JP2016104820A - 抗C4.4a抗体およびその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
抗体ベースの治療法は、固形腫瘍を含むさまざまながんの処置に極めて有効であることが判明しつつある。例えば、ハーセプチン(HERCEPTIN)(登録商標)は乳がんの処置に使用されて成功を収めており、リツキサン(RITUXAN)(登録商標)はB細胞関連がんタイプに有効である。奏効する抗体ベースの治療法の開発において中核を成すのは、腫瘍細胞上に優先的に発現することがわかった細胞表面タンパク質に対する抗体の単離である。C4.4a(遺伝子名:LYPD3)ポリペプチドは、グリコホスファチジルイノシトール(glycophosphatidylinositol)(GPI)固定型高グリコシル化細胞表面タンパク質である。ラットC4.4aは、最初は、転移性ラット膵腫瘍細胞における転移関連細胞表面タンパク質として記載された(Roesel M.ら, Oncogene 1998,17(15):1989-2002)。ヒトC4.4aは胎盤cDNAライブラリーからクローニングされた(Wuerfel, J.ら Gene 2001,262:35-41)。C4.4aはuPAR受容体に対して構造ホモロジーを示し、2つのLY6ドメインを含有して、典型的なスリーフィンガー(three finger)タンパク質フォールディングを呈する(Jacobsen B.およびPloug M., Current Medicinal Chemistry 2008,15:2559-2573)。このタンパク質は高度にグリコシル化されており、6個の予想Nグリコシル化部位と数個のOグリコシル化部位とを含有している。さらにまた、C4.4aは、2つのLy6ドメイン中に位置する合計9個のジスルフィド橋を含有している(Hansen L.ら, Biochem J. 2004, 380:845-857)。C4.4aは、肺がん、直腸結腸がん、乳がん、子宮頸がん、膵がん、腎がん、頭頚部がんおよびメラノーマのような腫瘍細胞において、強い発現を示す。ノーザンブロット分析により、原発性肺腫瘍の約50%および肺腫瘍転移の約75%におけるC4.4a発現が実証されたが、非罹患肺組織における発現は検出できなかった(Wuerfel J.ら, Gene 2001, 262:35-41)。非小細胞肺がんでは、C4.4aを予後マーカーとして使用することができる。ここでは、高いC4.4a発現が予後不良と相関することを、臨床データが明確に示している(Hansen L.ら, Lung Cancer 2007, 58:260-266)。メラノーマでは、詳細な発現分析により、C4.4aはメラノサイトおよび母斑では発現しないが、原発性悪性メラノーマの約60%ならびにリンパ節および皮膚転移の100%で発現することが明らかになった(Seiter S.ら, J Invest Dermatol. 2001, 116(2):344-347)。さらにまた、C4.4a遺伝子発現のアップレギュレーションが、対応する隣接正常乳房組織と比較した乳がん組織(Fletcher G.C., Br. J. Cancer 2003, 88(4):579-585)、さまざまな乳がん細胞株、および正常尿路上皮と比較した尿路上皮がん(Smith B. A.ら, Cancer Res 2001, 61(4):1678-1685)に見いだされた。直腸結腸がん、膵がん、乳がんおよび前立腺がんのさまざまな腫瘍細胞株において、ポリクローナル抗体を使ったFACSにより、C4.4a発現が実証された。直腸結腸がん、膵がんおよび乳がん試料のIHC研究では、ヒト腫瘍細胞株上でのC4.4aの可変的なグリコシル化が、これらの抗体の結合を妨害する。それゆえに、これらのポリクローナル抗体の結合を可能にするには、C4.4aを少なくとも部分的に脱グリコシル化する必要がある。直腸結腸がん患者ではC4.4a発現が著しく優勢であり、C4.4aは細胞表面から脱落することで、予後血清腫瘍マーカーになる。浸潤先端部(invasive front)におけるC4.4aの発現は、直腸結腸がんの疾患再発に関する新規予後マーカーである(K. Konishiら, Cancer Science 2010)。可溶性血清C4.4aに対する診断用抗体は記述されていない(Paret C.ら, British Journal of Cancer 2007, 97:1146-1156)。正常組織では、C4.4a発現が皮膚ケラチノサイト、食道内皮細胞および胎盤細胞に限定されていることが(Wuerfel J.ら, Gene 2001, 262:35-41)、これを、腫瘍治療法の理想的なターゲットにしている。WO01/23553は、C4.4a発現またはC4.4a活性を減少させまたは阻害するC4.4a阻害剤(例えば抗C4.4a抗体)を、がんの処置に使用することを提案している。
C4.aの正確な機能は分かっていないが、創傷治癒において遊走ケラチノサイトではアップレギュレートされる(Hansen L.ら, Biochem J. 2004, 380:845-857)。転移との関連およびuPARとの構造ホモロジーを考慮して、この分子は腫瘍細胞浸潤に、おそらくは細胞外マトリックスとの相互作用を介して、関与すると提案されている(Roesel M.ら, Oncogene 1998, 17(15):1989-2002;Paret C.ら, British Journal of Cancer 2007, 97:1146-1156)。潜在的リガンドは、ラミニン1および5、ガレクチン3(Paret C., Int. J. Cancer 2005, 115:724-733)、ならびにagr2およびagr3(Fletcher GC., Brit. J. Cancer 2003, 88:579-585)である。
