ES2495430T3

ES2495430T3 - Una forma de PRELP de 38 KDA como nuevo diagnóstico y objetivo terapéutico

Info

Publication number: ES2495430T3
Application number: ES11836736.6T
Authority: ES
Inventors: Hodjattallah Rabbani
Original assignee: Avicenna Research Institute
Current assignee: Avicenna Research Institute
Priority date: 2010-10-28
Filing date: 2011-10-28
Publication date: 2014-09-17
Anticipated expiration: 2031-10-28
Also published as: EP2556379B1; US8658380B2; US20130039917A1; EP2556379A4; US20140161809A1; EP2556379A1; WO2012057697A1

Abstract

Un método in vitro para evaluar el riesgo de que un sujeto padezca cánceres de tejidos u órganos derivados de las tres capas embrionarias de ectodermo, mesodermo y endodermo, que comprende medir el nivel de expresión de una forma de 38 kDa de la proteína rica en prolina/arginina con repeticiones de leucina terminales (PRELP) en células de dicho sujeto, en el que un nivel de expresión incrementado de PRELP, comparado con donantes sanos, indica una probabilidad incrementada de que dicho sujeto padezca dicho cáncer

Description

Una forma de PRELP de 38 KDA como nuevo diagnóstico y objetivo terapéutico

Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo de la terapia y diagnóstico del cáncer. Más específicamente, se refiere a la terapia y diagnóstico de cánceres de tejidos y órganos que se originan de ectodermo, mesodermo y endodermo, y a productos útiles en dichas terapias y diagnóstico.

Antecedentes de la invención

El microentorno es importante para la proliferación y supervivencia de células de leucemia linfocítica crónica (CLL)1, 2 . Varios tipos de células pueden contribuir para proporcionar señales y factores de liberación que previenen la apoptosis de las células CLL 3, 4. Las moléculas que facilitan la interacción entre las células leucémicas y el microentorno pueden ser críticas en la patofisiología de CLL y sirven potencialmente como estructuras para terapias dirigidas.

En 2001, el perfil de expresión génica en CLL mostró una expresión incrementada de la proteína de la matriz extracelular (ECM) fibromodulina (FMOD) 5. FMOD es un miembro de la familia de los proteoglicanos pequeños ricos en leucina (SLRP) y se expresa normalmente en tejidos ricos en colágeno. Nosotros demostramos que FMOD se expresaba a nivel génico y de proteína en CLL y linfoma de células del manto (MCL) 6. La regulación de agrupamientos de genes se ha indicado en enfermedades malignas 7. La proteína rica en prolina/arginina con repeticiones de leucina terminales (PRELP) tiene una estructura relacionada de cerca con FMOD y está localizada aproximadamente 80 kb 3' cerca de FMOD en el cromosoma 1q32.18. PRELP tiene un peso molecular (MW) de 55 kDa y se expresa normalmente en la matriz extracelular de tejidos conectivos, principalmente en el cartílago, pulmón, riñón, piel y tendón 9, 10. La función de PRELP no está clara, pero las interacciones entre PRELP y el colágeno de tipo I y II así como heparina y heparán sulfato11, 12 sugieren que PRELP puede ser una molécula que ancla las membranas basales con el tejido conectivo12 .

US2003/0219767 describe PRELP (número de registro Genbank NM_002725) como un marcador potencial para cáncer de mama, pero no identifica la forma de 38 kDa de PRELP como un biomarcador.

WO2007/082352 describe PRELP como un biomarcador ejemplar para cáncer de hueso, pero asimismo no identifica la forma de 38 kDa de PRELP como un biomarcador.

Resumen de la invención

La sobreexpresión de genes en células tumorales podría deberse a regulaciones epigenéticas que pueden abarcar un agrupamiento de genes localizados muy cerca. Después de nuestros estudios previos sobre FMOD6 y ROR-I13 en CLL, ambos localizados en el cromosoma 1, el presente estudio se comenzó inicialmente para explorar la expresión génica y de proteína de PRELP en CLL y otras malignidades hematológicas, en nuestro esfuerzo para explorar moléculas expresadas únicamente en CLL que podrían jugar un papel en la patología de la enfermedad.

De forma natural, PRELP es una proteína secretada. El presente inventor ha mostrado que en las células cancerosas no sólo no se secreta sino que es secuestrada en el interior de las células cancerosas. También, una fracción de esta proteína no procesada se expresa en la superficie celular, véase la Fig. 14. Esto se ha encontrado para células leucémicas y también para células cancerosas que se originan de las capas germinales embrionarias de ectodermo, mesodermo y endodermo. También se ha encontrado que los anticuerpos generados frente a PRELP inducen apoptosis en las células cancerosas que expresan PRELP en la superficie celular.

El presente inventor ha encontrado que PRELP se expresa en CLL y una línea celular de linfoma de Burkitt humano (Raji). El linfoma de Burkitt es un cáncer del sistema linfático en particular linfocitos B. La leucemia linfocítica crónica también es un cáncer de linfocitos B. La expresión de PRELP tanto en linfoma como leucemia con origen en linfocitos B formula PRELP como una diana terapéutica en las malignidades de las células B sin expresión de PRELP en las células B normales. Aparte de las malignidades de las células B, PRELP también se expresa en los tumores sólidos listados en la Tabla 1. Según estos datos, PRELP se expresa en cáncer de mama, cáncer de ovario y cáncer de próstata así como en tumores de neuroblastoma, glioblastoma y meduloblastoma.

Los tejidos y órganos siguientes derivan de tres capas germinales embrionarias de ectodermo, mesodermo y endodermo: el tejido de mama deriva de ectodermo y mesodermo. El sistema nervioso central deriva de ectodermo. El ovario, sistemas linfáticos y tejidos óseos incluyendo células sanguíneas derivan de mesodermo y finalmente la próstata deriva de endodermo.

Aunque la expresión de PRELP no se ha mostrado en todos los cánceres, el origen de tejidos y órganos más la expresión de PRELP en los cánceres mencionados anteriormente (como representativos para cada capa embrionaria)

ratificarían PRELP como un marcador tumoral universal, especialmente en el formato de la preproproteína inmadura (precursor). Incluso si PRELP se expresa en los tejidos normales correspondientes, la expresión en la superficie celular de PRELP en el formato precursor sería una ventaja para tomar a las células cancerosas como diana sin dañar a las células normales. En conclusión, dos propiedades distintas de precursor y expresión en la superficie celular de PRELP en las células cancerosas la hacen una diana ideal (Fig. 14) para la detección de dichas células cancerosas así como para la terapia y diagnóstico de dichos cánceres como se discute en la presente memoria.

En un primer aspecto, la invención se refiere a un método in vitro para evaluar el riesgo de que un sujeto padezca cánceres de tejidos u órganos derivados de las tres capas embrionarias de ectodermo, mesodermo y endodermo, que comprende medir el nivel de expresión de una forma de 38 kDa de la proteína rica en prolina/arginina con repeticiones de leucina terminales (PRELP) en las células de dicho sujeto, en el que un nivel de expresión incrementado de PRELP, comparado con donantes sanos, indica una probabilidad incrementada de que dicho sujeto padezca dicho cáncer.

En un aspecto adicional, la invención se refiere a un ligante de afinidad, siendo un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de éste, específico para la forma de 38 kDa de PRELP.

En un aspecto adicional, la invención se refiere a un ligante de afinidad, siendo un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de éste, según el aspecto anterior, para uso en terapia, particularmente en terapia de cáncer y especialmente en terapia de cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de próstata, glioblastoma, linfoma de Burkitt, neuroblastoma, meduloblastoma, leucemia linfocítica crónica (CLL) o linfoma de células del manto (MCL). Dichos ligantes de afinidad, siendo un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de éste, pueden estar "armados", es decir, unidos a un resto que tiene un efecto tóxico en las células, particularmente células cancerosas. Dichos restos son conocidos para el experto en la técnica, véase Polakis P. Arming antibodies for cancer therapy. Curr Opin Pharmacol 2005; 5: 382-7.

