm1(2.2℃的增加)。
表6A：HC-F404变体的性质
*-该DAR结果基于LC-MS分析。该偶联变体在HIC测定中产生了不能较好解析的(NWR)的峰，以及DAR利用LC-MS进行测定。
表6B：HC-F404变体的热荧光结果
实施例7
示例性抗体-药物偶联物的表征：释放因子分析
TAG扫描I(TAG SCAN I)方法和所选的变体清单
用于无细胞蛋白质合成反应的无细胞提取物自OmpT敏感的RF-1衰减的大肠杆菌菌株制备，所述OmpT敏感的RF-1衰减的大肠杆菌菌株也被工程化，以表达用于在琥珀终止密码子处插入非天然氨基酸的正交CUA编码的tRNA。在添加DNA模板后，在Flower板(m2p-labs#MTP-48-B)中，在650rpm的混合器上将无细胞反应在30℃孵育12小时。对于合成轻链变体(在轻链上具有nnAA的并入的变体)，使用4ug/mL的轻链DNA比8μg/mL的重链DNA的DNA比率。在48孔flower板上以1mL的规模单份(singlicate)地制备各曲妥珠单抗变体。总共使用6个板来表达所述变体。
用含有40μL树脂的IMAC Phytip通过吸量管以4.2μl/min的流速缓慢上下吸移10次而捕获上清液。用125μL IMAC洗脱缓冲液(50mM的pH8.0的Tris、300mM NaCl、500mM咪唑)来洗脱结合蛋白。纯化后，通过与在相同的Protein Express LabChip(Caliper LifeSciences#760499)上的的质量标准进行比较，在Caliper GXII系统上定量IMAC纯化的变体。制备样品，用于按照蛋白质表达试剂盒(Protein Express Reagent Kit)(Caliper Life Sciences#760328)中的说明进行分析，不同之处在于，在Caliper系统上分析之前，将样品(混合在样品缓冲液中)在65℃加热10分钟。
如先前所描述的，进行与药物(DBCO-MMAF)的偶联，以及进行用于进一步的分析的抗体药物偶联物的(ADC的)制备。
这些表征实验的阳性结果示于表7。在表中，显示了变体的下列性质：所制成的抗体-药物偶联物的最终浓度、结合HER-2表达细胞的能力、药物-抗体比率(DAR，表示为每抗体的细胞毒剂的数目)、关于HIC曲线的评论、以及从上述的细胞杀伤测定中观察到的IC50。在关于HIC测定的评价中，SP对应于被较好解析为单峰的曲线，NWR对应于解析较差的曲线，以及WR对应于较好解析的HIC曲线。若干显示单峰曲线的变体也表现出强效杀伤，这表明该变体确实与药物偶联，但不能在HIC柱上解析。
表7:用于Tag扫描I的所选的变体
优选的变体包括以非天然氨基酸置换该重链(HC)的以下这些位置的那些变体：A023、A084、A118、S119、T135、S136、G137、S160、G161、A162、T164、T195、T197、S219、V282、T289、Y296、A330、T335、N361、S400、F404、V422、S440、T260、S267、H268、E272、K274、R292、E293、N297、S298、V303、V305、I332、E333、K334、K340、G341、Q342、P343、R355、Q362、Q386、K392、F404、S424、Q438、S442和L443。
具有至少约0.7的DAR的变体也是优选的。优选的变体包括以非天然氨基酸置换该重链(HC)的以下这些位置的那些变体：A023、A084、A118、S119、T135、S136、G137、S160、G161、A162、T164、T195、T197、S219、V282、Y296、T335、N361、V422、S440、S267、E272、K274、E293、N297、S298、V303、V305、K334、K340、G341、Q342、P343、R355、Q362、K392、F404、S424、Q438、S442和L443。
具有至少约1.0的DAR的变体也是优选的。还更优选的变体包括以非天然氨基酸置换该重链的以下这些位置的那些变体：A023、A084、A118、S119、T135、S136、G137、S160、G161、A162、T164、T195、T197、S219、V282、Y296、N361、V422、S440、S267、E272、E293、N297、S298、V303、V305、K334、K340、G341、Q342、R355、Q362、K392、F404、S424、Q438、S442和L443。
具有至少约1.2的DAR的变体也是优选的。还更优选的变体包括以非天然氨基酸置换该重链的以下这些位置的那些变体：A023、A084、A118、S119、T135、S136、G137、S160、G161、A162、T195、T197、S219、V282、Y296、V422、S440、S267、E272、E293、N297、S298、V303、V305、K334、K340、G341、Q342、R355、K392、F404、S424、Q438、S442和L443。
具有至少约1.5的DAR的变体也是优选的。还更优选的变体包括以非天然氨基酸置换该重链的以下这些位置的那些变体：A023、A084、A118、S119、T135、S136、S160、A162、T195、S219、V282、Y296、S267、E293、N297、S298、V303、V305、K334、K340、G341、K392、F404、和Q438。
实施例8
示例性抗体-药物偶联物的表征：附加的释放因子分析
TAG扫描II方法和所选的变体清单
用于无细胞蛋白质合成反应的无细胞提取物自OmpT敏感的RF-1衰减的大肠杆菌菌株制备，所述OmpT敏感的RF-1衰减的大肠杆菌菌株也被工程化，以产生用于在琥珀终止密码子处插入非天然氨基酸(对叠氮基苯丙氨酸)的正交CUA编码的tRNA。在添加DNA模板后，在Flower板(m2p-labs#MTP-48-B)中，在650rpm的混合器上将无细胞反应在30℃孵育12小时。对于合成轻链变体(在轻链上具有nnAA的并入的变体)，使用4ug/mL的轻链DNA比8μg/mL的重链DNA的DNA比率。在48孔flower板上以1mL的规模单份(singlicate)地制备各曲妥珠单抗变体。总共使用6个板来表达所述变体。
用含有40μL树脂的IMAC Phytip通过吸量管以4.2μl/min的流速缓慢上下吸移10次而捕获上清液。用125μL IMAC洗脱缓冲液(50mM的pH8.0的Tris、300mM NaCl、500mM咪唑)来洗脱结合蛋白。纯化后，通过与在相同的Protein Express LabChip(Caliper LifeSciences#760499)上的的质量标准进行比较，在Caliper GXII系统上定量IMAC纯化的变体。制备样品，用于按照蛋白质表达试剂盒(Protein Express Reagent Kit)(Caliper Life Sciences#760328)中的说明进行分析，不同之处在于，在Caliper系统上分析之前，将样品(混合在样品缓冲液中)在65℃加热10分钟。
如先前所描述的，进行与药物(DBCO-MMAF)的偶联，以及进行用于进一步的分析的抗体药物偶联物的(ADC的)制备。
这些表征实验的阳性结果示于表8。在表中，显示了变体的下列性质：所制成的抗体-药物偶联物的最终浓度、与野生型进行比较的全长产物的表达效率(抑制效率)、结合HER-2表达细胞的能力、药物-抗体比率(DAR，表示为每抗体的细胞毒剂的数目)、关于HIC曲线的评论、以及从上述的细胞杀伤测定中观察到的IC50。在关于HIC测定的评价中，SP对应于被较好解析为单峰的曲线，NWR对应于解析较差的曲线，以及WR对应于较好解析的HIC曲线。若干显示单峰曲线的变体也表现出强效杀伤，这表明该变体确实与药物偶联，但不能在HIC柱上解析。
针对如所描述的活性，总共对在269个位点处具有非天然氨基酸的曲妥珠单抗变体进行筛选。表8给出了具有期望的DAR、表达曲线、抑制效率，和/或IC50值的71个变体。在测试之前，所有这些性质都无法预测，且很多时候样品中的各单独的性质的值不可预测地变化。例如，人们通常预期的是具有高DAR的变体将会显示出比具有低DAR的变体更低的IC50值。尽管如此，例如，I51变体显示出0.6的相对较低的DAR，但显示出1ng/ml的IC50。
表8.Tag扫描II变体
优选的变体包括以非天然氨基酸置换该重链(HC)的以下这些位置的那些变体：G042、Q003、S007、P014、G016、R019、S025、A040、K043、I051、Y052、T053、Y056、S070、N082A、D098、F100、T110、S112、K121、Y180、S184、S190、S192、K214、E216、D221、K222、T225、P227、P230、A231、P232、和G236。
具有至少约0.7的DAR的变体也是优选的。优选的变体包括以非天然氨基酸置换该重链(HC)的以下这些位置的那些变体：G042、Q003、S007、P014、G016、R019、S025、A040、K043、Y052、T053、Y056、S070、N082A、F100、T110、S112、K121、Y180、S190、S192、K214、E216、D221、K222、T225、P227、P230、A231、P232、和G236。
具有至少约1.0的DAR的变体也是优选的。还更优选的变体包括以非天然氨基酸置换该重链的以下这些位置的那些变体：G042、Q003、S007、P014、G016、R019、S025、A040、K043、Y052、T053、Y056、S070、N082A、F100、T110、S112、K121、Y180、S190、S192、K214、E216、D221、K222、T225、P227、P230、A231、P232、和G236。
具有至少约1.2的DAR的变体也是优选的。还更优选的变体包括以非天然氨基酸置换该重链的以下这些位置的那些变体：G042、Q003、S007、P014、G016、R019、S025、A040、K043、Y052、S070、N082A、F100、T110、S112、K121、Y180、S190、S192、K214、E216、D221、K222、T225、P227、P230、A231、P232、和G236。
具有至少约1.5的DAR的变体也是优选的。还更优选的变体包括以非天然氨基酸置换该重链的以下这些位置的那些变体：S007、P014、R019、S025、A040、K043、Y052、S070、F100、T110、S112、K121、Y180、K214、E216、K222、P227、P230、A231、P232、和G236。
优选的变体包括以非天然氨基酸置换轻链(LC)的以下这些位置的那些变体：-1、Q003、T005、S007、P008、S009、S010、G016、D017、R018、T020、T022、S026、Q027、K045、V058、S063、S065、R066、D070、S077、Q079、K107、N138、R142、E143、N152、S171、S182、K188、Q199、和L201。
具有至少约0.7的DAR的变体也是优选的。优选的变体包括以非天然氨基酸置换该轻链的以下这些位置的那些变体：-1、Q003、T005、S007、P008、S009、G016、D017、R018、T020、T022、S026、Q027、K045、V058、S063、S065、R066、D070、S077、Q079、K107、R142、E143、N152、S171、S182、K188、Q199、和L201。
具有至少约1.0的DAR的变体也是优选的。还更优选的变体包括以非天然氨基酸置换该轻链的以下这些位置的那些变体：-1、Q003、T005、S007、P008、S009、G016、D017、R018、T020、T022、S026、Q027、K045、V058、S063、S065、R066、D070、S077、Q079、K107、R142、N152、S171、S182、K188、和Q199。
具有至少约1.2的DAR的变体也是优选的。还更优选的变体包括以非天然氨基酸置换该轻链的以下这些位置的那些变体：-1、T005、S007、P008、G016、D017、R018、T020、T022、Q027、K045、V058、S063、S077、Q079、K107、R142、N152、S182、K188、和Q199。
具有至少约1.5的DAR的变体也是优选的。还更优选的变体包括以非天然氨基酸置换该轻链的以下这些位置的那些变体：-1、G016、S063、和Q199。
实施例9
示例性抗体-药物偶联物的表征：放大分析
来自TAG II所选变体的放大
基于DAR和细胞杀伤数据，挑选出具有所期望的性质的曲妥珠单抗变体的子集，用于小规模的无细胞表达，以便产生用于进一步表征的材料。选择用于小规模生产的重链变体是：R019、S025、I051、S070、D098、T110、S112、K121、S136、Y180、S187、S190、K214、E216、D221、和K222。选择用于小规模生产的轻链变体是：(-)1、S007、P008、G016、T022、S063、R014、D070、N138、R142、E143和N152。
在其中合成变体的无细胞反应混合物的组成如下：由OmpT敏感的RF-1衰减的大肠杆菌菌株、和为表达编码tRNA的正交CUA而工程化的OmpT敏感的RF-1衰减的大肠杆菌菌株，所分别制备的无细胞提取物的80％：20％的混合物。在flower板中将所有的变体放大至9ml(1.5mL，重复6次)，并利用蛋白标志物(Emerald Bio)进行纯化。
如先前所描述的，进行与药物(DBCO-MMAF)的偶联，以及进行用于进一步的分析的抗体药物偶联物的(ADC的)制备。
