BRPI0510883B1 - Composto conjugado de droga e anticorpo, composição farmacêutica, método defabricação de composto conjugado de droga e anticorpo e usos de uma formulação, de um conjugado de droga e anticorpo e um agente quimioterapêutico e de uma combinação - Google Patents

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Frederic S. Jacobson
Paul Polakis
Ralph H. Schwall
Mark X. Sliwkowski
Susan D. Spencer
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Abstract

composto conjugado de droga e anticorpo, composição farmacêutica, métodos de inibição da proliferação celular, de tratamento de câncer, de inibição do crescimento de células tumorosas e de tratamento de paciente humano suscetível à disfunção, teste de detecção de células cancerosas, artigo industrializado e método de fabricação de composto conjugado de droga e anticorpo a presente invenção refere-se a compostos conjugados de droga e anticorpo da fórmula 1, em que uma ou mais porções de droga maitansinóide (d) são ligadas covalentemente por l a um anticorpo (ab) que se une a receptor de erbb, ou que se une a um ou mais antígenos associados a tumor ou receptores da superfície celular. estes compostos podem ser utilizados em métodos de diagnóstico ou tratamento de câncer e outras doenças e disfunções.

Description

[001] O presente pedido não provisório depositado com base em 37 CFR § 1.53 (b) reivindica o benefício com base em 35 USC § 119 (e) do Pedido Provisório Norte-Americano com número de série 60.576.517 depositado em primeiro de junho de 2004 e do Pedido Provisório Norte- Americano com número de série 60/616.098 depositado em cinco de outubro de 2004, cada um dos quais é integralmente incorporado como referência.
CAMPO DA INVENÇÃO
[002] A presente invenção refere-se geralmente a compostos com atividade anticancerígena e, mais especificamente, a anticorpos conjugados com toxinas ou drogas maitansinóides quimioterapêuticas. A presente invenção também se refere a métodos de uso de compostos conjugados de droga e anticorpo para o tratamento ou diagnóstico in vitro, in situ e in vivo de células de mamíferos ou condições patológicas associadas.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[003] A terapia com anticorpos foi estabelecida para o tratamento dirigido de pacientes com câncer, disfunções imunológicas e angiogênicas. O uso de conjugados de droga e anticorpo (ADC), ou seja, imunoconjugados, para o fornecimento local de agentes citotóxicos ou citostáticos, ou seja, drogas para matar ou inibir células tumorais no tratamento de câncer (Payne, G. (2003) Cancer Cell 3: 207-212; Trail et al (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52: 328-337; Syrigos e Epenetos (1999) Anticancer Research 19: 605-614; Niculescu-Duvaz e Springer (1997), Adv. Drug Del. Rev. 26: 151-172; US 4.975.278) teoricamente permite o fornecimento dirigido da porção de droga a tumores e seu acúmulo intracelular, em que a administração sistêmica desses agentes de drogas não conjugados pode resultar em níveis inaceitáveis de toxicidade para células normais, bem como para as células tumorais que se busca eliminar (Baldwin et al (1986), Lancet, págs. (quinze de março de 1986): 603-05; Thorpe (1985), Antibody Carriers of Cytotoxic Agents in Cancer Therapy: A Review em Monoclonal Antibodies '84: Biological and Clinical Applications, A. Pinchera et al (eds), págs. 475-506). Busca-se por este intermédio eficácia máxima com toxicidade mínima. Os esforços para projetar e refinar ADC concentraram-se na seletividade de anticorpos monoclonais (mAbs), bem como propriedades de ligação a drogas e liberação de drogas. Tanto anticorpos policlonais quanto anticorpos monoclonais foram relatados como sendo úteis nestas estratégias (Rowland et al (1986), Cancer Immunol. Immunother. 21: 183-87). As drogas utilizadas nestes métodos incluem daunomicina, doxorubicina, metotrexato, mitomicina, neocarzinostatina (Takahashi et al (1988), Cancer 61: 881-88) e vindesina (Rowland et al (1986), acima). As toxinas utilizadas em conjugados de anticorpo e toxina incluem toxinas bacterianas tais como toxina de difteria, toxinas vegetais tais como rícino (US 4.753.894; US 5.629.197; US 4.958.009; US 4.956.453), toxinas de moléculas pequenas tais como geldanamicina (Mandler et al (2000), J. of the Nat. Cancer Inst. 92 (19): 1573-1581; Mandler et al (2000), Bioorganic & Med. Chem. Letters 10: 1025-1028; Mandler et al (2002), Bioconjugate Chem. 13: 786-791), maitansinóides (EP 1391213; Liu et al (1996), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93: 8618-8623) e caliqueamicina (Lode et al (1998), Cancer Res. 58: 2928; Hinman et al (1993), Cancer Res. 53: 3336-3342). As toxinas podem exercer seus efeitos citotóxicos e citostáticos por meio de mecanismos que incluem ligação de tubulina, ligação de DNA ou inibição da topoisomerase. Algumas drogas citotóxicas tendem a ser inativas ou menos ativas quando conjugadas a anticorpos grandes ou ligantes de receptores de proteínas.
[004] Foi aprovado conjugado de anticorpo e radioisótopo, ZEVALIN® (ibritumomab tiuxetan, Biogen/Idec) composto de anticorpo monoclonal IgG1 kappa murino dirigido contra o antígeno CD20 encontrado e radioisótopo 111In ou 90Y ligado por quelante-ligante de tiouréia (Wiseman et al (2000), Eur. J. Nucl. Med. 27 (7): 766-77; Wiseman et al (2002), Blood 99 (12): 4336-42; Witzig et al (2002), J. Clin. Oncol. 20 (10): 2453-63; Witzig et al (2002), J. Clin. Oncol. 20 (15): 3262-69). MYLOTARG® (gemtuzumab ozogamicin, Wyeth Pharmaceuticals), o conjugado de droga e anticorpo composto de anticorpo huCD33 ligado a caliqueamicina, foi aprovado em 2000 para o tratamento de leucemia mielóide aguda por meio de injeção (Drugs of the Future (2000) 25 (7): 686; US 4.970.198; US 5.079.233; US 5.585.089; US 5.606.040; US 5.693.762; US 5.739.116; US 5.767.285; US 5.773.001). Cantuzumab mertansina (Immunogen, Inc.), conjugado de droga e anticorpo composto do anticorpo huC242 ligado por meio do ligante dissulfeto SPP à porção de droga maitansinóide, DM1 (Xie et al (2004), J. of Pharm. and Exp. Ther. 308 (3): 1073-1082; Tolcher et al (2003), J. Clin. Oncology 21 (2): 211222; US 5.208.020), passou por testes de Fase I para o tratamento de cânceres que expressam CanAg, tais como do cólon, pancreático, gástrico e outros. MLN-2704 (Millennium Pharm., BZL Biologics, Immunogen Inc.) é conjugado de droga e anticorpo composto do anticorpo monoclonal de antígeno de membrana específico anti-próstata (PSMA) ligado à porção de droga maitansinóide, DM1, em desenvolvimento para o tratamento potencial de tumores da próstata. A mesma porção de droga maitansinóide, DM1, foi ligada por meio de ligante não-dissulfeto, SMCC, a um anticorpo monoclonal murino de camundongo, TA.1 (Chari et al (1992), Cancer Research 52: 127-131). Relatou-se que este conjugado é duzentas vezes menos potente que o conjugado de ligante dissulfeto correspondente. O ligante SMCC foi ali considerado “não divisível” (vide também US 4.981.979). Relatou-se HERCEPTIN® (trastuzumab) ligado por SMCC a DM1 (WO 2005/037992).
[005] Em tentativas de descobrir alvos celulares eficazes para terapia e diagnóstico de câncer, os pesquisadores buscaram identificar polipeptídeos associados a transmembrana ou tumor de outra forma que são expressos especificamente sobre a superfície de um ou mais tipos específicos de célula cancerosa em comparação com uma ou mais células não cancerosas normais. Frequentemente, esses polipeptídeos associados a tumores são expressos de forma mais abundante sobre a superfície das células cancerosas em comparação com a superfície das células não cancerosas. A identificação desses polipeptídeos de antígenos da superfície celular associados a tumores, ou seja, antígenos associados a tumores (TAA) gerou a capacidade de dirigir especificamente células cancerosas para destruição por meio de terapias com base em anticorpos.
[006] A terapia com anticorpos monoclonais foi estabelecida para o tratamento dirigido de pacientes com câncer, disfunções imunológicas e angiogênicas. Exemplo de terapia com anticorpos bem sucedida é o HERCEPTIN® (trastuzumab), anticorpo monoclonal humanizado derivado de DNA recombinante que se liga seletivamente com alta afinidade em teste com base em células (Kd = 5 nM) ao domínio extracelular da proteína receptora de fator do crescimento epidérmico humano 2, HER2 (ErbB2) (US 5.821.337; US 6.054.297; US 6.407.213; US 6.639.055; Coussens, L. et al (1985), Science 230: 1132-9; Slamon, D. J. et al (1989), Science 244: 707-12). Trastuzumab é o anticorpo IgG1 kappa que contém regiões de estrutura humana com as regiões de determinação de complementaridade de anticorpo murino (4D5) que se liga a HER2. Trastuzumab liga-se ao antígeno HER2 e, desta forma, inibe o crescimento de células cancerosas. Como trastuzumab é anticorpo humanizado, ele minimiza qualquer reação de HAMA em pacientes. O anticorpo humanizado contra HER2 é produzido por cultivo de suspensão de células de mamíferos (Ovário de Hamster Chinês, CHO). O proto-oncogene HER2 (ou c-erbB2) codifica proteína receptora de transmembrana de 185 kDa, que é relacionada estruturalmente ao receptor de fator de crescimento epidérmico. A sobreexpressão (overexpressing) de proteína HER2 é observada em 25% a 30% de cânceres de mama primários e pode ser determinada utilizando um ensaio com base em imunohistoquímica de blocos de tumor fixos (Press, M. F. et al (1993), Cancer Res. 53: 4960-70. Demonstrou-se que trastuzumab, tanto em testes in vitro quanto em animais, inibe a proliferação de células de tumor humano que sobreexpressam (overexpress) HER2 (Hudziak, R. M. et al (1989), Mol. Cell Biol. 9: 1165-72; Lewis, G. D. et al (1993), Cancer Immunol. Immunother.; 37: 255-63; Baselga, J. et al (1998), Cancer Res. 58: 2825-2831). Trastuzumab é um mediador de citotoxicidade celular dependente de anticorpos, ADCC (Hotaling, T. E. et al (1996) (resumo). Proc. Annual Meeting Am. Assoc. Cancer Res.; 37: 471; Pegram M. D. et al (1997) (resumo). Proc. Am. Assoc. Cancer Res.; 38: 602; Sliwkowski et al (1999), Seminars in Oncology 26 (4), Supl. 12: 60-70; Yarden Y. e Sliwkowski, M. (2001) Nature Reviews: Molecular Cell Biology, Macmillan Magazines, Ltd., Vol. 2: 127-137). HERCEPTIN® é clinicamente ativo em pacientes com cânceres de mama metastáticos que sobreexpressam (overexpress) ErbB2 que receberam extensa e prévia terapia anti-cancerígena (Baselga et al (1996), J. Clin. Oncol. 14: 737-744). Embora HERCEPTIN seja revolucionário no tratamento de pacientes com cânceres de mama que sobreexpressam (overexpress) ErbB2 e receberam extensa e prévia terapia anti-cancerígena, a maior parte dos pacientes dessa população deixa de reagir ou reage pouco ao tratamento com HERCEPTIN. Existe, portanto, uma necessidade clínica significativa de desenvolvimento de terapias adicionais de câncer dirigido por HER2 para os pacientes com tumores que sobreexpressam (overexpress) HER2 ou outras doenças associadas à expressão de HER2 que não reagem, ou reagem pouco, ao tratamento com HERCEPTIN. Além de HER2, existe a oportunidade de explorar outros antígenos associados a tumores com terapias dirigidas.
DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO
[007] A presente invenção fornece compostos inovadores com atividade biológica contra células cancerosas. Os compostos podem inibir o crescimento de tumores em mamíferos e podem ser úteis para o tratamento de pacientes com câncer humano.
[008] A presente invenção refere-se ao fornecimento, transporte, acúmulo ou retenção de compostos terapêuticos conjugados de droga e anticorpo (ADC) no interior de células. A presente invenção refere-se mais especificamente a atingir altas concentrações de moléculas metabólitas ativas em células cancerosas. O direcionamento intracelular pode ser atingido por meio de métodos e compostos que permitam o acúmulo ou a retenção de agentes biologicamente ativos no interior de células. Esse direcionamento eficaz pode ser aplicável a uma série de procedimentos e formulações terapêuticas.
[009] Realizou-se a descoberta surpreendente de que conjugados de droga e anticorpo com grupos ligantes não-dissulfeto, estáveis, que ligam uma porção de droga maitansinóide a um anticorpo resultam em aumento da potência in vitro e da eficácia in vivo. Além disso, os conjugados de droga e anticorpo exibem o resultado inesperado de melhor segurança in vivo com relação a certos conjugados de ligante dissulfeto.
[010] Compostos conjugados de droga e anticorpo (ADC) compreendem um anticorpo ligado covalentemente por um ligante a uma ou mais porções de droga maitansinóide. ADC pode ser representado pela Fórmula I: Ab-(L-D)p I em que uma ou mais porções de droga maitansinóide (D) são ligadas covalentemente por L a um anticorpo (Ab). Ab é um anticorpo que se liga a um receptor de ErbB, ou que se liga a um ou mais antígenos associados a tumor ou receptores da superfície celular. O ligante L pode ser estável fora da célula, ou seja, extracelular. O ligante L, a porção de droga maitansinóide D ou o ligante e a porção de droga maitansinóide tomados em conjunto (L-D), não compreendem um grupo dissulfeto.
[011] Em uma realização, uma quantidade substancial da porção de droga não é clivada do anticorpo até que o conjugado de droga e anticorpo incorpore uma célula com um receptor de superfície celular específico para o anticorpo do conjugado de droga e anticorpo, e a porção de droga é clivada do anticorpo quando o conjugado de droga e anticorpo incorpora a célula.
[012] Em outra realização, o ADC liga-se especificamente a um receptor codificado por um gene ErbB, tal como EGFR, HER2, HER3 e HER4. O ADC pode ligar-se especificamente ao domínio extracelular do receptor HER2. O ADC pode inibir o crescimento de células tumorais que sobreexpressam receptor de HER2.
[013] Em outra realização, o anticorpo (Ab) da Fórmula I é um anticorpo humanizado tal como huMAb4D5-1, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 ou huMAb4D5-8 (trastuzumab).
[014] Outro aspecto da presente invenção é uma composição farmacêutica que inclui um composto da Fórmula I, ou seu sal ou solvato farmaceuticamente aceitável, e um diluente, veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
[015] Outro aspecto fornece uma combinação farmacêutica que compreende o composto da Fórmula I e um segundo composto que possui propriedades anticancerígenas ou outros efeitos terapêuticos.
[016] Outro aspecto inclui usos terapêuticos e em diagnóstico para os compostos e composições descritas no presente.
[017] Outro aspecto é o método para matar ou inibir a proliferação de células tumorais ou células cancerosas que compreende o tratamento das células com uma quantidade de conjugado de droga e anticorpo, ou seu sal ou solvato farmaceuticamente aceitável, sendo eficaz para matar ou inibir a proliferação das células tumorais ou células cancerosas.
[018] Outro aspecto são os métodos de tratamento de câncer que compreendem a administração a pacientes de uma formulação de um composto da Fórmula I. Um método é para o tratamento de câncer em mamíferos, em que o câncer é caracterizado pela sobreexpressão de um receptor de ErbB. O mamífero opcionalmente não responde, ou responde fracamente, ao tratamento com um anticorpo anti-ErbB não conjugado. O método compreende a administração ao mamífero de quantidade terapeuticamente eficaz de um composto conjugado de droga e anticorpo.
[019] Outro aspecto é um método de inibição do crescimento de células tumorais que sobreexpressam um receptor de fator de crescimento selecionado a partir do grupo que consiste de receptor de HER2 e receptor de EGF que compreende a administração a um paciente de um composto conjugado de droga e anticorpo que se liga especificamente ao mencionado receptor de fator de crescimento e um agente quimioterapêutico, em que o mencionado conjugado de droga e anticorpo e o mencionado agente quimioterapêutico são administrados em quantidades eficazes para inibir o crescimento de células tumorais no paciente.
[020] Outro aspecto é um método de tratamento de um paciente humano suscetível a uma disfunção caracterizada pela sobreexpressão de receptor de ErbB2 ou com ela diagnosticado, que compreende a administração de uma combinação de um composto conjugado de droga e anticorpo da Fórmula I e um agente quimioterapêutico.
[021] Outro aspecto é um método de teste para detectar células cancerosas que compreende: exposição de células a um composto conjugado de droga e anticorpo, e determinação da extensão da ligação do composto conjugado de droga e anticorpo às células.
[022] Outro aspecto refere-se aos métodos de seleção de candidatos a drogas ADC para o tratamento de uma doença ou disfunção, em que a doença ou disfunção é caracterizada pela sobreexpressão de HER2.
[023] Outro aspecto inclui os artigos industrializados, ou seja, kits, que compreendem um conjugado de droga e anticorpo, um recipiente, e uma bula ou rótulo indicando um tratamento.
[024] Outro aspecto inclui métodos de tratamento de uma doença ou disfunção caracterizadas pela sobreexpressão de HER2 em um paciente com os compostos conjugados de droga e anticorpo.
[025] Outro aspecto inclui os métodos de fabricação, métodos de preparação, métodos de síntese, métodos de conjugação e métodos de purificação dos compostos conjugados de droga e anticorpo e os intermediários para a preparação, síntese e conjugação dos compostos conjugados de droga e anticorpo.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[026] A Figura 1 exibe um ensaio de proliferação celular in vitro com células SK-BR-3 tratadas com conjugados de droga e anticorpo: -□- trastuzumab-SPP-DM1, -Δ- trastuzumab-SPDP-DMI e -o- trastuzumab-
SMCC-DM1.
[027] A Figura 2 exibe um ensaio de proliferação celular in vitro com células BT-474 tratadas com conjugados de droga e anticorpo: -□- trastuzumab-SPP-DM1, -Δ- trastuzumab-SPDP-DM1 e -o- trastuzumab-
SMCC-DM1.
[028] A Figura 3 exibe um ensaio de proliferação celular in vitro com células MCF7 tratadas com conjugados de droga e anticorpo: -□- trastuzumab-SPP-DM1, -Δ- trastuzumab-SPDP-DM1 e -o- trastuzumab- SMCC-DM1.
[029] A Figura 4 exibe um ensaio de proliferação celular in vitro com células MDA-MB-468 tratadas com conjugados de droga e anticorpo: -□- trastuzumab-SPP-DM1, -Δ- trastuzumab-SPDP-DM1 e -o- trastuzumab- SMCC-DM1.
[030] A Figura 5 exibe a liberação no soro (serum clearance), em camundongos beige nude sem tumores, de trastuzumab-SMCC-DM1 versus. trastuzumab-SPP-DM1, medindo a concentração no soro de anticorpo total e conjugado em seis momentos (cinco minutos, uma hora, seis horas, 24 horas, 72 e 168 horas após a dosagem) ao longo de sete dias.
[031] A Figura 6 exibe a estabilidade ao longo do tempo em camundongos nude sem tumores dos conjugados: trastuzumab-SPDP-DM1, trastuzumab-SPP-DM1, trastuzumab-SPP-DM3, trastuzumab-SPP-DM4, e trastuzumab-SMCC-DM1, medindo a concentração no soro em seis momentos (cinco minutos, uma hora, seis horas, 24 horas, 72 e 168 horas após a dosagem) ao longo de sete dias.
[032] A Figura 7 exibe a medida das concentrações no soro de trastuzumab total/trastuzumab-SMCC-DM1 e trastuzumab total/trastuzumab- SPP-DM1 em camundongos, sete dias após o tratamento, com e sem tumor.
[033] A Figura 8 exibe um estudo da concentração liberada no plasma, após a administração de 10 mg/kg, de trastuzumab-SPP-DM1 a quatro ratos sujeitos. Foram medidas as concentrações de anticorpo total e trastuzumab-SPP-DM1 (tr = trastuzumab).
[034] A Figura 9 exibe um estudo da concentração liberada no plasma, após a administração de 10 mg/kg, de trastuzumab-SMCC-DM1 a quatro ratos sujeitos. Foram medidas as concentrações de anticorpo total e trastuzumab-SMCC-DM1.
[035] A Figura 10 exibe a alteração do volume médio do tumor ao longo do tempo em camundongos que receberam dosagem de: veículo (PBS pH 6,5), trastuzumab-SPP-DMI (370 μg de DM1/m2) e trastuzumab- SMCC-DM1 (330 μg de DM1/m2), em que a dose refere-se à dose de DM1 administrada.
[036] A Figura 11 exibe a alteração do volume médio do tumor ao longo do tempo em camundongos nude atímicos (athymic) com aloenxertos de tumor Fo5 que receberam dose no Dia 0 de: veículo (PBS, pH 6,5), 10 mg/kg de trastuzumab-SIAB-DM1 (3,4 DM1/Ab; 168 μg de DM1/kg) e 10 mg/kg de trastuzumab-SMCC-DM1 (3,2 DM1/Ab; 158 μg de DM1/kg), em que a dose refere-se a quantidade de dose do conjugado de droga e anticorpo administrado.
[037] A Figura 12 exibe a mudança do volume médio do tumor ao longo do tempo em camundongos beige nude MMTV-Her2 Fo 5 (sete de cada grupo, todos com tumores, Ti = 7) por meio de simples injeção com veículo (PBS, pH 6,5), 10 mg/kg de trastuzumab-SPP-DM1, 10 mg/kg de trastuzumab-SPP-DM4, 10 mg/kg de trastuzumab-SPP-DM3 e 10 mg/kg de trastuzumab-SMCC-DM1.
[038] A Figura 13 exibe o tempo para dobrar o volume do tumor e registro da análise de morte celular para veículo (PBS, pH 6,5), trastuzumab- SPP-DM1, trastuzumab-SPP-DM4, trastuzumab-SPP-DM3 e trastuzumab- SMCC-DM1 em tumores HER2-Fo5.
[039] A Figura 14 exibe a alteração do peso do corpo ao longo do tempo de ratos que receberam dose de: veículo (10 mM de succinato de sódio, 100 mg/ml de sacarose, 0,1% Tween 20, pH 5,0), trastuzumab-SPP- DM1 (1860 μg de DM1/m2), trastuzumab-SMCC-DM1 (1860 μg de DM1/m2), trastuzumab-SMCC-DM1 (3260 μg de DM1/m2) e DM1 livre (650 μg/m2).
[040] A Figura 15 exibe ensaio da função do fígado medida em unidades AST por litro ao longo do tempo no modelo de rato que recebeu dose de: veículo (10 mM de succinato de sódio, 100 mg/ml de sacarose, 0,1% Tween 20, pH 5,0), trastuzumab-SPP-DM1 (22,3 mg/kg), trastuzumab-SMCC- DM1 (10 mg/kg), trastuzumab-SMCC-DM1 (25 mg/kg), trastuzumab-SMCC- DM1 (50 mg/kg) e DM1 livre.
[041] A Figura 16 exibe perfil de segurança medido em unidades PLT em células por litro ao longo do tempo no modelo de rato que recebeu dose de: veículo (10 mM de succinato de sódio, 100 mg/ml de sacarose, 0,1% Tween 20, pH 5,0), trastuzumab-SPP-DM1 (22,3 mg/kg), trastuzumab-SMCC- DM1 (10 mg/kg), trastuzumab-SMCC-DM1 (25 mg/kg), trastuzumab-SMCC- DM1 (50 mg/kg) e DM1 livre.
[042] A Figura 17 exibe ensaio da proliferação celular in vitro com células HT1080EphB2 (C8) tratadas com conjugados de droga e anticorpo: -▲- antiEphB2R 2H9-SPP-DM1 e -▼- antiEphB2R 2H9-SMCC- DM1.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[043] Será feita agora referência detalhada a certas realizações da presente invenção, cujos exemplos são ilustrados nas fórmulas e estruturas acompanhantes. Enquanto a presente invenção estará sendo descrita em conjunto com as realizações enumeradas, deve-se compreender que elas não se destinam a limitar a presente invenção a estas realizações. Pelo contrário, a presente invenção destina-se a cobrir todas a alternativas, modificações e equivalentes que podem ser incluídos dentro do escopo da mesma, conforme definido pelas reivindicações.
[044] Os técnicos no assunto reconhecerão muitos métodos e materiais similares ou equivalentes aos descritos no presente, que poderão ser utilizados na prática da presente invenção. A presente invenção não se limita, de forma alguma, aos métodos e materiais descritos.
[045] A menos que definido de outra maneira, os termos técnicos e científicos utilizados no presente possuem o mesmo significado conforme comumente compreendido pelos técnicos no assunto a que pertence a presente invenção e são consistentes com: Singleton et al (1994), Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, segunda edição, J. Wiley & Sons, Nova Iorque NY; e Janeway, C., Travers, P., Walport, M., Shlomchik (2001) Immuno Biology, quinta edição, Garland Publishing, Nova Iorque.
DEFINIÇÕES
[046] A menos que indicado de outra maneira, os termos e expressões a seguir, da forma utilizada no presente, destinam-se às seguintes definições:
[047] Ao utilizar nomes comerciais no presente, os depositantes pretendem incluir independentemente a formulação de nome comercial do produto, da droga genérica, e o(s) ingrediente(s) farmacêutico(s) ativo(s) do nome comercial do produto.
[048] O termo “anticorpo” é utilizado no presente no sentido mais amplo e cobre especificamente anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, dímeros, multímeros, anticorpos multiespecíficos (tais como anticorpos biespecíficos) e fragmentos de anticorpo, desde que exibam a atividade biológica desejada (Miller et al (2003), Jour. Of Immunology 170: 4854-4861). Os anticorpos podem ser murinos, humanos, humanizados, quiméricos ou derivados de outras espécies. O anticorpo é uma proteína gerada pelo sistema imunológico que é capaz de reconhecer um antígeno específico e ligar-se a ele (Janeway, C., Travers, P., Walport, M., Shlomchik (2001) Immuno Biology, quinta edição, Garland Publishing, Nova Iorque). Um antígeno alvo geralmente contém numerosos sítio de ligação, também denominados epítopos, reconhecidos por CDRs em múltiplos anticorpos. Cada anticorpo que se liga especificamente a um epítopo diferente possui uma estrutura diferente. Desta forma, um antígeno pode ter mais de um anticorpo correspondente. Um anticorpo inclui uma molécula de imunoglobulina de comprimento total ou uma porção imunologicamente ativa da molécula de imunoglobulina de comprimento total, ou seja, uma molécula que contém um sítio de ligação ao antígeno que se liga imunoespecificamente a um antígeno de um alvo de interesse ou parte deste, em que estes alvos incluem, mas sem se limitar a, células cancerosas ou células que produzem anticorpos autoimunes associados a uma doença autoimune. A imunoglobulina descrita no presente pode ser de qualquer tipo (tal como IgG, IgE, IgM, IgD e IgA), classe (tal como IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) ou subclasse da molécula de imunoglobulina. As imunoglobulinas podem ser derivadas de qualquer espécie. Em um aspecto, entretanto, a imunoglobulina é de origem humana, murina ou de coelhos.
[049] “Fragmentos de anticorpos” compreendem uma parte de anticorpo de comprimento total, geralmente a sua região variável ou de ligação ao antígeno. Exemplos de fragmentos de anticorpos incluem fragmentos de Fab, Fab’, F(ab’)2 e Fv; diacorpos (diabodies); anticorpos lineares; fragmentos produzidos por uma biblioteca de expressão de Fab; anticorpos anti-idiotípicos (anti-Id), CDR (região de determinação de complementaridade) e fragmentos de ligação de epítopos de quaisquer dos acima que se liguem imunoespecificamente a antígenos de células cancerosas, antígenos virais ou antígenos microbianos, moléculas de anticorpos de fita única e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpos.
[050] A expressão “anticorpo monoclonal”, da forma utilizada no presente, designa um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, ou seja, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos, exceto por possíveis mutações de ocorrência natural que podem estar presentes em quantidades menores. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo dirigidos para um único sítio antigênico. Além disso, ao contrário das preparações de anticorpos policlonais que incluem diferentes anticorpos dirigidos a diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal é direcionado a um único determinante no antígeno. Além da sua especificidade, os anticorpos monoclonais são vantajosos por poderem ser sintetizados de forma não contaminada por outros anticorpos. O adjetivo “monoclonal” indica a característica do anticorpo como sendo obtido a partir de população substancialmente homogênea de anticorpos e não deve ser interpretado como exigindo a produção do anticorpo por meio de qualquer método específico. Os anticorpos monoclonais a serem utilizados de acordo com a presente invenção podem ser preparados, por exemplo, por meio do método do hibridoma descrito primeiramente por Kohler et al (1975), Nature 256: 495 ou podem ser fabricados por meio de métodos do DNA recombinante (vide US 4.816.567). O anticorpo monoclonal pode também ser isolado a partir de bibliotecas de anticorpos de fagos (phage antibody libraries) utilizando os métodos descritos, por exemplo, em Clackson et al (1991), Nature, 352: 624-628; Marks et al (1991), J. Mol. Biol., 222: 581-597.
[051] Os anticorpos monoclonais do presente incluem especificamente anticorpos “quiméricos” em que uma parte da cadeia pesada e/ou leve é idêntica ou homóloga a sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie específica ou pertencente a uma classe ou subclasse específica de anticorpo, enquanto o restante da(s) cadeia(s) é idêntico ou homólogo a sequências correspondentes de anticorpos derivados de outras espécies ou pertencentes à outra classe ou subclasse de anticorpo, bem como fragmentos desses anticorpos, desde que exibam a atividade biológica desejada (US 4.816.567; e Morrison et al (1984), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 81: 6851-6855). Os anticorpos quiméricos de interesse no presente incluem anticorpos “primatizados” incluindo domínios variáveis de sequências de ligação ao antígeno, derivados de primatas não humanos (por exemplo, Macaco do Velho Mundo ou Chimpanzé) e sequências de região constante humana.
[052] “Anticorpo intacto” é aquele que compreende os domínios VL e VH, bem como o domínio constante de cadeia leve (CL) e os domínios constantes de cadeia pesada CH1, CH2 e CH3. Os domínios constantes podem ser domínios constantes de sequência selvagem (tais como domínios constantes de sequência selvagem de humanos) ou sua sequência de aminoácidos variantes. O anticorpo intacto pode conter uma ou mais “funções efetoras” que designam as atividades biológicas que podem ser atribuídas à região Fc (região Fc da sequência selvagem ou região Fc com variação da sequência de aminoácidos) de um anticorpo. Exemplos de funções efetoras de anticorpos incluem ligação de C1q, citotoxicidade dependente de complemento, ligação de receptor Fc; citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos (ADCC); fagocitose; e regulagem para baixo de receptores da superfície celular, tais como receptor de células B e BCR.
[053] Dependendo da sequência de aminoácidos do domínio constante das suas cadeias pesadas, anticorpos intactos podem ser atribuídos a “classes” diferentes. Existem cinco classes principais de anticorpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e várias delas podem ser adicionalmente divididas em subclasses (isotipos), tais como IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgA2. Os domínios constantes de cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de anticorpos são denominados α, δ, ε, y e μ, respectivamente. As estruturas de subunidades e configurações tridimensionais de diferentes classes de imunoglobulinas são bem conhecidas.
[054] “Receptor de ErbB” é uma proteína tirosina quinase receptora que pertence à família de receptores de ErbB que são mediadores importantes do crescimento, diferenciação e sobrevivência celular. A família de receptores de ErbB inclui quatro membros distintos, que incluem receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR, ErbB1, HER1), HER2 (ErbB2 ou p185neu), HER3 (ErbB3) e HER4 (ErbB4 ou tiro2). Um quadro de anticorpos anti-ErbB2 foi caracterizado utilizando a linhagem de células SKBR3 de tumor de mama humano (Hudziak et al (1989), Mol. Cell. Biol. 9 (3): 1165-1172). Obteve-se inibição máxima com o anticorpo denominado 4D5, que inibiu a proliferação celular em 56%. Outros anticorpos no quadro reduziram a proliferação celular em pouca extenção neste ensaio. Conclui-se, adicionalmente, que o anticorpo 4D5 sensibiliza linhagens de células de tumor de mama que sobreexpressam ErbB2 para os efeitos citotóxicos de TNF-α (US 5.677.171). Os anticorpos anti-ErbB2 discutidos em Hudziak et al são adicionalmente caracterizados em Fendly et al (1990), Cancer Research 50: 1550-1558; Kotts et al (1990), In Vitro 26 (3): 59A, Sarup et al (1991) Growth Regulation 1: 72-82; Shepard et al, J. (1991) Clin. Immunol. 11 (3): 117-127; Kumar et al (1991), Mol. Cell. Biol. 11 (2): 979-986; Lewis et al (1993), Cancer Immunol. Immunother. 37: 255-263; Pietras et al (1994), Oncogene 9: 18291838; Vitetta et al (1994), Cancer Research 54: 5301-5309; Sliwkowski et al (1994), J. Biol. Chem. 269 (20): 14661-14665; Scott et al (1991) J. Biol. Chem. 266: 14300-5; D'souza et al, Proc. Natl. Acad. Sci. (1994) 91: 7202-7206; Lewis et al (1996), Cancer Research 56: 1457-1465; e Schaefer et al (1997), Oncogene 15: 1385-1394.
[055] Outros anticorpos anti-ErbB2 com diversas propriedades foram descritos em Franklin et al (2004), Cancer Cell 5: 317-328; Tagliabue et al (1991), Int. J. Cancer 47: 933-937; McKenzie et al (1989), Oncogene 4: 543548; Maier et al (1991), Cancer Res. 51: 5361-5369; Bacus et al (1990), Molecular Carcinogenesis 3: 350-362; Stancovski et al (1991), PNAS (USA) 88: 8691-8695; Bacus et al (1992), Cancer Research 52: 2580-2589; Xu et al (1993), Int. J. Cancer 53: 401-408; WO 94/00136; Kasprzyk et al (1992), Cancer Research 52: 2771-2776; Hancock et al (1991), Cancer Res. 51: 45754580; Shawver et al (1994), Cancer Res. 54: 1367-1373; Arteaga et al (1994), Cancer Res. 54: 3758-3765; Harwerth et al (1992), J. Biol. Chem. 267: 1516015167; US 5.783.186; e Klapper et al (1997), Oncogene 14: 2099-2109.
[056] Seleção (screening) de identidades de sequências resultou na identificação de dois outros membros da família de receptores de ErbB; ErbB3 (US 5.183.884; US 5.480.968; Kraus et al (1989), PNAS (USA) 86: 9193-9197) e ErbB4 (EP 599.274; Plowman et al (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 90: 1746-1750; e Plowman et al (1993), Nature 366: 473-475). Estes dois receptores exibem expressão maior sobre pelo menos algumas linhagens de células de câncer de mama.
[057] O receptor de ErbB geralmente compreenderá um domínio extracelular, que pode ligar um ligante de ErbB; um domínio de transmembrana lipofílica; um domínio de tirosina quinase intracelular conservado; e um domínio de sinalização carboxil-terminal que abriga vários resíduos de tirosina que podem ser fosforilados. O receptor de ErbB pode ser receptor de ErbB de “sequência selvagem” ou sua “sequência de aminoácidos variantes”. O receptor de ErbB pode ser receptor de ErbB humano de sequência selvagem. Consequentemente, “membro da família de receptores de ErbB” é EGFR (ErbB1), ErbB2, ErbB3, ErbB4 ou qualquer outro receptor de ErbB atualmente conhecido ou a ser identificado no futuro.
[058] As expressões “ErbB1”, “receptor de fator de crescimento epidérmico”, “EGFR” e “HER1” são utilizadas de forma intercambiável no presente e designam EGFR conforme descrito, por exemplo, em Carpenter et al (1987), Ann. Rev. Biochem. 56: 881-914, incluindo suas formas mutantes de ocorrência natural (tais como EGFR mutante de deleção como em Humphrey et al (1990), PNAS (USA) 87: 4207-4211). O termo erbB1 designa o gene que codifica o produto de proteína de EGFR. Os anticorpos contra HER1 são descritos, por exemplo, em Murthy et al (1987), Arch. Biochem. Biophys., 252: 549-560 e em WO 95/25167.
[059] As expressões “ERRP”, “Proteína Relativa a Receptor de EGF”, “Proteína Relativa a EGFR” e “proteína relativa a receptor de fator de crescimento epidérmico” são utilizadas de forma intercambiável no presente e designam ERRP conforme descrito, por exemplo, em US 6.399.743 e US 2003/0096373.
