KR20150023630A - 부위-특이적 비-천연 아미노산 잔기를 포함하는 항체, 그의 제조 방법 및 그의 사용 방법 - Google Patents

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Abstract

본원에서는 부위-특이적 위치에 비-천연 아미노산 잔기를 포함하는 항체, 상기 항체를 포함하는 조성물, 그의 생산 방법 및 그의 사용 방법이 제공된다. 상기 항체는 치료 및 예방 방법, 검출 방법 및 진단 방법에 유용하다.

Description

부위-특이적 비-천연 아미노산 잔기를 포함하는 항체, 그의 제조 방법 및 그의 사용 방법 {ANTIBODIES COMPRISING SITE-SPECIFIC NON-NATURAL AMINO ACID RESIDUES, METHODS OF THEIR PREPARATION AND METHODS OF THEIR USE}
본원에서는 부위-특이적 위치에 비-천연 아미노산 잔기를 포함하는 항체, 상기 항체를 포함하는 조성물, 그의 제조 방법 및 그의 사용 방법이 제공된다.
항체는 그의 표적 항원에 대한 현저한 친화도를 갖는 생물학적 분자이다. 자연은 외래 단백질, 세포 및 유기체의 제거 또는 파괴를 위해 특정 척추동물의 방어 시스템의 일부로서 항체를 제공한다. 특정 척추동물에게 예를 들어 감염된 세포 또는 감염성 박테리아 상의 외래 단백질이 제시되면, 항체는 외래 엔티티 (entity)를 그의 제거 또는 파괴로 유도하기 위해 그의 표적 외래 단백질에 결합할 수 있다.
요구되는 거의 모든 항원을 표적화하기 위해 항체의 선택적인 친화도가 사용될 수 있다. 항원은 감염된 세포 또는 감염성 미생물 상의 단백질일 수 있다. 이것은 또한 예를 들어 암 세포 상의 단백질, 표적 조직의 세포 상의 단백질, 혈류 내의 단백질, 염증이 생긴 또는 염증 세포 상의 단백질 또는 그의 선택적인 결합이 유용한 임의의 다른 단백질일 수 있다. 항체는 따라서 암, 염증성 질환, 자가면역 질환 및 이식 거부와 같은 병태에 대한 요법에서 유용할 수 있다. 항체는 이환된 세포를 파괴 또는 제거하기 위해 면역 시스템에 신호를 전달할 수 있거나, 또는 조작된 항체가 표적을 파괴하기 위해 분자 페이로드 (molecular payload)를 운반할 수 있다. 특정 용도에서 치료 항체는 유기체 내의 그의 수명을 증가시키기 위해 분자 방패 (molecular shield)에 연결된다. 항체는 또한 진단제로서 유용할 수 있다. 이들 항체는 세포 상의 또는 조직 내의 표적 항원의 존재를 나타내기 위한 표지를 보유할 수 있다. 이들 표지는 일반적으로 공유 결합에 의해 항체에 연결된다.
지금까지, 항체 분자 엔티티, 예컨대 분자 페이로드, 분자 방패 및 표지를 연결하기 위한 기술은 항체에 대한 연결의 정도 및 위치의 불균질성에 의해, 그의 낮은 수율에 의해 및 활성의 상실에 의해 제한된다. 일반적인 접합 부위는 항체 쇄 상의 무작위 위치, 예를 들어 아미노산 측쇄 상의 무작위 아민, 및 특정 항체 쇄의 N-말단을 포함한다. 상기 기술에서, 일부의 항체는 한 위치에서 접합체에 연결될 수 있고, 일부의 항체는 또 다른 위치에서 동일한 접합체에 연결되고, 일부의 항체는 전혀 연결되지 않을 수 있다.
예를 들어 요법 및 진단에서 항체의 유망한 용도를 발전시키기 위해 균일성, 수율 및/또는 활성에 대해 최적화된 부위-특이적 위치에서 변형된 항체에 대한 필요성이 존재한다.
개요
하나 이상의 비-천연 아미노산 잔기로 하나 이상의 부위-특이적 위치에서 변형된 항체가 본원에서 제공된다. 이들 부위-특이적 위치는 천연 아미노산 잔기의 비-천연 아미노산 잔기로의 치환을 위해 최적이다. 특정 실시양태에서, 이들 부위-특이적 위치에서의 치환은, 치환이 균일한, 즉 선택된 위치에서 실질적으로 변형된 항체를 생성한다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 이들 부위-특이적 위치에서 치환된 항체는 유리한 생산 수율, 유리한 용해도, 유리한 결합 및/또는 유리한 활성을 갖는다. 이들 항체의 특성은 아래 섹션에서 상세하게 설명된다.
한 측면에서, 최적으로 치환가능한 폴리펩티드 쇄 내의 위치에 적어도 하나의 비-천연 아미노산 잔기를 갖는 폴리펩티드 쇄를 포함하는 항체가 본원에서 제공된다. 항체는 당업자에게 항체로 인식되는 임의의 폴리펩티드 또는 다량체 폴리펩티드일 수 있다. 폴리펩티드 쇄는 임의의 중쇄 및 임의의 경쇄를 포함하는 항체의 임의의 폴리펩티드 쇄일 수 있다. 최적으로 치환가능한 폴리펩티드 쇄 내의 위치는 최적 수율, 균일성, 용해도, 결합 및/또는 활성을 보이는 치환을 제공할 수 있는 폴리펩티드 쇄 내의 임의의 위치이다. 아래 섹션에서 상기 폴리펩티드 쇄의 최적으로 치환가능한 위치를 상세하게 설명한다. 또한, 유용한 항체 유용한 비-천연 아미노산이 아래에서 설명된다.
또 다른 측면에서, 상기 항체를 포함하는 조성물이 본원에서 제공된다. 유리하게는, 상기 조성물은 본원에서 제공되는 항체의 치환의 균일성 때문에 높은 균일성을 가질 수 있다. 특정 실시양태에서, 조성물은 단백질의 총 중량에 의해 측정될 때 또는 항체의 총 중량에 의해 측정될 때 실질적인 양의 항체를 포함한다. 특정 실시양태에서, 조성물은 적어도 80 중량%의 항체, 적어도 85 중량%의 항체, 적어도 90 중량%의 항체 또는 적어도 95 중량%의 항체를 포함한다.
또 다른 측면에서, 항체의 제조 방법이 본원에서 제공된다. 항체는 비-천연 아미노산을 항체 쇄의 부위-특이적 위치 내로 도입하기 위한 당업자에게 명백한 임의의 기술에 의해 제조될 수 있다. 특정 실시양태에서, 항체는 고체상 합성, 반-합성, 생체내 번역, 시험관내 번역 또는 무세포 번역에 의해 제조된다.
또 다른 측면에서, 요법을 위해 항체를 사용하는 방법이 본원에서 제공된다. 치료 표적에 작용하는 항체는 본원의 설명에 따라 하나 이상의 부위-특이적 비-천연 아미노산을 포함할 수 있다. 이들 항체는 치료 표적과 연관된 질환 또는 병태의 치료 또는 예방을 위해 사용될 수 있다. 유리하게는, 부위-특이적 비-천연 아미노산은 효능을 촉진하기 위해 항체를 치료적 페이로드에 연결하기 위해 사용될 수 있다. 예시적인 항체, 치료 표적 및 질환 또는 병태가 본원에서 설명된다.
또 다른 측면에서, 검출을 위해 항체를 사용하는 방법이 본원에서 제공된다. 검출 표적에 작용하는 항체는 본원의 설명에 따라 하나 이상의 부위-특이적 비-천연 아미노산을 포함할 수 있다. 이들 항체는 검출 표적에 대한 결합의 신호를 전달하기 위한 표지와 함께 사용될 수 있다. 유리하게는, 부위-특이적 비-천연 아미노산은 검출을 용이하게 하기 위해 항체를 표지에 연결하는데 사용될 수 있다. 예시적인 항체, 검출 표적 및 표지를 본원에서 설명한다.
또 다른 측면에서, 항체의 안정성을 변경하는 방법이 본원에서 제공된다. 항체는 항체의 안정성을 변경할 수 있는 분자 엔티티에 대한 연결을 용이하게 하기 위해 본원에서 설명되는 비-천연 아미노산으로 변형될 수 있다. 예를 들어, 부위-특이적 비-천연 아미노산은 항체의 안정성을 증가시키기 위해 분자 방패, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜에 대한 연결을 용이하게 할 수 있다. 예시적인 비-천연 아미노산 및 연결 모이어티 (moiety)가 본원에서 설명된다.
도 1은 예시적인 세포독성 시약 DBCO-MMAF의 구조를 제공한다.
도 2는 단일 피크 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC) 검정 프로파일 (profile)을 제공한다.
도 3은 잘 분해되지 않은 (not-well-resolved) (NWR) HIC 검정 프로파일을 제공한다.
도 4는 잘 분해된 (WR) HIC 검정 프로파일을 제공한다.
도 5a 및 5b는 2개의 변이체 (HC T110 및 HC S112)의 예시적인 HIC 트레이스 (trace)를 도시한 것으로서, 비접합된, 부분적으로 접합된 및 완전히 접합된 IgG에 상응하는 피크를 보여준다.
도 6a-6e는 부위-특이적 접합을 보여주는 예시적인 실시양태를 도시한 것이다.
도 7a 및 7b는 상이한 비천연 아미노산을 포함하는 항체의 억제 효율 및 가용성 수율 비교 데이터를 보여준다.
도 8은 예시적인 브렌툭시맙 항체-약물 접합체에 의한 CD-30 양성 세포주의 세포 사멸을 보여준다.
도 9는 예시적인 브렌툭시맙 항체-약물 접합체가 CD-30을 발현하지 않는 세포를 사멸시키지 않음을 보여주는 실험 결과를 제공한다.
도 10은 예시적인 브렌툭시맙 (아드세트리스(ADCETRIS)®) 항체-약물 접합체에 의한 CD-30 양성 세포주에 대한 결합을 보여준다.
도 11a, 11b, 11c, 및 11d는 각각 예시적인 세포독성 시약 DBCO-MMAF 2, DBCO-DM4, DBCO-DM4 2, 및 DBCO-MMAE의 구조를 제공한다.
도 12는 예시적인 scFv-Fc 부위-특이적 항체-약물 접합체의 약동학을 보여주는 그래프를 제공한다.
도 13a 및 13b는 동물 모델에서 종양 성장의 지연 및/또는 종양 크기의 퇴행을 위한 예시적인 부위-특이적 항체-약물 접합체의 생체내 유효성을 보여주는 그래프를 제시한다.
본원에서는 하나 이상의 부위-특이적 위치에 비-천연 아미노산을 갖는 항체, 상기 항체를 포함하는 조성물, 상기 항체의 제조 방법 및 그의 사용 방법이 제공된다.
정의
본원에서 항체를 언급할 때, 하기 용어는 달리 나타내지 않으면 다음과 같은 의미를 갖는다. 달리 규정되지 않으면, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 학술 용여는 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에서 용어에 대한 다수의 정의가 존재하는 경우에는, 달리 언급되지 않으면 본 섹션의 정의가 적용된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 단수 형태 ("a", "an", 및 "the")는 문맥이 명백하게 달리 지시하지 않으면 복수 참조물을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "항체"의 언급은 하나 이상의 상기 항체 등에 대한 언급이다.
항체를 포함하는 조성물에 대해 용어 "실질적으로 순수한"은 조성물이 조성물의 나머지 부분에 비해 적어도 80, 85, 90 또는 95 중량%, 또는 특정 실시양태에서, 95, 98, 99 또는 100 중량% (예를 들어 건조 중량%)의 항체를 포함함을 의미한다. 중량 백분율은 조성물 내의 단백질의 총 중량에 대한 또는 조성물 내의 항체의 총 중량에 대한 것일 수 있다. 순도는 당업자에게 명백한 기술, 예를 들어 SDS-PAGE에 의해 결정할 수 있다.
용어 "단리된"은 그의 천연 생성 환경에서 또는 그의 생산 환경에서, 또는 둘 모두에서 발견되는 항체에 통상 수반되거나 상기 항체와 상호작용하는 성분이 실질적으로 또는 본질적으로 존재하지 않는 항체를 의미한다. 단리된 항체 제제는 약 30 중량% (예를 들어 건조 중량%) 미만, 약 25 중량% 미만, 약 20 중량% 미만, 약 15 중량% 미만, 약 10 중량% 미만, 약 5 중량% 미만, 약 4 중량% 미만, 약 3 중량% 미만, 약 2 중량% 미만 또는 약 1 중량% 미만의 오염 단백질을 갖는다.
용어 "항체"는 당업자에 의해 항체로 인식되는 임의의 거대분자를 의미한다. 항체는 결합을 포함하는 공통적인 특성 및 당업자에 의해 인식되는 임의의 이뮤노글로불린 유전자에 의해 코딩될 수 있는 폴리펩티드 쇄에 실질적으로 동일한 적어도 하나의 폴리펩티드 쇄를 공유한다. 이뮤노글로불린 유전자는 κ, λ, α, γ (IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4), δ, ε 및 μ 불변 영역 유전자, 및 이뮤노글로불린 가변 영역 유전자를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 이 용어는 전장 항체 및 당업자에 의해 인식되는 항체 단편, 및 그의 변이체를 포함한다. 이 용어는 글리코실화된 및 비글리코실화된 항체를 추가로 포함한다.
용어 "항체 단편"은 전장 형태 이외의 다른 항체의 임의의 형태를 의미한다. 본원에서 항체 단편은 전장 항체 및 조작된 항체 내에 존재하는 보다 작은 성분인 항체를 포함한다. 항체 단편은 Fv, Fc, Fab, 및 (Fab')2, 단일쇄 Fv (scFv), 디아바디 (diabody), 트리아바디 (triabody), 테트라바디 (tetrabody), 이기능성 하이브리드 항체, CDR1, CDR2, CDR3, CDR의 조합, 가변 영역, 프레임워크 영역, 불변 영역 등을 포함하고 이로 제한되지 않는다 ([Maynard & Georgiou, 2000, Annu. Rev. Biomed. Eng. 2:339-76]; [Hudson, 1998, Curr. Opin. Biotechnol. 9:395-402]).
용어 "이뮤노글로불린 (Ig)"은 실질적으로 이뮤노글로불린 유전자 중의 하나에 의해 코딩되는 하나 이상의 폴리펩티드로 이루어진 단백질, 또는 이와 아미노산 서열이 실질적으로 동일한 단백질을 의미한다. 이뮤노글로불린은 항체를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 이뮤노글로불린은 전장 항체, 항체 단편, 및 VH, Cγ1, Cγ2, Cγ3, VL, 및 CL을 포함하고 이로 제한되지 않는 개별적인 이뮤노글로불린 도메인을 포함하고 이로 제한되지 않는 많은 구조적 형태를 가질 수 있다.
용어 "이뮤노글로불린 (Ig) 도메인"은 이뮤노글로불린 유전자에 의해 실질적으로 코딩되는 폴리펩티드로 이루어진 단백질 도메인을 의미한다. Ig 도메인은 VH, Cγ1, Cγ2, Cγ3, VL, 및 CL을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
용어 항체의 "가변 영역"은 VH 이뮤노글로불린 도메인, VL 이뮤노글로불린 도메인, 또는 VH 및 VL 이뮤노글로불린 도메인으로 이루어진 폴리펩티드 또는 폴리펩티드들을 의미한다. 가변 영역은 별개로, Fv 단편으로서, scFv 단편으로서, 보다 큰 항체 단편의 맥락에서의 상기 영역으로서, 또는 전장 항체 또는 대체적인 비-항체 스캐폴드 (scaffold) 분자의 맥락에서의 상기 영역으로서 상기 또는 이들 폴리펩티드를 의미할 수 있다.
용어 "가변"은 가변 도메인의 특정 부분이 항체 사이에서 서열이 광범하게 상이하고 그의 특정 항원에 대한 각각의 특정 항체의 결합 특이성을 책임진다는 사실을 의미한다. 그러나, 변동성은 항체의 가변 도메인을 통해 균일하게 분포하지 않는다. 이것은 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 둘 모두에서 상보성 결정 영역 (CDR)으로 불리는 3개의 절편에 집중된다. 가변 도메인의 보다 고도로 보존된 부분은 프레임워크 영역 (FR)으로 불린다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각 4개의 FR 영역을 포함하고, 이들은 β-시트 구조를 연결하고 일부 경우에 이 구조의 일부를 형성하는 3 또는 4개의 CDR에 의해 연결된 β-시트 입체형태를 주로 취한다. 각각의 쇄 내의 CDR은 FR 영역과 매우 근접하여 함께 유지되고, 다른 쇄로부터의 CDR과 함께 항체의 항원 결합 부위의 형성에 기여하다 ([Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)] 참조).
불변 도메인은 일반적으로 항체를 항원에 결합시킬 때 직접 관여하지 않지만, 다양한 이펙터 기능을 보인다. 그의 중쇄의 불변 영역의 아미노산 서열에 따라, 항체 또는 이뮤노글로불린은 상이한 부류로 지정될 수 있다. IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM의 5개의 주요 이뮤노글로불린 부류가 존재하고, 이 중 몇 개는다시 하위부류 (이소형), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4; IgA1 및 IgA2로 나뉠 수 있다. 이뮤노글로불린의 상이한 부류에 상응하는 중쇄 불변 영역은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 불린다. 다양한 인간 이뮤노글로불린 부류 중에서, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgM만이 보체를 활성화하는 것으로 알려져 있다.
용어 "변이체 단백질 서열"은 또 다른 유사한 단백질 서열과 아미노산 동일성이 상이한 하나 이상의 잔기를 갖는 단백질 서열을 의미한다. 상기 유사한 단백질 서열은 천연 야생형 단백질 서열, 또는 야생형 서열의 또 다른 변이체일 수 있다. 변이체는 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환을 갖는 단백질을 포함한다. 변이체는 또한 하나 이상의 번역후 변형된 아미노산을 갖는 단백질을 포함한다.
용어 "모 항체"는 본원에서 제시되는 설명에 따라 변형되는, 당업자에게 알려진 항체를 의미한다. 변형은 물리적이고, 즉, 모 항체의 하나 이상의 아미노산을 화학적으로 또는 생화학적으로 교체하거나 변형하여 본 명세서의 범위 내의 항체를 생성할 수 있다. 변형은 또한 개념적일 수 있고, 즉, 본 설명에 따라 하나 이상의 부위-특이적 비-천연 아미노산을 포함하는 항체를 설계하기 위해 모 항체의 하나 이상의 폴리펩티드 쇄의 서열을 사용할 수 있다. 모 항체은 천연 생성 항체 또는 실험에서 설계되거나 개발된 항체일 수 있다. 모 항체는 또한 인공 또는 조작된 항체, 예를 들어, 키메릭 (chimeric) 또는 인간화 항체일 수 있다.
용어 "보존적으로 변형된 변이체"는 아미노산 서열의 보존적 치환에 의해 관련 항체와 상이한 항체를 의미한다. 당업자는 코딩되는 서열 내의 단일 아미노산 또는 작은 비율의 아미노산을 변경하거나, 부가하거나 결실시키는 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질 서열에 대한 개개의 치환, 결실 또는 부가가 "보존적으로 변형된 변이체" (변경이 아미노산을 화학적으로 유사한 아미노산으로 치환하는)임을 인식할 것이다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제시하는 보존적 치환 표는 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 보존적으로 변형된 변이체는 본 발명의 다형 (polymorphic) 변이체, 종간 상동체, 및 대립유전자에 추가적인 것이고, 이들을 배제하지 않는다.
하기 8개의 군은 각각 서로에 대해 보존적 치환인 아미노산을 함유한다:
1) 알라닌 (A), 글리신 (G);
2) 아스파르트산 (D), 글루탐산 (E);
3) 아스파라긴 (N), 글루타민 (Q);
4) 아르기닌 (R), 리신 (K), 히스티딘 (H);
5) 이소류신 (I), 류신 (L), 메티오닌 (M), 발린 (V);
6) 페닐알라닌 (F), 티로신 (Y), 트립토판 (W);
7) 세린 (S), 트레오닌 (T); 및
8) 시스테인 (C), 메티오닌 (M).
(예를 들어, 문헌 [Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W H Freeman & Co.; 2nd edition (December 1993)] 참조).
2 이상의 폴리펩티드 서열의 측면에서 용어 "동일한" 또는 "동일성"은 동일한 2 이상의 서열 또는 하위서열을 의미한다. 서열은 하기 서열 비교 알고리즘 중의 하나를 사용하여 또는 수동 정렬 및 시각적 조사에 의해 측정시에 비교 창 또는 지정된 영역에 걸쳐 최대 상응도로 비교 및 정렬될 때 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 비율 (즉, 특정된 영역에 걸쳐 약 60% 동일성, 임의로 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 또는 약 95% 동일성)을 갖는다면 "실질적으로 동일한" 것이다. 동일성은 적어도 약 50개 아미노산 또는 뉴클레오티드 길이의 영역에 걸쳐, 또는 75-100개 아미노산 또는 뉴클레오티드 길이의 영역에 걸쳐, 또는, 특정되지 않은 경우 전체 서열 또는 폴리펩티드에 걸쳐 존재할 수 있다. 항체의 경우에, 동일성은 가변 CDR 외부에서 측정될 수 있다. 비교를 위한 서열의 최적 정렬은 국소 상동성 알고리즘 (Smith and Waterman (1970) Adv. Appl. Math. 2:482c), 상동성 정렬 알고리즘 (Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443), 유사성 검색 방법 (Pearson and Lipman (1988) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444), 이들 알고리즘의 컴퓨터에 의한 실행 (위스콘신 제네틱스 소프트웨어 패키지 (Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 미국 위스콘신주 매디슨 사이언스 드라이브 575) 내의 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA; 또는 수동 정렬 및 시각적 조사 (예를 들어, [Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995 supplement)] 참조)를 포함하고 이로 제한되지 않는 방법에 의해 수행될 수 있다.
서열 동일성 및 서열 유사성 비율을 결정하기 위해 적합한 알고리즘의 예는 문헌 [Altschul et al. (1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402], 및 [Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410]에 각각 설명된 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘을 포함한다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 내셔널 센터 포 바이오테크놀로지 인포메이션 (National Center for Biotechnology Information)을 통해 공개적으로 이용가능하다. BLAST 알고리즘 파리미터 W, T, 및 X는 정렬의 감도 및 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램 (뉴클레오티드 서열에 대한)은 디폴트로서 단어 길이 (W) 11, 예상치 (E) 10, M=5, N=-4 및 두 가닥의 비교를 사용한다. 아미노산 서열에 대해, BLASTP 프로그램은 디폴트로서 단어 길이 3, 및 예상치 (E) 10, 및 BLOSUM62 채점 매트릭스 (scoring matrix) (Henikoff and Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915) 정렬 (B) 50, 예상치 (E) 10, M=5, N=-4, 및 두 가닥의 비교를 사용한다. BLAST 알고리즘은 일반적으로 "낮은 복합도" 필터를 차단한 상태에서 수행한다.
BLAST 알고리즘은 또한 두 서열 사이의 유사성에 대한 통계 분석을 수행한다 (예를 들어, 문헌 [Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787] 참조). BLAST 알고리즘에 의해 제시되는 유사성의 한 척도는 최소 총 확률 (smallest sum probability) (P(N))이고, 이것은 2개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 사이의 일치가 우연히 발생할 확률의 지표를 제공한다. 예를 들어, 핵산은 참조 핵산에 대해 시험 핵산의 비교시에 최소 총 확률이 약 0.2 미만, 보다 바람직하게는 약 0.01 미만, 및 가장 바람직하게는 약 0.001 미만일 경우 참조 서열에 유사한 것으로 간주된다.
용어 "아미노산"은 천연 생성 및 비-천연 생성 아미노산, 및 이미노산, 예컨대 프롤린, 천연 생성 아미노산에 유사한 방식으로 기능을 하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체를 의미한다.
천연적으로 코딩되는 아미노산은 당업자에게 알려진 단백질 생성 (proteinogenic) 아미노산이다. 아미노산은 20개의 통상적인 아미노산 (알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신, 및 발린) 및 덜 통상적인 피롤리신 및 셀레노시스테인을 포함한다. 천연적으로 코딩되는 아미노산은 22개의 천연 생성 아미노산의 번역후 변이체, 예컨대 프레닐화 아미노산, 이소프레닐화 아미노산, 미리스토일화 아미노산, 팔미토일화 아미노산, N-연결된 글리코실화된 아미노산, O-연결된 글리코실화된 아미노산, 인산화된 아미노산 및 아실화 아미노산을 포함한다.
용어 "비-천연 아미노산"은 단백질 생성 아미노산이 아닌 아미노산 또는 그의 번역후 변형된 변이체를 의미한다. 특히, 이 용어는 20개의 통상적인 아미노산 또는 피롤리신 또는 셀레노시스테인 중의 하나가 아닌 아미노산 또는 그의 번역후 변형된 변이체를 의미한다.
"기능성 방출 인자 1 (RF1) 단백질"은 야생형 또는 비변형된 RF1 단백질에 동일한 또는 실질적으로 유사한 활성을 보유하는 RF1을 의미한다. 기능성 RF1 활성은 예를 들어 변형된 RF1 단백질을 발현하는 박테리아의 성장 속도를 측정하고, 성장 속도를 야생형 또는 비변형된 RF1을 발현하는 박테리아와 비교함으로써 시험할 수 있다. 기능성 RF1 활성은 또한 예를 들어 표적 단백질을 코딩하는 mRNA 내의 특정 위치에서 nnAA의 오르토고날 (orthogonal) tRNA 통합을 감소시켜 조기 쇄 종결의 양을 증가시키는 (즉, 말단절단된 단백질의 양을 증가시키는) 변형된 RF1 단백질의 능력에 의해 시험할 수 있다.
"약화된 방출 인자 1 (RF1) 단백질"은 야생형 또는 비변형된 RF1 단백질에 비해 감소된 활성을 보유하는 변형된 RF1을 의미한다. RF1 활성은 예를 들어 변형된 RF1 단백질을 발현하는 박테리아의 성장 속도를 측정하고, 성장 속도를 야생형 또는 비변형된 RF1을 발현하는 박테리아와 비교함으로써 시험할 수 있다. RF1 활성은 또한 예를 들어 표적 단백질을 코딩하는 mRNA 내의 특정 위치에서 nnAA의 오르토고날 tRNA 통합을 감소시켜 조기 쇄 종결의 양을 증가시키는 (즉, 말단절단된 단백질의 양을 증가시키는) 변형된 RF1 단백질의 능력에 의해 시험할 수 있다. 일부 실시양태에서, 약화된 RF1 단백질은 전사 변형을 포함할 수 있고; 예를 들어 RF1 단백질 (야생형 또는 변형된)의 발현 수준은 약화를 달성하기 위해 감소될 수 있다. 감소는 또한 RNAi 기술을 사용하여 달성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 약화된 RF1 단백질은 번역 변형을 포함하고; 예를 들어, 합성된 RF1 단백질 (야생형 또는 변형된)의 양은 예를 들어 프로테아제-특이적 서열의 RF1 서열 내로의 삽입을 통해 단백질이 프로테아제에 의해 소화되는 속도를 증가시킴으로써, 약화를 달성하기 위해 감소될 수 있다.
항체
적어도 하나의 폴리펩티드 쇄의 아미노산 서열 내의 부위-특이적 위치에 하나 이상의 비-천연 아미노산 잔기를 포함하는 항체가 본원에서 제공된다.
항체는 당업자에 의해 인식되는 임의의 항체, 즉 모 항체와 높은 서열 동일성을 공유할 수 있다. 특정 실시양태에서, 항체의 아미노산 서열은 부위-특이적 위치에서 비-천연 아미노산 이외의 다른 모 항체의 아미노산 서열과 동일하다. 추가의 실시양태에서, 본원에서 제공되는 항체는 부위-특이적 위치에서의 하나 이상의 비-천연 아미노산 이외에 모 항체에 비해 하나 이상의 삽입, 결실 또는 돌연변이를 가질 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 항체는 당업자에 의해 항체로 인식되는 한 특유한 1차 서열을 가질 수 있다.
항체는 일반적으로 다중 폴리펩티드 쇄를 포함하는 단백질이다. 특정 실시양태에서, 항체는 2개의 동일한 경쇄 (L) 및 2개의 동일한 중쇄 (H)를 포함하는 이종사량체이다. 각각의 경쇄는 하나의 공유 디술피드 결합에 의해 중쇄에 연결될 수 있다. 각각의 중쇄는 하나의 공유 디술피드 결합에 의해 다른 중쇄에 연결될 수 있다. 각각의 중쇄 및 각각의 경쇄는 또한 하나 이상의 쇄내 디술피드 결합을 갖는다. 당업자에게 알려진 바와 같이, 각각의 중쇄는 일반적으로 가변 도메인 (VH), 이어서 많은 불변 도메인을 포함한다. 각각의 경쇄는 일반적으로 하나의 말단에 가변 도메인 (VL) 및 불변 도메인을 포함한다. 당업자에게 알려진 바와 같이, 항체는 일반적으로 그의 표적 분자, 즉 항원에 대해 선택적인 친화도를 갖는다.
본원에서 제공되는 항체는 당업자에게 알려진 임의의 항체 형태를 가질 수 있다. 항체는 전장, 또는 단편일 수 있다. 예시적인 전장 항체는 IgA, IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM 등을 포함한다. 예시적인 단편은 Fv, Fab, Fc, sFv 등을 포함한다.
본원에서 제공되는 항체는 적어도 하나의 비-천연 아미노산을 포함한다. 비-천연 아미노산은 당업자에게 알려진 임의의 비-천연 아미노산일 수 있다. 예시적인 비-천연 아미노산은 아래 섹션에서 설명된다.
비-천연 아미노산은 항체의 폴리펩티드 쇄 내의 선택된 위치에 존재한다. 이들 위치는 비-천연 아미노산으로의 치환을 위한 최적 부위를 제공하는 것으로 확인되었다. 각각의 부위는 항체를 생성하기 위한 최적 구조, 기능 및/또는 방법을 갖는 비-천연 아미노산을 보유할 수 있다.
특정 실시양태에서, 치환을 위한 부위-특이적 위치는 안정한 항체를 제공한다. 안정성은 당업자에게 명백한 임의의 기술에 의해 측정될 수 있다.
특정 실시양태에서, 치환을 위한 부위-특이적 위치는 최적 기능성 특성을 갖는 항체를 제공한다. 예를 들어, 항체는 부위-특이적 비-천연 아미노산이 없는 항체에 비해 그의 표적 항원에 대한 결합 친화도를 거의 또는 전혀 상실하지 않을 수 있다. 특정 실시양태에서, 항체는 부위-특이적 비-천연 아미노산이 없는 항체에 비해 향상된 결합을 보일 수 있다.
특정 실시양태에서, 치환을 위한 부위-특이적 위치는 유리하게 제조될 수 있는 항체를 제공한다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 항체는 아래에서 논의되는 그의 합성 방법에서 유리한 특성을 보인다. 특정 실시양태에서, 항체는 부위-특이적 비-천연 아미노산이 없는 항체에 비해 생산 수율을 거의 또는 전혀 상실하지 않을 수 있다. 특정 실시양태에서, 항체는 부위-특이적 비-천연 아미노산이 없는 항체에 비해 향상된 생산 수율을 보일 수 있다. 특정 실시양태에서, 항체는 부위-특이적 비-천연 아미노산이 없는 항체에 비해 아래에서 설명되는 tRNA 억제를 거의 또는 전혀 상실하지 않을 수 있다. 특정 실시양태에서, 항체는 부위-특이적 비-천연 아미노산이 없는 항체에 비해 아래에서 설명되는 향상된 tRNA 억제를 보일 수 있다.
특정 실시양태에서, 치환을 위한 부위-특이적 위치는 유리한 용해도를 갖는 항체를 제공한다. 특정 실시양태에서, 항체는 부위-특이적 비-천연 아미노산이 없는 항체에 비해 용해도를 거의 또는 전혀 상실하지 않을 수 있다. 특정 실시양태에서, 항체는 부위-특이적 비-천연 아미노산이 없는 항체에 비해 향상된 용해도를 보일 수 있다.
특정 실시양태에서, 치환을 위한 부위-특이적 위치는 유리한 발현을 보이는 항체를 제공한다. 특정 실시양태에서, 항체는 부위-특이적 비-천연 아미노산이 없는 항체에 비해 발현을 거의 또는 전혀 상실하지 않을 수 있다. 특정 실시양태에서, 항체는 부위-특이적 비-천연 아미노산이 없는 항체에 비해 향상된 발현을 보일 수 있다.
특정 실시양태에서, 치환을 위한 부위-특이적 위치는 유리한 폴딩 (folding)을 갖는 항체를 제공한다. 특정 실시양태에서, 항체는 부위-특이적 비-천연 아미노산이 없는 항체에 비해 적절한 폴딩을 거의 또는 전혀 상실하지 않을 수 있다. 특정 실시양태에서, 항체는 부위-특이적 비-천연 아미노산이 없는 항체에 비해 향상된 폴딩을 보일 수 있다.
특정 실시양태에서, 치환을 위한 부위-특이적 위치는 유리한 접합이 가능한 항체를 제공한다. 아래에서 설명되는 바와 같이, 몇 개의 비-천연 아미노산은 직접 또는 링커를 통해 제2 작용제에 대한 항체의 접합을 용이하게 하는 측쇄 또는 기능성 기를 갖는다. 특정 실시양태에서, 항체는 다른 위치에 동일한 또는 다른 비-천연 아미노산이 없는 항체에 비해 향상된 접합 효율을 보일 수 있다. 특정 실시양태에서, 항체는 다른 위치에 동일한 또는 다른 비-천연 아미노산이 없는 항체에 비해 향상된 접합 수율을 보일 수 있다. 특정 실시양태에서, 항체는 다른 위치에 동일한 또는 다른 비-천연 아미노산이 없는 항체에 비해 향상된 접합 특이성을 보일 수 있다.
하나 이상의 비-천연 아미노산은 항체의 적어도 하나의 폴리펩티드 쇄 내의 선택된 부위-특이적 위치에 존재한다. 폴리펩티드 쇄는 경쇄 또는 중쇄를 포함하고 이로 제한되지 않는 항체의 임의의 폴리펩티드 쇄일 수 있다. 부위-특이적 위치는 임의의 가변 도메인 및 임의의 불변 도메인을 포함하는 항체의 임의의 도메인 내에 존재할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 항체는 부위-특이적 위치에 하나의 비-천연 아미노산을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 항체는 부위-특이적 위치에 2개의 비-천연 아미노산을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 항체는 부위-특이적 위치에 3개의 비-천연 아미노산을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 항체는 부위-특이적 위치에 3개 초과의 비-천연 아미노산을 포함한다.
치환을 위한 부위-특이적 위치는 당업자에게 알려진 임의의 항체 명명 시스템을 사용하여 설명할 수 있다. 카바트(Kabat) 넘버링 시스템에서, 이들 위치는 중쇄 잔기 H005, H023, H042, H065, H074, H084, H118, H119, H132, H134, H135, H136, H137, H138, H139, H155, H160, H162, H165, H172, H174, H176, H177, H191, H194, H219, H238, H239, H241, H243, H246, H262, H264, H265, H267, H268, H269, H270, H271, H272, H274, H275, H278, H280, H281, H282, H283, H286, H289, H292, H293, H294, H295, H296, H297, H298, H299, H300, H301, H303, H305, H317, H320, H324, H326, H327, H329, H330, H332, H333, H334, H335, H337, H339, H340, H342, H344, H355, H356, H358, H359, H360, H375, H383, H384, H386, H389, H392, H398, H404, H420, H421, H436 및 H438이다. 다시 말하면, 카바트 잔기 H005, H023, H042, H065, H074, H084, H118, H119, H132, H134, H135, H136, H137, H138, H139, H155, H160, H162, H165, H172, H174, H176, H177, H191, H194, H219, H238, H239, H241, H243, H246, H262, H264, H265, H267, H268, H269, H270, H271, H272, H274, H275, H278, H280, H281, H282, H283, H286, H289, H292, H293, H294, H295, H296, H297, H298, H299, H300, H301, H303, H305, H317, H320, H324, H326, H327, H329, H330, H332, H333, H334, H335, H337, H339, H340, H342, H344, H355, H356, H358, H359, H360, H375, H383, H384, H386, H389, H392, H398, H404, H420, H421, H436 및 H438로부터 선택된 하나 이상의 위치에 하나 이상의 비-천연 아미노산을 포함하는 항체가 본원에서 제공된다.
특정 실시양태에서, 카바트 잔기 H005, H023, H074, H084, H118, H119, H132, H134, H135, H136, H137, H139, H160, H162, H165, H172, H191, H194, H239, H241, H246, H267, H268, H269, H270, H271, H272, H274, H275, H280, H281, H282, H283, H286, H289, H292, H293, H294, H295, H296, H297, H298, H299, H300, H301, H303, H305, H317, H320, H324, H326, H327, H329, H330, H332, H333, H334, H335, H337, H339, H340, H342, H344, H355, H359, H375, H386, H389, H392, H398, H404, H420, H421 및 H438로부터 선택된 하나 이상의 위치에 하나 이상의 비-천연 아미노산을 포함하는 항체가 본원에서 제공된다.
특정 실시양태에서, 카바트 잔기 H005, H023, H084, H118, H119, H132, H134, H136, H137, H160, H162, H172, H239, H241, H267, H269, H270, H271, H272, H282, H286, H292, H293, H296, H298, H329, H330, H334, H335, H340, H355, H359, H386, H389, H404, H420, H421, H438 및 H342로부터 선택된 하나 이상의 위치에 하나 이상의 비-천연 아미노산을 포함하는 항체가 본원에서 제공된다.
특정 실시양태에서, 카바트 잔기 H005, H084, H118, H132, H136, H239, H293, H334, H355, H359 및 H389로부터 선택된 하나 이상의 위치에 하나 이상의 비-천연 아미노산을 포함하는 항체가 본원에서 제공된다.
특정 실시양태에서, 카바트 잔기 H023, H074, H119, H134, H135, H137, H139, H160, H162, H165, H172, H191, H194, H241, H246, H267, H268, H269, H270, H271, H272, H274, H275, H280, H281, H282, H283, H286, H289, H292, H294, H295, H296, H297, H298, H299, H300, H301, H303, H305, H317, H320, H324, H326, H327, H329, H330, H332, H333, H335, H337, H339, H342, H344, H355, H375, H386, H392, H398, H404, H420, H421, H340 및 H438로부터 선택된 하나 이상의 위치에 하나 이상의 비-천연 아미노산을 포함하는 항체가 본원에서 제공된다.
특정 실시양태에서, 카바트 잔기 H042, H065, H138, H155, H174, H176, H177, H219, H238, H243, H262, H264, H265, H278, H342, H356, H358, H360, H383, H384, H404 및 H436으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 하나 이상의 비-천연 아미노산을 포함하는 항체가 본원에서 제공된다.
특정 실시양태에서, H292-H301, H303 및 H305에 상응하는 카바트 잔기로부터 선택된 하나 이상의 위치에 하나 이상의 비-천연 아미노산을 포함하는 항체가 본원에서 제공된다.
코티아(Chothia) 넘버링 시스템에서, 이들 위치는 중쇄 잔기 H005, H023, H042, H065, H074, H084, H118, H119, H132, H134, H135, H136, H137, H138, H139, H155, H160, H162, H165, H172, H174, H176, H177, H191, H194, H219, H238, H239, H241, H243, H246, H262, H264, H265, H267, H268, H269, H270, H271, H272, H274, H275, H278, H280, H281, H282, H283, H286, H289, H292, H293, H294, H295, H296, H297, H298, H299, H300, H301, H303, H305, H317, H320, H324, H326, H327, H329, H330, H332, H333, H334, H335, H337, H339, H340, H342, H344, H355, H356, H358, H359, H360, H375, H383, H384, H386, H389, H392, H398, H404, H420, H421, H436 및 H438이다. 다시 말하면, 코티아 잔기 H005, H023, H042, H065, H074, H084, H118, H119, H132, H134, H135, H136, H137, H138, H139, H155, H160, H162, H165, H172, H174, H176, H177, H191, H194, H219, H238, H239, H241, H243, H246, H262, H264, H265, H267, H268, H269, H270, H271, H272, H274, H275, H278, H280, H281, H282, H283, H286, H289, H292, H293, H294, H295, H296, H297, H298, H299, H300, H301, H303, H305, H317, H320, H324, H326, H327, H329, H330, H332, H333, H334, H335, H337, H339, H340, H342, H344, H355, H356, H358, H359, H360, H375, H383, H384, H386, H389, H392, H398, H404, H420, H421, H436 및 H438로부터 선택된 하나 이상의 위치에 하나 이상의 비-천연 아미노산을 포함하는 항체가 본원에서 제공된다.
특정 실시양태에서, 코티아 잔기 H005, H023, H074, H084, H118, H119, H132, H134, H135, H136, H137, H139, H160, H162, H165, H172, H191, H194, H239, H241, H246, H267, H268, H269, H270, H271, H272, H274, H275, H280, H281, H282, H283, H286, H289, H292, H293, H294, H295, H296, H297, H298, H299, H300, H301, H303, H305, H317, H320, H324, H326, H327, H329, H330, H332, H333, H334, H335, H337, H339, H340, H342, H344, H355, H359, H375, H386, H389, H392, H398, H404, H420, H421 및 H438로부터 선택된 하나 이상의 위치에 하나 이상의 비-천연 아미노산을 포함하는 항체가 본원에서 제공된다.
특정 실시양태에서, 코티아 잔기 H005, H084, H118, H132, H136, H239, H293, H334, H342, H355, H359, H389 및 H404로부터 선택된 하나 이상의 위치에 하나 이상의 비-천연 아미노산을 포함하는 항체가 본원에서 제공된다.
특정 실시양태에서, H292-H301, H303 및 H305에 상응하는 카바트 잔기로부터 선택된 하나 이상의 위치에 하나 이상의 비-천연 아미노산을 포함하는 항체가 본원에서 제공된다.
특정 실시양태에서, 코티아 잔기 H023, H074, H119, H134, H135, H137, H139, H160, H162, H165, H172, H191, H194, H241, H246, H267, H268, H269, H270, H271, H272, H274, H275, H280, H281, H282, H283, H286, H289, H292, H294, H295, H296, H297, H298, H299, H300, H301, H303, H305, H317, H320, H324, H326, H327, H329, H330, H332, H333, H335, H337, H339, H342, H344, H355, H375, H386, H392, H398, H420, H421, H340, H404 및 H438로부터 선택된 하나 이상의 위치에 하나 이상의 비-천연 아미노산을 포함하는 항체가 본원에서 제공된다.
특정 실시양태에서, 코티아 잔기 H042, H065, H138, H155, H174, H176, H177, H219, H238, H243, H262, H264, H265, H278, H342, H356, H358, H360, H383, H384, H404 및 H436으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 하나 이상의 비-천연 아미노산을 포함하는 항체가 본원에서 제공된다.
특정 실시양태에서, 카바트 또는 코티아 넘버링 방식에 따른 잔기 H005, H023, H084, H118, H119, H132, H134, H136, H137, H160, H162, H172, H239, H241, H267, H269, H270, H271, H272, H282, H286, H292, H293, H296, H298, H329, H330, H334, H335, H340, H355, H359, H386, H389, H404, H420, H421, H438 및 H342로부터 선택된 하나 이상의 위치에 하나 이상의 비-천연 아미노산을 포함하는 항체가 본원에서 제공된다.
특정 실시양태에서, 카바트 또는 코티아 넘버링 방식에 따른 잔기 L043, L049, L056, L057, L060, L067, L068, L109, L112, L114, L144, L153, L156, L157, L168, L184, L202, L203 및 L206으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 하나 이상의 비-천연 아미노산을 포함하는 항체가 본원에서 제공된다. 특정 실시양태에서, 카바트 또는 코티아 넘버링 방식에 따른 잔기 L043, L049, L056, L057, L060, L067, L068, L109, L112, L114, L144, L153, L156, L168, L184, L202 및 L203으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 하나 이상의 비-천연 아미노산을 포함하는 항체가 본원에서 제공된다. 특정 실시양태에서, 카바트 또는 코티아 넘버링 방식에 따른 잔기 L043, L049, L056, L057, L060, L067, L068, L109, L144, L153, L156, L184, L202 및 L203으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 하나 이상의 비-천연 아미노산을 포함하는 항체가 본원에서 제공된다. 특정 실시양태에서, 카바트 또는 코티아 넘버링 방식에 따른 잔기 L049, L056, L057, L060, L067, L109, L153, L202 및 L203으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 하나 이상의 비-천연 아미노산을 포함하는 항체가 본원에서 제공된다.
특정 실시양태에서, 카바트 또는 코티아 넘버링 방식에 따른 잔기 H023, H084, H118, H119, H135, H136, H137, H160, H161, H162, H164, H195, H197, H219, H282, H289, H296, H330, H335, H361, H400, H404, H422, H440, H260, H267, H268, H272, H274, H292, H293, H297, H298, H303, H305, H332, H333, H334, H340, H341, H342, H343, H355, H362, H386, H392, H404, H424, H438, H442 및 H443으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 하나 이상의 비-천연 아미노산을 포함하는 항체가 본원에서 제공된다. 특정 실시양태에서, 카바트 또는 코티아 넘버링 방식에 따른 잔기 H023, H084, H118, H119, H135, H136, H137, H160, H161, H162, H164, H195, H197, H219, H282, H296, H335, H361, H422, H440, H267, H272, H274, H293, H297, H298, H303, H305, H334, H340, H341, H342, H343, H355, H362, H392, H404, H424, H438, H442 및 H443으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 하나 이상의 비-천연 아미노산을 포함하는 항체가 본원에서 제공된다. 특정 실시양태에서, 카바트 또는 코티아 넘버링 방식에 따른 잔기 H023, H084, H118, H119, H135, H136, H137, H160, H161, H162, H195, H197, H219, H282, H296, H422, H440, H267, H272, H293, H297, H298, H303, H305, H334, H340, H341, H342, H355, H392, H404, H424, H438, H442 및 H443으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 하나 이상의 비-천연 아미노산을 포함하는 항체가 본원에서 제공된다. 특정 실시양태에서, 카바트 또는 코티아 넘버링 방식에 따른 잔기 H023, H084, H118, H119, H135, H136, H160, H162, H195, H219, H282, H296, H267, H293, H297, H298, H303, H305, H334, H340, H341, H392 및 H438, H442로부터 선택된 하나 이상의 위치에 하나 이상의 비-천연 아미노산을 포함하는 항체가 본원에서 제공된다.
특정 실시양태에서, 카바트 또는 코티아 넘버링 방식에 따른 잔기 H042, H003, H007, H014, H016, H019, H025, H040, H043, H051, H052, H053, H056, H070, H082A, H098, H100, H110, H112, H121, H180, H184, H190, H192, H214, H216, H221, H222, H225, H227, H230, H231, H232 및 H236으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 하나 이상의 비-천연 아미노산을 포함하는 항체가 본원에서 제공된다. 특정 실시양태에서, 카바트 또는 코티아 넘버링 방식에 따른 잔기 H042, H003, H007, H014, H016, H019, H025, H040, H043, H052, H053, H056, H070, H082A, H100, H110, H112, H121, H180, H190, H192, H214, H216, H221, H222, H225, H227, H230, H231, H232 및 H236으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 하나 이상의 비-천연 아미노산을 포함하는 항체가 본원에서 제공된다. 특정 실시양태에서, 카바트 또는 코티아 넘버링 방식에 따른 잔기 H042, H003, H007, H014, H016, H019, H025, H040, H043, H052, H070, H082A, H100, H110, H112, H121, H180, H190, H192, H214, H216, H221, H222, H225, H227, H230, H231, H232 및 H236으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 하나 이상의 비-천연 아미노산을 포함하는 항체가 본원에서 제공된다. 특정 실시양태에서, 카바트 또는 코티아 넘버링 방식에 따른 잔기 H007, H014, H019, H025, H040, H043, H052, H070, H100, H110, H112, H121, H180, H214, H216, H222, H227, H230, H231, H232 및 H236으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 하나 이상의 비-천연 아미노산을 포함하는 항체가 본원에서 제공된다.
특정 실시양태에서, 카바트 또는 코티아 넘버링 방식에 따른 잔기 (-)L001, L003, L005, L007, L008, L009, L010, L016, L017, L018, L020, L022, L026, L027, L045, L058, L063, L065, L066, L070, L077, L079, L107, L138, L142, L143, L152, L171, L182, L188, L199 및 L201로부터 선택된 하나 이상의 위치에 하나 이상의 비-천연 아미노산을 포함하는 항체가 본원에서 제공된다. 특정 실시양태에서, 카바트 또는 코티아 넘버링 방식에 따른 잔기 -1, L003, L005, L007, L008, L009, L010, L016, L017, L018, L020, L022, L026, L027, L045, L058, L063, L065, L066, L070, L077, L079, L107, L142, L143, L152, L171, L182, L188, L199 및 L201로부터 선택된 하나 이상의 위치에 하나 이상의 비-천연 아미노산을 포함하는 항체가 본원에서 제공된다. 특정 실시양태에서, 카바트 또는 코티아 넘버링 방식에 따른 잔기 (-)L001, L003, L005, L007, L008, L009, L016, L017, L018, L020, L022, L026, L027, L045, L058, L063, L065, L066, L070, L077, L079, L107, L142, L152, L171, L182, L188 및 L199로부터 선택된 하나 이상의 위치에 하나 이상의 비-천연 아미노산을 포함하는 항체가 본원에서 제공된다. 특정 실시양태에서, 카바트 또는 코티아 넘버링 방식에 따른 잔기 -1, L005, L007, L008, L016, L017, L018, L020, L022, L027, L045, L058, L063, L077, L079, L107, L142, L152, L182, L188 및 L199로부터 선택된 하나 이상의 위치에 하나 이상의 비-천연 아미노산을 포함하는 항체가 본원에서 제공된다. 특정 실시양태에서, 카바트 또는 코티아 넘버링 방식에 따른 잔기 (-)L001, L016, L063 및 L199로부터 선택된 하나 이상의 위치에 하나 이상의 비-천연 아미노산을 포함하는 항체가 본원에서 제공된다.
특정 실시양태에서, 카바트 또는 코티아 넘버링 방식에 따른 잔기 H019, H025, H051, H070, H098, H110, H112, H121, H136, H180, H187, H190, H214, H216, H221 및 H222로부터 선택된 하나 이상의 위치에 하나 이상의 비-천연 아미노산을 포함하는 항체가 본원에서 제공된다.
특정 실시양태에서, 카바트 또는 코티아 넘버링 방식에 따른 잔기 (-)L001, L007, L008, L016, L022, L063, L014, L070, L138, L142, L143 및 L152로부터 선택된 하나 이상의 위치에 하나 이상의 비-천연 아미노산을 포함하는 항체가 본원에서 제공된다.
특정 실시양태에서, 카바트 또는 코티아 넘버링 방식에 따른 잔기 H019, H025, H051, H070, H077, H079, H098, H110, H112, H121, H136, H180, H187, H190, H214, H216, H221 및 H222로부터 선택된 하나 이상의 위치에 하나 이상의 비-천연 아미노산을 포함하는 항체가 본원에서 제공된다.
특정 실시양태에서, 카바트 또는 코티아 넘버링 방식에 따른 잔기 (-)L001, L007, L008, L016, L022, L063, L070, L138, L142, L143, L152 및 L201로부터 선택된 하나 이상의 위치에 하나 이상의 비-천연 아미노산을 포함하는 항체가 본원에서 제공된다.
부위-특이적 위치는 또한 참조 항체의 폴리펩티드 쇄의 아미노산 서열에 대해 확인될 수 있다. 예를 들어, 참조 중쇄의 아미노산 서열이 서열 1에 제시된다. 참조 중쇄에서, 부위-특이적 위치는 잔기 5, 23, 42, 66, 75, 88, 121, 122, 135, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 158, 163, 165, 168, 175, 177, 179, 180, 194, 197, 222, 241, 242, 244, 246, 249, 265, 267, 268, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 277, 278, 281, 283, 284, 285, 286, 289, 292, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 306, 308, 320, 323, 327, 329, 330, 332, 333, 335, 336, 337, 338, 340, 342, 343, 345, 347, 358, 359, 361, 362, 363, 378, 386, 387, 389, 392, 395, 401, 407, 423, 424, 439 및 441이다. 다시 말하면, 서열 1에 따른 대표적인 중쇄 폴리펩티드의 5, 23, 42, 66, 75, 88, 121, 122, 135, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 158, 163, 165, 168, 175, 177, 179, 180, 194, 197, 222, 241, 242, 244, 246, 249, 265, 267, 268, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 277, 278, 281, 283, 284, 285, 286, 289, 292, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 306, 308, 320, 323, 327, 329, 330, 332, 333, 335, 336, 337, 338, 340, 342, 343, 345, 347, 358, 359, 361, 362, 363, 378, 386, 387, 389, 392, 395, 401, 407, 423, 424, 439 및 441에 상응하는 것으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 하나 이상의 비-천연 아미노산을 포함하는 항체가 본원에서 제공된다.
특정 실시양태에서, 서열 1에 따른 대표적인 중쇄 폴리펩티드의 5, 23, 75, 88, 121, 122, 135, 137, 138, 139, 140, 142, 163, 165, 168, 175, 194, 197, 242, 244, 249, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 277, 278, 283, 284, 285, 286, 289, 292, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 306, 308, 320, 323, 327, 329, 330, 332, 333, 335, 336, 337, 338, 340, 342, 343, 345, 347, 358, 362, 378, 389, 392, 395, 401, 407, 423, 424 및 441에 상응하는 것으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 하나 이상의 비-천연 아미노산을 포함하는 항체가 본원에서 제공된다.
특정 실시양태에서, 서열 1에 따른 대표적인 중쇄 폴리펩티드의 5, 23, 88, 121, 122, 135, 137, 138, 139, 140, 163, 165, 168, 175, 242, 244, 270, 273, 274, 275, 285, 289, 295, 296, 299, 300, 301, 332, 333, 337, 338, 343, 345, 358, 362, 389, 407, 423, 424 및 441에 상응하는 것으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 하나 이상의 비-천연 아미노산을 포함하는 항체가 본원에서 제공된다.
특정 실시양태에서, 서열 1에 따른 대표적인 중쇄 폴리펩티드의 5, 88, 121, 135, 139, 242, 296, 337, 358, 362 및 392에 상응하는 것으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 하나 이상의 비-천연 아미노산을 포함하는 항체가 본원에서 제공된다.
특정 실시양태에서, 서열 1에 따른 대표적인 중쇄 폴리펩티드의 23, 75, 122, 137, 138, 140, 142, 163, 165, 168, 175, 194, 197, 244, 249, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 277, 278, 283, 284, 285, 286, 289, 292, 295, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 306, 308, 320, 323, 327, 329, 330, 332, 333, 335, 336, 338, 340, 342, 343, 345, 347, 358, 378, 389, 395, 401, 407, 423, 424 및 441에 상응하는 것으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 하나 이상의 비-천연 아미노산을 포함하는 항체가 본원에서 제공된다.
특정 실시양태에서, 서열 1에 따른 대표적인 중쇄 폴리펩티드의 42, 66, 141, 158, 177, 179, 180, 222, 241, 246, 265, 267, 268, 281, 359, 361, 363, 386, 387, 407 및 439에 상응하는 것으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 하나 이상의 비-천연 아미노산을 포함하는 항체가 본원에서 제공된다.
특정 실시양태에서, 서열 1에 따른 대표적인 중쇄 폴리펩티드의 292-301, 303 및 305에 상응하는 것으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 하나 이상의 비-천연 아미노산을 포함하는 항체가 본원에서 제공된다.
특정 실시양태에서, 서열 1에 따른 대표적인 중쇄 폴리펩티드의 23, 88, 121, 122, 138, 139, 140, 163, 164, 165, 167, 198, 200, 222, 285, 292, 299, 333, 338, 364, 403, 407, 425, 443, 263, 270, 271, 275, 277, 295, 296, 300, 301, 306, 308, 335, 336, 337, 343, 344, 345, 346, 358, 365, 389, 395, 407, 427, 441, 445 및 446에 상응하는 것으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 하나 이상의 비-천연 아미노산을 포함하는 항체가 본원에서 제공된다.
특정 실시양태에서, 서열 1에 따른 대표적인 중쇄 폴리펩티드의 23, 88, 121, 122, 138, 139, 140, 163, 164, 165, 167, 198, 200, 222, 285, 299, 338, 364, 425, 443, 270, 275, 277, 295, 296, 300, 301, 306, 308, 337, 343, 344, 345, 346, 358, 365, 395, 407, 427, 441, 445 및 446에 상응하는 것으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 하나 이상의 비-천연 아미노산을 포함하는 항체가 본원에서 제공된다.
특정 실시양태에서, 서열 1에 따른 대표적인 중쇄 폴리펩티드의 23, 88, 121, 122, 138, 139, 140, 163, 164, 165, 167, 198, 200, 222, 285, 299, 364, 425, 443, 270, 275, 296, 300, 301, 306, 308, 337, 343, 344, 345, 358, 365, 395, 407, 427, 441, 445 및 446에 상응하는 것으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 하나 이상의 비-천연 아미노산을 포함하는 항체가 본원에서 제공된다.
특정 실시양태에서, 서열 1에 따른 대표적인 중쇄 폴리펩티드의 23, 88, 121, 122, 138, 139, 140, 163, 164, 165, 198, 200, 222, 285, 299, 425, 443, 270, 275, 296, 300, 301, 306, 308, 337, 343, 344, 345, 358, 395, 407, 427, 441, 445 및 446에 상응하는 것으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 하나 이상의 비-천연 아미노산을 포함하는 항체가 본원에서 제공된다.
특정 실시양태에서, 서열 1에 따른 대표적인 중쇄 폴리펩티드의 23, 88, 121, 122, 138, 139, 163, 165, 198, 222, 285, 299, 270, 296, 300, 301, 306, 308, 337, 343, 344, 395, 407 및 441에 상응하는 것으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 하나 이상의 비-천연 아미노산을 포함하는 항체가 본원에서 제공된다.
특정 실시양태에서, 서열 1에 따른 대표적인 중쇄 폴리펩티드의 42, 3, 7, 14, 16, 19, 25, 40, 43, 51, 52, 54, 57, 71, 84, 102, 104, 114, 119, 124, 183, 187, 193, 195, 217, 219, 224, 225, 228, 230, 233, 234, 235 및 239에 상응하는 것으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 하나 이상의 비-천연 아미노산을 포함하는 항체가 본원에서 제공된다.
특정 실시양태에서, 서열 1에 따른 대표적인 중쇄 폴리펩티드의 42, 3, 7, 14, 16, 19, 25, 40, 43, 52, 54, 57, 71, 84, 104, 114, 119, 124, 183, 193, 195, 217, 219, 224, 225, 228, 230, 233, 234, 235 및 239에 상응하는 것으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 하나 이상의 비-천연 아미노산을 포함하는 항체가 본원에서 제공된다.
특정 실시양태에서, 서열 1에 따른 대표적인 중쇄 폴리펩티드의 7, 14, 19, 25, 40, 43, 52, 71, 104, 114, 119, 124, 183, 195, 217, 219, 230, 233, 234, 235 및 239에 상응하는 것으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 하나 이상의 비-천연 아미노산을 포함하는 항체가 본원에서 제공된다.
특정 실시양태에서, 서열 2에 따른 대표적인 경쇄 폴리펩티드의 -1, 3, 5, 7, 8, 9, 10, 16, 17, 18, 20, 22, 26, 27, 45, 58, 63, 65, 66, 70, 77, 79, 107, 138, 142, 143, 152, 171, 182, 188, 199 및 201에 상응하는 것으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 하나 이상의 비-천연 아미노산을 포함하는 항체가 본원에서 제공된다.
특정 실시양태에서, 서열 2에 따른 대표적인 경쇄 폴리펩티드의 -1, 3, 5, 7, 8, 9, 16, 17, 18, 20, 22, 26, 27, 45, 58, 63, 65, 66, 70, 77, 79, 107, 142, 143, 152, 171, 182, 188, 199 및 201에 상응하는 것으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 하나 이상의 비-천연 아미노산을 포함하는 항체가 본원에서 제공된다.
특정 실시양태에서, 서열 2에 따른 대표적인 경쇄 폴리펩티드의 -1, 3, 5, 7, 8, 9, 16, 17, 18, 20, 22, 26, 27, 45, 58, 63, 65, 66, 70, 77, 79, 107, 142, 152, 171, 182, 188 및 199에 상응하는 것으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 하나 이상의 비-천연 아미노산을 포함하는 항체가 본원에서 제공된다.
특정 실시양태에서, 서열 2에 따른 대표적인 경쇄 폴리펩티드의 -1, 5, 7, 8, 16, 17, 18, 20, 22, 27, 45, 58, 63, 77, 79, 107, 142, 152, 182, 188 및 199에 상응하는 것으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 하나 이상의 비-천연 아미노산을 포함하는 항체가 본원에서 제공된다.
특정 실시양태에서, 서열 2에 따른 대표적인 경쇄 폴리펩티드의 -1, 16, 63 및 199에 상응하는 것으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 하나 이상의 비-천연 아미노산을 포함하는 항체가 본원에서 제공된다.
특정 실시양태에서, 서열 1에 따른 대표적인 중쇄 폴리펩티드의 19, 25, 51, 71, 102, 114, 119, 124, 139, 183, 187, 193, 217, 219, 224 및 225에 상응하는 것으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 하나 이상의 비-천연 아미노산을 포함하는 항체가 본원에서 제공된다.
