KR101931820B1 - 항―ｃ４.４ａ 항체 및 그의 용도 - Google Patents

항―ｃ４.４ａ 항체 및 그의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR101931820B1
KR101931820B1 KR1020127017608A KR20127017608A KR101931820B1 KR 101931820 B1 KR101931820 B1 KR 101931820B1 KR 1020127017608 A KR1020127017608 A KR 1020127017608A KR 20127017608 A KR20127017608 A KR 20127017608A KR 101931820 B1 KR101931820 B1 KR 101931820B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
ser
gly
ala
leu
val
Prior art date
Application number
KR1020127017608A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20120116958A (ko
Inventor
라르스 린덴
용-지앙 카오
가브리엘 레더
베아트릭스 스텔트-루드빅
악셀 하렌가
리카르다 핀네른
프란크 디트머
안케 마이어-바르트슈미드
위르겐 프란츠
시모네 그레벤
외르그 빌루다
얀 테베
Original Assignee
바이엘 파마 악티엔게젤샤프트
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 바이엘 파마 악티엔게젤샤프트 filed Critical 바이엘 파마 악티엔게젤샤프트
Publication of KR20120116958A publication Critical patent/KR20120116958A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101931820B1 publication Critical patent/KR101931820B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/42—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof; Derivatives thereof, e.g. albumin, gelatin or zein
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/06—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations
    • A61K49/08—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by the carrier
    • A61K49/10—Organic compounds
    • A61K49/14—Peptides, e.g. proteins
    • A61K49/16—Antibodies; Immunoglobulins; Fragments thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Abstract

본 발명은 여러 종양, 예를 들어, 폐암, 결장직장암, 췌장암, 전립선암, 신장암 및 유방암에서 과다발현되는 막-고정(anchored) 29 kDa C4.4a 폴리펩티드에 대해 특이적인, 재조합 항원-결합 영역 및 이같은 항원-결합 영역을 함유하는 항체 및 기능적 단편을 제공한다. 따라서, 이러한 항체는 이러한 장애 및 상태 및 기타 장애 및 상태를 치료하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 항체는 진단 분야에서, 뿐만 아니라, 추가로 암과 관련된 장애의 진행에서의 C4.4a의 역할을 연구하기 위해 또한 사용될 수 있다. 본 발명은 상기 항체를 코딩하는 핵산 서열, 이를 함유하는 벡터, 제약 조성물, 및 사용 설명서가 있는 키트를 또한 제공한다.