这些表征实验的阳性结果示于表9。在表中，显示了变体的下列性质：所制成的抗体-药物偶联物的最终浓度、与野生型进行比较的全长产物的表达效率(抑制效率)、结合HER-2表达细胞的能力、药物-抗体比率(DAR，表示为每抗体的细胞毒剂的数目)、关于HIC曲线的评论、以及从上述的细胞杀伤测定中观察到的IC50。在关于HIC测定的评价中，SP对应于被较好解析为单峰的曲线，NWR对应于解析较差的曲线，以及WR对应于较好解析的HIC曲线。
表9：优选的变体的子集
实施例10
示例性抗体-药物偶联物的表征：热荧光分析
如先前所描述的进行变体的热荧光分析。表10中为荧光分析的结果。
表10:小规模制备的变体的热荧光数据
受到热荧光分析的变体包括以非天然氨基酸置换该重链的以下这些位置的那些变体：R019、S025、I051、S070、T077、Y079、D098、T110、S112、K121、S136、Y180、S187、S190、K214、E216、D221、和K222。
受到热荧光分析的变体还包括以非天然氨基酸置换该轻链的以下这些位置的那些变体：-1、S007、P008、G016、T022、S063、D070、N138、R142、E143、N152、和L201。
实施例11
示例性抗体-药物偶联物的表征：动力学分析
所选择的变体的偶联动力学
针对显示宽范围的药物与抗体的偶联比的5种变体，测定偶联速率。通过以重复两次的方式在20℃，在PBS(pH7.4)中将变体与药物(DBCO-MMAF)混合15min、30min、1hr、2hr、4hr、8hr和16hr而引发反应。混合物中抗体的最终浓度范围为0.2uM至2uM。所有反应的最终药物浓度都是100uM。在孵育期结束时，将叠氮化钠(NaAzide)添加到该混合物中至10mM的终浓度。如先前所描述的，通过Zeba和MustangQ板纯化最终的混合物。利用赫赛汀作为质量标准通过Caliper来测定IgG的浓度。如先前所描述的，通过HIC来确定完全偶联的变体的组分。
表11.变体的半衰期和DAR
HC-S112 HC-T110 HC-T77 HC-Y79 HC-F126
T1/2 6.2h 10.5h ～40h ～270h ND
DAR 1.7 1.6 1.1 0.4 0
图5A和5B提供了两种变体(HC T110和HC S112)的HIC痕迹。该痕迹显示分别对应于未偶联的IgG、单(singly)偶联的IgG和完全偶联的IgG的三个峰(P0、P1和P2)。
图6A至6E显示对-叠氮基苯丙氨酸(pAzF)变体的偶联是位点特异性的。通过HIC分离单偶联和完全偶联的抗体的总百分比。
实施例12
示例性抗体-药物偶联物的表征：抑制比较分析
对-叠氮基苯丙氨酸(pAzF)和对-叠氮基甲基苯丙氨酸(pAzMeF)的抑制的比较
利用以下所描述的修饰，在如在Zawada等,2011,Biotechnol.Bioeng.108(7):1570-1578中所描述的如下的无细胞蛋白质合成反应中，表达具有一系列抑制效率的11种变体。还制备了未置换的曲妥珠单抗作为对照。将含有tRNA和敏感的OmpT RF1(菌株16/23的80/20的共混物)无细胞提取物，用50μM的碘乙酰胺在RT(20℃)处理30分钟，并添加到含有除以下成分以外的所有其他成分的预混合物中：GSSG、非天然氨基酸、tRNA合成酶、T7RNAP、DsbC、PDI和模板DNA。然后将除了DNA的所有剩余的试剂加入到混合物中。无细胞反应通过添加所选择的变体的质粒DNA而引发，并在96深孔板中，在450rpm的混合器上在30℃孵育12小时。将反应物在4℃进一步孵育5h。在蛋白质合成反应中的终浓度为30％的细胞提取物、1mM对-叠氮基苯丙氨酸(pAzF)(RSP氨基酸)与0.37mg/mL詹氏甲烷球菌pAzF特定的氨基酰基-tRNA合成酶(FRS)、或1mM对-叠氮基甲基苯丙氨酸(pAzMeF)与0.37mg/mL对-氰基苯丙氨酸特定的氨基酰基-tRNA合成酶(Young et al,2011,Biochem.50:1894-1900)、2mM的GSSG、0.29mg/mL的PDI(Mclab)、100μg/mL大肠杆菌DsbC、8mM二谷氨酸镁、10mM谷氨酸铵、130mM谷氨酸钾、35mM丙酮酸钠、1.2mM AMP、各自0.86mM的GMP、UMP、和CMP、2mM氨基酸(除了0.5mM的酪氨酸和苯丙氨酸外)、4mM草酸钠、1mM腐胺、1.5mM亚精胺、15mM磷酸钾、100nM T7RNAP、2μg/mL曲妥珠单抗轻链DNA、8μg/mL曲妥珠单抗-(His)6重链DNA。利用用于各变体的14C，以重复两次的方式在96孔板中以100uL的规模制备各曲妥珠单抗变体。应当注意的是，如此产生的所有的曲妥珠单抗变体均是未糖基化的。
为了监测蛋白质合成，向反应物中掺入3％(v/v)l-[U-14C]-亮氨酸(300mCi/mmole；GE Life Sciences,Piscataway,NJ)中。在重链和轻链的不同位点的琥珀密码子的抑制通过还原性SDS-PAGE凝胶的[14C]-放射自显影来确定。全长曲妥珠单抗重链和抑制的曲妥珠单抗重链变体在SDS-PAGE上以50kD运行。全长曲妥珠单抗轻链和抑制的曲妥珠单抗轻链变体在SDS-PAGE上以30kD运行。非抑制的(截短的)曲妥珠单抗变体以较低的分子量运行。重链或轻链中的琥珀抑制由下式确定：
带的强度通过ImageQuant(Amersham Biosciences Corp.；Piscataway,NJ)测定。在图7A中，对pAzF和pAzMeF变体的抑制效率进行了比较。抑制效率计算为变体HC的带的强度比野生型HC的带的强度，或变体LC的带的强度比野生型LC的带的强度。在图7B中，对pAzF和pAzMeF变体的可溶性IgG的产量进行比较。IgG的量根据下式计算：可溶性数目/总数目*IgG带强度/总泳道强度*2*74008.02Da/47亮氨酸。
实施例13
将非天然氨基酸并入位点转移到另一种抗体
为了测试用于并入非天然氨基酸的位点是否可以在具有可预测的DAR的两个不同的IgG序列之间转移，对在代表性位点含有非天然氨基酸的第二抗体进行了评估。对于该实验，将贝伦妥单抗选为第二抗体(参见SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4)。一些位点选自曲妥珠单抗突变研究，显示有不同的DAR。在重链中，位点相当于K121、Y180、K133、S157、F126、和P127(EU编号)。在轻链中，位点相当于R142、N152、Q147、E161、K149、和Q155(EU编号)。利用基于标准的快速变化的定点突变，将TAG终止密码子插入到贝伦妥单抗序列，并通过DNA测序确定每个变体的身份。利用Qiagen试剂盒制备小量制备型(Mini Prep)DNA，将其用作模板来驱动无细胞蛋白质合成反应。
在包含OmpT敏感的RF-1蛋白和在活体内表达的编码tRNA的正交CUA反应混合物中合成变体。在flower板中将所有的变体放大至9ml(1.5mL，重复6次)，并利用蛋白标志物(Emerald Bio)进行纯化。
如先前所描述的，进行与药物(DBCO-MMAF)的偶联，以及进行用于进一步的分析的抗体药物偶联物的(ADC的)制备。通过先前所描述的HIC分析(profiling)法确定DARs。
试验结果表明，位点通常可以可预见地在两个不同的IgG之间转移。
表12A:优选的HC变体的子集
表12B:优选的LC变体的子集
为了进一步表征贝伦妥单抗偶联物，选择在重链位置K121或F404或轻链位置N152含有琥珀突变的变体，用于进行放大和附加的表征。作为对照，在F404含有琥珀突变的曲妥珠单抗也被表达。通过在相当于重链上的位置K121和F404以及轻链上的位置N152的核苷酸处重叠PCR突变，而将TAG密码子插入，并分别地克隆到表达载体pYD317中。
在其中合成贝伦妥单抗变体和曲妥珠单抗变体的无细胞反应混合物包括由以下菌株制成的无细胞提取物的共混物：OmpT敏感的RF-1衰减的大肠杆菌菌株、和为产生用于在琥珀终止密码子处插入非天然氨基酸的正交CUA编码的tRNA而工程化的OmpT敏感的RF-1衰减的大肠杆菌菌株。利用以下所描述的修饰，在如在Zawada等,2011,Biotechnol.Bioeng.108(7):1570-1578中所描述的无细胞蛋白质合成反应中，表达所述变体。将无细胞提取物用50μM的碘乙酰胺在RT(20℃)处理30分钟，并添加到含有除编码目标变体的DNA以外的所有其他成分的预混合物中。蛋白质合成反应中的终浓度为30％的细胞提取物、1mM对-叠氮基甲基苯丙氨酸(pAzMeF)(RSP氨基酸)、0.37mg/mL詹氏甲烷球菌pAzMeF特定的氨基-酰基tRNA合成酶(FRS)、2mM的GSSG、0.29mg/mL的PDI(Mclab)、30μg/mL大肠杆菌DsbC、8mM二谷氨酸镁、10mM谷氨酸铵、130mM谷氨酸钾、35mM丙酮酸钠、1.2mM AMP、各自0.86mM的GMP、UMP、和CMP、2mM氨基酸(除了0.5mM的酪氨酸和苯丙氨酸外)、4mM草酸钠、1mM腐胺、1.5mM亚精胺、15mM磷酸钾、100nM T7RNAP。测定HC与LC的质粒比率以寻找最佳条件：3:1、2:1、1:1和1:2。总质粒浓度保持恒定在10ug/mL。添加DNA模板后，将无细胞反应物于培养皿上在30℃孵育12小时，并随后进行14C测定分析。在1:1的比率实现了最大收率。最高产量在1实现。在此条件下进行10毫升的无细胞反应。
为了纯化所述变体，用平衡缓冲液(50mM的磷酸钠，pH7)将各变体的10ml的无细胞粗产物进行1：0.5的稀释，并以11,000x g旋转30分钟。然后使上清液通过0.45微米注射器式过滤器，然后再以2分钟的停留时间上样到预平衡的1mL MabSelect Sure HiTrap(GE Lifesciences)，以捕获所述IgG变体。然后用7.5CV(柱体积)的洗涤缓冲液1(100mM的磷酸钠和800mM精氨酸，pH 7)洗涤该柱，并随后用7.5CV的洗涤缓冲液2(50mM的磷酸钠和0.5％(v/v)Triton X-100,pH 7.3)进行洗涤。在用7.5CV的平衡缓冲液洗涤后，各变体用4CV洗脱缓冲液(100mM的柠檬酸钠和300mm的精氨酸，pH 3)进行纯化。通过添加30％(v/v)的1M的Tris(pH9)将洗脱池调节至pH7。
将所收集的洗脱池液(elution pool)经由在10kD Slide-A-Lyzer(Pierce)单元中过夜透析而缓冲交换到PBS中。然后用Ultra-15(Millipore)离心式过滤装置将所透析的物质浓缩至5-10mg/mL的浓度。
对纯化的变体进行如下的偶联。将DBCO-MMAF2(ACME Bioscience公司；Palo Alto,CA)溶解在DMSO至5mM的终浓度。用PBS稀释该化合物至1mM的浓度，然后添加到在IMAC洗脱缓冲液中的纯化的曲妥珠单抗，以达到100μM的最终的药物浓度。将混合物在室温孵育(20℃)17小时。通过添加叠氮化钠至100mM的终浓度而使反应停止，并利用在1×PBS中平衡的Zeba板(Thermo Scientific；Waltham,MA)进行缓冲交换。
通过LC-MS按如下测定未糖基化的变体的DAR。通过LCMS的ADCs
样品在附设Xevo QTOF的Waters Aquity UPLC系统上运行。在80℃，在安捷伦PLRP-S柱(2.3x50mm,5μm,)上分离出蛋白质。流动相：A：0.1％甲酸的水；B：20:80异丙醇：乙腈、0.1％甲酸。在柱上以10％B对样品进行0.4分钟的脱盐，随后进行7分钟的从30％B至40％B的步进梯度、3分钟的从40％B至60％B的步进梯度。利用35V的采样锥电压在整个LC洗脱过程中收集数据。利用MassLynx软件对谱进行分析。将DAR值计算为加权平均值，并示于表13中。
表13:Adcetris ADC的DAR值
接着，按如下测定变体的细胞结合和细胞杀伤活性。Karpas 299和L540细胞系自德国微生物和细胞培养收藏中心(German Collection ofMicroorganisms and Cell Cultures)(DSMZ)获得，SKBR3和Raji细胞系自美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得。在含有20％热灭活的胎牛血清(Hyclone；Thermo Scientific；Waltham,MA)、2mM的glutamax(Invitrogen；Carlsbad,CA)和1×青霉素/链霉素(Cellgro-Mediatech；Manassas,VA)的RPMI 1650培养基(Cellgro-Mediatech；Manassas,VA)中使细胞生长。在补充有10％热灭活的胎牛血清、2mM的glutamax和1×青霉素/链霉素的DMEM/营养物F-12Ham(50:50)高葡萄糖培养基(Cellgro-Mediatech；Manassas,VA)中使粘附的SKBR3细胞生长。所有的细胞在5％CO2培养箱中在37℃生长和维持。SKBR3通过用无钙/镁的磷酸平衡平衡盐溶液(PBS)洗涤而进行传代，并用HyQTase(Hyclone；Thermo Scientific；Waltham,MA)进行收集。
曲妥珠单抗和贝伦妥单抗(Adcetris)变体的细胞杀伤活性使用细胞增殖实验进行测定。简言之，将104个悬浮细胞或3x103个SKBR3细胞以40μl每孔接种在96孔半区平底白色TC处理的板中，并在添加到抗体之前，在37℃孵育2小时。在各细胞培养基中配制抗体，并用0.45μm的醋酸纤维素Costar离心管式过滤器(Corning；Tewksbury,MA)过滤除菌。将40μl未偶联的抗体、偶联AB4285的抗体或或AB4285游离药物加入到细胞中，并分别针对悬浮细胞和SKBR3细胞培养3天或5天。通过将80μl的Cell试剂(Promega Corp.；Madison,WI)加入到各孔中而测定细胞活力，并按照产品的说明进行处理。用板检测仪(Perkin-Elmer；Waltham,MA)测定发光。使用未经处理的细胞作为对照将相对发光读数转换为％活力，并相对于抗体浓度进行作图。利用统计软件Prism(GraphPad Software；San Diego,CA)，自非线性回归方程log(抑制剂)对响应-可变斜率(4参数)来计算IC50。结果显示于图8和图9以及表14中。