En un aspecto adicional, la invención se refiere a un método para el tratamiento de un cáncer, que comprende administrar un ligante de afinidad, siendo un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de éste, específico para la forma de 38 kDa de PRELP a un sujeto que padece un cáncer.

En un aspecto adicional, la invención se refiere a un método para indicar una célula como una célula cancerosa, que comprende detectar una presencia o no presencia de la forma de 38 kDa de PRELP en la superficie de dicha célula, en el que la presencia de la forma de 38 kDa de PRELP en dicha superficie de dicha célula indica que dicha célula es una célula cancerosa. Dicha detección puede hacerse usando un ligante de afinidad, siendo un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de éste, específico para la forma de 38 kDa de PRELP, conjugado opcionalmente con un resto detectable tal como un resto fluorescente, en métodos de detección rutinarios conocidos para el experto en la técnica.

Las realizaciones preferidas se muestran en las reivindicaciones dependientes.

Descripción breve de los dibujos

Figura 1. Análisis de transferencia Western para validar la especificidad de los anticuerpos anti-PRELP. El gen PRELP precursor se clonó en el vector pCMV6-Neo y se transfectó en la línea celular de ratón SP2/0. Carril 1: Lisado celular de células SP2/0 transfectadas con el vector solo (control negativo). Carril 2: Lisado celular de células SP2/0 transfectadas con la construcción PRELP. El PRELP recombinante se detectó usando A) anticuerpo policlonal anti-PRELP C terminal de conejo que reconoce las formas no glicosiladas y glicosiladas de PRELP recombinante (38 kDa, 44 kDa, 48 kDa y 5558 kDa); B) anticuerpo monoclonal de ratón anti-PRELP C terminal y C) anticuerpo monoclonal de ratón anti-PRELP N terminal que reconoce PRELP no glicosilado (38 kDa).

Figura 2. Transferencia Western de lisados celulares de pacientes CLL y donantes control sanos. A) Fracción celular citosólica de tres controles sanos, tres CLL no progresiva y tres pacientes CLL progresiva. Panel superior: un anticuerpo policlonal anti-PRELP C terminal de conejo que detecta una banda de 38 kDa en células CLL pero no en PBMC de donantes sanos. Panel inferior: La misma membrana cortada y re-ensayada con un anticuerpo monoclonal anti-β-actina. B) Fracciones citosólicas y de citoesqueleto/membrana respectivamente de tres pacientes CLL y un donante sano. El anticuerpo monoclonal anti-PRELP N terminal reconoció PRELP monomérico de 38 kDa en la fracción citosólica y una banda de 76 kDa que probablemente representa un dímero de PRELP en la fracción de citoesqueleto y membrana.

Figura 3. Transferencia Western de muestras de suero (1:50) de pacientes CLL (n= 4) y donantes sanos (n= 4). Un anticuerpo policlonal anti-PRELP C terminal de conejo detectó bandas de PRELP de 50 kDa y 58 kDa en todas las muestras.

Figura 4. Desglicosilación química de PRELP recombinante producido en levaduras, PRELP madura desprovista del péptido señal. Se realizó transferencia Western usando un anticuerpo policlonal anti-C terminal. Carril 1: PRELP recombinante derivada de levaduras no tratada, Carriles 2 y 3: PRELP recombinante derivada de levaduras tratado con

TFMS durante 2 y 4 h, respectivamente. Después de la eliminación completa de las estructuras de carbohidrato, apareció una banda de 38 kDa.

Figura 5. La apoptosis se ensayó con tinción con Anexina V-FITC y yoduro de propidio (PI). Se incubaron PBMC sanas en presencia o ausencia de anticuerpo anti-PRELP durante 18 horas. A) Diagrama de gráficos de puntos que representa control sano sin anticuerpo (No Ab). B) 10 µg de anticuerpo anti-PRELP (PRELP-SS Clon 6G1-G11) en PBMC de un individuo sano. No se observó efecto apoptótico en PBMC sanas con y sin anticuerpo.

Figura 6. La apoptosis se ensayó con tinción con Anexina V-FITC y yoduro de propidio (PI). Se incubaron células CLL en presencia o ausencia de anticuerpo anti-PRELP durante 18 horas. A) Diagrama de gráficos de puntos que representa un paciente CLL sin anticuerpo (No Ab) con 10,8% de apoptosis espontánea. B, C, D) Se incubaron 2,5, 5 y 7,5 µg de anticuerpo anti-PRELP (PRELP-SS Clon 6G1-G11) con un número igual de células leucémicas, respectivamente. Los resultados muestran un efecto dependiente de la dosis sobre la apoptosis en células CLL. La apoptosis se incrementó de 10,8 a 16,9, 32,2 y 39,2% respecto a 2,5, 5 y 7,5 µg del anticuerpo.

Figura 7. Tinción de la superficie celular de líneas celulares de linfoma de células B humano usando tres clones de anticuerpos monoclonales anti-PRELP de 1C4-F8, 1C10-C3 y 3A5, generados frente a la parte N terminal de PRELP humano. La IgM de ratón se usó como control de isotipo y anti-Ig de ratón de oveja conjugada con FITC se usó como anticuerpo secundario.

Fig. 8. A) Línea celular MDA (cáncer de mama humano). B) Línea celular 2780S (carcinoma de ovario humano) y 2008C13R (carcinoma de ovario humano). C) Línea celular caov4 (carcinoma de ovario humano). La IgM de ratón se usó como control de isotipo y anti-Ig de ratón de oveja conjugada con FITC se usó como anticuerpo secundario.

Fig. 9. Análisis de transferencia Western de diferentes tejidos y líneas celulares usando dos clones de anticuerpos monoclonales anti-PRELP de 4A4 y 1C10-C3 generados frente a la parte N terminal de PRELP humano ambos en condiciones reductoras y no reductoras. La Ig anti-ratón de oveja conjugada con HRP se usó como anticuerpo secundario. A) Condiciones reductoras: Carril 1. Lisado de células tumorales de una paciente femenina de 23 años de edad con neuroblastoma, Carril 2. Lisado de células tumorales de masa abdominal de una paciente femenina de 35 meses de edad con neuroblastoma, Carril 3. Lisado de células tumorales de masa abdominal de una paciente femenina de 34 meses de edad con neuroblastoma, Carril 4. Lisado de células tumorales de masa cerebral de una paciente femenina de 25 meses de edad con meduloblastoma, Carril 5. Lisado celular de la línea celular U373 (glioblastoma humano), Carril 6. Lisados celulares de una piel humana sana, carril 7. Lisado celular de PBMC de un paciente CLL. Se usó anti-PRELP clon 4A4 como anticuerpo primario.

B) Transferencia Western en condiciones no reductoras y reductoras usando anticuerpo monoclonal anti-PRELP clon 1C10-C3. Carril 1. Lisado de la línea celular MDA (cáncer de mama humano), Carril 2. Lisado de la línea celular U373 (glioblastoma humano), Carril 3. Lisado de la línea celular PC3 (cáncer de próstata humano), Carril 4. Lisado celular de un PBMC sano humano. Las bandas respectivas de Ig se revelan después de reducción. La banda de 34 kDa corresponde a PRELP. La aparición de las cadenas pesada y ligera de Ig en las transferencias Western se debe a la reactividad cruzada del anticuerpo secundario con inmunoglobulinas humanas. Se usó anti-PRELP clon 1C10-C3 como anticuerpo primario. Se usó anti-ratón de oveja conjugado con HRP como anticuerpo secundario en este experimento.