Description

항―Ｃ４.４Ａ 항체 및 그의 용도{ANTI-C4.4A ANTIBODIES AND USES THEREOF}
본 발명은 종양에서 과다발현되는 C4.4a로 명명된 막-고정(anchored) 29 kDa 폴리펩티드에 대해 특이적인, 재조합 항원-결합 영역 및 이같은 항원-결합 영역을 함유하는 항체 및 기능적 단편을 제공한다.
추가로, 이는 이러한 암 유형의 전이물에서의 과다성이 높다. 따라서, 상기 항체는 이러한 장애 및 상태 및 기타 장애 및 상태를 치료하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 항체는 진단 분야에서, 뿐만 아니라, 추가로 암과 관련된 장애의 진행에서의 C4.4a의 역할을 연구하기 위해 또한 사용될 수 있다. 본 발명은 상기 항체를 코딩하는 핵산 서열, 이를 함유하는 벡터, 제약 조성물, 및 사용 설명서가 있는 키트를 또한 제공한다.
발명의 배경
항체-기반 치료법은 고형 종양을 비롯한 다양한 암의 치료에서 매우 효과적인 것으로 판명되고 있다. 예를 들어, 허셉틴(HERCEPTIN)®이 유방암을 치료하는데 성공적으로 사용되었고, 리툭산(RITUXAN)®이 B-세포 관련 암 유형에서 효과적이다. 성공적인 항체-기반 치료법 개발의 핵심은 종양 세포 상에서 우선적으로 발현되는 것으로 발견된 세포-표면 단백질에 대한 항체의 단리이다. C4.4a (유전자명: LYPD3) 폴리펩티드는 고도로 글리코실화된 글리코포스파티딜이노시톨 (GPI)-고정 세포 표면 단백질이다. 래트 C4.4a는 전이 중인 래트 췌장 종양 세포 내의 전이-관련 세포 표면 단백질로서 최초로 기술되었다 (문헌 [Roesel M. et al., Oncogene 1998, 17(15):1989-2002]). 태반 cDNA 라이브러리로부터 인간 C4.4a가 클로닝되었다 (문헌 [Wuerfel, J. et al., Gene 2001, 262:35-41]). C4.4a는 uPAR 수용체에 대한 구조적 상동성을 나타내고, 2개의 LY6 도메인을 함유하여, 전형적인 3-핑거 단백질 폴드(fold)를 나타낸다 (문헌 [Jacobsen B. & Ploug M., Current Medicinal Chemistry 2008, 15:2559-2573]). 이러한 단백질은 고도로 글리코실화되고, 6개의 예상 N-글리코실화 부위 및 몇몇 O-글리코실화 부위를 함유한다. 또한, C4.4a는 2개의 Ly6 도메인 내에 위치하는 총 9개의 디술피드 결합을 함유한다 (문헌 [Hansen L. et al., Biochem J. 2004, 380:845-857]). C4.4a는 폐암, 결장직장암, 유방암, 자궁경부암, 췌장암, 신장암, 두경부암 및 흑색종과 같은 종양 세포에서 강한 발현을 나타낸다. 노던(Northern) 블롯 분석은 원발성 폐 종양의 약 50％ 및 폐 종양 전이의 약 75％에서 C4.4a 발현을 나타낸 한편, 비-질환 폐 조직에서의 발현은 검출불가능하였다 (문헌 [Wuerfel J. et al., Gene 2001, 262:35-41]). 비-소세포 폐암에서, C4.4a가 예후 마커로서 사용될 수 있다. 이때, 임상 데이터는 높은 C4.4a 발현이 불량한 예후와 상관된다는 것을 명확하게 나타낸다 (문헌 [Hansen L. et al., Lung Cancer 2007, 58:260-266]). 흑색종에서, 상세한 발현 분석은 C4.4a가 멜라닌세포 및 반점에서는 발현되지 않지만, 원발성 악성 흑색종의 약 60％ 및 림프절 및 피부 전이의 100％에서 발현된다는 것을 드러냈다 (문헌 [Seiter S. et al., J Invest Dermatol. 2001, 116(2):344-347]). 또한, 필적하는 인근의 정상 유방 조직과 비교하여 유방암 조직에서 (문헌 [Fletcher G.C., Br. J. Cancer 2003, 88(4):579-585]), 다양한 유방암 세포주에서, 그리고 정상 요로상피와 비교하여 요로상피암에서 (문헌 [Smith B. A. et al., Cancer Res 2001, 61(4):1678-1685]), C4.4a 유전자 발현의 상향 조절이 발견되었다. 결장직장암, 췌장암, 유방암 및 전립선암의 다양한 종양 세포주에서 폴리클로날 항체로의 FACS에 의해 C4.4a 발현이 실연되었다. 결장직장암, 췌장암 및 유방암 샘플의 IHC 연구에서, 인간 종양 세포주 상에서의 C4.4a의 가변성 글리코실화가 이러한 항체의 결합을 방해한다. 따라서, 이러한 폴리클로날 항체의 결합을 허용하기 위해 C4.4a가 적어도 부분적으로 탈글리코실화되어야 한다. 결장직장암 환자에서, C4.4a 발현이 고도로 만연하고, C4.4a가 세포 표면으로부터 박리되어, 이를 예후성 혈청 종양 마커이게 한다. 침습성 전방에서의 C4.4a 발현은 결장직장암의 질환 재발에 대한 신규 예후 마커이다 (문헌 [K. Konishi et al., Cancer Science 2010]). 가용성 혈청 C4.4a에 대한 진단성 항체는 기술되지 않았다 (문헌 [Paret C. et al., British Journal of Cancer 2007, 97:1146-1156]). 정상 조직에서는 C4.4a 발현이 피부 각질세포, 식도 내피 세포 및 태반 세포에 제한되어 (문헌 [Wuerfel J. et al., Gene 2001, 262:35-41]), 이를 종양 치료법에 대한 이상적인 표적이게 한다. WO01/23553에서, 암의 치료를 위한 C4.4a 발현 또는 활성을 감소시키거나 억제하는 C4.4a 억제제 (예를 들어, 항-C4.4a 항체)의 용도가 제안되었다.
C4.4a의 정확한 기능은 미지이다; 그러나, 이는 상처 치유시 이동성 각질세포에서 상향 조절된다 (문헌 [Hansen L. et al., Biochem J. 2004, 380:845-857]). 전이 관련성 및 uPAR에 대한 구조적 상동성의 견지에서, 이러한 분자가, 아마도 세포외 기질과의 상호작용을 통해, 종양 세포 침습에서 수반된다는 것이 제안되었다 (문헌 [Roesel M. et al., Oncogene 1998, 17(15):1989-2002]; [Paret C. et al., British Journal of Cancer 2007, 97:1146-1156]). 잠재적인 리간드는 라미닌(Laminin) 1 및 5, 갈렉틴(Galectin) 3 (문헌 [Paret C., Int. J. Cancer 2005, 115:724-733]), 뿐만 아니라 agr2 및 agr3 (문헌 [Fletcher GC., Brit. J. Cancer 2003, 88:579-585])이다.
정상 조직에 대한 감소된 비-특이적 결합을 초래하는, 치료 항체와 그의 뮤린(murine) 오르토로그(orthologue)의 교차-반응성의 결여로 인해 면역독소 암 치료법의 임상 결과를 위한 이종이식 뮤린 암 모델의 예상 가치가 종종 제한된다. 한편, 뮤린 또는 키메라 항체로 치료 중인 환자에서 형성되는 중화성 항-마우스 Fv 항체가 용량-제한 독성 또는 감소된 치료 효능을 초래할 수 있다. 따라서, 암 치료법에서 특이적 C4.4a 발현의 잠재력을 충분히 활용하기 위해, 고친화도 C4.4a 결합의 장점을 완전히 인간형이거나 인간화된 항체 양식과, 그리고 뮤린 교차-반응성과 조합하는 표적화 항체가 요구된다.
신규 항체의 추가적인 필요한 특색은 표면 상에 C4.4a를 발현하는 상이한 암 세포주들에 대한 고친화도 결합이다. C4.4a는 종양 세포들 상에서 상이하게 글리코실화된다 (문헌 [Paret C. et al., British Journal of Cancer 2007 97:1146-1156]). 따라서, 효과적인 항-C4.4a 항체는, 상이한 형태의 C4.4a의 발현을 초래하는 글리코실화 패턴에서의 변이성을 포함하지만 이에 한정되지 않는 개체 변이와 독립적으로, 상이한 환자들로부터의 종양 세포가 제시하는 에피토프에 결합하여야 한다.
C4.4a에 높은 친화도로 결합하고, 효율적으로 내재화되며, 또 다른 종으로부터의 C4.4a에 대해 바람직하게 교차-반응성인 항체, 그의 항원-결합 항체 단편 또는 그의 변이체가 본원에서 제공된다. 암, 특히 예컨대 유방, 기도, 뇌, 생식 기관, 소화관, 요로, 눈, 간, 피부, 두경부, 갑상선, 부갑상선 및 이들의 원격 전이물의 암이고, 림프종, 육종 및 백혈병을 또한 포함하는 C4.4a 발현 종양에 대한 항체-기반 치료법이 또한 제공된다. 이러한 치료법은 암 세포로의 치료 활성제의 전달을 용이하게 하는 항체, 그의 항원-결합 항체 단편 또는 그의 변이체를 이용한다.
발명의 개요
본 발명의 목적은 세포 표면 상에 GPI-고정된 또는 GPI-부분의 제거에 의해 가용성인 환자 혈청 내의 C4.4a 폴리펩티드에 대해 고도로 선택적이고, 폐, 결장, 유방, 자궁경부, 췌장, 신장, 두경부 또는 흑색종의 암과 같은 질환 상태와 관련된 C4.4a 발현의 검출 방법 및 이같은 질환 상태의 치료에서 사용될 수 있는 항체 또는 그의 항원-결합 항체 단편 또는 그의 변이체를 제공하는 것이다. 이를 위해, 본 발명의 목적은 아미노산 278개 (서열 1)의 상이한 형태의 성숙 인간 C4.4a 폴리펩티드에 존재하고/하거나, C4.4a 발현 암 세포주에 의해 제시되고/되거나, 이러한 항체가 높은 친화도로 결합하는 C4.4a 에피토프에 특이적으로 결합하는 단리된 인간, 인간화 또는 키메라 항체 또는 그의 항원 결합 항체 단편을 제공하는 것이다. 본원에서 사용되는 바, 상이한 '형태'의 C4.4a는 상이한 당형(glycoform), 상이한 이소형(isoform), 또는 상이한 번역 및 번역후 변형이 진행된 C4.4a 폴리펩티드를 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 본 발명의 또 다른 목적은 인간 투여에 안전한 항체, 또는 그의 항원-결합 항체 단편, 또는 그의 변이체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 인간 C4.4a에 결합하고 또 다른 종의 C4.4a에 대해 교차-반응성인 항체, 또는 그의 항원-결합 항체 단편, 또는 그의 변이체를 제공하는 것이다. 바람직하게는, 상기 다른 종은 설치류, 예컨대 예를 들어 마우스 또는 래트이다. 가장 바람직하게는, 항체, 또는 그의 항원-결합 항체 단편, 또는 그의 변이체는 인간 C4.4a에 결합하고, 뮤린 C4.4a에 대해 교차-반응성이다.
본 발명의 또 다른 목적은 광범위한 상이한 C4.4a-발현 세포주들에 결합하는 항체, 또는 그의 항원-결합 항체 단편, 또는 그의 변이체를 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 하나 이상의 본 발명의 항체 또는 그의 변이체를 사용함으로써, 상이한 C4.4a-발현 암 세포 또는 종양 세포에 결합하고 C4.4a-발현 암 세포에 대한 면역 이펙터 활성 (예를 들어 ADCC 또는 CDC)을 도출하는 항체 또는 그의 변이체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 C4.4a 발현 세포에 대한 결합 후 효율적으로 내재화되는 항체, 또는 그의 항원-결합 항체 단편, 또는 그의 변이체를 제공하는 것이다. 본 발명의 항체는 공지된 의약과 공동-투여될 수 있고, 일부 경우에는, 항체 자체가 변형될 수 있다. 예를 들어, 잠재적으로 효능을 더 증가시키도록 항체가 세포독성제, 면역독소, 독소단 또는 방사성동위원소에 접합될 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 C4.4a 발현이 정상 조직과 비교하여 상승되었거나 C4.4a가 세포 표면으로부터 박리되어 혈청에서 검출가능하게 된 악성 또는 이형성 상태의 진단을 위한 도구를 구성하는 항체를 제공하는 것이다. 검출가능한 마커에 접합된 항-C4.4a 항체가 제공된다. 바람직한 마커는 방사성표지, 효소, 발색단 또는 형광물질이다.
또한 본 발명은 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 발현하는 세포, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 생산하는 방법, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 사용하여 이형성 세포의 성장을 억제하는 방법, 및 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 사용하여 암을 치료하고 검출하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 a) 세포 표면에서 발현되고 완전히 글리코실화된 천연 C4.4a에, 바람직하게는 세포 표면에서 발현되고 완전히 글리코실화된 천연 C4.4a의 도메인 S1에 결합하고, b) 뮤린 C4.4a에 대해 교차-반응성이며, c) C4.4a-발현 세포 내로 효율적으로 내재화된다는 점에서 기존의 C4.4a 항체 (문헌 [Paret C. et al., British Journal of Cancer 2007 97:1146-1156])와 구별되는 항체를 제공한다. 본 발명의 이러한 목적 및 기타 목적은 본원에서 더욱 자세하게 기술된다.
한 측면에서, 본 발명은 세포 표면에서 발현되고 완전히 글리코실화된 천연 C4.4a에 특이적으로 결합하고, 바람직하게는 세포 표면에서 발현되고 완전히 글리코실화된 천연 C4.4a 폴리펩티드의 도메인 S1 (C4.4a의 아미노산 1-85; 서열 1)에 특이적으로 결합하는 항원-결합 영역을 함유하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 항체 또는 항원-결합 단편이 C4.4a 발현 세포에 결합했을 때 상기 언급된 세포 내로 내재화된다. 추가적인 바람직한 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 C4.4a에 대한 결합에서 항체 M31-B01 또는 M20-D02 S-A와 경쟁한다. 추가적인 바람직한 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 C4.4a에 대한 결합에서 항체 M31-B01 또는 M20-D02 S-A와 경쟁한다. 추가적인 바람직한 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 및 설치류 C4.4a에 대한 결합에서 항체 M31-B01 또는 M20-D02 S-A와 경쟁하고, 추가적인 바람직한 실시양태는 설치류 C4.4a가 마우스 C4.4a인 경우이다.
더욱 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열 5 (H-CDR1), 서열 9 (H-CDR2) 및 서열 13 (H-CDR3)를 포함하는 중쇄 항원-결합 영역을 포함하고, 서열 17 (L-CDR1), 서열 21 (L-CDR2) 및 서열 25 (L-CDR3)를 포함하는 경쇄 항원-결합 영역을 포함한다.
더욱 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열 6 (H-CDR1), 서열 10 (H-CDR2) 및 서열 14 (H-CDR3)를 포함하는 중쇄 항원-결합 영역을 포함하고, 서열 18 (L-CDR1), 서열 22 (L-CDR2) 및 서열 26 (L-CDR3)을 포함하는 경쇄 항원-결합 영역을 포함한다.
더욱 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열 7 (H-CDR1), 서열 11 (H-CDR2) 및 서열 15 (H-CDR3)를 포함하는 중쇄 항원-결합 영역을 포함하고, 서열 19 (L-CDR1), 서열 23 (L-CDR2) 및 서열 27 (L-CDR3)을 포함하는 경쇄 항원-결합 영역을 포함한다.
더욱 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열 8 (H-CDR1), 서열 12 (H-CDR2) 및 서열 16 (H-CDR3)을 포함하는 중쇄 항원-결합 영역을 포함하고, 서열 20 (L-CDR1), 서열 24 (L-CDR2) 및 서열 28 (L-CDR3)을 포함하는 경쇄 항원-결합 영역을 포함한다.
더욱 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열 45 (H-CDR1), 서열 46 (H-CDR2) 및 서열 47 (H-CDR3)을 포함하는 중쇄 항원-결합 영역을 포함하고, 서열 48 (L-CDR1), 서열 49 (L-CDR2) 및 서열 50 (L-CDR3)을 포함하는 경쇄 항원-결합 영역을 포함한다.
더욱 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열 55 (H-CDR1), 서열 56 (H-CDR2) 및 서열 57 (H-CDR3)을 포함하는 중쇄 항원-결합 영역을 포함하고, 서열 58 (L-CDR1), 서열 59 (L-CDR2) 및 서열 60 (L-CDR3)을 포함하는 경쇄 항원-결합 영역을 포함한다.
더욱 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열 65 (H-CDR1), 서열 66 (H-CDR2) 및 서열 67 (H-CDR3)을 포함하는 중쇄 항원-결합 영역을 포함하고, 서열 68 (L-CDR1), 서열 69 (L-CDR2) 및 서열 70 (L-CDR3)을 포함하는 경쇄 항원-결합 영역을 포함한다.
추가적인 더욱 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열 75 (H-CDR1), 서열 76 (H-CDR2) 및 서열 77 (H-CDR3)을 포함하는 중쇄 항원-결합 영역을 포함하고, 서열 78 (L-CDR1), 서열 79 (L-CDR2) 및 서열 80 (L-CDR3)을 포함하는 경쇄 항원-결합 영역을 포함한다.
더욱 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열 85 (H-CDR1), 서열 86 (H-CDR2) 및 서열 87 (H-CDR3)을 포함하는 중쇄 항원-결합 영역을 포함하고, 서열 88 (L-CDR1), 서열 89 (L-CDR2) 및 서열 90 (L-CDR3)을 포함하는 경쇄 항원-결합 영역을 포함한다.
더욱 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열 95 (H-CDR1), 서열 96 (H-CDR2) 및 서열 97 (H-CDR3)을 포함하는 중쇄 항원-결합 영역을 포함하고, 서열 98 (L-CDR1), 서열 99 (L-CDR2) 및 서열 100 (L-CDR3)을 포함하는 경쇄 항원-결합 영역을 포함한다.
더욱 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열 105 (H-CDR1), 서열 106 (H-CDR2) 및 서열 107 (H-CDR3)을 포함하는 중쇄 항원-결합 영역을 포함하고, 서열 108 (L-CDR1), 서열 109 (L-CDR2) 및 서열 110 (L-CDR3)을 포함하는 경쇄 항원-결합 영역을 포함한다.
더욱 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열 115 (H-CDR1), 서열 116 (H-CDR2) 및 서열 117 (H-CDR3)을 포함하는 중쇄 항원-결합 영역을 포함하고, 서열 118 (L-CDR1), 서열 119 (L-CDR2) 및 서열 120 (L-CDR3)을 포함하는 경쇄 항원-결합 영역을 포함한다.
더욱 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열 125 (H-CDR1), 서열 126 (H-CDR2) 및 서열 127 (H-CDR3)을 포함하는 중쇄 항원-결합 영역을 포함하고, 서열 128 (L-CDR1), 서열 129 (L-CDR2) 및 서열 130 (L-CDR3)을 포함하는 경쇄 항원-결합 영역을 포함한다.
더욱 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열 135 (H-CDR1), 서열 136 (H-CDR2) 및 서열 137 (H-CDR3)을 포함하는 중쇄 항원-결합 영역을 포함하고, 서열 138 (L-CDR1), 서열 139 (L-CDR2) 및 서열 140 (L-CDR3)을 포함하는 경쇄 항원-결합 영역을 포함한다.
예를 들어, 본 발명의 항체는 IgG (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4)일 수 있는 한편, 항체 단편은 Fab, Fab', F(ab')2 또는 scFv일 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체 단편은 본원에 기술된 바와 같이 하나 이상의 방식으로 거동하는 항원-결합 영역일 수 있거나 또는 이러한 항원-결합 영역을 함유할 수 있다.
본 발명은 C4.4a의 에피토프에 대해 특이적인 상기 언급된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 각각 코딩할 수 있는 단리된 핵산 서열들에 또한 관련된다. 본 발명의 핵산은 항체 또는 항원-결합 항체 단편의 재조합 생산에 적절하다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 핵산 서열을 함유하는 벡터 및 숙주 세포에 또한 관련된다.
본 발명의 조성물은 치료 또는 예방 용도에 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 항체 (또는 그의 항원-결합 단편) 및 제약상 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물을 포함한다. 관련 측면에서, 본 발명은 C4.4a 발현 세포의 원치 않는 존재와 관련되는 장애 또는 상태를 치료하는 방법을 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 상기 언급된 장애는 암이다. 이같은 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게 본원에서 기술 또는 고려된 바와 같은 본 발명의 항체를 함유하는 제약 조성물을 유효량으로 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명은 C4.4a에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 항체 라이브러리 구성원을 단리하기 위해 그러한 항체 라이브러리를 사용하는 것에 대한 지침을 또한 제공한다.
도면의 설명
도 1은 샌드위치 표면 플라즈몬 공명 분석을 사용하여 수행된 에피토프 군별(grouping) 실험의 결과를 나타낸다. Y는 공명 유닛이고, X는 초 단위의 시간이다. 본 발명의 항체 중 하나를 칩 상에 코팅하였다. A는 C4.4a가 첨가된 시간을 나타낸다. B는 다른 본 발명의 항체가 첨가된 시간을 나타낸다. 두 항체가 C4.4a에 동시에 결합할 수 없었는데, 이는 적어도 중첩되는 에피토프를 나타낸다.
도 2는 인간 IgG1 형태의 재조합 인간 (a) 및 마우스 (b) C4.4a에 대한 본 발명의 항-C4.4a 항체의 결합에 대한 데이터를 제공한다. 실시예 4에 기술된 바와 같이 ELISA에 의해 EC50 값을 결정하였다. M31-B01 (A)는 인간 및 뮤린 C4.4a에 각각 0.24 및 0.29 nM의 EC50으로 결합한다. M20 B02 S-A (B)는 인간 및 뮤린 C4.4a에 각각 0.3 및 0.38 nM의 EC50으로 결합한다. X는 log nM이고, Y는 360 nm에서의 흡광이다..
도 3은 hC4.4a-유사 A549:hC4.4a로 형질감염되었거나 (a), 또는 NCI H322 (b), NCI H292 (c), H1975/BCRP (d) 또는 BxPC3 (e)와 같은 천연 C4.4a를 발현하는 종양 세포주인 상이한 종양 세포주들에 대한 본 발명의 항체의 특이적 결합에 대한 데이터를 제공한다. M31-B01 (백색 원) 및 M20-D02 S-A (흑색 원)의 결합에 대한 EC50 값이 (f)에서 요약된다. IgG1 이소형 대조군 (흑색 삼각형)은 세포에 대한 어떠한 결합도 나타내지 않았다. 모든 데이터는 FACS 적정에 의해 생성되었다. X는 농도 (log nM)이고, Y는 기하평균 형광 (×103)이다.
도 4(a)는 A549:hC4.4a 세포 내로의 형광단(Fluorophor)으로 표지된 항-C4.4a 항체의 특이적 내재화에 대한 데이터를 제공한다. 도 4 (b)는 음성 대조군으로서의 형질감염되지 않은 A549 세포에 대한 데이터를 제공한다. A는 M31-B01 (흑색 사각형)이고, B는 M20-D02 S-A (백색 사각형)이며, C는 hIgG1에 대한 이소형 대조군이고 (별표), X는 분 단위의 시간이고, Y는 과립 카운트/세포 [×103]이다. 두 C4.4a 항체 모두, C4.4a를 보유하는 종양 세포 내로 특이적으로, 효율적으로, 그리고 신속하게 내재화된다.
도 4 (c) 및 (d)는 A549:hC4.4a 세포 내로의 M31-B01의 내재화에 대한 데이터를 제공한다. 5분 후 (c), 세포 표면의 아주 약한 염색만 관찰할 수 있다. 90분 후 (d), pH 의존적 형광 염료를 보유하는 내재화된 M31-B01 항체를 함유하는 강하게 염색된 엔도솜이 명백하게 가시적이어서, 효과적인 내재화를 나타낸다.
도 5는 웨스턴 블롯팅에 의해 결정된 바와 같은 M31-B01 및 M20-D02 S-A가 결합하는 에피토프에 대한 데이터를 제공한다. A)는 상이한 C4.4a 종들의 쿠마시(Coomassie) 250으로 염색된 SDS-PAGE를 나타낸다 (레인 2+7 hC4.4a, 레인 3+8 mC4.4a, 레인 4+9 hC4.4a 도메인 S1-Fc-his6, 레인 5+10 hC4.4a 도메인 S2-Fc-his6; 레인 1, 6 및 11은 분자량 마커를 함유한다; 레인 2-5는 환원되지 않은 샘플을 함유한다; 레인 6-10은 환원된 샘플을 함유한다). B) 및 C)는 A)에서와 동일한 샘플 로드의 각각의 웨스턴 블롯을 나타낸다. 검출 항체로서, B)는 M31-B01과 함께 인큐베이션하였고, C)는 M20-D02 S-A와 함께 인큐베이션하였다. 두 항체 모두 특이적인 환원 의존적 염색을 나타내는데, 이는 입체형태적인 에피토프를 나타낸다. 그러나, 둘 모두 인간 및 마우스 전장 C4.4a 및 인간 C4.4a 도메인 S1에 결합하지만, 인간 C4.4a 도메인 S2에는 결합하지 않는다.
도 6은 엑스셀리전스(xCELLigence) 분석기로의 측정에 의해 결정된, 본 발명의 항체 (B01-3)에 의한 시험관내 종양 세포 증식 억제에 대한 데이터를 제공한다. A549:hC4.4a 세포를 실시예 15에 기술된 조건 하에 지시된 시간 동안 E-플레이트의 단일 웰들에서 100 nM의 비-결합 hIgG1 이소형 대조군 항체 (A) 또는 100 nM의 B01-3 (B)과 공동-인큐베이션하였다. X는 시간 단위의 시간이고, Y는 상대적인 세포 증식 속도이다. B01-3과 함께 인큐베이션된 A549:hC4.4a 세포는 대조군 IgG1에 비교하여 감소된 세포 증식을 나타낸다.
도 7a-7k는 본 발명의 서열을 나타낸다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 C4.4a에 대해 특이적이거나 이에 대한 친화도가 높고, 치료적 이점을 대상체에게 전달할 수 있는 신규 항체의 발견을 기초로 한다. 인간, 인간화 또는 키메라 항체일 수 있는 본 발명의 항체는 여러 상황에서 사용될 수 있고, 이는 본원에서 더욱 자세하게 기술된다.
정의
"인간" 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 본원에서 키메라가 아니고 (예를 들어, "인간화"되지 않고), (전체적으로 또는 부분적으로) 비-인간 종으로부터의 것이 아닌 것으로 정의된다. 인간 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간으로부터 유래될 수 있거나 또는 합성 인간 항체일 수 있다. "합성 인간 항체"는 공지된 인간 항체 서열의 분석을 기초로 하는 합성 서열로부터 인 실리코(in silico)로 서열이 전체적으로 또는 부분적으로 유래된 항체로서 본원에서 정의된다. 인간 항체 서열 또는 그의 단편의 인 실리코 디자인은, 예를 들어, 인간 항체 또는 항체 단편 서열의 데이터베이스를 분석하고, 이로부터 수득된 데이터를 이용하여 폴리펩티드 서열을 고안함으로써 달성될 수 있다. 인간 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 또 다른 예는 인간 기원의 항체 서열들의 라이브러리 (예를 들어, 이같은 라이브러리는 인간 천연 공급원으로부터 취득된 항체들을 기초로 함)로부터 단리된 핵산에 의해 코딩되는 것이다. 인간 항체의 예에는 문헌 [Soederlind et al., Nature Biotech. 2000, 18:853-856]에 기술된 바와 같은 항체가 포함된다.
"인간화 항체" 또는 그의 인간화 항원-결합 단편은 (i) 비-인간 공급원 (예를 들어, 이종성 면역계를 보유하는 트랜스제닉(transgenic) 마우스)로부터 유래되고, 항체가 인간 배선 서열을 기초로 하는 것, (ii) 비-인간 항체의 프레임워크 영역의 아미노산이 유전자 조작에 의해 인간 아미노산 서열로 부분적으로 교환된 것, 또는 (iii) 가변 도메인의 CDR이 비-인간 기원으로부터의 것인 한편, 가변 도메인의 하나 이상의 프레임워크가 인간 기원이고, 불변 도메인 (존재하는 경우)이 인간 기원인 CDR-이식물인 것으로 본원에서 정의된다.
"키메라 항체" 또는 그의 항원-결합 단편은 가변 도메인이 비-인간 기원으로부터 유래되고 일부 또는 모든 불변 도메인이 인간 기원으로부터 유래된 것으로 본원에서 정의된다.
용어 "모노클로날 항체"는, 본원에서 사용된 바, 실질적으로 균질한 항체들의 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하고, 즉, 집단을 이루는 개별적인 항체들은 미량으로 존재할 수 있는 가능한 돌연변이, 예를 들어, 천연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 따라서, 용어 "모노클로날"은 별개의 항체들의 혼합물이 아닌 것으로서의 항체의 특성을 나타낸다. 상이한 결정인자 (에피토프)들에 대해 지시된 상이한 항체들을 전형적으로 포함하는 폴리클로날 항체 제제와는 대조적으로, 모노클로날 항체 제제의 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정인자에 대해 지시된다. 그의 특이성에 더하여, 모노클로날 항체 제제는 전형적으로 다른 이뮤노글로불린에 의해 오염되지 않는다는 점에서 유리하다. 용어 "모노클로날"은 임의의 특정한 방법에 의한 항체 생산을 요구하는 것으로 해석되어서는 안된다. 용어 모노클로날 항체는 키메라, 인간화 및 인간 항체를 명확하게 포함한다.
본원에서 사용된 바, 항체가 관심 항원, 예를 들어, 종양-관련 폴리펩티드 항원 표적 (본원에서는 C4.4a)에 "특이적으로 결합한다", 이에 대해 "특이적이다", 또는 이를 "특이적으로 인식한다"는 것은, 이러한 항원을 발현하는 세포 또는 조직을 표적화하는 것에서 항체가 치료제로서 유용하도록 충분한 친화도로 항원에 결합하고, 다른 단백질과는 유의하게 교차-반응하지 않거나 상기 언급된 항원 표적의 오르토로그 및 변이체 (예를 들어, 돌연변이체 형태, 스플라이스(splice) 변이체 또는 단백질분해적으로 말단절단된 형태) 이외의 단백질과 유의하게 교차-반응하지 않는 항체이다. 본원에서 사용된 바 특정 폴리펩티드 또는 특정 폴리펩티드 표적 상의 에피토프를 "특이적으로 인식한다" 또는 이에 "특이적으로 결합한다" 또는 이에 대해 "특이적이다"라는 용어는, 예를 들어, 항원에 대한 1가 KD가 약 10-4 M 미만, 별법적으로는 약 10-5 M 미만, 별법적으로는 약 10-6 M 미만, 별법적으로는 약 10-7 M 미만, 별법적으로는 약 10-8 M 미만, 별법적으로는 약 10-9 M 미만, 별법적으로는 약 10-10 M 미만, 별법적으로는 약 10-11 M 미만, 별법적으로는 약 10-12 M 미만 또는 그보다 적은 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 의해 제시될 수 있다. 항체가 한 항원과 하나 이상의 기준 항원(들)을 구별할 수 있다면, 이같은 항체는 이같은 항원에 "특이적으로 결합하거나", 이에 대해 "특이적이거나", 또는 이를 "특이적으로 인식하는" 것이다. 이의 가장 일반적인 형태에서, "특이적 결합", "~에 특이적으로 결합한다", "~에 대해 특이적이다" 또는 "~를 특이적으로 인식한다"는, 예를 들어 하기의 방법들 중 하나에 따라 결정되는 바와 같은, 관심 항원과 관련되지 않은 항원을 구별하는 항체의 능력을 지칭한다. 이같은 방법은 웨스턴 블롯, ELISA-, RIA-, ECL-, IRMA-시험 및 펩티드 스캔을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 예를 들어, 표준 ELISA 검정을 수행할 수 있다. 표준 발색으로 채점을 수행할 수 있다 (예를 들어, 2차 항체 + 양고추냉이 퍼옥시다제 및 테트라메틸 벤지딘 + 과산화수소). 특정 웰에서의 반응을, 예를 들어, 450 nm에서, 광학 밀도에 의해 채점한다. 전형적인 배경 (= 음성 반응)은 0.1 OD일 수 있고, 전형적인 양성 반응은 1 OD일 수 있다. 이는 양성/음성 차이가 5배 초과, 10배 초과, 50배 초과, 바람직하게는 100배 초과임을 의미한다. 전형적으로, 결합 특이성의 측정은 단일 기준 항원이 아니라 분유, BSA, 트랜스페린 등과 같은 약 3개 내지 5개의 관련되지 않은 항원의 세트를 사용함으로써 수행된다.
"결합 친화도"는 분자의 단일 결합 부위와 그의 결합 파트너 간의 비-공유적 상호작용의 총계의 강도를 지칭한다. 달리 지시되지 않는 한, 본원에서 사용된 바, "결합 친화도"는 결합 쌍의 구성원들 (예를 들어, 항체 및 항원) 간의 1:1 상호작용을 반영하는 고유의 결합 친화도를 지칭한다. 분자 (예컨대 항체)와 그의 결합 파트너 (예컨대 항원) 간의 친화도, 즉, 얼마나 단단하게 리간드가 특정 단백질에 결합하는지를 기술하기 위해 해리 상수 "KD"가 통상적으로 사용된다. 리간드-단백질 친화도는 2개의 분자 간의 비-공유적 분자간 상호작용에 영향을 받는다. 본원에 기술된 것들이 포함되는 당업계에 공지된 통상적인 방법에 의해 친화도를 측정할 수 있다. 한 실시양태에서, 실시예 3에 따라 비아코어(Biacore) T100 기기 (지이 헬쓰케어 비아코어, 인코포레이티드(GE Healthcare Biacore, Inc.))를 사용하여 표면 플라즈몬 공명 검정을 사용함으로써 본 발명에 따른 "KD" 또는 "KD 값"이 측정된다. 간략하게, 간접적 포획 시약인 항-인간 IgG Fc를 통해 항체를 CM5 센서 칩 상에 고정하였다. "휴먼 안티바디 캡처 키트(Human Antibody Capture Kit)" (BR-1008-39, 지이 헬쓰케어 비아코어, 인코포레이티드)로부터의 시약을 제조사가 기술한 바와 같이 사용하였다. 셀(cell) 당 약 5000 공명 유닛 (RU)의 모노클로날 마우스 항-인간 IgG (Fc) 항체를 고정하였다. 약 200 내지 600 RU의 포획 수준에 도달하도록 항-C4.4 항체를 주입하였다. 고정된 항-C4.4a 항체 상에 다양한 농도의 인간 또는 뮤린 C4.4a를 주입하였다. 인-라인(in-line) 기준 셀 수정에 이어지는 완충제 샘플 차감 후에 센서그램(sensogram)이 생성되었다. 비아코어 이밸류에이션 소프트웨어(Biacore Evaluation Software)를 사용하여 1차 1:1 결합 모델로 센서그램을 핏팅(fitting)함으로써 수득된 회합 (kon) 및 해리 속도 (koff) 상수의 비율을 기초로 해리 평형 상수 (KD)를 계산하였다. 기타 적절한 장치는 비아코어(BIACORE)(R)-2000, 비아코어 (R)-3000 (비아코어, 인코포레이티드(BIAcore, Inc.), 뉴저지주 피스카타웨이), 또는 프로테온(ProteOn) XPR36 기기 (바이오-래드 래버러토리즈, 인코포레이티드(Bio-Rad Laboratories, Inc.))이다.
용어 "항체"는, 본원에서 사용된 바, 이뮤노글로불린 분자를 지칭하도록 의도되고, 이는 바람직하게는 4개의 폴리펩티드 사슬, 즉 전형적으로 디술피드 결합에 의해 상호 연결된 2개의 중쇄 (H) 및 2개의 경쇄 (L)로 구성된다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (본원에서 VH로 약기됨) 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은, 예를 들어, CH1, CH2 및 CH3의 3개의 도메인을 포함할 수 있다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 (본원에서 VL로 약기됨) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 1개의 도메인 (CL)으로 구성된다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역 (FR)으로 명명된 더욱 보존적인 영역들이 산재되어 있는, 상보성 결정 영역 (CDR)으로 명명된 초가변성 영역으로 추가로 세분될 수 있다. 전형적으로 각각의 VH 및 VL은 아미노 말단에서 카르복시 말단으로 예를 들어 하기의 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개 이하의 FR로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.
본원에서 사용된 바, 용어 "상보성 결정 영역 (CDR; 예를 들어, CDR1, CDR2, 및 CDR3)은 이의 존재가 항원 결합에 필요한 항체 가변 도메인의 아미노산 잔기들을 지칭한다. 각각의 가변 도메인에는 CDR1, CDR2 및 CDR3으로 확인되는 3개의 CDR 영역이 있다. 각각의 상보성 결정 영역은 카밧(Kabat)에 의해 정의된 바와 같은 "상보성 결정 영역"으로부터의 아미노산 잔기 (예를 들어, 대략적으로 경쇄 가변 도메인 내의 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2) 및 89-97 (L3) 및 중쇄 가변 도메인 내의 31-35 (H1), 50-65 (H2) 및 95-102 (H3); 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immulological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)]) 및/또는 "초가변 루프"로부터의 잔기 (예를 들어, 대략적으로 경쇄 가변 도메인 내의 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2) 및 91-96 (L3) 및 중쇄 가변 도메인 내의 26-32 (H1), 53-55 (H2) 및 96-101 (H3); 문헌 [Chothia and Lesk; J Mol Biol 196: 901-917 (1987)])를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 상보성 결정 영역은 카밧 및 초가변 루프에 따라 정의된 CDR 영역 둘 모두로부터의 아미노산을 포함할 수 있다.
중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 무손상 항체는 상이한 "클래스"로 배정될 수 있다. 무손상 항체에는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM의 5개의 주요 클래스가 있고, 이들 중 몇몇은 "서브클래스" (이소형), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, 및 IgA2로 추가로 나뉠 수 있다. 상이한 항체 클래스에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 [알파], [델타], [엡실론], [감마] 및 [뮤]로 칭해진다. 상이한 이뮤노글로불린 클래스들의 서브유닛 구조 및 3차원 형상이 주지되어 있다. 본원에서 사용된 바, 항체는 통상적으로 공지된 항체 및 그의 기능적 단편이다.
본원에서의 항체/이뮤노글로불린의 "기능적 단편" 또는 "항원-결합 항체 단편"은 항원-결합 영역을 유지하는 항체/이뮤노글로불린의 단편 (예를 들어, IgG의 가변 영역)으로 정의된다. 전형적으로 항체의 "항원-결합 영역"은 항체의 하나 이상의 초가변 영역(들), 예를 들어, CDR1, -2, 및/또는 -3 영역에서 확인된다; 그러나, 가변부 "프레임워크" 영역이, 예컨대 CDR에 대한 스캐폴드(scaffold)를 제공함으로써, 항원 결합에서 또한 중요한 역할을 할 수 있다. 바람직하게는, "항원-결합 영역"은 적어도 가변 경쇄 (VL)의 아미노산 잔기 4 내지 103 및 가변 중쇄 (VH)의 아미노산 잔기 5 내지 109, 더욱 바람직하게는 VL의 아미노산 잔기 3 내지 107 및 VH의 아미노산 잔기 4 내지 111을 포함하고, 완전한 VL 및 VH 사슬 (VL의 아미노산 위치 1 내지 109 및 VH의 아미노산 위치 1 내지 113)이 특히 바람직하다 (WO 97/08320에 따른 번호매김). 본 발명에서 사용하기 위한 바람직한 이뮤노글로불린 클래스는 IgG이다.
본 발명의 "기능적 단편" 또는 "항원-결합 항체 단편"은 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편; 디아바디(diabody); 단일 도메인 항체 (DAb), 선형 항체; 단일쇄 항체 분자 (scFv); 및 항체 단편들로부터 형성된 다중특이적, 예컨대 이중특이적 및 삼중특이적 항체를 포함한다 (문헌 [C. A. K Borrebaeck, ed. (1995) Antibody Engineering (Breakthroughs in Molecular Biology), Oxford University Press]; [R. Kontermann & S. Duebel, ed. (2001) Antibody Engineering (Springer Laboratory Manual), Springer Verlag]). "다중특이적" 또는 "다기능적" 항체 이외의 항체는 그의 결합 부위 각각이 동일한 것으로 이해된다. F(ab')2 또는 Fab는 CH1 도메인과 CL 도메인 사이에서 발생하는 분자간 디술피드 상호작용을 최소화하도록 또는 완전히 제거하도록 조작될 수 있다.
다수의 건강한 지원자의 항체로부터 단리된 아미노산 서열을 기초로 하는 재조합 항체 라이브러리로부터 본 발명의 항체가 유래될 수 있다. n-CoDeR® 기술을 사용하여, 완전히 인간형인 CDR이 신규 항체 분자로 재조합될 수 있다. 독특한 재조합 공정은 라이브러리가 인간 면역계에 의해 천연적으로 생성될 수 있는 것보다 더 광범위한 항체를 함유하도록 한다.
본원에서 사용된 바, 항원, 예를 들어 C4.4a의 상이한 '형태들'은 1차 C4.4a 전사물의 스플라이싱(splicing)에서의 차이, 글리코실화에서의 차이 및 번역후 단백질분해성 절단에서의 차이와 같은, 그러나 이에 한정되지는 않는 상이한 번역 및 번역후 변형으로부터 초래되는 상이한 단백질 분자들로 본원에서 정의된다.
본원에서 사용된 바, 용어 '에피토프'는 이뮤노글로불린 또는 T-세포 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 단백질 결정인자를 포함한다. 에피토프성 결정인자는 아미노산 또는 당 측쇄, 또는 이들의 조합물과 같은 분자들의 화학적으로 활성인 표면 군(grouping)으로 일반적으로 구성되고, 특이적인 3차원 구조 특성, 뿐만 아니라 특이적인 전하 특성을 일반적으로 지닌다. 당업자에게 주지된 방법들 중 임의의 것에 의해, 경쟁적 결합 검정에서 하나의 항체가 제2 항체와 경쟁하는 것으로 나타나면, 2개의 항체가 '동일한 에피토프에 결합한다'고 한다.
"단리된" 항체는 이를 발현하는 세포의 성분으로부터 확인 및 분리된 것이다. 세포의 오염물 성분은 항체의 진단 또는 치료 용도를 방해할 물질이고, 효소, 호르몬, 및 기타 단백질성 또는 비-단백질성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 항체가 (1) 예를 들어 로우리(Lowry) 방법, UV-Vis 분광학 또는 SDS-모세관 젤 전기영동 (예를 들어, 캘리퍼 랩칩(Caliper LabChip) GXII, GX 90 또는 바이오래드 바이오애널라이저(Biorad Bioanalyzer) 장치 상에서의 전기영동)에 의해 결정되는 바, 95 중량％의 항체를 초과하는 정도, 추가적인 바람직한 실시양태에서는 99 중량％를 초과하는 정도로, (2) N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 잔기 15개 이상을 수득하기에 충분한 정도로, 또는 (3) 쿠마시 블루(Coomassie blue) 또는 바람직하게는 은 염색을 이용하는 환원 또는 비-환원 조건 하에서의 SDS-PAGE에 의한 균질성 정도로 정제된다. 단리된 천연 발생 항체에는 재조합 세포 내의 계내 항체가 포함되는데, 이는 항체의 천연 환경의 1가지 이상의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문이다. 그러나, 통상적으로, 단리된 항체는 1회 이상의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
"항체-의존적 세포-매개 세포독성" 또는 "ADCC"는 특정한 세포독성 세포 (예를 들어, NK 세포, 호중구 및 대식세포) 상에 존재하는 Fc 감마 수용체 (FcγR) 상에 결합된 분비된 Ig가 이러한 세포독성 이펙터 세포가 항원-보유 표적 세포에 특이적으로 결합하고, 이어서 표적 세포를 예를 들어 세포독소로 사멸시킬 수 있게 하는 세포독성 형태를 지칭한다. 관심 항체의 ADCC 활성을 평가하기 위해, 시험관내 ADCC 검정, 예컨대 미국 특허 번호 5,500,362 또는 5,821,337 또는 미국 특허 번호 6,737,056 (프레스타(Presta))에 기술된 것을 수행할 수 있다. 이같은 검정에 유용한 이펙터 세포에는 PBMC 및 NK 세포가 포함된다.
"보체 의존적 세포독성" 또는 "CDC"는 보체의 존재 하에서의 표적 세포의 용해를 지칭한다. 전통적인 보체 경로의 활성화는 보체 시스템의 제1 성분 (C1q)이 동족 항원에 결합된 항체 (적합한 서브클래스의 항체)에 결합하는 것에 의해 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위하여, 예를 들어, 문헌 [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202: 163 (1996)]에 기술된 바와 같은 CDC 검정을 수행할 수 있다. Fc 영역 아미노산 서열이 변경되고 (변이체 Fc 영역이 있는 폴리펩티드), C1q 결합이 증가 또는 감소된 폴리펩티드 변이체가, 예를 들어, 미국 특허 번호 6,194,551 B1 및 WO 1999/51642에 기술되어 있다.
용어 면역접합체 (상호교환가능하게 "항체-약물 접합체," 또는 "ADC"로 지칭됨)는 하나 이상의 세포독성제, 예컨대 화학요법제, 약물, 성장 억제제, 독소 (예를 들어, 단백질 독소, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적으로 활성인 독소, 또는 그의 단편), 또는 방사성 동위원소 (즉, 방사성접합체)에 접합된 항체를 지칭한다. 면역접합체는 암의 치료에서 세포독성제, 즉, 세포를 사망시키거나 이의 성장 또는 증식을 억제하는 약물의 국소 전달에 사용되었다 (예를 들어 문헌 [Liu et al., Proc Natl. Acad. Sci. (1996), 93, 8618-8623]). 접합되지 않은 약물의 전신 투여가 정상 세포 및/또는 조직에 대한 허용될 수 없는 수준의 독성을 초래할 수 있는 경우에, 면역접합체는 종양으로의 약물 모이어티(moiety)의 표적화된 전달, 및 종양에서의 세포내 축적을 허용한다. 항체-독소 접합체에서 사용되는 독소에는 박테리아 독소 예컨대 디프테리아 독소, 식물 독소 예컨대 리신, 소형 분자 독소 예컨대 젤다마이신이 포함된다. 독소는 튜불린 결합, DNA 결합, 또는 토포이소머라제 억제가 포함되는 메커니즘에 의해 이들의 세포독성 효과를 발휘할 수 있다.
기준 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열 각각에 대한 "백분율 (％) 서열 동일성"은 서열들을 정렬하고, 필요하다면 갭(gap)을 도입하여, 최대 백분율 서열 동일성을 달성한 후의 기준 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열 각각 내의 핵산 또는 아미노산 잔기 각각과 동일한 후보 서열 내의 핵산 또는 아미노산 잔기 각각의 백분율로 정의된다. 보존적 치환은 서열 동일성의 일부로 간주되지 않는다. 갭이 없는 정렬이 바람직하다. 백분율 아미노산 서열 동일성을 결정하기 위한 목적의 정렬은 당업계의 기술에 속하는 다양한 방식으로, 예를 들어, 공개적으로 입수가능한 컴퓨터 소프트웨어 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여 달성할 수 있다. 당업자는 비교되는 서열들의 전체 길이에 걸쳐 최대의 정렬을 달성하기 위해 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 서열들을 정렬하기 위한 적합한 파라미터를 결정할 수 있다.
본 발명의 항체
본 발명은 항-C4.4a 항체를 제공함으로써 C4.4a-양성 암세포의 성장 및 신생물성 질환의 진행을 억제하는 방법에 관한 것이다. 29 kDa의 인간 C4.4a 폴리펩티드 (서열 1 또는 그의 단편)에 특이적으로 결합하는 항체, 그의 항원-결합 항체 단편, 및 상기 항체 및 단편의 변이체가 제공된다. 바람직한 실시양태에서, 항체, 그의 항원-결합 단편 또는 변이체는 C4.4a 폴리펩티드의 세포외 도메인 S1에 특이적으로 결합한다. C4.4a 폴리펩티드는 본원에서 'C4.4a'로 명명된다.
또 다른 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 C4.4a 발현 세포에 결합했을 때 상기 언급된 세포 내로 내재화된다. 추가적인 바람직한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 C4.4a에 대한 결합에서 항체 M31-B01 또는 M20-D02 S-A와 경쟁한다. 추가적인 바람직한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 C4.4a에 대한 결합에서 항체 M31-B01 또는 M20-D02 S-A와 경쟁한다. 추가적인 바람직한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 및 설치류 C4.4a에 대한 결합에서 항체 M31-B01 또는 M20-D02 S-A와 경쟁하고, 추가적인 바람직한 실시양태는 설치류 C4.4a가 마우스 C4.4a인 경우이다.
추가적인 바람직한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 표 7에 도시된 하나 이상의 CDR 서열에 대해 50％, 55％, 60％, 70％, 80％, 90％ 또는 95％ 이상 동일, 바람직하게는 상응하거나 또는 표 7에 도시된 VH 또는 VL 서열각각에 대해 50％, 60％, 70％, 80％, 90％, 92％ 또는 95％ 이상 동일한 가변 중쇄 또는 경쇄 서열을 포함하는 중쇄 또는 경쇄 CDR 서열을 포함한다.
추가적인 바람직한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 항체 M31-B01 또는 M20-D02 S-A 각각의 하나 이상의 CDR 서열에 대해 50％, 55％, 60％, 70％, 80％, 90％ 또는 95％ 이상 동일한, 바람직하게는 상응하는 중쇄 및/또는 경쇄 CDR 서열을 포함한다.
추가적인 바람직한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 항체 M31-B01 또는 M20-D02 S-A 각각의 중쇄 및/또는 경쇄 CDR 서열에 대해 50％, 55％, 60％, 70％, 80％, 90％ 또는 95％ 이상 동일한, 바람직하게는 상응하는 중쇄 및/또는 경쇄 CDR 서열을 포함한다.
추가적인 바람직한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 항체 M31-B01의 중쇄 CDR2 및 -3 서열에 대해 50％, 55％, 60％, 70％, 80％, 90％ 또는 95％ 이상 동일한 중쇄 CDR2 및 -3 서열 및 상기 항체의 경쇄 CDR1 및 -3 서열에 대해 50％, 55％, 60％, 70％, 80％, 90％ 또는 95％ 이상 동일한 경쇄 CDR1 및 -3 서열을 포함한다. 추가적인 바람직한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 항체 M20-D02 S-A의 중쇄 CDR2 및 -3 서열에 대해 50％, 55％, 60％, 70％, 80％, 90％ 또는 95％ 이상 동일한 중쇄 CDR2 및 -3 서열 및 상기 항체의 경쇄 CDR1 및 -3 서열에 대해 50％, 55％, 60％, 70％, 80％, 90％ 또는 95％ 이상 동일한 경쇄 CDR1 및 -3 서열을 포함한다.
추가적인 바람직한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 표 7 또는 표 4에 개시된 VH 서열, 바람직하게는 항체 M31-B01 또는 M20-D02 S-A의 것에 대해 50％, 60％, 70％, 80％, 90％, 92％ 또는 95％ 이상 동일한 가변 중쇄 서열을 포함한다. 추가적인 바람직한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 표 7 또는 표 3에 개시된 VL 서열, 바람직하게는 항체 M31-B01 또는 M20-D02 S-A의 것에 대해 50％, 60％, 70％, 80％, 90％, 92％ 또는 95％ 이상 동일한 가변 경쇄 서열을 포함한다.
추가적인 바람직한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 항체 M31-B01 또는 M20-D02 S-A 각각의 VH 및 VL 서열에 대해 50％, 60％, 70％, 80％, 90％, 92％ 또는 95％ 이상 동일한 가변 중쇄 및 경쇄 서열을 포함한다.
추가적인 바람직한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 표 15에 도시된 바와 같은, M31-B01 또는 M20-D02 S-A에서 유래된, 바람직하게는 상응하는, CDR 컨센서스(consensus) 서열에 부합하는 중쇄 및 경쇄 CDR 서열을 포함한다. 추가적인 바람직한 실시양태는 컨센서스 서열인 서열 297 (CDR H1), 서열 298 (CDR H2) 및 서열 299 (CDR H3)로 표시되는 바의 상응하는 중쇄 CDR 서열에 부합하는 중쇄 CDR 서열, 및 컨센서스 서열인 서열 300 (CDR L1), 서열 22 (CDR L2) 및 서열 301 (CDR L3)로 표시되는 바의 상응하는 경쇄 CDR 서열에 부합하는 경쇄 CDR 서열을 포함하거나, 또는 컨센서스 서열인 서열 302 (CDR H1), 서열 303 (CDR H2) 및 서열 304 (CDR H3)로 표시되는 바의 상응하는 중쇄 CDR 서열에 부합하는 중쇄 CDR 서열, 및 컨센서스 서열인 서열 305 (CDR L1), 서열 306 (CDR L2) 및 서열 307 (CDR L3)로 표시되는 바의 상응하는 경쇄 CDR 서열에 부합하는 경쇄 CDR 서열을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편이다.
추가적인 바람직한 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 항체 단편은 하나 이상의, 바람직하게는 상응하는, 표 7 또는 표 3 및 4에 개시된 바와 같은 중쇄 및/또는 경쇄 CDR 서열, 바람직하게는 표 7 또는 표 3 및 4에 도시된 바와 같은 항체의 것을 포함한다. 추가적인 바람직한 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 항체 단편은 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의, 바람직하게는 상응하는, 표 7 또는 표 3 및 4에 개시된 바와 같은 중쇄 및 경쇄 CDR 서열, 바람직하게는 표 7 또는 표 3 및 4에 도시된 바와 같은 항체의 것을 포함한다. 추가적인 바람직한 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 항체 단편은 표 7 또는 표 3 및 4에 도시된 바와 같은 항체의 중쇄 또는 경쇄 CDR1, CDR2 또는 CDR3 서열, 표 7 또는 표 3 및 4에 도시된 바와 같은 항체의 중쇄 또는 경쇄 CDR1 및 CDR2 서열, 표 7 또는 표 3 및 4에 도시된 바와 같은 항체의 중쇄 또는 경쇄 CDR1 및 CDR3 서열, 표 또는 표 3 및 4에 도시된 바와 같은 항체의 중쇄 또는 경쇄 CDR2 및 CDR3 서열, 표 또는 표 3 및 4에 도시된 바와 같은 항체의 중쇄 또는 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함한다. 추가적인 바람직한 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 항체 단편은 표 7 또는 표 3 및 4에 도시된 바와 같은 항체의 중쇄 CDR 서열 CDR1 및 CDR2 및 경쇄 CDR 서열 CDR1, CDR2, CDR3을 포함한다. 추가적인 바람직한 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 항체 단편은 표 7 또는 표 3 및 4에 도시된 바와 같은 항체의 중쇄 및 경쇄 CDR1, CDR2 또는 CDR3 서열, 표 또는 표 3 및 4에 도시된 바와 같은 항체의 중쇄 및 경쇄 CDR1 및 CDR2 서열, 표 7 또는 표 3 및 4에 도시된 바와 같은 항체의 중쇄 및 경쇄 CDR1 및 CDR3 서열, 표 7 또는 표 3 및 4에 도시된 바와 같은 항체의 중쇄 및 경쇄 CDR2 및 CDR3 서열, 표 7 또는 표 3 및 4에 도시된 바와 같은 항체의 중쇄 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함한다. 추가적인 바람직한 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 항체 단편은 표 7 또는 표 3 및 4에 도시된 바와 같은 항체의 중쇄 및 경쇄 CDR 서열을 포함한다.
추가적인 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 항체 단편은 표 7 또는 표 3 및 4에 개시된 VH 및/또는 VL 서열을 포함한다. 추가적인 바람직한 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 항체 단편은 표 7 또는 표 3 및 4에 도시된 항체의 VH 및 VL 서열을 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 항체 단편은 모노클로날 항체 또는 항체 단편이다. 추가적인 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 항체 단편은 인간, 인간화 또는 키메라 항체 또는 항체 단편이다.
본 발명에서 구상되는 항체 또는 항원-결합 항체 단편의 변이체는 C4.4a에 대한 항체 또는 항원-결합 항체 단편의 결합 활성이 유지된 분자이다. 바람직한 실시양태에서, 변이체는 C4.4a에 대한 결합에서 표 7에 도시된 항체, 바람직하게는 항체 M31-B01 또는 M20-D02 S-A와 경쟁한다.
본 명세서 전반에 걸쳐, 하기의 바람직한 본 발명의 항체들이 언급된다: "M31-B01", "M20-D02 S-A", "M60-G03" 및 "M36-H02", "B01-3", "B01-5", "B01-7", "B01-10", "B01-12", "D02-4", "D02-6", "D02-7", "D02-11" 및 "D02-13".
M31-B01은 서열 41 (DNA)/서열 33 (단백질)에 상응하는 중쇄 가변 영역 및 서열 37 (DNA)/서열 29 (단백질)에 상응하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체를 나타낸다.
M20-D02 S-A는 서열 42 (DNA)/서열 34 (단백질)에 상응하는 중쇄 가변 영역 및 서열 38 (DNA)/서열 30 (단백질)에 상응하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체를 나타낸다.
M60-DG03은 서열 43 (DNA)/서열 35 (단백질)에 상응하는 중쇄 가변 영역 및 서열 39 (DNA)/서열 31 (단백질)에 상응하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체를 나타낸다.
M36-H02는 서열 44 (DNA)/서열 36 (단백질)에 상응하는 중쇄 가변 영역 및 서열 40 (DNA)/서열 32 (단백질)에 상응하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체를 나타낸다.
B01-3은 서열 53 (DNA)/서열 51 (단백질)에 상응하는 중쇄 가변 영역 및 서열 54 (DNA)/서열 52 (단백질)에 상응하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체를 나타낸다.
B01-5는 서열 63 (DNA)/서열 61 (단백질)에 상응하는 중쇄 가변 영역 및 서열 64 (DNA)/서열 62 (단백질)에 상응하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체를 나타낸다.
B01-7은 서열 73 (DNA)/서열 71 (단백질)에 상응하는 중쇄 가변 영역 및 서열 74 (DNA)/서열 72 (단백질)에 상응하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체를 나타낸다.
B01-10은 서열 83 (DNA)/서열 81 (단백질)에 상응하는 중쇄 가변 영역 및 서열 84 (DNA)/서열 82 (단백질)에 상응하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체를 나타낸다.
B01-12는 서열 93 (DNA)/서열 91 (단백질)에 상응하는 중쇄 가변 영역 및 서열 94 (DNA)/서열 92 (단백질)에 상응하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체를 나타낸다.
D02-4는 서열 103 (DNA)/서열 101 (단백질)에 상응하는 중쇄 가변 영역 및 서열 104 (DNA)/서열 102 (단백질)에 상응하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체를 나타낸다.
D02-6은 서열 113 (DNA)/서열 111 (단백질)에 상응하는 중쇄 가변 영역 및 서열 114 (DNA)/서열 112 (단백질)에 상응하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체를 나타낸다.
D02-7은 서열 123 (DNA)/서열 121 (단백질)에 상응하는 중쇄 가변 영역 및 서열 124 (DNA)/서열 122 (단백질)에 상응하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체를 나타낸다.
D02-11은 서열 133 (DNA)/서열 131 (단백질)에 상응하는 중쇄 가변 영역 및 서열 134 (DNA)/서열 132 (단백질)에 상응하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체를 나타낸다.
D02-13은 서열 143 (DNA)/서열 141 (단백질)에 상응하는 중쇄 가변 영역 및 서열 144 (DNA)/서열 142 (단백질)에 상응하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체를 나타낸다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 서열 1에 의해 도시된 아미노산 서열을 갖는 C4.4a의 하나 이상의 영역에 특이적으로 결합하고/하거나 이에 대한 친화도가 높은 항원-결합 영역이 있는 항체 또는 항원-결합 단편을 제공한다. 친화도 측정치가 250 nM 미만이면 (항체 또는 항원-결합 단편의 1가 친화도), 항체 또는 항원-결합 단편이 항원에 대한 "높은 친화도"를 지닌다고 한다. 바람직하게는, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 영역은 인간 C4.4a에 대한 1가 친화도로 결정될 때 250 nM 미만, 바람직하게는 100 nM 미만, 더욱 바람직하게는 25 nM 미만, 더욱 더 바람직하게는 11 nM 미만의 친화도로 인간 C4.4a에 결합할 수 있다. 예를 들어, C4.4a에 대한 본 발명의 항체의 친화도는 약 220.0 nM 또는 1 nM일 수 있다 (항체 또는 항원-결합 단편의 1가 친화도).
표 1은 직접적으로 고정된 인간 또는 뮤린 C4.4a에 대한 표면 플라즈몬 공명 (비아코어)에 의해 결정된, 대표적인 본 발명의 항체의 해리 상수의 요약을 제공한다.
[표 1]
Figure 112012054109321-pct00001
스캐차드(Scatchard) 분석과 조합된 형광-활성화 세포 분류 (FACS)에 의한 세포-기반 친화도 결정에 IgG1 형태가 사용되었다. 도 3 f)는 형질감염된 C4.4a-발현 A549 종양 세포 및 내인성으로 C4.4a를 발현하는 종양 세포에 대한 대표적인 IgG 항체의 결합 강도를 나타낸다. 표 8은 형질감염된 뮤린 CHO-S:mC4.4a 세포 및 내인성으로 C4.4a를 발현하는 NCI H292 종양 세포에 대한 대표적인 IgG 항체의 결합 강도 (EC50)의 요약을 제공한다.
[표 8]
Figure 112012054109321-pct00002
FACS에 의해 측정된 친화도 측정치가 100 nM 미만이면 (IgG의 겉보기 친화도), IgG1이 항원에 대한 "높은 친화도"를 지니는 것이라고 한다. 본 발명의 2가 항체 또는 항원-결합 단편은 바람직하게는 100 nM 미만, 더욱 바람직하게는 50 nM 미만, 더욱 더 바람직하게는 10 nM 미만의 친화도로 인간 C4.4a에 결합할 수 있다. 인간 C4.4a에 대한 IgG의 겉보기 친화도로서 결정된 5 nM 미만, 더욱 바람직하게는 1 nM 미만의 친화도로 C4.4a에 결합하는 2가 항체가 더 바람직하다. 예를 들어, C4.4a에 대한 본 발명의 항체의 겉보기 친화도는 도 3 f에 도시된 바와 같이 FACS 분석에 의해 결정시 상이한 종양 세포주들에 대해 약 4.3 nM 또는 0.03 nM일 수 있다.
본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편은 C4.4a를 발현하는 종양 세포 내로의 절반 최대 내재화 시간 (t½)이 180분 미만, 더욱 바람직하게는 120분 미만, 더욱 더 바람직하게는 90분 미만이면 "효율적으로" 내재화된다. 실시예 6에 기술된 프로토콜에 의해 결정시 절반 최대 내재화 시간 (t½)이 60분 이하인 항체 또는 항원-결합 단편이 더욱 바람직하고, 50분 미만 또는 35분 미만이 더욱 바람직하다. 표 9는 실시예 6에 기술된 프로토콜에 의해 결정된 대표적인 본 발명의 항체의 내재화 시간의 요약을 제공한다. 내재화가능한 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편이 항체-약물 접합체 (ADC)의 표적화 모이어티로서 적절하다. 항체 또는 항원-결합 단편은 화합물, 바람직하게는 세포독성제를 C4.4a 발현 세포 내로 전달하기 위한 시험관내 또는 생체내 방법에서 적절하다.
[표 9]
Figure 112012054109321-pct00003
일부 실시양태에서, 항체, 그의 항원-결합 단편, 또는 그의 유도체, 또는 이들을 코딩하는 핵산이 단리된다. 단리된 생물학적 성분 (예컨대 핵산 분자 또는 단백질 예컨대 항체)은 이러한 성분이 천연적으로 발생하는 생물의 세포 내의 다른 생물학적 성분, 예를 들어, 다른 염색체 및 염색체외 DNA 및 RNA, 단백질 및 소기관으로부터 실질적으로 분리 또는 정제된 것이다. "단리된" 핵산 및 단백질에는 표준 정제 방법에 의해 정제된 핵산 및 단백질이 포함된다. 문헌 [Sambrook et al., 1989 (Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, USA)] 및 [Robert K. Scopes et al., 1994 Protein Purification, - Principles and Practice, Springer Science and Business Media LLC]. 이러한 용어는 숙주 세포에서의 재조합 발현에 의해 제조된 핵산 및 단백질, 뿐만 아니라 화학적으로 합성된 핵산을 또한 포함한다.
항체 생성
완전히 인간형인 N-CoDeR 항체 파지 디스플레이 라이브러리를 사용하여, 전체 세포 및 단백질 패닝(panning)의 조합에 의해, 그리고 특정 도구의 개발을 통해 고친화도의 C4.4a 특이적 인간 모노클로날 항체를 단리하였다. 이러한 도구 및 방법에는 인간 C4.4a를 발현하는 재조합 세포주, 뮤린 C4.4a를 발현하는 세포주, 재조합 인간 및 뮤린 C4.4a, 및 세포 표면 상에 디스플레이된 C4.4a에 우선적으로 결합하고 뮤린 C4.4a에 대해 교차-반응성인 항체를 확인할 수 있는 스크리닝 검정 및 패닝 절차의 개발이 포함된다.
파지-디스플레이 기술 (PDT)에서의 통상적이지 않은 3가지 접근법의 조합에 의해 암 세포-표면 마커 C4.4a에 대한 항체가 개발되었다. 첫번째로, GPI-고정 형태의 전장 인간 또는 마우스 단백질 (서열 3) 및 (서열 4)을 각각 코딩하는 플라스미드로 CHO-S 세포 및 A549 종양 세포를 안정적으로 형질감염시켜 인간 CHO-S:hC4.4a, 뮤린 CHO-S:mC4.4a 및 인간 A549:hC4.4a 세포주를 각각 제공함으로써 막에 결합된 형태의 인간 및 마우스 C4.4a를 발현하는 재조합 세포주를 구축하였다. 두번째로, 후자의 재조합 세포주 및 유방암 세포주 MCF-7로 세포-표면 선택을 수행하였다. 부모 세포의 에피토프에 결합하는 Fab 단편이 선택되는 것을 피하기 위해, CHO-S 세포 또는 형질감염되지 않은 A549 세포의 예비-흡착을 포함시켰다. 정제된 가용성 재조합 인간 C4.4a, 정제된 가용성 재조합 뮤린 C4.4a로 추가적인 선택을 수행하였다. 세번째로, 전체 A549:hC4.4a 세포, 뿐만 아니라 CHO-S:hC4.4a 세포에 대한 패닝에서 수득된 파지 산물의 연속적인 스크리닝을 허용하는 스크리닝 방법을 개발하였다. 이러한 특정한 방법들의 조합이 독특한 항체인 "M31-B01", "M20-D02 S-A", "M60-G03", 및 "M36-H02"의 단리를 허용하였다.
이러한 독특한 항체들을 ELISA에서의 이들의 결합 친화도, 가용성 C4.4a에 대한 비아코어 결합, 가용성 C4.4a 상의 상이한 에피토프들을 인식하는 능력, 및 비아코어 및 FACS에 의해 평가된 뮤린 C4.4a와 교차 반응하는 능력, 및 세포 기반 검정에서 내재화되는 능력에 의해 추가로 특성화하였다. 내재화 검정은 형광 표지된 항-C4.4a 항체의 내재화를 시간 분해 방식으로 정량적으로 측정하였다.