本発明の目的は、GPIで細胞表面に固定されているC4.4aポリペプチドに対して、またはGPI部分の除去により患者の血清中で可溶性であるC4.4aポリペプチドに対して、高度に選択的な抗体もしくはその抗原結合性抗体フラグメントまたはその変異体であって、肺、結腸、乳房、子宮頸部、膵臓、腎臓、頭頸部のがんまたはメラノーマなどの疾患状態と関連するC4.4a発現を検出するための方法に使用するか、そのような疾患状態の処置に使用することができるものを提供することである。これらの目的を達成するために、C4.4a発現がん細胞株によって提示され、かつ/またはこれらの抗体によって高いアフィニティで結合される、異なる形態の、278アミノ酸の成熟ヒトC4.4aポリペプチド(配列番号1)中に存在するC4.4aエピトープに特異的に結合する、単離されたヒト抗体、ヒト化抗体もしくはキメラ抗体、またはその抗原結合性抗体フラグメントを提供することが、本発明の目的である。本明細書にいう異なる「形態」のC4.4aには、異なるグリコフォーム、異なるアイソフォーム、または異なる翻訳時修飾および翻訳後修飾を受けたC4.4aポリペプチドが含まれるが、これらに限るわけではない。本発明のもう一つの目的は、ヒトへの投与に関して安全である、抗体もしくはその抗原結合性抗体フラグメントまたはその変異体を提供することである。
本発明は、C4.4aに対して特異的であるかまたは高いアフィニティを有し、対照に治療的利益(therapeutic benefit)を送達することができる、新規抗体の発見に基づく。本発明の抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体であることができ、本明細書にさらに詳しく説明する多くの状況において使用することができる。
「ヒト」抗体またはその抗原結合性フラグメントとは、ここでは、キメラ抗体ではなく(例えば「ヒト化」抗体ではなく)、非ヒト種に(全部または一部が)由来する抗体でもないものと定義される。ヒト抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ヒトから得ることができるか、または合成ヒト抗体であることができる。「合成ヒト抗体」とは、ここでは、既知のヒト抗体配列の解析に基づく合成配列からインシリコ(in silico)で全部または一部が導き出された配列を有する抗体と定義される。ヒト抗体配列またはそのフラグメントのインシリコ設計は、例えばヒト抗体配列または抗体フラグメント配列のデータベースを解析し、そこから得られたデータを利用してポリペプチド配列を考案することなどによって、達成することができる。ヒト抗体またはその抗原結合性フラグメントの一例は、ヒト起源の抗体配列のライブラリーから単離された核酸によってコードされるものである(すなわち前述のライブラリーはヒト天然供給源から採取された抗体に基づく)。ヒト抗体の例には、Soederlinら, Nature Biotech. 2000, 18:852-856に記載されている抗体が含まれる。
本発明は、抗C4.4a抗体を提供することによってC4.4a陽性がん細胞の成長および新生物疾患の進行を阻害するための方法に関する。29kDaのヒトC4.4aポリペプチド(配列番号1またはそのフラグメント)に特異的に結合する抗体、その抗原結合性抗体フラグメント、ならびに抗体およびフラグメントの変異体が提供される。好ましい一実施形態では、抗体、その抗原結合性フラグメント、または変異体が、C4.4aポリペプチドの細胞外ドメインS1に特異的に結合する。C4.4aポリペプチドを、本明細書においては、「C4.4a」という。
完全ヒトN-CoDeR抗体ファージディスプレイライブラリーを使って、全細胞パンニングとタンパク質パンニングの組み合わせにより、そしてまた特別なツールを開発することによって、高アフィニティC4.4a特異的ヒトモノクローナル抗体を単離した。これらのツールおよび方法には、ヒトC4.4a発現組換え細胞株、マウスC4.4a発現細胞株、組換えヒトおよびマウスC4.4a、ならびに細胞表面にディスプレイされたC4.4aに優先的に結合しマウスC4.4aに対して交差反応性である抗体を同定することができるパンニング手法およびスクリーニングアッセイの開発が含まれる。
本発明の抗体または抗原結合性フラグメントは、ここに提供する具体的ペプチド配列に限定されない。むしろ本発明は、これらのポリペプチドの変異体も包含する。本開示ならびに従来から利用できる技術および参考文献を参照して、当業者は、本明細書に開示する抗体の機能的変異体を製造し、試験し、利用することができると共に、C4.4aに結合する能力を有する変異体が本発明の範囲に包含されることを理解するであろう。
[表3]VL配列
本明細書に記載する抗体ペプチド配列の全体的分子構造を保存しているポリペプチド変異体を作製することができる。個々のアミノ酸の性質を考えれば、当業者には、いくつかの合理的な置換がわかるであろう。アミノ酸置換、すなわち「保存的置換」は、例えば、関与する残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および/または両親媒性の類似性に基づいて行うことができる。
本発明は、本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントをコードするDNA分子にも関係する。これらの配列には、配列番号37〜44、53、54、63、64、73、74、83、84、93、94、103、104、113、114、123、124、133、134、143、144および308〜345に示すDNA分子が含まれるが、これらに限るわけではない。
a.Tm=69.3+0.41(G+C)%