表14:贝伦妥单抗和曲妥珠单抗变体的细胞杀伤
曲妥珠单抗和贝伦妥单抗变体的细胞的结合亲和力利用基于FACS的测定法进行测定。简言之，将25μl结合缓冲液(由0.5％牛血清白蛋白(BSA)(Invitrogen；Carlsbad,CA)和0.09％叠氮化钠(Sigma；St.Louis,MO)组成)中的2x105的Karpas 299或L540细胞接种于96孔U型底聚丙烯板(Greiner Bio-One；Monroe,NC)。在结合缓冲液中抗体配制抗体，并在单独的96孔板中制备2倍的系列稀释液。将等体积的稀释的抗体加入到细胞中，并在4℃孵育1小时。将细胞用200μl的结合缓冲液洗涤两次，以去除未结合的抗体。对于抗体检测，在结合缓冲液中制备5μg/ml的Alexa-488偶联的山羊抗人IgG(Invitrogen；Carlsbad,CA)，并向细胞中加入50μl，并在4℃孵育1小时。将细胞洗涤两次，再悬浮于200μl的结合缓冲液中，并使用配备有96孔的自动微量取样器(automated microsampler)(Cytek；Fremont,CA)流式细胞仪(Cytek；Fremont,CA)进行分析。利用FlowJo(Tree Star；亚什兰,OR)采集并分析数据。通过标准化平均的最大MFI值而将平均荧光强度读数表示为结合％，并将数据相对于抗体浓度作图。自利用Prism软件的一个位点-总结合(one site-total binding)的非线性回归饱和结合方程计算结合亲和力。结果示于图10和表15。
表15:变体的细胞结合
实施例14：在替代性支架中的抗体药物偶联物：scFv格式(Formats)
为了证明使用scFv作为用于ADC的替代支架的可行性，将编码具有琥珀密码子的曲妥珠单抗scFv(VL_VH)的DNA克隆到表达载体pYD317。通过在相当于在位置(-1)的氨基酸丝氨酸的核苷酸处重叠PCR突变，而将TAG密码子插入。
为了表达scFv，将无细胞提取物解冻到室温，并用50uM的碘乙酰胺孵育30分钟。在30℃将无细胞反应运行最高达10小时，所述无细胞反应中含有30％(v/v)碘乙酰胺处理的提取物与8mM二谷氨酸镁、10mM谷氨酸铵、130mM谷氨酸钾、35mM丙酮酸钠、1.2mM AMP、各自0.86mM的GMP、UMP、和CMP、2mM的氨基酸(针对除了以0.5mM进行添加的酪氨酸和苯丙氨酸外的18种氨基酸)、4mM草酸钠、1mM腐胺、1.5mM亚精胺、15mM磷酸钾、100nM T7RNAP、1.3uM大肠杆菌DsbC、10ug/mLscFv质粒、15μm的在活体内产生的m.j.tRNA、5uM m.j RNA合成酶和1mM pA、2mM的氧化的(GSSG)谷胱甘肽叠氮基苯丙氨酸(pN3F)。表达野生型scFv作为对照。
通过蛋白L纯化scFv(-1)pN3F和野生型的scFv，随后进行SEC。用图1中所示的50uM的DBCO-MMAF试剂，将5uM scFv(-1)在室温孵育16小时。通过zeba脱盐柱除去过量的游离药物。
然后进行疏水作用层析，以定量的样品，以及按如下确定药物-抗体比率。在3M硫酸铵(EMD Chemical)、和在MilliQ水中制备的50mM的pH7.0磷酸钠(Mallinckrodt)中，对样品和标准物以1:1进行稀释。对DionexHPLC系统装配具有30℃的柱温箱温度的Tosoh Bioscience LLC TSK-gel(4.6mm x 3.5cm)柱。流动相A为1.5M硫酸铵、50mM的pH 7.0的磷酸钠。流动相B为在80:20的水：异丙醇(霍尼韦尔)中的50mM的pH 7.0的磷酸钠。以1.0mL/分钟的流速递送流动相。以15％流动相B至100％流动相B的线性梯度在10分钟内进行分离。在214nm处获得UV数据。使用Chromeleon软件(Thermo)来定量峰面积，以计算药物抗体比率(DAR)。
为了评估偶联的替代性支架变体的结合，以下进行了与表达HER2的细胞的结合的测定。将纯化的偶联变体与SKBR3细胞上的HER2的结合，与临床级通过无细胞蛋白质合成所产生的非糖基化的曲妥珠单抗、或作为阴性对照的人血清的IgG1(Sigma-Aldrich；St.Louis,MO)进行比较，其中所述SKBR3细胞过量表达具有每细胞超过150万个受体拷贝数(ATCC#HTB-30,Manassas,VA)的HER2/c-erb-2基因产物。在DMEM:Ham's F-12(50:50)、补充有10％热灭活的胎牛血清(Hyclone；Thermo Scientific；Waltham,MA)、2mM的glutamax(Invitrogen；Carlsbad,CA)和1×青霉素/链霉素(Cellgro-Mediatech；Manassas,VA)的高葡萄糖(Cellgro-Mediatech；Manassas,VA)中培养SKBR3细胞。粘附细胞用无钙和镁的Hanks平衡盐溶液(HBSS)洗涤两次，并用TASETM(Hyclone；Thermo Scientific；Waltham,MA)进行收集。利用偶联的替代性支架变体、临床级或者在10μL FACS缓冲液(补充有1％牛血清白蛋白的DPBS缓冲液)中制成的未糖基化的曲妥珠单抗的连续稀释来孵育10μL的总体积中的每个样品的总共200,000个细胞。将细胞加抗体或ADC在冰上孵育60分钟。将未染色的细胞、人IgG1(同型对照)和第二抗体(山羊抗人IgG)用作对照。为了检测或未糖基化的曲妥珠单抗的结合，细胞用冰冷的FACS缓冲液洗涤两次，并用5μg/ml Alexa647标记的山羊抗人IgG第二抗体(Invitrogen；Carlsbad,CA)在冰上孵育1小时。通过用5μg/mlAlexa 647标记的蛋白L(Pierce)或以Alexa 647标记的山羊抗人-Fc(Invitrogen；Carlsbad,CA)在冰上孵育1小时，来检测替代性支架变体的细胞结合。所有样品用FACS缓冲液洗涤并使用BD FACS Calibur系统(BDBiosciences；San Jose,CA)进行分析。
平均荧光强度使用具有利用GraphPad Prism(GraphPad v 5.00,软件；San Diego,CA)的一个位点特异性结合方程的非线性回归分析进行拟合。数据表示为相对的MFI对nM的抗体或抗体变体的浓度。
接着，偶联的替代性支架变体的细胞杀伤效果用如下的细胞增殖试验进行测量。自ATCC获得SKBR3细胞，并保持在DMEM:Ham’s F-12(50:50)、补充有10％热灭活的胎牛血清(Hyclone；Thermo Scientific；Waltham,MA)、2mM的glutamax(Invitrogen；Carlsbad,CA)和1×青霉素/链霉素(Cellgro-Mediatech；Manassas,VA)的高葡萄糖(Cellgro-Mediatech；Manassas,VA)中。粘附细胞用无钙和镁的Hanks平衡盐溶液(HBSS)洗涤两次，并用TASETM(Hyclone；Thermo Scientific；Waltham,MA)进行收集。将共103个细胞接种在96孔半区平底白色聚苯乙烯板的40μl体积中。在CO2培养箱中在37℃使细胞附着过夜。在DMEM/F12培养基中以2倍浓度配制ADC变体，并通过MultiScreen HTS96孔过滤板(Millipore；Billerica,MA)过滤。将过滤灭菌的偶联的曲妥珠单抗变体、赫赛汀、或未糖基化的曲妥珠单抗加入到处理孔中，并将板在CO2培养箱中在37℃培养120小时。对于细胞活力测定，将80μl的Cell试剂(Promega Corp.；Madison,WI)加入到各孔中，并按照每个产品的说明对板进行处理。相对发光在板检测仪(Perkin-Elmer；Waltham,MA)上进行测定。使用未经处理的细胞作为对照将相对发光读数转换为％活力。用非线性回归分析，使用log(抑制剂)对(vs.)响应-可变斜率(Variable slope)、使用GraphPadPrism的4参数拟合方程(GraphPad v 5.00,Software；San Diego,CA)来拟合数据。将数据表示为相对细胞活力、ATP含量％对nM的ADC剂量。
来自HIC分析、细胞结合和细胞杀伤实验的结果示于表16中。
表16:scFv细胞结合、细胞杀伤和DAR
实施例15:在替代性的支架中的抗体-药物偶联物：scFv-Fc形式
为了证明使用scFv作为用于ADC的替代支架的可行性，将编码具有琥珀密码子的曲妥珠单抗scFv Fc(VL_VH_Fc)的DNA克隆到表达载体pYD317。通过在相当于在位置(-1)、Fc R355、Fc N389和Fc F404(EU索引编号)的氨基酸丝氨酸的核苷酸处重叠PCR突变，而将TAG密码子插入。
除了添加5uM酵母PDI外，CFPS反应条件与实施例14中所描述的相同。表达野生型scFv Fc作为对照。
为了偶联未糖基化的scFv-Fc，首选通过蛋白A纯化蛋白质，随后进行SEC。用50uM的DBCO-MMAF将5uM pN3F在室温孵育16小时。通过zeba脱盐柱除去过量的游离药物。
此外，将对叠氮基甲基苯丙氨酸分别在位点R355、N389、和F404并入到scFv Fc。除了用1uM m.j.pCyano FRS和1mM对叠氮基甲基苯丙氨酸代替m.j.FRS和对叠氮基苯丙氨酸对外，反应条件与实施例14中所描述的相同。然后使蛋白A纯化的蛋白质与DBCO-MMAF试剂2(DBCO-MMAF2)进行偶联。DBCO-MMAF2的结构示于图11。
接着，进行LC-MS以按如下定量样品和确定药物-抗体比率。样品通过连接到QTOF质谱仪(Agilent 6520)的液相色谱(CHIP-Cube nanoLC,安捷伦)进行分析。利用0.1％的在水(溶剂A)中的甲酸和0.1％的在乙腈+异丙醇(80:20v/v，溶剂B)中的甲酸，在反相HPLC芯片(PLRP-S，5μ；富集柱：25mm；分离柱：150mm x 75μm)蛋白质上分离。数据使用MassHunter定量软件(安捷伦)进行处理。数据示于表17。
表17:scFv-Fc变体的DAR以及细胞结合和细胞杀伤
通过将2mg/kg的各scFv-Fc DBCO-MMAF 2偶联物给药至成米色裸Xid小鼠，而测量药物连接基团ADC偶联物的活体内的稳定性。自用于各时间点的n＝2个动物，在30分钟、d3、d7、d14和d21时通过末端放血而收集血浆。总循环的ScFv-FC ADC通过Fcγ片段特定的生物素(Fab)2山羊抗人IgG而捕获。用链霉亲和素Mag琼脂糖将复合物拉下。洗涤所捕获的复合物以除去非特异性的结合，并用1％甲酸进行洗脱。中和的洗脱物通过完整的LCMS进行分析。结果表明的scFv-Fc(N389)pN3CH2FDBCO-MMAF 2和scFv-Fc(R355)pN3CH2F DBCO-MMAF 2稳定长达28天。
接下来，在米色裸xid小鼠中分析ScFv-Fc ADC的药代动力学性质。以scFv-Fc R355和scFv-Fc N389的约2.0mg/kg的剂量水平对动物进行静脉内给药。取样至28天的血浆浓度，通过免疫测定法和利用具有WinNonlin‘v’5.2(Pharsight,CA)的非房室方法所算出的药物动力学参数来确定。结果示于图12。
为了评估scFc-Fc ADC在活体内的功效，将KPL-4人乳腺肿瘤细胞接种到SCID米色小鼠(Charles River实验室)的乳房脂肪垫。注射悬浮在混合有培养基的50％的无酚红的基质胶(Matrigel)(Becton DickinsonBioscience)中的每只小鼠的共3百万个细胞。一旦达到肿瘤尺寸，将所有的动物被随机分配到治疗组，以使得各组平均肿瘤体积为100mm3-150mm3。
将曲妥珠单抗(30mg/kg)给予腹腔内，接着以(15mg/kg)每周进行3周。经由静脉注射(在治疗第0天单次注射)而给予未糖基化的曲妥珠单抗2nnAA变体scFv-Fc N389DBCO-MMAF 215mg/kg(872ugMMAF/m2,DAR 1.901)、未糖基化的曲妥珠单抗2nnAA变体HC-S136(15mg/kg)(未偶联的)、媒介物(PBS)和游离药物(0.54mg/kg)。该实验的结果示于图13a中。
在另一个实验中，在第0天通过单次静脉注射而施用scFv-Fc F404vL-vH DBCO-MMAF 2(15mg/kg)、scFv-Fc F404vH-vL DBCO-MMAF 2(15mg/kg)、曲妥珠单抗-CF HC F404DBCO-MMAF 2(15mg/kg)、曲妥珠单抗-CF(15mg/kg)和媒介物。该实验的结果示于图13b中。
对于这两个实验，所有的治疗组每组由10只动物组成，并利用卡尺测量以每周两次来监测肿瘤的尺寸。将小鼠圈养在标准的啮齿动物微隔离笼中。设定动物室的环境控制，以保持70°F的温度，40％的-60％相对湿度、和约14小时光照/10小时黑暗的循环。
该实验的结果表明，在位置N389和F404处偶联的ADC在动物中是有效的，以持久地退化(regress)肿瘤尺寸。特别值得注意的是，F404scFv-FcscFv-Fc的偶联物实现了的基线以下的退化，这表明在固体肿瘤模型中该支架的特定功效。
实施例16：特异于CD74和HER2的、且具有附加的示例性连接基团-弹头组合(Warhead Combinations)的示例性ADC
本实施例提供了示例性抗体-药物偶联物，该抗体-药物偶联物用特异于CD74的抗体制备且含有如本文所述的示例性连接基团-弹头组合。本实施例还提供了自偶联有某些连接基团-弹头组合的曲妥珠单抗制备的示例性抗体-药物偶联物。