[060] As expressões “ErbB2” e “HER2” são utilizadas de forma intercambiável no presente e designam a proteína HER2 humana descrita, por exemplo, em Semba et al (1985), PNAS (USA) 82: 6497-6501 e Yamamoto et al (1986), Nature, 319: 230-234 (acesso Genbank número X03363). O termo “erbB2” designa gene que codifica ErbB2 humano e “neu” designa o gene que codifica p185neu de rato.
[061] “ErbB3” e “HER3” designam o polipeptídeo receptor conforme descrito, por exemplo, em US 5.183.884; US 5.480.968; Kraus et al (1989), PNAS (USA) 86: 9193-9197. Anticorpos contra ErbB3 são conhecidos na técnica (US 5.183.884; US 5.480.968; WO 97/35885).
[062] As expressões “ErbB4” e “HER4” designam no presente o polipeptídeo receptor conforme descrito, por exemplo, no Pedido de Patente Europeu n° 599.274; Plowman et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 90: 17461750 (1993); e Plowman et al, Nature, 366: 473-475 (1993), incluindo suas isoformas, por exemplo, conforme descrito em WO 99/19488. Anticorpos contra HER4 são descritos, por exemplo, em WO 02/18444.
[063] Anticorpos para receptores de ErbB são disponíveis comercialmente por meio de uma série de fontes, que inclui, por exemplo, Santa Cruz Biotechnology, Inc., Califórnia, Estados Unidos.
[064] “Ligante de ErbB” indica polipeptídeo que se liga a um receptor de ErbB e/ou ativa o mesmo. O ligante de ErbB pode ser ligante de ErbB humano de sequência selvagem tal como fator de crescimento epidérmico (EGF) (Savage et al (1972), J. Biol. Chem., 247: 7612-7621); fator de crescimento de transformação alfa (TGF-α) (Marquardt et al (1984), Science 223: 1079-1082); anfirregulina, também conhecida como fator de crescimento autócrino de queratinócitos ou schwanoma (Shoyab et al (1989), Science 243: 1074-1076; Kimura et al (1990), Nature 348: 257-260; e Cook et al (1991), Mol. Cell. Biol., 11: 2547-2557); betacelulin (Shing et al (1993), Science 259: 16041607; e Sasada et al (1993), Biochem. Biophys. Res. Commun. 190: 1173); fator de crescimento epidérmico de ligação de heparina (HB-EGF) (Higashiyama et al (1991), Science 251: 936-939); epirregulina (Toyoda et al (1995), J. Biol. Chem. 270: 7495-7500; e Komurasaki et al (1997), Oncogene 15: 2841-2848); herregulina (vide abaixo); neurregulina-2 (NRG-2) (Carraway et al, Nature, 387: 512-516 (1997)); neurregulina-3 (NRG-3) (Zhang et al (1997), Proc. Natl. Acad. Sci., 94: 9562-9567); neurregulina-4 (NRG-4) (Harari et al (1999), Oncogene, 18: 2681-89) ou cripto (CR-1) (Kannan et al (1997), J. Biol. Chem., 272 (6): 3330-3335). Ligantes de ErbB que ligam EGFR incluem EGF, TGF-α, anfirregulina, betacelulina, HB-EGF e epirregulina. Ligantes de ErbB que ligam ErbB3 incluem herregulinas. Ligantes de ErbB capazes de ligar ErbB4 incluem betacelulina, epirregulina, HB-EGF, NRG-2, NRG-3, NRG-4 e herregulinas. O ligante de ErbB pode também ser ligante de ErbB sintético. O ligante sintético pode ser específico para um receptor de ErbB particular, ou pode reconhecer complexos receptores de ErbB específicos. Exemplo de ligante sintético é a herregulina/birregulina de quimera de EGF (vide, por exemplo, Jones et al (1999), FEBS Letters, 447: 227-231, que é incorporado como referência).
[065] “Herregulina” (HRG) designa polipeptídeo codificado pelo produto genético de herregulina conforme descrito em US 5.641.869 ou Marchionni et al (1993), Nature 362: 312-318. Exemplos de herregulinas incluem herregulina-a, herregulina-β1, herregulina-β2 e herregulina-β3 (Holmes et al (1992), Science 256: 1205-1210; e US 5.641.869); fator de diferenciação neu (NDF) (Peles et al (1992), Cell 69: 205-216); atividade indutora de receptor acetilcolina (ARIA) (Falls et al (1993), Cell 72: 801-815); fatores de crescimento glial (GGFs) (Marchionni et al (1993), Nature 362: 312-318); fator derivado de neurônios sensoriais e motores (SMDF) (Ho et al (1995), J. Biol. Chem. 270: 14523-14532); y-herregulina (Schaefer et al (1997), Oncogene, 15: 1385-1394). O termo inclui fragmentos biologicamente ativos e/ou variantes de sequência de aminoácidos de polipeptídeo HRG de sequência selvagem, tais como seu fragmento de domínio similar a EGF (tal como HRGβ1177-244).
[066] “Heterooligômero de ErbB” é um oligômero associado de forma não covalente que compreende pelo menos dois receptores de ErbB diferentes. “Dímero de ErbB” é oligômero associado de forma não covalente que compreende dois receptores de ErbB diferentes. Estes complexos podem formar-se quando uma célula que expressa dois ou mais receptores de ErbB é exposta a ligante de ErbB. Oligômeros de ErbB, tais como dímeros de ErbB, podem ser isolados por meio de imunoprecipitação e analisados por meio de SDS-PAGE conforme descrito, por exemplo, em Sliwkowski et al (1994), J. Biol. Chem., 269 (20): 14661-14665. Exemplos desses heterooligômeros de ErbB incluem complexos de EGFR-ErbB2 (também denominado HER1/HER2), ErbB2-ErbB3 (HER2/HER3) e ErbB3-ErbB4 (HER3/HER4). Além disso, o heterooligômero de ErbB pode compreender dois ou mais receptores de ErbB2 combinados com receptor de ErbB diferente, tal como ErbB3, ErbB4 ou EGFR (ErbB1). Outras proteínas, tais como subunidade receptora de citoquina (por exemplo, gp130), podem ser incluídas no heterooligômero.
[067] Por “ativação de ligantes de receptor de ErbB”, indica-se transdução de sinal (tal como a causada por domínio de quinase intracelular de receptor de ErbB que fosforila resíduos de tirosina no receptor de ErbB ou polipeptídeo substrato) mediado por ligante de ErbB que se liga a heterooligômero de ErbB que compreende o receptor de ErbB de interesse. Geralmente, isso envolverá a ligação de ligante de ErbB a heterooligômero de ErbB que ativa o domínio quinase de um ou mais receptores de ErbB no heterooligômero e, desta forma, resulta em fosforilação de resíduos de tirosina em um ou mais dos receptores de ErbB e/ou fosforilação de resíduos de tirosina em polipeptídeo(s) substrato adicional(is). A ativação de receptores de ErbB pode ser quantificada utilizando vários ensaios de fosforilação de tirosina.
[068] Um polipeptídeo de “sequência selvagem” é aquele que contém a mesma sequência de aminoácidos de um polipeptídeo (tal como receptor de ErbB ou ligante de ErbB) derivado da natureza. Esses polipeptídeos de sequência selvagem podem ser isolados da natureza ou podem ser produzidos por meios sintéticos ou recombinantes. Assim, um polipeptídeo de sequência selvagem pode conter a sequência de aminoácidos de um polipeptídeo humano de ocorrência natural, polipeptídeo murino ou polipeptídeo de qualquer outra espécie de mamíferos.
[069] A expressão “sequência de aminoácidos variantes” designa polipeptídeos que contêm sequências de aminoácidos que diferem, até certo ponto, de um polipeptídeo de sequência selvagem. Normalmente, variantes de sequência de aminoácidos possuirão pelo menos cerca de 70% de identidade de sequências com pelo menos um domínio de ligação de receptor de um ligante de ErbB selvagem ou com pelo menos um domínio de ligação de ligante de um receptor de ErbB selvagem, ou pelo menos cerca de 80%, ou pelo menos cerca de 90% homólogo com esse receptor ou domínios de ligação de ligante. As sequências de aminoácidos variantes possuem substituições, deleções e/ou inserções em certas posições na sequência de aminoácidos da sequência de aminoácidos selvagem.
[070] “Identidade de sequências” é definida como o percentual de resíduos na sequência de aminoácidos variantes que são idênticos após o alinhamento das sequências e introdução de intervalos, se necessário, para atingir o percentual máximo de identidade de sequências. Os métodos e programas de computador para o alinhamento são bem conhecidos na técnica. Um desses programas de computador é “Align 2”, de autoria da Genentech, Inc., que foi depositado com a documentação de usuário no Escritório de Direitos Autorais dos Estados Unidos, Washington DC 20559, Estados Unidos, em dez de dezembro de 1991.
[071] “Citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos” e “ADCC” designam reação mediada por céulas na qual células citotóxicas não específicas que expressam receptores de Fc (FcRs) (tais como células Matadoras Naturais (NK), neutrófilos e macrófagos) reconhecem anticorpo ligado sobre a célula alvo e, em seguida, causam lise da célula alvo. As células primárias para a mediação de ADCC, células NK, expressam unicamente FcyRIII, enquanto monócitos expressam FcyRI, FcyRII e FcyRIII. A expressão de FcR sobre células hematopoiéticas é resumida na Tabela 3 da página 464 de Ravetch e Kinet (1991), Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92. Para determinar a atividade de ADCC de uma molécula de interesse, pode-se realizar ensaio de ADCC in vitro (US 5.500.362I; US 5.821.337). As células efetoras úteis para estes ensaios incluem células mononucleares periféricas do sangue (PBMC) e células Matadoras Naturais (NK). Alternativa ou adicionalmente, a atividade de ADCC da molécula de interesse pode ser determinada in vivo, tal como em um modelo animal como o descrito em Clynes et al (1998), PNAS (USA) 95: 652-656.
[072] “Porção de droga maitansinóide” indica a subestrutura de conjugado de droga e anticorpo que possui a estrutura de um composto de maitansina. Maitansina foi isolada em primeiro lugar a partir do arbusto do leste africano Maytenus serrata (US 3.896.111). Descobriu-se em seguida que certos micróbios também produzem maitansinóides, tais como maitansinol e C3 maitansinol ésteres (US 4.151.042). Análogos de maitansinol e maitansinol sintético foram relatados. Vide as Patentes Norte-Americanas n° 4.137.230; 4.248.870; 4.256.746; 4.260.608; 4.265.814; 4.294.757; 4.307.016; 4.308.268; 4.308.269; 4.309.428; 4.313.946; 4.315.929; 4.317.821; 4.322.348; 4.331.598; 4.361.650; 4.364.866; 4.424.219; 4.450.254; 4.362.663; e 4.371.533, e Kawai et al (1984) Chem. Pharm. Bull. 3441-3451), cada qual expressamente incorporada ao presente como referência.
[073] As expressões “receptor de Fc” ou “FcR” são utilizadas para descrever um receptor que se liga à região Fc de um anticorpo, tal como FcR humana de sequência selvagem. FcR pode ligar-se a um anticorpo IgG (receptor gama) e incluir receptores das subclasses FcyRI, FcyRII e FcyRIII, além de variantes alélicas e, alternativamente, formas divididas desses receptores. Os receptores de FcyRII incluem FcyRIIA (“receptor de ativação”) e FcyRIIB (“receptor de inibição”), que possuem sequências de aminoácidos similares que diferem principalmente nos seus domínios citoplasmáticos. O receptor de ativação FcyRIIA contém um motivo de ativação com base em tirosina imunorreceptora (ITAM) no seu domínio citoplasmático. O receptor de inibição FcyRIIB contém um motivo de inibição com base em tirosina imunorreceptora (ITIM) no seu domínio citoplasmático (vide análise M. em Daêron, Annu. Rev. Immunol., 15: 203-234 (1997)). FcRs são analisadas em Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991); Capel et al (1994), Immunomethods 4: 25-34; e de Haas et al (1995), J. Lab. Clin. Med., 126: 33041. Outras FcRs, incluindo aquelas a serem identificados no futuro, são englobadas pelo termo “FcR” no presente. O termo também inclui o receptor neonatal, FcRn, que é responsável pela transferência de IgGs maternos para o feto (Guyer et al (1976), J. Immunol. 117: 587 e Kim et al (1994), J. Immunol., 24: 249).
[074] “Citotoxicidade dependente de complemento” ou “CDC” designa a capacidade de uma molécula de lisar alvo na presença de complemento. O processo de ativação de complementos é iniciado pela ligação do primeiro componente do sistema de complemento (C1q) a uma molécula (tal como anticorpo) em complexo com antígeno cognato. Para determinar a ativação do complemento, pode ser realizado teste de CDC, conforme descrito, por exemplo, em Gazzano-Santoro et al, 1996, J. Immunol. Methods 202: 163.
[075] “Anticorpos selvagens” são normalmente glicoproteínas heterotetraméricas de cerca de 150.000 daltons, compostas de duas cadeias leves (L) idênticas e duas cadeias pesadas (H) idênticas. Cada cadeia leve é ligada a uma cadeia pesada por uma ligação covalente de dissulfeto, enquanto a quantidade de ligações dissulfeto varia entre as cadeias pesadas de diferentes isotipos de imunoglobulina. Cada cadeia leve e pesada também contém pontes dissulfeto intracadeias em espaços regulares. Cada cadeia pesada contém, em uma extremidade, um domínio variável (VH) seguido por uma série de domínios constantes. Cada cadeia leve contém um domínio variável em uma extremidade (VL) e um domínio constante na sua outra extremidade. O domínio constante da cadeia leve é alinhado ao primeiro domínio constante da cadeia pesada e o domínio variável da cadeia leve é alinhado ao domínio variável da cadeia pesada. Acredita-se que resíduos de aminoácidos específicos formem superfície intermediária entre os domínios variáveis de cadeia leve e de cadeia pesada.
[076] O termo “variável” indica o fato de que certas partes dos domínios variáveis diferem extensamente entre sequência dos anticorpos e são utilizadas na ligação e especificidade de cada anticorpo específico ao seu antígeno específico. A variabilidade não é, entretanto, distribuída regularmente ao longo de todos os domínios variáveis de anticorpos. Ela é concentrada em três segmentos denominados regiões hipervariáveis, tanto nos domínios variáveis de cadeia leve quanto de cadeia pesada. As partes mais altamente conservadas dos domínios variáveis são denominadas regiões de estrutura (FRs). Os domínios variáveis de cadeias leve e pesada selvagens compreendem quatro FRs cada um, adotando em grande parte uma configuração de folha β, conectadas por três regiões hipervariáveis, que formam alças (loops) que conectam e, em alguns casos, fazem parte da estrutura de folha β. As regiões hipervariáveis de cada cadeia são mantidas juntas em boa proximidade pelas FRs e, com as regiões hipervariáveis da outra cadeia, contribuem para a formação do sítio de ligação aos antígenos de anticorpos (vide Kabat et al (1991), Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edição, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda MD). Os domínios constantes não estão diretamente envolvidos na ligação de um anticorpo a um antígeno, mas exibem diversas funções efetoras, tais como a participação do anticorpo em citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC).
[077] A expressão “região hipervariável”, quando utilizada no presente, designa os resíduos de aminoácidos de um anticorpo que são responsáveis pela ligação aos antígenos. A região hipervariável compreende geralmente resíduos de aminoácidos de uma “região de determinação de complementaridade” ou “CDR” (tal como resíduos 24 a 34 (L1), 50 a 56 (L2) e 89 a 97 (L3) no domínio variável de cadeia leve e 31 a 35 (H1), 50 a 65 (H2) e 95 a 102 (H3) no domínio variável de cadeia pesada; Kabat et al, acima) e/ou os resíduos de “circuito hipervariável” (tais como os resíduos 26 a 32 (L1), 50 a 52 (L2) e 91 a 96 (L3) no domínio variável de cadeia leve e 26 a 32 (H1), 53 a 55 (H2) e 96 a 101 (H3) no domínio variável de cadeia pesada; Chothia e Lesk (1987), J. Mol. Biol., 196: 901-917 (1987)). Resíduos de “região de estrutura” ou “FR” são os de domínios variáveis diferentes dos resíduos de região hipervariável conforme definido no presente.
[078] A digestão de anticorpos por papaína produz dois fragmentos de ligação aos antígenos idênticos, denominados fragmentos “Fab”, cada qual com um único sítio de ligação aos antígenos, e um fragmento “Fc” residual, cujo nome reflete a sua capacidade de rápida cristalização. O tratamento com pepsina gera um fragmento F(ab’)2 que contém dois sítios de ligação de antígenos e ainda é capaz de fazer ligação cruzada (cross-linking) entre antígenos.
[079] “Fv” é o menor fragmento de anticorpo que contém um sítio completo de reconhecimento e de ligação aos antígenos. Esta região consiste de um dímero de um domínio variável de cadeia pesada e um de cadeia leve em associação firme e não covalente. É nesta configuração que as três regiões hipervariáveis de cada domínio variável interagem para definir um sítio de ligação aos antígenos sobre a superfície do dímero VH-VL. Coletivamente, as seis regiões hipervariáveis conferem especificidade de ligação aos antígenos ao anticorpo. Entretanto, mesmo um domínio variável isolado (ou a metade de um Fv que compreende apenas três regiões hipervariáveis específicas para um antígeno) possui a capacidade de reconhecer e ligar antígeno, embora em afinidade menor que o sítio de ligação completo.
[080] O fragmento Fab também contém o domínio constante da cadeia leve e o primeiro domínio constante (CH1) da cadeia pesada. Os fragmentos de Fab’ diferem de fragmentos de Fab pela adição de alguns resíduos no carbóxi terminal do domínio CH1 de cadeia pesada, que inclui uma ou mais cisteínas da região de articulação do anticorpo. Fab’-SH é a denominação do presente para Fab’, em que o(s) resíduo(s) de cisteína dos domínios constantes contém(êm) pelo menos um grupo tiol livre. Os fragmentos de anticorpos F(ab’)2 foram originalmente produzidos na forma de pares de fragmentos de Fab’ que contêm cisteínas de articulação entre eles. Outros acoplamentos químicos de fragmentos de anticorpos também são conhecidos.
[081] As “cadeias leves” de anticorpos de qualquer espécie vertebrada podem ser atribuídas a um dentre dois tipos claramente distintos, denominados kappa (K) e lambda (k), com base nas sequências de aminoácidos dos seus domínios constantes.
[082] “Fv de fita única” ou “scFv” indicam fragmentos de anticorpos de região variável e cadeia única que compreendem os domínios VH e VL de anticorpo, em que esses domínios estão presentes em uma única cadeia de polipeptídeo. O polipeptídeo Fv pode compreender adicionalmente um ligante de polipeptídeo entre os domínios VH e VL que permite que o scFv forme a estrutura desejada para ligação aos antígenos (Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg e Moore eds., Springer-Verlag, Nova Iorque, págs. 269-315 (1994)). Fragmentos de scFv de anticorpo anti-ErbB2 são descritos em WO 93/16185; US 5.571.894; US 5.587.458.
[083] O termo “diacorpos (diabodies)” designa pequenos fragmentos de anticorpos com dois sítios de ligação aos antígenos, que compreendem um domínio pesado variável (VH) conectado a um domínio leve variável (VL) na mesma cadeia de polipeptídeo (VH - VL). Utilizando um ligante que é curto demais para permitir o emparelhamento entre os dois domínios sobre a mesma cadeia, os domínios são forçados a emparelhar-se com os domínios complementares de outra cadeia e criar dois sítios de ligação aos antígenos. Os diacorpos (diabodies) são descritos mais completamente, por exemplo, em EP 404.097, WO 93/11161 e Hollinger et al (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90: 6444-6448.
[084] As formas “humanizadas” de anticorpos não humanos (por exemplo, de roedores) são anticorpos quiméricos que contêm sequência mínima derivada de imunoglobulina não humana. Na maior parte, os anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo receptor), nas quais os resíduos de uma região hipervariável do paciente são substituídos por resíduos de uma região hipervariável de uma espécie não humana (anticorpo doador) tal como camundongo, rato, coelho ou primata não humano que possui a especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Em alguns casos, os resíduos de região estrutural (FR) da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Além disso, os anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo receptor ou no anticorpo doador. Essas modificações são feitas para refinar ainda mais o desempenho do anticorpo. Geralmente, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos dentre pelo menos um, tipicamente dois domínios variáveis, em que todos ou substancialmente todos os circuitos hipervariáveis correspondem aos de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as FRs são as de uma sequência de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado também compreenderá opcionalmente pelo menos uma parte de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente a de imunoglobulina humana. Para detalhes adicionais, vide Jones et al (1986), Nature 321: 522-525; Reichmann et al (1988), Nature 332: 323-329; e Presta (1992), Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593596:
[085] Os anticorpos anti-ErbB2 humanizados incluem huMAb4D5-1, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 e huMAb4D5-8 (HERCEPTIN®, trastuzumab) conforme descrito na Tabela 3 de US 5.821.337 expressamente incorporada ao presente como referência; 520C9 humanizado (WO 93/21319) e anticorpos 2C4 humanizados.
[086] Um “anticorpo isolado” é aquele que tenha sido identificado, separado e/ou recuperado a partir de um componente do seu ambiente natural. Os componentes contaminantes do seu ambiente natural são materiais que interfeririam com diagnóstico ou utilizações terapêuticas para o anticorpo e podem incluir enzimas, hormônios e outros solutos proteináceos ou não proteináceos. O anticorpo pode ser purificado (1) até mais de 95% em peso de anticorpo, conforme determinado por meio do método de Lowry, ou mais de 99% em peso; (2) até um grau suficiente para a obtenção de pelo menos quinze resíduos de sequência de aminoácidos interna ou N-terminal, utilizando um sequenciador de proteínas de xícara de centrifugação (spinning cup protein); ou (3) até a homogeneidade, por meio de SDS-PAGE, sob condições redutoras ou não redutoras, utilizando azul de Coomassie ou manchas de prata. O anticorpo isolado inclui o anticorpo in situ em células recombinantes, desde que pelo menos um componente do ambiente natural do anticorpo não esteja presente. Normalmente, entretanto, o anticorpo isolado será preparado por meio de pelo menos uma etapa de purificação.
[087] Anticorpo "que liga" antígeno de interesse, tal como antígeno ErbB2, é aquele capaz de ligar aquele antígeno com afinidade suficiente para que o anticorpo seja útil no direcionamento de célula que expressa o antígeno. Quando o anticorpo ligar ErbB2, ele normalmente ligará preferencialmente ErbB2 em vez de outros receptores de ErbB, e pode ser um que não apresente reações cruzadas significativas com outras proteínas tais como EGFR, ErbB3 ou ErbB4. Nessas realizações, a extensão de ligação do anticorpo a estas proteínas não de ErbB2 (tais como ligação da superfície celular a receptor endógeno) será de menos de 10%, conforme determinado por meio de análise de ordenamento de células ativadas por fluorescência (FACS) ou radioimunoprecipitação (RIA). Às vezes, o anticorpo anti-ErbB2 não apresentará reações cruzadas significativamente com a proteína neu de ratos, conforme descrito, por exemplo, em Schecter et al (1984), Nature 312: 513 e Drebin et al (1984), Nature, 312: 545-548.
[088] Um anticorpo que “bloqueia” a ativação de ligantes de receptor de ErbB reduz ou evita esta ativação, em que o anticorpo é capaz de bloquear a ativação de ligantes do receptor de ErbB de forma substancialmente mais eficaz que anticorpo monoclonal 4D5, tal como de forma aproximadamente tão eficaz quanto os anticorpos monoclonais 7F3 ou 2C4 ou seus fragmentos de Fab. O anticorpo que bloqueia a ativação de ligantes de receptor de ErbB pode ser, por exemplo, um que seja cerca de 50 a 100% mais eficaz que 4D5 na formação de bloqueio de heterooligômero de ErbB. O bloqueio da ativação de ligantes de receptor de ErbB pode ocorrer por qualquer meio, tal como por meio de interferência com: ligação de ligantes a receptor de ErbB, formação de complexo de ErbB, atividade de tirosina quinase de receptor de ErbB em complexo de ErbB e/ou fosforilação de resíduo(s) de tirosina quinase em receptor de ErbB ou por ele.
[089] Um anticorpo que possui “característica biológica” de um anticorpo designado, tal como o anticorpo monoclonal denominado 2C4 (Omnitarg, Genentech, Inc.), é aquele que possui uma ou mais das características biológicas daquele anticorpo, que o distinguem de outros anticorpos que se liguem ao mesmo antígeno (tal como ErbB2). Anticorpo com característica biológica de 2C4, por exemplo, pode bloquear a ativação de HRG de heterooligômero de ErbB que compreende ErbB2 e ErbB3, ErbB1 ou ErbB4; bloquear a ativação de EGF, TGF-α, HB-EGF, epirregulina e/ou anfirregulina de receptor de ErbB que compreende EGFR e ErbB2; bloquear a ativação mediada por EGF, TGF-a e/ou HRG de MAPK; e/ou ligar o mesmo epítopo no domínio extracelular de ErbB2 tal como o ligado por 2C4 (que bloqueia, por exemplo, a ligação de anticorpo monoclonal 2C4 a ErB2).
[090] A menos que indicado em contrário, a expressão “anticorpo monoclonal 2C4” designa um anticorpo que contêm resíduos de ligação ao antígeno do anticorpo 2C4 murino dos exemplos abaixo, ou dele derivado. O anticorpo monoclonal 2C4, por exemplo, pode ser um anticorpo monoclonal 2C4 murino ou uma de suas variantes, tal como o anticorpo 2C4 humanizado, que possui resíduos de aminoácidos de ligação aos antígenos do anticorpo monoclonal 2C4 murino (WO 01/00245). A menos que indicado em contrário, a expresão “rhuMAb 2C4”, quando utilizada no presente, indica um anticorpo que compreende as sequências leve variável (VL) e pesada variável (VH) de SEQ ID N° 3 e 4, respectivamente, fundidas a sequências de região constante de IgG1 leve e pesada humanas (não do alotipo A) opcionalmente expressas por célula de Ovário de Hamster Chinês (CHO) (WO 01/00245).
[091] A menos que indicado em contrário, a expressão “anticorpo monoclonal 4D5” designa um anticorpo que contém resíduos de ligação a antígenos de anticorpo 4D5 murino (ATCC CRL 10463) ou dele derivados. O anticorpo monoclonal 4D5, por exemplo, pode ser anticorpo monoclonal 4D5 murino ou sua variante, tal como 4D5 humanizado, que possui resíduos de ligação a antígenos de anticorpo monoclonal murino 4D5. Exemplos de anticorpos 4D5 humanizados incluem huMAb4D5-1, huMAb4D5- 2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 e huMAb4D5-8 (HERCEPTIN®) como na US 5.821.337.
[092] “Agente inibidor do crescimento” designa um composto ou composição que inibe o crescimento de uma célula, tal como célula cancerosa que expressa ErbB in vitro ou in vivo. Desta forma, o agente inibidor do crescimento pode ser aquele que reduz significativamente o percentual de células que expressam ErbB na fase S. Exemplos de agentes inibidores do crescimento incluem agentes que bloqueiam a prograssão do ciclo celular (em um local diferente da fase S), tais como agentes que induzem a suspensão de G1 e a suspensão da fase M (The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn e Israel, eds., Capítulo 1, intitulado Cell Cycle Regulation, Oncogenes and Antineoplastic Drugs de Murakami et al (WB Saunders: Filadélfia, 1995), especialmente pág. 13). Exemplos de anticorpos “inibidores do crescimento” são aqueles que se ligam a ErbB2 e inibem o crescimento de células cancerosas que sobreexpressam ErbB2. Os anticorpos anti-ErbB2 inibidores do crescimento podem inibir o crescimento de células de tumor de mama SK- BR-3 em cultura celular em mais de 20%, ou mais de 50% (tal como cerca de 50% a cerca de 100%) em uma concentração de anticorpos de cerca de 0,5 a 30 μg/ml, em que a inibição do crescimento é determinada seis dias após a exposição das células SK-BR-3 ao anticorpo (US 5.677.171).
[093] Um anticorpo que “induz a morte celular” é aquele que faz com que uma célula viável torne-se não viável. A célula geralmente é aquela que expressa o receptor de ErbB2, especialmente quando a célula sobreexpressar o receptor de ErbB2. A célula pode ser célula cancerosa, tal como célula da mama, ovário, estômago, endométrio, glândula salivar, pulmão, rim, cólon, tireóide, pancreática ou da bexiga. In vitro, a célula pode ser célula SK-BR-3, BT474, Calu 3, MDA-MB-453, MDA-MB-361 ou SKOV3. A morte celular in vitro pode ser determinada na ausência de células efetoras imunes e complementares para distinguir a morte celular induzida por citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos (ADCC) ou citotoxicidade dependente de complemento (CDC). Desta forma, o ensaio de morte celular pode ser realizado utilizando soro inativado por calor (ou seja, na ausência de complemento) e na ausência de células efetoras imunológicas. Para determinar se o anticorpo é capaz de induzir a morte celular, a perda da integridade da membrana conforme avaliado por meio da absorção de iodeto de propídio (PI), azul de tripano (vide Moore et al, Cytotechnology 17: 1-11) ou 7AAD, este pode ser avaliado com relação a células não tratadas. Os anticorpos indutores da morte celular preferidos são aqueles que induzem a absorção de PI no teste de absorção de PI em células BT474 (vide abaixo).
[094] Um anticorpo que “induz a apoptose” é aquele que induz a morte celular programada, conforme determinado por meio da ligação de anexina V, fragmentação de DNA, redução celular, dilatação do retículo endoplasmático, fragmentação celular e/ou formação de vesículas de membrana (denominadas corpos apoptóticos). A célula normalmente é aquela que sobreexpressa o receptor de ErbB2, incluindo uma célula tumorosa, tal como célula da mama, ovário, estômago, endométrio, glândula salivar, pulmão, rim, cólon, tireóide, pancreática ou da bexiga. In vitro, a célula pode ser uma célula SK-BR-3, BT474, Calu 3, MDA-MB-453, MDA-MB-361 ou SKOV3.
[095] As expressões “tratamento” ou “melhoria” designam o tratamento terapêutico e medidas profiláticas ou preventivas, em que o objeto é o de evitar ou reduzir (diminuir) a velocidade da condição ou disfunção patológica desejada, tal como o desenvolvimento ou a difusão de câncer. Para os propósitos da presente invenção, resultados clínicos benéficos ou desejados incluem, mas sem limitar-se ao alívio de sintomas, redução da extensão da doença, estabilização (ou seja, sem piora) do estado da doença, atraso ou redução da velocidade do progresso da doença, melhoria ou paliação do estado doentio e reincidência (seja parcial ou total), seja detectável ou não detectável. “Tratamento” pode também indicar prolongamento da sobrevivência em comparação com a sobrevivência esperada sem receber tratamento. Os necessitados de tratamento incluem os que já possuem a condição ou disfunção, bem como os propensos a terem a condição ou disfunção ou aqueles em que a condição ou disfunção deva ser evitada.
[096] “Disfunção” é qualquer condição que se beneficiaria do tratamento de acordo com a presente invenção. Isso inclui doenças ou disfunções agudas e crônicas que incluem as condições patológicas que predispõem o mamífero à disfunção em questão. Exemplos não limitadores de disfunções a serem tratadas no presente incluem tumores benignos e malignos; leucemia e malignidades linfóides, particularmente câncer de mama, ovário, estômago, endométrio, glândula salivar, pulmão, rim, cólon, tireóide, pancreático, da próstata ou da bexiga; disfunções neuronais, gliais, astrocitais, hipotalâmicas e outras glandulares, macrofagais, epiteliais, estromais e blastocoélicas; e disfunções inflamatórias, angiogênicas e imunológicas. Exemplo de disfunção a ser tratada de acordo com a presente invenção é o tumor maligno sólido.
[097] A expressão “quantidade terapeuticamente eficaz” designa quantidade de droga eficaz para o tratamento de doença ou disfunção em mamíferos. No caso de câncer, a quantidade terapeuticamente eficaz da droga pode: (i) reduzir o número de células cancerosas; (ii) reduzir o tamanho do tumor; (iii), inibir, retardar, reduzir a velocidade até certo ponto e, preferencialmente, suspender a infiltração de células cancerosas em órgãos periféricos; (iv) inibir (ou seja, reduzir a velocidade até certo ponto e, preferencialmente, suspender) a metástase tumorosa; (v) inibir o crescimento de tumores; e/ou (vi) melhorar, até certo ponto, um ou mais dos sintomas associados ao câncer. Desde que possa evitar o crescimento de células cancerosas existentes e/ou matá-las, a droga pode ser citostática e/ou citotóxica. Em modelos animais, a eficácia pode ser determinada por meio de medições físicas do tumor durante o período após a administração do ADC e por meio de determinação de remissão parcial e completa do tumor. Para a terapia de câncer, pode-se medir a eficácia determinando-se o tempo para o progresso da doença (TTP) e/ou determinando-se a velocidade de reação (RR).
[098] O termo “biodisponibilidade” designa a disponibilidade sistêmica (ou seja, níveis de sangue/plasma) de dada quantidade de droga administrada a pacientes. A biodisponibilidade é termo absoluto que indica a medição do tempo (velocidade) e da quantidade total (extensão) de droga que atinge a circulação geral a partir de forma de dosagem administrada.
[099] Os termos “câncer” e “canceroso” designam ou descrevem a condição fisiológica em mamíferos que é tipicamente caracterizada pelo crescimento celular desregulado. “Tumor” compreende uma ou mais células cancerosas. Exemplos de câncer incluem, mas sem limitar-se a carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma e leucemia ou malignidades linfóides. Exemplos mais específicos desses cânceres incluem câncer de células escamosas (por exemplo, câncer de células escamosas epiteliais), câncer do pulmão, incluindo câncer do pulmão de células pequenas, câncer do pulmão não de células pequenas, adenocarcinoma do pulmão e carcinoma escamoso do pulmão, câncer do peritôneo, câncer hepatocelular, câncer gástrico ou estomacal, incluindo câncer gastrointestinal, tumor estromal gastrointestinal (GIST), câncer pancreático, glioblastoma, câncer cervical, câncer do ovário, câncer do fígado, câncer da bexiga, hepatoma, câncer de mama, câncer do cólon, câncer retal, câncer colo-retal, carcinoma uterino ou endométrico, carcinoma das glândulas salivares, câncer renal ou dos rins, câncer da próstata, câncer da vulva, câncer da tireóide, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma peniano e câncer da cabeça e pescoço.
[0100] O “câncer que expressa ErbB” é aquele que compreende células que contêm proteína ErbB presente na sua superfície celular. O “câncer que expressa ErbB2” é aquele que produz níveis suficientes de ErbB2 na superfície das suas células, de forma que um anticorpo anti-ErbB2 possa ligar- se a elas e apresentar efeito terapêutico com relação ao câncer.
[0101] O câncer que “sobreexpressa” um receptor, tal como um receptor de ErbB, é aquele que contém níveis significativamente mais altos do receptor, tal como ErbB2, na sua superfície celular, em comparação com uma célula não cancerosa do mesmo tipo de tecido. Essa sobreexpressão pode ser causada por amplificação genética ou por maior transcrição ou tradução. A sobreexpressão do receptor de ErbB pode ser determinada em um teste de diagnóstico ou prognóstico, por meio da avaliação de níveis mais altos da proteína ErbB presente sobre a superfície de uma célula (por exemplo, por meio de um ensaio de imunohistoquímica; IHC). Alternativa, ou adicionalmente, pode-se medir os níveis de ácido nucléico codificador de ErbB na célula, por exemplo, por meio de hibridização in situ fluorescente (FISH; vide WO 98/45479), Southern Blot ou técnicas de reação em cadeia de polimerase (PCR), tais como PCR quantitativo em tempo real (RT-PCR). A sobreexpressão (overexpressing) do ligante de ErbB pode ser determinada por meio de diagnóstico por avaliação de níveis do ligante (ou do ácido nucléico que o codifica) no paciente, por exemplo, em biópsia de tumores ou por meio de vários testes de diagnóstico, tais como IHC, FISH, Southern Blot, PCR ou ensaios in vivo descritos acima. Pode-se também estudar a sobreexpressão (overexpressing) de receptores de ErbB medindo-se anticorpo oculto (tal como domínio extracelular de ErbB) em fluido biológico tal como soro (vide, por exemplo, US 4.933.294; WO 91/05264; US 5.401.638; e Sias et al (1990), J. Immunol. Methods 132: 73-80). Além dos ensaios acima, diversos outros ensaios in vivo são disponíveis para os técnicos no assunto. Pode-se, por exemplo, expor as células no corpo do paciente a um anticorpo que seja opcionalmente marcado com marca detectável, tal como isótopo radioativo, e pode-se avaliar a ligação do anticorpo a células do paciente, por exemplo, por meio de varrimento externo para avaliação da radioatividade ou de análise de biópsia retirada de paciente exposto anteriormente ao anticorpo.
