ES2888024T3

ES2888024T3 - Reconocimiento de proteína similar a mucina de tipo membrana y aplicación clínica de la misma

Info

Publication number: ES2888024T3
Application number: ES17752868T
Authority: ES
Inventors: Shoutaro Tsuji; Taihei KAGEYAMA; Kota WASHIMI; Makiko Tsuji; Rieko MATSUURA; Mitsuyo YOSHIHARA; Kohzoh Imai
Original assignee: University of Tokyo NUC; Kanagawa Prefectural Hospital Organization
Current assignee: University of Tokyo NUC; Kanagawa Prefectural Hospital Organization
Priority date: 2016-02-15
Filing date: 2017-01-16
Publication date: 2021-12-30
Anticipated expiration: 2037-01-16
Also published as: US12123876B2; CN108699159B; PL3418304T3; EP3418304A1; US20190071517A1; EP3418304B1; JP2020196730A; JPWO2017141604A1; DK3418304T3; EP3418304A4; WO2017141604A1; CN108699159A; JP6859498B2

Abstract

Anticuerpo que se une a la proteína HEG1 que tiene glicosilación obtenida de mesotelioma, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, en el que la proteína HEG1 tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEQ ID NO: 30, 31, 33, 35 y 37.

Description

DESCRIPCIÓN

Reconocimiento de proteína similar a mucina de tipo membrana y aplicación clínica de la misma

Campo técnico

La presente invención se refiere al reconocimiento de una proteína similar a mucina de tipo membrana ya la aplicación clínica de la misma. Más específicamente, la presente invención se refiere a un anticuerpo para detectar mesotelioma y un anticuerpo que tiene alta especificidad para mesotelioma y alta sensibilidad al mismo. La presente invención también se refiere a un método de diagnóstico de mesotelioma mediante el uso del anticuerpo, un agente que comprende el anticuerpo para su uso en el diagnóstico de mesotelioma, y un kit que comprende el anticuerpo para su uso en el diagnóstico de mesotelioma. Además, la presente invención se refiere a un marcador para su uso en el diagnóstico de mesotelioma. Además, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que contiene el anticuerpo según la presente invención o un fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso en el tratamiento de mesotelioma.

Antecedentes de la técnica

El mesotelioma maligno, un tumor maligno generado principalmente por la exposición al amianto, es una enfermedad considerada como un problema social significativo. La detección temprana del mesotelioma maligno es difícil y el mesotelioma maligno se clasifica como uno de los tumores malignos con mal pronóstico. El mesotelioma maligno puede ser patológicamente similar al adenocarcinoma o sarcoma metastásico o las células mesoteliales reactivas, que se derivan de la proliferación benigna, y el diagnóstico diferencial de los mismos sobre una base patológica a menudo es difícil. Además, están presentes diversos tipos de tejidos de mesotelioma maligno, tal como el mesotelioma epitelial y el mesotelioma sarcomatoide, lo que ocasiona dificultades frecuentes en el diagnóstico del mesotelioma maligno. Si bien el desarrollo de un marcador inmunohistológico para el diagnóstico patológico con alta especificidad para el mesotelioma maligno se ha continuado en tales circunstancias, los anticuerpos que se usan con frecuencia no son necesariamente aquellos con alta especificidad para el mesotelioma maligno, y el diagnóstico diferencial desde múltiples puntos de vista generalmente se realiza mediante el uso de marcadores positivos y marcadores negativos en combinación en el diagnóstico patológico. El documento WO 2009/068204 A1 divulga anticuerpos específicos para el polipéptido de mesotelina de 40 kDa anclado a la membrana, que se sobreexpresa en varios tumores. Se divulga que determinados anticuerpos ahí descritos son adecuados para su uso en el diagnóstico y tratamiento de enfermedades asociadas con la presencia no deseada de mesotelina.

Los ejemplos de un marcador positivo que se usa con frecuencia para el diagnóstico patológico de mesotelioma maligno incluyen calretinina, citoqueratina 5/6 (CK5/6), mesotelina, podoplanina y el producto genético del tumor de Wilms 1 (WT-1). Estos marcadores permiten la detección del mesotelioma epitelial maligno generalmente con una alta sensibilidad (alrededor del 80 al 90%). Sin embargo, estos marcadores no son necesariamente superiores en especificidad y no pueden usarse para el diagnóstico diferencial entre el adenocarcinoma de pulmón y el mesotelioma epitelial maligno y la detección del mesotelioma sarcomatoide maligno en algunos casos. Una imagen de la localización nuclear de calretinina o WT-1 en el mesotelioma maligno es un factor importante en el diagnóstico diferencial del mesotelioma maligno. Se observa que las moléculas de tales marcadores se expresan en el citoplasma en diversos tejidos sanos y células cancerosas, y es necesario determinar si las moléculas se expresan en el núcleo o en el citoplasma. Por tanto, los marcadores son desventajosos en términos de visibilidad de los marcadores para el diagnóstico patológico.

El documento no de patente 1, en la que se analiza la expresión de genes como ARNm en el mesotelioma maligno, concluye que el aumento del nivel de ARNm analizado no es un fenómeno estadísticamente significativo y no especifica un factor disponible para el diagnóstico.

Lista de referencias

Bibliografía de patentes

Documento no de patente 1: Melaiu O. et al., Mutation Research, 771: 6-12, 2015

Sumario de la invención

La presente invención proporciona un anticuerpo para detectar mesotelioma y un anticuerpo que tiene alta especificidad para mesotelioma y alta sensibilidad al mismo. La presente invención también proporciona un método de diagnóstico de mesotelioma mediante el uso del anticuerpo, un agente que contiene el anticuerpo para su uso en el diagnóstico de mesotelioma, y un kit que comprende el anticuerpo para su uso en el diagnóstico de mesotelioma. Además, la presente invención proporciona un marcador para su uso en el diagnóstico de mesotelioma. Además, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que contiene el anticuerpo según la presente invención o un fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso en el tratamiento de mesotelioma.

Los presentes inventores encontraron que el anticuerpo SKM9-2 obtenido mediante la inmunización de un ratón con células de mesotelioma humanas es capaz de reconocer el mesotelioma con alta sensibilidad y alta especificidad. Los presentes inventores también encontraron que el antígeno del anticuerpo SKM9-2 es la proteína HEG1. Basándose en este resultado, los presentes inventores encontraron además que la proteína HEG1 puede usarse como marcador para el mesotelioma. Los presentes inventores encontraron además que el anticuerpo SKM9-2 se une a la proteína HEG1 de una manera dependiente de la glicosilación. Además, los presentes inventores encontraron que la proteína HEG1 que tiene glicosilación en mesotelioma también puede usarse como marcador para el mesotelioma. La presente invención se realizó basándose en estos hallazgos.

La invención se define por las reivindicaciones adjuntas. Específicamente, la presente invención proporciona lo siguiente.

[1] Un anticuerpo que se une a la proteína HEG1 que tiene glicosilación obtenida de mesotelioma, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, en el que la proteína HEG1 tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEQ ID NO: 30, 31, 33, 35 y 37.

[2] El anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo según [1], en el que el anticuerpo se une a la proteína HEG1 que tiene glicosilación obtenida de mesotelioma de una manera dependiente de la glicosilación.

[2'] El anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo según [1] o [2], en el que el anticuerpo se une a ambos de la parte de la cadena de azúcar y parte del péptido de la proteína HEG1 que tiene glicosilación obtenida de mesotelioma.

[2”] El anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo según [2], en el que el anticuerpo se une a un epítopo en el dominio extracelular de la proteína HEG1 humana expresada en células de mesotelioma humanas, pero experimenta debilitamiento en o pérdida de unión a la proteína HEG1 humana a través del tratamiento con a2-3 neuraminidasa o a2-3,6,8 neuraminidasa.

[3] Un anticuerpo que se une a la proteína HEG1 en una membrana celular de mesotelioma, en el que la proteína HEG1 tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEQ ID NO: 30, 31, 33, 35 y 37.

[4] El anticuerpo según [3] o un fragmento de unión a antígeno del mismo, en el que el anticuerpo es:

(1) un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 6, CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 8, y CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 10, y una región variable de cadena ligera que comprende CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 12, CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 14, y CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 16;

(2) un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en s Eq iD NO:2 y una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 4; o

(3) un anticuerpo que compite por la unión con el anticuerpo tal como se define en los (1) o (2) anteriores.

[5] Un anticuerpo que se une a un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 53, en el que el péptido se expresa en una línea celular de mesotelioma.

[6] El anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo según [4], en el que el antígeno es la proteína HEG1 que tiene glicosilación obtenida de mesotelioma, en el que la proteína HEG1 tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEQ ID NO: 30, 31, 33, 35 y 37.

[7] Un complejo de proteínas que comprende: una proteína de fusión de una región Vh o una región Vh y una región CH1 del anticuerpo según uno cualquiera de [1] a [6] con proteína intelectina humana; y una cadena ligera de dicho anticuerpo.

[8] Un agente para su uso en el diagnóstico de mesotelioma, que comprende un anticuerpo que se une a la proteína HEG1, el anticuerpo según uno cualquiera de [1] a [6] o un fragmento de unión a antígeno del mismo, o el complejo de proteínas según [7].

[9] Un agente para su uso en el diagnóstico in vivo de mesotelioma, que comprende un conjugado de un anticuerpo que se une a la proteína HEG1, el anticuerpo según uno cualquiera de [1] a [6] o un fragmento de unión a antígeno del mismo, o el complejo de proteínas según [7], con una sonda de obtención de imágenes.

[10] Un kit para su uso en el diagnóstico de mesotelioma, que comprende un anticuerpo que se une a la proteína HEG1, el anticuerpo según uno cualquiera de [1] a [6] o un fragmento de unión a antígeno del mismo, o el complejo de proteínas según [7].

[11] Un kit para su uso en el diagnóstico in vivo de mesotelioma, que comprende un conjugado de un anticuerpo que se une a la proteína HEG1, el anticuerpo según uno cualquiera de [1] a [6] o un fragmento de unión a antígeno del mismo, o el complejo de proteínas según [7], con una sonda de obtención de imágenes.

[12] Una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de mesotelioma, que comprende un anticuerpo que se une a la proteína HEG1, el anticuerpo según uno cualquiera de [1] a [6] o un fragmento de unión a antígeno del mismo, o el complejo de proteínas según [7], en la que la proteína HEG1 tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEQ ID NO: 30, 31, 33, 35 y 37.

[13] Una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de mesotelioma, que comprende un agente de supresión de la expresión para la proteína HEG1, proteína HEG1 que es la proteína HEG1 que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene homología con la secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEQ ID NO: 30, 31, 33, 35 y 37 del 80% o más.

[14] Un método de detección de mesotelioma, que comprende detectar la proteína HEG1 en una muestra separada de un organismo vivo, en el que la proteína HEG1 tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEQ ID NO: 30, 31, 33, 35 y 37.

[15] Un método de detección de mesotelioma, que comprende detectar la proteína HEG1 en una muestra separada de un organismo vivo mediante el uso de un anticuerpo que se une a la proteína HEG1, el anticuerpo según uno cualquiera de [1] a [6] o un fragmento de unión a antígeno del mismo, o el complejo de proteínas según [7].

[16] Proteína HEG1 que tiene glicosilación obtenida de mesotelioma o un fragmento de la misma que comprende una secuencia de aminoácidos desde la posición 799 hasta la posición 809 de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 35.

[16'] Proteína HEG1 que tiene O-glicosilación obtenida de mesotelioma o un fragmento de la misma que comprende una secuencia de aminoácidos desde la posición 799 hasta posición 809 de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 35.

[17] Un marcador para su uso en el diagnóstico de mesotelioma, que contiene la proteína HEG1 o el fragmento de la misma según [16].

[17'] Un marcador para su uso en el diagnóstico de mesotelioma, que contiene la proteína HEG1 definida o el fragmento de la misma según [16'].

Breve descripción de los dibujos

[Figura 1] La figura 1 muestra imágenes de tinción inmunohistológica de subtipos de mesotelioma representativos con anticuerpo SKM9-2, donde la figura 1A muestra una imagen de tinción inmunohistológica del mesotelioma epitelial y la figura 1B muestra una imagen de tinción inmunohistológica del mesotelioma sarcomatoide, y las puntas de flecha indican una porción teñida.

[Figura 2] La figura 2 muestra los resultados de la inmunotransferencia de tipo Western y SDS-PAGE para un antígeno SKM9-2 purificado.

[Figura 3] La figura 3 muestra los resultados de la inmunotransferencia de tipo Western con el anticuerpo SKM9-2 para la proteína HEG1 soluble recombinante expresada mediante el uso de un extracto celular con la proteína HEG1 atenuada y una línea celular de mesotelioma.

[Figura 4] La figura 4 es una fotografía que muestra el resultado de que el reconocimiento del antígeno por el anticuerpo SKM9-2 se debilita por el tratamiento con enzima de desialilación.

[Figura 5] La figura 5 es un gráfico que muestra que un antígeno para el anticuerpo SKM9-2 se expresa en la superficie celular del mesotelioma.

[Figura 6] La figura 6 muestra secuencias de bases y secuencias de aminoácidos para la cadena pesada y la cadena ligera en un gen de anticuerpo de un hibridoma que produce el anticuerpo SKM9-2 respectivamente, donde una región Vh y una región Vl se representa cada una como una región entre flechas.

[Figura 7] La figura 7 es una fotografía que muestra que el anticuerpo SKM10-2 también permite la detección de proteína HEG1 de una manera dependiente de la glicosilación.

[Figura 8] La figura 8 es un diagrama que muestra que un complejo de proteínas que incluye regiones Vh y regiones CH1 de anticuerpo SKM9-2 fusionadas a intelectina (ITLN) y las regiones Vl y regiones Cl del anticuerpo SKM9-2 (es decir, cadenas ligeras del anticuerpo SKM9-2) permiten la detección de proteína HEG1 como con el caso del anticuerpo SKM9-2.

[Figura 9] La figura 9 es una fotografía que muestra que la intelectina se une fuertemente a perlas que tienen enlaces diol.

[Figura 10] La figura 10 es un gráfico que muestra el efecto de la atenuación del gen HEG1 sobre la proliferación celular de una línea celular de mesotelioma a lo largo del tiempo.

[Figura 11] La figura 11 es un gráfico que muestra el efecto de la atenuación del gen HEG1 sobre la proliferación celular de una línea celular de mesotelioma.

[Figura 12] La figura 12 es un gráfico que muestra el efecto de la atenuación del gen HEG1 sobre la proliferación celular de otras líneas celulares de mesotelioma.