在本实施例中使用的抗CD74抗体的重链和轻链的蛋白质序列分别提供为SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6。所述重链序列包含6组氨酸的C-末端标签以辅助纯化(puridication)。利用实施例13中描述的方法，引入在编码HC K212、HC S136、HC F241、HC F404、LCS7或LC N152的位置处的琥珀密码子。利用实施例13中描述的方法，表达和纯化包含对甲基叠氮基苯丙氨酸的抗CD74抗体。按照实施例13中描述的方法，还表达和纯化在位置HC S136或HC F404处含有对甲基叠氮基苯丙氨酸的曲妥珠单抗变体。
接着，使抗CD74抗体或曲妥珠单抗变体与DBCO-MMAF 2(图11A)、DBCO-DM4(图11B)、DBCO-DM42(图11C)、或DBCO-MMAE(图11D)进行偶联。用于进行抗体变体和连接基团-弹头组合之间的偶联反应的方法，如实施例13中所述。
然后根据实施例13中所描述的方法，通过LC-MS测定ADC的药物-抗体的比率(DAR)。应注意的是，用于抗CD74样品的LC-MS法没有针对该抗体被优化；的测定对于这种抗体；分析的结果包含与未偶联的种类重叠的峰，人为地降低了这些样品的DAR。因此在本实施例中制备的ADC的变体的DAR，显示与在实施例1-15中论述的相应的位点含有nnAA的ADC的很好的一致性。DAR的分析结果列于以下的表18中。
接着在细胞杀伤实验中使用ADC变体，以测定它们的IC50值。按照实施例13中所描述的方法，分析曲妥珠单抗变体。偶联的抗CD74变体的细胞杀伤效果通过细胞增殖测定法测得。自ATCC获得SU-DHL-6和NCI-H929细胞，并保持在补充有20％热灭活的胎牛血清(Hyclone；ThermoScientific；Waltham,MA)、2mM的glutamax(Invitrogen；Carlsbad,CA)和1×青霉素/链霉素(Cellgro-Mediatech；Manassas,VA)的RPMI-1640培养基(Cellgro-Mediatech；Manassas,VA)中。收集SU-DHL-6和NCI-H929细胞，并以0.5x106cells/mL的终浓度再悬浮在培养基中。以40μl体积将总共20x103个细胞接种在96孔半区平底白色聚苯乙烯板的各孔中。在RPMI-1640完全培养基中以2倍浓度配制ADC变体，并通过MultiScreenHTS96孔过滤板(Millipore；Billerica,MA)过滤。将过滤灭菌的ADC加入到处理孔中，并将板在CO2培养箱中在37℃培养72小时。对于细胞活力测定，将80μl的Cell试剂(Promega Corp.；Madison,WI)加入到各孔中，并按照每个产品的说明对板进行处理。相对发光在板检测仪(Perkin-Elmer；Waltham,MA)上进行测定。使用未经处理的细胞作为对照将相对发光读数转换为％活力。用非线性回归分析，使用log(抑制剂)对(vs.)响应-可变斜率(Variable slope)、使用GraphPad Prism的4参数拟合方程(GraphPad v 5.00,Software；San Diego,CA)来拟合数据。将数据表示为相对细胞活力、ATP含量％对nM的ADC剂量。细胞杀伤测定的结果示于表18中。
表18:示例性的抗CD74和抗HER2的ADC的DAR和IC50值
抗体 药物偶联物 位点 DAR IC50
抗CD74抗体 DBCO-MMAF 2 HC K121 1.601 0.122
抗CD74抗体 DBCO-MMAF 2 HC S136 1.601 0.100
抗CD74抗体 DBCO-MMAF 2 HC F241 1.58 0.078
抗CD74抗体 DBCO-MMAF 2 HC F404 1.631 0.137
抗CD74抗体 DBCO-MMAF 2 LC S7 1.543 0.120
抗CD74抗体 DBCO-MMAF 2 LC N152 1.457 0.130
抗CD74抗体 DBCO-DM4 HC K121 1.572 0.191
抗CD74抗体 DBCO-DM4 HC S136 1.61 0.271
抗CD74抗体 DBCO-DM4 HC F241 1.581 0.187
抗CD74抗体 DBCO-DM4 HC F404 1.531 0.253
抗CD74抗体 DBCO-DM4 LC S7 1.509 0.293
抗CD74抗体 DBCO-DM4 LC N152 1.474 0.281
抗CD74抗体 DBCO-DM42 HC K121 1.578 0.215
抗CD74抗体 DBCO-DM42 HC S136 1.589 0.215
抗CD74抗体 DBCO-DM42 HC F241 1.612 0.196
抗CD74抗体 DBCO-DM42 HC F404 1.63 0.154
抗CD74抗体 DBCO-DM42 LC S7 1.561 0.291
抗CD74抗体 DBCO-DM42 LC N152 1.495 0.235
抗CD74抗体 DBCO-MMAE HC K121 1.811 0.166
抗CD74抗体 DBCO-MMAE HC S136 1.752 0.242
抗CD74抗体 DBCO-MMAE HC F241 1.81 0.238
抗CD74抗体 DBCO-MMAE HC F404 1.572 0.235
抗CD74抗体 DBCO-MMAE LC S7 1.581 0.224
抗CD74抗体 DBCO-MMAE LC N152 1.616 0.251
曲妥珠单抗 DBCO-DM4 HC F404 0.036 1.84
曲妥珠单抗 DBCO-DM4 HC S136 0.038 1.82
曲妥珠单抗 DBCO-DM42 HC F404 0.043 1.94
曲妥珠单抗 DBCO-DM42 HC S136 0.038 1.82
实施例17进一步证明，nnAA并入到抗体的位点可以在抗体之间进行合理、可预见地转移。此外，连接基团和弹头(warhead)的身份似乎不会显著影响所得ADC的偶联效率或DAR，证明了给定的弹头-连接基团组合可以偶联到在一个优选的位点含有非天然氨基酸的抗体的合理的可预测性。
本说明书所引用的所有出版物、专利及专利申请皆以引用方式并入本文，如同各单独的出版物、专利或专利申请具体而单独指明通过引用予以并入一样。虽然根据各种实施方案描述了要求保护的主题，但技术人员应理解可进行各种修改、取代、省略和变化而不偏离其精神。因此，意味着所要求保护的主题的范围只受限于所附权利要求书(包括其等同物)的范围。

Claims (20)

1.抗体，所述抗体包含在特异性位点具有一个或多个非天然氨基酸残基的多肽链或其翻译后修饰的变体，所述特异性位点选自由根据Kabat或Chothia编号方案的以下重链或轻链残基所构成的组：H404、H121、H180、H241、L22、L7、L152、H136、H25、H40、H119、H190、H222、H19、H52或H70。
2.如权利要求1所述的抗体，所述抗体包含在特异性位点具有一个或多个非天然氨基酸残基的多肽链或其翻译后修饰的变体，所述特异性位点选自由根据Kabat或Chothia编号方案的以下重链或轻链残基所构成的组：H404、H121、H180、H241、L22、L7、L152、H136、H25、H40、H119、H190和H222。
3.如权利要求1所述的抗体，所述抗体包含在特异性位点具有一个或多个非天然氨基酸残基的多肽链或其翻译后修饰的变体，所述特异性位点选自由根据Kabat或Chothia编号方案的以下重链或轻链残基所构成的组：H404、H121、H180、H241、L22、L7、L152和H136。
4.如权利要求1所述的抗体，所述抗体包含与SEQ ID NO:1具有至少70％、80％或90％的同源性、且在特异性位点具有一个或多个非天然氨基酸残基的多肽链或其翻译后修饰的变体，所述特异性位点选自由相当于根据SEQ ID NO:1的代表性重链多肽的以下残基对应的位点所构成的组：404、121、180、241、136、25、40、119、190、222、19、52或70。
5.如权利要求1所述的抗体，所述抗体包含与SEQ ID NO:2具有至少70％、80％或90％的同源性、且在特异性位点具有一个或多个非天然氨基酸残基的多肽链或其翻译后修饰的变体，所述特异性位点选自由相当于根据SEQ ID NO:2的代表性轻链多肽的以下残基对应的位点所构成的组：22、7和152。
6.如前述权利要求中任一项所述的抗体，其中，所述多肽链是选自由α、δ、ε和μ所构成的组的类型的重链。
7.如前述权利要求中任一项所述的抗体，其中，所述多肽链是选自λ和κ的类型的轻链。
8.如前述权利要求中任一项所述的抗体，所述抗体是选自由IgA、IgA、IgA2、IgD、IgE、IgG、IgG1、IgG2、IgG3和IgM所构成的组的类或子类。
9.如前述权利要求中任一项所述的抗体，其中，所述非天然氨基酸残基包括选自由氨基、羧基、乙酰基、肼基、酰肼基、半卡肼基、巯基、叠氮基和炔基所构成的组的部分。
10.如前述权利要求中任一项所述的抗体，其中，各非天然氨基酸残基是根据下式：
其中，各L独立地是二价连接基团；且
各R独立地是官能团。
11.如权利要求10所述的抗体，其中，R是反应性基团、治疗性部分或标记部分。
12.如权利要求10所述的抗体，其中，各R是选自由氨基、羧基、乙酰基、肼基、酰肼基、半卡肼基、巯基、叠氮基和炔基所构成的组的反应性基团。
13.如权利要求10所述的抗体，其中，各L是二价连接基团，所述二价连接基团选自由键、亚烷基、取代的亚烷基、亚杂烷基、取代的亚杂烷基、亚芳基、取代的亚芳基、亚杂芳基和取代的亚杂芳基所构成的组。
14.抗体偶联物，所述抗体偶联物包含连接到一种或多种治疗性部分或标记部分的前述权利要求中任一项所述的抗体。
15.如权利要求14所述的抗体偶联物，所述抗体偶联物包含连接到一种或多种药物或聚合物的所述抗体。
16.如权利要求14所述的抗体偶联物，所述抗体偶联物包含连接到一种或多种标记部分的所述抗体。
17.如权利要求14所述的抗体偶联物，所述抗体偶联物包含连接到一种或多种单链结合域(scFv)的所述抗体。
18.如权利要求14-17中任一项所述的抗体偶联物，其中所述抗体经由一个或多个连接基团而连接到所述一种或多种治疗性部分或标记部分。
19.组合物，所述组合物包含前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述组合物是实质上纯的。
20.组合物，所述组合物包含前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体的质量是所述组合物的总抗体质量的至少95％。
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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109069664A (zh) * 2016-01-27 2018-12-21 苏特罗生物制药公司 抗cd74抗体偶联物，包含抗cd74抗体偶联物的组合物以及抗cd74抗体偶联物的使用方法
CN109420167A (zh) * 2017-08-28 2019-03-05 四川九章生物科技有限公司 一种治疗肿瘤的联合用药物
CN110551195A (zh) * 2019-08-01 2019-12-10 天津科技大学 一种α-突触核蛋白聚集诱导发光体系及其构建与应用
WO2021057451A1 (zh) * 2019-09-26 2021-04-01 三生国健药业（上海）股份有限公司 一种抗体融合蛋白及其制法和在抗肿瘤中的应用
CN113660957A (zh) * 2019-02-12 2021-11-16 Ambrx公司 包含抗体-tlr激动剂缀合物的组合物、方法和用途
CN114502580A (zh) * 2019-07-30 2022-05-13 大学健康网络 Mhc ii类分子及其使用方法

Families Citing this family (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9956275B2 (en) 2011-01-31 2018-05-01 Kai Yuan Xu Methods of inhibiting platelet aggregation and preventing thrombosis using antibodies that bind (Na++K+)-ATPase beta subunit
US20150125449A1 (en) * 2012-05-10 2015-05-07 Zymeworks Inc. Single-Arm Monovalent Antibody Constructs and Uses Thereof
ES2718478T3 (es) 2012-06-08 2019-07-02 Sutro Biopharma Inc Anticuerpos que comprenden restos de aminoácidos no naturales de localización específica, métodos para su preparación y métodos para su uso
US9732161B2 (en) 2012-06-26 2017-08-15 Sutro Biopharma, Inc. Modified Fc proteins comprising site-specific non-natural amino acid residues, conjugates of the same, methods of their preparation and methods of their use