[0102] Os tumores que sobreexpressam HER2 são avaliados por meio de avaliações imunohistoquímicas correspondentes à quantidade de cópias de moléculas HER2 expressas por célula, e podem ser determinados bioquimicamente: 0 = 0-10.000 cópias por célula, 1+ = pelo menos cerca de 200.000 cópias por célula, 2+ = pelo menos cerca de 500.000 cópias por célula, 3+ = cerca de 1 a 2 x 106 cópias por célula. A sobreexpressão (overexpressing) de HER2 no nível 3+, que gera ativação independente de ligantes da tirosina quinase (Hudziak et al (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 84: 7159-7163) ocorre em cerca de 30% de cânceres de mama e, nesses pacientes, a sobrevivência livre de reincidência e a sobrevivência geral são reduzidas (Slamon et al (1989), Science 244: 707-712; Slamon et al (1987), Science, 235: 177-182). Por outro lado, câncer que “não é caracterizado pela sobreexpressão (overexpressing) do receptor de ErbB2” é aquele que, em teste de diagnóstico, não expressa níveis mais altos que os normais de receptor de ErbB2 em comparação com célula não cancerosa do mesmo tipo de tecido. O anticorpo anti-HER2 monoclonal murino inibe o crescimento de linhagens de células de câncer de mama que sobreexpressam HER2 no nível 2+ e 3+ (1-2 x 106 receptores de HER2 por célula), mas não apresenta atividade sobre células que expressam níveis mais baixos de HER2 (Lewis et al (1993), Cancer Immunol. Immunother. 37: 255-263). Com base nesta observação, o anticorpo 4D5 foi humanizado (huMAb4D5-8, rhuMAb HER2, US 5.821.337; Carter et al (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89: 4285-4289) e testado em pacientes com câncer de mama cujos tumores sobreexpressam HER2, mas que haviam progredido após a quimioterapia convencional (Cobleigh et al (1999), J. Clin. Oncol. 17: 2639-2648). A maior parte dos tumores de pacientes neste teste expressou HER2 no nível 3+, embora uma parte fosse 2+.
[0103] Câncer “independente de hormônios” é aquele em que a sua proliferação não é dependente da presença de hormônio que se liga a um receptor expresso por células no câncer. Esses cânceres não sofrem regressão clínica mediante administração de estratégias cirúrgicas ou farmacológicas que reduzem a concentração de hormônios no tumor ou perto dele. Exemplos de cânceres independentes de hormônios incluem câncer da próstata independente de andrógenos, câncer de mama independente de estrógenos, câncer endométrico e câncer do ovário. Esses cânceres podem começar como tumores dependentes de hormônios e progredir de estágio sensível a hormônios para tumor refratário a hormônios após a terapia anti-hormonal.
[0104] A expressão “agente citotóxico”, da forma utilizada no presente, indica substância que inibe ou evita o funcionamento das células e/ou causa destruição das células. A expressão destina-se a incluir isótopos radioativos (tais como 211At, 131I, 125I, 90Y, 186Re, 188Re, 153Sm, 212Bi, 32P, 60C e isótopos radioativos de Lu), agentes quimioterapêuticos e toxinas tais como toxinas de moléculas pequenas ou toxinas enzimaticamente ativas de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, incluindo seus análogos sintéticos e derivados.
[0105] “Agente quimioterapêutico” é composto químico útil no tratamento de câncer. Exemplos de agentes quimioterapêuticos incluem Erlotinib (TARCEVA®, Genentech/OSI Pharm.), Bortezomib (VELCADE®, Millenium Pharm.), Fulvestrant (FASLODEX®, Astrazeneca), Sutent (SU11248, Pfizer), Letrozole (FEMARA®, Novartis), mesilato de Imatinib (GLEEVEC®, Novartis), PTK787/ZK 222584 (Novartis), Oxaliplatin (Eloxatin®, Sanofi), 5-FU (5-fluorouracil), Leucovorin, Rapamicin (Sirolimus, RAPAMUNE®, Wyeth), Lapatinib (GSK572016, GlaxoSmithKline), Lonafarnib (SCH 66336), Sorafenib (BAY43-9006, Bayer Labs.) e Gefitinib (IRESSA®, Astrazeneca), AG1478, AG1571 (SU 5271; Sugen), agentes alquilantes tais como tiotepa e ciclofosfamida CYTOXAN®; sulfonatos de alquila tais como busulfan, improsulfan e piposulfan; aziridinas tais como benzodopa, carboquona, meturedopa e uredopa; etilenoiminas e metilamelaminas, que incluem trietilenomelamina, trietilenofosforamida, trietilenotiofosforamida e trimetilomelamina; acetogeninas (especialmente bulatacina e bulatacinona); camptotecina (incluindo o análogo sintético topotecan); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluindo seus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina e bizelesina); criptoficinas (particularmente criptoficina 1 e criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluindo os análogos sintéticos KW-2189 e CB1- TM1); eleuterobina; pancratistatina; sarcodictiina; espongistatina; mostardas de nitrogênio tais como clorambucil, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, cloridrato óxido de mecloretamina, melfalan, novembichin, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostarda de uracil; nitrosuréias, tais como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina e ranimnustina; antibióticos, tais como os antibióticos de enediina (por exemplo, caliqueamicina, especialmente caliqueamicina gama1I e caliqueamicina ômegaI1 (Angew Chem Intl. Ed. Engl. (1994) 33: 183-186; dinemicin, incluindo dinemicin A; bifosfonatos, tais como clodronato; esperamicin; bem como neocarzinostatin cromoforo e cromoforos antibióticos de enediina cromoproteína relacionados), aclacinomisinas, actinomicin, autramicin, azaserina, bleomicinas, cactinomicin, carabicin, carminomicin, carzinofilin, cromomicinas, dactinomicin, daunorubicin, detorubicin, 6-diazo-5- oxo-L-norleucina, doxorubicin ADRIAMYCIN® (incluindo morfolino-doxorubicin, cianomorfolino-doxorubicin, 2-pirrolino-doxorubicin e desoxidoxorubicin), epirubicin, esorubicin, idarubicin, marcelomicin, mitomicinas tais como mitomicin C, ácido micofenólico, nogalamicin, olivomicinas, peplomicin, potfiromicin, puromicin, quelamicin, rodorubicin, estreptonigrin, estreptozocin, tubercidin, ubenimex, zinostatin, zorubicin; antimetabólitos, tais como metotrexato e 5-fluorouracil (5-FU); análogos de ácido fólico, tais como denopterin, metotrexato, pteropterin, trimetrexato; análogos de purina, tais como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina, tais como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos, tais como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; anti-adrenais, tais como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reabastecedor de ácido fólico, tal como ácido frolínico; aceglatona; aldofosfamido glicosídeo; ácido aminolevulínico; eniluracil; amsacrina; bestrabucil; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfornitina; acetato de eliptínio; epotilona; etoglucídeo; nitrato de gálio; hidroxiuréia; lentinan; lonidainina; maitansinóides, tais como maitansina e ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitraerina; pentostatin; fenamet; pirarubicin; losoxantrona; ácido podofilínico; 2-etil hidrazida; procarbazina; complexo de polissacarídeos PSK® (JHS Natural Products, Eugene OR, Estados Unidos); razoxano; rizoxin; sizofiran; espirogermânio; ácido tenuazônico; triaziquona; 2,2’,2”-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurin A, roridin A e anguidina); uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabinosida (“Ara-C”); ciclofosfamida; tiotepa; taxóides, tais como paclitaxel TAXOL® (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton NJ), ABRAXANE® livre de Cremophor, formulação de nanopartículas de paclitaxel elaborada com albumina (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois) e doxetaxel TAXOTERE® (Rhône-Poulenc Rorer, Antony, França); clorambucil; gemcitabina GEMZAR®; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platina tais como cisplatina e carboplatina; vinblastina; platina; etoposida (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina NAVELBINE®; novantrona; teniposida; edatrexato; daunomicin; aminopterin; xeloda; ibandronato; CPT-11; inibidor de topoisomerase RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); retinóides, tais como ácido retinóico; capecitabina; e sais, ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis de quaisquer dos acima.
[0106] Também se incluem nesta definição de “agente quimioterapêutico”: (i) agentes anti-hormonais que agem para regular ou inibir a ação hormonal sobre tumores tais como antiestrógenos e moduladores receptores de estrógenos seletivos (SERMs), que incluem, por exemplo, tamoxifen (incluindo tamoxifen NOLVADEX®), raloxifeno, droloxifeno, 4- hidroxitamoxifen, trioxifeno, queoxifeno, LY117018, onapristona e toremifeno FARESTON; (ii) inibidores da aromatase que inibem a enzima aromatase, que regula a produção de estrógenos nas glândulas adrenais, tais como 4 (5)- imidazóis, aminoglutetimida, acetato de megestrol MEGASE®, exemestano AROMASIN®, formestanie, fadrozol, vorozol RIVISOR®, letrozol FEMARA® e anastrozol ARIMIDEX®; (iii) anti-andrógenos, tais como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida e goserelin; bem como troxacitabina (análogo de citosina nucleosídeo de 1,3-dioxolano); (iv) inibidores de aromatase; (v) inibidores de quinase de proteínas; (vi) inibidores de quinase de lipídios; (vii) oligonucleotídeos sem sentido, particularmente os que inibem a expressão de genes em processos de sinalização relacionados à proliferação celular aberrante, tais como PKC-alfa, Ralf e H-Ras; (viii) ribozimas, tais como inibidor da expressão de VEGF (por exemplo, ribozima ANGIOZYME®) e inibidor da expressão de HER2; (ix) vacinas, tais como vacinas de terapia genética, por exemplo vacina ALLOVECTIN®, vacina LEUVECTIN® e vacina VAXID®; rIL-2 PROLEUKIN®; inibidor da topoisomerase 1 LURTOTECAN®; rmRH ABARELIX®; (x) agentes antiangiogênicos, tais como bevacizumab (AVASTIN®, Genentech); e (xi) os sais, ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis de quaisquer dos acima.
[0107] Os inibidores de proteína quinase incluem inibidores da tirosina quinase que inibem, até certo ponto, a atividade da tirosina quinase tal como do receptor de ErbB. Exemplos de inibidores de tirosina quinase incluem drogas dirigidas por EGFR, tais como: (i) anticorpos que se ligam a EGFR, incluindo MAb 579 (ATCC CRL HB 8506), MAb 455 (ATCC CRL HB8507), MAb 225 (ATCC CRL 8508), MAb 528 (ATCC CRL 8509) (vide US 4.943.533, Mendelsohn et al) e seus variantes, tais como 225 quimerizado (C225 ou Cetuximab; ERBITUX®, Imclone) e 225 humano (H225) remodelado (WO 96/40210, Imclone Systems Inc.); anticorpos que ligam EGFR mutante tipo II (US 5.212.290); anticorpos quiméricos e humanizados que ligam EGFR (US 5.891.996); e anticorpos humanos que ligam EGFR, tais como ABX-EGF (WO 98/50433); (ii) anticorpo anti-EGFR conjugado a agente citotóxico (EP 659439A2); e moléculas pequenas que se ligam a EGFR, incluindo ZD1839 ou Gefitinib (IRESSA®; Astra Zeneca), Erlotinib HCl (CP-358774, TARCEVA®; Genentech/OSI) e AG1478, AG1571 (SU 5271; Sugen), quinazolinas tais como PD 153035,4-(3-cloroanilino) quinazolina, piridopirimidinas, pirimidopirimidinas, pirrolopirimidinas, tais como CGP 59326, CGP 60261 e CGP 62706, e pirazolopirimidinas, 4-(fenilamino)-7H-pirrolo[2,3-d] pirimidinas, curcumina (diferuloil metano, 4,5-bis (4-fluoroanilino)ftalimida), tirfostinas que contêm porções nitrotiofeno; PD-0183805 (Warner-Lambert); moléculas sem sentido (tais como os que se ligam a ácido nucléico que codifica ErbB); quinoxalinas (US 5.804.396); trifostinas (US 5.804.396); ZD6474 (Astra Zeneca); PTK-787 (Novartis/Schering AG); inibidores pan-ErbB tais como CI-1033 (Pfizer); Affinitac (ISIS 3521; Isis/Lilly); mesilato de Imatinib (Gleevac; Novartis); PKI 166 (Novartis); GW2016 (Glaxo SmithKline); CI-1033 (Pfizer); EKB-569 (Wyeth); Semaxanib (Sugen); ZD6474 (AstraZeneca); PTK-787 (Novartis/Schering AG); INC-1C11 (Imclone); ou conforme descrito em: US 5.804.396; WO 99/09016 (American Cyanamid); WO 98/43960 (American Cyanamid); WO 97/38983 (Warner Lambert); WO 99/06378 (Warner Lambert); WO 99/06396 (Warner Lambert); WO 96/30347 (Pfizer, Inc); WO 96/33978 (Zeneca); WO 96/3397 (Zeneca); e WO 96/33980 (Zeneca).
[0108] “Agente antiangiogênico” designa um composto que bloqueia ou interfere, até certo grau, no desenvolvimento de vasos sanguíneos. O fator antiangiogênico pode ser, por exemplo, uma molécula pequena ou anticorpo que se liga a um fator de cescimento ou receptor de fator de crescimento envolvido na promoção da angiogênese. Um exemplo de agente antiangiogênico é o anticorpo que se liga a Fator de Crescimento Endotelial Vascular (VEGF), tal como bevacizumab (AVASTIN®, Genentech).
[0109] O termo “citoquina” é o termo genérico para proteínas liberadas por população celular que agem sobre outra célula como mediadores intercelulares. Exemplos dessas citoquinas são linfoquinas, monoquinas e hormônios de polipeptídeos tradicionais. Encontram-se incluídos entre as citoquinas hormônios do crescimento, tais como hormônio do crescimento humano, hormônio do crescimento humano tipo N-metionila e hormônio do crescimento bovino; hormônio paratireóide; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina; pró-relaxina; hormônios de glicoproteínas tais como hormônio estimulante dos folículos (FSH), hormônio estimulante da tireóide (TSH) e hormônio luteinizante (LH); fator do crescimento hepático; fator de crescimento dos fibroblastos; prolactina; lactogênio da placenta; fator de necrose tumoral α e β; substância inibidora mulleriana; peptídeo associado a gonadotropina de camundongos; inibina; activina; fator de crescimento endotelial vascular; integrina; trombopoietina (TPO); fatores de crescimento nervoso tais como NGF-β; fator de crescimento das plaquetas, fatores de crescimento de transformação (TGFs) tais como TGF-α e TGF-β; fator de crescimento similar à insulina I e II; eritropoietina (EPO); fatores osteoindutivos; interferonas, tais como interferon-α, β e y; fatores estimulantes de colônias (CSFs) tais como macrófago-CSF (M-CSF); granulócito-macrófago-CSF (GM-CSF); e granulócito-CSF (G-CSF); interleucinas (ILs) tais como IL-1, IL-1α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; fator de necrose tumoral tal como TNF-α ou TNF-β; e outros fatores de polipeptídeos que incluem LIF e ligante de kits (KL). Da forma utilizada no presente, o termo citoquina inclui proteínas de fontes naturais ou de cultivo celular recombinante e equivalentes biologicamente ativos das citoquinas de sequências selvagens.
[0110] O termo “pró-droga”, da forma utilizada no presente pedido, designa uma forma precursora ou derivada de substância farmaceuticamente ativa que é menos citotóxica para células tumorais em comparação com a droga parental e é capaz de ser ativada enzimaticamente ou convertida na forma parental mais ativa. Vide, por exemplo, Wilman, Prodrugs in Cancer Chemotherapy, Biochemical Society Transactions, 14, págs. 375-382, 615a Reunião de Belfast (1986) e Stella et al, Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery, Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), págs. 247-267, Humana Press (1985). As pró-drogas de acordo com a presente invenção incluem, mas não se limitam à pró-drogas que contêm fosfato, pró-drogas que contêm tiofosfato, pró-drogas que contêm sulfato, pró-drogas que contêm peptídeos, pró-drogas modificadas com D- aminoácidos, pró-drogas glicosiladas, pró-drogas que contêm β-lactama, pró- drogas que contêm fenoxiacetamida opcionalmente substituída ou pró-drogas que contêm fenilacetamida opcionalmente substituída, 5-fluorocitosina e outras pró-drogas de 5-fluorouridina que podem ser convertidas na droga livre citotóxica mais ativa. Exemplos de drogas citotóxicas que podem ser derivadas em forma de pró-droga para uso na presente invenção incluem, mas sem limitar-se aos agentes quimioterapêuticos descritos acima.
[0111] “Lipossomo” é uma bolha pequena composta de vários tipos de lipídios, fosfolipídios e/ou tensoativo que é útil para o fornecimento de drogas (tais como os anticorpos anti-ErbB2 descritos no presente e, opcionalmente, um agente quimioterapêutico) a mamíferos. Os componentes do lipossomo são normalmente dispostos em formação bicamadas, similar à disposição de lipídios de membranas biológicas.
[0112] O termo “bula” é utilizado para indicar instruções costumeiramente incluídas em embalagens comerciais de produtos terapêuticos que contêm informações sobre as indicações, uso, dosagem, administração, contra-indicações e/ou avisos com referência ao uso desses produtos terapêuticos.
[0113] “Cardioprotetor” é o composto ou composição que evita ou reduz disfunções do miocárdio (ou seja, cardiomiopatia e/ou parada cardíaca congestiva) associada à administração de droga, tal como antibiótico de antraciclina e/ou anticorpo anti-ErbB2, a paciente. O cardioprotetor pode, por exemplo, bloquear ou reduzir efeito cardiotóxico mediado por radicais livres e/ou evitar ou reduzir lesões por tensão oxidativa. Exemplos de cardioprotetores englobados pela presente definição incluem o agente quelante de ferro dexrazoxano (ICRF-187) (Seifert et al, The Annals of Pharmacotherapy, 28: 1063-1072 (1994)); agente redutor de lipídios e/ou antioxidante tal como probucol (Singal et al, J. Mol. Cell Cardiol., 27: 1055-1063 (1995)); amifostina (aminotiol 2-[(3-aminopropil)amino]etanotiol-di-hidrogênio fosfato éster, também denominado WR-2721, e a sua forma de absorção celular desfosforilada denominada WR-1065) e ácido S-3-(3- metilaminopropilamino)propilfosforotióico (WR-151327), vide Green et al (1994), Cancer Research, 54: 738-741; digoxina (Bristow, M. R., ed. (1980) Drug-Induced Heart Disease, Nova Iorque: Elsevier 191-215); bloqueadores beta tais como metoprolol (Hjalmarson et al (1994) Drugs 47: Supl. 4: 31-9; e Shaddy et al (1995), Am. Heart J., 129: 197-9); vitamina E; ácido ascórbico (vitamina C); extratores de radicais livres tais como ácido oleanólico, ácido ursólico e N-acetilcisteína (NAC); compostos de captura de centrifugação tais como alfa-fenil-terc-butil nitrona (PBN); (Paracchini et al (1993), Anticancer Res., 13: 1607-1612); compostos selenoorgânicos, tais como P251 (Elbesen); e similares.
[0114] Uma molécula de ácido nucléico “isolada” é uma molécula de ácido nucléico que é identificada e separada a partir de pelo menos uma molécula de ácido nucléico contaminante com a qual é normalmente associada na fonte natural do ácido nucléico do anticorpo. Uma molécula de ácido nucléico isolada é diferente na forma ou ambiente em que é encontrada na natureza. As moléculas de ácido nucléico isoladas são diferenciadas, portanto, da molécula de ácido nucléico que existe em células naturais. Entretanto, uma molécula de ácido nucléico isolada inclui uma molécula de ácido nucléico contida em células que normalmente expressam o anticorpo em que, por exemplo, a molécula de ácido nucléico encontra-se em local cromossômico diferente daquele de células naturais.
[0115] “Alquila” é o hidrocarboneto C1-C18 que contém átomos de carbono normais, secundários, terciários ou cíclicos. Exemplos de radicais alquila incluem porções de hidrocarboneto C1-C8 tais como, mas sem limitar-se a: metila (Me, -CH3), etila (Et, -CH2CH3), 1-propila (n-Pr, n-propila, - CH2CH2CH3), 2-propila (i-Pr, i-propila, -CH(CH3)2), 1-butila (n-Bu, n-butila, - CH2CH2CH2CH3), 2-metil-1-propila (i-Bu, i-butila, -CH2CH(CH3)2), 2-butila (s-Bu, s-butila, -CH(CH3)CH2CH3), 2-metil-2-propila (t-Bu, t-butila, -C(CH3)3), 1-pentila (n-pentila, -CH2CH2CH2CH2CH3), 2-pentila (-CH(CH3)CH2CH2CH3), 3-pentila (- CH(CH2CH3)2), 2-metil-2-butila (-C(CH3)2CH2CH3), 3-metil-2-butila (- CH(CH3)CH(CH3)2), 3-metil-1-butila (-CH2CH2CH(CH3)2), 2-metil-1-butila (- CH2CH(CH3)CH2CH3), 1-hexila (-CH2CH2CH2CH2CH2CH3), 2-hexila (- CH(CH3)CH2CH2CH2CH3), 3-hexila (-CH(CH2CH3)(CH2CH2CH3)), 2-metil-2- pentil (-C(CH3)2CH2CH2CH3), 3-metil-2-pentila (-CH(CH3)CH(CH3)CH2CH3), 4- metil-2-pentila (-CH(CH3)CH2CH(CH3)2), 3-metil-3-pentila (-C(CH3)(CH2CH3)2), 2-metil-3-pentila (-CH(CH2CH3)CH(CH3)2), 2,3-dimetil-2-butila (- C(CH3)2CH(CH3)2), 3,3-dimetil-2-butila (-CH(CH3)C(CH3)3.
[0116] “Alquenila” é o hidrocarboneto C2-C18 que contém átomos de carbono normais, secundários, terciários ou cíclicos com pelo menos um sítio de insaturação, ou seja, ligação dupla sp2 carbono-carbono. Exemplos de radicais alquenila incluem porções de hidrocarboneto C2-C8 tais como, mas sem limitar- se a: etileno ou vinila (-CH=CH2), alila (-CH2CH=CH2), ciclopentenila (-C5H7) e 5-hexenila (-CH2CH2CH2CH2CH=CH2).
[0117] “Alquinila” é o hidrocarboneto C2-C18 que contém átomos de carbono normais, secundários, terciários ou cíclicos com pelo menos um sítio de insaturação, ou seja, ligação tripla sp carbono-carbono. Exemplos de radicais alquinila incluem porções de hidrocarboneto C2-C8 tais como, mas sem limitar- se a: acetilênico (-C CH) e propargila (-CH2C CH).
[0118] “Alquileno” indica a cadeia linear, ramificada ou saturada ou radical hidrocarboneto cíclico com um a dezoito átomos de carbono e que contém dois centros radicais monovalentes derivados por meio da remoção de dois átomos de hidrogênio do mesmo ou de dois átomos de carbono diferentes de alcano original. Radicais alquileno típicos incluem porções de hidrocarboneto C1C8 tais como, mas sem limitar-se a: metileno (-CH2-) 1,2-etila (-CH2CH2-), 1,3- propila (-CH2CH2CH2-), 1,4-butila (-CH2CH2CH2CH2-) e similares.
[0119] “Alquenileno” indica a cadeia linear, ramificada, insaturada ou radical hidrocarboneto cíclico com dois a dezoito átomos de carbono e que contém dois centros radicais monovalentes derivados por meio da remoção de dois átomos de hidrogênio do mesmo ou de dois átomos de carbono diferentes de alqueno original. Radicais alquenileno típicos incluem porções de hidrocarboneto C2-C8 tais como, mas sem limitar-se a: 1,2-etileno (-CH=CH-).
[0120] “Alquinileno” indica a cadeia linear, ramificada, insaturada ou radical hidrocarboneto cíclico com dois a dezoito átomos de carbono e que contém dois centros radicais monovalentes derivados por meio da remoção de dois átomos de hidrogênio do mesmo ou de dois átomos de carbono diferentes de alquino original. Radicais alquinileno típicos incluem porções de hidrocarboneto C2-C8 tais como, mas sem limitar-se a: acetileno (-C C-), propargila (-CH2C C-) e 4-pentinila (-CH2CH2CH2C C-).
[0121] “Arila”, isolado ou em combinação, indica o radical hidrocarboneto aromático monovalente com seis a vinte átomos de carbono derivado por meio da remoção de um átomo de hidrogênio de um único átomo de carbono de sistema de anéis aromáticos original. Radical arila pode conter um, dois ou três anéis em que esses anéis podem ser ligados entre si de maneira pendente, tais como bifenila, ou podem ser fundidos, tais como naftaleno ou antraceno. Alguns grupos arila são representados nos exemplos de estruturas como “Ar”. Grupos arila típicos incluem porções de hidrocarboneto C6-C12 tais como, mas sem limitar-se a radicais derivados de benzeno, benzeno substituído, naftaleno, antraceno, bifenila e similares.
[0122] “Arilalquila” indica o radical alquila acíclico em que um dos átomos de hidrogênio ligado a um átomo de carbono, tipicamente átomo de carbono sp3 ou terminal, é substituído com radical arila. Grupos arilalquila típicos incluem, mas sem limitar-se a benzila, 2-feniletan-1-ila, 2-fenileten-1-ila, naftilmetila, 2-naftiletan-1-ila, 2-naftileten-1-ila, naftobenzila, 2-naftofeniletan-1- ila e similares. O grupo arilalquila compreende de seis a vinte átomos de carbono, tais como a porção de alquila, que inclui grupos alcanila, alquenila ou alquinila, do grupo arilalquila é de um a seis átomos de carbono e a porção de arila é de cinco a quatorze átomos de carbono.
[0123] “Heteroarilalquila” indica o radical alquila acíclico em que um dos átomos de hidrogênio ligado a um átomo de carbono, tipicamente átomo de carbono sp3 ou terminal, é substituído com o radical heteroarila. Grupos heteroarilalquila típicos incluem, mas sem limitar-se a 2- benzimidazolilmetila, 2-furiletila e similares. O grupo heteroarilalquila compreende de seis a vinte átomos de carbono, tais como a porção de alquila, que inclui grupos alcanila, alquenila ou alquinila, do grupo heteroarilalquila é de um a seis átomos de carbono e a porção de heteroarila é de cinco a quatorze átomos de carbono e de um a três heteroátomos selecionados a partir de N, O, P e S. A porção heteroarila do grupo heteroarilalquila pode ser um monociclo que contém de três a sete membros de anéis (dois a seis átomos de carbono) ou um biciclo que contém de sete a dez membros de anéis (quatro a nove átomos de carbono e de um a três heteroátomos selecionados a partir de N, O, P e S), por exemplo: sistema biciclo [4,5], [5,5], [5,6] ou [6,6].
[0124] Grupos alquila, alquileno, arila, arilalquila e heteroarilalquila podem ser substituídos, em que um ou mais átomos de hidrogênio são substituídos independentemente com um substituinte cada um. Os substituintes típicos incluem, mas sem limitar-se a -X, -R, -O-, -OR, -SR, -S-, -NR2, -NR3, =NR, -CX3, -CN, -OCN, -SCN, -N=C=O, -NCS, -NO, -NO2, =N2, -N3, -NC(=O)R, -C(=O)R, -C(=O)NR2, -SO3-, -SO3H, -S(=O)2R, -OS(=O)2OR, -S(=O)2NR, - S(=O)R, -OP(=O)(OR)2, -P(=O)(OR)2, -PO-3, -PO3H2, -C(=O)R, -C(=O)X, - C(=S)R, -CO2R, -CO2-, -C(=S)OR, -C(=O)SR, -C(=S)SR, -C(=O)NR2, - C(=S)NR2, -C(=NR)NR2, em que cada X é independentemente um halogênio: F, Cl, Br ou I; e cada R é independentemente um H, alquila C1-C18, arila C6-C20, heterociclo C3-C14, grupo protetor ou porção de pró-droga. Grupos alquileno, alquenileno e alquinileno conforme descrito acima também podem ser substituídos de forma similar.
[0125] “Heteroarila”, também conhecido como heterociclo ou heterociclila, designa um radical de sistema de anéis em que um ou mais átomos de anel é heteroátomo, tal como nitrogênio, oxigênio e enxofre. O radical heteroarila compreende de cinco a quatorze átomos de carbono e de um a três heteroátomos selecionados a partir de N, O, P e S. Heteroarila pode ser um monociclo que contém de três a sete membros de anéis (dois a seis átomos de carbono e de um a três heteroátomos selecionados a partir de N, O, P e S) ou um biciclo que contém de sete a dez membros de anéis (quatro a nove átomos de carbono e de um a três heteroátomos selecionados a partir de N, O, P e S), por exemplo: sistema biciclo [4,5], [5,5], [5,6] ou [6,6]. Os compostos heteroarila são descritos em Paquette, Leo A., Principles of Modern Heterocyclic Chemistry (W. A. Benjamin, Nova Iorque, 1968), particularmente Capítulos 1, 3, 4, 6, 7 e 9; The Chemistry of Heterocyclic Compounds, A Series of Monographs (John Wiley & Sons, Nova Iorque, 1950 até o presente), particularmente Volumes 13, 14, 16, 19 e 28; e J. Am. Chem. Soc. (1960) 82: 5566.
[0126] “Ligante” ou “ligação” indica a porção química que compreende ligação covalente ou cadeia de átomos que liga covalentemente um anticorpo a uma porção de droga. Em várias realizações, ligante é especificado como L. Os ligantes incluem radical bivalente tal como o alquileno, arileno, heteroarileno, porções tais como: -(CR2)nO(CR2)n-, unidades de repetição de alquilóxi (tais como polietilenóxi, PEG, polimetilenoóxi) e alquilamino (tais como polietilenoamina, Jeffamine®); e éster biácido e amidas que incluem succinato, succinamida, diglicolato, malonato e caproamida.
[0127] O termo “quiral” designa moléculas que possuem a propriedade de falta de sobreposição do parceiro de imagem espelhada, enquanto o termo “aquiral” designa moléculas que podem ser sobrepostas sobre o seu parceiro de imagem espelhada.
[0128] O termo “estereoisômeros” designa compostos que possuem constituição química idêntica, mas diferem com relação à disposição dos átomos ou grupos no espaço.
[0129] “Diastereoisômero” designa estereoisômero com dois ou mais centros quirais e cujas moléculas não são imagens espelhadas entre si. Diastereoisômeros possuem propriedades físicas diferentes, tais como pontos de fusão, pontos de ebulição, propriedades de espectro e reatividades. Misturas de diastereoisômeros podem separar-se sob procedimentos analíticos em alta resolução tais como eletroforese e cromatografia.
[0130] “Enantiômeros” designam dois estereoisômeros de composto que não são imagens espelhadas que não podem ser sobrepostas entre si.
[0131] As definições estereoquímicas e convenções utilizadas no presente seguem, de forma geral, S. P. Parker, Ed., McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (1984), McGraw-Hill Book Company, Nova Iorque; e Eliel, E. e Wilen, S., Stereochemistry of Organic Compounds (1994), John Wiley & Sons, Inc., Nova Iorque. Muitos compostos orgânicos existem em formas oticamente ativas, ou seja, elas possuem a capacidade de girar o plano da luz polarizada plana. Ao descrever composto oticamente ativo, os prefixos D e L, ou R e S, são utilizados para indicar a configuração absoluta da molécula em volta do(s) seu(s) centro(s) quiral(is). Os prefixos d e l ou (+) e (-) são empregados para designar o sinal de rotação da luz polarizada plana pelo composto, em que (-) ou 1 indica que o composto é levogiro. Composto prefixado com (+) ou d é dextrogiro. Para dada estrutura química, estes estereoisômeros são idênticos, exceto por serem imagens espelhadas entre si. Estereoisômero específico pode também ser indicado como enantiômero e uma mistura desses isômeros é frequentemente denominada uma mistura enantiomérica. Uma mistura 50:50 de enantiômeros é denominada uma mistura racêmica ou racemato, o que pode ocorrer quando não houver estereoseleção ou estereoespecificidade em processo ou reação química. As expressões “mistura racêmica” e “racemato” designam mistura equimolar de duas espécies enantioméricas, isentas de atividade ótica.
[0132] A expressão “sal farmaceuticamente aceitável”, da forma utilizada no presente, indica sais orgânicos ou inorgânicos farmaceuticamente aceitáveis de ADC. Exemplos de sais incluem, mas sem limitar-se a sais de sulfato, citrato, acetato, oxalato, cloreto, brometo, iodeto, nitrato, dissulfato, fosfato, fosfato ácido, isonicotinato, lactato, salicilato, citrato ácido, tartrato, oleato, estanhato, pantotenato, bitartrato, ascorbato, succinato, maleato, gentisinato, fumarato, gluconato, glucuronato, sacarato, formato, benzoato, glutamato, metanossulfonato, etanossulfonato, benzenossulfonato, p- toluenossulfonato e pamoato (ou seja, 1,1’-metileno-bis-(2-hidróxi-3-naftoato)). Sal farmaceuticamente aceitável pode envolver a inclusão de outra molécula tal como íon de acetato, íon de succinato ou outro contraíon. O contraíon pode ser porção orgânica ou inorgânica que estabiliza a carga sobre o composto original. Além disso, o sal farmaceuticamente aceitável pode conter mais de um átomo carregado na sua estrutura. Casos em que diversos átomos carregados são parte do sal farmaceuticamente aceitável podem conter diversos contraíons. Desta forma, sal farmaceuticamente aceitável pode conter um ou mais átomos carregados e/ou um ou mais contraíons.
[0133] “Solvato farmaceuticamente aceitável” designa associação de uma ou mais moléculas de solvente e ADC. Exemplos de solventes que formam solvatos farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas sem limitar-se a água, isopropanol, etanol, metanol, DMSO, acetato de etila, ácido acético e etanolamina. CONJUGADOS DE DROGA E ANTICORPO
[0134] Os compostos de acordo com a presente invenção incluem os que possuem utilidade para atividade anticancerígena. Particularmente, os compostos incluem anticorpo conjugado, ou seja, ligado covalentemente por um ligante, a uma porção de droga, em que a droga, quando não conjugada a um anticorpo, possui um efeito citotóxico ou citostático. A atividade biológica da porção de droga é modulada, desta forma, por meio de conjugação a anticorpo. Os conjugados de droga e anticorpo (ADC) de acordo com a presente invenção podem fornecer seletivamente uma dose eficaz de agente citotóxico para tecido de tumor através de maior seletividade, ou seja, uma menor dose eficaz pode ser atingida.
[0135] Em uma realização, a biodisponibilidade do ADC, ou metabólito intracelular do ADC, é aprimorada em um mamífero em comparação com o composto maitansinóide correspondente isolado. Além disso, a biodisponibilidade do ADC, ou metabólito intracelular do ADC, é aprimorada em um mamífero em comparação com o anticorpo correspondente isolado (anticorpo do ADC, sem a porção de droga ou ligante).
[0136] Em uma realização, a porção de droga maitansinóide do ADC não é dividida do anticorpo até que o conjugado de droga e anticorpo ligue- se ao receptor da superfície celular ou entre na célula através do receptor da superfície celular específico para o anticorpo do conjugado de droga e anticorpo. A porção de droga pode ser dividida do anticorpo depois que o conjugado de droga e anticorpo entrar na célula. A porção de droga maitansinóide pode ser dividida de forma intracelular em mamífero a partir do anticorpo do composto, ou metabólito intracelular do composto, por meio de ação enzimática, hidrólise, oxidação ou outro mecanismo. Por exemplo, e sem nenhuma intenção de limitar a presente invenção a um mecanismo de ação específico, o átomo de enxofre da porção de droga maitansinóide do ADC pode ser oxidado em sulfona ou grupo sulfóxido. Prótons sobre carbonos ligados a sulfona e sulfóxido podem ser removidos sob catálise geral ou enzimática no interior da célula e resultam em fragmentação de eliminação beta que divide e separa a porção de droga do anticorpo do ADC. Alternativamente, outros grupos de retirada de elétrons tais como amidas no ligante, anticorpo ou porção de droga podem efetuar mecanismos de divisão/fragmentação similares no interior de uma célula.