[Figura 13] La figura 13 es un diagrama que muestra si un fragmento de HEG1 humana es positiva (+) o negativa (-) para unirse al anticuerpo SKM9-2 para cada caso, donde se ilustran las posiciones de los fragmentos de HEG1 humana en HEG1, la parte inferior muestra los resultados de la exploración con alanina, y cada uno de los aminoácidos no modificados se representa con el símbolo “-“.

[Figura 14A] La figura 14A muestra los resultados de la inmunotransferencia de tipo Western para examinar la reactividad de cada uno de HEG1 de longitud completa, fragmento de 3 kb, fragmento de 2 kb y fragmento de 1 kb con el anticuerpo SKM9-2.

[Figura 14B] La figura 14B muestra los resultados de la inmunotransferencia de tipo Western para examinar la reactividad de cada fragmento de HEG1 con el anticuerpo SKM9-2, en la que se encontró una señal positiva para el fragmento 7.6 y el fragmento 7.62.

[Figura 14C] La figura 14C muestra los resultados de la inmunotransferencia de tipo Western para examinar la reactividad de cada fragmento de HEG1 con el anticuerpo SKM9-2, en la que se encontró una señal positiva para el fragmento 7.623 y el fragmento 7.6231.

[Figura 14D] La figura 14D muestra los resultados del exploración con alanina, en el que S799A indica un fragmento que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 35 con serina en la posición 799 como un número de aminoácido sustituido con alanina.

[Figura 14E] La figura 14E muestra que el fragmento 7.6231 tratado con neuraminidasa no reacciona con el anticuerpo SKM9-2.

Descripción de aspectos

La invención está definida por las reivindicaciones adjuntas.

El término “sujeto” en la presente memoria descriptiva puede referirse a un mamífero y preferiblemente se refiere a un humano. El sujeto puede ser un sujeto afectado o posiblemente afectado por mesotelioma u otro tumor o carcinoma. El término “anticuerpo” en la presente memoria descriptiva se refiere a una inmunoglobulina y abarca anticuerpos policlonales y anticuerpos monoclonales. El anticuerpo preferido son los anticuerpos monoclonales. El origen del anticuerpo no está limitado y los ejemplos del anticuerpo incluyen anticuerpos derivados de animales no humanos, anticuerpos derivados de mamíferos no humanos y anticuerpos humanos. El anticuerpo puede ser cualquiera de los anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados y anticuerpos humanos. Además, el anticuerpo puede ser cualquiera de los anticuerpos biespecíficos.

El término “fragmento de unión a antígeno” en la presente memoria descriptiva se refiere a una parte de un anticuerpo con las propiedades de unión a antígeno retenidas. El fragmento de unión a antígeno puede comprender una región variable de cadena pesada o una región variable de cadena ligera del anticuerpo según la presente invención, o ambas. El fragmento de unión a antígeno puede ser quimerizado o humanizado. Los ejemplos del fragmento de unión a antígeno incluyen un Fab, Fab', F(ab')², Fv, scFv (Fv de cadena sencilla), diacuerpo y sc(Fv⁾²((Fv⁾²de cadena sencilla). Cada uno de estos fragmentos de anticuerpo puede obtenerse, por ejemplo, mediante el tratamiento enzimático de un anticuerpo, aunque el método no se limita a ello. Por ejemplo, la digestión de un anticuerpo con papaína produce Fab. Por otro lado, la digestión de un anticuerpo con pepsina da un F(ab')², que se reduce aún más para dar Fab. Estos fragmentos de unión a antígeno de un anticuerpo pueden usarse en la presente invención. El término “mesotelioma” en la presente memoria descriptiva se refiere a un tumor derivado de células mesoteliales. El mesotelioma se clasifica según el sitio de desarrollo y los ejemplos conocidos son el mesotelioma pleural, el mesotelioma peritoneal, el mesotelioma pericárdico y el mesotelioma de la túnica vaginal del testículo. En la presente memoria descriptiva, el término “mesotelioma” se refiere a mesotelioma benigno y/o mesotelioma maligno. El mesotelioma se clasifica ampliamente por tipo de tejido en mesotelioma epitelial, mesotelioma sarcomatoide, mesotelioma bifásico y otros mesoteliomas (por ejemplo, mesotelioma desmoplásico).

La proteína HEG1 es una proteína cuya expresión y función son casi desconocidas, y se infiere que es una proteína de membrana a partir del análisis de ontología genética. Los ejemplos de proteína HEG1 humana incluyen una proteína (SEQ ID NO: 30) codificada por un gen registrado por el Centro Nacional para la Información Biotecnológica (NCBI) como NM_020733.1 y que tiene la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 29; una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 31; una proteína (SEQ ID NO: 37) codificada por un gen registrado como ^{XM_005247666 y que tiene la secuencia expuesta en}SeQ ^{ID NO: 36; una proteína (SEQ ID NO: 33) codificada por}un gen que tiene la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 32; y una proteína (SEQ ID NO: 35) codificada por un gen que tiene la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 34. Los ejemplos de variantes que se producen de manera natural de proteína HEG1 incluyen, pero no se limitan a, una variante de proteína HEG1 que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una mutación correspondiente a cualquiera de Q145R, S305P, F602S, V980L y M1039T en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 30. En la presente memoria descriptiva, el concepto de proteína HEG1 incluye variantes que se producen de manera natural de proteína HEG1. En el caso de proteína HEG1 humana, la serina en la posición 1359 de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 30 puede reemplazarse con fosfoserina. El concepto de proteína HEG1 en la presente memoria descriptiva incluye proteína HEG1 en la que la serina correspondiente a la serina en la posición 1359 de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 30 se reemplaza con fosfoserina. Se espera a partir de los resultados de ontología genética que, en la proteína HEG1, la parte del péptido señal sea un dominio correspondiente a de posición 1 a posición 29 de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 30, el dominio extracelular es una dominio correspondiente a de posición 30 a posición 1248 de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 30, el domino transmembrana es un dominio correspondiente a de posición 1249 a posición 1269 de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 30, y el dominio intracelular es un dominio correspondiente a de posición 1270 a posición 1381 de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 30. El concepto de proteína HEG1 puede incluir, por ejemplo, una proteína codificada por una secuencia de ADN expuesta en SEQ ID NO: 29, 32, 34 o 36 o una secuencia de ADN que puede hibridarse en condiciones rigurosas con una hebra complementaria de un ADN que tiene una secuencia de ADN que codifica para la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 30, 31, 33, 35 o 37. Los ejemplos de condiciones rigurosas incluyen condiciones tales que el lavado se realiza con 1 * SSC (disolución acuosa que contiene NaCl 0,15 M y citrato de trisodio 15 mM) a 65°C después de la hibridación. Además, el concepto de proteína HEG1 puede incluir una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos que tiene homología con la secuencia de aminoácidos expuesta ^{en SEQ ID}nO: ^{30 del 90% o más, el 95% o más, el 98% o más, o el 99% o más. Por ejemplo, la proteína HEG1}puede tener una sustitución, inserción, adición y/o deleción de uno o más aminoácidos en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 30.

Los presentes inventores encontraron que la proteína HEG1 se expresa principalmente en el mesotelioma. Los presentes inventores sostienen que el mesotelioma puede diagnosticarse basándose en el nivel de expresión de la proteína HEG1. Por consiguiente, la presente invención permite la detección del mesotelioma mediante el uso de un anticuerpo que se une a la proteína HEG1. Según la presente invención, la proteína HEG1 se expresa en la superficie de la membrana celular de mesotelioma e incluye un dominio extracelular. En vista de esto, el anticuerpo según la presente invención se une a la proteína HEG1 que tiene glicosilación obtenida a partir de mesotelioma o la proteína HEG1 en la membrana celular de mesotelioma, en la que la proteína HEG1 tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEQ ID NO: 30, 31, 33, 35 y 37. El anticuerpo según la presente invención puede ser un anticuerpo ^{contra el dominio extracelular de la proteína}hEG1 ^{o un fragmento de unión a antígeno del mismo. Según la presente}invención, la proteína HEG1 también se expresa en el mesotelioma papilar bien diferenciado (MPBD) y, por tanto, puede usarse para detectar tal mesotelioma.

Tal como se describe más adelante en los ejemplos, el dominio extracelular de la proteína HEG1 se ha sometido a glicosilación que tiene sialilación en el mesotelioma. Por consiguiente, el anticuerpo según la presente invención o un fragmento de unión a antígeno del mismo se une a la proteína HEG1 que tiene glicosilación en una determinada realización. Cuando la proteína HEG1 que tiene glicosilación se purifica y analiza mediante SDS-PAGE, puede detectarse un peso molecular aparente en el intervalo de 300 kDa a 500 kDa como una banda ancha. Más específicamente, el peso molecular aparente mediante SDS-PAGE puede ser de aproximadamente 400 kDa. En un determinado aspecto de la presente invención, la glicosilación es la que tiene la proteína HEG1 expresada en la membrana celular de mesotelioma.

En un determinado aspecto, el anticuerpo según la presente invención o un fragmento de unión a antígeno del mismo se une a la proteína HEG1 que tiene glicosilación encontrada en células de mesotelioma, y la unión es dependiente de glicosilación. Específicamente, en este aspecto, el anticuerpo según la presente invención o un fragmento de unión a antígeno del mismo no se une a la proteína HEG1 no glicosilada (por ejemplo, proteína HEG1, cuya cadena de azúcar se ha descompuesto a través de un tratamiento de descomposición de la cadena de azúcar), o se une más débilmente a la misma que a la proteína HEG1 que tiene glicosilación (menor afinidad). En un determinado aspecto, el anticuerpo según la presente invención o un fragmento de unión a antígeno del mismo se une a la parte de la cadena de azúcar de la proteína HEG1 que tiene glicosilación encontrada en las células de mesotelioma. Por tanto, el anticuerpo según la presente invención puede unirse a la proteína HEG1 que tiene glicosilación de una manera dependiente de la glicosilación en determinados aspectos y la glicosilación puede ser la que tiene la proteína HEG1 presente en la membrana celular de mesotelioma. En una determinada realización, el anticuerpo según la presente invención se une a la proteína HEG1 que tiene glicosilación encontrada en células de mesotelioma desnaturalizadas. En un determinado aspecto, el anticuerpo según la presente invención se une a un fragmento desnaturalizado de la proteína HEG1 que tiene glicosilación encontrado en las células de mesotelioma, en el que el fragmento tiene una secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia de aminoácidos desde la posición 799 hasta la posición 809 de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 35.

En un determinado aspecto el anticuerpo según la presente invención o un fragmento de unión a antígeno del mismo es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a un epítopo en el dominio extracelular de la proteína HEG1 humana expresada en células de mesotelioma humanas, pero experimenta debilitamiento en o pérdida de unión a la proteína HEG1 humana a través del tratamiento con a2-3 neuraminidasa o a2-3,6,8 neuraminidasa. En este aspecto, el dominio extracelular de proteína HEG1 humana expresada en células de mesotelioma humanas tiene glicosilación que tiene sialilación. El término “proteína HEG1 que tiene glicosilación obtenida de mesotelioma” puede referirse a una proteína HEG1 que tiene glicosilación característica del mesotelioma, y la glicosilación puede ser, por ejemplo, O-glicosilación que tiene sialilación.

En un determinado aspecto, se proporciona un anticuerpo que se une a la membrana celular de mesotelioma, una proteína de membrana en la membrana celular de mesotelioma, o proteína HEG1 en la membrana celular de mesotelioma, en el que el anticuerpo comprende cualquiera de una, dos, tres, cuatro, cinco o seis de CDR1 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 6, CDR2 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 8, CDR3 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 10, CDR1 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 12, CDR2 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 14, y CDR3 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 16. En un determinado aspecto se proporciona un anticuerpo, en el que el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que comprende cualquiera de una, dos o tres de CDR1 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 6, CDR2 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 8, y CDR3 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 10, y una región variable de cadena ligera que comprende cualquiera de una, dos o tres de CDR1 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 12, CDR2 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 14, y CDR3 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 16.

En un determinado aspecto, se proporciona un anticuerpo que se une a la membrana celular de mesotelioma, una proteína de membrana en la membrana celular de mesotelioma, o proteína HEG1 en la membrana celular de mesotelioma, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, en el que el anticuerpo es:

(1) un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 6, CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 8, y CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 10;

(2) un anticuerpo que comprende una región variable de cadena ligera que comprende CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 12, CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 14, y CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 16;

(3) un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 6, CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 8, y CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 10, y una región variable de cadena ligera que comprende CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 12, CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 14, y CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 16;

(4) un anticuerpo que tiene homología de secuencia del 80% o más (por ejemplo, el 90% o más o el 95% o más) con cualquiera de los anticuerpos (1) a (3);

(5) un anticuerpo que compite por la unión con cualquiera de los anticuerpos (1) a (4); o

(6) un anticuerpo que se une a un epítopo por cualquiera de los anticuerpos (1) a (4).

En un determinado aspecto el anticuerpo según la presente invención es un anticuerpo que se une a un péptido que tiene la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 53. En una determinada realización, el anticuerpo según la presente invención es un anticuerpo que se une a un péptido que tiene la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 53 expresado en una línea celular de mesotelioma. En un determinado aspecto el anticuerpo según la presente invención es un anticuerpo que se une a un péptido que tiene una secuencia expuesta en SEQ ID NO: 53 de una manera dependiente de la glicosilación, en el que el péptido se expresa en una línea celular de mesotelioma. En un determinado aspecto el anticuerpo según la presente invención es un anticuerpo que se une a la membrana celular de mesotelioma, una proteína de membrana en la membrana celular de mesotelioma, o proteína HEG1 en la membrana celular de mesotelioma, y se une a un péptido que tiene la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 53. En un determinado aspecto el anticuerpo según la presente invención es un anticuerpo que se une a la membrana celular de mesotelioma, una proteína de membrana en la membrana celular de mesotelioma, o proteína HEG1 en la membrana celular de mesotelioma, y se une a un péptido que tiene la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 53, en el que el péptido se expresa en una línea celular de mesotelioma. En un determinado aspecto el anticuerpo según la presente invención es un anticuerpo que se une a la membrana celular de mesotelioma, una proteína de membrana en la membrana celular de mesotelioma, o proteína HEG1 en la membrana celular de mesotelioma, y se une a un péptido que tiene la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 53 de una manera dependiente de la glicosilación, en el que el péptido se expresa en una línea celular de mesotelioma.

La homología de secuencia puede determinarse, por ejemplo, mediante el uso de un programa FASTA descrito en Pearson y Lipman, PNAS, 85:2444-2448, 1988, con parámetros predeterminados.