펩티드 변이체
본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편은 본원에서 제공되는 특정 펩티드 서열에 한정되지 않는다. 오히려, 본 발명은 이러한 폴리펩티드들의 변이체를 또한 포함한다. 본 발명의 개시내용 및 통상적으로 입수가능한 기술 및 참고문헌을 참조로, C4.4a에 결합하는 능력이 있는 변이체가 본 발명의 범주 내에 속한다는 것을 이해하면서, 숙련가는 본원에 개시된 항체의 기능성 변이체를 제조, 시험 및 이용할 수 있을 것이다.
변이체는, 예를 들어, 본원에 개시된 펩티드 서열과 비교하여 상보성 결정 영역 (CDR) (초가변성) 및/또는 프레임워크 (FR) (가변성) 도메인/위치가 하나 이상 변경된 항체를 포함할 수 있다. 이러한 개념을 더 잘 설명하기 위해, 항체 구조의 간략한 설명이 이어진다.
항체는 2개의 펩티드 사슬로 구성되고, 이들 각각은 1개 (경쇄) 또는 3개 (중쇄)의 불변 도메인 및 가변 영역 (VL, VH)을 함유하며, 가변 영역은 각각의 경우에 4개의 FR 영역 및 3개의 산재된 CDR로 구성된다. 항원-결합 부위는 하나 이상의 CDR에 의해 형성되지만, FR 영역이 CDR에 대한 구조적 프레임워크를 제공하고, 따라서 항원 결합에서 중요한 역할을 한다. CDR 또는 FR 영역 내의 하나 이상의 아미노산 잔기를 변경시킴으로써, 숙련가는 돌연변이 또는 다양화된 항체 서열을 일상적으로 생성시킬 수 있고, 예를 들어, 새롭거나 개선된 성질에 대해 이를 항원에 대해 스크리닝할 수 있다.
표 3 (VL) 및 4 (VH)는 본 발명의 특정 항체에 대한 CDR 및 FR 영역을 서술하고, 소정의 위치에서의 아미노산을 서로 및 상응하는 컨센서스 서열과 비교한다.
[표 3]
Figure 112012054109321-pct00004
[표 4]
Figure 112012054109321-pct00005
본 발명의 추가로 바람직한 실시양태는 CDR 서열이 표 7에 제시된 바와 같이 선택된 항체 또는 그의 항원 결합 단편이다.
본 발명의 추가로 바람직한 실시양태는 VH 및 VL 서열이 표 7에 제시된 바와 같이 선택된 항체 또는 항원-결합 단편이다. 숙련가는 표 3, 4 및 7의 데이터를 사용하여 본 발명의 범주 내에 속하는 펩티드 변이체를 디자인할 수 있다. 하나 이상의 CDR 영역 내의 아미노산을 변화시킴으로써 변이체를 구축하는 것이 바람직하다; 또한 변이체에 하나 이상의 변경된 프레임워크 영역이 있을 수 있다. 변경은 프레임워크 영역에서 또한 이루어질 수 있다. 예를 들어, 배선 서열과 비교하여 잔기에서의 편차가 존재하도록 펩티드 FR 도메인이 변경될 수 있다.
표 3 및 4에 열거된 상응하는 컨센서스 서열에 대한 신규 항체의 비교를 참조로, 변화될 수 있는 후보 잔기에는, 예를 들어, 진(Gene) DP47의 VHIII에 비교된 M20-D02 S-A의 가변 중쇄의 잔기 42가 포함된다. 별법적으로, 예를 들어, 문헌 [Knappik A., et al., JMB 2000, 296:57-86]에 기술된 절차를 사용하여, 숙련가는 본원에 개시된 아미노산 서열을 이같은 항체의 동일한 클래스의 공지된 서열과 비교함으로써 동일한 분석을 수행할 수 있다.
또한, 항체 내의 하나 이상의 아미노산 잔기, 바람직하게는 하나 이상의 CDR 내의 아미노산 잔기의 다양화에 의한 최적화를 위한 출발점으로서 하나의 항체를 사용하고, 생성된 항체 변이체들의 집합체를 대상으로 성질이 개선된 변이체를 스크리닝함으로써 변이체를 수득할 수 있다. VL 및/또는 VH의 CDR3 내의 하나 이상의 아미노산 잔기의 다양화가 특히 바람직하다. 트리뉴클레오티드 돌연변이유발 (TRIM) 기술을 사용하여 DNA 분자들의 집합체를 합성함으로써 다양화를 수행할 수 있다 (문헌 [Virnekaes B. et al., Nucl. Acids Res. 1994, 22: 5600]). 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 예를 들어 반감기 변경에 이르는 변형 (예를 들어, Fc 부분의 변형 또는 추가적인 분자 예컨대 PEG의 부착) 또는 ADCC 또는 CDC 활성 변경에 이르는 변형이 포함되지만 이에 한정되지 않는 변형/변이가 있는 분자를 포함한다.
보존적 아미노산 변이체
본원에 기술된 항체 펩티드 서열의 전체적인 분자 구조가 보존된 폴리펩티드 변이체를 제조할 수 있다. 개별적인 아미노산들의 성질을 고려하여, 숙련가는 약간의 합리적인 치환을 인지할 것이다. 아미노산 치환, 즉 "보존적 치환"은, 예를 들어, 수반되는 잔기들의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양쪽성 성질에서의 유사성을 기초로 이루어질 수 있다.
예를 들어, (a) 비극성 (소수성) 아미노산에는 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌이 포함되고; (b) 극성 중성 아미노산에는 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민이 포함되고; (c) 양성 전하를 띠는 (염기성) 아미노산에는 아르기닌, 리신 및 히스티딘이 포함되며; (d) 음성 전하를 띠는 (산성) 아미노산에는 아스파르트산 및 글루탐산이 포함된다. 전형적으로 (a) 내지 (d) 군 내에서 치환이 이루어질 수 있다. 또한, 글리신 및 프롤린이 α-나선을 파괴하는 능력을 기초로 서로 치환될 수 있다. 유사하게, 특정 아미노산, 예컨대 알라닌, 시스테인, 류신, 메티오닌, 글루탐산, 글루타민, 히스티딘 및 리신은 α-나선에서 더욱 통상적으로 발견되는 반면, 발린, 이소류신, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판 및 트레오닌은 β-병풍 시트에서 더욱 통상적으로 발견된다. 글리신, 세린, 아스파르트산, 아르파라긴 및 프롤린은 회전(turn)에서 통상적으로 발견된다. 하기의 군들 사이에서 일부 바람직한 치환이 이루어질 수 있다: (i) S 및 T; (ii) P 및 G; 및 (iii) A, V, L 및 I. 공지된 유전자 코드, 및 재조합 및 합성 DNA 기술을 고려하여, 숙련된 과학자는 보존적 아미노산 변이체를 코딩하는 DNA를 용이하게 구축할 수 있다. 한 특정 예에서, 서열 33-36에서의 아미노산 위치 3이 Q에서 E로 변화될 수 있다.
본원에서 사용된 바, 2개의 폴리펩티드 서열 간의 "서열 동일성"은 서열들 간에 동일한 아미노산의 백분율을 나타낸다. "서열 상동성"은 동일하거나 보존적 아미노산 치환을 나타내는 아미노산의 백분율을 나타낸다.
본 발명의 DNA 분자
본 발명은 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 코딩하는 DNA 분자에 또한 관련된다. 이러한 서열에는 서열 37-44, 53, 54, 63, 64, 73, 74, 83, 84, 93, 94, 103, 104, 113, 114, 123, 124, 133, 134, 143, 144 및 308-345에 기재된 DNA 분자가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명의 DNA 분자는 본원에 개시된 서열에 한정되지 않고, 그의 변이체를 또한 포함한다. 본 발명의 DNA 변이체는 혼성화에서의 그의 물리적 성질을 참조로 기술될 수 있다. 핵산 혼성화 기술을 사용하여, DNA가 그의 상보물을 확인하는데, 그리고 DNA는 이중 가닥이므로 그의 등가물 또는 상동체를 확인하는데 사용될 수 있다는 것을 숙련가는 인지할 것이다. 100％ 미만의 상보성으로 혼성화가 발생할 수 있다는 것이 또한 인지될 것이다. 그러나, 적합한 선택 조건이 주어지면, 혼성화 기술을 사용하여 DNA 서열들을 특정 프로브에 대한 이들의 구조적 관련성을 기초로 구별할 수 있다. 이같은 조건에 관한 지침에 대해, 상기 문헌 [Sambrook et al., 1989] 및 문헌 [Ausubel et al., 1995 (Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Sedman, J. G., Smith, J. A., & Struhl, K. eds. (1995). Current Protocols in Molecular Biology. New York: John Wiley and Sons)]을 참조한다.
2개의 폴리뉴클레오티드 서열 간의 구조적 유사성은 2개의 서열이 서로 혼성화할 조건의 "엄격성"의 함수로서 표현될 수 있다. 본원에서 사용된 바, 용어 "엄격성"은 조건이 혼성화에 불리한 정도를 지칭한다. 엄격한 조건은 혼성화에 강하게 불리하고, 구조적으로 가장 관련된 분자들만이 이같은 조건 하에 서로 혼성화할 것이다. 반대로, 엄격하지 않은 조건은 더 낮은 정도의 구조적 관련성을 나타내는 분자들의 혼성화에 유리하다. 따라서, 혼성화 엄격성은 2개의 핵산 서열의 구조적 관계와 직접적으로 상관된다. 하기의 관계는 혼성화와 관련성을 상관시키는데 유용하다 (식중, Tm은 핵산 이중체의 용융 온도이다):
a. Tm = 69.3 + 0.41(G+C)％
b. 잘못 짝지워진 염기쌍의 수가 1％ 증가할 때마다 이중체 DNA의 Tm이 1℃씩 감소한다.
c. (Tm)μ2 - (Tm)μ1 = 18.5 log10μ2/μ1
[식중 μ1 및 μ2는 두 용액의 이온 강도이다].
혼성화 엄격성은 전체 DNA 농도, 이온 강도, 온도, 프로브 크기 및 수소 결합을 파괴하는 작용제의 존재가 포함되는 다수의 인자의 함수이다. 혼성화를 촉진하는 인자에는 높은 DNA 농도, 높은 이온 강도, 낮은 온도, 더 긴 프로브 크기 및 수소 결합을 파괴하는 작용제의 부재가 포함된다. 전형적으로 혼성화는 2개의 단계로 수행된다: "결합" 단계 및 "세척" 단계.
먼저, 결합 단계에서, 혼성화에 유리한 조건 하에 프로브를 표적에 결합시킨다. 일반적으로 온도를 변경시킴으로써 이러한 단계에서 엄격성이 조절된다. 높은 엄격성을 위해, 짧은 (< 20 nt) 올리고뉴클레오티드 프로브가 사용되지 않는 한, 온도는 보통 65℃ 내지 70℃이다. 대표적인 혼성화 용액은 6× SSC, 0.5％ SDS, 5× 덴하르트(Denhardt) 용액 및 100 ㎍의 비-특이적 캐리어 DNA를 포함한다. 문헌 [Ausubel et al., section 2.9, supplement 27 (1994)] 참조. 물론, 다수의 상이하지만 기능적으로 등가인 완충제 조건이 공지되어 있다. 관련성 정도가 낮을수록, 더 낮은 온도가 선택될 수 있다. 낮은 엄격성 결합 온도는 약 25℃ 내지 40℃이다. 중간 엄격성은 약 40℃ 이상 내지 약 65℃ 미만이다. 높은 엄격성은 약 65℃ 이상이다.
두번째로, 과량의 프로브를 세척에 의해 제거한다. 더욱 엄격한 조건이 이러한 단계에서 일반적으로 적용된다. 따라서, 혼성화를 통한 관련성의 결정에서 가장 중요한 것은 이러한 "세척" 단계이다. 세척 용액은 전형적으로 더 낮은 염 농도를 함유한다. 한 예시적인 중간 엄격성 용액은 2× SSC 및 0.1％ SDS를 함유한다. 높은 엄격성 세척 용액은 약 0.2× SSC 미만의 등가물 (이온 강도 면에서의 등가물)을 함유하고, 바람직한 엄격한 용액은 약 0.1× SSC를 함유한다. 다양한 엄격성과 관련된 온도는 "결합"에 대해 상기 논의된 것과 동일하다. 또한 전형적으로 세척 용액이 세척 동안 여러 번 교체된다. 예를 들어, 전형적인 높은 엄격 세척 조건은 55℃에서 30분 동안 2회, 60℃에서 15분 동안 3회 세척하는 것을 포함한다.
본 발명의 실시양태는 (i) 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편, 표 7에 도시된 CDR 서열, 또는 (ii) 표 7에 도시된 가변 경쇄 및 중쇄 서열을 코딩하는 단리된 핵산 서열, 또는 (iii) 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편, 표 7에 도시된 CDR 서열, 또는 표 7에 도시된 가변 경쇄 및 중쇄 서열을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산 서열이다.
본 발명의 변이체의 한 특정한 예에서, 서열 37-40 내의 핵산 위치 7, 또는 서열 41-44 내의 위치 16이 C에서 G로 치환됨으로써, 코돈이 CAC에서 GAG로 변화될 수 있다.
기능적으로 등가인 변이체
본 발명의 범주 내의 DNA 변이체의 또 다른 클래스가 이들이 코딩하는 생성물을 참조로 기술될 수 있다. 이러한 기능적으로 등가인 폴리뉴클레오티드들은 유전자 코드의 축퇴성으로 인해 서열 5-36, 45-50, 55-60, 65-70, 75-80, 85-90, 95-100, 105-110, 115-120, 125-130, 135-140에서 발견되는 것과 동일한 펩티드 서열을 코딩한다는 사실을 특징으로 한다.
본원에서 제공되는 DNA 분자의 변이체가 여러 상이한 방식으로 구축될 수 있는 것으로 인지된다. 예를 들어, 이들이 완전히 합성형인 DNA로서 구축될 수 있다. 뉴클레오티드 20개 내지 약 150개 범위의 올리고뉴클레오티드를 효율적으로 합성하는 방법이 광범위하게 이용가능하다. 문헌 [Ausubel et al., section 2.11, Supplement 21 (1993)] 참조. 중첩되는 올리고뉴클레오티드들을 문헌 [Khorana et al., J. Mol. Biol. 72:209-217 (1971)]에 최초로 보고된 방식으로 합성 및 조립할 수 있다; 상기 문헌 [Ausubel et al., Section 8.2]를 또한 참조한다. 바람직하게는, 적합한 벡터 내로의 클로닝을 용이하게 하기 위해 편리한 제한 부위가 유전자의 5' 및 3'말단에서 조작되도록 합성 DNA를 디자인한다.
지시된 바와 같이, 변이체를 생성시키는 방법은 본원에 개시된 DNA들 중 하나로 출발한 후 부위-지정 돌연변이유발을 수행하는 것이다. 상기 문헌 [Ausubel et al., chapter 8, Supplement 37 (1997)] 참조. 전형적인 방법에서, 표적 DNA를 단일 가닥 DNA 박테리오파지 비히클 내로 클로닝한다. 단일 가닥 DNA를 단리하고, 원하는 뉴클레오티드 변경(들)을 함유하는 올리고뉴클레오티드와 혼성화시킨다. 상보적인 가닥이 합성되고, 이중 가닥 파지를 숙주 내로 도입한다. 생성된 자손의 일부가 원하는 돌연변이체를 함유할 것이고, 이를 DNA 서열분석을 사용하여 확인할 수 있다. 또한, 자손 파지가 원하는 돌연변이체일 가능성을 증가시키는 다양한 방법이 이용가능하다. 이러한 방법들은 당업자에게 주지되어 있고, 이같은 돌연변이체를 생성시키기 위한 키트가 상업적으로 입수가능하다.
재조합 DNA 구축물 및 발현
본 발명은 하나 이상의 본 발명의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 DNA 구축물을 추가로 제공한다. 본 발명의 재조합 구축물은 벡터, 예컨대 플라스미드, 파지미드, 파지 또는 바이러스 벡터와 함께 사용되고, 이러한 벡터 내로 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 코딩하는 DNA 분자가 삽입된다.
본원에서 제공되는 항체, 그의 항원 결합 부분 또는 유도체가 숙주 세포 내에서의 경쇄 및 중쇄 또는 그의 일부분을 코딩하는 핵산 서열의 재조합 발현에 의해 제조될 수 있다. 항체, 그의 항원 결합 부분 또는 유도체를 재조합적으로 발현시키기 위해, 경쇄 및 중쇄가 숙주 세포에서 발현되도록 경쇄 및/또는 중쇄 또는 그의 일부분을 코딩하는 DNA 단편을 보유하는 하나 이상의 재조합 발현 벡터로 숙주 세포를 형질감염시킬 수 있다. 문헌 [Sambrook, Fritsch and Maniatis (eds.), Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989)], [Ausubel, F. M. et al. (eds.) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, (1989)] 및 미국 특허 번호 4,816,397 (보스(Boss) 등)에 기술된 것 등의, 표준 재조합 DNA 방법을 사용하여 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 핵산을 제조 및/또는 수득하고, 이러한 핵산을 재조합 발현 벡터 내로 혼입하고, 벡터를 숙주 세포 내로 도입한다.
또한, 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 영역을 코딩하는 핵산 서열을, 예를 들어, 전장 항체 사슬, Fab 단편, 또는 scFv를 코딩하는 핵산 서열로 전환시킬 수 있다. VL- 또는 VH-코딩 DNA 단편을 항체 불변 영역 또는 가요성 링커를 예를 들어 코딩하는 또 다른 DNA 단편에 (2개의 DNA 단편에 의해 코딩되는 아미노산 서열들이 인-프레임(in-frame)이도록) 작동적으로 연결시킬 수 있다. 인간 중쇄 및 경쇄 불변 영역의 서열이 당업계에 공지되어 있고 (예를 들어, 문헌 [Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242] 참조), 이러한 영역을 포함하는 DNA 단편을 표준 PCR 증폭에 의해 수득할 수 있다.
scFv를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 생성시키기 위해, VL 및 VH 영역이 가요성 링커에 의해 연결되면서 VH 및 VL 서열이 연속적인 단일 사슬 단백질로서 발현될 수 있도록 VH- 및 VL-코딩 핵산을 가요성 링커를 코딩하는 또 다른 단편에 작동적으로 연결시킬 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Bird et al. (1988) Science 242:423-426]; [Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883]; [McCafferty et al., Nature (1990) 348:552-554] 참조).
항체, 그의 항원 결합 부분 또는 유도체를 발현시키기 위해, 표준 재조합 DNA 발현 방법을 사용할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Goeddel; Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)] 참조). 예를 들어, 원하는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 발현 벡터 내로 삽입할 수 있고, 그 후 이를 적절한 숙주 세포 내로 형질감염시킨다. 적절한 숙주 세포는 원핵 및 진핵 세포이다. 원핵 숙주 세포의 예는, 예를 들어, 박테리아이고, 진핵 숙주 세포의 예는 효모, 곤충 또는 포유동물 세포이다. 일부 실시양태에서, 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 DNA가 별도의 벡터 내로 삽입된다. 다른 실시양태에서, 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 DNA가 동일한 벡터 내로 삽입된다. 조절 서열의 선택이 포함되는 발현 벡터 디자인은 숙주 세포의 선택, 원하는 단백질의 발현 수준 및 발현이 구성적인지 또는 유도성인지 여부와 같은 인자에 의해 영향을 받는 것으로 이해된다.
박테리아 발현
기능성 프로모터가 있는 작동가능한 판독상 내에 원하는 단백질을 코딩하는 구조적 DNA 서열을 적절한 번역 개시 및 종결 신호와 함께 삽입함으로써 박테리아 용도에 유용한 발현 벡터가 구축된다. 벡터는 벡터의 유지를 확실하게 하고, 바람직하다면 숙주 내에서의 증폭을 제공하기 위해 하나 이상의 표현형 선택 마커 및 복제 기원을 포함할 것이다. 형질전환을 위한 적절한 원핵생물 숙주에는 이. 콜라이(E. coli), 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 및 슈도모나스(Pseudomonas), 스트렙토미세스(Streptomyces), 및 스타필로코쿠스(Staphylococcus) 속의 다양한 종이 포함된다.
박테리아 벡터는, 예를 들어, 박테리오파지, 플라스미드 또는 파지미드를 기초로 할 수 있다. 이러한 벡터는 주지된 클로닝 벡터 pBR322 (ATCC 37017)의 요소를 전형적으로 함유하는 상업적으로 입수가능한 플라스미드로부터 유래된 박테리아 복제 기원 및 선택 마커를 함유할 수 있다. 적절한 숙주 균주의 형질전환 및 적합한 세포 밀도로의 숙주 균주의 성장 후, 선택된 프로모터가 적합한 수단 (예를 들어, 온도 이동 또는 화학적 유도)에 의해 탈억제/유도되고, 세포를 추가 기간 동안 배양한다. 세포를 전형적으로 원심분리에 의해 수확하고, 물리적 또는 화학적 수단에 의해 파괴하고, 생성된 조 추출물을 추가적인 정제를 위해 간직한다.
박테리아 시스템에서, 발현될 단백질에 대해 의도되는 용도에 따라 다수의 발현 벡터를 유리하게 선택할 수 있다. 예를 들어, 다량의 이같은 단백질이 생산되어야 하는 경우 (예를 들어 항체의 생성을 위해 또는 펩티드 라이브러리를 스크리닝하기 위해), 쉽게 정제되는 융합 단백질 생성물이 높은 수준으로 발현되게 하는 벡터가 바람직할 수 있다. 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 천연적으로 정제된 생성물, 화학적 합성 절차의 생성물, 및 이. 콜라이, 바실루스 서브틸리스, 살모넬라 티피무리움 및 슈도모나스, 스트렙토미세스 및 스타필로코쿠스 속의 다양한 종이 예를 들어 포함되는 원핵생물 숙주, 바람직하게는 이. 콜라이 세포로부터 재조합 기술에 의해 생산된 생성물을 포함한다.
포유동물 발현 & 정제
포유동물 숙주 세포 발현을 위한 바람직한 조절 서열에는 포유동물 세포에서 높은 수준의 단백질 발현을 지시하는 바이러스 요소, 예컨대 시토메갈로바이러스 (CMV) (예컨대 CMV 프로모터/인핸서), 원숭이 바이러스 40 (SV40) (예컨대 SV40 프로모터/인핸서), 아데노바이러스 (예를 들어, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터 (AdMLP)) 및 폴리오마로부터 유래된 프로모터 및/또는 인핸서가 포함된다. 바이러스 조절 요소, 및 그의 서열의 추가적인 설명을 위해, 예를 들어, 미국 5,168,062 (스팅스키(Stinski)), 미국 4,510,245 (벨(Bell) 등) 및 미국 4,968,615 (샤프너(Schaffner) 등)를 참조한다. 재조합 발현 벡터는 복제 기원 및 선택 마커를 또한 포함할 수 있다 (예를 들어, 미국 4,399,216, 4,634,665 및 미국 5,179,017 (악셀(Axel) 등) 참조). 적절한 선택 마커에는 벡터가 도입된 숙주 세포에 약물 예컨대 G418, 히그로마이신 또는 메토트렉세이트에 대한 저항성을 부여하는 유전자가 포함된다. 예를 들어, 디히드로폴레이트 환원효소 (DHFR) 유전자는 메토트렉세이트에 대한 저항성을 부여하고, neo 유전자는 G418에 대한 저항성을 부여한다.
표준 기법 예컨대 전기천공, 인산칼슘 침전, 및 DEAE-덱스트란, 리포펙션(lipofection) 또는 다가양이온-매개 형질감염을 사용하여 숙주 세포 내로의 발현 벡터의 형질감염을 수행할 수 있다.
본원에서 제공되는 항체, 그의 항원 결합 부분 또는 유도체를 발현시키기 위한 적절한 포유동물 숙주 세포에는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO 세포) (예를 들어, 문헌 [R. J. Kaufman and P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621]에 기술된 바와 같은, DHFR 선택 마커와 함께 사용되는 문헌 [Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220]에 기술된 dhfr- CHO 세포 포함), NSO 골수종 세포, COS 세포 및 SP2 세포가 포함된다. 일부 실시양태에서, 발현된 단백질이 숙주 세포가 성장중인 배양 배지 내로 분비되도록 발현 벡터가 디자인된다. 항체의 일시적인 형질감염/발현은, 예를 들어, 문헌 [Durocher et al. (2002) Nucl. Acids Res. Vol 30 e9]에 의한 프로토콜을 따라 달성될 수 있다. 항체의 안정적인 형질감염/발현은, 예를 들어, UCOE 시스템 (문헌 [T. Benton et al. (2002) Cytotechnology 38: 43-46])의 프로토콜에 따라 달성될 수 있다.
항체, 그의 항원 결합 부분, 또는 유도체를 표준 단백질 정제 방법을 사용하여 배양 배지로부터 회수할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 황산암모늄 또는 에탄올 침전, 산 추출, 단백질 A 크로마토그래피, 단백질 G 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포-셀룰로스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 히드록시아파타이트 크로마토그래피 및 렉틴 크로마토그래피를 포함하지만 이에 한정되지 않는 주지된 방법에 의해 재조합 세포 배양물로부터 회수 및 정제할 수 있다. 고성능 액체 크로마토그래피 ("HPLC")를 또한 정제에 사용할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Colligan, Current Protocols in Immunology, or Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, N.Y., (1997-2001)], 예를 들어, 챕터 1, 4, 6, 8, 9, 10을 참조하고, 이들 각각은 본원에 전문이 참고로 포함된다.
본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 천연적으로 정제된 생성물, 화학적 합성 절차의 생성물, 및 효모, 고등 식물, 곤충 및 포유동물 세포가 예를 들어 포함되는 진핵생물 숙주, 바람직하게는 포유동물 세포로부터 재조합 기술에 의해 생산된 생성물을 포함한다. 재조합 생산 절차에서 사용된 숙주에 따라, 본 발명의 항체가 글리코실화되거나 글리코실화되지 않을 수 있고, 이때 글리코실화가 바람직하다. 이같은 방법들이 다수의 표준 실험 매뉴얼, 예컨대 상기 문헌 [Sambrook, 섹션 17.37-17.42]; 상기 문헌 [Ausubel, 챕터 10, 12, 13, 16, 18 및 20]에 기술되어 있다.
치료 방법
치료 방법은 치료를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 본 발명에 의해 구상되는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 투여하는 것을 수반한다. "치료 유효량"은 단일 용량으로서 또는 다중 용량 요법에 따라, 단독으로 또는 다른 작용제와 조합되어, 대상체의 치료된 영역에서 C4.4a-양성 세포를 고갈시키는데 충분한 양이고, 불리한 상태의 경감에 이르게 하지만, 독성학적으로 허용가능한 양인 항체 또는 항원-결합 단편의 양으로서 본원에서 정의된다. 대상체는 인간 또는 비-인간 동물 (예를 들어, 토끼, 래트, 마우스, 개, 원숭이 또는 기타 하등 영장류)일 수 있다.
본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 공지된 의약과 공동-투여될 수 있고, 일부 경우에는 항체 자체가 변형될 수 있다. 예를 들어, 잠재적으로 효능을 더 증가시키도록 항체가 세포독성제 또는 방사성 동위원소에 접합될 수 있다.
본 발명의 항체는 단독 약제로서 또는 하나 이상의 추가적인 치료제와 조합되어 투여될 수 있고, 이때 조합물은 허용가능하지 않은 역효과를 야기하지 않는다. 이러한 조합 요법은 본 발명의 항체 및 하나 이상의 추가적인 치료제를 함유하는 단일 제약 투여 제형의 투여, 뿐만 아니라 독자적인 별도의 제약 투여 제형 내의 본 발명의 항체 및 각각의 추가적인 치료제의 투여를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 항체 및 치료제가 단일 경구 투여 조성물 예컨대 정제 또는 캡슐로 환자에게 함께 투여될 수 있거나, 또는 각각의 작용제가 별도의 투여 제형으로 투여될 수 있다.
별도의 투여 제형이 사용되는 경우에, 본 발명의 항체 및 하나 이상의 추가적인 치료제는 본질적으로 동일한 시간에 (예를 들어, 동시에), 또는 분리되어 차이가 나는 시간에 (예를 들어 순차적으로) 투여될 수 있다.
특히, 본 발명의 항체는 기타 항종양제 예컨대 알킬화제, 항대사물질, 식물-유래 항종양제, 호르몬 요법제, 토포이소머라제 억제제, 캄프토테신 유도체, 키나제 억제제, 표적화된 약물, 항체, 인터페론 및/또는 생물학적 반응 개질제, 항-혈관신생 화합물, 및 기타 항-종양 약물과의 고정된 조합물 또는 분리된 조합물에서 사용될 수 있다. 이와 관련하여, 하기는 본 발명의 항체와 조합되어 사용될 수 있는 제2 작용제의 예의 비-제한적인 목록이다:
알킬화제에는 질소 머스타드 N-옥시드, 시클로포스파미드, 이포스파미드, 티오테파, 라니무스틴, 니무스틴, 테모졸로마이드, 알트레타민, 아파지큐온, 브로스탈리신, 벤다무스틴, 카르무스틴, 에스트라무스틴, 포테무스틴, 글루포스파미드, 마포스파미드, 벤다무스틴 및 미톨락톨이 포함되지만, 이에 한정되지 않고; 백금-배위 알킬화 화합물에는 시스플라틴, 카르보플라틴, 엡타플라틴, 로바플라틴, 네다플라틴, 옥살리플라틴 또는 사트라플라틴이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다;
항대사물질에는 메토트렉세이트, 6-메르캅토퓨린 리보사이드, 메르캅토퓨린, 5-플루오로우라실 (단독 또는 류코보린과의 조합물), 테가푸르, 독시플루리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 시타라빈 옥포스페이트, 에노시타빈, 젬시타빈, 플루다라빈, 5-아자시티딘, 카페시타빈, 클라드리빈, 클로파라빈, 데시타빈, 에플로르니틴, 에티닐시티딘, 시토신 아라비노시드, 히드록시우레아, 멜팔란, 넬라라빈, 놀라트렉세드, 옥포스파이트, 디소듐 프레메트렉세드, 펜토스타틴, 펠리트렉솔, 랄티트렉세드, 트리아핀, 트리메트렉사트, 비다라빈, 빈크리스틴 및 비노렐빈이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다;
호르몬 요법제에는 엑세메스탄, 루프론(Lupron), 아나스트로졸, 독서칼시페롤, 파드로졸, 포르메스탄, 11-베타 히드록시스테로이드 데히드로게나제 1 억제제, 17-알파 히드록실라제/17,20 리아제 억제제 예컨대 아비라테론 아세테이트, 5-알파 리덕타제 억제제 예컨대 피나스테리드 및 에프리스테리드, 항-에스트로겐 예컨대 타목시펜 시트레이트 및 풀베스트란트, 트렐스타(Trelstar), 토레미펜, 랄록시펜, 라소폭시펜, 레트로졸, 항-안드로겐 예컨대 비칼루타미드, 플루타미드, 미페프리스톤, 닐루타미드, 카소덱스(Casodex), 및 항-프로게스테론 및 그의 조합물이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다;
식물 유래 항종양 물질에는, 예를 들어, 유사분열 억제제로부터 선택된 것들, 예를 들어 에포틸론 예컨대 사고필론, 익사베필론 및 에포틸론 B, 빈블라스틴, 빈플루닌, 도세탁셀 및 파클리탁셀이 포함된다;
세포독성 토포이소머라제 억제제에는 아클라루비신, 독소루비신, 아모나피드, 벨로테칸, 캄프토테신, 10-히드록시캄프토테신, 9-아미노캄프토테신, 디플로모테칸, 이리노테칸, 토포테칸, 에도테카린, 에핌비신, 에토포시드, 엑사테칸, 기마테칸, 루르토테칸, 미톡산트론, 피람비신, 픽산트론, 루비테칸, 소부족산, 타플루포시드, 및 그의 조합물이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다;
면역학적 작용제에는 인터페론 예컨대 인터페론 알파, 인터페론 알파-2a, 인터페론 알파-2b, 인터페론 베타, 인터페론 감마-1a 및 인터페론 감마-n1, 및 기타 면역 증강제 예컨대 L19-IL2 및 기타 IL2 유도체, 필그라스팀, 렌티난, 시조필란, 테라시스(TheraCys), 우베니멕스, 알데스류킨, 알렘투주맙, BAM-002, 다카르바진, 다클리주맙, 데닐류킨, 젬투주맙, 오조가미신, 이브리투모맙, 이미퀴모드, 레노그라스팀, 렌티난, 흑색종 백신 (코릭사(Corixa)), 몰그라모스팀, 사르그라모스팀, 타소너민, 테크류킨, 티말라신, 토시투모맙, 빔리진(Vimlizin), 에프라투주맙, 미투모맙, 오레고보맙, 펨투모맙, 및 프로벤지(Provenge)가 포함된다;
생물학적 반응 개질제는 살아 있는 유기체의 방어 메커니즘 또는 생물학적 반응 예컨대 조직 세포의 생존, 성장 또는 분화를 변형시켜 이들이 항종양 활성을 갖도록 하는 작용제이고, 이같은 작용제에는, 예를 들어, 크레스틴, 렌티난, 시조피란, 피시바닐, 프로뮨(ProMune) 또는 우베니멕스가 포함된다;
항-혈관신생 화합물에는 아시트레틴, 아플리버셉트, 안지오스타틴, 아플리딘, 아센타, 악시티닙, 베바시주맙, 브리바닙 알라니나트, 실렝티드, 콤브레타스타틴, 엔도스타틴, 펜레티니드, 할로푸기논, 파조파닙, 라니비주맙, 레비마스타트, 레센틴, 레고라페닙, 레모밥, 레블리미드, 소라페닙, 스쿠알라민, 수니티닙, 텔라티닙, 탈리도마이드, 우크라인, 바탈라닙 및 비탁신이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다;
항체에는 트라스투주맙, 세툭시맙, 베바시주맙, 리툭시맙, 티실리무맙, 이필리무맙, 루밀릭시맙, 카투막소맙, 아타시셉트, 오레고보맙, 및 알렘투주맙이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다;
VEGF 억제제, 예를 들어, 소라페닙, 레고라페닙, 베바시주맙, 수니티닙, 레센틴, 악시티닙, 아플리버셉트, 텔라티닙, 브리바닙 알라니네이트, 바탈라닙, 파조파닙 및 라니비주맙;
EGFR (HER1) 억제제, 예를 들어, 세툭시맙, 파니투무맙, 벡티빅스, 게피티닙, 엘로티닙, 작티마(Zactima);
HER2 억제제, 예를 들어, 라파티닙, 트라투주맙, 및 퍼투주맙;
mTOR 억제제, 예를 들어, 템시롤리무스, 시롤리무스/라파마이신(Rapamycin), 및 에버롤리무스;
c-Met 억제제;
PI3K 및 AKT 억제제;
CDK 억제제 예컨대 로스코비틴 및 플라보피리돌;
방추체 조립 체크포인트 억제제 및 표적화된 항유사분열제 예컨대 PLK 억제제, 오로라(Aurora) 억제제 (예를 들어 헤스페라딘(Hesperadin)), 체크포인트 키나제 억제제, 및 KSP 억제제;
HDAC 억제제, 예를 들어, 파노비노스타트, 보리노스타트, MS275, 벨리노스타트, 및 LBH589;
HSP90 및 HSP70 억제제;
프로테아좀 억제제 예컨대 보르테조밉 및 카르필조밉;
MEK 억제제 및 Raf 억제제 예컨대 소라페닙이 포함되는 세린/트레오닌 키나제 억제제;
파네실 트랜스퍼라제 억제제, 예를 들어, 티피파닙;
다사티닙, 닐로티빕, 레고라페닙, 보수티닙, 소라페닙, 베바시주맙, 수니티닙, 세디라닙, 악시티닙, 아플리버셉트, 텔라티닙, 이마티닙 메실레이트, 브리바닙 알라니네이트, 파조파닙, 라니비주맙, 바탈라닙, 세툭시주맙, 파니투무맙, 벡티빅스, 제피티닙, 엘로티닙, 라파티닙, 트라투주맙, 퍼투주맙 및 c-Kit 억제제가 예를 들어 포함되는 티로신 키나제 억제제;
비타민 D 수용체 효능제;
Bcl-2 단백질 억제제 예컨대 오바토클락스, 오블리메르센 소듐, 및 고시폴;
분화 클러스터 20 수용체 길항제, 예를 들어, 리툭시맙;
리보뉴클레오티드 리덕타제 억제제, 예를 들어, 젬시타빈;
종양 괴사 아폽토시스 유도 리간드 수용체 1 효능제, 예를 들어, 마파투무맙;
5-히드록시트립타민 수용체 길항제, 예를 들어, rEV598, 잘리프로드, 팔로노세트론 히드로클로라이드, 그라니세트론, 진돌(Zindol), 및 AB-1001;
알파5-베타1 인테그린 억제제, 예를 들어, E7820, JSM 6425, 볼로식시맙 및 엔도스타틴이 포함되는 인테그린 억제제;
난드롤론 데카노에이트, 플루옥시메스테론, 안드로이드(Android), 프로스트-에이드(Prost-aid), 안드로무스틴, 비칼루타미드, 플루타미드, 아포-시프로테론, 아포-플루타미드, 클로르마디논 아세테이트, 안드로쿨(Androcur), 타비(Tabi), 시프로테론 아세테이트, 및 닐루타미드가 예를 들어 포함되는 안드로겐 수용체 길항제;
아로마타제 억제제, 예를 들어, 아나스트로졸, 레트로졸, 테스톨락톤, 엑세메스탄, 아미노글루테티미드, 및 포르메스탄;
매트릭스 메탈로프로테이나제 억제제;
알리트레티노인, 암플리젠, 아트라센탄, 벡사로텐, 보르테조밉, 보센탄, 칼시트리올, 엑시술린드, 포테무스틴, 이반드론산, 밀테포신, 미톡산트론, I-아스파라기나제, 프로카르바진, 다카르바진, 히드록시카르바미드, 페가스파르가제(pegaspargase), 펜토스타틴, 타자로텐, 벨케이드, 질산 갈륨, 칸포스파미드, 다리나파르신 및 트레티노인이 예를 들어 포함되는 기타 항암제.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 화학요법 (즉, 세포독성제), 항-호르몬 및/또는 표적화된 요법 예컨대 기타 키나제 억제제 (예를 들어, EGFR 억제제), mTOR 억제제 및 혈관신생 억제제와 조합되어 사용될 수 있다.
본 발명의 화합물은 또한 방사선 요법 및/또는 외과적 중재와 함께 암 치료에서 사용될 수 있다.
일부 경우에 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편 자체가 변형될 수 있다. 예를 들어, 잠재적으로 효능을 더 증가시키도록 항체가 상기 언급된 화합물들 중 임의의 것 (그러나 이에 한정되지는 않음) 또는 임의의 방사성동위원소에 접합될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체가, 그대로 또는 조성물로, 연구 및 진단학에서, 또는 당업계에 주지되어 있는 분석용 기준 표준물 등으로서 사용될 수 있다.
본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 C4.4a가 원치 않게 발현 또는 발견되는 다양한 상황, 예를 들어, 세포 증식성 장애 예컨대 암에서 치료 또는 진단 도구로서 사용될 수 있다. 본 발명의 항체로의 치료에 특히 적절한 장애 및 상태는 고형 종양, 예컨대 유방, 기도, 뇌, 생식 기관, 소화관, 요로, 눈, 간, 피부, 두경부, 갑상선, 부갑상선 및 이들의 원격 전이물의 암이다. 이러한 장애에는 림프종, 육종 및 백혈병이 또한 포함된다.
유방암의 예에는 침습성 관상 암종, 침습성 소엽 암종, 상피내 관상 암종, 및 상피내 소엽 암종이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
기도암의 예에는 소세포 및 비-소세포 폐 암종, 뿐만 아니라 기관지 선종 및 흉막폐 모세포종이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
뇌암의 예에는 뇌간 및 시상하부 신경교종, 소뇌 및 대뇌 별아교세포종, 교모세포종, 속질모세포종, 뇌실막세포종, 뿐만 아니라 신경외배엽 및 송과체 종양이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
남성 생식기관 종양에는 전립선 및 고환 암이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 여성 생식기관 종양에는 자궁내막, 자궁경부, 난소, 질 및 외음부 암, 뿐만 아니라 자궁 육종이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
소화관 종양에는 항문, 결장, 직장결장, 식도, 담낭, 위, 췌장, 직장, 소장 및 타액선 암이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
요로 종양에는 방광, 음경, 신장, 신우, 요관, 요도, 및 유전성 및 산발성 유두상 신장 암이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
안암에는 안내 흑색종 및 망막모세포종이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
간암의 예에는 간세포 암종 (섬유층판 변형이 있는 간 세포 암종 또는 섬유층판 변형이 없는 간 세포 암종), 담관암종 (간내 담관 암종), 및 혼합형 간세포 담관암종이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
피부암에는 편평 세포 암종, 카포시 육종, 악성 흑색종, 메르켈 세포 피부 암, 및 비-흑색종 피부 암이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
두경부 암에는 후두, 하인두, 비강인두, 구인두 암, 입술 및 구강 암, 및 편평세포 암이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
림프종에는 AIDS-관련 림프종, 비-호지킨성 림프종, 피부 T-세포 림프종, 버킷 림프종, 호지킨병, 및 중추 신경계의 림프종이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
육종에는 연조직 육종, 골육종, 악성 섬유성 조직구종, 림프육종, 및 횡문근육종이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
백혈병으로는 급성 골수성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 만성 골수성 백혈병 및 모발상 세포 백혈병이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
상기 언급된 장애는 인간에서 잘 특성화되어 있지만, 포유동물이 포함되는 기타 동물에서 유사한 병인학으로 또한 존재하고, 이는 본 발명의 제약 조성물을 투여함으로써 치료될 수 있다.
임의의 상기 장애를 치료하기 위해, 본 발명에 따라 사용하기 위한 제약 조성물을 하나 이상의 생리학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 사용하여 통상적인 방식으로 제형화할 수 있다. 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 임의의 적절한 수단에 의해 투여될 수 있고, 이는 치료될 장애의 유형에 따라 변할 수 있다. 가능한 투여 경로에는 비경구 투여 (예를 들어, 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하), 폐내 투여 및 비강내 투여가 포함되고, 국소적인 면역억제 치료용으로 원하는 경우의 병변내 투여가 포함된다. 또한, 예를 들어, 항체의 용량을 감소시키면서, 펄스 주입에 의해 본 발명의 항체를 투여할 수 있다. 바람직하게는, 투여가 단기 또는 장기인지 여부에 부분적으로 좌우되어, 주사, 가장 바람직하게는 정맥내 또는 피하 주사에 의해 투여가 제공된다. 투여되는 양은 임상 증상, 개체의 체중, 기타 약물이 투여되는지 여부와 같은 다양한 인자에 좌우될 것이다. 숙련가는 투여 경로가 치료될 장애 또는 상태에 따라 변할 것임을 인지할 것이다.
본 발명에 따른 신규 폴리펩티드의 치료 유효량을 결정하는 것은 특정 환자 특성, 투여 경로, 및 치료될 장애의 성질에 주로 좌우될 것이다. 일반적인 지침을, 예를 들어, 국제 조화 회의(International Conference on Harmonization)의 간행물 및 문헌 [REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, chapters 27 & 28, pp. 484-528 (18th ed., Alfonso R. Gennaro, Ed., Easton, Pa.: Mack Pub. Co., 1990)]에서 확인할 수 있다. 더욱 구체적으로, 치료 유효량을 결정하는 것은 의약의 독성 및 효능과 같은 인자에 좌우될 것이다. 당업계에 주지되어 있고 상기 참고문헌에서 확인되는 방법을 사용하여 독성을 결정할 수 있다. 동일한 지침을 하기 실시예에서 기술된 방법와 함께 사용하여 효능을 결정할 수 있다.
진단 방법
C4.4a 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 C4.4a-발현 종양의 존재를 검출하는데 사용할 수 있다. 혈청 및 조직 생검 표본을 비롯한 다양한 생물학적 샘플 내의 C4.4a-함유 세포 또는 박리된 C4.4a의 존재를 C4.4a 항체로 검출할 수 있다. 또한, C4.4a 항체를 99Tc (또는 기타 동위원소)가 접합된 항체로의 면역섬광조영술과 같은 다양한 영상화 방법에서 사용할 수 있다. 예를 들어, 111In이 접합된 항-PSMA 항체를 사용하여 최근에 기술된 것과 유사한 영상화 프로토콜을 사용하여 췌장 또는 난소 암종을 검출할 수 있다 (문헌 [Sodee et al., Clin. Nuc. Med. 21: 759-766, 1997]). 사용될 수 있는 또 다른 검출 방법은 본 발명의 항체를 적절한 동위원소와 접합시키는 것에 의한 양전자 방출 단층촬영술이다 (문헌 [Herzog et al., J. Nucl. Med. 34:2222-2226, 1993] 참조).
제약 조성물 및 투여
본 발명의 실시양태는 염수, 완충 염수, 덱스트로스 및 물을 포함하지만 이에 한정되지 않는 임의의 멸균성, 생체적합성 제약 담체 내에서 투여될 수 있는, C4.4a 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 단독으로 또는 하나 이상의 다른 작용제 예컨대 안정화 화합물과 함께 포함하는 제약 조성물이다. 추가적인 실시양태는 C4.4a 결합 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 및 C4.4a 관련 질환 예컨대 암을 치료하는데 적절한 추가적인 제약 활성 화합물을 포함하는 제약 조성물이다. 임의의 이러한 분자는, 이들이 부형제(들) 또는 제약상 허용되는 담체와 혼합되는 제약 조성물로, 환자에게 단독으로 또는 다른 작용제, 약물 또는 호르몬과 조합되어 투여될 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제약상 허용되는 담체는 제약상 불활성이다.
본 발명은 제약 조성물의 투여에 또한 관련된다. 이같은 투여는 경구적으로 또는 비경구적으로 수행된다. 비경구 전달 방법에는 국소, 동맥내 (종양에 직접), 근육내, 피하, 척수내, 수막강내, 뇌실내, 정맥내, 복강내 또는 비강내 투여가 포함된다. 활성 성분에 더하여, 이러한 제약 조성물은 활성 화합물을 제약적으로 사용될 수 있는 제제로 가공하는 것을 용이하게 하는 부형제 및 보조제를 포함하는 적절한 제약상 허용되는 담체를 함유할 수 있다. 제형화 및 투여를 위한 기법에 대한 추가적인 상세사항을 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences (Ed. Maack Publishing Co, Easton, Pa.)]의 최신판에서 확인할 수 있다.
경구 투여에 적절한 투여량으로 당업계에 주지된 제약상 허용되는 담체를 사용하여 경구 투여용 제약 조성물을 제형화할 수 있다. 이같은 담체는 제약 조성물이 환자가 섭취하기 위한 정제, 환제, 당의정, 캡슐, 액체, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁액 등으로 제형화될 수 있게 한다.
활성 화합물을 고체 부형제와 조합하고, 임의적으로는 생성된 혼합물을 분쇄하고, 원하는 경우 적절한 보조제를 첨가한 후, 과립들의 혼합물을 가공하여 정제 또는 당의정 코어를 수득하는 것을 통해 경구 사용을 위한 제약 제제를 수득할 수 있다. 적절한 부형제는 탄수화물 또는 단백질 충전제 예컨대 락토스, 수크로스, 만니톨 또는 소르비톨이 포함되는 당; 옥수수, 밀, 쌀, 감자 또는 기타 식물로부터의 전분; 셀룰로스 예컨대 메틸 셀룰로스, 히드록시프로필메틸셀룰로스, 또는 나트륨 카르복시메틸 셀룰로스; 및 아라비아 고무 및 트라가칸트가 포함되는 고무; 및 단백질 예컨대 젤라틴 및 콜라겐이다. 원한다면, 붕해제 또는 가용화제, 예컨대 가교 폴리비닐 피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 그의 염, 예컨대 알긴산나트륨을 첨가할 수 있다.
당의정 코어에 적절한 코팅제 예컨대 농축된 당 용액이 제공되고, 이는 아라비아 고무, 탈크, 폴리비닐 피롤리돈, 카르보폴 겔, 폴리에틸렌 글리콜 및/또는 이산화티타늄, 래커 용액, 및 적절한 유기 용매 또는 용매 혼합물을 또한 함유할 수 있다. 제품 확인을 위해 또는 활성 화합물의 양, 즉 투여량을 특성화하기 위해 염료 또는 안료가 정제 또는 당의정 코팅제에 첨가될 수 있다.
경구적으로 사용될 수 있는 제약 제제에는 젤라틴으로 제조된 푸쉬-핏(push-fit) 캡슐, 뿐만 아니라 젤라틴 및 코팅제 예컨대 글리세롤 또는 소르비톨로 제조된 연질 밀봉 캡슐이 포함된다. 푸쉬-핏 캡슐은 충전제 또는 결합제 예컨대 락토스 또는 전분, 윤활제 예컨대 탈크 또는 스테아르산마그네슘, 및 임의적인 안정화제와 혼합된 활성 성분을 함유할 수 있다. 연질 캡슐에서는, 활성 화합물이 안정화제와 함께 또는 안정화제 없이 적절한 액체, 예컨대 지방 오일, 액체 파라핀 또는 액체 폴리에틸렌 글리콜 내에 용해 또는 현탁될 수 있다.
비경구 투여용 제약 제형에는 활성 화합물의 수용액이 포함된다. 주사를 위해, 본 발명의 제약 조성물이 수용액으로, 바람직하게는 생리학상 적합성 완충제 예컨대 행크 용액, 링거 용액 또는 생리학적 완충 염수 내에 제형화될 수 있다. 수성 주사 현탁액은 현탁액의 점도를 증가시키는 물질, 예컨대 나트륨 카르복시메틸 셀룰로스, 소르비톨, 또는 덱스트란을 함유할 수 있다. 추가적으로, 활성 화합물의 현탁액은 적합한 오일성 주사 현탁액으로서 제조될 수 있다. 적절한 친유성 용매 또는 비히클에는 지방 오일 예컨대 참깨 오일, 또는 합성 지방산 에스테르 예컨대 에틸 올레에이트 또는 트리글리세리드, 또는 리포솜이 포함된다. 임의적으로, 현탁액은 고도로 농축된 용액의 제조를 허용하도록 적절한 안정화제 또는 화합물의 용해도를 증가시키는 작용제를 또한 함유할 수 있다.
국소 또는 비강 투여를 위해, 투과될 특정 장벽에 적합한 침투제가 제형에서 사용된다. 이같은 침투제가 일반적으로 당업계에 공지되어 있다.
키트
본 발명은 상기 언급된 본 발명의 조성물들의 성분들 중 하나 이상이 충전된 하나 이상의 용기를 포함하는 제약 팩 및 키트에 추가로 관련된다. 약제 또는 생물학적 제품의 제작, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관이 인간 투여를 위한 제품의 제작, 사용 또는 판매를 승인하였음을 반영하는, 이러한 기관에 의해 규정된 형태의 통지서가 이같은 용기(들)에 결합될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 키트는 본 발명의 항체를 코딩하는 DNA 서열을 함유할 수 있다. 바람직하게는, 이러한 항체를 코딩하는 DNA 서열은 숙주 세포 내로의 형질감염 및 숙주 세포에 의한 발현에 적절한 플라스미드 내에서 제공된다. 플라스미드는 숙주 세포 내에서의 DNA의 발현을 조절하도록 프로모터 (종종, 유도성 프로모터)를 함유할 수 있다. 플라스미드는 플라스미드 내로의 다른 DNA 서열의 삽입을 촉진하여 다양한 항체가 생산되도록 적합한 제한 부위를 또한 함유할 수 있다. 플라스미드는 코딩된 단백질의 클로닝 및 발현을 촉진하도록 다수의 기타 요소를 또한 함유할 수 있다. 이같은 요소들은 당업자에게 주지되어 있고, 예를 들어, 선택 마커, 개시 코돈, 종결 코돈 등이 이에 포함된다.
제작 및 보관
본 발명의 제약 조성물을 당업계에 공지된 방식으로, 예를 들어, 통상적인 혼합, 용해, 과립화, 당의정-제조, 연마(levigating), 유화, 캡슐화, 포획 또는 동결건조 공정에 의해 제작할 수 있다.
제약 조성물이 염으로서 제공될 수 있고, 이는 염산, 황산, 아세트산, 락트산, 타르타르산, 말산, 숙신산 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는 산으로 형성될 수 있다. 염은 상응하는 유리 염기 형태인 수성 또는 기타 양성자성 용매에 더욱 가용성인 경향이 있다. 다른 경우에, 바람직한 제제는 pH가 4.5 내지 5.5 범위인 1 mM-50 mM 히스티딘, 0.1％-2％ 수크로스, 2％-7％ 만니톨 내의 동결건조 분말일 수 있고, 이는 사용 전에 완충제와 조합된다.
허용되는 담체 내에 제형화된 본 발명의 화합물을 포함하는 제약 조성물이 제조된 후, 이를 적합한 용기 내에 놓고, 지시되는 상태의 치료에 대해 표지할 수 있다. C4.4a 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 투여에 대해, 이같은 표지는 투여하는 양, 빈도 및 방법을 포함할 것이다.
치료 유효 용량
본 발명에서 사용하기에 적절한 제약 조성물은 의도된 목적, 즉 C4.4a 발현을 특징으로 하는 특정 질환 상태의 치료를 달성하는 유효량의 활성 성분이 함유된 조성물을 포함한다. 유효 용량의 결정은 충분히 당업자의 능력 내에 속한다.
임의의 화합물에 대해, 치료 유효 용량을 먼저 세포 배양 검정, 예를 들어, 신생물 세포에서, 또는 동물 모델, 일반적으로는 마우스, 토끼, 개, 돼지 또는 원숭이에서 추정할 수 있다. 동물 모델은 바람직한 농도 범위 및 투여 경로를 달성하는데 또한 사용된다. 그 후, 이같은 정보를 사용하여 인간에서의 투여를 위한 유용한 용량 및 경로를 결정할 수 있다.
치료 유효 용량은 증상 또는 상태를 경감시키는 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 양을 지칭한다. 이같은 화합물의 치료 효능 및 독성, 예를 들어, ED50 (집단의 50％에서 치료상 효과적인 용량) 및 LD50 (집단의 50％에 대해 치사성인 용량)을 세포 배양물 또는 실험 동물에서 표준 제약 절차에 의해 결정할 수 있다. 치료 효과와 독성 효과 사이의 용량 비율은 치료 지수이고, 이는 ED50/LD50 비율로 표현될 수 있다. 높은 치료 지수를 나타내는 제약 조성물이 바람직하다. 세포 배양 검정 및 동물 연구로부터 수득된 데이터가 인간 용도를 위한 투여량 범위를 공식화하는데 사용된다. 바람직하게는 이같은 화합물의 투여량은 독성이 거의 없거나 독성 없이 ED50을 포함하는 순환 농도의 범위 내이다. 투여량은 사용된 투여 형태, 환자의 민감도, 및 투여 경로에 따라 이러한 범위 내에서 변한다.
정확한 투여량은 치료될 환자를 고려하여 개별적인 의사에 의해 선택된다. 충분한 수준의 활성 모이어티를 제공하도록 또는 원하는 효과를 유지하도록 투여량 및 투여를 조정한다. 고려될 수 있는 추가적인 인자에는 질환 상태의 중증도, 예를 들어, 종양 크기 및 위치; 환자의 연령, 체중 및 성별; 식이, 투여 시간 및 빈도, 약물 조합물(들), 반응 민감도, 및 치료법에 대한 관용/반응이 포함된다. 특정 제형의 반감기 및 클리어런스율에 따라 장기 작용 제약 조성물이 3일 내지 4일마다, 매주, 또는 2주마다 1번 투여될 수 있다.
일반적인 투여량은 투여 경로에 따라 약 1 g의 총 용량까지 0.1 내지 100,000 ㎍으로 변할 수 있다. 특정 투여량 및 전달 방법에 관한 지침이 문헌에서 제공된다. 미국 특허 번호 4,657,760; 5,206,344; 또는 5,225,212 참조. 당업자는 단백질 또는 그의 억제제에 대한 것과 상이한 제형을 폴리뉴클레오티드에 대해 사용할 것이다. 유사하게, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 전달은 특정 세포, 상태, 위치 등에 대해 특이적일 것이다. 방사성표지된 항체에 대한 바람직한 비활성(specific activity)은 단백질 1 ㎎ 당 0.1 내지 10 mCi 범위일 수 있다 (문헌 [Riva et al., Clin. Cancer Res. 5:3275-3280, 1999]; [Ulaner et al., 2008 Radiology 246(3):895-902])
하기의 실시예에 의해 본 발명이 추가로 기술된다. 실시예는 단지 특정 실시양태를 참조로 본 발명을 설명하기 위해서 제공된다. 이러한 예시는, 본 발명의 특정한 구체적인 측면들을 설명하지만, 개시된 발명을 제한하거나 이의 범주의 경계를 정하지 않는다.
모든 실시예는, 상세하게 달리 기술된 경우를 제외하고는, 당업자에게 주지되어 있고 일상적인 표준 기법을 사용하여 수행되었다. 하기의 실시예의 일상적인 분자 생물학 기법은 표준 실험 매뉴얼, 예컨대 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989]에 기술된 바와 같이 수행될 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시양태는 하기와 같다:
A. C4.4a, 바람직하게는 C4.4a의 도메인 S1에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
B. 실시양태 A에 있어서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 설치류 C4.4a, 바람직하게는 뮤린 C4.4a에 대해 교차-반응성인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
C. 실시양태 A 또는 B에 있어서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 C4.4a 발현 세포에 대한 결합 후 내재화되는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
D. 실시양태 A 내지 C 중 어느 하나에 있어서, 항체 또는 항원-결합 단편이 C4.4a에 대한 결합에서 항체 M31-B01 또는 M20-D02 S-A와 경쟁하는 항체 또는 항원-결합 단편.
E. 실시양태 D에 있어서, 항체 또는 항원-결합 단편의 아미노산 서열이 표 7에 도시된 하나 이상의 CDR 서열에 대해 50％, 55％, 60％, 70％, 80％, 90％ 또는 95％ 이상 동일하거나, 또는 표 7에 도시된 하나 이상의 VH 또는 VL 서열에 대해 50％, 60％, 70％, 80％, 90％, 92％ 또는 95％ 이상 동일한 항체 또는 항원-결합 단편.
F. 실시양태 D 또는 E에 있어서, 항체 또는 항원-결합 단편의 아미노산 서열이 M31-B01 또는 M20-D02 S-A의 하나 이상의 CDR 서열에 대해 50％, 55％, 60％, 70％, 80％, 90％ 또는 95％ 이상 동일하거나, 또는 M31-B01 또는 M20-D02 S-A의 VH 또는 VL 서열에 대해 50％, 60％, 70％, 80％, 90％, 92％ 또는 95％ 이상 동일한 항체 또는 항원-결합 단편.
G. 실시양태 D 내지 F 중 어느 하나에 있어서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 컨센서스 서열인 서열 297 또는 서열 302 (CDR H1), 서열 298 또는 서열 303 (CDR H2), 또는 서열 299 또는 서열 304 (CDR H3)에 부합하는 중쇄 CDR 서열 중 하나 이상, 및/또는 컨센서스 서열인 서열 300 또는 서열 305 (CDR L1), 서열 22 또는 서열 306 (CDR L2), 또는 서열 301 또는 서열 307 (CDR L3)에 부합하는 경쇄 CDR 서열 중 하나 이상을 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편.
H. 실시양태 D 내지 G 중 어느 하나에 있어서,
a) 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 서열 297 (CDR H1), 서열 298 (CDR H2) 및 서열 299 (CDR H3)에 부합하는 중쇄 CDR 서열, 및 서열 300 (CDR L1), 서열 22 (CDR L2) 및 서열 301 (CDR L3)에 부합하는 경쇄 CDR 서열을 포함하거나, 또는
b) 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 서열 302 (CDR H1), 서열 303 (CDR H2) 및 서열 304 (CDR H3)에 부합하는 중쇄 CDR 서열, 및 서열 305 (CDR L1), 서열 306 (CDR L2) 및 서열 307 (CDR L3)에 부합하는 경쇄 CDR 서열을 포함하는
항체 또는 항원-결합 단편.
I. 실시양태 D 내지 H 중 어느 하나에 있어서, 항체 M31-B01의 가변 중쇄 및 가변 경쇄 CDR 서열 또는 이로부터 변형된 서열을 포함하고, 이때
i. 변형된 CDR-H1에서, 위치 3의 아미노산이 N 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되고, 위치 4의 아미노산이 A 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되고;
ii. 변형된 CDR-H2에서, 위치 10의 아미노산이 T 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되고, 위치 11의 아미노산이 I 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되고;
iii. 변형된 CDR-H3에서, 위치 10의 아미노산이 Y, K, G, W 및 N으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
iv. 변형된 CDR-L1에서, 위치 1의 아미노산이 T 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되며;
v. 변형된 CDR-L2에서, 위치 4의 아미노산이 Q 및 K로 이루어진 군으로부터 선택되고;
vi. 변형된 CDR-L3에서, 위치 4의 아미노산이 W, E, F 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되고, 위치 7의 아미노산이 R, S 및 M으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 위치 9의 아미노산이 N, K 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되고, 위치 10의 아미노산이 G 및 R로 이루어진 군으로부터 선택되며, 위치 11의 아미노산이 P 및 A로 이루어진 군으로부터 선택되는
항체 또는 항원-결합 단편.
J. 실시양태 G 내지 H 중 어느 하나에 있어서, 항체 M31-B01의 가변 중쇄 및 가변 경쇄 CDR 서열의 프레임워크 서열 또는 이로부터 변형된 서열을 포함하고, 이때 변형된 가변 경쇄에서, 위치 10의 아미노산이 A 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되고, 위치 13의 아미노산이 A 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체 또는 항원-결합 단편.
K. 실시양태 D 내지 H 중 어느 하나에 있어서, 항체 M20-D02 S-A의 가변 중쇄 및 가변 경쇄 CDR 서열 또는 이로부터 변형된 서열을 포함하고, 이때
i. 변형된 CDR-H1에서, 위치 3의 아미노산이 D 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되고;
ii. 변형된 CDR-H2에서, 위치 4의 아미노산이 V 및 I로 이루어진 군으로부터 선택되고, 위치 9의 아미노산이 A 및 G로 이루어진 군으로부터 선택되며, 위치 10의 아미노산이 R 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되고;
iii. 변형된 CDR-H3에서, 위치 9의 아미노산이 S, K 및 R로 이루어진 군으로부터 선택되고, 위치 10의 아미노산이 A, S 및 R로 이루어진 군으로부터 선택되고, 위치 14의 아미노산이 D, K, E 및 R로 이루어진 군으로부터 선택되며, 위치 15의 아미노산이 S 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되고;
iv. 변형된 CDR-L1에서, 위치 7의 아미노산이 V 및 I로 이루어진 군으로부터 선택되며;
v. 변형된 CDR-L3에서, 위치 3의 아미노산이 A, Q 및 R로 이루어진 군으로부터 선택되고, 위치 5의 아미노산이 D 및 G로 이루어진 군으로부터 선택되고, 위치 7의 아미노산이 R 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되고, 위치 9의 아미노산이 N, W 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되며, 위치 12의 아미노산이 V, A 및 G로 이루어진 군으로부터 선택되는
항체 또는 항원-결합 단편.
L. 실시양태 D 내지 K 중 어느 하나에 있어서, 항체 또는 항원-결합 단편이 표 7에 도시된 바와 같은 하나 이상의 CDR 서열 또는 하나 이상의 가변 중쇄 또는 경쇄 서열을 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편.
M. 실시양태 A 내지 L 중 어느 하나에 있어서, 항체 또는 항원-결합 단편이 표 7의 항체의 중쇄 및 경쇄 CDR 서열 또는 가변 중쇄 및 경쇄 서열을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편.
N. 실시양태 A 내지 M 중 어느 하나에 있어서,
서열 75-77로 표시되는 바와 같은 가변 중쇄 CDR 서열 및 서열 78-80으로 표시되는 가변 경쇄 CDR 서열, 또는
서열 5, 9 및 13으로 표시되는 바와 같은 가변 중쇄 CDR 서열 및 서열 17, 21 및 25로 표시되는 가변 경쇄 CDR 서열, 또는
서열 6, 10 및 14로 표시되는 바와 같은 가변 중쇄 CDR 서열 및 서열 18, 22 및 26으로 표시되는 가변 경쇄 CDR 서열, 또는
서열 7, 11 및 15로 표시되는 바와 같은 가변 중쇄 CDR 서열 및 서열 19, 23 및 27로 표시되는 가변 경쇄 CDR 서열, 또는
서열 8, 12 및 16으로 표시되는 바와 같은 가변 중쇄 CDR 서열 및 서열 20, 24 및 28로 표시되는 가변 경쇄 CDR 서열, 또는
서열 45-47로 표시되는 바와 같은 가변 중쇄 CDR 서열 및 서열 48-50으로 표시되는 가변 경쇄 CDR 서열, 또는
서열 55-57로 표시되는 바와 같은 가변 중쇄 CDR 서열 및 서열 58-60으로 표시되는 가변 경쇄 CDR 서열, 또는
서열 65-67로 표시되는 바와 같은 가변 중쇄 CDR 서열 및 서열 68-70으로 표시되는 가변 경쇄 CDR 서열, 또는
서열 85-87로 표시되는 바와 같은 가변 중쇄 CDR 서열 및 서열 88-90으로 표시되는 가변 경쇄 CDR 서열, 또는
서열 95-97로 표시되는 바와 같은 가변 중쇄 CDR 서열 및 서열 98-100으로 표시되는 가변 경쇄 CDR 서열, 또는
서열 105-107로 표시되는 바와 같은 가변 중쇄 CDR 서열 및 서열 108-110으로 표시되는 가변 경쇄 CDR 서열, 또는
서열 115-117로 표시되는 바와 같은 가변 중쇄 CDR 서열 및 서열 118-120으로 표시되는 가변 경쇄 CDR 서열, 또는
서열 125-127로 표시되는 바와 같은 가변 중쇄 CDR 서열 및 서열 128-130으로 표시되는 가변 경쇄 CDR 서열, 또는
서열 135-137로 표시되는 바와 같은 가변 중쇄 CDR 서열 및 서열 138-140으로 표시되는 가변 경쇄 CDR 서열
을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편.
O. 실시양태 A 내지 N 중 어느 하나에 있어서,
서열 81로 표시되는 바와 같은 가변 중쇄 서열 및 서열 82로 표시되는 바와 같은 가변 경쇄 서열, 또는
서열 33으로 표시되는 바와 같은 가변 중쇄 서열 및 서열 29로 표시되는 바와 같은 가변 경쇄 서열, 또는
서열 34로 표시되는 바와 같은 가변 중쇄 서열 및 서열 30으로 표시되는 바와 같은 가변 경쇄 서열, 또는
서열 35로 표시되는 바와 같은 가변 중쇄 서열 및 서열 31로 표시되는 바와 같은 가변 경쇄 서열, 또는
서열 36으로 표시되는 바와 같은 가변 중쇄 서열 및 서열 32로 표시되는 바와 같은 가변 경쇄 서열, 또는
서열 51로 표시되는 바와 같은 가변 중쇄 서열 및 서열 52로 표시되는 바와 같은 가변 경쇄 서열, 또는
서열 61로 표시되는 바와 같은 가변 중쇄 서열 및 서열 62로 표시되는 바와 같은 가변 경쇄 서열, 또는
서열 71로 표시되는 바와 같은 가변 중쇄 서열 및 서열 72로 표시되는 바와 같은 가변 경쇄 서열, 또는
서열 91로 표시되는 바와 같은 가변 중쇄 서열 및 서열 92로 표시되는 바와 같은 가변 경쇄 서열, 또는
서열 101로 표시되는 바와 같은 가변 중쇄 서열 및 서열 102로 표시되는 바와 같은 가변 경쇄 서열, 또는
서열 111로 표시되는 바와 같은 가변 중쇄 서열 및 서열 112로 표시되는 바와 같은 가변 경쇄 서열, 또는
서열 121로 표시되는 바와 같은 가변 중쇄 서열 및 서열 122로 표시되는 바와 같은 가변 경쇄 서열, 또는
서열 131로 표시되는 바와 같은 가변 중쇄 서열 및 서열 132로 표시되는 바와 같은 가변 경쇄 서열, 또는
서열 141로 표시되는 바와 같은 가변 중쇄 서열 및 서열 142로 표시되는 바와 같은 가변 경쇄 서열
을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편.
P. 실시양태 A 내지 O 중 어느 하나에 있어서, IgG 항체인 항체.
Q. 실시양태 A 내지 P 중 어느 하나에 있어서, scFv, Fab, Fab' 단편 또는 F(ab')2 단편인 항원-결합 단편.
R. 실시양태 A 내지 Q 중 어느 하나에 있어서, 모노클로날 항체 또는 항원-결합 단편인 항체 또는 항원-결합 단편.
S. 실시양태 A 내지 R 중 어느 하나에 있어서, 인간, 인간화 또는 키메라 항체 또는 항원-결합 단편인 항체 또는 항원-결합 단편.
T. 실시양태 A 내지 S 중 어느 하나에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 항체-약물 접합체. 추가적인 실시양태에서, ADC는 세포독성제 또는 방사성 동위원소를 포함하고, 추가로 바람직한 실시양태에서 세포독성제 또는 방사성동위원소는 항체 또는 항원-결합 단편에 공유적으로 연결된다.
U. 실시양태 A 내지 S 중 어느 하나에 따른 항체 또는 항원-결합 단편을 코딩하는 단리된 핵산 서열. 추가적인 실시양태는 표 7에 도시된 바와 같은 핵산이다.
V. 실시양태 U에 따른 핵산 서열을 포함하는 벡터.
W. 실시양태 A 내지 S 중 어느 하나에 따른 항체 또는 항원-결합 단편을 발현하고/하거나 실시양태 U에 따른 핵산 또는 실시양태 V에 따른 벡터를 포함하는 세포.
X. 실시양태 W에 있어서, 상기 세포가 원핵 또는 진핵 세포인 세포.
Y. 실시양태 X에 따른 세포의 배양 및 실시양태 A 내지 S 중 어느 하나에 따른 항체 또는 항원-결합 단편의 정제를 포함하는, 상기 항체 또는 항원-결합 단편을 생산하는 방법.
Z. 의약으로서의 실시양태 A 내지 S 중 어느 하나에 따른 항체 또는 항원-결합 단편 또는 실시양태 T에 따른 항체-약물 접합체.
AA. 진단제로서의 실시양태 A 내지 S 중 어느 하나에 따른 항체 또는 항원-결합 단편.