특정 실시양태에서, 서열 2에 따른 대표적인 경쇄 폴리펩티드의 -1, 7, 8, 16, 22, 63, 14, 70, 138, 142, 143 및 152에 상응하는 것으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 하나 이상의 비-천연 아미노산을 포함하는 항체가 본원에서 제공된다.
특정 실시양태에서, 서열 1에 따른 대표적인 중쇄 폴리펩티드의 19, 25, 51, 71, 78, 80, 102, 114, 119, 124, 139, 183, 187, 193, 217, 219, 224 및 225에 상응하는 것으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 하나 이상의 비-천연 아미노산을 포함하는 항체가 본원에서 제공된다.
특정 실시양태에서, 서열 2에 따른 대표적인 경쇄 폴리펩티드의 -1, 7, 8, 16, 22, 63, 70, 138, 142, 143, 152 및 201에 상응하는 것으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 하나 이상의 비-천연 아미노산을 포함하는 항체가 본원에서 제공된다.
특정 실시양태에서, 서열 2에 따른 대표적인 경쇄 폴리펩티드의 43, 49, 56, 57, 60, 67, 68, 109, 112, 114, 144, 153, 156, 157, 168, 184, 202, 203 및 206에 상응하는 것으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 하나 이상의 비-천연 아미노산을 포함하는 항체가 본원에서 제공된다.
특정 실시양태에서, 서열 2에 따른 대표적인 경쇄 폴리펩티드의 43, 49, 56, 57, 60, 67, 68, 109, 112, 144, 153, 156, 168, 184, 202 및 203에 상응하는 것으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 하나 이상의 비-천연 아미노산을 포함하는 항체가 본원에서 제공된다.
특정 실시양태에서, 서열 2에 따른 대표적인 경쇄 폴리펩티드의 43, 49, 56, 57, 60, 67, 68, 109, 144, 153, 156, 184, 202 및 203에 상응하는 것으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 하나 이상의 비-천연 아미노산을 포함하는 항체가 본원에서 제공된다.
특정 실시양태에서, 서열 2에 따른 대표적인 경쇄 폴리펩티드의 49, 56, 57, 60, 67, 109, 153, 202 및 203에 상응하는 것으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 하나 이상의 비-천연 아미노산을 포함하는 항체가 본원에서 제공된다.
특정 실시양태에서, 항체는 하기 식 I로 표시될 수 있는 폴리펩티드 쇄를 포함한다:
Xaa1-...-(Naap(i))n-...-Xaaq (I).
식 I에서, 각각의 Xaa는 임의의 종류의 폴리펩티드 쇄 내의 아미노산을 나타낸다. 즉, 각각의 Xaa는 임의의 아미노산, 일반적으로 임의의 천연 생성 아미노산, 또는 그의 변이체일 수 있다. 각각의 Xaa의 우측의 위첨자는 폴리펩티드 쇄의 1차 서열 내의 아미노산의 위치를 나타낸다. Xaa1은 폴리펩티드 쇄 내의 제1, 또는 N-말단 아미노산을 나타내고, Xaaq는 폴리펩티드 쇄 내의 마지막, 또는 C-말단 아미노산을 나타낸다. 변수 q는 폴리펩티드 쇄 내의 아미노산의 총수와 같은 정수이다. 각각의 Naa는 폴리펩티드 쇄 내의 비-천연 아미노산을 나타낸다. 유용한 비-천연 아미노산은 아래 섹션에서 설명된다. 정수 n은 폴리펩티드 쇄 내의 비-천연 아미노산의 수를 나타낸다. 일반적인 실시양태에서, n은 1 초과의 정수이다. 각각의 정수 p(i)는 1 초과 q 미만이고, 변수 i는 1 내지 n의 정수이다. 각각의 정수 p(i)는 상응하는 Naa에 대한 아미노산 서열 내의 부위-특이적 위치를 나타낸다. 각각의 부위 특이적 위치 p(i)는 본원에 기재된 기술에 따라 천연 생성 아미노산의 비-천연 아미노산, 예컨대 Naap(i)으로의 치환을 위해 최적이다.
실시예에서 제시되는 TAG 스크리닝으로부터 데이터의 분석을 통해, 세포 사멸, 발현 수준, 약물-대-항체 비, 용매 접근성 및 (이용가능한 경우) 열 안정성을 기초로 하여 ADC 제조를 위한 이상적인 후보인 부위의 선택이 가능하였다. 가장 바람직한 부위는 다른 시험된 변이체보다 더 낮은 용매 접근성, 및 더 높은 열안정성을 갖는다. nnAA에 대한 바람직한 부위를 하기 표 I에 제시한다.
<표 I>
Figure pct00001
따라서, 특정 실시양태에서, 카바트 또는 코티아 넘버링 방식에 따른 중쇄 또는 경쇄 잔기 HC-F404, HC-K121, HC-Y180, HC-F241, LC-T22, LC-S7, LC-N152, HC-S136, HC-S25, HC-A40, HC-S119, HC-S190, HC-K222, HC-R19, HC-Y52 또는 HC-S70으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 하나 이상의 비-천연 아미노산 또는 그의 번역후 변형된 변이체를 포함하는 항체가 본원에서 제공된다.
특정 실시양태에서, 카바트 또는 코티아 넘버링 방식에 따른 중쇄 또는 경쇄 잔기 HC-F404, HC-K121, HC-Y180, HC-F241, LC-T22, LC-S7, LC-N152, HC-S136, HC-S25, HC-A40, HC-S119, HC-S190 및 HC-K222로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 하나 이상의 비-천연 아미노산 또는 그의 번역후 변형된 변이체를 포함하는 항체가 본원에서 제공된다.
특정 실시양태에서, 카바트 또는 코티아 넘버링 방식에 따른 중쇄 또는 경쇄 잔기 HC-F404, HC-K121, HC-Y180, HC-F241, LC-T22, LC-S7, LC-N152 및 HC-S136으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 하나 이상의 비-천연 아미노산 또는 그의 번역후 변형된 변이체를 포함하는 항체가 본원에서 제공된다.
특정 실시양태에서, 상기 항체의 보존적으로 변형된 변이체가 본원에서 추가로 제공된다. 항체의 보존적으로 변형된 변이체는 당업자에 의해 평가될 때 항체의 구조 및/또는 기능을 붕괴시키지 않는 하나 이상의 삽입, 결실 또는 치환을 포함한다. 특정 실시양태에서, 보존적으로 변형된 변이체는 20개 이하의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환을 포함한다. 특정 실시양태에서, 보존적으로 변형된 변이체는 15개 이하의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환을 포함한다. 특정 실시양태에서, 보존적으로 변형된 변이체는 10개 이하의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환을 포함한다. 특정 실시양태에서, 보존적으로 변형된 변이체는 9개 이하의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환을 포함한다. 특정 실시양태에서, 보존적으로 변형된 변이체는 8개 이하의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환을 포함한다. 특정 실시양태에서, 보존적으로 변형된 변이체는 7개 이하의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환을 포함한다. 특정 실시양태에서, 보존적으로 변형된 변이체는 6개 이하의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환을 포함한다. 특정 실시양태에서, 보존적으로 변형된 변이체는 5개 이하의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환을 포함한다. 특정 실시양태에서, 보존적으로 변형된 변이체는 4개 이하의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환을 포함한다. 특정 실시양태에서, 보존적으로 변형된 변이체는 3개 이하의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환을 포함한다. 특정 실시양태에서, 보존적으로 변형된 변이체는 2개 이하의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환을 포함한다. 특정 실시양태에서, 보존적으로 변형된 변이체는 1개의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환을 포함한다. 특정 실시양태에서, 치환은 상기 설명된 바와 같은 동일한 부류 내의 아미노산의 보존적 치환이다.
특정 실시양태에서, 항체는 구조, 안정성 및/또는 활성을 조정하도록 변형된다. 상기 실시양태에서, 변형은 보존적 또는 보존적 이외의 다른 변형일 수 있다. 변형은 단지 본원에서 설명되는 방법을 수행하고 조성물을 사용하는 실시자에게 적합할 것만을 필요로 한다. 특정 실시양태에서, 변형은 항원 결합 친화도를 감소시키지만 제거하지 않는다. 특정 실시양태에서, 변형은 항원 결합 친화도를 증가시킨다. 특정 실시양태에서, 변형은 항체의 구조 또는 안정성을 향상시킨다. 특정 실시양태에서, 변형은 항체의 구조 또는 안정성을 감소시키지만 제거하지 않는다. 특정 실시양태에서, 변형된 변이체는 20개 이하의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환을 포함한다. 특정 실시양태에서, 변형된 변이체는 15개 이하의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환을 포함한다. 특정 실시양태에서, 변형된 변이체는 10개 이하의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환을 포함한다. 특정 실시양태에서, 변형된 변이체는 9개 이하의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환을 포함한다. 특정 실시양태에서, 변형된 변이체는 8개 이하의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환을 포함한다. 특정 실시양태에서, 변형된 변이체는 7개 이하의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환을 포함한다. 특정 실시양태에서, 변형된 변이체는 6개 이하의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환을 포함한다. 특정 실시양태에서, 변형된 변이체는 5개 이하의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환을 포함한다. 특정 실시양태에서, 변형된 변이체는 4개 이하의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환을 포함한다. 특정 실시양태에서, 변형된 변이체는 3개 이하의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환을 포함한다. 특정 실시양태에서, 변형된 변이체는 2개 이하의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환을 포함한다. 특정 실시양태에서, 변형된 변이체는 1개의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환을 포함한다.
또한, 번역후 변형된 변이체도 범위 내에 포함된다. 임의의 본원에서 제공되는 항체는 당업자에 의해 인식되는 임의의 방식으로 번역후 변형될 수 있다. 항체의 일반적인 번역후 변형은 쇄간 디술피드 결합, 쇄내 디술피드 결합, N-연결된 글리코실화 및 단백질 분해 (proteolysis)를 포함한다. 또한, 변형, 예컨대 인산화, O-연결된 글리코실화, 메틸화, 아세틸화, 지질화, GPI 고정 (anchoring), 미리스토일화 및 프레닐화를 갖는 다른 번역후 변형된 항체가 본원에서 제공된다. 번역후 변형은 생산 동안, 생체내에서, 시험관내에서 또는 다른 방식으로 생성될 수 있다. 특정 실시양태에서, 번역후 변형은 예를 들어 본원에서 제공되는 방법을 사용하여 실시자에 의한 의도적인 변형일 수 있다.
추가의 펩티드 또는 폴리펩티드에 융합된 항체가 범위 내에 추가로 포함된다. 예시적인 융합체는 예를 들어 메티오닌이 재조합 발현에 의해 항체의 N-말단에 연결된 메티오닐 항체, 정제를 위한 융합체 (폴리-히스티딘 또는 친화도 에피토프를 포함하고 이로 제한되지 않음), 다른 생물학적 활성 분자에 대한 연결을 위한 융합체, 혈청 알부민 결합 펩티드와의 융합체, 및 혈청 단백질, 예컨대 혈청 알부민과의 융합체를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 항체는 프로테아제 절단 서열, 반응성 기, 항체-결합 도메인 (FLAG 또는 폴리-His을 포함하고 이로 제한되지 않음) 또는 다른 친화도 기반 서열 (FLAG, 폴리-His, GST 등을 포함하고 이로 제한되지 않음)을 포함할 수 있다. 항체는 또한 검출 (GFP를 포함하고 이로 제한되지 않는음), 정제 또는 항체의 다른 특징을 개선하는 연결된 분자 (비오틴을 포함하고 이로 제한되지 않음)를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 항체는 전장 항체의 정제를 용이하게 하는 C-말단 친화도 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 C-말단 친화도 서열은 폴리-His 서열, 예를 들어, 6-His 서열이다.
항체는 당업자에 의해 인식되는 임의의 항체 형태일 수 있다. 항체는 단일 폴리펩티드 쇄 - 단일 중쇄 또는 단일 경쇄를 포함할 수 있다. 항체는 또한 동종이량체, 이종이량체, 동종다량체, 및 이종다량체를 포함하는, 당업자에 의해 인식되는 다량체를 형성할 수 있다. 이들 다량체는 연결되거나 연결되지 않을 수 있다. 유용한 연결은 항체 분자에 일반적인 쇄간 디술피드 결합을 포함한다. 다량체는 또한 본 설명에 따라 도입되는 비-천연 아미노산을 포함하는 다른 아미노산에 의해 연결될 수 있다. 항체는 이뮤노글로불린, 예컨대 IgA, IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 및 IgM을 포함하는 임의의 부류 또는 하위부류일 수 있다. 항체는 Fv, Fc, Fab, 및 (Fab')2 및 scFv를 포함하는 임의의 항체 단편의 형태일 수 있다.
항체는 추가로 글리코실화되거나 또는 비글리코실화될 수 있다. 따라서, 특정 실시양태에서, 항체는 글리코실화된다. 특정 실시양태에서, 항체는 비글리코실화된다. 비-천연 아미노산을 포함하는 비글리코실화된 항체는 예를 들어 본원에서 제공되는 실시예에서 설명되는 바와 같이 또는 당업자에게 알려진 박테리아 발현 시스템을 통해 제조될 수 있다. 비-천연 아미노산을 포함하는 글리코실화된 항체는 예를 들어, 문헌 [Axup et al., 2012, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 109(40): 16101-16106]에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다.
또한, 하나 이상의 접합 모이어에 접합된 항체가 본원에서 제공된다. 접합 모이어티는 당업자에게 유용한 것으로 간주되는 임의의 접합 모이어티일 수 있다. 예를 들어, 접합 모이어티는 시험관내에서 또는 생체내에서 항체의 안정성을 개선할 수 있는 중합체, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜일 수 있다. 접합 모이어티는 치료 활성을 보유하여 항체-약물 접합체를 생성할 수 있다. 접합 모이어티는 표적 세포에 유해한 분자 페이로드일 수 있다. 접합 모이어티는 검출 또는 진단에 유용한 표지일 수 있다. 특정 실시양태에서, 접합 모이어티는 직접적인 공유 결합을 통해 항체에 연결된다. 특정 실시양태에서, 접합 모이어티는 링커를 통해 항체에 연결된다. 유리한 실시양태에서, 접합 모이어티 또는 링커는 항체의 비-천연 아미노산 중의 하나에 부착되었다. 예시적인 접합 모이어티 및 링커는 아래 섹션에서 논의된다.
비-천연 아미노산
비-천연 아미노산은 당업자에게 알려진 임의의 비-천연 아미노산일 수 있다. 일부 실시양태에서, 비-천연적으로 코딩되는 아미노산은 기능성 기를 포함한다. 기능성 기는 당업자에게 알려진 임의의 기능성 기일 수 있다. 특정 실시양태에서 기능성 기는 표지, 극성 기, 비-극성 기 또는 반응성 기이다.
반응성 기는 기능성 기를 항체 쇄의 부위-특이적 위치에서 항체에 추가로 연결시키기 위해 특히 유리하다. 특정 실시양태에서, 반응성 기는 아미노, 카르복시, 아세틸, 히드라지노, 히드라지도, 세미카르바지도, 술파닐, 아지도 및 알키닐로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 아미노산 잔기는 임의의 하기 화학식에 따른다:
Figure pct00002
당업자는 항체가 일반적으로 L-아미노산으로 이루어짐을 알 것이다. 그러나, 비-천연 아미노산을 사용하여, 본 발명의 방법 및 조성물은 실시자에게 부위-특이적 위치에서 L-, D- 또는 라세미 (racemic) 비-천연 아미노산을 사용하는 능력을 부여한다. 특정 실시양태에서, 본원에서 설명되는 비-천연 아미노산은 천연 아미노산의 D-형태 및 천연 아미노산의 라세미 형태를 포함한다.
상기 화학식에서, 물결선은 항체의 폴리펩티드 쇄의 나머지에 연결되는 결합을 나타낸다. 이들 비-천연 아미노산은 천연 아미노산이 동일한 폴리펩티드 쇄 내로 도입되는 것처럼 폴리펩티드 쇄 내로 도입될 수 있다. 특정 실시양태에서, 비-천연 아미노산은 화학식에 나타낸 바와 같이 아미드 결합을 통해 폴리펩티드 쇄 내로 도입된다.
상기 화학식에서, R은 아미노산 잔기가 천연 아미노산 잔기와 동일하지 않는다면 어떠한 제한 없이 임의의 기능성 기를 나타낸다. 특정 실시양태에서, R은 소수성 기, 친수성 기, 극성 기, 산성 기, 염기성 기, 킬레이팅 기, 반응성 기, 치료 모이어티 또는 표지 모이어티일 수 있다. 특정 실시양태에서, R은 R1NR2R3, R1C(=O)R2, R1C(=O)OR2, R1N3, R1C(≡CH))로 이루어진 군으로부터 선택된다. 이들 실시양태에서, R1은 결합, 알킬렌, 헤테로알킬렌, 아릴렌, 헤테로아릴렌으로 이루어진 군으로부터 선택된다. R2 및 R3은 각각 독립적으로 수소, 알킬 및 헤테로알키닐로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 비-천연적으로 코딩되는 아미노산은 안정한 접합체를 형성하기 위해서 20개 이하의 통상적인 아미노산에서 발견되지 않는 기능성 기 (아지도, 케톤, 알데히드 및 아미노옥시 기를 포함하고 이로 제한되지 않음)와 효율적으로 및 선택적으로 반응하는 측쇄 기능성 기를 포함한다. 예를 들어, 아지도 기능성 기를 함유하는 비-천연적으로 코딩되는 아미노산을 포함하는 항원-결합 폴리펩티드는 중합체 (폴리(에틸렌 글리콜)을 포함하고 이로 제한되지 않음) 또는, 별법으로 알킨 모이어티를 함유하는 제2 폴리펩티드와 반응하여 아지드 및 알킨 기능성 기의 선택적인 반응에 의해 안정한 접합체를 형성함으로써 휘스겐 (Huisgen) [3+2] 고리 첨가 생성물을 형성할 수 있다.
본 발명에 사용하기 적합할 수 있고 수용성 중합체와의 반응에 유용한 예시적인 비-천연적으로 코딩되는 아미노산은 카르보닐, 아미노옥시, 히드라진, 히드라지드, 세미카르바지드, 아지드 및 알킨 반응성 기를 갖는 것을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 비-천연적으로 코딩되는 아미노산은 당류 모이어티를 포함한다. 상기 아미노산의 예는 N-아세틸-L-글루코사미닐-L-세린, N-아세틸-L-갈락토사미닐-L-세린, N-아세틸-L-글루코사미닐-L-트레오닌, N-아세틸-L-글루코사미닐-L-아스파라긴 및 O-만노사미닐-L-세린을 포함한다. 상기 아미노산의 예는 또한 아미노산과 당류 사이의 천연 생성 N- 또는 O-연결이 알켄, 옥심, 티오에테르, 아미드 등을 포함하고 이로 제한되지 않는, 자연에서 통상적으로 발견되지 않는 공유 연결에 의해 교체된 예를 포함한다. 상기 아미노산의 예는 또한 천연 생성 단백질에서 통상적으로 발견되지 않는 당류, 예컨대 2-데옥시-글루코스, 2-데옥시갈락토스 등을 포함한다.
본원에서 제공되는 많은 비-천연적으로 코딩되는 아미노산은 예를 들어 시그마-알드리치 (Sigma-Aldrich, 미국 미주리주 세인트루이스), 노바바이오켐 (Novabiochem, 이엠디 바이오사이언시스 (EMD Biosciences)의 자회사, 독일 다름쉬타트), 또는 펩테크 (Peptech, 미국 매사추세츠주 벌링턴)로부터 상업적으로 이용가능하다. 상업적으로 이용가능하지 않은 것은 본원에서 제시되는 바와 같이 또는 당업자에게 알려진 표준 방법을 사용하여 임의로 합성된다. 유기 합성 기술에 대해서는, 예를 들어 문헌 [Organic Chemistry by Fessendon and Fessendon, (1982, Second Edition, Willard Grant Press, Boston Mass.)]; [Advanced Organic Chemistry by March (Third Edition, 1985, Wiley and Sons, New York)]; 및 [Advanced Organic Chemistry by Carey and Sundberg (Third Edition, Parts A and B, 1990, Plenum Press, New York)]을 참조한다. 또한, 본원에 참조로 포함된 U.S. 특허 출원 공개 2003/0082575 및 2003/0108885를 참조한다. 신규한 측쇄를 함유하는 비천연 아미노산 이외에, 본 발명에서 사용하기 적합할 수 있는 비천연 아미노산은 또한 하기 화학식 II 및 III의 구조에 예시된 것을 포함하고 이로 제한되지 않는 변형된 골격 (backbone) 구조를 임의로 포함한다:
<화학식 II>
Figure pct00003
<화학식 III>
Figure pct00004
여기서, Z는 일반적으로 OH, NH2, SH, NH-R', 또는 S-R'를 포함하고; 동일하거나 상이할 수 있는 X 및 Y는 일반적으로 S 또는 O를 포함하고, 임의로 동일하거나 상이한 R 및 R'는 일반적으로 화학식 I을 갖는 비천연 아미노산에 대해 상기 설명한 R 기에 대한 구성 요소의 동일한 목록 및 수소로부터 선택된다. 예를 들어, 본 발명의 비천연 아미노산은 화학식 II 및 III에 의해 예시되는 아미노 또는 카르복실 기 내의 치환을 임의로 포함한다. 상기 종류의 비천연 아미노산은 통상적인 20개의 천연 아미노산 또는 비천연 측쇄에 상응하는 측쇄를 포함하고 이로 제한되지 않는 측쇄를 갖는 α-히드록시산, α-티오산, α-아미노티오카르복실레이트를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 또한, α-탄소에서의 치환은 L, D, 또는 α-α-이치환된 아미노산, 예컨대 D-글루타메이트, D-알라닌, D-메틸-O-티로신, 아미노부티르산 등을 임의로 포함하고 이로 제한되지 않는다. 다른 구조적 대체물은 시클릭 아미노산, 예컨대 프롤린 유사체 및 3, 4, 6, 7, 8, 및 9원 고리 프롤린 유사체, P 및 y 아미노산, 예컨대 치환된 β-알라닌 및 γ-아미노 부티르산을 포함한다.
많은 비천연 아미노산은 천연 아미노산, 예컨대 티로신, 글루타민, 페닐알라닌 등을 기초로 하고, 본 발명에서 사용하기 적합하다. 티로신 유사체는 파라-치환된 티로신, 오르토-치환된 티로신, 및 메타 치환된 티로신을 포함하고 이로 제한되지 않고, 여기서 치환된 티로신은 케토 기 (아세틸 기를 포함하고 이로 제한되지 않음), 벤조일 기, 아미노 기, 히드라진, 히드록시아민, 티올 기, 카르복시 기, 이소프로필 기, 메틸 기, C6-C20 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소, 포화 또는 불포화 탄화수소, O-메틸 기, 폴리에테르기, 니트로기, 알키닐 기 등을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 또한, 다중 치환된 아릴 고리도 고려된다. 본 발명에서 사용하기 적합할 수 있는 글루타민 유사체는 α-히드록시 유도체, γ-치환된 유도체, 시클릭 유도체, 및 아미드 치환된 글루타민 유도체를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 본 발명에 사용하기 적합할 수 있는 페닐알라닌 유사체는 파라-치환된 페닐알라닌, 오르토-치환된 페닐알라닌, 및 메타-치환된 페닐알라닌을 포함하고 이로 제한되지 않고, 여기서 치환체는 히드록시 기, 메톡시 기, 메틸 기, 알릴 기, 알데히드, 아지도, 아이오도, 브로모, 케토 기 (아세틸 기를 포함하고 이로 제한되지 않음), 벤조일, 알키닐 기 등을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 본 발명에 사용하기 적합할 수 있는 비천연 아미노산의 구체적인 예는 p-아세틸-L-페닐알라닌, O-메틸-L-티로신, L-3-(2-나프틸)알라닌, 3-메틸-페닐알라닌, O-4-알릴-L-티로신, 4-프로필-L-티로신, 트리-O-아세틸-GlcNAcβ-세린, L-도파, 불화 페닐알라닌, 이소프로필-L-페닐알라닌, p-아지도-L-페닐알라닌, p-아실-L-페닐알라닌, p-벤조일-L-페닐알라닌, L-포스포세린, 포스포노세린, 포스포노티로신, p-아이오도-페닐알라닌, p-브로모페닐알라닌, p-아미노-L-페닐알라닌, 이소프로필-L-페닐알라닌, 및 p-프로파르길옥시-페닐알라닌 등을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 본 발명에 사용하기 적합할 수 있는 다양한 비천연 아미노산의 구조의 예는 예를 들어 WO 2002/085923 (명칭: "In vivio incorporation of unnatural amino acids")에 제시되어 있다. 또한, 추가의 메티오닌 유사체에 대해서는 문헌 [Kiick et al., (2002) Incorporation of azides into recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudinger ligation, PNAS 99: 19-24]을 참조한다.
본 발명에 사용하기 적합한 많은 비천연 아미노산은 예를 들어 시그마 (USA) 또는 알드리치 (미국 위스콘신주 밀워키)로부터 상업적으로 이용가능하다. 상업적으로 이용가능하지 않은 것은 본원에서 제시되는 바와 같이 또는 다양한 간행물에 제시된 바와 같이 또는 당업자에게 알려진 표준 방법을 사용하여 임의로 합성된다. 유기 합성 기술에 대해서는, 예를 들어 문헌 [Organic Chemistry by Fessendon and Fessendon, (1982, Second Edition, Willard Grant Press, Boston Mass.)]; [Advanced Organic Chemistry by March (Third Edition, 1985, Wiley and Sons, New York)]; 및 [Advanced Organic Chemistry by Carey and Sundberg (Third Edition, Parts A and B, 1990, Plenum Press, New York)]을 참조한다. 비천연 아미노산의 합성을 설명하고 있는 추가의 간행물은 예를 들어 다음을 포함한다: WO 2002/085923 (명칭: "In vivio incorporation of Unnatural Amino Acids"); [Matsoukas et al., (1995) J. Med. Chem., 38, 4660-4669]; [King, F. E. & Kidd, D. A. A. (1949) A New Synthesis of Glutamine and of γ-Dipeptides of Glutamic acid from Phthylated Intermediates. J. Chem. Soc, 3315-3319]; [Friedman, O. M. & Chatterrji, R. (1959) Synthesis of Derivatives of Glutamine as Model Substrates for Anti-Tumor Agents. J. Am. Chem. Soc. 81, 3750-3752]; [Craig, J. C. et al. (1988) Absolute Configuration of the Enantiomers of 7-Chloro-4 [[4-(diethylamino)-1-methylbutyl]amino]quinoline (Chloroquine). J. Org. Chem. 53, 1167-1170]; [Azoulay, M., Vilmont, M. & Frappier, F. (1991) Glutamine analogues as Potential Antimalarials, Eur. J. Med. Chem. 26, 201-5]; [Koskinen, A. M. P. & Rapoport, H. (1989) Synthesis of 4-Substituted Prolines as Conformationally Constrained Amino Acid Analogues. J. Org. Chem. 54, 1859-1866]; [Christie, B. D. & Rapoport, H. (1985) Synthesis of Optically Pure Pipecolates from L-Asparagine. Application to the Total Synthesis of (+)-Apovincamine through Amino Acid Decarbonylation and Iminium Ion Cyclization. J. Org. Chem. 1989: 1859-1866]; [Barton et al., (1987) Synthesis of Novel a-Amino-Acids and Derivatives Using Radical Chemistry: Synthesis of L- and D-a-Amino-Adipic Acids, L-a-aminopimelic Acid and Appropriate Unsaturated Derivatives. Tetrahedron Lett. 43:4297-4308]; 및, [Subasinghe et al., (1992) Quisqualic acid analogues: synthesis of beta-heterocyclic 2-aminopropanoic acid derivatives and their activity at a novel quisqualate-sensitized site. J. Med. Chem. 35:4602-7]. 또한, 2003년 12월 22일 출원된 특허 출원 (명칭: "Protein Arrays") 10/744,899 및 2002년 12월 22일 출원된 60/435,821을 참고한다.
카르보닐 반응성 기를 갖는 아미노산은 다양한 반응, 특히 친핵성 부가 또는 알돌 축합 반응을 통해 분자 (PEG 또는 다른 수용성 분자를 포함하고 이로 제한되지 않음)를 연결시킬 수 있다.
예시적인 카르보닐-함유 아미노산은 다음과 같이 나타낼 수 있다:
Figure pct00005
여기서, n은 0-10이고; R1은 알킬, 아릴, 치환된 알킬, 또는 치환된 아릴이고; R2는 H, 알킬, 아릴, 치환된 알킬, 및 치환된 아릴이고; R3은 H, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 아미노 말단 변형 기이고, R4는 H, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 카르복시 말단 변형 기이다. 일부 실시양태에서, n은 1이고, R1은 페닐이고, R2는 간단한 알킬 (즉, 메틸, 에틸, 또는 프로필)이고, 케톤 모이어티는 알킬 측쇄에 대해 파라 위치에 존재한다. 일부 실시양태에서, n은 1이고, R1은 페닐이고, R2는 간단한 알킬 (즉, 메틸, 에틸, 또는 프로필)이고, 케톤 모이어티는 알킬 측쇄에 대해 메타 위치에 존재한다.
본 발명에서, 인접한 히드록실 및 아미노 기를 보유하는 비-천연적으로 코딩되는 아미노산은 "차폐된 (masked)" 알데히드 관능기로서 폴리펩티드 내에 도입될 수 있다. 예를 들어, 5-히드록시리신은 엡실론 아민에 인접한 히드록실 기를 보유한다. 알데히드를 생성하기 위한 반응 조건은 일반적으로 폴리펩티드 내의 다른 부위에서의 산화를 방지하기 위해 온건 조건 하에 몰 과량의 나트륨 메타퍼아이오데이트의 첨가를 수반한다. 산화 반응의 pH는 일반적으로 약 7.0이다. 일반적인 반응은 폴리펩티드의 완충된 용액에 약 1.5 몰 과량의 나트륨 메타 퍼아이오데이트를 첨가한 후, 약 10분 동안 암소에서 인큐베이션하는 것을 수반한다. 예를 들어 본원에 참조로 포함된 미국 특허 6,423,685를 참조한다.
카르보닐 관능기는 수용액 내의 온건 조건 하에 히드라진-, 히드라지드-, 히드록실아민-, 또는 세미카르바지드-함유 시약과 선택적으로 반응하여, 각각 상응하는 생리학적 조건 하에 안정한 히드라존, 옥심, 또는 세미카르바존 연결을 형성할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Jencks, W. P., J. Am. Chem. Soc. 81, 475-481 (1959)]; [Shao, J. and Tam, J. P., J. Am. Chem. Soc. 117:3893-3899 (1995)]을 참조한다. 또한, 카르보닐 기의 특유한 반응성은 다른 아미노산 측쇄의 존재 하에 선택적 변형을 허용한다. 예를 들어, 문헌 [Cornish, V. W., et al., J. Am. Chem. Soc. 118:8150-8151 (1996)]; [Geoghegan, K. F. & Stroh, J. G., Bioconjug. Chem. 3:138-146 (1992)]; [Mahal, L. K., et al., Science 276: 1125-1128 (1997)]을 참조한다.
친핵성 기, 예컨대 히드라진, 히드라지드 또는 세미카르바지드를 함유하는 비-천연적으로 코딩되는 아미노산은 다양한 친전자성 기 (PEG 또는 다른 수용성 중합체를 포함하고 이로 제한되지 않음)와 반응하여 접합체를 형성하는 것을 허용한다.
예시적인 히드라진, 히드라지드 또는 세미카르바지드-함유 아미노산은 다음과 같이 나타낼 수 있다:
Figure pct00006
여기서, n은 0-10이고; R1은 알킬, 아릴, 치환된 알킬, 또는 치환된 아릴이거나 또는 존재하지 않고; X는 O, N, 또는 S이거나 또는 존재하지 않고; R2는 H, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 아미노 말단 변형 기이고, R3은 H, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 카르복시 말단 변형 기이다.
일부 실시양태에서, n은 4이고, R1은 존재하지 않고, X는 N이다. 일부 실시양태에서, n은 2이고, R1은 존재하지 않고, X는 존재하지 않는다. 일부 실시양태에서, n은 1이고, R1은 페닐이고, X는 O이고, 산소 원자는 아릴 고리 상의 지방족 기에 파라 위치로 존재한다.
히드라지드-, 히드라진-, 및 세미카르바지드-함유 아미노산은 상업적인 공급원으로부터 이용가능하다. 예를 들어, L-글루타메이트-γ-히드라지드는 시그마 케미컬 (Sigma Chemical, 미국 미주리주 세인트루이스)로부터 이용가능하다. 상업적으로 이용가능하지 않은 다른 아미노산은 당업자에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 본원에 참조로 포함된 미국 특허 6,281,211을 참조한다.
히드라지드, 히드라진 또는 세미카르바지드 관능기를 보유하는 비-천연적으로 코딩되는 아미노산을 함유하는 폴리펩티드는 알데히드 또는 유사한 화학적 반응성을 갖는 다른 기능성 기를 함유하는 다양한 분자와 효율적으로 및 선택적으로 반응할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Shao, J. and Tam, J., J. Am. Chem. Soc. 117:3893-3899 (1995)]을 참조한다. 히드라지드, 히드라진 및 세미카르바지드 기능성 기의 특유한 반응성은 이들이 20개의 통상적인 아미노산에 존재하는 친핵성 기 (세린 또는 트레오닌의 히드록실 기 또는 리신 및 N-말단의 아미노 기를 포함하고 이로 제한되지 않음)에 비해 알데히드, 케톤 및 다른 친전자성 기를 향한 유의하게 더 큰 반응성을 갖도록 한다.
아미노옥시 (히드록실아민으로도 불림) 기를 함유하는 비-천연적으로 코딩되는 아미노산은 다양한 친전자성 기 (PEG 또는 다른 수용성 중합체를 포함하고 이로 제한되지 않음)와 반응하여 접합체를 형성하는 것을 허용한다. 히드라진, 히드라지드 및 세미카르바지드처럼, 아미노옥시 기의 향상된 친핵성 때문에 이 기는 알데히드 또는 유사한 화학적 반응성을 갖는 다른 기능성 기를 함유하는 다양한 분자와 효율적으로 및 선택적으로 반응할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Shao, J. and Tam, J., J. Am. Chem. Soc. 117:3893-3899 (1995)]; [H. Hang and C. Bertozzi, Acc. Chem. Res. 34: 727-736 (2001)]을 참조한다. 히드라진 기와의 반응 결과는 상응하는 히드라존인 반면, 옥심은 일반적으로 아미노옥시 기와 카르보닐-함유 기, 예컨대 케톤과의 반응에 의해 생성된다.
아미노옥시 기를 함유하는 예시적인 아미노산은 다음과 같이 나타낼 수 있다:
Figure pct00007
여기서, n은 0-10이고; R1은 알킬, 아릴, 치환된 알킬, 또는 치환된 아릴이거나 또는 존재하지 않고; X는 O, N, S이거나 또는 존재하지 않고; m은 0-10이고; Y=C(O) 또는 존재하지 않고; R2는 H, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 아미노 말단 변형 기이고, R3은 H, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 카르복시 말단 변형 기이다. 일부 실시양태에서, n은 1이고, R1은 페닐이고, X는 O이고, m은 1이고, Y는 존재한다. 일부 실시양태에서, n은 2이고, R1 및 X는 존재하지 않고, m은 0이고, Y는 존재하지 않는다.
아미노옥시-함유 아미노산은 쉽게 이용가능한 아미노산 전구체 (호모세린, 세린 및 트레오닌)로부터 제조될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [M. Carrasco and R. Brown, J. Org. Chem. 68: 8853-8858 (2003)]을 참조한다. 특정 아미노옥시-함유 아미노산, 예컨대 L-2-아미노-4-(아미노옥시)부티르산이 천연 공급원으로부터 단리되었다 (Rosenthal, G. et al., Life Sci. 60: 1635-1641 (1997)). 다른 아미노옥시-함유 아미노산은 당업자가 제조할 수 있다.
아지드 및 알킨 기능성 기의 특유한 반응성 때문에, 이들은 폴리펩티드 및 다른 생물학적 분자의 선택적인 변형에 극히 유용하다. 유기 아지드, 특히 지방족 아지드, 및 알킨은 일반적으로 통상적인 반응 화학적 조건에서 안정하다. 특히, 아지드 및 알킨 기능성 기 둘 모두는 천연 생성 폴리펩티드에서 발견되는 20개의 통상적인 아미노산의 측쇄 (즉, R 기)에 대해 불활성이다. 그러나, 매우 근접할 때, 아지드 및 알킨 기의 "스프링 로딩 (spring-loaded)" 특성이 나타나고, 이들은 휘스겐 [3+2] 고리 첨가 반응을 통해 선택적으로 및 효율적으로 반응하여 상응하는 트리아졸을 생성한다. 예를 들어, 문헌 [Chin J., et al., Science 301:964-7 (2003)]; [Wang, Q., et al., J. Am. Chem. Soc. 125, 3192-3193 (2003)]; [Chin, J. W., et al., J. Am. Chem. Soc. 124:9026-9027 (2002)]을 참조한다.
휘스겐 고리 첨가 반응은 친핵성 치환보다 선택적인 고리 첨가 반응 (예를 들어, 문헌 [Padwa, A., in COMPREHENSIVE ORGANIC SYNTHESIS, Vol. 4, (ed. Trost, B. M., 1991), p. 1069-1109]; [Huisgen, R. in 1,3-DIPOLAR CYCLOADDITION CHEMISTRY, (ed. Padwa, A., 1984), p. 1-176] 참조)을 수반하기 때문에, 아지드 및 알킨-함유 측쇄를 보유하는 비-천연적으로 코딩되는 아미노산의 도입은 생성되는 폴리펩티드가 비-천연적으로 코딩되는 아미노산의 위치에서 선택적으로 변형되도록 허용한다. 아지드 또는 알킨-함유 항체를 수반하는 고리 첨가 반응은 계내에서 Cu(II)를 Cu(I)로 환원하기 위한 환원제의 존재 하에 Cu(II) (촉매량의 CuSO4의 형태를 포함하고 이로 제한되지 않음)의 첨가에 의해 수성 조건 하에 실온에서 수행할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Wang, Q., et al., J. Am. Chem. Soc. 125, 3192-3193 (2003)]; [Tornoe, C. W., et al., J. Org. Chem. 67:3057-3064 (2002)]; [Rostovtsev, et al., Angew. Chem. Int. Ed. 41:2596-2599 (2002)]을 참조한다. 예시적인 환원제는 아스코르베이트, 금속 구리, 퀴닌, 히드로퀴논, 비타민 K, 글루타티온, 시스테인, Fe2 +, Co2 +, 및 인가된 전위를 포함하고 이로 제한되지 않는다.
아지드와 알킨 사이의 휘스겐 [3+2] 고리 첨가 반응이 요구되는 일부 경우에, 항원-결합 폴리펩티드는 알킨 모이어티를 포함하는 비-천연적으로 코딩되는 아미노산을 포함하고, 아미노산에 부착되는 수용성 중합체는 아지드 모이어티를 포함한다. 별법으로, 역 반응 (즉, 아미노산 상의 아지드 모이어티 및 수용성 중합체 상에 존재하는 알킨 모이어티와의)도 수행할 수 있다.
아지드 기능성 기는 또한 아릴 에스테르를 함유하는 수용성 중합체와 선택적으로 반응하고, 아미드 연결을 생성하기 위해 아릴 포스핀 모이어티로 적절하게 기능성화될 수 있다. 아릴 포스핀 기는 계내에서 아지드를 환원하고, 생성되는 아민은 이어서 가까운 에스테르 연결과 효율적으로 반응하여 상응하는 아미드를 생성한다. 예를 들어, 문헌 [E. Saxon and C. Bertozzi, Science 287, 2007-2010 (2000)]을 참조한다. 아지드-함유 아미노산은 알킬 아지드 (2-아미노-6-아지도-1-헥산산을 포함하고 이로 제한되지 않음) 또는 아릴 아지드 (p-아지도-페닐알라닌)일 수 있다.
아릴 에스테르 및 포스핀 모이어티를 함유하는 예시적인 수용성 중합체는 다음과 같이 나타낼 수 있다:
Figure pct00008
여기서, X는 O, N, S이거나 또는 존재하지 않을 수 있고, Ph는 페닐이고, W는 수용성 중합체이고, R은 H, 알킬, 아릴, 치환된 알킬 및 치환된 아릴 기일 수 있다. 예시적인 R 기는 -CH2, -C(CH3)3, -OR', -NR'R", -SR', -할로겐, -C(O)R', -CONR'R", -S(O)2R', -S(O)2NR'R", -CN 및 -NO2를 포함하고 이로 제한되지 않는다. R', R", R'" 및 R""는 각각 독립적으로 수소, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 1-3개의 할로겐으로 치환된 아릴을 포함하고 이로 제한되지 않는 치환된 또는 비치환된 아릴, 치환된 또는 비치환된 알킬, 알콕시 또는 티오알콕시 기, 또는 아릴알킬 기를 의미한다. 본 발명의 화합물이 하나 초과의 R 기를 포함할 때, 예를 들어, 각각의 R 기는 하나 초과의 R', R", R'" 및 R"" 기가 존재할 때 각각의 R', R", R'" 및 R"" 기처럼 독립적으로 선택된다. R' 및 R"가 동일한 질소 원자에 부착될 때, 이들은 질소 원자와 조합되어 5-, 6-, 또는 7원 고리를 형성할 수 있다. 예를 들어, -NR'R"는 1-피롤리디닐 및 4-모르폴리닐을 포함하고 이로 제한되지 않음을 의미한다. 상기 치환체에 대한 논의로부터, 당업자는 용어 "알킬"이 수소 기 이외의 다른 기, 예컨대 할로알킬 (-CF3 및 -CH2CF3을 포함하고 이로 제한되지 않음) 및 아실 (-C(O)CH3, -C(O)CF3, -C(O)CH2OCH3 등을 포함하고 이로 제한되지 않음)에 결합하는 탄소 원자를 포함하는 기를 포함함이 이해할 것이다.
아지드 기능성 기는 또한 티오에스테르를 함유하는 수용성 중합체와 선택적으로 반응하고, 아릴 포스핀 모이어티로 적절하게 기능성화되어 아미드 연결을 생성할 수 있다. 아릴 포스핀 기는 계내에서 아지드를 환원하고, 생성되는 아민은 이어서 티오에스테르 연결과 효율적으로 반응하여 상응하는 아미드를 생성한다. 티오에스테르 및 포스핀 모이어티를 함유하는 예시적인 수용성 중합체는 다음과 같이 나타낼 수 있다:
Figure pct00009
여기서, n은 1-10이고; X는 O, N, S이거나 또는 존재하지 않을 수 있고, Ph는 페닐이고, W는 수용성 중합체이다.
예시적인 알킨-함유 아미노산은 다음과 같이 나타낼 수 있다:
Figure pct00010
여기서, n은 0-10이고; R1은 알킬, 아릴, 치환된 알킬, 또는 치환된 아릴이거나 또는 존재하지 않고; X는 O, N, S이거나 또는 존재하지 않고; m은 0-10이고, R2는 H, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 아미노 말단 변형 기이고, R3은 H, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 카르복시 말단 변형 기이다. 일부 실시양태에서, n은 1이고, R1은 페닐이고, X는 존재하지 않고, m은 0이고, 아세틸렌 모이어티는 알킬 측쇄에 대해 파라 위치에 존재한다. 일부 실시양태에서, n은 1이고, R1은 페닐이고, X는 O이고, m은 1이고, 프로파르길옥시 기는 알킬 측쇄에 대해 파라 위치에 존재한다 (즉, O-프로파르길-티로신). 일부 실시양태에서, n은 1이고, R1 및 X는 존재하지 않고, m은 0이다 (즉, 프로파르길글리신).
알킨-함유 아미노산은 상업적으로 이용가능하다. 예를 들어, 프로파르길글리신은 펩테크 (미국 매사추세츠주 벌링턴)로부터 상업적으로 이용가능하다. 별법으로, 알킨-함유 아미노산은 표준 방법에 따라 제조할 수 있다. 예를 들어, p-프로파르길옥시페닐알라닌은 예를 들어 문헌 [Deiters, A., et al., J. Am. Chem. Soc. 125: 11782-11783 (2003)]에 기재된 바와 같이 합성될 수 있고, 4-알키닐-L-페닐알라닌은 문헌 [Kayser, B., et al., Tetrahedron 53(7): 2475-2484 (1997)]에 기재된 바와 같이 합성될 수 있다. 다른 알킨-함유 아미노산은 당업자가 제조할 수 있다.
예시적인 아지드-함유 아미노산은 다음과 같이 나타낼 수 있다:
Figure pct00011
여기서, n은 0-10이고; R1은 알킬, 아릴, 치환된 알킬, 치환된 아릴이거나 또는 존재하지 않고; X는 O, N, S이거나 또는 존재하지 않고; m은 0-10이고; R2는 H, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 아미노 말단 변형 기이고, R3은 H, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 카르복시 말단 변형 기이다. 일부 실시양태에서, n은 1이고, R1은 페닐이고, X는 존재하지 않고, m은 0이고, 아지드 모이어티는 알킬 측쇄에 대해 파라 위치에 존재한다. 일부 실시양태에서, n은 0-4이고, R1 및 X는 존재하지 않고, m=0이다. 일부 실시양태에서, n은 1이고, R1은 페닐이고, X는 O이고, m은 2이고, P-아지도에톡시 모이어티는 알킬 측쇄에 대해 파라 위치에 존재한다.
아지드-함유 아미노산은 상업적인 공급원으로부터 이용가능하다. 예를 들어, 4-아지도페닐알라닌은 켐-임펙스 인터내셔날, 인크. (Chem-Impex International, Inc., 미국 일리노이주 우드 데일)로부터 얻을 수 있다. 상업적으로 이용가능하지 않은 아지드-함유 아미노산의 경우, 아지드 기는 적합한 이탈기 (할라이드, 메실레이트, 토실레이트를 포함하고 이로 제한되지 않음)의 교체 또는 적절하게 보호된 락톤의 개방을 포함하고 이로 제한되지 않는 당업자에게 알려진 표준 방법을 사용하여 비교적 쉽게 제조될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Advanced Organic Chemistry by March (Third Edition, 1985, Wiley and Sons, New York)]을 참조한다.
베타-치환된 아미노티올 기능성 기의 특유한 반응성 때문에, 이들 기는 티아졸리딘의 형성을 통해 알데히드 기를 함유하는 폴리펩티드 및 다른 생물학적 분자의 선택적인 변형에 극히 유용하다. 예를 들어, 문헌 [J. Shao and J. Tam, J. Am. Chem. Soc. 1995, 117 (14) 3893-3899]을 참조한다. 일부 실시양태에서, 베타-치환된 아미노티올 아미노산은 항체 내로 도입된 후, 알데히드 관능기를 포함하는 수용성 중합체와 반응할 수 있다. 일부 실시양태에서, 수용성 중합체, 약물 접합체 또는 다른 페이로드는 티아졸리딘의 형성을 통해 베타-치환된 아미노티올 아미노산을 포함하는 항체 폴리펩티드에 커플링될 수 있다
유용한 비-천연 아미노산의 특정 예는 p-아세틸-L-페닐알라닌, O-메틸-L-티로신, L-3-(2-나프틸)알라닌, 3-메틸-페닐알라닌, O-4-알릴-L-티로신, 4-프로필-L-티로신, 트리-O-아세틸-GlcNAc b-세린, L-도파, 불화 페닐알라닌, 이소프로필-L-페닐알라닌, p-아지도-L-페닐알라닌, p-아실-L-페닐알라닌, p-벤조일-L-페닐알라닌, L-포스포세린, 포스포노세린, 포스포노티로신, p-아이오도-페닐알라닌, p-브로모페닐알라닌, p-아미노-L-페닐알라닌, 이소프로필-L-페닐알라닌, 및 p-프로파르길옥시-페닐알라닌을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 추가의 유용한 예는 N-아세틸-L-글루코사미닐-L-세린, N-아세틸-L-갈락토사미닐-L-세린, N-아세틸-L-글루코사미닐-L-트레오닌, N-아세틸-L-글루코사미닐-L-아스파라긴 및 O-만노사미닐-L-세린을 포함한다.
특정 실시양태에서, 비-천연 아미노산은 p-아세틸-페닐알라닌, p-에티닐-페닐알라닌, p-프로파르길옥시페닐알라닌, 및 p-아지도-페닐알라닌으로부터 선택된다. 특히 유용한 하나의 비-천연 아미노산은 p-아지도 페닐알라닌이다. 이 아미노산 잔기는 예를 들어 알키닐 기 보유 화합물과의 휘스겐 [3+2] 고리 첨가 반응 (소위 "클릭 (click)" 화학 반응)을 용이하게 하는 것으로 당업자에게 알려져있다. 이 반응을 통해, 당업자는 비-천연 아미노산의 부위-특이적 위치에서 항체에 용이하고 신속하게 접합시킬 수 있다.
특정 실시양태에서, 제1 반응성 기는 알키닐 모이어티 (비천연 아미노산 p-프로파르길옥시페닐알라닌을 포함하고 이로 제한되지 않고, 여기서 프로파르길 기는 때로 아세틸렌 모이어티로도 언급됨)이고, 제2 반응성 기는 아지도 모이어티이고, [3+2] 고리 첨가 화학이 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 제1 반응성 기는 아지도 모이어티 (비천연 아미노산 p-아지도-L-페닐알라닌을 포함하고 이로 제한되지 않음)이고, 제2 반응성 기는 알키닐 모이어티이다.
상기 화학식에서, 각각의 L은 2가 링커를 나타낸다. 2가 링커는 당업자에게 알려진 임의의 2가 링커일 수 있다. 일반적으로, 2가 링커는 기능성 모이어티 R 및 비-천연 아미노산의 알파 탄소에 공유 결합을 형성할 수 있다. 유용한 2가 링커는 결합, 알킬렌, 치환된 알킬렌, 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌 및 치환된 헤테로아릴렌을 포함한다. 특정 실시양태에서, L은 C1-10 알킬렌 또는 C1-10 헤테로알킬렌이다.
본원에서 설명되는 방법 및 조성물에 사용되는 비-천연 아미노산은 하기 4개의 특성 중 적어도 하나를 갖는다: (1) 비-천연 아미노산의 측쇄 상의 적어도 하나의 기능성 기는 20개의 통상적인 유전적으로-코딩되는 아미노산 (즉, 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신, 및 발린)의 화학 반응성에 오르토고날인, 또는 적어도 비-천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드에 존재하는 천연 생성 아미노산의 화학 반응성에 오르토고날인 적어도 하나의 특징 및/또는 활성 및/또는 반응성을 갖고; (2) 도입된 비-천연 아미노산은 20개의 통상적인 유전적으로-코딩되는 아미노산에 대해 실질적으로 화학적으로 불활성이고; (3) 비-천연 아미노산은 바람직하게는 천연 생성 아미노산과 동등한 안정성으로 또는 일반적인 생리학적 조건 하에 폴리펩티드 내로 안정적으로 도입될 수 있고, 추가로 바람직하게는 상기 도입은 생체내 시스템을 통해 발생할 수 있고; (4) 비-천연 아미노산은 옥심 기능성 기, 또는 바람직하게는 비-천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드의 생물학적 특성을 파괴하지 않는 조건 하에 (물론 상기 생물학적 특성의 파괴가 변형/변환의 목적이 아니라면) 시약과 반응함으로써 옥심 기로 변환될 수 있는 기능성 기를 포함하거나, 또는 여기서 변환은 수성 조건 하에 약 4 내지 약 8의 pH에서 발생할 수 있거나, 또는 비-천연 아미노산 상의 반응성 부위는 친전자성 부위이다. 본원에서 설명되는 조성물 및 방법에서 사용될 수 있는 비-천연 아미노산에 대한 상기 4개의 특성을 충족하는 아미노산의 예시적인 비-제한적인 예를 도 2, 3, 35 및 40-43에 제시한다. 임의의 수의 비-천연 아미노산이 폴리펩티드 내로 도입될 수 있다. 비-천연 아미노산은 또한 보호된 또는 차폐된 옥심 또는 보호된 기의 탈보호 또는 차폐된 기의 탈차폐 (unmasking) 후에 옥심 기로 변환될 수 있는 보호된 또는 차폐된 기를 포함할 수 있다. 비-천연 아미노산은 또한 보호된 기의 탈보호 또는 차폐된 기의 탈차폐 후에 카르보닐 또는 디카르보닐 기로 변환될 수 있고, 이에 의해 옥심 기를 형성하기 위해 히드록실아민 또는 옥심과의 반응에 이용가능한 보호된 또는 차폐된 카르보닐 또는 디카르보닐 기를 포함할 수 있다.
추가의 실시양태에서, 본원에서 설명되는 방법 및 조성물에 사용될 수 있는 비-천연 아미노산은 광활성화가능 가교결합제를 포함하는 아미노산, 스핀(spin)-표지된 아미노산, 형광 아미노산, 금속 결합 아미노산, 금속-함유 아미노산, 방사성 아미노산, 신규한 기능성 기를 갖는 아미노산, 다른 분자와 공유 또는 비-공유 상호작용하는 아미노산, 광케이징된 (photocaged) 및/또는 광이성질체화가능 아미노산, 비오틴 또는 비오틴 유사체를 포함하는 아미노산, 글리코실화된 아미노산, 예컨대 당 치환된 세린, 다른 탄수화물 변형된 아미노산, 케토-함유 아미노산, 알데히드-함유 아미노산, 폴리에틸렌 글리콜 또는 다른 폴리에테르를 포함하는 아미노산, 중원자 (heavy atom) 치환된 아미노산, 화학적으로 절단가능 및/또는 광절단가능 아미노산, 천연 아미노산에 비해 연장된, 폴리에테르 또는 긴 쇄 탄화수소 (약 5개 초과 또는 약 10개 초과의 탄소를 포함하고 이로 제한되지 않음)를 포함하고 이로 제한되지 않는 측쇄를 갖는 아미노산, 탄소-연결된 당-함유 아미노산, 레독스-활성 아미노산, 아미노 티오산 함유 아미노산, 및 하나 이상의 독성 모이어티를 포함하는 아미노산을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
일부 실시양태에서, 비-천연 아미노산은 당류 모이어티를 포함한다. 상기 아미노산의 예는 N-아세틸-L-글루코사미닐-L-세린, N-아세틸-L-갈락토사미닐-L-세린, N-아세틸-L-글루코사미닐-L-트레오닌, N-아세틸-L-글루코사미닐-L-아스파라긴 및 O-만노사미닐-L-세린을 포함한다. 상기 아미노산의 예는 또한 아미노산과 당류 사이의 천연 생성 N- 또는 O-연결이 알켄, 옥심, 티오에테르, 아미드 등을 포함하고 이로 제한되지 않는, 자연에서 통상적으로 발견되지 않는 공유 연결에 의해 교체된 예를 포함한다. 상기 아미노산의 예는 또한 천연 생성 단백질에서 통상적으로 발견되지 않는 당류, 예컨대 2-데옥시-글루코스, 2-데옥시갈락토스 등을 포함한다.
비-천연 아미노산의 도입을 통해 항체 내로 도입된 화학적 모이어티는 다양한 이점 및 폴리펩티드의 조작을 제공한다. 예를 들어, 카르보닐 또는 디카르보닐 기능성 기 (케토- 또는 알데히드-기능성 기 포함)의 특유한 반응성은 생체내에서 및 시험관내에서 임의의 많은 히드라진- 또는 히드록실아민-함유 시약을 사용한 항체의 선택적인 변형을 허용한다. 중원자 비-천연 아미노산은 예를 들어 x-선 구조 데이터의 위상화 (phasing)에 유용할 수 있다. 비-천연 아미노산을 사용한 중원자의 부위-특이적 도입은 중원자에 대한 위치 선택시의 선택성 및 탄력성을 제공한다. 광반응성 비-천연 아미노산 (벤조페논 및 아릴아지드 (페닐아지드를 포함하고 이로 제한되지 않음) 측쇄를 갖는 아미노산을 포함하고 이로 제한되지 않음)은 예를 들어 폴리펩티드의 효율적인 생체내 및 시험관내 광가교결합을 허용한다. 광반응성 비-천연 아미노산의 예는 p-아지도-페닐알라닌 및 p-벤조일-페닐알라닌을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 광반응성 비-천연 아미노산을 갖는 항체는 이어서 광반응성 기를 제공하는 일시 조절 (temporal control)의 여기에 의해 자유롭게 가교결합될 수 있다. 비-제한적인 예에서, 비-천연 아미노의 메틸 기는 핵 자기 공명 및 진동 분광학의 사용을 포함하고 이로 제한되지 않는 국소 구조적 및 역학적 프로브로서 동위원소로 표지된 메틸 기를 포함하고 이로 제한되지 않는 기로 치환될 수 있다.
친전자성 반응성 기를 갖는 아미노산은 다양한 반응이 친핵성 부가 반응을 포함하고 이로 제한되지 않는 다양한 화학 반응을 통해 분자를 연결하는 것을 허용한다. 상기 친전자성 반응성 기는 카르보닐- 또는 디카르보닐-기 (케토- 또는 알데히드 기 포함), 카르보닐-유사- 또는 디카르보닐-유사-기 (카르보닐- 또는 디카르보닐-기에 유사한 반응성을 갖고 카르보닐- 또는 디카르보닐-기에 구조상 유사한), 차폐된 카르보닐- 또는 차폐된 디카르보닐-기 (카르보닐- 또는 디카르보닐-기로 쉽게 전환될 수 있음), 또는 보호된 카르보닐- 또는 보호된 디카르보닐-기 (탈보호시에 카르보닐- 또는 디카르보닐-기에 유사한 반응성을 가짐)를 포함한다. 상기 아미노산은 화학식 I의 구조를 갖는 아미노산을 포함한다:
<화학식 I>
Figure pct00012
여기서, A는 선택적이고, 존재할 때 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알크아릴렌, 치환된 알크아릴렌, 아르알킬렌, 또는 치환된 아르알킬렌이고; B는 선택적이고, 존재할 때 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)k- (여기서, k는 1, 2, 또는 3임), -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -NS(O)2-, -OS(O)2-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')'-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-로 이루어진 군으로부터 선택되는 링커이고, 여기서 각각의 R'는 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이고; J는
Figure pct00013
이고,
R은 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 또는 치환된 시클로알킬이고; 각각의 R"는 독립적으로 H, 알킬, 치환된 알킬, 또는 보호기이거나, 또는 하나 초과의 R" 기가 존재할 때 2개의 R"는 임의로 헤테로시클로알킬을 형성하고; R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드이고; R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드이고; 각각의 R3 및 R4는 독립적으로 H, 할로겐, 저급 알킬, 또는 치환된 저급 알킬이거나, 또는 R3 및 R4는 또는 2개의 R3 기는 임의로 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하거나; 또는 -A-B-J-R 기는 함께 디카르보닐 기를 포함하는 적어도 하나의 카르보닐 기, 보호된 디카르보닐 기를 포함하는 보호된 카르보닐 기, 또는 차폐된 디카르보닐 기를 포함하는 차폐된 카르보닐 기를 포함하는 비시클릭 또는 트리시클릭 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하거나; 또는 -J-R 기는 함께 디카르보닐 기를 포함하는 적어도 하나의 카르보닐 기, 보호된 디카르보닐 기를 포함하는 보호된 카르보닐 기, 또는 차폐된 디카르보닐 기를 포함하는 차폐된 카르보닐 기를 포함하는 모노시클릭 또는 비시클릭 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하되; A가 페닐렌이고 각각의 R3이 H일 때, B는 존재하고; A가 -(CH2)4-이고 각각의 R3이 H일 때, B는 -NHC(O)(CH2CH2)-가 아니고; A 및 B가 존재하지 않고 각각의 R3이 H일 때, R은 메틸이 아니다. 상기 비-천연 아미노산은 염 형태일 수 있거나, 또는 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 다당류, 또는 폴리뉴클레오티드 내로 도입되고 임의로 번역후 변형될 수 있다.
특정 실시양태에서, 화학식 I의 화합물은 약산성 조건 하에 적어도 1개월 동안 수용액 내에서 안정하다. 특정 실시양태에서, 화학식 I의 화합물은 약산성 조건 하에 적어도 2주 동안 안정하다. 특정 실시양태에서, 화학식 I의 화합물은 약산성 조건 하에 적어도 5일 동안 안정하다. 특정 실시양태에서, 상기 산성 조건은 pH 2 내지 8이다.
화학식 I의 화합물의 특정 실시양태에서, B는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(R')=N-N(R')-, -N(R')CO-, -C(O)-, -C(R')=N-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, 또는 -S(O)2(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-이다. 화학식 I의 화합물의 특정 실시양태에서, B는 -O(CH2)-, -CH=N-, -CH=N-NH-, -NHCH2-, -NHCO-, -C(O)-, -C(O)-(CH2)-, -CONH-(CH2)-, -SCH2-, -S(=O)CH2- 또는 -S(O)2CH2-이다. 화학식 I의 화합물의 특정 실시양태에서, R은 C1 -6 알킬 또는 시클로알킬이다. 화학식 I의 화합물의 특정 실시양태에서, R은 -CH3, -CH(CH3)2, 또는 시클로프로필이다. 화학식 I의 화합물의 특정 실시양태에서, R1은 H, tert-부틸옥시카르보닐 (Boc), 9-플루오레닐메톡시카르보닐 (Fmoc), N-아세틸, 테트라플루오로아세틸 (TFA), 또는 벤질옥시카르보닐 (Cbz)이다. 화학식 I의 화합물의 특정 실시양태에서, R1은 수지, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드이다. 화학식 I의 화합물의 특정 실시양태에서, R2는 OH, O-메틸, O-에틸, 또는 O-t-부틸이다. 화학식 I의 화합물의 특정 실시양태에서, R2는 수지, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드이다. 화학식 I의 화합물의 특정 실시양태에서, R2는 폴리뉴클레오티드이다. 화학식 I의 화합물의 특정 실시양태에서, R2는 리보핵산 (RNA)이다. 화학식 I의 화합물의 특정 실시양태에서, R2는 tRNA이다. 화학식 I의 화합물의 특정 실시양태에서, tRNA는 셀렉터 (selector) 코돈을 특이적으로 인식한다. 화학식 I의 화합물의 특정 실시양태에서, 셀렉터 코돈은 앰버 (amber) 코돈, 오커 (ochre) 코돈, 오팔 (opal) 코돈, 특유한 코돈, 희귀한 코돈, 비천연 코돈, 5 염기 코돈, 및 4 염기 코돈으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 화학식 I의 화합물의 특정 실시양태에서, R2는 억제제 tRNA이다.