En un determinado aspecto, el anticuerpo comprende una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2. En un determinado aspecto, el anticuerpo comprende una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 4. En un determinado aspecto el anticuerpo según la presente invención comprende la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2 y la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 4. En un determinado aspecto el anticuerpo según la presente invención comprende de la posición 20 a la posición 132 de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2 como región variable de cadena pesada (región Vh). En un determinado aspecto el anticuerpo según la presente invención comprende de la posición 20 a la posición 132 de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 4 como región variable de cadena ligera (región Vl). En un determinado aspecto el anticuerpo según la presente invención comprende una región variable de cadena pesada que comprende de la posición 20 a la posición 132 de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2 y una región variable de cadena ligera que comprende de la posición 20 a la posición 132 de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 4. En un determinado aspecto el anticuerpo según la presente invención compite con cualquiera de los anticuerpos por la unión a la proteína HEG1 que tiene glicosilación.

La presente invención también proporciona un receptor de antígeno quimérico que comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera, tal como un scFv. Pueden usarse diversos receptores de antígenos quiméricos, y los ejemplos de los mismos incluyen receptores de antígenos quiméricos de primera generación en los que un scFv y una cadena Z del receptor de células T están unidos juntos mediante un espaciador, receptores de antígenos quiméricos de segunda generación en los que un scFv y una cadena Z del receptor de células T están unidos juntos mediante un CD28 o un 4-1BB, y los receptores de antígenos quiméricos de tercera generación en los que un scFv y una cadena Z del receptor de células T están unidos juntos mediante un CD28 y un 4-1BB u OX40.

En un determinado aspecto de la presente invención, se proporciona un conjugado del anticuerpo según la presente invención o un fragmento de unión a antígeno del mismo con un agente citotóxico. La presente invención proporciona una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de mesotelioma, que contiene un conjugado del anticuerpo según la presente invención o un fragmento de unión a antígeno del mismo con una sonda de obtención de imágenes. Los ejemplos del agente citotóxico usado en la presente invención incluyen radioisótopos para la terapia contra el cáncer (por ejemplo, P32, Y90, I131, I125, Sm153, Re186, Re188, A211, Bi212, Pb212y radioisótopos de Lu). Los ejemplos del agente citotóxico usado en la presente invención incluyen antineoplásicos.

En un determinado aspecto de la presente invención, se proporciona una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de mesotelioma, que contiene un ARNip, ARNhc u oligonucleótido antisentido para un gen HEG1. El ARNip, ARNhc u oligonucleótido antisentido puede ser un ácido nucleico modificado. Los ejemplos del ácido nucleico modificado incluyen ácidos nucleicos modificados con un colorante fluorescente, ácidos nucleicos biotinilados y ácidos nucleicos que comprenden un grupo colesterilo introducido en los mismos. Para mejorar la estabilidad de un ARN, las bases se someten a modificación con 2'-O-metilo o modificación con 2'-fluoro o modificación con 2'-metoxietilo (MOE) en algunos casos, y se reemplaza un enlace fosfodiéster en la estructura principal del ácido nucleico con un enlace fosforotioato en otros casos. Los ejemplos de un ácido nucleico artificial incluyen un ácido nucleico bloqueado (LNA), que es un ADN reticulado en el que un átomo de oxígeno en la posición 2' y un átomo de carbono en la posición 4' se reticulan a través de metileno y un ácido nucleico peptídico (p Na ), en el que la cadena principal es un polímero que incluye unidades de N-(2-aminoetil)glicina, en lugar de unidades de desoxirribosa o ribosa, unidas a través de enlaces amido. El ARNip, ARNhc u oligonucleótido antisentido pueden incorporarse en vesículas tales como micelas y liposomas. Pueden usarse vesículas tales como micelas y liposomas, por ejemplo, que tienen un diámetro de partícula de 20 a 100 nm. Se sabe que las vesículas tales como micelas y liposomas son capaces de acumularse de manera eficaz en un tejido tumoral en virtud del efecto EPR (efecto de retención y permeabilidad mejoradas) para administrar el contenido al tejido tumoral. Tales vesículas pueden modificarse con un modificador de superficie tal como polietilenglicol. En una determinada realización de la presente invención, se proporciona el uso de un ARNip, ARNhc u oligonucleótido antisentido para un gen HEG1 en la fabricación de una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de mesotelioma. Además, en un determinado aspecto de la presente divulgación se proporciona un método de tratamiento de mesotelioma, que comprende reducir la expresión de la proteína HEG1 en un sujeto que necesita dicho tratamiento del mesotelioma. En un determinado aspecto de la presente divulgación, se proporciona un método de tratamiento de mesotelioma, que comprende administrar un agente supresor de la expresión (por ejemplo, un ARNip, ARNhc u oligonucleótido antisentido) para el gen HEG1 a un sujeto que necesita dicho tratamiento del mesotelioma.

En un determinado aspecto de la presente invención, el anticuerpo según la presente invención puede tener actividad de citotoxicidad tal como actividad de citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (actividad CCDA) y actividad de citotoxicidad dependiente del complemento (actividad CDC). En este caso, el anticuerpo según la presente invención puede presentar actividad de citotoxicidad para las células de mesotelioma mediante la unión a la proteína HEG1 expresada en la superficie de la membrana de mesotelioma. Por tanto, en un determinado aspecto se proporciona una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de mesotelioma o un agente para su uso en la terapia de mesotelioma, que contiene el anticuerpo según la presente invención o un fragmento de unión a antígeno del mismo como principio activo. El término “tratar” usado en la presente memoria descriptiva tiene un significado que incluye tratamiento terapéutico.

La composición farmacéutica o el agente que contiene el anticuerpo según la presente invención como principio activo puede formularse usando un método farmacéutico conocido. Por ejemplo, la composición o agente farmacéuticos según la presente invención puede contener un excipiente farmacéuticamente aceptable. El excipiente puede ser uno que pueda administrarse apropiadamente para proporcionar a un sujeto una cantidad eficaz del anticuerpo según la presente invención como principio activo. En un determinado aspecto, la composición o agente farmacéuticos según la presente invención puede formularse en una inyección, y el excipiente para la inyección puede ser una disolución acuosa aséptica, por ejemplo, una disolución isotónica que contiene un tampón farmacéuticamente aceptable tal como la solución de Ringer, solución de Hanks y solución salina fisiológica, glucosa y un adyuvante adicional. Los ejemplos del adyuvante incluyen alcoholes tales como etanol, polialcoholes tales como polietilenglicol y tensioactivos no iónicos tales como polisorbato 80, y estos adyuvantes pueden añadirse en la formulación. Puede usarse aceite de sésamo, aceite de coco y aceite de soja como un líquido oleoso para la inyección, y puede usarse benzoato de bencilo o alcohol bencílico como adyuvante. La composición o agente farmacéuticos según la presente invención puede administrarse por vía parenteral (por ejemplo, administrada por vía intravenosa o administrada por vía intratorácica) en forma de inyección.

La actividad CCDA o la actividad CDC de un anticuerpo puede medirse usando un método bien conocido por los expertos en la técnica. Para determinar la actividad CCDa , por ejemplo, se incuban células de mesotelioma y células efectoras que expresan un receptor Fc (por ejemplo, linfocitos citolíticos naturales o monocitos) en presencia del anticuerpo según la presente invención en condiciones fisiológicas, y se cuentan el número de células viables y/o células muertas de las células de mesotelioma. Para determinar la actividad CDC, por ejemplo, las células de mesotelioma se incuban con una disolución que contiene complementos (por ejemplo, suero humano) en presencia de un anticuerpo en condiciones fisiológicas y se cuentan el número de células viables y/o células muertas de las células de mesotelioma.

La actividad de citotoxicidad puede mejorarse usando cualquiera de diversos métodos bien conocidos por los expertos en la técnica. Un ejemplo conocido de tales métodos es un método para mejorar la unión entre un receptor Fc de una célula efectora y un anticuerpo con el uso de un anticuerpo en el que se deleciona la fucosa como cadena de azúcar en la región Fc, un anticuerpo en el que biseccionando N-acetilglucosamina (GlcNAc) se une a una cadena de azúcar, o sustitución de aminoácidos en la región Fc para mejorar de ese modo la actividad de citotoxicidad, y cualquiera de tales anticuerpos modificados puede usarse como anticuerpo según la presente invención.

Un anticuerpo puede convertirse en un anticuerpo modificado genéticamente, por ejemplo, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo humano mediante el uso de un método bien conocido por los expertos en la técnica, por ejemplo, con el propósito de reducir la antigenicidad del propio anticuerpo en un humano. En la composición o agente farmacéuticos según la presente invención, el anticuerpo según la presente invención puede ser un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo humano. El anticuerpo puede ser un anticuerpo biespecífico.

En un determinado aspecto de la presente invención, se proporciona un conjugado del anticuerpo según la presente invención o un fragmento de unión a antígeno del mismo con una sonda de obtención de imágenes. Según la presente invención, el conjugado del anticuerpo según la presente invención o un fragmento de unión a antígeno del mismo con una sonda de obtención de imágenes puede usaras para el diagnóstico in vitro o el diagnóstico in vivo de mesotelioma. Por consiguiente, la presente invención proporciona un agente o kit para su uso en el diagnóstico de mesotelioma, que comprende un conjugado del anticuerpo según la presente invención o un fragmento de unión a antígeno del mismo con una sonda de obtención de imágenes. Además, la presente invención proporciona un agente o kit para su uso en el diagnóstico in vivo de mesotelioma, que comprende un conjugado del anticuerpo según la presente invención o un fragmento de unión a antígeno del mismo con una sonda de obtención de imágenes. Los ejemplos de la sonda de obtención de imágenes disponible para el diagnóstico in vivo de mesotelioma incluyen sondas fluorescentes de obtención de imágenes, potenciadores tales como agentes de contraste para obtención imágenes por resonancia magnética (IRM) (por ejemplo, iones paramagnéticos) y radionúclidos para la obtención de imágenes tales como sondas de obtención de imágenes moleculares para PET.

La presente invención proporciona, en otro aspecto, una proteína HEG1 que tiene una glicosilación (por ejemplo, O-glicosilación) obtenida de mesotelioma o un fragmento de la misma, en la que la proteína HEG1 tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEQ ID NO: 30, 31, 33, 35 y 37 (en particular, un fragmento de la misma que comprende la secuencia de aminoácidos desde la posición 799 hasta la posición 809 de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 35). Según la presente invención, puede usarse una proteína HEG1 que tiene glicosilación (por ejemplo, O-glicosilación) obtenida de mesotelioma o el fragmento de la misma como marcador para detectar mesotelioma con alta sensibilidad y alta especificidad. Por consiguiente, en un determinado aspecto de la presente invención, se proporciona un marcador para su uso en el diagnóstico de mesotelioma, que consiste en una proteína HEG1 que tiene glicosilación (por ejemplo, O-glicosilación) obtenida de mesotelioma o el fragmento de la misma. La O-glicosilación de una proteína HEG1 obtenida de mesotelioma o el fragmento de la misma puede ser una O-glicosilación que tiene sialilación. Tal proteína HEG1 puede ser una proteína HEG1 obtenida de mesotelioma y que tiene una secuencia de aminoácidos con homología de secuencia del 80% o más, el 90% o más, el 95% o más, o el 98% o más, por ejemplo, con una secuencia de aminoácidos cualquiera seleccionada de las SEQ ID NO: 30, 31, 33, 35 y 37, o una variante de la misma obtenida de mesotelioma. La proteína HEG1 que tiene glicosilación (por ejemplo, O-glicosilación) obtenida de mesotelioma o el fragmento de la misma pueden purificarse a partir de células de mesotelioma mediante el uso del anticuerpo según la presente invención (el anticuerpo según la presente invención que se une a una proteína HEG1 que tiene glicosilación (por ejemplo, O-glicosilación) obtenida de mesotelioma). Debido a que la proteína HEG1 o el fragmento de la misma tiene ácido siálico y GlcNAc, también se contempla purificar la proteína HEG1 utilizando la afinidad de la proteína HEG1 por lectinas, que son capaces de unirse específicamente a ácido siálico o GlcNAc, (por ejemplo, WGA, que es específica de ácido siálico, o d Sa , que es específica de GlcNAc, o una combinación de las mismas). La proteína HEG1 que tiene glicosilación (por ejemplo, O-glicosilación) obtenida de mesotelioma o el fragmento de la misma (en particular, un fragmento de la misma que comprende la secuencia de aminoácidos desde la posición 799 hasta la posición 809 de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 35) puede desnaturalizarse. El fragmento (en particular, el fragmento desnaturalizado) puede comprender una región alrededor de la secuencia de aminoácidos desde la posición 799 hasta la posición 809 de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 35 en la proteína HEG1 que tiene glicosilación (por ejemplo, O-glicosilación) obtenida de mesotelioma.

Complejo y proteína de fusión de intelectina

La presente invención proporciona una proteína de fusión de intelectina con un fragmento Fab o un fragmento scFv del anticuerpo según la presente invención. Por ejemplo, en esta proteína de fusión la cadena pesada del fragmento Fab o el fragmento scFv y la intelectina se fusionan junto. Por ejemplo, se proporciona un complejo que comprende: una proteína de fusión de intelectina con una región Vh y un ligador (por ejemplo, una región CH1) del anticuerpo según la presente invención; y una cadena L del anticuerpo según la presente invención. Una proteína de fusión o complejo de proteínas de este tipo se une a la membrana celular de mesotelioma, una proteína de membrana en la membrana celular, o proteína HEG1 en la membrana celular. La presente invención también proporciona una proteína de fusión del fragmento scFv del anticuerpo según la presente invención con intelectina. Una proteína de fusión o complejo de proteínas de este tipo comprende intelectina, y la intelectina se une específica y fuertemente a una estructura de diol. Por esta razón, la proteína de fusión o complejo de proteínas puede purificarse de una manera simple mediante el uso de una columna con una resina que tiene una estructura de diol expuesta (por ejemplo, una columna de filtración en gel que usa, por ejemplo, un gel que contiene un polisacárido (dextrano o agarosa) tratado con un agente de reticulación de epóxidos o un gel de sílice hidrofilizado a través de modificación con diol). Por ejemplo, la proteína de fusión o el complejo de proteínas puede purificarse usando una columna con perlas de diol-Sepharose mostradas en la tabla 5. Después de la purificación del complejo, la proteína de fusión puede producirse adicionalmente mediante el uso de una columna de afinidad que tiene un antígeno unido a la misma.