AU2013308494B2 (en) 2012-08-31 2018-03-01 Sutro Biopharma, Inc. Modified amino acids comprising an azido group
CN105143271A (zh) * 2013-02-08 2015-12-09 Irm责任有限公司 用于修饰抗体以制备免疫缀合物的特定位点
WO2014124258A2 (en) * 2013-02-08 2014-08-14 Irm Llc Specific sites for modifying antibodies to make immunoconjugates
ES2759503T3 (es) 2013-05-02 2020-05-11 Glykos Finland Oy Conjugados de una glicoproteína o un glicano con una carga útil tóxica
WO2015006555A2 (en) 2013-07-10 2015-01-15 Sutro Biopharma, Inc. Antibodies comprising multiple site-specific non-natural amino acid residues, methods of their preparation and methods of their use
AU2014293011A1 (en) 2013-07-26 2016-03-17 Race Oncology Ltd. Compositions to improve the therapeutic benefit of bisantrene
EP3068430A4 (en) * 2013-11-13 2017-07-05 Zymeworks Inc. Methods using monovalent antigen binding constructs targeting her2
CN106470708B (zh) 2014-04-25 2019-12-31 皮埃尔法布雷医药公司 抗体-药物-缀合物和其用于治疗癌症的用途
EP3903826B1 (en) 2014-12-04 2024-05-08 Celgene Corporation Biomolecule conjugates
SG10202006863YA (en) 2015-02-16 2020-08-28 Lonza Ag Cl and/or ch1 mutated antibodies for drug conjugation
US9669106B2 (en) 2015-10-26 2017-06-06 Pierre Fabre Medicament Conjugate of monomethyl auristatin F and trastuzumab and its use for the treatment of cancer
WO2017191817A1 (ja) * 2016-05-02 2017-11-09 味の素株式会社 アジド基含有Ｆｃタンパク質
KR20190035737A (ko) 2016-07-06 2019-04-03 셀진 코포레이션 낮은 면역원성을 갖는 항체 및 이의 용도
WO2018183182A1 (en) 2017-03-27 2018-10-04 Celgene Corporation Methods and compositions for reduction of immunogenicity
WO2018218004A1 (en) * 2017-05-24 2018-11-29 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Linkers for antibody drug conjugates
EP3658588A1 (en) 2017-07-26 2020-06-03 Sutro Biopharma, Inc. Methods of using anti-cd74 antibodies and antibody conjugates in treatment of t-cell lymphoma
KR20200064085A (ko) 2017-09-07 2020-06-05 큐 바이오파마, 인크. 접합 부위를 갖는 t-세포 조절 다량체 폴리펩타이드 및 이의 사용 방법
JP7423513B2 (ja) 2017-09-18 2024-01-29 ストロ バイオファーマ インコーポレーテッド 抗葉酸受容体α抗体コンジュゲート及びその使用
CA3086842A1 (en) * 2017-12-27 2019-07-04 Kyowa Kirin Co., Ltd. Il-2 variant
US20220047716A1 (en) 2018-09-17 2022-02-17 Sutro Biopharma, Inc. Combination therapies with anti-folate receptor antibody conjugates
WO2020081493A1 (en) 2018-10-16 2020-04-23 Molecular Templates, Inc. Pd-l1 binding proteins
US20220362394A1 (en) 2019-05-03 2022-11-17 Sutro Biopharma, Inc. Anti-bcma antibody conjugates
WO2020252043A1 (en) 2019-06-10 2020-12-17 Sutro Biopharma, Inc. 5H-PYRROLO[3,2-d]PYRIMIDINE-2,4-DIAMINO COMPOUNDS AND ANTIBODY CONJUGATES THEREOF
WO2020257235A1 (en) 2019-06-17 2020-12-24 Sutro Biopharma, Inc. 1-(4-(aminomethyl)benzyl)-2-butyl-2h-pyrazolo[3,4-c]quinolin-4-amine derivatives and related compounds as toll-like receptor (tlr) 7/8 agonists, as well as antibody drug conjugates thereof for use in cancer therapy and diagnosis
US11918649B2 (en) 2019-09-18 2024-03-05 Molecular Templates, Inc. PD-L1-binding molecules comprising Shiga toxin a subunit scaffolds
US20230095053A1 (en) 2020-03-03 2023-03-30 Sutro Biopharma, Inc. Antibodies comprising site-specific glutamine tags, methods of their preparation and methods of their use
CA3176515A1 (en) 2020-04-22 2021-10-28 Merck Sharp & Dohme Llc Human interleukin-2 conjugates biased for the interleukin-2 receptor beta gammac dimer and conjugated to a nonpeptidic, water-soluble polymer
US20210340586A1 (en) * 2020-04-30 2021-11-04 Sutro Biopharma, Inc. Methods of Producing Full-Length Antibodies Using E. coli
WO2022051591A2 (en) 2020-09-04 2022-03-10 Novarock Biotherapeutics, Ltd. Nectin-4 antibodies and uses thereof
IL301292A (en) 2020-09-14 2023-05-01 Sutro Biopharma Inc A method for the large-scale production of antibodies using a cell-free protein synthesis system
EP4308242A1 (en) 2021-03-17 2024-01-24 Molecular Templates, Inc. Pd-l1 binding proteins comprising shiga toxin a subunit scaffolds and cd8+ t cell antigens
WO2024006542A1 (en) 2022-06-30 2024-01-04 Sutro Biopharma, Inc. Anti-ror1 antibodies and antibody conjugates, compositions comprising anti-ror1 antibodies or antibody conjugates, and methods of making and using anti-ror1 antibodies and antibody conjugates

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010051056A2 (en) * 2008-03-11 2010-05-06 Ambrx, Inc. ANTI-FcεRI POLYPEPTIDES AND THEIR USES

Family Cites Families (241)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SU11248A1 (ru) 1927-03-29 1929-09-30 В.С. Григорьев Способ очистки антрацена
CU22545A1 (es) 1994-11-18 1999-03-31 Centro Inmunologia Molecular Obtención de un anticuerpo quimérico y humanizado contra el receptor del factor de crecimiento epidérmico para uso diagnóstico y terapéutico
US4289872A (en) 1979-04-06 1981-09-15 Allied Corporation Macromolecular highly branched homogeneous compound based on lysine units
JPS57206622A (en) 1981-06-10 1982-12-18 Ajinomoto Co Inc Blood substitute
US4671958A (en) 1982-03-09 1987-06-09 Cytogen Corporation Antibody conjugates for the delivery of compounds to target sites
US4486414A (en) 1983-03-21 1984-12-04 Arizona Board Of Reagents Dolastatins A and B cell growth inhibitory substances
US4753894A (en) 1984-02-08 1988-06-28 Cetus Corporation Monoclonal anti-human breast cancer antibodies
US4943533A (en) 1984-03-01 1990-07-24 The Regents Of The University Of California Hybrid cell lines that produce monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
EP0154316B1 (en) 1984-03-06 1989-09-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified lymphokine and production thereof
US4625014A (en) 1984-07-10 1986-11-25 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Cell-delivery agent
US4542225A (en) 1984-08-29 1985-09-17 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Acid-cleavable compound
GB8430252D0 (en) 1984-11-30 1985-01-09 Beecham Group Plc Compounds
DE3675588D1 (de) 1985-06-19 1990-12-20 Ajinomoto Kk Haemoglobin, das an ein poly(alkenylenoxid) gebunden ist.