[0137] Conjugados de droga e anticorpo (ADC) podem ser representados pela Fórmula I: Ab-(L-D)p I ou seu sal ou solvato farmaceuticamente aceitável, em que: - Ab é o anticorpo que se liga ao receptor de ErbB, ou que se liga a um ou mais antígenos associados a tumor ou receptores da superfície celular selecionados a partir de (1) a (36): (1) BMPR1B (tipo IB de receptor de proteína morfogenética óssea, acesso Genbank n° NM_001203); (2) E16 (LAT1, SLC7A5, acesso Genbank n° NM_003486); (3) STEAP1 (antígeno epitelial de seis transmembranas da próstata, acesso Genbank n° NM_012449); (4) 0772P (CA125, MUC16, acesso Genbank n° AF361486); (5) MPF (MPF, MSLN, SMR, fator de potencialização de megacariócitos, mesotelina, acesso Genbank n° NM_005823); (6) Napi3b (NAPI-3B, NPTIIb, SLC34A2, família carreadora de soluto 34 (fosfato de sódio), membro 2, transportador de fosfato dependente de sódio tipo II 3b, acesso Genbank n° NM_006424); (7) Sema 5b (FLJ10372, KIAA1445, Mm.42015, SEMA5B, SEMAG, Semaforin 5b Hlog, domínio sema, sete repetições de trombospondina (tipo 1 e similar a tipo 1), domínio de transmembrana (TM) e domínio citoplasmático curto (semaforin) 5B, acesso Genbank n° AB040878); (8) PSCA hlg (gene 2700050C12Rik, C530008O16Rik, RIKEN cDNA 2700050C12, RIKEN cDNA 2700050C12, acesso Genbank n° AY358628); (9) ETBR (receptor tipo B de endotelina, acesso Genbank n° AY275463); (10) MSG783 (RNF124, proteína hipotética FLJ20315, acesso Genbank n° NM_017763); (11) STEAP2 (HGNC_8639, IPCA-1, PCANAP1, STAMP1, STEAP2, STMP, gene 1 associado a câncer da próstata, proteína 1 associada a câncer da próstata, antígeno epitelial de seis transmembranas da próstata 2, proteína da próstata de seis transmembranas, acesso Genbank n° AF455138); (12) TrpM4 (BR22450, FLJ20041, TRPM4, TRPM4B, canal de cátions potencial de receptor transitório, subfamília M, membro 4, acesso Genbank n° NM_017636); (13) CRIPTO (CR, CR1, CRGF, CRIPTO, TDGF1, fator de crescimento derivado de teratocarcinoma, acesso Genbank n° NP_003203 ou NM_003212); (14) CD21 (CR2 (receptor de complemento 2) ou C3DR (C3d/receptor de vírus Epstein Barr) ou Hs.73792, acesso Genbank n° M26004); (15) CD79b (CD79B, CD79β, IGb (beta associado à imunoglobulina), B29, acesso Genbank n° NM_000626); (16) FcRH2 (IFGP4, IRTA4, SPAP1A (domínio SH2 que contém proteína âncora de fosfatase 1a), SPAP1B, SPAP1C, acesso Genbank n° NM_030764); (17) HER2 (acesso Genbank n° M11730); (18) NCA (acesso Genbank n° M18728); (19) MDP (acesso Genbank n° BC017023); (20) IL20Ra (acesso Genbank n° AF184971); (21) Brevican (acesso Genbank n° AF229053); (22) EphB2R (acesso Genbank n° NM_004442); (23) ASLG659 (acesso Genbank n° AX092328); (24) PSCA (acesso Genbank n° AJ297436); (25) GEDA (acesso Genbank n° AY260763); (26) BAFF-R (receptor de fator de ativação de células B, receptor BLyS 3, BR3, NP_443177.1); (27) CD22 (isoforma CD22-B de receptor de células B, NP- 001762.1); (28) CD79a (CD79A, CD79a, alfa associado à imunoglobulina, proteína específica de células B que interage covalentemente com Ig beta (CD79B) e forma um complexo sobre a superfície com moléculas de IgM, transduz um sinal envolvido na diferenciação de células B, acesso Genbank n° NP_001774.1); (29) CXCR5 (receptor de linfoma de Burkitt 1, um receptor acoplado a proteína G que é ativado pela quemoquina CXCL13, funções em migração de linfócitos e defesa humoral, desempenha um papel em infecções por HIV-2 e talvez no desenvolvimento de AIDS, linfoma, mieloma e leucemia, acesso Genbank n° NP_001707.1); (30) HLA-DOB (subunidade beta da molécula de classe II do MHC (antígeno Ia) que liga peptídeos e os apresenta a linfócitos T CD4+, acesso Genbank n° NP_002111.1); (31) P2X5 (canal de íons 5 com portal de ligante P2X receptor purinérgico, um canal de íons com portal de ATP extracelular, pode estar envolvido na transmissão sináptica e neurogênese, deficiência pode contribuir com a patofisiologia de instabilidade detrusora idiopática, acesso Genbank n° NP_002552.2); (32) CD72 (antígeno de diferenciação de células B CD72, Lyb- 2, acesso Genbank n° NP_001773.1); (33) LY64 (antígeno de linfócitos 64 (RP105), proteína de membrana do tipo I da família de repetição rica em leucinas (LRR), regula a apoptose e a ativação de células B, a perda de função é associada ao aumento da atividade da doença em pacientes com eritematose do lúpus sistêmico, acesso Genbank n° NP_005573.1); (34) FcRH1 (proteína 1 similar a receptor de Fc, suposto receptor para o domínio Fc de imunoglobulina que contém domínios ITAM e similares a Ig tipo C2, pode apresentar um papel na diferenciação de linfócitos B, acesso Genbank n° NP_443170.1); (35) IRTA2 (receptor de superfamília de imunoglobulina associado a translocação 2, um suposto imunorreceptor com possíveis papéis no desenvolvimento de células B e linfomagênese; a desregulagem do gene por meio de translocação ocorre em algumas malignidades de células B; acesso Genbank n° NP_112571.1); e (36) TENB2 (suposta proteoglicana de transmembrana, relativo à família de EGF/heregulina de fatores de crescimento e folistatina, acesso Genbank n° AF179274); desde que o anticorpo não seja TA.1. - L é um ligante não-dissulfeto. L inclui, mas sem limitar-se às estruturas:
Figure img0001
em que as linhas onduladas indicam as ligações covalentes entre Ab e D;
Figure img0002
Figure img0003
- R é independentemente H ou alquila C1-C6; e n é 1 a 12; - D é uma porção de droga maitansinóide. Os maitansinóides incluem, mas sem limitar-se à estrutura:
Figure img0004
em que a linha ondulada indica a ligação covalente a L; - R é independentemente H ou alquila C1-C6; e - m é 1, 2 ou 3.
[0138] A razão entre droga e anticorpo ou a carga da droga é representada por p para compostos da Fórmula I. O valor de carga da droga p é de 1 a 8. Os compostos da Fórmula I incluem todas as misturas de conjugados de droga e anticorpo carregados de diversas formas e ligados, em que uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete e oito porções de droga são ligadas covalentemente ao anticorpo.
[0139] Em outra realização, Ab é anticorpo que se liga a um ou mais antígenos associados a tumores ou receptores da superfície celular selecionados a partir de (1) a (16) e (18) a (36), ou seja, não a receptor de ErbB, incluindo HER2.
ANTICORPOS
[0140] A unidade de anticorpo (Ab-) da Fórmula I inclui no seu escopo qualquer unidade de anticorpo que ligue ou associe-se reativamente ou forme complexos com receptor, antígeno ou outra porção receptiva associada à dada população de células alvo. Anticorpo pode ser qualquer proteína ou molécula similar à proteína que se ligue a uma porção de população celular, ou forme complexos ou reaja com ela, que busque ser modificada terapeuticamente ou biologicamente de outra forma. Em um aspecto, a unidade de anticorpo age para fornecer a porção de droga maitansinóide à população específica de células alvo com a qual a unidade de anticorpo reage. Esses anticorpos incluem, mas sem limitar-se a proteínas com alto peso molecular tais como anticorpos de comprimento total e fragmentos de anticorpos.
[0141] Os anticorpos que compreendem os conjugados de droga e anticorpo de acordo com a presente invenção retêm preferencialmente a capacidade de ligação aos antígenos dos seus parceiros nativos do tipo selvagem. Desta forma, os anticorpos de acordo com a presente invenção são capazes de ligar-se, de preferência especificamente, a antígenos. Esses antígenos incluem, por exemplo, antígenos associados a tumores (TAA), proteínas receptoras da superfície celular e outras moléculas da superfície celular, fatores reguladores da sobrevivência celular, fatores reguladores da proliferação celular, moléculas associadas (tais como conhecidas ou suspeitas de contribuírem funcionalmente) com o desenvolvimento ou diferenciação celular, linfoquinas, citoquinas, moléculas envolvidas na regulagem do ciclo celular, moléculas envolvidas na vasculogênese e moléculas associadas (tais como conhecidas ou suspeitas de contribuírem funcionalmente) com a angiogênese. O antígeno associado a tumor pode ser fator de diferenciação de conjuntos (ou seja, proteína CD). Um antígeno ao qual o anticorpo da presente invenção é capaz de ligar-se pode ser membro de subconjunto de uma das categorias mencionadas acima, em que o(s) outro(s) subconjunto(s) da mencionada categoria compreende(m) outras moléculas/antígenos que possuem característica distinta (com relação ao antígeno de interesse).
[0142] Em uma realização, o anticorpo dos conjugados de droga e anticorpo (ADC) liga-se especificamente ao receptor codificado por gene ErbB. O anticorpo pode ligar-se especificamente ao receptor ErbB selecionado a partir de EGFR, HER2, HER3 e HER4. O ADC pode ligar-se especificamente ao domínio extracelular (ECD) do receptor HER2 e inibir o crescimento de células tumorais que sobreexpressam receptor HER2. O anticorpo do ADC pode ser um anticorpo monoclonal, tal como um anticorpo monoclonal murino, um anticorpo quimérico ou um anticorpo humanizado. O anticorpo humanizado pode ser huMAb4D5-1, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5- 5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 ou huMAb4D5-8 (trastuzumab). O anticorpo pode ser um fragmento de anticorpo, tal como fragmento Fab.
[0143] Os anticorpos em conjugados de droga e anticorpo da Fórmula I (ADC) e que podem ser úteis no tratamento de câncer incluem, mas sem limitar-se a anticorpos contra receptores da superfície celular e antígenos associados a tumores (TAA). Esses antígenos associados a tumores são conhecidos na técnica e podem ser preparados para uso na geração de anticorpos utilizando métodos e informações que são bem conhecidos na técnica. Em tentativas de descobrir alvos celulares eficazes para terapia e diagnóstico de câncer, os pesquisadores buscaram identificar polipeptídeos associados a transmembrana ou tumor de outra forma que são expressos especificamente sobre a superfície de um ou mais tipos específicos de célula cancerosa em comparação com uma ou mais células não cancerosas normais. Frequentemente, esses polipeptídeos associados a tumores são expressos de forma mais abundante sobre a superfície das células cancerosas em comparação com a superfície das células não cancerosas. A identificação desses antígenos polipeptídicos da superfície celular associados a tumores gerou a capacidade de dirigir especificamente células cancerosas para destruição por meio de terapias com base em anticorpos.
[0144] Exemplos de TAA incluem, mas sem limitar-se a antígenos associados a tumores (1) a (36) relacionados abaixo. Por motivo de conveniência, as informações relativas a estes antígenos, todos os quais são conhecidos na técnica, são relacionadas abaixo e incluem nomes, nomes alternativos, números de acesso no Genbank e referência(s) primária(s), seguindo convenções de identificação de sequências de proteínas e ácidos nucléicos do Centro Nacional de Informações Biotecnológicas (NCBI). Sequências de proteínas e ácidos nucléicos correspondentes a TAA (1) a (36) são disponíveis em bancos de dados públicos, tais como o GenBank. Antígenos associados a tumores alvejados por anticorpos incluem todas as variantes e isoformas de sequências de aminoácidos que possuem pelo menos cerca de 70%, 80%, 85%, 90% ou 95% de identidade de sequências com relação às sequências identificadas nas referências mencionadas, ou que exibem substancialmente as mesmas propriedades biológicas ou características de TAA que contém sequência encontrada nas referências mencionadas. TAA que possui sequência variante, por exemplo, geralmente é capaz de ligar-se especificamente a anticorpo que se ligue especificamente a TAA com a sequência correspondente relacionada. As sequências e descrição na referência indicada especificamente no presente são expressamente incorporadas como referência. ANTÍGENOS ASSOCIADOS A TUMORES (1) A (36): (1) BMPR1B (receptor de proteína morfogenética óssea tipo IB, acesso Genbank n° NM_001203) ten Dijke, P. et al, Science 264 (5155): 101-104 (1994), Oncogene 14 (11): 1377-1382 (1997)); WO 2004063362 (reivindicação 2); WO 2003042661 (reivindicação 12); US 2003134790-A1 (págs. 38 e 39); WO 2002102235 (reivindicação 13; pág. 296); WO 2003055443 (págs. 91 e 92); WO 200299122 (Exemplo 2; págs. 528 a 530); WO 2003029421 (reivindicação 6); WO 2003024392 (reivindicação 2; Fig. 112); WO 200298358 (reivindicação 1; pág. 183); WO 200254940 (págs. 100 e 101); WO 200259377 (págs. 349 e 350); WO 200230268 (reivindicação 27; pág. 376); WO 200148204 (Exemplo; Fig. 4). NP_001194 receptor de proteína morfogenética óssea, tipo IB / pid = NP_001194.1 - Referências cruzadas: MIM: 603248; NP_001194.1; AY065994 (2) E16 (LAT1, SLC7A5, acesso Genbank n° NM_003486) Biochem. Biophys. Res. Commun. 255 (2), 283-288 (1999), Nature 395 (6699): 288-291 (1998), Gaugitsch, H. W. et al (1992), J. Biol. Chem. 267 (16): 11267-11273); WO 2004048938 (Exemplo 2); WO 2004032842 (Exemplo IV); WO 2003042661 (reivindicação 12); WO 2003016475 (reivindicação 1); WO 200278524 (Exemplo 2); WO 200299074 (reivindicação 19; págs. 127 a 129); WO 200286443 (reivindicação 27; págs. 222 e 393); WO 2003003906 (reivindicação 10; pág. 293); WO 200264798 (reivindicação 33; Págs. 93 e 95); WO 200014228 (reivindicação 5; págs. 133 a 136); US 2003224454 (Fig. 3); WO 2003025138 (reivindicação 12; pág. 150); US 20050107595; US 20050106644; NP_003477 família carreadora de soluto 7 (transportador de aminoácido catiônico, sistema y+), membro 5 / pid = NP_003477.3 - Homo sapiens Referências cruzadas: MIM:600182; NP_003477.3; NM_015923; NM_003486_1 (3) STEAP1 (antígeno epitelial de seis transmembranas da próstata, acesso Genbank n° NM_012449) Cancer Res. 61 (15), 5857-5860 (2001), Hubert, R. S. et al (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96 (25): 14523-14528); WO 2004065577 (reivindicação 6); WO 2004027049 (Fig. 1L); EP 1394274 (Exemplo 11); WO 2004016225 (reivindicação 2); WO 2003042661 (reivindicação 12); US 2003157089 (Exemplo 5); US 2003185830 (Exemplo 5); US 2003064397 (Fig. 2); WO 200289747 (Exemplo 5; págs. 618 e 619); WO 2003022995 (Exemplo 9; Fig. 13A, Exemplo 53; pág. 173, Exemplo 2; Fig. 2A); NP_036581 antígeno epitelial de seis transmembranas da próstata Referências cruzadas: MIM:604415; NP_036581.1; NM_012449_1 (4) 0772P (CA125, MUC16, acesso Genbank n° AF361486) J. Biol. Chem. 276 (29): 27371-27375 (2001)); WO 2004045553 (reivindicação 14); WO 200292836 (reivindicação 6; Fig. 12); WO 200283866 (reivindicação 15; págs. 116 a 121); US 2003124140 (Exemplo 16); US 2003091580 (reivindicação 6); WO 200206317 (reivindicação 6; págs. 400 a 408); Referências cruzadas: GI:34501467; AAK74120.3; AF361486_1 (5) MPF (MPF, MSLN, SMR, fator de potencialização de megacariócitos, mesotelina, acesso Genbank n° NM_005823) Yamaguchi, N. et al, Biol. Chem. 269 (2), 805-808 (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96 (20): 11531-11536 (1999), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93 (1): 136-140 (1996), J. Biol. Chem. 270 (37): 21984-21990 (1995)); WO 2003101283 (reivindicação 14); (WO 2002102235 (reivindicação 13; págs. 287 e 288); WO 2002101075 (reivindicação 4; págs. 308 e 309); WO 200271928 (págs. 320 e 321); WO 9410312 (págs. 52 a 57); Referências cruzadas: MIM:601051; NP_005814.2; NM_005823_1 (6) Napi3b (NAPI-3B, NPTIIb, SLC34A2, família carreadora de soluto 34 (fosfato de sódio), membro 2, transportador de fosfato dependente de sódio tipo II 3b, acesso Genbank n° NM_006424) J. Biol. Chem. 277 (22): 19665-19672 (2002), Genomics 62 (2): 281-284 (1999), Feild, J. A. et al (1999), Biochem. Biophys. Res. Commun. 258 (3): 578-582); WO 2004022778 (reivindicação 2); EP 1394274 (Exemplo 11); WO 2002102235 (reivindicação 13; pág. 326); EP 875569 (reivindicação 1; págs. 17 a 19); WO 200157188 (reivindicação 20; pág. 329); WO 2004032842 (Exemplo IV); WO 200175177 (reivindicação 24; págs. 139 e 140); Referências cruzadas: MIM:604217; NP_006415.1; NM_006424_1 (7) Sema 5b (FLJ10372, KIAA1445, Mm.42015, SEMA5B, SEMAG, Semaforin 5b Hlog, domínio sema, sete repetições de trombospondina (tipo 1 e similar a tipo 1), domínio de transmembrana (TM) e domínio citoplasmático curto, (semaforin) 5B, acesso Genbank n° AB040878) Nagase, T. et al (2000) DNA Res. 7 (2): 143-150); WO 2004000997 (reivindicação 1); WO 2003003984 (reivindicação 1); WO 200206339 (reivindicação 1; pág. 50); WO 200188133 (reivindicação 1; págs. 41 a 43, 48 a 58); WO 2003054152 (reivindicação 20); WO 2003101400 (reivindicação 11); Acesso: Q9P283; EMBL; AB040878; BAA95969.1. Genew; HGNC: 10737; (8) PSCA hlg (gene 2700050C12Rik, C530008O16Rik, RIKEN cDNA 2700050C12, RIKEN cDNA 2700050C12, acesso Genbank n° AY358628); Ross et al (2002), Cancer Res. 62: 2546-2553; US 2003129192 (reivindicação 2); US 2004044180 (reivindicação 12); US 2004044179 (reivindicação 11); US 2003096961 (reivindicação 11); US 2003232056 (Exemplo 5); WO 2003105758 (reivindicação 12); US 2003206918 (Exemplo 5); EP 1347046 (reivindicação 1); WO 2003025148 (reivindicação 20); Referências cruzadas: GI:37182378; AAQ88991.1; AY358628_1 (9) ETBR (receptor tipo B de endotelina, acesso Genbank n° AY275463); Nakamuta, M. et al, Biochem. Biophys. Res. Commun. 177, 3439, 1991; Ogawa, Y. et al, Biochem. Biophys. Res. Commun. 178, 248-255, 1991; Arai, H. et al, Jpn. Circ. J. 56, 1303-1307, 1992; Arai, H. et al, J. Biol. Chem. 268, 3463-3470, 1993; Sakamoto A., Yanagisawa M. et al, Biochem. Biophys. Res. Commun. 178, 656-663, 1991; Elshourbagy N. A. et al, J. Biol. Chem. 268, 3873-3879, 1993; Haendler B. et al, J. Cardiovasc. Pharmacol. 20, s1-S4, 1992; Tsutsumi M. et al, Gene 228, 43-49, 1999; Strausberg R. L. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 16899-16903, 2002; Bourgeois C. et al, J. Clin. Endocrinol. Metab. 82, 3116-3123, 1997; Okamoto Y. et al, Biol. Chem. 272, 21589-21596, 1997; Verheij J. B. et al, Am. J. Med. Genet. 108, 223-225, 2002; Hofstra R. M. W. et al, Eur. J. Hum. Genet. 5, 180-185, 1997; Puffenberger E. G. et al, Cell 79, 1257-1266, 1994; Attie T. et al, Hum. Mol. Genet. 4, 2407-2409, 1995; Auricchio A. et al, Hum. Mol. Genet. 5: 351-354, 1996; Amiel J. et al, Hum. Mol. Genet. 5, 355-357, 1996; Hofstra, R. M. W. et al, Nat. Genet. 12, 445-447, 1996; Svensson P. J. et al, Hum. Genet. 103, 145148, 1998; Fuchs, S. et al, Mol. Med. 7, 115-124, 2001; Pingault, V. et al (2002), Hum. Genet. 111, 198-206; WO 2004045516 (reivindicação 1); WO 2004048938 (Exemplo 2); WO 2004040000 (reivindicação 151); WO 2003087768 (reivindicação 1); WO 2003016475 (reivindicação 1); WO 2003016475 (reivindicação 1); WO 200261087 (Fig. 1); WO 2003016494 (Fig. 6); WO 2003025138 (reivindicação 12; pág. 144); WO 200198351 (reivindicação 1; págs. 124 e 125); EP 522868 (reivindicação 8; Fig. 2); WO 200177172 (reivindicação 1; págs. 297 a 299); US 2003109676; US 6.518.404 (Fig. 3); US 5.773.223 (reivindicação 1a; Col. 31 a 34); WO 2004001004; (10) MSG783 (RNF124, proteína hipotética FLJ20315, acesso Genbank n° NM_017763); WO 2003104275 (reivindicação 1); WO 2004046342 (Exemplo 2); WO 2003042661 (reivindicação 12); WO 2003083074 (reivindicação 14; pág. 61); WO 2003018621 (reivindicação 1); WO 2003024392 (reivindicação 2; Fig. 93); WO 200166689 (Exemplo 6); Referências cruzadas: LocusID:54894; NP_060233.2; NM_017763_1 (11) STEAP2 (HGNC_8639, IPCA-1, PCANAP1, STAMP1, STEAP2, STMP, gene 1 associado a câncer da próstata, proteína 1 associada a câncer da próstata, antígeno epitelial de seis transmembranas da próstata 2, proteína da próstata de seis transmembranas, acesso Genbank n° AF455138) Lab. Invest. 82 (11): 1573-1582 (2002)); WO 2003087306; US 2003064397 (reivindicação 1; Fig. 1); WO 200272596 (reivindicação 13; págs. 54 e 55); WO 200172962 (reivindicação 1; Fig. 4B); WO 2003104270 (reivindicação 11); WO 2003104270 (reivindicação 16); US 2004005598 (reivindicação 22); WO 2003042661 (reivindicação 12); US 2003060612 (reivindicação 12; Fig. 10); WO 200226822 (reivindicação 23; Fig. 2); WO 200216429 (reivindicação 12; Fig. 10); Referências cruzadas: GI:22655488; AAN04080.1; AF455138_1 (12) TrpM4 (BR22450, FLJ20041, TRPM4, TRPM4B, canal de cátions potencial de receptor transitório, subfamília M, membro 4, acesso Genbank n° NM_017636) Xu, X. Z. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 98 (19): 1069210697 (2001), Cell 109 (3): 397-407 (2002), J. Biol. Chem. 278 (33): 3081330820 (2003)); US 2003143557 (reivindicação 4); WO 200040614 (reivindicação 14; págs. 100 a 103); WO 200210382 (reivindicação 1; Fig. 9A); WO 2003042661 (reivindicação 12); WO 200230268 (reivindicação 27; pág. 391); US 2003219806 (reivindicação 4); WO 200162794 (reivindicação 14; Fig. 1A-D); Referências cruzadas: MIM:606936; NP_060106.2; NM_017636_1 (13) CRIPTO (CR, CR1, CRGF, CRIPTO, TDGF1, fator de crescimento derivado de teratocarcinoma, acesso Genbank n° NP_003203 ou NM_003212) Ciccodicola, A. et al, EMBO J. 8 (7): 1987-1991 (1989), Am. J. Hum. Genet. 49 (3): 555-565 (1991)); US 2003224411 (reivindicação 1); WO 2003083041 (Exemplo 1); WO 2003034984 (reivindicação 12); WO 200288170 (reivindicação 2; págs. 52 e 53); WO 2003024392 (reivindicação 2; Fig. 58); WO 200216413 (reivindicação 1; págs. 94-95, 105); WO 200222808 (reivindicação 2; Fig. 1); US 5.854.399 (Exemplo 2; Col. 17-18); US 5.792.616 (Fig. 2); Referências cruzadas: MIM:187395; NP_003203.1; NM_003212_1 (14) CD21 (CR2 (receptor de complemento 2) ou C3DR (C3d/receptor de vírus Epstein Barr) ou Hs.73792, acesso Genbank n° M26004) Fujisaku et al (1989), J. Biol. Chem. 264 (4): 2118-2125); Weis, J. J. et al, J. Exp. Med. 167, 1047-1066, 1988; Moore, M. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 84, 9194-9198, 1987; Barel, M. et al, Mol. Immunol. 35, 10251031, 1998; Weis, J. J. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 83, 5639-5643, 1986; Sinha, S. K. et al (1993), J. Immunol. 150, 5311-5320; WO 2004045520 (Exemplo 4); US 2004005538 (Exemplo 1); WO 2003062401 (reivindicação 9); WO 2004045520 (Exemplo 4); WO 9102536 (Fig. 9.1-9.9); WO 2004020595 (reivindicação 1); Acesso: P20023; Q13866; Q14212; EMBL; M26004; AAA35786.1. (15) CD79b (CD79B, CD79β, Igb (beta associado a imunoglobulina), B29, acesso Genbank n° NM_000626 ou 11038674) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. (2003) 100 (7): 4126-4131, Blood (2002) 100 (9): 3068-3076, Muller et al (1992), Eur. J. Immunol. 22 (6): 1621-1625); WO 2004016225 (reivindicação 2, Fig. 140); WO 2003087768, US 2004101874 (reivindicação 1, pág. 102); WO 2003062401 (reivindicação 9); WO 200278524 (Exemplo 2); US 2002150573 (reivindicação 5, pág. 15); US 5.644.033; WO 2003048202 (reivindicação 1, págs. 306 e 309); WO 99/558658, US 6.534.482 (reivindicação 13, Fig. 17A/B); WO 200055351 (reivindicação 11, págs. 1145 e 1146); Referências cruzadas: MIM:147245; NP_000617.1; NM_000626_1 (16) FcRH2 (IFGP4, IRTA4, SPAP1A (domínio SH2 que contém proteína âncora de fosfatase 1a), SPAP1B, SPAP1C, acesso Genbank n° NM_030764, AY358130) Genome Res. 13 (10): 2265-2270 (2003), Immunogenetics 54 (2): 87-95 (2002), Blood 99 (8): 2662-2669 (2002), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 98 (17): 9772-9777 (2001), Xu, M. J. et al (2001), Biochem. Biophys. Res. Commun. 280 (3): 768-775; WO 2004016225 (reivindicação 2); WO 2003077836; WO 200138490 (reivindicação 5; Figs. 18D-1 e 18D-2); WO 2003097803 (reivindicação 12); WO 2003089624 (reivindicação 25); Referências cruzadas: MIM:606509; NP_110391.2; NM_030764_1 (17) HER2 (ErbB2, acesso Genbank n° M11730) Coussens, L. et al, Science (1985) 230 (4730): 1132-1139); Yamamoto, T. et al, Nature 319, 230-234, 1986; Semba, K. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 82, 6497-6501, 1985; Swiercz, J. M. et al, J. Cell Biol. 165, 869-880, 2004; Kuhns, J. J. et al, J. Biol. Chem. 274, 36422-36427, 1999; Cho, H.-S. et al, Nature 421, 756-760, 2003; Ehsani, A. et al (1993), Genomics 15, 426-429; WO 2004048938 (Exemplo 2); WO 2004027049 (Fig. 1I); WO 2004009622; WO 2003081210; WO 2003089904 (reivindicação 9); WO 2003016475 (reivindicação 1); US 2003118592; WO 2003008537 (reivindicação 1); WO 2003055439 (reivindicação 29; Fig. 1A-B); WO 2003025228 (reivindicação 37; Fig. 5C); WO 200222636 (Exemplo 13; págs. 95 a 107); WO 200212341 (reivindicação 68; Fig. 7); WO 200213847 (págs. 71 a 74); WO 200214503 (págs. 114 a 117); WO 200153463 (reivindicação 2; págs. 41 a 46); WO 200141787 (pág. 15); WO 200044899 (reivindicação 52; Fig. 7); WO 200020579 (reivindicação 3; Fig. 2); US 5.869.445 (reivindicação 3; Col. 31-38); WO 9630514 (reivindicação 2; págs. 56 a 61); EP 1439393 (reivindicação 7); WO 2004043361 (reivindicação 7); WO 2004022709; WO 200100244 (Exemplo 3; Fig. 4); Acesso: P04626; EMBL; M11767; AAA35808.1. EMBL; M11761; AAA35808.1. (18) NCA (CEACAM6, acesso Genbank n° M18728); Barnett, T. et al, Genomics 3, 59-66, 1988; Tawaragi, Y. et al, Biochem. Biophys. Res. Commun. 150, 89-96, 1988; Strausberg, R. L. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99: 16899-16903, 2002; WO 2004063709; EP 1439393 (reivindicação 7); WO 2004044178 (Exemplo 4); WO 2004031238; WO 2003042661 (reivindicação 12); WO 200278524 (Exemplo 2); WO 200286443 (reivindicação 27; pág. 427); WO 200260317 (reivindicação 2); Acesso: P40199; Q14920; EMBL; M29541; AAA59915.1. EMBL; M18728; (19) MDP (DPEP1, acesso Genbank n° BC017023) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99 (26): 16899-16903 (2002)); WO 2003016475 (reivindicação 1); WO 200264798 (reivindicação 33; págs. 85 a 87); JP 05003790 (Fig. 6-8); WO 9946284 (Fig. 9); Referências cruzadas: MIM:179780; AAH17023.1; BC017023_1 (20) IL20Rα (IL20Ra, ZCYTOR7, acesso Genbank n° AF184971); Clark, H. F. et al, Genome Res. 13, 2265-2270, 2003; Mungall, A. J. et al, Nature 425, 805-811, 2003; Blumberg, H. et al, Cell 104, 9-19, 2001; Dumoutier, L. et al, J. Immunol. 167, 3545-3549, 2001; Parrish-Novak, J. et al, J. Biol. Chem. 277, 47517-47523, 2002; Pletnev, S. et al (2003), Biochemistry 42: 12617-12624; Sheikh, F. et al (2004), J. Immunol. 172, 2006-2010; EP 1394274 (Exemplo 11); US 2004005320 (Exemplo 5); WO 2003029262 (págs. 74 e 75); WO 2003002717 (reivindicação 2; pág. 63); WO 200222153 (págs. 45 e 47); US 2002042366 (págs. 20 e 21); WO 200146261 (págs. 57 a 59); WO 200146232 (págs. 63 a 65); WO 9837193 (reivindicação 1; págs. 55 a 59); Acesso: Q9UHF4; Q6UWA9; Q96SH8; EMBL; AF184971; AAF01320.1. (21) Brevican (BCAN, BEHAB, acesso Genbank n° AF229053) Gary, S. C. et al, Gene 256, 139-147, 2000; Clark, H. F. et al, Genome Res. 13, 2265-2270, 2003; Strausberg, R. L. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 16899-16903, 2002; US 2003186372 (reivindicação 11); US 2003186373 (reivindicação 11); US 2003119131 (reivindicação 1; Fig. 52); US 2003119122 (reivindicação 1; Fig. 52); US 2003119126 (reivindicação 1); US 2003119121 (reivindicação 1; Fig. 52); US 2003119129 (reivindicação 1); US 2003119130 (reivindicação 1); US 2003119128 (reivindicação 1; Fig. 52); US 2003119125 (reivindicação 1); WO 2003016475 (reivindicação 1); WO 200202634 (reivindicação 1); (22) EphB2R (DRT, ERK, Hek5, EPHT3, Tyro5, acesso Genbank n° NM_004442) Chan, J. e Watt, V. M., Oncogene 6 (6), 1057-1061 (1991), Oncogene 10 (5):897-905 (1995), Annu. Rev. Neurosci. 21: 309-345 (1989), Int. Rev. Cytol. 196: 177-244 (2000)); WO 2003042661 (reivindicação 12); WO 200053216 (reivindicação 1; pág. 41); WO 2004065576 (reivindicação 1); WO 2004020583 (reivindicação 9); WO 2003004529 (págs. 128 a 132); WO 200053216 (reivindicação 1; pág. 42); Referências cruzadas: MIM:600997; NP_004433.2; NM_004442_1 (23) ASLG659 (B7h, acesso Genbank n° AX092328) US 20040101899 (reivindicação 2); WO 2003104399 (reivindicação 11); WO 2004000221 (Fig. 3); US 2003165504 (reivindicação 1); US 2003124140 (Exemplo 2); US 2003065143 (Fig. 60); WO 2002102235 (reivindicação 13; pág. 299); US 2003091580 (Exemplo 2); WO 200210187 (reivindicação 6; Fig. 10); WO 200194641 (reivindicação 12; Fig. 7b); WO 200202624 (reivindicação 13; Fig. 1A-1B); US 2002034749 (reivindicação 54; págs. 45 e 46); WO 200206317 (Exemplo 2; págs. 320 e 321, reivindicação 34; págs. 321 e 322); WO 200271928 (págs. 468 e 469); WO 200202587 (Exemplo 1; Fig. 1); WO 200140269 (Exemplo 3; págs. 190 a 192); WO 200036107 (Exemplo 2; págs. 205 a 207); WO 2004053079 (reivindicação 12); WO 2003004989 (reivindicação 1); WO 200271928 (págs. 233 e 234, 452-453); WO 0116318; (24) PSCA (precursor de antígeno de célula tronco da próstata, acesso Genbank n° AJ297436) Reiter, R. E. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 1735-1740, 1998; Gu, Z. et al, Oncogene 19, 1288-1296, 2000; Biochem. Biophys. Res. Commun. (2000) 275 (3): 783-788; WO 2004022709; EP 1394274 (Exemplo 11); US 2004018553 (reivindicação 17); WO 2003008537 (reivindicação 1); WO 200281646 (reivindicação 1; pág. 164); WO 2003003906 (reivindicação 10; pág. 288); WO 200140309 (Exemplo 1; Fig. 17); US 2001055751 (Exemplo 1; Fig. 1b); WO 200032752 (reivindicação 18; Fig. 1); WO 9851805 (reivindicação 17; pág. 97); WO 9851824 (reivindicação 10; pág. 94); WO 9840403 (reivindicação 2; Fig. 1B); Acesso: O43653; EMBL; AF043498; AAC39607.1. (25) GEDA (acesso Genbank n° AY260763); Proteína de fusão a parceiro similar HMGIC lipoma AAP14954 / pid = AAP14954.1 - Homo sapiens Espécie: Homo sapiens (humanos) WO 2003054152 (reivindicação 20); WO 2003000842 (reivindicação 1); WO 2003023013 (Exemplo 3, reivindicação 20); US 2003194704 (reivindicação 45); Referências cruzadas: GI:30102449; AAP14954.1; AY260763_1 (26) BAFF-R (receptor de fator de ativação de células B, receptor BLyS 3, BR3, acesso Genbank n° AF116456); receptor BAFF / pid = NP_443177.1 - Homo sapiens Thompson J. S. et al, Science 293 (5537), 2108-2111 (2001); WO 2004058309; WO 2004011611; WO 2003045422 (Exemplo; págs. 32 e 33); WO 2003014294 (reivindicação 35; Fig. 6B); WO 2003035846 (reivindicação 70; págs. 615 e 616); WO 200294852 (Col. 136-137); WO 200238766 (reivindicação 3; pág. 133); WO 200224909 (Exemplo 3; Fig. 3); Referências cruzadas: MIM:606269; NP_443177.1; NM_052945_1; AF132600 (27) CD22 (receptor de células B isoforma CD22-B, BL-CAM, Lyb-8, Lyb8, SIGLEC-2, FLJ22814, acesso Genbank n° AK026467); Wilson et al (1991), J. Exp. Med. 173: 137-146; WO 2003072036 (reivindicação 1; Fig. 1); Referências cruzadas: MIM:107266; NP_001762.1; NM_001771_1 (28) CD79a (CD79A, CD79α, associados à imunoglobulina alfa, proteína de células B específica que interage covalentemente com Ig beta (CD79B) e forma complexo sobre a superfície com moléculas IgM, transduz sinal envolvido na diferenciação de células B) SEQUÊNCIA DE PROTEÍNAS completa mpggpgv...dvqlekp (1..226; 226 aa), pl: 4,84, MW: 25028 TM: 2 [P] Cromossomo Genético: 19q13.2, acesso Genbank n° NP_001774.10) WO 2003088808, US 20030228319; WO 2003062401 (reivindicação 9); US 2002150573 (reivindicação 4, págs. 13 e 14); WO 9958658 (reivindicação 13, Fig. 16); WO 9207574 (Fig. 1); US 5.644.033; Ha et al (1992), J. Immunol. 148 (5): 1526-1531; Mueller et al (1992), Eur. J. Biochem. 22: 1621-1625; Hashimoto et al (1994), Immunogenetics 40 (4): 287-295; Preud’homme et al (1992), Clin. Exp. Immunol. 90 (1): 141-146; Yu et al (1992), J. Immunol. 148 (2) 633-637; Sakaguchi et al (1988), EMBO J. 7 (11): 3457-3464; (29) CXCR5 (receptor de linfoma de Burkitt 1, receptor acoplado a proteína G que é ativado pela quemoquina CXCL13, funções em migração de linfócitos e defesa humoral, desempenha papel em infecções por HIV-2 e talvez no desenvolvimento da AIDS, linfoma, mieloma e leucemia) SEQUÊNCIA DE PROTEÍNAS completa mnypltl...atslttf (1..372; 372 aa), pI: 8,54, MW: 41959 TM: 7 [P] Cromossomo Genético: 11q23.3, acesso Genbank n° NP_001707.1) WO 2004040000; WO 2004015426; US 2003105292 (Exemplo 2); US 6.555.339 (Exemplo 2); WO 200261087 (Fig. 1); WO 200157188 (reivindicação 20, pág. 269); WO 200172830 (págs. 12 e 13); WO 200022129 (Exemplo 1, págs. 152 e 153, Exemplo 2, págs. 254 a 256); WO 9928468 (reivindicação 1, pág. 38); US 5.440.021 (Exemplo 2, col. 49-52); WO 9428931 (págs. 56 a 58); WO 9217497 (reivindicação 7, Fig. 5); Dobner et al (1992), Eur. J. Immunol. 22: 2795-2799; Barella et al (1995), Biochem. J. 309: 773-779; (30) HLA-DOB (subunidade beta da molécula de classe II do MHC (antígeno Ia) que liga peptídeos e os apresenta a linfócitos T CD4+) SEQUÊNCIA DE PROTEÍNAS completa mgsgwvp...vllpqsc (1..273; 273 aa, pI: 6,56, MW: 30820 TM: 1 [P] Cromossomo Genético: 6p21.3, acesso Genbank n° NP_002111.1) Tonnelle et al (1985), EMBO J. 4 (11): 2839-2847; Jonsson et al (1989), Immunogenetics 29 (6): 411-413; Beck et al (1992), J. Mol. Biol. 228: 433-441; Strausberg et al (2002), Proc. Natl. Acad. Sci U. S. A. 99: 1689916903; Servenius et al (1987), J. Biol. Chem. 262: 8759-8766; Beck et al (1996), J. Mol. Biol. 255: 1-13; Naruse et al (2002), Tissue Antigens 59: 512519; WO 9958658 (reivindicação 13, Fig. 15); US 6.153.408 (Col. 35-38); US 5.976.551 (col. 168-170); US 6.011.146 (col. 145-146); Kasahara et al (1989), Immunogenetics 30 (1): 66-68; Larhammar et al (1985), J. Biol. Chem. 260 (26): 14111-14119; (31) P2X5 (canal de íons 5 com portal de ligante P2X receptor purinérgico, canal de íons com portal de ATP extracelular, pode estar envolvido na transmissão sináptica e neurogênese, deficiência pode contribuir com a patofisiologia de instabilidade detrusora idiopática) SEQUÊNCIA DE PROTEÍNAS completa mgqagck...lephrst (1..422; 422 aa), pI: 7,63, MW: 47206 TM: 1 [P] Cromossomo Genético: 17p13.3, acesso Genbank n° NP_002552.2) Le et al (1997), FEBS Lett. 418 (1-2): 195-199; WO 2004047749; WO 2003072035 (reivindicação 10); Touchman et al (2000), Genome Res. 10: 165-173; WO 200222660 (reivindicação 20); WO 2003093444 (reivindicação 1); WO 2003087768 (reivindicação 1); WO 2003029277 (pág. 82); (32) CD72 (antígeno de diferenciação de células B CD72, Lyb- 2) SEQUÊNCIA DE PROTEÍNAS completa maeaity...tafrfpd (1..359; 359 aa), pI: 8,66, MW: 40225 TM: 1 [P] Cromossomo Genético: 9p13.3, acesso Genbank n° NP_001773.1) WO 2004042346 (reivindicação 65); WO 2003026493 (págs. 51 e 52, 57 e 58); WO 200075655 (págs. 105 e 106); Von Hoegen et al (1990), J. Immunol. 144 (12): 4870-4877; Strausberg et al (2002), Proc. Natl. Acad. Sci U. S. A. 99: 16899-16903; (33) LY64 (antígeno de linfócitos 64 (RP105), proteína de membrana do tipo I da família de repetição rica em leucinas (LRR), regula a apoptose e a ativação de células B, a perda de função é associada ao aumento da atividade da doença em pacientes com eritematose do lúpus sistêmico) SEQUÊNCIA DE PROTEÍNAS completa mafdvsc...rwkyqhi (1..661; 661 aa); pI: 6,20, MW: 74147 TM: 1 [P] Cromossomo Genético: 5q12, acesso Genbank n° NP_005573.1) US 2002193567; WO 9707198 (reivindicação 11, págs. 39-42); Miura et al (1996), Genomics 38 (3): 299-304; Miura et al (1998), Blood 92: 2815-2822; WO 2003083047; WO 9744452 (reivindicação 8, págs. 57 a 61); WO 200012130 (págs. 24 a 26); (34) FcRH1 (proteína 1 similar a receptor de Fc, suposto receptor para o domínio Fc de imunoglobulina que contém domínios ITAM e similares a Ig tipo C2, pode apresentar papel na diferenciação de linfócitos B) SEQUÊNCIA DE PROTEÍNAS completa mlprlll...vdyedam (1..429; 429 aa); pI: 5,28, MW: 46925 TM: 1 [P] Cromossomo Genético: 1q21-1q22, acesso Genbank n° NP_443170.1) WO 2003077836; WO 200138490 (reivindicação 6, Fig. 18E-1-18- E-2); Davis et al (2001), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 98 (17): 9772-9777; WO 2003089624 (reivindicação 8); EP 1347046 (reivindicação 1); WO 2003089624 (reivindicação 7); (35) IRTA2 (receptor da superfamília de imunoglobulina associado a translocação 2, suposto imunorreceptor com possíveis papéis no desenvolvimento de células B e linfomagênese; a desregulagem do gene por meio de translocação ocorre em algumas malignidades de células B) SEQUÊNCIA DE PROTEÍNAS completa mllwvil...assaphr (1..977; 977 aa), pI: 6,88, MW: 106468 TM: 1 [P] Cromossomo Genético: 1q21, acesso Genbank n° Humanos: AF343662, AF343663, AF343664, AF343665, AF369794, AF397453, AK090423, AK090475, AL834187, AY358085; camundongo: AK089756, AY158090, AY506558; NP_112571.1 WO 2003024392 (reivindicação 2, Fig. 97); Nakayama et al (2000), Biochem. Biophys. Res. Commun. 277 (1): 124-127; WO 2003077836; WO 200138490 (reivindicação 3, Fig. 18B-1-18B-2); (36) TENB2 (TMEFF2, tumorregulina, TPEF, HPP1, TR, suposta proteoglicana de transmembrana, relativo à família de EGF/heregulina de fatores de crescimento e folistatina) SEQUÊNCIA DE PROTEÍNAS completa mvlwesp...rastrli (1..374; 374 aa, Acesso NCBI: AAD55776, AAF91397, AAG49451, NCBI RefSeq: NP_057276; NCBI Gene: 23671; OMIM: 605734; SwissProt Q9UIK5; acesso Genbank n° AF179274; AY358907, CAF85723, CQ782436 WO 2004074320 (SEQ ID N° 810); JP 2004113151 (SEQ ID N° 2, 4, 8); WO 2003042661 (SEQ ID N° 580); WO 2003009814 (SEQ ID N° 411); EP 1295944 (págs. 69 e 70); WO 200230268 (pág. 329); WO 200190304 (SEQ ID N° 2706); US 2004249130; US 2004022727; WO 2004063355; US 2004197325; US 2003232350; US 2004005563; US 2003124579; US 6.410.506; US 6.642.006l; Horie et al (2000), Genomics 67: 146-152; Uchida et al (1999), Biochem. Biophys. Res. Commun. 266: 593-602; Liang et al (2000), Cancer Res. 60: 4907-12; Glynne-Jones et al (2001), Int. J. Cancer, quinze de outubro; 94 (2): 178-84.