En un determinado aspecto de la presente invención, se proporciona (1) una proteína de fusión de una región variable de cadena pesada que comprende CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 6, CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 8, y CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 10, con intelectina, o (2) un complejo de proteínas que comprende la proteína de fusión descrita en (1) y una región variable de cadena ligera que comprende CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 12, CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 14, y CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 16. El complejo de proteínas se une a la membrana celular de mesotelioma, una proteína de membrana en la membrana celular de mesotelioma, o proteína HEG1 en la membrana celular de mesotelioma. En esta realización, por ejemplo, la región variable de cadena pesada y la intelectina pueden formar una proteína de fusión a través de la región CH1 o sin intervención de la región CH1, y preferiblemente la región variable de cadena pesada y la intelectina pueden formar una proteína de fusión a través de la región CH1. Las moléculas de esta proteína de fusión pueden unirse juntas a través de la porción de intelectina de cada molécula para formar un multímero (principalmente, un trímero) en condiciones fisiológicas. En la presente memoria descriptiva, el concepto de la proteína de fusión incluye monómeros y multímeros.

La proteína de fusión o complejo de intelectina según la presente invención puede unirse a una proteína HEG1 que tiene glicosilación obtenida de mesotelioma. Por consiguiente, la proteína de fusión o complejo de intelectina según la presente invención puede usarse para detectar mesotelioma. Por tanto, la presente invención proporciona un agente para su uso en el diagnóstico de mesotelioma, que contiene la proteína de fusión o complejo de intelectina según la presente invención. Un conjugado de la proteína de fusión o complejo de intelectina según la presente invención con una sonda de obtención de imágenes puede usarse para la obtención de imágenes in vivo de mesotelioma. Por tanto, la presente invención proporciona un agente para su uso en el diagnóstico in vivo de mesotelioma, que comprende un conjugado de la proteína de fusión o complejo de intelectina según la presente invención con una sonda de obtención de imágenes. Un conjugado de la proteína de fusión o complejo de intelectina según la presente invención con el agente citotóxico definido anteriormente puede usarse para el tratamiento de mesotelioma. Por tanto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de mesotelioma, que contiene un conjugado de la proteína de fusión o complejo de intelectina según la presente invención con el agente citotóxico definido anteriormente.

Preparación del anticuerpo

Puede prepararse un anticuerpo mediante el uso de un método bien conocido por los expertos en la técnica. Específicamente, puede obtenerse un anticuerpo policlonal mediante la inmunización de un animal con un antígeno y un adyuvante y la extracción del plasma del animal inmunizado. Alternativamente, puede emplearse el siguiente procedimiento para obtener un hibridoma que produzca un anticuerpo deseado: se inmuniza un animal con un antígeno y un adyuvante; se obtiene un linfocito B del animal inmunizado; y se somete el linfocito B a fusión celular con un mieloma para formar un hibridoma, que puede clonarse adicionalmente. En el procedimiento de inmunización, un animal puede inmunizarse con células obtenidas permitiendo que una línea celular de mesotelioma (por ejemplo, células ACC-MESO4) exprese a la fuerza la proteína HEG1. En este caso, el animal inmunizado puede producir un anticuerpo contra la proteína HEG1 porque la proteína HEG1 está expuesta en la superficie celular. Alternativamente, un animal puede inmunizarse con proteína HEG1 purificada a partir de células que expresan proteína HEG1, preferiblemente de una línea celular de mesotelioma. Alternativamente, en el procedimiento de inmunización, puede emplearse el siguiente procedimiento: se permite que una línea celular de mesotelioma (por ejemplo, células ACC-MESO4) exprese a la fuerza una forma solubilizada de proteína HEG1 (por ejemplo, el dominio extracelular); la proteína HEG1 solubilizada se obtiene del sobrenadante del cultivo; y se inmuniza un animal con la proteína HEG1 solubilizada. Según la presente invención, también tal proteína HEG1 solubilizada tiene glicosilación, y la glicosilación es similar a la modificación de la proteína HEG1 en la membrana celular de mesotelioma.

Puede prepararse un anticuerpo quimérico usando un método bien conocido en la técnica. Por ejemplo, puede prepararse un anticuerpo quimérico mediante la sustitución de las regiones constantes de un anticuerpo por las regiones constantes de un anticuerpo humano. Por ejemplo, un anticuerpo humanizado comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR) derivadas de un animal no humano y regiones de entramado derivadas de un anticuerpo humano y regiones constantes derivadas de un anticuerpo humano. Por ejemplo, puede obtenerse un anticuerpo humanizado mediante el trasplante de las CDR a un anticuerpo humano. Por ejemplo, puede obtenerse un anticuerpo humano mediante la inmunización de un ratón modificado genéticamente que produce un anticuerpo humano con un antígeno. Un anticuerpo biespecífico es un anticuerpo capaz de unirse a dos epítopos o antígenos diferentes, y puede prepararse usando un método bien conocido por los expertos en la técnica. Por ejemplo, puede prepararse un anticuerpo biespecífico usando un método de fusión adicional de células que producen dos anticuerpos diferentes para preparar un hibridoma híbrido, o un método en el que una región Vh y una región Vl se expresan en una cadena polipeptídica a través de un ligador corto que no permite el emparejamiento entre las dos regiones, y se permite que la cadena polipeptídica forme un complejo con otra cadena polipeptídica que comprende una región Vh y una región Vl complementarias capaces de emparejarse con la región Vh y la región Vl anteriores.

Puede obtenerse un anticuerpo que compite con un determinado anticuerpo por unirse a un antígeno, por ejemplo, mediante un ensayo de competencia bien conocido por los expertos en la técnica. Por ejemplo, en un ensayo de competencia, si un anticuerpo puede bloquear al menos el 20%, preferiblemente del 20 al 50%, más preferiblemente al menos el 50% de la unión de un anticuerpo de interés, entonces el anticuerpo puede determinarse como un anticuerpo que compite por unión al mismo antígeno. El anticuerpo competidor puede confirmarse mediante un ensayo de bloqueo cruzado, preferiblemente mediante un ELISA competitivo. En un ensayo de bloqueo cruzado, por ejemplo, se recubre una placa de microvaloración con un antígeno, y se le añade una entidad de un anticuerpo competidor candidato y se incuba para formar la unión entre el antígeno y el anticuerpo candidato. Después de esto, se marca un anticuerpo de interés y se añade adicionalmente al pocillo y se incuba, y el pocillo se lava y se cuantifica la tasa de unión del anticuerpo de interés. De ese modo, se puede determinar la presencia o ausencia de la competencia de los anticuerpos. Si hay competencia, una cantidad menor de la etiqueta permanecerá en el pocillo.

La presente divulgación proporciona, en otro aspecto, un método de diagnóstico de mesotelioma en un paciente que tiene mesotelioma o un sujeto en riesgo de tener mesotelioma mediante el uso de anticuerpo que se une a la proteína HEG1 o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

Además, la presente divulgación proporciona un método preliminar (por ejemplo, un método industrial) para el diagnóstico de mesotelioma en un paciente que tiene mesotelioma o un sujeto en riesgo de tener mesotelioma mediante el uso de un anticuerpo que se une a la proteína HEG1 o un fragmento de unión a antígeno del mismo. Además, la presente divulgación proporciona un método de detección de una célula de mesotelioma en un paciente que tiene mesotelioma o un sujeto en riesgo de tener mesotelioma mediante el uso de un anticuerpo que se une a la proteína HEG1 o un fragmento de unión a antígeno del mismo. En estas realizaciones, un médico realiza el diagnóstico de mesotelioma, y la presente invención proporciona al médico información básica para el diagnóstico como método para el diagnóstico por el médico.

La presente invención proporciona, en otro aspecto, un agente o kit para su uso en el diagnóstico de mesotelioma en un paciente que tiene mesotelioma o un sujeto en riesgo de tener mesotelioma, que comprende un anticuerpo que se une a la proteína HEG1 o un fragmento de unión a antígeno del mismo. El kit para su uso en el diagnóstico puede comprender una instrucción para detectar mesotelioma mediante el uso de un anticuerpo que se une a la proteína HEG1 o un fragmento de unión a antígeno del mismo. En una determinada realización, el agente o kit para su uso en el diagnóstico puede comprender cualquiera de los anticuerpos según la presente invención o un fragmento de unión a antígeno del mismo. Tal como se describe a continuación, el agente o kit para su uso en el diagnóstico según la presente invención puede usarse para detectar mesotelioma.

Detección de mesotelioma

La presente invención proporciona un método de diagnóstico de mesotelioma, un método de detección de mesotelioma, un método para detectar mesotelioma, y un método de detección de mesotelioma para ayudar en el diagnóstico de mesotelioma por un médico, en el que cada método comprende poner en contacto el anticuerpo según la presente invención o un fragmento de unión a antígeno del mismo con una muestra separada de un organismo vivo. Para la detección de mesotelioma según la presente invención, el anticuerpo según la presente invención o un fragmento de unión a antígeno del mismo se pone en contacto con una muestra separada de un organismo vivo. En el caso de que se use una muestra separada de un organismo vivo, tal como células, un tejido o una sección de tejido, la reacción de anticuerpos puede detectarse usando un método bien conocido por los expertos en la técnica (por ejemplo, un método de tinción inmunohistológica). Si luego se observa una reacción de anticuerpos (por ejemplo, en el caso de un resultado positivo), es probable que el sujeto del que se deriva la muestra se vea afectado por mesotelioma. Si el resultado de una reacción de anticuerpos es positivo puede determinarse según un método de puntuación de Allred (véase Allred DC et al., Mod Pathol, 11: 155-168, 1998). Por ejemplo, en el método de puntuación de Allred, se calcula una puntuación total a partir de la siguiente ecuación:

Puntuación total (TS) = puntuación de proporción (PS) puntuación de intensidad (IS)

Si la puntuación total es de 3 o más, entonces puede determinarse que el resultado para la reacción es positivo. PS e IS pueden determinarse a partir de las siguientes tablas de puntuación.

Tablas de puntuación para el método de puntuación de Allred

Puntuación de proporción, PS

0: sin tinción

1: una proporción de tinción de menos del 1%

2: una proporción de tinción del 1% o más y menos del 10%

3: una proporción de tinción del 10% o más y menos de 1/3

4: una proporción de tinción de 1/3 o más y menos de 2/3

5: una proporción de tinción de 2/3 o más

Puntuación de intensidad, IS

0: negativa

1: tinción débil

2: tinción intermedia

3: tinción fuerte

En un determinado aspecto de la presente invención, la detección de mesotelioma comprende:

poner en contacto el anticuerpo según la presente invención o un fragmento de unión a antígeno del mismo con una muestra obtenida de un sujeto que se sospecha que tiene mesotelioma; y

detectar la presencia de proteína HEG1 (preferiblemente, un dominio extracelular de proteína HEG1) en la muestra mediante el uso del anticuerpo según la presente invención. En un aspecto preferido la proteína HEG1 que va a ^{detectarse en la detección de mesotelioma es HEG1 que tiene glicosilación, más preferiblemente proteína}hEG1 ^quetiene O-glicosilación, e incluso más preferiblemente proteína HEG1 que tiene glicosilación obtenida de mesotelioma. La detección de mesotelioma puede comprender adicionalmente determinar si el mesotelioma se detecta mediante el uso de una tasa de tinción y/o intensidad de tinción como índices o índice. En un determinado aspecto la detección de mesotelioma puede comprender determinar si el mesotelioma se detecta según el método de puntuación de Allred. En un determinado aspecto la detección de mesotelioma puede comprender determinar que se detecta mesotelioma si una puntuación total (TS) según el método de puntuación de Allred es de 2 o más, preferiblemente 3 o más.

La detección de mesotelioma en la presente invención puede ser tal que la presencia de proteína HEG1 que tiene glicosilación obtenida de mesotelioma se detecta en una muestra mediante el uso de un anticuerpo que se une a la proteína HEG1 que tiene glicosilación obtenida de mesotelioma de una manera dependiente de la glicosilación, en la que la proteína HEG1 tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEQ ID NO: 30, 31, 33, 35 y 37. La detección de mesotelioma en la presente invención puede ser tal que la presencia de proteína HEG1 que tiene glicosilación obtenida de mesotelioma se detecta en una muestra mediante el uso de un anticuerpo que se une a la proteína HEG1 que tiene glicosilación obtenida de mesotelioma, en la que la proteína HEG1 tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEQ ID NO: 30, 31, 33, 35 y 37.

En un determinado aspecto de la presente invención, en el caso de que se use un tejido o una sección de tejido como muestra, una proteína antigénica o una parte de la misma puede detectarse mediante tinción inmunohistológica con el anticuerpo según la presente invención.

En el método de diagnóstico de mesotelioma, método de detección de mesotelioma, método para detectar mesotelioma o método de detección de mesotelioma para ayudar al diagnóstico de mesotelioma por un médico, puede determinarse que el mesotelioma se detecta en un sujeto si un antígeno reconocido por el anticuerpo según la presente invención está contenido en la muestra.

En la presente invención, cualquier mesotelioma epitelial, mesotelioma bifásico, mesotelioma sarcomatoide y mesotelioma desmoplásico puede detectarse mediante el uso del anticuerpo según la presente invención. Por tanto, el mesotelioma que va a detectarse en la presente invención es al menos un mesotelioma seleccionado del grupo que consiste en mesotelioma epitelial, mesotelioma bifásico, mesotelioma sarcomatoide y mesotelioma desmoplásico. Aunque los métodos convencionales adolecen de dificultades en la detección del mesotelioma sarcomatoide, en particular, el uso del anticuerpo según la presente invención permite la detección del mesotelioma sarcomatoide. Por tanto, el mesotelioma que va a detectarse en la presente invención puede ser un mesotelioma sarcomatoide.

La presente invención permite el diagnóstico diferencial para determinar si un sujeto sospechoso de tener mesotelioma (en particular, mesotelioma epitelial) o adenocarcinoma de pulmón realmente tiene mesotelioma (en particular, mesotelioma epitelial) o adenocarcinoma de pulmón. Por tanto, la detección del mesotelioma según la presente invención puede realizarse para un sujeto que se sospecha que tiene mesotelioma (en particular, mesotelioma epitelial) o adenocarcinoma de pulmón. Además, la presente invención permite el diagnóstico diferencial entre mesotelioma y otros carcinomas. Por tanto, la detección de mesotelioma según la presente divulgación puede realizarse en un sujeto que se sospecha que tiene mesotelioma u otro carcinoma.

En la presente invención, puede usarse un conjugado de una sonda de obtención de imágenes con el anticuerpo según la presente invención o un fragmento de unión a antígeno del mismo, o una proteína de fusión o complejo del fragmento de anticuerpo definido anteriormente según la presente invención con intelectina en la detección de mesotelioma, en lugar del anticuerpo según la presente invención o un fragmento de unión a antígeno del mismo. La proteína de fusión o complejo del fragmento de anticuerpo definido anteriormente según la presente invención con intelectina puede estar en forma de un conjugado con una sonda de obtención de imágenes.

Ejemplos

Ejemplo 1: Preparación de anticuerpo específico de mesotelioma

Se cultivaron las líneas celulares derivadas del mesotelioma pleural maligno humano ACC-MESO1 (RCB2292, RIKEN ^{Cell Bank) y ACC-MESO4 (RCB2293, RIKEN Cell Bank) en}RpMI ^{1640 que contenía FCS al 10% en placas de 10 cm}a 37°C hasta alcanzar confluencia. Se recogieron las células de las dos placas de células con un raspador para cada línea celular y se lavaron con PBS tres veces. Se mezclaron y dividieron las células en cuartos, y cada uno de ellos se centrifugó para producir un precipitado de células, que se almacenó a -80°C. La masa de células para cada línea celular fue de aproximadamente 10 mg por precipitado de células.

Se suspendió el precipitado de células almacenado bajo congelación en 100 |il de PBS y se mezcló con 100 |il de AddaVax (InvivoGen). se administró todo el resultante por vía intraperitoneal a ratones Balb/c de seis semanas (hembras), y se administró repetidamente el precipitado de células almacenado bajo congelación a cada uno de los ratones de la misma manera cada dos semanas. Después de tres inmunizaciones en total, se extrajo una gota de sangre de la vena de la cola y se obtuvo el suero de la misma. Se preparó una sección delgada a partir de (Sato Y et al. Soy J Pathol 125: 431-435 (1986)) precipitados de células ACC-MESO1 y ACC-MESO4 fijados con AMeX, con los que se realizó inmunotinción para determinar si se produjo un anticuerpo para células de mesotelioma. Se inmunizaron de nuevo los ratones con altos títulos de anticuerpos con el precipitado de células tal como se describió anteriormente, y después de 1 semana se extirpó de manera aséptica el bazo.

Se trituró el bazo en una malla de acero inoxidable y se dispersaron los linfocitos en 10 ml de RPMI 1640. Después de separar grandes masas de células mediante pipeteo, se transfirió la dispersión a un tubo de centrífuga de 15 ml y se dejó reposar durante 3 minutos. Se transfirió la suspensión de células a otro tubo de centrífuga con cuidado de no succionar un gran agregado, y se lavaron las células dos veces con RPMI 1640 y se contó el número de células.

Se mezclaron juntos linfocitos (6,75 * 107 células) y células de mieloma (PAI) (5,25 * 106 células) cultivadas de antemano y se lavaron dos veces con RPMI 1640, y luego se realizó una operación de fusión celular. En la fusión celular, se usó PEG1500 (Roche Diagnostics K.K.) según un protocolo adjunto al producto. Después de la fusión, se suspendieron las células en RPMI 1640 (76 ml) que contenía FCS al 15%, BM Condimed H1 (Roche Diagnostics KK) al 10% y 1 * HAT (Thermo Fisher Scientific, Inc.), y se sembraron en cuatro placas de 96 pocillos en un volumen de 200 |il por pocillo (aproximadamente 1,9 * 105 células/pocillo). Después de cultivar a 37°C durante 3 días, se retiraron aproximadamente 100 |il del sobrenadante del cultivo y se añadieron 100 |il de la disolución de cultivo HAT descrita anteriormente para el intercambio de medio. El día 5 después de la fusión, se retiraron aproximadamente 100 |il del sobrenadante del cultivo y se añadió RPMI 1640 que contenía FCS al 15%, BM Condimed H1 al 10% y 1 * HT (Thermo Fisher Scientific, Inc.) para el intercambio de medio, y se seleccionaron los pocillos con un diámetro de colonia de 5 mm o más después del día 7.

Para la selección, se realizó la inmunotinción con secciones delgadas preparadas a partir de precipitados de células ACC-MESO1 y ACC-MESO4 fijadas con AMeX. Se bloquearon las secciones delgadas con caseína al 0,5% durante 10 minutos y se hicieron reaccionar con 100 |il de un sobrenadante de cultivo para un hibridoma como anticuerpo primario durante 2 horas. Se lavaron las secciones delgadas con PBS y luego se hicieron reaccionar con los kits EnVision (Dako Japan Ltd.) como un anticuerpo secundario durante 30 minutos y se dejaron desarrollar color usando DAB. Se realizó una selección de 384 pocillos y se obtuvieron 93 clones como clones positivos para la inmunotinción. Se realizó una selección secundaria para escoger clones no reactivos con una sección delgada preparada a partir de un precipitado de células A549 fijadas con AMeX, y se realizó una selección terciaria para seleccionar clones reactivos con una sección de tejido de mesotelioma fijado con formalina. Finalmente, se obtuvo una pluralidad de clones casi no reactivos con secciones de tejido de cánceres fijadas con formalina, excepto mesotelioma (SKM9-2 y SKM10-2).

Ejemplo 2: detección de mesotelioma con anticuerpo monoclonal obtenido

Se tiñeron diversos tipos de mesotelioma con un anticuerpo monoclonal producido a partir del SKM9-2 obtenido en la selección anterior.

Se incrustaron en parafina precipitados de células fijados con AMeX o tejidos fijados con formalina para preparar secciones delgadas. Cada una de las secciones se fijó a un portaobjetos de microscopio y se sometió a desparafinización y deshidratación con xileno y etanol, seguido de la activación de un antígeno en diferentes condiciones. Se trató cada sección con peróxido de hidrógeno al 3% durante 5 minutos para desactivar la peroxidasa endógena, y luego se lavó con PBS y se bloqueó con caseína al 0,5% durante 10 minutos. Después de que se añadieron 100 |il de una disolución que contenía un anticuerpo primario a cada sección y se trató a temperatura ambiente durante 2 horas, se lavó la sección con PBS y se dejó que desarrollara color mediante el uso de Histofine Simple Stain MAX-PO (Multi) (NICHIREI BIOSCIENCE INC.), el kit universal Ventana ultraView DAB (Roche Diagnostics KK) o los kits EnVision+. Se tiñó cada sección con hematoxilina y luego se deshidrató y se encapsuló con Malinol (MUTO PURE CHEMICALS CO., LTD.) para observar al microscopio. Las condiciones para la activación de un antígeno fueron las siguientes: a 98°C durante 40 minutos para calretinina, mesotelina y el antígeno SKM9-2; y a 95°C durante 64 minutos para la citoqueratina 5/6 (CK5/6), la podoplanina y el producto génico del tumor de Wilms 1 (WT-1). Se usaron las siguientes disoluciones de activación: tampón Tris 10 mM (pH 9,0) que contenía tetraacetato de etilendiamina (EDTA) 1 mM para calretinina, CK5/6 y podoplanina; y tampón citrato 10 mM (pH 6,0) que contiene Tween-20 al 0,1% para WT-1, mesotelina y el antígeno SKM9-2. Se usaron los siguientes anticuerpos primarios: un anticuerpo policlonal de conejo anti-calretinina (PAD: DC8) (Life Technologies Japan Ltd., Tokio, Japón) para calretinina; un anticuerpo monoclonal de ratón anti-citoqueratina 5,6 (D5/16B4) (NICHIREI BIOSCIENCE INC.) para CK5/6; un anticuerpo monoclonal de ratón anti-mesotelina humana (5B2) (Leica Microsystems, Inc., Bannockburn, IL) para mesotelina; un anticuerpo monoclonal de ratón anti-podoplanina (D2-40) (Roche Diagnostics K.K.) para podoplanina; y un anticuerpo monoclonal de ratón anti-WT-1 humano (6F-H2) (Roche Diagnostics K.K.) para WT-1.

Las imágenes de tinción representativas del mesotelioma fueron las que se muestran en las figuras 1A y 1B. El mesotelioma epitelial (figura 1A) y el mesotelioma sarcomatoide (figura 1B) se tiñeron con éxito con el anticuerpo SKM9-2. Tal como se muestra en la tabla 1, el anticuerpo SKM9-2 logró detectar el mesotelioma con una sensibilidad más alta que cualquier otro anticuerpo. A continuación en el presente documento, los casos en los que la fracción de células con puntuaciones de 1 o más determinadas según el método de puntuación de Allred era del 10% o más en la célula se determinaron como positivas.

[Tabla 1]

Tabla 1: detección de mesotelioma con anticuerpo SKM9-2

Tal como se describió anteriormente, se reveló que el anticuerpo SKM9-2 permite la detección de cada tipo de mesotelioma con una alta sensibilidad. Además, el mesotelioma papilar bien diferenciado (WDPM), que es un mesotelioma benigno o menos maligno, se tiñó con éxito con el anticuerpo SKM9-2 (uno en un caso).

Posteriormente, las características de detección del anticuerpo SKM9-2 para otros carcinomas se compararon con las de otros anticuerpos para confirmar la especificidad de detección del mesotelioma. En esta medición, se midió la especificidad de detección de cada anticuerpo para varios carcinomas: carcinoma gástrico, carcinoma colorrectal, carcinoma de mama, carcinoma de ovario, carcinoma de células renales y carcinoma urotelial, que tienen más probabilidades de presentar problemas en el diagnóstico diferencial de mesotelioma, tal como “otros carcinomas”; carcinosarcoma, liposarcoma, rabdomiosarcoma, leiomiosarcoma, fibrosarcoma, sarcoma sinovial, sarcoma del estroma gastrointestinal (GIST), sarcoma de Ewing, sarcoma alveolar de partes blandas (ASPS), tumor fibroso solitario, tumor maligno de la vaina del nervio periférico (MPNST), angiosarcoma, hemangioendotelioma epitelioide, angiosarcoma epitelioide y sarcoma sinovial bifásico como “sarcoma de tejido blando”; y condrosarcoma y osteosarcoma como “sarcoma óseo”. Los resultados fueron los que se muestran en la tabla 2.

[Tabla 2]

Tabla 2: especificidad de mesotelioma del anticuerpo SKM9-2 en comparación con anticuerpos para otros marcadores como antígenos

Tal como se muestra en la tabla 2, se reveló que el anticuerpo SKM9-2 tiene una alta especificidad para el mesotelioma y permite el diagnóstico diferencial entre el mesotelioma y otros tipos de tumores o cáncer con una alta precisión. Además, hubo muy pocos casos en los que el anticuerpo SKM9-2 reconoció tejidos sanos. Sólo hubo tres casos en los que se obtuvo un resultado positivo con el anticuerpo SKM9-2: carcinoma urotelial (1/10), leiomiosarcoma (1/10) y hemangioendotelioma epitelioide (1/6).

El anticuerpo calretinina, el anticuerpo citoqueratina 5/6, el anticuerpo mesotelina y el anticuerpo WT-1, que se conocen como anticuerpos convencionales para el diagnóstico de mesotelioma, permiten la detección del mesotelioma epitelial con una alta sensibilidad. Sin embargo, tal como resulta evidente a partir de la tabla 2, estos anticuerpos no son necesariamente superiores en especificidad y se sabe que tienen dificultades en el diagnóstico diferencial entre el adenocarcinoma de pulmón y el mesotelioma epitelial y la detección del mesotelioma sarcomatoide. Además, se observan expresiones de calretinina y WT-1 en el citoplasma de diversos tejidos sanos y tejidos de carcinomas, lo que conduce a un riesgo de confundirse con una imagen de localización nuclear característica del mesotelioma. A partir de este punto, la calretinina y WT-1 no son marcadores fáciles de usar y que permitan un fácil diagnóstico diferencial. Por el contrario, el anticuerpo SKM9-2 fue superior a los anticuerpos convencionales porque permite un diagnóstico diferencial más sencillo del mesotelioma según el resultado sea positivo o negativo y permite además la detección tanto del mesotelioma epitelial como del mesotelioma sarcomatoide. Además, el anticuerpo SKM9-2 logró el diagnóstico diferencial entre mesotelioma y otros cánceres.

Además, se examinó la reactividad del anticuerpo SKM9-2 con tejidos normales mediante tinción inmunohistológica. La inmunotinción se realizó usando el anticuerpo SKM9-2 para tejidos sanos sin ninguna lesión aparente. Los resultados fueron los que se muestran en la tabla 3.

[Tabla 3]

* Algunas células fueron positivas

Tal como se muestra en la tabla 3, aunque se encontró una imagen positiva para las células mesoteliales pericárdicas y las células endoteliales vasculares, la mayoría de los tejidos fueron negativos. En un caso del testículo, el túbulo seminífero fue positivo. Se obtuvieron resultados negativos para las células mesoteliales normales distintas de las células mesoteliales pericárdicas, lo que sugiere que el anticuerpo SKM9-2 tiene una capacidad superior para discriminar entre células de mesotelioma y tejidos normales. Además, la mayoría de las células endoteliales vasculares eran células negativas y las células positivas representaban sólo una pequeña fracción de las células.

Estos resultados sugieren que el antígeno reconocido por el anticuerpo SKM9-2 puede servir como un marcador extremadamente útil para el diagnóstico de mesotelioma.

Ejemplo 3: análisis de hibridoma obtenido

Ahora que se confirmó que en los ejemplos 1 y 2 se obtuvo un anticuerpo monoclonal que tiene alta especificidad para las células de mesotelioma, se realizaron la identificación del antígeno para el anticuerpo SKM9-2 y un análisis adicional de las propiedades de reconocimiento del antígeno del anticuerpo.