BB. 암 치료용 의약으로서의 실시양태 A 내지 S 중 어느 하나에 따른 항체 또는 항원-결합 단편 또는 실시양태 T에 따른 항체-약물 접합체.
CC. 실시양태 A 내지 S 중 어느 하나에 따른 항체 또는 항원-결합 단편 또는 실시양태 T에 따른 항체-약물 접합체를 포함하는 제약 조성물.
DD. 실시양태 A 내지 S 중 어느 하나에 따른 항체 또는 항원-결합 단편 또는 실시양태 CC에 따른 제약 조성물과 하나 이상의 치료 활성 화합물의 조합물.
EE. C4.4a의 원치 않는 존재와 관련된 장애 또는 상태의 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 실시양태 CC에 따른 제약 조성물 또는 실시양태 DD에 따른 조합물을 투여하는 것을 포함하는, C4.4a의 원치 않는 존재와 관련된 장애 또는 상태를 치료하는 방법. 추가적인 바람직한 실시양태에서, 질환은 암이다.
실시예
실시예 1: n- CoDeR 라이브러리로부터의 항체 생성
C4.4a에 대한 인간 항체의 단리를 세포 선택 접근법에서 바이오인벤트 인터내셔날 아베(BioInvent International AB) (스웨덴 룬드)의 천연 항체 라이브러리 n-CoDeR (문헌 [Soederling et al., Nature Biotech. 2000, 18:853-856]에 기술됨)을 사용하여 파지 디스플레이 기술에 의해 수행하였다. n-CoDeR은 6개의 CDR 모두가 다양화되어 있는 Fab 라이브러리이다. CDR 서열은 건강한 인간 공여자로부터 초기에 수득되었다.
간략하게, Fab 항체 라이브러리의 분취량을 15분 동안 엔드-오버-엔드(end-over-end) 회전에 의해 4℃에서 PBS / 3％ FCS / 0.01 ％ NaN3 (완충제 A) 내의 107개의 C4.4a를 발현하지 않는 부모 CHO-S 세포와 함께 예비-인큐베이션시킴으로써 원치않는 표면 결합제에 대해 고갈시켰다. 그 후, 세포를 원심분리에 의해 제거하고, 상청액을 CHO-S 세포 상에서의 2회의 추가적인 라운드의 예비-인큐베이션에 사용하였다. 완충제 A 중에서 4℃에서 45분 동안 파지 제제와 함께 인큐베이션한 후 완충제 A (4℃)로 10회 세척함으로써 표적 세포 (107개의 CHO-S:hC4.4a 세포)에 대한 후속 패닝(panning)을 수행하였다. 세포를 5분 엔드-오버-엔드 회전 동안 76 mM 시트르산 (4℃)으로 처리함으로써 결합된 파지를 용리시켰다. 용리된 파지를 함유하는 제제를 1 M 트리스(Tris)/HCl, pH 7.5의 첨가에 의해 중화시키고, 2회의 추가적인 라운드의 세포 패닝을 수행하였다. 각각의 라운드에서, 용리된 파지를 증식시키고, 파지 역가를 기존에 기술된 바와 같이 결정하였다 (문헌 [Cicortas Gunnarsson et al., PEDS 2004, 17(3) 213-221]). 간략하게, 용리물 용액의 분취량을 적정 실험을 위해 확보한 한편, 새로운 파지 스톡의 제조를 위해 나머지를 사용하여 기하급수적으로 성장 중인 이. 콜라이 HB101'을 형질전환시켰다. 각각의 선택 라운드에 대해, 투입 및 산출 파지 둘 모두를 기하급수적으로 성장 중인 이. 콜라이 HB101' 상에 적정하였고, 파지 ELISA에서의 분석을 위해 라운드 2 및 3으로부터 클론을 채집하였다.
효소-결합 면역흡착 검정 ( ELISA ):
파지 ELISA :
상이한 선택 라운드들로부터의 선택된 파지를 파지 ELISA를 사용하여 특이성에 대해 분석하였다. 간략하게, 10 ㎕의 밤새 배양한 배양물 (100 ㎍/㎖ 암피실린 및 15 ㎍/㎖ 테트라사이클린이 보충된 LB-배지 내)을 100 ㎕의 신선한 배지 (100 ㎍/㎖ 암피실린, 15 ㎍/㎖ 테트라사이클린 및 0.1％ 글루코스가 보충된 LB-배지)에 첨가하고, 0.5의 OD600에 도달할 때까지 96-웰 MTP 내에서 250 rpm 및 37℃에서 진탕시킴으로써 파지 발현을 수행하였다. 이어서, 헬퍼 파지 M13KO7 (인비트로젠(Invitrogen))을 첨가하고, 샘플을 진탕시키지 않으면서 37℃에서 15분 동안 더 인큐베이션하였다. IPTG (0.25 mM의 최종 농도)의 첨가 후, 세포를 200 rpm에서 진탕시키면서 30℃에서 16시간 동안 인큐베이션하였다.
96-웰 MTP (눈크-맥시소르브(Nunc-maxisorb))를 16시간 동안 4℃에서 50 ㎕의 재조합 C4.4a (5 ㎍/㎖ 인간 또는 마우스 단백질)로 코팅하였다. 다음날, 플레이트를 PBS/0.05％ 트윈(Tween) 20 (완충제 B)으로 3회 세척하고, 차단 시약 (완충제 B 중 3％ 분유)으로 처리하고, 완충제 B로 다시 3회 세척하였다. 그 후, 웰 당 50 ㎕의 파지 발현으로부터의 분취량을 옮기고, 20℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 완충제 B로 3회 세척한 후, HRP에 커플링된 항-M13 항체 (지이 헬쓰케어(GE Healthcare), 27-9421-01; 완충제 B 내에 1:2500 희석됨)를 첨가하고, 20℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 50 ㎕ TMB (인비트로젠)를 첨가하여 발색 반응을 일으키고, 50 ㎕의 정지 용액 (인비트로젠)을 첨가함으로써 20℃에서 5-15분 후에 정지시켰다. 테칸(Tecan) 판독기에서 450 nM에서 비색 반응을 기록하였다.
ELISA 에 의한 sFab 의 스크리닝:
가용성 Fab (sFab)의 생성을 위해, 선택 라운드 2 및 3으로부터의 파지미드 DNA를 단리하고, 유전자 III 생성물을 제거하기 위해 공급업자의 설명서에 따라 제한 효소 EagI 및 EcoRI로 소화시켰다. 생성된 단편을 다시 결찰시키고, 표준 방법을 사용하여 구축물을 화학적으로 적격인 이. 콜라이 Top10 내로 형질전환시켰다. 전체적으로 약 1500개의 클론을 채집하고, LB-배지 (100 ㎍/㎖, 0.1％ 글루코스)를 함유하는 96-웰 플레이트로 옮기고, 0.5의 OD600에 도달할 때까지 250 rpm 및 37℃에서 진탕시켰다. 그 후, IPTG (최종 농도 0.5 mM)의 첨가에 의해 sFab 생산을 유도하였고, 200 rpm에서 진탕시키면서 30℃에서 16시간 동안 계속 인큐베이션하였다. 다음날 아침, BEL-완충제를 각각의 웰에 첨가하였고 (24.7 g/ℓ 붕산; 18.7 g/ℓ NaCl; 1.49 g/ℓ EDTA pH 8.0; 2.5 ㎎/㎖ 라이소자임 (로슈(Roche))), 50 ㎕의 처리된 배양물을 HRP에 커플링된 항-hIgG (Fab-특이적) (시그마(Sigma); 제품 번호 A 0293)로 검출을 수행한 것을 제외하고는 본질적으로 파지에 대해 기술된 바와 같은 ELISA에서 표적에 대한 sFab 결합에 대해 분석하였다.
FACS :
표적 세포에 대한 sFab의 세포 결합을 BD로부터의 팩스어레이(FACSarray) 상에서 분석하였다. 간략하게, 50 ㎕ 세포 현탁액 (2×106개의 세포/㎖)을 1시간 동안 4℃ 및 300 rpm에서 50 ㎕ 이. 콜라이 상청액과 혼합하였다. 이어서, 100 ㎕의 완충제 A를 첨가하고, 세포를 원심분리하고, 완충제 A로 2회 더 세척하였다. 결합된 Fab의 검출을 위해, R-피코에리트린(Phycoerythrin) 접합 어피니퓨어(AffiniPure) F(ab')2 단편 염소 항-인간 F(ab')2 단편 특이적 (잭슨 이뮤노 리서치(Jackson Immuno Research); 제품 번호 109-116-097, 완충제 A에 1:100 희석됨)을 세포에 첨가하고, 1시간 동안 4℃에서 인큐베이션하였다. 완충제 A로 3회 세척한 후, 최종 펠릿을 150 ㎕ 완충제 A에 재현탁시키고, 샘플 당 5000개의 FACS 이벤트를 기록하였다. 데이터 분석을 BD 팩스어레이 시스템 소프트웨어를 사용하여 수행하였다.
실시예 2: 에피토프 그룹화
C4.4a에 대한 항-C4.4a 항체 쌍의 동시 결합을 모니터링함으로써 비아코어 T100 기기 (지이 헬쓰케어 비아코어, 인코포레이티드) 상에서 표면 플라즈몬 공명 분석을 사용하여 에피토프 그룹화 실험을 수행하였다. 하기의 모든 단계를 20℃에서 수행하였다. 약 2000 RU (1 RU (공명 유닛)는 1 pg의 단백질/㎟의 결합을 나타낸다)의 제1 항체를 1급 아민 커플링을 통해 CM5 센서 칩 상에 공유적으로 고정시켰다. 칩을 5-15분 동안 유량 10 ㎕/분의 1:1 비율의 0.4 M N-에틸-N-(3-디에틸아미노프로필) 카르보디이미드 (EDC) 및 0.1 M n-히드록시숙신아미드 (NHC)로 활성화시켰다. 그 후, 표면 상의 비어 있는 결합 부위를 과량의 1 M 에탄올아민 pH 8.5로 차단하였다. 고정된 항체를 통해 가용성 C4.4a (HEPES-EP 완충제 (지이 헬쓰케어 비아코어, 인코포레이티드) 중 400 nM의 농도, 3분 동안 유량 10 ㎕/분)가 표면에 포획되었다. 따라서, 모든 결합된 C4.4a 분자에 대해 포획 항체의 에피토프가 차단되었다. 이어서, 제2 항체 (HEPES-EP 완충제 중 200 nM의 농도, 3분 동안 유량 10 ㎕/분)를 즉각적으로 표면 상에 통과시켜, 포획된 C4.4a에 결합시켰다. 동일하거나 중첩되는 에피토프를 인식하는 2개의 항체는 C4.4a에 결합할 수 없는 한편, 별개의 에피토프가 있는 항체는 결합할 수 있다. 3 M MgCl2 (30초 동안 유량 10 ㎕/분)로 항체 표면을 재생시켜 모든 결합된 단백질을 제거한 후, 다른 항체로 공정을 반복하였다.
IgG1 형태의 항체 M31-B01 및 M20-D02 S-A를 시험하였다. 두 항체 모두 C4.4a에 동시에 결합할 수 없었고, 따라서 결합에서 경쟁하였다 (도 1 참조).
실시예 3: 뮤린 C4 .4a에 대한 교차-반응성
뮤린 C4.4a에 대한 본 발명의 항체의 교차-반응성 및 해리 상수 (KD)를 나타내는 비아코어 및 연구의 결과가 표 1에서 제시된다.
항-C4.4a 항체의 결합 친화도를 비아코어 T100 기기 (지이 헬쓰케어 비아코어, 인코포레이티드) 상에서 표면 플라즈몬 공명 분석에 의해 결정하였다. 항체를 간접적 포획 시약인 항-인간 IgG Fc를 통해 CM5 센서 칩 상에 고정하였다. "휴먼 안티바디 캡처 키트" (BR-1008-39, 지이 헬쓰케어 비아코어, 인코포레이티드)로부터의 시약을 제조사에 기술한 바와 같이 사용하였다. 셀 당 약 5000 RU의 모노클로날 마우스 항-인간 IgG (Fc) 항체를 고정하였다. 약 200 내지 600 RU의 포획 수준에 도달하도록 항-C4.4 항체를 5 ㎍/㎖의 농도로 10초 동안 10 ㎕/분으로 주입하였다. 고정된 항-C4.4a 항체 상에 HEPES-EP 완충제 (지이 헬쓰케어 비아코어, 인코포레이티드) 중의 다양한 농도 (400 nM, 200 nM, 100 nM, 50 nM, 25 nM, 12.5 nM, 6.25 nM, 및 3.12 nM)의 인간 또는 뮤린 C4.4a를 3분 동안 유량 60 ㎕/분으로 주입하고, 10분 동안 해리시켰다. 인-라인 기준 셀 보정에 이어지는 완충제 샘플 차감 후에 센서그램이 생성되었다. 비아밸류에이션 소프트웨어(Biavaluation Software) (버전 4.0)를 사용하여 1차 1:1 결합 모델로 센서그램을 핏팅함으로써 수득된 회합 (kon) 및 해리 속도 (koff) 상수의 비율을 기초로 해리 평형 상수 (KD)를 계산하였다.
실시예 4: 재조합 인간 및 뮤린 C4 .4a에 대한 결합
도 2는 재조합 인간 C4.4a (A) 및 뮤린 C4.4a (B) 각각에 대한 항-C4.4 항체 M31-B01 및 M20 D02 S-A의 결합 곡선을 도시한다. 간략하게, 96-웰 MTP를 16시간 동안 4℃에서 재조합 인간 또는 마우스 C4.4a (100 ng/웰)로 코팅하고, 플레이트를 PBS/0.05％ 트윈 20 (=완충제 B)으로 3회 세척하고, 차단 시약 (PBS + 2％ BSA)으로 처리하고, 다시 완충제 B로 3회 세척하였다. 그 후, 본 발명의 항-C4.4a 항체를 0.39 ng 내지 400 ng/웰의 농도로 첨가하고, 20℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 완충제 B로 3회 세척한 후, 100 ㎕ 완충제 B 내의 20 ng의 단백질 A를 각각의 웰에 첨가하였다. 50 ㎕ 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 (TMB) (시그마)을 첨가하여 발색 반응을 일으켰다. 테칸 인피니트(infinite) 플레이트 판독기에서 360 nm 흡광을 측정함으로써 18분 후에 EC50 결정을 위한 데이터를 기록하였다. M31-B01에 대한 EC50 값은 인간 및 뮤린 C4.4a에 대해 각각 0.24 및 0.29 nM이었다. M20-D02 S-A에 대해, EC50 값은 인간 및 뮤린 C4.4a에 대해 각각 0.3 및 0.38 nM이었다. 이는 인간 및 뮤린 가용성 재조합 C4.4a 둘 모두에 대한 본 발명의 항-C4.4a 항체의 고친화도 결합을 나타낸다.
실시예 5: 상이한 종양 세포들에 대한 결합
도 3은 상이한 종양 세포들에 대한 항체 M31-B01 및 M20-D02 S-A의 결합 곡선 및 EC50 값을 도시한다. 형질감염된 세포주 A549:hC4.4a 및 천연적으로 C4.4a를 발현하는 종양 세포주 NCI H292, NCI H332, H1975/BCRP 및 BxPC3을 사용하여 FACS에 의해 분석을 수행하였다. 도 3 f)는 본 발명의 항체 둘 모두가 이러한 광범위한 종양 세포들에 특이적으로, 그리고 높은 친화도로 결합하였음을 나타낸다. mC4.4a:CHO 세포 및 NCI H292 세포에 대한 추가적인 본 발명의 항체들의 EC50 값이 표 8에서 도시된다.
96웰 마이크로타이터 플레이트에서 FACS 적정을 수행하였고, 이때 50 ㎕ 부피의 FACS 완충제 (3％ FCS, PBS 내) 내의 1차 항체의 단계 희석물을 비-효소성 세포 해리 용액 (1×)(Cell Dissociation Solution (1×) Non-enzymatic) (시그마)으로 분리되고 FACS 완충제 내에 재현탁된 2×105개의 세포/㎖로 이루어진 세포 현탁액 50 ㎕와 혼합하였다. 진탕시키면서 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션을 수행하였다. 세포를 펠릿화시키고, FACS 완충제로 세척하고, 100 ㎕/웰의 FACS 완충제 내의 피코에리트린-표지 염소 항-인간 IgG (디아노바(Dianova)) 용액에 재현탁시켰다. 앞서와 같이 인큐베이션 및 세척을 수행하였다. 세포에 결합된 항체를 각각의 검출 파장에서 팩스어레이 장치를 사용하여 분석하였다. 스위프트(Swift) 8.0 소프트웨어를 사용하여 중복물들의 형광 중앙값으로부터 EC50 값을 결정하였다.
실시예 6: 내재화
형질감염된 C4.4a:A549 세포 상에서의 항-C4.4a 항체의 상대적인 내재화가 도 4 및 표 9에서 제시된다. 내재화 검정을 형광 표지된 C4.4a 항체로 수행하였다.
엔도솜 내에 존재하여 산성 pH에서만 형광 신호를 검출할 수 있고, 중성 또는 염기성 pH 값에서는 형광이 측정되지 않기 때문에, pH-민감성 형광 염료 CypHer 5E (지이 헬쓰케어, PA15401)를 형광 마커로 선택하였다. 커플링을 위해, 항- C4.4a 항체를 PBS/탄산나트륨 pH 8.3 (9:1) 내의 2-몰 과량의 염료와 함께 20℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 평균적으로, 1.6의 Lys-커플링 염료 로드가 달성되었다. 친화도에 대한 커플링의 효과를 FACS 검정에서 시험하였고, EC50 값에서의 변화는 무시할 수 있는 것으로 간주되었다. 1×104개의 A549:hC4.4a 세포를 사용하여 항체 결합시의 특이적 C4.4a 내재화를 조사하였다. 세포를 37℃/5％ CO2에서 다양한 농도 (34 nM - 6.6 nM)의 표지된 항체로 처리하였다. 인 셀 애널라이저(IN Cell Analyzer) 1000을 사용하여 24시간까지의 내재화를 동역학적으로 측정하였다. 40× 배율로 현미경으로, 그리고 과립성 (과립 카운트/세포; CypHer5E에 대해 620 nm 여기 및 700 nm 방출)의 결정에 의해 내재화 분석을 수행하였다. 세포 투과성 염료 훼스트(Hoechst) 33342 (0.5 ㎍/㎖, 30분 인큐베이션, 353-365 nm에서의 방출, 480 nm에서의 검출)를 사용하는 DNA 염색으로 핵을 가시화하였다.
C4.4a를 발현하지 않는 상응하는 벡터 세포, 뿐만 아니라 A549 야생형 (A549 wt) 세포가 대조군으로서 사용되었다. 인간 IgG1이 이소형 대조군으로 선택되었고, 병행하여 표지되었다. 3회의 독립적인 실험을 수행하였다; 데이터 포인트들은 3중 결정을 나타낸다. M31-B01 및 M20-D02 S-A는 효율적으로 내재화되었다. 절반 최대 내재화 시간은 각각 M31-B01에 대해 31분, M20-D02 S-A에 대해 49분이었다.
실시예 7: Fab에서 IgG 형태로의 전환
Fab에서 IgG 형태로 VH 및 VL 영역을 옮기기 위해 및/또는 이. 콜라이에서 포유동물 세포 시스템으로 발현 시스템을 변화시키기 위해, VH 및 VL을 PCR 프라이머를 사용하여 증폭시켰다. 측면의(flanking) 제한 효소 절단 부위를 VH 및 VL 각각의 5' 및 3' 말단 둘 모두에 도입하였다. 이러한 제한 부위들을 IgG 골격을 함유하는 발현 벡터 내로의 VH 및 VL의 클로닝에 사용하였다.
이. 콜라이 세포를 시험관 내의 100 ㎕ 물에 첨가하고, 95℃에서 10분 동안 인큐베이션한 후, 얼음 상에서 5분 동안 유지시켰다. 볼텍싱 후, 박테리아 잔해물을 원심분리에 의해 펠릿화시켰다. 상청액을 DNA 증폭에 사용하였다. VL에 대한 BamHI 및 HpaI 제한 부위 및 VH에 대한 Blp1 및 Mfe1 부위 각각과 함께 특이적 프라이머를 사용하여 VH 및 VL에 대해 별도로 PCR 반응을 준비하였다. 제조사의 설명서에 따라 어큐프라임(AccuPrime) Pfx 폴리머라제 (인비트로젠 # 12344-024)로 PCR 반응을 수행하였다. PCR 생성물의 품질을 1％ 아가로스 겔 상에서 점검하였다. 공급업자의 설명서에 따라, 발현 벡터 및 PCR 생성물을 2시간 동안 37℃에서 각각의 제한 엔도뉴클레아제로 소화시켜 호환성 말단을 생성시켰다. 70℃에서 15분 동안 인큐베이션함으로써 소화 반응을 정지시켰다. 생성된 단편들을 발현 벡터 내로 결찰시키고, 표준 방법을 사용하여 구축물을 이. 콜라이 또는 포유동물 세포 내로 형질전환시켰다.
실시예 8: 피하 이종이식편 암 모델:
항-C4.4a 항체의 항종양 효과를 면역결핍 마우스에서의 피하 이종이식편 모델을 사용하여 평가하였다. A431 세포를 10 ％ FBS가 보충된 DMEM 내의 부착성 배양물로서 유지시켰다. 6-7주령의 SCID 마우스의 오른쪽 옆구리에 0.1 ㎖의 배지 내의 1×107개의 세포를 피하 접종하였다. 모노클로날 항체를 5-60 mg/kg의 용량으로 3일마다 3회 복강내 투여하였다. 대조군 마우스는 PBS 또는 관련이 없는 모노클로날 항체로 처리하였다. 종양 크기를 2일마다 슬라이딩 캘리퍼로 측정하였다. 항-C4.4a 항체 처리 대 대조군 처리의 종양 크기를 비교함으로써 항종양 효능을 평가하였다.
실시예 9: 항체 약물 접합체로의 피하 이종이식편 암 모델:
당업계에 공지된 프로토콜 (예를 들어, 문헌 [Liu et al., Proc Natl. Acad. Sci. (1996), 93, 8618-8623])을 사용하여 항-C4.4a 항체를 세포독성 소형 분자에 접합시킬 수 있었다. A431 세포를 10 ％ FBS가 보충된 DMEM 내의 부착성 배양물로서 유지시켰다. 6-7주령의 SCID 마우스의 오른쪽 옆구리에 0.1 ㎖의 배지 내의 1×107개의 세포를 피하 접종하였다. 종양 크기가 50 ㎣에 도달했을 때, 항체-약물 접합체를 1-60 mg/kg의 용량으로 3일마다 3회 복강내 투여하였다. 대조군 마우스는 PBS, 관련이 없는 모노클로날 항체 또는 접합되지 않은 유리 약물로 처리하였다. 종양 크기를 2일마다 슬라이딩 캘리퍼로 측정하였다. 항-C4.4a 항체-약물 접합체 처리 대 대조군 처리의 종양 크기를 비교함으로써 항종양 효능을 평가하였다.
실시예 10: 친화도 성숙을 위한 Fab 항체 단편의 클로닝 , 발현 및 발현 수준 정량.
중쇄의 C-말단에 3×HA-태그 및 헥사-히스티딘 태그를 보유하는 야생형 Fab M31-B01 및 M20-D02 S-A의 중쇄 및 경쇄를 pET28a 박테리아 발현 벡터 (노바젠/머크 케미칼즈 리미티드(Novagen/Merck Chemicals Ltd.), 영국 노팅엄) 내로 서브클로닝하고, Top10F' 세포 (인비트로젠 게엠베하(Invitrogen GmbH), 독일 카를스루에) 내로 형질전환시켰다. 별법적으로, 다른 박테리아 발현 벡터 (예를 들어 pQE 벡터 시스템, 퀴아젠 게엠베하(Qiagen GmbH), 독일 힐덴) 및 균주 (예를 들어 DH5α, 인비트로젠 게엠베하, 독일 카를스루에)를 사용할 수 있다. 표준 올리고-기반 부위-지정 돌연변이유발에 의해 변이체를 생성시켰고, DNA 서열분석에 의해 확인하였다. 특히, 상보성 결정 영역 내 또는 주변의 아미노산 잔기가 중쇄 및/또는 경쇄 내에서 변형되었다.
발현을 위해, 변이체들을 BL21starDE3 에스케리키아 콜라이 균주 (인비트로젠, C6010-03) 내로 형질전환시키고, 카나마이신 (30 ㎍/㎖)을 포함하는 LB 배지 내에서 밤새 배양한 배양물 내로 접종하고, 37℃에서 18시간 동안 인큐베이션하였다. 배양물을 카나마이신 (30 ㎍/㎖)이 함유된 신선한 LB 배지 내로 1:20으로 접종함으로써 발현 배양물을 생성하였다. 37℃에서의 6시간 후, 1 mM IPTG를 첨가하여 항체 발현을 유도하였고, 배양물을 추가로 18시간 동안 30℃에서 인큐베이션하였다.
발현 수준의 정량을 위해, ELISA 접근법을 사용하였다. 간략하게, MTP 플레이트 (눈크 맥시소르브 블랙, 460518)를 코팅 완충제 (칸도르 바이오사이언스 게엠베하(Candor Bioscience GmbH), 121125) 내에 희석된 HA 에피토프 태그 특이적 mAb (코밴스(Covance), MMS-101P)와 함께 4℃에서 16시간 동안 인큐베이션하고, PBST (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7.4, 0.05％ 트윈 20을 함유하는 포스페이트 완충 염수)로 세척하고, 100％ 스마트 블록(Smart Block) (칸도르 바이오사이언스 게엠베하, 113500)으로 20℃에서 1시간 동안 차단하고, 다시 세척하였다. 배양물을 PBST 내의 10％ 스마트 블록에 희석하고, 20℃에서 1시간 동안 MTP 플레이트에 결합시켰다. PBST로 세척한 후, 포획된 항체를 HRP가 커플링된 항-람다 항체 (시그마, A5175)와 함께 인큐베이션하고, 플레이트를 10 μM 암플렉스 레드(amplex red) 기질 (인비트로젠, A12222)과 함께 30분 동안 20℃에서 암실에서 인큐베이션한 후 형광 측정함으로써 검출하였다. 결정된 정량 신호는 농축된 부모 Fab (M31-B01 또는 M20-D02-S-A) 발현 배양물 상청액으로 만들어진 검정 시리즈의 역학적 범위 내인 것으로 확인되어, 각각의 개별적인 Fab 발현 샘플의 상대적인 정량을 허용하였다.
실시예 11: 생성된 Fab 항체 단편 변이체의 활성 및 종간 교차 반응성의 결정
재조합 가용성 인간 또는 마우스 C4.4a에 대한 돌연변이된 Fab 변이체의 활성을 결정하기 위해, 직접적인 ELISA 검정 양식을 사용하였다. 간략하게, MTP 플레이트 (눈크 맥시소르브 블랙, 460518)을 코팅 완충제 (칸도르 바이오사이언스 게엠베하, 121125) 내에 희석된 2 ㎍/㎖의 인간 또는 마우스 C4.4a로 코팅하고, 15시간 동안 4℃에서 인큐베이션하였다. PBST로 3회 세척한 후, 플레이트를 100％ 스마트 블록 (칸도르 바이오사이언스 게엠베하, 113500)으로 20℃에서 1시간 동안 차단하고, 세척 단계를 반복하였다. Fab 항체 단편의 결합을 위해, 20 ㎕의 배양 상청액을 20℃에서 1시간 동안 플레이트에 첨가한 후 세척하였다. 일부 경우에, 90분 동안의 PBST 내의 10％ 스마트 블록과의 추가적인 인큐베이션 단계에 이어서 PBST로 3회 세척하는 것에 의해 세척 엄격성이 증가되었다 (표 10b의 "공정 B"). 그 후, 결합된 부모 Fab 및 변이체를 HA-에피토프 태그 특이적 항체_HRP 접합체 (베틸(Bethyl), A190-108P)에 의해 검출하였다. 10 μM 암플레스 레드 기질 (인비트로젠, A12222)을 플레이트에 첨가하고, 통상적인 형광 판독기, 예를 들어 테칸 울트라(Tecan Ultra)를 사용하여 형광 신호를 검출하였다. 각각의 ELISA에서의 배경 보정된 친화도 및 정량 신호의 비율로서 양에 대해 표준화된 친화도 신호를 계산하였다: (신호 친화도 - 배경 친화도) / (신호 양 - 배경 양). 생성된 값은 양성 방식으로 주로 친화도와 상관되는 한편, 표준화되지 않은 값은 샘플 내의 결합 Fab의 농도와 추가적으로 상관된다. 따라서, 양에 대해 표준화된 친화도 신호는 친화도가 개선된 변이체의 결정을 위한 매우 양호한 지침으로서의 역할을 한다.　
실시예 12: 단일 및 다중 아미노산 치환
M20-D02 S-A의 중쇄 및 경쇄에서 생성된 단일 아미노산 치환의 몇몇 예가 표 10a 및 10b에서 제공된다. HC D101K, LC A90Q, LC V97A 및 LC V97G가 인간 C4.4a에 대한 표준화된 친화도 신호와 관련하여 가장 강한 개선을 나타냈고, 이때 마우스 C4.4a에 대한 상응하는 신호는 인간 C4.4a에 대한 신호와 비교하여 1/8 이상이었다 (표 10a). CDR3 너머에서, 2개의 치환 HC D31S 및 HC V51I가 인간 C4.4a에 대한 표준화된 친화도 신호와 관련하여 가장 강한 개선을 나타냈고, 이때 HC V51I의 경우에 마우스 C4.4a에 대한 상응하는 신호는 30％였다 (표 10b).
표 10a. M20-D02 S-A의 중쇄 및 경쇄의 CDR3 내에서의 단일 아미노산 치환의 분석. 인간 및 마우스 C4.4a에 대한 표준화된 친화도 신호 (4개조 이상에서의 2개의 측정치의 평균 및 각각의 표준 편차)가 열거된다.
[표 10a]
Figure 112012054109321-pct00006
표 10b. M20-D02 S-A의 중쇄 및 경쇄의 CDR3 너머에서의 단일 아미노산 치환의 분석. 인간 및 뮤린 C4.4a 각각에 대한 표준화된 친화도 신호가 열거된다; 소정의 숫자는 4개조에서의 측정치의 중앙값이다. 공정 B와 A 사이의 차이는 공정 B에서의 90분 동안의 완충제 내에서의 추가적인 인큐베이션 단계이다.
[표 10b]
Figure 112012054109321-pct00007
B01의 중쇄 및 경쇄에서 생성된 단일 아미노산 치환의 몇몇 예가 표 11a 및 11b에서 제공된다. LC W91E, LC W91F, LC W91Y 및 LC G95bR이 인간 C4.4a에 대한 표준화된 친화도 신호와 관련하여 가장 강한 개선을 나타냈고, 이때 마우스 C4.4a에 대한 상응하는 신호는 인간 C4.4a에 대한 신호와 비교하여 1/8 이상이었고, 후자 3개는 40％ 이상이었다 (표 11a). CDR3 너머에서, 치환 HC A32Y가 인간 C4.4a에 대한 표준화된 친화도 신호와 관련하여 가장 강한 개선을 나타냈다 (표 11b).
표 11a. M31-B01의 중쇄 및 경쇄의 CDR3 내에서의 단일 아미노산 치환의 분석. 인간 및 마우스 C4.4a에 대한 표준화된 친화도 신호가 열거된다; 2개의 측정치의 평균 및 각각의 표준 편차는 4개조 이상으로부터 생성된 것이다.
[표 11a]
Figure 112012054109321-pct00008
표 11b. B01의 중쇄 및 경쇄의 CDR3 너머에서의 단일 아미노산 치환의 분석. 인간 및 마우스 C4.4a에 대한 표준화된 친화도 신호가 열거된다; 소정의 숫자는 3개조 이상에서의 측정치의 중앙값이다.
[표 11b]
Figure 112012054109321-pct00009
M20-D02 S-A 항-C4.4a 항체 내에서의 조합된 아미노산 치환의 일부 예가 표 12a 및 12b에서 제공된다. 일부 치환은 단일 아미노산 치환 (표 10a 및 10b)으로서 분석되었고, 추가물은 이러한 조합된 치환의 일부로서만 분석되었다. 모든 조합이 표 12a 및 12b에서 제공되지는 않지만, 항-C4.4a 항체가 표 10a 및 10b에서 제공된 변형의 임의의 조합을 포함할 수 있는 것으로 구상된다.
[표 12a 및 12b]
Figure 112012054109321-pct00010
M31-B01 항-C4.4a 항체 내에서의 조합된 아미노산 치환의 일부 예가 표 13a 및 13b에서 제공된다. 일부 치환은 단일 아미노산 치환 (표 11a 및 11b)으로서 분석되었고, 추가물은 이러한 조합된 치환의 일부로서만 분석되었다. 모든 조합이 표 13a 및 13b에서 제공되지는 않지만, 항-C4.4a 항체가 표 11a 및 11b에서 제공된 변형의 임의의 조합을 포함할 수 있는 것으로 구상된다.
[표 13a 및 13b]
Figure 112012054109321-pct00011
잠재적인 탈아미드화 부위, 구체적으로는 M20-D02 S-A 및 M31-B01 내의 Asn-Gly ("NG") 및 Asn-Ala ("NA")가 있는 CDR 서열 스트레치(stretch), 뿐만 아니라 다중 아미노산 치환이 있는 일부 상응하는 변이체의 각각의 서열이 표 14a 및 14b에서 제공된다.
M20 D02-S-A에는, CDR 내에 2개의 잠재적인 탈아미드화 부위 (CDR-L3 내의 1개 및 CDR-H2 내의 1개)가 있다. D02-11, -10, -06, -07 및 -13에서는, CDR-L3 내의 이러한 부위가 N>S 치환에 의해 제거되었다.
[표 14a]
Figure 112012054109321-pct00012
M31-B01에는 CDR 내에 2개의 잠재적인 탈아미드화 부위 (CDR-L3 내의 1개 및 CDR-H1 내의 1개)가 있다. CDR-L3 내의 이러한 부위가 B01-nn3, -05, -10, -nn4 및 -12에서는 N>S 치환에 의해, B01-nn1에서는 N>K 치환에 의해, B01-06에서는 G>R 치환에 의해 제거되었다. CDR-H1 내의 이러한 부위가 B01-02, -09, -10, -06, -nn4, -12, -nn5 및 -11에서는 N>S 치환에 의해 제거되었다. B01-10, -06, -nn4 및 -12는 이러한 잠재적인 탈아미드화 부위 중 어느 것도 나타내지 않는다.
[표 14b]
Figure 112012054109321-pct00013
호번칭실시예 10-12에 기술된 방법들을 사용하여 친화도가 성숙된 항체를 단일 돌연변이 및 단일 돌연변이의 조합에 의해 생성시켰다. 이러한 방법들은 부모 항체로부터 유래된 경쟁 항체들의 생성에 매우 적절하다. 상기 언급된 실시예들의 항체가 표 7에서 도시된다. 이러한 실시예들은 M31 B01의 CDR H1에 대해 77％ 이상 동일한 CDR H1 서열, M31 B01의 CDR H2에 대해 90％ 이상 동일한 CDR H2 서열, M31 B01의 CDR H3에 대해 90％ 이상 동일한 CDR H3 서열, M31 B01의 CDR L1에 대해 92％ 이상 동일한 CDR L1 서열, M31 B01의 CDR L2에 대해 85％ 이상 동일한 CDR L2 서열 및 M31 B01의 CDR L3에 대해 58％ 이상 동일한 CDR L3 서열을 포함하는 C4.4a 결합 항체 또는 항원-단편-결합 단편 (이러한 항체 변이체들은 결합에서 M31 B01과 경쟁한다), 및 M20 D02 S-A의 CDR H1에 대해 88％ 이상 동일한 CDR H1 서열, M20 D02 S-A의 CDR H2에 대해 85％ 이상 동일한 CDR H2 서열, M20 D02 S-A의 CDR H3에 대해 73％ 이상 동일한 CDR H3 서열, M20 D02 S-A의 CDR L1에 대해 92％ 이상 동일한 CDR L1 서열, M20 D02 S-A의 CDR L2에 대해 100％ 이상 동일한 CDR L2 서열 및 M20 D02 S-A의 CDR L3에 대해 58％ 이상 동일한 CDR L3 서열을 포함하는 항체 또는 항원-단편-결합 단백질 (이러한 항체 변이체들은 결합에서 M20 D02 S-A와 경쟁한다)을 추가로 제공한다.
표 15a: 이 표는 방법 12에 기술된 바와 같은 M20 D02 S-A에 대한 중쇄 및 경쇄의 CDR 1-3의 아미노산 변이를 요약한다.
하기는 M20 D02 S-A로부터 유래된 각각의 CDR 서열의 컨센서스 서열 형태의 상기 결과를 나타낸다. CDR H1에 대한 컨센서스는 표 15a (i) (서열 297)에 도시되고, CDR H2에 대한 것은 표 15a (ii) (서열 298)에 도시되고, CDR H3에 대한 것은 표 15a (iii) (서열 299)에 도시되며, CDR L1에 대한 것은 표 15a (iv) (서열 300)에 도시되고, CDR L2에 대한 것은 서열 22 (표 15a (v))와 동일하며, CDR L3에 대한 것은 표 15a (v) (서열 301)에 각각 도시된다.
[표 15a]
Figure 112012054109321-pct00014
하기는 M31 B01로부터 유래된 각각의 CDR 서열의 컨센서스 서열 형태의 상기 결과를 나타낸다. CDR H1에 대한 컨센서스는 표 15b (i) (서열 302)에 도시되고, CDR H2에 대한 것은 표 15b (ii) (서열 303)에 도시되고, CDR H3에 대한 것은 표 15b (iii) (서열 304)에 도시되며, CDR L1에 대한 것은 표 15b (iv) (서열 305)에 도시되고, CDR L2에 대한 것은 표 15b (v) (서열 306)에 도시되며, CDR L3에 대한 것은 표 15b (v) (서열 307)에 각각 도시된다.
[표 15b]
Figure 112012054109321-pct00015
실시예 13: 웨스턴 블롯에 의한 C4 .4a 단일 도메인에 대한 항체 결합의 결정
M31-B01 및 M20-D02 S-A의 항체 결합 도메인을 특성화하기 위해, 표준 방법에 의해 인간 C4.4a 서열 1의 C4.4a 도메인 S1 아미노산 1-85 및 C4.4 도메인 S2 108-193으로 각각 이루어진 구축물을 C-말단 인간 IgG1 Fc-6xHis태그 융합물로서 생성시키고, CMV5 프로모터를 함유하는 포유동물 발현 벡터 내로 클로닝하고, HEK293 6E 세포에서 일시적으로 발현시켰다. 그 후, 발현된 S1 및 S2 단백질을 20℃에서 5 ㎖ NiNTA 수퍼플로우(superflow) 칼럼 (퀴아젠)을 사용하는 금속 킬레이트 크로마토그래피에 의해 세포 상청액으로부터 정제하였다. 샘플의 pH를 1 M NaOH로 pH 8.0으로 조정한 후, 1 ㎖/분으로 50 mM NaH2PO4 + 300 mM NaCl pH 8.0으로 미리 평형화된 칼럼에 적용하였다. 칼럼을 15 CV의 평형 완충제로 세척하고, 결합된 His태깅된 단백질을 50 mM NaH2PO4 + 300 mM NaCl + 250 mM 이미다졸 pH 8.0으로 용리시켰다. 용리된 단백질을 크기 배제 크로마토그래피에 의해 트리콘 수퍼덱스(Tricorn Superdex) 75 10/300 GL (지이 헬쓰케어) 상에서 추가로 정제하였다.
추가적인 분석을 위해, 전장 (C4.4a 서열 1), 정제된 S1-Fc-6xHis태그 융합물 및 S2 Fc-6xHis태그를 미리 형성된 누페이지(NuPage) 비스-트리스 4 - 12％ 구배 겔 (인비트로젠, No. NP0322Box)의 상이한 레인에 적용하고, 제조사의 설명서에 따라 누페이지 MES SDS 전개 완충제 (인비트로젠 NP0002)를 사용하여 전기영동에 의해 분리하였다.
그 후, SDS 겔을 아이블롯(iblot) 장치 (인비트로젠)를 사용하여 아이블롯 겔 전달 막 (인비트로젠 IB3010-02)으로 블롯팅하였다. 막을 4℃에서 16시간 동안 DPBS pH 7.4 + 4 ％ 분유 + 0.1 ％ 트윈 20에서 차단한 후, 20℃에서 5분 동안 DPBS pH 7.4 + 0.1 ％ 트윈 20에서 3회 세척하였다. M31-B01 (5.76 ㎎/㎖) 또는 M20-D02 S-A (3.49 ㎎/㎖)를 각각 1/5000 및 1/2000의 희석물로 적용하고, 20℃에서 1.5시간 동안 인큐베이션한 후, DPBS pH 7.4 + 0.1 ％ 트윈 20에서 2× 세척하였다. 제2 항체 (알칼리성 포스파타제 접합 염소 항-인간 IgG, Fab 특이적; 109-055-097 잭슨 이뮤노리서치)를 20℃에서 1.5시간 동안 1/1000의 희석으로 인큐베이션한 후, DPBS pH 7.4 + 0.1 ％ 트윈 20에서 20℃에서 5분 동안 3회 세척하였다. 밴드가 가시적이 될 때까지 20℃에서 시그마 패스트(Sigma Fast) BCIP/NBT (10 ㎖ 물 내의 1개의 정제)로 염색하였다. 물로 세척함으로써 염색 반응을 정지시켰다.
도 6에 도시된 바와 같이, 항체 M31-B01 및 M20-D02 S-A 둘 모두 전장 인간 및 마우스 C4.4a에 결합하였고, 또한 이들은 C4.4a의 도메인 S1에 결합하였지만, C4.4a의 도메인 S2에는 결합하지 않았다. DTT로 환원되지 않은 샘플에서만 결합이 배타적으로 검출될 수 있었는데, 이는 하나 이상의 디술피드 가교에 의해 안정화되는 입체형태 의존적 에피토프의 존재를 강하게 시사한다.
실시예 14: 항체 의존적 세포 매개 세포독성 검정 ( ADCC 검정)
항-C4.4a IgG의 항-종양 활성은 ADCC에 의해 매개될 수 있다. C4.4a를 발현하는 A549:hC4.4a 세포 및 C4.4a를 발현하지 않는 부모 세포를 250 ng/㎖, 1000 ng/㎖ 또는 2000 ng/㎖ 인간 항-C4.4a 또는 대조군 IgG1 항체 (예를 들어 항-디곡신 항체)와 함께 인큐베이션하였다. 인간 PBMC를 50:1, 25:1 및 5:1 비율의 이펙터-표적 비율로 이들 세포에 첨가하였다. 크로뮴-51 방출 검정을 수행하여 표적 용해 수준을 결정하였다. 모조 항체 및 PBMC가 존재하거나 항체 없이 PBMC가 존재하는 경우의 (자발적인) 용해 속도보다 항-C4.4a 항체 및 PBMC의 존재 하에서의 용해 속도가 더 높으면, 이는 ADCC가 효과적임을 시사한다.
실시예 15: 항체 의존적 증식 억제 - 엑스셀리전스 시스템에 의해 측정된 세포 증식
엑스셀리전스 시스템 (RTCA 분석기 카탈로그 번호 05228972001, 로슈)은 표지의 혼입 없이 실시간으로 세포성 이벤트를 모니터링한다. 이러한 시스템은 조직 배양 E-플레이트(E-Plate)의 바닥 상에서 통합된 상호교차(interdigitated) 마이크로전극을 통해 전기 임피던스를 측정한다. 이러한 임피던스 측정치는 세포 개수, 생존력 및 형태학이 포함되는 세포의 생물학적 상태에 관한 정량적 정보를 제공한다. A549:hC4.4a의 세포 증식 속도를 결정하기 위해, 세포를 비-결합 hIgG1 이소형 대조군 항체 또는 100 nM의 B01-3 (hIgG1)과 함께 인큐베이션하였다. 먼저, 50 ㎕의 세포 배양 배지 (RPMI (바이오크롬(Biochrom) FG1640) + 10 ％ FCS (바이오크롬 #S0145) + 1 ㎍/㎖ 퓨로마이신(Puromycin) (시그마 8833))를 E-플레이트 96의 각각의 웰에 첨가하였다. E-플레이트 96을 RTCA MP 스테이션(Station) (카탈로그 번호 05331625001, 로슈) 내로 삽입하고, 각각의 웰의 배경 임피던스를 결정하였다. 용액을 다시 E-플레이트 96에서 제거하고, 50 ㎕의 세포 현탁액 (세포 배양 배지 내의 5000개 세포/웰의 A549:hC4.4a)을 웰에 첨가하였다. 플레이트를 다시 삽입하고, 4시간 동안 37℃ + 5 ％ CO2에서 측정하였다. E-플레이트 96을 다시 제거하고, 세포 배양 배지 내의 100 ㎕의 항체 (100 nM의 B01-3 또는 비-결합 대조군 hIgG1)를 첨가하였다. 모든 샘플을 삼중으로 실행하였다. E-플레이트의 재삽입 후, 92시간 동안 37℃ + 5 ％ CO2에서 측정을 수행하였다. 내장된 소프트웨어 패키지로 결과를 분석하였다. 결과가 도 6에서 도시된다. 항체 B01-3이 비-결합 대조군 항체와 비교하여 세포 증식을 명확하게 감소시킨다. 이는 본 발명의 항체가 C4.4a 발현 세포의 세포성 증식을 효과적으로 억제한다는 것을 나타낸다.
[표 7]
Figure 112012054109321-pct00016
SEQUENCE LISTING <110> Bayer Schering Pharma AG <120> Anti-C4.4a Antibodies and Uses Thereof <130> BHC 09 1 039 <160> 345 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 278 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 1 Leu Glu Cys Tyr Ser Cys Val Gln Lys Ala Asp Asp Gly Cys Ser Pro 1 5 10 15 Asn Lys Met Lys Thr Val Lys Cys Ala Pro Gly Val Asp Val Cys Thr 20 25 30 Glu Ala Val Gly Ala Val Glu Thr Ile His Gly Gln Phe Ser Leu Ala 35 40 45 Val Arg Gly Cys Gly Ser Gly Leu Pro Gly Lys Asn Asp Arg Gly Leu 50 55 60 Asp Leu His Gly Leu Leu Ala Phe Ile Gln Leu Gln Gln Cys Ala Gln 65 70 75 80 Asp Arg Cys Asn Ala Lys Leu Asn Leu Thr Ser Arg Ala Leu Asp Pro 85 90 95 Ala Gly Asn Glu Ser Ala Tyr Pro Pro Asn Gly Val Glu Cys Tyr Ser 100 105 110 Cys Val Gly Leu Ser Arg Glu Ala Cys Gln Gly Thr Ser Pro Pro Val 115 120 125 Val Ser Cys Tyr Asn Ala Ser Asp His Val Tyr Lys Gly Cys Phe Asp 130 135 140 Gly Asn Val Thr Leu Thr Ala Ala Asn Val Thr Val Ser Leu Pro Val 145 150 155 160 Arg Gly Cys Val Gln Asp Glu Phe Cys Thr Arg Asp Gly Val Thr Gly 165 170 175 Pro Gly Phe Thr Leu Ser Gly Ser Cys Cys Gln Gly Ser Arg Cys Asn 180 185 190 Ser Asp Leu Arg Asn Lys Thr Tyr Phe Ser Pro Arg Ile Pro Pro Leu 195 200 205 Val Arg Leu Pro Pro Pro Glu Pro Thr Thr Val Ala Ser Thr Thr Ser 210 215 220 Val Thr Thr Ser Thr Ser Ala Pro Val Arg Pro Thr Ser Thr Thr Lys 225 230 235 240 Pro Met Pro Ala Pro Thr Ser Gln Thr Pro Arg Gln Gly Val Glu His 245 250 255 Glu Ala Ser Arg Asp Glu Glu Pro Arg Leu Thr Gly Gly Ala Ala Gly 260 265 270 His Gln Asp Arg Ser Asn 275 <210> 2 <211> 293 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Leu Glu Cys Tyr Ser Cys Val Gln Lys Ala Asp Asp Gly Cys Ser Pro 1 5 10 15 His Arg Met Lys Thr Val Lys Cys Gly Pro Gly Val Asp Val Cys Thr 20 25 30 Glu Ala Val Gly Ala Val Glu Thr Ile His Gly Gln Phe Ser Val Ala 35 40 45 Val Arg Gly Cys Gly Ser Gly Ile Pro Gly Lys Asn Asp Arg Gly Leu 50 55 60 Asp Leu His Gly Leu Leu Ala Phe Phe Gln Leu Gln Gln Cys Ser Glu 65 70 75 80 Asp Arg Cys Asn Ala Lys Leu Asn Leu Thr Leu Arg Gly Leu Asn Pro 85 90 95 Ala Gly Asn Glu Ser Ala Tyr Glu Pro Asn Gly Ala Glu Cys Tyr Ser 100 105 110 Cys Val Gly Leu Ser Arg Glu Lys Cys Gln Gly Ser Met Pro Pro Val 115 120 125 Val Asn Cys Tyr Asn Ala Ser Gly Arg Val Tyr Lys Gly Cys Phe Asp 130 135 140 Gly Asn Val Thr Leu Thr Ala Ala Asn Val Thr Val Ser Leu Pro Val 145 150 155 160 Arg Gly Cys Val Gln Asp Glu Thr Cys Thr Arg Asp Gly Val Thr Gly 165 170 175 Pro Gly Phe Thr Leu Ser Gly Ser Cys Cys Gln Gly Pro Arg Cys Asn 180 185 190 Ala Asp Leu Arg Asn Lys Thr Tyr Phe Ser Pro Arg Ile Pro Pro Leu 195 200 205 Val Leu Leu Pro Pro Pro Thr Thr Ala Ala Pro Ser Thr Arg Ala Gln 210 215 220 Asn Ser Ser Ser Thr Thr Ser Thr Ala Ala Pro Thr Thr Thr Thr Ser 225 230 235 240 Ile Ile Lys Pro Thr Thr Ala Gln Ala Ser His Thr Ser Pro His Glu 245 250 255 Met Asp Leu Glu Val Ile Gln Glu Glu Gly Ala Ser Leu Ser Gly Gly 260 265 270 Ala Ala Gly His Gly Gly Thr Ala Gly His Gly Gly Ala Ala Gly His 275 280 285 Gln Asp Arg Ser Asn 290 <210> 3 <211> 346 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 3 Met Asp Pro Ala Arg Lys Ala Gly Ala Gln Ala Met Ile Trp Thr Ala 1 5 10 15 Gly Trp Leu Leu Leu Leu Leu Leu Arg Gly Gly Ala Gln Ala Leu Glu 20 25 30 Cys Tyr Ser Cys Val Gln Lys Ala Asp Asp Gly Cys Ser Pro Asn Lys 35 40 45 Met Lys Thr Val Lys Cys Ala Pro Gly Val Asp Val Cys Thr Glu Ala 50 55 60 Val Gly Ala Val Glu Thr Ile His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Arg 65 70 75 80 Gly Cys Gly Ser Gly Leu Pro Gly Lys Asn Asp Arg Gly Leu Asp Leu 85 90 95 His Gly Leu Leu Ala Phe Ile Gln Leu Gln Gln Cys Ala Gln Asp Arg 100 105 110 Cys Asn Ala Lys Leu Asn Leu Thr Ser Arg Ala Leu Asp Pro Ala Gly 115 120 125 Asn Glu Ser Ala Tyr Pro Pro Asn Gly Val Glu Cys Tyr Ser Cys Val 130 135 140 Gly Leu Ser Arg Glu Ala Cys Gln Gly Thr Ser Pro Pro Val Val Ser 145 150 155 160 Cys Tyr Asn Ala Ser Asp His Val Tyr Lys Gly Cys Phe Asp Gly Asn 165 170 175 Val Thr Leu Thr Ala Ala Asn Val Thr Val Ser Leu Pro Val Arg Gly 180 185 190 Cys Val Gln Asp Glu Phe Cys Thr Arg Asp Gly Val Thr Gly Pro Gly 195 200 205 Phe Thr Leu Ser Gly Ser Cys Cys Gln Gly Ser Arg Cys Asn Ser Asp 210 215 220 Leu Arg Asn Lys Thr Tyr Phe Ser Pro Arg Ile Pro Pro Leu Val Arg 225 230 235 240 Leu Pro Pro Pro Glu Pro Thr Thr Val Ala Ser Thr Thr Ser Val Thr 245 250 255 Thr Ser Thr Ser Ala Pro Val Arg Pro Thr Ser Thr Thr Lys Pro Met 260 265 270 Pro Ala Pro Thr Ser Gln Thr Pro Arg Gln Gly Val Glu His Glu Ala 275 280 285 Ser Arg Asp Glu Glu Pro Arg Leu Thr Gly Gly Ala Ala Gly His Gln 290 295 300 Asp Arg Ser Asn Ser Gly Gln Tyr Pro Ala Lys Gly Gly Pro Gln Gln 305 310 315 320 Pro His Asn Lys Gly Cys Val Ala Pro Thr Ala Gly Leu Ala Ala Leu 325 330 335 Leu Leu Ala Val Ala Ala Gly Val Leu Leu 340 345 <210> 4 <211> 363 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4 Met Asp Ala Ala Arg Arg Gly Asp Thr Gln Pro Val Met Trp Thr Thr 1 5 10 15 Gly Trp Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Leu Cys Glu Gly Ala Gln Ala 20 25 30 Leu Glu Cys Tyr Ser Cys Val Gln Lys Ala Asp Asp Gly Cys Ser Pro 35 40 45 His Arg Met Lys Thr Val Lys Cys Gly Pro Gly Val Asp Val Cys Thr 50 55 60 Glu Ala Val Gly Ala Val Glu Thr Ile His Gly Gln Phe Ser Val Ala 65 70 75 80 Val Arg Gly Cys Gly Ser Gly Ile Pro Gly Lys Asn Asp Arg Gly Leu 85 90 95 Asp Leu His Gly Leu Leu Ala Phe Phe Gln Leu Gln Gln Cys Ser Glu 100 105 110 Asp Arg Cys Asn Ala Lys Leu Asn Leu Thr Leu Arg Gly Leu Asn Pro 115 120 125 Ala Gly Asn Glu Ser Ala Tyr Glu Pro Asn Gly Ala Glu Cys Tyr Ser 130 135 140 Cys Val Gly Leu Ser Arg Glu Lys Cys Gln Gly Ser Met Pro Pro Val 145 150 155 160 Val Asn Cys Tyr Asn Ala Ser Gly Arg Val Tyr Lys Gly Cys Phe Asp 165 170 175 Gly Asn Val Thr Leu Thr Ala Ala Asn Val Thr Val Ser Leu Pro Val 180 185 190 Arg Gly Cys Val Gln Asp Glu Thr Cys Thr Arg Asp Gly Val Thr Gly 195 200 205 Pro Gly Phe Thr Leu Ser Gly Ser Cys Cys Gln Gly Pro Arg Cys Asn 210 215 220 Ala Asp Leu Arg Asn Lys Thr Tyr Phe Ser Pro Arg Ile Pro Pro Leu 225 230 235 240 Val Leu Leu Pro Pro Pro Thr Thr Ala Ala Pro Ser Thr Arg Ala Gln 245 250 255 Asn Ser Ser Ser Thr Thr Ser Thr Ala Ala Pro Thr Thr Thr Thr Ser 260 265 270 Ile Ile Lys Pro Thr Thr Ala Gln Ala Ser His Thr Ser Pro His Glu 275 280 285 Met Asp Leu Glu Val Ile Gln Glu Glu Gly Ala Ser Leu Ser Gly Gly 290 295 300 Ala Ala Gly His Gly Gly Thr Ala Gly His Gly Gly Ala Ala Gly His 305 310 315 320 Gln Asp Arg Ser Asn Met Glu Lys Tyr Pro Gly Lys Gly Gly Ala Gln 325 330 335 Ile Pro Ala Lys Gly Gly Ser Gly Thr Leu Gly Ser Trp Leu Ser Ala 340 345 350 Val Leu Leu Thr Val Val Ala Gly Ala Met Leu 355 360 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 5 Phe Ser Asn Ala Trp Met Ser Trp Val 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 6 Phe Ser Asp Tyr Gln Met Thr Trp Ile 1 5 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 7 Phe Gly His Tyr Tyr Met Phe Trp Ile 1 5 <210> 8 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 8 Phe Ser Ser Asn Tyr Met Ser Trp 1 5 <210> 9 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 9 Val Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly Arg 20 <210> 10 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 10 Val Ser Gly Val Ser Trp Asn Gly Ala Arg Thr His Tyr Ala Asp Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly Arg 20 <210> 11 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 11 Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Tyr Ser Thr His Tyr Ala Asp Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly Arg 20 <210> 12 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 12 Val Ser Ala Ile Ser Ser Ser Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly Arg 20 <210> 13 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 13 Ala Arg Glu Gly Leu Trp Ala Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 14 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 14 Ala Lys Gly Asp Tyr Leu Val Tyr Ser Ala Tyr Tyr Phe Asp Ser 1 5 10 15 <210> 15 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 15 Ala Arg Leu Pro Tyr Gly Ser Gln Ser Gly Val Asp Tyr 1 5 10 <210> 16 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 16 Ala Arg Glu Ser Gly Gly Ser Gly Pro Asn Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp 1 5 10 15 Val <210> 17 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 17 Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Val Val His 1 5 10 <210> 18 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 18 Ser Gly Ser Ser Ser Asn Val Gly Ser Asn Pro Val Asn 1 5 10 <210> 19 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 19 Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Val Val His 1 5 10 <210> 20 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 20 Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Val Val His 1 5 10 <210> 21 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 21 Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser 1 5 <210> 22 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 22 Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser 1 5 <210> 23 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 23 Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser 1 5 <210> 24 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 24 Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser 1 5 <210> 25 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 25 Cys Ala Ala Trp Asp Asp Arg Leu Asn Gly Pro Val 1 5 10 <210> 26 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 26 Cys Ala Ala Trp Asp Asp Arg Leu Asn Gly Trp Val 1 5 10 <210> 27 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 27 Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser His Val Leu 1 5 10 <210> 28 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 28 Cys Gln Ser Tyr Asp Arg Ser Leu Arg Gly Trp Val 1 5 10 <210> 29 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 29 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly 20 25 30 Tyr Val Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Arg 85 90 95 Leu Asn Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 Gln <210> 30 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 30 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Val Gly Ser Asn 20 25 30 Pro Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Arg Leu 85 90 95 Asn Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln 100 105 110 <210> 31 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 31 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly 20 25 30 Tyr Val Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser 85 90 95 His Val Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln 100 105 110 <210> 32 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 32 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly 20 25 30 Tyr Val Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Arg Ser 85 90 95 Leu Arg Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 Gln <210> 33 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 33 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Leu Trp Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Thr Ser 115 <210> 34 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 34 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Gln Met Thr Trp Ile Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Val Ser Trp Asn Gly Ala Arg Thr His Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gly Asp Tyr Leu Val Tyr Ser Ala Tyr Tyr Phe Asp Ser Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Thr Ser 115 120 <210> 35 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 35 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly His Tyr 20 25 30 Tyr Met Phe Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Tyr Ser Thr His Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Pro Tyr Gly Ser Gln Ser Gly Val Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Thr Ser 115 120 <210> 36 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 36 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Asn 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Ser Ser Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Ser Gly Gly Ser Gly Pro Asn Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp 100 105 110 Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Thr Ser 115 120 <210> 37 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 37 cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ctgggcagag ggtcaccatc 60 tcctgcactg ggagcagctc caacattggg gcgggttatg ttgtacattg gtatcagcag 120 ctcccaggaa cggcccccaa actcctcatc tatgacaata ataagcgacc ctcaggggtc 180 cctgaccgat tctctggctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cagtgggctc 240 cggtccgagg atgaggctga ttattactgt gcagcatggg atgacaggct gaatggtccg 300 gtgttcggcg gaggaaccaa gttaaccgtc ctaggtcag 339 <210> 38 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 38 cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60 tcttgttctg gaagcagctc caacgtcggg agtaatcctg taaactggta tcagcagctc 120 ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat aggaataatc agcggccctc aggggtccct 180 gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccgg 240 tccgaggatg aggctgatta ttactgtgca gcatgggatg acaggctgaa tggttgggtg 300 ttcggcggag gaaccaagct gacggtccta ggtcag 336 <210> 39 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 39 cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60 tcctgcactg ggagcagctc caacattggg gcgggttatg ttgtacattg gtatcagcag 120 ctcccaggaa cggcccccaa actcctcatc tatagtaata atcagcggcc ctcaggagtc 180 cctgaccgat tctctggctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cagtgggctc 240 cggtccgagg atgaggctga ttattactgc cagtcctatg acagcagcca tgttttattc 300 ggcggaggaa ccaagctgac ggtcctaggt cag 333 <210> 40 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 40 cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60 tcctgcactg ggagcagctc caacattggg gcgggttatg ttgtacattg gtatcagcag 120 ctcccaggaa cggcccccaa actcctcatc tatagtaata atcagcggcc ctcaggggtc 180 cctgaccgat tctctggctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cagtgggctc 240 cggtccgagg atgaggctga ttattactgc cagtcctatg acagaagcct gcgtggttgg 300 gtgttcggcg gaggaaccaa gctgacggtc ctaggtcag 339 <210> 41 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 41 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt aacgcctgga tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtttcatac attagtagta gtggtagtac catatactac 180 gcagactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac actgccgtgt attactgtgc gagagaaggg 300 ttatgggcct ttgactactg gggccagggt accctggtca ccgtgactag t 351 <210> 42 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 42 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt gactatcaga tgacctggat ccgccagact 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtatcgggt gttagttgga atggcgctag gacgcactat 180 gcagactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctacaaatga acagcctgag agccgaggac actgccgtgt attactgtgc gaagggcgac 300 tacctggttt actccgcata ctactttgac tcctggggcc agggtaccct ggtcaccgtg 360 actagt 366 <210> 43 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 43 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcggt cactactata tgttctggat ccgtcaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggttatag cacacactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac actgccgtgt attactgtgc gagactgcca 300 tatggttcgc agagtggcgt tgactactgg ggccagggta ccctggtcac cgtgactagt 360 <210> 44 <211> 372 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 44 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agcaactaca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtagta gtggtagtag cacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac actgccgtgt attactgtgc gagagaatct 300 ggtgggagcg gaccgaacta ctactacggt atggacgtct ggggccaagg taccctggtc 360 accgtgacta gt 372 <210> 45 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 45 Phe Ser Asn Ala Trp Met Ser Trp Val 1 5 <210> 46 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 46 Val Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly Arg 20 <210> 47 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 47 Ala Arg Glu Gly Leu Trp Ala Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 48 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 48 Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Val Val His 1 5 10 <210> 49 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 49 Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser 1 5 <210> 50 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 50 Cys Ala Ala Trp Asp Asp Arg Leu Asn Gly Pro Val 1 5 10 <210> 51 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 51 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Leu Trp Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 52 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 52 Glu Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly 20 25 30 Tyr Val Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Arg 85 90 95 Leu Asn Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 Gln <210> 53 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 53 gaggtgcagc tgctggaaag cggcggagga ctggtgcagc ctggaggcag cctgagactg 60 tcttgcgccg ccagcggctt caccttcagc aacgcctgga tgagctgggt ccgacaggct 120 cctggcaagg gcctggaatg ggtgtcctac atcagcagca gcggcagcac catctactac 180 gccgacagcg tgaagggccg gttcaccatc agccgggaca acagcaagaa caccctgtac 240 ctgcagatga acagcctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc cagagaaggc 300 ctgtgggcct tcgactactg gggccagggc accctggtca ccgtgtctag c 351 <210> 54 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 54 gagagcgtgc tgacccagcc tcctagcgtg tccggcgctc ctggccagag agtgaccatc 60 agctgcaccg gcagcagcag caacatcgga gccggctacg tggtgcactg gtatcagcag 120 ctgcccggca ccgcccccaa gctgctgatc tacgacaaca acaagcggcc tagcggcgtg 180 cccgacagat tcagcggcag caagagcggc accagcgcca gcctggccat cagcggcctg 240 agaagcgagg acgaggccga ctactactgc gccgcctggg acgacagact gaacggccct 300 gtgttcggcg gaggcaccaa gctgaccgtg ctgggacag 339 <210> 55 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 55 Phe Ser Asn Ala Trp Met Ser Trp Val 1 5 <210> 56 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 56 Val Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly Arg 20 <210> 57 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 57 Ala Arg Glu Gly Leu Trp Ala Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 58 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 58 Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Val Val His 1 5 10 <210> 59 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 59 Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser 1 5 <210> 60 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 60 Cys Ala Ala Tyr Asp Asp Ser Leu Ser Gly Pro Val 1 5 10 <210> 61 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 61 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Leu Trp Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 62 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 62 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly 20 25 30 Tyr Val Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Tyr Asp Asp Ser 85 90 95 Leu Ser Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 Gln <210> 63 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 63 gaggtgcagc tgctggaatc cggcggaggc ctggtgcagc ctggcggatc tctgagactg 60 tcctgcgccg ccagcggctt taccttctcc aacgcctgga tgtcctgggt ccgacaggcc 120 cctggcaagg gactggaatg ggtgtcctac atctcctcct ccggctccac catctactac 180 gccgactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgggaca actccaagaa caccctgtac 240 ctgcagatga actccctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc ccgagagggc 300 ctgtgggcct tcgattattg gggccagggc accctggtca ccgtcagctc a 351 <210> 64 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 64 cagtccgtgc tgacccagcc cccttctgtg tctggcgccc ctggccagag agtgaccatc 60 tcttgcaccg gctcctccag caacatcggc gctggctacg tggtgcactg gtatcagcag 120 ctgcccggca ccgcccccaa gctgctgatc tacgacaaca acaagcggcc ctccggcgtg 180 cccgacagat tctccggctc caagtccggc acctccgcct ccctggccat ctccggcctg 240 agatctgagg acgaggccga ctactactgc gccgcctacg acgactccct gtccggccct 300 gtgttcggcg gaggcacaaa gttaaccgtg ctgggccag 339 <210> 65 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 65 Phe Ser Asn Ala Trp Met Ser Trp Val 1 5 <210> 66 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 66 Val Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly Arg 20 <210> 67 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 67 Ala Arg Glu Gly Leu Trp Ala Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 68 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 68 Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Val Val His 1 5 10 <210> 69 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 69 Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser 1 5 <210> 70 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 70 Cys Ala Ala Phe Asp Asp Ser Leu Asn Gly Pro Val 1 5 10 <210> 71 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 71 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Leu Trp Ala Phe Asp Lys Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 72 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 72 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly 20 25 30 Tyr Val Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Phe Asp Asp Arg 85 90 95 Leu Asn Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 Gln <210> 73 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 73 gaggtgcagc tgctggaatc cggcggaggc ctggtgcagc ctggcggatc tctgagactg 60 tcctgcgccg cctccggctt taccttctcc aacgcctgga tgtcctgggt ccgacaggct 120 cctggcaagg gcctggaatg ggtgtcctac atctcctcct ccggctccac catctactac 180 gccgactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgggaca actccaagaa caccctgtac 240 ctgcagatga actccctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc ccgagagggc 300 ctgtgggcct tcgataagtg gggccagggc accctggtca ccgtcagctc a 351 <210> 74 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 74 cagtccgtgc tgacccagcc tccttccgcc tctggcaccc ctggccagag agtgaccatc 60 tcctgcaccg gctcctccag caacatcggc gctggctacg tggtgcactg gtatcagcag 120 ctgcccggca ccgcccccaa gctgctgatc tacgacaaca acaagcggcc ctccggcgtg 180 cccgacagat tctccggctc caagtccggc acctccgcct ccctggccat ctccggcctg 240 agatctgagg acgaggccga ctactactgc gccgccttcg acgaccggct gaacggccct 300 gtgttcggcg gaggcacaaa gttaaccgtg ctgggccag 339 <210> 75 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 75 Phe Ser Ser Ala Trp Met Ser Trp Val 1 5 <210> 76 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 76 Val Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly Arg 20 <210> 77 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 77 Ala Arg Glu Gly Leu Trp Ala Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 78 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 78 Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Val Val His 1 5 10 <210> 79 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 79 Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser 1 5 <210> 80 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 80 Cys Ala Ala Tyr Asp Asp Ser Leu Ser Gly Pro Val 1 5 10 <210> 81 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 81 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Ala 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Leu Trp Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 82 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 82 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly 20 25 30 Tyr Val Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Tyr Asp Asp Ser 85 90 95 Leu Ser Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 Gln <210> 83 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 83 gaggtgcagc tgctggaatc cggcggaggc ctggtgcagc ctggcggatc tctgagactg 60 tcctgcgccg ccagcggctt taccttctcc agcgcctgga tgtcctgggt ccgacaggcc 120 cctggcaagg gactggaatg ggtgtcctac atctcctcct ccggctccac catctactac 180 gccgactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgggaca actccaagaa caccctgtac 240 ctgcagatga actccctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc ccgagagggc 300 ctgtgggcct tcgattattg gggccagggc accctggtca ccgtcagctc a 351 <210> 84 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 84 cagtccgtgc tgacccagcc cccttctgtg tctggcgccc ctggccagag agtgaccatc 60 tcttgcaccg gctcctccag caacatcggc gctggctacg tggtgcactg gtatcagcag 120 ctgcccggca ccgcccccaa gctgctgatc tacgacaaca acaagcggcc ctccggcgtg 180 cccgacagat tctccggctc caagtccggc acctccgcct ccctggccat ctccggcctg 240 agatctgagg acgaggccga ctactactgc gccgcctacg acgactccct gtccggccct 300 gtgttcggcg gaggcacaaa gttaaccgtg ctgggccag 339 <210> 85 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 85 Phe Ser Ser Ala Trp Met Ser Trp Val 1 5 <210> 86 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 86 Val Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly Arg 20 <210> 87 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 87 Ala Arg Glu Gly Leu Trp Ala Phe Asp Lys 1 5 10 <210> 88 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 88 Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Val Val His 1 5 10 <210> 89 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 89 Asp Asn Asn Gln Arg Pro Ser 1 5 <210> 90 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 90 Cys Ala Ala Phe Asp Asp Arg Leu Ser Gly Pro Val 1 5 10 <210> 91 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 91 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Ala 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Leu Trp Ala Phe Asp Lys Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 92 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 92 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly 20 25 30 Tyr Val Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Asp Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Phe Asp Asp Arg 85 90 95 Leu Ser Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 Gln <210> 93 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 93 gaggtgcagc tgctggaaag cggcggaggc ctggtgcagc ctggcggaag cctgagactg 60 agctgtgccg ccagcggctt caccttcagc agcgcctgga tgagctgggt ccgacaggcc 120 cctggcaagg gcctggaatg ggtgtcctac atcagcagca gcggcagcag cacctactac 180 gccgacagcg tgaagggccg gttcaccatc agccgggaca acagcaagaa caccctgtac 240 ctgcagatga acagcctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc cagagaaggc 300 ctgtgggcct tcgataagtg gggccagggc accctggtca ccgtcagctc a 351 <210> 94 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 94 cagagcgtgc tgacccagcc tcctagcgcc tctggcaccc ctggccagag agtgaccatc 60 agctgcagcg gcagcagcag caacatcgga gccggctacg tggtgcactg gtatcagcag 120 ctgcccggca ccgcccccaa gctgctgatc tacgacaaca accagcggcc cagcggcgtg 180 cccgacagat tttccggcag caagagcggc accagcgcca gcctggccat cagcggcctg 240 agaagcgagg acgaggccga ctactactgc gccgccttcg acgacagact gagcggccct 300 gtgttcggcg gaggcacaaa gttaaccgtg ctgggccag 339 <210> 95 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 95 Phe Ser Asp Tyr Gln Met Thr Trp Ile 1 5 <210> 96 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 96 Val Ser Gly Val Ser Trp Asn Gly Ala Arg Thr His Tyr Ala Asp Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly Arg 20 <210> 97 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 97 Ala Lys Gly Asp Tyr Leu Val Tyr Ser Ala Tyr Tyr Phe Asp Ser 1 5 10 15 <210> 98 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 98 Ser Gly Ser Ser Ser Asn Val Gly Ser Asn Pro Val Asn 1 5 10 <210> 99 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 99 Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser 1 5 <210> 100 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 100 Cys Ala Ala Trp Asp Asp Arg Leu Asn Gly Trp Val 1 5 10 <210> 101 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 101 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Gln Met Thr Trp Ile Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Ser Trp Asn Gly Gly Ser Thr His Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gly Asp Tyr Leu Val Tyr Ser Ala Tyr Tyr Phe Asp Ser Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 102 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 102 Glu Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Pro Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Arg Leu 85 90 95 Asn Gly Trp Gly Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln 100 105 110 <210> 103 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 103 gaggtgcagc tgctggaaag cggcggagga ctggtgcagc ctggaggcag cctgagactg 60 tcttgcgccg ccagcggctt caccttcagc gactaccaga tgacctggat ccgacagacc 120 cctggcaagg gcctggaatg ggtgtccggc atcagctgga acggaggcag cacccactac 180 gccgacagcg tgaagggccg gttcaccatc agccgggaca acagcaagaa caccctgtac 240 ctgcagatga acagcctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc caagggcgac 300 tacctggtgt acagcgccta ctacttcgac agctggggcc agggcaccct ggtcaccgtg 360 tctagc 366 <210> 104 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 104 gagagcgtgc tgacccagcc tcctagcgcc tctggcaccc ctggccagag agtgaccatc 60 agctgctctg gcagcagcag caacatcgga agcaaccccg tgaactggta tcagcagctg 120 cccggcaccg cccccaagct gctgatctac cggaacaacc agcggcctag cggcgtgccc 180 gacagattca gcggcagcaa gagcggcacc agcgccagcc tggccatcag cggcctgaga 240 agcgaggacg aggccgacta ctactgcgcc gcctgggacg acagactgaa cggctggggc 300 ttcggcggag gcaccaagct gaccgtgctg ggacag 336 <210> 105 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 105 Phe Ser Asp Tyr Gln Met Thr Trp Ile 1 5 <210> 106 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 106 Val Ser Gly Ile Ser Trp Asn Gly Gly Ser Thr His Tyr Ala Asp Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly Arg 20 <210> 107 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 107 Ala Lys Gly Asp Tyr Leu Val Tyr Ser Ser Tyr Tyr Phe Lys Ser 1 5 10 15 <210> 108 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 108 Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Pro Val Asn 1 5 10 <210> 109 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 109 Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser 1 5 <210> 110 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 110 Cys Ala Ala Trp Asp Asp Arg Leu Ser Gly Trp Ala 1 5 10 <210> 111 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 111 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Gln Met Thr Trp Ile Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Ser Trp Asn Gly Gly Ser Thr His Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gly Asp Tyr Leu Val Tyr Ser Ser Tyr Tyr Phe Lys Ser Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 112 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 112 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Pro Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Arg Leu 85 90 95 Ser Gly Trp Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln 100 105 110 <210> 113 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 113 gaggtgcagc tgctggaatc cggcggaggc ctggtgcagc ctggcggatc tctgagactg 60 tcctgcgccg cctccggctt caccttctcc gactaccaga tgacctggat cagacagacc 120 cccggcaagg gcctggaatg ggtgtccggc atctcctgga acggcggctc cacccactac 180 gccgactctg tgaagggccg gttcaccatc tcccgggaca actccaagaa caccctgtac 240 ctgcagatga actccctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc caagggcgac 300 tacctggtgt actcctccta ctacttcaag tcctggggcc agggcaccct ggtcaccgtc 360 agctca 366 <210> 114 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 114 cagtccgtgc tgacccagcc tccttccgcc tctggcaccc ctggccagag agtgaccatc 60 tcctgctccg gctcctcctc caacatcggc tccaaccccg tgaactggta tcagcagctg 120 cccggcaccg cccccaagct gctgatctac cggaacaacc agcggccctc cggcgtgccc 180 gacagattct ccggctccaa gtccggcacc tccgcctccc tggccatctc cggcctgaga 240 tctgaggacg aggccgacta ctactgcgcc gcctgggacg accggctgtc tggctgggct 300 tttggcggcg gaacaaagtt aaccgtgctg ggccag 336 <210> 115 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 115 Phe Ser Asp Tyr Gln Met Thr Trp Ile 1 5 <210> 116 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 116 Val Ser Gly Ile Ser Trp Asn Gly Gly Ser Thr His Tyr Ala Asp Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly Arg 20 <210> 117 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 117 Ala Lys Gly Asp Tyr Leu Val Tyr Lys Ser Tyr Tyr Phe Lys Ser 1 5 10 15 <210> 118 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 118 Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Pro Val Asn 1 5 10 <210> 119 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 119 Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser 1 5 <210> 120 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 120 Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Ser Gly Trp Ala 1 5 10 <210> 121 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 121 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Gln Met Thr Trp Ile Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Ser Trp Asn Gly Gly Ser Thr His Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gly Asp Tyr Leu Val Tyr Lys Ser Tyr Tyr Phe Lys Ser Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 122 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 122 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Pro Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95 Ser Gly Trp Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln 100 105 110 <210> 123 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 123 gaggtgcagc tgctggaatc cggcggaggc ctggtgcagc ctggcggatc tctgagactg 60 tcctgcgccg cctccggctt caccttctcc gactaccaga tgacctggat cagacagacc 120 cccggcaagg gcctggaatg ggtgtccggc atctcctgga acggcggctc cacccactac 180 gccgactctg tgaagggccg gttcaccatc tcccgggaca actccaagaa caccctgtac 240 ctgcagatga actccctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc caagggcgac 300 tacctggtgt acaagtccta ctacttcaag tcctggggcc agggcaccct ggtcaccgtc 360 agctca 366 <210> 124 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 124 cagtccgtgc tgacccagcc tccttccgcc tctggcaccc ctggccagag agtgaccatc 60 tcctgctccg gctcctcctc caacatcggc tccaaccccg tgaactggta tcagcagctg 120 cccggcaccg cccccaagct gctgatctac cggaacaacc agcggccctc cggcgtgccc 180 gacagattct ccggctccaa gtccggcacc tccgcctccc tggccatctc cggcctgaga 240 tctgaggacg aggccgacta ctactgcgcc gcctgggacg actccctgtc tggctgggct 300 tttggcggcg gaacaaagtt aaccgtgctg ggccag 336 <210> 125 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 125 Phe Ser Asp Tyr Gln Met Thr Trp Ile 1 5 <210> 126 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 126 Val Ser Gly Ile Ser Trp Asn Gly Gly Ser Thr His Tyr Ala Asp Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly Arg 20 <210> 127 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 127 Ala Lys Gly Asp Tyr Leu Val Tyr Ser Ser Tyr Tyr Phe Lys Ser 1 5 10 15 <210> 128 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 128 Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Pro Val Asn 1 5 10 <210> 129 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 129 Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser 1 5 <210> 130 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 130 Cys Ala Ala Trp Asp Asp Arg Leu Ser Gly Trp Gly 1 5 10 <210> 131 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 131 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Gln Met Thr Trp Ile Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Ser Trp Asn Gly Gly Ser Thr His Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gly Asp Tyr Leu Val Tyr Ser Ser Tyr Tyr Phe Lys Ser Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 132 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 132 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Pro Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Arg Leu 85 90 95 Ser Gly Trp Gly Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln 100 105 110 <210> 133 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 133 gaggtgcagc tgctggaatc cggcggaggc ctggtgcagc ctggcggatc tctgagactg 60 tcctgcgccg cctccggctt caccttctcc gactaccaga tgacctggat cagacagacc 120 cccggcaagg gcctggaatg ggtgtccggc atctcctgga acggcggctc cacccactac 180 gccgactctg tgaagggccg gttcaccatc tcccgggaca actccaagaa caccctgtac 240 ctgcagatga actccctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc caagggcgac 300 tacctggtgt actcctccta ctacttcaag tcctggggcc agggcaccct ggtcaccgtc 360 agctca 366 <210> 134 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 134 cagtccgtgc tgacccagcc tccttccgcc tctggcaccc ctggccagag agtgaccatc 60 tcctgctccg gctcctcctc caacatcggc tccaaccccg tgaactggta tcagcagctg 120 cccggcaccg cccccaagct gctgatctac cggaacaacc agcggccctc cggcgtgccc 180 gacagattct ccggctccaa gtccggcacc tccgcctccc tggccatctc cggcctgaga 240 tctgaggacg aggccgacta ctactgcgcc gcctgggacg accggctgtc tggctgggga 300 tttggcggcg gaacaaagtt aaccgtgctg ggccag 336 <210> 135 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 135 Phe Ser Ser Tyr Gln Met Thr Trp Ile 1 5 <210> 136 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 136 Val Ser Gly Ile Ser Trp Asn Gly Gly Ser Thr His Tyr Ala Asp Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly Arg 20 <210> 137 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 137 Ala Lys Gly Asp Tyr Leu Val Tyr Lys Ser Tyr Tyr Phe Lys Ser 1 5 10 15 <210> 138 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 138 Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Pro Val Asn 1 5 10 <210> 139 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 139 Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser 1 5 <210> 140 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 140 Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Ser Gly Trp Ala 1 5 10 <210> 141 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 141 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gln Met Thr Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Ser Trp Asn Gly Gly Ser Thr His Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gly Asp Tyr Leu Val Tyr Lys Ser Tyr Tyr Phe Lys Ser Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 142 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 142 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Pro Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95 Ser Gly Trp Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln 100 105 110 <210> 143 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 143 gaggtgcagc tgctggaaag cggcggaggc ctggtgcagc ctggcggaag cctgagactg 60 agctgtgccg ccagcggctt caccttcagc agctaccaga tgacctggat cagacaggcc 120 cctggcaagg gcctggaatg ggtgtccggc atcagctgga acggcggcag cacccactac 180 gccgacagcg tgaagggccg gttcaccatc agccgggaca acagcaagaa caccctgtac 240 ctgcagatga acagcctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc caagggcgac 300 tacctggtgt acaagagcta ctacttcaag agctggggcc agggcacact ggtcaccgtc 360 agctca 366 <210> 144 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 144 cagagcgtgc tgacccagcc tcctagcgcc tctggcaccc ctggccagag agtgaccatc 60 agctgcagcg gcagcagcag caacatcggc agcaaccccg tgaactggta tcagcagctg 120 cccggcaccg cccccaagct gctgatctac cggaacaacc agcggcccag cggcgtgccc 180 gacagatttt ccggcagcaa gagcggcacc agcgccagcc tggccatcag cggcctgaga 240 agcgaggacg aggccgacta ctactgcgcc gcctgggacg atagcctgag cggctgggcc 300 tttggcggcg gaacaaagtt aaccgtgctg ggccag 336 <210> 145 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 145 Phe Ser Asn Ala Trp Met Ser Trp Val 1 5 <210> 146 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 146 Val Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly Arg 20 <210> 147 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 147 Ala Arg Glu Gly Leu Trp Ala Phe Asp Lys 1 5 10 <210> 148 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 148 Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Val Val His 1 5 10 <210> 149 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 149 Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser 1 5 <210> 150 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 150 Cys Ala Ala Tyr Asp Asp Ser Leu Lys Gly Pro Val 1 5 10 <210> 151 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 151 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Leu Trp Ala Phe Asp Lys Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Thr Ser 115 <210> 152 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 152 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly 20 25 30 Tyr Val Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Tyr Asp Asp Ser 85 90 95 Leu Lys Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 Gln <210> 153 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 153 Phe Ser Asn Ala Trp Met Ser Trp Val 1 5 <210> 154 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 154 Val Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly Arg 20 <210> 155 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 155 Ala Arg Glu Gly Leu Trp Ala Phe Asp Lys 1 5 10 <210> 156 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 156 Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Val Val His 1 5 10 <210> 157 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 157 Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser 1 5 <210> 158 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 158 Cys Ala Ala Phe Asp Asp Ser Leu Asn Gly Pro Val 1 5 10 <210> 159 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 159 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Leu Trp Ala Phe Asp Lys Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Thr Ser 115 <210> 160 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 160 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly 20 25 30 Tyr Val Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Phe Asp Asp Ser 85 90 95 Leu Asn Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 Gln <210> 161 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 161 Phe Ser Asn Ala Trp Met Ser Trp Val 1 5 <210> 162 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 162 Val Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly Arg 20 <210> 163 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 163 Ala Arg Glu Gly Leu Trp Ala Phe Asp Lys 1 5 10 <210> 164 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 164 Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Val Val His 1 5 10 <210> 165 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 165 Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser 1 5 <210> 166 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 166 Cys Ala Ala Tyr Asp Asp Ser Leu Ser Gly Pro Val 1 5 10 <210> 167 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 167 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Leu Trp Ala Phe Asp Lys Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Thr Ser 115 <210> 168 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 168 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly 20 25 30 Tyr Val Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Phe Asp Asp Ser 85 90 95 Leu Asn Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 Gln <210> 169 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 169 Phe Ser Ser Ala Trp Met Ser Trp Val 1 5 <210> 170 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 170 Val Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly Arg 20 <210> 171 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 171 Ala Arg Glu Gly Leu Trp Ala Phe Asp Trp 1 5 10 <210> 172 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 172 Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Val Val His 1 5 10 <210> 173 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 173 Asp Asn Asn Gln Arg Pro Ser 1 5 <210> 174 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 174 Cys Ala Ala Tyr Asp Asp Ser Leu Ser Gly Pro Val 1 5 10 <210> 175 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 175 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Ala 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Leu Trp Ala Phe Asp Trp Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Thr Ser 115 <210> 176 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 176 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly 20 25 30 Tyr Val Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Asp Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Tyr Asp Asp Ser 85 90 95 Leu Ser Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 Gln <210> 177 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 177 Phe Ser Ser Ala Trp Met Ser Trp Val 1 5 <210> 178 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 178 Val Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly Arg 20 <210> 179 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 179 Ala Arg Glu Gly Leu Trp Ala Phe Asp Asn 1 5 10 <210> 180 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 180 Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Val Val His 1 5 10 <210> 181 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 181 Asp Asn Asn Gln Arg Pro Ser 1 5 <210> 182 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 182 Cys Ala Ala Tyr Asp Asp Ser Leu Asn Gly Pro Val 1 5 10 <210> 183 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 183 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Leu Trp Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Thr Ser 115 <210> 184 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 184 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly 20 25 30 Tyr Val Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Asp Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Tyr Asp Asp Ser 85 90 95 Leu Asn Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 Gln <210> 185 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 185 Phe Ser Ser Ala Trp Met Ser Trp Val 1 5 <210> 186 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 186 Val Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly Arg 20 <210> 187 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 187 Ala Arg Glu Gly Leu Trp Ala Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 188 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 188 Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Val Val His 1 5 10 <210> 189 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 189 Asp Asn Asn Gln Arg Pro Ser 1 5 <210> 190 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 190 Cys Ala Ala Trp Asp Asp Arg Leu Asn Gly Pro Val 1 5 10 <210> 191 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 191 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Ala 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Leu Trp Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 192 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 192 Glu Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly 20 25 30 Tyr Val Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Asp Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Arg 85 90 95 Leu Asn Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 Gln <210> 193 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 193 Phe Thr Phe Ser Asn Ala Trp Met Ser Trp Val 1 5 10 <210> 194 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 194 Val Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly Arg 20 <210> 195 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 195 Ala Arg Glu Gly Leu Trp Ala Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 196 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 196 Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Val Val His 1 5 10 <210> 197 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 197 Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser 1 5 <210> 198 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 198 Cys Ala Ala Tyr Asp Asp Arg Leu Asn Gly Pro Val 1 5 10 <210> 199 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 199 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Leu Trp Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 200 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 200 Glu Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly 20 25 30 Tyr Val Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Tyr Asp Asp Arg 85 90 95 Leu Asn Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 Gln <210> 201 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 201 Phe Thr Phe Ser Ser Ala Trp Met Ser Trp Val 1 5 10 <210> 202 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 202 Val Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly Arg 20 <210> 203 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 203 Ala Arg Glu Gly Leu Trp Ala Phe Asp Gly 1 5 10 <210> 204 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 204 Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Val Val His 1 5 10 <210> 205 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 205 Asp Asn Asn Gln Arg Pro Ser 1 5 <210> 206 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 206 Cys Ala Ala Tyr Asp Asp Ser Leu Asn Arg Pro Val 1 5 10 <210> 207 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 207 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Ala 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Leu Trp Ala Phe Asp Gly Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 208 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 208 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly 20 25 30 Tyr Val Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Asp Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Tyr Asp Asp Ser 85 90 95 Leu Asn Arg Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 Gln <210> 209 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 209 Phe Thr Phe Ser Asn Ala Trp Met Ser Trp Val 1 5 10 <210> 210 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 210 Val Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly Arg 20 <210> 211 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 211 Ala Arg Glu Gly Leu Trp Ala Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 212 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 212 Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Val Val His 1 5 10 <210> 213 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 213 Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser 1 5 <210> 214 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 214 Cys Ala Ala Phe Asp Asp Ser Leu Asn Gly Pro Val 1 5 10 <210> 215 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 215 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Leu Trp Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 216 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 216 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly 20 25 30 Tyr Val Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Phe Asp Asp Ser 85 90 95 Leu Asn Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 Gln <210> 217 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 217 Phe Ser Ser Ala Trp Met Ser Trp Val 1 5 <210> 218 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 218 Val Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly Arg 20 <210> 219 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 219 Ala Arg Glu Gly Leu Trp Ala Phe Asp Lys 1 5 10 <210> 220 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 220 Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Val Val His 1 5 10 <210> 221 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 221 Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser 1 5 <210> 222 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 222 Cys Ala Ala Phe Asp Asp Ser Leu Asn Gly Pro Val 1 5 10 <210> 223 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 223 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Ala 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Leu Trp Ala Phe Asp Lys Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Thr Ser 115 <210> 224 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 224 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly 20 25 30 Tyr Val Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Phe Asp Asp Ser 85 90 95 Leu Asn Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 Gln <210> 225 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 225 Phe Thr Phe Ser Ser Ala Trp Met Ser Trp Val 1 5 10 <210> 226 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 226 Val Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly Arg 20 <210> 227 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 227 Ala Arg Glu Gly Leu Trp Ala Phe Asp Lys 1 5 10 <210> 228 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 228 Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Val Val His 1 5 10 <210> 229 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 229 Asp Asn Asn Gln Arg Pro Ser 1 5 <210> 230 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 230 Cys Ala Ala Phe Asp Asp Ser Leu Asn Gly Pro Val 1 5 10 <210> 231 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 231 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Ala 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Leu Trp Ala Phe Asp Lys Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 232 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 232 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly 20 25 30 Tyr Val Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Asp Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Phe Asp Asp Ser 85 90 95 Leu Asn Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 Gln <210> 233 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 233 Phe Thr Phe Ser Ser Ala Trp Met Ser Trp Val 1 5 10 <210> 234 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 234 Val Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly Arg 20 <210> 235 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 235 Ala Arg Glu Gly Leu Trp Ala Phe Asp Lys 1 5 10 <210> 236 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 236 Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Val Val His 1 5 10 <210> 237 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 237 Asp Asn Asn Gln Arg Pro Ser 1 5 <210> 238 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 238 Cys Ala Ala Phe Asp Asp Arg Leu Ser Gly Pro Val 1 5 10 <210> 239 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 239 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Ala 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Leu Trp Ala Phe Asp Lys Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 240 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 240 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly 20 25 30 Tyr Val Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Asp Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Phe Asp Asp Arg 85 90 95 Leu Ser Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 Gln <210> 241 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 241 Phe Ser Asp Tyr Gln Met Thr Trp Ile 1 5 <210> 242 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 242 Val Ser Gly Val Ser Trp Asn Gly Ala Arg Thr His Tyr Ala Asp Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly Arg 20 <210> 243 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 243 Ala Lys Gly Asp Tyr Leu Val Tyr Ser Ser Tyr Tyr Phe Lys Ser 1 5 10 15 <210> 244 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 244 Ser Gly Ser Ser Ser Asn Val Gly Ser Asn Pro Val Asn 1 5 10 <210> 245 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 245 Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser 1 5 <210> 246 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 246 Cys Ala Ala Trp Asp Asp Arg Leu Asn Gly Trp Thr Gly 1 5 10 <210> 247 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 247 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Gln Met Thr Trp Ile Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Val Ser Trp Asn Gly Ala Arg Thr His Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gly Asp Tyr Leu Val Tyr Ser Ser Tyr Tyr Phe Lys Ser Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Thr Ser 115 120 <210> 248 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 248 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Val Gly Ser Asn 20 25 30 Pro Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Arg Leu 85 90 95 Asn Gly Trp Gly Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln 100 105 110 <210> 249 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 249 Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gln Met Thr Trp Ile 1 5 10 <210> 250 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 250 Val Ser Gly Ile Ser Trp Asn Gly Gly Ser Thr His Tyr Ala Asp Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly Arg 20 <210> 251 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 251 Ala Lys Gly Asp Tyr Leu Val Tyr Ser Ala Tyr Tyr Phe Asp Ser 1 5 10 15 <210> 252 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 252 Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Pro Val Asn 1 5 10 <210> 253 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 253 Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser 1 5 <210> 254 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 254 Cys Ala Ala Trp Asp Asp Arg Leu Asn Gly Trp Gly 1 5 10 <210> 255 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 255 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gln Met Thr Trp Ile Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Ser Trp Asn Gly Gly Ser Thr His Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gly Asp Tyr Leu Val Tyr Ser Ala Tyr Tyr Phe Asp Ser Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 256 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 256 Glu Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Pro Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Arg Leu 85 90 95 Asn Gly Trp Gly Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln 100 105 110 <210> 257 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 257 Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Gln Met Thr Trp Ile 1 5 10 <210> 258 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 258 Val Ser Gly Ile Ser Trp Asn Gly Gly Ser Thr His Tyr Ala Asp Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly Arg 20 <210> 259 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 259 Ala Lys Gly Asp Tyr Leu Val Tyr Ser Ser Tyr Tyr Phe Lys Tyr 1 5 10 15 <210> 260 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 260 Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Pro Val Asn 1 5 10 <210> 261 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 261 Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser 1 5 <210> 262 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 262 Cys Ala Ala Trp Asp Asp Arg Leu Asn Gly Trp Ala 1 5 10 <210> 263 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 263 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Gln Met Thr Trp Ile Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Ser Trp Asn Gly Gly Ser Thr His Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gly Asp Tyr Leu Val Tyr Ser Ser Tyr Tyr Phe Lys Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 264 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 264 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Pro Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Arg Leu 85 90 95 Asn Gly Trp Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln 100 105 110 <210> 265 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 265 Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Gln Met Thr Trp Ile 1 5 10 <210> 266 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 266 Val Ser Gly Ile Ser Trp Asn Gly Gly Ser Thr His Tyr Ala Asp Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly Arg 20 <210> 267 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 267 Ala Lys Gly Asp Tyr Leu Val Tyr Ser Ser Tyr Tyr Phe Lys Ser 1 5 10 15 <210> 268 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 268 Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Pro Val Asn 1 5 10 <210> 269 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 269 Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser 1 5 <210> 270 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 270 Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly Trp Gly 1 5 10 <210> 271 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 271 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Gln Met Thr Trp Ile Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Ser Trp Asn Gly Gly Ser Thr His Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gly Asp Tyr Leu Val Tyr Ser Ser Tyr Tyr Phe Lys Ser Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 272 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 272 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Pro Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95 Asn Gly Trp Gly Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln 100 105 110 <210> 273 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 273 Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Gln Met Thr Trp Ile 1 5 10 <210> 274 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 274 Val Ser Gly Ile Ser Trp Asn Gly Gly Ser Thr His Tyr Ala Asp Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly Arg 20 <210> 275 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 275 Ala Lys Gly Asp Tyr Leu Val Tyr Lys Ser Tyr Tyr Phe Lys Ser 1 5 10 15 <210> 276 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 276 Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Pro Val Asn 1 5 10 <210> 277 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 277 Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser 1 5 <210> 278 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 278 Cys Ala Ala Trp Asp Asp Arg Leu Ser Gly Trp Gly 1 5 10 <210> 279 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 279 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Gln Met Thr Trp Ile Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Ser Trp Asn Gly Gly Ser Thr His Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gly Asp Tyr Leu Val Tyr Lys Ser Tyr Tyr Phe Lys Ser Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 280 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 280 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Pro Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Arg Leu 85 90 95 Ser Gly Trp Gly Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln 100 105 110 <210> 281 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 281 Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Gln Met Thr Trp Ile 1 5 10 <210> 282 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 282 Val Ser Gly Ile Ser Trp Asn Gly Gly Ser Thr His Tyr Ala Asp Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly Arg 20 <210> 283 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 283 Ala Lys Gly Asp Tyr Leu Val Tyr Ser Ser Tyr Tyr Phe Lys Ser 1 5 10 15 <210> 284 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 284 Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Pro Val Asn 1 5 10 <210> 285 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 285 Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser 1 5 <210> 286 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 286 Cys Ala Ala Trp Asp Asp Arg Leu Ser Gly Trp Gly 1 5 10 <210> 287 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 287 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Gln Met Thr Trp Ile Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Ser Trp Asn Gly Gly Ser Thr His Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gly Asp Tyr Leu Val Tyr Ser Ser Tyr Tyr Phe Lys Ser Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 288 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 288 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Pro Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Arg Leu 85 90 95 Ser Gly Trp Gly Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln 100 105 110 <210> 289 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 289 Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Gln Met Thr Trp Ile 1 5 10 <210> 290 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 290 Val Ser Gly Ile Ser Trp Asn Gly Gly Ser Thr His Tyr Ala Asp Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly Arg 20 <210> 291 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 291 Ala Lys Gly Asp Tyr Leu Val Tyr Lys Ser Tyr Tyr Phe Lys Ser 1 5 10 15 <210> 292 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 292 Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Pro Val Asn 1 5 10 <210> 293 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 293 Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser 1 5 <210> 294 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 294 Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly Trp Gly 1 5 10 <210> 295 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 295 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Gln Met Thr Trp Ile Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Ser Trp Asn Gly Gly Ser Thr His Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gly Asp Tyr Leu Val Tyr Lys Ser Tyr Tyr Phe Lys Ser Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 296 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 296 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Pro Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95 Asn Gly Trp Gly Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln 100 105 110 <210> 297 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> consensus sequence for M20 D02 S-A derived CDR H1 <220> <221> VARIANT <222> (3)..(3) <223> X = D or S <400> 297 Phe Ser Xaa Tyr Gln Met Thr Trp Ile 1 5 <210> 298 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> consensus sequence for M20 D02 S-A derived CDRH2 <220> <221> VARIANT <222> (4)..(4) <223> X = V or I <220> <221> VARIANT <222> (9)..(9) <223> X = A or G <220> <221> VARIANT <222> (10)..(10) <223> X = R or S <400> 298 Val Ser Gly Xaa Ser Trp Asn Gly Xaa Xaa Thr His Tyr Ala Asp Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly Arg 20 <210> 299 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> consensus for M20 D02 S-A derived CDRH3 <220> <221> VARIANT <222> (9)..(9) <223> X = S, K, or R <220> <221> VARIANT <222> (10)..(10) <223> X = A, S or R <220> <221> VARIANT <222> (14)..(14) <223> X = D, K, E or R <220> <221> VARIANT <222> (15)..(15) <223> X = S or Y <400> 299 Ala Lys Gly Asp Tyr Leu Val Tyr Xaa Xaa Tyr Tyr Phe Xaa Xaa 1 5 10 15 <210> 300 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> consensus seqeunce derived from M20 D02 S-A CDRL1 <220> <221> VARIANT <222> (7)..(7) <223> X = V or I <400> 300 Ser Gly Ser Ser Ser Asn Xaa Gly Ser Asn Pro Val Asn 1 5 10 <210> 301 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> consensus sequence derived from M20 D02 S-A derived CDR L3 <220> <221> VARIANT <222> (3)..(3) <223> X = A, Q or R <220> <221> VARIANT <222> (5)..(5) <223> X = D or G <220> <221> VARIANT <222> (7)..(7) <223> X = R or S <220> <221> VARIANT <222> (9)..(9) <223> X = N, W or S <220> <221> VARIANT <222> (12)..(12) <223> X = V, A or G <400> 301 Cys Ala Xaa Trp Xaa Asp Xaa Leu Xaa Gly Trp Xaa 1 5 10 <210> 302 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> consensus sequence derived from M31 B01 CDR H1 <220> <221> VARIANT <222> (3)..(3) <223> X = N or S <220> <221> VARIANT <222> (4)..(4) <223> X = A or Y <400> 302 Phe Ser Xaa Xaa Trp Met Ser Trp Val 1 5 <210> 303 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> consensus sequence derived from M31 B01 CDR H2 <220> <221> VARIANT <222> (10)..(10) <223> X = T or S <220> <221> VARIANT <222> (11)..(11) <223> X = I or T <400> 303 Val Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Xaa Xaa Tyr Tyr Ala Asp Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly Arg 20 <210> 304 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> consensus sequence derived from M31 B01 CDR H3 <220> <221> VARIANT <222> (10)..(10) <223> X = Y, K, G, W or N <400> 304 Ala Arg Glu Gly Leu Trp Ala Phe Asp Xaa 1 5 10 <210> 305 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> consensus sequence derived from M31 B01 CDR L1 <220> <221> VARIANT <222> (1)..(1) <223> X = T or S <400> 305 Xaa Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Val Val His 1 5 10 <210> 306 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> consensus sequence derived from M31 B01 CDR L2 <220> <221> VARIANT <222> (4)..(4) <223> X = K or Q <400> 306 Asp Asn Asn Xaa Arg Pro Ser 1 5 <210> 307 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> consensus sequence derived from M31 B01 CDR L3 <220> <221> VARIANT <222> (4)..(4) <223> X = W, E, F or Y <220> <221> VARIANT <222> (7)..(7) <223> X = R, S or M <220> <221> VARIANT <222> (9)..(9) <223> X = N, K or S <220> <221> VARIANT <222> (10)..(10) <223> X = G or R <220> <221> VARIANT <222> (11)..(11) <223> X = P or A <400> 307 Cys Ala Ala Xaa Asp Asp Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Val 1 5 10 <210> 308 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 308 gaggtgcagc tgctggagag cggggggggg ctggtgcagc cgggggggag cctgcgcctg 60 agctgcgcgg cgagcgggtt tacctttagc aacgcgtgga tgagctgggt gcgccaggcg 120 ccggggaaag ggctggagtg ggtgagctat attagcagca gcgggagcac catttattat 180 gcggatagcg tgaaagggcg ctttaccatt agccgcgata acagcaaaaa caccctgtat 240 ctgcagatga acagcctgcg cgcggaggat accgcggtgt attattgcgc gcgcgagggg 300 ctgtgggcgt ttgataaatg ggggcagggg accctggtga ccgtgaccag c 351 <210> 309 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 309 cagagcgtgc tgacccagcc gccgagcgcg agcgggaccc cggggcagcg cgtgaccatt 60 agctgcaccg ggagcagcag caacattggg gcggggtatg tggtgcattg gtatcagcag 120 ctgccgggga ccgcgccgaa actgctgatt tatgataaca acaaacgccc gagcggggtg 180 ccggatcgct ttagcgggag caaaagcggg accagcgcga gcctggcgat tagcgggctg 240 cgcagcgagg atgaggcgga ttattattgc gcggcgtatg atgatagcct gaaagggccg 300 gtgtttgggg gggggaccaa actgaccgtg ctggggcag 339 <210> 310 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 310 gaggtgcagc tgctggagag cggggggggg ctggtgcagc cgggggggag cctgcgcctg 60 agctgcgcgg cgagcgggtt tacctttagc aacgcgtgga tgagctgggt gcgccaggcg 120 ccggggaaag ggctggagtg ggtgagctat attagcagca gcgggagcac catttattat 180 gcggatagcg tgaaagggcg ctttaccatt agccgcgata acagcaaaaa caccctgtat 240 ctgcagatga acagcctgcg cgcggaggat accgcggtgt attattgcgc gcgcgagggg 300 ctgtgggcgt ttgataaatg ggggcagggg accctggtga ccgtgaccag c 351 <210> 311 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 311 cagagcgtgc tgacccagcc gccgagcgtg agcggggcgc cggggcagcg cgtgaccatt 60 agctgcaccg ggagcagcag caacattggg gcggggtatg tggtgcattg gtatcagcag 120 ctgccgggga ccgcgccgaa actgctgatt tatgataaca acaaacgccc gagcggggtg 180 ccggatcgct ttagcgggag caaaagcggg accagcgcga gcctggcgat tagcgggctg 240 cgcagcgagg atgaggcgga ttattattgc gcggcgtttg atgatagcct gaacgggccg 300 gtgtttgggg gggggaccaa actgaccgtg ctggggcag 339 <210> 312 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 312 gaggtgcagc tgctggagag cggggggggg ctggtgcagc cgggggggag cctgcgcctg 60 agctgcgcgg cgagcgggtt tacctttagc aacgcgtgga tgagctgggt gcgccaggcg 120 ccggggaaag ggctggagtg ggtgagctat attagcagca gcgggagcac catttattat 180 gcggatagcg tgaaagggcg ctttaccatt agccgcgata acagcaaaaa caccctgtat 240 ctgcagatga acagcctgcg cgcggaggat accgcggtgt attattgcgc gcgcgagggg 300 ctgtgggcgt ttgataaatg ggggcagggg accctggtga ccgtgaccag c 351 <210> 313 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 313 cagagcgtgc tgacccagcc gccgagcgtg agcggggcgc cggggcagcg cgtgaccatt 60 agctgcaccg ggagcagcag caacattggg gcggggtatg tggtgcattg gtatcagcag 120 ctgccgggga ccgcgccgaa actgctgatt tatgataaca acaaacgccc gagcggggtg 180 ccggatcgct ttagcgggag caaaagcggg accagcgcga gcctggcgat tagcgggctg 240 cgcagcgagg atgaggcgga ttattattgc gcggcgtttg atgatagcct gaacgggccg 300 gtgtttgggg gggggaccaa actgaccgtg ctggggcag 339 <210> 314 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 314 gaggtgcagc tgctggagag cggggggggg ctggtgcagc cgggggggag cctgcgcctg 60 agctgcgcgg cgagcgggtt tacctttagc agcgcgtgga tgagctgggt gcgccaggcg 120 ccggggaaag ggctggagtg ggtgagctat attagcagca gcgggagcag cacctattat 180 gcggatagcg tgaaagggcg ctttaccatt agccgcgata acagcaaaaa caccctgtat 240 ctgcagatga acagcctgcg cgcggaggat accgcggtgt attattgcgc gcgcgagggg 300 ctgtgggcgt ttgattggtg ggggcagggg accctggtga ccgtgaccag c 351 <210> 315 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 315 cagagcgtgc tgacccagcc gccgagcgcg agcgggaccc cggggcagcg cgtgaccatt 60 agctgcagcg ggagcagcag caacattggg gcggggtatg tggtgcattg gtatcagcag 120 ctgccgggga ccgcgccgaa actgctgatt tatgataaca accagcgccc gagcggggtg 180 ccggatcgct ttagcgggag caaaagcggg accagcgcga gcctggcgat tagcgggctg 240 cgcagcgagg atgaggcgga ttattattgc gcggcgtatg atgatagcct gagcgggccg 300 gtgtttgggg gggggaccaa actgaccgtg ctggggcag 339 <210> 316 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 316 gaggtgcagc tgctggagag cggggggggg ctggtgcagc cgggggggag cctgcgcctg 60 agctgcgcgg cgagcgggtt tacctttagc aacgcgtgga tgagctgggt gcgccaggcg 120 ccggggaaag ggctggagtg ggtgagctat attagcagca gcgggagcac catttattat 180 gcggatagcg tgaaagggcg ctttaccatt agccgcgata acagcaaaaa caccctgtat 240 ctgcagatga acagcctgcg cgcggaggat accgcggtgt attattgcgc gcgcgagggg 300 ctgtgggcgt ttgattattg ggggcagggg accctggtga ccgtgaccag c 351 <210> 317 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 317 cagagcgtgc tgacccagcc gccgagcgcg agcgggaccc cggggcagcg cgtgaccatt 60 agctgcagcg ggagcagcag caacattggg gcggggtatg tggtgcattg gtatcagcag 120 ctgccgggga ccgcgccgaa actgctgatt tatgataaca accagcgccc gagcggggtg 180 ccggatcgct ttagcgggag caaaagcggg accagcgcga gcctggcgat tagcgggctg 240 cgcagcgagg atgaggcgga ttattattgc gcggcgtatg atgatagcct gaacgggccg 300 gtgtttgggg gggggaccaa actgaccgtg ctggggcag 339 <210> 318 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 318 gaggtgcagc tgctggagag cggggggggg ctggtgcagc cgggggggag cctgcgcctg 60 agctgcgcgg cgagcgggtt tacctttagc agcgcgtgga tgagctgggt gcgccaggcg 120 ccggggaaag ggctggagtg ggtgagctat attagcagca gcgggagcag cacctattat 180 gcggatagcg tgaaagggcg ctttaccatt agccgcgata acagcaaaaa caccctgtat 240 ctgcagatga acagcctgcg cgcggaggat accgcggtgt attattgcgc gcgcgagggg 300 ctgtgggcgt ttgattattg ggggcagggg accctggtga ccgtgagcag c 351 <210> 319 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 319 gagagcgtgc tgacccagcc gccgagcgcg agcgggaccc cggggcagcg cgtgaccatt 60 agctgcagcg ggagcagcag caacattggg gcggggtatg tggtgcattg gtatcagcag 120 ctgccgggga ccgcgccgaa actgctgatt tatgataaca accagcgccc gagcggggtg 180 ccggatcgct ttagcgggag caaaagcggg accagcgcga gcctggcgat tagcgggctg 240 cgcagcgagg atgaggcgga ttattattgc gcggcgtggg atgatcgcct gaacgggccg 300 gtgtttgggg gggggaccaa actgaccgtg ctggggcag 339 <210> 320 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 320 gaggtgcagc tgctggagag cggggggggg ctggtgcagc cgggggggag cctgcgcctg 60 agctgcgcgg cgagcgggtt tacctttagc aacgcgtgga tgagctgggt gcgccaggcg 120 ccggggaaag ggctggagtg ggtgagctat attagcagca gcgggagcac catttattat 180 gcggatagcg tgaaagggcg ctttaccatt agccgcgata acagcaaaaa caccctgtat 240 ctgcagatga acagcctgcg cgcggaggat accgcggtgt attattgcgc gcgcgagggg 300 ctgtgggcgt ttgattattg ggggcagggg accctggtga ccgtgagcag c 351 <210> 321 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 321 gagagcgtgc tgacccagcc gccgagcgtg agcggggcgc cggggcagcg cgtgaccatt 60 agctgcaccg ggagcagcag caacattggg gcggggtatg tggtgcattg gtatcagcag 120 ctgccgggga ccgcgccgaa actgctgatt tatgataaca acaaacgccc gagcggggtg 180 ccggatcgct ttagcgggag caaaagcggg accagcgcga gcctggcgat tagcgggctg 240 cgcagcgagg atgaggcgga ttattattgc gcggcgtatg atgatcgcct gaacgggccg 300 gtgtttgggg gggggaccaa actgaccgtg ctggggcag 339 <210> 322 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 322 gaggtgcagc tgctggagag cggggggggg ctggtgcagc cgggggggag cctgcgcctg 60 agctgcgcgg cgagcgggtt tacctttagc agcgcgtgga tgagctgggt gcgccaggcg 120 ccggggaaag ggctggagtg ggtgagctat attagcagca gcgggagcag cacctattat 180 gcggatagcg tgaaagggcg ctttaccatt agccgcgata acagcaaaaa caccctgtat 240 ctgcagatga acagcctgcg cgcggaggat accgcggtgt attattgcgc gcgcgagggg 300 ctgtgggcgt ttgatgggtg ggggcagggg accctggtga ccgtgagcag c 351 <210> 323 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 323 cagagcgtgc tgacccagcc gccgagcgcg agcgggaccc cggggcagcg cgtgaccatt 60 agctgcagcg ggagcagcag caacattggg gcggggtatg tggtgcattg gtatcagcag 120 ctgccgggga ccgcgccgaa actgctgatt tatgataaca accagcgccc gagcggggtg 180 ccggatcgct ttagcgggag caaaagcggg accagcgcga gcctggcgat tagcgggctg 240 cgcagcgagg atgaggcgga ttattattgc gcggcgtatg atgatagcct gaaccgcccg 300 gtgtttgggg gggggaccaa actgaccgtg ctggggcag 339 <210> 324 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 324 gaggtgcagc tgctggagag cggggggggg ctggtgcagc cgggggggag cctgcgcctg 60 agctgcgcgg cgagcgggtt tacctttagc aacgcgtgga tgagctgggt gcgccaggcg 120 ccggggaaag ggctggagtg ggtgagctat attagcagca gcgggagcac catttattat 180 gcggatagcg tgaaagggcg ctttaccatt agccgcgata acagcaaaaa caccctgtat 240 ctgcagatga acagcctgcg cgcggaggat accgcggtgt attattgcgc gcgcgagggg 300 ctgtgggcgt ttgattattg ggggcagggg accctggtga ccgtgagcag c 351 <210> 325 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 325 cagagcgtgc tgacccagcc gccgagcgtg agcggggcgc cggggcagcg cgtgaccatt 60 agctgcaccg ggagcagcag caacattggg gcggggtatg tggtgcattg gtatcagcag 120 ctgccgggga ccgcgccgaa actgctgatt tatgataaca acaaacgccc gagcggggtg 180 ccggatcgct ttagcgggag caaaagcggg accagcgcga gcctggcgat tagcgggctg 240 cgcagcgagg atgaggcgga ttattattgc gcggcgtttg atgatagcct gaacgggccg 300 gtgtttgggg gggggaccaa actgaccgtg ctggggcag 339 <210> 326 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 326 gaggtgcagc tgctggagag cggggggggg ctggtgcagc cgggggggag cctgcgcctg 60 agctgcgcgg cgagcgggtt tacctttagc agcgcgtgga tgagctgggt gcgccaggcg 120 ccggggaaag ggctggagtg ggtgagctat attagcagca gcgggagcag cacctattat 180 gcggatagcg tgaaagggcg ctttaccatt agccgcgata acagcaaaaa caccctgtat 240 ctgcagatga acagcctgcg cgcggaggat accgcggtgt attattgcgc gcgcgagggg 300 ctgtgggcgt ttgataaatg ggggcagggg accctggtga ccgtgaccag c 351 <210> 327 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 327 cagagcgtgc tgacccagcc gccgagcgcg agcgggaccc cggggcagcg cgtgaccatt 60 agctgcaccg ggagcagcag caacattggg gcggggtatg tggtgcattg gtatcagcag 120 ctgccgggga ccgcgccgaa actgctgatt tatgataaca acaaacgccc gagcggggtg 180 ccggatcgct ttagcgggag caaaagcggg accagcgcga gcctggcgat tagcgggctg 240 cgcagcgagg atgaggcgga ttattattgc gcggcgtttg atgatagcct gaacgggccg 300 gtgtttgggg gggggaccaa actgaccgtg ctggggcag 339 <210> 328 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 328 gaggtgcagc tgctggagag cggggggggg ctggtgcagc cgggggggag cctgcgcctg 60 agctgcgcgg cgagcgggtt tacctttagc agcgcgtgga tgagctgggt gcgccaggcg 120 ccggggaaag ggctggagtg ggtgagctat attagcagca gcgggagcag cacctattat 180 gcggatagcg tgaaagggcg ctttaccatt agccgcgata acagcaaaaa caccctgtat 240 ctgcagatga acagcctgcg cgcggaggat accgcggtgt attattgcgc gcgcgagggg 300 ctgtgggcgt ttgataaatg ggggcagggg accctggtga ccgtgagcag c 351 <210> 329 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a <400> 329 cagagcgtgc tgacccagcc gccgagcgcg agcgggaccc cggggcagcg cgtgaccatt 60 agctgcagcg ggagcagcag caacattggg gcggggtatg tggtgcattg gtatcagcag 120 ctgccgggga ccgcgccgaa actgctgatt tatgataaca accagcgccc gagcggggtg 180 ccggatcgct ttagcgggag caaaagcggg accagcgcga gcctggcgat tagcgggctg 240 cgcagcgagg atgaggcgga ttattattgc gcggcgtttg atgatagcct gaacgggccg 300 gtgtttgggg gggggaccaa actgaccgtg ctggggcag 339 <210> 330 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 330 gaggtgcagc tgctggagag cggggggggg ctggtgcagc cgggggggag cctgcgcctg 60 agctgcgcgg cgagcgggtt tacctttagc agcgcgtgga tgagctgggt gcgccaggcg 120 ccggggaaag ggctggagtg ggtgagctat attagcagca gcgggagcag cacctattat 180 gcggatagcg tgaaagggcg ctttaccatt agccgcgata acagcaaaaa caccctgtat 240 ctgcagatga acagcctgcg cgcggaggat accgcggtgt attattgcgc gcgcgagggg 300 ctgtgggcgt ttgataaatg ggggcagggg accctggtga ccgtgagcag c 351 <210> 331 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 331 cagagcgtgc tgacccagcc gccgagcgcg agcgggaccc cggggcagcg cgtgaccatt 60 agctgcagcg ggagcagcag caacattggg gcggggtatg tggtgcattg gtatcagcag 120 ctgccgggga ccgcgccgaa actgctgatt tatgataaca accagcgccc gagcggggtg 180 ccggatcgct ttagcgggag caaaagcggg accagcgcga gcctggcgat tagcgggctg 240 cgcagcgagg atgaggcgga ttattattgc gcggcgtttg atgatcgcct gagcgggccg 300 gtgtttgggg gggggaccaa actgaccgtg ctggggcag 339 <210> 332 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 332 gaggtgcagc tgctggagag cggggggggg ctggtgcagc cgggggggag cctgcgcctg 60 agctgcgcgg cgagcgggtt tacctttagc gattatcaga tgacctggat tcgccagacc 120 ccggggaaag ggctggagtg ggtgagcggg gtgagctgga acggggcgcg cacccattat 180 gcggatagcg tgaaagggcg ctttaccatt agccgcgata acagcaaaaa caccctgtat 240 ctgcagatga acagcctgcg cgcggaggat accgcggtgt attattgcgc gaaaggggat 300 tatctggtgt atagcagcta ttattttaaa agctgggggc aggggaccct ggtgaccgtg 360 accagc 366 <210> 333 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 333 cagagcgtgc tgacccagcc gccgagcgcg agcgggaccc cggggcagcg cgtgaccatt 60 agctgcagcg ggagcagcag caacgtgggg agcaacccgg tgaactggta tcagcagctg 120 ccggggaccg cgccgaaact gctgatttat cgcaacaacc agcgcccgag cggggtgccg 180 gatcgcttta gcgggagcaa aagcgggacc agcgcgagcc tggcgattag cgggctgcgc 240 agcgaggatg aggcggatta ttattgcgcg gcgtgggatg atcgcctgaa cgggtggggg 300 tttggggggg ggaccaaact gaccgtgctg gggcag 336 <210> 334 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 334 gagcagctgc tggagagcgg gggggggctg gtgcagccgg gggggagcct gcgcctgagc 60 tgcgcggcga gcgggtttac ctttagcagc tatcagatga cctggattcg ccagaccccg 120 gggaaagggc tggagtgggt gagcgggatt agctggaacg gggggagcac ccattatgcg 180 gatagcgtga aagggcgctt taccattagc cgcgataaca gcaaaaacac cctgtatctg 240 cagatgaaca gcctgcgcgc ggaggatacc gcggtgtatt attgcgcgaa aggggattat 300 ctggtgtata gcgcgtatta ttttgatagc tgggggcagg ggaccctggt gaccgtgagc 360 agc 363 <210> 335 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 335 caggtgctga cccagccgcc gagcgcgagc gggaccccgg ggcagcgcgt gaccattagc 60 tgcagcggga gcagcagcaa cattgggagc aacccggtga actggtatca gcagctgccg 120 gggaccgcgc cgaaactgct gatttatcgc aacaaccagc gcccgagcgg ggtgccggat 180 cgctttagcg ggagcaaaag cgggaccagc gcgagcctgg cgattagcgg gctgcgcagc 240 gaggatgagg cggattatta ttgcgcggcg tgggatgatc gcctgaacgg gtgggggttt 300 ggggggggga ccaaactgac cgtgctgggg cag 333 <210> 336 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 336 gaggtgcagc tgctggagag cggggggggg ctggtgcagc cgggggggag cctgcgcctg 60 agctgcgcgg cgagcgggtt tacctttagc gattatcaga tgacctggat tcgccagacc 120 ccggggaaag ggctggagtg ggtgagcggg attagctgga acggggggag cacccattat 180 gcggatagcg tgaaagggcg ctttaccatt agccgcgata acagcaaaaa caccctgtat 240 ctgcagatga acagcctgcg cgcggaggat accgcggtgt attattgcgc gaaaggggat 300 tatctggtgt atagcagcta ttattttaaa tattgggggc aggggaccct ggtgaccgtg 360 agcagc 366 <210> 337 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 337 cagagcgtgc tgacccagcc gccgagcgcg agcgggaccc cggggcagcg cgtgaccatt 60 agctgcagcg ggagcagcag caacattggg agcaacccgg tgaactggta tcagcagctg 120 ccggggaccg cgccgaaact gctgatttat cgcaacaacc agcgcccgag cggggtgccg 180 gatcgcttta gcgggagcaa aagcgggacc agcgcgagcc tggcgattag cgggctgcgc 240 agcgaggatg aggcggatta ttattgcgcg gcgtgggatg atcgcctgaa cgggtgggcg 300 tttggggggg ggaccaaact gaccgtgctg gggcag 336 <210> 338 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 338 gaggtgcagc tgctggagag cggggggggg ctggtgcagc cgggggggag cctgcgcctg 60 agctgcgcgg cgagcgggtt tacctttagc gattatcaga tgacctggat tcgccagacc 120 ccggggaaag ggctggagtg ggtgagcggg attagctgga acggggggag cacccattat 180 gcggatagcg tgaaagggcg ctttaccatt agccgcgata acagcaaaaa caccctgtat 240 ctgcagatga acagcctgcg cgcggaggat accgcggtgt attattgcgc gaaaggggat 300 tatctggtgt atagcagcta ttattttaaa agctgggggc aggggaccct ggtgaccgtg 360 agcagc 366 <210> 339 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 339 cagagcgtgc tgacccagcc gccgagcgcg agcgggaccc cggggcagcg cgtgaccatt 60 agctgcagcg ggagcagcag caacattggg agcaacccgg tgaactggta tcagcagctg 120 ccggggaccg cgccgaaact gctgatttat cgcaacaacc agcgcccgag cggggtgccg 180 gatcgcttta gcgggagcaa aagcgggacc agcgcgagcc tggcgattag cgggctgcgc 240 agcgaggatg aggcggatta ttattgcgcg gcgtgggatg atagcctgaa cgggtggggg 300 tttggggggg ggaccaaact gaccgtgctg gggcag 336 <210> 340 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 340 gaggtgcagc tgctggagag cggggggggg ctggtgcagc cgggggggag cctgcgcctg 60 agctgcgcgg cgagcgggtt tacctttagc gattatcaga tgacctggat tcgccagacc 120 ccggggaaag ggctggagtg ggtgagcggg attagctgga acggggggag cacccattat 180 gcggatagcg tgaaagggcg ctttaccatt agccgcgata acagcaaaaa caccctgtat 240 ctgcagatga acagcctgcg cgcggaggat accgcggtgt attattgcgc gaaaggggat 300 tatctggtgt ataaaagcta ttattttaaa agctgggggc aggggaccct ggtgaccgtg 360 agcagc 366 <210> 341 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 341 cagagcgtgc tgacccagcc gccgagcgcg agcgggaccc cggggcagcg cgtgaccatt 60 agctgcagcg ggagcagcag caacattggg agcaacccgg tgaactggta tcagcagctg 120 ccggggaccg cgccgaaact gctgatttat cgcaacaacc agcgcccgag cggggtgccg 180 gatcgcttta gcgggagcaa aagcgggacc agcgcgagcc tggcgattag cgggctgcgc 240 agcgaggatg aggcggatta ttattgcgcg gcgtgggatg atcgcctgag cgggtggggg 300 tttggggggg ggaccaaact gaccgtgctg gggcag 336 <210> 342 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 342 gaggtgcagc tgctggagag cggggggggg ctggtgcagc cgggggggag cctgcgcctg 60 agctgcgcgg cgagcgggtt tacctttagc gattatcaga tgacctggat tcgccagacc 120 ccggggaaag ggctggagtg ggtgagcggg attagctgga acggggggag cacccattat 180 gcggatagcg tgaaagggcg ctttaccatt agccgcgata acagcaaaaa caccctgtat 240 ctgcagatga acagcctgcg cgcggaggat accgcggtgt attattgcgc gaaaggggat 300 tatctggtgt atagcagcta ttattttaaa agctgggggc aggggaccct ggtgaccgtg 360 agcagc 366 <210> 343 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 343 cagagcgtgc tgacccagcc gccgagcgcg agcgggaccc cggggcagcg cgtgaccatt 60 agctgcagcg ggagcagcag caacattggg agcaacccgg tgaactggta tcagcagctg 120 ccggggaccg cgccgaaact gctgatttat cgcaacaacc agcgcccgag cggggtgccg 180 gatcgcttta gcgggagcaa aagcgggacc agcgcgagcc tggcgattag cgggctgcgc 240 agcgaggatg aggcggatta ttattgcgcg gcgtgggatg atcgcctgag cgggtggggg 300 tttggggggg ggaccaaact gaccgtgctg gggcag 336 <210> 344 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 344 gaggtgcagc tgctggagag cggggggggg ctggtgcagc cgggggggag cctgcgcctg 60 agctgcgcgg cgagcgggtt tacctttagc gattatcaga tgacctggat tcgccagacc 120 ccggggaaag ggctggagtg ggtgagcggg attagctgga acggggggag cacccattat 180 gcggatagcg tgaaagggcg ctttaccatt agccgcgata acagcaaaaa caccctgtat 240 ctgcagatga acagcctgcg cgcggaggat accgcggtgt attattgcgc gaaaggggat 300 tatctggtgt ataaaagcta ttattttaaa agctgggggc aggggaccct ggtgaccgtg 360 agcagc 366 <210> 345 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C4.4a binder <400> 345 cagagcgtgc tgacccagcc gccgagcgcg agcgggaccc cggggcagcg cgtgaccatt 60 agctgcagcg ggagcagcag caacattggg agcaacccgg tgaactggta tcagcagctg 120 ccggggaccg cgccgaaact gctgatttat cgcaacaacc agcgcccgag cggggtgccg 180 gatcgcttta gcgggagcaa aagcgggacc agcgcgagcc tggcgattag cgggctgcgc 240 agcgaggatg aggcggatta ttattgcgcg gcgtgggatg atagcctgaa cgggtggggg 300 tttggggggg ggaccaaact gaccgtgctg gggcag 336