PRODUÇÃO DE ANTICORPOS
[0145] Foram empregados vários métodos de produção de anticorpos monoclonais (MAbs). A tecnologia de hibridoma, que designa uma linhagem de células clonadas que produz um único tipo de anticorpo, utiliza as células de várias espécies, incluindo camundongos (murinos), hamsters, ratos e seres humanos. Outros métodos de preparação de MAbs, que incluem anticorpos quiméricos e humanizados, utilizam engenharia genética, ou seja, técnicas de DNA recombinante.
[0146] Os anticorpos policlonais podem ser elevados em animais por meio de injeções subcutâneas (sc) ou intraperitoneais (ip) do antígeno relevante e um adjuvante. Os anticorpos monoclonais são obtidos a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, ou seja, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos, exceto por possíveis mutações de ocorrência natural que podem estar presentes em quantidades menores.
[0147] Linhagens celulares de mieloma humano e heteromieloma humano/de camundongos também foram descritas para a produção de anticorpos monoclonais humanos (Kozbor (1984), J. Immunol., 133: 3001 e Brodeur et al, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, págs. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, 1987)). O meio de cultivo em que são cultivadas células de hibridoma é testado para determinar a produção de anticorpos monoclonais dirigidos ao antígeno. A especificidade de ligação dos anticorpos monoclonais produzidos por células de hibridoma pode ser determinada por meio de imunoprecipitação ou de um ensaio de ligação in vitro, tal como radioimunoensaio (RIA) ou ensaio imunoabsorvente ligado por enzimas (ELISA). A afinidade de ligação do anticorpo monoclonal pode ser determinada, por exemplo, por meio da análise Scatchard de Munson et al (1980), Anal. Biochem. 107: 220.
[0148] DNA que codifica os anticorpos monoclonais é facilmente isolado e sequenciado utilizando-se procedimentos convencionais (utilizando, por exemplo, sondas de oligonucleotídeos que são capazes de ligar-se especificamente a genes que codificam as cadeias leve e pesada de anticorpos murinos). As células do hibridoma servem de fonte preferida desse DNA. Uma vez isolado, o DNA pode ser colocado em vetores de expressão, que são transfectados em seguida para células hospedeiras, tais como células de E. coli, células COS de símios, células de Ovário de Hamster Chinês (CHO) ou células de mieloma que, de outra forma, não produzem proteína de anticorpo, para obter a síntese de anticorpos monoclonais nas células hospedeiras recombinantes (US 2005/0048572; US 2004/0229310). Artigos de análise sobre expressão recombinante em bactérias de DNA que codificam o anticorpo incluem Skerra et al (1993), Curr. Opinion in Immunol. 5: 256-262 e Pluckthun (1992), Immunol. Revs. 130: 151-188.
[0149] Em realização adicional, anticorpos monoclonais ou fragmentos de anticorpos podem ser isolados de bibliotecas de fagos de anticorpos geradas utilizando os métodos descritos em McCafferty et al (1990), Nature 348: 552-554. Clackson et al (1991), Nature 352: 624-628 e Marks et al (1991), J. Mol. Biol., 222: 581-597 descrevem o isolamento de anticorpos murinos e humanos, respectivamente, utilizando bibliotecas de fagos. Publicações subsequentes descrevem a produção de anticorpos humanos de alta afinidade (faixa de nM) por meio de mistura de cadeias (Marks et al (1992), Bio/Technology 10: 779-783), bem como infecções combinatórias e recombinação in vivo, como estratégia para a construção de bibliotecas de fagos muito grandes (Waterhouse et al (1993), Nuc. Acids. Res. 21: 22652266). Desta forma, estas técnicas são alternativas viáveis para as técnicas de hibridoma de anticorpos monoclonais tradicionais para o isolamento de anticorpos monoclonais.
[0150] O DNA pode também ser modificado, por exemplo, por meio da substituição da sequência de codificação por domínios constantes de cadeia leve e de cadeia pesada no lugar das sequências murinas homólogas (US 4.816.567); e Morrison et al (1984), Proc. Natl. Acad. Sci. (U. S. A., 81: 6851), ou por meio de ligação covalente da sequência de codificação de imunoglobulina com a sequência de codificação para um polipeptídeo não de imunoglobulina, no todo ou em parte.
[0151] Tipicamente, esses polipeptídeos não de imunoglobulina são substituídos pelos domínios constantes de um anticorpo ou são substituídos pelos domínios variáveis de um sítio de ligação aos antígenos de um anticorpo para criar um anticorpo bivalente quimérico que compreende um sítio de ligação aos antígenos que possui especificidade para um antígeno e outro sítio de ligação aos antígenos que possui especificidade para um antígeno diferente.
[0152] Segue-se uma descrição de exemplos de técnicas de produção dos anticorpos (Ab) utilizados nos conjugados de droga e anticorpo (ADC) de acordo com a presente invenção. A produção de anticorpos será ilustrada com referência a anticorpos anti-ErbB2, mas será evidente para os técnicos no assunto que anticorpos para outros membros da família de receptores de ErbB, bem como qualquer outro receptor ou antígeno associado a tumor ou alvo, podem ser produzidos e modificados de forma similar.
[0153] O antígeno ErbB2 a ser utilizado para a produção de anticorpos pode ser, por exemplo, forma solúvel do domínio extracelular de ErbB2 ou uma de suas partes que contém o epítopo desejado. Alternativamente, células que expressam ErbB2 na sua superfície celular, por exemplo, células NIH-3T3 transformadas para sobreexpressar ErbB2; ou linhagem de células de carcinoma, tais como células SK-BR-3 (Stancovski et al (1991), PNAS (USA) 88: 8691-8695), podem ser utilizadas para gerar anticorpos. Outras formas de ErbB2 úteis para a geração de anticorpos serão evidentes para os técnicos no assunto.
[0154] O Exemplo 1 descreve a produção de exemplo de anticorpo anti-ErbB2 humanizado. O anticorpo humanizado pode compreender, por exemplo, resíduos de regiões hipervariáveis não humanas incorporados a um domínio pesado variável humano e pode compreender adicionalmente uma substituição de região de estrutura (FR) em posição selecionada a partir do grupo que consiste de 69H, 71H e 73H, utilizando o sistema de numeração de domínios variáveis estabelecido em Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edição, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda MD (1991). Em uma realização, o anticorpo humanizado compreende substituições FR em duas ou todas as proteínas 69H, 71H e 73H.
[0155] Como alternativa para a humanização, podem ser gerados anticorpos humanos. É agora possível produzir, por exemplo, animais transgênicos (tais como camundongos) que são capazes, mediante imunização, de produzir repertório completo de anticorpos humanos na ausência da produção de imunoglobulina endógena (Jakobovits et al (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90: 2551; Jakobovits et al (1993), Nature 362: 255-258; Bruggermann et al (1993), Year in Immuno. 7: 33; e US 5.591.669; US 5.589.369; US 5.545.807).
[0156] Alternativamente, pode-se utilizar tecnologia de exibição de fagos (McCafferty et al (1990), Nature 348: 552-553) para produzir anticorpos humanos e fragmentos de anticorpos in vitro a partir de repertórios de genes de domínio variável (V) de imunoglobulina de doadores não imunizados (Johnson, Kevin S. e Chiswell, David J. (1993), Current Opinion in Structural Biology 3: 564-571). Um repertório de genes V de doadores humanos não imunizados pode ser construído e anticorpos para um conjunto diverso de antígenos (incluindo antígenos próprios) podem ser essencialmente isolados (Marks et al (1991), J. Mol. Biol. 222: 581-597, Griffith et al (1993), EMBO J. 12: 725-734; US 5.565.332; US 5.573.905). Anticorpos humanos também podem ser gerados por células B ativadas in vitro (US 5.567.610; US 5.229.275). São descritos anticorpos anti-ErbB2 humanos (US 5.772.997 e WO 97/00271).
[0157] Foram desenvolvidas diversas técnicas de produção de fragmentos de anticorpos. Tradicionalmente, estes fragmentos foram derivados por meio de digestão proteolítica de anticorpos intactos (vide, por exemplo, Morimoto et al (1992), Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117; e Brennan et al (1985), Science 229: 81). Fragmentos de anticorpos podem também ser produzidos diretamente por células hospedeiras recombinantes e pelas bibliotecas de fagos de anticorpos discutidas acima. Fragmentos de Fab’-SH podem ser recuperados diretamente de E. coli e acoplados quimicamente para formar fragmentos de F(ab’)2 (Carter et al (1992), Bio/Technology 10: 163-167). De acordo com outra abordagem, fragmentos de F(ab’)2 podem ser isolados diretamente a partir do cultivo de células hospedeiras recombinantes. Outros métodos de produção de fragmentos de anticorpos serão evidentes para os técnicos no assunto. Em outras realizações, o anticorpo selecionado é um fragmento de Fv de fita única (scFv). Vide WO 93/16185; US 5.571.894; e US 5.587.458. O fragmento de anticorpo pode também ser “anticorpo linear”, tal como descrito na Patente Norte-Americana n° 5.641.870, por exemplo. Esses fragmentos de anticorpos lineares podem ser monoespecíficos ou biespecíficos.
[0158] Anticorpos biespecíficos com especificidades de ligação para pelo menos dois epítopos diferentes (Millstein et al (1983), Nature 305: 537-539) podem ligar-se a dois epítopos diferentes da proteína ErbB2. Outros desses anticorpos podem combinar sítio de ligação ao ErbB2 com sítio(s) de ligação para EGFR, ErbB3 e/ou ErbB4. Alternativamente, um braço de ligação anti-ErbB2 pode ser combinado com um braço que se ligue a uma molécula acionadora sobre um leucócito, tal como uma molécula receptora de células T (por exemplo, CD2 ou CD3), ou receptores de Fc para IgG (FcyR), tais como FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) e FcyRIII (CD16), de forma a dirigir mecanismos de defesa celular para a célula que expressa ErbB2. Anticorpos biespecíficos também podem ser utilizados para localizar agentes citotóxicos para células que expressam ErbB2 (WO 96/16673; US 5.837.234; WO 98/02463; US 5.821.337). Foram descritos métodos de purificação para anticorpos biespecíficos (WO 93/08829; Traunecker et al (1991), EMBO J. 10: 3655-3659; WO 94/04690; Suresh et al (1986), Methods in Enzymology 121: 210; US 5.731.168). Anticorpos biespecíficos podem ser produzidos utilizando fechos de leucina (Kostelny et al (1992), J. Immunol. 148 (5): 1547-1553) e dímeros de Fv de cadeia única (sFv) (Gruber et al (1994), J. Immunol. 152: 5368).
[0159] Foram também descritos métodos de geração de anticorpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticorpos, utilizando, por exemplo, ligação química em que anticorpos intactos são divididos proteoliticamente para gerar fragmentos de F(ab’)2 (Brennan et al (1985), Science 229: 81). Fragmentos de Fab’-SH podem ser recuperados a partir de E. coli e acoplados quimicamente para formar anticorpos biespecíficos (Shalaby et al (1992), J. Exp. Med. 175: 217-225). A tecnologia de “diacorpos (diabodies)” fornece método alternativo de elaboração de fragmentos de anticorpos biespecíficos (Hollinger et al (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 90: 6444-6448).
[0160] São contemplados anticorpos com mais de duas valências. Anticorpos multivalentes, “Octopus”, com três ou mais sítios de ligação aos antígenos e dois ou mais domínios variáveis podem ser facilmente produzidos por meio de expressão recombinante de ácido nucléico codificador das cadeias de polipeptídeos do anticorpo (US 2002/0004586; WO 01/77342). Podem ser preparados, por exemplo, anticorpos triespecíficos (Tutt et al (1991), J. Immunol. 147: 60).
[0161] É (são) contemplada(s) modificação(ões) nas sequências de aminoácidos de anticorpos. Mutantes e várias isoformas de anticorpos que se liguem a antígenos associados a tumores, por exemplo, são contemplados para aprimorar a afinidade de ligação e/ou outras propriedades biológicas do anticorpo. As sequências de aminoácidos variantes de anticorpo são preparadas por meio da introdução de mudanças de nucleotídeos apropriadas no ácido nucléico que codifica o anticorpo, ou por meio da síntese de peptídeos. Essas modificações incluem, por exemplo, deleções e/ou inserções e/ou substituições de resíduos nas sequências de aminoácidos do anticorpo. Qualquer combinação de deleção, inserção e substituição são feitas para chegar à construção final, desde que a construção final possua as características desejadas. As mudanças de aminoácidos podem também alterar processos pós-tradução do anticorpo, tais como a mudança do número ou posição de locais de glicosilação.
[0162] Um método útil de identificação de certos resíduos ou regiões do anticorpo que são locais preferidos para mutagênese é denominado “mutagênese de varrimento de alanina”, conforme descrito por Cunningham e Wells (1989), Science 244: 1081-1085, em que um resíduo de aminoácido ou grupo de resíduos desejados é identificado (por exemplo, resíduos carregados, tais como arg, asp, his, lys e glu) e substituído por um aminoácido neutro ou negativamente carregado (de maior preferência alanina ou polialanina) para otimizar a interação dos aminoácidos com o antígeno. As inserções nas sequências de aminoácidos incluem fusões de carboxila e/ou amino terminais que variam de comprimento de um resíduo até polipeptídeos que contenham cem ou mais resíduos, bem como inserções intra-sequenciais de resíduos de aminoácidos isolados ou múltiplos. Exemplos de inserções terminais incluem um anticorpo anti-ErbB2 com um resíduo de metionila N-terminal ou o anticorpo fundido a um polipeptídeo citotóxico. Outras variantes de inserção da molécula de anticorpo anti-ErbB2 incluem a fusão ao N ou C terminal do anticorpo anti- ErbB2 a uma enzima (por exemplo, para ADEPT: Tietze et al (2003), Current Pharm. Design 9: 2155-2175) ou polipeptídeo que aumenta a meia vida em soro do anticorpo, tal como peptídeo de ligação à albumina.
[0163] A ligação de proteínas plasmáticas pode ser um meio eficaz de melhoria das propriedades farmacocinéticas de moléculas de vida curta. Albumina é a proteína mais abundante no plasma. Peptídeos de ligação à albumina de soro (ABP) podem alterar a farmacodinâmica de proteínas de domínio ativo fundido, que incluem a alteração da absorção, penetração e difusão de tecido. Estes parâmetros farmacodinâmicos podem ser modulados por meio de seleção específica da sequência de peptídeos de ligação à albumina de soro apropriada (US 20040001827). Uma série de peptídeos de ligação à albumina foi identificada por meio de seleção de exibição de fagos (Dennis et al (2002), Albumin Binding as a General Strategy for Improving the Pharmacokinetics of Proteins, J. Biol. Chem. 277: 35035-35043; WO 01/45746). Os compostos de acordo com a presente invenção incluem as sequências de ABP ensinadas por: (i) Dennis et al (2002), J. Biol. Chem. 277: 35035-35043 nas Tabelas III e IV, pág. 35038; (ii) US 20040001827 em [0076] SEQ ID N° 9 a 22; e (iii) WO 01/45746 nas páginas 12 e 13, SEQ ID N° z1 a z14 todos os quais são incorporados ao presente como referência.
[0164] A sequência de aminoácidos normalmente é alterada por meio de alteração da sequência de ácidos nucléicos subjacentes. Moléculas de ácidos nucléicos que codificam a sequência de aminoácidos variantes do anticorpo são preparadas por meio de uma série de métodos conhecidos na técnica. Estes métodos incluem, mas sem limitar-se ao isolamento a partir de fonte natural (no caso de sequências de aminoácidos variantes de ocorrência natural) ou preparação por meio de mutagênese mediada por oligonucleotídeo (ou dirigida para local), mutagênese de PCR e mutagênese de conjunto de uma variante preparada anteriormente ou versão não variante do anticorpo. Os locais de maior interesse para mutagênese de substituição incluem as regiões hipervariáveis, mas também são contempladas alterações de FR.
[0165] Modificações substanciais das propriedades biológicas do anticorpo são atingidas por meio da seleção de substituições que difiram significativamente de efeito sobre a manutenção (a) da estrutura da cadeia principal de polipeptídeo na área da substituição, por exemplo, na forma de folha ou em conformação helicoidal; (b) da carga ou hidrofobicidade da molécula no local desejado; ou (c) do volume da cadeia lateral. Os resíduos de ocorrência natural são divididos em grupos com base nas propriedades comuns da cadeia lateral: (1) hidrofóbicos: norleucina, met, ala, val, leu, ile; (2) hidrofílicos neutros: cys, ser, thr; (3) ácidos: asp, glu; (4) básicos: asn, gln, his, lys, arg; (5) resíduos que influenciam a orientação de cadeias: gly, pro; e (6) aromáticos: trp, tyr, phe.
[0166] Substituições não conservadoras causarão a substituição de um membro de uma dessas classes por outra classe.
[0167] Qualquer resíduo de cisteína não envolvido na manutenção da conformação adequada do anticorpo pode também ser substituído, geralmente com serina, para aprimorar a estabilidade oxidativa da molécula e evitar reticulamento aberrante. Por outro lado, ligação(ões) de cisteína pode(m) ser adicionada(s) ao anticorpo para aumentar a sua estabilidade (particularmente quando o anticorpo for fragmento de anticorpo, tal como fragmento de Fv).
[0168] Para aumentar a meia vida do anticorpo em soro, pode-se incorporar um epítopo de ligação ao receptor recuperado ao anticorpo (especialmente um fragmento de anticorpo), conforme descrito, por exemplo, em US 5.739.277. Da forma utilizada no presente, a expressão “epítopo de ligação ao receptor recuperado” designa um epítopo da região Fc de uma molécula de IgG (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4) que é responsável pelo aumento da meia vida em soro in vivo da molécula de IgG (US 2003/0190311, US 6.821.505, US 6.165.745, US 5.624.821, US 5.648.260, US 6.165.745 e US 5.834.597).
[0169] Variantes de glicosilação de anticorpos são variantes em que o padrão de glicosilação de um anticorpo é alterado. Alteração indica a deleção de uma ou mais porções de carboidrato encontradas no anticorpo, adição de uma ou mais porções de carboidrato ao anticorpo, alteração da composição de glicosilação (padrão de glicosilação) ou a extensão da glicosilação.
[0170] Os anticorpos podem ser glicosilados em posições conservadas (N-ligadas ou O-ligadas) nas suas regiões constantes (Hse et al (1997), J. Biol. Chem. 272: 9062-9070; Jefferis e Lund (1997), Chem. Immunol. 65: 111-128; Wright e Morrison (1997), TibTECH 15: 26-32). As cadeias laterais de oligossacarídeos das imunoglobulinas afetam a função da proteína (Boyd et al (1996), Mol. Immunol. 32: 1311-1318; Wittwe e Howard (1990), Biochem. 29: 4175-4180) e a interação intramolecular entre porções da glicoproteína que podem afetar a confirmação e apresentaram superfície tridimensional da glicoproteína (Hefferis e Lund, acima; Wyss e Wagner (1996), Current Opin. Biotech. 7: 409-416). Os oligossacarídeos podem também servir para dirigir uma dada glicoproteína a certas moléculas com base em estruturas de reconhecimento específicas (Malhotra et al (1995), Nature Med. 1: 237-243; Umana et al (1999), Nature Biotech. 17: 176-180). A remoção dos oligossacarídeos pode otimizar a ligação aos antígenos e outras propriedades do anticorpo (Boyd et al (1996), Mol. Immunol. 32: 1311-1318).
[0171] Os fatores que afetam a glicosilação durante a produção recombinante de anticorpos incluem o modo de crescimento, formulação dos meios, densidade do cultivo, oxigenação, pH, esquemas de purificação e similares (US 5.074.335, US 5.510.261, US 5.278.299). Glicosilação ou certos tipos de glicosilação podem ser removidos enzimaticamente da glicoproteína, utilizando, por exemplo, endoglicosidase H (Endo H). Além disso, a célula hospedeira recombinante pode ser elaborada geneticamente, tal como tornada defeituosa no processamento de certos tipos de polissacarídeos. Estes e outros métodos similares são bem conhecidos na técnica.
[0172] A estrutura de glicosilação de anticorpos pode ser facilmente analisada por meio de métodos convencionais de análise de carboidratos, que incluem cromatografia de lectinas, NMR, espectrometria de massa, HPLC, GPC, análise da composição de monossacarídeos, digestão enzimática sequencial e HPAEC-PAD, que utiliza cromatografia de troca de ânions de alto pH para separar os oligossacarídeos com base na carga. Também são conhecidos métodos de liberação de oligossacarídeos para propósitos analíticos, que incluem, sem limitação, tratamento enzimático (comumente realizado utilizando peptídeo-N-glicosidase F/endo-β- galactosidase), eliminação utilizando ambiente alcalino severo para liberar principalmente estruturas O-ligadas e métodos químicos que utilizam hidrazina anidra para liberar oligossacarídeos N e O-ligados.
PORÇÕES DE DROGAS MAITANSINÓIDES
[0173] Os compostos de maitansina inibem a proliferação celular por meio da inibição da formação de microtúbulos durante a mitose, inibindo a polimerização da proteína de microtubulina, tubulina (Remillard et al (1975), Science 189: 1002-1005; US 5.208.020). Maitansina e maitansinóides são altamente citotóxicos, mas seu uso clínico em terapia de câncer foi grandemente limitado pelos seus severos efeitos colaterais sistêmicos, atribuídos principalmente à sua má seletividade para tumores. Testes clínicos com maitansina foram suspensos devido a sérios efeitos adversos sobre o sistema nervoso central e o sistema gastrointestinal (Issel et al (1978), Can. Treatment. Rev. 5: 199-207).
[0174] Porções de drogas maitansinóides são porções de drogas atrativas em conjugados de droga e anticorpo porque são: (i) relativamente acessíveis para preparação por meio de fermentação ou modificação química, derivação de produtos de fermentação, (ii) propensas à derivação com grupos funcionais apropriados para conjugação por meio dos ligantes não-dissulfeto a anticorpos, (iii) estáveis no plasma e (iv) eficazes contra uma série de linhagens de células de tumores.
[0175] Os compostos de maitansina apropriados para uso como porções de drogas maitansinóides são bem conhecidos na técnica e podem ser isolados a partir de fontes naturais de acordo com métodos conhecidos, produzidos utilizando técnicas de engenharia genética (vide Yu et al (2002), PNAS 99: 7968-7973) ou maitansinol e análogos de maitansinol preparados sinteticamente de acordo com métodos conhecidos.
[0176] Exemplos de porções de drogas maitansinóides incluem as que possuem anel aromático modificado, tais como: C-19-decloro (US 4.256.746) (preparado por meio de redução com hidreto de alumínio e lítio de ansamitocin P2); C-20-hidróxi (ou C-20-demetila) +/- C-19-decloro (Patentes Norte-Americanas n° 4.361.650 e 4.307.016) (preparado por meio de desmetilação utilizando Streptomyces ou Actinomyces ou descloração utilizando LAH); e C-20-demetóxi, C-20-acilóxi (-OCOR), +/- decloro (US 4.294.757) (preparado por meio de acilação utilizando cloretos acila) e os que possuem modificações em outras posições.
[0177] Exemplos de porções de drogas maitansinóides incluem as que possuem modificações tais como: C-9-SH, preparada por meio da reação de maitansinol com H2S ou P2S5 (US 4.424.219); C-14- alcoximetil(demetóxi/CH2 OR) (US 4.331.598); C-14-hidroximetila ou aciloximetila (CH2OH ou CH2OAc) preparado a partir de Nocardia (US 4.450.254); C-15-hidróxi/acilóxi, preparado por meio da conversão de maitansinol por Streptomyces (US 4.364.866); C-15-metóxi, isolado a partir de Trewia nudlflora (US 4.313.946 e US 4.315.929); C-18-N-demetila, preparado por meio de desmetilação de maitansinol por Streptomyces (US 4.362.663 e US 4.322.348); e 4,5-deóxi, preparado por meio de redução com tricloreto de titânio/LAH de maitansinol (US 4.371.533).
[0178] Muitas posições sobre compostos de maitansina são conhecidamente úteis como posição de ligação, dependendo do tipo de ligação. Para formar ligação éster, por exemplo, a posição C-3 que contém um grupo hidroxila, a posição C-14 modificada com hidroximetila, a posição C-15 modificada com grupo hidroxila e a posição C-20 que contém um grupo hidroxila são todas apropriadas.
[0179] Porções de droga maitansinóides (D) incluem as que possuem a estrutura:
Figure img0005
em que a linha ondulada indica a ligação covalente do átomo de enxofre de D a um ligante (L) de um conjugado de droga e anticorpo (ADC). R pode ser independentemente H ou alquila C1-C6. A cadeia de alquileno que liga o grupo amida ao átomo de enxofre pode ser metanila, etanila ou propila, ou seja, m é 1, 2 ou 3 (US 633.410, 5.208.020, Chari et al (1992), Cancer Res. 52: 127-131; Liu et al (1996), Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 8618-8623).
[0180] Todos os estereoisômeros da porção de droga maitansinóide são contemplados para os compostos de acordo com a presente invenção, ou seja, qualquer combinação de configurações R e S nos carbonos quirais de D. Em uma realização, a porção de droga maitansinóide (D) terá a estereoquímica a seguir:
Figure img0006
[0181] As realizações de D incluem: DM1 (N2’-deacetil-N2’-(3-mercapto-1-oxopropil)-maitansina) em que (CR2)m = CH2CH2;
Figure img0007
DM3 (N2’-deacetil-N-2’(4-mercapto-1-oxopentil)-maitansina) em que (CR2)m = CH2CH2CH(CH3);
Figure img0008
DM4 (N2’-deacetil-N2’-(4-metil-4-mercapto-1-oxopentil)-maitansina) em que (CR2)m = CH2CH2C(CH3)2:
Figure img0009
[0182] A obstrução estérica conferida por grupos alquila tais como os grupos metila sobre o carbono adjacente ao átomo de enxofre de DM3 e DM4 pode afetar a velocidade de divisão intracelular do ADC (US 2004/0235840 A1). A unidade alquila variável (CR2)m pode afetar, portanto, a potência, eficácia e segurança/toxicidade in vitro e in vivo.
LIGANTES
[0183] O ligante, L, liga o anticorpo a uma porção de droga por meio de ligação(ões) covalente(s) que não compreende(m) grupo dissulfeto. O ligante é porção bifuncional ou multifuncional que pode ser utilizada para ligar uma ou mais porções de droga (D) e uma unidade de anticorpo (Ab) para formar conjugados de droga e anticorpo (ADC) da Fórmula I. Conjugados de droga e anticorpo (ADC) podem ser preparados convenientemente utilizando ligante que possui funcionalidade reativa para ligação à Droga e ao Anticorpo. Tiol de cisteína, ou uma amina, tal como cadeia lateral de aminoácidos ou N- terminal tal como lisina, do anticorpo (Ab) pode formar ligação com grupo funcional de reagente ligante, porção de droga ou reagente de ligante e droga.
[0184] Os ligantes são preferencialmente estáveis extracelularmente. Antes do transporte ou do fornecimento para célula, o conjugado de droga e anticorpo (ADC) é preferencialmente estável e permanece intacto, ou seja, o anticorpo permanece ligado à porção de droga. Os ligantes são estáveis fora da célula alvo e podem ser divididos em alguma velocidade eficaz no interior da célula. Ligante eficaz: (i) manterá as propriedades de ligação específicas do anticorpo; (ii) permitirá o fornecimento intracelular do conjugado ou porção de droga; (iii) permanecerá estável e intacto, ou seja, não dividido, até que o conjugado tenha sido fornecido ou transportado para o seu sítio dirigido; e (iv) manterá efeito citotóxico de morte celular ou efeito citostático da porção de droga maitansinóide. A estabilidade do ADC pode ser medida por meio de métodos analíticos padrão tais como espectroscopia de massa, HPLC e a técnica de separação/análise LC/MS.
[0185] A ligação covalente do anticorpo e da porção de droga necessita que o ligante contenha dois grupos funcionais reativos, ou seja, bivalência em sentido reativo. Reagentes ligantes bivalentes que são úteis para ligação de duas ou mais porções funcionais ou biologicamente ativas, tais como peptídeos, ácidos nucléicos, drogas, toxinas, anticorpos, haptenos e grupos relatores são conhecidos e foram descritos métodos para seus conjugados resultantes (Hermanson, G. T. (1996), Bioconjugate Techniques; Academic Press: Nova Iorque, págs. 234 a 242).
[0186] Os ligantes podem possuir estruturas selecionadas a partir de
Figure img0010
em que as linhas onduladas indicam as ligações covalentes ao Ab e D em qualquer orientação. X pode possuir as seguintes estruturas, em qualquer orientação:
Figure img0011
em que R é independentemente H ou alquila C1-C6; e n é 1 a 12. Y pode possuir as seguintes estruturas, em qualquer orientação:
Figure img0012
em que R é independentemente H ou alquila C1-C6; e n é 1 a 12.
[0187] O ligante pode possuir, por exemplo, a estrutura denominada SMCC:
Figure img0013
[0188] Em outra realização, o ligante (L) possui a estrutura:
Figure img0014
em que as linhas onduladas indicam as ligações covalentes a Ab e D em qualquer orientação.
[0189] O ligante pode possuir, por exemplo, a estrutura denominada SIAB:
Figure img0015
[0190] Em outra realização, o ligante (L) possui a estrutura:
Figure img0016
[0191] Em outra realização, o ligante pode ser substituído com grupos que modularam a solubilidade ou reatividade. Substituinte sulfonato, por exemplo, pode aumentar a solubilidade em água do reagente e facilitar a reação de acoplamento do reagente ligante com o anticorpo ou a porção de droga ou facilitar a reação de acoplamento de Ab-L com D, ou D-L com Ab, dependendo da via sintética empregada para a preparação do ADC.
[0192] Em outra realização, ligante possui grupo funcional reativo que contém grupo nucleofílico que é reativo a grupo eletrofílico presente sobre anticorpo. Grupos eletrofílicos úteis sobre anticorpo incluem, mas sem limitar- se a grupos aldeído e cetona carbonila. O heteroátomo de grupo nucleofílico de ligante pode reagir com grupo eletrofílico sobre anticorpo e forma ligação covalente a uma unidade de anticorpo. Grupos nucleofílicos úteis sobre ligante incluem, mas sem limitar-se a hidrazida, oxima, amino, hidrazina, tiosemicarbazona, carboxilato de hidrazina e aril hidrazida. O grupo eletrofílico em um anticorpo fornece local conveniente para ligação a ligante.
[0193] Os ligantes podem ser peptídicos, que compreendem uma ou mais unidades de aminoácidos. Os reagentes ligantes de peptídeos podem ser preparados por meio de métodos de síntese de fase sólida ou fase líquida (E. Schroder e K. Lubke, The Peptides, volume 1, págs. 76-136 (1965), Academic Press), que são bem conhecidos no campo de química de peptídeos, incluindo química t-BOC (Geiser et al, Automation of Solid-Phase Peptide Synthesis, em Macromolecular Sequencing and Synthesis, Alan R. Liss, Inc., 1988, págs. 199-218) e química de Fmoc/HBTU (Fields, G. e Noble, R. (1990), Solid Phase Peptide Synthesis Utilizing 9-Fluoroenylmethoxycarbonyl Amino Acids, Int. J. Peptide Protein Res. 35: 161-214) em sintetizador automatizado tal como o Sintetizador de Peptídeos Rainin Symphony (Protein Technologies, Inc., Tucson AZ) ou Modelo 433 (Applied Biosystems, Foster City CA).
[0194] Os compostos contemplam expressamente, mas sem limitar-se a, ADC preparado com reagentes reticulantes: BMPEO, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC, sulfo-SMPB e SVSB (benzoato de succinimidil-(4-vinilsulfona)), incluindo os reagentes de bis-maleimida: DTME, BMB, BMDB, BMH, BMOE, BM(PEO)3 e BM(PEO)4, que são disponíveis comercialmente por meio da Pierce Biotechnology, Inc., Customer Service Department, P. O. Box 117, Rockford IL 61105, Estados Unidos, E. U. A. 1-800-874-3723, Internacional +815 968-0747. Vide págs. 467 a 498, 2003-2004 Applications Handbook and Catalog. Reagentes de bis-maleimida permitem a ligação de um grupo tiol livre de um resíduo de cisteína, de um anticorpo, a uma porção de droga que contém tiol, marca ou ligante intermediário, de forma sequencial ou simultânea. Outros grupos funcionais além da maleimida, que são reativos com grupo tiol do anticorpo, porção de droga maitansinóide ou intermediário ligante incluem iodoacetamida, bromoacetamida, vinil piridina, dissulfeto, dissulfeto de piridila, isocianato e isotiocianato.
Figure img0017
[0195] Exemplos de conjugados de droga e anticorpo em que DM1 é ligado por meio de um ligante BMPEO a um grupo tiol de trastuzumab
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[0196] Reagentes ligantes úteis também podem ser obtidos por meio de outras fontes comerciais, tais como Molecular Biosciences Inc. (Boulder CO) ou sintetizados de acordo com os procedimentos descritos em Toki et al (2002), J. Org. Chem. 67: 1866-1872; US 6.214.345 de Firestone et al; WO 02/088172; US 2003130189; US 2003096743; WO 03/026577; WO 03/043583 e WO 04/032828.
[0197] O ligante pode ser ligante do tipo dendrítico para ligação covalente de mais de uma porção de droga por meio de porção ligante multifuncional de ramificação a um anticorpo (Sun et al (2002), Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12: 2213-2215; Sun et al (2003), Bioorganic & Medicinal Chemistry 11: 1761-1768; King et al (2002), Tetrahedron Letters 43: 1987-1990). Ligantes dendríticos podem aumentar a razão molar entre droga e anticorpo, ou seja, a carga, que é relativa à potência do ADC. Desta forma, quando um anticorpo contém apenas um grupo tiol de cisteína reativo, uma série de porções de droga pode ser ligada por meio de ligante dendrítico.
[0198] Os exemplos de realizações de reagentes ligantes dendríticos a seguir permitem a conjugação de até nove reagentes de porções de drogas nucleofílicas por meio de reação com os grupos funcionais de mostarda de nitrogênio cloroetila:
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CARREGAMENTO DE DROGAS
[0199] O carregamento de drogas é representado por p em uma molécula da Fórmula I, a quantidade média de drogas maitansinóide por anticorpo. O carregamento de drogas pode variar de uma a oito drogas (D) por anticorpo (Ab), ou seja, em que uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete e oito porções de drogas são ligadas covalentemente ao anticorpo. As composições de ADC da Fórmula I incluem coleções de anticorpos conjugados com uma série de drogas, de 1 a 8. A quantidade média de drogas por anticorpo em preparações de ADC a partir de reações de conjugação pode ser caracterizada por meios convencionais tais como espectroscopia de massa, teste ELISA, eletroforese e HPLC. A distribuição quantitativa de ADC em termos de p pode também ser determinada. Por ELISA, pode-se determinar o valor médio de p em preparação específica de ADC (Hamblett et al (2004), Clinical Cancer Res. 10: 7063-7070; Sanderson et al (2005), Clinical Cancer Res. 11: 843-852). Entretanto, a distribuição de valores p (droga) não é discernível pela ligação de anticorpo e antígeno e limitação de detecção de ELISA. Além disso, o teste ELISA para a detecção de conjugados de anticorpo e droga não determina onde as porções de drogas são ligadas ao anticorpo, tal como fragmentos de cadeia leve ou cadeia pesada, ou os resíduos de aminoácidos específicos. Em alguns casos, a separação, purificação e caracterização de ADC homogêneo em que p é certo valor a partir de ADC com outras cargas de droga pode ser atingida por meios tais como HPLC de fase reversa ou eletroforese.
[0200] Para alguns conjugados de droga e anticorpo, p pode ser limitado pelo número de sítios de ligação no anticorpo. Quando a ligação for tiol de cisteína, como nos exemplos de realizações acima, um anticorpo pode conter apenas um ou vários grupos tiol de cisteína, ou pode conter apenas um ou vários grupos tiol suficientemente relativos por meio dos quais pode-se ligar um ligante. Cargas de droga mais altas, tais como p > 5, podem causar agregação, insolubilidade, toxicidade ou perda da permeabilidade celular de certos conjugados de droga e anticorpo.
[0201] Tipicamente, quantidade menor que a máxima teórica de porções de droga é conjugada a anticorpo durante reação de conjugação. Um anticorpo pode conter, por exemplo, vários resíduos de lisina que não reagem com o intermediário de droga-ligante (D-L) ou o reagente ligante. Somente os grupos lisina mais reativos podem reagir com reagente ligante reativo de amina. Além disso, somente os grupos tiol de cisteína mais reativos podem reagir com reagente ligante reativo de tiol. Geralmente, os anticorpos não contêm muitos, se houver, grupos tiol de cisteína livres e reativos que podem ser ligados à porção de droga. A maior parte dos resíduos de tiol de cisteína nos anticorpos dos compostos existe na forma de pontes dissulfeto e deve ser reduzida com agente redutor tal como ditiotreitol (DTT) ou TCEP, sob condições de redução totais ou parciais. Além disso, o anticorpo deve ser submetido a condições de desnaturação para revelar grupos nucleofílicos reativos, tais como lisina ou cisteína. A carga (razão droga/anticorpo) de ADC pode ser controlada de várias formas diferentes, que incluem: (i) limitação do excesso molar de intermediário droga-ligante (D-L) ou reagente ligante com relação ao anticorpo, (ii) limitação do tempo ou temperatura de reação de conjugação e (iii) condições redutoras parciais ou limitadoras para modificação de tiol de cisteína.
[0202] Quando mais de um grupo nucleofílico ou eletrofílico do anticorpo reagir com intermediário de droga-ligante ou reagente ligante seguido por reagente de porção de droga, o produto resultante é a mistura de compostos de ADC com distribuição de porções de droga ligadas a anticorpo, tais como 1, 2, 3 etc. Métodos de cromatografia de líquidos tais como fase reversa polimérica (PLRP) e interação hidrofóbica (HIC) podem separar os compostos na mistura por valor de carga de droga. As preparações de ADC com um único valor de carga de droga (p) podem ser isoladas (Effect of Drug Loading on the Pharmacology, Pharmacokinetics and Toxicity of an anti-CD30 Antibody-Drug Conjugate, Hamblett, K. J. et al, Resumo n° 624, American Association for Cancer Research; Reunião Anual de 2004, 27 a 31 de março de 2004, Proceedings of the AACR, Volume 45, março de 2004; Controlling the Location of Drug Attachment in Antibody-Drug Conjugates, Alley, S. C. et al, Resumo n° 627, American Association for Cancer Research; Reunião Annual de 2004, 27 a 31 de março de 2004, Proceedings of the AACR, Volume 45, março de 2004). Estes ADCs com único valor de carga, entretanto, podem ainda ser misturas heterogêneas porque as porções de droga podem ser ligadas, por meio do ligante, em diferentes sítios no anticorpo.
PREPARAÇÃO DE CONJUGADOS DE DROGA E ANTICORPO
[0203] O ADC da Fórmula I pode ser preparado por vários caminhos, empregando reações de química orgânica, condições e reagentes conhecidos dos técnicos no assunto, que incluem: (1) reação de grupo nucleofílico ou grupo eletrofílico de um anticorpo com um reagente de ligante bivalente, para formar intermediário anticorpo-ligante Ab-L, por meio de uma ligação covalente, seguida por reação com uma porção de droga ativada D; e (2) reação de um grupo nucleofílico ou grupo eletrofílico de uma porção de droga com um reagente ligante, para formar intermediário droga-ligante D-L, por meio de uma ligação covalente, seguida por reação com o grupo nucleofílico ou grupo eletrofílico de um anticorpo. Os métodos de conjugação (1) e (2) podem ser empregados com uma série de anticorpos, porções de drogas e ligantes para preparar os conjugados de droga e anticorpo da Fórmula I.
[0204] Os grupos nucleofílicos nos anticorpos incluem, mas sem limitar-se a: (i) grupos amina N-terminais, (ii) grupos amina de cadeia lateral, tais como lisina, (iii) grupos tiol de cadeia lateral, tais como cisteína, e (iv) grupos amino ou hidroxil açúcar em que o anticorpo é glicosilado. Amina, tiol e grupos hidroxila são nucleofílicos e capazes de reagir para formar ligações covalentes com grupos eletrofílicos sobre porções ligantes e reagentes ligantes, que incluem: (i) ésteres ativos tais como ésteres NHS, ésteres HOBt, haloformatos e haletos ácidos; (ii) haletos de alquila e benzila tais como haloacetamidas; (iii) aldeídos, cetonas, carboxila e grupos maleimida. Certos anticorpos possuem intercadeias dissulfetos redutíveis, ou seja, pontes de cisteína. Os anticorpos podem ser tornados reativos para conjugação com reagentes ligantes por meio de tratamento com agente redutor tal como DTT (reagente de Cleland, ditiotreitol) ou TCEP (cloridrato de (tris(2- carboxietil)fosfina; Getz et al (1999), Anal. Biochem. Vol. 273: 73-80; Soltec Ventures, Beverly MA). Cada ponte dissulfeto cisteína formará, portanto, teoricamente, dois nucleófilos de tiol reativos. Grupos nucleofílicos adicionais podem ser introduzidos em anticorpos por meio da reação de lisinas com 2- iminotiolano (reagente de Traut), resultando em conversão de amina em tiol.
[0205] Conjugados de drogas e anticorpos também podem ser produzidos por meio de modificação do anticorpo para introduzir porções eletrofílicas, que podem reagir com substituintes nucleofílicos sobre o reagente ligante ou droga. Os açúcares de anticorpos glicosilados podem ser oxidados, por exemplo, com reagentes oxidantes de periodato, para formar grupos cetona ou aldeído que podem reagir com o grupo amina de reagentes ligantes ou porções de drogas. Os grupos base Schiff imina resultantes podem formar ligação estável ou podem ser reduzidos, por exemplo, por reagentes de boroidreto para formar ligações de amina estáveis. Em uma realização, a reação da porção carboidrato de anticorpo glicosilado com galactose oxidase ou metaperiodato de sódio pode gerar grupos carbonila (aldeído e cetona) na proteína que podem reagir com grupos apropriados sobre a droga (Hermanson, G. T. (1996), Bioconjugate Techniques; Academic Press: Nova Iorque, págs. 234-242). Em outra realização, as proteínas que contêm resíduos de serina ou treonina N-terminais podem reagir com metaperiodato de sódio, resultando na produção de aldeído no lugar do primeiro aminoácido (Geoghegan e Stroh (1992), Bioconjugate Chem. 3: 138-146; US 5.362.852). Esse aldeído pode ser reagido com porção de droga ou nucleófilo ligante.
[0206] De forma similar, os grupos nucleofílicos sobre uma porção de droga incluem, mas sem limitar-se a: amina, tiol, hidroxila, hidrazida, oxima, hidrazina, tiosemicarbazona, carboxilato de hidrazina e grupos aril hidrazida capazes de reagir para formar ligações covalentes com grupos eletrofílicos sobre porções ligantes e reagentes ligantes, que incluem: (i) ésteres ativos tais como ésteres NHS, ésteres HOBt, haloformatos e haletos ácidos; (ii) haletos de alquila e benzila tais como haloacetamidas; (iii) aldeídos, cetonas, carboxila e grupos maleimida.
[0207] Maitansina pode ser convertida, por exemplo, em May- SSCH3, que pode ser reduzido no tiol livre, May-SH, e reagido com anticorpo modificado (Chari et al (1992), Cancer Research, 52: 127-131) para gerar um imunoconjugado de maitansinóide e anticorpo. Foram relatados conjugados de anticorpo e maitansinóide com ligante dissulfeto (WO 04/016801; US 6.884.874; US 2004/039176 A1; WO 03/068144; US 2004/001838 A1; US 6.441.163; US 5.208.020; US 5.416.064; WO 01/024763). O ligante dissulfeto SPP é construído com reagente ligante 4-(2-piridiltio) pentanoato de N- succinimidila. Conjugados de anticorpo-SPP-DM1 são representados pela estrutura:
[0208] Ligantes dissulfetos (S-S) de conjugados de droga e anticorpo foram testados para fins de comparação com o ligante não-dissulfeto de ADC de acordo com a presente invenção. Trastuzumab-SPP-DM1 foi preparado de acordo com o Exemplo 3 (Ranson, M. e Sliwkowski, M. (2002) Oncology 63 (supl. 1): 17-24). Conjugados de droga e anticorpo dissulfeto: trastuzumab-SPDP-DM1, trastuzumab-SPP-DM3 e trastuzumab-SPP-DM4
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[0209] ADC de acordo com a presente invenção incluem ligantes de SMCC e a porção de droga maitansinóide DM1, representada por Ab- SMCC-DM1:
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[0210] Uma realização de Ab-SMCC-DM1 é trastuzumab-SMCC- DM1 em que p é 1, 2, 3 ou 4 (Ab = trastuzumab, Tr, WO 2005/037992). Outra realização de ADC é trastuzumab-SIAB-DM1 (trastuzumab = Tr) que possui a
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SELEÇÃO DE CONJUGADOS DE DROGA E ANTICORPO (ADC) DIRIGIDOS CONTRA ANTÍGENOS ASSOCIADOS A TUMORES E RECEPTORES DA SUPERFÍCIE CELULAR
[0211] Animais transgênicos e linhagens celulares são particularmente úteis na seleção de conjugados de droga e anticorpo (ADC) que possuem potencial para tratamento profilático ou terapêutico de doenças ou disfunções que envolvem a sobreexpressão (overexpressing) de antígenos associados a tumores e receptores da superfície celular, tais como HER2 (US 6.632.979). A seleção de ADC útil pode envolver a administração de possível ADC ao longo de uma série de doses para o animal transgênico e seu teste em vários momentos para determinar o(s) efeito(s) do ADC sobre a doença ou disfunção sendo avaliada. Alternativa ou adicionalmente, a droga pode ser administrada antes da exposição a indutor da doença ou simultaneamente a ela, se aplicável. Possível ADC pode ser selecionado em série e individualmente, ou em paralelo em formato de seleção de médio ou alto rendimento. A velocidade em que ADC pode ser selecionado em busca de utilidade para tratamentos profiláticos ou terapêuticos de doenças ou disfunções somente é limitada pela velocidade de síntese ou metodologia de seleção, incluindo a detecção/medição/análise de dados.
[0212] Uma realização é o método de seleção que compreende (a) transplante de células de linhagem de células de câncer de mama estáveis em animal não humano; (b) administração de possível droga ADC ao animal não humano e (c) determinação da capacidade do candidato de inibir a formação de tumores a partir da linhagem celular transplantada. A presente invenção também se refere a método de seleção de possíveis ADC para o tratamento de doença ou disfunção caracterizada pela sobreexpressão (overexpressing) de proteína receptora que compreende (a) contato de células de linhagem de células de câncer de mama estável com possível droga e (b) avaliação da capacidade do possível ADC de inibir o crescimento da linhagem celular estável.
[0213] Uma realização é o método de seleção que compreende (a) contato de células de linhagem de células de câncer de mama estáveis com possível droga ADC; e (b) avaliação da capacidade do possível ADC de bloquear a ativação de ligantes de HER2. Outra realização é a avaliação da capacidade do possível ADC de bloquear a ligação de heregulina. Em outra realização, é avaliada a capacidade do possível ADC de bloquear a fosforilação de tirosina estimulada por ligante.
[0214] Outra realização é método de seleção que compreende (a) contato de células de linhagem de células de câncer de mama estável com possível droga ADC e (b) avaliação da capacidade do possível ADC de induzir a morte celular. Em uma realização, a capacidade do possível ADC de induzir a apoptose é avaliada.
[0215] Outra realização é o método de seleção que compreende (a) adminsitração de possível droga ADC a mamífero não humano transgênico que sobreexpressa (overexpress), tal como nas suas células de glândulas mamárias, proteína humana selvagem, tal como HER2 ou seu fragmento, em que esse mamífero transgênico integrou de forma estável ao seu genoma uma sequência de ácido nucléico que codifica a proteína humana selvagem ou seu fragmento que possui a atividade biológica da proteína humana selvagem, ligada operativamente a sequências reguladoras de transcrição que dirigem a sua expressão e desenvolve tumor, tal como tumor mamário, que não reage ou reage pouco a tratamento com anticorpo, tal como anti-HER2, ou a outro mamífero não humano que possui tumor transplantado do mencionado mamífero não humano transgênico; e (b) avaliação do efeito do possível ADC sobre a doença ou disfunção alvo. Sem limitações, a doença ou disfunção pode ser câncer que sobreexpressa (overexpressing) HER2, tal como câncer de mama, ovário, estômago, endométrio, glândula salivar, pulmão, rim, cólon, tireóide, pancreática e da bexiga. O câncer pode ser câncer de mama, que expressou HER2 em pelo menos cerca de 500.000 cópias por célula ou pelo menos cerca de 2.000.000 cópias por célula. Possíveis drogas ADC podem ser avaliadas, por exemplo, pela sua capacidade de indução da morte celular e/ou apoptose, utilizando métodos de teste bem conhecidos na técnica e descritos a seguir.
[0216] Em uma realização, possíveis ADC são selecionados por meio da sua administração ao animal transgênico ao longo de uma série de doses e avaliação da reação fisiológica do animal aos compostos ao longo do tempo. A administração pode ser oral ou por meio de injeção apropriada, dependendo da natureza química do composto sendo avaliado. Em alguns casos, pode ser apropriado administrar o composto em conjunto com cofatores que aumentariam a eficácia do composto. Caso linhagens celulares derivadas dos animais transgênicos pacientes sejam utilizadas para selecionar compostos úteis no tratamento de várias disfunções associadas a sobreexpressão (overexpressing) de certas proteínas de antígenos associadas a tumores ou receptores da superfície celular, tais como sobreexpressão (overexpression) de HER2, os compostos de teste são adicionados ao meio de cultivo celular em momento apropriado e a reação celular ao composto é avaliada ao longo do tempo utilizando os testes histológicos e/ou bioquímicos apropriados. Em alguns casos, pode ser apropriado aplicar o composto de interesse ao meio de cultivo em conjunto com cofatores que aumentariam a eficácia do composto.
[0217] Desta forma, a presente invenção fornece testes de identificação de ADC que dirigem especificamente e ligam a proteína HER2 sobreexpressa (overexpressed), cuja presença é correlacionada à função celular anormal e na patogênese de proliferação celular e/ou diferenciação de glândula mamária que possui relação causal com o desenvolvimento de tumores de mama.
[0218] Para identificar o ADC que bloqueia a ativação de ligante de receptor de ErbB (tal como ErbB2), pode-se determinar a capacidade do composto de bloquear a ligação de ligante de ErbB a células que expressam o receptor de ErbB (ErbB2) (tal como em conjugação com outro receptor de ErbB com o qual o receptor de ErbB de interesse forma heterooligômero de ErbB). Células isoladas do animal transgênico que sobreexpressa (overexpress) HER2 e transfectadas para expressar outro receptor de ErbB (com o qual HER2 forma um heterooligômero), por exemplo, podem ser incubadas, ou seja cultivadas, com o ADC e expostas em seguida a ligante de ErbB marcado. A capacidade do composto de bloquear a ligação de ligante ao receptor de ErbB no heterooligômero de ErbB pode ser avaliada em seguida.
[0219] A inibição da ligação de heregulina (HRG) a linhagens de células de tumor de mama, sobreexpressão (overexpressing) de HER2 e estabelecimento a partir dos mamíferos não humanos transgênicos (tais como camundongos) do presente pelo possível ADC podem ser realizados utilizando cultivos monocamadas sobre gelo em formato de placa de 24 cavidades. Os anticorpos monoclonais anti-ErbB2 podem ser adicionados a cada cavidade e incubados por trinta minutos. rHRGβl-177-224 marcado com 125I (25.000 cpm) pode ser adicionado em seguida e a incubação pode prosseguir por quatro a dezesseis horas. Curvas de reação à dosagem podem ser preparadas e valor IC50 pode ser calculado para o composto de interesse.
[0220] Alternativa ou adicionalmente, pode-se determinar a capacidade de ADC de bloquear a fosforilação de tirosina estimulada por ligante ErbB de receptor de ErbB presente em heterooligômero de ErbB. Linhagens celulares estabelecidas a partir dos animais transgênicos do presente podem ser incubadas, por exemplo, com ADC de teste e testadas em seguida para determinar a atividade de fosforilação de tirosina dependente de ligante ErbB utilizando anticorpo monoclonal anti-fosfotirosina (que é opcionalmente conjugado com marca detectável). O teste de ativação de receptor de quinase descrito em US 5.766.863 também é disponível para determinar a ativação de receptor de ErbB e o bloqueio daquela atividade pelo composto.
[0221] Em uma realização, pode-se selecionar ADC que inibe o estímulo por HRG da fosforilação de pI80 tirosina em células MCF7 essencialmente conforme descrito abaixo. Linhagem celular estabelecida, por exemplo, a partir de animal transgênico de HER2 pode ser colocado em placas com 24 cavidades e o composto pode ser adicionado a cada cavidade e incubado por trinta minutos à temperatura ambiente; em seguida, pode-se adicionar rHRGβii77-244 a cada cavidade até concentração final de 0,2 nM e a incubação pode prosseguir por cerca de oito minutos. Meios podem ser aspirados de cada cavidade e as reações podem ser suspensas por meio da adição de 100 μl de tampão de amostra SDS (5% SDS, 25 mM de DTT e 25 mM de Tris-HCl, pH 6,8). Cada amostra (25 μl) pode sofrer eletroforese sobre gel de gradiente 4 a 12% (Novex) e, em seguida, transferida eletroforeticamente para membrana de difluoreto de polivinilideno. Imunomanchas de antifosfotirosina (a 1 μg/ml) podem ser desenvolvidas e a intensidade da faixa reativa predominante a Mr -180.000 pode ser quantificada por meio de densitometria de reflexão. Método alternativo de avaliar a inibição da fosforilação do receptor é o teste de KIRA (ativação do receptor de quinase (Sadick et al (1998), Jour. of Pharm. and Biomed. Anal. 1-9). Alguns dos anticorpos monoclonais bem estabelecidos contra HER2 que são conhecidos por inibirem o estímulo por HRG de fosforilação de p180 tirosina podem ser utilizados como controle positivo neste teste. Curva de reação à dosagem para inibir o estímulo por HRG de fosforilação de p180 tirosina conforme determinado por meio de densitometria de reflexão pode ser preparada e pode- se calcular IC50 para o composto de interesse.
[0222] Podem-se também determinar os efeitos inibidores do crescimento de ADC de teste sobre linhagens celulares derivadas de animal transgênico de HER2 (Schaefer et al (1997), Oncogene 15: 1385-1394). Segundo este teste, as células podem ser tratadas com composto de teste em diversas concentrações por quatro dias e manchadas com violeta de cristal ou tintura redox Azul Alamar. A incubação com o composto pode exibir efeito inibidor do crescimento sobre esta linhagem celular similar ao exibido pelo anticorpo monoclonal 2C4 sobre células MDA-MB-175 (Schaefer et al, acima). Em realização adicional, HRG exógeno não reverterá significativamente esta inibição.
[0223] Para identificar compostos de ADC inibidores do crescimento que direcionam especificamente HER2, pode-se selecionar ADC que inibam o crescimento de células cancerosas que sobreexpressam (overexpress) HER2 derivadas de animais transgênicos (US 5.677.171). De acordo com este teste, células que sobreexpressam (overexpress) HER2 são cultivadas em mistura 1:1 de meio F12 e DMEM suplementado com soro de feto bovino a 10%, glutamina e penicilino estreptomicina. As células são colocadas em placas a 20.000 células em placa de cultivo celular de 35 mm (2 ml/placa de 35 mm) e o composto de teste é adicionado em várias concentrações. Após seis dias, a quantidade de células, em comparação com células não tratadas, é contada utilizando contador celular eletrônico COULTER®. Os ADCs que inibem o crescimento celular em cerca de 20 a 100% ou cerca de 50 a 100% podem ser selecionados como compostos inibidores do crescimento.
[0224] Para selecionar ADCs que induzam a morte celular, pode- se determinar a perda de integridade da membrana, conforme indicado, por exemplo, pela absorção de PI, azul de tripano ou 7AAD com relação à testemunha. O teste de absorção de PI utiliza células isoladas do tecido de tumor de mama de animal transgênico. De acordo com este teste, as células são cultivadas em Meio Eagle Modificado da Dulbecco (D-MEM): F-12 de Ham (50:50) suplementado com FBS desativado por calor a 10% (Hyclone) e 2 mM de L-glutamina. Desta forma, o teste é realizado na ausência de complemento e células efetoras imunes e complementares. As células são semeadas em densidade de 3 x 106 por placa em cem placas de 20 mm e mantidas em ligação por uma noite. O meio é removido em seguida e substituído com meio novo isolado ou meio que contém diversas concentrações do composto. As células são incubadas por período de tempo de três dias. Após cada tratamento, monocamadas são lavadas com PBS e destacadas por meio de tripsinização. As células são centrifugadas em seguida a 1200 rpm por cinco minutos a 4 °C, a pelota é novamente suspensa em 3 ml de tampão de ligação de Ca2+ frio (10 mM de Hepes, pH 7,4, 140 mM de NaCl, 2,5 mM de CaCl2) e parcelada em doze tubos de 75 mm com tampa de coador de 35 mm (1 ml por tubo, três tubos por grupo de tratamento) para a remoção de massas celulares. Os tubos recebem então PI (10 μg/ml). As amostras podem ser analisadas utilizando um citômetro de fluxo FACSCAN® e software FACSCONFERT® CellQuest (Becton Dickinson). Os compostos que induzem níveis estatisticamente significativos de morte celular, conforme determinado por meio da absorção de PI, podem ser selecionados como anticorpos que induzem a morte celular.
[0225] A fim de selecionar compostos que induzem a apoptose, é realizado o teste de ligação de anexina utilizando células estabelecidas a partir do tecido de tumor de mama do animal transgênico. As células são cultivadas e semeadas em placas conforme discutido no parágrafo anterior. O meio é removido em seguida e substituído com meio novo isolado ou meio que contém 10 μg/ml do conjugado de droga e anticorpo (ADC). Após período de incubação de três dias, monocamadas são lavadas com PBS e destacadas por meio de tripsinização. As células são centrifugadas em seguida, novamente suspensas em tampão de ligação de Ca2+ e parceladas em tubos conforme discutido acima para o teste de morte celular. Os tubos recebem então anexina marcada (tal como anexina V-FITC (1 μg/ml). As amostras podem ser analisadas utilizando um citômetro de fluxo FACSCAN® e software FACSCONFERT® CellQuest (Becton Dickinson). Os compostos que induzem níveis estatisticamente significativos de ligação de anexina com relação ao controle são selecionados como compostos indutores da apoptose.
TESTES DE PROLIFERAÇÃO CELULAR IN VITRO
[0226] Geralmente, a atividade citotóxica ou citostática de conjugado de droga e anticorpo (ADC) é medida por meio de: exposição de células de mamíferos que possuem antígenos associados a tumores ou proteínas receptoras ao anticorpo do ADC em meio de cultivo celular; cultivo das células por período de cerca de seis horas a cerca de cinco dias; e medição da viabilidade celular. Testes in vitro com base em células foram utilizados para medir a viabilidade, ou seja, a proliferação (IC50), citotoxicidade (EC50) e indução de apoptose (ativação de caspase) do ADC.
[0227] A potência in vitro de conjugados de droga e anticorpo foi medida por meio de teste de proliferação celular (Figuras 1 a 4). O Teste de Viabilidade Celular Luminescente CellTiter-Glo® é o método de teste homogêneo disponível comercialmente (Promega Corp., Madison WI, Estados Unidos) com base na expressão recombinante de luciferase de Coleoptera (US 5.583.024; US 5.674.713; US 5.700.670). Este teste de proliferação celular determina a quantidade de células viáveis em cultivo com base na quantificação do ATP presente, indicador de células metabolicamente ativas (Crouch et al (1993), J. Immunol. Meth. 160: 81-88; US 6.602.677). O Teste CellTiter-Glo® foi conduzido em formato de 96 cavidades, tornando-o propenso a seleção automatizada de alto rendimento (HTS) (Cree et al (1995), AntiCancer Drugs 6: 398-404). O procedimento de teste homogêneo envolve a adição do reagente isolado (Reagente CellTiter-Glo®) diretamente a células cultivadas em meio suplementado com soro. Lavagem celular, remoção de meio e diversas etapas de pipetagem não são necessárias. O sistema detecta até quinze células por cavidade em formato de 384 cavidades dez minutos após a adição do reagente e mistura. O formato de “medição da mistura de adição” homogênea resulta em lise celular e a geração de sinal luminescente proporcional à quantidade de ATP presente. A quantidade de ATP é diretamente proporcional à quantidade de células presente em cultivo. O Teste CellTiter-Glo® gera sinal luminescente de "tipo brilhante", produzido por meio da reação de luciferase, que possui meia vida geralmente de mais de cinco horas, dependendo do tipo de célula e do meio utilizado. As células viáveis são refletidas em unidades de luminescência relativa (RLU). O substrato, Beetle Luciferin, é descarboxilado oxidativamente por luciferase de vaga-lume recombinante com conversão simultânea de ATP em AMP e geração de fótons. A meia vida estendida elimina a necessidade de uso de injetores de reagente e fornece flexibilidade para processamento contínuo ou em modo de bateladas de diversas placas. Este teste de proliferação celular pode ser utilizado com vários formatos de diversas cavidades, tais como formato de 96 ou 384 cavidades. Os dados podem ser registrados por luminômetro ou dispositivo de formação de imagens de câmera CCD. O rendimento de luminescência é apresentado na forma de unidades de luz relativa (RLU), medidas ao longo do tempo.
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[0228] Os efeitos antiproliferativos de três conjugados de droga e anticorpo foram medidos por meio do teste de morte celular in vitro e proliferação celular acima contra quatro linhagens diferentes de células de tumor mamário (Figuras 1 a 4). A Figura 1 exibe as medições de potência em concentrações crescentes de trastuzumab-SPP-DM1, trastuzumab-SPDP-DM1 e trastuzumab-SMCC-DM1 após tratamento por três dias sobre células de tumor de mama SK-BR-3 (HER2 3+). A Figura 2 exibe as medições de potência sob concentrações crescentes de trastuzumab-SPP-DM1, trastuzumab-SPDP- DM1 e trastuzumab-SMCC-DM1 após tratamento por três dias sobre células de tumor de mama BT-474 (HER2 3+). A Figura 3 exibe as medições de potência sob concentrações crescentes de trastuzumab-SPP-DM1, trastuzumab-SPDP- DM1 e trastuzumab-SMCC-DM1 após tratamento por três dias sobre células de tumor de mama MCF7 (HER2 baixo). A Figura 4 exibe as medições de potência sob concentrações crescentes de trastuzumab-SPP-DM1, trastuzumab-SPDP-DM1 e trastuzumab-SMCC-DM1 após tratamento por três dias sobre células de tumor de mama MDA-MB-468 (HER2 negativo).
[0229] Os valores de IC50 foram estabelecidos para SK-BR-3 e BT-474, que são conhecidos por sobreexpressar (overexpress) proteína receptora de HER2. Um lote de conjugado trastuzumab-SPP-DM1 com 2,8 DM1 por trastuzumab (droga/Ab) gerou IC50 médio de 14,4 μg/ml com faixa de 9,1 a 22,3 μg/ml para seis experimentos contra células SK-BR-3 e IC50 médio de 51,7 μg/ml com faixa de 28,7 a 63,1 μg/ml para quatro experimentos contra células BT-474. Um lote de conjugado trastuzumab-SMCC-DM1 com 2,7 DM1 por trastuzumab (droga/Ab) gerou IC50 médio de 15,2 μg/ml com faixa de 12,6 a 18,8 μg/ml para quatro experimentos contra células SK-BR-3 e IC50 médio de 94,9 μg/ml com faixa de 75,2 a 114,6 μg/ml para dois experimentos contra células BT-474. Os conjugados foram inativos contra células MCF7 e MDA-MB- 468 que não sobreexpressam (overexpress) HER2.
[0230] AntiCD19-SMCC-DM1 exibiu potente morte celular in vitro com células Raji (IC50 <= 0,25 μg/ml), em que o anticorpo bruto e ADC controle, trastuzumab-SMCC-DM1, não exibiu efeito. AntiCD79a-SMCC-DM1 e antiCD79b-SMCC-DM1 exibiram potente morte celular in vitro com células Ramos (IC50 <= 0,25 μg/ml), em que o anticorpo bruto e ADC controle, trastuzumab-SMCC-DM1, não exibiu efeito.