(1) Purificación de antígeno para el anticuerpo SKM9-2

Se cultivó una cantidad masiva de ACC-MESO4 y se realizó la purificación de un antígeno del lisado celular. Se solubilizaron células de 240 placas de 10 cm con tampón Tris 50 mM (pH 8,0) que contenía Triton X-100 al 1%, CHAPS al 1%, EDTA 1 mM, NaCl 50 mM e inhibidor de proteasa (Complete, Roche Life Science), y luego se centrifugaron. Se dializó el sobrenadante resultante con tampón acetato 20 mM (pH 5,0) a 4°C durante 18 horas para producir un precipitado ácido. Se extrajo el precipitado con tampón Tris 20 mM (pH 7,2) que contenía Tween 20 al 0,1% y NaCl 150 mM y se centrifugó, y se concentró el sobrenadante resultante usando un Amicon Ultra-15, 100 kDa (Merck Millipore) y se sometió a intercambio de disolución con tampón Tris 20 mM (pH 8,0) que contiene clorhidrato de guanidina 6 M. A la disolución concentrada, se le añadió clorhidrato de tris (2-carboxietil)fosfina con una concentración final de 10 mM, y se calentó el resultante a 60°C durante 30 minutos, y luego se le añadió yodoacetamida con una concentración final de 40 mM, y se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 3 horas. Se sometió la disolución de reacción a cromatografía de filtración en gel (Superose 6 Increase 10/300 GL (GE Healthcare)) en tampón Tris 20 mM (pH 8,0) que contenía clorhidrato de guanidina 6 M y Tween 20 al 0,05%, y se recogieron fracciones positivas para transferencia puntual. Se dializó la muestra con tampón fosfato 25 mM (pH 7,0) que contenía urea 4 M y Tween 20 al 0,05% a temperatura ambiente durante la noche, y se aplicó a un Mono Q 5/50 GL (GE Healthcare). Se lavó la columna con tampón fosfato 25 mM (pH 7,0) que contenía urea 4 M y Tween 20 al 0,05%, y luego se realizó la elución con un gradiente de concentración de sal de NaCl de 0 a 1 M. Se recogieron fracciones fuertemente positivas para transferencia puntual, y se dializaron con tampón fosfato 25 mM (pH 7,2) que contenía NaCI 150 mM y Tween 20 al 0,05% a temperatura ambiente durante la noche, y se aplicaron a 1 ml de WGA-Sepharose (J-OIL MILLS, Inc.). Después de lavar con tampón, se realizó la elución con tampón fosfato 25 mM (pH 7,2) que contenía N-acetilglucosamina 0,2 M, NaCl 150 mM y Tween 20 al 0,05%, y se concentró el eluyente con un Centricon (YM-30) (Millipore). Se realizó cromatografía de filtración en gel (Superose 6 Increase 10/300 GL (GE Healthcare)) en tampón fosfato 25 mM (pH 7,2) que contenía GdnHCl 3 M y CHAPS al 0,5%, y se dializaron las fracciones fuertemente positivas para transferencia puntual con NH⁴HCO³20 mM que contiene CHAPS al 0,5% a temperatura ambiente durante la noche para producir un antígeno purificado.

Se realizó la transferencia puntual tal como sigue. Se empapó una membrana de PVDF (Immobilon-P, Merck Millipore) en metanol, y luego se lavó y se impregnó con agua pura. Se colocó la membrana de PVDF hidrofilizada sobre un papel de filtro que contenía agua para evitar la inclusión de aire, se eliminó el exceso de humedad y se empapó con de 1 a 5 |il de la muestra en puntos alimentados por una micropipeta. Después de secar la membrana a temperatura ambiente durante la noche, se hidrofilizó la membrana de nuevo con metanol y agua pura y se bloqueó con tampón Tris 20 mM (pH 7,4) que contenía leche desnatada al 5%, Tween 20 al 0,1% y NaCl 150 mM (tampón de bloqueo) a temperatura ambiente durante 1 hora. Se hizo reaccionar la membrana con líquido ascítico de ratón que contenía el hibridoma SKM9-2 diluido 1.000 veces con el tampón de bloqueo, como anticuerpo primario, a temperatura ambiente durante 1 hora, y luego se lavó con tampón Tris 20 mM (pH 7,4) que contenía Tween 20 al 0,1% y NaCl 150 mM (TBST). Se hizo reaccionar la membrana con anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón marcado con peroxidasa de rábano picante (Jackson ImmunoResearch Inc.) diluido 30.000 veces con el tampón de bloqueo a temperatura ambiente durante 1 hora, se lavó con TBST y luego se dejó que desarrollara color usando el reactivo ECL prime (GE Healthcare) para su detección.

Se confirmó el antígeno purificado mediante inmunotransferencia de tipo Western. Se separó la muestra con SDS-PAGE al 6% o con geles prefabricados Mini-PROTEAN TGX al 4-15% (Bio-Rad Laboratories, Inc.) y se transfirió a una membrana de PVDF usando un aparato de transferencia submarina con tampón CAPS 10 mM (pH 10,5) que contiene SDS al 0,01%. Se bloqueó la membrana después de la transferencia de la misma manera que en la transferencia puntual, se sometió a reacción de anticuerpos y se dejó que desarrollara color usando el reactivo ECL prime (GE Healthcare) para la detección. Después de dejar que desarrollara color, se lavó la membrana con tampón Tris 20 mM (pH 8,0) que contenía clorhidrato de guanidina 6 M, Tween 20 al 0,1% y 2-mercaptoetanol al 1% a temperatura ambiente durante 15 minutos y se lavó minuciosamente con agua pura y, a continuación, se volvió a realizar la operación de bloqueo. Como anticuerpo de control, se usó un anticuerpo monoclonal anti-p-actina de ratón (Sigma-Aldrich Japan) diluido 5.000 veces y se realizaron las mismas operaciones para la detección.

Los resultados fueron tal como se muestran en la figura 2. Cuando se realizó la tinción con CBB según un método convencional, se detectó una banda en una posición correspondiente a aproximadamente 400 kDa, tal como se muestra en la figura 2, y esta banda fue reconocida por el anticuerpo SKM9-2 en inmunotransferencia de tipo Western. Este resultado demuestra que el antígeno para el anticuerpo SKM9-2 se purificó con éxito mediante las operaciones anteriores.

(2) Identificación del antígeno SKM9-2 (HEG1)

Se cortó la banda que presentaba aproximadamente 400 kDa en la tinción con CBB y se trató con peptidasa, y luego se sometió a espectrometría de masas (nano-CL EM/EM) para identificar una proteína candidata a través de la búsqueda Mascot. Como resultado, se obtuvo el homólogo 1 de proteína HEG (HEG1) como proteína candidata.

Sin embargo, el peso molecular estimado de la proteína HEG1 (aproximadamente 150 kDa) era inconsecuente con el peso molecular del antígeno para el anticuerpo SKM9-2 estimado por SDS-PAGE en el ejemplo mencionado anteriormente, que era aproximadamente 400 kDa. Teniendo esto en cuenta, se realizó el siguiente experimento para determinar si el anticuerpo SKM9-2 es capaz de reconocer la proteína HEG1.

En primer lugar, se realizó un análisis de inmunotransferencia de tipo Western para ver si una banda reconocida por el anticuerpo SKM9-2 se debilitaría mediante la supresión de la expresión de HEG1. Además, se confirmó si el anticuerpo SKM9-2 es capaz de detectar HEG1 soluble recombinante producida en ACC-MESO4 mediante análisis de inmunotransferencia de tipo Western.

Se prepararon los siguientes tres tipos de ARNip para HEG1 humana (H1097, H2674, H3671) y se realizó la supresión de la expresión de HEG1.

hebra sentido de H1097: GAUCUUUGACGGUCAGUCUGG (SEQ ID NO: 23)

hebra antisentido de H1097: AGACUGACCGUCAAAGAUCGC (SEQ ID NO: 24)

hebra sentido de H2674: CCUAUAGCCGUACAGACUACA (SEQ ID NO: 25)

hebra antisentido de H2674: UAGUCUGUACGGCUAUAGGGC (SEQ ID NO: 26)

hebra sentido de H3671: GCAAGUCGGGAUACUUUCAGU (SEQ ID NO: 27)

hebra antisentido de H3671: UGAAAGUAUCCCGACUUGCAC (SEQ ID NO: 28)

Como control negativo, se usó el control Mission Negative SIC-001, secuencias confidenciales (Sigma-Aldrich Japan K.K.).

El procedimiento específico fue tal como sigue. Se transfectó cada ARNip en ACC-MESO4 usando Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific, Inc.). Se cultivaron las células durante 72 horas y después de esto se lavaron con PBS y se añadieron a lo mismo 25 |il/cm2 de tampón Tris 20 mM (pH 8,0) que contenía SDS al 1% y nucleasa benzonasa 125 mU/ml (Merck Millipore) y se dejó reposar el resultante en hielo durante 5 minutos y se recogió el lisado. Se centrifugó el lisado para obtener un sobrenadante como muestra, que se separó mediante SDS-PAGE al 6% y luego se sometió a inmunotransferencia de tipo Western. Además, la supresión de la expresión se realizó usando un lentivirus que expresaba ARNhc para h EG1 humana. Se obtuvieron partículas lentivirales (sc-78365-V) para su uso de Santa Cruz Biotechnology, Inc., y se infectó ACC-MESO4 con ellas según el protocolo del producto. Después de 48 horas, se inició la selección del fármaco con 10 |ig/ml de puromicina, y las células que sobrevivieron y proliferaron hasta el día 10 se usaron como células que expresaban ARNhc de manera estable. Las operaciones realizadas después de la solubilización fueron las mismas que las del tratamiento con ARNip. Como control negativo, se usaron partículas lentivirales de control cop GFP (sc-108084, producidas por Santa Cruz Biotechnology, Inc.).

Los resultados fueron tal como se muestran en la figura 3. Cuando se suprimió la expresión de HEG1 en células de mesotelioma con tres tipos de ARNip, la reactividad del anticuerpo SKM9-2 con la banda reconocida por el anticuerpo SKM9-2 disminuyó para cualquier tipo de ARNip. La reactividad del anticuerpo SKM9-2 disminuyó de manera similar cuando se expresó ARNhc para HEG1 con el uso de partículas lentivirales disponibles comercialmente. Estos resultados sugieren que el anticuerpo SKM9-2 reconoce la proteína HEG1.

Se clonaron ADNc de HEG1 (SEQ ID NO: 32 y 34) a partir de ACC-MESO4, y se conectaron una etiqueta FLAG y una etiqueta His a una secuencia de bases correspondiente a una región extracelular en la secuencia de bases expuesta en SEQ ID NO: 32 (posición 1 a posición 4059 de SEQ ID NO: 32) para producir un gen (SEQ ID NO: 17), que se insertó entre un sitio XhoI y un sitio NotI de pcDNA3.1 (-) (Thermo Fisher Scientific, Inc.) para preparar un plásmido de expresión de HEG1 soluble recombinante. Se transfectó el plásmido en ACC-MESO4 usando reactivo Lipofectamine LTX con reactivo PLUS (Thermo Fisher Scientific, Inc.), y se realizó la selección de fármacos usando 750 |ig/ml de Geneticin (Thermo Fisher Scientific, Inc.). Después de 2 semanas, se recogieron las células supervivientes y en proliferación, que se usaron como células que expresan de manera estable HEG1 soluble recombinante. Se añadió el sobrenadante del cultivo para las células en un volumen de 40 ml a HisTrap excel (1 ml) (GE Healthcare) y se sometió el resultante a elución con tampón fosfato 25 mM (pH 7,2) que contenía imidazol 10 mM y NaCl 0,5 M con un gradiente de concentración de imidazol de 10 a 500 mM a través de una columna lavada previamente con el mismo tampón. Se recogieron las fracciones positivas para la unión con el anticuerpo SKM9-2 en la transferencia puntual, se concentraron usando un Amicon Ultra-15, 100 kDa (Merck Millipore) y se sometieron a intercambio de disolución con tampón Tris 20 mM (pH 8,0) que contenía EDTA 10 mM y clorhidrato de guanidina 6 M seguido de intercambio de disolución con tampón fosfato 25 mM (pH 7,2) que contiene Tween 20 al 0,1% para preparar HEG1 soluble recombinante parcialmente purificada. La HEG1 soluble recombinante tenía un peso molecular comparable al del antígeno SKM9-2 y reconocido por el anticuerpo SKM9-2 (figura 3). Estos resultados sugieren que cuando se produce en el mesotelioma, la proteína HEG1 sufre una modificación postraduccional o similar y el peso molecular aumenta significativamente, y que el anticuerpo SKM9-2 reconoce e1HEG1 modificado de manera postraduccional expresado en el mesotelioma.

(3) Modificación postraduccional de HEG1 incluida en el epítopo

El peso molecular aparente de la proteína HEG1 por SDS-PAGE fue de aproximadamente 400 kDa, que fue considerablemente más alto que el peso molecular esperado de la proteína, 148 kDa. Para averiguar la causa, se analizó la secuencia de aminoácidos primaria de la proteína HEG1, y se esperaba del análisis que HEG1 experimentaría una serie de O- y N-glicosilación. Basándose en la expectativa, el antígeno purificado se trató con una glicosidasa y se analizó la reactividad del anticuerpo SKM9-2.

Específicamente, la proteína HEG1 purificada a partir de células ACC-MESO4 se dejó sin tratar o se trató con una enzima, y luego se examinó la reactividad del anticuerpo SKM9-2. El examen de la reactividad se realizó basándose en el análisis de transferencia puntual como se describió anteriormente.

Los resultados fueron tal como se muestran en la figura 4. El anticuerpo SKM9-2 no se unió al antígeno tratado con neuraminidasa tal como se muestra en la figura 4 (se obtuvo el mismo resultado para HEG1 soluble recombinante, aunque no se ilustra). El resultado de que el anticuerpo perdió la reactividad con el antígeno a través del tratamiento con a2-3 neuraminidasa sugiere que el epítopo del anticuerpo SKM9-2 incluye una cadena de azúcar unida a a2-3 derivada de la sialilación.

Por tanto, se reveló que la proteína HEG1 en el estado de forma glicosilada que tiene sialilación se expresaba en células ACC-MESO4. También se reveló que el anticuerpo SKM9-2 reconoce la proteína HEG1 dependiendo de la glicosilación de la proteína HEG1. En el ejemplo 1, se obtuvieron anticuerpos policlonales del suero de un ratón inmunizado con una línea celular derivada del mesotelioma pleural maligno humano, y se trató la proteína HEG1 con neuraminidasa y luego se realizó un gráfico de puntos para encontrar que el reconocimiento por el anticuerpo HEG1 estaba debilitado por el tratamiento con neuraminidasa. A partir de este resultado, se infiere que los anticuerpos obtenidos incluían muchos anticuerpos capaces de reconocer la proteína HEG1 de manera dependiente de la glicosilación.

Un análisis adicional de los resultados encontró que el tratamiento con N-glicanasa (PNGasa F) no hizo que el anticuerpo perdiera la reactividad tal como se muestra en la figura 4, a partir de la cual se infirió que la cadena de azúcar incluida en el epítopo era una cadena de azúcar ligada a O. Además, el tratamiento con proteinasa K provocó que el anticuerpo perdiera la reactividad, a partir de la cual se esperaba que el epítopo incluyera una región peptídica. Estos resultados sugieren que el anticuerpo SKM9-2 es un anticuerpo capaz de reconocer la parte de la cadena de azúcar y la parte del péptido de la proteína HEG1. Por otro lado, los anticuerpos anti-HEG1 disponibles comercialmente son aquellos para un antígeno peptídico y un anticuerpo anti-HEG1 como un anticuerpo policlonal de cabra de Santa Cruz Biotechnology, Inc. (HEG1 (N-13): sc-102592) y un anticuerpo anti-HEG1 como anticuerpo policlonal de conejo de Bioss Inc. no reaccionó con la proteína HEG1 purificada de mesotelioma.