Fig. 10. Inmunocitoquímica (ICC) en la línea celular de cáncer de mama humano SKBR3. A) Células SKBR3 teñidas con IgM de ratón irrelevante como control de isotipo. B) Células SKBR3 teñidas con anticuerpo monoclonal anti-PRELP clon 1C10-C3. Se usó anti-ratón de oveja conjugado con FITC como anticuerpo secundario.

Fig. 11. Inmunohistoquímica (IHC) en tejidos de mama humanos normales. A) IgM de ratón irrelevante como control de isotipo. B) anticuerpo monoclonal anti-PRELP clon 1C10-C3. Se usó anti-ratón de oveja conjugado con FITC como anticuerpo secundario.

Fig. 12. Inmunohistoquímica (IHC) en tejidos humanos normales. A y B) tejido de piel humana de un hombre de 26 años de edad teñido con IgM de ratón irrelevante como control de isotipo y anticuerpo monoclonal anti-PRELP clon 1C10-C3, respectivamente.

B y C) tejido de piel humana de una mujer de 67 años de edad teñido con IgM de ratón irrelevante como control de isotipo y anticuerpo monoclonal anti-PRELP clon 1C10-C3, respectivamente. No se observó expresión de PRELP en los tejidos de piel de estos dos individuos normales. Se usó anti-ratón de oveja conjugado con FITC como anticuerpo secundario.

Fig. 13. Inmunohistoquímica (IHC) en tejidos de testículo humanos normales. El tejido de testículo se obtuvo de un hombre de 49 años de edad 24 horas después de la muerte. A) IgM de ratón irrelevante como control de isotipo. B)

anticuerpo monoclonal anti-PRELP clon 1C10-C3. Se usó anti-ratón de oveja conjugado con FITC como anticuerpo secundario. No se observó expresión de PRELP en el tejido de testículo.

Fig. 14. Representación esquemática de la interacción de anticuerpo anti-PRELP con células cancerosas tanto para diagnóstico como terapia. El diagrama muestra la expresión de PRELP en una célula normal como una proteína madura secretada. En una célula normal la proteína precursora se sintetiza en el retículo endoplásmico (RE). Después de la escisión del péptido señal por peptidasas de señal, la proteína madura se secretará a la matriz extracelular. Como el anticuerpo anti-señal es frente al péptido señal, no puede interaccionar con la proteína PRELP madura que carece del péptido señal, permaneciendo inocuo (panel izquierdo). En una célula cancerosa por una razón todavía desconocida la PRELP expresada estará en un formato precursor incapaz de secretarse pero que se expresa en la superficie celular bien intacta o anclada a una proteína desconocida. Este PRELP precursor de la superficie celular puede ser reconocido por e interaccionar con anticuerpo anti-señal dando lugar a la inducción de la apoptosis. La generación de anticuerpo frente a cualquier otra parte de PRELP además del péptido señal para el tratamiento in vivo causará la interacción con PRELP secretada (en la matriz extracelular) dando lugar a la generación de complejo anticuerpo-antígeno con la mediación posterior de la respuesta inmune desencadenando daño tisular. Pero los anticuerpos frente a la parte completa de PRELP pueden usarse como una herramienta para detectar PRELP y diagnosticar cáncer según la invención.

Secuencias

SEQ ID NO: 1: VH (anti-PRELP-SS clon 6G1-G11), isotipo IgM de ratón.

SEQ ID NO: 2: VL (anti-PRELP-SS clon 6G1-G11), cadena kappa de ratón.

SEQ ID NO: 3: Secuencia de ADN que codifica VH (anti-PRELP-SS clon 6G1-G11), isotipo IgM de ratón.

SEQ ID NO: 4: Secuencia de ADN que codifica VL (anti-PRELP-SS clon 6G1-G11), cadena kappa de ratón.

SEQ ID NO: 5: Anti-PRELP-SS VH clon HB35-G11

SEQ ID NO: 6: Secuencia de ADN que codifica Anti-PRELP-SS VH clon HB35-G11.

SEQ ID NO: 7: Parte N terminal de PRELP (péptido señal)

SEQ ID NO: 8: Parte C terminal de PRELP

Descripción detallada de la invención

El presente estudio demuestra que una proteína PRELP no glicosilada de 38 kDa parece expresarse exclusivamente en células leucémicas CLL, líneas celulares de CLL, células MCL, células de linfoma de Burkitt, células de cáncer de mama, células de cáncer de ovario, células de cáncer de próstata y células de glioblastoma. Otras malignidades hematológicas así como PBMC de donantes normales no expresaron PRELP. La activación policlonal fuerte (PMA/yonomicina) de linfocitos B y T normales no indujo la expresión de PRELP (datos no mostrados), lo que sugiere que la expresión de PRELP de 38 kDa en CLL podría reflejar una aberración constitutiva in vivo.

PRELP se secreta normalmente en el compartimento de la matriz extracelular pero su función no se conoce claramente. Las proteínas PRELP maduras (50 y 58 kDa), que se detectaron en suero tanto de pacientes CLL como donantes sanos, se producen probablemente por los fibroblastos. Sin embargo, en las células CLL, se identificó una única proteína PRELP de 38 kDa. El análisis de mutación del gen PRELP en CLL no reveló ninguna aberración de nucleótidos sustancial que pudiera explicar la diferencia a nivel de proteína. No se encontraron mutaciones de nucleótidos en la región C terminal (frente a la que se generó nuestro anticuerpo C terminal). Estos descubrimientos, en combinación con el pequeño número de exones codificadores (sólo 2 exones) hacen que las variantes de corte y empalme o truncamientos sean improbables. La PRELP de 38 kDa específica de CLL se detectó por un anticuerpo monoclonal frente al péptido señal de PRELP lo que indica que el péptido señal no se ha eliminado por escisión. Además, la PRELP de 38 kDa específica de CLL no se detectó en suero. Esto podría deberse a una secreción alterada de las células leucémicas y la retención en orgánulos subcelulares o, alternativamente, a la rápida degradación en el suero por proteasas. La presencia de un péptido señal intacto puede sugerir la retención en el citosol. La glicosilación alterada y el péptido señal retenido pueden ser específicos de CLL, ya que la PRELP expresada en las células SP2/0 parece ser completamente madura y procesada, es decir, translocada, glicosilada y con el péptido señal eliminado por escisión (Figura 1). Se han indicado observaciones similares para las cadenas mu y CD79a en la superficie de las células CLL21 .

La diferencia entre PRELP normal (50-58 kDa) y PRELP derivada de CLL (38 kDa) puede deberse a modificaciones posteriores a la traducción. La desglicosilación completa de PRELP derivada de levaduras resultó en una PRELP de 38

kDa, correspondiente en tamaño a la PRELP detectada en CLL, posiblemente la proteína central PRELP sin modificaciones de glicano en la cadena lateral.

La dimerización estable de varios SLRP incluyendo opticina, decorina, biglicano y condroadherina22-25 apoya la sugerencia de una PRELP dimerizada en CLL. La formación de dímeros de PRELP puede ser análoga al modelo propuesto de dimerización de opticina22. En este modelo, el amino terminal del dímero era accesible a anticuerpos lo que podría explicar la reactividad de nuestro anticuerpo N terminal con la PRELP dimerizada. Los análisis de fraccionamiento de células CLL indicaron que la PRELP dimerizada está localizada en las fracciones de citoesqueleto y de membrana.

Éste es el primer estudio que asocia PRELP con CLL. Existen publicaciones que asocian otros SLRP al cáncer. La decorina suprime el crecimiento celular y la angiogénesis mediada por células tumorales26,27. La decorina y los demás SLRP son proteínas secretadas que normalmente median sus funciones mediante la unión a receptores de membrana o proteínas de la matriz extracelular. Sin embargo, se han indicado otras localizaciones y funciones. Se ha propuesto un papel intracelular para la decorina mediante la unión a la proteína del citoesqueleto, filamina28 . Se ha mostrado que PRELP se une e inhibe la actividad de NF-kappa B en el núcleo de osteoclastos29 .

Nuestros descubrimientos sugieren una PRELP de 38 kDa no secretada en CLL pero el papel no está claro. Sin embargo, la expresión específica y única de una proteína PRELP de 38 kDa indica fuertemente un papel funcional en CLL. La expresión específica de otro proteoglicano, FMOD6 en CLL puede sugerir un papel de los proteoglicanos en CLL. Además, los datos preliminares indican que otro SRLP, opticina, localizado muy cerca de FMOD y PRELP en el cromosoma 1 (1q32) también está regulado al alza en CLL. La caracterización funcional de estos proteoglicanos en CLL se requiere urgentemente para entender su importancia biológica.

Experimentos adicionales que muestran la expresión de PRELP en Raji, una línea celular de linfoma de Burkitt humano, añaden pruebas a la posibilidad de la expresión de PRELP en otras malignidades hematológicas o incluso tumores sólidos. Para investigar la expresión de PRELP en tumores sólidos se seleccionó un panel de líneas celulares. La razón para seleccionar la línea celular es la facilidad para separar las células para detectar la expresión en la superficie por la técnica de citometría de flujo. Las células adherentes se recuperaron sin tripsinización, ya que esto puede alterar la estructura de los antígenos de superficie dando lugar a resultados falsos. Debe indicarse que la expresión en la superficie de PRELP en células tumorales es crucial para tomar como diana las células cancerosas. PRELP no se expresa en la superficie de las células normales.

La expresión de PRELP en líneas celulares de cáncer de mama, ovario, próstata así como en células de glioblastoma y también la ausencia de expresión en la superficie en las células normales verifica adicionalmente el uso de esta estructura única para tomar como diana las células cancerosas mediante un anticuerpo monoclonal. Nuestros anticuerpos se generan frente al péptido señal de PRELP, en el que se elimina por escisión en condiciones normales en el retículo endoplásmico antes de la secreción a las matrices extracelulares. Éste es el asunto más importante, lo que hace que la PRELP expresada en la superficie celular en las células tumorales sea una diana completamente única y también segura sin interacción con ninguna otra molécula de PRELP expresada por otros tejidos normales.

Para investigar este tema, se obtuvieron tejidos normales especialmente PBMC, mama, testículo y piel y se estudió la expresión de PRELP. No se encontró expresión de PRELP en estos tejidos normales usando tres clones diferentes de anticuerpos anti-PRELP.

Un nivel alto de expresión de PRELP en tres líneas celulares de cáncer de mama diferentes, SKBR3, MDA y BT474 así como tres líneas celulares de carcinoma de ovario A2780S, 2008C13R y CaOv4 sin expresión en una mama sana sugiere fuertemente la expresión ectópica de PRELP en dichos tumores lo que hace que esta molécula sea un buen candidato para el direccionamiento. También hemos mostrado que el anticuerpo anti-PRELP puede inducir la apoptosis en células CLL. Esta función puede conferir a cualquier otra célula que expresa PRELP. En general, sugerimos que los anticuerpos anti-PRELP generados específicamente frente al péptido señal podrían usarse para tomar como diana cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de próstata, leucemia linfocítica crónica, linfoma de Burkitt, glioblastoma, neuroblastoma y meduloblastoma sin dañar al menos tejidos de piel, mama, testículo y, lo más importante, células mononucleares de sangre periférica.

Definiciones

El término "ligante de afinidad" debe considerarse como que es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de éste capaz de unirse selectivamente a un analito de interés. Los ligantes de afinidad pueden ser anticuerpos policlonales o monoclonales, fragmentos de éstos tales como fragmentos F(ab')2, Fab, Fab', Fv, Fc y Fd, que pueden incorporarse en anticuerpos de dominio único, anticuerpos de cadena única, maxicuerpos, minicuerpos, intracuerpos, fragmentos divalentes, fragmentos trivalentes, fragmentos tetravalentes, v-NAR y bis-scFv.

Afinidad entre dos entidades significa una afinidad de al menos 106, 107, 108, 109 M-1 ó 1010 M-1 . Se prefieren las afinidades mayores de 108 M-1 .

El término "especifico para" indica que las regiones variables de los anticuerpos reconocen y se unen a PRELP según la invención exclusivamente (es decir, son capaces de distinguir PRELP de otros polipéptidos similares a pesar de identidad de secuencia, homología o similitud encontrada en la familia de los polipéptidos), pero que también pueden interaccionar con otras proteínas (por ejemplo, proteína A de S. aureus u otros anticuerpos en técnicas de ELISA) a través de interacciones con secuencias fuera de la región variable de los anticuerpos y, en particular, en la región constante de la molécula. Los ensayos de cribado en los que se puede determinar la especificidad de unión de un anticuerpo anti-PRELP son muy conocidos y se practican rutinariamente en la técnica. (Capítulo 6, Antibodies A Laboratory Manual, Eds. Harlow, et al., Cold Spring Harbor Laboratory; Cold Spring Harbor, NY (1988), incorporado en la presente memoria por referencia en su totalidad).

Un "agente inmunogénico" o "inmunógeno" es capaz de inducir una respuesta inmunológica frente a sí mismo después de la administración a un paciente, opcionalmente conjuntamente con un adyuvante.

Los anticuerpos que reconocen el mismo epítopo pueden identificarse en un inmunoensayo sencillo que muestra la capacidad de un anticuerpo de bloquear la unión de otro anticuerpo a un antígeno diana. Las células T reconocen epítopos continuos de aproximadamente nueve aminoácidos para células CD8 o aproximadamente 13-15 aminoácidos para células CD4. Las células T que reconocen el epítopo pueden identificarse mediante ensayos in vitro que miden la proliferación dependiente de antígeno, según se determina por la incorporación de 3H-timidina por células T estimuladas en respuesta a un epítopo (Burke et al., J. Inf. Dis. 170, 1110-19 (1994)), mediante muerte dependiente de antígeno (ensayo de linfocitos T citotóxicos, Tigges et al., J. Immunol. 156, 3901-3910) o mediante la secreción de citoquinas.

Cuando se practica la presente invención, el experto en la técnica puede usar además técnicas convencionales en el campo de la química farmacéutica, inmunología, biología molecular, microbiología, biología celular, animales transgénicos y tecnología de ADN recombinante, como se describe, entre otros, en Sambrook et al. "Molecular cloning: A laboratory manual", 3ª ed. 2001; Ausubel et al. "Short protocols in molecular biology", 5ª ed. 1995; "Methods in enzymology", Academic Press, Inc.; MacPherson, Hames y Taylor (eds.). "PCR 2: A practical approach", 1995; "Harlow y Lane (eds.) "Antibodies, a laboratory manual" 1988; Freshney (ed.) "Culture of animal cells", 4ª ed. 2000; Hogan et al. "Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1994; o ediciones posteriores de estos libros.

Ejemplos

Los ejemplos siguientes sirven para ilustrar la invención y no debe considerarse que limitan el alcance de la invención, que es el de las reivindicaciones.

Materiales y métodos

Pacientes y controles

El diagnóstico de CLL y el estadio de la enfermedad (progresivo/no progresivo) se establecieron como se describe13 usando la clasificación de la OMS de malignidades hematopoyéticas y linfoides y los criterios NCI modificados14,15. Las características clínicas de los pacientes se muestran en la Tabla 1.

Se recogió sangre heparinizada como la fuente de células leucémicas de pacientes con CLL (n= 30), MCL (n= 5), leucemia de células pilosas (HCL) (n= 2), leucemia prolinfocítica de células B (B-PLL) (n= 1), leucemia prolinfocítica de células T (T-PLL) (n= 4), leucemia mielógena crónica (CML) (n= 5), leucemia mielógena aguda (AML) (n= 5) y leucemia linfoblástica aguda (ALL) (n= 10). Las células tumorales de médula ósea se obtuvieron de pacientes con mieloma múltiple (MM) (n= 6) y linfoma folicular (FL) (n= 2). También se recogió sangre de donantes control sanos (n= 10). Se recogió suero de pacientes CLL (n= 8) y controles sanos (n= 8). Todas las muestras se recogieron con consentimiento informado de los pacientes y aprobación del comité ético local.

Líneas celulares hematológicas y de fibroblastos

Se incluyeron cuatro líneas celulares de CLL y nueve líneas celulares derivadas de una variedad de otras malignidades hematológicas; CLL (EHEB, I83-E95, 232-B4, WAC3-CD5), MM (LP-1), leucemia de células T (SKW3), ALL (HUT-78, HPB-ALL, MOLT-4, JURKAT), AML (HL60), CML (K562) y linfoma de células NK (YT). EHEB e YT se obtuvieron de DSMZ (Braunschweig, Alemania). Las demás líneas celulares de CLL (I83-E95, 232-B4, WAC3-CD5)16 fueron un regalo amable del Prof. Anders Rosén (Linköping University, Suecia) y Prof. Kenneth Nilsson (Uppsala University, Suecia). Las líneas celulares restantes fueron proporcionadas por el National Cell Bank de Irán (NCBI, Pasteur Institute de Irán, Teherán, Irán). Todas las líneas celulares se adaptaron para crecer en medio RPMI-1640 (Gibco, Paisley, Escocia)

suplementado con 10% suero fetal bovino (FBS) (Gibco), L-glutamina (2 mM), penicilina (100 U/ml) y estreptomicina (100 µg/ml) (Gibco).

Aislamiento de las células

Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) (linfocitos y monocitos) de donantes normales y células leucémicas de la sangre y médula ósea usando centrifugación con gradiente de densidad Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare, Bio-sciences AB, Buckinghamshire, Reino Unido), como se describe17 . Los granulocitos, células B leucémicas, linfocitos T y B normales se aislaron como se describe6. La pureza de las poblaciones aisladas se ensayó por inmunofluorescencia directa usando anticuerpos monoclonales frente a CD3, CD19 y CD14 (BD Biosciences, San Jose, CA, EEUU).

Amplificación por RT-PCR y RT-QPCR del ARNm de PRELP

Se extrajo ARN total de células leucémicas y PBMC normales usando el reactivo RNAzol B (BioSite, Täby, Suecia) según las instrucciones del fabricante. Se sintetizó la primera hebra de ADNc como se describe6. La amplificación por PCR se realizó usando cebadores específicos de PRELP (Tabla 2). Brevemente, se prepararon 25 µl de mezcla de reacción de PCR usando 2,5 µl de 10 x tampón, 2 µl de 25 mM MgCl2, 1,5 µl dNTP (10 mM), 5 pmoles de cada cebador y 1 unidad de ADN polimerasa Ampli-Taq Gold (Perkin-Elmer/Applied Biosystems, Boston, MA, EEUU). La PCR se realizó en 35 ciclos, iniciada por 1 ciclo a 950C durante 10 min, seguido de 920C; 30 seg, 600C; 30 seg y 720C; 30 seg dando lugar a un amplicón de 334 pb. Para asegurar la especificidad de los cebadores, algunos productos de PCR se clonaron en el vector pGEM-T easy (Promega, Madison, WI, EEUU) y se sometieron a secuenciación. La RT-QPCR se realizó como se describe6. Las muestras de ADNc se usaron como molde y se cuantificó la β-actina (gen constitutivo endógeno) como un control positivo frente al que se normalizaron los diferentes valores de molde.

Producción de la proteína PRELP

Para la expresión en levaduras, se combinaron los ADNc de PBMC de pacientes CLL (n=10) y se amplificó por PCR un transcrito de PRELP de longitud completa. El producto de PCR se clonó en el vector pGEM-T easy y se subclonó en el vector pGAPZα-A para la levadura P. pastoris (Invitrogen, Carlsbad, CA, EEUU). Los plásmidos recombinantes se seleccionaron para secuenciación. Después de seleccionar un clon en marco, la construcción se linearizó usando la enzima de restricción AvrII y se transfectó en la cepa de P. pastoris SMD1168 (Invitrogen). Las colonias se cribaron por amplificación por PCR específica de gen y los clones positivos se seleccionaron para la producción de proteína. El sobrenadante de un clon de levadura cultivado 72 h se recogió y se concentró hasta 30 veces usando Unidades de Filtro de Centrífuga Amicon Ultra-15 (Millipore Corporation, Bedford, MA, EEUU).

Para la expresión en células de mamífero, un clon de ADNc de PRELP de longitud completa (variante de transcrito 1, SC111673, TrueClones, OriGene Technologies, Inc. Rockville, MD, EEUU) se subclonó en el sitio NotI de un vector de expresión de mamíferos pCMV6-Neo (OriGene Technologies). Después de la selección y secuenciación de un clon en marco, el plásmido se transfectó en la línea celular SP2/0 de ratón para obtener transfectantes estables usando el reactivo de transfección jetPEI™ (Polyplus-transfection™, Illkirch, Francia). Las células se recogieron, se lavaron extensamente y se preparó un lisado como se describe para transferencia Western.

Desglicosilación química de la proteína PRELP

La proteína PRELP recombinante producida en levaduras se sometió a desglicosilación química usando ácido trifluorometanosulfónico (TFMS) (Sigma, St Louis, MO, EEUU) y anisol (Fluka, Sigma). El TFMS elimina todas las cadenas de carbohidrato de las glicoproteínas independientemente de la unión y composición18 .

Se precipitaron 250 µl de sobrenadante de cultivo de levaduras en 100% etanol a -200C toda la noche en dos tubos separados. Los sedimentos de proteína se recogieron por centrifugación a 15.000g durante 20 min, se lavaron en 95% etanol, se recogieron por centrifugación y se secaron al aire durante 1 h. Se añadieron 200 µl de TFMS y anisol (9:1) a los sedimentos secos y las muestras se incubaron en hielo durante 2 y 4 h, respectivamente. La reacción se paró por la adición de 2M Tris base (pH 8) hasta que el pH alcanzó 6. Las muestras se dializaron frente a 10 mM tampón fosfato durante 24 h, se concentraron 20 veces en Unidades de Filtro de Centrífuga Amicon Ultra-15 (Millipore Corp.) y se sometieron a transferencia Western.

Anticuerpos poli y monoclonales anti-PRELP

Se produjo un anticuerpo policlonal anti-PRELP de conejo frente a un péptido 19 mer (CGGKARAKGGFRLLQSVVI) adquirido en Thermo Electron Corporation GmbH (Ulm, Alemania) del que los últimos 9 aminoácidos corresponden a la parte carboxi terminal (C terminal) de PRELP humana9. El anticuerpo se purificó por cromatografía de afinidad.

Se produjeron dos anticuerpos monoclonales anti-PRELP de ratón usando péptidos PRELP conjugados con hemocianina de lapa (KLH) según un protocolo estándar con modificaciones menores19. Se generó un anticuerpo frente al péptido carboxi terminal (CGGKARAKGGFRLLQSVVI). El otro se generó frente a la región N terminal para la que se usó un péptido 20 mer (MRSPLCWLLPLLILASVAQG) (Thermo Electron) que abarca la secuencia señal completa.

Transferencia Western

Se prepararon lisados celulares como se describe con modificaciones menores20. Brevemente, se lisaron 50x106 células en 1 mL de tampón que contenía 0,2% tritón-X, 130 mM HEPES, 4 mM MgCl2, 10 mM EGTA con 2% de mezcla de inhibidores de proteinasas (Sigma). Después de 1 h de incubación en hielo, los lisados se centrifugaron a 2.500 rpm durante 5 min y se recogió la fracción soluble ("fase superior"). El sedimento resistente a Tritón-X se disolvió en tampón de muestra 1x NuPAGE LDS (Invitrogen) y se sonicó durante 3x15 seg ("fase inferior"). La concentración de proteína se midió por el ensayo de proteínas de Bio-Rad según las instrucciones del fabricante (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EEUU). El lisado celular (20 µg), suero (dil 1:50) y los sobrenadantes de levadura se sometieron a transferencia Western usando un gel al 10% NuPAGE Bis-Tris (Invitrogen) a 120 V durante 3 h en condiciones reductoras. Las proteínas resueltas se transfirieron a una membrana de PVDF Immobilon-P (Millipore Corp.) en un Mini-Transblot Cell (Invitrogen). Las membranas se bloquearon a +40C toda la noche con 5% de leche desnatada (Semper, Estocolmo, Suecia) en PBS más 0,05% Tween 20 (PBS-T). Los filtros se incubaron con 10 µg/ml de anticuerpo anti-PRELP policlonal de conejo o monoclonal de ratón toda la noche a +40C. Después de lavados extensos en PBS-T, los filtros se incubaron con un anticuerpo secundario anti-conejo de cabra o anti-ratón de conejo conjugado con peroxidasa de rábano (HRP) (DakoCytomation, Glostrup, Dinamarca) durante 1,5 h a temperatura ambiente. Los filtros se revelaron usando el sistema Enhanced Chemiluminiscence ECL™ de Amersham (GE Healthcare). Para verificar una carga igual de las muestras, los filtros se desmontaron en un tampón que contenía 62,5 mM Tris-HCl, 2% SDS, 100 mM mercaptoetanol (Sigma) a 500C durante 30 min. Después de lavado de 3x15 min en PBS-T, las membranas se re-ensayaron con 2,5 µg/ml de un anticuerpo monoclonal anti-β-actina de ratón (Sigma).

Ensayo de apoptosis

Se incubaron 2x106 células diana (células CLL o PBMC de donantes sanos) con 10 µg/ml de los anticuerpos monoclonales anti-PRELP de ratón o los controles de isotipo relevantes en 1 ml de medio sin suero (CTL-010, Cellular Technology Ltd. OH, EEUU). Después de 18 horas de incubación a 370C en aire humidificado con 5% CO2, las células se recogieron, se lavaron dos veces con 1xPBS y se resuspendieron en 100 µl de tampón de unión 1x a una concentración de 1x106 células/ml. Se añadieron a las células 5 µl de Anexina V conjugada con FITC y PI (BD Biosciences), se agitó con vórtex y se incubó a temperatura ambiente en oscuridad durante 15 minutos. Se añadieron 100 µl de tampón de unión 1x a las células que se analizaron por citometría de flujo (FACSCalibur).

Experimentos realizados durante el año de prioridad de la Convención de París

Inmunocitoquímica (ICC) e inmunohistoquímica (IHC)

Para ICC, las líneas celulares se cultivaron y recogieron usando 0,5% tripsina y 0,1% EDTA (Gibco), se cargaron 1-2 x 104 células en un portaobjetos de vidrio laminado de 8 pocillos (Marienfeld, Alemania) que se homogeneizaron en RPMI 1640 que contenía 20% FBS con incubación posterior en condiciones humidificadas durante toda la noche.

Después de la incubación de toda la noche, el medio se eliminó y las células se lavaron con PBS tres veces (3x3 min). Los portaobjetos se secaron a temperatura ambiente durante 15 min, se fijaron con acetona (a -200C), se permeabilizaron durante 2 minutos y se mantuvieron a 40C durante 30 min hasta que los portaobjetos estuvieron secos. Los portaobjetos se lavaron con disolución salina tamponada con Tris, pH 7,4, que contenía 5% de albúmina de suero bovino (TBS-BSA) tres veces (3x3 min). Los portaobjetos se bloquearon con 5% suero de oveja durante 10 min a temperatura ambiente. Los anticuerpos anti-PRELP primarios se diluyeron con TBS-BSA hasta una concentración final de 5 µg/ml y se incubaron a temperatura ambiente durante 60 minutos y se lavaron con TBS-BSA tres veces (3x3 min). El anti-ratón de oveja conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) (ACECR, Teherán, Irán) se diluyó con TBS-BSA en una proporción de 1:50 y se incubó a temperatura ambiente durante 45 minutos. Los portaobjetos control negativo de anticuerpo se incubaron con IgM de ratón (control de isotipo) a una concentración final de 10 µg/ml en TBS-BSA. Después de lavar con TBS-BSA, los núcleos se contratiñeron con dihidrocloruro de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (Calbiochem, EEUU) a 1 µg/ml durante 5 minutos, los portaobjetos se lavaron, se montaron en PBS-glicerol 80% y se examinaron con un microscopio de fluorescencia (Olympus, Tokio, Japón).

Para IHC, los tejidos después de su recepción se almacenaron a -800C. En el momento de realizar el experimento, los tejidos se equilibraron a -200C durante aproximadamente 2 horas antes de intentar seccionarlos.

Los tejidos se cortaron a un espesor de 5µm y se dejaron secar al aire durante 3-12 horas a temperatura ambiente. Las secciones de tejido se fijaron sumergiendo los portaobjetos en acetona pre-enfriada (-200C) durante 1,5 minutos a (-200C) seguido de 0,5 minutos a 40C.

El fijador se eliminó por vertido y se dejó que la acetona se evaporara de las secciones de tejido durante > 20 minutos a 40C. Las secciones se secaron al aire en la poyata durante 5 minutos. Los portaobjetos se lavaron en 300 µl de TBS (pH= 7,4)+ 0,1% BSA (TBS-BSA) durante 3 minutos. Los portaobjetos se cubrieron con reactivo de bloqueo durante 10 min a temperatura ambiente (5% de suero no inmune de especies de anticuerpo secundario en TBS-BSA). La disolución de bloqueo se eliminó y 100 µl de anticuerpo diluido (Anticuerpo diluido en TBS-BSA). El anticuerpo primario se añadió a cada sección. Se incubó a temperatura ambiente durante una hora. Después de esto, el anticuerpo primario se eliminó y los portaobjetos se lavaron con 200 µl de TBS-BSA 3 veces (cada uno de 3 min).

Se añadieron 100 µl de anticuerpo secundario anti-ratón de oveja (conjugado con FITC), diluido en TBS-BSA. Los portaobjetos se incubaron durante 45 minutos en oscuridad a temperatura ambiente. Después de esto, el anticuerpo secundario se eliminó y los portaobjetos se lavaron con 200 µl de TBS-BSA 3 veces (cada uno de 3 min).

Se añadieron 100 µl de DAPI (0,1 µg/ml diluido en TBS-BSA) a cada sección. Los portaobjetos se incubaron aproximadamente 5 minutos en oscuridad a temperatura ambiente. Después de eliminar el DAPI, los portaobjetos se lavaron en 200 µl de TBS-BSA 3 veces (cada uno de 1 min).

Se montó el cubreobjetos usando TBS-glicerol (50% v/v).