화학식 I의 화합물의 특정 실시양태에서,
Figure pct00014
는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: (i) A는 치환된 저급 알킬렌, C4-아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알크아릴렌, 치환된 알크아릴렌, 아르알킬렌, 또는 치환된 아르알킬렌이고; B는 선택적이고, 존재할 때 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S(O)-, -S(O)2-, -NS(O)2-, -OS(O)2-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -N(R')-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -N(R')C(S)-, -S(O)N(R'), -S(O)2N(R'), -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)N(R')-, -N(R')S(O)2N(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-로 이루어진 군으로부터 선택된 2가 링커이고; (ii) A는 선택적이고, 존재할 때 치환된 저급 알킬렌, C4-아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알크아릴렌, 치환된 알크아릴렌, 아르알킬렌, 또는 치환된 아르알킬렌이고; B는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S(O)-, -S(O)2-, -NS(O)2-, -OS(O)2-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -N(R')-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -N(R')C(S)-, -S(O)N(R'), -S(O)2N(R'), -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)N(R')-, -N(R')S(O)2N(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N-, 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-로 이루어진 군으로부터 선택된 2가 링커이고; (iii) A는 저급 알킬렌이고; B는 선택적이고, 존재할 때 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S(O)-, -S(O)2-, -NS(O)2-, -OS(O)2-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -N(R')-, -C(O)N(R')-, -CSN(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -N(R')C(S)-, -S(O)N(R'), -S(O)2N(R'), -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)N(R')-, -N(R')S(O)2N(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N-, 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-로 이루어진 군으로부터 선택된 2가 링커이고; (iv) A는 페닐렌이고; B는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S(O)-, -S(O)2-, -NS(O)2-, -OS(O)2-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -N(R')-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -N(R')C(S)-, -S(O)N(R'), -S(O)2N(R'), -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)N(R')-, -N(R')S(O)2N(R')-, -N(R')-N=, -C(R')N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N-, 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-로 이루어진 군으로부터 선택된 2가 링커이고; J는
Figure pct00015
이고,
각각의 R'는 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이고; R1은 선택적이고, 존재할 때 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드이고; R2는 선택적이고 존재할 때 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드이고; 각각의 R3 및 R4는 독립적으로 H, 할로겐, 저급 알킬, 또는 치환된 저급 알킬이고; R은 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 또는 치환된 시클로알킬이다.
또한, 화학식 II의 구조를 갖는 아미노산이 포함된다:
<화학식 II>
Figure pct00016
여기서, A는 선택적이고, 존재할 때 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알크아릴렌, 치환된 알크아릴렌, 아르알킬렌, 또는 치환된 아르알킬렌이고; B는 선택적이고, 존재할 때 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)k- (여기서, k는 1, 2, 또는 3임), -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -NS(O)2-, -OS(O)2-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N-, 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-로 이루어진 군으로부터 선택되는 링커이고, 여기서 각각의 R'는 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이고; R은 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 또는 치환된 시클로알킬이고; R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드이고; R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드이다. 특정 실시양태에서, A가 페닐렌일 때, B는 존재하고; A가 -(CH2)4-일 때, B는 -NHC(O)(CH2CH2)-가 아니고; A 및 B가 존재하지 않을 때, R은 메틸이 아니다. 상기 비-천연 아미노산은 염 형태일 수 있거나, 또는 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 다당류, 또는 폴리뉴클레오티드 내로 도입되고 임의로 번역후 변형될 수 있다.
또한, 화학식 III의 구조를 갖는 아미노산이 포함된다:
<화학식 III>
Figure pct00017
여기서, B는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)k- (여기서, k는 1, 2, 또는 3임), -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -NS(O)2-, -OS(O)2-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-로 이루어진 군으로부터 선택되는 링커이고, 여기서 각각의 R'는 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이고; R은 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 또는 치환된 시클로알킬이고; R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드이고; R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드이고; 각각의 Ra는 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, -N(R')2, -C(O)kR' (여기서, k는 1, 2, 또는 3임), -C(O)N(R')2, -OR', 및 -S(O)kR'로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고, 여기서 각각의 R'는 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이다. 상기 비-천연 아미노산은 염 형태일 수 있거나, 또는 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 다당류, 또는 폴리뉴클레오티드 내로 도입되고 임의로 번역후 변형될 수 있다.
또한, 하기 아미노산이 포함된다:
Figure pct00018
상기 비-천연 아미노산은 임의로 아미노 보호된 기, 카르복실 보호된 기 및/또는 염 형태일 수 있거나, 또는 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 다당류, 또는 폴리뉴클레오티드 내로 도입되고 임의로 번역후 변형될 수 있다.
또한, 하기 화학식 IV의 구조를 갖는 아미노산이 포함된다:
<화학식 IV>
Figure pct00019
여기서, -NS(O)2-, -OS(O)2-는 선택적이고, 존재할 때 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)k- (여기서, k는 1, 2, 또는 3임), -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-로 이루어진 군으로부터 선택되는 링커이고, 여기서 각각의 R'는 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이고; R은 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 또는 치환된 시클로알킬이고; R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드이고; R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드이고; 각각의 Ra는 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, -N(R')2, -C(O)kR' (여기서, k는 1, 2, 또는 3임), -C(O)N(R')2, -OR', 및 -S(O)kR'로 이루어진 군으로부터 선택되는 링커이고, 여기서 각각의 R'는 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이고; n은 0 내지 8이다. 특정 실시양태에서, A가 -(CH2)4-일 때, B는 -NHC(O)(CH2CH2)-가 아니다. 상기 비-천연 아미노산은 염 형태일 수 있거나, 또는 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 다당류, 또는 폴리뉴클레오티드 내로 도입되고 임의로 번역후 변형될 수 있다.
또한, 하기 아미노산이 포함된다:
Figure pct00020
여기서, 상기 화합물은 임의로 아미노 보호된, 임의로 카르복실 보호된, 임의로 아미노 보호된 및 카르복실 보호된, 또는 그의 염 형태일 수 있거나, 또는 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 다당류, 또는 폴리뉴클레오티드 내로 도입되고 임의로 번역후 변형될 수 있다.
또한, 하기 화학식 VIII의 구조를 갖는 아미노산이 포함된다:
<화학식 VIII>
Figure pct00021
여기서, A는 선택적이고, 존재할 때 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알크아릴렌, 치환된 알크아릴렌, 아르알킬렌, 또는 치환된 아르알킬렌이고; B는 선택적이고, 존재할 때 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)k- (여기서, k는 1, 2, 또는 3임), -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -NS(O)2-, -OS(O)2-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N-, 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-로 이루어진 군으로부터 선택되는 링커이고, 여기서 각각의 R'는 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이고; R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드이고; R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드이다. 상기 비-천연 아미노산은 염 형태일 수 있거나, 또는 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 다당류, 또는 폴리뉴클레오티드 내로 도입되고 임의로 번역후 변형될 수 있다.
또한, 하기 화학식 IX의 구조를 갖는 아미노산이 포함된다:
<화학식 IX>
Figure pct00022
여기서, B는 선택적이고, 존재할 때 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)k- (여기서, k는 1, 2, 또는 3임), -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -NS(O)2-, -OS(O)2-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N-, 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-로 이루어진 군으로부터 선택되는 링커이고, 여기서 각각의 R'는 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이고; R은 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 또는 치환된 시클로알킬이고; R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드이고; R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드이고, 여기서 각각의 Ra는 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, -N(R')2, -C(O)kR' (여기서, k는 1, 2, 또는 3임), -C(O)N(R')2, -OR', 및 -S(O)kR'로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고, 여기서 각각의 R'은 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이다. 상기 비-천연 아미노산은 염 형태일 수 있거나, 또는 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 다당류, 또는 폴리뉴클레오티드 내로 도입되고 임의로 번역후 변형될 수 있다.
또한, 하기 아미노산이 포함된다:
Figure pct00023
여기서, 상기 화합물은 임의로 아미노 보호된, 임의로 카르복실 보호된, 임의로 아미노 보호된 및 카르복실 보호된, 또는 그의 염 형태일 수 있거나, 또는 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 다당류, 또는 폴리뉴클레오티드 내로 도입되고 임의로 번역후 변형될 수 있다.
또한, 하기 화학식 X의 구조를 갖는 아미노산이 포함된다:
<화학식 X>
Figure pct00024
여기서, B는 선택적이고, 존재할 때 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)k- (여기서, k는 1, 2, 또는 3임), -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -NS(O)2-, -OS(O)2-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-로 이루어진 군으로부터 선택되는 링커이고, 여기서 각각의 R'는 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이고; R은 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 또는 치환된 시클로알킬이고; R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드이고; R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드이고; 각각의 Ra는 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, -N(R')2, -C(O)kR' (여기서, k는 1, 2, 또는 3임), -C(O)N(R')2, -OR', 및 -S(O)kR'로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고, 여기서 각각의 R'는 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이고; n은 0 내지 8이다. 상기 비-천연 아미노산은 염 형태일 수 있거나, 또는 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 다당류, 또는 폴리뉴클레오티드 내로 도입되고 임의로 번역후 변형될 수 있다.
또한, 하기 아미노산이 포함된다:
Figure pct00025
여기서, 상기 화합물은 임의로 아미노 보호된, 임의로 카르복실 보호된, 임의로 아미노 보호된 및 카르복실 보호된, 또는 그의 염 형태일 수 있거나, 또는 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 다당류, 또는 폴리뉴클레오티드 내로 도입되고 임의로 번역후 변형될 수 있다.
모노카르보닐 구조 이외에, 본원에서 설명되는 비-천연 아미노산은 디카르보닐, 디카르보닐 유사, 차폐된 디카르보닐 및 보호된 디카르보닐 기와 같은 기를 포함할 수 있다. 예를 들어, 하기 화학식 V의 구조를 갖는 아미노산이 포함된다:
<화학식 V>
Figure pct00026
여기서, A는 선택적이고, 존재할 때 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알크아릴렌, 치환된 알크아릴렌, 아르알킬렌, 또는 치환된 아르알킬렌이고; B는 선택적이고, 존재할 때 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)k- (여기서, k는 1, 2, 또는 3임), -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -NS(O)2-, -OS(O)2-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-로 이루어진 군으로부터 선택되는 링커이고, 여기서 각각의 R'는 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이고; R은 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 또는 치환된 시클로알킬이고; R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드이고; R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드이다. 상기 비-천연 아미노산은 염 형태일 수 있거나, 또는 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 다당류, 또는 폴리뉴클레오티드 내로 도입되고 임의로 번역후 변형될 수 있다.
또한, 하기 화학식 VI의 구조를 갖는 아미노산이 포함된다:
<화학식 VI>
Figure pct00027
여기서, B는 선택적이고, 존재할 때 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)k- (여기서, k는 1, 2, 또는 3임), -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -NS(O)2-, -OS(O)2-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-로 이루어진 군으로부터 선택되는 링커이고, 여기서 각각의 R'는 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이고; R은 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 또는 치환된 시클로알킬이고; R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드이고; R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드이고, 여기서 각각의 Ra는 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, -N(R')2, -C(O)kR' (여기서, k는 1, 2, 또는 3임), -C(O)N(R')2, -OR', 및 -S(O)kR'로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고, 여기서 각각의 R'는 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이다. 상기 비-천연 아미노산은 염 형태일 수 있거나, 또는 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 다당류, 또는 폴리뉴클레오티드 내로 도입되고 임의로 번역후 변형될 수 있다.
또한, 하기 아미노산이 포함된다:
Figure pct00028
여기서, 상기 화합물은 임의로 아미노 보호된 및 카르복실 보호된, 또는 그의 염이다. 상기 비-천연 아미노산은 염 형태일 수 있거나, 또는 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 다당류, 또는 폴리뉴클레오티드 내로 도입되고 임의로 번역후 변형될 수 있다.
또한, 하기 화학식 VII의 구조를 갖는 아미노산이 포함된다:
<화학식 VII>
Figure pct00029
여기서, B는 선택적이고, 존재할 때 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)k- (여기서, k는 1, 2, 또는 3임), -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -NS(O)2-, -OS(O)2-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-로 이루어진 군으로부터 선택되는 링커이고, 여기서 각각의 R'는 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이고; R은 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 또는 치환된 시클로알킬이고; R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드이고; R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드이고; 각각의 Ra는 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, -N(R')2, -C(O)kR' (여기서, k는 1, 2, 또는 3임), -C(O)N(R')2, -OR', 및 -S(O)kR'로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고, 여기서 각각의 R'는 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이고; n은 0 내지 8이다. 상기 비-천연 아미노산은 염 형태일 수 있거나, 또는 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 다당류, 또는 폴리뉴클레오티드 내로 도입되고 임의로 번역후 변형될 수 있다.
또한, 하기 아미노산이 포함된다:
Figure pct00030
여기서, 상기 화합물은 임의로 아미노 보호된 및 카르복실 보호된, 또는 그의 염 형태일 수 있거나, 또는 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 다당류, 또는 폴리뉴클레오티드 내로 도입되고 임의로 번역후 변형될 수 있다.
또한, 하기 화학식 XXX의 구조를 갖는 아미노산이 포함된다:
<화학식 XXX>
Figure pct00031
여기서, A는 선택적이고, 존재할 때 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알크아릴렌, 치환된 알크아릴렌, 아르알킬렌, 또는 치환된 아르알킬렌이고; R은 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 또는 치환된 시클로알킬이고; R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드이고; R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드이고; X1은 C, S, 또는 S(O)이고; L은 알킬렌, 치환된 알킬렌, N(R')(알킬렌) 또는 N(R')(치환된 알킬렌)이고, 여기서 R'는 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 또는 치환된 시클로알킬이다. 상기 비-천연 아미노산은 염 형태일 수 있거나, 또는 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 다당류, 또는 폴리뉴클레오티드 내로 도입되고 임의로 번역후 변형될 수 있다.
또한, 하기 화학식 XXX-A의 구조를 갖는 아미노산이 포함된다:
<화학식 XXX-A>
Figure pct00032
여기서, A는 선택적이고, 존재할 때 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알크아릴렌, 치환된 알크아릴렌, 아르알킬렌, 또는 치환된 아르알킬렌이고; R은 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 또는 치환된 시클로알킬이고; R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드이고; R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드이고; L은 알킬렌, 치환된 알킬렌, N(R')(알킬렌) 또는 N(R')(치환된 알킬렌)이고, 여기서 R'는 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 또는 치환된 시클로알킬이다. 상기 비-천연 아미노산은 염 형태일 수 있거나, 또는 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 다당류, 또는 폴리뉴클레오티드 내로 도입되고 임의로 번역후 변형될 수 있다.
또한, 하기 화학식 XXX-B의 구조를 갖는 아미노산이 포함된다:
<화학식 XXX-B>
Figure pct00033
여기서, A는 선택적이고, 존재할 때 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알크아릴렌, 치환된 알크아릴렌, 아르알킬렌, 또는 치환된 아르알킬렌이고; R은 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 또는 치환된 시클로알킬이고; R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드이고; R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드이고; L은 알킬렌, 치환된 알킬렌, N(R')(알킬렌) 또는 N(R')(치환된 알킬렌)이고, 여기서 R'는 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 또는 치환된 시클로알킬이다. 상기 비-천연 아미노산은 염 형태일 수 있거나, 또는 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 다당류, 또는 폴리뉴클레오티드 내로 도입되고 임의로 번역후 변형될 수 있다.
또한, 하기 화학식 XXXI의 구조를 갖는 아미노산이 포함된다:
<화학식 XXXI>
Figure pct00034
여기서, A는 선택적이고, 존재할 때 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알크아릴렌, 치환된 알크아릴렌, 아르알킬렌, 또는 치환된 아르알킬렌이고; R은 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 또는 치환된 시클로알킬이고; R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드이고; R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드이고; X1은 C, S, 또는 S(O)이고; n은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5이고; 각각의 CR8R9 기 상의 각각의 R8 및 R9는 H, 알콕시, 알킬아민, 할로겐, 알킬, 아릴로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되거나, 또는 임의의 R8 및 R9는 함께 =O 또는 시클로알킬을 형성할 수 있거나, 또는 임의의 인접한 R8 기는 함께 시클로알킬을 형성할 수 있다. 상기 비-천연 아미노산은 염 형태일 수 있거나, 또는 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 다당류, 또는 폴리뉴클레오티드 내로 도입되고 임의로 번역후 변형될 수 있다.
또한, 하기 화학식 XXXI-A의 구조를 갖는 아미노산이 포함된다:
<화학식 XXXI-A>
Figure pct00035
여기서, A는 선택적이고, 존재할 때 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알크아릴렌, 치환된 알크아릴렌, 아르알킬렌, 또는 치환된 아르알킬렌이고; R은 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 또는 치환된 시클로알킬이고; R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드이고; R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드이고; n은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5이고; 각각의 CR8R9 기 상의 각각의 R8 및 R9는 H, 알콕시, 알킬아민, 할로겐, 알킬, 아릴로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되거나, 또는 임의의 R8 및 R9는 함께 =O 또는 시클로알킬을 형성할 수 있거나, 또는 임의의 인접한 R8 기는 함께 시클로알킬을 형성할 수 있다. 상기 비-천연 아미노산은 염 형태일 수 있거나, 또는 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 다당류, 또는 폴리뉴클레오티드 내로 도입되고 임의로 번역후 변형될 수 있다.
또한, 하기 화학식 XXXI-B의 구조를 갖는 아미노산이 포함된다:
<화학식 XXXI-B>
Figure pct00036
여기서, A는 선택적이고, 존재할 때 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알크아릴렌, 치환된 알크아릴렌, 아르알킬렌, 또는 치환된 아르알킬렌이고; R은 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 또는 치환된 시클로알킬이고; R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드이고; R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드이고; n은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5이고; 각각의 CR8R9 기 상의 각각의 R8 및 R9는 H, 알콕시, 알킬아민, 할로겐, 알킬, 아릴로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되거나, 또는 임의의 R8 및 R9는 함께 =O 또는 시클로알킬을 형성할 수 있거나, 또는 임의의 인접한 R8 기는 함께 시클로알킬을 형성할 수 있다. 상기 비-천연 아미노산은 염 형태일 수 있거나, 또는 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 다당류, 또는 폴리뉴클레오티드 내로 도입되고 임의로 번역후 변형될 수 있다.
또한, 하기 화학식 XXXII의 구조를 갖는 아미노산이 포함된다:
<화학식 XXXII>
Figure pct00037
여기서, A는 선택적이고, 존재할 때 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알크아릴렌, 치환된 알크아릴렌, 아르알킬렌, 또는 치환된 아르알킬렌이고; R은 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 또는 치환된 시클로알킬이고; R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드이고; R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드이고; X1은 C, S, 또는 S(O)이고; L은 알킬렌, 치환된 알킬렌, N(R')(알킬렌) 또는 N(R')(치환된 알킬렌)이고, 여기서 R'는 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 또는 치환된 시클로알킬이다. 상기 비-천연 아미노산은 염 형태일 수 있거나, 또는 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 다당류, 또는 폴리뉴클레오티드 내로 도입되고 임의로 번역후 변형될 수 있다.
또한, 하기 화학식 XXXII-A의 구조를 갖는 아미노산이 포함된다:
<화학식 XXXII-A>
Figure pct00038
여기서, A는 선택적이고, 존재할 때 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알크아릴렌, 치환된 알크아릴렌, 아르알킬렌, 또는 치환된 아르알킬렌이고; R은 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 또는 치환된 시클로알킬이고; R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드이고; R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드이고; L은 알킬렌, 치환된 알킬렌, N(R')(알킬렌) 또는 N(R')(치환된 알킬렌)이고, 여기서 R'는 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 또는 치환된 시클로알킬이다. 상기 비-천연 아미노산은 염 형태일 수 있거나, 또는 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 다당류, 또는 폴리뉴클레오티드 내로 도입되고 임의로 번역후 변형될 수 있다.
또한, 하기 화학식 XXXII-B의 구조를 갖는 아미노산이 포함된다:
<화학식 XXXII-B>
Figure pct00039
여기서, A는 선택적이고, 존재할 때 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알크아릴렌, 치환된 알크아릴렌, 아르알킬렌, 또는 치환된 아르알킬렌이고; R은 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 또는 치환된 시클로알킬이고; R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드이고; R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드이고; L은 알킬렌, 치환된 알킬렌, N(R')(알킬렌) 또는 N(R')(치환된 알킬렌)이고, 여기서 R'는 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 또는 치환된 시클로알킬이다. 상기 비-천연 아미노산은 염 형태일 수 있거나, 또는 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 다당류, 또는 폴리뉴클레오티드 내로 도입되고 임의로 번역후 변형될 수 있다.
또한, 화학식 XXXX의 구조를 갖는 아미노산이 포함된다:
<화학식 XXXX>
Figure pct00040
여기서, A는 선택적이고, 존재할 때 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알크아릴렌, 치환된 알크아릴렌, 아르알킬렌, 또는 치환된 아르알킬렌;
Figure pct00041
이고,
여기서, (a)는 A 기에 대한 결합을 나타내고 (b)는 각각의 카르보닐 기에 대한 결합을 나타내고, R3 및 R4는 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 또는 치환된 시클로알킬로부터 독립적으로 선택되거나, 또는 R3 및 R4 또는 2개의 R3 기 또는 2개의 R4 기는 임의로 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하고; R은 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 또는 치환된 시클로알킬이고; T3은 결합, C(R)(R), O, 또는 S이고, R은 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 또는 치환된 시클로알킬이고; R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드이고; R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드이다. 상기 비-천연 아미노산은 염 형태일 수 있거나, 또는 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 다당류, 또는 폴리뉴클레오티드 내로 도입되고 임의로 번역후 변형될 수 있다.
또한, 화학식 XXXXI의 구조를 갖는 아미노산이 포함된다:
<화학식 XXXXI>
Figure pct00042
여기서,
Figure pct00043
여기서, (a)는 A 기에 대한 결합을 나타내고 (b)는 각각의 카르보닐 기에 대한 결합을 나타내고, R3 및 R4는 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 또는 치환된 시클로알킬로부터 독립적으로 선택되거나, 또는 R3 및 R4 또는 2개의 R3 기 또는 2개의 R4 기는 임의로 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하고; R은 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 또는 치환된 시클로알킬이고; T3은 결합, C(R)(R), O, 또는 S이고, R은 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 또는 치환된 시클로알킬이고; R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드이고; R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드이고; 각각의 Ra는 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, -N(R')2, -C(O)kR' (여기서, k는 1, 2, 또는 3임), -C(O)N(R')2, -OR', 및 -S(O)kR'로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고, 여기서 각각의 R'는 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이다. 상기 비-천연 아미노산은 염 형태일 수 있거나, 또는 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 다당류, 또는 폴리뉴클레오티드 내로 도입되고 임의로 번역후 변형될 수 있다.
또한, 화학식 XXXXII의 구조를 갖는 아미노산이 포함된다:
<화학식 XXXXII>
Figure pct00044
여기서, R은 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 또는 치환된 시클로알킬이고; T3은 O, 또는 S이다. 상기 비-천연 아미노산은 염 형태일 수 있거나, 또는 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 다당류, 또는 폴리뉴클레오티드 내로 도입되고 임의로 번역후 변형될 수 있다.
또한, 화학식 XXXXIII의 구조를 갖는 아미노산이 포함된다:
<화학식 XXXXIII>
Figure pct00045
여기서, R은 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 또는 치환된 시클로알킬이다.
또한, 하기 화학식 XXXXIII의 구조를 갖는 아미노산이 포함된다:
Figure pct00046
상기 비-천연 아미노산은 염 형태일 수 있거나, 또는 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 다당류, 또는 폴리뉴클레오티드 내로 도입되고 임의로 번역후 변형될 수 있다.
히드록실아민 (또한 아미노옥시로도 불림) 기를 함유하는 비-천연 아미노산은 다양한 친전자성 기 (PEG 또는 다른 수용성 중합체를 포함하고 이로 제한되지 않음)와 반응하여 접합체를 형성하는 것을 허용한다. 히드라진, 히드라지드 및 세미카르바지드처럼, 아미노옥시 기의 향상된 친핵성 때문에 이 기는 케톤, 알데히드 또는 유사한 화학적 반응성을 갖는 다른 기능성 기를 포함하고 이로 제한되지 않는 카르보닐- 또는 디카르보닐-기를 함유하는 다양한 분자와 효율적으로 및 선택적으로 반응할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Shao, J. and Tam, J., J. Am. Chem. Soc. 117:3893-3899 (1995)]; [H. Hang and C. Bertozzi, Acc. Chem. Res. 34(9): 727-736 (2001)]을 참조한다. 히드라진 기와의 반응 결과는 상응하는 히드라존인 반면, 옥심은 일반적으로 아미노옥시 기와 카르보닐- 또는 디카르보닐-함유 기, 예컨대 케톤, 알데히드 또는 유사한 화학적 반응성을 갖는 다른 기능성 기와의 반응에 의해 생성된다.
따라서, 본원의 특정 실시양태에서 히드록실아민 기, 히드록실아민-유사 기 (히드록실아민 기와 유사한 반응성을 갖고 히드록실아민 기와 구조적으로 유사한), 차폐된 히드록실아민 기 (히드록실아민 기로 쉽게 전환될 수 있는), 또는 보호된 히드록실아민 기 (탈보호시에 히드록실아민 기에 유사한 반응성을 갖는)를 포함하는 측쇄를 갖는 비-천연 아미노산이 설명된다. 상기 아미노산은 화학식 XIV의 구조를 갖는 아미노산을 포함한다:
<화학식 XIV>
Figure pct00047
여기서, A는 선택적이고, 존재할 때 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알크아릴렌, 치환된 알크아릴렌, 아르알킬렌, 또는 치환된 아르알킬렌이고; B는 선택적이고, 존재할 때 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)k- (여기서, k는 1, 2, 또는 3임), -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -NS(O)2-, -OS(O)2-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N-, 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-로 이루어진 군으로부터 선택되는 링커이고, 여기서 각각의 R'는 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이고; K는 -NR6R7 또는 -N=CR6R7이고; R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드이고; R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드이고; 각각의 R3 및 R4는 독립적으로 H, 할로겐, 저급 알킬, 또는 치환된 저급 알킬이거나, 또는 R3 및 R4 또는 2개의 R3 기는 임의로 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하고; 각각의 R6 및 R7은 H, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 폴리알킬렌 옥시드, 치환된 폴리알킬렌 옥시드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 알크아릴, 치환된 알크아릴, 아르알킬, 및 치환된 아르알킬, -C(O)R", -C(O)2R", -C(O)N(R")2로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고, 여기서 각각의 R"는 독립적으로 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 알크아릴, 치환된 알크아릴, 아르알킬, 또는 치환된 아르알킬이거나; 또는 R6 또는 R7은 L-X이고, 여기서 X는 표지; 염료; 중합체; 수용성 중합체; 폴리에틸렌 글리콜의 유도체; 광가교결합제; 세포독성 화합물; 약물; 친화도 표지; 광친화도 표지; 반응성 화합물; 수지; 제2 단백질 또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체; 항체 또는 항체 단편; 금속 킬레이터; 보조인자; 지방산; 탄수화물; 폴리뉴클레오티드; DNA; RNA; 안티센스 폴리뉴클레오티드; 당류, 수용성 덴드리머, 시클로덱스트린, 생체재료; 나노입자; 스핀 표지; 형광단, 금속-함유 모이어티; 방사성 모이어티; 신규한 기능성 기; 다른 분자와 공유 또는 비공유 상호작용하는 기; 광케이징된 모이어티; 광이성질체화가능 모이어티; 비오틴; 비오틴 유사체; 중원자를 포함하는 모이어티; 화학적 절단가능 기; 광절단가능 기; 연장된 측쇄; 탄소-연결된 당; 레독스-활성제; 아미노 티오산; 독성 모이어티; 동위원소로 표지된 모이어티; 생물리학적 프로브; 인광 기; 화학발광기; 전자 고밀도 기; 자기 기; 삽입 (intercalating) 기; 발색단 (chromophore); 에너지 전달제; 생물학적 활성제; 검출가능 표지; 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고; L은 선택적이고, 존재할 때 알킬렌, 치환된 알킬렌, 알케닐렌, 치환된 알케닐렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)k- (여기서, k는 1, 2, 또는 3임), -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N-, 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-로 이루어진 군으로부터 선택되는 링커이고, 여기서 각각의 R'는 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이다. 상기 비-천연 아미노산은 염 형태일 수 있거나, 또는 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 다당류, 또는 폴리뉴클레오티드 내로 도입되고 임의로 번역후 변형될 수 있다.
화학식 XIV의 화합물의 특정 실시양태에서, A는 페닐렌 또는 치환된 페닐렌이다. 화학식 XIV의 화합물의 특정 실시양태에서, B는 -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, 또는 -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-이다. 화학식 XIV의 화합물의 특정 실시양태에서, B는 -O(CH2)2-, -S(CH2)2-, -NH(CH2)2-, -CO(CH2)2- 또는 -(CH2)n-이고, 여기서 n은 1 내지 4이다. 화학식 XIV의 화합물의 특정 실시양태에서, R1은 H, tert-부틸옥시카르보닐 (Boc), 9-플루오레닐메톡시카르보닐 (Fmoc), N-아세틸, 테트라플루오로아세틸 (TFA), 또는 벤질옥시카르보닐 (Cbz)이다. 화학식 XIV의 화합물의 특정 실시양태에서, R1은 수지, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드이다. 화학식 XIV의 화합물의 특정 실시양태에서, R2는 OH, O-메틸, O-에틸, 또는 O-t-부틸이다. 화학식 XIV의 화합물의 특정 실시양태에서, R2는 수지, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드이다. 화학식 XIV의 화합물의 특정 실시양태에서, R2는 폴리뉴클레오티드이다. 화학식 XIV의 화합물의 특정 실시양태에서, R2는 리보핵산 (RNA)이다. 화학식 XIV의 화합물의 특정 실시양태에서, R2는 tRNA이다. 화학식 XIV의 화합물의 특정 실시양태에서, tRNA는 앰버 코돈, 오커 코돈, 오팔 코돈, 특유한 코돈, 희귀한 코돈, 비천연 코돈, 5 염기 코돈, 및 4 염기 코돈으로 이루어진 군으로부터 선택되는 코돈을 특이적으로 인식한다. 화학식 XIV의 화합물의 특정 실시양태에서, R2는 억제제 tRNA이다. 화학식 XIV의 화합물의 특정 실시양태에서, 각각의 R6 및 R7은 H, 알킬, 치환된 알킬, 알콕시, 치환된 알콕시, 폴리알킬렌 옥시드, 치환된 폴리알킬렌 옥시드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 알크아릴, 치환된 알크아릴, 아르알킬, 및 치환된 아르알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 화학식 XIV의 화합물의 특정 실시양태에서, 각각의 R6 및 R7은 H, 메틸, 페닐, 및 -[(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-O-(수소, 알킬, 또는 치환된 알킬)]x (여기서, x는 1-50임)로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 화학식 XIV의 화합물의 특정 실시양태에서, K는 -NR6R7이다.
화학식 XIV의 화합물의 특정 실시양태에서, X는 펩티드, 단백질, 효소, 항체, 약물, 염료, 지질, 뉴클레오시드, 올리고뉴클레오티드, 세포, 바이러스, 리포좀, 미세입자, 및 미셀로 이루어진 군으로부터 선택되는 생물학적 활성제이다. 화학식 XIV의 화합물의 특정 실시양태에서, X는 항생제, 살진균제, 항-바이러스제, 소염제, 항종양제, 심혈관제, 항-불안제, 호르몬, 성장 인자, 및 스테로이드제로 이루어진 군으로부터 선택되는 약물이다. 화학식 XIV의 화합물의 특정 실시양태에서, X는 양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 및 글루코스 옥시다제로 이루어진 군으로부터 선택되는 효소이다. 화학식 XIV의 화합물의 특정 실시양태에서, X는 형광, 인광, 화학발광, 킬레이팅, 전자 고밀도, 자기, 삽입, 방사성, 발색성, 및 에너지 전달 모이어티로 이루어진 군으로부터 선택되는 검출가능 표지이다.
특정 실시양태에서, 화학식 XIV의 화합물은 약산성 조건 하에 적어도 1개월 동안 수용액 내에서 안정하다. 특정 실시양태에서, 화학식 XIV의 화합물은 약산성 조건 하에 적어도 2주 동안 안정하다. 특정 실시양태에서, 화학식 XIV의 화합물은 약산성 조건 하에 적어도 5일 동안 안정하다. 특정 실시양태에서, 상기산성 조건은 pH 2 내지 8이다.
상기 아미노산은 화학식 XV의 구조를 갖는 아미노산을 포함한다:
<화학식 XV>
Figure pct00048
여기서, A는 선택적이고, 존재할 때 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알크아릴렌, 치환된 알크아릴렌, 아르알킬렌, 또는 치환된 아르알킬렌이고; B는 선택적이고, 존재할 때 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)k- (여기서, k는 1, 2, 또는 3임), -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -NS(O)2-, -OS(O)2-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-로 이루어진 군으로부터 선택되는 링커이고, 여기서 각각의 R'는 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이고; R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드이고; R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드이고; 각각의 R3 및 R4는 독립적으로 H, 할로겐, 저급 알킬, 또는 치환된 저급 알킬이거나, 또는 R3 및 R4 또는 2개의 R3 기는 임의로 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성한다. 상기 비-천연 아미노산은 염 형태일 수 있거나, 또는 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 다당류, 또는 폴리뉴클레오티드 내로 도입되고 임의로 번역후 변형될 수 있다.
비-제한적인 대표적인 아미노산은 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00049
상기 비-천연 아미노산은 염 형태일 수 있거나, 또는 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 다당류, 또는 폴리뉴클레오티드 내로 도입되고 임의로 번역후 변형될 수 있다.
옥심 기를 함유하는 비-천연 아미노산은 특정 반응성 카르보닐- 또는 디카르보닐-기 (케톤, 알데히드, 또는 유사한 반응성을 갖는 다른 기를 포함하고 이로 제한되지 않음)를 함유하는 다양한 시약과 반응하여 새로운 옥심 기를 포함하는 새로운 비-천연 아미노산을 형성하는 것을 허용한다. 상기 옥심 교환 반응은 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 추가의 기능성화를 허용한다. 또한, 옥심 기를 함유하는 본래의 비-천연 아미노산은 폴리펩티드 내로 아미노산을 도입하기 위해 필요한 조건 (예를 들어, 본원에 설명되는 생체내, 시험관내 및 화학적 합성 방법) 하에 옥심 연결이 안정하다면 그 자체 권리로서 유용할 수 있다.
따라서, 본원의 특정 실시양태에서 옥심 기, 옥심-유사 기 (옥심 기와 유사한 반응성을 갖고 옥심 기에 구조적으로 유사함), 차폐된 옥심 기 (옥심 기로 쉽게 전환될 수 있음), 또는 보호된 옥심 기 (탈보호시에 옥심 기와 유사한 반응성을 가짐)를 포함하는 측쇄를 갖는 비-천연 아미노산이 설명된다. 상기 아미노산은 화학식 XI의 구조를 갖는 아미노산을 포함한다:
<화학식 XI>
Figure pct00050
여기서, A는 선택적이고, 존재할 때 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알크아릴렌, 치환된 알크아릴렌, 아르알킬렌, 또는 치환된 아르알킬렌이고; B는 선택적이고, 존재할 때 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)k- (여기서, k는 1, 2, 또는 3임), -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -NS(O)2-, -OS(O)2-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-로 이루어진 군으로부터 선택되는 링커이고, 여기서 각각의 R'는 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이고; R은 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 또는 치환된 시클로알킬이고; R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드이고; R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드이고; 각각의 R3 및 R4는 독립적으로 H, 할로겐, 저급 알킬, 또는 치환된 저급 알킬이거나, 또는 R3 및 R4 또는 2개의 R3은 임의로 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하고; R5는 H, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 알킬알콕시, 치환된 알킬알콕시, 폴리알킬렌 옥시드, 치환된 폴리알킬렌 옥시드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 알크아릴, 치환된 알크아릴, 아르알킬, 치환된 아르알킬, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-ON(R")2, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-C(O)SR", -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-S-(아릴 또는 치환된 아릴), -C(O)R", -C(O)2R", 또는 -C(O)N(R")2이고, 여기서 각각의 R"는 독립적으로 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 알크아릴, 치환된 알크아릴, 아르알킬, 또는 치환된 아르알킬이거나; 또는 R5는 L-X이고, 여기서 X는 표지; 염료; 중합체; 수용성 중합체; 폴리에틸렌 글리콜의 유도체; 광가교결합제; 세포독성 화합물; 약물; 친화도 표지; 광친화도 표지; 반응성 화합물; 수지; 제2 단백질 또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체; 항체 또는 항체 단편; 금속 킬레이터; 보조인자; 지방산; 탄수화물; 폴리뉴클레오티드; DNA; RNA; 안티센스 폴리뉴클레오티드; 당류, 수용성 덴드리머, 시클로덱스트린, 생체재료; 나노입자; 스핀 표지; 형광단, 금속-함유 모이어티; 방사성 모이어티; 신규한 기능성 기; 다른 분자와 공유 또는 비공유 상호작용하는 기; 광케이징된 모이어티; 광이성질체화가능 모이어티; 비오틴; 비오틴 유사체; 중원자를 포함하는 모이어티; 화학적 절단가능 기; 광절단가능 기; 연장된 측쇄; 탄소-연결된 당; 레독스-활성제; 아미노 티오산; 독성 모이어티; 동위원소로 표지된 모이어티; 생물리학적 프로브; 인광 기; 화학발광기; 전자 고밀도 기; 자기 기; 삽입 기; 발색단; 에너지 전달제; 생물학적 활성제; 검출가능 표지; 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고; L은 선택적이고, 존재할 때 알킬렌, 치환된 알킬렌, 알케닐렌, 치환된 알케닐렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)k- (여기서, k는 1, 2, 또는 3임), -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-O-N=CR'-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-C(O)NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S(O)k-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-S-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-로 이루어진 군으로부터 선택되는 링커이고, 여기서 각각의 R'는 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이되; A 및 B가 존재하지 않을 때, R은 메틸이 아니다. 상기 비-천연 아미노산은 염 형태일 수 있거나, 또는 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 다당류, 또는 폴리뉴클레오티드 내로 도입되고 임의로 번역후 변형될 수 있다.
화학식 XI의 화합물의 특정 실시양태에서, B는 -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-이다. 화학식 XI의 화합물의 특정 실시양태에서, B는 -O(CH2)-이다. 화학식 XI의 화합물의 특정 실시양태에서, R은 C1 -4 알킬이다. 화학식 XI의 화합물의 특정 실시양태에서, R은 -CH3이다. 화학식 XI의 화합물의 특정 실시양태에서, R1은 H, tert-부틸옥시카르보닐 (Boc), 9-플루오레닐메톡시카르보닐 (Fmoc), N-아세틸, 테트라플루오로아세틸 (TFA), 또는 벤질옥시카르보닐 (Cbz)이다. 화학식 XI의 화합물의 특정 실시양태에서, R1은 수지, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드이다. 화학식 XI의 화합물의 특정 실시양태에서, R2는 OH, O-메틸, O-에틸, 또는 O-t-부틸이다. 화학식 XI의 화합물의 특정 실시양태에서, R2는 수지, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드이다. 화학식 XI의 화합물의 특정 실시양태에서, R2는 폴리뉴클레오티드이다. 화학식 XI의 화합물의 특정 실시양태에서, R2는 리보핵산 (RNA)이다. 화학식 XI의 화합물의 특정 실시양태에서, R2는 tRNA이다. 화학식 XI의 화합물의 특정 실시양태에서, tRNA는 셀렉터 코돈을 특이적으로 인식한다. 화학식 XI의 화합물의 특정 실시양태에서, 셀렉터 코돈은 앰버 코돈, 오커 코돈, 오팔 코돈, 특유한 코돈, 희귀한 코돈, 비천연 코돈, 5 염기 코돈, 및 4 염기 코돈으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 화학식 XI의 화합물의 특정 실시양태에서, R2는 억제제 tRNA이다. 화학식 XI의 화합물의 특정 실시양태에서, R5는 알킬알콕시, 치환된 알킬알콕시, 폴리알킬렌 옥시드, 치환된 폴리알킬렌 옥시드, 또는 -C(O)2R"이다. 화학식 XI의 화합물의 특정 실시양태에서, R5는 -[(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-O-(수소, 알킬, 또는 치환된 알킬)]x이고, 여기서 x는 1-50이다. 화학식 XI의 화합물의 특정 실시양태에서, R5는 -(CH2CH2)-O-CH3 또는 -COOH이다.
특정 실시양태에서, 화학식 XI의 화합물은 약산성 조건 하에 적어도 1개월 동안 수용액 내에서 안정하다. 특정 실시양태에서, 화학식 XI의 화합물은 약산성 조건 하에 적어도 2주 동안 안정하다. 특정 실시양태에서, 화학식 XI의 화합물은 약산성 조건 하에 적어도 5일 동안 안정하다. 특정 실시양태에서, 상기 산성 조건은 pH 2 내지 8이다.
화학식 XI의 아미노산은 화학식 XII의 구조를 갖는 아미노산을 포함한다:
<화학식 XII>
Figure pct00051
여기서, B는 선택적이고, 존재할 때 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)k- (여기서, k는 1, 2, 또는 3임), -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -NS(O)2-, -OS(O)2-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-로 이루어진 군으로부터 선택되는 링커이고, 여기서 각각의 R'는 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이고; R은 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 또는 치환된 시클로알킬이고; R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드이고; R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드이고; R5는 H, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 알킬알콕시, 치환된 알킬알콕시, 폴리알킬렌 옥시드, 치환된 폴리알킬렌 옥시드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 알크아릴, 치환된 알크아릴, 아르알킬, 치환된 아르알킬, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-ON(R")2, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-C(O)SR", -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-S-(아릴 또는 치환된 아릴), -C(O)R", -C(O)2R", 또는 -C(O)N(R")2이고, 여기서 각각의 R"는 독립적으로 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 알크아릴, 치환된 알크아릴, 아르알킬, 또는 치환된 아르알킬이거나; 또는 R5는 L-X이고, 여기서 X는 표지; 염료; 중합체; 수용성 중합체; 폴리에틸렌 글리콜의 유도체; 광가교결합제; 세포독성 화합물; 약물; 친화도 표지; 광친화도 표지; 반응성 화합물; 수지; 제2 단백질 또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체; 항체 또는 항체 단편; 금속 킬레이터; 보조인자; 지방산; 탄수화물; 폴리뉴클레오티드; DNA; RNA; 안티센스 폴리뉴클레오티드; 당류, 수용성 덴드리머, 시클로덱스트린, 생체재료; 나노입자; 스핀 표지; 형광단, 금속-함유 모이어티; 방사성 모이어티; 신규한 기능성 기; 다른 분자와 공유 또는 비공유 상호작용하는 기; 광케이징된 모이어티; 광이성질체화가능 모이어티; 비오틴; 비오틴 유사체; 중원자를 포함하는 모이어티; 화학적 절단가능 기; 광절단가능 기; 연장된 측쇄; 탄소-연결된 당; 레독스-활성제; 아미노 티오산; 독성 모이어티; 동위원소로 표지된 모이어티; 생물리학적 프로브; 인광 기; 화학발광기; 전자 고밀도 기; 자기 기; 삽입 기; 발색단; 에너지 전달제; 생물학적 활성제; 검출가능 표지; 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고; L은 선택적이고, 존재할 때 알킬렌, 치환된 알킬렌, 알케닐렌, 치환된 알케닐렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)k- (여기서, k는 1, 2, 또는 3임), -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-O-N=CR'-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-C(O)NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S(O)k-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-S-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-로 이루어진 군으로부터 선택되는 링커이고, 여기서 각각의 R'는 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이다. 상기 비-천연 아미노산은 염 형태일 수 있거나, 또는 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 다당류, 또는 폴리뉴클레오티드 내로 도입되고 임의로 번역후 변형될 수 있다.
상기 아미노산은 화학식 XIII의 구조를 갖는 아미노산을 포함한다:
<화학식 XIII>
Figure pct00052
여기서, R은 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 또는 치환된 시클로알킬이고; R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드이고; R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드이고; R5는 H, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 알킬알콕시, 치환된 알킬알콕시, 폴리알킬렌 옥시드, 치환된 폴리알킬렌 옥시드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 알크아릴, 치환된 알크아릴, 아르알킬, 치환된 아르알킬, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-ON(R")2, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-C(O)SR", -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-S-(아릴 또는 치환된 아릴), -C(O)R", -C(O)2R", 또는 -C(O)N(R")2이고, 여기서 각각의 R"는 독립적으로 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 알크아릴, 치환된 알크아릴, 아르알킬, 또는 치환된 아르알킬이거나; 또는 R5는 L-X이고, 여기서 X는 표지; 염료; 중합체; 수용성 중합체; 폴리에틸렌 글리콜의 유도체; 광가교결합제; 세포독성 화합물; 약물; 친화도 표지; 광친화도 표지; 반응성 화합물; 수지; 제2 단백질 또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체; 항체 또는 항체 단편; 금속 킬레이터; 보조인자; 지방산; 탄수화물; 폴리뉴클레오티드; DNA; RNA; 안티센스 폴리뉴클레오티드; 당류, 수용성 덴드리머, 시클로덱스트린, 생체재료; 나노입자; 스핀 표지; 형광단, 금속-함유 모이어티; 방사성 모이어티; 신규한 기능성 기; 다른 분자와 공유 또는 비공유 상호작용하는 기; 광케이징된 모이어티; 광이성질체화가능 모이어티; 비오틴; 비오틴 유사체; 중원자를 포함하는 모이어티; 화학적 절단가능 기; 광절단가능 기; 연장된 측쇄; 탄소-연결된 당; 레독스-활성제; 아미노 티오산; 독성 모이어티; 동위원소로 표지된 모이어티; 생물리학적 프로브; 인광 기; 화학발광기; 전자 고밀도 기; 자기 기; 삽입 기; 발색단; 에너지 전달제; 생물학적 활성제; 검출가능 표지; 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고; L은 선택적이고, 존재할 때 알킬렌, 치환된 알킬렌, 알케닐렌, 치환된 알케닐렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)k- (여기서, k는 1, 2, 또는 3임), -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-O-N=CR'-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-C(O)NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S(O)k-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-S-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-로 이루어진 군으로부터 선택되는 링커이고, 여기서 각각의 R'는 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이다. 상기 비-천연 아미노산은 염 형태일 수 있거나, 또는 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 다당류, 또는 폴리뉴클레오티드 내로 도입되고 임의로 번역후 변형될 수 있다.
상기 아미노산의 추가의 비-제한적인 예는 하기 구조를 갖는 아미노산을 포함한다:
Figure pct00053
상기 비-천연 아미노산은 염 형태일 수 있거나, 또는 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 다당류, 또는 폴리뉴클레오티드 내로 도입되고 임의로 번역후 변형될 수 있다.
또한, 상기 아미노산은 화학식 XIV의 구조를 갖는 아미노산을 포함한다:
<화학식 XIV>
Figure pct00054
여기서, A는 선택적이고, 존재할 때 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알크아릴렌, 치환된 알크아릴렌, 아르알킬렌, 또는 치환된 아르알킬렌이고; B는 선택적이고, 존재할 때 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)k- (여기서, k는 1, 2, 또는 3임), -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -NS(O)2-, -OS(O)2-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N-, 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-로 이루어진 군으로부터 선택되는 링커이고, 여기서 각각의 R'는 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이고; K는 -NR6R7 또는 -N=CR6R7이고; R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드이고; R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드이고; 각각의 R3 및 R4는 독립적으로 H, 할로겐, 저급 알킬, 또는 치환된 저급 알킬이거나, 또는 R3 및 R4 또는 2개의 R3 기는 임의로 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하고; 각각의 R6 및 R7은 H, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 폴리알킬렌 옥시드, 치환된 폴리알킬렌 옥시드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 알크아릴, 치환된 알크아릴, 아르알킬, 및 치환된 아르알킬, -C(O)R", -C(O)2R", -C(O)N(R")2로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고, 여기서 각각의 R"는 독립적으로 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 알크아릴, 치환된 알크아릴, 아르알킬, 또는 치환된 아르알킬이거나; 또는 R6 또는 R7은 L-X이고, 여기서 X는 표지; 염료; 중합체; 수용성 중합체; 폴리에틸렌 글리콜의 유도체; 광가교결합제; 세포독성 화합물; 약물; 친화도 표지; 광친화도 표지; 반응성 화합물; 수지; 제2 단백질 또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체; 항체 또는 항체 단편; 금속 킬레이터; 보조인자; 지방산; 탄수화물; 폴리뉴클레오티드; DNA; RNA; 안티센스 폴리뉴클레오티드; 당류, 수용성 덴드리머, 시클로덱스트린, 생체재료; 나노입자; 스핀 표지; 형광단, 금속-함유 모이어티; 방사성 모이어티; 신규한 기능성 기; 다른 분자와 공유 또는 비공유 상호작용하는 기; 광케이징된 모이어티; 광이성질체화가능 모이어티; 비오틴; 비오틴 유사체; 중원자를 포함하는 모이어티; 화학적 절단가능 기; 광절단가능 기; 연장된 측쇄; 탄소-연결된 당; 레독스-활성제; 아미노 티오산; 독성 모이어티; 동위원소로 표지된 모이어티; 생물리학적 프로브; 인광 기; 화학발광기; 전자 고밀도 기; 자기 기; 삽입 기; 발색단; 에너지 전달제; 생물학적 활성제; 검출가능 표지; 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고; L은 선택적이고, 존재할 때 알킬렌, 치환된 알킬렌, 알케닐렌, 치환된 알케닐렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)k- (여기서, k는 1, 2, 또는 3임), -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N-, 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-로 이루어진 군으로부터 선택되는 링커이고, 여기서 각각의 R'는 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이다. 상기 비-천연 아미노산은 염 형태일 수 있거나, 또는 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 다당류, 또는 폴리뉴클레오티드 내로 도입되고 임의로 번역후 변형될 수 있다.
상기 아미노산은 화학식 XVI의 구조를 갖는 아미노산을 추가로 포함한다:
<화학식 XVI>
Figure pct00055
여기서, A는 선택적이고, 존재할 때 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알크아릴렌, 치환된 알크아릴렌, 아르알킬렌, 또는 치환된 아르알킬렌이고; B는 선택적이고, 존재할 때 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)k- (여기서, k는 1, 2, 또는 3임), -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -NS(O)2-, -OS(O)2-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N-, 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-로 이루어진 군으로부터 선택되는 링커이고, 여기서 각각의 R'는 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이고; R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드이고; R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드이고; 각각의 R3 및 R4는 독립적으로 H, 할로겐, 저급 알킬, 또는 치환된 저급 알킬이거나, 또는 R3 및 R4 또는 2개의 R3은 임의로 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하고; 각각의 R6 및 R7은 H, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 폴리알킬렌 옥시드, 치환된 폴리알킬렌 옥시드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 알크아릴, 치환된 알크아릴, 아르알킬, 및 치환된 아르알킬, -C(O)R", -C(O)2R", -C(O)N(R")2로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고, 여기서 각각의 R"는 독립적으로 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 알크아릴, 치환된 알크아릴, 아르알킬, 또는 치환된 아르알킬이거나; 또는 R6 또는 R7은 L-X이고, 여기서 X는 표지; 염료; 중합체; 수용성 중합체; 폴리에틸렌 글리콜의 유도체; 광가교결합제; 세포독성 화합물; 약물; 친화도 표지; 광친화도 표지; 반응성 화합물; 수지; 제2 단백질 또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체; 항체 또는 항체 단편; 금속 킬레이터; 보조인자; 지방산; 탄수화물; 폴리뉴클레오티드; DNA; RNA; 안티센스 폴리뉴클레오티드; 당류, 수용성 덴드리머, 시클로덱스트린, 생체재료; 나노입자; 스핀 표지; 형광단, 금속-함유 모이어티; 방사성 모이어티; 신규한 기능성 기; 다른 분자와 공유 또는 비공유 상호작용하는 기; 광케이징된 모이어티; 광이성질체화가능 모이어티; 비오틴; 비오틴 유사체; 중원자를 포함하는 모이어티; 화학적 절단가능 기; 광절단가능 기; 연장된 측쇄; 탄소-연결된 당; 레독스-활성제; 아미노 티오산; 독성 모이어티; 동위원소로 표지된 모이어티; 생물리학적 프로브; 인광 기; 화학발광기; 전자 고밀도 기; 자기 기; 삽입 기; 발색단; 에너지 전달제; 생물학적 활성제; 검출가능 표지; 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고; L은 선택적이고, 존재할 때 알킬렌, 치환된 알킬렌, 알케닐렌, 치환된 알케닐렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)k- (여기서, k는 1, 2, 또는 3임), -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-로 이루어진 군으로부터 선택되는 링커이고, 여기서 각각의 R'는 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이다. 상기 비-천연 아미노산은 염 형태일 수 있거나, 또는 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 다당류, 또는 폴리뉴클레오티드 내로 도입되고 임의로 번역후 변형될 수 있다.
또한, 상기 아미노산은 화학식 XVII의 구조를 갖는 아미노산을 포함한다:
<화학식 XVII>
Figure pct00056
여기서, B는 선택적이고, 존재할 때 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)k- (여기서, k는 1, 2, 또는 3임), -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -NS(O)2-, -OS(O)2-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N-, 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-로 이루어진 군으로부터 선택되는 링커이고, 여기서 각각의 R'는 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이고; R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드이고; R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드이고; 각각의 R6 및 R7은 H, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 폴리알킬렌 옥시드, 치환된 폴리알킬렌 옥시드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 알크아릴, 치환된 알크아릴, 아르알킬, 및 치환된 아르알킬, -C(O)R", -C(O)2R", -C(O)N(R")2로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고, 여기서 각각의 R"는 독립적으로 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 알크아릴, 치환된 알크아릴, 아르알킬, 또는 치환된 아르알킬이거나; 또는 R6 또는 R7은 L-X이고, 여기서 X는 표지; 염료; 중합체; 수용성 중합체; 폴리에틸렌 글리콜의 유도체; 광가교결합제; 세포독성 화합물; 약물; 친화도 표지; 광친화도 표지; 반응성 화합물; 수지; 제2 단백질 또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체; 항체 또는 항체 단편; 금속 킬레이터; 보조인자; 지방산; 탄수화물; 폴리뉴클레오티드; DNA; RNA; 안티센스 폴리뉴클레오티드; 당류, 수용성 덴드리머, 시클로덱스트린, 생체재료; 나노입자; 스핀 표지; 형광단, 금속-함유 모이어티; 방사성 모이어티; 신규한 기능성 기; 다른 분자와 공유 또는 비공유 상호작용하는 기; 광케이징된 모이어티; 광이성질체화가능 모이어티; 비오틴; 비오틴 유사체; 중원자를 포함하는 모이어티; 화학적 절단가능 기; 광절단가능 기; 연장된 측쇄; 탄소-연결된 당; 레독스-활성제; 아미노 티오산; 독성 모이어티; 동위원소로 표지된 모이어티; 생물리학적 프로브; 인광 기; 화학발광기; 전자 고밀도 기; 자기 기; 삽입 기; 발색단; 에너지 전달제; 생물학적 활성제; 검출가능 표지; 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고; L은 선택적이고, 존재할 때 알킬렌, 치환된 알킬렌, 알케닐렌, 치환된 알케닐렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)k- (여기서, k는 1, 2, 또는 3임), -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-로 이루어진 군으로부터 선택되는 링커이고, 여기서 각각의 R'는 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이다.
상기 아미노산의 비-제한적인 예는 하기 구조를 갖는 아미노산을 포함한다:
Figure pct00057
상기 비-천연 아미노산은 염 형태일 수 있거나, 또는 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 다당류, 또는 폴리뉴클레오티드 내로 도입되고 임의로 번역후 변형될 수 있다.
추가로, 상기 아미노산은 화학식 XVIII의 구조를 갖는 아미노산을 포함한다:
<화학식 XVIII>
Figure pct00058
여기서, B는 선택적이고, 존재할 때 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)k- (여기서, k는 1, 2, 또는 3임), -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -NS(O)2-, -OS(O)2-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N-, 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-로 이루어진 군으로부터 선택되는 링커이고, 여기서 각각의 R'는 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이고; R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드이고; R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드이고; 각각의 R6 및 R7은 H, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 폴리알킬렌 옥시드, 치환된 폴리알킬렌 옥시드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 알크아릴, 치환된 알크아릴, 아르알킬, 및 치환된 아르알킬, -C(O)R", -C(O)2R", -C(O)N(R")2로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고, 여기서 각각의 R"는 독립적으로 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 알크아릴, 치환된 알크아릴, 아르알킬, 또는 치환된 아르알킬이거나; 또는 R6 또는 R7은 L-X이고, 여기서 X는 표지; 염료; 중합체; 수용성 중합체; 폴리에틸렌 글리콜의 유도체; 광가교결합제; 세포독성 화합물; 약물; 친화도 표지; 광친화도 표지; 반응성 화합물; 수지; 제2 단백질 또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체; 항체 또는 항체 단편; 금속 킬레이터; 보조인자; 지방산; 탄수화물; 폴리뉴클레오티드; DNA; RNA; 안티센스 폴리뉴클레오티드; 당류, 수용성 덴드리머, 시클로덱스트린, 생체재료; 나노입자; 스핀 표지; 형광단, 금속-함유 모이어티; 방사성 모이어티; 신규한 기능성 기; 다른 분자와 공유 또는 비공유 상호작용하는 기; 광케이징된 모이어티; 광이성질체화가능 모이어티; 비오틴; 비오틴 유사체; 중원자를 포함하는 모이어티; 화학적 절단가능 기; 광절단가능 기; 연장된 측쇄; 탄소-연결된 당; 레독스-활성제; 아미노 티오산; 독성 모이어티; 동위원소로 표지된 모이어티; 생물리학적 프로브; 인광 기; 화학발광기; 전자 고밀도 기; 자기 기; 삽입 기; 발색단; 에너지 전달제; 생물학적 활성제; 검출가능 표지; 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고; L은 선택적이고, 존재할 때 알킬렌, 치환된 알킬렌, 알케닐렌, 치환된 알케닐렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)k- (여기서, k는 1, 2, 또는 3임), -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N-, 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-로 이루어진 군으로부터 선택되는 링커이고, 여기서 각각의 R'는 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이고; 각각의 Ra는 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, -N(R')2, -C(O)kR' (여기서, k는 1, 2, 또는 3임), -C(O)N(R')2, -OR', 및 -S(O)kR'로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고, 여기서 각각의 R'는 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이고, n은 0 내지 8이다. 상기 비-천연 아미노산은 염 형태일 수 있거나, 또는 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 다당류, 또는 폴리뉴클레오티드 내로 도입되고 임의로 번역후 변형될 수 있다.
상기 아미노산의 비-제한적인 예는 하기 구조를 갖는 아미노산을 포함한다:
Figure pct00059
상기 비-천연 아미노산은 염 형태일 수 있거나, 또는 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 다당류, 또는 폴리뉴클레오티드 내로 도입되고 임의로 번역후 변형될 수 있다.
특정 실시양태에서, 비-천연 아미노산은 화학식 XIX에 따르거나 또는 그의 염일 수 있다:
<화학식 XIX>
Figure pct00060
여기서, D는 -Ar-W3- 또는 -W1-Y1-C(O)-Y2-W2-이고; Ar은
Figure pct00061
이고,
각각의 W1, W2, 및 W3은 독립적으로 단일 결합 또는 저급 알킬렌이고; 각각의 X1은 독립적으로 -NH-, -O-, 또는 -S-이고; 각각의 Y1은 독립적으로 단일 결합, -NH-, 또는 -O-이고; 각각의 Y2는 독립적으로 단일 결합, -NH-, -O-, 또는 N-연결된 또는 C-연결된 피롤리디닐렌이고; Z1, Z2, 및 Z3 중의 하나는 -N-이고, Z1, Z2, 및 Z3 중의 나머지는 독립적으로 -CH-이다. 특정 실시양태에서, 비-천연 아미노산은 화학식 XIXa에 따른다:
<화학식 XIXa>
Figure pct00062
여기서, D는 화학식 XIX의 측면에서 규정된 바와 같다. 특정 실시양태에서, 비-천연 아미노산은 화학식 XIXb에 따르거나 또는 그의 염이다:
<화학식 XIXb>
Figure pct00063
여기서, W4는 C1-C10 알킬렌이다. 추가의 실시양태에서, W4는 C1-C5 알킬렌이다. 한 실시양태에서, W4는 C1-C3 알킬렌이다. 한 실시양태에서, W4는 C1 알킬렌이다. 특정 실시양태에서, 비-천연 아미노산은 하기 또는 그의 염으로 이루어진 군으로부터 선택된다:
Figure pct00064
Figure pct00065
Figure pct00066
상기 비-천연 아미노산은 염 형태일 수 있거나, 또는 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 다당류, 또는 폴리뉴클레오티드 내로 도입되고 임의로 번역후 변형될 수 있다.
링커 및 페이로드
특정 실시양태에서, 항체는 상기 설명된 바와 같은 반응성 기를 갖는 비-천연 아미노산을 포함한다. 당업자는 비-천연 아미노산에 직접 또는 간접적으로 링커를 통해 공유 결합을 형성할 수 있는 임의의 분자 엔티티에 항체를 연결하기 위해 반응성 기를 사용할 수 있다.
유용한 링커는 상기 섹션에서 설명한 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 링커는 당업자에게 알려진 임의의 2가 또는 다가 링커이다. 일반적으로, 링커는 기능성 모이어티 R 및 비-천연 아미노산의 알파 탄소에 공유 결합을 형성할 수 있다. 유용한 2가 링커는 결합, 알킬렌, 치환된 알킬렌, 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌 및 치환된 헤테로아릴렌을 포함한다. 특정 실시양태에서, 링커는 C1-10 알킬렌 또는 C1-10 헤테로알킬렌이다.
분자 페이로드는 당업자가 항체에 접합시키고자 하는 임의의 분자 엔티티일 수 있다. 특정 실시양태에서, 페이로드는 치료 모이어티이다. 상기 실시양태에서, 항체 접합체는 치료 모이어티를 그의 분자 표적에 표적화하기 위해 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 페이로드는 표지 모이어티이다. 상기 실시양태에서, 항체 접합체는 그의 표적에 대한 항체의 결합을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 페이로드는 세포독성 모이어티이다. 상기 실시양태에서, 접합체는 세포의 파괴 또는 제거를 개시하기 위해 세포독성 모이어티를 이환된 세포, 예를 들어 암 세포에 표적화하기 위해 사용될 수 있다. 당업자에게 명백한 다른 분자 페이로드를 포함하는 접합체는 본원에 설명된 접합체의 범위 내에 있다.
특정 실시양태에서, 접합체는 표지, 염료, 중합체, 수용성 중합체, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜의 유도체, 광가교결합제, 세포독성 화합물, 방사성핵종, 약물, 친화도 표지, 광친화도 표지, 반응성 화합물, 수지, 제2 단백질 또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체, 항체 또는 항체 단편, 금속 킬레이터, 보조인자, 지방산, 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, DNA, RNA, 안티센스 폴리뉴클레오티드, 펩티드, 수용성 덴드리머, 시클로덱스트린, 억제성 리보핵산, 생체재료, 나노입자, 스핀 표지, 형광단, 금속-함유 모이어티, 방사성 모이어티, 신규한 기능성 기, 다른 분자와 공유 또는 비공유 상호작용하는 기, 광케이징된 모이어티, 광이성질체화가능 모이어티, 비오틴, 비오틴의 유도체, 비오틴 유사체, 중원자를 포함하는 모이어티, 화학적 절단가능 기, 광절단가능 기, 연장된 측쇄, 탄소-연결된 당, 레독스-활성제, 아미노 티오산, 독성 모이어티, 동위원소로 표지된 모이어티, 생물리학적 프로브, 인광 기, 화학발광기, 전자 고밀도 기, 자기 기, 삽입 기, 발색단, 에너지 전달제, 생물학적 활성제, 검출가능 표지, 소분자, 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 페이로드를 가질 수 있다.
유용한 약물 페이로드는 임의의 세포독성, 세포증식억제 또는 면역조정 약물을 포함한다. 유용한 부류의 세포독성제 또는 면역조절제는 예를 들어, 항튜불린제, 아우리스타틴, DNA 작은 홈 (minor groove) 결합제, DNA 복제 억제제, 알킬화제 (예를 들어, 백금 복합체, 예컨대 시스플라틴, 모노(백금), 비스(백금) 및 트리-핵 백금 복합체 및 카르보플라틴), 안트라사이클린, 항생제, 항엽산제, 항대사물질, 칼모듈린 억제제, 화학요법 감작제, 듀오카르마이신, 에토포시드, 불화 피리미딘, 이온운반체 (ionophore), 렉시트롭신, 메이탄시노이드, 니트로소우레아, 플라티놀, 세공-형성 화합물, 퓨린 항대사물질, 푸로마이신, 방사선 감작제, 라파마이신, 스테로이드, 탁산, 토포이소머라제 억제제, 빙카 알칼로이드 등을 포함한다.
개별 세포독성제 또는 면역조절제는 예를 들어, 안드로겐, 안트라마이신 (AMC), 아스파라기나제, 5-아자시티딘, 아자티오프린, 블레오마이신, 부술판, 부티오닌 술폭시민, 칼리케아미신, 칼리케아미신 유도체, 캄토테신, 카르보플라틴, 카르무스틴 (BSNU), CC-1065, 클로람부실, 시스플라틴, 콜히친, 시클로포스파미드, 시타라빈, 사이티딘 아라비노사이드, 사이토칼라신 B, 다카르바진, 닥티노마이신 (이전에 악티노마이신), 다우노루비신, 데카르바진, DM1, DM4, 도세탁셀, 독소루비신, 에토포시드, 에스트로겐, 5-플루오르데옥시유리딘, 5-플루오로우라실, 젬시타빈, 그라미시딘 D, 히드록시우레아, 이다루비신, 이포스파미드, 이리노테칸, 로무스틴 (CCNU), 메이탄신, 메클로에타민, 멜팔란, 6-머캅토퓨린, 메토트렉세이트, 미트라마이신, 미토마이신 C, 미톡산트론, 니트로이미다졸, 파클리탁셀, 팔리톡신, 플리카마이신, 프로카르비진, 리족신, 스트렙토조토신, 테노포시드, 6-티오구아닌, 티오테파, 토포테칸, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 비노렐빈, VP-16 및 VM-26을 포함한다.
일부 실시양태에서, 적합한 세포독성제는 예를 들어, DNA 작은 홈 결합제 (예를 들어, 에네딘 및 렉시트롭신, CBI 화합물; 또한 미국 특허 6,130,237 참조), 듀오카르마이신, 탁산 (예를 들어, 파클리탁셀 및 도세탁셀), 푸로마이신, 빙카 알칼로이드, CC-1065, SN-38, 토포테칸, 모르폴리노-독소루비신, 리족신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 에키노마이신, 콤브레타스타틴, 네트롭신, 에포틸론 A 및 B, 에스트라무스틴, 크립토파이신, 세마도틴, 메이탄시노이드, 디스코데르몰리드, 엘류테로빈, 및 미톡산트론을 포함한다.
일부 실시양태에서, 페이로드는 항-튜불린 제이다. 항-튜불린제의 예는 탁산 (예를 들어, 탁솔(Taxol)® (파클리탁셀), 탁소테레(Taxotere)® (도세탁셀)), T67 (툴라릭 (Tularik)) 및 빙카 알칼로이드 (예를 들어, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 빈데신, 및 비노렐빈)를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 다른 항튜불린제는 예를 들어, 박타틴 유도체, 탁산 유사체, 에포틸론 (예를 들어, 에포틸론 A 및 B), 노코다졸, 콜히친 및 콜시미드, 에스트라무스틴, 크립토파이신, 세마도틴, 메이탄시노이드, 콤브레타스타틴, 디스코데르몰리드, 및 엘류테로빈을 포함한다.
특정 실시양태에서, 세포독성제는 메이탄시노이드, 또 다른 군의 항-튜불린제이다. 예를 들어, 구체적인 실시양태에서, 메이탄시노이드는 메이탄신 또는 DM-1 (이뮤노겐, 인크. (ImmunoGen, Inc.); 또한 [Chari et al., 1992, Cancer Res. 52:127-131] 참조)일 수 있다.
일부 실시양태에서, 페이로드는 아우리스타틴, 예컨대 아우리스타틴 E 또는 그의 유도체이다. 예를 들어, 아우리스타틴 E 유도체는 아우리스타틴 E 및 케토산 사이에 형성된 에스테르일 수 있다. 예를 들어, 아우리스타틴 E는 파라아세틸 벤조산 또는 벤조일발레르산과 반응하여 각각 AEB 및 AEVB를 생산할 수 있다. 다른 일반적인 아우리스타틴 유도체는 AFP, MMAF, 및 MMAE를 포함한다. 아우리스타틴 유도체의 합성 및 구조는 미국 특허 출원 공개 2003-0083263, 2005-0238649 및 2005-0009751; 국제 특허 공개 WO 04/010957, 국제 특허 공개 WO 02/088172, 및 미국 특허 6,323,315; 6,239,104; 6,034,065; 5,780,588; 5,665,860; 5,663,149; 5,635,483; 5,599,902; 5,554,725; 5,530,097; 5,521,284; 5,504,191; 5,410,024; 5,138,036; 5,076,973; 4,986,988; 4,978,744; 4,879,278; 4,816,444; 및 4,486,414에 기재되어 있다.
일부 실시양태에서, 페이로드는 방사성동위원소가 아니다. 일부 실시양태에서, 페이로드는 방사성이 아니다.
일부 실시양태에서, 페이로드는 항대사물질이다. 항대사물질은 예를 들어, 퓨린 길항제 (예를 들어, 아조티오프린 또는 미코페놀레이트 모페틸), 디히드로엽산 환원효소 억제제 (예를 들어, 메토트렉세이트), 아시클로버, 강시클로버, 지도부딘, 비다라빈, 리바바린, 아지도티미딘, 사이티딘 아라비노사이드, 아만타딘, 디데옥시유리딘, 아이오도데옥시유리딘, 포스카르넷, 또는 트리플루리딘일 수 있다.
다른 실시양태에서, 페이로드는 타크로리무스, 시클로스포린, FU506 또는 라파마이신이다. 추가의 실시양태에서, 약물은 알데스류킨, 아렘투주맙, 알리트레티노인, 알로푸리놀, 알트레타민, 아미포스틴, 아나스트로졸, 삼산화비소, 벡사로텐, 벡사로텐, 칼루스테론, 카페시타빈, 세레콕시브, 클라드리빈, 다르베포에틴 알파, 데니류킨 디프티톡스, 덱스라족산, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피루비신, 에포에틴 알파, 에스트라무스틴, 엑스메스탄, 필그라스팀, 플록수리딘, 플루다라빈, 풀베스트란트, 젬시타빈, 젬투주맙 오조가마이신 (마일로타그(MYLOTARG)), 고세렐린, 이다루비신, 이포스파미드, 이매티닙 메실레이트, 인터페론 알파-2a, 이리노테칸, 레트로졸, 류코보린, 레바미솔, 메클로에타민 또는 질소 머스타드 (mustard), 메게스트롤, 메스나, 메토트렉세이트, 메톡살렌, 미토마이신 C, 미토테인, 난드로론 펜프로피오네이트, 오프렐베킨, 옥살리플라틴, 파미드로네이트, 페가데마제, 페가스파르가제, 페그필그라스팀, 펜토스타틴, 피포브로만, 플리카마이신, 포르피머 나트륨, 프로카르바진, 퀴나크린, 라스부리카제, 리툭시맙, 사르그라모스팀, 스트렙토조신, 타목시펜, 테모졸로미드, 테니포시드, 테스토락톤, 티오구아닌, 토레미펜, 토시투모맙, 트라스투주맙 (헤르셉틴 (HERCEPTIN)), 트레티노인, 우라실 머스타드, 발루비신, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 비노렐빈 또는 졸드로네이트이다.
일부 실시양태에서, 페이로드는 면역조절제이다. 면역조절제는 예를 들어 강시클로버, 에타네르셉트, 타크로리무스, 시클로스포린, 라파마이신, 시클로포스파미드, 아자티오프린, 미코페놀레이트 모페틸 또는 메토트렉세이트이다. 별법으로, 면역조절제는 예를 들어, 글루코코르티코이드 (예를 들어, 코르티솔 또는 알도스테론) 또는 글루코코르티코이드 유사체 (예를 들어, 프레드니손 또는 덱사메타손)일 수 있다.
일부 실시양태에서, 면역조절제는 소염제, 예컨대 아릴카르복실산 유도체, 피라졸-함유 유도체, 옥시캄 유도체 및 니코틴산 유도체이다. 소염제의 부류는 예를 들어, 시클로옥시게나제 억제제, 5-리폭시게나제 억제제, 및 류코트리엔 수용체 길항제를 포함한다.
적합한 시클로옥시게나제 억제제는 메클로페남산, 메페남산, 카르프로펜, 디클로페낙, 디플루니살, 펜부펜, 페노프로펜, 인도메타신, 케토프로펜, 나부메톤, 술린닥, 테녹시캄 및 톨메틴을 포함한다.
적합한 리폭시게나제 억제제는 레독스 억제제 (예를 들어, 카테콜 부탄 유도체, 노르디히드로구아이아레트산 (NDGA), 마소프로콜, 페니돈, 이아노팔렌 (Ianopalen), 인다졸리논, 나파자트롬, 벤조푸라놀, 알킬히드록실아민), 및 비-레독스 억제제 (예를 들어, 히드록시티아졸, 메톡시알킬티아졸, 벤조피란 및 그의 유도체, 메톡시테트라히드로피란, 보스웰산 및 보스웰산의 아세틸화 유도체, 및 시클로알킬 라디칼로 치환된 퀴놀린메톡시페닐아세트산), 및 레독스 억제제의 전구체를 포함한다.
다른 적합한 리폭시게나제 억제제는 항산화제 (예를 들어, 페놀, 프로필 갈레이트, 플라보노이드 및/또는 플라보노이드 함유 천연 생성 기질, 플라본의 히드록실화 유도체, 플라보놀, 디히드로퀘르세틴, 루테올린, 갈란긴, 오로볼, 칼콘의 유도체, 4,2',4'-트리히드록시칼콘, 오르토-아미노페놀, N-히드록시우레아, 벤조푸라놀, 에베세렌 및 환원성 셀레노효소의 활성을 증가시키는 물질종), 철 킬레이팅제 (예를 들어, 히드록삼산 및 그의 유도체, N-히드록시우레아, 2-벤질-1-나프톨, 카테콜, 히드록실아민, 카르노솔 트롤록스 C, 카테콜, 나프톨, 술파살라진,자일류톤, 5-히드록시안트라닐산 및 4-(오메가-아릴알킬)페닐알칸산), 이미다졸-함유 화합물 (예를 들어, 케토코나졸 및 이트라코나졸), 페노티아진, 및 벤조피란 유도체를 포함한다.
또 다른 적합한 리폭시게나제 억제제는 에이코사노이드 (예를 들어, 옥타데카테트라엔산, 에이코사테트라엔산, 도코사펜타엔산, 에이코사헥사엔산 및 도코사헥사엔산 및 그의 에스테르, PGE1 (프로스타글란딘 E1), PGA2 (프로스타글란딘 A2), 비프로스톨, 15-모노히드록시에이코사테트라엔산, 15-모노히드록시-에이코사트리엔산 및 15-모노히드록시에이코사펜타엔산, 및 류코트리엔 B5, C5 및 D5)의 억제제, 칼슘 유동을 저해하는 화합물, 페노티아진, 디페닐부틸아민, 베라파밀, 푸스코시드, 쿠르쿠민, 클로로게닌산, 카페인산, 5,8,11,14-에이코사테트라옌산 (ETYA), 히드록시페닐레틴아미드, 이오나팔렌 (Ionapalen), 에스쿨린, 디에틸카르바마진, 페난트롤린, 바이칼레인, 프록시크로밀, 티오에테르, 디알릴 술피드 및 디-(1-프로페닐) 술피드를 포함한다.
류코트리엔 수용체 길항제는 칼시트리올, 온타조라스트, 바이엘 (Bayer) Bay-x-1005, 시바-가이기 (Ciba-Geigy) CGS-25019C, 에베세렌, 레오 덴마크 (Leo Denmark) ETH-615, 릴리 (Lilly) LY-293111, 오노 (Ono) ONO-4057, 테루모 (Terumo) TMK-688, 베링거 잉겔하임 (Boehringer Ingleheim) BI-RM-270, 릴리 LY 213024, 릴리 LY 264086, 릴리 LY 292728, 오노 ONO LB457, 화이자 (Pfizer) 105696, 퍼듀 프레데릭 (Perdue Frederick) PF 10042, 롱-프랑 로라 (Rhone-Poulenc Rorer) RP 66153, 스미스클라인 비참 (SmithKline Beecham) SB-201146, 스미스클라인 비참 SB-201993, 스미스클라인 비참 SB-209247, 시얼 (Searle) SC-53228, 수미타모 (Sumitamo) SM 15178, 어메리칸 홈 프러덕츠 (American Home Products) WAY 121006, 바이엘 Bay-o-8276, 워너-램버트 (Warner-Lambert) CI-987, 워너-램버트 CI-987BPC-15LY 223982, 릴리 LY 233569, 릴리 LY-255283, 마크로넥스 (MacroNex) MNX-160, 머크 앤 코. (Merck and Co.) MK-591, 머크 앤 코. MK-886, 오노 ONO-LB-448, 퍼듀 프레데릭 PF-5901, 롱-프랑 로라 RG14893, 롱-프랑 로라 RP 66364, 롱-프랑 로라 RP 69698, 시누기 (Shionoogi) S-2474, 시얼 SC-41930, 시얼 SC-50505, 시얼 SC-51146, 시얼 SC-52798, 스미스클라인 비참 SK&F-104493, 레오 덴마크 SR-2566, 타나베 (Tanabe) T-757 및 테이진 (Teijin) TEI-1338을 포함한다.
다른 유용한 약물 페이로드는 암 치료에서 유용한 화학적 화합물을 포함한다. 화학요법제의 예는 엘로티닙 (타쎄바(TARCEVA)®, 제넨테크 (Genentech)/오에스아이 팜. (OSI Pharm.)), 보르테조밉 (벨케이드(VELCADE)®, 밀레니엄 팜. (Millennium Pharm.)), 풀베스트란트 (파슬로덱스(FASLODEX)®, 아스트라제네카 (AstraZeneca)), 수텐트 (SU11248, 화이자), 레트로졸 (페마라(FEMARA)®, 노바티스 (Novartis)), 이매티닙 메실레이트 (글리벡(GLEEVEC)®, 노바티스), PTK787/ZK 222584 (노바티스), 옥살리플라틴 (엘록사틴(Eloxatin®, 사노피)), 5-FU (5-플루오로우라실), 류코보린, 라파마이신 (시롤리무스, 라파뮨(RAPAMUNE)®, 와이어쓰 (Wyeth)), 라파티닙 (타이커브(TYKERB)®, GSK572016, 글락소 스미스클라인 (Glaxo Smith Kline)), 로나파닙 (SCH 66336), 소라페닙 (BAY43-9006, 바이엘 랩스 (Bayer Labs)), 및 게피티닙 (이레사(IRESSA)®, 아스트라제네카), AG1478, AG1571 (SU 5271; 수젠 (Sugen)), 알킬화제, 예컨대 티오테파 및 싸이톡산(CYTOXAN)® 시클로스포스파미드; 알킬 술포네이트, 예컨대 부술판, 임프로술판 및 피포술판; 아지리딘, 예컨대 벤조도파, 카르보쿠온, 메투레도파, 및 유레도파; 에틸렌이민 및 메틸아멜라민, 예를 들어 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포라미드, 트리에틸렌티오포스포라미드 및 트리메틸로멜라민; 아세토게닌 (특히 불라타신 및 불라타시논); 캄토테신 (합성 유사체 토포테칸 포함); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065 (그의 아도젤레신, 카르젤레신 및 비젤레신 합성 유사체 포함); 크립토파이신 (특히 크립토파이신 1 및 크립토파이신 8); 돌라스타틴; 듀오카르마이신 (합성 유사체 KW-2189 및 CB1-TM1 포함); 엘류테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕티인; 스폰지스타틴; 질소 머스타드, 예컨대 클로람부실, 클로마파진, 클로로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로에타민, 메클로에타민 옥시드 염산염, 멜팔란, 노벰비친, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로스우레아, 예컨대 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 및 라님누스틴; 항생제, 예컨대 에네딘 항생제 (예를 들어, 칼리케아미신, 특히 칼리케아미신 감마ll 및 칼리케아미신 오메가ll (Angew Chem. Intl. Ed. Engl. (1994) 33:183-186); 다이네미신, 예를 들어 다이네미신 A; 비스포스포네이트, 예컨대 클로드로네이트; 에스페라미신; 및 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련 발색단백질 에네딘 항생제 발색단), 아클라시노마이신, 악티노마이신, 오트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이시니스, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데테루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 아드리아마이신(ADRIAMYCIN)® (독소루비신), 모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시독소루비신), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 예컨대 미토마이신 C, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포르피로마이신, 푸로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 유베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항대사물질, 예컨대 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 엽산 유사체, 예컨대 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예컨대 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티암니프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예컨대 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자유리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시유리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘; 안드로겐, 예컨대 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항-부신제, 예컨대 아미노글루테치미드, 미토테인, 트릴로스테인; 엽산 보충제, 예컨대 프롤리닌산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트렉세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르미틴; 엘리프티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 질산갈륨; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 메이탄시노이드, 예컨대 메이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로소잔트론; 포도필린산; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; PSK® 다당류 복합체 (제이에이치에스 내추럴 프러덕츠 (JHS Natural Products, 미국 오레곤주 유진)); 라족산; 리족신; 시조푸란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센 (특히 T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노사이드 ("Ara-C"); 시클로포스파미드; 티오테파; 탁소이드, 예를 들어, 탁솔® (파클리탁셀; 브리스톨-마이어스 스퀴브 온콜로지 (Bristol-Myers Squibb Oncology, 미국 뉴저지주 프린스턴)), 아브락산(ABRAXANE)® (크레모포르(Cremophor)-비함유), 파클리탁셀의 알부민-조작된 나노입자 제제 (어메리칸 파마슈티컬 파트너스 (American Pharmaceutical Partners, 미국 일리노이주 샴버그)), 및 탁소테레® (도세탁셀; 롱-프랑 로라, 프랑스 안톤); 클로람부실; 젬자(GEMZAR)® (젬시타빈); 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 유사체, 예컨대 시스플라틴 및 카르보플라틴; 빈블라스틴; 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미톡산트론; 빈크리스틴; 나벨빈(NAVELBINE)® (비노렐빈); 노반트론; 테니포시드; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 카페시타빈 (젤로다(XELODA)®); 이반드로네이트; CPT-11; 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노이드, 예컨대 레티논산; 및 상기한 임의의 물질의 제약상 허용되는 염, 산 및 유도체를 포함한다.
다른 유용한 페이로드는 (i) 종양에 대한 호르몬 작용을 조절하거나 억제하는 작용을 하는 항-호르몬제, 예컨대 항-에스트로겐 및 선택적 에스트로겐 수용체 조정제 (SERM), 예를 들어, 타목시펜 (놀바덱스(NOLVADEX)®; 타목시펜 시트레이트 포함), 랄록시펜, 드로록시펜, 4-히드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤, 및 화레스톤(FARESTON)® (토레미핀 시트레이트); (ii) 부신샘에서 에스트로겐 생산을 조절하는 효소 아로마타제를 억제하는 아로마타제 억제제, 예컨대, 예를 들어, 4(5)-이미다졸, 아미노글루테치미드, 메게이스(MEGASE)® (메게스트롤 아세테이트), 아로마신(AROMASIN)® (엑스메스탄; 화이자), 포르메스타니, 파드라졸, 리비졸(RIVISOR)® (보로졸), 페마라® (레트로졸; 노바티스), 및 아리미덱스(ARIMIDEX)® (아나스트로졸; 아스트라제네카); (iii) 항-안드로겐, 예컨대 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드, 류프롤리드, 및 고세렐린; 및 트록사시타빈 (1,3-디옥솔란 뉴클레오시드 시토신 유사체); (iv) 단백질 키나제 억제제; (v) 지질 키나제 억제제; (vi) 안티센스 올리고뉴클레오티드, 특히 이상 세포 증식에 관여하는 신호전달 경로에서 유전자의 발현을 억제하는 것, 예컨대, 예를 들어, PKC-알파, Ralf 및 H-Ras; (vii) 리보자임, 예컨대 VEGF 발현 억제제 (예를 들어, 안지오자임(ANGIOZYME)®) 및 HER2 발현 억제제; (viii) 백신, 예컨대 유전자 요법 백신, 예를 들어, 알로벡틴(ALLOVECTIN)®, 류벡틴(LEUVECTIN)®, 및 박시드(VAXID)®; 프로류킨(PROLEUKIN)® rIL-2; 토포이소머라제 1 억제제, 예컨대 류르토테칸(LURTOTECAN)®; 아바렐릭스(ABARELIX)® rmRH; (ix) 항-혈관신생물질, 예컨대 베바시주맙 (아바스틴(AVASTIN)®, 제넨테크); 및 (x) 상기한 임의의 물질의 제약상 허용되는 염, 산 및 유도체를 포함한다. 다른 항-혈관신생물질은 MMP-2 (매트릭스-메탈로프로테이나제 2) 억제제, MMP-9 (매트릭스-메탈로프로테이나제 9) 억제제, COX-II (시클로옥시게나제 II) 억제제, 및 VEGF 수용체 티로신 키나제 억제제를 포함한다. 본 발명의 화합물/조성물과 조합하여 사용할 수 있는 그러한 유용한 매트릭스 메탈로프로테이나제 억제제의 예는 그 전문이 본원에 참조로 포함된 WO 96/33172, WO 96/27583, EP 818442, EP 1004578, WO 98/07697, WO 98/03516, WO 98/34918, WO 98/34915, WO 98/33768, WO 98/30566, EP 606,046, EP 931,788, WO 90/05719, WO 99/52910, WO 99/52889, WO 99/29667, WO 99/07675, EP 945864, 미국 특허 5,863,949, 미국 특허 5,861,510, 및 EP 780,386에 기재되어 있다. VEGF 수용체 티로신 키나제 억제제의 예는 4-(4-브로모-2-플루오로아닐리노)-6-메톡시-7-(1-메틸피페리딘-4-일메톡시)퀴나졸린 (ZD6474; WO 01/32651의 실시예 2), 4-(4-플루오로-2-메틸인돌-5-일옥시)-6-메톡시-7-(3-피롤리딘-1-일프로폭시)--퀴나졸린 (AZD2171; WO 00/47212의 실시예 240), 바타라닙 (PTK787; WO 98/35985) 및 SU11248 (수니티닙; WO 01/60814), 및 화합물, 예컨대 PCT 공개 WO 97/22596, WO 97/30035, WO 97/32856, 및 WO 98/13354에 개시된 것을 포함한다.
특정 실시양태에서, 페이로드는 항체 또는 항체 단편이다. 특정 실시양태에서, 페이로드 항체 또는 단편은 당업자에 의해 인식되는 임의의 이뮤노글로불린 유전자에 의해 코딩될 수 있다. 이뮤노글로불린 유전자는 κ, λ, α, γ (IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4), δ, ε 및 μ 불변 영역 유전자, 및 이뮤노글로불린 가변 영역 유전자를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 이 용어는 당업자에 의해 인식되는 전장 항체 및 항체 단편, 및 그의 변이체를 포함한다. 예시적인 단편은 Fv, Fc, Fab, 및 (Fab')2, 단일쇄 Fv (scFv), 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 이기능성 하이브리드 항체, CDR1, CDR2, CDR3, CDR들의 조합물, 가변 영역, 프레임워크 영역, 불변 영역 등을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
특정 실시양태에서, 페이로드는 하나 이상의 수용성 중합체이다. 매우 다양한 거대분자 중합체 및 다른 분자를 본 발명의 항원-결합 폴리펩티드에 결합시켜 항체의 생물학적 성질을 조절하고/하거나 항체에 새로운 생물학적 특성을 부여할 수 있다. 이러한 거대분자 중합체는 천연적으로 코딩되는 아미노산, 비-천연적으로 코딩되는 아미노산, 또는 천연 또는 비-천연 아미노산의 임의의 기능성 치환체, 또는 천연 또는 비-천연 아미노산에 부가되는 임의의 치환체 또는 기능성 기를 통해 항체에 연결될 수 있다. 중합체의 분자량은 약 100 Da 내지 약 100,000 Da 또는 그 초과를 포함하고 이로 제한되지 않는 넓은 범위 내의 분자량일 수 있다.
선택된 중합체는 부착되는 단백질이 수성 환경, 예를 들어 생리학적 환경 내에서 침전되지 않도록 수용성일 수 있다. 중합체는 분지형 또는 비분지형 중합체일 수 있다. 바람직하게는, 최종 생성물 제제의 치료적 사용을 위해, 중합체는 제약상 허용되는 것이다.
항체 분자에 대한 폴리에틸렌 글리콜 분자의 비율은 반응 혼합물 내의 그들의 농도처럼 변하게 된다. 일반적으로, (최소 과량의 미반응 단백질 또는 중합체가 존재한다는 점에서 반응 효율에 비추어) 최적 비는 선택된 폴리에틸렌 글리콜의 분자량 및 이용가능한 반응성 기에 의해 결정될 수 있다. 분자량의 경우, 일반적으로 중합체의 분자량이 높을수록, 단백질에 부착될 수 있는 중합체 분자의 수는 적다. 유사하게, 이들 파라미터를 최적화하는 경우 중합체의 분지화를 고려해야 한다. 일반적으로, 분자량이 높을수록 (또는 분지가 많을수록) 중합체:단백질 비가 높다.
수용성 중합체는 선형, 갈래형 (forked) 또는 분지형을 포함하고 이로 제한되지 않는 임의의 구조 형태일 수 있다. 일반적으로, 수용성 중합체는 폴리(알킬렌 글리콜), 예를 들어, 폴리(에틸렌 글리콜) (PEG)이지만, 다른 수용성 중합체도 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 특정 실시양태를 설명하기 위해 PEG를 사용한다.
PEG는 상업적으로 입수가능하거나 또는 당업계에 공지된 방법에 따라 에틸렌 글리콜의 개환 (ring-opening) 중합에 의해 제조될 수 있는 공지된 수용성 중합체이다 (Sandler and Karo, Polymer Synthesis, Academic Press, New York, Vol. 3, pages 138-161). 용어 "PEG"는 크기 또는 PEG 말단에서의 변형과 관계없이 임의의 폴리에틸렌 글리콜 분자를 포괄하는 용어로서 널리 사용되며, 하기 화학식으로 표시되는 바와 같이 항체에 결합되는 것으로서 나타낼 수 있다:
XO-(CH2CH2O)n-CH2CH2-Y
여기서, n은 2 내지 10,000이고, X는 H이거나, C1 -4 알킬을 포함하고 이로 제한되지 않는 말단 변형이다.
일부 경우에, 본 발명에 사용되는 PEG는 히드록시 또는 메톡시 (즉, X는 H 또는 CH3임)를 갖는 한 말단 상에서 종결된다 ("메톡시 PEG"). 별법으로, PEG는 반응성 기로 종결되어 이기능성 중합체를 형성할 수 있다. 일반적인 반응성 기는 20개의 통상적인 아미노산에서 발견되는 기능성 기와 반응하는 데 통상적으로 사용되는 반응성 기 (말레이미드기, 활성화된 카르보네이트 (p-니트로페닐 에스테르를 포함하고 이로 제한되지 않음), 활성화된 에스테르 (N-히드록시숙신이미드, p-니트로페닐 에스테르를 포함하고 이로 제한되지 않음) 및 알데히드를 포함하고 이로 제한되지 않음) 뿐만 아니라, 20개의 통상적인 아미노산에 대해 불활성이지만 비-천연적으로 코딩되는 아미노산에 존재하는 상보적 기능성 기 (아지드 기 및 알킨 기를 포함하고 이로 제한되지 않음)와 특이적으로 반응하는 기능성 기를 포함할 수 있다. 상기 화학식에서 Y로 표시되는 PEG의 다른 말단이 천연 생성 아미노산 또는 비-천연적으로 코딩되는 아미노산을 통해 항원-결합 폴리펩티드에 직접 또는 간접적으로 부착된다는 점이 주목된다. 예를 들어, Y는 폴리펩티드의 아민 기 (리신의 엡실론 아민 또는 N-말단을 포함하고 이로 제한되지 않음)에 대한 아미드, 카르바메이트 또는 우레아 결합일 수 있다. 별법으로, Y는 티올 기 (시스테인의 티올 기를 포함하고 이로 제한되지 않음)에 대한 말레이미드 연결일 수 있다. 별법으로, Y는 20개의 통상적인 아미노산을 통해 통상적으로 접근할 수 없는 잔기와의 연결일 수 있다. 예를 들어, PEG 상의 아지드 기는 항체 상의 알킨 기와 반응하여 휘스겐 [3+2] 고리 첨가 생성물을 형성할 수 있다. 별법으로, PEG 상의 알킨 기는 비-천연적으로 코딩되는 아미노산에 존재하는 아지드 기와 반응하여 유사한 생성물을 형성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 강한 친핵성 물질 (히드라진, 히드라지드, 히드록실아민, 세미카르바지드를 포함하고 이로 제한되지 않음)은 적용가능한 경우에 비-천연적으로 코딩되는 아미노산에 존재하는 알데히드 또는 케톤 기와 반응하여 히드라존, 옥심 또는 세미카르바존을 형성할 수 있으며, 일부 경우 히드라존, 옥심 또는 세미카르바존은 적절한 환원제의 처리에 의해 더 환원될 수 있다. 별법으로, 강한 친핵성 물질은 비-천연적으로 코딩되는 아미노산을 통해 항체 내로 도입될 수 있으며, 수용성 중합체에 존재하는 케톤 또는 알데히드기와 우선적으로 반응하는 데 사용될 수 있다.
실제 필요에 따라 약 100 달톤 (Da) 내지 100,000 Da 또는 그 초과를 포함하고 이로 제한되지 않는 (때로 0.1-50 kDa 또는 10-40 kDa를 포함하고 이로 제한되지 않음) 임의의 분자 질량의 PEG가 사용될 수 있다. MW가 1-100 kDa (1-50 kDa 또는 5-20 kDa를 포함하고 이로 제한되지 않음)인 각 쇄를 갖는 PEG 분자를 포함하고 이로 제한되지 않는 분지쇄 PEG를 사용할 수도 있다. 매우 다양한 PEG 분자가 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Shearwater Polymers, Inc. catalog, Nektar Therapeutics catalog]을 포함하고 이로 제한되지 않는 문헌에 기재되어 있다.
일반적으로, PEG 분자의 적어도 하나의 말단은 비-천연적으로 코딩되는 아미노산과의 반응에 이용가능하다. 예를 들어, 아미노산 측쇄와의 반응을 위해 알킨 및 아지드 모이어티를 갖는 PEG 유도체를 사용하여 본 명세서에 기재된 바와 같이 PEG를 비-천연적으로 코딩되는 아미노산에 부착시킬 수 있다. 비-천연적으로 코딩되는 아미노산이 아지드를 포함하는 경우, PEG는 일반적으로 알킨 모이어티를 함유하여 [3+2] 고리 첨가 생성물을 형성하거나, 포스핀 기를 함유하는 활성화된 PEG 종 (즉, 에스테르, 카르보네이트)을 함유하여 아미드 결합을 형성할 것이다. 별법으로, 비-천연적으로 코딩되는 아미노산이 알킨을 포함하는 경우, PEG는 일반적으로 아지드 모이어티를 함유하여 [3+2] 휘스겐 고리 첨가 생성물을 형성할 것이다. 비-천연적으로 코딩되는 아미노산이 카르보닐 기를 포함하는 경우, PEG는 각각 상응하는 히드라존, 옥심 및 세미카르바존 연결을 형성하기 위해 일반적으로 강력한 친핵성 물질 (히드라지드, 히드라진, 히드록실아민 또는 세미카르바지드 관능기를 포함하고 이로 제한되지 않음)을 포함할 것이다. 별법으로, 상기한 반응성 기의 역 배향을 사용할 수 있다. 즉, 비-천연적으로 코딩되는 아미노산 내의 아지드 모이어티를 알킨을 함유하는 PEG 유도체와 반응시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, PEG 유도체를 갖는 항체 변이체는 비-천연적으로 코딩되는 아미노산의 측쇄 상에 존재하는 화학적 관능기와 반응성인 화학적 관능기를 함유한다.
특정 실시양태에서, 페이로드는 약 800 Da 내지 약 100,000 Da의 평균 분자량을 갖는 수용성 중합체 골격을 포함하는 아지드- 및 아세틸렌 함유 중합체이다. 수용성 중합체의 중합체 골격은 폴리(에틸렌 글리콜)일 수 있다. 그러나, 폴리(에틸렌) 글리콜, 및 폴리(덱스트란) 및 폴리(프로필렌 글리콜)을 포함하는 다른 관련 중합체를 포함하고 이로 제한되지 않는 매우 다양한 수용성 중합체도 본 발명을 실시하기에 적합하고, 용어 PEG 또는 폴리(에틸렌 글리콜)의 사용은 모든 이러한 분자를 포괄하고 포함하기 위한 것이라는 점을 이해해야 한다. 용어 PEG는 이기능성 PEG, 멀티아암형 (multiarmed) PEG, 유도체화된 PEG, 갈래형 PEG, 분지형 PEG, 매달린 (pendent) PEG (즉, 중합체 골격에 매달린된 하나 이상의 기능성 기를 갖는 PEG 또는 관련 중합체), 또는 분해가능한 연결을 갖는 PEG를 비롯한 임의의 형태의 폴리(에틸렌 글리콜)을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
중합체 골격은 선형 또는 분지형일 수 있다. 일반적으로, 분지형 중합체 골격은 당업계에 공지되어 있다. 일반적으로, 분지형 중합체는 중심 분지 코어 모이어티, 및 중심 분지 코어에 연결된 다수의 선형 중합체 쇄를 갖는다. 통상, PEG는 다양한 폴리올, 예컨대 글리세롤, 글리세롤 올리고머, 펜타에리쓰리톨 및 소르비톨에 에틸렌 옥시드를 첨가함으로써 제조될 수 있는 분지 형태로 사용된다. 또한, 중심 분지 모이어티는 몇몇 아미노산, 예를 들어 리신으로부터 유도될 수 있다. 분지형 폴리(에틸렌 글리콜)은 화학식 R(-PEG-OH)m (여기서, R은 코어 모이어티, 예컨대 글리세롤, 글리세롤 올리고머 또는 펜타에리쓰리톨로부터 유도되고, m은 아암의 수를 나타냄)으로서 일반적인 형태로 표시될 수 있다. 또한, 멀티아암형 PEG 분자, 예컨대 각각 그 전부가 본원에 참조로 포함된 미국 특허 5,932,462 5,643,575; 5,229,490; 4,289,872; 미국 특허 출원 공개 2003/0143596; WO 96/21469; 및 WO 93/21259에 기재된 것들도 중합체 골격으로서 사용될 수 있다.
또한, 분지형 PEG는 PEG(-YCHZ2)n (여기서, Y는 연결기이고, Z는 규정된 길이의 원자 쇄에 의해 CH에 연결된 활성화된 말단 기임)으로 표시되는 갈래형 PEG의 형태로 존재할 수 있다.
또한, 또 다른 분지형 형태인 매달린 PEG는 PEG 쇄의 말단에서가 아니라 PEG 골격을 따라 반응성 기, 예를 들어 카르복실 기를 갖는다.
또한, 이러한 PEG 형태 이외에, 골격 내에 약한 또는 분해가능한 연결을 갖는 PEG 중합체를 제조할 수 있다. 예를 들어, 가수분해되기 쉬운 중합체 골격 내에 에스테르 연결을 갖는 PEG를 제조할 수 있다. 아래에 표시되는 바와 같이, 이러한 가수분해는 상기 중합체를 저 분자량의 단편으로 절단시킨다: -PEG-CO2-PEG- + H2O → PEG-CO2H + HO-PEG-. 용어 폴리(에틸렌 글리콜) 또는 PEG가 본원에 개시된 것들을 포함하고 이로 제한되지 않는, 당업계에 공지된 모든 형태를 나타내거나 포함한다는 점은 당업자에게 이해될 것이다.
또한, 많은 다른 중합체들도 본 발명에서 사용하기에 적합하다. 일부 실시양태에서, 2 내지 약 300개의 말단을 갖는 수용성 중합체 골격이 본 발명에서 특히 유용하다. 적합한 중합체의 예는 다른 폴리(알킬렌 글리콜), 예를 들어 폴리(프로필렌 글리콜) ("PPG"), 이들의 공중합체 (에틸렌 글리콜 및 프로필렌 글리콜의 공중합체를 포함하고 이로 제한되지 않음), 이들의 삼원중합체, 이들의 혼합물 등을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 비록 중합체 골격의 각각의 쇄의 분자량은 변할 수 있지만, 일반적으로는 약 800 Da 내지 약 100,000 Da, 종종 약 6,000 Da 내지 약 80,000 Da이다.
당업자는 실질적으로 수용성을 나타내는 골격에 대한 상기 목록이 결코 전부가 아니며 단순히 예시를 위한 것이고, 상기한 품질을 갖는 모든 중합체 물질이 본 발명에서 사용하기 적합한 것으로 고려된다는 점을 인식할 것이다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 중합체 유도체는 "다기능성" 유도체이며, 이는 중합체 골격이 기능성 기에 의해 기능성화되거나 활성화된 적어도 2개의 말단, 및, 가능한 경우 약 300개의 많은 말단을 갖는다는 것을 의미한다. 다기능성 중합체 유도체는 동일하거나 상이할 수 있는 기능성 기에 각각 결합된 2개의 말단을 갖는 선형 중합체를 포함하고 이로 제한되지 않는다.
한 실시양태에서, 중합체 유도체는 하기 구조를 갖는다:
X-A-POLY-B-N=N=N
여기서, N=N=N은 아지드 모이어티이고, B는 존재하거나 존재하지 않을 수 있는 링커 모이어티이고, POLY는 수용성 및 비항원성 중합체이고, A는 존재하거나 존재하지 않을 수 있으며 B와 동일하거나 상이할 수 있는 링커 모이어티이고, X는 제2 기능성 기이다. A 및 B에 대한 링커 모이어티의 예로는 18개 이하, 보다 바람직하게는 1-10개의 탄소 원자를 함유하는 다기능성화된 알킬 기를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 알킬 쇄에 헤테로원자, 예를 들어 질소, 산소 또는 황이 포함될수 있다. 또한, 알킬 쇄는 헤테로원자에서 분지될 수 있다. A 및 B에 대한 연결 모이어티의 다른 예로는 10개 이하, 보다 바람직하게는 5-6개의 탄소 원자를 함유하는 다기능성화된 아릴 기를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 아릴 기는 하나 이상의 탄소 원자, 질소, 산소 또는 황 원자로 치환될 수 있다. 적합한 연결 기의 다른 예는 각각 본원에 참고로 도입되는 미국 특허 5,932,462, 5,643,575 및 미국 특허 출원 공개 2003/0143596에 기재된 연결 기를 포함한다. 당업자는 상기 연결 모이어티에 대한 목록이 결코 전부가 아니며 단순히 예시를 위한 것이고, 상기한 품질을 갖는 모든 연결 모이어티가 본 발명에서 사용하기 적합한 것으로 고려된다는 것을 인식할 것이다.
X로 사용하기 적합한 기능성 기의 예는 히드록실, 보호된 히드록실, 알콕실, 활성 에스테르, 예컨대 N-히드록시숙신이미딜 에스테르 및 1-벤조트리아졸릴 에스테르, 활성 카르보네이트, 예컨대 N-히드록시숙신이미딜 카르보네이트 및 1-벤조트리아졸릴 카르보네이트, 아세탈, 알데히드, 알데히드 수화물, 알케닐, 아크릴레이트, 메타크릴레이트, 아크릴아미드, 활성 술폰, 아민, 아미노옥시, 보호된 아민, 히드라지드, 보호된 히드라지드, 보호된 티올, 카르복실산, 보호된 카르복실산, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 말레이미드, 비닐술폰, 디티오피리딘, 비닐피리딘, 아이오도아세트아미드, 에폭시드, 글리옥살, 디온, 메실레이트, 토실레이트, 트레실레이트, 알켄, 케톤 및 아지드를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 선택된 X 모이어티는 아지드 기와의 반응이 일어나지 않도록 아지드 기와 상용가능해야 한다. 아지드 함유 중합체 유도체는 제2 기능성 기 (즉, X)도 아지드 모이어티인 것을 의미하는 동종이기능성 (homobifunctional) 유도체이거나, 제2 기능성 기가 상이한 기능성 기임을 의미하는 이종이기능성 (heterobifunctional) 유도체일 수 있다.
용어 "보호된"은 특정 반응 조건 하에서 화학적 반응성 기능성 기의 반응을 방지하는 보호기 또는 모이어티의 존재를 지칭한다. 보호기는 보호되는 화학적 반응성 기의 종류에 따라 달라진다. 예를 들어, 화학적 반응성 기가 아민 또는 히드라지드인 경우, 보호기는 tert-부틸옥시카르보닐 (t-Boc) 및 9-플루오레닐메톡시카르보닐 (Fmoc)로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 화학적 반응성 기가 티올인 경우, 보호기는 오르토피리딜디술피드일 수 있다. 화학적 반응성 기가 카르복실산, 예컨대 부탄산, 프로피온산 또는 히드록실 기인 경우, 보호기는 벤질 또는 알킬 기, 예를 들어 메틸, 에틸 또는 tert-부틸일 수 있다. 또한, 당업계에 공지된 다른 보호기도 본 발명에서 사용될 수 있다.
문헌의 말단 기능성 기의 구체적인 예는 N-숙신이미딜 카르보네이트 (예를 들어, 미국 특허 5,281,698, 5,468,478 참조), 아민 (예를 들어, 문헌 [Buckmann et al. Makromol. Chem. 182: 1379 (1981)], [Zaplipsky et al. Eur. Polym. J. 19: 1177 (1983)] 참조), 히드라지드 (예를 들어, 문헌 [Andresz et al. Makromol. Chem. 179:301 (1978)] 참조), 숙신이미딜 프로피오네이트 및 숙신이미딜 부타노에이트 (예를 들어, 문헌 [Olson et al. in Poly(ethylene glycol) Chemistry & Biological Applications, pp 170-181, Harris & Zaplipsky Eds., ACS, Washington, D.C., 1997]; 또한 미국 특허 5,672,662 참조), 숙신이미딜 숙시네이트 (예를 들어, 문헌 [Abuchowski et al. Cancer Biochem. Biophys. 7:175 (1984)] 및 [Joppich et al. Macrolol. Chem. 180: 1381 (1979)] 참조), 숙신이미딜 에스테르 (예를 들어, 미국 특허 4,670,417 참조), 벤조트리아졸 카르보네이트 (예를 들어, 미국 특허 5,650,234 참조), 글리시딜 에테르 (예를 들어, 문헌 [Pitha et al. Eur. J Biochem. 94:11 (1979)], [Elling et al., Biotech. Appl. Biochem. 13:354 (1991)] 참조), 옥시카르보닐이미다졸 (예를 들어, 문헌 [Beauchamp, et al., Anal. Biochem. 131:25 (1983)], [Tondelli et al. J. Controlled Release 1:251 (1985)] 참조), p-니트로페닐 카르보네이트 (예를 들어, 문헌 [Veronese, et al., Appl. Biochem. Biotech., 11:141 (1985)]; 및 [Sartore et al., Appl. Biochem. Biotech., 27:45 (1991)] 참조), 알데히드 (예를 들어, 문헌 [Harris et al. J. Polym. Sci. Chem. Ed. 22:341 (1984)], 미국 특허 5,824,784, 미국 특허 5,252,714 참조), 말레이미드 (예를 들어, 문헌 [Goodson et al. Bio/Technology 8:343 (1990)], [Romani et al. in Chemistry of Peptides and Proteins 2:29 (1984)], 및 [Kogan, Synthetic Comm. 22:2417 (1992)] 참조), 오르토피리딜-디술피드 (예를 들어, 문헌 [Woghiren, et al. Bioconj. Chem. 4:314(1993)] 참조), 아크릴롤 (예를 들어, 문헌 [Sawhney et al., Macromolecules, 26:581 (1993)] 참조), 비닐술폰 (예를 들어, 미국 특허 5,900,461 참조)을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 모든 상기 참고문헌 및 특허는 본원에 참조로 포함된다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 본 발명의 중합체 유도체는 하기 구조를 갖는 중합체 골격을 포함한다:
X-CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-N=N=N
여기서, X는 상기 설명된 바와 같은 기능성 기이고; n은 약 20 내지 약 4000이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 중합체 유도체는 하기 구조를 갖는 중합체 골격을 포함한다:
X-CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-O-(CH2)m-W-N=N=N
여기서, W는 1-10개의 탄소 원자를 포함하는 지방족 또는 방향족 링커 모이어티이고; n은 약 20 내지 약 4000이고; X는 상기 설명된 바와 같은 기능성 기이고; m은 1 내지 10이다.
본 발명의 아지드 함유 PEG 유도체는 당업계에 공지되고/되거나 본원에 개시되어 있는 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다. 한 방법에서, 아래에 나타내는 바와 같이, 제1 기능성 기에 결합된 제1 말단 및 적합한 이탈기에 결합된 제2 말단을 가지며 약 800 Da 내지 약 100,000 Da의 평균 분자량을 갖는 수용성 중합체 골격은 아지드 음이온 (이는 나트륨, 칼륨, tert-부틸암모늄 등을 포함하는 임의의 다수의 적합한 반대-이온과 쌍을 이룰 수 있음)과 반응한다. 이러한 이탈기는 친핵성 치환을 받게 되고, 아지드 모이어티에 의해 교체되어 다음과 같은 목적하는 아지드 함유 PEG 중합체를 제공한다: X-PEG-L+N3 -→X-PEG-N3.
위에 제시된 바와 같이, 본 발명에서 사용하기 적합한 중합체 골격은 화학식 X-PEG-L (여기서, PEG는 폴리(에틸렌 글리콜)이고, X는 아지드 기와 반응하지 않는 기능성 기이고, L은 적합한 이탈기임)로 표시된다. 적합한 기능성 기의 예는 히드록실, 보호된 히드록실, 아세탈, 알케닐, 아민, 아미노옥시, 보호된 아민, 보호된 히드라지드, 보호된 티올, 카르복실산, 보호된 카르복실산, 말레이미드, 디티오피리딘, 및 비닐피리딘, 및 케톤을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 적합한 이탈기의 예는 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 메실레이트, 트레실레이트, 및 토실레이트를 포함하고 이로 제한되지 않는다.
본 발명의 아지드 함유 중합체 유도체를 제조하는 또 다른 방법에서, 아지드 관능기를 갖는 연결제를 약 800 Da 내지 약 100,000 Da의 평균 분자량을 갖는 수용성 중합체 골격과 접촉시키고, 이때 연결제는 PEG 중합체 상의 화학적 관능기와 선택적으로 반응하여 아지드 함유 중합체 유도체 생성물을 형성하는 화학적 관능기를 보유하고, 여기서 아지드는 연결 기에 의해 중합체 골격으로부터 분리된다.
예시적인 반응식은 다음과 같이 표시된다:
X-PEG-M+N-링커-N=N=N→PG-X-PEG-링커-N=N=N
여기서, PEG는 폴리(에틸렌 글리콜)이고, X는 캡핑 (capping) 기, 예를 들어 알콕시 또는 상기 설명된 바와 같은 기능성 기이고, M은 N 기능성 기와 효율적으로 및 선택적으로 반응하는 아지드 관능기와 반응하지 않는 기능성 기이다.
적절한 기능성 기의 예는 N이 아민인 경우 카르복실산, 카르보네이트 또는 활성 에스테르인 M, N이 히드라지드 또는 아미노옥시 모이어티인 경우 케톤인 M, N이 친핵성 물질인 경우 이탈기인 M을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
조 생성물의 정제는 생성물을 침전시킨 후, 필요에 따라 크로마토그래피를 수행하는 방법을 포함하고 이로 제한되지 않는 공지된 방법에 의해 달성될 수 있다.
보다 구체적인 예는 아민 중의 하나가 보호기 모이어티, 예를 들어 tert-부틸-Boc에 의해 보호되는 PEG 디아민의 경우로서 하기와 같이 표시되고, 생성되는 일-보호된 PEG 디아민은 아지드 관능기를 갖는 연결 모이어티와 반응한다: BocHN-PEG-NH2+H02C-(CH2)3-N=N=N.
이 경우, 아민 기는 다양한 활성화제, 예를 들어 티오닐 클로라이드 또는 카르보디이미드 시약 및 N-히드록시숙신이미드 또는 N-히드록시벤조트리아졸을 사용하여 카르복실산 기에 커플링되어, 모노아민 PEG 유도체와 아지드-보유 링커 모이어티 사이에 아미드 결합을 형성할 수 있다. 아미드 결합의 성공적인 형성 후, 생성된 N-tert-부틸-Boc-보호된 아지드 함유 유도체는 생체활성 분자를 변형시키는 데 직접 사용될 수 있거나 또는 보다 다듬어져 다른 유용한 기능성 기를 부가시키는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, N-t-Boc 기는 강한 산 처리에 의해 가수분해되어 오메가-아미노-PEG-아지드를 생성할 수 있다. 생성된 아민은 다른 유용한 관능기, 예를 들어, 말레이미드 기, 활성화된 디술피드, 활성화된 에스테르 등을 부가시키는 합성 핸들(handle)로서 사용되어 가치있는 이종이기능성 시약을 생성시킬 수 있다.
상이한 분자를 중합체의 각 말단에 부착시킬 필요가 있는 경우, 이종이기능성 유도체가 특히 유용하다. 예를 들어, 오메가-N-아미노-N-아지도 PEG는 활성화된 친전자성 기, 예컨대 알데히드, 케톤, 활성화된 에스테르, 활성화된 카르보네이트 등을 갖는 분자를 PEG의 한 말단에 부착시키고, 아세틸렌 기를 갖는 분자를 PEG의 다른 말단에 부착시킨다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 중합체 유도체는 하기 구조를 갖는다:
X-A-POLY-B-C=C-R
여기서, R은 H 또는 알킬, 알켄, 알킬옥시, 또는 아릴 또는 치환된 아릴 기일 수 있고, B는 존재하거나 존재하지 않을 수 있는 연결 모이어티이고, POLY는 수용성 비항원성 중합체이고, A는 존재하거나 존재하지 않을 수 있고 B와 동일하거나 상이할 수 있는 연결 모이어티이고, X는 제2 기능성 기이다.
A 및 B에 대한 연결 모이어티의 예는 18개 이하, 보다 바람직하게는 1-10개의 탄소 원자를 함유하는 다기능성된 알킬 기를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 알킬 쇄에는 헤테로원자, 예컨대 질소, 산소 또는 황이 포함될 수 있다. 또한, 알킬 쇄는 헤테로원자에서 분지될 수 있다. A 및 B에 대한 연결 모이어티의 다른 예는 10개 이하, 보다 바람직하게는 5-6개의 탄소 원자를 함유하는 다기능성화된 아릴 기를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 아릴 기는 하나 이상의 탄소 원자, 질소, 산소 또는 황 원자로 치환될 수 있다. 적합한 연결 기의 다른 예는 각각 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 5,932,462 및 5,643,575, 및 미국 특허 출원 공개 2003/0143596에 기재된 연결 기를 포함한다. 당업자는 상기 연결 모이어티에 대한 목록이 결코 전부가 아니며 단순히 예시를 위한 것이고, 상기한 품질을 갖는 매우다양한 연결 모이어티가 본 발명에서 유용한 것으로 고려된다는 것을 인식할 것이다.
X로 사용하기 적합한 기능성 기의 예는 히드록실, 보호된 히드록실, 알콕실, 활성 에스테르, 예컨대 N-히드록시숙신이미딜 에스테르 및 1-벤조트리아졸릴 에스테르, 활성 카르보네이트, 예컨대 N-히드록시숙신이미딜 카르보네이트 및 1-벤조트리아졸릴 카르보네이트, 아세탈, 알데히드, 알데히드 수화물, 알케닐, 아크릴레이트, 메타크릴레이트, 아크릴아미드, 활성 술폰, 아민, 아미노옥시, 보호된 아민, 히드라지드, 보호된 히드라지드, 보호된 티올, 카르복실산, 보호된 카르복실산, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 말레이미드, 비닐술폰, 디티오피리딘, 비닐피리딘, 아이오도아세트아미드, 에폭시드, 글리옥살, 디온, 메실레이트, 토실레이트, 및 트레실레이트, 알켄, 케톤 및 아세틸렌을 포함한다. 이해되는 바와 같이, 선택된 X 모이어티는 아세틸렌 기와의 반응이 일어나지 않도록 아세틸렌 기와 상용가능해야 한다. 아세틸렌 함유 중합체 유도체는 제2 기능성 기 (즉, X)도 아세틸렌 모이어티인 것을 의미하는 동종이기능성 유도체이거나, 제2 기능성 기가 상이한 기능성 기임을 의미하는 이종이기능성 유도체일 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 중합체 유도체는 하기 구조를 갖는 중합체 골격을 포함한다:
X-CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-O-(CH2)m-C=CH
여기서, X는 상기한 바와 같은 기능성 기이고, n은 약 20 내지 약 4000이고, m은 1 내지 10이다. 이종이기능성 PEG 중합체의 각각의 구체적인 예는 아래에 제시된다.
본 발명의 아세틸렌 함유 PEG 유도체는 당업계에 공지되고/되거나 본원에 개시되어 있는 방법에 의해 제조될 수 있다. 한 방법에서, 제1 기능성 기에 결합된 제1 말단, 및 적합한 친핵성 기에 결합된 제2 말단을 가지며 약 800 Da 내지 약 100,000 Da의 평균 분자량을 갖는 수용성 중합체 골격은 아세틸렌 관능기 및 PEG 상의 친핵성 기와 반응하기 적합한 이탈기 둘 모두를 갖는 화합물과 반응한다. 친핵성 모이어티를 갖는 PEG 중합체와 이탈기를 갖는 분자가 조합되는 경우, 이탈기는 친핵성 치환을 거치고, 친핵성 모이어티로 교체되어 목적하는 아세틸렌 함유 중합체를 제공한다: X-PEG-Nu+L-A-C→X-PEG-Nu-A-C=CR'.
상기 제시된 바와 같이, 반응에 사용하기에 바람직한 중합체 골격은 화학식 X-PEG-Nu로 표시되고, 여기서 PEG는 폴리(에틸렌글리콜)이고, Nu는 친핵성 모이어티이고, X는 Nu, L 또는 아세틸렌 관능기와 반응하지 않는 기능성 기이다.
Nu의 예는 주로 SN2-형 메카니즘을 통해 반응하는 아민, 알콕시, 아릴옥시, 술프히드릴, 이미노, 카르복실레이트, 히드라지드, 아미녹시 기를 포함하고 이로 제한되지 않는다. Nu 기의 추가의 예는 주로 친핵성 부가 반응을 통해 반응하는 기능성 기를 포함한다. L 기의 예는 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 메실레이트, 트레실레이트, 및 토실레이트 및 친핵성 치환을 받을 것으로 예상되는 다른 기뿐만 아니라, 케톤, 알데히드, 티오에스테르, 올레핀, 알파-베타 불포화 카르보닐 기, 카르보네이트 및 친핵성 물질에 의한 부가를 받을 것으로 예상되는 다른 친전자성 기를 포함한다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, A는 1-10개의 탄소 원자의 지방족 링커 또는 6-14개의 탄소 원자의 치환된 아릴 고리이다. X는 아지드 기와 반응하지 않는 기능성 기이고, L은 적합한 이탈기이다.
본 발명의 아세틸렌 함유 중합체 유도체를 제조하는 또 다른 방법에서, 한 말단에 보호된 기능성 기 또는 캡핑제를 보유하고 다른 말단에는 적합한 이탈기를 보유하며 평균 분자량이 약 800 Da 내지 약 100,000 Da인 PEG 중합체는 아세틸렌 음이온에 의해 접촉된다.
수용성 중합체는 본 발명의 항체에 연결될 수 있다. 수용성 중합체는 항체 내로 도입된 비-천연적으로 코딩되는 아미노산, 비-천연적으로 코딩 또는 천연적으로 코딩되는 아미노산의 임의의 기능성 기 또는 치환체, 또는 비-천연적으로 코딩 또는 천연적으로 코딩되는 아미노산에 부가된 임의의 기능성 기 또는 치환체를 통해 연결될 수 있다. 별법으로, 수용성 중합체는 천연 생성 아미노산 (시스테인, 리신 또는 N-말단 잔기의 아민 기를 포함하고 이로 제한되지 않음)을 통해 비-천연적으로 코딩되는 아미노산을 도입하는 항원-결합 폴리펩티드에 연결된다. 일부 경우에, 본 발명의 항체는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 비-천연 아미노산을 포함하며, 이때 하나 이상의 비-천연적으로 코딩되는 아미노산(들)은 수용성 중합체(들) (PEG 및/또는 올리고당을 포함하고 이로 제한되지 않음)에 연결된다. 일부 경우에, 본 발명의 항체는 수용성 중합체에 결합된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 또는 그 초과의 천연적으로 코딩되는 아미노산(들)을 추가로 포함한다. 일부 경우에, 본 발명의 항체는 수용성 중합체에 연결된 하나 이상의 비-천연적으로 코딩되는 아미노산(들) 및 수용성 중합체에 연결된 하나 이상의 천연 생성 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명에서 사용되는 수용성 중합체는 접합되지 않은 형태에 비해 항체의 혈청 반감기를 증가시킨다.
본 발명의 항원-결합 폴리펩티드에 연결된 수용성 중합체의 수 (즉, PEG화 또는 글리코실화 정도)를 조정하여 변경된 (증가 또는 감소를 포함하고 이로 제한되지 않음) 약리학적, 약동학적 또는 약력학적 특징, 예컨대 생체내 반감기를 제공할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체의 반감기는 비-변형된 폴리펩티드에 비해 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90%, 또는 약 2배, 5배, 10 배, 50배 또는 적어도 약 100배 증가된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 카르보닐 함유 비-천연적으로 코딩되는 아미노산을 포함하는 항원-결합 폴리펩티드는 PEG 골격에 직접 연결된 말단 히드라진, 히드록실아민, 히드라지드 또는 세미카르바지드 모이어티를 함유하는 PEG 유도체로 변형된다.
일부 실시양태에서, 히드록실아민-말단 PEG 유도체는 하기 구조를 가질 것이다:
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-O-NH2
여기서, R은 간단한 알킬 (메틸, 에틸, 프로필 등)이고, m은 2-10이고, n은 100-1,000이다 (즉, 평균 분자량은 5-40 kDa이다).
일부 실시양태에서, 히드라진- 또는 히드라지드-함유 PEG 유도체는 하기 구조를 가질 것이다:
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-X-NH-NH2
여기서, R은 간단한 알킬 (메틸, 에틸, 프로필 등)이고, m은 2-10이고, n은 100-1,000이고, X는 임의로 존재하거나 존재하지 않을 수 있는 카르보닐 기 (C=O)이다.
일부 실시양태에서, 세미카르바지드-함유 PEG 유도체는 하기 구조를 가질 것이다:
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-NH-C(O)-NH-NH2
여기서, R은 간단한 알킬 (메틸, 에틸, 프로필 등)이고, m은 2-10이고, n은 100-1,000이다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 카르보닐 함유 아미노산을 포함하는 항원-결합 폴리펩티드는 아미드 연결에 의해 PEG 골격에 연결되는 말단 히드록실아민, 히드라지드, 히드라진 또는 세미카르바지드 모이어티를 함유하는 PEG 유도체에 의해 변형된다.
일부 실시양태에서, 히드록실아민-말단 PEG 유도체는 하기 구조를 갖는다:
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)m-O-NH2
여기서, R은 간단한 알킬 (메틸, 에틸, 프로필 등)이고, m은 2-10이고, n은 100-1,000이다 (즉, 평균 분자량은 5-40 kDa이다).
일부 실시양태에서, 히드라진- 또는 히드라지드-함유 PEG 유도체는 하기 구조를 갖는다:
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)m-X-NH-NH2
여기서, R은 간단한 알킬 (메틸, 에틸, 프로필 등)이고, m은 2-10이고, n은 100-1,000이고, X는 임의로 존재하거나 존재하지 않을 수 있는 카르보닐 기 (C=O)이다.
일부 실시양태에서, 세미카르바지드-함유 PEG 유도체는 하기 구조를 갖는다:
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)m-NH-C(O)-NH-NH2
여기서, R은 간단한 알킬 (메틸, 에틸, 프로필 등)이고, m은 2-10이고, n은 100-1,000이다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 카르보닐 함유 아미노산을 포함하는 항체는 말단 히드라진, 히드록실아민, 히드라지드 또는 세미카르바지드 모이어티를 함유하는 분지형 PEG 유도체로 변형되고, 이러한 분지형 PEG의 각각의 쇄의 MW는 10-40 kDa, 보다 바람직하게는 5-20 kDa이다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 비-천연적으로 코딩되는 아미노산을 포함하는 항체는 분지형 구조를 갖는 PEG 유도체로 변형된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 히드라진- 또는 히드라지드-말단 PEG 유도체는 하기 구조를 가질 것이다:
[RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)]2CH(CH2)m-X-NH-NH2
여기서, R은 간단한 알킬 (메틸, 에틸, 프로필 등)이고, m은 2-10이고, n은 100-1,000이고, X는 임의로 존재하거나 존재하지 않을 수 있는 카르보닐 기 (C=O)이다.
일부 실시양태에서, 세미카르바지드 기를 함유하는 PEG 유도체는 하기 구조를 가질 것이다:
[RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-C(O)-NH-CH2-CH2]2CH-X-(CH2)m-NH-C(O)-NH-NH2
여기서, R은 간단한 알킬 (메틸, 에틸, 프로필 등)이고, X는 임의로 NH, O, S, C(O)이거나 또는 존재하지 않고, m은 2-10이고, n은 100-1,000이다.
일부 실시양태에서, 히드록실아민 기를 함유하는 PEG 유도체는 하기 구조를 가질 것이다:
[RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-C(O)-NH-CH2-CH2]2CH-X-(CH2)m-O-NH2
여기서, R은 간단한 알킬 (메틸, 에틸, 프로필 등)이고, X는 임의로 NH, O, S, C(O)이거나 또는 존재하지 않고, m은 2-10이고, n은 100-1,000이다.
수용성 중합체(들)이 항체에 연결되는 정도 및 부위는 항체와 항원 또는 수용체의 결합을 조절할수 있다.
중합체의 활성화 및 펩티드의 접합을 위한 방법 및 화학적 방법이 문헌에 기재되어 있고, 당업계에 공지되어 있다. 중합체의 활성화에 통상 이용되는 방법은 시아노겐 브로마이드, 퍼아이오데이트, 글루타르알데히드, 비에폭시드, 에피클로로히드린, 디비닐술폰, 카르보디이미드, 술포닐 할라이드, 트리클로로트리아진 등을 사용한 기능성 기의 활성화를 포함하고 이로 제한되지 않는다 ([R. F. Taylor, (1991), PROTEIN IMMOBILISATION. FUNDAMENTAL AND APPLICATIONS, Marcel Dekker, N.Y.]; [S. S. Wong, (1992), CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSSLINKING, CRC Press, Boca Raton]; [G. T. Hermanson et al., (1993), IMMOBILIZED AFFINITY LIGAND TECHNIQUES, Academic Press, N.Y.]; [Dunn, R. L., et al., Eds. POLYMERIC DRUGS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS, ACS Symposium Series Vol. 469, American Chemical Society, Washington, D.C. 1991] 참조).
PEG의 기능성화 및 접합에 대한 몇 개의 리뷰 및 논문이 이용가능하다. 예를 들어, 문헌 [Harris, Macronol. Chem. Phys. C25: 325-373 (1985)]; [Scouten, Methods in Enzymology 135: 30-65 (1987)]; [Wong et al., Enzyme Microb. Technol. 14: 866-874 (1992)]; [Delgado et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9: 249-304 (1992)]; [Zalipsky, Bioconjugate Chem. 6: 150-165 (1995)]을 참조한다.
또한, 중합체의 활성화 방법은 WO 94/17039, 미국 특허 5,324,844, WO 94/18247, WO 94/04193, 미국 특허 5,219,564, 미국 특허 5,122,614, WO 90/13540, 미국 특허 5,281,698, 및 WO 93/15189에서 찾을 수 있고, 응고인자 VIII (WO 94/15625), 헤모글로빈 (WO 94/09027), 산소 운반 분자 (미국 특허 4,412,989), 리보뉴클레아제 및 슈퍼옥시드 디스뮤타제 (Veronese at al., App. Biochem. Biotech. 11: 141-45 (1985))를 포함하고 이로 제한되지 않는 활성화된 중합체와 효소 사이의 접합 방법도 공지되어 있다. 인용된 모든 참고문헌 및 특허는 본원에 참조로 포함된다.
비-천연적으로 코딩되는 아미노산, 예를 들어 p-아지도-L-페닐알라닌을 함유하는 항원-결합 폴리펩티드의 PEG화 (즉, 임의의 수용성 중합체의 부가)는 임의의 편리한 방법에 의해 수행된다. 예를 들어, 항체는 알킨-종결 mPEG 유도체에 의해 PEG화된다. 간단히 설명하면, 실온에서 과량의 고체 mPEG(5000)-O-CH2-C=CH를 교반하면서 p-아지도-L-Phe 함유 항체의 수용액에 첨가한다. 일반적으로, 이 수용액은 반응이 수행되는 pH (일반적으로, 약 pH 4-10) 근처에서 pKa를 갖는 완충제에 의해 완충된다. 예를 들어, pH 7.5에서 PEG화하기 적합한 완충제의 예는 HEPES, 포스페이트, 보레이트, TRIS-HCl, EPPS 및 TES를 포함하고 이로 제한되지 않는다. pH를 연속적으로 모니터링하고, 필요에 따라, 조정한다. 일반적으로, 반응을 약 1 내지 48시간 동안 계속 수행한다.
이어서, 반응 생성물을 소수성 상호작용 크로마토그래피로 정제하여, 차단되지 않은 PEG가 분자의 양쪽 말단에서 활성화되어 항체 변이체 분자를 가교결합시키는 경우 형성될 수 있는 PEG화된 항체의 임의의 고-분자량 복합체와, 유리 mPEG(5000)-O-CH2-C=CH로부터 PEG화된 항체 변이체를 분리시킨다. 소수성 상호작용 크로마토그래피로 정제하는 동안의 조건은 임의의 가교결합된 PEG화된 항체 변이체 복합체가 하나 이상의 PEG 기에 접합된 하나의 항체 변이체 분자를 함유하는 목적하는 형태 다음으로 용출되는 동안 유리 mPEG(5000)-O-CH2-C=CH가 칼럼을 통해 흘러나오게 하는 조건이다. 적합한 조건은 가교결합된 복합체 대 목적하는 접합체의 상대적 크기에 따라 달라지고, 당업자에 의해 용이하게 결정된다. 목적하는 접합체를 함유하는 용리액을 한외여과에 의해 농축하고, 투석여과에 의해 탈염한다.
필요에 따라, 소수성 크로마토그래피로부터 얻은 PEG화된 항체를 친화도 크로마토그래피; 음이온- 또는 양이온 교환 크로마토그래피 (DEAE 세파로스를 사용하는 것을 포함하고 이로 제한되지 않음); 실리카 상에서의 크로마토그래피; 역상 HPLC; 겔 여과 (세파덱스 G-75를 사용하는 것을 포함하고 이로 제한되지 않음); 소수성 상호작용 크로마토그래피; 크기-배제 크로마토그래피, 금속-킬레이트 크로마토그래피; 한외여과/투석여과: 에탄올 침전; 황산암모늄 침전; 크로마토포커싱 (chromatofocusing); 치환 크로마토그래피; 전기영동 절차 (분취형 등전위 포커싱을 포함하고 이로 제한되지 않음), 차등 용해도 이용법 (황산암모늄 침전을 포함하고 이로 제한되지 않음), 또는 추출을 포함하고 이로 제한되지 않는 당업자에게 공지된 하나 이상의 절차에 의해 추가로 정제할 수 있다. 겉보기 분자량은 구형 단백질 기준물과 비교함으로써 GPC에 의해 추정될 수 있다 (문헌 [PROTEIN PURIFICATION METHODS, A PRACTICAL APPROACH (Harris & Angal, Eds.) IRL Press 1989, 293-306] 참조). 항체-PEG 접합체의 순도를 단백질 분해성 분해 (트립신 절단을 포함하고 이로 제한되지 않음) 후 질량 분광측정 분석에 의해 평가될 수 있다 (Pepinsky B., et al., J. Pharmacol. & Exp. Ther. 297 (3): 1059-66 (2001)).
본 발명의 항체의 아미노산에 연결된 수용성 중합체는 제한 없이 추가로 유도체화되거나 치환될 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 항원-결합 폴리펩티드는 비-천연적으로 코딩되는 아미노산의 측쇄 상에 존재하는 알킨 모이어티와 반응하는 아지드 모이어티를 함유하는 PEG 유도체에 의해 변형된다. 일반적으로, PEG 유도체의 평균 분자량은 1 내지 100 kDa이고, 일부 실시양태에서는 10 내지 40 kDa이다.
일부 실시양태에서, 아지드-말단 PEG 유도체는 하기 구조를 가질 것이다:
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-N3
여기서, R은 간단한 알킬 (메틸, 에틸, 프로필 등)이고, m은 2-10이고, n은 100-1,000이다 (즉, 평균 분자량은 5-40 kDa이다).
또 다른 실시양태에서, 아지드-말단 PEG 유도체는 하기 구조를 가질 것이다:
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-NH-C(O)-(CH2)p-N3
여기서, R은 간단한 알킬 (메틸, 에틸, 프로필 등)이고, m은 2-10이고, p는 2-10이고, n은 100-1,000이다 (즉, 평균 분자량은 5-40 kDa이다).
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 알킨 함유 아미노산을 포함하는 항체는 말단 아지드 모이어티를 함유하는 분지형 PEG 유도체에 의해 변형되며, 이러한 분지형 PEG의 각 쇄의 MW는 10 내지 40 kDa, 보다 바람직하게는 5 내지 20 kDa이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 아지드-말단 PEG 유도체는 하기 구조를 갖는다:
[RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)]2CH(CH-2)m-X-(CH2)p-N3
여기서, R은 간단한 알킬 (메틸, 에틸, 프로필 등)이고, m은 2-10이고, p는 2-10이고, n은 100-1,000이고, X는 임의로 각각의 경우에 존재하거나 존재하지 않을 수 있는 O, N, S 또는 카르보닐 기 (C=O)이다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 항원-결합 폴리펩티드는 비-천연적으로 코딩되는 아미노산의 측쇄 상에 존재하는 아지드 모이어티와 반응하는 알킨 모이어티를 함유하는 PEG 유도체에 의해 변형된다.
일부 실시양태에서, 알킨-말단 PEG 유도체는 하기 구조를 갖는다:
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-C=CH
여기서, R은 간단한 알킬 (메틸, 에틸, 프로필 등)이고, m은 2-10이고, n은 100-1,000이다 (즉, 평균 분자량은 5-40 kDa이다).
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 알킨 함유 비-천연적으로 코딩되는 아미노산을 포함하는 항체는 아미드 연결에 의해 PEG 골격에 연결된 말단 아지드 또는 말단 알킨 모이어티를 함유하는 PEG 유도체에 의해 변형된다.
일부 실시양태에서, 알킨-말단 PEG 유도체는 하기 구조를 갖는다:
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-NH-C(O)-(CH2)p-C=CH
여기서, R은 간단한 알킬 (메틸, 에틸, 프로필 등)이고, m은 2-10이고, p는 2-10이고, n은 100-1,000이다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 아지드 함유 아미노산을 포함하는 항원-결합 폴리펩티드는 말단 알킨 모이어티를 함유하는 분지형 PEG 유도체에 의해 변형되며, 이러한 분지형 PEG의 각 쇄의 MW는 10 내지 40 kDa, 보다 바람직하게는 5 내지 20 kDa이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 알킨-말단 PEG 유도체는 하기 구조를 갖는다:
[RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)]2CH(CH-2)m-X-(CH2)pC=CH
여기서, R은 간단한 알킬 (메틸, 에틸, 프로필 등)이고, m은 2-10이고, p는 2-10이고, n은 100-1,000이고, X는 임의로 O, N, S 또는 카르보닐 기 (C=O)이거나, 또는 존재하지 않는다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 항체는 비-천연적으로 코딩되는 아미노산의 측쇄 상에 존재하는 아지드 모이어티와 반응하게 되는 아릴 포스핀 기를 추가로 포함하는 활성화된 기능성 기 (에스테르, 카르보네이트를 포함하고 이로 제한되지 않음)를 함유하는 PEG 유도체에 의해 변형된다. 일반적으로, PEG 유도체의 평균 분자량은 1 내지 100 kDa이고, 일부 실시양태에서 10 내지 40 kDa이다.
항체에 결합될 수 있는 다른 예시적인 PEG 분자, 및 PEG화 방법은 예를 들어 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 출원 공개 2004/0001838; 2002/0052009; 2003/0162949; 2004/0013637; 2003/0228274; 2003/0220447; 2003/0158333; 2003/0143596; 2003/0114647; 2003/0105275; 2003/0105224; 2003/0023023; 2002/0156047; 2002/0099133; 2002/0086939; 2002/0082345; 2002/0072573; 2002/0052430; 2002/0040076; 2002/0037949; 2002/0002250; 2001/0056171; 2001/0044526; 2001/0027217; 2001/0021763; 미국 특허 6,646,110; 5,824,778; 5,476,653; 5,219,564; 5,629,384; 5,736,625; 4,902,502; 5,281,698; 5,122,614; 5,473,034; 5,516,673; 5,382,657; 6,552,167; 6,610,281; 6,515,100; 6,461,603; 6,436,386; 6,214,966; 5,990,237; 5,900,461; 5,739,208; 5,672,662; 5,446,090; 5,808,096; 5,612,460; 5,324,844; 5,252,714; 6,420,339; 6,201,072; 6,451,346; 6,306,821; 5,559,213; 5,612,460; 5,747,646; 5,834,594; 5,849,860; 5,980,948; 6,004,573; 6,129,912; WO 97/32607, EP 229,108, EP 402,378, WO 92/16555, WO 94/04193, WO 94/14758, WO 94/17039, WO 94/18247, WO 94/28024, WO 95/00162, WO 95/11924, W095/13090, WO 95/33490, WO 96/00080, WO 97/18832, WO 98/41562, WO 98/48837, WO 99/32134, WO 99/32139, WO 99/32140, WO 96/40791, WO 98/32466, WO 95/06058, EP 439 508, WO 97/03106, WO 96/21469, WO 95/13312, EP 921131, WO 98/05363, EP 809 996, WO 96/41813, WO 96/07670, EP 605 963, EP 510 356, EP 400 472, EP 183 503 및 EP 154 316에 기재된 것을 포함한다. 본 명세서에 기재된 임의의 PEG 분자는 단일쇄 PEG, 분지쇄 PEG, 멀티아암쇄 PEG, 단일기능성 PEG, 이기능성 PEG, 다기능성 PEG 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하고 이로 제한되지 않는 임의의 형태로 사용될 수 있다.
특정 실시양태에서, 항체는 비-천연 아미노산과 반응할 수 있는 하나 이상의 링커로 페이로드에 연결될 수 있다. 하나 이상의 링커는 당업자에게 명백한 임의의 링커일 수 있다. 용어 "링커"는 일반적으로 화학 반응의 결과로서 형성되며 일반적으로 공유 연결인 기 또는 결합을 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. 가수분해적으로 안정한 연결은 연결이 물 중에서 실질적으로 안정하고 생리학적 조건 하의 pH를 포함하고 이로 제한되지 않는 유용한 pH에서 연장된 기간 동안, 아마도 심지어 무기한 동안 물과 반응하지 않는 것을 의미한다. 가수분해적으로 불안정한 또는 분해가능한 연결은 연결이 예를 들어 혈액을 비롯한 수용액 내에서 또는 물 내에서 분해될 수 있는 것을 의미한다. 효소적으로 불안정한 또는 분해가능한 연결은 결합이 하나 이상의 효소에 의해 분해될 수 있다는 것을 의미한다. 당업계에서 이해되고 있는 바와 같이, PEG 및 관련 중합체는 중합체 골격 내의, 또는 중합체 골격과 중합체 분자의 하나 이상의 말단 기능성 기 사이의 링커 기 내의 분해가능한 연결을 포함할 수 있다. 예를 들어, PEG 카르복실산 또는 활성화된 PEG 카르복실산과 생물학적 활성제 상의 알콜 기의 반응에 의해 형성된 에스테르 연결은 일반적으로 생리학적 조건 하에 가수분해되어 상기 작용제를 방출한다. 다른 가수분해적으로 분해가능한 연결은 카르보네이트 연결; 아민과 알데히드의 반응으로부터 발생된 이민 연결; 알콜과 포스페이트 기를 반응시킴에 의해 형성된 포스페이트 에스테르 연결; 히드라지드와 알데히드의 반응 생성물인 히드라존 연합; 알데히드와 알콜의 반응 생성물인 아세탈 연결; 포름메이트와 알콜의 반응 생성물인 오르토에스테르 연결; PEG와 같은 중합체의 말단에 있는 아민 기를 포함하고 이로 제한되지 않는 아민 기와 펩티드의 카르복실 기에 의해 형성된 펩티드 결합; 및 중합체의 말단에 있는 포스포르아미다이트 기를 포함하고 이로 제한되지 않는 포스포르아미다이트 기와 올리고뉴클레오티드의 5' 히드록실 기에 의해 형성된 올리고뉴클레오티드 결합을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 분지형 링커가 본 발명의 항체에 사용될 수 있다. 많은 상이한 절단가능 링커가 당업자에게 알려져 있다. 미국 특허 4,618,492; 4,542,225, 및 4,625,014를 참고한다. 이들 링커 기로부터 작용제의 방출 메카니즘은 예를 들어 광불안정성 결합 및 산 촉매된 가수분해를 포함한다. 미국 특허 4,671,958은 예를 들어 환자의 보체계의 단백질 분해성 효소에 의해 생체내에서 표적 부위에서 절단되는 링커를 포함하는 면역접합체에 대한 설명은 포함한다. 링커의 길이는 항체와 이에 연결되는 분자 사이의 목적하는 공간 관계에 따라 미리 결정되거나 선택될 수 있다. 항체에 다양한 방사성 진단 화합물, 방사선요법 화합물, 약물, 독소, 및 다른 작용제를 부착시키기 위한 매우 많은 방법에 비추어, 당업자는 제시된 작용제를 항체에 부착시키기 위한 적합한 방법을 결정할 수 있을 것이다.
임의의 이종- 또는 동종-이기능성 링커가 접합체를 연결하기 위해 사용될 수 있다. 링커는 넓은 범위의 분자량 또는 분자 길이를 가질 수 있다. 분자량이 보다 큰 또는 작은 링커는 항체와 연결된 엔티티 사이에 목적하는 공간적 관계 또는 입체형태를 제공하는 데 사용될 수 있다. 분자 길이가 보다 길거나 또는 짧은 링커는 항체와 연결된 엔티티 사이에서 목적하는 공간 또는 유연성을 제공하기 위해 사용될 수 있다. 유사하게, 특정 형태 또는 입체형태를 갖는 링커는 항체가 그의 표적에 도달하기 전에 또는 후에 항체 또는 연결된 엔티티에 특정 형태 또는 입체형태를 부여하기 위해 사용될 수 있다. 링커의 각각의 말단에 존재하는 기능성 기는 목적하는 조건 하에서 항체 또는 페이로드의 방출을 조절하기 위해 선택될 수 있다. 항체와 연결된 엔티티 사이의 공간적 관계의 상기 최적화는 상기 분자에 새로운, 조절된 또는 목적하는 특성을 제공할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 다음을 포함하는 아령 구조를 갖는 수용성 이기능성 링커를 제공한다: a) 중합체 골격의 적어도 제1 말단 상의 아지드, 알킨, 히드라진, 히드라지드, 히드록실아민 또는 카르보닐 함유 모이어티; 및 b) 중합체 골격의 제2 말단 상의 적어도 제2 기능성 기. 제2 기능성 기는 제1 기능성 기와 동일하거나 상이할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제2 기능성 기는 제1 기능성 기와 반응하지 않는다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 분지형 분자 구조의 하나 이상의 아암을 포함하는 수용성 화합물을 제공한다. 예를 들어, 분지형 분자 구조는 수지상일 수 있다.
모 항체
모 항체는 비제한적으로, 당업자에게 알려져 있거나, 또는 후에 발견되는 임의의 항체일 수 있다. 모 항체는 인간, 마우스, 래트, 토끼, 낙타, 라마, 단봉낙타, 원숭이, 특히 포유동물, 및 특히 인간 및 특히 마우스 및 래트를 포함하고 이로 제한되지 않는 임의의 유기체로부터의 항체 유전자 또는 항체 유전자들에 의해 실질적으로 코딩될 수 있다. 한 실시양태에서, 모 항체는 선택 방법 (Griffiths & Duncan, 1998, Curr. Opin. Biotechnol. 9:102-108)과 함께, 예를 들어 트랜스제닉 (transgenic) 마우스 또는 다른 동물 (Bruggemann & Taussig, 1997, Curr. Opin. Biotechnol. 8:455-458) 또는 인간 항체 라이브러리를 사용하여 환자 또는 대상체로부터 얻은 완전 인간 항체일 수 있다. 모 항체는 인공 또는 천연 생성을 포함하는 임의의 공급원으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 모 항체는 키메릭 항체 및 인간화 항체 (Clark, 2000, Immunol. Today 21:397-402)를 포함하고 이로 제한되지 않는 조작된 항체이거나 또는 조합 라이브러리로부터 유래될 수 있다. 또한, 모 항체는 하나 이상의 천연 항체 유전자에 의해 실질적으로 코딩되는 항체의 조작된 변이체일 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서 모 항체는 친화도 성숙에 의해 확인된 항체이다.
모 항체는 당업자에게 알려져 있거나 후에 발견되는 임의의 항원에 대한 친화도를 가질 수 있다. 실질적으로 임의의 물질이 본원 명세서의 모 항체, 또는 항체에 대한 항원일 수 있다. 유용한 항원의 예는 알파-1 항트립신, 안지오스타틴, 항용혈 인자, 항체, 아포지단백질, 아포단백질, 심방 나트륨이뇨 인자, 심방 나트륨이뇨 폴리펩티드, 심방 펩티드, C-X-C 케모카인 (예를 들어, T39765, NAP-2, ENA-78, Gro-a, Gro-b, Gro-c, IP-10, GCP-2, NAP-4, SDF-1, PF4, MIG), 칼시토닌, CC 케모카인 (예를 들어, 단핵구 화학주성 단백질-1, 단핵구 화학주성 단백질-2, 단핵구 화학주성 단백질-3, 단핵구 염증성 단백질-1 알파, 단핵구 염증성 단백질-1 베타, RANTES, I309, R83915, R91733, HCC1, T58847, D31065, T64262), CD40 리간드, C-키트 리간드, 콜라겐, 콜로니 자극 인자 (CSF), 보체 인자 5a, 보체 억제제, 보체 수용체 1, 시토카인, (예를 들어, 상피 호중구 활성화 펩티드-78, GRO/MGSA, GRO, GRO, MIP-1, MIP-1, MCP-1), 표피 성장 인자 (EGF), 에리쓰로포이에틴 ("EPO"), 박리 (exfoliating) 독소 A 및 B, 인자 IX, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 X, 섬유모세포 성장 인자 (FGF), 피브리노겐, 피브로넥틴, G-CSF, GM-CSF, 글루코세레브로시다제, 고나도트로핀, 성장 인자, 헤지호그 (hedgehog) 단백질 (예를 들어, Sonic, Indian, Desert), 헤모글로빈, 간세포 성장 인자 (HGF), 히루딘, 인간 혈청 알부민, 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자 (IGF), 인터페론 (예를 들어, IFN-α, IFN-, IFN-γ), 인터류킨 (예를 들어, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12 등), 각질세포 성장 인자 (KGF), 락토페린, 백혈병 억제 인자, 루시페라제, 뉴투린, 호중구 억제 인자 (NIF), 온코스타틴 M, 골원성 단백질, 부갑상선 호르몬, PD-ECSF, PDGF, 펩티드 호르몬 (예를 들어, 인간 성장 호르몬), 플레이오트로핀, 단백질 A, 단백질 G, 발열성 외독소 A, B, 및 C, 릴랙신, 레닌, SCF, 가용성 보체 수용체 I, 가용성 I-CAM 1, 가용성 인터류킨 수용체 (IL-1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15), 가용성 TNF 수용체, 소마토메딘, 소마토스타틴, 소마토트로핀, 스트렙토키나제, 초항원, 즉, 스타필로코커스 (staphylococcal) 장독소 (SEA, SEB, SEC1, SEC2, SEC3, SED, SEE), 슈퍼옥시드 디스뮤타제, 독성 쇼크 증후군 독소 (TSST-1), 타이모신 알파 1, 조직 플라스미노겐 활성제, 종양 괴사 인자 (TNF 베타), 종양 괴사 인자 수용체 (TNFR), 종양 괴사 인자-알파 (TNF 알파), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 유로키나제 등을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 이들 항원은 예를 들어 상업적인 공급원 또는 공개된 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열 (예를 들어 젠뱅크 (Genbank))로부터 당업자에게 알려진 방법에 의해 얻을 수 있다.
추가의 항원은 전사 및 발현 활성제를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 예시적인 전사 및 발현 활성제는 세포 성장, 분화, 조절 등을 조정하는 유전자 및 단백질을 포함한다. 발현 및 전사 활성제는 원핵세포, 바이러스, 및 진균, 식물, 및 포유동물을 포함하는 동물을 포함하는 진핵세포에서 발견되고, 매우 광범한 치료 표적을 제공한다. 발현 및 전사 활성제가 많은 메카니즘에 의해, 예를 들어 수용체에 결합하고, 신호 전달 캐스케이드를 자극하고, 전사 인자의 발현을 조절하고, 프로모터 및 인핸서에 결합하고, 프로모터 및 인핸서에 결합하는 단백질에 결합하고, DNA를 풀고, 프리-mRNA를 스플라이싱하고, RNA를 폴리아데닐화하고, RNA를 분해함으로써 전사를 조절함이 이해될 것이다. 항원은 발현 활성제, 예컨대 시토카인, 염증성 분자, 성장 인자, 그의 수용체, 및 종양유전자 산물, 예를 들어, 인터류킨 (예를 들어, IL-1, IL-2, IL-8 등), 인터페론, FGF, IGF-I, IGF-II, FGF, PDGF, TNF, TGF-α, TGF-β, EGF, KGF, SCF/c-Kit, CD40L/CD40, VLA-4VCAM-1, ICAM-1/LFA-1, 및 히알루닌/CD44; 신호 전달 분자 및 상응하는 종양유전자 산물, 예를 들어, Mos, Ras, Raf, 및 Met; 및 전사 활성제 및 억제제, 예를 들어, p53, Tat, Fos, Myc, Jun, Myb, Rel, 및 스테로이드 호르몬 수용체, 예컨대 에스트로겐, 프로게스테론, 테스토스테론, 알도스테론, LDL 수용체 리간드 및 코티코스테론에 대한 수용체를 포함하고 이로 제한되지 않는다.
백신 단백질은 감염성 진균, 예를 들어, 아스페르길루스 (Aspergillus), 칸디다 (Candida) 종; 병원성 박테리아에 대한 모델로서 기능하는 박테리아, 특히 이. 콜라이 (E. coli), 및 의학적으로 중요한 박테리아, 예컨대 스타필로코커스 (Staphylococcus) (예를 들어, 아우레우스 (aureus)), 또는 스트렙토코커스 (Streptococcus) (예를 들어, 뉴모니애 (pneumoniae)); 원생동물, 예컨대 포자충 (예를 들어, 플라스모디아 (Plasmodia)), 근족충 (예를 들어, 엔타모에바 (Entamoeba)) 및 편모충 (트리파노소마 (Trypanosoma), 레슈마니아 (Leishmania), 트리코모나스 (Trichomonas), 기아르디아 (Giardia) 등); 바이러스, 예컨대 (+) RNA 바이러스 (그 예는 폭스바이러스 예를 들어, 우두; 피코르나바이러스, 예를 들어 소아마비; 토가바이러스, 예를 들어, 풍진; 플라비바이러스, 예를 들어, HCV; 및 코로나바이러스를 포함함), (-) RNA 바이러스 (예를 들어, 랍도바이러스, 예를 들어, VSV; 파라믹소바이러스, 예를 들어, RSV; 오르토믹소바이러스, 예를 들어, 인플루엔자; 분야바이러스; 및 아레나바이러스), dsDNA 바이러스 (예를 들어 레오바이러스), RNA에서 DNA로의 바이러스, 즉, 레트로바이러스, 예를 들어, HIV 및 HTLV, 및 특정 DNA로부터 RNA로의 바이러스, 예컨대 B형 간염 바이러스로부터의 단백질을 포함하고 이로 제한되지 않는 항원일 수 있다.
항원은 아미다제, 아미노산 라세마제, 아실라제, 데할로게나제, 디옥시게나제, 디아릴프로판 퍼옥시다제, 에피머라제, 에폭시드 히드롤라제, 에스테라제, 이소머라제, 키나제, 글루코스 이소머라제, 글리코시다제, 글리코실 트랜스퍼라제, 할로퍼옥시다제, 모노옥시게나제 (예를 들어, p450), 리파제, 리그닌 퍼옥시다제, 니트릴 히드라타제, 니트릴라제, 프로테아제, 포스파타제, 섭틸리신, 트랜스아미나제, 및 뉴클레아제를 포함하고 이로 제한되지 않는 효소일 수 있다.
농업상 관련 단백질, 예컨대 곤충 저항성 단백질 (예를 들어, Cry 단백질), 전분 및 지질 생산 효소, 식물 및 곤충 독소, 독소-저항성 단백질, 진균독 해독 단백질, 식물 성장 효소 (예를 들어, 리불로스 1,5-비스포스페이트 카르복실라제/옥시게나제, "RUBISCO"), 리폭시게나제 (LOX), 및 포스포에놀피루베이트 (PEP) 카르복실라제도 항원일 수 있다.
예를 들어, 항원은 질환-연관 분자, 예컨대 종양 표면 항원, 예컨대 B-세포 개별특이형 (idiotype), 악성 B 세포 상의 CD20, 백혈병 모세포 상의 CD33, 및 유방암의 HER2/neu일 수 있다. 별법으로, 항원은 성장 인자 수용체일 수 있다. 성장 인자의 예는 표피 성장 인자 (EGF), 트랜스페린, 인슐린-유사 성장 인자, 전환 성장 인자 (TGF), 인터류킨-1, 및 인터류킨-2를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 예를 들어, EGF 수용체의 높은 발현이 매우 다양한 인간 상피 1차 종양에서 발견되었다. TGF-α는 암 세포에서 내분비 자극 경로를 매개하는 것으로 밝혀졌다. 몇 개의 뮤린 모노클로날 항체는 EGF 수용체에 결합하고, 리간드의 EGF 수용체에 대한 결합을 차단하고, 배양액 및 이종이식 모델에서 다양한 인간 암 세포주의 증식을 억제할 수 있는 것으로 입증되었다 (Mendelsohn and Baselga (1995) Antibodies to growth factors and receptors, in Biologic Therapy of Cancer, 2nd Ed., J B Lippincott, Philadelphia, pp 607-623). 따라서, 본 발명의 항체는 다양한 암의 치료를 위해 사용될 수 있다.
항원은 또한 관상 동맥 질환과 연관된 세포 표면 단백질 또는 수용체, 예컨대 혈소판 당단백질 IIb/IIIa 수용체, 자가면역 질환과 연관된 세포 표면 단백질 또는 수용체, 예컨대 CD4, CAMPATH-1 및 그람-음성 박테리아 지질다당류의 지질 A 영역일 수 있다. CD4에 대한 인간화 항체를 균상 식육종, 전신성 농포 건선, 중증 건선, 및 류마티스성 관절염 환자의 치료를 위한 임상 시험에서 시험하였다. 그람-음성 박테리아 지질다당류의 지질 A 영역에 대한 항체를 패혈성 쇼크의 치료시에 임상적으로 시험하였다. CAMPATH-1에 대한 항체도 불응성 류마티스성 관절염의 치료시에 임상적으로 시험하였다. 따라서, 본원에서 제공되는 항체는 다양한 자가면역 질환의 치료를 위해 사용될 수 있다.
유용한 항원은 또한 인간 알레르기성 질환과 연관된 단백질 또는 펩티드, 예컨대 염증 매개체 단백질, 예를 들어 인터류킨-1 (IL-1), 종양 괴사 인자 (TNF), 류코트리엔 수용체 및 5-리폭시게나제, 및 부착 분자, 예컨대 V-CAM/VLA-4를 포함한다. 또한, IgE는 또한 IgE가 유형 I 즉시 과민성 알레르기 반응, 예컨대 천식에서 중추적인 역할을 수행하기 때문에 항원으로서 기능할 수 있다. 연구는 총 혈청 IgE의 수준이 특히 천식에서 질환의 중증도와 상관성이 있는 경향이 있음을 보여주었다 (Burrows et al. (1989) "Association of asthma with serum IgE levels and skin-test reactivity to allergens" New Engl. L. Med. 320:271-277). 따라서, IgE에 대해 선택된 항체는 정상 면역 기능에 대한 실질적인 영향을 갖지 않으면서 알레르기성 질환의 치료에서 비만 세포 및 호염기구에 대한 IgE의 결합을 차단하거나 IgE의 수준을 감소시키기 위해 사용될 수 있다.
항원은 또한 숙주의 면역 반응을 촉발하는 항원으로서 기능할 수 있는 바이러스 표면 또는 코어 단백질일 수 있다. 이들 바이러스 단백질의 예는 당단백질 (또는 표면 항원, 예를 들어, GP120 및 GP41) 및 캡시드 단백질 (또는 구조 단백질, 예를 들어, P24 단백질); A, B, C, D 또는 E형 간염 바이러스의 표면 항원 또는 코어 단백질 (예를 들어 B형 간염 바이러스의 작은 B형 간염 표면 항원 (SHBsAg) 및 C형 간염 바이러스의 코어 단백질, NS3, NS4 및 NS5 항원); 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV)의 당단백질 (G-단백질) 또는 융합 단백질 (F-단백질); 단순 포진 바이러스 HSV-1 및 HSV-2의 표면 및 코어 단백질 (예를 들어, HSV-2로부터의 당단백질 D)을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
항원은 또한 그의 종양-억제 기능을 상실하고 세포를 암에 보다 취약하게 만들 수 있는 돌연변이된 종양 억제제 유전자 산물일 수 있다. 종양 억제제 유전자는 세포 성장 및 분열 사이클을 억제하여 신생물 발생을 억제하는 기능을 하는 유전자이다. 종양 억제제 유전자 내의 돌연변이는 세포가 억제 신호 네트워크의 하나 이상의 성분을 무시하고 세포 주기 체크 지점을 극복하여 보다 높은 비율의 제어된 세포 성장-암을 생성하도록 유발한다. 종양 억제제 유전자의 예는 DPC-4, NF-1, NF-2, RB, p53, WT1, BRCA1 및 BRCA2를 포함하고 이로 제한되지 않는다. DPC-4는 췌장암에 관련되고, 세포 분열을 억제하는 세포질 경로에 참여한다. NF-1은 세포질 억제 단백질인 Ras를 코딩한다. NF-1은 신경계의 신경섬유종 및 크롬 친화성 세포종 및 골수양 백혈병에 관련된다. NF-2는 신경계의 수막종, 신경초종, 및 뇌실막세포종에 관련되는 핵 단백질을 코딩한다. RB는 세포 주기의 주요 억제제인 핵 단백질 pRB 단백질을 코딩한다. RB는 망막모세포종 및 뼈, 방광, 소세포 폐 및 유방의 암에 관련된다. p53은 세포 분열을 조절하고 아폽토시스를 유도할 수 있는 p53 단백질을 코딩한다. p53의 돌연변이 및/또는 활동저하는 매우 광범한 암에서 발견된다. WT1은 신장의 윌름즈 (Wilms) 종양에 관련된다. BRCA1은 유방암 및 난소암에 관련되고, BRCA2는 유방암에 관련된다. 따라서, 항체는 유전자 산물과 종양 개시 및 발달 경로 내의 다른 단백질 또는 생화학적 물질의 상호작용을 차단하기 위해 사용될 수 있다.
항원은 CD1a, CD1b, CD1c, CD1d, CD2, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8α, CD8β, CD9, CD10, CD11a, CD11b, CD11c, CDw12, CD13, CD14, CD15, CD15s, CD16a, CD16b, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, CD26, CD27, CD28, CD29, CD30, CD31, CD32, CD33, CD34, CD35, CD36, CD37, CD38, CD39, CD40, CD41, CD42a, CD42b, CD42c, CD42d, CD43, CD44, CD45, CD45R, CD46, CD47, CD48, CD49a, CD49b, CD49c, CD49d, CD49e, CD49f, CD50, CD51, CD52, CD53, CD54, CD55, CD56, CD57, CD58, CD59, CDw60, CD61, CD62E, CD62L, CD62P, CD63, CD64, CD65, CD66a, CD66b, CD66c, CD66d, CD66e, CD66f, CD67, CD68, CD69, CDw70, CD71, CD72, CD73, CD74, CDw75, CDw76, CD77, CD79α, CD79β, CD80, CD81, CD82, CD83, CD84, CD85, CD86, CD87, CD88, CD89, CD90, CD91, CDw92, CD93, CD94, CD95, CD96, CD97, CD98, CD99, CD100, CD101, CD102, CD103, CD104, CD105, CD106, CD107a, CD107b, CDw108, CDw109, CD110-113, CD114, CD115, CD116, CD117, CD118, CD119, CD120a, CD120b, CD121a, CD121b, CD122, CD123, CDw124, CD125, CD126, CDw127, CDw128a, CDw128b, CD129, CDw130, CD131, CD132, CD133, CD134, CD135, CD136, CDw137, CD138, CD139, CD140a, CD140b, CD141, CD142, CD143, CD144, CDw145, CD146, CD147, CD148, CDw149, CD150, CD151, CD152, CD153, CD154, CD155, CD156, CD157, CD158a, CD158b, CD161, CD162, CD163, CD164, CD165, CD166, 및 TCRζ을 포함하고 이로 제한되지 않는 CD 분자일 수 있다. 항원은 VEGF, VEGF 수용체, EGFR, Her2, TNFa, TNFRI 수용체, GPIIb/IIIa, IL-2R 알파 쇄, IL-2R 베타 쇄, RSV F 단백질, 알파4 인테그린, IgE, IgE 수용체, 디곡신, 카펫 독사 (carpet viper) 독액, 보체 C5, OPGL, CA-125 종양 항원, 스타필로코커스 단백질, 스타필로코커스 에피데르미디스 (S. epidermidis) 단백질, 스타필로코커스 아우레우스 단백질, 스타필로코커스 감염 (스타필로코커스 아우레우스 및 스타필로코커스 에피데르미디스를 포함하고 이로 제한되지 않음)에 관련되는 단백질, IL-6 수용체, CTLA-4, RSV, IL-2 수용체의 Tac 서브유닛, IL-5, 및 EpCam일 수 있다. 특정 실시양태에서, 항원은 CD74이다. 항원은 분자의 단편일 수 있다.
모 항체는 비제한적으로, 당업계에 알려진 임의의 항체 또는 당업자에 의해 개발된 임의의 항체일 수 있다. 그 예는 항-TNF 항체 (미국 특허 6,258,562), 항-IL-12 및/또는 항-IL-12p40 항체 (미국 특허 6,914,128); 항-IL-18 항체 (미국 특허 출원 공개 2005/0147610), 항-O5, 항-CBL, 항-CD147, 항-gp120, 항-VLA-4, 항-CD11a, 항-CD18, 항-VEGF, 항-CD40L, 항 CD-40 (예를 들어, PCT 공개 WO 2007/124299 참조), 항-Id, 항-ICAM-1, 항-CXCL13, 항-CD2, 항-EGFR, 항-TGF-베타2, 항-HGF, 항-cMet, 항 DLL-4, 항-NPR1, 항-PLGF, 항-ErbB3, 항-E-셀렉틴, 항-Fact VII, 항-Her2/neu, 항-F gp, 항-CD11/18, 항-CD14, 항-ICAM-3, 항-RON, 항-SOST, 항 CD-19, 항-CD80 (예를 들어, PCT 공개 WO 2003/039486 참조), 항-CD4, 항-CD3, 항-CD23, 항-베타2-인테그린, 항-알파4베타7, 항-CD52, 항-HLA DR, 항-CD22 (예를 들어, 미국 특허 5,789,554 참조), 항-CD20, 항-MIF, 항-CD64 (FcR), 항-TCR 알파 베타, 항-CD2, 항-Hep B, 항-CA 125, 항-EpCAM, 항-gp120, 항-CMV, 항-gpIIbIIIa, 항-IgE, 항-CD25, 항-CD33, 항-HLA, 항-IGF1,2, 항 IGFR, 항-VNR인테그린, 항-IL-1 알파, 항-IL-1베타, 항-IL-1 수용체, 항-IL-2 수용체, 항-IL-4, 항-IL-4 수용체, 항-IL5, 항-IL-5 수용체, 항-IL-6, 항-IL-8, 항-IL-9, 항-IL-13, 항-IL-13 수용체, 항-IL-17, 항-IL-6R, 항-RANKL, 항-NGF, 항-DK, 항-알파V베타3, 항-IL-17A, 항-IL23p19 및 항-IL-23을 포함하고 이로 제한되지 않는다 ([Presta, L. G. (2005) J. Allergy Clin. Immunol. 116: 731-6] 및 www.path.cam.ac.uk/~mrc7/humanisation/antibodies.html 참조).
모 항체는 또한 임상 시험에 또는 임상 용도를 위한 개발시에 사용을 위해 승인된 다양한 치료 항체로부터 선택될 수 있다. 상기 치료 항체는 리툭시맙 (리툭산(Rituxan)®, IDEC/제넨테크/로슈 (Roche)) (예를 들어, 미국 특허 5,736,137 참조), 비-호지킨 (Hodgkin) 림프종 치료를 위해 승인된 키메릭 항-CD20 항체; HuMax-CD20, 젠맵 (Genmab)에 의해 현재 개발되고 있는 항-CD20, 미국 특허 5,500,362에 기재된 항-CD20 항체, AME-133 (어플라이드 몰레큘라 에볼루션 (Applied Molecular Evolution)), hA20 (이뮤노메딕스, 인크. (Immunomedics, Inc.)), HumaLYM (인트라셀 (Intracel)), 및 PRO70769 (PCT 출원 PCT/US2003/040426), 트라스투주맙 (헤르셉틴®, 제넨테크) (예를 들어, 미국 특허 5,677,171 참조), 유방암 치료를 위해 승인된 인간화 항-Her2/neu 항체; 제넨테크에 의해 현재 개발되고 있는 퍼투주맙 (rhuMab-2C4, 옴니타르그(Omnitarg)®); 항-Her2 항체 (미국 특허 4,753,894; 세툭시맙 (에르비툭스(Erbitux)®, 임클론 (Imclone)) (미국 특허 4,943,533; PCT 공개 WO 96/40210), 다양한 암에 대한 임상 시험에서의 키메릭 항-EGFR 항체; 아브게닉스 (Abgenix)-이뮤넥스 (Immunex)-암젠 (Amgen)에 의해 현재 개발되고 있는 ABX-EGF (미국 특허 6,235,883); 젠맵에 의해 현재 개발되고 있는 HuMax-EGFr (미국 특허 7,247,301); 425, EMD55900, EMD62000, 및 EMD72000 (머크 KGaA) (미국 특허 5,558,864; [Murthy, et al. (1987) Arch. Biochem. Biophys. 252(2): 549-60]; [Rodeck, et al. (1987) J. Cell. Biochem. 35(4): 315-20]; [Kettleborough, et al. (1991) Protein Eng. 4(7): 773-83]); ICR62 (인스티튜트 오브 캔서 리써치 (Institute of Cancer Research)) (PCT 공개 WO 95/20045; [Modjtahedi, et al. (1993) J. Cell. Biophys. 22(1-3): 129-46]; [Modjtahedi, et al. (1993) Br. J. Cancer 67(2): 247-53]; [Modjtahedi, et al. (1996) Br. J. Cancer 73(2): 228-35]; [Modjtahedi, et al. (2003) Int. J. Cancer 105(2): 273-80]); TheraCIM hR3 (와이엠 바이오사이언시스 (YM Biosciences, 캐나다) 및 센트로 데 이뮤놀로지아 몰레큘라 (Centro de Immunologia Molecular, 쿠바) (미국 특허 5,891,996; 미국 특허 6,506,883; [Mateo, et al. (1997) Immunotechnol. 3(1): 71-81]); mAb-806 (루드빅 인스티튜트 포 캔서 리서치 (Ludwig Institue for Cancer Research), 메모리알 슬로안-케터링 (Memorial Sloan-Kettering)) (Jungbluth, et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100(2): 639-44); KSB-102 (케이에스 바이오메딕스 (KS Biomedix)); MR1-1 [이박스 (IVAX), 내셔날 캔서 인스티튜트 (National Cancer Institute)) (PCT 공개 WO 01/62931A2); 및 SC100 (스캔셀 (Scancell)) (PCT 공개 WO 01/88138); 알렘투주맙 (캄파쓰(Campath)®, 밀레니엄 (Millenium)), 현재 B-세포 만성 림프구성 백혈병 치료용으로 승인된 인간화 mAb; 무로모납-CD3 (오르토클론 (Orthoclone) OKT3®), 오르토 바이오테크 (Ortho Biotech)/존슨 앤드 존슨 (Johnson & Johnson)에 의해 개발 중인 항-CD3 항체, 이브리투모맙 티욱세탄 (제발린(Zevalin)®), 아이디이씨 (IDEC)/쉐링 아게 (Schering AG)에 의해 개발된 항-CD20 항체, 겜투주맙 오조가미신 (밀로타르그(Mylotarg)®), 셀테크 (Celltech)/와이어쓰에 의해 개발된 항-CD33 (p67 단백질) 항체, 알레파셉트 (아메비브(Amevive)®), 바이오겐 (Biogen)에 의해 개발된 항-LFA-3 Fc 융합체, 센토코르 (Centocor)/릴리 (Lilly)에 의해 개발된 아브킥시맙 (레오프로(ReoPro)®), 노바티스 (Novartis)에 의해 개발된 바실릭시맙 (시물렉트(Simulect)®), 메디뮨 (Medimmune)에 의해 개발된 팔리비주맙 (시나기스(Synagis)®), 인플릭시맙 (레미케이드(Remicade)®), 센토코르에 의해 개발된 항-TNF알파 항체, 아달리무맙 (휴미라(Humira)®), 애보트 (Abbott)에 의해 개발된 항-TNF알파 항체, 휴미케이드(Humicade)®, 셀테크 (Celltech)에 의해 개발된 항-TNF알파 항체, 골리무맙 (CNTO-148), 센토코르에 의해 개발된 완전 인간 TNF 항체, 에타네르셉트 (엔브렐(Enbrel)®), 이뮤넥스/암젠에 의해 개발된 p75 TNF 수용체 Fc 융합체, 이에네르셉트, 로슈에 의해 앞서 개발된 p55TNF 수용체 Fc 융합체, ABX-CBL, 아브게닉스에 의해 개발 중인 항-CD147 항체, ABX-IL8, 아브게닉스에 의해 개발 중인 항-IL8 항체, ABX-MA1, 아브게닉스에 의해 개발중인 항-MUC18 항체, 펨투모맙 (R1549, 90Y-muHMFG1), 안티소마 (Antisoma)에 의해 개발 중인 항-MUC1, 테렉스 (R1550), 안티소마에 의해 개발 중인 항-MUC1 항체, 안티소마에 의해 개발 중인 AngioMab (AS1405), 안티소마에 의해 개발중인 HuBC-1, 안티소마에 의해 개발 중인 티오플라틴 (AS1407), 안테그렌(Antegren)®) (나탈리주맙), 바이오겐에 의해 개발 중인 항-알파-4-베타-1 (VLA-4) 및 알파-4-베타-7 항체, VLA-1 mAb, 바이오겐에 의해 개발 중인 항-VLA-1 인테그린 항체, LTBR mAb, 바이오겐에 의해 개발 중인 항-림프독소 베타 수용체 (LTBR) 항체, CAT-152, 캠브리지 안티바디 테크놀로지 (Cambridge Antibody Technology)에 의해 개발 중인 항-TGF-β 항체, ABT 874(J695), 애보트 (Abbott)에 의해 개발중인 항-IL-12 p40 항체, CAT-192, 캠브리지 안티바디 테크놀로지 및 젠자임 (Genzyme)에 의해 개발 중인 항-TGFβ1 항체, CAT-213, 캠브리지 안티바디 테크놀로지에 의해 개발 중인 항-에오탁신1 항체, 캠브리지 안티바디 테크놀로지 및 휴먼 게놈 사이언시즈 인코포레이티드 (Human Genome Sciences Inc.)에 의해 개발 중인 LymphoStat-B® 항-Blys 항체, TRAIL-R1 mAb, 캠브리지 안티바디 테크놀로지 및 휴먼 게놈 사이언시즈 인코포레이티드에 의해 개발 중인 항-TRAIL-R1 항체, 아바스틴(Avastin)®) 베바치주맙, rhuMAb-VEGF), 제넨테크에 의해 개발된 항-VEGF 항체, 제넨테크에 의해 개발 중인 항-HER 수용체 패밀리 항체, 항-조직 인자 (ATF), 제넨테크에 의해 개발 중인 항-조직 인자 항체, 졸레어 (Xolair)®) (오말리주맙), 제넨테크에 의해 개발 중인 항-IgE 항체, 랍티바(Raptiva)®) (에팔리주맙), 제넨테크 및 조마 (Xoma)에 의해 개발 중인 항-CD11a 항체, 제넨테크 및 밀레니엄 파마슈티칼즈 (Millenium Pharmaceuticals)에 의해 개발 중인 MLN-O2 항체 (이전의 LDP-O2), HuMax CD4, 젠맵에 의해 개발 중인 항-CD4 항체, HuMax-IL15, 젠맵 및 암젠에 의해 개발중인 항-IL15 항체, 젠맵 및 메다렉스 (Medarex)에 의해 개발 중인 HuMax-Inflam, HuMax-캔서, 젠맵 및 메다렉스 및 옥스포드 지코사이언시스 (Oxford GcoSciences)에 의해 개발 중인 항-헤파라나제 I 항체, 젠맵 및 암젠에 의해 개발 중인 HuMax-Lymphoma, 젠맵에 의해 개발 중인 HuMax-TAC, IDEC-131, 및 아이디이씨 파마슈티칼스(IDEC Pharmaceuticals)에 의해 개발 중인 항-CD40L 항체, IDEC-151 (클레놀릭시맙), 아이디이씨 파마슈티칼스에 의해 개발 중인 항-CD4 항체, IDEC-114, 아이디이씨 파마슈티칼스에 의해 개발 중인 항-CD80 항체, IDEC-152, 아이디이씨 파마슈티칼스에 의해 개발 중인 항-CD23, 아이디이씨 파마슈티칼스에 의해 개발 중인 항-대식세포 이동 인자 (MIF) 항체, BEC2, 임클론에 의해 개발 중인 항-개별특이형 항체, IMC-1C11, 임클론에 의해 개발 중인 항-KDR 항체, DC101, 임클론에 의해 개발 중인 항-flk-1 항체, 임클론에 의해 개발 중인 항-VE 카드헤린 항체, CEA-Cide® (라베투주마브), 이뮤노메딕스에 의해 개발 중인 항-암배아 항원 (CEA) 항체, 림포시드(LymphoCide)® (에프라투주맙), 이뮤노메딕스에 의해 개발 중인 항-CD22 항체, 이뮤노메딕스에 의해 개발 중인 AFP-Cide, 이뮤노메딕스에 의해 개발 중인 미엘로마시드 (MyelomaCide), 이뮤노메딕스에 의해 개발 중인 LkoCide, 이뮤노메딕스에 의해 개발 중인 프로스타시드 (ProstaCide), MDX-O10, 메다렉스에 의해 개발 중인 항-CTLA4 항체, MDX-O60, 메다렉스에 의해 개발 중인 항-CD30 항체, 메다렉스에 의해 개발 중인 MDX-O70, 메다렉스에 의해 개발 중인 MDX-O18, 오시뎀 (Osidem)® (IDM-1), 및 메다렉스 및 이뮤노-디자인드 몰레큘스 (Immuno-Designed Molecules)에 의해 개발 중인 항-Her2 항체, HuMax®-CD4, 메다렉스 및 젠맵에 의해 개발 중인 항-CD4 항체, HuMax-IL15, 메다렉스 및 젠맵에 의해 개발 중인 항-IL15 항체, CNTO 148, 메다렉스 및 센토코르/제이앤드제이 (J&J)에 의해 개발 중인 항-TNFα 항체, CNTO 1275, 센토코르/제이앤드제이에 의해 개발 중인 항-시토카인 항체, MOR101 및 MOR102, 모포시스 (MorphoSys)에 의해 개발 중인 항-세포간 부착 분자-1 (ICAM-1) (CD54) 항체, MOR201, 모포시스에 의해 개발 중인 항-섬유모세포 성장 인자 수용체 3 (FGFR-3) 항체, 누비온(Nuvion)® (비실리주맙), 프로테인 디자인 랩스 (Protein Design Labs)에 의해 개발된 항-CD3 항체, HuZAF®, 프로테인 디자인 랩스에 의해 개발된 항-감마 인터페론 항체, 프로테인 디자인 랩스에 의해 개발된 항-α5β1 인테그린, 프로테인 디자인 랩스에 의해 개발된 항-IL-12, ING-1, 조마에 의해 개발 중인 항-Ep-CAM 항체, 졸레어® (오말리주마브), 제넨테크 및 노바티스에 의해 개발된 인간화된 항-IgE 항체, 및 MLNO1, 조마에 의해 개발 중인 항-베타2 인테그린 항체을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 또 다른 실시양태에서, 치료제는 KRN330 (기린 (Kirin)); huA33 항체 (A33, 루드빅 인스티튜트 포 캔서 리서치); CNTO 95 (알파 V 인테그린, 센토코어); MEDI-522 (알파 Vβ3 인테그린, 메디뮨); 볼로칙시맙 (알파 Vβ1 인테그린, 바이오겐/피디엘 (PDL)); 인간 mAb 216 (B 세포 글리코실화된 에피토프, 엔씨엘 (NCl)); BiTE MT103 (이중특이적 CD19xCD3, 메디뮨); 4G7xH22 (이중특이적 B 세포xFc감마R1, 메다렉스/머크 케이지에이 (Merck KGa)); rM28 (이중특이적 CD28xMAPG, 유럽 특허 EP1444268); MDX447(EMD 82633) (이중특이적 CD64xEGFR, 메데렉스); 카투막소맙 (레모밥) (이중특이적 EpCAMx항-CD3, 트리온 (Trion)/프레스 (Fres)]; 에르투막소맙 (이중특이적 HER2/CD3, 프레세니우스 바이오테크 (Fresenius Biotech)]; 오레고보맙 (오바렉스 (OvaRex)) (CA-125, 비렉스 (ViRexx)); 렌카렉스 (Rencarex)® (WX G250) (카르보닉 안히드라제 IX, 윌렉스 (Wilex)); CNTO 888 (CCL2, 센토코어); TRC105 (CD105 (엔도글린), 트라콘 (Tracon)); BMS-663513 (CD137 효능제, 브리스톨 마이어스 스퀴브 (Brystol Myers Squibb)); MDX-1342 (CD19, 메다렉스); 시플리주맙 (MEDI-507) (CD2, 메디뮨); 오파투무맙 (Humax-CD20) (CD20, 젠맵); 리툭시맙 (리툭산) (CD20, 제넨테크); 벨투주맙 (hA20) (CD20, 이뮤노메딕스); 에프라투주마브 (CD22, 암젠); 루밀릭시맙 (IDEC 152) (CD23, 바이오겐); 무로모납-CD3 (CD3, 오르토 (Ortho)); HuM291 (CD3 fc 수용체, 피디엘 바이오파마 (PDL Biopharma)); HeFi-1, CD30, NCl); MDX-O60 (CD30, 메다렉스); MDX-1401 (CD30, 메다렉스); SGN-30 (CD30, 시애틀 제넨틱스 (Seattle Genentics)); SGN-33 (린투주맙) (CD33, 시애틀 제넨틱스); 자놀리무맙 (HuMax-CD4) (CD4, 젠맵); HCD122 (CD40, 노바티스); SGN-40 (CD40, 씨애틀 제넨틱스); 캄파쓰1h (알렘투주맙) (CD52, 젠자임); MDX-1411 (CD70, 메다렉스); hLL1 (EPB-1) (CD74.38, 이뮤노메딕스); 갈릭시맙 (IDEC-144) (CD80, 바이오겐); MT293 (TRC093/D93) (절단된 콜라겐, 트라콘); HuLuc63 (CS1, 피디엘 파마); 이필리무맙 (MDX-O10) (CTLA4, 브리스톨 마이어스 스퀴브); 트레멜리무맙 (티실리무맙, CP-675,2) (CTLA4, 화이자); HGS-ETR1 (마파투무맙) (DR4 TRAIL-R1 효능제, 휴먼 게놈 사이언스 (Human Genome Science)/글락소 스미쓰 클라인); AMG-655 (DR5, 암젠); 아포맙 (DR5, 제넨테크); CS-1008 (DR5, 다이이치 산교 (Daiichi Sankyo)); HGS-ETR2 (렉사투무맙) (DR5 TRAIL-R2 효능제, HGS); 세툭시맙 (에르비툭스) (EGFR, 임클론); IMC-11F8 (EGFR, 임클론); 나모투주맙 (EGFR, 와이엠 바이오(YM Bio)); 파니투무맙 (벡타빅스) (EGFR, 암젠); 잘루투무맙 (HuMaxEGFr) (EGFR, 젠맵); CDX-110 (EGFRvIII, 아반트 이뮤노테라퓨틱스 (AVANT Immunotherapeutics)); 아데카투무맙 (MT201) (에프캄, 머크); 에드레콜로맙 (파노렉스, 17-1A) (에프캄, 글락소/센토코어); MORAb-O03 (엽산 수용체 a, 모르포테크 (Morphotech)); KW-2871 (강글리오시드 GD3, 교와 (Kyowa)); MORAb-O09 (GP-9, 모르포테크); CDX-1307 (MDX-1307) (hCGb, 셀덱스 (Celldex)); 트라스투주맙 (헤르셉틴) (HER2, 셀덱스); 퍼투주맙 (rhuMAb 2C4) (HER2 (DI), 제넨테크); 아폴리주맙 (HLA-DR 베타 쇄, 피디엘 파마); AMG-479 (IGF-1R, 암젠); 항-IGF-1R R1507 (IGF1-R, 로슈); CP 751871 (IGF1-R, 화이자); IMC-A12 (IGF1-R, 임클론); BIIB022 (IGF-1R, 바이오겐); Mik-베타-1 (IL-2Rb (CD122), 호프만 라로슈 (Hoffman LaRoche)); CNTO 328 (IL6, 센토코어); 항-KIR (1-7F9) (킬러 세포 Ig-유사 수용체 (KIR), 노보); Hu3S193 (루이스 (y), 와이어쓰, 루드빅 인스티튜트 오브 캔서 리서치); hCBE-11 (LTβR, 바이오겐); HuHMFG1 (MUC1, 안티소마/NCl); RAV12 (N-연결된 탄수화물 에피토프, 레이븐 (Raven)); CAL (부갑상선 호르몬-관련 단백질 (PTHrP), 유니버시티 오르 캘리포니아); CT-O11 [PD1, 큐어테크 (CureTech)]; MDX-1106 (오노-4538) (PD1, 메다렉스/오노(Ono)]; MAb CT-O11 (PD1, 큐어테크); IMC-3G3 (PDGFRa, 임클론); 바비툭시맙 (포스파티딜세린, 페레그린 (Peregrine)); huJ591 (PSMA, 코넬 리서치 파운데이션 (Cornell Research Foundation)); muJ591 (PSMA, 코넬 리서치 파운데이션); GC1008 (TGFb (pan) 억제제 (IgG4), 겐자임); 인플릭시맙 (레미케이드) (TNFα, 센토코어); A27.15 (트랜스페린 수용체, 살크 인스티튜트 (Salk Institute), INSERN WO 2005/111082); E2.3 (트랜스페린 수용체, 살크 인스티튜트); 베바치주맙 (아바스틴)( VEGF, 제넨테크); HuMV833 (VEGF, 츠쿠바 리서치 랩 (Tsukuba Research Lab), PCT 출원 공개 WO/2000/034337, 유니버시티 오브 텍사스 (University of Texas)]; IMC-18F1 (VEGFR1, 임클론); IMC-1121 (VEGFR2, 임클론)을 포함한다.
유용한 이중특이적 모 항체의 예는 종양 세포 항원에 대해 작용하는 하나의 항체 및 세포독성 촉발 분자에 대해 작용하는 다른 항체, 예컨대 항-FcγRI/항-CD15, 항-p185HER2/FcγRIII (CD16), 항-CD3/항-악성 B-세포 (1D10), 항-CD3/항-p185HER2, 항-CD3/항-p97, 항-CD3/항-신 세포 암종, 항-CD3/항-OVCAR-3, 항-CD3/L-D1 (항-결장 암종), 항-CD3/항-멜라닌 세포 자극 호르몬 유사체, 항-EGF 수용체/항-CD3, 항-CD3/항-CAMA1, 항-CD3/항-CD19, 항-CD3/MoV18, 항-신경 세포 부착 분자 (NCAM)/항-CD3, 항-엽산 결합 단백질 (FBP)/항-CD3, 항-pan 암종 관련 항원 (AMOC-31)/항-CD3를 갖는 것; 종양 항원에 특이적으로 결합하는 하나의 항체 및 독소에 결합하는 또 다른 항체, 예컨대 항-사포린/항-Id-1, 항-CD22/항-사포린, 항-CD7/항-사포린, 항-CD38/항-사포린, 항-CEA/항-리신 A 쇄, 항-인터페론-α (IFN-α)/항-하이브리도마 개별특이형, 항-CEA/항-빙카 알칼로이드를 갖는 이중특이적 항체; 효소 활성화된 전구약물을 전환하기 위한 이중특이적 항체, 예컨대 항-CD30/항-알칼리성 포스파타제 (미토마이신 포스페이트 전구약물의 미토마이신 알콜로의 전환을 촉매함); 피브린 용해제로서 사용될 수 있는 이중특이적 항체, 예컨대 항-피브린/항-조직 플라스미노겐 활성제 (tPA), 항-피브린/항-유로키나제-형 플라스미노겐 활성제 (uPA); 면역 복합체를 세포 표면 수용체로 표적화하기 위한 이중특이적 항체, 예컨대 항-저밀도 지단백질 (LDL)/항-Fc 수용체 (예를 들어 FcγRI, FcγRII 또는 FcγRIII); 감염성 질환의 요법에 사용하기 위한 이중특이적 항체, 예컨대 항-CD3/항-단순 포진 바이러스 (HSV), 항-T-세포 수용체:CD3 복합체/항-인플루엔자, 항-FcγR/항-HIV; 시험관내에서 또는 생체내에서 종양 검출을 위한 이중특이적 항체, 예컨대 항-CEA/항-EOTUBE, 항-CEA/항-DPTA, 항-항-p185HER2/항-합텐; 백신 아주반트로서의 이중특이적 항체 (본원에 참조로 포함된 문헌 [Fanger, M W et al., Crit Rev Immunol. 1992; 12(34): 101-24] 참조); 및 진단 도구로서의 이중특이적 항체, 예컨대 항-토끼 IgG/항-페리틴, 항-양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP)/항-호르몬, 항-소마토스타틴/항-물질 P, 항-HRP/항-FITC, 항-CEA/항-β-갈락토시다제 (본원에 참조로 포함된 문헌 [Nolan, O et R. O'Kennedy, Biochim Biophys Acta. 1990 Aug. 1; 1040(1):1-11] 참조)를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 삼중특이적 항체의 예는 항-CD3/항-CD4/항-CD37, 항-CD3/항-CD5/항-CD37 및 항-CD3/항-CD8/항-CD37을 포함한다.
특정 실시양태에서, 부위-특이적 위치에서 하나 이상의 비-천연 아미노산 잔기를 포함하는 항체는 본원에서 설명되는 임의의 모 항체에 대한 높은 서열 동일성을 갖는다. 특정 실시양태에서, 항체는 본원에서 설명되는 모 항체에 실질적으로 동일하다. 특정 실시양태에서, 항체는 본원에서 설명되는 모 항체에 약 60% 동일성, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 또는 약 95% 동일성을 갖는다. 특정 실시양태에서, 항체는 본원에서 설명되는 모 항체에 약 65% 초과, 약 70% 초과, 약 75% 초과, 약 80% 초과, 약 85% 초과, 약 90% 초과, 또는 약 95% 초과의 동일성을 갖는다. 항체는 하나의 항체의 적어도 하나의 폴리펩티드 쇄가 또 다른 항체의 상응하는 폴리펩티드 쇄에 대한 서열 동일성을 가질 경우 실질적으로 동일하다. 특정 실시양태에서, 부위-특이적 위치에 하나 이상의 비-천연 아미노산 잔기를 포함하는 항체는 적어도 하나의 도메인, 적어도 2개의 도메인 또는 적어도 3개의 도메인에 걸쳐 임의의 서열 1-6에 대해 약 65% 초과, 약 70% 초과, 약 75% 초과, 약 80% 초과, 약 85% 초과, 약 90% 초과, 또는 약 95% 초과의 동일성을 갖는 적어도 하나의 폴리펩티드 쇄를 갖는다.
항체 조성물
본원에서 설명되는 항체는 당업계에서 이용가능한 방법 및 본원에 개시된 방법을 사용하여 조성물로 제제화될 수 있다. 본원에 개시된 임의의 화합물은 적절한 제약 조성물 내에 제공되고, 적합한 투여 경로에 의해 투여될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 항체 조성물은 제약상 허용되는 담체를 추가로 포함한다. 담체는 그와 함께 제약 조성물이 투여되는 희석제, 부형제, 또는 비히클일 수 있다. 상기 제약 담체는 멸균 액체, 예컨대 물, 및 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의 것, 예컨대 땅콩 기름, 대두유, 광유, 참기름 등을 포함하는 오일일 수 있다. 염수 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액이 또한 특히 주사가능한 용액을 위한 액체 담체로서 사용될 수 있다. 적합한 제약 부형제는 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 백악, 실리카 겔, 스테아르산나트륨, 글리세롤 모노스테아레이트, 탈크, 염화나트륨, 탈지분유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 요구되는 경우, 조성물은 또한 소량의 습윤 또는 유화제, 또는 pH 완충제를 함유할 수 있다. 이들 조성물은 용액, 현탁액, 에멀젼, 정제, 알약, 캡슐, 분말, 지속 방출 제제 등의 형태를 위할 수 있다. 경구 제제는 표준 담체, 예컨대 제약 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 스테아르산마그네슘, 사카린나트륨, 셀룰로스, 마그네슘 카르보네이트 등을 포함할 수 있다. 적합한 제약 담체의 예는 문헌 [E.W. Martin, 1990, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co.]에 기재되어 있다.
일부 실시양태에서, 제약 조성물은 인간 대상체에게 투여하기 적합한 형태로 제공된다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 환자에게 적절한 투여 형태를 제공하기 위해 적합한 양의 담체와 함께 예방상 또는 치료상 유효량의 항체를 함유할 것이다. 제제는 투여 방식에 적합하여야 한다.
일부 실시양태에서, 제약 조성물은 정맥내 투여에 적합한 형태로 제공된다. 일반적으로, 정맥내 투여에 적합한 조성물은 멸균 등장성 수성 완충제 내의 용액이다. 필요한 경우, 조성물은 또한 가용화제 및 주사 부위의 통증을 완화하기 위한 국소 마취제, 예컨대 리그노카인을 포함할 수 있다. 그러나, 상기 조성물은 정맥내 투여 이외의 다른 경로에 의해 투여될 수 있다.
특정 실시양태에서, 제약 조성물은 피하 투여에 적합하다. 특정 실시양태에서, 제약 조성물은 근내 투여에 적합하다.
제약 조성물의 성분은 별개로 또는 단위 투여 형태로, 예를 들어 동결건조된 분말 또는 물 미함유 농축물로서 함께 혼합될 수 있다. 조성물이 주입에 의해 투여될 경우, 조성물은 멸균 제약 등급 물 또는 염수가 담긴 주입 병으로 분배될 수 있다. 조성물이 주사에 의해 투여될 경우, 성분이 투여 전에 혼합될 수 있도록 주사용 멸균수 또는 염수의 앰퓰이 제공될 수 있다.
일부 실시양태에서, 제약 조성물은 대상체에게 투여하기 위한 적절한 농도로 재구성될 수 있는 멸균된 동결건조된 분말로서 공급된다. 일부 실시양태에서, 항체는 물 미함유 농축물로서 공급된다. 일부 실시양태에서, 항체는 적어도 0.5 mg, 적어도 1 mg, 적어도 2 mg, 적어도 3 mg, 적어도 5 mg, 적어도 10 mg, 적어도 15 mg, 적어도 25 mg, 적어도 30 mg, 적어도 35 mg, 적어도 45 mg, 적어도 50 mg, 적어도 60 mg, 또는 적어도 75 mg의 단위 용량의 멸균 동결건조된 분말로서 공급된다.
또 다른 실시양태에서, 제약 조성물은 액체 형태로 공급된다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 액체 형태로 제공되고, 계면활성제 및/또는 무기 염이 실질적으로 존재하지 않는다. 일부 실시양태에서, 항체는 적어도 0.1 mg/ml, 적어도 0.5 mg/ml, 적어도 1 mg/ml, 적어도 2.5 mg/ml, 적어도 3 mg/ml, 적어도 5 mg/ml, 적어도 8 mg/ml, 적어도 10 mg/ml, 적어도 15 mg/ml, 적어도 25 mg/ml, 적어도 30 mg/ml, 또는 적어도 60 mg/ml의 단위 용량의 액체 형태로서 공급된다.
일부 실시양태에서, 제약 조성물은 염 형태로서 제제화된다. 제약상 허용되는 염은 음이온을 사용하여 형성된 염, 예컨대 염산, 인산, 아세트산, 옥살산, 타르타르산 등으로부터 유래된 것, 및 양이온을 사용하여 형성된 염, 예컨대 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화암모늄, 수산화칼슘, 수산화제이철, 이소프로필아민, 트리에틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등으로부터 유래된 것을 포함한다.
치료 용도에서, 실시자는 예방 또는 치유 처치에 따라 및 처치되는 대상체의 연령, 체중, 감염 병기 및 대상체에 특이적인 다른 인자에 따라 가장 적절한 약량학을 결정할 것이다. 특정 실시양태에서, 용량은 성인에 대해 1일당 약 1 내지 약 1000 mg, 또는 약 5 내지 약 250 mg 또는 약 10 내지 50 mg이다. 특정 실시양태에서, 용량은 성인에 대해 1일당 약 5 내지 약 400 mg 또는 25 내지 200 mg이다. 특정 실시양태에서, 1일당 약 50 내지 약 500 mg의 투여량도 고려된다.
요법 또는 예방을 위한 사용 방법
본원에서 제공되는 특정 항체는 당업자에게 적합한 것으로 간주되는 임의의 질환 또는 병태의 치료 또는 예방을 위해 사용될 수 있다. 일반적으로, 치료 또는 예방 방법은 질환 또는 병태의 치료 또는 예방을 위해 치료상 또는 예방상 유효량의 항체 또는 항체 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
치료상 유효량의 항체 또는 조성물은 특정 질환 또는 병태의 중증도, 지속 기간 및/또는 증상을 감소시키기에 효과적인 양이다. 특정 질환의 예방, 관리, 치료 및/또는 개선에서 치료상 효과적일 항체 또는 조성물의 양은 표준 임상 기술에 의해 결정될 수 있다. 투여되는 항체 또는 조성물의 정확한 양은 부분적으로 투여 경로, 특정 질환 또는 병태의 중증도에 따라 결정되고, 실시자의 판단 및 각각의 대상체의 상황에 따라 결정되어야 한다.
일부 실시양태에서, 유효량의 본원에서 제공되는 항체는 약 0.025 mg/kg 내지 약 1000 mg/kg (인간 대상체의 체중)이다. 특정 실시양태에서, 항체는 인간 대상체에게 약 1000 mg/kg (체중) 이하, 약 950 mg/kg (체중) 이하, 약 900 mg/kg (체중) 이하, 약 850 mg/kg (체중) 이하, 약 800 mg/kg (체중) 이하, 약 750 mg/kg (체중) 이하, 약 700 mg/kg (체중) 이하, 약 650 mg/kg (체중) 이하, 약 600 mg/kg (체중) 이하, 약 550 mg/kg (체중) 이하, 약 500 mg/kg (체중) 이하, 약 450 mg/kg (체중) 이하, 약 400 mg/kg (체중) 이하, 약 350 mg/kg (체중) 이하, 약 300 mg/kg (체중) 이하, 약 250 mg/kg (체중) 이하, 약 200 mg/kg (체중) 이하, 약 150 mg/kg (체중) 이하, 약 100 mg/kg (체중) 이하, 약 95 mg/kg (체중) 이하, 약 90 mg/kg (체중) 이하, 약 85 mg/kg (체중) 이하, 약 80 mg/kg (체중) 이하, 약 75 mg/kg (체중) 이하, 약 70 mg/kg (체중) 이하, 또는 약 65 mg/kg (체중) 이하의 양으로 투여된다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공되는 항체의 유효량은 약 0.025 mg/kg 내지 약 60 mg/kg (인간 대상체의 체중)이다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공되는 제약 조성물의 항체의 유효량은 약 0.025 mg/kg 이하, 약 0.05 mg/kg 이하, 약 0.10 mg/kg 이하, 약 0.20 mg/kg 이하, 약 0.40 mg/kg 이하, 약 0.80 mg/kg 이하, 약 1.0 mg/kg 이하, 약 1.5 mg/kg 이하, 약 3 mg/kg 이하, 약 5 mg/kg 이하, 약 10 mg/kg 이하, 약 15 mg/kg 이하, 약 20 mg/kg 이하, 약 25 mg/kg 이하, 약 30 mg/kg 이하, 약 35 mg/kg 이하, 약 40 mg/kg 이하, 약 45 mg/kg 이하, 약 50 mg/kg 또는 약 60 mg/kg 이하이다.
방법의 제약 조성물은 당업자에게 알려진 임의의 방법을 사용하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 제약 조성물은 근내, 피내, 복강내, 정맥내, 피하 투여되거나 또는 이들의 임의의 조합 방식으로 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 피하 투여된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 정맥내 투여된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 근내 투여된다.
검출 또는 진단을 위해 사용하는 방법
본원에서 제공되는 항체는 임의의 표적의 검출을 위해 또는 당업자에게 적합한 것으로 간주되는 임의의 질환 또는 병태의 진단을 위해 사용될 수 있다. 이 방법은 적절한 위치, 예를 들어, 적절한 신체, 조직, 또는 세포에서 표적 항원에 대한 항체의 결합을 검출하는 것을 포함한다. 방법에서, 항체와 항원 사이의 복합체의 형성은 당업자에게 알려진 임의의 방법에 의해 검출될 수 있다. 그 예는 검출을 위해 2차 시약을 사용하는 검정, ELISA 및 면역침전 및 응집 검정을 포함한다. 이들 검정에 대한 상세한 설명은 예를 들어 문헌 [Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1988 555-612], WO96/13590 (메르텐스 (Maertens) 및 스투이버 (Stuyver)), [Zrein et al. (1998)] 및 WO96/29605에 제시되어 있다.
인 시튜 (in situ) 진단을 위해, 본 발명에 따른 항체와 아밀로이드 단백질 상의 에피토프 영역 사이에 특이적 결합이 발생할 수 있도록 항체를 당업계에 공지된 방법, 예컨대 정맥내, 비내, 복강내, 뇌내, 동맥내 주사에 의해 대상체에게 투여될 수 있다. 항체/항원 복합체는 항체에 부착된 표지 또는 임의의 다른 당업계에 공지된 검출 방법을 통해 편리하게 검출될 수 있다.
또한, 검출 또는 진단을 위한 키트가 본원에서 제공된다. 예시적인 키트는 하나 이상의 항체와 이들의 표적 항원 사이의 복합체 검출에 유용한 하나 이상의 시약과 함께 본원에서 제공되는 하나 이상의 항체를 포함한다.
항체의 제조
본원에서 설명되는 항체는 비제한적으로 당업자에게 명백한 임의의 기술에 의해 제조될 수 있다. 유용한 제조 기술은 예를 들어 변형된 tRNA 및 tRNA 합성효소를 사용한 생체내 합성, 예를 들어 변형된 tRNA 및 tRNA 합성효소를 사용한 무세포 합성, 고상 폴리펩티드 합성 및 액상 폴리펩티드 합성을 포함한다. 예시적인 기술은 상기 섹션 및 하기 실시예에서 설명된다.
특정 방법에서, 항체는 항체의 폴리펩티드 쇄를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드로부터 번역 및/또는 전사된다. 따라서, 하나 이상의 폴리펩티드 쇄 내의 부위-특이적 위치에 하나 이상의 비-천연 아미노산을 갖는 항체를 코딩할 수 있는 폴리뉴클레오티드가 본원에서 제공된다. 특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 비-천연 아미노산에 대한 부위-특이적 폴리펩티드 위치에 상응하는 폴리뉴클레오티드 위치에, 정상적으로는 아미노산과 연관되지 않는 코돈을 포함한다. 상기 코돈의 예는 중지 코돈, 4 bp 코돈, 5 bp 코돈 등을 포함한다. 반응 혼합물은 일반적으로 상기 코돈을 보완하는 (억제하는) tRNA를 생산할 수 있는 tRNA 합성효소를 포함한다. 이들 억제제 tRNA는 비-천연 아미노산에 연결되어 억제제 코돈의 부위에서 폴리펩티드 내로 비-천연 아미노산의 도입을 용이하게 한다.
항체는 폴리펩티드 쇄의 부위-특이적 위치 내로 비-천연 아미노산을 도입하기 위해 상기 폴리뉴클레오티드를 발현하기 위해 당업자에게 알려진 기술에 의해 제조될 수 있다. 상기 기술은 예를 들어 그 내용 전부가 본원에 참조로 포함된 미국 특허 7,045,337 및 7,083,970, 미국 특허 출원 공개 US 2008/0317670, US 2009/0093405, US 2010/0093082, US 2010/0098630, US 2008/0085277 및 국제 특허 출원 공개 WO 2004/016778 A1 및 WO 2008/066583 A2에 기재되어 있다.
특정 실시양태에서, 항체는 비천연 아미노산으로 아미노아실화된 적어도 하나의 오르토고날 tRNA를 포함하는 세포-비함유 반응 혼합물에서 제조될 수 있고, 여기서 오르토고날 tRNA 염기는 정상적으로는 아미노산과 연관되지 않는 코돈, 예를 들어 중지 코돈; 4 bp 코돈 등과 쌍을 형성한다. 반응 혼합물은 또한 오르토고날 tRNA를 비천연 아미노산으로 아미노아실화할 수 있는 tRNA 합성효소를 포함한다. 대체로, 박테리아 세포 추출액에 존재하는 프로테아제에 의한 분해에 취약한 오르토고날 tRNA 합성효소는 외부에서 합성되고, 폴리펩티드 합성 개시 전에 반응 혼합물에 첨가된다. 오르토고날 tRNA는 그로부터 세포 추출액이 얻어지는 박테리아 세포에서 합성될 수 있거나, 폴리펩티드 합성 반응 동안 드 노보 (de novo)로 합성될 수 있거나, 또는 반응 혼합물에 외부에서 첨가될 수 있다.
특정 실시양태에서, 비천연 아미노산 삽입 및 단백질 삽입 또는 폴딩에 영향을 주는 성분이 임의로 반응 혼합물에 첨가된다. 상기 성분은 방출 인자 1 및 2의 효과를 최소화하고 오르토고날 성분 농도를 추가로 최적화하기 위해 상승한 농도의 번역 인자를 포함한다. 단백질 샤페론 (chaperone) (옥시도리덕타제 및 이소머라제의 Dsb 시스템, GroES, GroEL, DNAJ, DNAK, Skp 등)은 반응 혼합물에 외부에서 첨가될 수 있거나 또는 세포 추출액을 제조하기 위해 사용된 공급원 세포에서 과다발현될 수 있다. 반응은 대규모 반응기, 소규모 반응기를 이용할 수 있거나, 또는 다수의 동시 합성을 수행하기 위해 다중화될 수 있다. 연속 반응은 시약 유동을 도입하기 위한 공급 메카니즘을 사용할 것이고, 공정의 일부로서 최종 생성물을 단리할 수 있다. 회분식 (batch) 시스템도 또한 관심의 대상이고, 여기서 추가의 시약이 활발한 합성 기간을 연장하기 위해 도입될 수 있다. 반응기는 임의의 방식, 예컨대 회분식, 연장된 회분식 (extended batch), 반-회분식 (semi-batch), 반-연속식, 유가식 (fed-batch) 및 연속식으로 운전될 수 있고, 적용 목적에 따라 선택될 것이다. 반응은 임의의 부피일 수 있고, 소규모에서 부피는 대체로 적어도 약 1 ㎕ 및 약 15 ㎕ 이하이거나, 또는 규모 확대된 반응에서 반응 부피는 적어도 약 15 ㎕, 대체로 적어도 약 50 ㎕, 보다 대체로 적어도 약 100 ㎕이고, 500 ㎕, 1000 ㎕, 또는 그 초과일 수 있다. 원칙적으로, 반응은 충분한 산소 (또는 다른 전자 수용자)가 필요할 때 공급된다면 임의의 규모로도 수행될 수 있다.
적어도 하나의 비천연 아미노산이 연장 동안 폴리펩티드 가닥 내로 도입되는 유용한 합성 방법은 다음을 포함하고 이로 제한되지 않는다: (I) 외인성의 정제된 오르토고날 합성효소, 비천연 아미노산, 및 오르토고날 tRNA의 세포-비함유 반응물에 대한 첨가, (II) 외인성의 정제된 오르토고날 합성효소 및 비천연 아미노산의 반응 혼합물에 대한 첨가, 그러나 오르토고날 tRNA는 세포-비함유 반응 동안 전사됨, (III) 외인성의 정제된 오르토고날 합성효소 및 비천연 아미노산의 반응 혼합물에 대한 첨가, 그러나 오르토고날 tRNA는 세포 추출액 공급원 유기체에 의해 합성됨. 특정 실시양태에서, 오르토고날 성분은 조절가능 프로모터에 의해 유도되어 합성 수준을 제어할 수 있지만, 첨가 또는 특이적 소화에 의한 관련 DNA 주형의 수준의 제어와 같은 다른 수단도 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 박테리아 세포-비함유 발현 시스템이 비-천연 아미노산 (nnAA)을 갖는 단백질 또는 펩티드 변이체를 생산하기 위해 사용된다. 시험관내 단백질 합성을 위한 박테리아 세포-비함유 추출액의 사용은 통상적인 생체내 단백질 발현 방법에 비해 몇 개의 이점을 제공한다. 세포-비함유 시스템은 전부는 아니지만 세포의 대부분의 대사 자원을 하나의 단백질의 배타적인 생산을 향하도록 유도할 수 있다. 또한, 시험관내에서 세포벽 및 막 성분의 결여는 합성 환경의 제어를 허용하기 때문에 유리하다. 그러나, 세포-비함유 추출액의 효율은 단백질 합성을 직접 또는 간접적으로 억제하는 박테리아 단백질에 의해 감소될 수 있다. 따라서, 단백질 합성 효율을 저하시키는 바람직하지 않은 단백질의 불활성화는 세포-비함유 추출액 내의 바람직한 단백질의 수득량을 증가시켜야 한다. 예를 들어, 단백질 합성 효율을 저하시키는 단백질의 불활성화는 규정된 아미노산 잔기에 도입되는 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 수득량을 증가시켜야 한다. nnAA의 폴리펩티드 내로의 도입은 단백질의 생물학적 다양성 및 기능의 증가에 유용하다. 규정된 아미노산 잔기에 도입되는 nnAA를 갖는 폴리펩티드를 생산하는 한 방법은 단백질 번역 동안 앰버 (중지) 코돈에서 nnAA를 신생 폴리펩티드 내로 도입하기 위해 tRNA를 함유하는 아미노아실화 오르토고날 CUA인 nnAA를 이용하는 것이다. 그러나, 앰버 코돈에 nnAA의 도입은 정상적으로 중지 코돈을 인식하고 번역을 종결시키는 천연 박테리아 종결 복합체에 의해 억제될 수 있다. 방출 인자 1 (RF1)은 mRNA 서열 내의 앰버 코돈을 인식함으로써 번역의 종결을 용이하게 하는 종결 복합체 단백질이다. 앰버 중지 코돈의 RF1 인식은 비-천연 아미노산 도입 부위에서 성숙전 말단절단 생성물을 촉진하고 따라서 단백질 수득량을 감소시킬 수 있다. 따라서, RF1의 활성의 약화는 재조합 단백질 내로의 nnAA의 도입을 증가시킬 수 있다.
nnAA 도입은 RF1 활성을 다음과 같은 3가지 방식으로 약화시킴으로써 증가시킬 수 있음이 이전에 밝혀졌다: 1) RF1의 중화 항체 불활성화, 2) RF1의 게놈 낙아웃 (knockout) (RF2 강화된 균주에서), 및 3) 친화도 크로마토그래피에 의한 제거를 위한 단백질 태그 (키틴 결합 도메인 및 His 태그)를 함유하는 RF1을 발현하도록 조작된 균주를 사용한 RF1의 부위 특이적 제거. RF1을 불활성화하기 위한 또 다른 방법은 단백질 분해성 절단 부위를 RF1 아미노산 서열 내로 도입하는 것을 포함한다. 절단 부위는 박테리아 세포 성장 동안 프로테아제에 의해 접근가능하지 않지만, 박테리아 세포가 세포-비함유 추출액을 생성하기 위해 용해될 때 프로테아제에 의해 절단된다. 따라서, nnAA가 앰버 코돈에 도입된 전장 폴리펩티드의 수득량은 상기 변형된 RF1 변이체를 발현하는 박테리아 세포 추출액에서 증가한다.
일부 실시양태에서, 비-천연 아미노산을 포함하는 항체를 생산하기 위해서는 핵산 주형이 필요하다. 세포-비함유 단백질 합성을 위한 주형은 mRNA 또는 DNA일 수 있다. 주형은 관심있는 임의의 특정 항체에 대한 서열을 포함할 수 있고, 전장 항체 또는 그의 임의의 길이의 단편을 코딩할 수 있다. 단백질 합성 주형으로서 기능하는 핵산은 임의로 천연 공급원으로부터 유래되거나 또는 합성 또는 재조합 핵산일 수 있다. 예를 들어, DNA는 재조합 DNA, 예를 들어, 플라스미드, 바이러스 등일 수 있다.
일부 실시양태에서, 항체의 핵산 주형이 생산된 후에, 주형은 세포-비함유 번역 시스템에서 항체를 합성하기 위해 사용된다. 예를 들어, 주형은 주형을 단백질로 번역하기에 충분한 조건 하에 세포 용해물에 첨가될 수 있다. 세포 용해물은 박테리아 세포 또는 진핵 세포로부터 유래될 수 있다. 발현된 단백질은 이어서 아래에서 설명되는 바와같이 당업계에 공지된 방법을 사용하여 정제할 수 있다.
일부 실시양태에서, 번역 시스템 (예를 들어, 시험관내 단백질 합성 시스템)이 하나 이상의 nnAA가 도입된 항체를 생산하기 위해 사용된다. 예시적인 번역 시스템은 미리 선택된 (규정된) 위치에서 비-천연 아미노산을 갖는 목적하는 폴리펩티드 또는 단백질의 합성을 위한 핵산 주형과 함께 세포 비함유 추출액, 세포 용해물, 또는 재구성된 번역 시스템을 포함한다. 반응 혼합물은 합성되는 거대분자를 위한 단량체, 예를 들어 아미노산, 뉴클레오티드 등, 및 합성에 필요한 상기 보조 인자, 효소 및 다른 시약, 예를 들어 리보좀, tRNA, 중합효소, 전사 인자 등을 추가로 포함할 것이다. 상기 성분, 예컨대 세포-비함유 추출액, 핵산 주형, 및 아미노산에 추가로, 단백질 합성에 특이적으로 필요한 물질이 반응물에 첨가될 수 있다. 그 물질은 염, 폴린산, 시클릭 AMP, 단백질 또는 핵산 분해 효소 억제제, 단백질 합성의 억제제 또는 조절제, 산화/환원 전위의 조절제, 비-변성 계면활성제, 완충제 성분, 스페르민, 스페르미딘, 푸트레신 등을 포함한다. 다양한 세포-비함유 합성 반응 시스템은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Kim, D.M. and Swartz, J.R. Biotechnol. Bioeng. 66:180-8 (1999)]; [Kim, D.M. and Swartz, J.R. Biotechnol. Prog. 16:385-90 (2000)]; [Kim, D.M. and Swartz, J.R. Biotechnol. Bioeng. 74:309-16 (2001)]; [Swartz et al., Methods MoL Biol. 267: 169-82 (2004)]; [Kim, D.M. and Swartz, J.R. Biotechnol. Bioeng. 85:122-29 (2004)]; [Jewett, M.C. and Swartz, J.R., Biotechnol. Bioeng. 86:19-26 (2004)]; [Yin, G. and Swartz, J.R., Biotechnol. Bioeng. 86:188-95 (2004)]; [Jewett, M.C. and Swartz, J.R., Biotechnol. Bioeng. 87:465-72 (2004)]; [Voloshin, A.M. and Swartz, J.R., Biotechnol. Bioeng. 91:516-21 (2005)]을 참조한다. 폴리펩티드의 세포-비함유 합성을 위한 추가의 조건은 그 전부가 본원에 참조로 포함된 WO2010/081110에 기재되어 있다.
일부 실시양태에서, DNA 주형은 시험관내 단백질 합성을 유도하기 위해 사용되고, RNA 중합효소는 DNA 주형의 향상된 전사를 제공하기 위해 반응 혼합물에 첨가된다. 본원에 사용하기 적합한 RNA 중합효소는 박테리아 추출액이 그로부터 유래되는 박테리아에서 기능하는 임의의 RNA 중합효소를 포함한다. 다른 실시양태에서, RNA 주형이 시험관내 단백질 합성을 유도하기 위해 사용되고, 반응 혼합물의 성분은 임의의 편리한 순서로 함께 혼합될 수 있지만, 바람직하게는 RNA 주형이 마지막으로 첨가되어 뉴클레아제에 의한 RNA 주형의 잠재적인 분해를 최소화하는 순서로 혼합된다
일부 실시양태에서, 세포-비함유 번역 시스템이 하나 이상의 nnAA가 도입된 항체를 생산하기 위해 사용된다. 세포-비함유 단백질 합성은 세포 기구의 촉매력을 이용한다. 시험관내에서 최대 단백질 수득량의 달성은 적당한 기질 공급, 예를 들어 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 아미노산, 항상성 환경, 촉매 안정성, 및 억제 부산물의 제거 또는 방지를 필요로 한다. 시험관내 합성 반응의 최적화는 신속하게 성장하는 유기체의 생체내 상태의 재현이 도움이 될 수 있다. 따라서, 본 발명의 일부 실시양태에서, 세포-비함유 합성은 산화적 인산화가 활성화되는 반응에서 수행한다. 추가의 상세한 내용은 그 내용 전부가 본원에 참조로 포함된 미국 특허 7,338,789에 기재되어 있다.
시험관내, 또는 세포-비함유 단백질 합성은 통상적인 생체내 단백질 발현 방법에 비해 몇 개의 이점을 제공한다. 세포-비함유 시스템은 전부는 아니지만 세포의 대부분의 대사 자원을 하나의 단백질의 배타적인 생산을 향하도록 유도할 수 있다. 또한, 시험관내에서 세포벽 및 막 성분의 결여는 합성 환경의 제어를 허용하기 때문에 유리하다. 예를 들어, tRNA 수준은 발현되는 유전자의 코돈 사용 빈도를 반영하도록 변경될 수 있다. 레독스 전위, pH, 또는 이온 강도는 또한 세포 성장 또는 생존 문제가 존재하지 않기 때문에 생체내 단백질 합성보다 더 큰 정도의 유연성 (flexibility)으로 변경될 수 있다. 또한, 정제되고 적절하게 폴딩된 단백질 생성물의 직접적인 회수는 쉽게 달성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포-비함유 시스템의 생산성은 최근 수년 동안 약 5 ㎍/ml-hr로부터 약 500 ㎍/ml-hr로 100배 개선되었다.
특정 실시양태에서, tRNA 합성효소는 외부에서 합성되고, 세포-비함유 반응 혼합물에 첨가된다. 특정 실시양태에서, 반응 혼합물은 ompT가 불활성화되었거나 천연적으로 불활성인 박테리아 세포로부터 제조된다. OmpT는 tRNA 합성효소를 포함하는 반응 혼합물의 성분을 분해하는 것으로 생각된다.
상기 성분, 예컨대 세포-비함유 추출액, 유전자 주형, 및 아미노산에 추가로, 단백질 합성에 특이적으로 필요한 물질이 반응물에 첨가될 수 있다. 이들 물질은 염, 폴린산, 시클릭 AMP, 단백질 또는 핵산 분해 효소 억제제, 단백질 합성의 억제제 또는 조절제, 산화/환원 전위(들)의 조절제, 비-변성 계면활성제, 완충제 성분, 스페르민, 스페르미딘, 푸트레신 등을 포함한다.
염은 바람직하게는 칼륨, 마그네슘, 및 암모늄 염 (예를 들어 아세트산 또는 글루탐산의)을 포함한다. 하나 이상의 상기 염은 반대 음이온으로서 대체 아미노산을 가질 수 있다. 최적 농도를 위해 이온 종 사이에 상호의존성이 존재한다. 이들 이온 종은 일반적으로 단백질 생산에 대해 최적화된다. 반응 매질의 특정 성분의 농도를 변경할 때, 또 다른 성분의 농도도 그에 따라 변경될 수 있다. 예를 들어, 몇몇 성분, 예컨대 뉴클레오티드 및 에너지 공급원 화합물의 농도는 다른 성분의 변화에 따라 동시에 조절될 수 있다. 또한, 반응기 내의 성분의 농도 수준은 시간에 따라 변할 수 있다. 산화/환원 전위의 조절제는 디티오트레이톨, 아스코르브산, 글루타티온 및/또는 그의 산화된 형태일 수 있다.
특정 실시양태에서, 반응은 투석식, 투석여과 회분식, 유가식 또는 반-연속 운전 방식으로 진행될 수 있다. 특정 실시양태에서, 공급 용액은 막을 통해 또는 주사 장치를 통해 반응기에 공급될 수 있다. 합성된 항체는 반응기에 축적되고, 시스템 운전 완료 후에 단리 또는 정제될 수 있다. 항체를 함유하는 소포는 또한 원 위치에서 또는 반응 유체가 흡착 매트릭스를 지나 펌핑되기 때문에 순환 루프에서, 예를 들어 반응 혼합물로부터 친화도 흡착에 의해 연속적으로 단리될 수 있다.
반응기에서 단백질 합성 동안, 목적하는 단백질을 선택적으로 단리하기 위한 단백질 단리 수단은 합성된 목적하는 단백질을 흡착하기 위한 항체 분자 또는 다른 분자로 코팅된 입자로 충전된 장치를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 단백질 단리 수단은 교대 사용을 위해 2개의 칼럼을 포함한다.
생성되는 항체는 표준 기술에 의해 정제하거나 단리할 수 있다. 예시적인 기술은 아래 실시예에서 제시된다.
검정 방법
항체는 당업자에게 명백한 임의의 검정에 따라 그의 예상된 활성에 대해, 또는 새로운 활성에 대해 검정할 수 있다. 생성되는 항체는 기능성 검정에서 또는 비-기능성 검정, 예를 들어 면역염색, ELISA, 쿠마시 (Coomasie) 또는 은 염색된 겔 상에서의 정량 등에서 존재하는 단백질의 양을 정량하고 생물학적 활성 단백질 대 총 단백질의 비를 결정함으로써 활성에 대해 검정될 수 있다.
번역 반응에서 생성된 단백질의 양은 다양한 방식으로 측정될 수 있다. 한 방법은 번역되는 특정 단백질의 활성을 측정하는 검정의 이용가능성에 의존한다. 단백질 활성을 측정하기 위한 검정의 예는 루시페라제 검정 시스템, 또는 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제 검정 시스템이다. 이들 검정은 번역 반응으로부터 생성된 기능적 활성 단백질의 양을 측정한다. 활성 검정은 부적절한 단백질 폴딩 또는 단백질 활성에 필요한 다른 번역후 변형의 결여 때문에 불활성인 전장 단백질을 측정하지 않을 것이다.
커플링된 시험관내 전사 및 번역 반응에서 생성된 단백질의 양을 측정하는 또 다른 방법은 기지량의 방사성 표지된 아미노산, 예컨대 35S-메티오닌, 3H-류신 또는 14C-류신을 사용하여 반응을 수핸한 후, 새로 번역되는 단백질 내에 도입되는 방사성 표지된 아미노산의 양을 측정한다. 도입 검정은 말단절단된 단백질 생성물을 비롯하여 시험관내 번역 반응에서 생성된 모든 단백질 내의 방사성 표지된 아미노산의 양을 측정할 것이다. 방사성 표지된 단백질은 단백질 겔 상에서 추가로 분리되고, 자기 방사 기록법에 의해 생성물의 크기가 적절하고 2차 단백질 생성물이 생성되지 않았음이 확인될 수 있다.
실시예
본원에서 사용되는 바와 같이, 특정 약어의 구체적으로 규정 여부와 상관 없이 이들 방법, 방식 및 실시예에서 사용된 기호 및 규약은 동시대의 학술 문헌, 예를 들어 [Journal of Biological Chemistry]에서 사용된 것과 일치한다.
하기 모든 실시예에서, 당업자에게 알려진 표준 마무리 처리 및 정제 방법이 이용될 수 있다. 달리 나타내지 않으면, 모든 온도는 ℃ (섭씨 온도)로 표현된다. 모든 방법은 달리 표시내지 않으면 실온에서 수행된다.
실시예 1
비-천연 아미노산을 함유하는 예시적인 항체의 합성 및 예시적인 세포독성제에 대한 접합
하기 실시예는 그의 구축 및 발현 방법과 함께 규정된 위치에 비-천연 아미노산을 함유하는 예시적인 항체를 설명한다. 항체는 아래에서 제시되는 바와 같이 발현, 억제 효율, 세포사멸제와의 접합 효율, 세포 결합, 및 세포 사멸에 대해 평가하였다. 본 실시예에서, 예시적인 항체는 모 항체 트라스투주맙을 기초로 한다 (미국 특허 6,165,464 및 2006/0018899 A1; [Carter et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 10:4285-4289]).
트라스투주맙의 중쇄 내의 규정된 위치에 TAG 앰버 코돈을 포함하는 제1 구축물을 제조하였다. DNA 주형으로서 C-말단-(His)6 태그 (SD02005)와 함께 트라스투주맙의 코딩 영역을 함유하는 pYD 플라스미드 및 센스 및 안티센스 방향 둘 모두에서 관심있는 돌연변이를 함유하는 합성 올리고뉴클레오티드 (유로핀스 엠더블유에스 오페론 (Eurofins MWS Operon); 미국 앨라배마주 헌츠빌)를 사용하여 부위 지정 돌연변이 유발을 수행하였다. 각각의 돌연변이의 올리고뉴클레오티드를 20 ㎕의 최종 부피로 DNA 주형 및 퓨젼(PHUSION)® 중합효소 (뉴 잉글랜드 바이오랩스 (New England Biolabs); 미국 매사추세츠주 입스위치)에 첨가하였다. 각각의 성분의 최종 농도는 1.5 mM MgCl2 및 200 μM dNTP를 함유하는 HF 완충제 내의 0.16 μM의 각각의 올리고뉴클레오티드, 0.5 ng/㎕ 주형 DNA, 0.02 U/㎕ 퓨젼® 중합효소이었다. 혼합물을 98℃ 5m, 18 PCR 사이클 (98℃ 30s, 55℃ 1 min, 72℃ 4 min), 72℃ 10 min 인큐베이션하고, 4℃에서 보관하였다. DpnI (뉴 잉글랜드 바이오랩스; 미국 매사추세츠주 입스위치)를 혼합물에 0.6 U/㎕의 최종 농도로 첨가하고, 37℃에서 1h 동안 인큐베이션하여 모 DNA를 소화하였다.
이어서, 제조자의 절차 (인비트로겐 (Invitrogen); 미국 캘리포니아주 칼스바드)에 따라 멀티샷(MultiShot)™ 96-웰 플레이트 TOP10을 사용하여 5 ㎕의 각각의 혼합물로 50 ㎕의 화학적으로 적격 이. 콜라이 세포 내로 형질전환하였다. 형질전환된 세포를 200 ㎕ SOC (인비트로겐; 미국 캘리포니아주 칼스바드) 내에서 37℃에서 1 hr 동안 회수하고, 50 ㎍/mL 카나마이신 (테크노바 (Teknova); 미국 캘리포니아주 홀리스터)을 보충한 루리아-베르타니 (Luria-Bertani; LB) 아가 상에 도말하였다. 37℃에서 24 hr 후에, 콜로니를 7.5% 글리세롤 및 50 ㎍/mL 카나마이신이 존재하는 200 ㎕ LB 내에 집어넣고, 37℃에서 24 hr 동안 성장시스템. 20 ㎕의 배양액을 회전 환 (rolling circle) 증폭 (RCA)을 위해 사용하고, T7 (5'TAATACGACTCACTATAGG 3') 및 T7 term (5'GCTAGTTATTGCTCAGCG3') 프라이머를 사용한 프라이머 연장에 의해 서열을 결정하였다. 서열을 SEQUENCHER® 소프트웨어 (진 코즈 코프 (Gene Codes Corp); 미국 미시건주 앤 아버)를 이용하여 분석하고, 돌연변이를 함유하는 클론을 선발하고, 96 웰 플레이트에 배열하였다. 선택된 변이체의 밤새 배양액을 성장시키고, 제조자 (퀴아겐 (Qiagen); 미국 메릴랜드주 저먼타운)에 따른 표준 96 웰 미니 프렙 (mini-prep) 프로토콜을 사용하여 플라스미드 DNA를 제조하기 위해 사용하였다. 미니 프렙 DNA의 농도는 260 nm (및 280 nm)에서의 흡광도를 사용하여 측정하였다.
이어서, 변이체를 문헌 [Zawada et al., 2011, Biotechnol. Bioeng. 108(7)1570-1578]에 기재된 바와 같이 수행하되 아래와 같이 변형한 세포-비함유 단백질 합성 반응에서 발현시켰다. 비치환된 트라스투주맙을 또한 대조군으로 제조하였다. 세포 비함유 추출액을 50 μM 아이오도아세트아미드로 30 min 동안 RT (20℃)에서 처리하고, 관심있는 변이체로부터의 중쇄 DNA를 제외한 모든 다른 성분을 함유하는 사전혼합물에 첨가하였다. 세포 미함유 반응을 중쇄 DNA 변이체의 플라스미드 DNA의 첨가에 의해 개시시키고, 96 딥 (deep) 웰 플레이트에서 진탕기에서 450 rpm에서 30℃에서 12h 동안 인큐베이션하였다. 반응액을 4℃에서 5 h 동안 추가로 인큐베이션하였다. 단백질 합성 반응에서 최종 농도는 30% 세포 추출액, 1 mM 파라-아지도 페닐알라닌 (pAzF) (알에스피 아미노 애시드 (RSP Amino Acid)), 0.125 mg/mL 엠 자나쉬이 (M jannaschii) 앰버 억제제 tRNA, 0.37 mg/mL 엠 자나쉬이 pAzF-특이적 아미노-아실 tRNA 합성효소 (FRS), 2 mM GSSG, 0.29 mg/mL PDI (Mclab), 100 ㎍/mL 이. 콜라이 DsbC, 8 mM 마그네슘 글루타메이트, 10 mM 암모늄 글루타메이트, 130 mM 칼륨 글루타메이트, 35 mM 나트륨 피루베이트, 1.2 mM AMP, 각각 0.86 mM의 GMP, UMP, 및 CMP, 2 mM 아미노산 (예외적으로 티로신 및 페닐알라닌은 0.5 mM), 4 mM 옥살산나트륨, 1 mM 푸트레신, 1.5 mM 스페르미딘, 15 mM 인산칼륨, 100 nM T7 RNAP, 2 ㎍/mL 트라스투주맙 경쇄 DNA, 8 ㎍/mL 트라스투주맙-(His)6 중쇄 DNA이었다. 각각의 트라스투주맙 변이체는 1 mL 규모로 96 딥 웰 플레이트에서 이중으로 생산되었다. 총 3개의 플레이트를 변이체를 발현시키기 위해 사용하였고, 플레이트에 걸친 발현을 정규화하기 위해 각각 비치환된 트라스투주맙의 발현과 비교하였다. 이와 같이 생산된 모든 트라스투주맙 변이체는 비글리코실화됨을 이해하여야 한다.
단백질 합성을 모니터링하기 위해, 각각의 세포-비함유 단백질 합성 반응물의 일부를 제거하고, 3.33% (v/v) l-[U-14C]-류신 (300 mCi/mmole; 지이 라이프 사이언시스 (GE Life Sciences), 미국 뉴저지주 피스카타웨이)로 스파이킹 (spiking)하였다. 중쇄의 상이한 부위에서 앰버 코돈의 억제는 환원 SDS-PAGE 겔의 [14C]-자기 방사 기록법에 의해 결정하였다. 전장 트라스투주맙 중쇄 및 억제된 트라스투주맙 중쇄 변이체는 SDS-PAGE에서 50 kD로 이동하였다. 비억제된 (말단절단된) 트라스투주맙 변이체는 보다 낮은 분자량으로 이동하였다. 중쇄 내의 앰버 억제는 다음과 같이 결정한다:
Figure pct00067
밴드 강도는 ImageQuant (아머샴 바이오사이언시스 코프. (Amersham Biosciences Corp.); 미국 뉴저지주 피스카타웨이)에 의해 결정하였다. 상기 14C 겔 검정은 말단절단된 변이체가 전장 생성물과 구별될 수 없기 때문에, 425의 위치 (EU 인덱스 넘버링)로부터 C 말단까지의 중쇄의 TAG 변이체에 대한 억제를 평가하기 위해 사용될 수 없음을 유의해야 한다.
합성 후에, 각각 1 mL의 반응물을 1 mL PBS (pH7.4)로 희석하였다. 혼합물을 5000xg로 4℃에서 15 min 동안 원심분리하였다. 4.2 ㎕/min의 유량으로 서서히 위에서 아래로 피펫으로 4회 옮겨 상청액을 40 ㎕ 수지 함유 IMAC Phytip (파이넥서스, 인크. (PhyNexus, Inc.); 미국 캘리포니아주 산 호세)으로 포획하였다. 수지를 8.3 ㎕/min의 유량으로 위에서 아래로 피펫으로 2회 옮겨 925 ㎕ IMAC 결합 완충제 (50 mM Tris pH 8.0, 300 mM NaCl, 10 mM 이미다졸)로 세척하였다. 이 과정을 추가의 925 ㎕ IMAC 결합 완충제를 사용하여 1회 반복하였다. 결합된 단백질을 4.2 ㎕/min의 유량으로 위에서 아래로 피펫으로 4회 옮겨 250 ㎕ IMAC 용리 완충제 (50 mM Tris pH 8.0, 300 mM NaCl, 500 mM 이미다졸)로 용리시켰다. 구축물의 (his)6 태그가 C-말단이기 때문에, 상기 절차는 전장 단백질의 단리를 허용한다. 정제 후에 변이체를 정량하기 위해, IMAC 정제된 샘플을 4-15% 스테인-프리(Stain-Free)™ 겔 (바이오-라드 크라이테리온(Criterion)™ TGX #567-8085)에 의해 용해된 2x 겔 로딩 완충제 (바이오-라드(Bio-Rad) #161-O737)와 혼합하였다. 샘플을 겔의 웰 내로 로딩하기 전에 가열하지 않았다. 단백질 밴드가 가시화되고, 이미지 랩 (Image Lab) 소프트웨어 (v3)를 사용하여 바이오-라드 겔 독 (Gel Doc) EZ 시스템에 의해 정량하였다. 샘플의 밴드 강도는 동일한 겔에 로딩된 헤르셉틴®의 질량 표준을 기초로 하여 결정하였다.
다음으로, 트라스투주맙 변이체를 제약된 (constrained) 시클로옥틴 시약을 사용하여 예시적인 세포독성제 MMAF에 접합하였다. 간단히 설명하면, DBCO-MMAF (도 1에 제시된 구조; ACME 바이오사이언스 (ACME Bioscience); 미국 캘리포니아주 팔로 알토)를 DMSO에 5 mM의 최종 농도로 용해시켰다. 화합물을 PBS로 1 mM로 희석한 후, IMAC 용리 완충제 내의 트라스투주맙-(His)6 변이체에 100 μM의 최종 농도로 첨가하였다. 혼합물을 RT (20℃)에서 17시간 동안 인큐베이션하였다. 반응은 아지드화나트륨을 100 mM의 최종 농도로 첨가하여 중지시키고, 1X PBS 내에서 평형화된 제바 (Zeba) 플레이트 (써모 사이언티픽 (Thermo Scientific); 미국 매사추세츠주 월섬)를 사용하여 완충제를 교환하였다. 이어서, 여액을 무스탕(MUSTANG)® Q 플레이트 (폴 코프. (Pall Corp.); 미국 뉴욕주 포트 워싱턴)에 통과시켜 내독소를 제거하였다.
실시예 2
예시적인 항체-약물 접합체의 특성화
샘플을 정량하고 트라스투주맙 변이체 약물 접합체의 약물-항체 비를 결정하기 위해 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC)를 다음과 같이 수행하였다. 샘플 및 표준물질을 밀리큐 (MilliQ) 물 내에 제조된 3M 황산암모늄 (EMD 케미칼 (EMD Chemical)), 50 mM 인산나트륨 pH 7.0 (말린크로트 (Mallinckrodt))에 1:2로 희석하였다. 애질런트 (Agilent) 1100 바이너리 펌프 HPLC 시스템에는 칼럼 구획 온도가 30℃인 토소 바이오사이언스 엘엘씨 (Tosoh Bioscience LLC) TSK-겔 부틸-NPR® (4.6 mm x 3.5 cm) 칼럼이 구비되었다. 이동상 A는 1.5 M 황산암모늄, 50 mM 인산나트륨, pH 7.0이었다. 이동상 B는 80:20의 물:이소프로필 알콜 (허니웰 (Honeywell)) 내의 50 mM 인산나트륨, pH 7.0이었다. 이동상은 1.0 mL/분의 유량으로 전달되었다. 10분 동안 15% 이동상 B로부터 100% 이동상 B로의 선형 구배로 분리를 수행하였다. UV 데이터를 210 및 280 nm 둘 모두에서 얻었다. 피크 면적은 켐스테이션 (Chemstation) 소프트웨어 (애질런트)를 사용하여 정량하고, 약물 항체 비 (DAR)는 총 피크 면적의 백분율로부터 계산하였다.
접합된 트라스투주맙 변이체의 결합을 평가하기 위해, HER2를 발현하는 세포에 대한 결합 검정을 다음과 같이 수행하였다. 세포당 1백5십만 개 초과의 수용체 카피를 갖는, HER2/c-erb-2 유전자 산물을 과다발현하는 SKBR3 세포 (ATCC # HTB-30, 미국 버지니아주 매나싸스) 상의 HER2에 대한 정제된 접합된 변이체의 결합을 임상 등급 헤르셉틴®, 세포-비함유 단백질 합성에 의해 생산된 비글리코실화된 트라스투주맙, 또는 음성 대조군으로서 인간 혈청 IgG1 (시그마-알드리치; 미국 미주리주 세인트루이스)과 비교하였다. SKBR3 세포를 10% 열-불활성화된 태소 혈청 (하이클론 (Hyclone); 써모 사이언티픽; 미국 매사추세츠주 월섬), 2 mM 글루타맥스 (인비트로겐; 미국 캘리포니아주 칼스바드) 및 1x 페니실린/스트렙토마이신 (셀그로-메디아테크 (Cellgro-Mediatech); 미국 버지니아주 매나싸스)을 보충한 DMEM:Ham의 F-12 (50:50), 고 글루코스 (셀그로-메디아테크; 미국 버지니아주 매나싸스) 내에서 배양하였다. 부착 세포를 칼슘 및 마그네슘-비함유 행크 평형 염 용액 (HBSS)으로 2회 세척하고, HYQ®TASE™ (하이클론; 써모 사이언티픽; 미국 매사추세츠주 월섬)으로 수확하였다. 총 10 ㎕의 부피 내의 샘플당 총 200,000개의 세포를 10 ㎕ FACS 완충제 (1% 소 혈청 알부민을 보충한 DPBS 완충제) 내에 제조된 접합된 트라스투주맙 변이체, 임상 등급 헤르셉틴®, 또는 비글리코실화된 트라스투주맙의 연속 희석액과 함께 인큐베이션하였다. 세포 + 항체 또는 ADC를 60분 동안 얼음 상에서 인큐베이션하였다. 비염색된 세포, 인간 IgG1 (이소형 대조군) 및 2차 항체 (염소 항-인간 IgG)를 대조군으로 사용하였다. 세포를 빙냉 FACS 완충제로 2회 세척하고, 5 ㎍/ml 알렉사 (Alexa) 647 표지된 염소 항-인간 IgG 2차 항체 (인비트로겐; 미국 캘리포니아주 칼스바드)와 함께 얼음 상에서 1 hr 동안 인큐베이션하였다. 모든 샘플을 FACS 완충제를 사용하여 세척하고, BD FACS 캘리버 (Calibur) 시스템 (비디 바이오사이언시스 (BD Biosciences); 미국 캘리포니아주 산 호세)을 이용하여 분석하였다.
평균 형광 강도는 그래프패드 프리즘 (GraphPad Prism) (그래프패드 v 5.00, 소프트웨어; 미국 캘리포니아주 샌 디에고)을 사용하여 하나의 부위 특이적 결합 식을 이용한 비-선형 회귀 분석에 의해 피팅하였다. 데이터는 상대적인 MFI vs. 항체 또는 항체 변이체의 농도 (㎍/ml)로 표현하였다.
다음으로, 접합된 트라스투주맙의 세포 사멸에 대한 효과를 다음과 같이 세포 증식 검정으로 측정하였다. SKBR3 및 MDA-MB-468을 ATCC로부터 입수하고, 10% 열-불활성화된 태소 혈청 (하이클론; 써모 사이언티픽; 미국 매사추세츠주 월섬), 2 mM 글루타맥스 (인비트로겐; 미국 캘리포니아주 칼스바드) 및 1x 페니실린/스트렙토마이신 (셀그로-메디아테크; 미국 버지니아주 매나싸스)을 보충한 DMEM:Ham의 F-12 (50:50), 고 글루코스 (셀그로-메디아테크; 미국 버지니아주 매나싸스) 내에 유지하였다. 부착 세포를 칼슘 및 마그네슘-비함유 행크 평형 염 용액 (HBSS)으로 2회 세척하고, HYQ®TASE™ (하이클론; 써모 사이언티픽; 미국 매사추세츠주 월섬)를 사용하여 수확하였다. 총 103 세포를 96-웰 1/2 영역 (half area) 평저 백색 폴리스티렌 플레이트 내에 40 ㎕의 부피로 씨딩하였다. 세포를 밤새 37℃에서 C02 인큐베이터 내에서 부착시켰다. ADC 변이체를 DMEM/F12 배지에 2x 농도로 만들고, 멀티스크린 (MultiScreen) HTS 96-웰 필터 플레이트 (밀리포어 (Millipore); 미국 매사추세츠주 빌러리카)를 통해 여과하였다. 필터 멸균된 접합된 트라스투주맙 변이체, 헤르셉틴, 또는 비글리코실화된 트라스투주맙을 처리 웰 내로 첨가하고, 플레이트를 37℃에서 C02 인큐베이터 내에서 120 hr 동안 배양하였다. 세포 생존율 측정을 위해, 80 ㎕의 셀 타이터-글로(Cell Titer-Glo)® 시약 (프로메가 코프. (Promega Corp.); 미국 위스콘신주 매디슨)을 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 제품 지시서에 따라 처리하였다. 상대적인 발광을 엔비젼® 플레이트 판독기 (퍼킨-엘머 (Perkin-Elmer); 미국 매사추세츠주 월섬)로 측정하였다. 상대적인 발광 판독치를 대조군으로서 미처리 세포를 사용하여 % 생존율으로 전환하였다. 데이터를 그래프패드 프리즘 (그래프패드 v 5.00, 소프트웨어; 미국 캘리포니아주 샌 디에고)을 사용하여 log(억제제) vs. 반응 - 가변 기울기, 4 파라미터 피트 식을 이용한 비-선형 회귀 분석에 의해 피팅하였다. 데이터는 상대적인 세포 생존율, ATP 함량 % vs. ADC의 용량 (㎍/ml)으로 표현하였다.
이들 특성화 실험의 양성 결과를 표 1, 2, 및 3 (각각 플레이트 1, 2, 및 3)에 제시한다. 표에, 변이체의 하기 특성이 제시된다: 제조된 단백질의 순위 및 농도, 야생형에 비해 전장 생성물의 발현 효율 (억제 효율), HER2-발현 세포에 결합하는 능력, 약물-항체 비 (항체당 세포독성제의 수로 표현됨), HIC 프로파일에 대한 코멘트, 및 상기 설명한 세포-사멸 검정으로부터 관찰된 IC50. HIC 검정에 대한 코멘트에서, 단일 피크는 단일 피크로서 잘 분해된 프로파일 (상기 프로파일의 예는 도 2에 제시됨)에 상응하고, NWR은 불량하게 분해된 프로파일 (상기 프로파일의 예는 도 3에 제시됨)에 상응하고, WR은 잘 분해된 HIC 프로파일 (상기 프로파일의 예는 도 4에 제시됨)에 상응한다. 단일 피크 프로파일을 보인 몇 개의 변이체는 또한 강력한 사멸을 보였고, 이것은 변이체가 실제로는 약물과 접합되었지만, HIC 칼럼에서 분해되지 않았음을 나타낸다.
일반적으로, 바람직한 변이체는 약 20 ng/ml 이하, 보다 바람직하게는 약 10 ng/ml 미만, 훨씬 더 바람직하게는 약 5 ng/ml 미만의 IC50을 보인다. 바람직하게는, 변이체는 상위 50%의 발현에 해당하고, 보다 바람직하게는 상위 25%의 발현에 해당한다. DAR이 적어도 약 1.0인 변이체도 바람직하다. 바람직한 변이체는 위치 V005, A023, G042, G065, S074, A084, A118, S119, S132, S134, T135, S136, G137, G138, T139, T155, S160, A162, S165, A172, L174, S176, S177, S191, G194, S219, P238, S239, F241, F243, K246, E356, M358, K360, V262, V264, D265, S267, H268, E269, D270, P271, E272, K274, F275, Y278, D280, G281, V282, E283, N286, T289, R292, E293, E294, Q295, Y296, N297, S298, T299, Y300, R301, V303, V305, K317, K320, S324, K326, A327, P329, A330, I332, E333, K334, T335, S337, A339, R344, R355, T359, L398, S375, S383, N384, Q386, N389, K392, G420, K340, Q342, F404, Q438, N421, 및 Y436을 교체하는 비-천연 아미노산을 갖는 것을 포함한다. 보다 바람직한 변이체는 위치 V005, A023, S074, A084, A118, S119, S132, S134, T135, S136, G137, T139, S160, A162, S165, A172, S191, G194, S239, F241, K246, S267, H268, E269, D270, P271, E272, K274, F275, D280, G281, V282, E283, N286, T289, R292, E293, E294, Q295, Y296, N297, S298, T299, Y300, R301, V303, V305, K317, K320, S324, K326, A327, P329, A330, I332, E333, K334, T335, S337, A339, R344, R355, T359, L398, S375, Q386, N389, K392, G420, K340, Q342, Q438, 및 N421을 교체하는 비-천연 아미노산을 갖는 것을 포함한다. 훨씬 더 바람직한 변이체는 위치 V005, A023, A084, A118, S119, S132, S134, S136, G137, S160, A162, A172, S239, F241, S267, E269, D270, P271, E272, V282, N286, R292, E293, Y296, S298, P329, A330, K334, T335, K340, R355, T359, Q386, N389, F404, G420, N421, Q438, 및 Q342를 교체하는 비-천연 아미노산을 갖는 것을 포함한다. 위치 V005, A084, A118, S132, S136, S239, E293, K334, R355, Q342, T359, 및 N389를 교체하는 비-천연 아미노산을 갖는 변이체가 특히 바람직한 것으로서 확인되었다.
또한, 발현, 억제 효율, 접합 효율, 세포-결합, 및 세포 사멸은 Fc의 공개된 결정 구조를 기초로 하여 예측할 수 없었음에 유의한다. 예를 들어, E293 및 K334는 Fc 구조 내의 이들의 위치를 기초로 할 때 방향족 페닐알라닌 유도체로의 치환을 수용하는 것으로 예측되지 않지만, 둘 모두 잘 발현되고 강력한 치사제로서, IC50 값은 각각 2.7 및 3.0 ng/ml이었다. 이와 반대로, S131은 중쇄 표면 상에서 그의 이용가능성을 기초로 할 때 접합을 위한 매우 우수한 위치로 예측되었지만, 상기 위치에서의 치환을 갖는 유도체는 불량한 접합자 (DAR: 0.65) 및 불량한 치사제 (IC50: 27.1 ng/mL)이었다. 따라서, 발현, 억제, 접합, 및 세포 사멸을 위한 최적 부위를 확인하기 위한 실험이 필요하다고 결론지었다.
또한, 트라스투주맙의 N-연결된 글리코실화 부위 N297 근처의 부위가 접합에 매우 적합한 것으로 밝혀졌음에 유의하여야 한다. 특히, R292 내지 R301, V303 및 V305의 부위는 바람직한 세포-사멸 및/또는 접합 특성을 보이는 것으로 밝혀졌다. 상기 설명된 바와 같은 세포-비함유 단백질 합성 반응에서 생산된 트라스투주맙 변이체의 비글리코실화된 형태 때문에 이들 부위를 평가하는 것이 가능하였다.
Figure pct00068
Figure pct00069
Figure pct00070
Figure pct00071
Figure pct00072
실시예 3
예시적인 항체-약물 접합체에서 비-천연 아미노산의 도입의 충실도
본 실시예는 예시적인 항체-약물 접합체에서 비-천연 아미노산의 도입 충실도에 대한 평가를 설명한다. DBCO-MMAF와 접합된 S136에서 치환된 p-아지도-페닐알라닌으로 치환된 트라스투주맙을 트립신으로 소화하고, 나노-전기분무 ChipCube 공급원이 장착된 애질런트 6520 애큐리트 매스 (Accurate Mass) Q-TOF LC-MS 시스템 상에서 분석하였다. 잠재적인 착오도입된 아미노산 및 그의 야생형 상대물을 함유하는 펩티드를 펩티드의 z=1-4 충전 상태에 대한 이론적 m/z의 ±10 ppm 내의 LC-MS 데이터로부터 추출된 이온 크로마토그램을 사용하여 검색하였다. 발견된 피크의 m/z가 이론적 m/z의 ±10 ppm 이내이고 정확한 충전 상태이면, 이것은 MS/MS 확인시까지 잠재적으로 매치로 간주되었다. 착오도입에 의한 신호의 부재시에, 신호는 질량 스펙트럼에서 노이즈 (noise)와 같거나 더 작은 것으로 가정되었다. 최소 충실도 비율은 노이즈 대 신호 비이었다. 신호는 가장 풍부한 충전 상태에 대한 펩티드의 용리 프로파일에 걸쳐 모든 단일동위원소 (monoisotopic) 이온의 평균으로서 측정하고, 노이즈는 최소량의 신호를 보이는 영역에 인접한 영역의 동일한 스펙트럼에서 추정되었다. 착오도입 사건을 포함하는 관찰된 펩티드가 발견될 경우, 그의 평균 신호를 노이즈 측정치 대신에 사용하였다.
시험된 항체-약물 접합체의 펩티드 지도에서, nnAA + 접합된 약물을 갖는 펩티드가 충전 상태 2 및 3에서 검출되었고, 오류는 4 ppm 미만이었다. 위치 136에서, 티로신 도입은 존재하지 않았고, pAzPhe에 대한 도입 효율은 98.3%로 결정되었다. 티로신 착오도입은 검출된 IgG 서열에 걸쳐 Phe 위치에서 검출되지 않았다. Phe의 전체적인 도입 효율은 최소 99.7%로 측정되었다.
실시예 4
예시적인 항체-약물 접합체의 열 안정성 평가
본 실시예는 비글리코실화된 트라스투주맙 및 트라스투주맙 변이체의 열 안정성 (Tm)을 측정하도록 설계된 실험을 설명한다. 검정되는 단백질 (수트로셉틴 및 변이체)을 완충된 용액 (PBS) 내의 환경 감수성 염료 (SYPRO 오렌지, 라이프 테크놀로지스 (Life Technologies) Cat #S-6650)와 혼합하고 제어된 열 변성을 겪으면서 혼합물의 형광을 실시간으로 모니터링함으로써 열 이동 검정을 수행하였다. 검정 혼합물 내의 단백질의 최종 농도는 100-250 ㎍/mL이었고, 염료는 본래의 원액으로부터 1:1000으로 희석하였다 (원액 염료는 DMSO 내의 5000x임). 384-웰 미세플레이트 (바이오-라드 Cat #MSP-3852)에 단백질-염료 혼합물의 5 ㎕ 분취액을 분배한 후, 플레이트를 광 투명 밀봉 필름 (바이오-라드 Cat #MSB-1001)으로 밀봉하고, 384-웰 플레이트 실시간 열순환기 (바이오-라드 CFX384 리얼 타임 시스템 (Real Time System))에 두었다. 단백질-염료 혼합물을 사이클당 0.1℃의 증분 (~1.5℃/분)으로 25℃로부터 95℃로 가열하였고, 이 때 형광 측정 전에 각각의 온도에서 3초의 평형을 허용하였다. 실험 종료시에, 융점 (Tm)을 바이오-라드 CFX 매니저 소프트웨어를 사용하여 결정하였다. 복잡합 열 전이 프로파일을 갖는 단백질 샘플에 대해, 융점 (Tm)은 온도 (X축)에 대해 형광 강도 (Y축)의 음성 1차 도함수 플롯 (negative first order derivative plot)으로부터, 또는 데이터를 볼츠만 시그모이드 모델 (Boltzmann sigmoidal model)에 피팅함으로써 계산한다. 야생형 단백질에 비해 IgG 변이체의 융점의 차이는 검정되는 단백질에 대한 열 이동의 척도이다.
특정 변이체에 대한 상기 검정의 결과를 표 4에 제시한다. 일반적으로, 비치환된 트라스투주맙보다 유의하게 더 낮은 Tm, 특히 Tm1의 편향은 안정성의 바람직하지 않은 상실 및/또는 응집 경향을 나타낸다. 따라서, 비치환된 트라스투주맙의 약 5℃ 내의 Tm1 및/또는 Tm2를 보이는 트라스투주맙 변이체가 바람직하다. 보다 바람직한 변이체는 비치환된 트라스투주맙의 약 3℃ 내의 Tm1 및/또는 Tm2를 보이는 것이다. 보다 더 바람직한 변이체는 비치환된 트라스투주맙의 약 2℃ 내의 Tm1 및/또는 Tm2를 보이는 것이다. 보다 더 바람직한 변이체는 비치환된 트라스투주맙의 약 1℃ 내의 Tm1 및/또는 Tm2를 보이는 것이다. Tm1 및 Tm2는 비접합된 또는 접합된 형태에서 측정될 수 있다.
Figure pct00073
실시예 5
예시적인 항체-약물 접합체의 특성화: 경쇄 치환
실시예 9에서 설명되는 방법을 사용하여 경쇄 치환을 갖는 변이체를 생성하고 분석하였다. 이들 특성화 실험의 결과를 표 5에 제시한다.
Figure pct00074
바람직한 변이체는 경쇄 (LC)의 이들 위치를 교체하는 비-천연 아미노산을 갖는 것을 포함한다: A043, Y049, S056, G057, S060, S067, G068, T109, A112, S114, A144, A153, S156, G157, S168, A184, S202, S203, 및 T206.
DAR이 적어도 약 1.0인 변이체도 바람직하다. 보다 더 바람직한 변이체는 경쇄의 이들 위치를 교체하는 비-천연 아미노산을 갖는 것을 포함한다: A043, Y049, S056, G057, S060, S067, G068, T109, A112, A144, A153, S156, S168, A184, S202, 및 S203.
DAR이 적어도 약 1.2인 변이체도 바람직하다. 보다 더 바람직한 변이체는 경쇄의 이들 위치를 교체하는 비-천연 아미노산을 갖는 것을 포함한다: A043, Y049, S056, G057, S060, S067, G068, T109, A144, A153, S156, A184, S202, 및 S203.
DAR이 적어도 약 1.5인 변이체도 바람직하다. 보다 더 바람직한 변이체는 경쇄의 이들 위치를 교체하는 비-천연 아미노산을 갖는 것을 포함한다: Y049, S056, G057, S060, S067, T109, A153, S202, 및 S203.
실시예 6
RF-1 약화된 추출액 내의 HC-F404의 발현의 평가
RF-1 약화된 이. 콜라이 균주를 사용하여 비-천연 아미노산의 도입에 대한 효과를 초기에 평가하기 위해, RF-1 양성 균주에서 불량하게 발현되는 12개의 변이체를 발현시키고, RF-1 약화된 균주에서 규모를 확대하였다. 상기 변이체 중의 하나, 즉 HC-F404는 아래에서 논의되는 바와 같이 예외적으로 바람직한 특성을 보였다.
앰버 중지 코돈에서 비-천연 아미노산의 삽입을 위해 오르토고날 CUA-코딩 tRNA를 생산하도록 또한 조작된 OmpT 감수성 RF-1 약화된 이. 콜라이 균주로부터 상기 세포 비함유 단백질 합성 반응을 위해 사용된 세포 비함유 추출액을 제조하였다. HC-F404 및 WT LC를 코딩하는 DNA 주형의 첨가 후에, 세포 비함유 반응액을 30℃에서 12h 동안 플라워 (Flower) 플레이트 (m2p-labs # MTP-48-B)에서 1 ml 규모 X 6 (총 9 ml)로 650 rpm에서 진탕기로 인큐베이션하였다. 이어서, 프로테인 메이커 (Protein Maker) (에메랄드 바이오 (Emerald Bio))를 사용하여 단백질 A 및 캅토 어드히어 (Capto Adhere) 수지로 단백질을 정제하였다.
추가 분석을 위한 약물 (DBCO-MMAF)과의 접합 및 항체 약물 접합체 (ADC)의 제조는 상기 설명한 바와 같이 수행하였다.
변이체의 써모플루오르 (Thermofluor) 분석을 이전에 설명된 바와 같이 수행하였다.
TAG 스캔 동안 및 중간 규모로 생성된 HC 변이체 F404는 우수한 세포-사멸능을 보였지만 (TAG 스캔 I: IC50 = 0.018 nM; 중간 규모: IC50 = 0.023 nM), 그의 HIC 프로파일을 기초로 한 DAR 추정은 피크의 낮은 분해능 때문에, 가능하게는 HIC 분석 동안 약물의 분석 칼럼에 대한 비접근성 때문에 문제가 있는 것으로 입증되었다. 그러나, MS 분석은 그의 DAR이 1.74임을 보여주었다. 또한, 써모플루오르 분석은 HC-F404의 ADC 형태가 항체 단독에 비해 개선된 (보다 높은 열 안정성) Tm1 (2.2℃ 증가)을 갖는다는 것을 보여주었다.
Figure pct00075
실시예 7
예시적인 항체-약물 접합체의 특성화: 방출 인자 분석
TAG 스캔 I 방법 및 선택된 변이체의 목록
앰버 중지 코돈에서 비-천연 아미노산의 삽입을 위해 오르토고날 CUA-코딩 tRNA를 발현하도록 또한 조작된 OmpT 감수성 RF-1 약화된 이. 콜라이 균주로부터 세포 비함유 단백질 합성 반응을 위해 사용된 세포 비함유 추출액을 제조하였다. DNA 주형의 첨가 후에, 세포 비함유 반응액을 30℃에서 12h 동안 플라워 플레이트 (m2p-labs # MTP-48-B)에서 650 rpm에서 진탕기로 인큐베이션하였다. 경쇄 변이체 (경쇄 상에 nnAA가 도입된 변이체)의 합성을 위해, 4 ㎍/ml의 경쇄 DNA 대 8 ㎍/ml의 중쇄 DNA의 DNA 비를 사용하였다. 각각의 트라스투주맙 변이체는 48-웰 플라워 플레이트에서 1 mL 규모로 1회 생산되었다. 총 6개의 플레이트가 변이체를 발현하기 위해 사용되었다.
4.2 ㎕/min의 유량으로 서서히 위에서 아래로 피펫으로 10회 옮겨 상청액을 40 ㎕ 수지를 함유하는 IMAC Phytip으로 포획하였다. 결합된 단백질을 125 ㎕ IMAC 용리 완충제 (50 mM Tris pH 8.0, 300 mM NaCl, 500 mM 이미다졸)로 용리하였다. 정제 이후, IMAC 정제된 변이체를 동일한 프로테인 익스프레스 랩칩 (Protein Express LabChip) (칼리퍼 라이프사이언시스 (Caliper LifeSciences) # 760499)에서 이동시킨 헤르셉틴®의 질량 표준물질과 비교함으로써 칼리퍼 GXII 시스템에서 정량하였다. 샘플 (샘플 완충제에서 혼합됨)을 칼리퍼 시스템에서 분석하기 전에 10분 동안 65℃에서 가열한 것을 제외하고는 프로테인 익스프레스 시약 키트 (칼리퍼 라이프사이언시스 # 760328)에 명시된 바와 같은 분석을 위해 샘플을 제조하였다.
추가 분석을 위한 약물 (DBCO-MMAF)과의 접합 및 항체 약물 접합체 (ADC)의 제조는 상기 설명한 바와 같이 수행하였다.
이들 특성화 실험의 양성 결과를 표 7에 제시한다. 표에서, 변이체의 하기 특성이 제시된다: 제조된 항체-약물 접합체의 최종 농도, HER2-발현 세포에 결합하는 능력, 약물-항체 비 (DAR, 항체당 세포독성제의 수로 표현됨), HIC 프로파일에 대한 코멘트, 및 상기 설명한 세포-사멸 검정으로부터 관찰된 IC50. HIC 검정에 대한 코멘트에서, SP는 단일 피크로서 잘 분해된 프로파일에 상응하고, NWR은 불량하게 분해된 프로파일에 상응하고, WR은 잘 분해된 HIC 프로파일에 상응한다. 단일 피크 프로파일을 보인 몇 개의 변이체는 또한 강력한 사멸을 보였고, 이것은 변이체가 실제로는 약물과 접합되었지만, HIC 칼럼에서 분해되지 않았음을 나타낸다.
Figure pct00076
Figure pct00077
바람직한 변이체는 중쇄 (HC)의 이들 위치를 교체하는 비-천연 아미노산을 갖는 것을 포함한다: A023, A084, A118, S119, T135, S136, G137, S160, G161, A162, T164, T195, T197, S219, V282, T289, Y296, A330, T335, N361, S400, F404, V422, S440, T260, S267, H268, E272, K274, R292, E293, N297, S298, V303, V305, I332, E333, K334, K340, G341, Q342, P343, R355, Q362, Q386, K392, F404, S424, Q438, S442 및 L443.
DAR이 적어도 약 0.7인 변이체도 바람직하다. 바람직한 변이체는 중쇄 (HC)의 이들 위치를 교체하는 비-천연 아미노산을 갖는 것을 포함한다: A023, A084, A118, S119, T135, S136, G137, S160, G161, A162, T164, T195, T197, S219, V282, Y296, T335, N361, V422, S440, S267, E272, K274, E293, N297, S298, V303, V305, K334, K340, G341, Q342, P343, R355, Q362, K392, F404, S424, Q438, S442 및 L443.
DAR이 적어도 약 1.0인 변이체도 바람직하다. 보다 더 바람직한 변이체는 중쇄의 이들 위치를 교체하는 비-천연 아미노산을 갖는 것을 포함한다: A023, A084, A118, S119, T135, S136, G137, S160, G161, A162, T164, T195, T197, S219, V282, Y296, N361, V422, S440, S267, E272, E293, N297, S298, V303, V305, K334, K340, G341, Q342, R355, Q362, K392, F404, S424, Q438, S442 및 L443.
DAR이 적어도 약 1.2인 변이체도 바람직하다. 보다 더 바람직한 변이체는 중쇄의 이들 위치를 교체하는 비-천연 아미노산을 갖는 것을 포함한다: A023, A084, A118, S119, T135, S136, G137, S160, G161, A162, T195, T197, S219, V282, Y296, V422, S440, S267, E272, E293, N297, S298, V303, V305, K334, K340, G341, Q342, R355, K392, F404, S424, Q438, S442 및 L443.
DAR이 적어도 약 1.5인 변이체도 바람직하다. 보다 더 바람직한 변이체는 중쇄의 이들 위치를 교체하는 비-천연 아미노산을 갖는 것을 포함한다: A023, A084, A118, S119, T135, S136, S160, A162, T195, S219, V282, Y296, S267, E293, N297, S298, V303, V305, K334, K340, G341, K392, F404, 및 Q438.
실시예 8
예시적인 항체-약물 접합체의 특성화: 추가의 방출 인자 분석
TAG 스캔 II 방법 및 선택된 변이체의 목록
앰버 중지 코돈에서 비-천연 아미노산 (p-아지도-페닐알라닌)의 삽입을 위해 오르토고날 CUA-코딩 tRNA를 생산하도록 또한 조작된 OmpT 감수성 RF-1 약화된 이. 콜라이 균주로부터 세포 비함유 단백질 합성 반응을 위해 사용된 세포 비함유 추출액을 제조하였다. DNA 주형의 첨가 후에, 세포 비함유 반응액을 30℃에서 12h 동안 플라워 플레이트 (m2p-labs # MTP-48-B)에서 650 rpm에서 진탕기로 인큐베이션하였다. 경쇄 변이체 (경쇄 상에 nnAA가 도입된 변이체)의 합성을 위해, 4 ㎍/ml의 경쇄 DNA 대 8 ㎍/ml의 중쇄 DNA의 DNA 비를 사용하였다. 각각의 트라스투주맙 변이체는 48-웰 플라워 플레이트에서 1 mL 규모로 1회 생산되었다. 총 6개의 플레이트가 변이체를 발현하기 위해 사용되었다.
4.2 ㎕/min의 유량으로 서서히 위에서 아래로 피펫으로 10회 옮겨 상청액을 40 ㎕ 수지를 함유하는 IMAC Phytip으로 포획하였다. 결합된 단백질을 125 ㎕ IMAC 용리 완충제 (50 mM Tris pH 8.0, 300 mM NaCl, 500 mM 이미다졸)로 용리하였다. 정제 이후, IMAC 정제된 변이체를 동일한 프로테인 익스프레스 랩칩 (칼리퍼 라이프사이언시스 # 760499)에서 이동시킨 헤르셉틴®의 질량 표준물질과 비교함으로써 칼리퍼 GXII 시스템에서 정량하였다. 샘플 (샘플 완충제에서 혼합됨)을 칼리퍼 시스템에서 분석하기 전에 10분 동안 65℃에서 가열한 것을 제외하고는 프로테인 익스프레스 시약 키트 (칼리퍼 라이프사이언시스 # 760328)에 명시된 바와 같은 분석을 위해 샘플을 제조하였다.
추가 분석을 위한 약물 (DBCO-MMAF)과의 접합 및 항체 약물 접합체 (ADC)의 제조는 상기 설명한 바와 같이 수행하였다.
이들 특성화 실험의 양성 결과를 표 8에 제시한다. 표에서, 변이체의 하기 특성이 제시된다: 제조된 항체-약물-접합체의 최종 농도, 야생형에 비해 전장 생성물의 발현 효율 (억제 효율), HER2-발현 세포에 결합하는 능력, 약물-항체 비 (DAR, 항체당 세포독성제의 수로 표현됨), HIC 프로파일에 대한 코멘트, 및 상기 설명한 세포-사멸 검정으로부터 관찰된 IC50. HIC 검정에 대한 코멘트에서, SP는 단일 피크로서 잘 분해된 프로파일에 상응하고, NWR은 불량하게 분해된 프로파일에 상응하고, WR은 잘 분해된 HIC 프로파일에 상응한다. 단일 피크 프로파일을 보인 몇 개의 변이체는 또한 강력한 사멸을 보였고, 이것은 변이체가 실제로는 약물과 접합되었지만, HIC 칼럼에서 분해되지 않았음을 나타낸다.
종합적으로, 269 부위에 비-천연 아미노산을 갖는 트라스투주맙 변이체가 설명된 활성에 대해 스크리닝되었다. 표 8은 바람직한 DAR, 발현 프로파일, 억제 효율, 및/또는 IC50 값을 갖는 71개의 변이체를 제시한다. 이들 특성 중 어느 것도 시험 전에 예측할 수 없었고, 각각의 개별적인 특성에 대한 값이 여러 번 샘플 내에서 예측할 수 없게 변하였다. 예를 들어, 일반적으로 높은 DAR을 갖는 변이체가 낮은 DAR을 갖는 것보다 더 낮은 IC50 값을 보일 것으로 예상될 것이다. 그럼에도 불구하고, 예를 들어 I51 변이체는 0.6의 비교적 낮은 DAR을 보였지만, 1 ng/ml의 IC50을 보였다.
Figure pct00078
Figure pct00079
Figure pct00080
바람직한 변이체는 중쇄 (HC)의 이들 위치를 교체하는 비-천연 아미노산을 갖는 것을 포함한다: G042, Q003, S007, P014, G016, R019, S025, A040, K043, I051, Y052, T053, Y056, S070, N082A, D098, F100, T110, S112, K121, Y180, S184, S190, S192, K214, E216, D221, K222, T225, P227, P230, A231, P232, 및 G236.
DAR이 적어도 약 0.7인 변이체도 바람직하다. 바람직한 변이체는 중쇄 (HC)의 이들 위치를 교체하는 비-천연 아미노산을 갖는 것을 포함한다: G042, Q003, S007, P014, G016, R019, S025, A040, K043, Y052, T053, Y056, S070, N082A, F100, T110, S112, K121, Y180, S190, S192, K214, E216, D221, K222, T225, P227, P230, A231, P232, 및 G236.
DAR이 적어도 약 1.0인 변이체도 바람직하다. 보다 더 바람직한 변이체는 중쇄의 이들 위치를 교체하는 비-천연 아미노산을 갖는 것을 포함한다: G042, Q003, S007, P014, G016, R019, S025, A040, K043, Y052, T053, Y056, S070, N082A, F100, T110, S112, K121, Y180, S190, S192, K214, E216, D221, K222, T225, P227, P230, A231, P232, 및 G236.
DAR이 적어도 약 1.2인 변이체도 바람직하다. 보다 더 바람직한 변이체는 중쇄의 이들 위치를 교체하는 비-천연 아미노산을 갖는 것을 포함한다: G042, Q003, S007, P014, GO16, R019, S025, A040, K043, Y052, S070, N082A, F100, T110, S112, K121, Y180, S190, S192, K214, E216, D221, K222, T225, P227, P230, A231, P232, 및 G236.
DAR이 적어도 약 1.5인 변이체도 바람직하다. 보다 더 바람직한 변이체는 중쇄의 이들 위치를 교체하는 비-천연 아미노산을 갖는 것을 포함한다: S007, P014, R019, S025, A040, K043, Y052, S070, F100, T110, S112, K121, Y180, K214, E216, K222, P227, P230, A231, P232, 및 G236.
바람직한 변이체는 경쇄 (LC)의 이들 위치를 교체하는 비-천연 아미노산을 갖는 것을 포함한다: -1, Q003, T005, S007, P008, S009, S010, G016, D017, R018, T020, T022, S026, Q027, K045, V058, S063, S065, R066, D070, S077, Q079, K107, N138, R142, E143, N152, S171, S182, K188, Q199, 및 L201.
DAR이 적어도 약 0.7인 변이체도 바람직하다. 바람직한 변이체는 경쇄의 이들 위치를 교체하는 비-천연 아미노산을 갖는 것을 포함한다: -1, Q003, T005, S007, P008, S009, G016, D017, R018, T020, T022, S026, Q027, K045, V058, S063, S065, R066, D070, S077, Q079, K107, R142, E143, N152, S171, S182, K188, Q199, 및 L201.
DAR이 적어도 약 1.0인 변이체도 바람직하다. 보다 더 바람직한 변이체는 경쇄의 이들 위치를 교체하는 비-천연 아미노산을 갖는 것을 포함한다: -1, Q003, T005, S007, P008, S009, G016, D017, R018, T020, T022, S026, Q027, K045, V058, S063, S065, R066, D070, S077, Q079, K107, R142, N152, S171, S182, K188, 및 Q199.
DAR이 적어도 약 1.2인 변이체도 바람직하다. 보다 더 바람직한 변이체는 경쇄의 이들 위치를 교체하는 비-천연 아미노산을 갖는 것을 포함한다: -1, T005, S007, P008, G016, D017, R018, T020, T022, Q027, K045, V058, S063, S077, Q079, K107, R142, N152, S182, K188, 및 Q199.
DAR이 적어도 약 1.5인 변이체도 바람직하다. 보다 더 바람직한 변이체는 경쇄의 이들 위치를 교체하는 비-천연 아미노산을 갖는 것을 포함한다: -1, G016, S063, 및 Q199.
실시예 9
예시적인 항체-약물 접합체의 특성화: 규모 확대 분석
TAG II 스캔으로부터 선택된 변이체의 규모 확대
DAR 및 세포-사멸 데이터를 기초로 하여, 목적하는 특징을 갖는 트라스투주맙 변이체의 하위세트를 추가의 특성화를 위한 물질을 생성하기 위한 소규모 세포 비함유 발현을 위해 선발하였다. 소규모 생산을 위해 선택된 중쇄 변이체는 다음과 같았다: R019, S025, I051, S070, D098, T110, S112, K121, S136, Y180, S187, S190, K214, E216, D221, 및 K222. 소규모 생산을 위해 선택된 경쇄 변이체는 다음과 같았다: (-)1, S007, P008, G016, T022, S063, R014, D070, N138, R142, E143 및 N152.
변이체가 합성된 세포 비함유 반응 혼합물은 OmpT 감수성 RF-1 약화된 이. 콜라이 균주로부터 제조된 비함유 추출액 및 각각 오르토고날 CUA 코딩 tRNA를 발현하도록 조작된 OmpT 감수성 RF-1 약화된 이. 콜라이 균주의 80%:20% 블렌드로 이루어졌다. 모든 변이체는 플라워 플레이트에서 9 ml까지 확대되었고 (1.5 mL X 6회 반복), 프로테인 메이커 (에메랄드 바이오)를 사용하여 정제하였다.
추가 분석을 위한 약물 (DBCO-MMAF)과의 접합 및 항체 약물 접합체 (ADC)의 제조는 상기 설명한 바와 같이 수행하였다.
이들 특성화 실험의 양성 결과를 표 9에 제시한다. 표에서, 변이체의 하기 특성이 제시된다: 제조된 항체-약물-접합체의 최종 농도, 야생형에 비해 전장 생성물의 발현 효율 (억제 효율), HER2-발현 세포에 결합하는 능력, 약물-항체 비 (DAR, 항체당 세포독성제의 수로 표현됨), HIC 프로파일에 대한 코멘트, 및 상기 설명한 세포-사멸 검정으로부터 관찰된 IC50. HIC 검정에 대한 코멘트에서, SP는 단일 피크로서 잘 분해된 프로파일에 상응하고, NWR은 불량하게 분해된 프로파일에 상응하고, WR은 잘 분해된 HIC 프로파일에 상응한다.
Figure pct00081
실시예 10
예시적인 항체-약물 접합체의 특성화: 써모플루오르 분석
변이체의 써모플루오르 분석을 이전에 설명한 바와 같이 수행하였다. 써모플루오르 결과를 표 10에 제시한다.
Figure pct00082
써모플루오르 분석에 적용된 변이체는 중쇄의 이들 위치를 교체하는 비-천연 아미노산을 갖는 것을 포함하였다: R019, S025, I051, S070, T077, Y079, D098, T110, S112, K121, S136, Y180, S187, S190, K214, E216, D221, 및 K222.
써모플루오르 분석에 적용된 변이체는 또한 경쇄의 이들 위치를 교체하는 비-천연 아미노산을 갖는 것을 포함하였다: -1, S007, P008, GO16, T022, S063, D070, N138, R142, E143, N152, 및 L201.
실시예 11
예시적인 항체-약물 접합체의 특성화: 동역학 분석
선택된 변이체의 접합 동역학
접합 속도는 넓은 범위의 약물 대 항체 접합체 비를 보여준 5개의 변이체에 대해 결정하였다. 15 min, 30 min, 1hr, 2hr, 4hr, 8hr 및 16hr 동안 이중으로 20℃에서 PBS (pH7.4) 내의 약물 (DBCO-MMAF)과 변이체의 혼합물에 의해 반응을 개시시켰다. 혼합물 내의 항체의 최종 농도는 0.2 내지 2 μM이다. 모든 반응에 대한 최종 약물 농도는 100 μM이다. 인큐베이션 기간의 끝에, 아지드화나트륨을 혼합물에 10 mM의 최종 농도로 첨가하였다. 최종 혼합물을 이전에 설명된 바와 같이 제바 및 무스탕Q 플레이트에 의해 정제하였다. IgG의 농도는 질량 표준으로서 헤르셉틴을 사용하여 칼리퍼에 의해 결정하였다. 완전히 접합된 변이체의 분획은 이전에 설명된 바와 같이 HIC에 의해 결정하였다.
Figure pct00083
도 5a및 5b는 2개의 변이체 (HC T110 및 HC S112)의 예시적인 HIC 트레이스를 제공한다. 트레이스는 비접합된 IgG, 단일 접합된 IgG 및 완전히 접합된 IgG에 상응하는 3개의 피크 (P0, P1 및 P2)를 보여준다.
도 6a 내지 6e는 접합이 파라-아지도 페닐알라닌 (pAzF) 변이체의 접합이 부위-특이적임을 보여준다. 총 단일 및 완전히 접합된 항체의 비율은 HIC에 의해 분해되었다.
실시예 12
예시적인 항체-약물 접합체의 특성화: 억제 비교 분석
파라-아지도 페닐알라닌 (pAzF) 및 파라-아지도 메틸 페닐알라닌 (pAzMeF)에 의한 억제의 비교
광범한 억제 효율을 갖는 11개의 변이체를 문헌 [Zawada et al., 2011, Biotechnol. Bioeng. 108(7): 1570-1578]에 기재된 바와 같이 수행하되 아래와 같이 변형한 세포-비함유 단백질 합성 반응에서 발현시켰다. 비치환된 트라스투주맙을 또한 대조군으로 제조하였다. tRNA 및 OmpT 감수성 RF1 (균주 16/23의 80/20 블렌드)을 함유하는 세포 비함유 추출액을 50 μM 아이오도아세트아미드로 30 min 동안 RT (20℃)에서 처리하고, GSSG, 비-천연 아미노산, tRNA 합성효소, T7 RNAP, DsbC, PDI, 및 주형 DNA를 제외한 모든 다른 성분을 함유하는 사전혼합물에 첨가하였다. 이어서, DNA를 제외한 모든 잔여 시약을 혼합물에 첨가하였다. 세포 미함유 반응을 선택된 변이체의 플라스미드 DNA의 첨가에 의해 개시시키고, 96-웰 플레이트에서 진탕기에서 450 rpm에서 30℃에서 12h 동안 인큐베이션하였다. 반응액을 4℃에서 5h 동안 추가로 인큐베이션하였다. 단백질 합성 반응액 내의 최종 농도는 30% 세포 추출액, 0.37 mg/mL 엠 자나쉬이 pAzF-특이적 아미노-아실 tRNA 합성효소 (FRS)와 함께 1 mM 파라-아지도 페닐알라닌 (pAzF) (RSP 아미노 애시즈), 또는 0.37 mg/mL p-시아노페닐알라닌 특이적 아미노아실-tRNA 합성효소와 함께 1 mM 파라-아지도 메틸 페닐알라닌 (pAzMeF) (Young et al., 2011, Biochem. 50: 1894-1900), 2 mM GSSG, 0.29 mg/mL PDI (Mclab), 100 ㎍/mL 이. 콜라이 DsbC, 8 mM 마그네슘 글루타메이트, 10 mM 암모늄 글루타메이트, 130 mM 칼륨 글루타메이트, 35 mM 나트륨 피루베이트, 1.2 mM AMP, 0.86 mM의 각각의 GMP, UMP, 및 CMP, 2 mM 아미노산 (예외적으로 티로신 및 페닐알라닌은 0.5 mM), 4 mM 옥살산나트륨, 1 mM 푸트레신, 1.5 mM 스페르미딘, 15 mM 인산칼륨, 100 nM T7 RNAP, 2 ㎍/mL 트라스투주맙 경쇄 DNA, 8 ㎍/mL 트라스투주맙-(His)6 중쇄 DNA이었다. 각각의 트라스투주맙 변이체는 각각의 변이체에 대해 14C를 사용하여 100 ㎕ 규모로 96-웰 플레이트에서 이중으로 생산되었다. 이와 같이 생산된 모든 트라스투주맙 변이체는 비글리코실화됨을 이해하여야 한다.
단백질 합성을 모니터링하기 위해, 반응물을 3% (v/v) l-[U-14C]-류신 (300 mCi/mmole; 지이 라이프 사이언시스, 미국 뉴저지주 피스카타웨이)로 스파이킹하였다. 중쇄 및 경쇄의 상이한 부위에서 앰버 코돈의 억제는 환원 SDS-PAGE 겔의 [14C]-자기 방사 기록법에 의해 결정하였다. 전장 트라스투주맙 중쇄 및 억제된 트라스투주맙 중쇄 변이체는 SDS-PAGE에서 50 kD로 이동하였다. 전장 트라스투주맙 경쇄 및 억제된 트라스투주맙 경쇄 변이체는 SDS-PAGE에서 30 kD로 이동하였다. 비억제된 (말단절단된) 트라스투주맙 변이체는 보다 낮은 분자량으로 이동하였다. 중쇄 또는 경쇄 내의 앰버 억제는 다음과 같이 결정한다:
Figure pct00084
밴드 강도는 ImageQuant (아머샴 바이오사이언시스 코프.; 미국 뉴저지주 피스카타웨이)에 의해 결정하였다. 도 7a에서, pAzF 및 pAzMeF 변이체의 억제 효율이 비교된다. 억제 효율은 야생형 HC 밴드 강도에 대한 변이체 HC 밴드 강도 또는 야생형 LC 밴드 강도에 대한 변이체 LC 밴드 강도로서 계산된다. 도 7b에서, pAzF 및 pAzMeF 변이체의 가용성 IgG 수득량이 비교된다. IgG의 양은 하기 식에 따라 계산된다: 가용성 수/총 수 * IgG 밴드 강도/총 레인 강도 * 2 * 74008.02 Da/47 류신.
실시예 13
또 다른 항체에 대한 비-천연 아미노산 도입 부위의 전달
비-천연 아미노산의 도입 부위가 예측가능한 DAR을 갖는 2개의 별개의 IgG 서열 사이에서 전달될 수 있는지 시험하기 위해, 대표적인 부위에 비-천연 아미노산을 함유하는 제2 항체를 평가하였다. 상기 실험을 위해, 브렌툭시맙을 제2 항체 (서열 3 및 서열 4 참조)로서 선택하였다. 몇 개의 부위를 상이한 DAR을 보이는 트라스투주맙 돌연변이 유발 연구로부터 선택하였다. 중쇄에서, 부위는 K121, Y180, K133, S157, F126, 및 P127 (EU 넘버링)에 상응하였다. 경쇄에서, 부위는 R142, N152, Q147, E161, K149, 및 Q155 (EU 넘버링)에 상응하였다. TAG 중지 코돈을 표준 신속 변화 기반 부위 지정 돌연변이 유발을 사용하여 브렌툭시맙 서열 내로 삽입하고, 각각의 변이체의 동일성을 DNA 서열결정에 의해 확인하였다. 미니 프렙 DNA를 세포 비함유 단백질 합성 반응을 유도하기 위한 주형으로서 사용하기 위해 퀴아겐 키트를 사용하여 제조하였다.
변이체는 OmpT 감수성 RF-1 단백질 및 생체내에서 발현된 오르토고날 CUA 코딩 tRNA를 함유하는 반응 혼합물에서 합성하였다. 모든 변이체는 플라워 플레이트에서 9 ml까지 확대되었고 (1.5 mL X 6회 반복), 프로테인 메이커 (에메랄드 바이오)를 사용하여 정제하였다.
추가 분석을 위한 약물 (DBCO-MMAF)과의 접합 및 항체 약물 접합체 (ADC)의 제조는 상기 설명한 바와 같이 수행하였다. DAR은 상기 설명한 바와 같은 HIC 프로파일링 방법에 의해 확인하였다.
실험 결과는 부위가 일반적으로 2개의 별개의 IgG 사이에서 예측가능하게 전달될 수 있음을 시사한다.
Figure pct00085
브렌툭시맙 접합체를 추가로 특성화하기 위해, 중쇄 위치 K121 또는 F404 또는 경쇄 위치 N152에 앰버 돌연변이를 함유하는 변이체를 규모 확대 및 추가의 특성화를 위해 선택하였다. 대조군으로서, F404에 앰버 돌연변이를 함유하는 트라스투주맙을 또한 발현시켰다. TAG 코돈은 중쇄 상의 위치 K121 및 F404 및 경쇄 상의 N152에 상응하는 뉴클레오티드에 중복 PCR 돌연변이 유발에 의해 삽입하고, 발현 벡터 pYD317 내로 클로닝하였다.
브렌툭시맙 및 트라스투주맙 변이체가 합성되는 세포 비함유 반응 혼합물은 OmpT 감수성 RF-1 약화된 이. 콜라이 균주로부터 제조된 세포 비함유 추출액, 및 앰버 중지 코돈에 비-천연 아미노산의 삽입을 위한 오르토고날 CUA-코딩 tRNA를 생산하도록 조작된 OmpT 감수성 RF-1 약화된 이. 콜라이 균주의 블렌드를 포함하였다. 변이체를 문헌 [Zawada et al., 2011, Biotechnol. Bioeng. 108(7)1570-1578]에 기재된 바와 같이 수행하되 아래와 같이 변형한 세포-비함유 단백질 합성 반응에서 발현시켰다. 세포 비함유 추출액을 50 μM 아이오도아세트아미드로 30 min 동안 RT (20℃)에서 처리하고, 관심있는 변이체를 코딩하는 DNA를 제외한 모든 다른 성분을 함유하는 사전혼합물에 첨가하였다. 단백질 합성 반응물 내의 최종 농도는 30% 세포 추출액, 1 mM 파라-아지도 메틸 페닐알라닌 (pAzMeF) (RSP 아미노 애시즈), 0.37 mg/mL 엠 자나쉬이 pAzMeF-특이적 아미노-아실 tRNA 합성효소 (FRS), 2 mM GSSG, 0.29 mg/mL PDI (Mclab), 30 ㎍/mL 이. 콜라이 DsbC, 8 mM 마그네슘 글루타메이트, 10 mM 암모늄 글루타메이트, 130 mM 칼륨 글루타메이트, 35 mM 나트륨 피루베이트, 1.2 mM AMP, 0.86 mM의 각각의 GMP, UMP, 및 CMP, 2 mM 아미노산 (예외적으로 티로신 및 페닐알라닌은 0.5 mM), 4 mM 옥살산나트륨, 1 mM 푸트레신, 1.5 mM 스페르미딘, 15 mM 인산칼륨, 100 nM T7 RNAP이었다. 하기 HC 대 LC의 플라스미드 비를 최적 조건을 발견하기 위해 시험하였다: 3:1, 2:1, 1:1 및 1:2. 총 플라스미드 농도는 10 ㎍/mL에서 일정하게 유지하였다. DNA 주형의 첨가 후에, 세포 비함유 반응액을 페트리 접시에서 30℃에서 12h 동안 인큐베이션한 후, 14C 검정 분석을 수행하였다. 최대 수득량은 1:1의 비에서 달성되었다. 10 mL 세포-비함유 반응을 상기 조건 하에 수행하였다.
변이체를 정제하기 위해, 각각의 변이체에 대해 10 ml의 조 세포-비함유물을 평형 완충제 (50 mM 인산나트륨, pH 7)로 1:0.5로 먼저 희석하고, 1l,000x g에서 30분 동안 원심분리하였다. 이어서, 상청액을 0.45 마이크로미터 주사기 필터에 통과시킨 후, IgG 변이체를 포획하기 위해 2분의 체류 시간으로 예비-평형화된 1 mL MabSelect Sure HiTrap (지이 라이프사이언시스 (GE Lifesciences)) 상에 로딩하였다. 이어서, 칼럼을 7.5 CV (칼럼 부피)의 세척 완충제 1 (100 mM 인산나트륨 및 800 mM 아르기닌, pH 7), 이어서 7.5 CV의 세척 완충제 2 (50 mM 인산나트륨 및 0.5% (v/v) Triton X-100, pH 7.3)으로 세척하였다. 7.5 CV의 평형 완충제로 세척한 후, 각각의 변이체를 4 CV 용리 완충제 (100 mM 시트르산나트륨 및 300 mM 아르기닌, pH 3)으로 용리하였다. 용리 풀 (pool)을 30% (v/v)의 1 M Tris, pH 9의 첨가에 의해 pH 7로 조정하였다.
수집된 용리 풀을 10 kD Slide-A-Lyzer (피어스 (Pierce)) 유닛에서 밤새 투석을 통해 PBS로 완충제를 교환하였다. 이어서, 투석된 물질을 아미콘 (Amicon) Ultra-15 (밀리포어) 원심분리 필터 유닛을 사용하여 5-10 mg/mL의 농도로 농축하였다.
정제된 변이체를 다음과 같이 접합하였다. DBCO-MMAF 2 (ACME 바이오사이언스; 미국 캘리포니아주 팔로 알토)를 DMSO에 5 mM의 최종 농도로 용해시켰다. 화합물을 PBS로 1 mM로 희석한 후, IMAC 용리 완충제 내의 정제된 트라스투주맙 변이체에 100 μM의 최종 약물 농도를 달성하도록 첨가하였다. 혼합물을 RT (20℃)에서 17시간 동안 인큐베이션하였다. 반응은 아지드화나트륨을 100 mM의 최종 농도로 첨가하여 중지시키고, 1X PBS 내에서 평형화된 제바 플레이트 (써모 사이언티픽; 미국 매사추세츠주 월섬)를 사용하여 완충제를 교환하였다.
비글리코실화된 변이체의 DAR을 다음과 같이 LC-MS에 의해 결정하였다. LCMS에 의한 ADC 샘플을 Xevo QTOF에 연결된 Waters Aquity UPLC 시스템에서 이동시켰다. 단백질을 애질런트 PLRP-S 칼럼 (2.3x50 mm, 5 ㎛, 4000Å)에서 80℃에서 분리하였다. 이동상: A: 0.1% 포름산 물; b: 20:80 이소프로판올:아세토니트릴, 0.1% 포름산. 샘플을 10%B에서 0.4분, 이어서 7분에 걸쳐 30%B로부터 40%B, 3분에 걸쳐 40%B로부터 60%B로의 단계 구배에 의해 칼럼에서 탈염하였다. 데이터는 35V의 콘 전압 (cone voltage)을 사용하여 전체 LC 용리에 대해 얻었다. 스펙트럼을 MassLynx 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. DAR 값은 가중 평균으로 계산하고, 표 13에 제시한다.
Figure pct00086
다음으로, 변이체의 세포 결합 및 세포 사멸 활성을 다음과 같이 측정하였다. Karpas299 및 L540 세포주는 독일 컬렉션 오브 마이크로오거니즘즈 앤드 셀 컬쳐스 (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures) (DSMZ)로부터 얻고, SKBR3 및 Raji 세포주는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (American Type Culture Collection, ATCC)으로부터 얻었다. 세포를 20% 열-불활성화된 태소 혈청 (하이클론; 써모 사이언티픽; 미국 매사추세츠주 월섬), 2 mM 글루타맥스 (인비트로겐; 미국 캘리포니아주 칼스바드) 및 1x 페니실린/스트렙토마이신 (셀그로-메디아테크; 미국 버지니아주 매나싸스)을 함유하는 RPMI 1650 배지 (셀그로-메디아테크;미국 버지니아주 매나싸스)에서 성장시켰다. 부착 SKBR3 세포를 10% 열-불활성화된 태소 혈청, 2 mM 글루타맥스 및 1x 페니실린/스트렙토마이신을 보충한 DMEM/뉴트리언트 (Nutrient) F-12 Ham (50:50) 고 글루코스 배지 (셀그로-메디아테크; 미국 버지니아주 매나싸스) 내에서 성장시켰다. 모든 세포를 37℃에서 5% C02 인큐베이터 내에서 성장시키고, 유지하였다. SKBR3을 칼슘/마그네슘-비함유 포스페이트 평형 염수 (PBS)로 세척하고, HyQTase (하이클론; 써모 사이언티픽; 미국 매사추세츠주 월섬)를 사용하여 수확하였다.
트라스투주맙 및 브렌툭시맙 (아드세트리스) 변이체의 세포 사멸 활성을 셀 타이터-글로® 세포 증식 검정을 사용하여 측정하였다. 간단히 설명하면, 104 현탁액 세포 또는 3x103 SKBR3 세포를 96-웰 1/2 영역 백색 TC-처리 플레이트에 40 ㎕/웰로 도말하고, 항체에 첨가하기 전에 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 항체를 각각의 세포 배양 배지에서 생산하고, 0.45 ㎛ 셀룰로스 아세테이트 코스타 스핀(Costar Spin)-X® 원심분리관 필터 (코닝 (Corning); 미국 매사추세츠주 ?스베리)로 필터-멸균하였다. 40 ㎕의 비접합된 항체, AB4285-접합된 항체 또는 AB4285 미함유 약물을 세포에 첨가하고, 각각 현탁액 세포 및 SKBR3 세포에 대해 3일 또는 5일 동안 배양하였다. 세포 생존율은 80 ㎕의 셀 타이터-글로® 시약 (프로메가 코프.; 미국 위스콘신주 매디슨)을 각각의 웰에 첨가하고, 제품 지시서에 따라 처리함으로써 측정하였다. 발광을 엔비젼® 플레이트 판독기 (퍼킨-엘머; 미국 매사추세츠주 월섬)로 측정하였다. 상대적인 발광 판독치를 대조군으로서 미처리 세포를 사용하여 % 생존율으로 전환하고, 항체 농도에 대해 플로팅하였다. IC50은 통계 소프트웨어 Prism (그래프패드 소프트웨어; 미국 캘리포니아주 샌 디에고)을 사용하여 비-선형 회귀식 log(억제제) vs. 반응 - 가변 기울기, 4 파라미터로부터 계산하였다. 결과를 도 8 및 9와 표 14에 제시한다.
Figure pct00087
트라스투주맙 및 브렌툭시맙 변이체의 세포 결합 친화도는 FACS-기반 검정을 사용하여 측정하였다. 간단히 설명하면, 0.5% 소 혈청 알부민 (BSA) (인비트로겐; 미국 캘리포니아주 칼스바드) 및 0.09% 아지드화나트륨 (시그마; 미국 미주리주 세인트루이스)을 함유하는 PBS로 이루어진 25 ㎕의 결합 완충제 내의 2x105 Karpas 299 또는 L540 세포를 96-웰 U자형 기저부 폴리프로필렌 플레이트 (그레이너 바이오-원 (Greiner Bio-One); 미국 노쓰캐롤라이나주 몬로)에 도말하였다. 항체를 결합 완충제 내에서 생산하고, 2배 연속 희석액을 별개의 96-웰 플레이트에 제조하였다. 등부피의 희석된 항체를 세포에 첨가하고, 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 200 ㎕의 결합 완충제로 2회 세척하여 미결합 항체를 제거하였다. 2차 항체 검출을 위해, 5 ㎍/ml 알렉사-488 접합된 염소 항-인간 IgG (인비트로겐; 미국 캘리포니아주 칼스바드)를 결합 완충제 내에 제조하고, 50 ㎕를 세포에 첨가하고, 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 2회 세척하고, 200 ㎕의 결합 완충제 내에 재현탁하고, 96-웰 자동 마이크로샘플러 (사이텍 (Cytek); 미국 캘리포니아주 프레몽트)가 구비된 BD FACScan® 유동 세포측정기 (사이텍; 미국 캘리포니아주 프레몽트)를 사용하여 분석하였다. 데이터를 FlowJo (트리 스타 (Tree Star); 미국 오레곤주 애쉬랜드)를 사용하여 얻고 분석하였다. 평균 형광 강도 판독치는 최대 평균 MFI 값에 정규화함으로써 % 결합으로 표현하고, 데이터를 항체 농도에 대해 플로팅하였다. 결합 친화도는 Prism 소프트웨어를 사용하여 비-선형 회귀 포화 결합식, 1 부위 - 총 결합으로부터 계산하였다. 결과를 도 10 및 표 15에 제시한다.
Figure pct00088
실시예 14: 대체 스캐폴드 내의 항체-약물 접합체: scFv 포맷
ADC에 대한 대체 스캐폴드로서 scFv를 사용할 수 있는 가능성을 입증하기 위해, 앰버 코돈이 존재하는 트라스투주맙 scFv (VL_VH)를 코딩하는 DNA를 발현 벡터 pYD317 내로 클로닝하였다. TAG 코돈은 위치 (-1)의 아미노산 세린에 상응하는 뉴클레오티드에서 중복 PCR 돌연변이 유발에 의해 삽입하였다.
scFv를 발현시키기 위해, 세포-비함유 추출액을 실온으로 해동하고, 50 μM 아이오도아세트아미드와 함께 30 min 동안 인큐베이션하였다. 8 mM 마그네슘 글루타메이트, 10 mM 암모늄 글루타메이트, 130 mM 칼륨 글루타메이트, 35 mM 나트륨 피루베이트, 1.2 mM AMP, 0.86 mM의 각각의 GMP, UMP, 및 CMP, 2 mM의 18개의 모든 아미노산 (티로신 및 페닐알라닌은 0.5 mM로 첨가됨), 4 mM 옥살산나트륨, 1 mM 푸트레신, 1.5 mM 스페르미딘, 15 mM 인산칼륨, 100 μM T7 RNAP, 1.3 μM 이. 콜라이 DsbC, 2 mM 산화된 (GSSG) 글루타티온, 10 ㎍/mL scFv 플라스미드, 15 μM 생체내에서 생산된 m.j. tRNA, 5 μM m.j RNA 합성효소 및 1 mM p아지도 페닐알라닌 (pN3F)와 함께 30% (v/v) 아이오도아세트아미드-처리 추출액을 함유하는 세포-비함유 반응물을 30℃에서 10 h까지 동안 이동시켰다. 야생형 scFv를 대조군으로서 발현시켰다.
scFv(-1)pN3F 및 야생형 scFv를 단백질 L, 이어서 SEC에 의해 정제하였다. 5 μM scFv (-1)을 도 1에 제시된 50 μM의 DBCO-MMAF 시약과 함께 16 hr 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 과량의 유리 약물을 제바 탈염 칼럼에 의해 제거하였다.
샘플을 정량하고 약물-항체 비를 결정하기 위해 소수성 상호작용 크로마토그래피를 다음과 같이 수행하였다. 샘플 및 표준물질을 밀리큐 물 내에 제조된 3 M 황산암모늄 (EMD 케미칼), 50 mM 인산나트륨 pH 7.0 (말린크로트)에 1:1로 희석하였다. 디오넥스 (Dionex) HPLC 시스템에는 칼럼 구획 온도가 30℃인 토소 바이오사이언스 엘엘씨 TSK-겔 부틸-NPR® (4.6 mm x 3.5 cm) 칼럼이 구비되었다. 이동상 A는 1.5 M 황산암모늄, 50 mM 인산나트륨, pH 7.0이었다. 이동상 B는 80:20의 물:이소프로필 알콜 (허니웰) 내의 50 mM 인산나트륨, pH 7.0이었다. 이동상은 1.0 mL/분의 유량으로 전달되었다. 10분 동안 15% 이동상 B로부터 100% 이동상 B로의 선형 구배로 분리를 수행하였다. UV 데이터를 214 nm에서 얻었다. 피크 면적은 크로멜레온 (Chromeleon) 소프트웨어 (써모)를 사용하여 정량하여 약물 항체 비 (DAR)를 계산하였다.
접합된 대체 스캐폴드 변이체의 결합을 평가하기 위해, HER2를 발현하는 세포에 대한 결합 검정을 다음과 같이 수행하였다. 세포당 1백5십만 개 초과의 수용체 카피를 갖는, HER2/c-erb-2 유전자 산물을 과다발현하는 SKBR3 세포 (ATCC # HTB-30, 미국 버지니아주 매나싸스) 상의 HER2에 대한 정제된 접합된 변이체의 결합을 임상 등급 헤르셉틴®, 세포-비함유 단백질 합성에 의해 생산된 비글리코실화된 트라스투주맙, 또는 음성 대조군으로서 인간 혈청 IgG1 (시그마-알드리치; 미국 미주리주 세인트루이스)과 비교하였다. SKBR3 세포를 10% 열-불활성화된 태소 혈청 (하이클론; 써모 사이언티픽; 미국 매사추세츠주 월섬), 2 mM 글루타맥스 (인비트로겐; 미국 캘리포니아주 칼스바드) 및 1x 페니실린/스트렙토마이신 (셀그로-메디아테크; 미국 버지니아주 매나싸스)을 보충한 DMEM:Ham의 F-12 (50:50), 고 글루코스 (셀그로-메디아테크; 미국 버지니아주 매나싸스) 내에서 배양하였다. 부착 세포를 칼슘 및 마그네슘-비함유 행크 평형 염 용액 (HBSS)으로 2회 세척하고, HYQ®TASE™ (하이클론; 써모 사이언티픽; 미국 매사추세츠주 월섬)으로 수확하였다. 총 10 ㎕의 부피 내의 샘플당 총 200,000개의 세포를 10 ㎕ FACS 완충제 (1% 소 혈청 알부민을 보충한 DPBS 완충제) 내에 제조된 접합된 대체 트라스투주맙 변이체, 임상 등급 헤르셉틴®, 또는 비글리코실화된 트라스투주맙의 연속 희석액과 함께 인큐베이션하였다. 세포 + 항체 또는 ADC를 60분 동안 얼음 상에서 인큐베이션하였다. 비염색된 세포, 인간 IgG1 (이소형 대조군) 및 2차 항체 (염소 항-인간 IgG)를 대조군으로 사용하였다. 헤르셉틴® 또는 비글리코실화된 트라스투주맙 결합을 검출하기 위해, 세포를 빙냉 FACS 완충제로 2회 세척하고, 5 ㎍/ml 알렉사 647 표지된 염소 항-인간 IgG 2차 항체 (인비트로겐; 미국 캘리포니아주 칼스바드)와 함께 얼음 상에서 1 hr 동안 인큐베이션하였다. 대체 스캐폴드 변이체 세포 결합은 5 ㎍/ml 알렉사 647 표지된 단백질 L (피어스) 또는 알렉사 647로 표지된 염소 항-인간-Fc (인비트로겐; 미국 캘리포니아주 칼스바드)와 함께 세포를 얼음 상에서 1h 동안 인큐베이션함으로써 검출하였다. 모든 샘플을 FACS 완충제를 사용하여 세척하고, BD FACS 캘리버 시스템 (비디 바이오사이언시스; 미국 캘리포니아주 산 호세)을 이용하여 분석하였다.
평균 형광 강도는 그래프패드 프리즘 (그래프패드 v 5.00, 소프트웨어; 미국 캘리포니아주 샌 디에고)을 사용하여 하나의 부위 특이적 결합 식을 이용한 비-선형 회귀 분석에 의해 피팅하였다. 데이터는 상대적인 MFI vs. 항체 또는 항체 변이체의 농도 (nM)로 표현하였다.
다음으로, 접합된 대체 스캐폴드 변이체의 세포 사멸에 대한 효과를 다음과 같이 세포 증식 검정으로 측정하였다. SKBR3 세포를 ATCC로부터 입수하고, 10% 열-불활성화된 태소 혈청 (하이클론; 써모 사이언티픽; 미국 매사추세츠주 월섬), 2 mM 글루타맥스 (인비트로겐; 미국 캘리포니아주 칼스바드) 및 1x 페니실린/스트렙토마이신 (셀그로-메디아테크; 미국 버지니아주 매나싸스)을 보충한 DMEM:Ham의 F-12 (50:50), 고 글루코스 (셀그로-메디아테크; 미국 버지니아주 매나싸스) 내에 유지하였다. 부착 세포를 칼슘 및 마그네슘-비함유 행크 평형 염 용액 (HBSS)으로 2회 세척하고, HYQ®TASE™ (하이클론; 써모 사이언티픽; 미국 매사추세츠주 월섬)를 사용하여 수확하였다. 총 103 세포를 96-웰 1/2 영역 평저 백색 폴리스티렌 플레이트 내에 40 ㎕의 부피로 씨딩하였다. 세포를 밤새 37℃에서 C02 인큐베이터 내에서 부착시켰다. ADC 변이체를 DMEM/F12 배지에 2x 농도로 만들고, 멀티스크린HTS 96-웰 필터 플레이트 (밀리포어; 미국 매사추세츠주 빌러리카)를 통해 여과하였다. 필터 멸균된 접합된 대체 스캐폴드 변이체, 헤르셉틴, 또는 비글리코실화된 트라스투주맙을 처리 웰 내로 첨가하고, 플레이트를 37℃에서 C02 인큐베이터 내에서 120 hr 동안 배양하였다. 세포 생존율 측정을 위해, 80 ㎕의 셀 타이터-글로® 시약 (프로메가 코프.; 미국 위스콘신주 매디슨)을 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 제품 지시서에 따라 처리하였다. 상대적인 발광을 엔비젼® 플레이트 판독기 (퍼킨-엘머; 미국 매사추세츠주 월섬)로 측정하였다. 상대적인 발광 판독치를 대조군으로서 미처리 세포를 사용하여 % 생존율으로 전환하였다. 데이터를 그래프패드 프리즘 (그래프패드 v 5.00, 소프트웨어; 미국 캘리포니아주 샌 디에고)을 사용하여 log(억제제) vs. 반응 - 가변 기울기, 4 파라미터 피트 식을 이용한 비-선형 회귀 분석에 의해 피팅하였다. 데이터는 상대적인 세포 생존율, ATP 함량 % vs. ADC의 용량 (nM)으로 표현하였다.
HIC 분석, 세포 결합, 및 세포 사멸 실험의 결과를 표 16에 제시한다.
Figure pct00089
실시예 15: 대체 스캐폴드 내의 항체-약물 접합체: scFv-Fc 포맷
ADC에 대한 대체 스캐폴드로서 scFv-Fc를 사용할 수 있는 가능성을 입증하기 위해, 앰버 코돈이 존재하는 트라스투주맙 scFv-Fc (VL_VH_Fc)를 코딩하는 DNA를 발현 벡터 pYD317 내로 클로닝하였다. TAG 코돈은 위치 (-1), Fc R355, Fc N389, 및 Fc F404 (EU 인덱스 넘버링)의 아미노산 세린에 상응하는 뉴클레오티드에서 중복 PCR 돌연변이 유발에 의해 삽입하였다.
CFPS 반응 조건은 5 μM 효모 PDI를 첨가한 것을 제외하고는 실시예 14에 기재된 바와 동일하였다. 야생형 scFv Fc를 대조군으로서 발현시켰다.
비글리코실화된 scFv-Fc를 접합하기 위해, 단백질을 먼저 단백질 A, 이어서 SEC에 의해 정제하였다. scFv-Fc를 함유하는 5 μM pN3F를 50 μM DBCO-MMAF와 함께 16 hr 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 과량의 유리 약물을 제바 탈염 칼럼에 의해 제거하였다.
추가로, p아지도 메틸 페닐알라닌을 각각 R355, N389, 및 F404의 부위에 scFv Fc를 도입하였다. 반응 조건은 1 μM m.j. p시아노 FRS 및 1 mM p아지도 메틸 Phe을 사용하여 m.j. FRS 및 p아지도 Phe을 교체한 것을 제외하고, 실시예 14와 동일하였다. 이어서, 단백질 A 정제된 단백질을 DBCO-MMAF 시약 2 (DBCO-MMAF 2)와 접합하였다. DBCO-MMAF 2의 구조를 도 11에 제시한다.
다음으로, 다음과 같이 샘플을 정량하고 약물-항체 비를 결정하기 위해 LC-MS를 수행하였다. 샘플을 qTOF 질량 분광기 (애질런트 6520)에 연결된 액체 크로마토그래피 (CHIP-Cube nanoLC, 애질런트)에 의해 분석하였다. 단백질을 물 내의 0.1% 포름산 (용매 A) 및 아세토니트릴 + 이소프로필 알콜 내의 0.1% 포름산 (80:20 v/v, 용매 B)를 사용하여 역상 HPLC-Chip (PLRP-S, 4000Å, 5 μ; 농축 칼럼: 25 mm; 분리 칼럼: 150 mm x 75 ㎛)에서 분리하였다. 데이터를 MassHunter Qualitative 소프트웨어 (애질런트)로 처리하였다. 데이터를 표 17에 제시한다.
Figure pct00090
약물 링커 ADC 접합체의 생체내 안정성은 2 mg/kg의 각각의 scFv-Fc DBCO-MMAF 2 접합체를 베이지 누드 시드 (Beige nude Xid) 마우스에 투여함으로써 측정하였다. 혈장을 각각의 시점에 n=2 동물로부터 30 min, d3, d7, d14 및 d21에 말단 출혈에 의해 수집하였다. 총 순환 ScFv-FC ADC를 비오틴-(Fab)2 염소 항-인간 IgG, Fcγ 단편 특이적에 의해 포획하였다. 복합체를 스트렙타비딘 Mag 세파로스를 사용하여 침강시켰다. 포획된 복합체를 1% 포름산으로 세척하여 비특이적 결합을 제거하고 용리시켰다. 중화된 용리액을 완전한 LCMS에 의해 분석하였다. 그 결과는 scFv-Fc (N389) pN3CH2F DBCO-MMAF 2 및 scFv-Fc (R355) pN3CH2F DBCO-MMAF 2가 28일까지 안정함을 나타낸다.
다음으로, ScFv-Fc ADC의 약동학적 특성을 베이지 누드 시드 마우스에서 분석하였다. 동물에게 약 2.0 mg/kg의 scFv-Fc R355 및 scFv-Fc N389의 용량 수준으로 정맥내 투여하였다. 28일에 채취한 샘플의 혈장 농도는 면역검정에 의해 결정하고, 약동학 파라미터는 WinNonlin 'v' 5.2 (파사이트 (Pharsight), 미국 캘리포니아주)를 사용한 비-구획 방식 (compartmental approach)에 의해 계산하였다. 결과를 도 12에 제시한다.
scFc-Fc ADC의 생체내 효율을 평가하기 위해서, KPL-4 인간 유방 종양 세포를 SCID 베이지 마우스 (찰스 리버 래보래토리즈 (Charles River Laboratories))의 유방 지방체 내로 접종하였다. 배양 배지와 혼합한 50% 페놀레드-비함유 마트리겔 (Matrigel) (벡톤 디킨슨 바이오사이언스 (Becton Dickinson Bioscience)) 내에 현탁시킨 마우스당 총 3 백만 개의 세포를 주사하였다. 종양 크기에 도달한 후, 각각의 군에 대한 평균 종양 부피가 100-150 mm3가 되도록 모든 동물을 무작위로 치료 군으로 지정하였다.
트라스투주맙 30 mg/kg을 (치료 제0일에 단일 주사), 이어서 3주 동안 주당 15 mg/kg을 i.p. 투여하였다. 비글리코실화된 트라스투주맙 2nnAA 변이체 scFv-Fc N389 DBCO-MMAF 2 15 mg/kg (872 ㎍ MMAF/m2, DAR 1.901), 비글리코실화된 트라스투주맙 2nnAA 변이체 HC-S136 (15 mg/kg) (비접합된) 비히클 (PBS) 및 유리 약물 (0.54 mg/kg)을 i.v 투여하였다 (치료 제0일에 단일 주사). 상기 실험 결과를 도 13a에 제시한다.
또 다른 실험에서, scFv-Fc F404 vL-vH DBCO-MMAF 2 (15 mg/kg), scFv-Fc F404 vH-vL DBCO-MMAF 2 (15 mg/kg), 트라스투주맙-CF HC F404 DBCO-MMAF 2 (15 mg/kg), 트라스투주맙-CF (15 mg/kg), 및 비히클을 제0일에 단일 i.v. 주사에 의해 투여하였다. 상기 실험 결과를 도 13b에 제시한다.
두 실험 모두에서, 모든 치료 군은 군당 10마리의 동물로 이루어졌고, 종양 크기는 캘리퍼스 측정을 사용하여 매주 2회 모니터링하였다. 마우스를 표준 설치류 미세격리 우리 (microisolator cage)에 수용하였다. 동물 방에 대한 환경 제어는 70℉의 온도, 40% 내지 60%의 상대 습도, 및 대략 14-h 명/10-h 암 주기를 유지하도록 설정되었다.
상기 실험 결과는 위치 N389 및 F404에서 접합된 ADC가 동물에서 종양 크기를 지속적으로 퇴행시키기 위해 효과적임을 입증한다. 특히, F404 scFv-Fc 접합체는 기준선 미만의 퇴행을 달성하였고, 이것은 고형 종양 모델에서 상기 스캐폴드에 대한 특정 효율을 입증한다.
실시예 16: CD74 및 Her2 에 특이적이고 추가의 예시적인 링커- 워헤드 ( warhead ) 조합을 갖는 예시적인 ADC
본 실시예는 CD74에 특이적이고 본원에서 설명되는 상이한 예시적인 링커-워헤드 조합을 함유하는 항체로 제조된 예시적인 항체-약물 접합체를 제공한다. 본 실시예는 특정 링커-워헤드 조합과 접합된 트라스투주맙으로 제조된 예시적인 항체-약물 접합체를 추가로 제공한다.
본 실시예에 사용된 항-CD74 항체의 중쇄 및 경쇄의 단백질 서열을 각각 서열 5 및 6에 제시한다. 중쇄 서열은 정제를 돕기 위한 6-His C-말단 태그를 포함한다. HC K212, HC S136, HC F241, HC F404, LCS7, 또는 LC N152를 코딩하는 위치에 앰버 코돈은 실시예 13에 기재된 방법을 사용하여 도입하였다. p-메틸아지도-Phe을 함유하는 항-CD74 항체를 실시예 13에 기재된 방법을 사용하여 발현시키고 정제하였다. 위치 HC S136 또는 HC F404에 p-메틸아지도-Phe을 함유하는 트라스투주맙 변이체도 실시예 13에 기재된 바와 같이 발현시키고 정제하였다.
다음으로, 항-CD74 또는 트라스투주맙 변이체를 DBCO-MMAF 2 (도 11a), DBCO-DM4 (도 11b), DBCO-DM4 2 (도 11c), 또는 DBCO-MMAE (도 11d)와 접합하였다. 항체 변이체와 링커-워헤드 조합 사이의 접합 반응을 수행하기 위해 사용된 방법은 실시예 13에 기재된 바와 같았다.
이어서, ADC의 약물-항체 비 (DAR)를 실시예 13에 기재된 방법에 따라 LC-MS에 의해 결정하였다. 항-CD74 샘플에 대한 LC-MS 방법이 상기 항체에 대해 최적화되지 않았고; 분석 결과는 비접합된 종과 중첩되고 이들 샘플의 DAR을 인위적으로 저하시키는 피크를 함유함을 유의하여야 한다. 따라서, 본 실시예에서 제조된 ADC 변이체의 DAR은 실시예 1-15에서 논의된 상응하는 부위에 nnAA를 함유하는 ADC와 잘 일치하였다. DAR 분석 결과를 아래 표 18에 제시한다.
다음으로, ADC 변이체를 그의 IC50 값을 결정하기 위해서 세포 사멸 실험에 사용하였다. 트라스투주맙 변이체를 실시예 13에 기재된 바와 같이 분석하였다. 접합된 항-CD74 변이체의 세포 사멸에 대한 효과를 세포 증식 검정에 의해 측정하였다. SU-DHL-6 및 NCI-H929 세포를 ATCC로부터 입수하고, 20% 열-불활성화된 태소 혈청 (하이클론; 써모 사이언티픽; 미국 매사추세츠주 월섬), 2 mM 글루타맥스 (인비트로겐; 미국 캘리포니아주 칼스바드) 및 1x 페니실린/스트렙토마이신 (셀그로-메디아테크; 미국 버지니아주 매나싸스)을 보충한 RPMI-1640 배지 (셀그로-메디아테크; 미국 버지니아주 매나싸스) 내에 유지하였다. SU-DHL-6 및 NCI-H929 수확하고, 배양 배지 내에 0.5x106 세포/mL의 최종 농도로 재현탁시켰다. 40 ㎕의 부피의 총 20x103 세포를 96-웰 1/2 영역 평저 백색 폴리스티렌 플레이트의 각각의 웰 내에 씨딩하였다. ADC 변이체를 RPMI-1640 완전 배지에 2x 농도로 만들고, 멀티스크린HTS 96-웰 필터 플레이트 (밀리포어; 미국 매사추세츠주 빌러리카)를 통해 여과하였다. 필터 멸균된 ADC를 처리 웰 내로 첨가하고, 플레이트를 37℃에서 C02 인큐베이터 내에서 72 hr 동안 배양하였다. 세포 생존율 측정을 위해, 80 ㎕의 셀 타이터-글로® 시약 (프로메가 코프.; 미국 위스콘신주 매디슨)을 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 제품 지시서에 따라 처리하였다. 상대적인 발광을 엔비젼® 플레이트 판독기 (퍼킨-엘머; 미국 매사추세츠주 월섬)로 측정하였다. 상대적인 발광 판독치를 대조군으로서 미처리 세포를 사용하여 % 생존율으로 전환하였다. 데이터를 그래프패드 프리즘 (그래프패드 v 5.00, 소프트웨어; 미국 캘리포니아주 샌 디에고)을 사용하여 log(억제제) vs. 반응 - 가변 기울기, 4 파라미터 피트 식을 이용한 비-선형 회귀 분석에 의해 피팅하였다. 데이터는 상대적인 세포 생존율, ATP 함량 % vs. ADC의 용량 (nM)으로 표현하였다. 세포 사멸 검정의 결과를 표 18에 제시한다.
Figure pct00091
실시예 17은 추가로 nnAA의 항체 내로의 도입 부위가 항체 사이에서 합리적으로 예측가능하게 전달될 수 있음을 입증한다. 또한, 링커 및 워헤드의 종류는 생성되는 ADC의 접합 효율 또는 DAR에 유의하게 영향을 주는 것으로 보이지 않고, 이것은 제시된 워헤드-링커 조합이 바람직한 부위 중의 하나에 비-천연 아미노산을 함유하는 항체에 접합될 수 있다는 합리적인 예측가능성을 보여준다.
본 명세서에 인용된 모든 간행물 및 특허, 출원은 각각의 개별적인 간행물 또는 특허 출원이 마치 구체적이고 개별적으로 참조로 포함된다고 나타낸 것처럼 본원에 참조로 포함된다. 특허청구된 대상은 다양한 실시양태의 측면에서 설명되었지만, 숙련된 당업자는 다양한 변형, 치환, 생략 및 변화가 그의 취지로부터 벗어나지 않으면서 이루어질 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 대상의 범위는 하기 청구의 범위에 의해서만 제한되고, 그의 균등물을 포함함이 의도된다.
서열 목록
Figure pct00092
Figure pct00093
Figure pct00094
SEQUENCE LISTING <110> THANOS, CHRISTOPHER D. MCEVOY, LESLIE YIN, GANG PENTA, KALYANI BALIGA, RAMESH BAJAD, SUNIL POLLITT, SONIA MURRAY, CHRIS STEINER, ALEX GILL, AVINASH <120> ANTIBODIES COMPRISING SITE-SPECIFIC NON-NATURAL AMINO ACID RESIDUES, METHODS OF THEIR PREPARATION AND METHODS OF THEIR USE <130> 108843.00009 <140> US 13/913,345 <141> 2013-06-07 <150> 61/725,433 <151> 2012-11-12 <150> 61/657,556 <151> 2012-06-08 <160> 8 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 449 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 1 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly <210> 2 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 2 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 3 <211> 451 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 3 Met Gln Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Val Val Lys Pro Gly 1 5 10 15 Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp 20 25 30 Tyr Tyr Ile Thr Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys 50 55 60 Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala 65 70 75 80 Phe Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe 85 90 95 Cys Ala Asn Tyr Gly Asn Tyr Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Gln Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu 180 185 190 Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr 195 200 205 Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 210 215 220 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 225 230 235 240 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 245 250 255 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 260 265 270 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 275 280 285 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Tyr Val Val Ser Val Leu Thr 290 295 300 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 305 310 315 320 Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 325 330 335 Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 340 345 350 Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 355 360 365 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 370 375 380 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 385 390 395 400 Phe Phe Lys Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 405 410 415 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 420 425 430 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Ser His His His 435 440 445 His His His 450 <210> 4 <211> 217 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 4 Met Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu 1 5 10 15 Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Phe 20 25 30 Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro 35 40 45 Pro Lys Val Leu Ile Tyr Ala Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala Arg 50 55 60 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His Pro 65 70 75 80 Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Glu 85 90 95 Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr 100 105 110 Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu 115 120 125 Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro 130 135 140 Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly 145 150 155 160 Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr 165 170 175 Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His 180 185 190 Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val 195 200 205 Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 5 <211> 463 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 5 Met Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser 20 25 30 Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Asp Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Val Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser 50 55 60 Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu 65 70 75 80 Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Gly Gly Thr Leu Val Arg Gly Ala Met Tyr Gly Thr Asp 100 105 110 Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 115 120 125 Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly 130 135 140 Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro 145 150 155 160 Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr 165 170 175 Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val 180 185 190 Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn 195 200 205 Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro 210 215 220 Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 225 230 235 240 Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 245 250 255 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 260 265 270 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 275 280 285 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn 290 295 300 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 305 310 315 320 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 325 330 335 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 340 345 350 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 355 360 365 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 370 375 380 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 385 390 395 400 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 405 410 415 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 420 425 430 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 435 440 445 Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Ser His His His His His His 450 455 460 <210> 6 <211> 215 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 6 Met Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 5 10 15 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser 20 25 30 Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu 35 40 45 Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro 85 90 95 Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 100 105 110 Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser 115 120 125 Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 130 135 140 Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser 145 150 155 160 Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 165 170 175 Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 180 185 190 Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys 195 200 205 Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 7 taatacgact cactatagg 19 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 8 gctagttatt gctcagcg 18

Claims (20)

  1. 카바트(Kabat) 또는 코티아(Chothia) 넘버링 방식에 따른 중쇄 또는 경쇄 잔기 H404, H121, H180, H241, L22, L7, L152, H136, H25, H40, H119, H190, H222, H19, H52 또는 H70으로 이루어진 군으로부터 선택된 특이적 부위에 하나 이상의 비-천연 아미노산 잔기 또는 그의 번역후 변형된 변이체를 갖는 폴리펩티드 쇄를 포함하는 항체.
  2. 제1항에 있어서, 카바트 또는 코티아 넘버링 방식에 따른 중쇄 또는 경쇄 잔기 H404, H121, H180, H241, L22, L7, L152, H136, H25, H40, H119, H190 및 H222로 이루어진 군으로부터 선택된 특이적 부위에 하나 이상의 비-천연 아미노산 잔기 또는 그의 번역후 변형된 변이체를 갖는 폴리펩티드 쇄를 포함하는 항체.
  3. 제1항에 있어서, 카바트 또는 코티아 넘버링 방식에 따른 중쇄 또는 경쇄 잔기 H404, H121, H180, H241, L22, L7, L152 및 H136으로 이루어진 군으로부터 선택된 특이적 부위에 하나 이상의 비-천연 아미노산 잔기 또는 그의 번역후 변형된 변이체를 갖는 폴리펩티드 쇄를 포함하는 항체.
  4. 제1항에 있어서, 서열 1에 대해 적어도 70%, 80% 또는 90% 상동성을 가지며 서열 1에 따른 대표적인 중쇄 폴리펩티드의 잔기 404, 121, 180, 241, 136, 25, 40, 119, 190, 222, 19, 52 또는 70에 상응하는 부위로 이루어진 군으로부터 선택된 특이적 부위에 하나 이상의 비-천연 아미노산 잔기 또는 그의 번역후 변형된 변이체를 갖는 폴리펩티드 쇄를 포함하는 항체.
  5. 제1항에 있어서, 서열 2에 대해 적어도 70%, 80% 또는 90% 상동성을 가지며 서열 2에 따른 대표적인 경쇄 폴리펩티드의 잔기 22, 7 및 152에 상응하는 부위로 이루어진 군으로부터 선택된 특이적 부위에 하나 이상의 비-천연 아미노산 잔기 또는 그의 번역후 변형된 변이체를 갖는 폴리펩티드 쇄를 포함하는 항체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드 쇄가 α, δ, ε 및 μ로 이루어진 군으로부터 선택된 유형의 중쇄인 항체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드 쇄가 λ 및 κ로부터 선택된 유형의 경쇄인 항체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, IgA, IgA, IgA2, IgD, IgE, IgG, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgM으로 이루어진 군으로부터 선택된 부류 또는 하위부류인 항체.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비-천연 아미노산 잔기가 아미노, 카르복시, 아세틸, 히드라지노, 히드라지도, 세미카르바지도, 술파닐, 아지도 및 알키닐로 이루어진 군으로부터 선택된 모이어티를 포함하는 것인 항체.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 비-천연 아미노산 잔기가 화학식
    Figure pct00095
    에 따르며, 식 중 각각의 L은 독립적으로 2가 링커이고, 각각의 R은 독립적으로 기능성 기인 항체.
  11. 제10항에 있어서, R이 반응성 기, 치료 모이어티 또는 표지 모이어티인 항체.
  12. 제10항에 있어서, 각각의 R이 아미노, 카르복시, 아세틸, 히드라지노, 히드라지도, 세미카르바지도, 술파닐, 아지도 및 알키닐로 이루어진 군으로부터 선택된 반응성 기인 항체.
  13. 제10항에 있어서, 각각의 L이 결합, 알킬렌, 치환된 알킬렌, 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌 및 치환된 헤테로아릴렌으로 이루어진 군으로부터 선택된 2가 링커인 항체.
  14. 하나 이상의 치료 모이어티 또는 표지 모이어티에 연결된 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 항체를 포함하는 항체 접합체.
  15. 제14항에 있어서, 하나 이상의 약물 또는 중합체에 연결된 상기 항체를 포함하는 항체 접합체.
  16. 제14항에 있어서, 하나 이상의 표지 모이어티에 연결된 상기 항체를 포함하는 항체 접합체.
  17. 제14항에 있어서, 하나 이상의 단일쇄 결합 도메인 (scFv)에 연결된 상기 항체를 포함하는 항체 접합체.
  18. 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 하나 이상의 링커를 통해 상기 하나 이상의 치료 모이어티 또는 표지 모이어티에 연결되는 것인 항체 접합체.
  19. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 항체를 포함하고, 실질적으로 순수한 조성물.
  20. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 항체를 포함하는 조성물이며, 상기 항체가 상기 조성물의 총 항체 질량의 적어도 95 질량%인 조성물.
KR1020157000097A 2012-06-08 2013-06-07 부위-특이적 비-천연 아미노산 잔기를 포함하는 항체, 그의 제조 방법 및 그의 사용 방법 KR102172897B1 (ko)

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EP (2) EP2859017B1 (ko)
JP (1) JP6498600B2 (ko)
KR (1) KR102172897B1 (ko)
CN (1) CN104583235B (ko)
AU (1) AU2013270684B2 (ko)
BR (1) BR112014030278A2 (ko)
CA (1) CA2875989A1 (ko)
DK (1) DK2859017T3 (ko)
ES (1) ES2718478T3 (ko)
HK (1) HK1203518A1 (ko)
HR (1) HRP20190475T1 (ko)
HU (1) HUE043552T2 (ko)
IL (1) IL236111B (ko)
PL (1) PL2859017T3 (ko)
SG (1) SG11201408161RA (ko)
SI (1) SI2859017T1 (ko)
WO (1) WO2013185115A1 (ko)

Families Citing this family (42)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9956275B2 (en) 2011-01-31 2018-05-01 Kai Yuan Xu Methods of inhibiting platelet aggregation and preventing thrombosis using antibodies that bind (Na++K+)-ATPase beta subunit
KR20150008171A (ko) * 2012-05-10 2015-01-21 자임워크스 인코포레이티드 단일군 일가 항체 구조물 및 그의 용도
EP2859017B1 (en) 2012-06-08 2019-02-20 Sutro Biopharma, Inc. Antibodies comprising site-specific non-natural amino acid residues, methods of their preparation and methods of their use
EP2863955B1 (en) 2012-06-26 2016-11-23 Sutro Biopharma, Inc. Modified fc proteins comprising site-specific non-natural amino acid residues, conjugates of the same, methods of their preparation and methods of their use
WO2014036492A1 (en) 2012-08-31 2014-03-06 Sutro Biopharma, Inc. Modified amino acids comprising an azido group
AU2014214751B2 (en) 2013-02-08 2017-06-01 Novartis Ag Specific sites for modifying antibodies to make immunoconjugates
WO2014124258A2 (en) * 2013-02-08 2014-08-14 Irm Llc Specific sites for modifying antibodies to make immunoconjugates
PL2991683T3 (pl) 2013-05-02 2020-03-31 Glykos Finland Oy Koniugaty glikoproteiny lub glikanu z toksycznym ładunkiem
US9764039B2 (en) 2013-07-10 2017-09-19 Sutro Biopharma, Inc. Antibodies comprising multiple site-specific non-natural amino acid residues, methods of their preparation and methods of their use
KR20160099081A (ko) 2013-07-26 2016-08-19 업데이트 파마 인코포레이트 비산트렌의 치료 효과 개선용 조합 방법
AU2014348487A1 (en) * 2013-11-13 2016-06-02 Zymeworks Inc. Methods using monovalent antigen binding constructs targeting HER2
EP3607996B1 (en) * 2014-04-25 2023-01-04 Pierre Fabre Medicament Antibody-drug-conjugate and its use for the treatment of cancer
WO2016090157A1 (en) 2014-12-04 2016-06-09 Celgene Corporation Biomolecule conjugates
EP3259285A2 (en) 2015-02-16 2017-12-27 Lonza Ltd Cl and/or ch1 mutated antibodies for drug conjugation
US9669106B2 (en) 2015-10-26 2017-06-06 Pierre Fabre Medicament Conjugate of monomethyl auristatin F and trastuzumab and its use for the treatment of cancer
MX2018009085A (es) 2016-01-27 2019-05-09 Sutro Biopharma Inc Conjugados de anticuerpos anti-cd74, composiciones que comprenden conjugados de anticuerpos anti-cd74 y metodos de uso de congujados de anticuerpos anti-cd74.
JP7020403B2 (ja) * 2016-05-02 2022-02-16 味の素株式会社 アジド基含有Ｆｃタンパク質
US11427632B2 (en) 2016-07-06 2022-08-30 Celgene Corporation Antibodies with low immunogenicity and uses thereof
US20200330590A1 (en) 2017-03-27 2020-10-22 Celgene Corporation Methods and compositions for reduction of immunogenicity
US11629122B2 (en) 2017-05-24 2023-04-18 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Linkers for antibody drug conjugates
EP3658588A1 (en) 2017-07-26 2020-06-03 Sutro Biopharma, Inc. Methods of using anti-cd74 antibodies and antibody conjugates in treatment of t-cell lymphoma
CN109420167B (zh) * 2017-08-28 2022-02-11 四川九章生物科技有限公司 一种治疗肿瘤的联合用药物
WO2019051127A1 (en) 2017-09-07 2019-03-14 Cue Biopharma, Inc. MULTIMER MODULATOR POLYPEPTIDE OF LYMPHOCYTE T HAVING CONJUGATION SITES AND METHODS OF USE THEREOF
JP7423513B2 (ja) 2017-09-18 2024-01-29 ストロ バイオファーマ インコーポレーテッド 抗葉酸受容体α抗体コンジュゲート及びその使用
CA3086842A1 (en) * 2017-12-27 2019-07-04 Kyowa Kirin Co., Ltd. Il-2 variant
JP2022500454A (ja) 2018-09-17 2022-01-04 ストロ バイオファーマ インコーポレーテッド 抗葉酸受容体抗体コンジュゲートによる併用療法
WO2020081493A1 (en) 2018-10-16 2020-04-23 Molecular Templates, Inc. Pd-l1 binding proteins
US20220226488A1 (en) * 2019-02-12 2022-07-21 Ambrx, Inc. Compositions containing, methods and uses of antibody-tlr agonist conjugates
EP3962951A1 (en) 2019-05-03 2022-03-09 Sutro Biopharma, Inc. Anti-bcma antibody conjugates
EP3980423A1 (en) 2019-06-10 2022-04-13 Sutro Biopharma, Inc. 5h-pyrrolo[3,2-d]pyrimidine-2,4-diamino compounds and antibody conjugates thereof
US20220259202A1 (en) 2019-06-17 2022-08-18 Sutro Biopharma, Inc. 1-(4-(aminomethyl)benzyl)-2-butyl-2h-pyrazolo[3,4-c]quinolin-4-amine derivatives and related compounds as toll-like receptor (tlr) 7/8 agonists, as well as antibody drug conjugates thereof for use in cancer therapy and diagnosis
MX2022001211A (es) * 2019-07-30 2022-05-03 Univ Health Network Moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (mhc) de clase ii y métodos para su uso.
CN110551195B (zh) * 2019-08-01 2022-08-09 天津科技大学 一种α-突触核蛋白聚集诱导发光体系及其构建与应用
WO2021055816A1 (en) 2019-09-18 2021-03-25 Molecular Templates, Inc. Pd-l1 binding molecules comprising shiga toxin a subunit scaffolds
CN112552410A (zh) * 2019-09-26 2021-03-26 三生国健药业（上海）股份有限公司 一种抗体融合蛋白及其制法和在抗肿瘤中的应用
EP4114852A1 (en) 2020-03-03 2023-01-11 Sutro Biopharma, Inc. Antibodies comprising site-specific glutamine tags, methods of their preparation and methods of their use
AU2021259426B2 (en) 2020-04-22 2024-05-16 Merck Sharp & Dohme Corp. Human interleukin-2 conjugates biased for the interleukin-2 receptor beta gammac dimer and conjugated to a nonpeptidic, water-soluble polymer
US20210340586A1 (en) * 2020-04-30 2021-11-04 Sutro Biopharma, Inc. Methods of Producing Full-Length Antibodies Using E. coli
AU2021337687A1 (en) 2020-09-04 2023-03-23 Novarock Biotherapeutics, Ltd. Nectin-4 antibodies and uses thereof
US20220089690A1 (en) 2020-09-14 2022-03-24 Sutro Biopharma, Inc. Method for large scale production of antibodies using a cell-free protein synthesis system
CA3213295A1 (en) 2021-03-17 2022-09-22 Molecular Templates, Inc. Pd-l1 binding proteins comprising shiga toxin a subunit scaffolds and cd8+ t cell antigens
US20240058465A1 (en) 2022-06-30 2024-02-22 Sutro Biopharma, Inc. Anti-ror1 antibody conjugates, compositions comprising anti ror1 antibody conjugates, and methods of making and using anti-ror1 antibody conjugates

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010051056A2 (en) * 2008-03-11 2010-05-06 Ambrx, Inc. ANTI-FcεRI POLYPEPTIDES AND THEIR USES

Family Cites Families (242)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SU11248A1 (ru) 1927-03-29 1929-09-30 В.С. Григорьев Способ очистки антрацена
CU22545A1 (es) 1994-11-18 1999-03-31 Centro Inmunologia Molecular Obtención de un anticuerpo quimérico y humanizado contra el receptor del factor de crecimiento epidérmico para uso diagnóstico y terapéutico
US4289872A (en) 1979-04-06 1981-09-15 Allied Corporation Macromolecular highly branched homogeneous compound based on lysine units
JPS57206622A (en) 1981-06-10 1982-12-18 Ajinomoto Co Inc Blood substitute
US4671958A (en) 1982-03-09 1987-06-09 Cytogen Corporation Antibody conjugates for the delivery of compounds to target sites
US4486414A (en) 1983-03-21 1984-12-04 Arizona Board Of Reagents Dolastatins A and B cell growth inhibitory substances
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4753894A (en) 1984-02-08 1988-06-28 Cetus Corporation Monoclonal anti-human breast cancer antibodies
US4943533A (en) 1984-03-01 1990-07-24 The Regents Of The University Of California Hybrid cell lines that produce monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
EP0154316B1 (en) 1984-03-06 1989-09-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified lymphokine and production thereof
US4625014A (en) 1984-07-10 1986-11-25 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Cell-delivery agent
US4542225A (en) 1984-08-29 1985-09-17 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Acid-cleavable compound
GB8430252D0 (en) 1984-11-30 1985-01-09 Beecham Group Plc Compounds
DE3675588D1 (de) 1985-06-19 1990-12-20 Ajinomoto Kk Haemoglobin, das an ein poly(alkenylenoxid) gebunden ist.
JP2524586B2 (ja) 1985-06-26 1996-08-14 シタス コーポレイション ポリマ−接合を利用する医薬組成物用蛋白質の可溶化
US5567610A (en) 1986-09-04 1996-10-22 Bioinvent International Ab Method of producing human monoclonal antibodies and kit therefor
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
US5229490A (en) 1987-05-06 1993-07-20 The Rockefeller University Multiple antigen peptide system
US4816444A (en) 1987-07-10 1989-03-28 Arizona Board Of Regents, Arizona State University Cell growth inhibitory substance
US5080891A (en) 1987-08-03 1992-01-14 Ddi Pharmaceuticals, Inc. Conjugates of superoxide dismutase coupled to high molecular weight polyalkylene glycols
US5204244A (en) 1987-10-27 1993-04-20 Oncogen Production of chimeric antibodies by homologous recombination
JP3040121B2 (ja) 1988-01-12 2000-05-08 ジェネンテク，インコーポレイテッド 増殖因子レセプターの機能を阻害することにより腫瘍細胞を処置する方法
US4847325A (en) 1988-01-20 1989-07-11 Cetus Corporation Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
GB8824591D0 (en) 1988-10-20 1988-11-23 Royal Free Hosp School Med Fractionation process
US5076973A (en) 1988-10-24 1991-12-31 Arizona Board Of Regents Synthesis of dolastatin 3
GB8827305D0 (en) 1988-11-23 1988-12-29 British Bio Technology Compounds
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
ATE135370T1 (de) 1988-12-22 1996-03-15 Kirin Amgen Inc Chemisch modifizierte granulocytenkolonie erregender faktor
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US4902502A (en) 1989-01-23 1990-02-20 Cetus Corporation Preparation of a polymer/interleukin-2 conjugate
US4978744A (en) 1989-01-27 1990-12-18 Arizona Board Of Regents Synthesis of dolastatin 10
US5324844A (en) 1989-04-19 1994-06-28 Enzon, Inc. Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides
EP0893439B1 (en) 1989-04-19 2005-07-27 Enzon, Inc. A process for forming a modified polypeptide comprising a polypeptide and a polyalkylene oxide
US5122614A (en) 1989-04-19 1992-06-16 Enzon, Inc. Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides
US4879278A (en) 1989-05-16 1989-11-07 Arizona Board Of Regents Isolation and structural elucidation of the cytostatic linear depsipeptide dolastatin 15
US4986988A (en) 1989-05-18 1991-01-22 Arizona Board Of Regents Isolation and structural elucidation of the cytostatic linear depsipeptides dolastatin 13 and dehydrodolastatin 13
ATE136315T1 (de) 1989-05-27 1996-04-15 Sumitomo Pharma Verfahren für die herstellung von polyethylenglykolderivate und modifizierte proteine.
US5138036A (en) 1989-11-13 1992-08-11 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Isolation and structural elucidation of the cytostatic cyclodepsipeptide dolastatin 14
US5312808A (en) 1989-11-22 1994-05-17 Enzon, Inc. Fractionation of polyalkylene oxide-conjugated hemoglobin solutions
US5229275A (en) 1990-04-26 1993-07-20 Akzo N.V. In-vitro method for producing antigen-specific human monoclonal antibodies
US5219564A (en) 1990-07-06 1993-06-15 Enzon, Inc. Poly(alkylene oxide) amino acid copolymers and drug carriers and charged copolymers based thereon
EP0513332A4 (en) 1990-11-14 1993-03-17 Cargill, Incorporated Conjugates of poly(vinylsaccharide) with proteins for the stabilization of proteins
US5252714A (en) 1990-11-28 1993-10-12 The University Of Alabama In Huntsville Preparation and use of polyethylene glycol propionaldehyde
CA2082160C (en) 1991-03-06 2003-05-06 Mary M. Bendig Humanised and chimeric monoclonal antibodies
JPH06506217A (ja) 1991-03-18 1994-07-14 エンゾン，インコーポレーテッド ポリペプチドまたはグリコポリペプチドとポリマーとのヒドラジン含有結合体
US5595732A (en) 1991-03-25 1997-01-21 Hoffmann-La Roche Inc. Polyethylene-protein conjugates
US6407213B1 (en) 1991-06-14 2002-06-18 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
US5281698A (en) 1991-07-23 1994-01-25 Cetus Oncology Corporation Preparation of an activated polymer ester for protein conjugation
US5565332A (en) 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
IT1260468B (it) 1992-01-29 1996-04-09 Metodo per mantenere l'attivita' di enzimi proteolitici modificati con polietilenglicole
WO1993016177A1 (en) 1992-02-11 1993-08-19 Cell Genesys, Inc. Homogenotization of gene-targeting events
US5573905A (en) 1992-03-30 1996-11-12 The Scripps Research Institute Encoded combinatorial chemical libraries
EP0636156B1 (en) 1992-04-14 1997-07-30 Cornell Research Foundation, Inc. Dendritic based macromolecules and method of production
US5869644A (en) 1992-04-15 1999-02-09 The Johns Hopkins University Synthesis of diverse and useful collections of oligonucleotidies
ZA933926B (en) 1992-06-17 1994-01-03 Amgen Inc Polyoxymethylene-oxyethylene copolymers in conjuction with blomolecules
WO1994004193A1 (en) 1992-08-21 1994-03-03 Enzon, Inc. Novel attachment of polyalkylene oxides to bio-effecting substances
US5382657A (en) 1992-08-26 1995-01-17 Hoffmann-La Roche Inc. Peg-interferon conjugates
US5736137A (en) 1992-11-13 1998-04-07 Idec Pharmaceuticals Corporation Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma
US5635483A (en) 1992-12-03 1997-06-03 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Tumor inhibiting tetrapeptide bearing modified phenethyl amides
US6034065A (en) 1992-12-03 2000-03-07 Arizona Board Of Regents Elucidation and synthesis of antineoplastic tetrapeptide phenethylamides of dolastatin 10
NZ250375A (en) 1992-12-09 1995-07-26 Ortho Pharma Corp Peg hydrazone and peg oxime linkage forming reagents and protein derivatives
US5298643A (en) 1992-12-22 1994-03-29 Enzon, Inc. Aryl imidate activated polyalkylene oxides
US5455258A (en) 1993-01-06 1995-10-03 Ciba-Geigy Corporation Arylsulfonamido-substituted hydroxamic acids
AU6029594A (en) 1993-01-15 1994-08-15 Enzon, Inc. Factor viii - polymeric conjugates
US5349001A (en) 1993-01-19 1994-09-20 Enzon, Inc. Cyclic imide thione activated polyalkylene oxides
US5410024A (en) 1993-01-21 1995-04-25 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Human cancer inhibitory pentapeptide amides
US5780588A (en) 1993-01-26 1998-07-14 Arizona Board Of Regents Elucidation and synthesis of selected pentapeptides
US5321095A (en) 1993-02-02 1994-06-14 Enzon, Inc. Azlactone activated polyalkylene oxides
IL104734A0 (en) 1993-02-15 1993-06-10 Univ Bar Ilan Bioactive conjugates of cellulose with amino compounds
WO1994028024A1 (en) 1993-06-01 1994-12-08 Enzon, Inc. Carbohydrate-modified polymer conjugates with erythropoietic activity
WO1995000162A1 (en) 1993-06-21 1995-01-05 Enzon, Inc. Site specific synthesis of conjugated peptides
GB9317618D0 (en) 1993-08-24 1993-10-06 Royal Free Hosp School Med Polymer modifications
US5643575A (en) 1993-10-27 1997-07-01 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5919455A (en) 1993-10-27 1999-07-06 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
ES2174915T3 (es) 1993-11-10 2002-11-16 Enzon Inc Productos de conjugacion mejorados de un interferon con un polimero.
US5951974A (en) 1993-11-10 1999-09-14 Enzon, Inc. Interferon polymer conjugates
US5446090A (en) 1993-11-12 1995-08-29 Shearwater Polymers, Inc. Isolatable, water soluble, and hydrolytically stable active sulfones of poly(ethylene glycol) and related polymers for modification of surfaces and molecules
GB9401182D0 (en) 1994-01-21 1994-03-16 Inst Of Cancer The Research Antibodies to EGF receptor and their antitumour effect
US5473034A (en) 1994-03-18 1995-12-05 Hyogo Prefectural Government Method for producing protein-synthetic polymer conjugate and said conjugate produced thereby
US5534615A (en) 1994-04-25 1996-07-09 Genentech, Inc. Cardiac hypertrophy factor and uses therefor
US5629384A (en) 1994-05-17 1997-05-13 Consiglio Nazionale Delle Ricerche Polymers of N-acryloylmorpholine activated at one end and conjugates with bioactive materials and surfaces
AU2826495A (en) 1994-06-02 1996-01-04 Enzon, Inc. Method of solubilizing substantially water insoluble materials
US5730990A (en) 1994-06-24 1998-03-24 Enzon, Inc. Non-antigenic amine derived polymers and polymer conjugates
US5521284A (en) 1994-08-01 1996-05-28 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Human cancer inhibitory pentapeptide amides and esters
US5504191A (en) 1994-08-01 1996-04-02 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Human cancer inhibitory pentapeptide methyl esters
US5530097A (en) 1994-08-01 1996-06-25 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Human cancer inhibitory peptide amides
CA2195557C (en) 1994-08-12 2006-10-17 Shui-On Leung Immunoconjugates and humanized antibodies specific for b-cell lymphoma and leukemia cells
US5650234A (en) 1994-09-09 1997-07-22 Surface Engineering Technologies, Division Of Innerdyne, Inc. Electrophilic polyethylene oxides for the modification of polysaccharides, polypeptides (proteins) and surfaces
US5554725A (en) 1994-09-14 1996-09-10 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Synthesis of dolastatin 15
US5824784A (en) 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
DE69526973T3 (de) 1994-10-21 2010-01-07 Innogenetics N.V. Sequenzen von hepatitis-c-virus genotype 7, und deren verwendung als vorbeugende, therapeutische und diagnostische mittel
CA2204726A1 (en) 1994-11-09 1996-12-27 Robin E. Offord Functionalized polymers for site-specific attachment
US5738846A (en) 1994-11-10 1998-04-14 Enzon, Inc. Interferon polymer conjugates and process for preparing the same
US5599902A (en) 1994-11-10 1997-02-04 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Cancer inhibitory peptides
US5663149A (en) 1994-12-13 1997-09-02 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Human cancer inhibitory pentapeptide heterocyclic and halophenyl amides
US5932462A (en) 1995-01-10 1999-08-03 Shearwater Polymers, Inc. Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces
US5863949A (en) 1995-03-08 1999-01-26 Pfizer Inc Arylsulfonylamino hydroxamic acid derivatives
US5756662A (en) 1995-03-14 1998-05-26 Corixa Corporation Compounds and methods for the detection of T. cruzi infection
WO1996033172A1 (en) 1995-04-20 1996-10-24 Pfizer Inc. Arylsulfonyl hydroxamic acid derivatives as mmp and tnf inhibitors
AU6267896A (en) 1995-06-07 1996-12-30 Imclone Systems Incorporated Antibody and antibody fragments for inhibiting the growth oftumors
WO1996040791A1 (en) 1995-06-07 1996-12-19 Novo Nordisk A/S Modification of polypeptides
US5672662A (en) 1995-07-07 1997-09-30 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) and related polymers monosubstituted with propionic or butanoic acids and functional derivatives thereof for biotechnical applications
GB9624482D0 (en) 1995-12-18 1997-01-15 Zeneca Phaema S A Chemical compounds
EP0780386B1 (en) 1995-12-20 2002-10-02 F. Hoffmann-La Roche Ag Matrix metalloprotease inhibitors
HU230048B1 (hu) 1996-02-09 2015-06-29 Abbvie Biotechnology Ltd Humán TNFalfa-kötő antitestek alkalmazása
BR9707495A (pt) 1996-02-13 1999-07-27 Zeneca Ltd Derivado de quinazolina processo para a preparação do mesmo composição farmacêutica e processo para a produç o de um efeito antiangiogênico e/ou de redução de permeabilidade vascular em um animal de sangue quente
KR100489174B1 (ko) 1996-03-05 2005-09-30 제네카-파마 소시에떼아노님 4-아닐리노퀴나졸린유도체
US5747639A (en) 1996-03-06 1998-05-05 Amgen Boulder Inc. Use of hydrophobic interaction chromatography to purify polyethylene glycols
TW517067B (en) 1996-05-31 2003-01-11 Hoffmann La Roche Interferon conjugates
EP0818442A3 (en) 1996-07-12 1998-12-30 Pfizer Inc. Cyclic sulphone derivatives as inhibitors of metalloproteinases and of the production of tumour necrosis factor
EP0923585B1 (en) 1996-07-18 2002-05-08 Pfizer Inc. Phosphinate based inhibitors of matrix metalloproteases
KR20000029673A (ko) 1996-08-02 2000-05-25 오르토-맥네일 파마슈티칼, 인코퍼레이티드 단일의공유결합된ｎ-말단수용성폴리머를갖는폴리펩티드
US5980948A (en) 1996-08-16 1999-11-09 Osteotech, Inc. Polyetherester copolymers as drug delivery matrices
SK21499A3 (en) 1996-08-23 2000-05-16 Pfizer Arylsulfonylamino hydroxamic acid derivatives
US6130237A (en) 1996-09-12 2000-10-10 Cancer Research Campaign Technology Limited Condensed N-aclyindoles as antitumor agents
GB9718972D0 (en) 1996-09-25 1997-11-12 Zeneca Ltd Chemical compounds
US6214966B1 (en) 1996-09-26 2001-04-10 Shearwater Corporation Soluble, degradable poly(ethylene glycol) derivatives for controllable release of bound molecules into solution
BR9714266A (pt) 1997-01-06 2000-04-18 Pfizer Derivados de sulfona cìclicos.
EP0921817B1 (en) 1997-01-29 2001-03-28 PolyMASC Pharmaceuticals plc Pegylation process
PL335027A1 (en) 1997-02-03 2000-03-27 Pfizer Prod Inc Derivatives of arylsulphonylamino hydroxamic acid
AU5493598A (en) 1997-02-07 1998-08-26 Pfizer Inc. N-hydroxy-beta-sulfonyl-propionamide derivatives and their use as inhibitors of matrix metalloproteinases
AU722784B2 (en) 1997-02-11 2000-08-10 Pfizer Inc. Arylsulfonyl hydroxamic acid derivatives
US20020192228A1 (en) 1997-02-12 2002-12-19 Samir M. Hanash Protein markers for lung cancer and use thereof
US6239104B1 (en) 1997-02-25 2001-05-29 Arizona Board Of Regents Isolation and structural elucidation of the cytostatic linear and cyclo-depsipeptides dolastatin 16, dolastatin 17, and dolastatin 18
CA2288992C (en) 1997-04-30 2012-06-12 Enzon, Inc. Single-chain antigen-binding proteins capable of glycosylation, production and uses thereof
US6235883B1 (en) 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
US5990237A (en) 1997-05-21 1999-11-23 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) aldehyde hydrates and related polymers and applications in modifying amines
CA2263795C (en) 1997-06-06 2008-02-19 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Chemically modified polypeptides
DE69838552T2 (de) 1997-07-14 2008-05-21 Bolder Biotechnology, Inc., Louisville Derivate des wachstumshormons und verwandte proteine
CA2299355C (en) 1997-08-08 2005-09-27 Pfizer Products Inc. Aryloxyarylsulfonylamino hydroxamic acid derivatives
WO1999016318A1 (en) 1997-09-26 1999-04-08 Uab Research Foundation Reduced antigenic cells and uses therefor
US6004573A (en) 1997-10-03 1999-12-21 Macromed, Inc. Biodegradable low molecular weight triblock poly(lactide-co-glycolide) polyethylene glycol copolymers having reverse thermal gelation properties
US6201072B1 (en) 1997-10-03 2001-03-13 Macromed, Inc. Biodegradable low molecular weight triblock poly(lactide-co- glycolide) polyethylene glycol copolymers having reverse thermal gelation properties
DE19748489A1 (de) 1997-11-03 1999-05-06 Roche Diagnostics Gmbh Polyethylenglykol-derivatisierte Biomoleküle und deren Verwendung in heterogenen Nachweisverfahren
US6448369B1 (en) 1997-11-06 2002-09-10 Shearwater Corporation Heterobifunctional poly(ethylene glycol) derivatives and methods for their preparation
GB9725782D0 (en) 1997-12-05 1998-02-04 Pfizer Ltd Therapeutic agents
US5985263A (en) 1997-12-19 1999-11-16 Enzon, Inc. Substantially pure histidine-linked protein polymer conjugates
US5981709A (en) 1997-12-19 1999-11-09 Enzon, Inc. α-interferon-polymer-conjugates having enhanced biological activity and methods of preparing the same
GB9801690D0 (en) 1998-01-27 1998-03-25 Pfizer Ltd Therapeutic agents
JP2002505338A (ja) 1998-03-05 2002-02-19 カイロン コーポレイション 生物学的に活性な分子の血清半減期を増加するための方法
ATE268609T1 (de) 1998-03-12 2004-06-15 Nektar Therapeutics Al Corp Polyethylenglycolderivate mit benachbarten reaktiven gruppen
JP4462654B2 (ja) 1998-03-26 2010-05-12 ソニー株式会社 映像素材選択装置及び映像素材選択方法
PA8469401A1 (es) 1998-04-10 2000-05-24 Pfizer Prod Inc Derivados biciclicos del acido hidroxamico
PA8469501A1 (es) 1998-04-10 2000-09-29 Pfizer Prod Inc Hidroxamidas del acido (4-arilsulfonilamino)-tetrahidropiran-4-carboxilico
EP0953639A1 (en) 1998-04-30 1999-11-03 Boehringer Ingelheim International GmbH FAPalpha-specific antibody with improved producibility
DE69936946T2 (de) 1998-05-06 2008-05-15 Genentech, Inc., South San Francisco Reinigung von Antikörpern durch Ionenaustauschchromatographie
DK1400551T3 (da) 1998-08-28 2007-10-15 Amylin Pharmaceuticals Inc Polyamidkæder med præcis længde og deres konjugater med proteiner
US6420339B1 (en) 1998-10-14 2002-07-16 Amgen Inc. Site-directed dual pegylation of proteins for improved bioactivity and biocompatibility
DE69915004T2 (de) 1998-11-05 2004-09-09 Pfizer Products Inc., Groton 5-Oxo-pyrrolidine-2-Carbonsäure-Hydroxamidderivate
WO2000034337A1 (en) 1998-12-10 2000-06-15 Tsukuba Research Laboratory, Toagosei Co., Ltd. Humanized monoclonal antibodies against vascular endothelial cell growth factor
US6451346B1 (en) 1998-12-23 2002-09-17 Amgen Inc Biodegradable pH/thermosensitive hydrogels for sustained delivery of biologically active agents
JP4805432B2 (ja) 1998-12-28 2011-11-02 ランクセス・ドイチュランド・ゲーエムベーハー 木質材又は木質複合材を製造する際に使用される接着剤混入用薬剤
US6281211B1 (en) 1999-02-04 2001-08-28 Euro-Celtique S.A. Substituted semicarbazides and the use thereof
PL199802B1 (pl) 1999-02-10 2008-10-31 Astrazeneca Ab Pochodne chinazoliny, sposoby ich wytwarzania, ich kompozycje farmaceutyczne i ich zastosowania
US6914128B1 (en) 1999-03-25 2005-07-05 Abbott Gmbh & Co. Kg Human antibodies that bind human IL-12 and methods for producing
KR100696407B1 (ko) 1999-04-16 2007-03-19 더블유엠. 마쉬 라이스 유니버시티 폴리(프로필렌 푸마레이트)-디아크릴레이트 마크로머와가교결합된 생분해성 폴리(프로필렌 푸마레이트) 네트워크
US7829064B2 (en) 1999-05-10 2010-11-09 Immunomedics, Inc. Anti-CD74 immunoconjugates and methods
US6924359B1 (en) 1999-07-01 2005-08-02 Yale University Neovascular-targeted immunoconjugates
US6323315B1 (en) 1999-09-10 2001-11-27 Basf Aktiengesellschaft Dolastatin peptides
EP1676845B1 (en) 1999-11-05 2008-06-11 AstraZeneca AB New quinazoline derivatives
US6348558B1 (en) 1999-12-10 2002-02-19 Shearwater Corporation Hydrolytically degradable polymers and hydrogels made therefrom
CA2394980C (en) 1999-12-22 2008-05-13 Shearwater Corporation Sterically hindered derivatives of water soluble polymers
KR100729977B1 (ko) 1999-12-22 2007-06-20 넥타르 테라퓨틱스 에이엘, 코포레이션 폴리(에틸렌 글리콜)의 1-벤조트리아졸릴 카르보네이트에스테르의 제조 방법
US6413507B1 (en) 1999-12-23 2002-07-02 Shearwater Corporation Hydrolytically degradable carbamate derivatives of poly (ethylene glycol)
US6646110B2 (en) 2000-01-10 2003-11-11 Maxygen Holdings Ltd. G-CSF polypeptides and conjugates
ES2290117T3 (es) 2000-02-15 2008-02-16 Sugen, Inc. Inhibidores de proteina quinasa 2-indolina sustituida con pirrol.
WO2001062827A2 (en) 2000-02-22 2001-08-30 Shearwater Corporation N-maleimidyl polymer derivatives
MXPA02008178A (es) 2000-02-25 2004-04-05 Us Gov Health & Human Serv Scfvs anti-egfrviii con citotoxicidad y rendimiento mejorados, inmunotoxinas en base a los mismos y metodos para su uso.
AU2001257577A1 (en) 2000-02-28 2001-09-03 Shearwater Corporation Water-soluble polymer conjugates of artelinic acid
ES2259030T3 (es) 2000-05-19 2006-09-16 Scancell Limited Anticuerpos humanizados frente al receptor del factor de crecimiento epidermico.
US6436386B1 (en) 2000-11-14 2002-08-20 Shearwater Corporation Hydroxyapatite-targeting poly (ethylene glycol) and related polymers
TW593427B (en) 2000-12-18 2004-06-21 Nektar Therapeutics Al Corp Synthesis of high molecular weight non-peptidic polymer derivatives
AU2002249854B2 (en) 2000-12-18 2007-09-20 Dyax Corp. Focused libraries of genetic packages
TWI246524B (en) 2001-01-19 2006-01-01 Shearwater Corp Multi-arm block copolymers as drug delivery vehicles
WO2002085923A2 (en) 2001-04-19 2002-10-31 The Scripps Research Institute In vivo incorporation of unnatural amino acids
US20030083263A1 (en) 2001-04-30 2003-05-01 Svetlana Doronina Pentapeptide compounds and uses related thereto
US6884869B2 (en) 2001-04-30 2005-04-26 Seattle Genetics, Inc. Pentapeptide compounds and uses related thereto
KR20090125840A (ko) 2001-06-13 2009-12-07 젠맵 에이/에스 표피 성장 인자 수용체 (ｅｇｆｒ)에 대한 인간 모노클로날 항체
US6908963B2 (en) 2001-10-09 2005-06-21 Nektar Therapeutics Al, Corporation Thioester polymer derivatives and method of modifying the N-terminus of a polypeptide therewith
US7026440B2 (en) 2001-11-07 2006-04-11 Nektar Therapeutics Al, Corporation Branched polymers and their conjugates
WO2003039486A2 (en) 2001-11-09 2003-05-15 Idec Pharmaceuticals Corporation Anti-cd80 antibody having adcc activity for adcc mediated killing of b cell lymphoma cells alone or in combination with other therapies
DE10156482A1 (de) 2001-11-12 2003-05-28 Gundram Jung Bispezifisches Antikörper-Molekül
US6716821B2 (en) 2001-12-21 2004-04-06 Immunogen Inc. Cytotoxic agents bearing a reactive polyethylene glycol moiety, cytotoxic conjugates comprising polyethylene glycol linking groups, and methods of making and using the same
AU2003217912A1 (en) 2002-03-01 2003-09-16 Xencor Antibody optimization
PT1545613E (pt) 2002-07-31 2011-09-27 Seattle Genetics Inc Conjugados de auristatina e sua utilização para tratamento do cancro, de uma doença autoimune ou de uma doença infecciosa
CA2496437C (en) 2002-08-19 2013-01-08 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Improved methods of in vitro protein synthesis
US20040202666A1 (en) 2003-01-24 2004-10-14 Immunomedics, Inc. Anti-cancer anthracycline drug-antibody conjugates
SG10201701737XA (en) 2003-11-06 2017-04-27 Seattle Genetics Inc Monomethylvaline compounds capable of conjugation to ligands
US7968684B2 (en) 2003-11-12 2011-06-28 Abbott Laboratories IL-18 binding proteins
JP4870569B2 (ja) 2003-11-13 2012-02-08 ハンミ ホールディングス カンパニー リミテッド 免疫グロブリン断片を用いた蛋白質結合体およびその製造方法
US20050260711A1 (en) 2004-03-30 2005-11-24 Deepshikha Datta Modulating pH-sensitive binding using non-natural amino acids
SG172616A1 (en) 2004-04-13 2011-07-28 Hoffmann La Roche Anti-p-selectin antibodies
ATE537189T1 (de) 2004-04-30 2011-12-15 Inst Nat Sante Rech Med Anti-tfr-antikörper
AU2005265163B2 (en) 2004-06-18 2009-10-01 Ambrx, Inc. Novel antigen-binding polypeptides and their uses
JP2008507520A (ja) 2004-07-22 2008-03-13 ジェネンテック・インコーポレーテッド Ｈｅｒ２抗体組成物
US20060074225A1 (en) 2004-09-14 2006-04-06 Xencor, Inc. Monomeric immunoglobulin Fc domains
TWI380996B (zh) 2004-09-17 2013-01-01 Hoffmann La Roche 抗ｏｘ４０ｌ抗體
AU2005330514B2 (en) 2004-10-27 2011-05-12 The Scripps Research Institute Orthogonal translation components for the in vivo incorporation of unnatural amino acids
MX2007007590A (es) 2004-12-22 2007-12-10 Ambrx Inc Composiciones que contienen, metodos que involucran y usos de aminoacidos no naturales y polipeptidos.
KR100754667B1 (ko) 2005-04-08 2007-09-03 한미약품 주식회사 비펩타이드성 중합체로 개질된 면역글로불린 Ｆｃ 단편 및이를 포함하는 약제학적 조성물
CA2606102C (en) 2005-04-26 2014-09-30 Medimmune, Inc. Modulation of antibody effector function by hinge domain engineering
WO2008020827A2 (en) * 2005-08-01 2008-02-21 Biogen Idec Ma Inc. Altered polypeptides, immunoconjugates thereof, and methods related thereto
US8008453B2 (en) 2005-08-12 2011-08-30 Amgen Inc. Modified Fc molecules
EP1931709B1 (en) 2005-10-03 2016-12-07 Xencor, Inc. Fc variants with optimized fc receptor binding properties
AU2006326404B2 (en) 2005-12-14 2011-11-03 Ambrx, Inc. Compositions containing, methods involving, and uses of non-natural amino acids and polypeptides
KR20080108416A (ko) 2006-01-19 2008-12-15 암브룩스, 인코포레이티드 조절된 면역원성을 갖는 비천연 아미노산 폴리펩티드
NZ571757A (en) 2006-04-21 2012-01-12 Novartis Ag Antagonist anti-CD40 antibody pharmaceutical compositions comprising arginine-HCl and a citrate or citric acid buffer
CA2653748A1 (en) 2006-05-02 2007-11-15 Allozyne, Inc. Non-natural amino acid substituted polypeptides
JP5620100B2 (ja) 2006-06-29 2014-11-05 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー 非天然アミノ酸を含有するタンパク質の無細胞合成の方法
SG174780A1 (en) 2006-09-08 2011-10-28 Ambrx Inc Site specific incorporation of non-natural amino acids by vertebrate cells
KR20090060294A (ko) 2006-09-08 2009-06-11 암브룩스, 인코포레이티드 변형된 인간 혈장 폴리펩티드 또는 Ｆｃ 스캐폴드 및 그의 용도
WO2008083346A1 (en) 2006-12-28 2008-07-10 Ambrx, Inc. Phenazine and quinoxaline substituted amino acids and polypeptides
EP2155177A2 (en) 2007-04-30 2010-02-24 Intezyne Technologies Incorporated Modification of biological targeting groups for the treatment of cancer
CA3187687A1 (en) 2007-09-14 2009-03-19 Adimab, Llc Rationally designed, synthetic antibody libraries and uses therefor
ES2450755T3 (es) 2007-10-19 2014-03-25 Genentech, Inc. Anticuerpos anti-TENB2 modificados por ingeniería genética con cisteína, y conjugados de anticuerpo y fármaco
CN102083460A (zh) * 2008-01-18 2011-06-01 米迪缪尼有限公司 用于位点特异性偶联的半胱氨酸工程化抗体
WO2010006214A1 (en) 2008-07-09 2010-01-14 Ambrx, Inc. Fgf-21 neutralizing antibodies and their uses
EP2379578A4 (en) 2009-01-12 2012-05-02 Sutro Biopharma Inc DOUBLE-LOADING SYSTEM FOR THE SELECTIVE INTRODUCTION OF NON-NITIVE AMINO ACIDS IN PROTEINS DUE TO AN IN VITRO-SYNTHESIS PROCESS
AU2010206681A1 (en) 2009-01-23 2011-09-01 Biogen Idec Ma Inc. Stabilized Fc polypeptides with reduced effector function and methods of use
GB2470770A (en) 2009-06-04 2010-12-08 Medical Res Council Incorporation of unnatural amino acids having an orthogonal functional group into polypeptides using orthogonal tRNA/tRNA synthetase pairs
CN103261222B (zh) 2010-09-10 2017-07-28 医疗免疫有限公司 抗体衍生物
NZ611428A (en) 2010-12-08 2015-07-31 Stemcentrx Inc Novel modulators and methods of use
SG10201608138RA (en) 2011-02-01 2016-11-29 Genmab As Human antibodies and antibody-drug conjugates against cd74
WO2013068874A1 (en) * 2011-11-11 2013-05-16 Pfizer Inc. Antibody-drug conjugates
CA3111357A1 (en) 2011-12-23 2013-06-27 Pfizer Inc. Engineered antibody constant regions for site-specific conjugation and methods and uses therefor
CN102627615B (zh) 2012-03-23 2014-01-01 兰州大学 一种化合物l-4-四嗪-苯丙氨酸及其制备方法和应用
EP2859017B1 (en) 2012-06-08 2019-02-20 Sutro Biopharma, Inc. Antibodies comprising site-specific non-natural amino acid residues, methods of their preparation and methods of their use
EP2863955B1 (en) 2012-06-26 2016-11-23 Sutro Biopharma, Inc. Modified fc proteins comprising site-specific non-natural amino acid residues, conjugates of the same, methods of their preparation and methods of their use
WO2014036492A1 (en) 2012-08-31 2014-03-06 Sutro Biopharma, Inc. Modified amino acids comprising an azido group
WO2014044873A1 (en) 2012-09-24 2014-03-27 Allozyne, Inc Amino acid derivatives
US9902705B2 (en) 2012-10-24 2018-02-27 The General Hospital Corporation Functionalized 1,2,4,5-tetrazine compounds for use in bioorthogonal coupling reactions
ES2730011T3 (es) 2013-02-20 2019-11-07 Innate Pharma Un compuesto que se une específicamente a KIR3DL2 para el uso en el tratamiento de linfoma de células T periférico
US9764039B2 (en) 2013-07-10 2017-09-19 Sutro Biopharma, Inc. Antibodies comprising multiple site-specific non-natural amino acid residues, methods of their preparation and methods of their use
ES2753551T3 (es) 2014-07-22 2020-04-13 Sutro Biopharma Inc Anticuerpos anti-cd74, composiciones que comprenden anticuerpos anti-CD74 y procedimientos de uso de los anticuerpos anti-CD74
BR112017010110A2 (pt) 2014-11-21 2018-01-30 Bristol-Myers Squibb Company anticorpos contra cd73 e usos do mesmo
US10844090B2 (en) 2015-01-30 2020-11-24 Sutro Biopharma, Inc. Hemiasterlin derivatives for conjugation and therapy
CN106146663B (zh) 2015-04-10 2019-11-08 北京大学 非天然氨基酸标记的新型抗体-药物偶联物及其制备
MX2018009085A (es) 2016-01-27 2019-05-09 Sutro Biopharma Inc Conjugados de anticuerpos anti-cd74, composiciones que comprenden conjugados de anticuerpos anti-cd74 y metodos de uso de congujados de anticuerpos anti-cd74.
WO2017197241A1 (en) 2016-05-13 2017-11-16 Tarveda Therapeutics, Inc. Targeted constructs and formulations thereof
US10799597B2 (en) 2017-04-03 2020-10-13 Immunomedics, Inc. Subcutaneous administration of antibody-drug conjugates for cancer therapy
EP3658588A1 (en) 2017-07-26 2020-06-03 Sutro Biopharma, Inc. Methods of using anti-cd74 antibodies and antibody conjugates in treatment of t-cell lymphoma

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010051056A2 (en) * 2008-03-11 2010-05-06 Ambrx, Inc. ANTI-FcεRI POLYPEPTIDES AND THEIR USES

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
J. Mol. Biol., 406(4):595-603(2011) *

Also Published As

Publication number Publication date
HUE043552T2 (hu) 2019-09-30
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