Claims (28)

  1. 가변 중쇄 CDR 서열로서, 서열 45를 포함하는 H-CDR1, 서열 46을 포함하는 H-CDR2, 및 서열 47을 포함하는 H-CDR3를 포함하고,
    가변 경쇄 CDR 서열로서, 서열 48을 포함하는 L-CDR1, 서열 49를 포함하는 L-CDR2, 및 서열 50을 포함하는 L-CDR3를 포함하며,
    서열 1의 아미노산 1 내지 85에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  2. 제1항에 있어서,
    서열 33으로 표시되는 바와 같은 가변 중쇄 서열 및 서열 29로 표시되는 바와 같은 가변 경쇄 서열, 또는
    서열 51로 표시되는 바와 같은 가변 중쇄 서열 및 서열 52로 표시되는 바와 같은 가변 경쇄 서열
    을 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, IgG 항체인 항체.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, scFv, Fab, Fab' 단편 또는 F(ab')2 단편인 항원-결합 단편.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 모노클로날 항체 또는 항원-결합 단편인 항체 또는 항원-결합 단편.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 인간, 인간화 또는 키메라 항체 또는 항원-결합 단편인 항체 또는 항원-결합 단편.
  7. 제1항 또는 제2항에 따른 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 항체-약물 접합체.
  8. 제1항 또는 제2항에 따른 항체 또는 항원-결합 단편을 코딩하는 단리된 핵산.
  9. 제8항에 따른 핵산을 포함하는 벡터.
  10. 제1항 또는 제2항에 따른 항체 또는 항원-결합 단편을 발현하고/하거나 제1항 또는 제2항에 따른 항체 또는 항원-결합 단편을 코딩하는 핵산 또는 제1항 또는 제2항에 따른 항체 또는 항원-결합 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 포함하는 단리된 세포.
  11. 제10항에 있어서, 원핵 또는 진핵 세포인 단리된 세포.
  12. 제1항 또는 제2항에 따른 항체 또는 항원-결합 단편을 발현하고/하거나 제1항 또는 제2항에 따른 항체 또는 항원-결합 단편을 코딩하는 핵산 또는 제1항 또는 제2항에 따른 항체 또는 항원-결합 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 포함하는 원핵 또는 진핵 세포의 배양, 및 항체 또는 항원-결합 단편의 정제를 포함하는, 제1항 또는 제2항에 따른 항체 또는 항원-결합 단편의 생산 방법.
  13. 제1항 또는 제2항에 따른 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하는 암 진단용 제제.
  14. 제1항 또는 제2항에 따른 항체 또는 항원-결합 단편 또는 제1항 또는 제2항에 따른 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하는 항체-약물 접합체를 포함하는, 암 치료용 약제로서 사용하기 위한 제약 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 하나 이상의 치료 활성 화합물을 추가로 포함하는 제약 조성물.
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 삭제
  26. 삭제
  27. 삭제
  28. 삭제
KR1020127017608A 2009-12-09 2010-12-08 항―ｃ４.４ａ 항체 및 그의 용도 KR101931820B1 (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP09178474.4 2009-12-09
EP09178474 2009-12-09
EP10170797 2010-07-26
EP10170797.4 2010-07-26
PCT/EP2010/069216 WO2011070088A1 (en) 2009-12-09 2010-12-08 Anti-c4.4a antibodies and uses thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20120116958A KR20120116958A (ko) 2012-10-23
KR101931820B1 true KR101931820B1 (ko) 2018-12-21