b.二重鎖DNAのTmは、ミスマッチ塩基対の数が1%増加するごとに1℃低下する。
c.(Tm)μ2 −(Tm)μ1=18.5log10μ2/μ1
式中、μ1およびμ2は2つの溶液のイオン強度である。
本発明の範囲に包含されるさらにもう一種類のDNA変異体は、それらがコードする産物を参照して記述することができる。これらの機能的に等価なポリヌクレオチドは、遺伝暗号の縮重ゆえに、配列番号5〜36、45〜50、55〜60、65〜70、75〜80、85〜90、95〜100、105〜110、115〜120、125〜130、135〜140に見いだされるものと同じペプチド配列をコードするという事実を特徴とする。
本発明はさらに、本発明のヌクレオチド配列の1つ以上を含む組換えDNAコンストラクトを提供する。本発明の組換えコンストラクトは、プラスミド、ファージミド、ファージまたはウイルスベクターなどのベクターと共に使用され、そこに本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントをコードするDNA分子が挿入される。
細菌での使用に役立つ発現ベクターは、所望のタンパク質をコードする構造DNA配列を、適切な翻訳開始シグナルおよび翻訳終結シグナルと共に、機能的プロモーターに対して作動可能な読み枠(reading phase)で挿入することによって構築される。ベクターは、ベクターの維持が保証されるように、また所望であれば、宿主内での増幅がもたらされるように、1つ以上の表現型選択可能マーカーと複製起点とを含むであろう。形質転換に適した原核宿主には、大腸菌(E. coli)、枯草菌(Bacillus subtilis)、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)、およびシュードモナス(Pseudomonas)属、ストレプトミセス(Streptomyces)属、およびスタフィロコッカス(Staphylococcus)属のさまざまな種が含まれる。
哺乳動物宿主細胞発現のための好ましい調節配列には、哺乳動物細胞における高レベルのタンパク質発現を指示するウイルス要素、例えば、サイトメガロウイルス(CMV)(CMVプロモーター/エンハンサーなど)、シミアンウイルス40(SV40)(SV40プロモーター/エンハンサーなど)、アデノウイルス(例えばアデノウイルス主要後期プロモーター(AdMLP))およびポリオーマに由来するプロモーターおよび/またはエンハンサーなどが含まれる。ウイルス調節要素のさらなる説明およびその配列については、例えばStinskiによるU.S.5,168,062、BellらによるU.S.4,510,245、およびSchaffnerらによるU.S.4,968,615を参照されたい。組換え発現ベクターは複製起点および選択可能マーカーも含むことができる(例えばAxelらによるU.S.4,399,216、4,634,665およびU.S.5,179,017を参照されたい)。適切な選択可能マーカーには、そのベクターが導入されている宿主細胞にG418、ハイグロマイシンまたはメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を付与する遺伝子が含まれる。例えばジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)遺伝子は、メトトレキサートに対する耐性を付与し、neo遺伝子はG418に対する耐性を付与する。
治療法は、本発明によって考慮される抗体またはその抗原結合性フラグメントの治療有効量を、処置を必要とする対象に投与することを伴う。「治療有効」量とは、ここでは、単回投与として、または複数回投与レジメンに従って、単独で、または他の薬剤との組み合わせで、対象の処置区域におけるC4.4a陽性細胞を枯渇させるのに十分な量であって、有害な状態の軽減につながるが、毒物学的には認容できるような、抗体または抗原結合性フラグメントの量と定義される。対象は、ヒトまたは非ヒト動物(例えばウサギ、ラット、マウス、イヌ、サルまたは他の下等霊長類)であることができる。
C4.4a抗体またはその抗原結合性フラグメントは、C4.4a発現腫瘍の存在を検出するために使用することができる。血清および組織生検標本を含むさまざまな生物学的試料におけるC4.4a含有細胞または脱落C4.4aの存在は、C4.4a抗体を使って検出することができる。また、C4.4a抗体は、99Tc(または他の同位体)コンジュゲート抗体を使った免疫シンチグラフィなど、さまざまなイメージング方法に使用することができる。例えば、111Inコンジュゲート抗PSMA抗体を使って最近記述されたものに似たイメージングプロトコールを使って、膵臓癌または卵巣がんを検出することができる(Sodeeら, Clin. Nuc. Med. 21: 759-766, 1997)。使用することができるもう一つの検出方法は、本発明の抗体を適切な同位体にコンジュゲートすることによる陽電子放出断層撮影である(Herzogら, J. Nucl. Med. 34:2222-2226, 1993参照)。
本発明の一実施形態は、C4.4a抗体またはその抗原結合性フラグメントを単独で含むか、安定化化合物などといった少なくとも1つの他の薬剤と組み合わせて含む医薬組成物であって、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、および水などといった(ただしこれらに限るわけではない)任意の滅菌生体適合性医薬担体に入れて投与することができる医薬組成物である。さらなる一実施形態は、C4.4a結合抗体またはその抗原結合性フラグメントと、がんなどのC4.4a関連疾患を処置するのに適したさらにもう一つの医薬活性化合物とを含む医薬組成物である。これらの分子はいずれも、患者に単独で、または他の薬剤、薬物もしくはホルモンと組み合わせて、医薬組成物として投与することができ、医薬組成物では、賦形剤または医薬上許容される担体と混合される。本発明の一実施形態では、医薬上許容される担体は医薬的に不活性である。
本発明はさらに、上述した本発明組成物の成分の1つ以上が充填された1つ以上の容器を含む医薬パックおよびキットに関する。そのような容器には、医薬または生物学的製剤の製造、使用または販売を規制する政府当局によって指示された形式で、当局によるヒト投与用製品の製造、使用または販売の認可を反映した告知書(notice)を、添付することができる。
本発明の医薬組成物は、当技術分野においてよく知られている方法で、例えば従来の混合、溶解、造粒、糖衣形成(dragee-making)、研和(levigating)、乳化、カプセル化、捕捉(entrapping)または凍結乾燥プロセスなどによって、製造することができる。
本発明における使用に適した医薬組成物には、その活性成分が、意図する目的、すなわちC4.4a発現を特徴とする特定の疾患状態の処置を達成するのに有効な量で含有されている組成物が含まれる。有効量の決定は、当業者の能力の範囲で十分に可能である。
b)抗体またはその抗原結合性フラグメントが、配列番号302(CDR H1)、配列番号303(CDR H2)および配列番号304(CDR H3)に準拠する重鎖CDR配列と、配列番号305(CDR L1)、配列番号306(CDR L2)および配列番号307(CDR L3)に準拠する軽鎖CDR配列とを含む、
実施形態D〜Gのいずれか一つによる抗体または抗原結合性フラグメント。
i.修飾されたCDR-H1では、位置3のアミノ酸が、NおよびSからなる群より選択され、位置4のアミノ酸が、AおよびYからなる群より選択され;
ii.修飾されたCDR-H2では、位置10のアミノ酸が、TおよびSからなる群より選択され、位置11のアミノ酸が、IおよびTからなる群より選択され;
iii.修飾されたCDR-H3では、位置10のアミノ酸が、Y、K、G、WおよびNからなる群より選択され;
iv.修飾されたCDR-L1では、位置1のアミノ酸が、TおよびSからなる群より選択され;
v.修飾されたCDR-L2では、位置4のアミノ酸が、QおよびKからなる群より選択され;
vi.修飾されたCDR-L3では、位置4のアミノ酸が、W、E、FおよびYからなる群より選択され、位置7のアミノ酸が、R、SおよびMからなる群より選択され、位置9のアミノ酸が、N、KおよびSからなる群より選択され、位置10のアミノ酸が、GおよびRからなる群より選択され、位置11のアミノ酸が、PおよびAからなる群より選択される、
実施形態D〜Hのいずれか一つによる抗体または抗原結合性フラグメント。
i.修飾されたCDR-H1では、位置3のアミノ酸が、DおよびSからなる群より選択され;
ii.修飾されたCDR-H2では、位置4のアミノ酸が、VおよびIからなる群より選択され、位置9のアミノ酸が、AおよびGからなる群より選択され、位置10のアミノ酸が、RおよびSからなる群より選択され;
iii.修飾されたCDR-H3では、位置9のアミノ酸が、S、KおよびRからなる群より選択され、位置10のアミノ酸が、A、SおよびRからなる群より選択され、位置14のアミノ酸が、D、K、EおよびRからなる群より選択され、位置15のアミノ酸が、SおよびYからなる群より選択され;
iv.修飾されたCDR-L1では、位置7のアミノ酸が、VおよびIからなる群より選択され;
v.修飾されたCDR-L3では、位置3のアミノ酸が、A、QおよびRからなる群より選択され、位置5のアミノ酸が、DおよびGからなる群より選択され、位置7のアミノ酸が、RおよびSからなる群より選択され、位置9のアミノ酸が、N、WおよびSからなる群より選択され、位置12のアミノ酸が、V、AおよびGからなる群より選択される、
実施形態D〜Hのいずれか一つによる抗体または抗原結合性フラグメント。
配列番号5、9および13によって表される可変重鎖CDR配列および配列番号17、21および25によって表される可変軽鎖CDR配列、または
配列番号6、10および14によって表される可変重鎖CDR配列および配列番号18、22および26によって表される可変軽鎖CDR配列、または
配列番号7、11および15によって表される可変重鎖CDR配列および配列番号19、23および27によって表される可変軽鎖CDR配列、または
配列番号8、12および16によって表される可変重鎖CDR配列および配列番号20、24および28によって表される可変軽鎖CDR配列、または
配列番号45〜47によって表される可変重鎖CDR配列および配列番号48〜50によって表される可変軽鎖CDR配列、または
配列番号55〜57によって表される可変重鎖CDR配列および配列番号58〜60によって表される可変軽鎖CDR配列、または
配列番号65〜67によって表される可変重鎖CDR配列および配列番号68〜70によって表される可変軽鎖CDR配列、または
配列番号85〜87によって表される可変重鎖CDR配列および配列番号88〜90によって表される可変軽鎖CDR配列、または
配列番号95〜97によって表される可変重鎖CDR配列および配列番号98〜100によって表される可変軽鎖CDR配列、または
配列番号105〜107によって表される可変重鎖CDR配列および配列番号108〜110によって表される可変軽鎖CDR配列、または
配列番号115〜117によって表される可変重鎖CDR配列および配列番号118〜120によって表される可変軽鎖CDR配列、または
配列番号125〜127によって表される可変重鎖CDR配列および配列番号128〜130によって表される可変軽鎖CDR配列、または
配列番号135〜137によって表される可変重鎖CDR配列および配列番号138〜140によって表される可変軽鎖CDR配列、
を含む、前記実施形態のいずれか一つによる抗体または抗原結合性フラグメント。
配列番号33によって表される可変重鎖配列および配列番号29によって表される可変軽鎖配列、または
配列番号34によって表される可変重鎖配列および配列番号30によって表される可変軽鎖配列、または
配列番号35によって表される可変重鎖配列および配列番号31によって表される可変軽鎖配列、または
配列番号36によって表される可変重鎖配列および配列番号32によって表される可変軽鎖配列、または
配列番号51によって表される可変重鎖配列および配列番号52によって表される可変軽鎖配列、または
配列番号61によって表される可変重鎖配列および配列番号62によって表される可変軽鎖配列、または
配列番号71によって表される可変重鎖配列および配列番号72によって表される可変軽鎖配列、または
配列番号91によって表される可変重鎖配列および配列番号92によって表される可変軽鎖配列、または
配列番号101によって表される可変重鎖配列および配列番号102によって表される可変軽鎖配列、または
配列番号111によって表される可変重鎖配列および配列番号112によって表される可変軽鎖配列、または
配列番号121によって表される可変重鎖配列および配列番号122によって表される可変軽鎖配列、または
配列番号131によって表される可変重鎖配列および配列番号132によって表される可変軽鎖配列、または
配列番号141によって表される可変重鎖配列および配列番号142によって表される可変軽鎖配列、
を含む、前記実施形態のいずれか一つによる抗体または抗原結合性フラグメント。
C4.4aに対するヒト抗体の単離は、BioInvent International AB(スウェーデン・ルンド)のナイーブ抗体ライブラリーn-CoDeRを使用するファージディスプレイ技術(Soederlingら, Nature Biotech. 2000, 18:853-856に記載されている)により、細胞選択アプローチで行った。n-CoDeRは、6つのCDR全てが多様化されているFabライブラリーである。CDR配列は、まず最初に、健常ヒトドナーから得られた。
ファージELISA:
異なる選択ラウンドから選択されたファージを、ファージELISAを使って、特異性について分析した。簡単に述べると、ファージ発現は、10μlの終夜培養物(100μg/mlアンピシリンおよび15μg/mlテトラサイクリンを補足したLB培地中)を、100μlの新鮮培地(100μg/mlアンピシリン、15μg/mlテトラサイクリンおよび0.1%グルコースを補足したLB培地)に加え、96ウェルMTP中、250rpm、37℃で、OD600が0.5に達するまで振とうすることによって行った。次に、ヘルパーファージM13KO7(Invitrogen)を加え、試料を振とうせずに37℃でさらに15分間インキュベートした。IPTG(最終濃度0.25mM)を加えた後、細胞を、200rpmで振とうしながら、30℃で16時間インキュベートした。
可溶性Fab(sFab)を生成させるために、第2および第3選択ラウンドからのファージミドDNAを単離し、gene III産物を取り出すために、制限酵素EagIおよびEcoRIにより、供給者の説明書に従って消化した。得られたフラグメントを再ライゲーションし、コンストラクトを、ケミカリーコンピテント大腸菌Top10に、標準的方法を使って形質転換した。全部で約1500個のクローンを拾って、LB培地(100μg/ml、0.1%グルコース)が入っている96ウェルプレートに移し、250rpm、37℃で、OD600が0.5に達するまで振とうした。その後、IPTG(最終濃度0.5mM)の添加によって、sFab産生を誘導し、200rpmで振とうしながらインキュベーションを30℃で16時間続けた。翌朝、BELバッファーを各ウェルに加え(24.7g/lホウ酸;18.7g/l NaCl;1.49g/l EDTA pH8.0;2.5mg/mlリゾチーム(Roche))、50μlの処理済み培養物を、ELISAにおいてターゲットに結合するsFabについて、検出をHRPにカップリングした抗hIgG(Fab特異的)(Sigma;製品番号A0293)で行った点以外は基本的にはファージについて述べたようにして、分析した。
ターゲット細胞へのsFabの細胞結合をBDのFACSarrayで分析した。簡単に述べると、50μlの細胞懸濁液(2×106細胞/ml)を、50μlの大腸菌上清と4℃、300rpmで1時間混合した。次に、100μlのバッファーAを加え、細胞を遠心分離し、バッファーAでさらに2回洗浄した。結合したFabを検出するために、R-フィコエリトリンコンジュゲートAffiniPure F(ab')2フラグメントヤギ抗ヒト F(ab')2フラグメント特異的;Jackson Immuno Research;製品番号109-116-097(バッファーA中に1:100希釈)を、細胞に加え、4℃で1時間インキュベートした。バッファーAで3回洗浄した後、最後のペレットを150μlのバッファーAに再懸濁し、1試料につき5000のFACSイベントを記録した。データ解析は、BD FACSArrayシステムソフトウェアを使って行った。
エピトープ分類実験は、Biacore T100計器(GE Healthcare Biacore, Inc.)での表面プラズモン共鳴分析を使用し、C4.4aへの抗C4.4a抗体のペアの同時結合をモニタリングすることによって行った。以下のステップを全て20℃で行った。約2000RU(1RU(レゾナンスユニット)は1平方mmあたり1pgのタンパク質の結合を表す)の第1抗体を、1級アミンカップリングにより、CM5センサーチップ上に共有結合で固定化した。流速10μl/分の比率1:1の0.4M N-エチル-N-(3-ジエチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)および0.1M n-ヒドロキシスクシンアミド(NHC)で、5〜15分間、チップを活性化した。次に、表面上の占有されていない結合部位を、過剰の1MエタノールアミンpH8.5でブロッキングした。可溶性C4.4a(HEPES-EPバッファー(GE Healthcare Biacore, Inc.)中、濃度400nM、流速10μl/分で3分間)を、固定化抗体によって表面に捕捉した。それゆえに、結合された全てのC4.4a分子に関して、捕捉抗体のエピトープはブロックされている。次に、第2の抗体(HEPES-EPバッファー中、濃度200nM、流速10μl/分で、3分間)を、直ちに表面上に流して、捕捉されたC4.4aに結合させる。同じエピトープまたはオーバーラップするエピトープを認識する2つの抗体はC4.4aに結合することができないが、異なるエピトープを持つ抗体は結合することができる。この抗体表面を、結合したタンパク質を全て除去するために3M MgCl2(流速10μl/分で30秒間)で再生し、次に他の抗体を使って、このプロセスを繰り返した。
表1に示すのは、マウスC4.4aに対する本発明の抗体の交差反応性および解離定数(KD)を示すBiacore研究の結果である。
図2に、それぞれ組換えヒトC4.4a(A)およびマウスC4.4a(B)に対する抗C4.4抗体M31-B01およびM20 D02 S-A結合曲線を図示する。簡単に述べると、96ウェルMTPを、4℃において16時間、組換えヒトまたはマウスC4.4a(100ng/ウェル)でコーティングした。プレートをPBS/0.05% Tween 20(=バッファーB)で3回洗浄し、ブロッキング試薬(PBS+2%BSA)で処理し、バッファーBで再び3回洗浄した。その後、本発明の抗C4.4a抗体を0.39ng〜400ng/ウェルの濃度で加え、20℃で1時間インキュベートした。バッファーBで3回洗浄した後、20ngのプロテインAを100μlのバッファーBに入れて各ウェルに加えた。50μlの3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン(TMB)(Sigma)を添加することによって、呈色反応を進行させた。18分後に、Tecanインフィニットプレートリーダーで360nmにおける吸光度を測定することによって、EC50決定用のデータを記録した。M31-B01のEC50値は、ヒトおよびマウスC4.4aに対して、それぞれ0.24nMおよび0.29nMであった。また、M20-D02 S-Aの場合は、EC50値が、ヒトおよびマウスC4.4aに対して、それぞれ0.3nMおよび0.38nMであった。これは、ヒトおよびマウス可溶性組換えC4.4aの両方に対する本発明の抗C4.4a抗体の高アフィニティ結合を示している。
図3に、さまざまな腫瘍細胞に対する抗体M31-B01およびM20-D02 S-Aの結合曲線およびEC50値を図示する。分析は、トランスフェクトされた細胞株A549:hC4.4aおよび生来的にC4.4aを発現する腫瘍細胞株NCI H292、NCI H332、H1975/BCRPおよびBxPC3を使用し、FACSによって行った。図3f)は、本発明の両抗体が、この広範囲にわたる腫瘍細胞に、特異的にかつ高いアフィニティで結合したことを示している。mC4.4a:CHO細胞およびNCI H292細胞に対する本発明のさらなる抗体のEC50値を表8に示す。
トランスフェクトされたC4.4a:A549細胞での抗C4.4a抗体の相対的内部移行を図4および表9に示す。内部移行アッセイは、蛍光標識C4.4a抗体を使って行った。
FabのVH領域およびVL領域をIgGフォーマットに移し、かつ/または発現系を大腸菌から哺乳動物細胞系へと変えるために、PCRプライマーを使ってVHおよびVLを増幅した。隣接する制限酵素切断部位を、それぞれVHおよびVLの5'端と3'端の両方に導入した。これらの制限部位を使って、発現ベクター(すなわちIgGバックボーンを含有するもの)中にVHおよびVLをクローニングした。
抗C4.4a抗体の抗腫瘍効果は、免疫不全マウスにおける皮下異種移植モデルを使って評価されるだろう。10%FBSを補足したDMEM中、接着培養として、A431細胞を維持する。6〜7週齢のSCIDマウスの右脇腹の皮下に、培地0.1ml中の1×10e7細胞を接種する。モノクローナル抗体を5〜60mg/kgの用量で3日ごとに3回i.p.投与する。対照マウスはPBSまたは無関係なモノクローナル抗体で処置する。2日ごとに滑動計で腫瘍サイズを測定する。抗C4.4a抗体処置と対照処置の腫瘍サイズを比較することによって抗腫瘍効力を評価する。
抗C4.4a抗体は、当業者に知られているプロトコールを使って細胞毒性小分子にコンジュゲートすることができる(例えばLiuら, Proc Natl. Acad. Sci. (1996), 93, 8618-8623)。10%FBSを補足したDMEM中、接着培養として、A431細胞を維持する。6〜7週齢のSCIDマウスの右脇腹の皮下に、培地0.1ml中の1×10e7細胞を接種する。腫瘍サイズが50mm3に達したら、抗体薬物コンジュゲートを1〜60mg/kgの用量で3日ごとに3回i.p.投与する。対照マウスはPBS、無関係なモノクローナル抗体、または遊離の非コンジュゲート薬物で処置する。2日ごとに滑動計で腫瘍サイズを測定する。抗C4.4a抗体薬物コンジュゲート処置と対照処置の腫瘍サイズを比較することによって抗腫瘍効力を評価する。
重鎖のC末端に3×HAタグおよびヘキサヒスチジンタグを保有する野生型Fab、M31-B01およびM20-D02 S-Aの重鎖および軽鎖を、pET28a細菌発現ベクター(Novagen/Merck Chemicals Ltd.、英国ノッティンガム)にサブクローニングし、Top10F'細胞(Invitrogen GmbH、ドイツ・カールスルーエ)に形質転換した。あるいは、他の細菌発現ベクター(例えばpQEベクター系、Qiagen GmbH、ドイツ・ヒルデン)および株(例えばDH5α、Invitrogen GmbH、ドイツ・カールスルーエ)を使用することもできる。変異体を、標準的なオリゴベースの部位特異的変異誘発によって生成させ、DNA配列決定によって確認した。特に、相補性決定領域内またはその周囲にあるアミノ酸残基を、重鎖および/または軽鎖内で修飾した。
組換え可溶性ヒトまたはマウスC4.4aでの変種型Fab変異体の活性を決定するために、直接ELISAアッセイフォーマットを使用した。簡単に述べると、MTPプレート(Nunc maxisorp black、460518)を、コーティングバッファー(Candor Bioscience GmbH、121125)に希釈した2μg/mlのヒトまたはマウスC4.4aでコーティングし、4℃で15時間インキュベートした。PBSTで3回洗浄した後、プレートを、20℃において1時間、100%Smart Block(Candor Bioscience GmbH、113500)でブロッキングし、洗浄ステップを繰り返した。Fab抗体フラグメントを結合させるために、20μlの培養上清を20℃で1時間、プレートに加えてから洗浄した。いくつかの例では、PBST中の10%Smart Blockと共に90分間の追加インキュベーションステップ後に、PBSTで3回洗浄することにより、洗浄ストリンジェンシーを増加させた(表10bにおける「プロセスB」)。次に、結合した親Fabおよび変異体を、HAエピトープタグ特異的抗体_HRPコンジュゲート(Bethyl、A190-108P)によって検出した。10μMアンプレックスレッド基質(Invitrogen、A12222)をプレートに加え、一般的な蛍光リーダー、例えばTecan Ultraを使って、蛍光シグナルを検出した。量標準化アフィニティ(quantity normalized affinty)シグナルを、各ELISAにおいて、バックグラウンド補正したアフィニティシグナルと定量シグナルとの比:(アフィニティシグナル−アフィニティバックグラウンド)/(量シグナル−量バックグランド)[(Signalaffinity−Backgroundaffinity)/(Signalquantity−Backgroundquantity)]として算出した。その結果得られた値は、主として、アフィニティと正に相関するが、標準化されていない値は、試料における結合性Fabの濃度とも相関する。それゆえに、量標準化アフィニティシグナルは、アフィニティが改良された変異体の決定にとって、極めて良い指針として役立つ。
表10aおよび10bに記載するのは、M20-D02 S-Aの重鎖および軽鎖中に生成させた単一アミノ酸置換のいくつかの例である。HC D101K、LC A90Q、LC V97AおよびLC V97Gは、ヒトC4.4aでの標準化アフィニティシグナルに関して最も強い改善を示し、マウスC4.4aでの対応するシグナルは、ヒトC4.4aでのシグナルと比較して少なくとも1/8であった(図10a)。CDR3以外では、2つの置換HC D31SとHC V51Iが、ヒトC4.4aでの標準化アフィニティシグナルに関して最も強い改善を示し、HC V51Iの場合、マウスC4.4aでの対応するシグナルは30%であった(表10b)。
表10a:
表10b:
表11a:
表11b:
以下は、上記の結果を、M20 D02 S-Aから誘導される各CDR配列のコンセンサス配列の形で表している。コンセンサスを、それぞれ、CDR H1については表15a(i)に示し(配列番号297)、CDR H2については表15a(ii)に示し(配列番号298)、CDR H3については表15a(iii)に示し(配列番号299)、CDR L1については表15a(iv)に示し(配列番号300)、CDR L2については配列番号22と同一であり(表15a(v))、CDR L3については15a(v)に示す(配列番号301)。
M31-B01およびM20-D02 S-Aの抗体結合ドメインを特徴づけるために、標準的方法により、それぞれヒトC4.4a(配列番号1)のC4.4aドメインS1アミノ酸1〜85およびC4.4ドメインS2 108〜193からなるコンストラクトを、C末端ヒトIgG1 Fc-6×Hisタグ融合物として作製し、CMV5プロモーターを含有する哺乳動物細胞発現ベクターにクローニングし、HEK293 6E細胞中で一過性に発現させた。次に、発現したS1およびS2タンパク質を、細胞上清から、5ml NiNTAスーパーフローカラム(Qiagen)を用いる金属キレートクロマトグラフィーにより、20℃で精製した。試料のpHを1M NaOHでpH8.0に調節してから、1ml/分の50mM NaH2PO4+300mM NaCl pH8.0で前もって平衡化しておいたカラムに適用した。カラムを15CVの平衡化バッファーで洗浄し、結合したHisタグ付きタンパク質を50mM NaH2PO4+300mM NaCl+250mMイミダゾール(pH8.0)で溶出させた。溶出したタンパク質を、サイズ排除クロマトグラフィーにより、Tricorn Superdex 75 10/300 GL(GE Healthcare)で、さらに精製した。
抗C4.4a IgGの抗腫瘍活性は、ADCCによって媒介されうる。C4.4a発現A549:hC4.4a細胞および非C4.4a発現親細胞を、250ng/ml、1000ng/mlまたは2000ng/mlのヒト抗C4.4aまたは対照IgG1抗体(例えば抗ジゴキシン抗体)と共にインキュベートする。ヒトPBMCを、これらの細胞に、比50:1、25:1および5:1のエフェクター-ターゲット比で加える。ターゲット溶解のレベルを決定するためにクロム51放出アッセイを行う。抗C4.4a抗体およびPBMCの存在下での溶解率が、モック抗体または抗体なしおよびPBMCの存在下での(自発的)溶解率よりも高い場合、それはADCCが有効であることを示す。
xCELLigenceシステム(RTCAアナライザー、カタログ番号05228972001、Roche)は、ラベルを取り込ませることなく、細胞イベントをリアルタイムにモニターする。このシステムでは、組織培養E-プレートの底に組み込まれた櫛型微小電極間の電気的インピーダンスを測定する。インピーダンス測定は、細胞数、生存率および形態を含む細胞の生物学的状態に関して、定量的情報を与える。A549:hC4.4aの細胞増殖率を決定するために、細胞を、非結合性hIgG1アイソタイプ対照抗体または100nMのB01-3(hIgG1として)と共にインキュベートした。まず最初に、50μlの細胞培養培地(RPMI(Biochrom FG1640)+10%FCS(Biochrom #S0145)+1μg/mlピューロマイシン(Sigma 8833))を、E-プレート96の各ウェルに加えた。E-プレート96をRTCA MPステーション(カタログ番号05331625001、Roche)に挿入し、各ウェルのバックグラウンドインピーダンスを決定した。溶液をE-プレート96から再び除去し、50μlの細胞懸濁液(細胞培養培地中の5000細胞/ウェルのA549:hC4.4a)をウェルに加えた。プレートを再び挿入し、37℃+5%CO2で4時間測定した。E-プレート96を再び取り出し、細胞培養培地中の抗体(100nMのB01-3または非結合性対照hIG1)100μlを加えた。全ての試料を三つ一組にして操作した。E-プレートの再挿入後に、測定を、37℃+5%CO2で92時間行った。結果は組込みソフトウェアパッケージで解析した。結果を図6に図示する。抗体B01-3は非結合性対照抗体と比較して細胞増殖を明確に減少させる。これは、本発明の抗体がC4.4a発現細胞の細胞増殖を効果的に阻害することを示している。
Claims (1)
- 齧歯類C4.4aに対して交差反応性であり、C4.4a発現細胞への結合後に内部移行し、配列番号1のアミノ酸配列を有するペプチドへの結合に関して抗体M31-B01(可変重鎖領域:配列番号33、可変軽鎖領域:配列番号29)またはM20-D02 S-A(可変重鎖領域:配列番号34、可変軽鎖領域:配列番号30)と競合する、配列番号1のアミノ酸1〜85に特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合性フラグメント。
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WO2023240135A2 (en) | 2022-06-07 | 2023-12-14 | Actinium Pharmaceuticals, Inc. | Bifunctional chelators and conjugates |
Citations (1)
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---|---|---|---|---|
WO2001023553A2 (en) * | 1999-09-29 | 2001-04-05 | Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts | Metastasis-associated antigen c4.4a |
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US4657760A (en) | 1979-03-20 | 1987-04-14 | Ortho Pharmaceutical Corporation | Methods and compositions using monoclonal antibody to human T cells |
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DK1143006T3 (da) | 1995-08-18 | 2008-07-14 | Morphosys Ip Gmbh | Vektorer/DNA-sekvenser fra humane kombinatoriske antistofbiblioteker |
DE69710911T2 (de) * | 1996-05-31 | 2002-09-19 | Health Research Inc | Monoklonale Antikörper gegen Endoglin und ihre Verwendung in der anti-Angiogenese-Therapie |
ATE375365T1 (de) | 1998-04-02 | 2007-10-15 | Genentech Inc | Antikörper varianten und fragmente davon |
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US20050276812A1 (en) * | 2004-06-01 | 2005-12-15 | Genentech, Inc. | Antibody-drug conjugates and methods |
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