DE3676670D1 (de) 1985-06-26 1991-02-07 Cetus Corp Solubilisierung von proteinen fuer pharmazeutische zusammensetzungen mittels polymerkonjugierung.
US5567610A (en) 1986-09-04 1996-10-22 Bioinvent International Ab Method of producing human monoclonal antibodies and kit therefor
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
US5229490A (en) 1987-05-06 1993-07-20 The Rockefeller University Multiple antigen peptide system
US4816444A (en) 1987-07-10 1989-03-28 Arizona Board Of Regents, Arizona State University Cell growth inhibitory substance
US5080891A (en) 1987-08-03 1992-01-14 Ddi Pharmaceuticals, Inc. Conjugates of superoxide dismutase coupled to high molecular weight polyalkylene glycols
US5204244A (en) 1987-10-27 1993-04-20 Oncogen Production of chimeric antibodies by homologous recombination
JP3040121B2 (ja) 1988-01-12 2000-05-08 ジェネンテク，インコーポレイテッド 増殖因子レセプターの機能を阻害することにより腫瘍細胞を処置する方法
US4847325A (en) 1988-01-20 1989-07-11 Cetus Corporation Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
GB8824591D0 (en) 1988-10-20 1988-11-23 Royal Free Hosp School Med Fractionation process
US5076973A (en) 1988-10-24 1991-12-31 Arizona Board Of Regents Synthesis of dolastatin 3
GB8827305D0 (en) 1988-11-23 1988-12-29 British Bio Technology Compounds
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
DE68925966T2 (de) 1988-12-22 1996-08-29 Kirin Amgen Inc Chemisch modifizierte granulocytenkolonie erregender faktor
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US4902502A (en) 1989-01-23 1990-02-20 Cetus Corporation Preparation of a polymer/interleukin-2 conjugate
US4978744A (en) 1989-01-27 1990-12-18 Arizona Board Of Regents Synthesis of dolastatin 10
US5122614A (en) 1989-04-19 1992-06-16 Enzon, Inc. Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides
US5324844A (en) 1989-04-19 1994-06-28 Enzon, Inc. Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides
ES2247656T3 (es) 1989-04-19 2006-03-01 Enzon, Inc. Un proceso para formar un polipeptido modificado que comprende un polipeptido y un oxido de polialquileno.
US4879278A (en) 1989-05-16 1989-11-07 Arizona Board Of Regents Isolation and structural elucidation of the cytostatic linear depsipeptide dolastatin 15
US4986988A (en) 1989-05-18 1991-01-22 Arizona Board Of Regents Isolation and structural elucidation of the cytostatic linear depsipeptides dolastatin 13 and dehydrodolastatin 13
DK0400472T3 (da) 1989-05-27 1996-05-13 Sumitomo Pharma Fremgangsmåde til fremstilling af polyethylenglycolderivater og modificeret protein
US5138036A (en) 1989-11-13 1992-08-11 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Isolation and structural elucidation of the cytostatic cyclodepsipeptide dolastatin 14
US5312808A (en) 1989-11-22 1994-05-17 Enzon, Inc. Fractionation of polyalkylene oxide-conjugated hemoglobin solutions
US5229275A (en) 1990-04-26 1993-07-20 Akzo N.V. In-vitro method for producing antigen-specific human monoclonal antibodies
US5219564A (en) 1990-07-06 1993-06-15 Enzon, Inc. Poly(alkylene oxide) amino acid copolymers and drug carriers and charged copolymers based thereon
US5492821A (en) 1990-11-14 1996-02-20 Cargill, Inc. Stabilized polyacrylic saccharide protein conjugates
US5252714A (en) 1990-11-28 1993-10-12 The University Of Alabama In Huntsville Preparation and use of polyethylene glycol propionaldehyde
JP3854306B2 (ja) 1991-03-06 2006-12-06 メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフトング ヒト化及びキメラモノクローナル抗体
JPH06506217A (ja) 1991-03-18 1994-07-14 エンゾン，インコーポレーテッド ポリペプチドまたはグリコポリペプチドとポリマーとのヒドラジン含有結合体
US5595732A (en) 1991-03-25 1997-01-21 Hoffmann-La Roche Inc. Polyethylene-protein conjugates
CA2103059C (en) 1991-06-14 2005-03-22 Paul J. Carter Method for making humanized antibodies
US5281698A (en) 1991-07-23 1994-01-25 Cetus Oncology Corporation Preparation of an activated polymer ester for protein conjugation
US5565332A (en) 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
IT1260468B (it) 1992-01-29 1996-04-09 Metodo per mantenere l'attivita' di enzimi proteolitici modificati con polietilenglicole
JP3571337B2 (ja) 1992-02-11 2004-09-29 セル ジェネシス，インコーポレーテッド 遺伝子標的現象による同型遺伝子接合
US5573905A (en) 1992-03-30 1996-11-12 The Scripps Research Institute Encoded combinatorial chemical libraries
EP0636156B1 (en) 1992-04-14 1997-07-30 Cornell Research Foundation, Inc. Dendritic based macromolecules and method of production
US5869644A (en) 1992-04-15 1999-02-09 The Johns Hopkins University Synthesis of diverse and useful collections of oligonucleotidies
ZA933926B (en) 1992-06-17 1994-01-03 Amgen Inc Polyoxymethylene-oxyethylene copolymers in conjuction with blomolecules
WO1994004193A1 (en) 1992-08-21 1994-03-03 Enzon, Inc. Novel attachment of polyalkylene oxides to bio-effecting substances
US5382657A (en) 1992-08-26 1995-01-17 Hoffmann-La Roche Inc. Peg-interferon conjugates
US5736137A (en) 1992-11-13 1998-04-07 Idec Pharmaceuticals Corporation Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma
US6034065A (en) 1992-12-03 2000-03-07 Arizona Board Of Regents Elucidation and synthesis of antineoplastic tetrapeptide phenethylamides of dolastatin 10
US5635483A (en) 1992-12-03 1997-06-03 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Tumor inhibiting tetrapeptide bearing modified phenethyl amides
NZ250375A (en) 1992-12-09 1995-07-26 Ortho Pharma Corp Peg hydrazone and peg oxime linkage forming reagents and protein derivatives
US5298643A (en) 1992-12-22 1994-03-29 Enzon, Inc. Aryl imidate activated polyalkylene oxides
US5455258A (en) 1993-01-06 1995-10-03 Ciba-Geigy Corporation Arylsulfonamido-substituted hydroxamic acids
WO1994015625A1 (en) 1993-01-15 1994-07-21 Enzon, Inc. Factor viii - polymeric conjugates
US5349001A (en) 1993-01-19 1994-09-20 Enzon, Inc. Cyclic imide thione activated polyalkylene oxides
US5410024A (en) 1993-01-21 1995-04-25 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Human cancer inhibitory pentapeptide amides
US5780588A (en) 1993-01-26 1998-07-14 Arizona Board Of Regents Elucidation and synthesis of selected pentapeptides
US5321095A (en) 1993-02-02 1994-06-14 Enzon, Inc. Azlactone activated polyalkylene oxides
IL104734A0 (en) 1993-02-15 1993-06-10 Univ Bar Ilan Bioactive conjugates of cellulose with amino compounds
AU7097094A (en) 1993-06-01 1994-12-20 Enzon, Inc. Carbohydrate-modified polymer conjugates with erythropoietic activity
WO1995000162A1 (en) 1993-06-21 1995-01-05 Enzon, Inc. Site specific synthesis of conjugated peptides
GB9317618D0 (en) 1993-08-24 1993-10-06 Royal Free Hosp School Med Polymer modifications
US5919455A (en) 1993-10-27 1999-07-06 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5643575A (en) 1993-10-27 1997-07-01 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
NZ276943A (en) 1993-11-10 1998-02-26 Schering Corp Substituted For Alpha-interferon conjugated to a non-antigenic polymer (preferably a polyalkylene oxide) and its preparation
US5951974A (en) 1993-11-10 1999-09-14 Enzon, Inc. Interferon polymer conjugates
US5446090A (en) 1993-11-12 1995-08-29 Shearwater Polymers, Inc. Isolatable, water soluble, and hydrolytically stable active sulfones of poly(ethylene glycol) and related polymers for modification of surfaces and molecules
GB9401182D0 (en) 1994-01-21 1994-03-16 Inst Of Cancer The Research Antibodies to EGF receptor and their antitumour effect
US5473034A (en) 1994-03-18 1995-12-05 Hyogo Prefectural Government Method for producing protein-synthetic polymer conjugate and said conjugate produced thereby
US5534615A (en) 1994-04-25 1996-07-09 Genentech, Inc. Cardiac hypertrophy factor and uses therefor
US5629384A (en) 1994-05-17 1997-05-13 Consiglio Nazionale Delle Ricerche Polymers of N-acryloylmorpholine activated at one end and conjugates with bioactive materials and surfaces
AU2826495A (en) 1994-06-02 1996-01-04 Enzon, Inc. Method of solubilizing substantially water insoluble materials
US5730990A (en) 1994-06-24 1998-03-24 Enzon, Inc. Non-antigenic amine derived polymers and polymer conjugates
US5504191A (en) 1994-08-01 1996-04-02 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Human cancer inhibitory pentapeptide methyl esters
US5521284A (en) 1994-08-01 1996-05-28 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Human cancer inhibitory pentapeptide amides and esters
US5530097A (en) 1994-08-01 1996-06-25 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Human cancer inhibitory peptide amides
IL114909A (en) 1994-08-12 1999-10-28 Immunomedics Inc Immunoconjugates and humanized antibodies specific for b-cell lymphoma and leukemia cells
US5650234A (en) 1994-09-09 1997-07-22 Surface Engineering Technologies, Division Of Innerdyne, Inc. Electrophilic polyethylene oxides for the modification of polysaccharides, polypeptides (proteins) and surfaces
US5554725A (en) 1994-09-14 1996-09-10 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Synthesis of dolastatin 15
US5824784A (en) 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
EP0804584B2 (en) 1994-10-21 2008-07-09 Innogenetics N.V. Sequences of hepatitis c virus genotype 7 and their use as prophylactic, therapeutic and diagnostic agents
WO1996041813A2 (en) 1994-11-09 1996-12-27 Offord Robin E Functionalized polymers for site-specific attachment
US5738846A (en) 1994-11-10 1998-04-14 Enzon, Inc. Interferon polymer conjugates and process for preparing the same
US5599902A (en) 1994-11-10 1997-02-04 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Cancer inhibitory peptides
US5663149A (en) 1994-12-13 1997-09-02 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Human cancer inhibitory pentapeptide heterocyclic and halophenyl amides
US5932462A (en) 1995-01-10 1999-08-03 Shearwater Polymers, Inc. Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces
US5863949A (en) 1995-03-08 1999-01-26 Pfizer Inc Arylsulfonylamino hydroxamic acid derivatives
US5756662A (en) 1995-03-14 1998-05-26 Corixa Corporation Compounds and methods for the detection of T. cruzi infection
EP0821671B1 (en) 1995-04-20 2000-12-27 Pfizer Inc. Arylsulfonyl hydroxamic acid derivatives as mmp and tnf inhibitors
WO1996040210A1 (en) 1995-06-07 1996-12-19 Imclone Systems Incorporated Antibody and antibody fragments for inhibiting the growth of tumors
WO1996040791A1 (en) 1995-06-07 1996-12-19 Novo Nordisk A/S Modification of polypeptides
US5672662A (en) 1995-07-07 1997-09-30 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) and related polymers monosubstituted with propionic or butanoic acids and functional derivatives thereof for biotechnical applications
GB9624482D0 (en) 1995-12-18 1997-01-15 Zeneca Phaema S A Chemical compounds
DK0780386T3 (da) 1995-12-20 2003-02-03 Hoffmann La Roche Matrixmetalloproteaseinhibitorer
CN1300173C (zh) 1996-02-09 2007-02-14 艾博特生物技术有限公司 结合人TNFα的人抗体
KR19990082463A (ko) 1996-02-13 1999-11-25 돈 리사 로얄 혈관 내피 성장 인자 억제제로서의 퀴나졸린유도체
DK0885198T3 (da) 1996-03-05 2002-03-25 Astrazeneca Ab 4-Anilinoquinazolinderivater
US5747639A (en) 1996-03-06 1998-05-05 Amgen Boulder Inc. Use of hydrophobic interaction chromatography to purify polyethylene glycols
TW517067B (en) 1996-05-31 2003-01-11 Hoffmann La Roche Interferon conjugates
EP0818442A3 (en) 1996-07-12 1998-12-30 Pfizer Inc. Cyclic sulphone derivatives as inhibitors of metalloproteinases and of the production of tumour necrosis factor
EP0923585B1 (en) 1996-07-18 2002-05-08 Pfizer Inc. Phosphinate based inhibitors of matrix metalloproteases
US6077939A (en) 1996-08-02 2000-06-20 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Methods and kits for making polypeptides having a single covalently bound N-terminal water-soluble polymer
US5980948A (en) 1996-08-16 1999-11-09 Osteotech, Inc. Polyetherester copolymers as drug delivery matrices
JP2000501423A (ja) 1996-08-23 2000-02-08 ファイザー インク． アリールスルホニルアミノヒドロキサム酸誘導体
US6130237A (en) 1996-09-12 2000-10-10 Cancer Research Campaign Technology Limited Condensed N-aclyindoles as antitumor agents
GB9718972D0 (en) 1996-09-25 1997-11-12 Zeneca Ltd Chemical compounds
US6214966B1 (en) 1996-09-26 2001-04-10 Shearwater Corporation Soluble, degradable poly(ethylene glycol) derivatives for controllable release of bound molecules into solution
PT950059E (pt) 1997-01-06 2004-10-29 Pfizer Derivados de sulfona ciclicos
ATE200030T1 (de) 1997-01-29 2001-04-15 Polymasc Pharmaceuticals Plc Pegylationsverfahren
ID22799A (id) 1997-02-03 1999-12-09 Pfizer Prod Inc Turunan-turunan asam arilsulfonilamino hidroksamat
JP2000507975A (ja) 1997-02-07 2000-06-27 ファイザー・インク Ｎ−ヒドロキシ−β−スルホニルプロピオンアミド誘導体類及びそれらのマトリックスメタロプロテイナーゼ阻害薬としての使用
IL131123A0 (en) 1997-02-11 2001-01-28 Pfizer Arylsulfonyl hydroxamic acid derivatives
DK0961780T3 (da) 1997-02-12 2007-08-27 Electrophoretics Ltd Proteinmarkörer for lungecancer og anvendelse deraf
US6239104B1 (en) 1997-02-25 2001-05-29 Arizona Board Of Regents Isolation and structural elucidation of the cytostatic linear and cyclo-depsipeptides dolastatin 16, dolastatin 17, and dolastatin 18
CA2288994C (en) 1997-04-30 2011-07-05 Enzon, Inc. Polyalkylene oxide-modified single chain polypeptides
US6235883B1 (en) 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
US5990237A (en) 1997-05-21 1999-11-23 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) aldehyde hydrates and related polymers and applications in modifying amines
US6583267B2 (en) 1997-06-06 2003-06-24 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Chemically modified polypeptides
WO1999003887A1 (en) 1997-07-14 1999-01-28 Bolder Biotechnology, Inc. Derivatives of growth hormone and related proteins
US6214872B1 (en) 1997-08-08 2001-04-10 Pfizer Inc. Aryloxyarylsulfonylamino hydroxamic acid derivatives
EP1032268A4 (en) 1997-09-26 2003-08-20 Uab Research Foundation REDUCED ANTIGENS CELLS AND THEIR USE
US6201072B1 (en) 1997-10-03 2001-03-13 Macromed, Inc. Biodegradable low molecular weight triblock poly(lactide-co- glycolide) polyethylene glycol copolymers having reverse thermal gelation properties
US6004573A (en) 1997-10-03 1999-12-21 Macromed, Inc. Biodegradable low molecular weight triblock poly(lactide-co-glycolide) polyethylene glycol copolymers having reverse thermal gelation properties
DE19748489A1 (de) 1997-11-03 1999-05-06 Roche Diagnostics Gmbh Polyethylenglykol-derivatisierte Biomoleküle und deren Verwendung in heterogenen Nachweisverfahren
US6448369B1 (en) 1997-11-06 2002-09-10 Shearwater Corporation Heterobifunctional poly(ethylene glycol) derivatives and methods for their preparation
GB9725782D0 (en) 1997-12-05 1998-02-04 Pfizer Ltd Therapeutic agents
US5985263A (en) 1997-12-19 1999-11-16 Enzon, Inc. Substantially pure histidine-linked protein polymer conjugates
US5981709A (en) 1997-12-19 1999-11-09 Enzon, Inc. α-interferon-polymer-conjugates having enhanced biological activity and methods of preparing the same
GB9801690D0 (en) 1998-01-27 1998-03-25 Pfizer Ltd Therapeutic agents
WO1999045026A1 (en) 1998-03-05 1999-09-10 Chiron Corporation Method for increasing the serum half-life of a biologically active molecule
ATE399809T1 (de) 1998-03-12 2008-07-15 Nektar Therapeutics Al Corp Verfahren zur herstellung von polymerkonjugaten
JP4462654B2 (ja) 1998-03-26 2010-05-12 ソニー株式会社 映像素材選択装置及び映像素材選択方法
PA8469501A1 (es) 1998-04-10 2000-09-29 Pfizer Prod Inc Hidroxamidas del acido (4-arilsulfonilamino)-tetrahidropiran-4-carboxilico
PA8469401A1 (es) 1998-04-10 2000-05-24 Pfizer Prod Inc Derivados biciclicos del acido hidroxamico
EP0953639A1 (en) 1998-04-30 1999-11-03 Boehringer Ingelheim International GmbH FAPalpha-specific antibody with improved producibility
AU760048B2 (en) 1998-05-06 2003-05-08 Genentech Inc. Protein purification by ion exchange chromatography
WO2000012587A2 (en) 1998-08-28 2000-03-09 Gryphon Sciences Polyamide chains of precise length, methods to manufacture them and their conjugates
US6420339B1 (en) 1998-10-14 2002-07-16 Amgen Inc. Site-directed dual pegylation of proteins for improved bioactivity and biocompatibility
US6114361A (en) 1998-11-05 2000-09-05 Pfizer Inc. 5-oxo-pyrrolidine-2-carboxylic acid hydroxamide derivatives
WO2000034337A1 (en) 1998-12-10 2000-06-15 Tsukuba Research Laboratory, Toagosei Co., Ltd. Humanized monoclonal antibodies against vascular endothelial cell growth factor
US6451346B1 (en) 1998-12-23 2002-09-17 Amgen Inc Biodegradable pH/thermosensitive hydrogels for sustained delivery of biologically active agents
JP4805432B2 (ja) 1998-12-28 2011-11-02 ランクセス・ドイチュランド・ゲーエムベーハー 木質材又は木質複合材を製造する際に使用される接着剤混入用薬剤
US6281211B1 (en) 1999-02-04 2001-08-28 Euro-Celtique S.A. Substituted semicarbazides and the use thereof
KR20080015482A (ko) 1999-02-10 2008-02-19 아스트라제네카 아베 혈관형성 억제제로서의 퀴나졸린 유도체
US6914128B1 (en) 1999-03-25 2005-07-05 Abbott Gmbh & Co. Kg Human antibodies that bind human IL-12 and methods for producing
KR100696408B1 (ko) 1999-04-16 2007-03-19 더블유엠. 마쉬 라이스 유니버시티 폴리(에틸렌글리콜)과 가교결합을 이룬 폴리(프로필렌푸마레이트)
US7829064B2 (en) 1999-05-10 2010-11-09 Immunomedics, Inc. Anti-CD74 immunoconjugates and methods
US6924359B1 (en) 1999-07-01 2005-08-02 Yale University Neovascular-targeted immunoconjugates
US6323315B1 (en) 1999-09-10 2001-11-27 Basf Aktiengesellschaft Dolastatin peptides
UA72946C2 (uk) 1999-11-05 2005-05-16 Астразенека Аб Похідні хіназоліну як інгібітори васкулярного ендотеліального фактора росту (vegf)
US6348558B1 (en) 1999-12-10 2002-02-19 Shearwater Corporation Hydrolytically degradable polymers and hydrogels made therefrom
CA2393638C (en) 1999-12-22 2009-10-20 Shearwater Corporation Method for the preparation of 1-benzotriazolyl carbonate esters of poly(ethylene glycol)
DK1259562T3 (da) 1999-12-22 2006-04-18 Nektar Therapeutics Al Corp Sterisk hindrede derivater af vandoplöselige polymerer
US6413507B1 (en) 1999-12-23 2002-07-02 Shearwater Corporation Hydrolytically degradable carbamate derivatives of poly (ethylene glycol)
US6646110B2 (en) 2000-01-10 2003-11-11 Maxygen Holdings Ltd. G-CSF polypeptides and conjugates
CA2399358C (en) 2000-02-15 2006-03-21 Sugen, Inc. Pyrrole substituted 2-indolinone protein kinase inhibitors
US6602498B2 (en) 2000-02-22 2003-08-05 Shearwater Corporation N-maleimidyl polymer derivatives
AU2001239857B9 (en) 2000-02-25 2006-07-27 Duke University Anti-EGFRvIII SCFVS with improved cytotoxicity and yield, immunotoxins based thereon, and methods of use thereof
WO2001062299A2 (en) 2000-02-28 2001-08-30 Shearwater Corporation Water-soluble polymer conjugates of artelinic acid
KR100480985B1 (ko) 2000-05-19 2005-04-07 이수화학 주식회사 표피 성장 인자 수용체에 대한 사람화된 항체
US6436386B1 (en) 2000-11-14 2002-08-20 Shearwater Corporation Hydroxyapatite-targeting poly (ethylene glycol) and related polymers
JP4860098B2 (ja) 2000-12-18 2012-01-25 ダイアックス、コープ 遺伝的パッケージの焦点を合わせたライブラリー
TW593427B (en) 2000-12-18 2004-06-21 Nektar Therapeutics Al Corp Synthesis of high molecular weight non-peptidic polymer derivatives
TWI246524B (en) 2001-01-19 2006-01-01 Shearwater Corp Multi-arm block copolymers as drug delivery vehicles
CA2444098C (en) 2001-04-19 2016-06-21 The Scripps Research Institute Methods and composition for the production of orthogonal trna-aminoacyltrna synthetase pairs
US6884869B2 (en) 2001-04-30 2005-04-26 Seattle Genetics, Inc. Pentapeptide compounds and uses related thereto
US20030083263A1 (en) 2001-04-30 2003-05-01 Svetlana Doronina Pentapeptide compounds and uses related thereto
MXPA03011365A (es) 2001-06-13 2005-03-07 Genmab As Anticuerpos monoclonales humanos para el receptor de factor de crecimiento epidermico (egfr).