[0231] A Figura 17 exibe teste de proliferação celular in vitro (Exemplo 5) com células HT1080EphB2 (C8) tratadas com conjugados de droga e anticorpo anti-EphB2R 2H9: 2H9-SPP-DM1 (IC50 80 ng/ml) e 2H9- SMCC-DM1 (IC50 50 ng/ml).
ESTABILIDADE E LIBERAÇÃO NO SORO IN VIVO EM CAMUNDONGOS
[0232] A liberação no soro e a estabilidade de ADC foram pesquisadas em camundongos nude selvagens (sem tumores recebidos por enxertos exógenos). A Figura 5 exibe a liberação no soro em camundongos brutos bege sem tumores de trastuzumab-SMCC-DM1 contra trastuzumab- SPP-DM1, medição da concentração no soro de anticorpo total e conjugado em seis momentos ao longo de sete dias. A diferença na quantidade de anticorpo total e ADC indica divisão do ligante e separação do anticorpo da sua porção DM1. Conforme ilustrado pela alta concentração no soro de anticorpo conjugado após sete dias, o ADC ligado por SMCC permaneceu intacto in vivo por mais tempo que conjugados ligados a SPP.
[0233] A Figura 6 exibe a estabilidade ao longo do tempo em camundongos nude sem tumores dos conjugados: trastuzumab-SPDP-DM1, trastuzumab-SPP-DM1, trastuzumab-SPP-DM3, trastuzumab-SPP-DM4 e trastuzumab-SMCC-DM1, medindo-se a concentração no soro em seis momentos ao longo de sete dias. ADC com o ligante SMCC foram mais estáveis in vivo que conjugados ligados por SPP ou SPDP, embora trastuzumab-SMCC-DM1 apresentasse aproximadamente a mesma estabilidade do conjugado dissulfeto mais obstruído, trastuzumab-SPP-DM4.
[0234] Os experimentos exibidos nas Figuras 5 e 6 foram realizados em camundongos nude sem tumores. Entretanto, conjugados ligados a SMCC exibiram a mesma estabilidade aumentada em comparação com conjugados ligados a SPP em camundongos nude com tumores. Conforme exibido na Figura 7, cerca de 72% do trastuzumab-SMCC-DM1 inicial permaneceram na forma de conjugado sete dias após o tratamento, enquanto apenas cerca de 10% do trastuzumab-SPP-DM1 inicial permaneceram na forma de conjugado sete dias após o tratamento, o que ilustra a maior estabilidade de conjugados de trastuzumab-SMCC-DM1 não divisíveis enzimaticamente em camundongos nude com tumores.
LIBERAÇÃO NO SORO IN VIVO E ESTABILIDADE EM RATOS
[0235] As Figuras 8 e 9 exibem os perfis de liberação e estabilidade comparativos de ligante dissulfeto de ADC (trastuzumab-SPP- DM1) e um ligante não-dissulfeto de ADC (trastuzumab-SMCC-DM1) em ratos. Os parâmetros do estudo incluem:
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[0236] O ligante não-dissulfeto de ADC, trastuzumab-SMCC-DM1 (Figura 9), exibiu melhor estabilidade no soro de rato que o ligante dissulfeto de ADC, trastuzumab-SPP-DM1 (Figura 8).
EFICÁCIA IN VIVO
[0237] A eficácia dos conjugados de droga e anticorpo de acordo com a presente invenção pode ser medida in vivo por meio de implante de aloenxertos ou xenoenxertos de células cancerosas em roedores e tratamento dos tumores com ADC. São esperados resultados variáveis, dependendo da linhagem celular, da especificidade de ligação de anticorpos do ADC a receptores presentes sobre as células cancerosas, regime de dosagem e outros fatores. A eficácia in vivo de ADC anti-HER2 foi medida por modelo de camundongo explante transgênico com alta expressão de HER2. Um aloenxerto foi propagado a partir do camundongo transgênico Fo5 mmtv, que não reage ou reage pouco à terapia com HERCEPTIN. Os pacientes foram tratados por uma vez com ADC e monitorados ao longo de três a seis semanas para medir o tempo para dobrar o tumor, registrar a morte celular e para a redução do tumor. Foram conduzidos experimentos de múltiplas dosagens e de reação dose-resposta.
[0238] Tumores surgem facilmente em camundongos transgênicos que expressam forma mutacionalmente ativada de neu, o homólogo de HER2 de ratos, mas o HER2 que é sobreexpresso (overxpressed) em cânceres de mama não sofre mutação e a formação de tumores é muito menos robusta em camundongos transgênicos que sobreexpressam (overexpress) HER2 que não sofreu mutação (Webster et al (1994), Semin. Cancer Biol. 5: 69-76).
[0239] Para aumentar a formação de tumores com HER2 que não sofreu mutação, foram produzidos camundongos transgênicos utilizando plasmídeo de cDNA HER2 no qual ATG acima no fluxo foi deletado para evitar o início de tradução nesses códons de ATG acima no fluxo, o que de outra forma reduziria a frequência de início de tradução a partir do códon de início autêntico abaixo no fluxo de HER2 (vide, por exemplo, Child et al (1999), J. Biol. Chem. 274: 24335-24341). Além disso, intron quimérico foi adicionado à extremidade 5', o que também deverá aumentar o nível de expressão conforme relatado anteriormente (Neuberger e Williams (1988), Nucleic Acids Res. 16: 6713; Buchman e Berg (1988), Mol. Cell. Biol. 8: 4395; Brinster et al (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 85: 836). O intron quimérico foi derivado de vetor Promega, vetor de expressão de mamíferos pCI-neo (bp 890-1022). A extremidade 3’ de DNA é ladeada por exons 4 e 5 de hormônio do crescimento humano e sequências de poliadenilação. Além disso, foram utilizados camundongos FVB porque esta linhagem é mais suscetível ao desenvolvimento de tumores. O promotor de MMTV-LTR foi utilizado para garantir a expressão de HER2 específico de tecidos na glândula mamária. Animais receberam a dieta AIN 76A para aumentar a suscetibilidade à formação de tumores (Rao et al (1997), Breast Cancer Res. and Treatment 45: 149-158).
[0240] As Figuras 10 a 13 demonstram que os ADCs possuem forte atividade antitumorosa no aloenxerto de tumor HER2 positivo (Fo5) que surgiu originalmente em camundongo transgênico MMTV-HER2. O anticorpo isolado (tal como trastuzumab) não apresenta atividade antitumorosa significativa neste modelo (Erickson et al, US 6.632.979). Conforme ilustrado nas Figuras 10 e 11, o crescimento dos tumores foi retardado por meio de tratamento com ADC em comparação com o nível de crescimento controle (veículo). O crescimento do tumor teve a velocidade reduzida principalmente por meio do tratamento com conjugados de trastuzumab-SMCC-DM1 e trastuzumab-SIAB-DM1. Conforme exibido nas Figuras 10, 12 e 13, o conjugado de trastuzumab-SMCC-DM1 reduziu a velocidade do crescimento de tumor mais que os conjugados com ligantes SPP, ou seja, mais potência, se medida como o dobro do tempo de tumores em camundongos brutos ou como Registro de Morte Celular correspondente ao dobro das medições de tempo exibidas (Figura 13).
[0241] A eficácia in vivo de ADC anti-CD22 foi medida com modelo de xenoenxerto de tumor de camundongo. Grupos de oito camundongos SCID com vinte milhões de células de tumores de xenoenxertos Bjab-luc (células Bjab que expressam luciferase) por camundongo receberam dose por uma vez no dia 1 (exceto quando observado) com conjugado de droga e anticorpo anti-CD22 ou anticorpo bruto (Exemplo 8).
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[0242] Foi medido o tempo para dobrar o tamanho de tumores (MTD, tempo médio de dobra de tumor). Os três anticorpos anti-CD22 brutos não exibiram essencialmente nenhuma eficácia com relação com o ADC de ligação não específica (trastuzumab-SMCC-DM1). Todos os conjugados correspondentes exibiram o efeito de retardamento significativo do crescimento de tumor. O efeito de dosagem múltipla foi estabelecido com RFB4-SMCC- DM1 em que o MTD para camundongos com dosagem única foi de dezoito dias, enquanto o MTD para camundongos que receberam três doses, nos dias 1, 7 e 14, foi de 55 dias. Remissão completa de tumor ocorreu em todos os oito camundongos no grupo com três dosagens. Outros conjugados antiCD22- SMCC-DM1, com os anticorpos 12F7, 9A8, 8C9, 8G10, 3F11, 10D2, 6C9, 14D1 e 11H10, exibiram redução do volume inicial de tumor ou retardamento do crescimento de tumores com relação ao controle (trastuzumab-SMCC-DM1) em sete dias após uma única dose (400 μg de DM1/m2) em camundongos SCID com vinte milhões de células de tumores de xenoenxerto Bjab-luc por camundongo. Conjugados antiCD22, RFB4-SMCC-DM1, 5E8-SMCC-DM1 e 7A2-SMCC-DM1 também foram eficazes no retardamento do crescimento de tumores com relação ao controle (trastuzumab-SMCC-DM1) em onze dias após dose única (200 μg de DM1/m2) em camundongos SCID com cinco milhões de células de tumor de xenoenxerto Ramos RA1 por camundongo.
[0243] O conjugado RFB4-SMCC-DM1 foi estudado em três cargas de droga diferentes em grupos de dez camundongos SCID com xenoenxertos Bjab-luc (Exemplo 8). Os conjugados com carga baixa (1,95) e média (3,7) de drogas exibiram o efeito de retardamento significativo do crescimento de tumores, com MTD de cerca de quinze dias. O conjugado com carga alta (6,75) não exibiu efeito significativamente diferente do conjugado controle GP120-SMCC-DM1 ou do anticorpo RFB4 bruto.
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[0244] Conjugados antiCD19-SMCC-DM1 e antiCD22-SMCC- DM1 não exibiram atividade in vivo em modelo de xenoenxerto de tumores de camundongos de células Raji. Outros conjugados antiCD19 e antiCD22 podem apresentar atividade in vivo contra outros modelos de tumores de células cancerosas.
[0245] A eficácia in vivo de ADC antiCD79a (alfa) e antiCD79b (beta) foi medida com modelo de xenoenxerto de tumor de camundongo. Grupos de oito camundongos SCID com vinte milhões de células de tumores de xenoenxertos de Bjab-luc por camundongo receberam dose no dia 1 com amostras da tabela abaixo e do Exemplo 8 a seguir.
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[0246] Os conjugados SN8 antiCD79b-SMCC-DM1, 17A7 antiCD79b-SMCC-DM1 e 8H9 antiCD79a-SMCC-DM1 exibiram redução do volume de tumor inicial (média de 160 mm3) após sete dias. Nos grupos de oito camundongos, conjugado SN8 antiCD79b-SMCC-DM1 gerou remissão parcial (PR) em quatro animais e remissão completa (CR) em dois animais. Conjugado 17A7 antiCD79b-SMCC-DM1 gerou CR em um animal. Conjugado 8H9 antiCD79a-SMCC-DM1 gerou PR em dois animais e CR em um animal. Outros conjugados antiCD79b-SMCC-DM1, com os anticorpos 2F2, 5C3, 7H7, 8D11, 15E4 e 16C11, exibiram retardamento do crescimento de tumores ou redução do volume do tumor inicial com relação ao controle (trastuzumab-SMCC-DM1) em oito dias após uma única dose (192 μg de DM1/m2) em camundongos SCID ICR CB17 com vinte milhões de células de tumores de xenoenxerto Bjab-luc por camundongo.
[0247] Foi medido o efeito de reação à dosagem sobre camundongos que receberam administração de antiCD79b-SMCC-DM1. Grupos de oito camundongos SCID com vinte milhões de células de tumores de xenoenxertos de Bjab-luc por camundongo receberam dose no dia 1 com amostras da tabela abaixo (Exemplo 8). O antiCD79b-SMCC-DM1 foi dosado em níveis de 0,5, 2,0 e 3,64 mg Ab/kg de camundongo.
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[0248] A eficácia in vivo de ADC antiTENB2 foi medida com modelo de xenoenxerto de tumor de camundongo. TENB2 é antígeno de tumores que é exibido como sendo quase exclusivamente expresso na próstata humana e sobreexpresso (overexpressed) em tumores da próstata humana (Glynne-Jones et al (2001), Int. J. Cancer, quinze de outubro; 94 (2): 178-84). PC3-TVA-919cv1:5 é linhagem de células de câncer da próstata humano que expressa alto nível de TENB2.
[0249] Camundongos brutos atímicos receberam injeção subcutânea de cinco milhões de células expressoras médias ou expressoras altas de PC3-TVA-919 em volume de 0,2 ml por camundongo. As células foram suspensas em HBSS. Quando o tamanho médio do tumor atingiu 100 a 200 mm3, os camundongos foram agrupados aleatoriamente em oito grupos de oito a dez camundongos cada e geraram um único tratamento IV das amostras abaixo (Exemplo 8).
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[0250] Conjugados anti-TENB2-DM1 murinos exibiram eficácia antitumores contra tumores PC3-TENB2, com relação ao controle negativo e ao veículo controle. Conjugado 10H1 antiNaPi3b-SMCC-DM1 murino não exibiu eficácia antitumores contra tumores PC3-NaPi3b, com relação ao controle negativo e ao veículo controle. Outros variantes de anticorpos de conjugados anti-NaPi3b podem apresentar atividade in vivo contra tumores PC3-NaPi3b ou outras linhagens de células cancerosas.
TOXICIDADE PARA ROEDORES
[0251] Conjugados de droga e anticorpo e um controle ADC- negativo (ADC-minus), “Veículo”, foram avaliados em modelo de toxicidade aguda em ratos. A toxicidade de ADC foi pesquisada por meio de tratamento de fêmeas de ratos Sprague-Dawley com o ADC e subsequente inspeção e análise dos efeitos sobre diversos órgãos. Com base em observações superficiais (pesos do corpo), parâmetros de patologia clínica (química do soro e hematologia) e histopatologia, a toxicidade de ADC pode ser observada, caracterizada e medida. Descobriu-se que, em níveis de dosagem equivalentes, trastuzumab-SMCC-DM1 foi associado à toxicidade menos aguda que trastuzumab-SPP-DM1.
[0252] Estudo de toxicidade aguda por cinco dias em fêmeas de ratos adolescentes (100 a 125 g) foi conduzido por meio de simples injeção de trastuzumab-SMCC-DMI (duas doses: 1860 e 3260 μg de DM1/m2), um ADC dissulfeto de comparação, trastuzumab-SPP-DM1 (duas doses: 1860 e 3260 μg de DM1/m2), DM1 maitansina livre (tiol) e veículo controle (dia 0). O peso do corpo foi medido diariamente. Química clínica, análise hematológica e de enzimas do soro foram conduzidas nos dias 3 e 5, concluindo com a necrópsia completa com determinação histopatológica. Os sinais de toxicidade incluíram a observação clínica de perda de peso.
[0253] Considera-se que a perda de peso, ou alteração de peso com relação a animais dosados somente com veículo em animais após a dosagem com ADC, é indicador geral e aproximado da toxicidade sistêmica ou localizada. A Figura 14 exibe as alterações do peso do corpo (gramas) ao longo de cinco dias. Ratos que recebem o ADC dissulfeto, trastuzumab-SPP- DM1 exibiram notável toxicidade dependente de dosagem, indicada por letalidade na dose mais alta e declínio de peso do corpo na dose mais baixa. Por outro lado, os ratos que recebem trastuzumab-SMCC-DM1 ganharam peso, com os ratos com dosagem mais baixa não exibindo declínio da velocidade de ganho de peso, com relação aos ratos dosados com veículo placebo. Os ratos dosados no nível mais alto de trastuzumab-SMCC-DM1 também ganharam peso, em comparação com a citotoxina DM1 livre.
[0254] A hepatotoxicidade foi medida por enzimas do fígado elevadas, aumento das quantidades de figuras mitóticas e apoptóticas e necrose de hepatócitos. Toxicidade hematolinfóide foi observada por meio de esgotamento de leucócitos, principalmente granulócitos (neutrófilos) e/ou plaquetas e envolvimento de órgãos linfóides, ou seja, atividade apoptótica ou atrofia. Também se observou toxicidade por meio de lesões do trato gastrointestinal, tais como aumento das quantidades de figuras mitóticas e apoptóticas e entercolite degenerativa.
[0255] As enzimas indicativas de lesão do fígado que foram estudadas incluem: AST (aspartato aminotransferase) - Localização: citoplasmático; fígado, coração, músculos do esqueleto, rim - Fígado: razão em plasma de 7000:1 - T1/2: 17 h ALT (alanino aminotransferase) - Localização: citoplasmático; fígado, rim, coração, músculos do esqueleto - Fígado: razão em plasma de 3000:1 - T1/2: 42 h; variação diurna GGT (g-glutamil transferase) - Localização: membrana plasmática de células com alta capacidade secretória ou de absorção, fígado, rim, intestino - Mau previsor de lesões do fígado; comumente elevado em disfunções do duto biliar
[0256] Nenhuma das três enzimas medidas acima é específica do fígado. Descobriu-se que o ADC de acordo com a presente invenção causou suave elevação transitória das enzimas do fígado ALT e AST, com reticulocitopenia transitória (Figura 15). Nenhum efeito significativo sobre granulócitos do sangue periférico ou plaquetas foi observado (Figura 16).
[0257] As Figuras 15 e 16 demonstram que ratos expostos a 22,3 mg/kg de trastuzumab-SPP-DM1 (Grupo 2) demonstraram a toxicidade clínica mais severa neste estudo de toxicidade aguda de cinco dias. Estes animais exibiram a perda de peso do corpo mais profunda, elevações de testes do funcionamento do fígado, leuco e trombocitopenia e evidência morfológica da toxicidade contra tecidos hematolinfóides. A extensão de toxicidade foi similar em comparação com a encontrada em estudos anteriores utilizando dose de 25 mg/kg. Por outro lado, animais nos Grupos 3 e 4 que receberam trastuzumab- SMCC-DM1 a 10 e 25 mg/kg, respectivamente, não puderam ser diferenciados de animais tratados com veículo com base na patologia clínica e em dados de peso do corpo. Morfologicamente, estes animais exibiram número suavemente aumentado de figuras mitóticas no fígado, mas tecidos hematopoiéticos e linfóides periféricos encontravam-se dentro de limites normais.
[0258] Animais do grupo 5, 50 mg/kg de trastuzumab-SMCC- DM1, exibiram evidência de toxicidade. Entretanto, com a exceção de um teste de função do fígado (ALT), a severidade da toxicidade foi menor que a de animais que recebem 50% da mesma dose de droga de trastuzumab-SPP-DM1 (Grupo 2). Aproximadamente na mesma dose, trastuzumab-SMCC-DM1 (Grupo 4, 22,3 mg/kg) exibiu cerca de 25% no nível de AST de trastuzumab- SPP-DM1 (Grupo 2, 25 mg/kg). No dia cinco deste estudo, animais do Grupo 5 exibiram aumentos de peso do corpo (após perda transitória durante os dias 3 e 4), queda da bilirubina no soro e aumento da contagem de plaquetas (Figura 15).
[0259] Os animais expostos a maitansinóide DM1 livre (Grupo 6) exibem o mesmo padrão de toxicidade de animais tratados com conjugados de trastuzumab. Esta dose de DM1 livre corresponde à quantidade de droga administrada na forma de dose de 10 mg/kg de trastuzumab-SPP-DM1 em estudos anteriores. A severidade da toxicidade em animais do Grupo 6 foi menor que a observada em animais do Grupo 2, mas maior que a observada anteriormente em animais tratados com 10 mg/kg de trastuzumab-SPP-DM1. A recuperação foi aparentemente um tanto rápida. As seções de baço exibiram aumento das quantidades de elementos hematopoiéticos imaturos em animais tratados com maitansina livre; além disso, LFTs e parâmetros de hematologia clínica exibiram tendência distinta para normalização em animais do Grupo 6 no dia 5.
TOXICIDADE/SEGURANÇA PARA MACACOS CYNOMOLGUS
[0260] Pode-se determinar a toxicidade e segurança de ADC administrado a macacos Cynomolgus. Estudo de toxicidade e segurança do conjugado de droga e anticorpo, trastuzumab-SMCC-DM1, foi conduzido em macacos Cynomolgus. Três grupos de macacos foram estudados para determinar a toxicidade de trastuzumab-SMCC-DM1 administrado por meio de injeção intravenosa em doses escalonadas, com relação ao controle (veículo). O Grupo 1 (quatro pacientes) recebeu apenas veículo (PBS, pH 6,5, ou seja, formulação menos ADC) no dia 1 e no dia 22, seguido por necrópsia no dia 36. O Grupo 2 (quatro pacientes) recebeu trastuzumab-SMCC-DM1, 4900 μg/m2 no dia 1 e no dia 22. O Grupo 3 (quatro pacientes) recebeu trastuzumab- SMCC-DM1,7200 μg/m2 no dia 22.
[0261] A hepatotoxicidade foi inferida por meio de medição das enzimas elevadas no fígado a partir do estudo de Toxicidade para Roedores. Macacos Cynomolgus foram dosados com Veículo (Grupo 1) e trastuzumab- SMCC-DM1 (Grupo 2: 4900 μg/m2; Grupo 3: 7200 μg/m2. AST de enzimas do fígado, contagens de plaquetas, contagens de glóbulos brancos, neutrófilos absolutos, glóbulos vermelhos do sangue, reticulócitos e comparação de dois regimes de dosagem intravenosa foram medidos para trastuzumab-SMCC- DM1 em Macacos Cynomolgus (Exemplo 10).
ADMINISTRAÇÃO DE FORMULAÇÕES FARMACÊUTICAS DE CONJUGADOS DE DROGA E ANTICORPO
[0262] Conjugados de droga e anticorpo (ADC) terapêuticos podem ser administrados por qualquer via apropriada para a condição a ser tratada. O ADC será tipicamente administrado por via parenteral, ou seja, por infusão, subcutânea, intramuscular, intravenosa, intradérmica, intratecal, bolus, injeção intratumorosa ou epidural (Shire et al (2004), J. Pharm. Sciences 93 (6): 1390-1402). Formulações farmacêuticas de conjugados de droga e anticorpo (ADC) terapêuticas são tipicamente preparadas para administração parenteral com um veículo parenteral farmaceuticamente aceitável e em forma injetável de dosagem única. Um conjugado de droga e anticorpo (ADC) que possui o grau desejado de pureza é opcionalmente misturado com diluentes, veículos, excipientes ou estabilizantes farmaceuticamente aceitáveis, na forma de uma formulação liofilizada ou solução aquosa (Remington’s Pharmaceutical Sciences (1980), 16a edição, Osol, A., ed.).
[0263] Veículos, diluentes, carreadores, excipientes e estabilizantes aceitáveis não são tóxicos para pacientes nas dosagens e concentrações empregadas e incluem tampões tais como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos, antioxidantes que incluem ácido ascórbico e metionina; conservantes (tais como cloreto de octadecildimetilbenzil amônio, cloreto de hexametônio, cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio; álcool fenólico, butílico ou benzílico; alquil parabenos tais como metil ou propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular (menos de cerca de dez resíduos); proteínas, tais como albumina do soro, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos que incluem glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes tais como EDTA; açúcares, tais como sacarose, manitol, trehalose ou sorbitol; contraíons formadores de sais tais como sódio; complexos metálicos (por exemplo, complexos de Zn e proteína); e/ou tensoativos não iônicos, tais como TWEEN®, PLURONICS® ou polietileno glicol (PEG). Formulações de anticorpos anti-ErbB2 liofilizadas são descritas, por exemplo, em WO 97/04801, expressamente incorporada ao presente como referência. Exemplo de formulação de ADC tal como trastuzumab-SMCC-DM1 contém cerca de 100 mg/ml de trehalose (2-(hidroximetil)-6-[3,4,5-tri-hidróxi-6- (hidroximetil)tetraidropiran-2-il]óxi-tetraidropiran-3,4,5-triol; C12H22O11; Número CAS 99-20-7) e cerca de 0,1% TWEEN® 20 (polissorbato 20; 2-[2-[3,4-bis(2- hidroxietóxi)tetraydrofuran-2-il]-2-(2-hidroxietóxi)etóxi]etil éster de ácido dodecanóico; C26H50O10; Número CAS 9005-64-5) em pH de cerca de 6.
[0264] Formulações farmacêuticas de conjugado de droga e anticorpo (ADC) terapêutico podem conter certas quantidades de porção de droga não reagida (D), intermediário entre ligante e anticorpo (Ab-L) e ou intermediário entre ligante e droga (D-L), em consequência de purificação incompleta e separação de reagentes, impurezas e subprodutos em excesso no processo de fabricação do ADC; ou hidrólise tempo/temperatura ou degradação mediante armazenagem do volume de ADC ou composição de ADC formulada. Formulação do ADC trastuzumab-SMCC-DM1, por exemplo, pode conter quantidade detectável de droga livre DM1. Alternativa ou adicionalmente, ela pode conter quantidade detectável de intermediário entre droga e ligante DM1-SMCC. Alternativa ou adicionalmente, ela pode conter quantidade detectável do anticorpo, trastuzumab. Exemplo de formulação de trastuzumab-SMCC-DM1 pode conter até 10% equivalente molar de DM1- SMCC. Inesperadamente, o teste de proliferação celular in vitro determinou (Exemplo 5) que DM1-SMCC (IC50 0,05 μM) é cerca de vinte vezes menos potente na matança das células que droga livre DM1 (IC50 0,0045 μM) contra células de câncer de mama SK-BR-3 e BT-474.
[0265] Os ingredientes farmacêuticos ativos também podem ser capturados em microcápsulas preparadas, por exemplo, por meio de técnicas de acumulação ou polimerização interfacial, tais como microcápsulas de hidroximetilcelulose ou gelatina e microcápsulas de póli(metilmetacrilato), respectivamente, em sistemas de fornecimento de drogas coloidais (por exemplo, lipossomos, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas), ou em macroemulsões. Estas técnicas são descritas em Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16a edição, Osol, A. Ed. (1980).
[0266] Podem ser fabricadas preparações de liberação prolongada. Exemplos apropriados de preparações de liberação prolongada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos que contenham o ADC, que se encontram na forma de artigos moldados, tais como filmes ou microcápsulas. Exemplos de matrizes de liberação prolongada incluem poliésteres, hidrogéis (tais como metacrilato de (póli)2-hidroxietila) ou álcool (poli)vinílico), polilactídeos (US 3.773.919), copolímeros de ácido L- glutâmico e L-glutamato de gama-etila, etileno vinil acetato não degradável, copolímeros degradáveis de ácido láctico e ácido glicólico, tais como LUPRON DEPOT® (microesferas injetáveis compostas de copolímero de ácido láctico e ácido glicólico e acetato de leuprolida) e ácido póli-D-(-)-3-hidroxibutírico.
[0267] As formulações a serem utilizadas para administração in vivo devem ser estéreis, o que é facilmente conseguido por meio de filtragem através de membranas de filtragem estéreis.
[0268] As formulações incluem as apropriadas para as vias de administração a seguir. As formulações podem ser convenientemente apresentadas em forma de dosagem única e podem ser preparadas por meio de qualquer dos métodos bem conhecidos na técnica farmacêutica. Métodos e formulações geralmente são encontrados em Remington’s Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, Easton PA). Esses métodos incluem a etapa de colocar em associação o ingrediente ativo com o veículo que constitui um ou mais ingredientes acessórios. Geralmente, as formulações são preparadas colocando-se em associação íntima e uniformemente o ingrediente ativo com veículos líquidos ou veículos sólidos finamente divididos ou ambos e, em seguida, modelando-se o produto, se necessário.
[0269] As suspensões aquosas contêm os materiais ativos (ADC) em mistura com excipientes apropriados para a fabricação de suspensões aquosas. Esses excipientes incluem agente formador de suspensão, tal como carboximetilcelulose de sódio, croscarmelose, povidona, metilcelulose, hidroxipropil metilcelulose, alginato de sódio, polivinilpirrolidona, goma tragacanto e goma acácia, e agentes formadores de dispersão ou umectantes tais como fosfatídeo de ocorrência natural (tal como lecitina), produto de condensação de óxido de etileno com ácido graxo (tal como estearato de polioxietileno), produto de condensação de óxido de etileno com álcool alifático de cadeia longa (tal como heptadecaetilenoooxicetanol), produto de condensação de óxido de etileno com éster parcial derivado de ácido graxo e anidrido hexitol (tal como monooleato de polioxietileno sorbitan). A suspensão aquosa pode também conter um ou mais conservantes, tais como p-hidróxi- benzoato de etila ou n-propila, um ou mais agentes corantes, um ou mais agentes aromatizantes e um ou mais agentes adoçantes, tais como sacarose ou sacarina.
[0270] As composições farmacêuticas de ADC podem apresentar- se na forma de preparação injetável estéril, tal como suspensão oleaginosa ou aquosa injetável estéril. Esta suspensão pode ser formulada de acordo com o estado da técnica, utilizando os agentes umectantes ou dispersantes e agentes formadores de suspensão apropriados que foram mencionados acima. A preparação injetável estéril pode também ser solução ou suspensão injetável estéril em solvente ou diluente parenteralmente aceitável não tóxico, tal como solução em 1,3-butano-diol, ou preparada na forma de pó liofilizado. Dentre os veículos e solventes aceitáveis que podem ser empregados, encontram-se água, solução de Ringer e solução de cloreto de sódio isotônico. Além disso, óleos fixos estéreis podem ser convencionalmente empregados na forma de solvente ou meio formador de suspensão. Com este propósito, qualquer óleo fixo suave pode ser empregado, incluindo mono ou diglicérides sintéticos. Além disso, ácidos graxos tais como ácido oléico podem ser utilizados de forma similar na preparação de injetáveis.
[0271] A quantidade de ingrediente ativo que pode ser combinada com o material veículo para produzir uma única forma de dosagem variará dependendo do hospedeiro tratado e do modo de administração específico. A solução aquosa destinada à infusão intravenosa, por exemplo, pode conter cerca de 3 a 500 μg do ingrediente ativo por mililitro de solução, para que possa ocorrer infusão de um volume apropriado em uma velocidade de cerca de 30 ml/h. Administração subcutânea (mistura) pode ser efetuada com cerca de 1,5 ml ou menos de volume total e concentração de cerca de 100 mg de ADC por mililitro. Para ADC que necessitam de administração crônica e frequente, pode-se empregar a via subcutânea, tal como por meio de seringa previamente cheia ou tecnologia de dispositivo autoinjetor.
[0272] Como proposição geral, a quantidade farmaceuticamente eficaz inicial de ADC administrado por dose estará na faixa de cerca de 0,01 a 100 mg/kg, nomeadamente cerca de 0,1 a 20 mg/kg de peso do corpo do paciente por dia, com a faixa inicial típica de composto utilizada sendo de 0,3 a 15 mg/kg/dia. Pacientes humanos, por exemplo, podem receber dose inicial de cerca de 1,5 mg de ADC por kg de peso do corpo do paciente. A dose pode ser escalonada até a dose máxima tolerada (MTD). O cronograma de dosagem pode ser a cada três semanas, mas, de acordo com a resposta ou condição diagnosticada, o cronograma pode ser mais ou menos frequente. A dose pode ser adicionalmente ajustada durante o transcurso do tratamento para que esteja na MTD ou abaixo dela, o que pode ser administrado de forma segura por diversos ciclos, tais como cerca de quatro ou mais.
[0273] Formulações apropriadas para administração parenteral incluem soluções de injeção estéril aquosas e não aquosas que podem conter antioxidantes, tampões, bacteriostáticos e solutos que tornam a formulação isotônica com o sangue do paciente desejado; e suspensões estéreis aquosas e não aquosas que podem incluir agentes formadores de suspensão e agentes espessantes.
[0274] Embora a administração oral de produtos terapêuticos de proteínas seja geralmente desfavorecida devido à pouca biodisponibilidade por absorção limitada, hidrólise ou desnaturação no intestino, formulações de ADC apropriadas para administração oral podem ser preparadas na forma de unidades discretas tais como cápsulas, comprimidos ou pastilhas, cada qual contendo quantidade previamente determinada do ADC.
[0275] As formulações podem ser embaladas em recipientes com dose única ou múltiplas doses, tais como ampolas e frascos vedados, e podem ser armazenadas em condição seca por congelamento (liofilizada), necessitando apenas da adição do veículo líquido estéril, tal como água, para injeção imediatamente antes do uso. Suspensões e soluções para injeção extemporânea são preparadas a partir de pós, grânulos e pastilhas estéreis do tipo descrito anteriormente. Exemplos de formulações de dosagem única contêm dose diária ou subdose diária unitária, ou sua fração apropriada, do ingrediente ativo.
[0276] A presente invenção fornece ainda composições veterinárias que compreendem pelo menos um ingrediente ativo conforme definido acima junto com veículo veterinário para ele. Veículos veterinários são materiais úteis para o propósito de administração da composição e podem ser materiais sólidos, líquidos ou gasosos que, de outra forma, são inertes ou aceitáveis na técnica veterinária e são compatíveis com o ingrediente ativo. Estas composições veterinárias podem ser administradas por via parenteral, oral ou por qualquer outra via desejada.
TRATAMENTOS COM CONJUGADOS DE DROGA E ANTICORPO
[0277] Contempla-se que os conjugados de droga e anticorpo (ADC) de acordo com a presente invenção possam ser utilizados para o tratamento de diversas doenças ou disfunções, tais como câncer e condições autoimunes. Exemplos de condições ou disfunções incluem tumores benignos e malignos; leucemia e malignidades linfóides; outras disfunções tais como disfunções neuronais, gliais, astrocitais, hipotalâmicas e outras glandulares, macrofagais, epiteliais, estromais, blastocoélicas, inflamatórias, angiogênicas e imunológicas. Câncer suscetível ao tratamento com ADC inclui os que são caracterizados pela sobreexpressão (overexpressing) de certos antígenos associados a tumores ou receptores da superfície celular, tais como HER2.
[0278] Os compostos de ADC que são identificados nos modelos animais e testes com base em células podem ser adicionalmente testados em primatas superiores portadores de tumores e testes clínicos com seres humanos. Testes clínicos com seres humanos podem ser projetados de forma similar aos testes clínicos que testam a eficácia do anticorpo monoclonal anti- HER2 HERCEPTIN em pacientes com cânceres de mama metastáticos que sobreexpressam (overexpress) ErbB2 que receberam extensa terapia anticâncer anterior conforme relatado por Baselga et al (1996), J. Clin. Oncol. 14: 737-744. O teste clínico pode ser projetado para avaliar a eficácia de ADC em combinação com regimes terapêuticos conhecidos, tais como radiação e/ou quimioterapia envolvendo agentes citotóxicos e/ou quimioterapêuticos conhecidos (Pegram et al (1999), Oncogene 18: 2241-2251).
[0279] Geralmente, a doença ou disfunção a ser tratada é câncer. Exemplos de câncer a ser tratado no presente incluem, mas sem limitar-se a carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma e leucemia ou malignidades linfóides. Exemplos mais específicos desses cânceres incluem câncer de células escamosas (por exemplo, câncer de células escamosas epiteliais), câncer do pulmão, incluindo câncer do pulmão de células pequenas, câncer do pulmão de células não pequenas, adenocarcinoma do pulmão e carcinoma escamoso do pulmão, câncer do peritôneo, câncer hepatocelular, câncer gástrico ou estomacal, incluindo câncer gastrointestinal, tumor estromal gastrointestinal (GIST), câncer pancreático, glioblastoma, câncer cervical, câncer do ovário, câncer do fígado, câncer da bexiga, hepatoma, câncer de mama, câncer do cólon, câncer retal, câncer colo-retal, carcinoma uterino ou endométrico, carcinoma das glândulas salivares, câncer renal ou dos rins, câncer da próstata, câncer da vulva, câncer da tireóide, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma peniano e câncer da cabeça e do pescoço.