(4) Localización de la proteína HEG1 en la membrana celular

Teniendo en cuenta que la tinción inmunohistológica encontró localización de la proteína HEG1 en la membrana celular, se examinó si el anticuerpo SKM9-2 se une a la región extracelular o intracelular de la proteína HEG1.

En primer lugar, se cultivó ACC-MESO4 y se despegaron las células adheridas a la placa de cultivo con un raspador. Se hicieron reaccionar las células despegadas con el anticuerpo SKM9-2 y luego se trataron con anticuerpo de ratón anti-IgG marcado con FITC y se analizaron usando un citómetro de flujo. Se usó un anticuerpo 2D2, que no se une a ninguna célula, como control negativo. Si el anticuerpo SKM9-2 se une a la región extracelular de la proteína HEG1, las células deben marcarse con FITC y, por tanto, se observaría fluorescencia en la citometría de flujo. El resultado fue tal como se muestra en la figura 5.

Se reveló que el anticuerpo SKM9-2 se une a una parte de la proteína HEG1 expuesta en la superficie de la membrana celular, tal como se muestra en la figura 5.

Ejemplo 4: secuenciación del anticuerpo SKM9-2

En este ejemplo, se determinaron la secuencia de ADN del anticuerpo SKM9-2 y la secuencia de aminoácidos del ^anticuerposKm9-2.

Se analizó el sobrenadante del cultivo para el hibridoma SKM9-2 usando un kit de isotipado de anticuerpos monoclonales de ratón IsoStrip (Roche Diagnostics K.K.), y el resultado sugirió que la subclase del anticuerpo SKM9-2 era IgG1 y tenía cadenas L kappa. Luego, se extrajo ARN del hibridoma usando TRIzol (Life Technologies), y se realizó 5'RACE (Takara Bio Inc.) con un cebador diseñado basándose en la información de bases de datos de secuencias de genes para IgG1 de ratón y cadenas kappa. De ese modo, se determinaron las secuencias de bases completas de los marcos de lectura abiertos de la cadena H y la cadena L del anticuerpo SKM9-2. Los resultados fueron tal como se muestran en la figura 6.

Ejemplo 5: reactividad del anticuerpo SKM10-2 con la proteína HEG1

Se examinó la especificidad de reacción del anticuerpo SKM10-2, que se obtuvo como un anticuerpo capaz de reconocer específicamente el mesotelioma en el ejemplo 1.

El lisado celular que contenía HEG1 soluble recombinante (véase el ejemplo 3 (2)) y ACC-MESO4 se separaron mediante SDS-PAGE al 6% y se sometieron a inmunotransferencia de tipo Western con el sobrenadante del cultivo para SKM10-2. Los resultados fueron tal como se muestran en la figura 7. El anticuerpo SKM10-2 reconoció la proteína HEG1 tal como se muestra en la figura 7. Además, el resultado mostrado en la figura 7 de que el anticuerpo SKM10-2 perdió la reactividad a través del tratamiento de descomposición de la cadena de azúcar reveló que el anticuerpo SKM10-2 es un anticuerpo que se une a la proteína HEG1 de una manera dependiente de la glicosilación, de manera similar al anticuerpo SKM9-2. Además, el anticuerpo SKM10-2 es capaz de competir con el anticuerpo SKM9-2 por unirse a la proteína HEG1.

Ejemplo 6: preparación de un Fab fusionado con intelectina

Se preparó una proteína de fusión de fragmentos Fab del anticuerpo SKM9-2 y la intelectina, y se examinó si este anticuerpo fusionado con intelectina es capaz de reconocer la proteína HEG1.

Se fusionaron la región VH y la región CH1 de una cadena H del anticuerpo SKM9-2 y los aminoácidos desde la posición 19 hasta la posición 313 de la intelectina humana (SEQ ID NO: 20) para producir una proteína (SEQ ID NO: 21), que se expresó conjuntamente con cadenas L del anticuerpo SKM9-2 en células para producir un anticuerpo fusionado con intelectina. Los presentes inventores han revelado que la intelectina tiene una especificidad extremadamente alta y una alta afinidad por la estructura del diol, y puede ser altamente purificada usando una columna empaquetada con gel modificado con diol. Por consiguiente, el sobrenadante del cultivo que contenía el anticuerpo fusionado con intelectina se añadió a una columna empaquetada con diol-Sepharose y se eluyó con 1,2-propanodiol para obtener un anticuerpo fusionado con intelectina purificado. Se preparó diol-Sepharose mediante hidrólisis alcalina de grupos epoxi de perlas de Sepharose que incluían 1,4-bis(2,3-epoxipropil)butano introducido en las mismas (Sepharose 6B activada con epoxi (GE Healthcare Bio-Sciences AB)). Se realizó un análisis de inmunotransferencia de tipo Western para determinar si el anticuerpo fusionado con intelectina es capaz de reconocer la proteína HEG1. En la inmunotransferencia de tipo Western, el anticuerpo fusionado con intelectina se usó como anticuerpo primario y un anticuerpo anti-intelectina humana marcado con peroxidasa de rábano picante se usó como anticuerpo secundario. Los resultados fueron tal como se muestran en la figura 8, y el anticuerpo fusionado con intelectina reconoció la proteína HEG1 glicosilada como en el caso del anticuerpo SKM9-2.

Los presentes inventores dilucidaron que la intelectina se une a la estructura de diol. Se permitió que las células RK-13 expresaran a la fuerza intelectina-1 humana, y se añadieron perlas con o sin estructura de diol, tal como se indica en la tabla 4, a 500 ^l del sobrenadante del cultivo para las células RK-13 (medio MEM que contiene intelectina-1 humana recombinante y FCS al 5%), y se agitó el resultante a 25°C durante 18 horas. Después de esto, se recogieron las perlas mediante centrifugación y se lavaron las perlas recogidas una vez con tampón Tris 20 mM (pH 7,2) que contenía Tween 20 al 0,1% y NaCl 150 mM, y se realizó la elución con tampón que contenía glicerol al 15%. La muestra eluida se separó mediante SDS-PAGE y se realizó la tinción con CBB. Las perlas de diol usadas fueron perlas obtenidas uniendo 3-amino-1-propanodiol a la superficie de perlas de poliestireno a través de grupos amino, y las perlas de diol-Sepharose usadas fueron las preparadas mediante hidrólisis alcalina de grupos epoxi de perlas de Sepharose incluyendo 1,4-bis(2,3-epoxipropil)butano introducido en las mismas (Sepharose 6B activada con epoxi (gE ^{Healthcare Bio-Sciences}Ab)).

Los resultados fueron tal como se muestran en la figura 9. En resumen, la intelectina se unió fuertemente a las perlas de diol y las perlas de diol-Sepharose, y no se unió a las perlas sin estructura de diol.

[Tabla 4]

Se inhibió la unión entre la intelectina y las perlas de diol-Sepharose en presencia de otro compuesto con estructura de diol. Se llevó a cabo un experimento en el que se midió la unión de la intelectina-1 humana recombinante a un chip sensor que incluía 3-amino-1-propanodiol fijado al mismo mediante grupos amino usando un Biacore (GE Healthcare Bio-Sciences AB) en presencia de diversos compuestos diluidos en serie, donde se usó intelectina con una concentración final de 0,5 |ag/ml, y tampón HEPES 10 mM (pH 7,0) que contenía CaCh 1 mM, se usó NaCl 150 mM y Tween 20 al 0,03% como tampón para la medición, y se determinó la tasa de unión de intelectina para cada muestra, ya que el grado de unión de intelectina medido para una muestra sin adición de compuesto se definió como una tasa de unión del 100%.

Los resultados fueron los que se muestran en la tabla 5. La CI⁵⁰en la inhibición de la unión entre la intelectina y las perlas de diol-Sepharose fue de 1 mM o menos para L-ribosa, D-ribosa, ácido L-ascórbico, monobutirina, glicerol, 1,2-butanodiol, 1,2-propanodiol y (R)-1,2-propanodiol (véase la tabla 5). Por el contrario, la CI⁵⁰fue superior a 100 mM para compuestos sin estructura de diol tales como etanol, 1-propanol y 3-amino-1-propanol.

[Tabla 5]

Por tanto, la intelectina se une a la estructura diol de un compuesto. Por consiguiente, puede purificarse la intelectina con perlas de diol-Sepharose o similares. Además, se purificó con éxito una proteína de fusión de fragmentos Fab del anticuerpo y la intelectina con las perlas de diol-Sepharose. Resulta evidente que los expertos en la técnica entienden que la purificación de la proteína de fusión de intelectina puede lograrse usando una columna o perlas que incluyan cualquiera de los compuestos enumerados en la tabla 5 como una fase sólida. Dado que las columnas con estructura de diol pueden obtenerse a bajo coste, la proteína de fusión de intelectina es útil para la detección del mesotelioma desde el punto de vista del coste de producción.

Ejemplo 7A: efecto supresor de la proliferación para el mesotelioma mediante atenuación de HEG1

En este ejemplo, se atenuó HEG1 en una línea celular de mesotelioma usando ARNip para HEG1, y se examinó el efecto sobre la proliferación celular del mesotelioma.

Se usó una línea celular ACC-MESO-4 como células de mesotelioma. Se sembraron las células en una placa de 96 pocillos a 5 x ^{10 3}células/pocillo y se cultivaron con 100 |il de medio durante 24 horas. Se lavaron las células con PBS y se añadieron a cada pocillo 15 |il de Opti-MEM (Thermo Fisher Scientific Inc.) que contenía 7,5 pmol de ARNip y 0,15 |il de Lipofectamine 2000 o Lipofectamine RNAiMAX (Thermo Fisher Scientific Inc.). Se cultivaron las células durante 24 horas, 48 horas o 72 horas, y se contó el número de células supervivientes usando el reactivo de proliferación celular CellTiter 96 AQueous One Solution (Promega K.K., Tokio, Japón).

Para el ARNip, se usó una mezcla 1:1 de los H1097 y H2674 anteriores como ARNip y sc-78365 disponible comercialmente (Santa Cruz Biothechnology, Inc.) como ARNip2, y adicionalmente S3816, SASI_Hs02_00353816; S3817, SASI_Hs02_00353817; y S3818, SASI_Hs02_00353818 (Sigma-Aldrich Japan K.K.).

Como H3059, se usó

hebra sentido de H3059: 5'-GCGAAUGCGUCGCAGACAACA-3' (SEQ ID NO: 38)

hebra antisentido de H3059: 5'-UUGUCUGCGACGCAUUCGCCA-3' (SEQ ID NO: 39)

y como H9106, se usó

hebra sentido de H9106: 5'-CUGGCGUUCUAGUCAGUAAAA-3' (SEQ ID NO: 40)

hebra antisentido de H9106: 5'-UUACUGACUAGAACGCCAGAC-3' (SEQ ID NO: 41)

Como control, se usó control negativo universal para ARNip MISSION (SIC-001) (Sigma-Aldrich Japan K.K., Tokio, Japón).

El efecto de la atenuación de HEG1 sobre la proliferación celular a lo largo del tiempo fue tal como se muestra en la figura 10. Tal como se muestra en la figura 10, se reveló que la potencia de proliferación celular en cualquiera de los casos con atenuación de HEG1 (ARNip1 y ARNip2 de HEG1) era menor que los de la línea celular de mesotelioma de control y sin tratar. El recuento de células disminuyó desde antes del inicio del cultivo para el ARNip1 de HEG1 (figura 10). Se indujo muerte celular en algunas de las células de mesotelioma tratadas con el ARNip1 de HEG1 en la hora 48.

Se comprobó el número de células 72 horas después de la introducción de ARNip para HEG1 para cada uno de los ARNip anteriores. Se realizó la introducción de ARNip en las células tal como se describió anteriormente. Los resultados fueron tal como se muestran en la figura 11. Se redujo la potencia de proliferación celular de las células de mesotelioma mediante la atenuación de HEG1 con cualquiera de los ARNip tal como se muestra en la figura 11.

Se introdujo el ARNip H2674 en células NCI-H2452, como otra línea celular de mesotelioma, y células HEK-293T, que no expresan HEG1. Los resultados fueron tal como se muestran en la figura 12.

La atenuación de HEG1 con el ARNip de HEG1 suprimió la proliferación celular para otra línea celular de mesotelioma tal como se muestra en la figura 12. Por otro lado, las células HEK-293T, que no expresan HEG1, no resultaron afectadas por el ARNip.

Estos resultados revelaron que la expresión de HEG1 está muy implicada en la proliferación celular del mesotelioma. Además, se reveló que la proliferación celular del mesotelioma puede suprimirse mediante la supresión de la expresión de HEG1. Este hallazgo sugiere que el tratamiento de cánceres que implican la expresión de HEG1 (por ejemplo, mesotelioma) es posible mediante la inhibición de la expresión de HEG1 o la función de aceleración de la proliferación celular de h Eg 1.

El análisis de ontología génica de una molécula de HEG1 muestra que la proteína HEG1 tiene tres dominios EGF en la región extracelular. Por ejemplo, la proteína MUC4 tiene un dominio EGF extracelular y se sabe que se une a ErbB2 (o HER2/neu) que va a implicarse en la carcinogénesis. Tal información sugiere la posibilidad de que los dominios EGF de la proteína HEG1 estén implicados de manera similar en la oncogénesis. En este ejemplo, se suprimió la proliferación celular de células tumorales mediante la anulación de HEG1. En otras palabras, este ejemplo mostró el resultado de que la proteína HEG1 es necesaria para la proliferación de células tumorales. Este resultado indica la posibilidad de que los dominios EGF estén implicados en la función de aceleración de la proliferación celular de la proteína HEG1.

Con respecto al sitio de expresión intracelular de HEG1, mientras que el HEG1 no glicosilado convencional se expresa en un sitio de unión estrecha entre las células epiteliales, el HEG1 glicosilado característico del mesotelioma es hidrófilo debido a la glicosilación y se expresa en la superficie apical de una célula epitelial. Este hecho también sugiere la posibilidad de que HEG1 esté implicado en señales intercelulares o transducción de señales asociadas con la proliferación celular.

Ejemplo 8A: determinación de la región del epítopo

En este ejemplo, se dejó que la línea celular de mesotelioma ACC-MESO-1 expresara un fragmento de HEG1 humana con el HEG1 endógeno de ACC-MESO-1 atenuado, y se examinó la reactividad con el anticuerpo SKM9-2. Posteriormente, se sometió a prueba la reactividad con el anticuerpo para la región del epítopo a través de exploración con alanina y se determinaron los aminoácidos clave para la unión al anticuerpo.

(1) Análisis de dominio de unión

Se realizó la transferencia génica con ARNip de HEG1 (H9106) (SEQ ID NO: 40, 41) y HEG1 humana para la línea celular de mesotelioma ACC-MESO-1, y se examinó la reactividad del SKM9-2 mediante análisis de inmunotransferencia de tipo Western. Se usó una proteína de longitud completa (HEG1 de longitud completa) o un fragmento (HEG1 de 3 kb, HEG1 de 2 kb o HEG1 de 1 kb) de la HEG1 humana. Se obtuvo la proteína He G1 humana de longitud completa, una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 35, insertando una secuencia de bases indicada en SEQ ID NO: 34 en pFLAG-CMV1 (Sigma-Aldrich Japan KK) para obtener un plásmido, transformar el plásmido y permitir que la línea celular de mesotelioma exprese el plásmido. Se obtuvo el fragmento HEG1 de 3 kb insertando un fragmento correspondiente a una secuencia desde la posición 285, leucina, hasta la posición 1387, fenilalanina, de SEQ ID NO: 35 en pFLAG-CMV1 (Sigma-Aldrich Japan KK) de una manera en marco, y permitiendo que la línea celular de mesotelioma exprese la resultante. Se obtuvieron HEG1 de 2 kb y HEG1 de 1 kb permitiendo que la línea celular de mesotelioma expresara productos obtenidos de manera similar a partir de un fragmento correspondiente a una secuencia desde la posición 677, leucina, hasta la posición 1387, fenilalanina, de SEQ ID NO: 35 y un fragmento correspondiente a una secuencia desde la posición 992, valina, hasta la posición 1387, fenilalanina, de SEQ ID NO: 35, respectivamente. Se analizó cada lisado celular mediante inmunotransferencia de tipo Western con el anticuerpo SKM9-2. Los resultados fueron tal como se muestran en la figura 13 y la figura 14A.

HEG1 de longitud completa, HEG1 de 3 kb y HEG1 de 2 kb, incluyendo cada una el exón 7 de HEG1, fueron positivas (+) tal como se muestra en la figura 13 y la figura 14A. En cambio, HEG1 de 1kb fue negativa (-) en la unión al anticuerpo (figura 13 y figura 14A).

Estos resultados revelaron que el anticuerpo SKM9-2 se une a una región en el exón 7 de HEG1.

(2) Análisis del dominio de unión - parte 2

Además, se analizó en detalle la región del exón 7 de HEG1. La secuencia de aminoácidos de una parte del exón 7 de HEG1 se conectó al lado N-terminal de una proteína obtenida conectando una señal de anclaje de GPI a SLURP1 humana (SEQ ID NO: 42; a continuación en el presente documento denominada “SLURPgpi”) para producir una proteína de fusión, y se examinó la reactividad del SKM9-2 mediante análisis de inmunotransferencia de tipo Western con la proteína de fusión. Se añadió una secuencia señal (SEQ ID NO: 43) al extremo N-terminal de la proteína de fusión antes de la expresión.

Las proteínas de fusión usadas de una secuencia parcial del exón 7 de HEG1 y SLURPgpi fueron las siguientes: un fragmento obtenido uniendo un fragmento desde el aminoácido n.° 783, ácido aspártico, hasta el aminoácido n.° 991, serina, con SLURPgpi (7.6);

un fragmento obtenido uniendo un fragmento desde el aminoácido n.° 832, glutamina, hasta el aminoácido n.° 991, serina, con SLURPgpi (7.7);

un fragmento obtenido uniendo un fragmento desde el aminoácido n.° 886, glutamina, hasta el aminoácido n.° 991, serina, con SLURPgpi (7.8);

un fragmento obtenido uniendo un fragmento desde el aminoácido n.° 941, alanina, hasta el aminoácido n.° 991, serina, con SLURPgpi (7.9);

un fragmento obtenido uniendo SEQ ID NO: 44 con SLURPgpi (7.61);

un fragmento obtenido uniendo SEQ ID NO: 45 con SLURPgpi (7.62);

un fragmento obtenido uniendo SEQ ID NO: 46 con SLURPgpi (7.63);

un fragmento obtenido uniendo SEQ ID NO: 47 con SLURPgpi (7.64);

un fragmento obtenido uniendo SEQ ID NO: 48 con SLURPgpi (7.623);

un fragmento obtenido uniendo SEQ ID NO: 49 con SLURPgpi (7.6231);

un fragmento obtenido uniendo SEQ ID NO: 50 con SLURPgpi (7.6232);

un fragmento obtenido uniendo SEQ ID NO: 51 con SLURPgpi (7.6241); y

un fragmento obtenido uniendo SEQ ID NO: 52 con SLURPgpi (7.6242).

Los resultados fueron tal como se muestran en la figura 13 y la figura 14B.

Las proteínas de fusión (7.6 y 7.62) fueron positivas tal como se muestra en la figura 13 y la figura 14B. Estos resultados revelaron que el anticuerpo SKM9-2 se une a una región que incluye de E793 a T812 de HEG1.

Tal como se muestra en la figura 13 y la figura 14C, las proteínas de fusión (7.623 y 7.6231) fueron positivas. Estos resultados revelaron que el anticuerpo SKM9-2 se une a una región que incluye de S799 a E810 de HEG1.

(3) Análisis del sitio de unión por exploración con alanina

Posteriormente, se modificó un fragmento de S799 a E810 mediante la sustitución de un aminoácido con alanina, y el fragmento resultante se unió a SLURPgpi como se describió anteriormente, y se examinó la reactividad con el anticuerpo SKM9-2 mediante análisis de inmunotransferencia de tipo Western.

Como se muestra en la figura 13 y la figura 14D, se encontró que de S799 a T809 (SKSPSLVSLPT; SEQ ID NO: 53) es el epítopo (epítopo lineal) para el anticuerpo SKM9-2.

Además, cuando se trató un lisado de células que expresaban el fragmento 7.6231 con neuraminidasa, la reacción entre el fragmento y el anticuerpo SKM9-2 desapareció (véase la figura 14E). Este resultado reveló que el epítopo reconocido por el anticuerpo SKM9-2 incluye una modificación con ácido siálico.

Lista de secuencias

SEQ ID NO: 1: secuencia de ácido nucleico de cadena pesada de anticuerpo SKM9-2

SEQ ID NO: 2: secuencia de aminoácidos de cadena pesada de anticuerpo SKM9-2

SEQ ID NO: 3: secuencia de ácido nucleico de cadena ligera de anticuerpo SKM9-2

SEQ ID NO: 4: secuencia de aminoácidos de cadena ligera de anticuerpo SKM9-2

SEQ ID NO: 5: secuencia de ácido nucleico de CDR1 de cadena pesada de anticuerpo SKM9-2

SEQ ID NO: 6: secuencia de aminoácidos de CDR1 de cadena pesada de anticuerpo SKM9-2

SEQ ID NO: 7: secuencia de ácido nucleico de CDR2 de cadena pesada de anticuerpo SKM9-2

SEQ ID NO: 8: secuencia de aminoácidos de CDR2 de cadena pesada de anticuerpo SKM9-2

SEQ ID NO: 9: secuencia de ácido nucleico de CDR3 de cadena pesada de anticuerpo SKM9-2

SEQ ID NO: 10: secuencia de aminoácidos de CDR3 de cadena pesada de anticuerpo SKM9-2

SEQ ID NO: 11: secuencia de ácido nucleico de CDR1 de cadena ligera de anticuerpo SKM9-2

SEQ ID NO: 12: secuencia de aminoácidos de CDR1 de cadena ligera de anticuerpo SKM9-2

SEQ ID NO: 13: secuencia de ácido nucleico de CDR2 de cadena ligera de anticuerpo SKM9-2

SEQ ID NO: 14: secuencia de aminoácidos de CDR2 de cadena ligera de anticuerpo SKM9-2

SEQ ID NO: 15: secuencia de ácido nucleico de CDR3 de cadena ligera de anticuerpo SKM9-2

SEQ ID NO: 16: secuencia de aminoácidos de CDR3 de cadena ligera de anticuerpo SKM9-2

SEQ ID NO: 17: secuencia de ácido nucleico de ADNc de HEG1 soluble que tiene etiqueta FLAG y etiqueta His SEQ ID NO: 18: secuencia de aminoácidos codificada por ADNc de HEG1 soluble que tiene etiqueta FLAG y etiqueta His

SEQ ID NO: 19: secuencia de ácido nucleico de gen intelectina-1 humano

SEQ ID NO: 20: secuencia de aminoácidos de proteína intelectina-1 humana

SEQ ID NO: 21: secuencia de ácido nucleico de gen de fusión de cadena pesada de anticuerpo SKM9-2 e intelectina SEQ ID NO: 22: secuencia de aminoácidos de proteína de fusión de cadena pesada de anticuerpo SKM9-2 e intelectina SEQ ID NO: 23: secuencia de ácido nucleico de hebra sentido de H1097

SEQ ID NO: 24: secuencia de ácido nucleico de hebra antisentido de H1097

SEQ ID NO: 25: secuencia de ácido nucleico de hebra sentido de H2674

SEQ ID NO: 26: secuencia de ácido nucleico de hebra antisentido de H2674

SEQ ID NO: 27: secuencia de ácido nucleico de hebra sentido de H3671

SEQ ID NO: 28: secuencia de ácido nucleico de hebra antisentido de H3671

SEQ ID NO: 29: secuencia de ácido nucleico de gen HEG1 registrado como NM_020733,1

SEQ ID NO: 30: secuencia de aminoácidos de proteína codificada por SEQ ID NO: 29

SEQ ID NO: 31: forma soluble de una variante que se produce de manera natural de proteína HEG1

SEQ ID NO: 32: secuencia de ácido nucleico de ácido nucleico que codifica para una variante que se produce de manera natural de proteína HEG1

SEQ ID NO: 33: secuencia de aminoácidos de proteína codificada por SEQ ID NO: 32

SEQ ID NO: 34: secuencia de ácido nucleico de ácido nucleico que codifica para una variante que se produce de manera natural de proteína HEG1

SEQ ID NO: 35: secuencia de aminoácidos de proteína codificada por SEQ ID NO: 34

SEQ ID NO: 36: secuencia de ácido nucleico de ácido nucleico que codifica para una variante que se produce de

Claims

REIVINDICACIONES

i . Anticuerpo que se une a la proteína HEG1 que tiene glicosilación obtenida de mesotelioma, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, en el que la proteína HEG1 tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEQ ID NO: 30, 31, 33, 35 y 37.
2. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo se une a la proteína HEG1 que tiene glicosilación obtenida de mesotelioma de una manera dependiente de la glicosilación.
3. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según la reivindicación 2, en el que el anticuerpo se une a un epítopo en el dominio extracelular de proteína HEG1 humana expresada en células de mesotelioma humanas, pero experimenta debilitación en o pérdida de unión a proteína HEG1 humana a través de un tratamiento con a2-3 neuraminidasa o a2-3,6,8 neuraminidasa.
4. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo se une a proteína HEG1 en una membrana celular de mesotelioma.
5. Anticuerpo según o fragmento de unión a antígeno del mismo según la reivindicación 4, en el que el anticuerpo es:

1) un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 6, CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 8, y CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 10, y una región variable de cadena ligera que comprende CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 12, CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 14, y Cd R3 que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 16;

(2) un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO:2 y una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 4; o

(3) un anticuerpo que compite por la unión con el anticuerpo tal como se define en (1) o (2) anteriores.
6. Anticuerpo que se une a un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 53, en el que el péptido se expresa en una línea celular de mesotelioma.
7. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según la reivindicación 5, en el que el antígeno es la proteína HEG1 que tiene glicosilación obtenida de mesotelioma, en el que la proteína HEG1 tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEQ ID NO: 30, 31, 33, 35 y 37.
8. Complejo de proteínas que comprende: una proteína de fusión de una región Vh o una región Vh y una región CH1 del anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 con proteína intelectina humana; y una cadena ligera de dicho anticuerpo.
9. Agente para su uso en el diagnóstico de mesotelioma, que comprende un anticuerpo que se une a la proteína HEG1, el anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o un fragmento de unión a antígeno del mismo, o el complejo de proteínas según la reivindicación 8.
10. Agente para su uso en el diagnóstico in vivo de mesotelioma, que comprende un conjugado de un anticuerpo que se une a la proteína HEG1, el anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o un fragmento de unión a antígeno del mismo, o el complejo de proteínas según la reivindicación 8, con una sonda de obtención de imágenes.
11. Kit para su uso en el diagnóstico de mesotelioma, que comprende un anticuerpo que se une a la proteína HEG1, el anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o un fragmento de unión a antígeno del mismo, o el complejo de proteínas según la reivindicación 8.
12. Kit para su uso en el diagnóstico in vivo de mesotelioma, que comprende un conjugado de un anticuerpo que se une a la proteína HEG1, el anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o un fragmento de unión a antígeno del mismo, o el complejo de proteínas según la reivindicación 8, con una sonda de obtención de imágenes.
13. Composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de mesotelioma, que comprende un anticuerpo que se une a la proteína HEG1, el anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o un fragmento de unión a antígeno del mismo, o el complejo de proteínas según la reivindicación 8, en la que la proteína HEG1 tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEQ ID NO: 30, 31, 33, 35 y 37.
14. Composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de mesotelioma, que comprende un agente de supresión de la expresión para la proteína HEG1, proteína HEG1 que es la proteína HEG1 que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene homología con la secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEQ ID NO: 30, 31, 33, 35 y 37 del 80% o más.
15. Método de detección de mesotelioma, que comprende detectar la proteína HEG1 en una muestra separada de un organismo vivo, en el que la proteína HEG1 tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEQ ID NO: 30, 31, 33, 35 y 37.
16. Método de detección de mesotelioma, que comprende detectar la proteína HEG1 en una muestra separada de un organismo vivo mediante el uso de un anticuerpo que se une a la proteína HEG1, el anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o un fragmento de unión a antígeno del mismo, o el complejo de proteínas según la reivindicación 8.
17. Proteína HEG1 que tiene glicosilación obtenida de mesotelioma o un fragmento de la misma que comprende una secuencia de aminoácidos desde la posición 799 hasta la posición 809 de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 35.
18. Marcador para su uso en el diagnóstico de mesotelioma, que comprende la proteína HEG1 o el fragmento de la misma según la reivindicación 17.