Análisis de citometría de flujo

Las células se recogieron con 0,5% tripsina y 0,1% EDTA (Gibco) y se lavaron concienzudamente con PBS. Según el protocolo relacionado, el análisis de las muestras y la adquisición de datos se realizaron con software de análisis de citometría de flujo Flomax (Partec, Alemania).

Resultados

Expresión génica de PRELP

La expresión del ARNm de PRELP en células leucémicas de sangre periférica de pacientes CLL así como de otras malignidades hematológicas y donantes control sanos se ensayó por RT-PCR. Las PBMC de todos los pacientes CLL (n= 30) expresaron PRELP (Tabla 3), independientemente de la fase clínica (no progresiva/progresiva). PRELP también se expresó en células tumorales de pacientes MCL (3/5) pero no en AML (0/5), FL (0/2) PLL T o B (0/5), HCL (0/2), MM (0/6), CML (0/5) y ALL (0/10). PRELP no se expresó en PBMC frescas (linfocitos y monocitos) de donantes sanos (0/10), células B (0/6), células T (0/4) o granulocitos (0/5) de sangre normal enriquecida.

PRELP se expresó en cuatro líneas celulares de CLL (EHEB, I83-E95, 232-B4, WAC3-CD5) pero no en líneas celulares derivadas de mieloma (0/1), leucemia de células T (0/1), ALL (0/4), AML (0/1), CML (0/1) y linfoma de células NK (0/1) (Tabla 4). La secuenciación del ADNc de 10 pacientes CLL no reveló mutaciones importantes en el gen de PRELP (datos no mostrados).

Especificidad de los anticuerpos anti-PRELP

El MW de la proteína PRELP normal es 55 kDa9. La especificidad de nuestros anticuerpos anti-PRELP poli y monoclonales se ensayó frente a PRELP recombinante expresada en la línea celular SP2/0 de ratón (Figuras 1A-C). Se usaron células transfectadas con el vector pCMV6-Neo solo como un control negativo. En la transferencia Western, el anticuerpo policlonal C terminal reconoció una banda principal de 55-58 kDa, correspondiente a la proteína PRELP madura, glicosilada9. Además, este anticuerpo policlonal detectó tres bandas de 38 kDa, 44 kDa y 48 kDa, que presumiblemente representan PRELP no glicosilada o parcialmente glicosilada10. Los anticuerpos monoclonales frente al C terminal así como el N terminal, sólo reconocieron la PRELP de 38 kDa. Esto puede deberse a que los anticuerpos monoclonales podrían reconocer epítopos que están escondidos por estructuras secundarias en la proteína PRELP madura.

Expresión de la proteína PRELP

Se ensayaron PBMC de pacientes CLL (n= 30) para la expresión de la proteína PRELP en transferencia Western. Se prepararon lisados de células tumorales por un método en 2 etapas dando lugar a dos fracciones. En la fracción superior, que representa la parte citosólica, se detectó una banda de 38 kDa en todos los pacientes CLL (Figura 2A). En la fracción inferior resistente a Tritón-X que se consideró que contenía estructuras de membrana y citoesqueleto20 se observó una banda de aproximadamente 76 kDa (Figura 2B). La banda de 38 kDa fue reconocida tanto por los

anticuerpos C terminal (monoclonal y policlonal) como N terminal (monoclonal) eliminando la posibilidad de que el fragmento de 38 kDa fuera un producto de degradación. La banda de 76 kDa sólo se detectó por el anticuerpo monoclonal N terminal. Una posible explicación es que la variante de 76 kDa tenga el péptido señal sin escindir y la parte C terminal escondido, lo que podría deberse a la formación de dímeros. Las cuatro líneas CLL también expresaron la PRELP de 38 kDa así como el dímero de 76 kDa (datos no mostrados). Las PBMC de donantes control sanos (n= 10) no expresaron ninguna de las variantes de la proteína PRELP (Figura 2A-B). También analizamos el suero de 8 pacientes CLL y 8 donantes control sanos por transferencia Western. Todas las muestras de suero mostraron dos bandas, 50 y 58 kDa, que representan la PRELP madura glicosilada10 (Figura 3). Las proteínas PRELP de 38 kda y 76 kDa no se detectaron en el suero de pacientes ni donantes normales.

Desglicosilación de la proteína PRELP

La PRELP derivada de levaduras no tratada tenía un MW de aproximadamente 100 kDa (Figura 4) que puede representar un dímero de la PRELP madura glicosilada (55 kDa). Después de la desglicosilación química usando TFMS durante 2 h, aparecieron bandas en la región de 51-64 kDa, que pueden representar monómeros de la PRELP madura glicosilada. Después de tratamiento con TFMS durante 4 h, se observó una banda de 38 kDa, correspondiente a la proteína PRELP completamente desglicosilada (Figura 4).

Ensayo de apoptosis

Los resultados del ensayo de apoptosis se presentan en las Figuras 5 y 6.

Resultados de experimentos realizados durante el año de prioridad de la Convención de París

La expresión de PRELP se estudió en dos líneas celulares incluyendo Raji (linfoma de células B humano) y I83-E95 (línea de leucemia linfocítica crónica) por tinción de la superficie celular (citometría de flujo). Los experimentos de citometría de flujo usando diferentes clones de anticuerpos anti-PRELP mostraron una reactividad de 22-80% en Raji en los que el clon 3A5 mostró la reactividad más alta (Fig. 7). La expresión de PRELP se estudió en una línea celular de cáncer de mama humano MDA mostrando 9-17% de reactividad por citometría de flujo dependiendo de la clonalidad del anticuerpo anti-PRELP (Fig. 8A). El perfil de expresión de PRELP en tres líneas celulares de carcinoma de ovario A2780S, 2008C13R y CaOv4 fue 44, 50 y 23%, respectivamente, por citometría de flujo usando el anticuerpo anti-PRELP clon 1C10-C3 (Fig. 8B y 8C).

Los tejidos tumorales de tres pacientes con neuroblastoma y un paciente con meduloblastoma también mostraron expresión de PRELP usando el anticuerpo anti-PRELP clon 4A4 (Fig. 9A). La expresión de PRELP fue mayor en tejidos tumorales en comparación con PBMC de un donante sano (Fig. 9A).

El análisis por transferencia Western de los lisados de las líneas celulares MDA (cáncer de mama humano), U373 (glioblastoma humano) y PC3 (cáncer de próstata humano) mostraron una expresión fuerte de PRELP sin reactividad con PBMC humanas de un donante sano (Fig. 9B).

La inmunocitoquímica (ICC) en la línea celular de cáncer de mama humano SKBR3 mostró una expresión fuerte de PRELP usando el anticuerpo anti-PRELP clon 1C10-C3 (Fig. 10). No se detectó expresión de PRELP en tejidos humanos normales de mama, piel y testículos (Figs. 11-13).

La Tabla 5 muestra un resumen de la expresión de PRELP en diferentes tejidos y líneas celulares tanto en muestras patológicas como no patológicas usando tanto anticuerpos anti-PRELP N terminal como C terminal.

Tabla 1. Características clínicas de los pacientes CLL (n= 30) Característica Frecuencia % Sexo

No progresiva * 53

Estadio Rai

III 27

Tratamiento

* para definición, véase materiales y métodos (pacientes y controles) ** tratamientos estándar incluyendo clorambucilo, fludarabina, ciclofosfamida

Tabla 2. Cebadores y sondas usados en la amplificación por PCR y cuantificación de PRELP

S= Sentido, AS= Antisentido, Q= Azul-6-FAM, 9= TAMRA, g.b= genebank

Tabla 3. Expresión génica de PRELP (RT-PCR) de células tumorales recién aisladas de pacientes con varias malignidades hematológicas y PBMC de sangre de donantes control sanos

Fuente celular No. de casos positivos /no. total

Linfoma de células del manto (PBMC) 3/5

Leucemia linfoblástica aguda (PBMC) 0/10

Leucemia prolinfocítica (tipos de células B y T) (PBMC) 0/5

Linfoma folicular (BMMC) 0/2

PBMC sanos normales (linfocitos y monocitos) 0/10

Células B sanguíneas normales * 0/6

PBMC; células mononucleares de sangre periférica, BMMC; células mononucleares de médula ósea

* Pureza > 90%, ** pureza > 98%

CLL WAC3-CD5 Positivo

Leucemia de células T SKW3 Negativo

Leucemia linfoblástica aguda HPB-ALL Negativo

Línea celular/tejido: Descripción W.B FACS IHC/ICC Resumen

SKBR3: Cáncer de mama humano ND ND Positivo +

MDA: Cáncer de mama humano Positivo 9-17% ND +

BT474: Cáncer de mama humano ND 65% ND +

2008C13R: Cáncer de ovario humano ND 44% ND +

A2087S: Cáncer de ovario humano ND 50% ND +

CaOv4: Cáncer de ovario humano ND 25% ND +

PC3: Cáncer de próstata humano Positivo ND ND +

U373: Glioblastoma humano Positivo ND ND +

Raji: Linfoma de Burkitt humano ND 22-80% ND +

Mama: Tejido de mama humano normal ND ND Negativo -

Piel: Tejido de piel humano normal ND ND Negativo -

Testículo: Tejido de testículo humano normal ND ND Negativo -

PBMC-1: PBMC-1 humano normal Negativo 1-3% ND -

PBMC-2: PBMC-2 humano normal Negativo 1-3% ND -

PBMC-3: PBMC-3 humano normal Negativo 1-3% ND -

PBMC-4: PBMC-4 humano normal Negativo 1-3% ND -

Tabla 5. Perfil de expresión de PRELP en diferentes células y tejidos humanos patológicos y no patológicos usando diferentes anticuerpos monoclonales anti-PRELP en diferentes sistemas de lectura

5 ND; no determinado, FACS; citometría de flujo, W-B; transferencia western, IHC; Inmunohistoquímica, ICC; Inmunocitoquímica

REFERENCIAS

LISTA DE SECUENCIAS

<110> Modmab Limited UK Filial Rabbani, Hodjattallah

5 <120> Nueva diana diagnóstica y terapéutica

<130> P9437PC00

<150> US61/407556 10 <151>

<150> SE1051158-2

<151>

15 <160> 8

<170> PatentIn versión 3.5

<210> 1 20 <211> 135

<212> PRT

<213> Mus musculus

<220>: 25 <221> DOMINIO

<222> (44)..(51)

<223> CDRI

<220>: 30 <221> DOMINIO

<222> (69) .. (76)

<223> CDRII

<220>

<221> DOMINIO

<222> (114)..(125)

<223> CDRIII

<400> 1

10 <210> 2

<211> 127

<212> PRT

<213> Mus musculus

<220>

<221> DOMINIO

<222>: (48) .. (53) 5 <223> CDRI

<220>

<221> DOMINIO

<222>: (71) .. (73) 10 <223> CDRII

<220>

<221> DOMINIO

<222>: (109)..(118) 15 <223> CDRIII

<400> 2

5 <210> 3

<211> 408

<212> DNA

<213> Mus musculus

10 <400> 3

<210> 4

<211> 384

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 4

<210> 5

<211> 138

<212> PRT 15 <213> Mus musculus

<400> 5

5 <210> 6

<211> 414

<212> DNA

<213> Mus musculus

10 <400> 6

<210> 7

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 7

10 <210> 8

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

15 <400> 8

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Un método in vitro para evaluar el riesgo de que un sujeto padezca cánceres de tejidos u órganos derivados de las tres capas embrionarias de ectodermo, mesodermo y endodermo, que comprende medir el nivel de expresión de una forma de 38 kDa de la proteína rica en prolina/arginina con repeticiones de leucina terminales (PRELP) en células de dicho sujeto, en el que un nivel de expresión incrementado de PRELP, comparado con donantes sanos, indica una probabilidad incrementada de que dicho sujeto padezca dicho cáncer.
2.

Método según la reivindicación 1, en el que el cáncer es cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de próstata, glioblastoma, linfoma de Burkitt, neuroblastoma, meduloblastoma, leucemia linfocítica crónica (CLL) o linfoma de células del manto (MCL), preferiblemente CLL.
3.

Método según la reivindicación 1 ó 2, en el que el nivel de expresión de PRELP se mide en células de tejidos u órganos derivados de las tres capas embrionarias de ectodermo, mesodermo y endodermo, tales como tejido de mama, tejido de ovario, tejido de próstata, células neuronales y células sanguíneas, preferiblemente células mononucleares de sangre periférica.

4, Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que se mide el nivel de expresión de PRELP no glicosilada.
5.

Un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno de éste, específico para la forma de 38 kDa de PRELP.
6.

Anticuerpo según la reivindicación 5, siendo un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de éste, que tiene la secuencia de VH SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 5 y/o la secuencia de VL SEQ ID NO: 2.
7.

Un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno de éste, según la reivindicación 5 que es específico para la parte N terminal de PRELP.
8.

Anticuerpo según la reivindicación 5, o fragmento de unión a antígeno de éste, específico para un inmunógeno con la secuencia MRSPLCWLLPLLILASVAQG (SEQ ID NO: 7).
9.

Anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno de éste, según cualquiera de las reivindicaciones 5-8 que es un anticuerpo monoclonal.
10.

Anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno de éste, según cualquiera de las reivindicaciones 5-9, unido a un resto que tiene actividad anti-cancerosa.
11.

Anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno de éste, específico para una forma de 38 kDa de PRELP, para uso en terapia.
12.

Anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno de éste, específico para una forma de 38 kDa de PRELP, para uso en un método para el tratamiento de cáncer.
13.

Anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno de éste, específico para una forma de 38 kDa de PRELP para uso en un método para el tratamiento de cáncer, en el que las células de dicho cáncer expresan una forma de 38 kDa de PRELP en su superficie.
14.

Anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno de éste, específico para una forma de 38 kDa de PRELP para uso en un método para el tratamiento de un cáncer, en el que el cáncer es cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de próstata, glioblastoma, linfoma de Burkitt, neuroblastoma, meduloblastoma, leucemia linfocítica crónica (CLL) o linfoma de células del manto (MCL).
15.

Anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno de éste, para uso según la reivindicación 11-14, que es un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno de éste, según cualquiera de las reivindicaciones 6-10.
16.

Un método para indicar una célula como una célula cancerosa, que comprende detectar una presencia o no presencia de una forma de 38 kDa de PRELP en la superficie de dicha célula, en el que la presencia de una forma de 38 kDa de PRELP en dicha superficie de dicha célula indica que dicha célula es una célula cancerosa.
17.

Método según la reivindicación 16, en el que se mide el nivel de expresión de una forma de 38 kDa de PRELP en células derivadas de las tres capas embrionarias de ectodermo, mesodermo y endodermo, tales como tejido de mama, tejido de ovario, tejido de próstata, células neuronales o células sanguíneas de dicho sujeto.
18.

Método según la reivindicación 17 ó 18, en el que el cáncer es cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de próstata, glioblastoma, linfoma de Burkitt, neuroblastoma, meduloblastoma, leucemia linfocítica crónica (CLL) o linfoma de células del manto (MCL), preferiblemente CLL.
19.

Método según cualquiera de las reivindicaciones 16-18, en el que se mide la presencia o no presencia de PRELP no glicosilada.