[0280] O câncer a ser tratado no presente pode ser caracterizado pela ativação excessiva de receptor de ErbB, tal como HER2. Essa ativação excessiva pode ser atribuída a sobreexpressão (overexpressing) ou aumento da produção do receptor de ErbB ou ligante de ErbB. Em uma realização, teste de prognóstico ou diagnóstico será realizado para determinar se o câncer do paciente é caracterizado pela ativação excessiva de receptor de ErbB. Pode-se determinar, por exemplo, a amplificação e/ou a sobreexpressão (overexpressing) de gene ErbB de receptor ErbB no câncer. Vários testes para determinar essa amplificação/sobreexpressão (overexpressing) são disponíveis na técnica e incluem os testes IHC, FISH e de antígeno oculto descritos acima. Alternativa ou adicionalmente, os níveis de ligante de ErbB, tais como TGF- alfa, no tumor ou em associação com ele podem ser determinados de acordo com procedimentos conhecidos. Estes testes podem detectar proteína e/ou ácido nucléico que o codifica na amostra a ser testada. Em uma realização, os níveis de ligantes ErbB no tumor podem ser determinados utilizando imunohistoquímica (IHC); vide, por exemplo, Scher et al, (1995) Clin. Cancer Research 1: 545-550. Alternativa ou adicionalmente, pode-se avaliar os níveis de ácido nucléico que codifica ligante de ErbB na amostra a ser testada; tal como por meio dos métodos de FISH, Southern Blot ou PCR. Em uma realização, a sobreexpressão (overexpressing) de ErbB2 pode ser analisada por meio de IHC, utilizando, por exemplo, o HERCEPTEST (Dako). Seções de tecidos embutidas em parafina da biópsia de um tumor podem ser submetidas ao teste de IHC de acordo com os critérios de intensidade de manchas de proteína ErbB2 a seguir: Nota 0, nenhuma mancha é observada ou mancha de membrana é observada em menos de 10% das células tumorais; nota 1+, mancha de membrana ligeira/pouco perceptível é detectada em mais de 10% das células tumorais, as células somente são manchadas em parte da sua membrana; nota 2+, mancha fraca a moderada de toda membrana é observada em mais de 10% das células tumorais; nota 3+, mancha moderada a forte de toda membrana é observada em mais de 10% das células tumorais. Os tumores com notas 0 ou 1+ para determinação da sobreexpressão (overexpressing) de ErbB2 podem ser caracterizados como não sobreexpressando (overexpressing) ErbB2, enquanto os tumores com notas 2+ ou 3+ podem ser caracterizados como sobreexpressando (overexpressing) ErbB2.
[0281] Alternativa ou adicionalmente, testes FISH tais como INFORM® (Ventana Co., Arizona) ou PATHVISION® (Vysis, Illinois) podem ser conduzidos sobre tecido tumoroso embutido em parafina e fixo por formalina, para determinar a extensão (se houver) da sobreexpressão (overexpressing) de ErbB2 no tumor.
[0282] Além disso, a amplificação ou sobreexpressão (overexpressing) de receptor de ErbB ou ligante de ErbB pode ser avaliada utilizando teste diagnóstico in vivo, por exemplo, por meio da administração de uma molécula (tal como um anticorpo) que ligue a molécula a ser detectada e seja marcada com uma marca detectável (por exemplo, isótopo radioativo) e varrimento externo do paciente para localização da marca.
[0283] Para a prevenção ou tratamento de doença, a dosagem apropriada de ADC dependerá do tipo de doença a ser tratada, conforme definido acima, da severidade e do curso da doença, se a molécula é administrada para propósitos preventivos ou terapêuticos, terapia anterior, histórico clínico do paciente e reação ao anticorpo e do critério do médico atendente. A molécula é administrada adequadamente ao paciente uma vez ou ao longo de uma série de tratamentos. Dependendo do tipo e da severidade da doença, cerca de 1 μg/kg a 15 mg/kg (tal como 0,1a 20 mg/kg) de molécula é possível dose inicial para administração ao paciente, seja, por exemplo, por meio de uma ou mais administrações separadas ou por meio de infusão contínua. Dosagem diária típica poderá variar de cerca de 1 μg/kg a 100 mg/kg ou mais, dependendo dos fatores mencionados acima. Exemplo de dosagem de ADC a ser administrada a paciente encontra-se na faixa de cerca de 0,1 a cerca de 10 mg/kg de peso do paciente.
[0284] Para administrações repetidas ao longo de vários dias ou mais, dependendo da condição, o tratamento é mantido até que ocorra supressão desejada de sintomas da doença. Exemplo de regime de dosagem compreende a administração de dose de carregamento inicial de cerca de 4 mg/kg, seguida por dose de manutenção semanal de cerca de 2 mg/kg do anticorpo anti-ErbB2. Outros regimes de dosagem podem ser úteis. O andamento desta terapia é facilmente monitorado por meio de técnicas e testes convencionais.
TERAPIA DE COMBINAÇÃO
[0285] Conjugado de droga e anticorpo (ADC) pode ser combinado em uma formulação de combinação farmacêutica ou regime de dosagem como a terapia de combinação, com um segundo composto que possui propriedades anticancerígenas. O segundo composto da formulação de combinação farmacêutica ou regime de dosagem possui preferencialmente atividades complementares ao ADC da combinação, de forma a não se prejudicarem entre si.
[0286] O segundo composto pode ser um agente quimioterapêutico, agente citotóxico, citoquina, agente inibidor do crescimento, agente anti-hormonal, inibidor da aromatase, inibidor de proteína quinase, inibidor de lipídeo quinase, anti-andrógeno, oligonucleotídeo sem sentido (antisense), ribozima, vacina de terapia genética, agente antiangiogênico e/ou cardioprotetor. Essas moléculas encontram-se adequadamente presentes em combinação, em quantidades que são eficazes para o propósito desejado. A composição farmacêutica que contém ADC pode também conter quantidade terapeuticamente eficaz de agente quimioterapêutico tal como inibidor da formação de tubulina, inibidor da topoisomerase ou aglutinante de DNA.
[0287] Alternativa ou adicionalmente, o segundo composto pode ser um anticorpo que liga ErbB2 e bloqueia a ativação de ligante de um receptor de ErbB. O segundo anticorpo pode ser anticorpo monoclonal 2C4 ou 2C4 humanizado “Omnitarg” (WO 01/00245). O segundo anticorpo pode ser conjugado com um agente citotóxico ou quimioterapêutico, tal como maitansinóide, auristatina, caliqueamicina ou porção 1,8 bis-naftalimida. Pode ser desejável, por exemplo, por fornecer adicionalmente anticorpos que se liguem a EGFR, ErbB2, ErbB3, ErbB4 ou fator endotelial vascular (VEGF) na formulação única ou regime de dosagem.
[0288] Outros regimes terapêuticos podem ser combinados com a administração de agente anticancerígeno identificado de acordo com a presente invenção. A terapia de combinação pode ser administrada na forma de regime simultâneo ou sequencial. Quando administrada sequencialmente, a combinação pode ser administrada em duas ou mais administrações. A administração combinada inclui coadministração, utilizando formulações separadas ou uma única formulação farmacêutica, e administração consecutiva em qualquer ordem, em que há período de tempo em que ambos (ou todos) os agentes ativos exercem simultaneamente as suas atividades biológicas.
[0289] Em uma realização, o tratamento com ADC de acordo com a presente invenção envolve a administração combinada de um agente anticancerígeno identificado no presente, e um ou mais agentes quimioterapêuticos ou agentes inibidores do crescimento, que incluem a coadministração de coquetéis de agentes quimioterapêuticos diferentes, opcionalmente junto com tratamento com anticorpo anti-ErbB2, tal como trastuzumab. Os agentes quimioterapêuticos incluem Erlotinib HCl (CP-358774, TARCEVA®, Genentech/OSI), taxanos (tais como paclitaxel e doxetaxel) e/ou antibióticos de antraciclina. Cronogramas de preparação e dosagem para esses agentes quimioterapêuticos podem ser utilizados de acordo com as instruções dos fabricantes ou conforme determinado empiricamente pelos técnicos no assunto. Cronogramas de preparação e dosagem para essa quimioterapia também são descritos em Chemotherapy Service, Ed. M. C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore MD (1992).
[0290] O agente anticancerígeno pode ser combinado com um composto anti-hormonal; por exemplo, composto anti-estrógenos tal como tamoxifen; anti-progesterona tal como onapristona (EP 616.812); ou anti- andrógeno, tal como flutamida, em dosagens conhecidas para essas moléculas. Quando o câncer a ser tratado for câncer independente de hormônios, o paciente pode haver sido submetido anteriormente à terapia anti- hormonal e, depois que o câncer torna-se independente, o anticorpo anti-ErbB2 (e, opcionalmente, outros agentes, conforme descrito no presente) pode ser administrado ao paciente. Pode ser benéfico também coadministrar um cardioprotetor (para evitar ou reduzir disfunções miocardianas associadas à terapia) ou uma ou mais citoquinas ao paciente. Além dos regimes terapêuticos acima, o paciente pode ser submetido à remoção cirúrgica de células cancerosas e/ou terapia de radiação.
[0291] Dosagens apropriadas para qualquer dos agentes coadministrados acima são as utilizadas no presente e podem ser reduzidas devido à ação combinada (sinergia) do agente recém identificado e outros tratamentos ou agentes quimioterapêuticos.
[0292] A terapia de combinação pode fornecer “sinergia” e resultar “sinérgica”, ou seja, o efeito atingido quando os ingredientes ativos utilizados juntos é maior que a soma dos efeitos resulta do uso dos compostos separadamente. Efeito sinérgico pode ser atingido quando os ingredientes ativos são: (1) coformulados e administrados ou fornecidos simultaneamente em formulação de dosagem unitária combinada; (2) fornecidos por meio de alternação ou paralelamente como formulações separadas; ou (3) por algum outro regime. Quando fornecido em terapia de alternação, o efeito sinérgico pode ser atingido quando os compostos são administrados ou fornecidos sequencialmente, tal como por meio de diferentes injeções em seringas separadas. Geralmente, durante a terapia de alternação, dosagem eficaz de cada ingrediente ativo é administrada sequencialmente, ou seja, em série, enquanto, em terapia de combinação, dosagens eficazes de dois ou mais ingredientes ativos são administradas juntas.
METABÓLITOS DOS CONJUGADOS DE DROGA E ANTICORPO
[0293] Também se enquadram dentro do escopo da presente invenção os produtos metabólicos in vivo dos compostos de ADC descritos no presente, até o ponto em que esses produtos são inovadores e não são óbvios sobre o estado da técnica. Esses produtos podem resultar, por exemplo, da oxidação, redução, hidrólise, amidação, esterificação, divisão enzimática e similares do composto administrado. Consequentemente, a presente invenção inclui compostos inovadores e não óbvios produzidos por meio de processo que comrpreende o contato de composto de acordo com a presente invenção com mamífero por período de tempo suficiente para gerar seu produto metabólico.
[0294] Os produtos metabólitos podem ser identificados por meio de preparação de ADC radiomarcado (tal como 14C ou 3H), sua administração parenteral em dose detectável (tal como mais de cerca de 0,5 mg/kg) a animal tal como rato, camundongo, cobaia, macaco ou a seres humanos, permitindo tempo suficiente para que ocorra o metabolismo (tipicamente cerca de trinta segundos a trinta horas) e o isolamento dos seus produtos de conversão a partir da urina, sangue ou outras amostras biológicas. Estes produtos são facilmente isolados, pois eles são marcados (os demais são isolados utilizando anticorpos capazes de ligar epítopos que sobrevivem no metabólito). As estruturas de metabólitos são determinadas de forma convencional, tal como por análise de MS, LC/MS ou NMR. Geralmente, a análise de metabólitos é realizada da mesma forma que estudos de metabolismo de drogas convencionais bem conhecidos dos técnicos no assunto. Os produtos de conversão, desde que não sejam encontrados de outra forma in vivo, são úteis em testes de diagnóstico para dosagem terapêutica dos compostos de ADC.
[0295] Os metabólitos incluem os produtos de divisão in vivo do ADC em que ocorre divisão de qualquer ligação que ligue a porção de droga ao anticorpo. A divisão metabólica pode resultar, portanto, no anticorpo bruto ou em fragmento de anticorpo. O metabólito de anticorpo pode ser ligado ao ligante, no todo ou em parte. A divisão metabólica pode também resultar na produção de porção de droga ou sua parte. O metabólito de porção de droga pode ser ligado ao ligante, no todo ou em parte.
ARTIGOS INDUSTRIALIZADOS
[0296] Em outra realização, é fornecido artigo industrializado ou “kit” que contém ADC e materiais úteis para o tratamento das disfunções descritas acima. O artigo industrializado compreende um recipiente e um rótulo ou bula sobre o recipiente ou a ele associado. Recipientes apropriados incluem, por exemplo, garrafas, ampolas, seringas ou embalagens blister. Os recipientes podem ser formados a partir de uma série de materiais tais como vidro ou plástico. O recipiente contém uma composição de conjugado de droga e anticorpo (ADC) que é eficaz para o tratamento da condição e pode ter uma porta de acesso estéril (o recipiente pode ser, por exemplo, um saco de solução intravenosa ou uma ampola que contém uma tampa perfurável por agulha de injeção hipodérmica). Pelo menos um agente ativo na composição é ADC. O rótulo ou bula indica que a composição é utilizada para o tratamento da condição específica, tal como câncer. Em uma realização, o rótulo ou bula indica que a composição que compreende o anticorpo que liga ErbB2 pode ser utilizada para o tratamento de câncer que expressa um receptor de ErbB selecionado a partir do grupo que consiste de receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR), ErbB2, ErbB3 e ErbB4. Além disso, o rótulo ou bula pode indicar que o paciente a ser tratado é aquele que possui câncer caracterizado pela ativação excessiva de um receptor de ErbB selecionado a partir de EGFR, ErbB2, ErbB3 ou ErbB4. O câncer pode, por exemplo, sobreexpressar um destes receptores e/ou sobreexpressar um ligante de ErbB (tal como TGF-a). O rótulo ou bula pode também indicar que a composição pode ser utilizada para o tratamento de câncer, em que o câncer não é caracterizado pela sobreexpressão (overexpressing) do receptor de ErbB2. Em outras realizações, a bula pode indicar que a composição de ADC também pode ser utilizada para o tratamento de câncer independente de hormônios, câncer da próstata, câncer do cólon ou câncer colo-retal.
[0297] O artigo industrializado pode compreender (a) o primeiro recipiente com composto nele contido, em que o composto compreende um ADC de acordo com a presente invenção, em que o anticorpo do ADC é primeiro anticorpo que liga ErbB2 e inibe o crescimento de células cancerosas que sobreexpressam (overexpress) ErbB2; e (b) o segundo recipiente com um composto nele contido, em que o composto compreende um segundo anticorpo que liga ErbB2 e bloqueia a ativação de ligante de um receptor de ErbB ou conjugado deste segundo anticorpo com maitansinóide. O artigo industrializado nesta realização pode compreender adicionalmente uma bula que indica que os primeiro e segundo compostos podem ser utilizados para o tratamento de câncer. Alternativa ou adicionalmente, o artigo industrializado pode compreender adicionalmente segundo (ou terceiro) recipiente que compreende um tampão farmaceuticamente aceitável, tal como água bacteriostática para injeção (BWFI), solução salina tamponada com fosfato, solução de Ringer e solução de dextrose. Ele pode ainda incluir outros materiais desejáveis do ponto de vista comercial e do usuário, que incluem outros tampões, diluentes, filtros, agulhas e seringas.
EXEMPLOS EXEMPLO 1 PRODUÇÃO, CARACTERIZAÇÃO E HUMANIZAÇÃO DE ANTICORPO MONOCLONAL ANTI- ERBB2 4D5
[0298] O anticorpo monoclonal murino 4D5 que liga especificamente o domínio extracelular de ErbB2 foi produzido conforme descrito em Fendly et al (1990), Cancer Research 50: 1550-1558. Resumidamente, células NIH 3T3/HER2-3400 (que expressam cerca de 1 x 105 moléculas de ErbB2 por célula) produzidas conforme descrito em Hudziak et al (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. (U. S. A.) 84: 7158-7163 foram colhidas com solução salina tamponada com fosfato (PBS) que contém 25 mM de EDTA e utilizadas para imunizar camundongos BALB/c. Os camundongos receberam injeções intraperitoneais de 107 células em 0,5 ml de PBS nas semanas 0, 2, 5 e 7. Os camundongos com anti-soros que imunoprecipitaram ErbB2 marcado com 32P receberam injeções intraperitoneais de extrato de membrana de ErbB2 purificado com aglutinina de gérmen de trigo-Sepharose (WGA) nas semanas 9 e 13. Isso foi seguido por injeção intravenosa de 0,1 ml da preparação de ErbB2 e os esplenócitos foram fundidos com mieloma de camundongo linhagem X63-Ag8.653. Os sobrenadantes de hibridoma foram selecionados em busca de ligação de ErbB2 por ELISA e radioimunoprecipitação.
[0299] O anticorpo monoclonal murino 4D5 foi humanizado, utilizando estratégia de “mutagênese de conversão genética”, conforme descrito em US 5.821.337, cujo relatório descritivo integral é expressamente incorporado ao presente como referência. O anticorpo monoclonal humanizado 4D5 utilizado nos experimentos a seguir é denominado huMAb4D5-8. Este anticorpo é do isotipo IgG1.
EXEMPLO 2 PURIFICAÇÃO DE TRASTUZUMAB
[0300] Uma ampola contendo 440 mg de anticorpo HERCEPTIN® (huMAb4D5-8, rhuMAb HER2, US 5.821.337) foi dissolvida em 50 ml de tampão MES (25 mM de MES, 50 mM de NaCl, pH 5,6) e carregada sobre coluna de troca de cátions (Sepharose S, 15 cm x 1,7 cm) que havia sido equilibrada no mesmo tampão. A coluna foi lavada em seguida com o mesmo tampão (cinco volumes de coluna). Trastuzumab foi eluído elevando-se a concentração de NaCl do tampão para 200 mM. Frações que contêm o anticorpo foram reunidas, diluídas até 10 mg/ml e dialisadas em tampão contendo 50 mm de fosfato de potássio, 50 mM de NaCl, 2 mM de EDTA, pH 6,5.
EXEMPLO 3 PREPARAÇÃO DE CONJUGADOS DE DROGA E ANTICORPO TRASTUZUMAB-SPP-DM1
Figure img0032
[0301] Trastuzumab purificado foi derivado com 4-(2- piridiltio)pentanoato de N-succinimidila para introduzir grupos ditiopiridila. Trastuzumab (375,0 mg, 8 mg/ml) em 44,7 ml de 50 mM de tampão fosfato de potássio (pH 6,5) contendo NaCl (50 mM) e EDTA (1 mM) foi tratado com SPP (5,3 equivalentes molares em 2,3 ml de etanol). Após incubação por noventa minutos sob argônio à temperatura ambiente, a mistura de reação foi filtrada em gel através de coluna Sephadex G25 equilibrada com 35 mM de citrato de sódio, 154 mM de NaCl e 2 mM de EDTA. Frações contendo anticorpos foram reunidas e testadas. O grau de modificação do anticorpo foi determinado conforme descrito acima. A recuperação do anticorpo modificado (trastuzumabSPP-Py) foi de 337 mg (89,7%) com 4,5 grupos 2-tiopiridina liberáveis ligados por anticorpo (p’).
[0302] Trastuzumab-SPP-Py (337,0 mg, 9,5 μmol de grupos 2- tiopiridina liberáveis) foi diluído com o tampão de 35 mM de citrato de sódio acima, pH 6,5, até a concentração final de 2,5 mg/ml. DM1 (N2-deacetil-N2-(3- mercapto-1-oxopropil)-maitansina), cuja estrutura é exibida na Figura 1 (1,7 equivalentes, 16,1 μmol) em 3,0 mM de dimetilacetamida (DMA, 3% v/v na mistura de reação final), foi adicionado em seguida à solução de anticorpo. A reação procedeu-se à temperatura ambiente sob argônio por vinte horas.
[0303] A reação foi carregada sobre coluna de filtragem de gel Sephacryl S300 (5,0 cm x 90,0 cm, 1,77 l) equilibrada com 35 mM de citrato de sódio, 154 mM de NaCl, pH 6,5. A velocidade de fluxo foi de 5,0 ml/min e foram recolhidas 65 frações (20,0 ml cada). Pico principal centralizou-se em volta da fração n° 47 (Figura 3). O pico principal compreende trastuzumab-SPP-DMI monomérico. As frações 44 a 51 foram reunidas e testadas. O número de moléculas de droga DM1 ligadas por molécula de anticorpo (p’) foi determinado por meio de medição da absorção a 252 nm e 280 nm e concluiu-se que é de 3,7 moléculas de droga por molécula de anticorpo.
EXEMPLO 4 PREPARAÇÃO DE CONJUGADOS DE DROGA E ANTICORPO TRASTUZUMAB-SMCC- DM1
Figure img0033
[0304] Trastuzumab purificado foi derivado com 4-(N- maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato de succinimidila, SMCC, Pierce Biotechnology, Inc.) para introduzir o ligante SMCC. Trastuzumab foi purificado a partir de HERCEPTIN® como no Exemplo 2 e tratado com troca de tampão a 20 mg/ml em 50 mM de fosfato de potássio/50 mM de cloreto de sódio/2 mM de EDTA, pH 6,5 com 7,5 a 10 equivalentes molares de SMCC (20 mM em DMSO ou DMA (dimetilacetamida), 6,7 mg/ml). Após agitação por duas a quatro horas sob argônio à temperatura ambiente, a mistura de reação foi filtrada através de coluna Sephadex G25 equilibrada com 50 mM de fosfato de potássio/50 mM de cloreto de sódio/2 mM de EDTA, pH 6,5. Alternativamente, a mistura de reação foi filtrada com gel com 30 mM de citrato e 150 mM de cloreto de sódio sob pH 6. Frações que contêm anticorpo foram reunidas e testadas. A recuperação de trastuzumab-SMCC foi de 88%.
[0305] O intermediário entre ligante e droga, trastuzumab-SMCC do acima, foi diluído com 50 mM de fosfato de potássio/50 mM de cloreto de sódio/2 mM de EDTA, pH 6,5, até concentração final de 10 mg/ml e reagido com solução de 10 mM de DM1 (1,7 equivalentes considerando 5 SMCC/trastuzumab, 7,37 mg/ml) em dimetilacetamida. A reação foi agitada à temperatura ambiente sob argônio por quatro a cerca de dezessseis horas. A mistura de reação de conjugação foi filtrada através de coluna de filtragem de gel Sephadex G25 (1,5 x 4,9 cm) com 1 x PBS sob pH 6,5. Alternativamente, a mistura de reação foi filtrada com gel com 10 mM de succinato e 150 mM de cloreto de sódio sob pH 5. A razão DM1/trastuzumab (p) foi de 3,1, conforme medido por meio da absorção a 252 nm e a 280 nm. A razão entre droga e anticorpo (p) pode também ser medida por meio de espectrometria de massa. A conjugação pode também ser monitorada por meio de eletroforese em gel de poliacrilamida SDS. Pode-se determinar a agregação por meio de análise de difusão de raio laser. CONJUGADOS DE ANTICORPO-SMCC-DM1:
[0306] Seguindo este protocolo, foram preparados outros conjugados de droga e anticorpo com o ligante SMCC e a porção de droga DM1, que incluem:
Figure img0034
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CONJUGADOS DE ANTICORPO-BMPEO-DM1:
[0307] Para a conjugação de cisteína, o anticorpo pode ser reduzido com agente redutor tal como ditiotreitol (DTT) ou TCEP, na presença de EDTA. Após incubação por cerca de uma hora a 37 °C, o pH é ajustado em cerca de 7 com 100 mM de fosfato de potássio. O anticorpo reduzido é modificado pelo reagente de bis-maleimido BM(PEO)4 (Pierce Chemical), deixando grupo maleimido não reagido sobre a superfície do anticorpo. Isso pode ser conseguido por meio de dissolução de BM(PEO)4 em mistura de 50% etanol/água até a concentração de 10 mM e adição de excesso molar de dez vezes a uma solução que contém anticorpo em solução salina tamponada com fosfato sob concentração de cerca de 1,6 mg/ml (10 μM), mantendo-a em reação por uma hora para formar Ab-BMPEO. BM(PEO)4 em excesso é removido por meio de filtragem com gel (coluna HiTrap, Pharmacia) em 30 mM de citrato, pH 6 com 150 mM de tampão NaCl. Um excesso molar de cerca de dez vezes DM1 é dissolvido em dimetil acetamida (DMA) e adicionado ao intermediário de Ab-BMPEO. Dimetilformamida (DMF) pode também ser empregado para dissolver o reagente de porção de droga. A mistura de reação é mantida em reação por uma noite antes da filtragem de gel ou diálise em PBS para remover DM1 não reagido. Filtragem em gel sobre colunas S200 em PBS foi utilizada para remover agregados de alto peso molecular e fornecer Ab-BMPEO-DM1 purificado.
[0308] Seguindo este protocolo, foram preparados outros conjugados de droga e anticorpo com o ligante BMPEO e a porção de droga DM1, que incluem:
Figure img0039
EXEMPLO 5 TESTE DE PROLIFERAÇÃO CELULAR IN VITRO
[0309] A eficácia de ADC foi medida por meio de teste de proliferação celular empregando o protocolo a seguir (Boletim Técnico Promega Corp. TB288; Mendoza et al (2002), Cancer Res. 62: 5485-5488): 1. Parcela de 100 μl de cultivo celular contendo cerca de 104 células (SKBR-3, BT474, MCF7 ou MDA-MB-468) em meio foi depositada em cada cavidade de placa de 96 cavidades com paredes opacas. 2. Foram preparadas cavidades de controle contendo meio e nenhuma célula. 3. ADC foi adicionado às cavidades experimentais e incubado por três a cinco dias. 4. As placas foram equilibradas à temperatura ambiente por cerca de trinta minutos. 5. Adicionou-se volume de Reagente CellTiter-Glo igual ao volume de meio de cultivo celular presente em cada cavidade. 6. O conteúdo foi misturado por dois minutos sobre agitador orbital para induzir a lise celular. 7. A placa foi incubada à temperatura ambiente por dez minutos para estabilizar o sinal de luminescência. 8. A luminescência foi registrada e relatada em gráficos como RLU = unidades de luminescência relativa.
EXEMPLO 6 LIBERAÇÃO NO SORO E ESTABILIDADE EM CAMUNDONGOS
[0310] Camundongos selvagens (sem tumores), brutos e de mutação bege em seis grupos de quatro animais foram estudados. No Dia 0, cada camundongo recebeu uma única dose de 2 mg/kg de ADC em 200 μl de veículo aquoso, exceto pelo Grupo Veículo que recebeu apenas veículo. Sangue foi recolhido por meio de punção cardíaca sob anestesia em cada momento (cinco minutos, uma hora, seis horas, 24 horas, 72 horas e 168 horas) após a dosagem. O soro foi isolado e foram medidos o anticorpo e ADC. Grupo 1: Veículo (PBS, pH 6,5, sem ADC) Grupo 2: Trastuzumab-SMCC-DM1 Grupo 3: Trastuzumab-SPP-DM1 Grupo 4: Trastuzumab-SPDP-DM1 Grupo 5: Trastuzumab-SPP-DM3 Grupo 6: Trastuzumab-SPP-DM4
EXEMPLO 7 ESTABILIDADE DO SORO EM RATOS
[0311] Foram estudados seis grupos de dosagem com seis ratos Sprague-Dawley (100 a 125 gramas cada) por grupo de dosagem. No Dia 0, os animais receberam administração de uma única dose IV de Veículo, 10 mg/kg de trastuzumab-SPP-DM1 ou 10 mg/kg de trastuzumab-SMCC-DM1, em volume de dose de 10 ml/kg através da veia lateral da cauda. Cerca de 300 μl de sangue integral foram recolhidos em cada momento: 0 (dose prévia), 10 e 30 minutos: 1, 2, 4, 8, 24 e 36 horas; e 2, 3, 4, 7, 14, 21 e 28 dias após a dosagem.
EXEMPLO 8 EFICÁCIA IN VIVO DO VOLUME DO TUMOR
[0312] Camundongos explantes transgênicos com alta expressão de HER2:
[0313] Animais apropriados para experimentos transgênicos podem ser obtidos por meio de fontes comerciais padrão tais como Taconic (Germantown NY). Muitas linhagens são apropriadas, mas fêmeas de camundongos FVB são preferidas devido à sua suscetibilidade à formação de tumores. Machos de FVB foram utilizados para acasalamento e machos CD.1 vasectomizados foram utilizados para estimular gravidez psicológica. Camundongos vasectomizados podem ser obtidos por meio de qualquer fornecedor comercial. Os fundadores foram obtidos com camundongos FVB ou com camundongos heterozigóticos 129/BL6 x FVB p53. Os camundongos com heterozigosidade em alelo p53 foram utilizados para aumentar potencialmente a formação de tumores. Isso, entretanto, comprovou ser desnecessário. Portanto, alguns tumores F1 são de linhagem misturada. Os tumores fundadores são somente de FVB. Seis fundadores foram obtidos com alguns tumores em desenvolvimento sem ter ninhadas.
[0314] Os animais que apresentam tumores (aloenxerto propagado a partir de camundongos transgênicos Fo5 mmtv) foram tratados com uma única injeção de conjugado de trastuzumab-DM1 maitansinóide (dose de 10 mg/kg) e o volume do tumor foi determinado por mais de vinte dias após a injeção.
[0315] Camundongos SCID de xenoenxerto Bjab-luc:
[0316] Grupos de oito a dez camundongos SCID com vinte milhões de células de tumores de xenoenxertos de Bjab-luc por camundongo receberam dose no dia 1 com conjugado de droga e anticorpo ou anticorpo bruto. Grupo de oito camundongos foi testado com ADC anti-CD22, anticorpos anti-CD22 brutos e controle. ADC controle (trastuzumab-SMCC-DM1; carga: DMI/trastuzumab = 3,2) não é aglutinante específico e recebeu 200 μg de DM1/m2, 4,2 trastuzumab/kg de camundongo, e resultou em tempo médio para o dobro do tumor de cerca de três dias. Conjugados anti-CD22 7A2-SMCC- DM1 (carga: DM1/Ab = 3,6), 5E8-SMCC- DM1 (carga: DM1/Ab = 3,6) e RFB4- SMCC-DM1 (carga: DM1/Ab = 4,3). Os anticorpos brutos 7A2, 5E8 e RFB4 foram dosados em 4 mg/kg de camundongo.
EXEMPLO 9 TOXICIDADE EM RATOS
[0317] Foi avaliado o perfil de toxicidade aguda de trastuzumab- SPP-DM1 (ligante dissulfeto) em comparação com o de DM1 livre e trastuzumab-SMCC-DM1 (ligante não-dissulfeto). Os animais receberam injeção no dia 1, os perfis de hematologia e química completos foram obtidos na linha base, dia 3 e dia 5 e necrópsia completa foi realizada no dia 5. Histologia de rotina foi realizada em três animais aleatórios para cada grupo para os tecidos a seguir: esterno, fígado, rim, timo, baço, intestino grosso e delgado. Os grupos experimentais foram os seguintes: Grupo 1: veículo (10 mM de succinato de sódio, 100 mg/ml de sacarose, 0,1% Tween 20, pH 5,0). Grupo 2: Trastuzumab-SPP-DM1, 22,3 mg/kg. Grupo 3: Trastuzumab-SMCC-DM1, 10 mg/kg. Grupo 4: Trastuzumab-SMCC-DM1, 25 mg/kg. Grupo 5: Trastuzumab-SMCC-DM1, 50 mg/kg. Grupo 6: DM1 livre, 160 μg/kg.
EXEMPLO 10 TOXICIDADE/SEGURANÇA PARA MACACOS CYNOMOLGUS
[0318] Foram estudados três grupos de quatro Macaca fascicularis (macacos cynomolgus) selvagens (dois machos e duas fêmeas).
[0319] Grupo 1: (quatro animais) receberam apenas veículo (PBS, pH 6,5, ou seja, formulação menos ADC) no dia 1 e no dia 22, seguido por necrópsia no dia 36.
[0320] Grupo 2: (quatro animais) receberam trastuzumab-SMCC- DM1,4900 μg/m2 no dia 1 e no dia 22.
[0321] Grupo 3: (quatro animais) receberam trastuzumab-SMCC- DM1, 7200 μg/m2 no dia 22.
[0322] A dosagem é expressa em extensão de animal, de forma que seja relevante para outras espécies, ou seja, a dosagem em μg/m2 é independente da espécie e, portanto, comparável entre as espécies. Formulações de trastuzumab-SMCC-DM1 para estudos do Grupo 2 e do Grupo 3 continham PBS, 5,4 mM de fosfato de sódio, 4,2 mM de fosfato de potássio e 140 mM de cloreto de sódio, pH 6,5.
[0323] Sangue foi recolhido para análise de hematologia prévia a primeira dosagem (período de aclimatação) e nos dias 3, 7, 11 e 14 após a primeira dose (Grupos 1 e 2) e nos dias 3, 7, 11, 14 e 21 após a segunda dose (Grupos 1, 2 e 3). As contagens de eritrócitos (RBC) e plaquetas (PLT) foram medidas por meio do método de difusão de luz. A contagem de leucócitos (WBC) foi medida por meio do método de peroxidase/basófilos. A contagem de reticulócitos foi medida por meio do método de difusão de luz com tintura catiônica. As contagens celulares foram medidas em aparelho Advia 120. ALT (alanino aminotransferase) e AST (aspartato aminotransferase) foram medidas em U/L por UV/NADH; metodologia IFCC em aparelho Olympus AU400 e utilizando Total Ab ELISA - ECD/GxhuFc-HRP. Conj. Ab ELISA - xDM1/ECD- Bio/SA-HRP testes.
[0324] Todas as patentes, pedidos de patentes e referências mencionadas ao longo de todo o relatório descritivo são expressamente incorporados como referência.

Claims (17)

1. COMPOSTO CONJUGADO DE DROGA E ANTICORPO, caracterizado por compreender um anticorpo ligado covalentemente por um ligante a uma ou mais porções de droga maitansinóide, em que o composto possui a Fórmula I: Ab-(L-D)p i ou um sal ou solvato farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que: - Ab é huMAb4D5-8 (trastuzumab); - L é 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato de succinimidila (SMCC); - D é uma porção de droga maitansinóide DM1 tendo a seguinte estrutura;
Figure img0040
2. COMPOSTO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo anticorpo ligar-se especificamente a um receptor de HER2.
3. COMPOSTO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ligar-se especificamente ao domínio extracelular do receptor de HER2 e inibir o crescimento de células tumorais que sobreexpressam receptor de HER2.
4. COMPOSTO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo anticorpo ser ligado ao ligante por meio de um tiol de cisteína do anticorpo.
5. COMPOSTO, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por p ser 1, 2, 3 ou 4.
6. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada por compreender o composto conjugado de droga e anticorpo, conforme definido na reivindicação 1, ou seu sal farmaceuticamente aceitável, e um diluente, veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitáveis.
7. MÉTODO DE FABRICAÇÃO DE COMPOSTO CONJUGADO DE DROGA E ANTICORPO, conforme definido na reivindicação 1, caracterizado pelo método compreender: - reagir Ab com um reagente ligante para formar um intermediário de anticorpo e ligante Ab-L e, em seguida, reagir Ab-L com uma porção de droga D para formar o conjugado de droga e anticorpo; ou - reagir uma porção de droga D com um reagente ligante para formar um intermediário de droga e ligante D-L e, em seguida, reagir D-L com Ab para formar o conjugado de droga e anticorpo.
8. USO DE UMA FORMULAÇÃO, de um composto conjugado de droga e anticorpo, conforme definido na reivindicação 1, e um diluente, veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitáveis caracterizado por ser para a preparação de um medicamento para o tratamento de câncer.
9. USO, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo câncer ser selecionado a partir do grupo que consiste em câncer de mama, ovário, estômago, endométrico, glândula salivar, pulmão, rim, cólon, colo-retal, tireóide, pancreático, de próstata e de bexiga.
10. USO, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo câncer ser câncer de mama que sobreexpressa ErbB2 em um nível 2+ ou maior.
11. USO, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo conjugado de droga e anticorpo ser formulado com um veículo parenteral farmaceuticamente aceitável.
12. USO, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo conjugado de droga e anticorpo ser formulado em uma forma injetável de dosagem unitária.
13. USO DE UM CONJUGADO DE DROGA E ANTICORPO E UM AGENTE QUIMIOTERAPÊUTICO, que se liga especificamente a um receptor de fator de crescimento selecionado a partir de HER2 ou EGF, caracterizado por ser para a preparação de um medicamento para inibir o crescimento de células tumorais, que sobreexpressam um receptor de fator de crescimento.
14. USO DE UMA COMBINAÇÃO, de um composto conjugado de droga e anticorpo, conforme definido na reivindicação 1, e um agente quimioterapêutico ou um agente inibidor do crescimento, caracterizado por ser para a preparação de um medicamento para o tratamento de uma disfunção que apresenta sobreexpressão de receptor de ErbB2.
15. USO, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo anticorpo do conjugado de droga e anticorpo ser um anticorpo anti-ErbB2.
16. USO, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo anticorpo anti-ErbB2 possuir uma característica biológica de um anticorpo monoclonal 4D5.
17. USO, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo anticorpo anti-ErbB2 ligar-se essencialmente ao mesmo epítopo que um anticorpo monoclonal 4D5.
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