US6908963B2 (en) 2001-10-09 2005-06-21 Nektar Therapeutics Al, Corporation Thioester polymer derivatives and method of modifying the N-terminus of a polypeptide therewith
AU2002352524B2 (en) 2001-11-07 2007-10-04 Nektar Therapeutics Branched polymers and their conjugates
AU2002346373A1 (en) 2001-11-09 2003-05-19 Idec Pharmaceuticals Corporation Anti-cd80 antibody having adcc activity for adcc mediated killing of b cell lymphoma cells alone or in combination with other therapies
DE10156482A1 (de) 2001-11-12 2003-05-28 Gundram Jung Bispezifisches Antikörper-Molekül
US6716821B2 (en) 2001-12-21 2004-04-06 Immunogen Inc. Cytotoxic agents bearing a reactive polyethylene glycol moiety, cytotoxic conjugates comprising polyethylene glycol linking groups, and methods of making and using the same
WO2003074679A2 (en) 2002-03-01 2003-09-12 Xencor Antibody optimization
ES2556641T3 (es) 2002-07-31 2016-01-19 Seattle Genetics, Inc. Conjugados de fármacos y su uso para tratar cáncer, una enfermedad autoinmune o una enfermedad infecciosa
EP2108697A1 (en) 2002-08-19 2009-10-14 The Board of Trustees of The Leland Stanford Junior University Improved methods of in vitro protein systhesis
US20040202666A1 (en) 2003-01-24 2004-10-14 Immunomedics, Inc. Anti-cancer anthracycline drug-antibody conjugates
SG195524A1 (en) 2003-11-06 2013-12-30 Seattle Genetics Inc Monomethylvaline compounds capable of conjugation to ligands
US7968684B2 (en) 2003-11-12 2011-06-28 Abbott Laboratories IL-18 binding proteins
ES2372495T3 (es) 2003-11-13 2012-01-20 Hanmi Holdings Co., Ltd Método para la producción en masa de la región constante de inmunoglobulina.
US20050260711A1 (en) * 2004-03-30 2005-11-24 Deepshikha Datta Modulating pH-sensitive binding using non-natural amino acids
EP2374817B1 (en) 2004-04-13 2017-09-06 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-P-selectin antibodies
PT1740616E (pt) 2004-04-30 2012-03-23 Inst Nat Sante Rech Med Anticorpo anti-rtf
BRPI0512235A (pt) 2004-06-18 2008-02-19 Ambrx Inc polipeptìdeos ligadores de antìgenos e seus usos
KR20180091967A (ko) 2004-07-22 2018-08-16 제넨테크, 인크. Ｈｅｒ２ 항체 조성물
WO2006031994A2 (en) 2004-09-14 2006-03-23 Xencor, Inc. Monomeric immunoglobulin fc domains
TWI309240B (en) 2004-09-17 2009-05-01 Hoffmann La Roche Anti-ox40l antibodies
JP5135504B2 (ja) 2004-10-27 2013-02-06 ザ スクリプス リサーチ インスティチュート 非天然アミノ酸のインビボ組込み用直交翻訳成分
CA3005835C (en) 2004-12-22 2023-01-31 Ambrx, Inc. Compositions containing, methods involving, and uses of non-natural amino acids and polypeptides
KR100754667B1 (ko) 2005-04-08 2007-09-03 한미약품 주식회사 비펩타이드성 중합체로 개질된 면역글로불린 Ｆｃ 단편 및이를 포함하는 약제학적 조성물
US8008443B2 (en) 2005-04-26 2011-08-30 Medimmune, Llc Modulation of antibody effector function by hinge domain engineering
WO2008020827A2 (en) * 2005-08-01 2008-02-21 Biogen Idec Ma Inc. Altered polypeptides, immunoconjugates thereof, and methods related thereto
US8008453B2 (en) 2005-08-12 2011-08-30 Amgen Inc. Modified Fc molecules
AU2006299429B2 (en) 2005-10-03 2012-02-23 Xencor, Inc. Fc variants with optimized Fc receptor binding properties
CA2631491C (en) 2005-12-14 2015-02-24 Ambrx, Inc. Compositions containing, methods involving, and uses of non-natural amino acids and polypeptides
CN101384711A (zh) 2006-01-19 2009-03-11 Ambrx公司 具有经调节的免疫原性的非天然氨基酸多肽
AU2007240507B2 (en) 2006-04-21 2013-07-18 Novartis Ag Antagonist anti-CD40 antibody pharmaceutical compositions
CA2653748A1 (en) 2006-05-02 2007-11-15 Allozyne, Inc. Non-natural amino acid substituted polypeptides
US8715958B2 (en) 2006-06-29 2014-05-06 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Cell-free synthesis of proteins containing unnatural amino acids
ATE542888T1 (de) 2006-09-08 2012-02-15 Ambrx Inc Standortspezifische inkorporation nicht natürlicher aminosäuren in wirbeltierzellen
AU2007292903B2 (en) 2006-09-08 2012-03-29 Ambrx, Inc. Modified human plasma polypeptide or Fc scaffolds and their uses
WO2008083346A1 (en) 2006-12-28 2008-07-10 Ambrx, Inc. Phenazine and quinoxaline substituted amino acids and polypeptides
WO2008134761A2 (en) 2007-04-30 2008-11-06 Intezyne Technologies, Inc. Modification of biological targeting groups for the treatment of cancer
EP3753947A1 (en) 2007-09-14 2020-12-23 Adimab, LLC Rationally designed, synthetic antibody libraries and uses therefor
ES2450755T3 (es) 2007-10-19 2014-03-25 Genentech, Inc. Anticuerpos anti-TENB2 modificados por ingeniería genética con cisteína, y conjugados de anticuerpo y fármaco
KR20100107501A (ko) * 2008-01-18 2010-10-05 메디뮨 엘엘씨 부위 특이적 접합을 위한 시스테인 조작 항체
WO2010006214A1 (en) 2008-07-09 2010-01-14 Ambrx, Inc. Fgf-21 neutralizing antibodies and their uses
WO2010081110A1 (en) 2009-01-12 2010-07-15 Sutro Biopharma, Inc. Dual charging system for selectively introducing non-native amino acids into proteins using an in vitro synthesis method
US20120100140A1 (en) 2009-01-23 2012-04-26 Biogen Idec Ma Inc. Stabilized fc polypeptides with reduced effector function and methods of use
GB2470770A (en) 2009-06-04 2010-12-08 Medical Res Council Incorporation of unnatural amino acids having an orthogonal functional group into polypeptides using orthogonal tRNA/tRNA synthetase pairs
EP2640745B1 (en) 2010-09-10 2018-11-07 MedImmune Limited Bivalent and bispecific anti-il6/anti-il23 antibodies
RU2016123839A (ru) 2010-12-08 2018-11-30 АббВай Стемсентркс ЭлЭлСи Новые модуляторы и способы их применения
AU2012213437B2 (en) 2011-02-01 2016-08-18 Genmab A/S Human antibodies and antibody-drug conjugates against CD74
WO2013068874A1 (en) * 2011-11-11 2013-05-16 Pfizer Inc. Antibody-drug conjugates
US11147852B2 (en) 2011-12-23 2021-10-19 Pfizer Inc. Engineered antibody constant regions for site-specific conjugation and methods and uses therefor
CN102627615B (zh) 2012-03-23 2014-01-01 兰州大学 一种化合物l-4-四嗪-苯丙氨酸及其制备方法和应用
ES2718478T3 (es) 2012-06-08 2019-07-02 Sutro Biopharma Inc Anticuerpos que comprenden restos de aminoácidos no naturales de localización específica, métodos para su preparación y métodos para su uso
US9732161B2 (en) 2012-06-26 2017-08-15 Sutro Biopharma, Inc. Modified Fc proteins comprising site-specific non-natural amino acid residues, conjugates of the same, methods of their preparation and methods of their use
AU2013308494B2 (en) 2012-08-31 2018-03-01 Sutro Biopharma, Inc. Modified amino acids comprising an azido group
WO2014044872A1 (en) 2012-09-24 2014-03-27 Allozyne, Inc Cell lines
US9902705B2 (en) 2012-10-24 2018-02-27 The General Hospital Corporation Functionalized 1,2,4,5-tetrazine compounds for use in bioorthogonal coupling reactions
EP3521312B1 (en) 2013-02-20 2021-04-07 Innate Pharma A compound that specifically binds to kir3dl2 for use in the treatment of peripheral t cell lymphoma
WO2015006555A2 (en) 2013-07-10 2015-01-15 Sutro Biopharma, Inc. Antibodies comprising multiple site-specific non-natural amino acid residues, methods of their preparation and methods of their use
EP3708227A1 (en) 2014-07-22 2020-09-16 Sutro Biopharma, Inc. Anti-cd74 antibodies, compositions comprising anti-cd74 antibodies and methods of using anti-cd74 antibodies
US10100129B2 (en) 2014-11-21 2018-10-16 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies against CD73 and uses thereof
US10844090B2 (en) 2015-01-30 2020-11-24 Sutro Biopharma, Inc. Hemiasterlin derivatives for conjugation and therapy
CN106146663B (zh) 2015-04-10 2019-11-08 北京大学 非天然氨基酸标记的新型抗体-药物偶联物及其制备
KR20180104106A (ko) 2016-01-27 2018-09-19 서트로 바이오파마, 인크. anti-CD74 항체 접합체, anti-CD74 항체 접합체를 포함하는 조성물 및 anti-CD74 항체 접합체의 이용 방법
TW201801751A (zh) 2016-05-13 2018-01-16 塔維達治療公司 靶向構建體及其製劑
CA3044082A1 (en) 2017-04-03 2018-10-11 Immunomedics, Inc. Subcutaneous administration of antibody-drug conjugates for cancer therapy
EP3658588A1 (en) 2017-07-26 2020-06-03 Sutro Biopharma, Inc. Methods of using anti-cd74 antibodies and antibody conjugates in treatment of t-cell lymphoma

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010051056A2 (en) * 2008-03-11 2010-05-06 Ambrx, Inc. ANTI-FcεRI POLYPEPTIDES AND THEIR USES

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BENJAMIN M. HUTCHINS, ET AL.: "Site-Specific Coupling and Sterically Controlled Formation of Multimeric Antibody Fab Fragments with Unnatural Amino Acids", 《JOURNAL OF MOLECULAR BIOLOGY》 *
JAMES F. ZAWADA，ET AL.: "Microscale to Manufacturing Scale-up of Cell-Free Cytokine Production—A New Approach for Shortening Protein Production Development Timelines", 《BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING》 *

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109069664A (zh) * 2016-01-27 2018-12-21 苏特罗生物制药公司 抗cd74抗体偶联物，包含抗cd74抗体偶联物的组合物以及抗cd74抗体偶联物的使用方法
CN109069664B (zh) * 2016-01-27 2022-05-13 苏特罗生物制药公司 抗cd74抗体偶联物，包含抗cd74抗体偶联物的组合物以及抗cd74抗体偶联物的使用方法
CN109420167A (zh) * 2017-08-28 2019-03-05 四川九章生物科技有限公司 一种治疗肿瘤的联合用药物
CN109420167B (zh) * 2017-08-28 2022-02-11 四川九章生物科技有限公司 一种治疗肿瘤的联合用药物
CN113660957A (zh) * 2019-02-12 2021-11-16 Ambrx公司 包含抗体-tlr激动剂缀合物的组合物、方法和用途
CN114502580A (zh) * 2019-07-30 2022-05-13 大学健康网络 Mhc ii类分子及其使用方法
CN110551195A (zh) * 2019-08-01 2019-12-10 天津科技大学 一种α-突触核蛋白聚集诱导发光体系及其构建与应用
CN110551195B (zh) * 2019-08-01 2022-08-09 天津科技大学 一种α-突触核蛋白聚集诱导发光体系及其构建与应用
WO2021057451A1 (zh) * 2019-09-26 2021-04-01 三生国健药业（上海）股份有限公司 一种抗体融合蛋白及其制法和在抗肿瘤中的应用

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