Family

ID=43629588

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020127017608A KR101931820B1 (ko) 2009-12-09 2010-12-08 항―ｃ４.４ａ 항체 및 그의 용도

Country Status (28)

Country Link
US (2) US20120321619A1 (ko)
EP (2) EP2510012B1 (ko)
JP (3) JP5989544B2 (ko)
KR (1) KR101931820B1 (ko)
CN (1) CN102812047B (ko)
AR (1) AR079340A1 (ko)
AU (1) AU2010329904B2 (ko)
BR (1) BR112012013915A8 (ko)
CA (1) CA2783338A1 (ko)
CY (1) CY1119051T1 (ko)
DK (1) DK2510012T3 (ko)
ES (1) ES2632748T3 (ko)
HK (1) HK1178920A1 (ko)
HR (1) HRP20170973T1 (ko)
HU (1) HUE034847T2 (ko)
IL (1) IL219801A (ko)
IN (1) IN2012DN05175A (ko)
LT (1) LT2510012T (ko)
MX (1) MX2012006593A (ko)
NZ (1) NZ600470A (ko)
PL (1) PL2510012T3 (ko)
PT (1) PT2510012T (ko)
RS (1) RS56161B1 (ko)
RU (1) RU2577977C2 (ko)
SI (1) SI2510012T1 (ko)
TW (1) TWI488642B (ko)
WO (1) WO2011070088A1 (ko)
ZA (1) ZA201203498B (ko)

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5881604B2 (ja) * 2010-06-15 2016-03-09 国立大学法人大阪大学 癌予後判定可能な抗体、および癌予後判定方法
CN103826661B (zh) * 2011-04-21 2019-03-05 西雅图基因公司 新的结合剂-药物缀合物(adc)及其用途
JP2014117191A (ja) * 2012-12-13 2014-06-30 Fisheries Research Agency リン酸化中性スフィンゴミエリナーゼ１、抗リン酸化中性スフィンゴミエリナーゼ１抗体、中性スフィンゴミエリナーゼ１変異体、及びそれらの用途
CN107074940A (zh) * 2014-09-09 2017-08-18 德州大学系统董事会 针对agr2和其受体c4.4a的阻断性单克隆抗体
JP6720208B2 (ja) 2015-04-17 2020-07-08 スプリング バイオサイエンス コーポレーション Ｃ４．４ａを検出するための抗体、組成物、及び免疫組織化学法
BR112018011270A2 (pt) * 2015-12-04 2018-11-21 Univ California anticorpo isolado, composição farmacêutica, e, métodos para tratamento ou redução da taxa de recorrência de um câncer em um paciente e para detecção de células tronco do câncer.
WO2017156280A1 (en) * 2016-03-09 2017-09-14 Viba Therapeutics, Inc. Methods of treating cancer using monoclonal antibodies to agr2 and c4.4a
JP7305543B2 (ja) 2017-01-26 2023-07-10 スロゼン オペレーティング， インコーポレイテッド 組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子およびその使用
JP7052389B2 (ja) * 2018-02-07 2022-04-12 株式会社三洋物産 遊技機
CN112955466A (zh) * 2018-07-20 2021-06-11 杜克大学 用于癌症治疗的抗lypd3 car t细胞疗法
KR20210091734A (ko) * 2018-11-08 2021-07-22 고쿠리츠다이가쿠호우징 카가와다이가쿠 희소당 함유 조성물의 제조 방법 및 희소당 함유 조성물
CN111349164B (zh) * 2018-12-21 2023-05-26 艾比玛特医药科技（上海）有限公司 糖基磷脂酰肌醇锚定糖蛋白（c4.4a）的单克隆抗体及其应用
AU2020298326A1 (en) * 2019-06-21 2022-01-27 Children's National Medical Center Methods and composition for a binding molecule targeting cancer cells expressing SSX2 peptide 41-49 in HLA-A*0201 context
WO2023175117A1 (en) 2022-03-16 2023-09-21 Glycotope Gmbh Antibodies against lypd3
WO2023240135A2 (en) 2022-06-07 2023-12-14 Actinium Pharmaceuticals, Inc. Bifunctional chelators and conjugates

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001023553A2 (en) * 1999-09-29 2001-04-05 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Metastasis-associated antigen c4.4a

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4657760A (en) 1979-03-20 1987-04-14 Ortho Pharmaceutical Corporation Methods and compositions using monoclonal antibody to human T cells
US5179017A (en) 1980-02-25 1993-01-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4634665A (en) 1980-02-25 1987-01-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4510245A (en) 1982-11-18 1985-04-09 Chiron Corporation Adenovirus promoter system
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US5168062A (en) 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
US5206344A (en) 1985-06-26 1993-04-27 Cetus Oncology Corporation Interleukin-2 muteins and polymer conjugation thereof
US4968615A (en) 1985-12-18 1990-11-06 Ciba-Geigy Corporation Deoxyribonucleic acid segment from a virus
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
US5225212A (en) 1989-10-20 1993-07-06 Liposome Technology, Inc. Microreservoir liposome composition and method
LU91067I2 (fr) 1991-06-14 2004-04-02 Genentech Inc Trastuzumab et ses variantes et dérivés immuno chimiques y compris les immotoxines
EP0859841B1 (en) 1995-08-18 2002-06-19 MorphoSys AG Protein/(poly)peptide libraries
DE69710911T2 (de) * 1996-05-31 2002-09-19 Health Research Inc Monoklonale Antikörper gegen Endoglin und ihre Verwendung in der anti-Angiogenese-Therapie
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
JP2002510481A (ja) 1998-04-02 2002-04-09 ジェネンテック・インコーポレーテッド 抗体変異体及びその断片
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
CA2450793A1 (en) * 2001-06-20 2002-12-27 Prochon Biotech Ltd. Antibodies that block receptor protein tyrosine kinase activation, methods of screening for and uses thereof
KR20120064120A (ko) * 2004-06-01 2012-06-18 제넨테크, 인크. 항체 약물 접합체 및 방법
PL2117571T3 (pl) * 2006-12-08 2017-08-31 Monopar Therapeutics Inc. Epitop receptora aktywatora plazminogenu typu urokinazy
CN103826661B (zh) * 2011-04-21 2019-03-05 西雅图基因公司 新的结合剂-药物缀合物(adc)及其用途

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001023553A2 (en) * 1999-09-29 2001-04-05 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Metastasis-associated antigen c4.4a

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Biochem. J., Vol. 380, pp. 845-857 (2004.03.10.)
Lung Cancer, Vol. 58, pp. 260-266 (2007.)
Thrombosis and Haemostasis, Vol. 93, No. 4, pp. A33 (2005.04.09.)*

Also Published As

Publication number Publication date
TW201134485A (en) 2011-10-16
PL2510012T3 (pl) 2017-09-29
JP5989544B2 (ja) 2016-09-07
WO2011070088A1 (en) 2011-06-16
US20120321619A1 (en) 2012-12-20
KR20120116958A (ko) 2012-10-23
IN2012DN05175A (ko) 2015-10-23
RS56161B1 (sr) 2017-11-30
AU2010329904A1 (en) 2012-06-14
RU2577977C2 (ru) 2016-03-20
JP6240696B2 (ja) 2017-11-29
CA2783338A1 (en) 2011-06-16
JP2013513369A (ja) 2013-04-22
LT2510012T (lt) 2017-07-25
AR079340A1 (es) 2012-01-18
CN102812047B (zh) 2015-08-26
PT2510012T (pt) 2017-07-13
HK1178920A1 (en) 2013-09-19
CN102812047A (zh) 2012-12-05
JP2016104820A (ja) 2016-06-09
US20170158775A1 (en) 2017-06-08
DK2510012T3 (en) 2017-07-31
HUE034847T2 (en) 2018-03-28
CY1119051T1 (el) 2018-01-10
IL219801A (en) 2016-08-31
EP3144323A2 (en) 2017-03-22
SI2510012T1 (sl) 2017-08-31
AU2010329904B2 (en) 2015-07-09
JP2018019721A (ja) 2018-02-08
ES2632748T3 (es) 2017-09-15
IL219801A0 (en) 2012-07-31
EP2510012A1 (en) 2012-10-17
TWI488642B (zh) 2015-06-21
BR112012013915A8 (pt) 2017-12-26
EP2510012B1 (en) 2017-04-19
EP3144323A3 (en) 2017-05-31
RU2012128343A (ru) 2014-01-20
BR112012013915A2 (pt) 2017-01-10
HRP20170973T1 (hr) 2017-09-22
MX2012006593A (es) 2012-06-28
NZ600470A (en) 2015-02-27
ZA201203498B (en) 2015-10-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101931820B1 (ko) 항―ｃ４.４ａ 항체 및 그의 용도
CN107743495B (zh) 抗ceacam6抗体及其用途
US20180258181A1 (en) Anti-mesothelin antibodies and uses thereof
KR20140102698A (ko) 항-fgfr2 항체 및 그의 용도
BR112021005585A2 (pt) proteínas de ligação a sirpa e métodos de uso das mesmas
JP2016521715A (ja) 抗ｔｗｅａｋｒ抗体およびその使用
WO2015189143A1 (en) Aglycosyl anti-tweakr antibodies and uses thereof
JP7419238B2 (ja) Ｐｄ１結合剤
AU2017219386B2 (en) Antibody against EGFRvIII and use thereof
NZ624534B2 (en) Anti-fgfr2 antibodies and uses thereof

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant