KR20140102698A - 항-fgfr2 항체 및 그의 용도 - Google Patents

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마크 트라우트베인
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쥐르겐 프란즈
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라르스 린덴
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Abstract

본 발명은 FGFR2를 과다발현하는 세포 및 돌연변이된 FGFR2를 발현하는 세포 둘 다에서 FGFR2에 대한 결합 후에 FGFR2의 세포 표면 발현을 감소시키는 항체, 또는 그의 항원-결합 항체 단편, 또는 그의 변이체를 제공한다. 또한, FGFR2-관련 질환 또는 상태, 예컨대 암에 대한 항체-기반 요법이 제공된다. 본 발명의 항체는 또한 진단 분야에 사용될 수 있다. 본 발명은 또한 상기 항체를 코딩하는 핵산 서열, 그를 함유하는 벡터, 제약 조성물, 및 사용 지침서가 있는 키트를 제공한다.

Description

항-FGFR2 항체 및 그의 용도 {ANTI-FGFR2 ANTIBODIES AND USES THEREOF}
본 발명은 섬유모세포 성장 인자 수용체 2 (FGFR2)에 대해 특이적인 재조합 항원-결합 영역, 및 이러한 항원-결합 영역을 함유하는 항체 및 기능적 단편을 제공한다.
따라서, 항체는 종양, 및 FGFR2의 발현과 연관된 다른 장애 및 상태를 치료하는데 사용될 수 있다. 본 발명은 또한 상기 항체를 코딩하는 핵산 서열, 그를 함유하는 벡터, 제약 조성물, 및 사용 지침서가 있는 키트를 제공한다.
항체-기반 요법은 고형 종양을 비롯한 다양한 암의 치료에 대해 매우 효과적인 것으로 입증되고 있다. 예를 들어, 헤르셉틴(HERCEPTIN)®은 유방암을 치료하는데 성공적으로 사용되어 왔고, 리툭산(RITUXAN)®은 B-세포 관련 암 유형에 효과적이다. 성공적인 항체-기반 요법의 개발에 있어 중요한 것은 종양 세포 상에서 우선적으로 발현되는 것으로 밝혀진 세포-표면 단백질에 대한 항체의 단리이다.
섬유모세포 성장 인자 수용체는 티로신 수용체 키나제 (RTK)이며, 이로부터 4종이 포유동물에서 공지되어 있다 (FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4). 리간드로서, 22종의 인간 섬유모세포 성장 인자 (FGF)가 확인되어 있다 (문헌 [Eswarakumar and Schlessinger, Cytokine & Growth Factor Reviews 2005, 16:139-149; Shimada et al., Proc Natl Acad Sci USA 2001, 98:6500-6505]). FGFR은 3개의 세포외 이뮤노글로불린 (Ig)-유사 도메인 D1-D3 (도메인 2 및 3은 리간드 결합에 요구됨), 단일 막횡단 도메인, 및 촉매 단백질 티로신 키나제 코어를 함유하는 세포질 도메인으로 구성되어 있다 (개략적 표현에 대해서는 도 1 참조). 세포외 부분은 추가로 산성 박스 (AB) 및 헤파린 결합 부위 (HBS)를 보유한다 (도 1 참조). RTK의 FGFR 패밀리의 중요한 특징은 선택적으로 스플라이싱된 다양한 변이체가 존재한다는 것이다. 전장 FGFR2는 FGFR2 알파라 불리고, 한편 D1이 결핍된 이소형은 FGFR2 베타라 칭해진다 (도 1). 도메인 3에서의 선택적 스플라이싱은 2종의 상이한 변이체, 즉 엑손 7 및 8을 보유하는 FGFR2 IIIb 및 엑손 7 및 9를 함유하는 FGFR2 IIIc를 생성한다 (도 1). 후자의 스플라이싱은 리간드 결합에 영향을 미쳐 특이성 패턴을 생성한다. FGFR2 IIIc는 주로 중간엽 세포에 의해 발현되고, FGFR2 IIIb는 주로 상피 세포에 의해 발현된다. 각질세포 성장 인자 (KGF)로도 또한 공지되어 있는 FGF7은 단지 FGFR2 IIIb에만 결합하며, 이는 따라서 KGFR이라고도 또한 칭해진다. FGF가 그의 수용체에 결합하면, 후속적으로 FGFR의 이량체화 및 인산화, 및 FRS-GRB2 도킹 단백질 복합체를 통한 RAS-MAPK 신호전달 캐스케이드 및 PI3K-AKT 신호전달 캐스케이드로의 하류 신호전달이 일어난다. 첫번째 신호전달 캐스케이드는 세포 성장 및 분화와 관련되어 있으며, 후자는 세포 생존 및 운명 결정과 관련되어 있다 (문헌 [Katoh and Katoh, Int J Oncol 2006, 29:163-168]).
배아발생 동안의 적절한 기관발생을 위해서는 다양한 FGF를 통한 모든 4종의 수용체 (FGFR1 내지 FGFR4) 및 이들의 스플라이스 변이체의 조정된 신호전달이 요구된다 (문헌 [Ornitz et al., Genome Biol 2001, 2:3005]). FGFR2의 경우에, 모든 FGFR2 변이체의 결핍은 태반 및 지아 형성에서의 결함을 일으키고, 결과적으로 E10.5에서 치사를 일으킨다. FGFR2 IIIb의 특이적 녹아웃은 또한 폐, 뇌하수체 전엽, 갑상선, 치아 및 사지의 무발생과 연관된 (P0에서의) 치사를 일으키고, 한편 FGFR2 IIIc 변이체의 파괴의 경우에는 지연된 골화, 균형성 왜소증 및 두개저의 골유합증을 보이면서 생존가능하다 (문헌 [Eswarakumar and Schlessinger, 2005]). 인간에서의 FGFR2의 배선 활성화 돌연변이는 배아발생 동안의 중증 기형, 예컨대 에이퍼트 또는 파이퍼 증후군에서의 관상- 및 두개골유합증을 유발한다 (문헌 [Robin et al., in Gene Reviews, NCBI Bookshelf Washington, edts. Pagon et al., 1993]). 성인에서, FGFR2 신호전달은 상처 치유, 상피 복구, 및 피부 및 점막의 세포보호 (문헌 [Braun et al., Phil Trans R Soc Lond B 2004, 359:753-757]) 및 손상된 간의 재생 (문헌 [Steiling et al., Oncogene 2003, 22:4380-4388; Boehm, dissertation, Swiss Federal Institute of Technology Zurich, 2009])에 관여한다. 경색 후의 심외막 유래 세포 (EPDC)의 심장 내로의 이동에서의 FGFR2 신호전달의 역할은 논의 중이며, 이는 배아발생 동안 무손상 심장 발생에 요구되는 과정인 치밀 심근에서의 EPDC의 이동에 FGF10/FGFR2 신호전달이 필요하기 때문이다 (문헌 [Vega-Hernandez et al., Development 2011:3331-3340; Winter and De Groot, Cell Mol Life Sci 2007, 64:692-703]).
FGFR2를 통한 증가된 배선-비의존성 신호전달은 다양한 병리상태, 예컨대 여드름 (문헌 [Katoh, J of Invest Dermatol 2009, 129:1861-1867]), 건선 (문헌 [Finch et al., Am J Pathol 1997, 151:1619-1628; Xu et al., J Invest Dermatol 2011:131:1521-1529]), 치주염 (문헌 [Li et al., J Peridontal Res 2005, 40:128-138]), 일광 흑색점 (문헌 [Lin et al., Journal Dermatol Sci 2010, 59:91-97]), 장 질환 (문헌 [Brauchle et al., J Pathol 1996, 149:521-529]), 자궁내막증 (문헌 [Taniguchi et al., Fertil Steril 2008, 89:478-480]), 진주종 (문헌 [Yamamoto-Fukuda et al., Eur Arch Otorhinolaryngol (2008) 265:1173-1178; d'Alessandro et al., Otol Neurotol. 2010 Sep;31(7):1163-9]), 진주종성 만성 중이염 (문헌 [Yamamoto-Fukuda et al., Otol Neurotol. 2010 Jul;31(5):745-51]), 아테롬성동맥경화증 (문헌 [Che et al., Am J Physiol Heart Circ Physiol 300: H154-H161, 2011]) 및 암 (하기 참조)에 관여한다.
FGFR2 발현과 암 환자의 불량한 결과의 강한 연관성을 강조하는 여러 연구가 공개되어 있다:
FGFR2 및/또는 KGF의 과다발현은 위암의 팽창성 성장 및 환자의 보다 짧은 생존과 연관되어 있다 (문헌 [Matsunobu et al., Int J Cancer 2006, 28:307-314; Toyokawa et al., Oncol Reports 2009, 21:875-880]). 이에 따라, FGFR2의 과다발현은 시험된 모든 위암 샘플 중 31-36.5%에서 검출되었다 (문헌 [Matsunobu et al., Int J Cancer 2006, 28:307-314; Toyokawa et al., Oncol Reports 2009, 21:875-880]). 선암종 (모든 위암 중 70%)은 추가로 2개의 특징적인 병리학적 유형, 즉 장형 및 미만형 위암으로 분류된다. 흥미롭게도, 첫번째의 덜 공격성인 유형은 활성화된 ErbB2 종양원성 경로와 연관되어 있지만, 후자의 보다 공격성인 표현형은 FGFR2/PI3K 경로에 이상을 보유한다 (문헌 [Yamashita et al., Surg Today 2011, 41:24-38]). 위 선암종 중 대략 60%는 미만형에 속하고, 나머지 40%는 장형에 속한다 (문헌 [Werner et al., J Cancer Res Clin Oncol 2001, 127:207-216]). FGFR2 과다발현은 미만형 위암 샘플 중 53%에서 발견되었다 (문헌 [Yamashita et al., Surg Today 2011, 41:24-38]). 모든 데이터를 종합하면, HER2 및 FGFR2 발현이 2개의 특징적인 환자 집단에서 일어나는 것으로 보인다. 아마도, FGFR2의 발현은 원발성 위암 중 대략 7-10%에서 FGFR2의 증폭이 발견될 수 있는 바와 같이 부분적으로 유전자 증폭으로부터 유래하는 것 같다 (문헌 [Kunii et al. Cancer Res 2008, 68:23-40-2348]). 추가로, FGFR2 발현은 전이에서 발견되었을 뿐만 아니라, 원발성 종양에서보다 훨씬 더 강했다 (문헌 [Yamashita et al., Surg Today 2011, 41:24-38]).
유방암에서, FGFR2 IIIb 발현은 종양 샘플 중 57%에서 발견되었지만, 건강한 조직에서는 거의 발견되지 않았다 (문헌 [Tamaru et al. 2004, 84:1460-1471]). KGF (FGF7)는 샘플 중 45%에서 발견되었고, 일반적으로 FGFR2 IIIb와 동시에 발견되었다. FGF7과 그의 유일한 수용체 FGFR2 IIIb의 공-발현은, FGF7도 또는 FGFR2 IIIb도 발현하지 않는 원발성 유방암과 비교시 원발성 종양 내의 유의하게 감소된 아폽토시스 세포 개수와 연관되었다 (문헌 [Tamaru et al. 2004, 84:1460-1471]). 위암에서와 같이, 유방암에서도 또한 삼중 음성 유방암 (TNBC) 중 4%에서 유전자 증폭이 발견되었다 (문헌 [Turner et al. Oncogene 2010, 29:2013-2023]). 유방암에서 여러 소형 핵 다형성 (SNP)이 확인되었으며, 이는 증가된 유방암 위험과 연관되어 있다 (문헌 [Hunter et al. Nature Genetics 2007, 6:870-874]). SNP가 인트론 2 내부로 국한되는 경우에, 이는 FGFR2의 전사 상향조절을 일으킨다 (문헌 [Katoh Expert Reviews 2010, 10:1375-1379]). 흥미롭게도, FGFR1은 ER-양성 유방암에서 우선적으로 상향조절되는 반면, FGFR2는 ER-음성 유방암에서 우선적으로 상향조절된다 (문헌 [Katoh, Expert Reviews 2010, 10:1375-1379]).
췌장암에서, FGFR2 IIIb 및/또는 FGF7의 과다발현은 정맥 침습과 강하게 상호연관되어 있으며 (문헌 [Cho et al., Am J Pathol 170:1964-1974]), 이에 따라 FGFR2와 FGF7의 공-발현이 종양 세포에서 발견되었지만, 이는 종양 세포에 인접한 기질 세포에서 훨씬 더 풍부하였다 (문헌 [Ishiwata et al., Am J Pathol 1998, 153:213-222]).
상피 난소암에서, 시험된 사례 중 80%에서 정상 조직과 비교시 FGFR2의 상향조절이 발견되었고, 70%에서 복수 중의 FGF7이 발견되었다 (문헌 [Steele et al., Oncogene 20:5878-5887]).
FGFR2 단백질은 모든 시험된 침습성 자궁경부암에서 발견되었고, 종양의 침습 경계면에서 강하게 발현되었다 (문헌 [Kawase et al., Int J Oncol 2010, 36:331-340]).
폐 선암종에서, FGF7과 FGFR2의 공-발현은 시험된 사례 중 51.6%에서 발견되었고, 이는 보다 낮은 분화 등급, 보다 높은 증식 속도, 림프절 전이 및 보다 짧은 5년 생존과 상호연관되어 있다 (문헌 [Yamayoshi et al., J Pathol 2004, 204:110-118]).
자궁내막암에서, FGFR2의 가장 빈번한 활성화 돌연변이는 자궁내막암 중 대략 16%에서 발견된다 (문헌 [Pollock et al., Oncogene 2007, 26:7158-7162]).
식도 암종 (EC)에서, 암 세포에서의 FGF7과 FGFR2의 공-발현은 보다 짧은 생존의 경향과 연관된 환자 중 26%에서 발견되었다 (문헌 [Yoshino et al., Int J Oncol 2007, 31:721-728]).
간세포성 암종에서, FGFR2 발현은 저분화 종양에서 4.7배까지 상향조절되었다. 상기 발현은 문맥 침습의 발생률 및 보다 짧은 무질환 생존 시간과 연관되어 있다 (문헌 [Harimoto et al., Oncology 2010, 78:361-368]).
실험적 시험관내 및 생체내 데이터를 갖는 여러 공개문헌은 이상 FGFR2-신호전달과 종양 진행의 원인 관계를 입증한다:
위 (문헌 [Takeda et al., Clin Cancer Res 2007; 13:3051-3057; Kunii et al., Cancer Res 2008; 68:2340-2348]), 유방 (문헌 [Turner et al. Oncogene 2010, 29:2013-2023]), 난소 (문헌 [Cole et al., Cancer Biol Ther 2010, 10:495-504]) 및 두경부 편평 세포 (문헌 [Marshall et al., Clin Cancer Res 2011, 17:5016-5025]) 암종 세포에서의 FGFR2의 녹다운 및/또는 억제는 종양 세포의 감소된 증식 및/또는 증가된 아폽토시스를 일으켰다. 또한 종양 이종이식편에서, FGFR2를 과다발현하는 종양 세포주에서의 FGFR2의 억제 뿐만 아니라 FGFR2의 녹다운에 의해, 위 (문헌 [Takeda et al., Clin Cancer Res 2007; 13:3051-3057]) 및 난소 (문헌 [Cole et al., Cancer Biol Ther 2010, 10:495-504]) 암 세포주에 대해 성장 억제가 나타났다. 추가로, 단지 FGFR2만을 활성화하는 FGF7은 시험관내에서 및 생체내에서 위 (문헌 [Shin et al., J Cancer Res Clin Oncol 2002, 128:596-602]), 유방 (문헌 [Zhang et al., Anticancer Res 1998, 18:2541-2546]) 및 난소 ([Cole et al., Cancer Biol Ther 2010, 10:495-504]) 암 세포주의 증식을 증가시켰다. 추가로, 활성화 돌연변이를 갖는 FGFR2를 보유하는 자궁내막암 세포주에서의 FGFR2의 녹다운은 또한 세포 주기 정지 및 세포 사멸의 유도를 일으켰다 (문헌 [Byron et al., Cancer Res 2008, 68:6902-6907]).
FGFR2 신호전달은 시험관내에서 위 (문헌 [Shin et al., J Cancer Res Clin Oncol 2002, 128:596-602]), 유방 (문헌 [Zhang et al., Anticancer Res 1998, 18:2541-2546]) 및 췌장 (문헌 [Nomura et al., Br J Cancer 2008, 99:305-313; Niu et al., J Biol Chem 2007, 282:6601-6011]) 암 세포주의 이동 및 침습을 촉진한다.
식도 암종에서, FGFR2는 종양-연관 섬유모세포에서 가장 고도로 상향조절되는 유전자이다. 단리된 종양-연관 섬유모세포는 식도암 세포의 증식을 촉진하는 가용성 인자를 방출하였으며 (문헌 [Zhang et al., hum Cancer Biol 2009, 15:4017-4022]), 이는 기질 세포에 의해 발현된 FGFR2도 또한 종양 진행을 촉진할 수 있다는 것을 입증한다.
단지 제한된 수의 항 FGFR2 항체만이 보고된 바 있다. 문헌 [Fortin et al. (J. Neurosci. 2005, 25: 7470-7479)]은 차단 항 FGFR2 항체를 기재한다. 문헌 [Wei et al. (Hybridoma 2006, 25: 115-124)]은 KGF 유도된 세포 증식을 억제하는, 단지 FGFR2 IIIb에 대해서만 특이적인 항체를 보여주었다. WO2007/144893에는 FGFR2 및 FGFR3에 결합하는 억제 항체가 개시되어 있다. WO2010/054265 및 문헌 [Zhao et al. (Clin Cancer Res. 2010,16:5750-5758)]에는 FGF 결합을 억제하는 항체가 개시되어 있다. 문헌 [Bai et al. (Cancer Res. 2010, 70:7630-7639)]은 FGFR2 IIIb에 대해 특이적인 항체를 기재한다. 알앤디 시스템즈(R&D Systems)는 그의 검정에서 활성을 중화시키는 항-FGFR2 항체를 시판한다.
요약하면, 여러 FGFR2 스플라이스 변이체가 공지되어 있다. 추가로, FGFR2-관련 질환은 FGFR2의 이상 발현, 예를 들어 과다발현 또는 증폭, 또는 다양한 돌연변이된 FGFR2 단백질로 인한 것으로 공지되어 있다. 그러나, 다수의 다양한 FGFR2 관련 질환을 다루는 요법은 부족한 상태이다.
본 발명은 FGFR2를 과다발현하는 세포 및 돌연변이된 FGFR2를 발현하는 세포 둘 다에서 FGFR2에 대한 결합 후에 FGFR2의 세포 표면 발현을 감소시키는 항체, 또는 그의 항원-결합 항체 단편, 또는 그의 변이체의 제공에 관한 것이다. 또한, FGFR2-관련 질환 또는 상태, 예컨대 암, 특히 FGFR2 발현 종양, 예컨대 위암, 유방암, 췌장암, 결장직장암, 신세포 암종, 전립선암, 난소암, 자궁경부암, 폐암, 비소세포 폐암 (NSCLC), 자궁내막암, 식도암, 두경부암, 간세포성 암종, 흑색종 및 방광암에 대한 항체-기반 요법이 제공된다.
본 발명은 또한 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 발현하는 세포, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 생산하는 방법, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 사용하여 이형성 세포의 성장을 억제하는 방법, 및 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 사용하여 암을 치료하고 검출하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 돌연변이된 FGFR2를 발현하는 세포에서 뿐만 아니라 FGFR2를 과다발현하는 세포에서도 FGFR2에 대한 결합 후에 FGFR2의 표면 발현을 감소시킨다는 점에서 기존의 FGFR2 항체와 구별되는 항체를 기재한다. 본 발명의 한 실시양태는 FGFR2의 세포외 N-말단 에피토프 (1RPSFSLVEDTTLEPE15) (서열 63)에 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편이다. 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 생체내 종양 실험에서 a) 단기적으로 FGFR2를 활성화하고, b) FGFR2의 내재화를 유도하고, c) 효율적인 분해를 일으키고, d) FGFR2-발현 암 세포 또는 종양 세포를 탈감작시켜, e) 최종적으로 이들 항체의 항종양 활성을 생성한다. 본 발명의 이들 및 다른 목적은 본원에 보다 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 항체는 공지된 의약과 공-투여될 수 있고, 일부 경우에는 항체 자체가 변형될 수 있다. 예를 들어, 잠재적으로 효능을 추가로 증가시키기 위해 항체가 세포독성제, 면역독소, 독성단 또는 방사성동위원소에 접합될 수 있다.
본 발명은 FGFR2 발현이 정상 조직과 비교시 상승되었거나 또는 FGFR2가 세포 표면으로부터 박리되어 혈청에서 검출가능하게 된 악성 또는 이형성 상태의 진단을 위한 도구를 구성하는 항체를 추가로 제공한다. 검출가능한 마커에 접합된 항-FGFR2 항체가 제공된다. 바람직한 마커는 방사성표지, 효소, 발색단 또는 형광물질이다.
본 발명은 또한 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 발현하는 세포, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 생산하는 방법, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 사용하여 이형성 세포의 성장을 억제하는 방법, 및 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 사용하여 암을 치료하고 검출하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 FGFR2의 에피토프에 대해 특이적인 상기 언급된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 각각 코딩할 수 있는 단리된 핵산 서열에 관한 것이다. 본 발명의 핵산은 항체 또는 항원-결합 항체 단편의 재조합 생산에 적합하다. 따라서, 본 발명은 또한 본 발명의 핵산 서열을 함유하는 벡터 및 숙주 세포에 관한 것이다.
본 발명의 조성물은 치료 또는 예방 용도로 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편 및 제약상 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물을 포함한다. 관련된 측면에서, 본 발명은 FGFR2 발현 세포의 원치 않는 존재와 연관된 장애 또는 상태를 치료하는 방법을 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 상기 언급된 장애는 암이다. 이러한 방법은 본원에 기재 또는 고려된 바와 같은 본 발명의 항체를 함유하는 제약 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 함유한다.
본 발명은 또한 FGFR2에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 항체 라이브러리 구성원을 단리하기 위해 이러한 라이브러리를 사용하는 것에 대한 지침을 제공한다.
도 1: FGFR2의 구조의 개략적 다이어그램. 알파 (서열 61) 및 베타 (서열 62) 스플라이스 변이체를 비교하여 나타내었다. 다이어그램은 3개의 Ig-유사 도메인 (D1, D2 및 D3), 막횡단 도메인 (TM) 및 세포내 키나제 도메인을 보여준다. 헤파린 결합 부위 (HBS), 산성 박스 (AB) 및 선택적 IIIb/IIIc 부분 도메인을 나타내었다. 아미노 말단은 N으로, 카르복시 말단은 C로 표시하였다. 본 발명의 항체의 결합 에피토프는 줄무늬로 나타내었다.
도 2: MFM223 세포에서의 10μg/ml의 항 FGFR2 항체와의 단기간 (15분) 인큐베이션 후의 인산화 FGFR2 (P-FGFR2) 수준의 유도. Y는 "비처리된 대조군 세포의 %"이다. 나타낸 바와 같이, 항체 M048-D01-hIgG1 및 M047-D08-hIgG1은 비처리된 대조군 세포와 비교시 P-FGFR2의 ELISA 신호를 4배 초과의 지수로 증가시켰다. 대조적으로, 대조군 IgG 항체이든 또는 알앤디로부터 상업적으로 입수가능한 항 FGFR2 항체 (MAB665, MAB684, MAB6843)이든 단기간 인큐베이션 후의 P-FGFR2 수준에 대한 어떠한 유의한 효과도 나타내지 않았다. 이들 결과는 단기간 인큐베이션 후의 FGFR2에 대한 본 발명에 기재된 항 FGFR2 항체의 효능작용 효과를 밝혀내었다.
도 3: 10μg/ml의 항 FGFR2 항체와의 장기간 (24시간) 인큐베이션 후의 P-FGFR2 수준의 FGF7 (25ng/ml, 15분) 매개 유도에 대한 MFM223 세포의 탈감작. Y는 "비처리된 대조군 세포의 %"이다. 나타낸 바와 같이, 항체 M048-D01-hIgG1 및 M047-D08-hIgG1은 FGF7 자극 후에 달성될 수 있는 P-FGFR2의 수준을 매우 확연히 감소시켰다. 이소형 대조군 IgG로 처리된 세포 뿐만 아니라 항체로 처리하지 않은 세포에서, FGF7로의 자극은 P-FGFR2 수준의 약 4배 증가를 유발하였다. 대조적으로, 항 FGFR2 항체로 24시간 동안 전처리된 샘플에서, FGF7은 P-FGFR2 수준을 단지 1.37-1.4배까지만 유도하였다.
종합하면, 이들 결과는 세포와 본 발명의 항 FGFR2 항체의 장기간 인큐베이션이 FGF7로의 자극에 대한 탈감작을 유발한다는 것을 보여준다.
도 4: FACS 분석에 의해 측정된, 10μg/ml의 항 FGFR2 항체와의 인큐베이션 4.5시간 후의 FGFR2 과다발현을 갖는 세포주 (MFM223, SNU16) 또는 FGFR2 돌연변이를 갖는 세포주 (AN3-CA, MFE-296)에서의 FGFR2 표면 발현의 하향조절. Y는 "대조군 세포의 %"이다. 나타낸 바와 같이, 항체 M048-D01-hIgG1 및 M047-D08-hIgG1은 FGFR2 과다발현 세포주 (MFM223, SNU16) 및 FGFR2 돌연변이를 갖는 세포주 (AN3-CA, MFE-296)에 의한 FGFR2 표면 발현을 감소시킨 유일한 항체였다. MAB684 및 MAB6843 (알앤디)과 같은 항체는 단지 FGFR2를 과다발현하지 않는 세포주에 의한 FGFR2 표면 발현만을 감소시켰다. GAL-FR21과 같은 항체는 FGFR2 돌연변이를 갖는 세포주에 의한 FGFR2 표면 발현을 감소시키지 않았다.
도 5: SNU16 세포에서의 항 FGFR2 항체와의 장기간 (96시간) 인큐베이션 후의 전체 FGFR2 수준의 하향조절. Y는 "대조군 세포의 %"이다. X는 "항체 농도 [μg/ml]"이다. 나타낸 바와 같이, 항체 M048-D01-hIgG1 (백색) 및 M047-D08-hIgG1 (줄무늬)은 96시간 후에 전체 FGFR2 수준을 용량 의존적 방식으로 유의하게 감소시켰다. 비-결합 대조군 항체 (흑색)는 어떠한 효과도 나타내지 않았다. 이들 결과는 항 FGFR2 항체 M048-D01-hIgG1 및 M047-D08-hIgG1이 표면 FGFR2 수준의 단기적 감소를 유발할 뿐만 아니라 전체 FGFR2 수준의 장기적 감소도 또한 유발한다는 것을 나타낸다.
도 6: 내인성 FGFR2 발현 세포에 결합시의 M048-D01-hIgG1 및 M047-D08-hIgG1의 특이적 내재화의 시간 경과의 현미경 평가. Y는 "세포당 과립 카운트"이다. X는 "시간 [분]"이다. 항체의 내재화는 유방암 세포주 SUM 52PE상에서 조사하였다. 세포당 과립 카운트는 동역학적 방식으로 측정하였다. 나타낸 바와 같이, 항체 M048-D01-hIgG1 (■ 및 실선) 및 M047-D08-hIgG1 (▲ 및 파선)은 증가하는 세포당 과립 카운트에 의해 나타난 바와 같이 신속한 내재화를 보여주었다. 이소형 대조군 항체 (* 및 파선)는 어떠한 내재화도 보여주지 않았다.
도 7: 나타난 바와 같이, SUM 52PE 세포에서의 M048-D01-hIgG1 (A, B) 및 M047-D08-hIgG1 (C, D)의 내재화는 Rab 7 (A, C)과는 동시-염색을 보여주었고, Rab 11 (B, D)과는 동시-염색을 보여주지 않았다. 나타난 바와 같이, SUM 52PE 세포에서의 GAL-FR21 (E, F) 및 GAL-FR22 (G,H)의 내재화는 Rab 11 (F, H)과는 동시-염색을 보여주었고, Rab 7 (E, G)과는 동시-염색을 보여주지 않았다.
도 8: PBS (●, 실선) 및 대조군 IgG 처리 (▲, 실선)와 비교시의 2 mg/kg의 M017-B02-hIgG1 (△, 실선)로의 복강내 처리 하의 피하 SNU-16 이종이식편의 성장. 평균 + 표준 편차를 플롯팅하였다. X는 "종양 접종 후 시간 [일]"이다. Y는 "종양 면적 [mm2]"이다. M017-B02-hIgG1로의 처리는 매우 유의한 종양 성장 억제를 일으켰다.
도 9: PBS (●, 실선) 및 대조군 IgG 처리 (▲, 실선)와 비교시의 2 mg/kg의 M021-H02-hIgG1 (△, 실선)로의 복강내 처리 하의 피하 SNU-16 이종이식편의 성장. 평균 + 표준 편차를 플롯팅하였다. X는 "종양 접종 후 시간 [일]"이다. Y는 "종양 면적 [mm2]"이다. M021-H02-hIgG1로의 처리는 매우 유의한 종양 성장 억제를 일으켰다.
도 10: PBS (●, 실선) 및 대조군 IgG 처리 (▲, 실선)와 비교시의 2 mg/kg의 M048-D01-hIgG1 (△, 실선)로의 복강내 처리 하의 피하 SNU-16 이종이식편의 성장. 평균 + 표준 편차를 플롯팅하였다. X는 "종양 접종 후 시간 [일]"이다. Y는 "종양 면적 [mm2]"이다. M048-D01-hIgG1로의 처리는 매우 유의한 종양 성장 억제를 일으켰다.
도 11: PBS (●, 실선) 및 대조군 IgG 처리 (▲, 실선)와 비교시의 2 mg/kg의 M054-A05-hIgG1 (△, 실선)로의 복강내 처리 하의 피하 SNU-16 이종이식편의 성장. 평균 + 표준 편차를 플롯팅하였다. X는 "종양 접종 후 시간 [일]"이다. Y는 "종양 면적 [mm2]"이다. M054-A05-hIgG1로의 처리는 매우 유의한 종양 성장 억제를 일으켰다.
도 12: PBS (●, 실선)와 비교시의 2 mg/kg의 M054-D03-hIgG1 (△, 실선)로의 복강내 처리 하의 피하 SNU-16 이종이식편의 성장. 평균 + 표준 편차를 플롯팅하였다. X는 "종양 접종 후 시간 [일]"이다. Y는 "종양 면적 [mm2]"이다. M054-D03-hIgG1로의 처리는 매우 유의한 종양 성장 억제를 일으켰다.
도 13: PBS (●, 실선)와 비교시의 2 mg/kg의 M047-D08-hIgG1 (△, 실선)로의 복강내 처리 하의 피하 SNU-16 이종이식편의 성장. 평균 + 표준 편차를 플롯팅하였다. X는 "종양 접종 후 시간 [일]"이다. Y는 "종양 면적 [mm2]"이다. M047-D08-hIgG1로의 처리는 매우 유의한 종양 성장 억제를 일으켰다.
도 14: 종양 세포 접종 후 제13일 (종양이 괴사성이 되기 전 최종 시점)의 피하 4T1 종양의 종양 면적의 점 플롯. 상기 시점에 마우스를 PBS 단독 (A), 5 mg/kg의 M048-D01-hIgG1 매주 2회 i.v. (B), 100 mg/kg 라파티닙 p.o. (C) 또는 5 mg/kg의 M048-D01-hIgG1 매주 2회 i.v. 및 100 mg/kg 라파티닙 p.o. (D)로 처리하였다. Y는 제13일의 종양 면적 [mm2]이고, 점선은 평균 값을 나타내고, 실선은 중앙값을 나타낸다. M048-D01-hIgG1 단독으로의 처리는 종양 면적의 유의한 감소를 일으켰지만, 라파티닙 단독으로는 종양 면적에 유의하게 영향을 미치지 않았다. M048-D01-hIgG1과 라파티닙의 조합은 유의하게 상가적인 항종양 활성을 생성하였다.
도 15: 종양 세포 접종 후 제13일 (종양이 괴사성이 되기 전 최종 시점)의 피하 4T1 종양의 종양 면적의 점 플롯. 상기 시점에 마우스를 PBS 단독 (A), 5 mg/kg의 M048-D01-hIgG1 매주 2회 i.v. (B), 24 mg/kg 탁솔 매주 1회 i.v. (C) 또는 5 mg/kg의 M048-D01-hIgG1 매주 2회 i.v. 및 24 mg/kg 탁솔 매주 1회 i.v. (D)로 처리하였다. Y는 제13일의 종양 면적 [mm2]이고, 점선은 평균 값을 나타내고, 실선은 중앙값을 나타낸다. M048-D01-hIgG1 단독으로의 처리는 종양 면적의 유의한 감소를 일으켰지만, 탁솔 단독으로는 종양 면적에 유의하게 영향을 미치지 않았다. M048-D01-hIgG1과 탁솔의 조합은 유의하게 상가적인 항종양 활성을 생성하였다.
도 16: PBS (◇, 실선)와 비교시의 5 mg/kg (▲, 실선), 2 mg/kg (●, 파선) 및 1 mg/kg (■, 점선)의 M048-D01-hIgG1로의 복강내 처리 하의 피하 환자-유래 GC10-0608 이종이식편의 성장. 평균 ± 평균의 표준 오차를 플롯팅하였다. X는 "처리 하의 시간 [일]"이다. Y는 "종양 부피 [mm3]"이다. M048-D01-hIgG1의 모든 3가지 용량으로의 처리는 유의한 종양 성장 억제를 일으켰다.
도 17: PBS (◇, 실선)와 비교시의 5 mg/kg (▲, 실선), 2 mg/kg (●, 파선) 및 1 mg/kg (■, 점선)의 M048-D01-hIgG1로의 복강내 처리 하의 피하 환자-유래 GC12-0811 이종이식편의 성장. 평균 ± 평균의 표준 오차를 플롯팅하였다. X는 "처리 하의 시간 [일]"이다. Y는 "종양 부피 [mm3]"이다. 5 및 1 mg/kg M048-D01-hIgG1의 용량으로의 처리는 유의한 종양 성장 억제를 일으켰다.
도 18: 대조군 항체와 비교시의 항 FGFR2 항체 M048-D01-hIgG1 및 M047-D08-hIgG1로의 SNU16 이종이식편의 장기간 처리 (2mg/kg, 매주 2회, i.p., 최종 용량 24시간 후에 샘플을 채취함) 후의 전체 FGFR2 [전체 FGFR2] 및 인산화 FGFR2 [P-FGFR2]의 하향조절. 나타낸 바와 같이, M048-D01-hIgG1 및 M047-D08-hIgG1로 처리한 후에 전체 FGFR2 [전체 FGFR2] 및 인산화 FGFR2 [P-FGFR2]는 대조군 IgG1로의 처리와 비교시 유의하게 감소되었다. 액틴을 로딩 대조군으로 사용하였다.
도 19: 본 발명의 서열
본 발명은 FGFR2에 대해 특이적 친화도를 가지며 대상체에게 치료 이익을 전달할 수 있는 신규 항체의 발견에 기반한다. 인간, 인간화 또는 키메라 항체일 수 있는 본 발명의 항체는 다수의 상황에서 사용될 수 있고, 이는 본원에 보다 상세히 기재되어 있다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 전문 과학 용어는 본 발명이 속한 분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 갖는다. 그러나, 하기 참고문헌은 본 발명과 관련된 당업자에게 본 발명에 사용된 다수의 용어의 일반적 정의를 제공할 수 있으며, 이러한 정의가 당업계에서 통상적으로 이해되는 의미와 일관되는 한 참조되고 사용될 수 있다. 이러한 참고문헌은 문헌 [Singleton et ah, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2d ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991); 및 Lackie et al., The Dictionary of Cell & Molecular Biology (3d ed. 1999); 및 Cellular and Molecular Immunology, Eds. Abbas, Lichtman and Pober, 2nd Edition, W.B. Saunders Company]을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 당업계에서 통상적으로 이해되는 의미를 갖는 본원에 사용된 용어의 정의를 제공하는, 당업자가 입수가능한 임의의 추가의 기술적 자원이 참고될 수 있다. 본 발명의 목적을 위해, 하기 용어가 추가로 정의된다. 추가의 용어는 명세서의 다른 곳에 정의되어 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 첨부된 특허청구범위에서, 단수 형태는 문맥상 명백히 달리 지시되지 않는 한 복수 언급을 포함한다. 따라서, 예를 들어 "유전자"에 대한 언급은 1개 이상의 유전자에 대한 언급이고, 당업자에게 공지된 그의 등가물 등을 포함한다.
"인간" 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 본원에서 키메라가 아니고 (예를 들어, "인간화"되지 않았고), (전적으로 또는 부분적으로) 비-인간 종으로부터의 것이 아닌 것으로 정의된다. 인간 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간으로부터 유래될 수 있거나 또는 합성 인간 항체일 수 있다. "합성 인간 항체"는 전적으로 또는 부분적으로, 공지된 인간 항체 서열의 분석에 기반한 합성 서열로부터 인 실리코(in silico)로 유도된 서열을 갖는 항체로서 본원에서 정의된다. 인간 항체 서열 또는 그의 단편의 인 실리코 설계는, 예를 들어 인간 항체 또는 항체 단편 서열의 데이터베이스를 분석하고, 그로부터 얻은 데이터를 활용하여 폴리펩티드 서열을 고안함으로써 달성될 수 있다. 인간 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 또 다른 예는 인간 기원의 항체 서열의 라이브러리 (예를 들어, 이러한 라이브러리는 인간 천연 공급원으로부터 획득한 항체에 기반함)로부터 단리된 핵산에 의해 코딩되는 것이다. 인간 항체의 예는 문헌 [Soederlind et al., Nature Biotech. 2000, 18:853-856]에 기재된 바와 같은 항체를 포함한다.
"인간화 항체" 또는 그의 인간화 항원-결합 단편은 (i) 비-인간 공급원 (예를 들어, 이종성 면역계를 보유하는 트랜스제닉 마우스)로부터 유래되고, 항체가 인간 배선 서열에 기반한 것, (ii) 비-인간 항체의 프레임워크 영역의 아미노산이 유전자 조작에 의해 인간 아미노산 서열로 부분적으로 교체된 것, 또는 (iii) 가변 도메인의 CDR은 비-인간 기원으로부터의 것이지만, 가변 도메인의 하나 이상의 프레임워크가 인간 기원의 것이고, 불변 도메인 (존재하는 경우)이 인간 기원의 것인 CDR-이식물인 것으로 본원에서 정의된다.
"키메라 항체" 또는 그의 항원-결합 단편은 가변 도메인이 비-인간 기원으로부터 유래되고 일부 또는 모든 불변 도메인이 인간 기원으로부터 유래된 것으로 본원에서 정의된다.
본원에 사용된 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동종인 항체 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하는데, 즉 상기 집단을 구성하는 개별 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 돌연변이, 예를 들어 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 따라서, 용어 "모노클로날"은 별개의 항체들의 혼합물이 아닌 것으로서의 항체의 특징을 나타낸다. 전형적으로 다양한 결정기 (에피토프)에 대해 지시되는 다양한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와는 대조적으로, 모노클로날 항체 제제의 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대해 지시된다. 모노클로날 항체 제제는 그의 특이성에 더하여 전형적으로 다른 이뮤노글로불린에 의해 오염되지 않는다는 점에서 유리하다. 용어 "모노클로날"은 임의의 특정한 방법에 의한 항체의 생산을 요구하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 용어 모노클로날 항체는 구체적으로 키메라, 인간화 및 인간 항체를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 항체가 관심 항원, 예를 들어 종양-연관 폴리펩티드 항원 표적 (본원에서는 FGFR2)에 "특이적으로 결합한다", 이에 대해 "특이적이다", 또는 이를 "특이적으로 인식한다"는 것은, 상기 항체가 치료제로서 상기 항원을 발현하는 세포 또는 조직을 표적화하는데 유용하도록 충분한 친화도로 항원에 결합하며, 다른 단백질과 유의하게 교차-반응하지 않거나, 또는 상기 언급된 항원 표적의 오르토로그 및 변이체 (예를 들어, 돌연변이체 형태, 스플라이스 변이체 또는 단백질분해적으로 말단절단된 형태) 이외의 단백질과 유의하게 교차-반응하지 않는 것이다. 본원에 사용된 바와 같이, 특정한 폴리펩티드 또는 특정한 폴리펩티드 표적 상의 에피토프를 "특이적으로 인식한다", 또는 이에 "특이적으로 결합한다", 또는 이에 대해 "특이적이다"라는 용어는, 예를 들어 약 10-4 M 미만, 다르게는 약 10-5 M 미만, 다르게는 약 10-6 M 미만, 다르게는 약 10-7 M 미만, 다르게는 약 10-8 M 미만, 다르게는 약 10-9 M 미만, 다르게는 약 10-10 M 미만, 다르게는 약 10-11 M 미만, 다르게는 약 10-12 M 미만, 또는 그 미만의 항원에 대한 1가 KD를 갖는 항체, 또는 그의 항원-결합 단편으로 나타내어질 수 있다. 항체는, 이러한 항체가 항원과 하나 이상의 참조 항원(들)을 구별할 수 있는 경우에 이러한 항원에 "특이적으로 결합하거나", 이에 대해 "특이적이거나", 또는 이를 "특이적으로 인식한다". 그의 가장 일반적인 형태에서, "특이적 결합", "~에 특이적으로 결합한다", "~에 대해 특이적이다", 또는 "~를 특이적으로 인식한다"는, 예를 들어 하기 방법 중 하나에 따라 결정되는 바와 같은, 관심 항원과 관련되지 않은 항원을 구별하는 항체의 능력을 지칭한다. 이러한 방법은 웨스턴 블롯, ELISA-, RIA-, ECL-, IRMA-시험 및 펩티드 스캔을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, 표준 ELISA 검정이 수행될 수 있다. 표준 발색에 의한 점수화가 수행될 수 있다 (예를 들어, 2차 항체 + 양고추냉이 퍼옥시다제, 및 테트라메틸 벤지딘 + 과산화수소). 특정 웰에서의 반응은, 예를 들어 450 nm에서의 광학 밀도에 의해 점수화된다. 전형적인 백그라운드 (=음성 반응)는 0.1 OD일 수 있고; 전형적인 양성 반응은 1 OD일 수 있다. 이는 양성/음성 차이가 5배 초과, 10배 초과, 50배 초과, 바람직하게는 100배 초과임을 의미한다. 전형적으로, 결합 특이성의 결정은 단일 참조 항원이 아니라, 약 3 내지 5종의 관련되지 않은 항원, 예컨대 우유 분말, BSA, 트랜스페린 등의 세트를 사용하여 수행된다.
"결합 친화도"는 분자의 단일 결합 부위와 그의 결합 파트너 사이의 비공유 상호작용의 총계의 강도를 지칭한다. 달리 나타내지 않는 한, 본원에 사용된 "결합 친화도"는 결합 쌍의 구성원 (예를 들어, 항체 및 항원) 사이의 1 : 1 상호작용을 반영하는 내재적 결합 친화도를 지칭한다. 해리 상수 "KD"는 통상적으로 분자 (예컨대, 항체)와 그의 결합 파트너 (예컨대, 항원) 사이의 친화도, 즉 리간드가 특정한 단백질에 얼마나 단단하게 결합하는지를 기재하는데 사용된다. 리간드-단백질 친화도는 2개의 분자 사이의 비-공유 분자간 상호작용에 의해 영향을 받는다. 친화도는 본원에 기재된 것들을 비롯하여 당업계에 공지된 통상의 방법에 의해 측정될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 "KD" 또는 "KD 값"은 실시예 7에 따라 비아코어(Biacore) T100 기기 (지이 헬스케어 비아코어, 인크.(GE Healthcare Biacore, Inc.))를 사용하는 표면 플라즈몬 공명 검정을 이용함으로써 측정된다. 간략하게, 간접적 포획 시약인 항-인간 IgG Fc를 통해 항체를 CM5 센서 칩 상에 고정화시켰다. "휴먼 안티바디 캡처 키트("Human Antibody Capture Kit"; BR-1008-39, 지이 헬스케어 비아코어, 인크.)로부터의 시약을 제조업체에 의해 기재된 바와 같이 사용하였다. 셀당 대략 5000 공명 단위 (RU)의 모노클로날 마우스 항-인간 IgG (Fc) 항체를 고정화시켰다. 항 FGFR2 항체를 대략 200 내지 600 RU의 포획 수준에 도달하도록 주입하였다. 아미노산 1-15를 함유하는 다양한 농도의 인간, 뮤린, 래트, 개 및 다른 종 유래 FGFR2 펩티드를 고정화된 항-FGFR2 항체 상에 주입하였다. 인-라인 참조 셀 보정에 이어서 완충제 샘플 감산 후에 센소그램을 생성하였다. 해리 평형 상수 (KD)는 비아코어 평가 소프트웨어를 사용하여 1차 1:1 결합 모델로 센소그램을 적합시킴으로써 얻은 회합 (kon) 및 해리 속도 (koff) 상수의 비에 기반하여 계산하였다. 다른 적합한 장치는 비아코어(R)-2000, 비아코어 (R)-3000 (비아코어, 인크., 뉴저지주 피스카타웨이), 또는 프로테온(ProteOn) XPR36 기기 (바이오-라드 래보러토리즈, 인크.(Bio-Rad Laboratories, Inc.))이다.
항체 또는 항체 단편 에피토프의 결합에 결정적인 잔기를 결정하기 위해, 예를 들어 펩티드의 알라닌-스캐닝을 이용하여 정밀 맵핑을 수행할 수 있다. 이에 따라, 결합 에피토프의 각각의 아미노산을 알라닌 잔기에 의해 대체하고, 본 발명의 대표적인 항체의 결합을 ELISA-기반 검정으로 시험하였다. 이에 따라, 실시예 6에 기재된 바와 같이 잔기를 알라닌으로 변화시킴으로써 항체가 그의 ELISA 신호 중 50% 초과를 상실한 경우에, 상기 잔기를 결합에 결정적인 것으로 간주하였다.
본원에 사용된 용어 "항체"는 이뮤노글로불린 분자를 지칭하도록 의도되고, 이는 바람직하게는 4개의 폴리펩티드 쇄, 즉 전형적으로 디술피드 결합에 의해 상호-연결된 2개의 중쇄 (H) 및 2개의 경쇄 (L)로 구성된다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (본원에서 VH로 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은, 예를 들어 3개의 도메인 CH1, CH2 및 CH3을 포함할 수 있다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 (본원에서 VL로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 1개의 도메인 (CL)으로 구성된다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역 (FR)이라 칭해지는 보다 보존된 영역이 산재되어 있는, 상보성 결정 영역 (CDR)이라 불리는 초가변 영역으로 추가로 세분화될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 전형적으로 아미노 말단에서 카르복시 말단으로, 예를 들어 하기 순서: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4로 배열된 3개의 CDR 및 4개 이하의 FR로 구성된다.
본원에 사용된 용어 "상보성 결정 영역" (CDR; 예를 들어, CDR1, CDR2 및 CDR3)은 그의 존재가 항원 결합에 필요한 항체 가변 도메인의 아미노산 잔기들을 지칭한다. 각각의 가변 도메인은 전형적으로 CDR1, CDR2 및 CDR3으로 식별되는 3개의 CDR 영역을 갖는다. 각각의 상보성 결정 영역은 카바트(Kabat)에 의해 정의된 바와 같은 "상보성 결정 영역"으로부터의 아미노산 잔기 (예를 들어, 대략적으로 경쇄 가변 도메인 내의 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2) 및 89-97 (L3) 및 중쇄 가변 도메인 내의 31-35 (H1), 50-65 (H2) 및 95-102 (H3); 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immulological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)]) 및/또는 "초가변 루프"로부터의 잔기 (예를 들어, 대략적으로 경쇄 가변 도메인 내의 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2) 및 91-96 (L3) 및 중쇄 가변 도메인 내의 26-32 (H1), 53-55 (H2) 및 96-101 (H3); 문헌 [Chothia and Lesk; J Mol Biol 196: 901-917 (1987)])를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 상보성 결정 영역은 카바트에 따라 규정된 CDR 영역 및 초가변 루프 둘 다로부터의 아미노산을 포함할 수 있다.
중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 무손상 항체는 다양한 "부류"에 할당될 수 있다. 무손상 항체의 5가지 주요 부류: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하며, 이들 중 몇몇은 "하위부류" (이소형), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA 및 IgA2로 추가로 분할될 수 있다. 다양한 항체 부류에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 [알파], [델타], [엡실론], [감마] 및 [뮤]라 불린다. 다양한 이뮤노글로불린 부류의 서브유닛 구조 및 3차원 배위는 널리 공지되어 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 항체는 통상적으로 공지된 항체 및 그의 기능적 단편이다.
항체/이뮤노글로불린의 "기능적 단편" 또는 "항원-결합 항체 단편"은 본원에서 항원-결합 영역을 보유하는 항체/이뮤노글로불린의 단편 (예를 들어, IgG의 가변 영역)으로 정의된다. 항체의 "항원-결합 영역"은 전형적으로 항체의 하나 이상의 초가변 영역(들), 예를 들어 CDR1, -2 및/또는 -3 영역에서 발견되지만; 가변 "프레임워크" 영역이, 예컨대 CDR에 대한 스캐폴드를 제공함으로써 항원 결합에서도 또한 중요한 역할을 할 수 있다. 바람직하게는, "항원-결합 영역"은 적어도 가변 경쇄 (VL)의 아미노산 잔기 4 내지 103 및 가변 중쇄 (VH)의 아미노산 잔기 5 내지 109, 보다 바람직하게는 VL의 아미노산 잔기 3 내지 107 및 VH의 아미노산 잔기 4 내지 111을 포함하며, 완전한 VL 및 VH 쇄 (VL의 아미노산 위치 1 내지 109 및 VH의 아미노산 위치 1 내지 113; WO 97/08320에 따른 넘버링)이 특히 바람직하다. 본 발명에서 사용하기 위한 이뮤노글로불린의 바람직한 부류는 IgG이다.
본 발명의 "기능적 단편" 또는 "항원-결합 항체 단편"은 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편; 디아바디; 단일 도메인 항체 (DAb), 선형 항체; 단일-쇄 항체 분자 (scFv); 및 항체 단편들로부터 형성된 다중특이적, 예컨대 이중- 및 삼중-특이적 항체를 포함한다 (문헌 [C. A. K Borrebaeck, editor (1995) Antibody Engineering (Breakthroughs in Molecular Biology), Oxford University Press; R. Kontermann & S. Duebel, editors (2001) Antibody Engineering (Springer Laboratory Manual), Springer Verlag]). "다중-특이적" 또는 "다-작용성" 항체 이외의 항체는 그의 각 결합 부위가 동일한 것으로 여겨진다. F(ab')2 또는 Fab는 CH1과 CL 도메인 사이에 발생하는 분자간 디술피드 상호작용을 최소화하거나 또는 완전히 제거하도록 조작될 수 있다.
본 발명에서 고려되는 항체 또는 항원-결합 항체 단편의 변이체는 FGFR2에 대한 항체 또는 항원-결합 항체 단편의 결합 활성이 유지되어 있는 분자이다.
본 발명에서 고려되는 결합 단백질은, 예를 들어 항체 모방체, 예컨대 아피바디, 애드넥틴, 안티칼린, DARPin, 아비머, 나노바디 (문헌 [Gebauer M. et al., Curr. Opinion in Chem. Biol. 2009; 13:245-255; Nuttall S.D. et al., Curr. Opinion in Pharmacology 2008; 8:608-617]에 의해 리뷰됨)이다.
본원에 사용된 용어 '에피토프'는 이뮤노글로불린 또는 T-세포 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 단백질 결정기를 포함한다. 에피토프 결정기는 통상적으로 분자, 예컨대 아미노산 또는 당 측쇄, 또는 그의 조합의 화학적으로 활성인 표면 그룹화로 구성되며, 통상적으로 특정 3차원 구조 특징, 뿐만 아니라 특정 전하 특징을 갖는다. 두 항체는, 한 항체가 당업자에게 널리 공지된 임의의 방법에 의해 경쟁적 결합 검정에서 제2 항체와 경쟁하는 것으로 나타나는 경우에 '동일한 에피토프에 결합한다'고 말해진다.
"단리된" 항체는 이것을 발현한 세포의 성분으로부터 확인 및 분리된 것이다. 세포의 오염 성분은 항체의 진단 또는 치료 용도를 방해할 물질이고, 효소, 호르몬, 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 항체는 (1) 예를 들어 로우리(Lowry) 방법, UV-Vis 분광학 또는 (예를 들어, 캘리퍼 랩칩(Caliper LabChip) GXII, GX 90 또는 바이오라드 생물분석기 장치 상에서의) SDS-모세관 겔 전기영동에 의해 결정시, 95 중량%의 항체를 초과하는 정도, 추가의 바람직한 실시양태에서는 99 중량%를 초과하는 정도로, (2) N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 잔기 15개 이상을 수득하기에 충분한 정도로, 또는 (3) 쿠마시 블루(Coomassie blue) 또는 바람직하게는 은 염색을 이용하는 환원 또는 비환원 조건 하에서의 SDS-PAGE에 의한 동질성의 정도로 정제된다. 단리된 자연 발생 항체는 재조합 세포 내의 계내 항체를 포함하는데, 이는 항체의 자연 환경의 하나 이상의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문이다. 그러나, 통상적으로, 단리된 항체는 적어도 1회의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
"항체-의존성 세포-매개 세포독성" 또는 "ADCC"는 특정 세포독성 세포 (예를 들어, NK 세포, 호중구 및 대식세포) 상에 존재하는 Fc 감마 수용체 (FcγR) 상에 결합된 분비형 Ig가, 이들 세포독성 이펙터 세포가 항원-보유 표적 세포에 특이적으로 결합하고 후속적으로 표적 세포를 세포독소로 사멸시킬 수 있게 하는 것인 세포독성의 한 형태를 지칭한다. 관심 항체의 ADCC 활성을 평가하기 위해, 시험관내 ADCC 검정, 예컨대 미국 특허 번호 5,500,362 또는 5,821,337 또는 미국 특허 번호 6,737,056 (프레스타(Presta))에 기재된 것을 수행할 수 있다. 이러한 검정에 유용한 이펙터 세포는 PBMC 및 NK 세포를 포함한다.
"보체 의존성 세포독성" 또는 "CDC"는 보체 존재 하의 표적 세포의 용해를 지칭한다. 고전적 보체 경로의 활성화는 보체계의 제1 성분 (C1q)이 동족 항원에 결합되어 있는 (적절한 하위부류의) 항체에 결합함으로써 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위해, 예를 들어 문헌 [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202: 163 (1996)]에 기재된 바와 같은 CDC 검정을 수행할 수 있다. 변경된 Fc 영역 아미노산 서열 (변이체 Fc 영역을 갖는 폴리펩티드) 및 증가 또는 감소된 C1q 결합을 갖는 폴리펩티드 변이체가, 예를 들어 미국 특허 번호 6,194,551 B1 및 WO 1999/51642에 기재되어 있다.
용어 면역접합체 (상호교환적으로 "항체-약물 접합체" 또는 "ADC"로 지칭됨)는 하나 이상의 세포독성제, 예컨대 화학요법제, 약물, 성장 억제제, 독소 (예를 들어, 단백질 독소, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소, 또는 그의 단편) 또는 방사성 동위원소 (즉, 방사성접합체)에 접합된 항체를 지칭한다. 면역접합체는 암의 치료에서 세포독성제, 즉 세포를 사멸시키거나 그의 성장 또는 증식을 억제하는 약물의 국부 전달에 사용되어 왔다 (예를 들어, 문헌 [Liu et al., Proc Natl. Acad. Sci. (1996), 93, 8618-8623]). 접합되지 않은 약물의 전신 투여가 정상 세포 및/또는 조직에 대한 허용되지 않는 수준의 독성을 일으킬 수 있는 경우에, 면역접합체는 종양으로의 약물 모이어티의 표적화된 전달, 및 종양에서의 세포내 축적을 허용한다. 항체-독소 접합체에 사용되는 독소는 박테리아 독소, 예컨대 디프테리아 독소, 식물 독소, 예컨대 리신, 소분자 독소, 예컨대 겔다나마이신을 포함한다. 독소는 튜불린 결합, DNA 결합, 또는 토포이소머라제 억제를 비롯한 메카니즘에 의해 세포독성 효과를 발휘할 수 있다.
참조 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열 각각에 대한 "서열 동일성 퍼센트 (%)"는 서열들을 정렬시키고 필요한 경우에는 갭을 도입시켜 최대 서열 동일성 퍼센트를 달성한 후의 참조 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열 각각 내의 핵산 또는 아미노산 잔기 각각과 동일한 후보 서열 내의 핵산 또는 아미노산 잔기 각각의 백분율로 정의된다. 보존적 치환은 서열 동일성의 일부로 간주되지 않는다. 갭이 없는 정렬이 바람직하다. 아미노산 서열 동일성 퍼센트를 결정하기 위한 정렬은 당업계 기술 범위 내의 다양한 방식, 예를 들어 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어를 이용하여 달성할 수 있다. 당업자는 비교할 전장 서열에 대한 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 비롯하여 서열 정렬에 적절한 파라미터를 결정할 수 있다.
용어 '성숙 항체' 또는 '성숙 항원-결합 단편', 예컨대 성숙 Fab 변이체는 주어진 항원, 예컨대 FGFR2의 세포외 도메인에 대한 보다 강한 결합을 나타내는 - 즉, 증가된 친화도로 결합하는 - 항체 또는 항체 단편의 유도체를 포함한다. 성숙은 상기 친화도 증가를 유발하는 항체 또는 항체 단편의 6개의 CDR 내의 소수의 돌연변이를 확인하는 과정이다. 성숙 과정은 항체로의 돌연변이의 도입을 위한 분자 생물학 방법과 개선된 결합제를 확인하기 위한 스크리닝의 조합이다.
본 발명의 항체
본 발명은 항-FGFR2 항체를 제공함으로써 FGFR2-양성 암 세포의 성장 및 신생물성 질환의 진행을 억제하는 방법에 관한 것이다. FGFR2를 과다발현하는 세포 및 돌연변이된 FGFR2를 발현하는 세포 둘 다에서 FGFR2에 대한 결합 후에 FGFR2의 표면 발현을 감소시키는 결합 단백질, 항체, 그의 항원-결합 항체 단편, 및 상기 항체 및 단편의 변이체가 제공된다. 본 발명의 또 다른 실시양태는 돌연변이된 FGFR2를 발현하는 세포 뿐만 아니라 FGFR2를 과다발현하는 세포 둘 다에서 광범위한 다양한 FGFR2 발현 세포주, 예컨대 비제한적으로 FGFR2를 과다발현하는 SNU16 (ATCC-CRL-5974) 및 MFM223 (ECACC-98050130) 및 돌연변이된 FGFR2를 발현하는 AN3-CA (DSMZ-ACC 267) 및 MFE-296 (ECACC-98031101)에 결합하는 항체, 또는 그의 항원-결합 항체 단편, 또는 그의 변이체를 제공하는 것이다.
이들 목표를 위해, 본 발명의 실시양태는 FGFR2 발현 암 세포주/암 세포에 의해 제시되고/거나 단리된 인간, 인간화 또는 키메라 항체, 또는 그의 항원 결합 항체 단편에 의해 높은 친화도로 결합되는 다양한 형태의 성숙 인간 FGFR2 폴리펩티드에 존재하는 FGFR2 에피토프 (예를 들어, FGFR2 알파 IIIb에 대해서는 서열 61, 및 FGFR2 베타 IIIb에 대해서는 서열 62 참조)에 특이적으로 결합하는 이들 항체를 제공하는 것이다. 본원에 사용된 바와 같이, FGFR2의 다양한 '형태'는 다양한 이소형, 다양한 스플라이스 변이체, 다양한 당형태, 또는 다양한 번역적 및 번역후 변형을 겪는 FGFR2 폴리펩티드를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. FGFR2 폴리펩티드는 본원에서 'FGFR2'로 명명된다.
본 발명의 또 다른 실시양태는 인간 투여에 안전한 항체, 또는 그의 항원-결합 항체 단편, 또는 그의 변이체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 실시양태는 인간 FGFR2에 결합하고 또 다른 종의 FGFR2, 예컨대 비제한적으로 뮤린, 래트, 마카카 물라타(macaca mulatta), 토끼, 돼지 및 개 FGFR2에 대해 교차-반응성인 항체, 또는 그의 항원-결합 항체 단편, 또는 그의 변이체를 제공하는 것이다. 바람직하게는, 상기 다른 종은 설치류, 예컨대 예를 들어 마우스 또는 래트이다. 가장 바람직하게는, 항체, 또는 그의 항원-결합 항체 단편, 또는 그의 변이체는 인간 FGFR2에 결합하고 뮤린 FGFR2에 대해 교차-반응성이다.
본 발명의 또 다른 실시양태는 FGFR2 발현 세포에 대한 결합 후에 효율적으로 내재화되는 항체, 또는 그의 항원-결합 항체 단편, 또는 그의 변이체를 제공하는 것이다. 본 발명의 항체는 공지된 의약과 공-투여될 수 있고, 일부 경우에는 항체 자체가 변형될 수 있다. 예를 들어, 잠재적으로 효능을 추가로 증가시키기 위해 항체가 세포독성제, 면역독소, 독성단 또는 방사성동위원소에 접합될 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시양태는 단기적으로 FGFR2를 활성화하고 내재화 후에 FGFR2 분해를 유발하여 이에 따라 FGF 자극에 대한 다양한 FGFR2-발현 암 세포 또는 종양 세포의 탈감작을 일으킴으로써 최종적으로 생체내에서 종양 성장을 억제하는 항체, 또는 그의 항원-결합 항체 단편, 또는 그의 변이체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 실시양태는 FGFR2 발현이 정상 조직과 비교시 상승되었거나 또는 FGFR2가 세포 표면으로부터 박리되어 혈청에서 검출가능하게 된 악성 또는 이형성 상태의 진단을 위한 도구를 구성하는 항체를 제공하는 것이다. 검출가능한 마커에 접합된 항-FGFR2 항체가 제공된다. 바람직한 마커는 방사성표지, 효소, 발색단 또는 형광물질이다.
한 측면에서, 본 발명은 세포 표면 발현된 FGFR2에 결합하는 항원-결합 영역을 함유하며, FGFR2를 과다발현하는 세포 및 돌연변이된 FGFR2를 발현하는 세포 둘 다에서의 FGFR2의 세포 표면 발현을 FGFR2에 대한 결합 후에 감소시키는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 천연의 세포 표면 발현된 FGFR2에 특이적으로 결합하는 항원-결합 영역을 함유하며, FGFR2를 과다발현하는 세포 및 돌연변이된 FGFR2를 발현하는 세포 둘 다에서의 FGFR2의 세포 표면 발현을 FGFR2에 대한 결합 후에 감소시키는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 천연의 세포 표면 발현된 FGFR2에 특이적으로 결합하며, FGFR2를 과다발현하는 2종 이상의 상이한 세포 및 돌연변이된 FGFR2를 발현하는 2종 이상의 상이한 세포 둘 다에서의 FGFR2의 세포 표면 발현을 FGFR2에 대한 결합 후에 감소시키는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
추가 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 천연의 세포 표면 발현된 FGFR2에 특이적으로 결합하여 (i) FGFR2를 과다발현하는 세포 및 돌연변이된 FGFR2를 발현하는 세포 둘 다에서의 FGFR2의 세포 표면 발현을 FGFR2에 대한 결합 후에 감소시키고, (ii) FGFR2 인산화를 유도한다.
추가 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 천연의 세포 표면 발현된 FGFR2에 특이적으로 결합하여 (i) FGFR2를 과다발현하는 세포 및 돌연변이된 FGFR2를 발현하는 세포 둘 다에서의 FGFR2의 세포 표면 발현을 FGFR2에 대한 결합 후에 감소시키고, (ii) FGFR2 인산화를 유도하며, 여기서 항체는 FGFR2 발현 세포를 FGF7로의 자극에 대해 탈감작시킨다. 추가 실시양태에서, 탈감작은 FGFR2 과다발현 세포의 탈감작이다.
추가 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 천연의 세포 표면 발현된 FGFR2에 특이적으로 결합하여 (i) FGFR2를 과다발현하는 세포 및 돌연변이된 FGFR2를 발현하는 세포 둘 다에서의 FGFR2의 세포 표면 발현을 FGFR2에 대한 결합 후에 감소시키고, (ii) FGFR2의 내재화를 유도하여 FGFR2 분해를 일으킨다.
추가 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 천연의 세포 표면 발현된 FGFR2에 특이적으로 결합하여 (i) FGFR2를 과다발현하는 세포 및 돌연변이된 FGFR2를 발현하는 세포 둘 다에서의 FGFR2의 세포 표면 발현을 FGFR2에 대한 결합 후에 감소시키고, (ii) 이종이식 종양 실험에서 종양-성장을 감소시킨다.
추가 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 FGFR2를 과다발현하는 SNU16 (ATCC-CRL-5974) 및 MFM223 (ECACC-98050130)을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 다양한 세포주, 및 돌연변이된 FGFR2를 발현하는 세포주 AN3-CA (DSMZ-ACC 267) 및 MFE-296 (ECACC-98031101)에서의 FGFR2 세포 표면 발현을 감소시킬 수 있다.
추가 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 FGFR2를 과다발현하는 SNU16 (ATCC-CRL-5974) 및 MFM223 (ECACC-98050130) 세포 및 돌연변이된 FGFR2를 발현하는 세포주 AN3-CA (DSMZ-ACC 267) 및 MFE-296 (ECACC-98031101)에서의 FGFR2 세포 표면 발현을 FGFR2에 대한 결합 후에 감소시킬 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 세포 표면 감소는 비-처리 또는 대조군 처리된 세포의 FGFR2 세포 표면 발현과 비교시 적어도 10%, 15%, 20%, 25% 또는 30%이다.
추가의 바람직한 실시양태에서, 96시간 후의 세포 표면 감소는 비-처리 또는 대조군 처리된 세포의 FGFR2 세포 표면 발현과 비교시 적어도 10%, 15%, 20%, 25% 또는 30%이다.
추가 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 FGFR2의 세포외 N-말단 에피토프 (1RPSFSLVEDTTLEPE15) (서열 63)에 특이적으로 결합한다. 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 결합에 결정적인 FGFR2의 N-말단 에피토프 (1RPSFSLVEDTTLEPE15) 내의 잔기는 Arg 1, Pro 2, Phe 4, Ser 5, Leu 6 및 Glu 8을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
추가 실시양태에서, 세포외 N-말단 에피토프 (서열 63)에 대한 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 결합은 Arg 1, Pro 2, Phe 4, Ser 5, Leu 6 및 Glu 8로 이루어진 잔기의 군으로부터 선택된 1개 이상의 에피토프 잔기에 의해 매개된다.
추가 실시양태에서, 세포외 N-말단 에피토프 (서열 63)에 대한 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 결합은 Arg 1, Pro 2, Phe 4, Ser 5, Leu 6 및 Glu 8로 이루어진 잔기의 군으로부터 선택된 1개 이상의 에피토프 잔기의 아미노산 알라닌에 의한 치환에 의해 감소된다.
추가 실시양태에서, 세포외 N-말단 에피토프 (서열 63)에 대한 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 결합은 Pro 2, Leu 6 및 Glu 8로 이루어진 잔기의 군으로부터 선택된 1개 이상의 에피토프 잔기에 의해 매개된다.
추가 실시양태에서, 세포외 N-말단 에피토프 (서열 63)에 대한 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 결합은 Pro 2, Leu 6 및 Glu 8로 이루어진 잔기의 군으로부터 선택된 1개 이상의 에피토프 잔기의 아미노산 알라닌에 의한 치환에 의해 감소된다.
또 다른 실시양태에서, 세포외 N-말단 에피토프 (서열 63)에 대한 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 결합은 Pro 2, Leu 6 및 Glu 8로 이루어진 잔기의 군으로부터 선택된 1개 이상의 에피토프 잔기에 의해 매개되고, 에피토프에 대한 결합은 에피토프의 위치 5의 서열 변경에 대해 불변이다.
추가 실시양태에서, 세포외 N-말단 에피토프 (서열 63)에 대한 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 결합은 Pro 2, Leu 6 및 Glu 8로 이루어진 잔기의 군으로부터 선택된 1개 이상의 에피토프 잔기의 아미노산 알라닌에 의한 치환에 의해 감소되고, 에피토프에 대한 결합은 에피토프의 위치 5의 서열 변경에 대해 불변이다.
추가 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 FGFR2의 N-말단 에피토프 (1RPSFSLVEDTTLEPE15) 내의 아미노산 잔기 중 1개 이상을 알라닌으로 변화시킴으로써 그의 ELISA 신호 중 50% 초과를 상실하며, (i) 상기 잔기는 군 Pro 2, Leu 6 및 Glu 8로부터 선택되거나, 또는 (ii) 상기 잔기는 군 Arg 1, Pro 2, Phe 4 및 Ser 5로부터 선택된다.
추가의 바람직한 실시양태에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 FGFR2의 N-말단 에피토프 (1RPSFSLVEDTTLEPE15) 내의 아미노산 잔기 중 1개 이상을 알라닌으로 변화시킴으로써 그의 ELISA 신호 중 50% 초과를 상실하며, 여기서 상기 잔기는 표 7에 나타낸 바와 같이 a) Pro 2, Leu 6 및 Glu 8 또는 b) Arg 1, Pro 2, Phe 4 및 Ser 5를 포함하지만 이에 제한되지는 않는 군으로부터 선택된다.
추가 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 FGFR2에 대한 결합에서 군 "M048-D01", "M047-D08", "M017-B02", "M021-H02", "M054-A05", "M054-D03", "TPP-1397", "TPP-1398", "TPP-1399", "TPP-1400", "TPP-1401", "TPP-1402", "TPP-1403", "TPP-1406", "TPP-1407", "TPP-1408", "TPP-1409", "TPP-1410", "TPP-1411", "TPP-1412" 및 "TPP-1415"로부터 선택된 1종 이상의 항체와 경쟁한다.
본 문헌 전체에 걸쳐, 표 9 및 표 10에 나타낸 바와 같은 하기 본 발명의 바람직한 항체가 언급되어 있다: "M017-B02", "M021-H02", "M047-D08", "M048-D01", "M054-A05", "M054-D03", "TPP-1397", "TPP-1398", "TPP-1399", "TPP-1400", "TPP-1401", "TPP-1402", "TPP-1403", "TPP-1406", "TPP-1407", "TPP-1408", "TPP-1409", "TPP-1410", "TPP-1411", "TPP-1412" 및 "TPP-1415".
M017-B02는 서열 3 (DNA)/서열 1 (단백질)에 상응하는 가변 중쇄 영역 및 서열 4 (DNA)/서열 2 (단백질)에 상응하는 가변 경쇄 영역을 포함하는 항체를 나타낸다.
M021-H02는 서열 13 (DNA)/서열 11 (단백질)에 상응하는 가변 중쇄 영역 및 서열 14 (DNA)/서열 12 (단백질)에 상응하는 가변 경쇄 영역을 포함하는 항체를 나타낸다.
M047-D08은 서열 23 (DNA)/서열 21 (단백질)에 상응하는 가변 중쇄 영역 및 서열 24 (DNA)/서열 22 (단백질)에 상응하는 가변 경쇄 영역을 포함하는 항체를 나타낸다.
M048-D01은 서열 33 (DNA)/서열 31 (단백질)에 상응하는 가변 중쇄 영역 및 서열 34 (DNA)/서열 32 (단백질)에 상응하는 가변 경쇄 영역을 포함하는 항체를 나타낸다.
M054-D03은 서열 43 (DNA)/서열 41 (단백질)에 상응하는 가변 중쇄 영역 및 서열 44 (DNA)/서열 42 (단백질)에 상응하는 가변 경쇄 영역을 포함하는 항체를 나타낸다.
M054-A05는 서열 53 (DNA)/서열 51 (단백질)에 상응하는 가변 중쇄 영역 및 서열 54 (DNA)/서열 52 (단백질)에 상응하는 가변 경쇄 영역을 포함하는 항체를 나타낸다.
TPP-1397은 서열 83 (단백질)에 상응하는 가변 중쇄 영역 및 서열 84 (단백질)에 상응하는 가변 경쇄 영역을 포함하는 항체를 나타낸다.
TPP-1398은 서열 93 (단백질)에 상응하는 가변 중쇄 영역 및 서열 94 (단백질)에 상응하는 가변 경쇄 영역을 포함하는 항체를 나타낸다.
TPP-1399는 서열 103 (단백질)에 상응하는 가변 중쇄 영역 및 서열 104 (단백질)에 상응하는 가변 경쇄 영역을 포함하는 항체를 나타낸다.
TPP-1400은 서열 113 (단백질)에 상응하는 가변 중쇄 영역 및 서열 114 (단백질)에 상응하는 가변 경쇄 영역을 포함하는 항체를 나타낸다.
TPP-1401은 서열 123 (단백질)에 상응하는 가변 중쇄 영역 및 서열 124 (단백질)에 상응하는 가변 경쇄 영역을 포함하는 항체를 나타낸다.
TPP-1402는 서열 133 (단백질)에 상응하는 가변 중쇄 영역 및 서열 134 (단백질)에 상응하는 가변 경쇄 영역을 포함하는 항체를 나타낸다.
TPP-1403은 서열 73 (단백질)에 상응하는 가변 중쇄 영역 및 서열 74 (단백질)에 상응하는 가변 경쇄 영역을 포함하는 항체를 나타낸다.
TPP-1406은 서열 153 (단백질)에 상응하는 가변 중쇄 영역 및 서열 154 (단백질)에 상응하는 가변 경쇄 영역을 포함하는 항체를 나타낸다.
TPP-1407은 서열 163 (단백질)에 상응하는 가변 중쇄 영역 및 서열 164 (단백질)에 상응하는 가변 경쇄 영역을 포함하는 항체를 나타낸다.
TPP-1408은 서열 173 (단백질)에 상응하는 가변 중쇄 영역 및 서열 174 (단백질)에 상응하는 가변 경쇄 영역을 포함하는 항체를 나타낸다.
TPP-1409는 서열 183 (단백질)에 상응하는 가변 중쇄 영역 및 서열 184 (단백질)에 상응하는 가변 경쇄 영역을 포함하는 항체를 나타낸다.
TPP-1410은 서열 193 (단백질)에 상응하는 가변 중쇄 영역 및 서열 194 (단백질)에 상응하는 가변 경쇄 영역을 포함하는 항체를 나타낸다.
TPP-1411은 서열 203 (단백질)에 상응하는 가변 중쇄 영역 및 서열 204 (단백질)에 상응하는 가변 경쇄 영역을 포함하는 항체를 나타낸다.
TPP-1412는 서열 213 (단백질)에 상응하는 가변 중쇄 영역 및 서열 214 (단백질)에 상응하는 가변 경쇄 영역을 포함하는 항체를 나타낸다.
TPP-1415는 서열 143 (단백질)에 상응하는 가변 중쇄 영역 및 서열 144 (단백질)에 상응하는 가변 경쇄 영역을 포함하는 항체를 나타낸다. 추가의 바람직한 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 각각 항체 "M048-D01", "M047-D08", "M017-B02", "M021-H02", "M054-A05", "M054-D03", "TPP-1397", "TPP-1398", "TPP-1399", "TPP-1400", "TPP-1401", "TPP-1402", "TPP-1403", "TPP-1406", "TPP-1407", "TPP-1408", "TPP-1409", "TPP-1410", "TPP-1411", "TPP-1412" 또는 "TPP-1415"의 하나 이상의, 바람직하게는 상응하는 CDR 서열과 적어도 50%, 55%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 동일하거나, 또는 "M048-D01", "M047-D08", "M017-B02", "M021-H02", "M054-A05", "M054-D03", "TPP-1397", "TPP-1398", "TPP-1399", "TPP-1400", "TPP-1401", "TPP-1402", "TPP-1403", "TPP-1406", "TPP-1407", "TPP-1408", "TPP-1409", "TPP-1410", "TPP-1411", "TPP-1412" 또는 "TPP-1415"의 VH 또는 VL 서열과 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 92% 또는 95% 동일한 중쇄 또는 경쇄 CDR 서열을 포함한다.
추가의 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편은 표 9 및 표 10에 나타낸 바와 같은 1개 이상의 CDR 서열 또는 1개 이상의 가변 중쇄 또는 경쇄 서열을 포함한다.
보다 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열 5 (H-CDR1), 서열 6 (H-CDR2) 및 서열 7 (H-CDR3)을 포함하는 중쇄 항원-결합 영역을 포함하고, 서열 8 (L-CDR1), 서열 9 (L-CDR2) 및 서열 10 (L-CDR3)을 포함하는 경쇄 항원-결합 영역을 포함한다.
보다 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열 15 (H-CDR1), 서열 16 (H-CDR2) 및 서열 17 (H-CDR3)을 포함하는 중쇄 항원-결합 영역을 포함하고, 서열 18 (L-CDR1), 서열 19 (L-CDR2) 및 서열 20 (L-CDR3)을 포함하는 경쇄 항원-결합 영역을 포함한다.
보다 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열 25 (H-CDR1), 서열 26 (H-CDR2) 및 서열 27 (H-CDR3)을 포함하는 중쇄 항원-결합 영역을 포함하고, 서열 28 (L-CDR1), 서열 29 (L-CDR2) 및 서열 30 (L-CDR3)을 포함하는 경쇄 항원-결합 영역을 포함한다.
보다 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열 35 (H-CDR1), 서열 36 (H-CDR2) 및 서열 37 (H-CDR3)을 포함하는 중쇄 항원-결합 영역을 포함하고, 서열 38 (L-CDR1), 서열 39 (L-CDR2) 및 서열 40 (L-CDR3)을 포함하는 경쇄 항원-결합 영역을 포함한다.
보다 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열 45 (H-CDR1), 서열 46 (H-CDR2) 및 서열 47 (H-CDR3)을 포함하는 중쇄 항원-결합 영역을 포함하고, 서열 48 (L-CDR1), 서열 49 (L-CDR2) 및 서열 50 (L-CDR3)을 포함하는 경쇄 항원-결합 영역을 포함한다.
보다 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열 55 (H-CDR1), 서열 56 (H-CDR2) 및 서열 57 (H-CDR3)을 포함하는 중쇄 항원-결합 영역을 포함하고, 서열 58 (L-CDR1), 서열 59 (L-CDR2) 및 서열 60 (L-CDR3)을 포함하는 경쇄 항원-결합 영역을 포함한다.
보다 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열 75 (H-CDR1), 서열 76 (H-CDR2) 및 서열 77 (H-CDR3)을 포함하는 중쇄 항원-결합 영역을 포함하고, 서열 78 (L-CDR1), 서열 79 (L-CDR2) 및 서열 80 (L-CDR3)을 포함하는 경쇄 항원-결합 영역을 포함한다.
보다 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열 85 (H-CDR1), 서열 86 (H-CDR2) 및 서열 87 (H-CDR3)을 포함하는 중쇄 항원-결합 영역을 포함하고, 서열 88 (L-CDR1), 서열 89 (L-CDR2) 및 서열 90 (L-CDR3)을 포함하는 경쇄 항원-결합 영역을 포함한다.
보다 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열 95 (H-CDR1), 서열 96 (H-CDR2) 및 서열 97 (H-CDR3)을 포함하는 중쇄 항원-결합 영역을 포함하고, 서열 98 (L-CDR1), 서열 99 (L-CDR2) 및 서열 100 (L-CDR3)을 포함하는 경쇄 항원-결합 영역을 포함한다.
보다 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열 105 (H-CDR1), 서열 106 (H-CDR2) 및 서열 107 (H-CDR3)을 포함하는 중쇄 항원-결합 영역을 포함하고, 서열 108 (L-CDR1), 서열 109 (L-CDR2) 및 서열 110 (L-CDR3)을 포함하는 경쇄 항원-결합 영역을 포함한다.
보다 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열 115 (H-CDR1), 서열 116 (H-CDR2) 및 서열 117 (H-CDR3)을 포함하는 중쇄 항원-결합 영역을 포함하고, 서열 118 (L-CDR1), 서열 119 (L-CDR2) 및 서열 120 (L-CDR3)을 포함하는 경쇄 항원-결합 영역을 포함한다.
보다 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열 125 (H-CDR1), 서열 126 (H-CDR2) 및 서열 127 (H-CDR3)을 포함하는 중쇄 항원-결합 영역을 포함하고, 서열 128 (L-CDR1), 서열 129 (L-CDR2) 및 서열 130 (L-CDR3)을 포함하는 경쇄 항원-결합 영역을 포함한다.
보다 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열 135 (H-CDR1), 서열 136 (H-CDR2) 및 서열 137 (H-CDR3)을 포함하는 중쇄 항원-결합 영역을 포함하고, 서열 138 (L-CDR1), 서열 139 (L-CDR2) 및 서열 140 (L-CDR3)을 포함하는 경쇄 항원-결합 영역을 포함한다.
보다 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열 145 (H-CDR1), 서열 146 (H-CDR2) 및 서열 147 (H-CDR3)을 포함하는 중쇄 항원-결합 영역을 포함하고, 서열 148 (L-CDR1), 서열 149 (L-CDR2) 및 서열 150 (L-CDR3)을 포함하는 경쇄 항원-결합 영역을 포함한다.
보다 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열 155 (H-CDR1), 서열 156 (H-CDR2) 및 서열 157 (H-CDR3)을 포함하는 중쇄 항원-결합 영역을 포함하고, 서열 158 (L-CDR1), 서열 159 (L-CDR2) 및 서열 160 (L-CDR3)을 포함하는 경쇄 항원-결합 영역을 포함한다.
보다 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열 165 (H-CDR1), 서열 166 (H-CDR2) 및 서열 167 (H-CDR3)을 포함하는 중쇄 항원-결합 영역을 포함하고, 서열 168 (L-CDR1), 서열 169 (L-CDR2) 및 서열 170 (L-CDR3)을 포함하는 경쇄 항원-결합 영역을 포함한다.
보다 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열 175 (H-CDR1), 서열 176 (H-CDR2) 및 서열 177 (H-CDR3)을 포함하는 중쇄 항원-결합 영역을 포함하고, 서열 178 (L-CDR1), 서열 179 (L-CDR2) 및 서열 180 (L-CDR3)을 포함하는 경쇄 항원-결합 영역을 포함한다.
보다 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열 185 (H-CDR1), 서열 186 (H-CDR2) 및 서열 187 (H-CDR3)을 포함하는 중쇄 항원-결합 영역을 포함하고, 서열 188 (L-CDR1), 서열 189 (L-CDR2) 및 서열 190 (L-CDR3)을 포함하는 경쇄 항원-결합 영역을 포함한다.
보다 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열 195 (H-CDR1), 서열 196 (H-CDR2) 및 서열 197 (H-CDR3)을 포함하는 중쇄 항원-결합 영역을 포함하고, 서열 198 (L-CDR1), 서열 199 (L-CDR2) 및 서열 200 (L-CDR3)을 포함하는 경쇄 항원-결합 영역을 포함한다.
보다 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열 205 (H-CDR1), 서열 206 (H-CDR2) 및 서열 207 (H-CDR3)을 포함하는 중쇄 항원-결합 영역을 포함하고, 서열 208 (L-CDR1), 서열 209 (L-CDR2) 및 서열 210 (L-CDR3)을 포함하는 경쇄 항원-결합 영역을 포함한다.
보다 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열 215 (H-CDR1), 서열 216 (H-CDR2) 및 서열 217 (H-CDR3)을 포함하는 중쇄 항원-결합 영역을 포함하고, 서열 218 (L-CDR1), 서열 219 (L-CDR2) 및 서열 220 (L-CDR3)을 포함하는 경쇄 항원-결합 영역을 포함한다.
본 발명의 항체는 IgG (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4)일 수 있고, 한편 항체 단편은 예를 들어 Fab, Fab', F(ab')2 또는 scFv일 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체 단편은 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 방식으로 거동하는 항원-결합 영역일 수 있거나 또는 이러한 항원-결합 영역을 함유할 수 있다.
예를 들어, 항체 Fab 단편 M048-D01 (VH 쇄에 대해 서열 31, 및 VL 쇄에 대해 서열 32)은 인간 IgG1 M048-D01-hIgG1 (중쇄에 대해 서열 67, 및 경쇄에 대해 서열 68)로서 발현되었고, Fab 단편 M047-D08 (VH 쇄에 대해 서열 21, 및 VL 쇄에 대해 서열 22)은 인간 IgG1 M047-D08-hIgG1 (중쇄에 대해 서열 69, 및 경쇄에 대해 서열 70)로서 발현되었다. 효율적 클로닝을 위해, 중쇄의 N-말단의 처음 3개의 아미노산 [EVQ] (서열 67 및 서열 69)는 또한 다르게는 [QVE]로서, 예를 들어 인간 IgG1 M048-D01-hIgG1의 중쇄의 변이체 (서열 222)로서 발현될 수 있다. 효율적 클로닝을 위해, 경쇄의 N-말단은 아미노산 잔기, 예를 들어 알라닌에 의해 연장될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 항체 단편은 모노클로날 항체 또는 항체 단편이다. 추가의 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 항체 단편은 인간, 인간화 또는 키메라 항체 또는 항체 단편이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 IIIb 및 IIIc 스플라이스 형태 뿐만 아니라 알파 및 베타 이소형에 비의존적으로 FGFR2에 특이적으로 결합하고/거나 이에 대한 높은 친화도를 갖는 항원-결합 영역을 갖는 항체 또는 항원-결합 단편을 제공한다 (예를 들어, FGFR2 알파 IIIb에 대해서는 서열 61, 및 FGFR2 베타 IIIb에 대해서는 서열 62 참조). 항체 또는 항원-결합 단편은, 친화도 측정치가 250 nM (항체 또는 항원-결합 단편의 1가 친화도) 미만인 경우에 항원에 대한 "높은 친화도"를 갖는다고 말해진다. 본 발명의 항체 또는 항원-결합 영역은 바람직하게는 인간 FGFR2에 대한 1가 친화도로서 결정시 250 nM 미만, 바람직하게는 150 nM 미만의 친화도로 인간 FGFR2에 결합할 수 있다. 예를 들어, 다양한 종으로부터의 FGFR2에 대한 본 발명의 항체의 친화도는 예시적으로 M048-D1 및 M047-D08에 대해 표 8에 나타낸 바와 같이 약 100 nM (항체 또는 항원-결합 단편의 1가 친화도)일 수 있다.
IgG1 포맷을 형광-활성화 세포 분류 (FACS)에 의한 세포-기반 친화도 결정에 사용하였다. 표 6은 인간 (SNU16, MFM223), 뮤린 (4T1) 및 래트 (RUCA) 기원의 암 세포주 상에서의 대표적인 항-FGFR2-IgG 항체의 결합력 (EC50)의 개요를 제공한다.
IgG1은, FACS에 의해 측정된 친화도 측정치가 100 nM (IgG의 겉보기 친화도) 미만인 경우에 항원에 대한 "높은 친화도"를 갖는다고 말해진다. 본 발명의 2가 항체 또는 항원-결합 단편은 바람직하게는 100 nM 미만, 보다 바람직하게는 50 nM 미만, 보다 더 바람직하게는 10 nM 미만의 친화도로 FGFR2에 결합할 수 있다. FGFR2에 대한 IgG의 겉보기 친화도로서 결정시 5 nM 미만, 보다 바람직하게는 1 nM 미만의 친화도로 FGFR2에 결합하는 2가 항체가 추가로 바람직하다. 예를 들어, FGFR2에 대한 본 발명의 항체의 겉보기 친화도는 표 6에 나타낸 바와 같이 FACS 분석에 의해 결정시 인간, 뮤린 및 래트 기원의 다양한 종양 세포주 상에서 약 89.5 nM 또는 0.1 nM 미만일 수 있다.
본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편은 FGFR2 발현 종양 세포 내로의 절반 최대 내재화 시간 (t ½)이 180분 미만, 보다 바람직하게는 120분 미만, 보다 더 바람직하게는 90분 미만인 경우에 "효율적으로" 내재화된다. 실시예 12에 기재된 프로토콜에 의해 결정시 60분 이하의 절반 최대 내재화 시간 (t ½)을 갖는 항체 또는 항원-결합 단편이 추가로 바람직하다.
내재화 후의 항체의 트래픽킹 경로의 보다 상세한 평가를 위해 소형 G-단백질의 동시-염색이 이용될 수 있다. 예를 들어, 소포 형성, 액틴 및 튜불린 네트워크에 따른 소포 운동 및 막 융합을 비롯한 막 트래픽의 다수의 단계를 조절하는 Rab GTPase를 사용하여 상이한 경로를 구별할 수 있다. 이에 따라, 표지된 항체와 후기 엔도솜 및 리소솜에서 발현되는 Rab7의 동시-염색은 FGFR2의 내재화 후에 복합체가 엔도솜 - 리소솜 경로에 진입한다는 것을 나타내는 반면에, 초기 및 재활용 엔도솜에서 발현되는 Rab11과의 동시-염색은 이들 항체가 FGFR2에 대한 결합 후에 내재화되고 재활용 경로를 선호한다는 것을 나타낸다. 엔도솜 - 리소솜 경로에 진입하는 것은 항체가 내재화 후의 FGFR2의 분해를 유도하여 최종적으로 상기 경로의 탈감작을 일으킬 수 있게 한다. 도 7은 실시예 12에 기재된 바와 같은 본 발명의 대표적인 항체와 Rab7 및 Rab11의 동시-염색 패턴을 보여준다.
내재화가능한 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편이 항체-약물 접합체 (ADC)의 표적화 모이어티로서 적합하다. 항체 또는 항원-결합 단편은 화합물, 바람직하게는 세포독성제를 FGFR2 발현 세포 내로 전달하기 위한 시험관내 또는 생체내 방법에 적합하다.
일부 실시양태에서, 항체, 그의 항원-결합 단편, 또는 그의 유도체, 또는 그를 코딩하는 핵산이 단리된다. 단리된 생물학적 성분 (예컨대, 핵산 분자 또는 단백질, 예컨대 항체)은 상기 성분이 자연 발생하는 유기체의 세포 내의 다른 생물학적 성분, 예를 들어 다른 염색체 및 염색체외 DNA 및 RNA, 단백질 및 소기관으로부터 실질적으로 분리 또는 정제된 것이다. "단리된" 핵산 및 단백질은, 예를 들어 문헌 [Sambrook et al., 1989 (Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, USA) 및 Robert K. Scopes et al. 1994 (Protein Purification, - Principles and Practice, Springer Science and Business Media LLC)]에 기재된 바와 같은 표준 정제 방법에 의해 정제된 핵산 및 단백질을 포함한다. 상기 용어는 숙주 세포에서의 재조합 발현에 의해 제조된 핵산 및 단백질 뿐만 아니라 화학적으로 합성된 핵산도 또한 포괄한다.
본 발명의 항체는 다수의 건강한 지원자의 항체로부터 단리된 아미노산 서열에 기반한 재조합 항체 라이브러리로부터 유래될 수 있다. n-CoDeR® 기술을 이용하여, 완전 인간 CDR이 새로운 항체 분자로 재조합된다. 고유의 재조합 공정은 라이브러리가 인간 면역계에 의해 자연적으로 생성될 수 있는 것보다 더 광범위한 항체를 함유하도록 한다.
항체 생성
완전 인간 N-CoDeR 항체 파지 디스플레이 라이브러리를 사용하여, 전세포 및 단백질 패닝의 조합에 의해, 그리고 특정 방법의 개발을 통해 본 발명의 FGFR2-특이적 인간 모노클로날 항체를 단리하였다. 이들 방법은 세포 표면에 디스플레이된 FGFR2에 우선적으로 결합하고 뮤린 FGFR2 및 다른 종으로부터의 FGFR2에 대해 교차-반응성이며 FGFR2-관련 질환, 예컨대 암에서 발견되는 FGFR2 과다발현 및 공통적인 FGFR2 돌연변이에 비의존적인 결합 및 기능적 활성을 갖는 항체를 확인할 수 있는 패닝 절차 및 스크리닝 검정의 개발을 포함한다.
세포-표면 FGFR2에 대한 항체를 파지-디스플레이 기술 (PDT)에서의 3가지 비-통상적 접근법의 조합에 의해 개발하였다. 첫번째로, 재조합 가용성 인간 및 뮤린 FGFR2 Fc-융합 단백질의 여러 스플라이스 변이체 (알파, 베타, IIIb 및 IIIc)로 선택을 수행하여 매우 광범위한 스플라이스 변이체 교차-반응성에 대해 선택하였다. 두번째로, 이에 더하여 세포-표면 상에 FGFR2를 발현하는 KATO III 세포로 세포-표면 선택을 수행하였다. 세번째로, KATOIII 세포 및 재조합 가용성 인간 및 뮤린 FGFR1, FGFR2, FGFR3 및 FGFR4 Fc 융합 단백질의 여러 스플라이스 변이체 (알파, 베타, IIIb 및 IIIc) 전부에 걸쳐 수득한 파지 결과물의 계속적인 스크리닝을 허용하는 스크리닝 방법을 개발하여, 매우 광범위한 스플라이스 변이체 교차-반응성을 갖는 FGFR2 특이적 결합제 (FGFR1, FGFR3 및 FGFR4에는 결합하지 않음)를 선택하였다.
바람직한 Fab 단편의 확인 후에 이들을 전장 IgG로서 발현시켰다. 예를 들어, 항체 Fab 단편 M048-D01 (VH 쇄에 대해 서열 31, 및 VL 쇄에 대해 서열 32)을 인간 IgG1 M048-D01-hIgG1 (중쇄에 대해 서열 67, 및 경쇄에 대해 서열 68)로서 발현시키고, Fab 단편 M047-D08 (VH 쇄에 대해 서열 21, 및 VL 쇄에 대해 서열 22)을 인간 IgG1 M047-D08-hIgG1 (중쇄에 대해 서열 69, 및 경쇄에 대해 서열 70)로서 발현시켰다. 효율적 클로닝을 위해, 중쇄의 N-말단의 처음 3개의 아미노산 [EVQ] (서열 67 및 서열 69)을 또한 다르게는 [QVE]로서, 예를 들어 인간 IgG1 M048-D01-hIgG1의 중쇄의 변이체 (서열 222)로서 발현시킬 수 있었다. 효율적 클로닝을 위해, 경쇄의 N-말단을 아미노산 잔기, 예를 들어 알라닌에 의해 연장시킬 수 있었다. 이들 구축물을, 예를 들어 문헌 [Tom et al., Chapter 12 in Methods Express: Expression Systems edited by Micheal R. Dyson and Yves Durocher, Scion Publishing Ltd, 2007]에 기재된 바와 같이 포유동물 세포에서 일시적으로 발현시켰다. 간략하게, CMV-프로모터 기반 발현 플라스미드를 HEK293-6E 세포 내로 형질감염시키고, 페른바흐(Fernbach)-플라스크 또는 웨이브-백(Wave-Bag)에서 인큐베이션하였다. F17 배지 (인비트로젠(Invitrogen)) 중에서 5 내지 6일 동안 37℃에서 발현시켰다. 5 g/l 트립톤 TN1 (오르가노테크니(Organotechnie)), 1% 울트라-로우(Ultra-Low) IgG FCS (인비트로젠) 및 0.5 mM 발프로산 (시그마(Sigma))을 형질감염 24시간 후에 보충하였다.
이들 항체를 ELISA에서의 그의 결합 친화도, 및 가용성 FGFR2에 대한 비아코어 결합에 의해 추가로 특성화하였다. 다양한 종으로부터의 세포와의 FACS 결합을 수행하여, 마우스, 래트 및 인간 암 세포주 상에서 높은 친화도를 갖는 세포 결합 항체를 선택하였다.
이들 특정 방법의 조합은 고유의 항체 "M017-B02", "M021-H02", "M047-D08", "M048-D01", "M054-A05" 및 "M054-D03"의 단리를 허용하였다.
추가의 특성화는, 선택된 항체가 FGFR2의 N-말단에 있는 고유의 에피토프에 결합하여 그의 특별한 특징을 생성한다는 것을 밝혀내었다. 이들 고유의 항체를 시험관내 인산화 검정, 내재화 검정 및 생체내 종양 이종이식편 실험에서 추가로 특성화하였다. 선택된 항체는 SNU16 세포를 사용한 종양 이종이식편 실험에서 강하고 유의한 항종양 활성을 나타내었다.
펩티드 변이체
본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편은 본원에서 제공되는 특정 펩티드 서열에 제한되지 않는다. 오히려, 본 발명은 이들 폴리펩티드의 변이체도 또한 포함한다. 본 발명의 개시내용 및 통상적으로 이용가능한 기술 및 참고문헌을 참조하여, 당업자는 본원에 개시된 항체의 기능적 변이체를 제조, 시험 및 활용할 수 있을 것이며, FGFR2에 결합하는 능력을 갖는 변이체가 본 발명의 범위 내에 속한다는 것을 인지할 것이다.
변이체는, 예를 들어 본원에 개시된 펩티드 서열과 비교시 상보성 결정 영역 (CDR) (초가변) 및/또는 프레임워크 (FR) (가변) 도메인/위치가 하나 이상 변경된 항체를 포함할 수 있다. 상기 개념을 보다 잘 예시하기 위해, 항체 구조에 대한 간략한 설명이 하기 기재되어 있다.
항체는 2개의 펩티드 쇄로 구성되고, 각각은 1개 (경쇄) 또는 3개 (중쇄)의 불변 도메인 및 가변 영역 (VL, VH)을 함유하며, 후자는 각각의 경우에 4개의 FR 영역 및 3개의 개재된 CDR로 구성된다. 항원-결합 부위는 1개 이상의 CDR에 의해 형성되지만, FR 영역은 CDR을 위한 구조적 프레임워크를 제공하고, 따라서 항원 결합에서 중요한 역할을 수행한다. CDR 또는 FR 영역에서 1개 이상의 아미노산 잔기를 변경함으로써, 당업자는 일상적으로 항원에 대해, 예를 들어 새로운 또는 개선된 특성에 대해 스크리닝될 수 있는 돌연변이된 또는 다양화된 항체 서열을 생성할 수 있다.
본 발명의 추가로 바람직한 실시양태는 VH 및 VL 서열이 표 9에 나타낸 바와 같이 선택된 항체 또는 항원-결합 단편이다. 당업자는 표 9의 데이터를 사용하여 본 발명의 범위 내에 있는 펩티드 변이체를 설계할 수 있다. 1개 이상의 CDR 영역 내의 아미노산을 변화시킴으로써 변이체를 구축하는 것이 바람직하며; 변이체는 또한 1개 이상의 변경된 프레임워크 영역을 가질 수 있다. 변경은 프레임워크 영역에서도 또한 이루어질 수 있다. 예를 들어, 펩티드 FR 도메인은 배선 서열과 비교시 잔기의 변이가 존재하도록 변경될 수 있다.
다르게는, 당업자는 예를 들어 문헌 [Knappik A., et al., JMB 2000, 296:57-86]에 의해 기재된 절차를 이용하여 본원에 개시된 아미노산 서열을 이러한 항체의 동일한 부류의 공지된 서열과 비교함으로써 동일한 분석을 수행할 수 있다.
추가로, 항체 내의 1개 이상의 아미노산 잔기, 바람직하게는 1개 이상의 CDR 내의 아미노산 잔기의 다양화에 의한 최적화를 위한 출발점으로서 하나의 항체를 사용하고, 생성된 항체 변이체들의 집합체를 특성이 개선된 변이체에 대해 스크리닝함으로써 변이체를 수득할 수 있다. VL 및/또는 VH의 CDR3 내의 1개 이상의 아미노산 잔기의 다양화가 특히 바람직하다. 트리뉴클레오티드 돌연변이유발 (TRIM) 기술을 이용하여 DNA 분자들의 집합체를 합성함으로써 다양화를 수행할 수 있다 (문헌 [Virnekaes B. et al., Nucl. Acids Res. 1994, 22: 5600]). 항체 또는 그의 항원-결합 단편은, 예를 들어 반감기 변경을 유발하는 변형 (예를 들어, Fc 부분의 변형 또는 추가의 분자, 예컨대 PEG의 부착), 결합 친화도 변경 또는 ADCC 또는 CDC 활성 변경을 유발하는 변형을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 변형/변이를 갖는 분자를 포함한다.
항체의 변이체의 예는 표 10에 나타낸 바와 같이 M048-D01 (TPP-1397, TPP-1398, TPP-1399, TPP-1400, TPP-1401, TPP-1402 및 TPP-1403) 및 M047-D08 (TPP-1406, TPP-1407, TPP-1408, TPP-1409, TPP-1410, TPP-1411, TPP-1412 및 TPP-1415)에 대해 제공되어 있다. 이들 변이체 항체의 개선된 특성을 표 11에 나타내었다.
보존적 아미노산 변이체
본원에 기재된 항체 펩티드 서열의 전체적인 분자 구조를 보존하는 폴리펩티드 변이체를 제조할 수 있다. 당업자는 개별 아미노산의 특성을 고려하여 일부 합리적인 치환을 인지할 것이다. 아미노산 치환, 즉 "보존적 치환"은, 예를 들어 관련 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성의 유사성에 기반하여 이루어질 수 있다.
예를 들어, (a) 비극성 (소수성) 아미노산은 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌을 포함하고; (b) 극성 중성 아미노산은 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민을 포함하고; (c) 양성으로 하전된 (염기성) 아미노산은 아르기닌, 리신 및 히스티딘을 포함하며; (d) 음성으로 하전된 (산성) 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함한다. 치환은 전형적으로 군 (a)-(d) 내에서 이루어질 수 있다. 또한, 글리신 및 프롤린은 α-나선을 파괴하는 그의 능력에 기반하여 서로 치환될 수 있다. 유사하게, 특정 아미노산, 예컨대 알라닌, 시스테인, 류신, 메티오닌, 글루탐산, 글루타민, 히스티딘 및 리신은 α-나선에서 보다 통상적으로 발견되는 반면, 발린, 이소류신, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판 및 트레오닌은 β-병풍 시트에서 보다 통상적으로 발견된다. 글리신, 세린, 아스파르트산, 아스파라긴 및 프롤린은 통상적으로 턴에서 발견된다. 일부 바람직한 치환은 하기 군 중에서 이루어질 수 있다: (i) S 및 T; (ii) P 및 G; 및 (iii) A, V, L 및 I. 공지된 유전자 코드, 및 재조합 및 합성 DNA 기술을 고려하여, 숙련된 과학자는 보존적 아미노산 변이체를 코딩하는 DNA를 용이하게 구축할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 2개의 폴리펩티드 서열 사이의 "서열 동일성"은 서열 사이에 동일한 아미노산의 백분율을 나타낸다. "서열 상동성"은 동일하거나 또는 보존적 아미노산 치환을 나타내는 아미노산의 백분율을 나타낸다.
본 발명의 DNA 분자
본 발명은 또한 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 코딩하는 DNA 분자에 관한 것이다. 이들 서열은 서열 3, 4, 13, 14, 23, 24, 33, 34, 43, 44, 53 및 54에 제시된 DNA 분자를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 DNA 분자는 본원에 개시된 서열에 제한되지 않고, 그의 변이체도 또한 포함한다. 본 발명에 속하는 DNA 변이체는 혼성화에서의 그의 물리적 특성을 참조하여 기재될 수 있다. 당업자는 핵산 혼성화 기술을 이용하여, DNA가 그의 상보물을 확인하는데 사용될 수 있고, DNA가 이중 가닥이기 때문에 그의 등가물 또는 상동체를 확인하는데 사용될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 100% 미만의 상보성으로 혼성화가 일어날 수 있다는 것도 또한 인지될 것이다. 그러나, 조건들의 적절한 선택 하에, 혼성화 기술을 이용하여 DNA 서열들을 특정한 프로브에 대한 이들의 구조적 관련성에 기반하여 구별할 수 있다. 이러한 조건에 관한 지침에 대해서는, 상기 문헌 [Sambrook et al., 1989] 및 문헌 [Ausubel et al., 1995 (Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Sedman, J. G., Smith, J. A., & Struhl, K. eds. (1995). Current Protocols in Molecular Biology. New York: John Wiley and Sons)]을 참조한다.
2개의 폴리뉴클레오티드 서열 사이의 구조적 유사성은 2개의 서열이 서로 혼성화할 조건의 "엄격성"의 함수로서 표현될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "엄격성"은 조건이 혼성화에 불리한 정도를 지칭한다. 엄격한 조건은 혼성화에 강하게 불리하고, 이러한 조건 하에서는 구조적으로 가장 관련된 분자들만 서로 혼성화할 것이다. 반대로, 엄격하지 않은 조건은 보다 낮은 정도의 구조적 관련성을 나타내는 분자들의 혼성화에 유리하다. 따라서, 혼성화 엄격성은 2개의 핵산 서열의 구조적 관계와 직접적으로 상호연관된다. 하기 관계가 혼성화와 관련성을 상호연관시키는데 유용하다 (식 중, Tm은 핵산 듀플렉스의 용융 온도임):
a. Tm = 69.3 + 0.41(G+C)%
b. 미스매치된 염기 쌍의 개수가 1% 증가할 때마다 듀플렉스 DNA의 Tm이 1℃만큼 감소된다.
c. (Tm)μ2 - (Tm)μ1 = 18.5 log10μ2/μ1
(식 중, μ1 및 μ2는 2개의 용액의 이온 강도임).
혼성화 엄격성은 전체적인 DNA 농도, 이온 강도, 온도, 프로브 크기, 및 수소 결합을 파괴하는 작용제의 존재를 비롯한 다수의 인자의 함수이다. 혼성화를 촉진하는 인자는 높은 DNA 농도, 높은 이온 강도, 낮은 온도, 보다 긴 프로브 크기, 및 수소 결합을 파괴하는 작용제의 부재를 포함한다. 혼성화는 전형적으로 두 단계로 수행된다: "결합" 단계 및 "세척" 단계.
기능적으로 동등한 변이체
본 발명의 범위 내의 DNA 변이체의 또 다른 부류가 이들이 코딩하는 생성물과 관련하여 기재될 수 있다. 이들 기능적으로 동등한 폴리뉴클레오티드는 이들이 유전자 코드의 축중성으로 인해 서열 1, 2, 5-12, 15-22, 25-32, 35-42, 45-52, 55-60에서 발견되는 동일한 펩티드 서열을 코딩한다는 사실을 특징으로 한다.
본원에서 제공되는 DNA 분자의 변이체는 몇몇 다양한 방식으로 구축될 수 있는 것으로 인지된다. 예를 들어, 이들은 완전히 합성 DNA로서 구축될 수 있다. 20 내지 약 150개 뉴클레오티드 범위의 올리고뉴클레오티드를 효율적으로 합성하는 방법이 널리 이용가능하다. 문헌 [Ausubel et al., section 2.11, Supplement 21 (1993)]을 참조한다. 중첩되는 올리고뉴클레오티드는 문헌 [Khorana et al., J. Mol. Biol. 72:209-217 (1971)]에 처음 보고된 방식으로 합성되고 어셈블리될 수 있으며; 또한 상기 문헌 [Ausubel et al., Section 8.2]을 참조한다. 합성 DNA는 바람직하게는 적절한 벡터 내로의 클로닝을 용이하게 하기 위해 유전자의 5' 및 3' 말단에서 조작된 편리한 제한 부위를 갖도록 설계된다.
나타낸 바와 같이, 변이체를 생성하는 방법은 본원에 개시된 DNA 중 하나로 출발하여 부위-지정 돌연변이유발을 수행하는 것이다. 상기 문헌 [Ausubel et al., chapter 8, Supplement 37 (1997)]을 참조한다. 전형적인 방법에서는, 표적 DNA를 단일-가닥 DNA 박테리오파지 비히클 내로 클로닝한다. 단일-가닥 DNA를 단리하고, 목적 뉴클레오티드 변경(들)을 함유하는 올리고뉴클레오티드와 혼성화시킨다. 상보적 가닥을 합성하고, 이중 가닥 파지를 숙주 내로 도입시킨다. 생성된 자손체 중 일부는 DNA 서열분석을 이용하여 확인될 수 있는 목적 돌연변이체를 함유할 것이다. 또한, 자손체 파지가 목적 돌연변이체일 가능성을 증가시키는 다양한 방법이 이용가능하다. 이들 방법은 당업계에 널리 공지되어 있고, 이러한 돌연변이체를 생성하기 위한 키트가 상업적으로 입수가능하다.
재조합 DNA 구축물 및 발현
본 발명은 하나 이상의 본 발명의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 DNA 구축물을 추가로 제공한다. 본 발명의 재조합 구축물은 벡터, 예컨대 플라스미드, 파지미드, 파지 또는 바이러스 벡터와 함께 사용되고, 이러한 벡터 내로 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 코딩하는 DNA 분자가 삽입된다.
본원에서 제공되는 항체, 항원 결합 부분, 또는 그의 유도체는 숙주 세포에서의 경쇄 및 중쇄 또는 그의 일부분을 코딩하는 핵산 서열의 재조합 발현에 의해 제조될 수 있다. 항체, 항원 결합 부분, 또는 그의 유도체를 재조합적으로 발현시키기 위해, 경쇄 및 중쇄가 숙주 세포에서 발현되도록 경쇄 및/또는 중쇄 또는 그의 일부분을 코딩하는 DNA 단편을 보유하는 하나 이상의 재조합 발현 벡터로 숙주 세포를 형질감염시킬 수 있다. 표준 재조합 DNA 방법을 이용하여 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 핵산을 제조 및/또는 수득하고, 이들 핵산을 재조합 발현 벡터 내로 혼입시키고, 벡터를 숙주 세포, 예컨대 문헌 [Sambrook, Fritsch and Maniatis (eds.), Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989), Ausubel, F. M. et al. (eds.) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, (1989)] 및 미국 특허 번호 4,816,397 (Boss et al.)에 기재된 것들 내로 도입시킨다.
또한, 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 영역을 코딩하는 핵산 서열을, 예를 들어 전장 항체 쇄, Fab 단편 또는 scFv를 코딩하는 핵산 서열로 전환시킬 수 있다. VL- 또는 VH-코딩 DNA 단편을, 예를 들어 항체 불변 영역 또는 가요성 링커를 코딩하는 또 다른 DNA 단편에 (2개의 DNA 단편에 의해 코딩되는 아미노산 서열들이 인-프레임이도록) 작동적으로 연결시킬 수 있다. 인간 중쇄 및 경쇄 불변 영역의 서열은 당업계에 공지되어 있고 (예를 들어, 문헌 [Kabat, E. A., el al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242] 참조), 이들 영역을 포함하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 수득될 수 있다.
특정 검정에서, 뮤린 IgG로서의 본 발명의 항체의 발현이 바람직한데, 예를 들어 인간 샘플을 사용한 면역조직화학은 뮤린 항체를 사용함으로써 보다 쉽게 분석될 수 있다. 따라서, 예를 들어 항체 Fab 단편 M048-D01 (VH 쇄에 대해 서열 31, 및 VL 쇄에 대해 서열 32)을 M048-D01-mIgG2a (중쇄에 대해 서열 221)라 불리는 뮤린 IgG2a로서 발현시켰다. 상기 항체를 또한 대조군으로서 실시예 17에 사용하였다.
scFv를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 생성하기 위해, VL 및 VH 영역이 가요성 링커에 의해 연결된 인접한 단일-쇄 단백질로서 VH 및 VL 서열이 발현될 수 있도록, VH- 및 VL-코딩 핵산을 가요성 링커를 코딩하는 또 다른 단편에 작동적으로 연결시킬 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Bird et al. (1988) Science 242:423-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., Nature (1990) 348:552-554] 참조).
항체, 항원 결합 부분 또는 그의 유도체를 발현시키기 위해, 표준 재조합 DNA 발현 방법을 이용할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Goeddel; Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)] 참조). 예를 들어, 목적 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 발현 벡터 내로 삽입시킨 다음, 이를 적합한 숙주 세포 내로 형질감염시킬 수 있다. 적합한 숙주 세포는 원핵 및 진핵 세포이다. 원핵 숙주 세포의 예는 예를 들어 박테리아이고, 진핵 숙주 세포의 예는 효모, 곤충 또는 포유동물 세포이다. 일부 실시양태에서, 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 DNA는 개별 벡터 내로 삽입된다. 다른 실시양태에서, 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 DNA는 동일한 벡터 내로 삽입된다. 조절 서열의 선택을 비롯하여, 발현 벡터의 설계는 숙주 세포의 선택, 목적 단백질의 발현 수준, 및 발현이 구성적인지 또는 유도성인지의 여부와 같은 인자에 의해 영향을 받는 것으로 이해된다.
박테리아 발현
목적 단백질을 코딩하는 구조적 DNA 서열을 적합한 번역 개시 및 종결 신호와 함께 기능성 프로모터가 있는 작동가능한 리딩 페이즈 내에 삽입함으로써 박테리아 사용에 유용한 발현 벡터가 구축된다. 상기 벡터는 벡터의 유지를 보증하고 바람직한 경우에는 숙주 내에서의 증폭을 제공하도록 하나 이상의 표현형 선택 마커 및 복제 기원을 포함할 것이다. 형질전환에 적합한 원핵 숙주는 이. 콜라이(E. coli), 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium), 및 슈도모나스(Pseudomonas), 스트렙토미세스(Streptomyces) 및 스타필로코쿠스(Staphylococcus) 속에 속하는 다양한 종을 포함한다.
박테리아 벡터는, 예를 들어 박테리오파지-, 플라스미드- 또는 파지미드-기반일 수 있다. 이들 벡터는 전형적으로 널리 공지되어 있는 클로닝 벡터 pBR322 (ATCC 37017)의 요소들을 함유하는 상업적으로 입수가능한 플라스미드로부터 유래된 선택 마커 및 박테리아 복제 기원을 함유할 수 있다. 적합한 숙주 균주의 형질전환 및 숙주 균주의 적절한 세포 밀도로의 성장 후에, 선택된 프로모터를 적절한 수단 (예를 들어, 온도 변환 또는 화학적 유도)에 의해 탈억제/유도하고, 세포를 추가의 기간 동안 배양한다. 세포를 전형적으로 원심분리에 의해 수확하고, 물리적 또는 화학적 수단에 의해 파괴하고, 생성된 조 추출물을 추가 정제를 위해 유지한다.
박테리아 시스템에서, 발현시킬 단백질에 대해 의도되는 용도에 따라 다수의 발현 벡터가 유리하게 선택될 수 있다. 예를 들어, 항체를 생성하거나 또는 펩티드 라이브러리를 스크리닝하기 위해 다량의 이러한 단백질이 생산되어야 하는 경우에는, 용이하게 정제되는 융합 단백질 생성물의 높은 수준의 발현을 지시하는 벡터가 바람직할 수 있다.
따라서, 본 발명의 한 실시양태는 본 발명의 신규 항체를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터이다. 예시적인 설명에 대해서는 실시예 2를 참조한다.
본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 자연적으로 정제된 생성물, 화학적 합성 절차의 생성물, 및 예를 들어 이. 콜라이, 바실루스 서브틸리스, 살모넬라 티피뮤리움, 및 슈도모나스, 스트렙토미세스 및 스타필로코쿠스 속에 속하는 다양한 종을 비롯한 원핵 숙주, 바람직하게는 이. 콜라이 세포로부터 재조합 기술에 의해 생산된 생성물을 포함한다.
포유동물 발현 및 정제
포유동물 숙주 세포 발현을 위한 바람직한 조절 서열은 포유동물 세포에서의 높은 수준의 단백질 발현을 지시하는 바이러스 요소, 예컨대 시토메갈로바이러스 (CMV) (예컨대, CMV 프로모터/인핸서), 원숭이 바이러스 40 (SV40) (예컨대, SV40 프로모터/인핸서), 아데노바이러스 (예를 들어, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터 (AdMLP)) 및 폴리오마로부터 유래된 프로모터 및/또는 인핸서를 포함한다. 바이러스 조절 요소 및 그의 서열에 대한 추가 설명에 대해서는, 예를 들어 U.S. 5,168,062 (Stinski), U.S. 4,510,245 (Bell et al.) 및 U.S. 4,968,615 (Schaffner et al.)를 참조한다. 재조합 발현 벡터는 또한 복제 기원 및 선택 마커를 포함할 수 있다 (예를 들어, U.S. 4,399,216, 4,634,665 및 U.S. 5,179,017 (Axel et al.) 참조). 적합한 선택 마커는 벡터가 도입된 숙주 세포에 G418, 히그로마이신 또는 메토트렉세이트와 같은 약물에 대한 저항성을 부여하는 유전자를 포함한다. 예를 들어, 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR) 유전자는 메토트렉세이트에 대한 저항성을 부여하고, neo 유전자는 G418에 대한 저항성을 부여한다. 효율적 클로닝을 위해, 중쇄의 N-말단의 처음 3개의 아미노산 [EVQ] (서열 67 및 서열 69)은 또한 다르게는 [QVE]로서, 예를 들어 인간 IgG1 M048-D01-hIgG1의 중쇄의 변이체 (서열 222)로서 발현될 수 있다. 효율적 클로닝을 위해, 경쇄의 N-말단은 아미노산 잔기, 예를 들어 알라닌에 의해 연장될 수 있다.
숙주 세포 내로의 발현 벡터의 형질감염은 표준 기술, 예컨대 전기천공, 인산칼슘 침전, 및 DEAE-덱스트란 형질감염을 이용하여 수행할 수 있다.
본원에서 제공되는 항체, 항원 결합 부분, 또는 그의 유도체를 발현하기 위한 적합한 포유동물 숙주 세포는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 [예를 들어, 문헌 [R. J. Kaufman and P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621]에 기재된 바와 같은 DHFR 선택 마커와 함께 사용되는, 문헌 [Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220]에 기재된 dhfr-CHO 세포 포함], NSO 골수종 세포, COS 세포 및 SP2 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 발현 벡터는 발현된 단백질이 숙주 세포를 성장시키는 배양 배지 중으로 분비되도록 설계된다. 항체, 항원 결합 부분, 또는 그의 유도체는 표준 단백질 정제 방법을 이용하여 배양 배지로부터 회수될 수 있다.
본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 황산암모늄 또는 에탄올 침전, 산 추출, 단백질 A 크로마토그래피, 단백질 G 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포-셀룰로스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 히드록실아파타이트 크로마토그래피 및 렉틴 크로마토그래피를 포함하지만 이에 제한되지는 않는 널리 공지된 방법에 의해 재조합 세포 배양물로부터 회수 및 정제될 수 있다. 또한, 고성능 액체 크로마토그래피 ("HPLC")를 정제용으로 사용할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Colligan, Current Protocols in Immunology, 또는 Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, N.Y., (1997-2001), e.g., Chapters 1, 4, 6, 8, 9, 10]을 참조하고, 이들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 자연적으로 정제된 생성물, 화학적 합성 절차의 생성물, 및 예를 들어 효모, 고등 식물, 곤충 및 포유동물 세포를 비롯한 진핵 숙주로부터 재조합 기술에 의해 생산된 생성물을 포함한다. 재조합 생산 절차에 사용되는 숙주에 따라, 본 발명의 항체는 글리코실화될 수 있거나 또는 비-글리코실화될 수 있다. 이러한 방법은 다수의 표준 실험 설명서, 예컨대 상기 문헌 [Sambrook, Section 17.37-17.42; Ausubel, Chapters 10, 12, 13, 16, 18 and 20]에 기재되어 있다.
따라서, 본 발명의 한 실시양태는 또한 벡터 또는 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포이고, 여기서 숙주 세포는 고등 진핵 숙주 세포, 예컨대 포유동물 세포, 하등 진핵 숙주 세포, 예컨대 효모 세포일 수 있고, 원핵 세포, 예컨대 박테리아 세포일 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시양태는 숙주 세포를 적합한 조건 하에 배양하고 항체 및 항원 결합 단편을 회수하는 것을 포함하는, 숙주 세포를 이용하여 상기 항체를 생산하는 방법이다.
따라서, 본 발명의 또 다른 실시양태는 본 발명의 숙주 세포, 및 적어도 95 중량% 동질성까지의 본 발명에 따른 항체 (예를 들어, 항체 M048-D01-hIgG1)의 정제에 의한 이들 항체의 생산이다.
치료 방법
치료 방법은 치료를 필요로 하는 대상체에게 본 발명에 의해 고려되는 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함한다. "치료 유효량"은 단일 용량으로서 또는 다중 용량 요법에 따라, 단독으로 또는 다른 작용제와 조합되어, 대상체의 치료된 영역에서 FGFR2-양성 세포를 고갈시키는데 충분한 양이고, 유해한 상태의 경감을 유발하면서 독성학적으로 허용가능한 양인 항체 또는 항원-결합 단편의 양으로서 본원에서 정의된다. 대상체는 인간 또는 비-인간 동물 (예를 들어, 토끼, 래트, 마우스, 개, 원숭이 또는 다른 하등 영장류)일 수 있다.
본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 공지된 의약과 공-투여될 수 있고, 일부 경우에는 항체 자체가 변형될 수 있다. 예를 들어, 잠재적으로 효능을 추가로 증가시키기 위해 항체가 세포독성제 또는 방사성동위원소에 접합될 수 있다.
본 발명의 항체는 단독 제약 작용제로서 또는 하나 이상의 추가의 치료제와 조합되어 투여될 수 있고, 여기서 조합물은 허용되지 않는 부작용을 전혀 유발하지 않는다. 상기 조합 요법은 본 발명의 항체 및 하나 이상의 추가의 치료제를 함유하는 단일 제약 투여 제제의 투여, 뿐만 아니라 독자적인 개별 제약 투여 제제로의 본 발명의 항체 및 각각의 추가의 치료제의 투여를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 항체 및 치료제가 환자에게 단일 경구 투여 조성물, 예컨대 정제 또는 캡슐로 함께 투여될 수 있거나, 또는 각각의 작용제가 개별 투여 제제로 투여될 수 있다.
개별 투여 제제가 사용되는 경우에, 본 발명의 항체 및 하나 이상의 추가의 치료제는 본질적으로 동일한 시간에 (예를 들어, 동시에), 또는 시간 간격을 두고 개별적으로 (예를 들어, 순차적으로) 투여될 수 있다.
특히, 본 발명의 항체는 다른 항종양제, 예컨대 알킬화제, 항대사물, 식물-유래 항종양제, 호르몬 요법제, 토포이소머라제 억제제, 캄프토테신 유도체, 키나제 억제제, 표적화 약물, 항체, 인터페론 및/또는 생물학적 반응 조절제, 항혈관신생 화합물, 및 다른 항종양 약물과의 고정 또는 개별 조합물에서 사용될 수 있다. 이와 관련하여, 하기는 본 발명의 항체와 조합되어 사용될 수 있는 제2 작용제의 예의 비제한적 목록이다:
알킬화제는 질소 머스타드 N-옥시드, 시클로포스파미드, 이포스파미드, 티오테파, 라니무스틴, 니무스틴, 테모졸로미드, 알트레타민, 아파지쿠온, 브로스탈리신, 벤다무스틴, 카르무스틴, 에스트라무스틴, 포테무스틴, 글루포스파미드, 마포스파미드, 벤다무스틴 및 미토락톨을 포함하지만 이에 제한되지는 않고; 백금-배위 알킬화 화합물은 시스플라틴, 카르보플라틴, 엡타플라틴, 로바플라틴, 네다플라틴, 옥살리플라틴 또는 사트라플라틴을 포함하지만 이에 제한되지는 않고;
항-대사물은 메토트렉세이트, 6-메르캅토퓨린 리보시드, 메르캅토퓨린, 단독의 또는 류코보린과 조합된 5-플루오로우라실, 테가푸르, 독시플루리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 시타라빈 옥포스페이트, 에노시타빈, 겜시타빈, 플루다라빈, 5-아자시티딘, 카페시타빈, 클라드리빈, 클로파라빈, 데시타빈, 에플로르니틴, 에티닐시티딘, 시토신 아라비노시드, 히드록시우레아, 멜팔란, 넬라라빈, 놀라트렉세드, 옥포스파이트, 이나트륨 프레메트렉세드, 펜토스타틴, 펠리트렉솔, 랄티트렉세드, 트리아핀, 트리메트렉세이트, 비다라빈, 빈크리스틴 및 비노렐빈을 포함하지만 이에 제한되지는 않고;
호르몬 요법제는 엑세메스탄, 루프론, 아나스트로졸, 독세르칼시페롤, 파드로졸, 포르메스탄, 11-베타 히드록시스테로이드 데히드로게나제 1 억제제, 17-알파 히드록실라제/17,20 리아제 억제제, 예컨대 아비라테론 아세테이트, 5-알파 리덕타제 억제제, 예컨대 피나스테리드 및 에프리스테리드, 항에스트로겐, 예컨대 타목시펜 시트레이트 및 풀베스트란트, 트렐스타, 토레미펜, 랄록시펜, 라소폭시펜, 레트로졸, 항안드로겐, 예컨대 비칼루타미드, 플루타미드, 미페프리스톤, 닐루타미드, 카소덱스, 및 항프로게스테론 및 그의 조합물을 포함하지만 이에 제한되지는 않고;
식물-유래 항종양 물질은, 예를 들어 유사분열 억제제, 예를 들어 에포틸론, 예컨대 사고필론, 익사베필론 및 에포틸론 B, 빈블라스틴, 빈플루닌, 도세탁셀 및 파클리탁셀로부터 선택된 것들을 포함하고;
세포독성 토포이소머라제 억제제는 아클라루비신, 독소루비신, 아모나피드, 벨로테칸, 캄프토테신, 10-히드록시캄프토테신, 9-아미노캄프토테신, 디플로모테칸, 이리노테칸, 토포테칸, 에도테카린, 에핌비신, 에토포시드, 엑사테칸, 기마테칸, 루르토테칸, 미톡산트론, 피람비신, 픽산트론, 루비테칸, 소부족산, 타플루포시드, 및 그의 조합물을 포함하지만 이에 제한되지는 않고;
면역물질은 인터페론, 예컨대 인터페론 알파, 인터페론 알파-2a, 인터페론 알파-2b, 인터페론 베타, 인터페론 감마-1a 및 인터페론 감마-n1, 및 다른 면역 증강제, 예컨대 L19-IL2 및 다른 IL2 유도체, 필그라스팀, 렌티난, 시조필란, 테라시스, 우베니멕스, 알데스류킨, 알렘투주맙, BAM-002, 다카르바진, 다클리주맙, 데니류킨, 겜투주맙, 오조가미신, 이브리투모맙, 이미퀴모드, 레노그라스팀, 렌티난, 흑색종 백신 (코릭사(Corixa)), 몰그라모스팀, 사르그라모스팀, 타소네르민, 테크류킨, 티말라신, 토시투모맙, 빔리진, 에프라투주맙, 미투모맙, 오레고보맙, 펨투모맙 및 프로벤지를 포함하고;
생물학적 반응 조절제는 살아있는 유기체의 방어 메카니즘 또는 조직 세포의 생물학적 반응, 예컨대 생존, 성장 또는 분화를 변형시켜 이들이 항종양 활성을 갖도록 지시하는 작용제이고; 이러한 작용제는, 예를 들어 크레스틴, 렌티난, 시조피란, 피시바닐, 프로뮨 및 우베니멕스를 포함하고;
항혈관신생 화합물은 아시트레틴, 아플리베르셉트, 안지오스타틴, 아플리딘, 아센타르, 악시티닙, 베바시주맙, 브리바닙 알라니네이트, 실렌그티드, 콤브레타스타틴, 엔도스타틴, 펜레티니드, 할로푸기논, 파조파닙, 라니비주맙, 레비마스타트, 레센틴, 레고라페닙, 리모밥, 레블리미드, 소라페닙, 스쿠알라민, 수니티닙, 텔라티닙, 탈리도미드, 우크라인, 바탈라닙 및 비탁신을 포함하지만 이에 제한되지는 않고;
항체는 트라스투주맙, 세툭시맙, 베바시주맙, 리툭시맙, 티실리무맙, 이필리무맙, 루밀릭시맙, 카투막소맙, 아타시셉트, 오레고보맙 및 알렘투주맙을 포함하지만 이에 제한되지는 않고;
VEGF 억제제, 예컨대 예를 들어 소라페닙, 레고라페닙, 베바시주맙, 수니티닙, 레센틴, 악시티닙, 아플리베르셉트, 텔라티닙, 브리바닙 알라니네이트, 바탈라닙, 파조파닙 및 라니비주맙;
EGFR (HER1) 억제제, 예컨대 예를 들어 세툭시맙, 파니투무맙, 벡티빅스, 게피티닙, 에를로티닙 및 작티마;
HER2 억제제, 예컨대 예를 들어 라파티닙, 트라투주맙 및 페르투주맙;
mTOR 억제제, 예컨대 예를 들어 템시롤리무스, 시롤리무스/라파마이신 및 에베롤리무스;
c-Met 억제제;
PI3K 및 AKT 억제제;
CDK 억제제, 예컨대 로스코비틴 및 플라보피리돌;
스핀들 어셈블리 체크포인트 억제제 및 표적화된 항유사분열제, 예컨대 PLK 억제제, 오로라 억제제 (예를 들어, 헤스페라딘), 체크포인트 키나제 억제제 및 KSP 억제제;
HDAC 억제제, 예컨대 예를 들어 파노비노스타트, 보리노스타트, MS275, 벨리노스타트 및 LBH589;
HSP90 및 HSP70 억제제;
프로테아솜 억제제, 예컨대 보르테조밉 및 카르필조밉;
세린/트레오닌 키나제 억제제, 예컨대 MEK 억제제 및 Raf 억제제, 예컨대 소라페닙;
파르네실 트랜스퍼라제 억제제, 예컨대 예를 들어 티피파르닙;
티로신 키나제 억제제, 예컨대 예를 들어 다사티닙, 닐로티빕, 레고라페닙, 보수티닙, 소라페닙, 베바시주맙, 수니티닙, 세디라닙, 악시티닙, 아플리베르셉트, 텔라티닙, 이마티닙 메실레이트, 브리바닙 알라니네이트, 파조파닙, 라니비주맙, 바탈라닙, 세툭시맙, 파니투무맙, 벡티빅스, 게피티닙, 에를로티닙, 라파티닙, 트라투주맙, 페르투주맙 및 c-Kit 억제제;
비타민 D 수용체 효능제;
Bcl-2 단백질 억제제, 예컨대 오바토클락스, 오블리메르센 소듐 및 고시폴;
분화 클러스터 20 수용체 길항제, 예컨대 예를 들어 리툭시맙;
리보뉴클레오티드 리덕타제 억제제, 예컨대 예를 들어 겜시타빈;
종양 괴사 아폽토시스 유도 리간드 수용체 1 효능제, 예컨대 예를 들어 마파투무맙;
5-히드록시트립타민 수용체 길항제, 예컨대 예를 들어 rEV598, 크살리프로드, 팔로노세트론 히드로클로라이드, 그라니세트론, 진돌 및 AB-1001;
인테그린 억제제, 예컨대 알파5-베타1 인테그린 억제제, 예컨대 예를 들어 E7820, JSM 6425, 볼로식시맙 및 엔도스타틴;
안드로겐 수용체 길항제, 예컨대 예를 들어 난드롤론 데카노에이트, 플루옥시메스테론, 안드로이드, 프로스트-에이드, 안드로무스틴, 비칼루타미드, 플루타미드, 아포-시프로테론, 아포-플루타미드, 클로르마디논 아세테이트, 안드로큐어, 타비, 시프로테론 아세테이트 및 닐루타미드;
아로마타제 억제제, 예컨대 예를 들어 아나스트로졸, 레트로졸, 테스토락톤, 엑세메스탄, 아미노글루테티미드 및 포르메스탄;
매트릭스 메탈로프로테이나제 억제제;
다른 항암제, 예컨대 예를 들어 알리트레티노인, 앰플리겐, 아트라센탄 벡사로텐, 보르테조밉, 보센탄, 칼시트리올, 엑시술린드, 포테무스틴, 이반드론산, 밀테포신, 미톡산트론, I-아스파라기나제, 프로카르바진, 다카르바진, 히드록시카르바미드, 페가스파르가제, 펜토스타틴, 타자로텐, 벨케이드, 갈륨 니트레이트, 칸포스파미드, 다리나파르신 및 트레티노인.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 화학요법 (즉, 세포독성제), 항호르몬 및/또는 표적화 요법, 예컨대 다른 키나제 억제제 (예를 들어, EGFR 억제제), mTOR 억제제 및 혈관신생 억제제와 조합되어 사용될 수 있다.
본 발명의 화합물은 또한 방사선 요법 및/또는 외과적 개입과 함께 암 치료에 사용될 수 있다.
일부 경우에, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편 자체가 변형될 수 있다. 예를 들어, 잠재적으로 효능을 추가로 증가시키기 위해 항체가 상기 언급된 화합물 중 임의의 것 (그러나 이에 제한되지는 않음) 또는 임의의 방사성동위원소에 접합될 수 있다. 추가로, 본 발명의 항체는 그대로 또는 조성물로, 연구 및 진단학에서, 또는 당업계에 널리 공지되어 있는 분석용 참조 표준물 등으로서 활용될 수 있다.
본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 이상 FGFR2-신호전달을 갖는 다양한 상황, 예를 들어 세포 증식성 장애, 예컨대 암 또는 섬유화 질환에서 치료 또는 진단 도구로서 사용될 수 있다. 본 발명의 항체로의 치료에 특히 적합한 장애 및 상태는 고형 종양, 예컨대 유방, 기도, 뇌, 생식 기관, 소화관, 요로, 안구, 간, 피부, 두경부, 갑상선, 부갑상선의 암, 및 그의 원격 전이이다. 이들 장애는 또한 림프종, 육종 및 백혈병을 포함한다.
소화관의 종양은 항문암, 결장암, 결장직장암, 식도암, 담낭암, 위암, 췌장암, 직장암, 소장암 및 타액선암을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
식도암의 예는 식도 세포 암종 및 선암종, 뿐만 아니라 편평 세포 암종, 평활근육종, 악성 흑색종, 횡문근육종 및 림프종을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
위암의 예는 장형 및 미만형 위 선암종을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
췌장암의 예는 관 선암종, 선편평상피 암종 및 췌장 내분비 종양을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
유방암의 예는 삼중 음성 유방암, 침습성 관 암종, 침습성 소엽성 암종, 관상피내 암종 및 상피내 소엽성 암종을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
기도암의 예는 소세포 및 비소세포 폐 암종, 뿐만 아니라 기관지 선종 및 흉막폐 모세포종을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
뇌암의 예는 뇌간 및 시상하부 신경교종, 소뇌 및 뇌 성상세포종, 교모세포종, 수모세포종, 상의세포종, 뿐만 아니라 신경외배엽 및 송과체 종양을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
남성 생식 기관의 종양은 전립선암 및 고환암을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 여성 생식 기관의 종양은 자궁내막암, 자궁경부암, 난소암, 질암 및 외음부암, 뿐만 아니라 자궁 육종을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
난소암의 예는 혈청 종양, 자궁내막양 종양, 점액성 낭선암종, 과립막 세포 종양, 세르톨리-라이디히 세포 종양 및 남성배종을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
자궁경부암의 예는 편평 세포 암종, 선암종, 선편평상피 암종, 소세포 암종, 신경내분비 종양, 유리질 세포 암종 및 융모선 선암종을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
요로의 종양은 방광암, 음경암, 신장암, 신우암, 요관암, 요도암, 및 유전성 및 산발성 유두상 신암을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
신장암의 예는 신세포 암종, 요로상피 세포 암종, 사구체옆 세포 종양 (레닌종), 혈관근지방종, 신장 호산과립세포종, 벨리니관 암종, 신장의 투명-세포 육종, 중배엽성 신종 및 윌름스 종양을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
방광암의 예는 이행 세포 암종, 편평 세포 암종, 선암종, 육종 및 소세포 암종을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
안암은 안내 흑색종 및 망막모세포종을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
간암의 예는 간세포성 암종 (섬유층판성 변이체를 갖거나 갖지 않는 간 세포 암종), 담관암종 (간내 담관 암종) 및 혼합 간세포성 담관암종을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
피부암은 편평 세포 암종, 카포시 육종, 악성 흑색종, 메르켈 세포 피부암 및 비-흑색종 피부암을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
두경부암은 편평 세포 두경부암, 후두암, 하인두암, 비인두암, 구인두암, 구순암 및 구강암, 및 편평세포암을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
림프종은 AIDS-관련 림프종, 비-호지킨 림프종, 피부 T-세포 림프종, 버킷 림프종, 호지킨병 및 중추 신경계의 림프종을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
육종은 연부 조직 육종, 골육종, 악성 섬유성 조직구종, 림프육종 및 횡문근육종을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
백혈병은 급성 골수성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수 백혈병 및 모발상 세포 백혈병을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 위암, 유방암, 췌장암, 결장직장암, 신장암, 전립선암, 난소암, 자궁경부암, 폐암, 자궁내막암, 식도암, 두경부암, 간세포성 암종, 흑색종 및 방광암으로 이루어진 군에 포함되는 암 질환의 치료 또는 진단을 위한 치료 또는 진단 방법에 적합하다. 또한, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 또한 FGFR2가 관여하는 다양한 다른 장애, 예컨대 비제한적으로 섬유화 질환, 예컨대 폐포내 섬유증, 실리카-유발 폐 섬유증, 실험적 폐 섬유증, 특발성 폐 섬유증, 신섬유증, 뿐만 아니라 림프관평활근종증, 다낭성 난소 증후군, 여드름, 건선, 진주종, 진주종성 만성 중이염, 치주염, 일광 흑색점, 장 질환, 아테롬성동맥경화증 또는 자궁내막증에서 치료 또는 진단 도구로서 사용될 수 있다.
상기 언급된 장애는 인간에서 잘 특성화되어 있지만, 포유동물을 비롯한 다른 동물에서도 또한 유사한 병인으로 존재하고, 이는 본 발명의 제약 조성물을 투여함으로써 치료될 수 있다.
임의의 상기 장애를 치료하기 위해, 본 발명에 따라 사용하기 위한 제약 조성물은 하나 이상의 생리학상 허용되는 담체 또는 부형제를 사용하여 통상의 방식으로 제제화될 수 있다. 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 임의의 적합한 수단에 의해 투여될 수 있고, 이는 치료할 장애의 유형에 따라 달라질 수 있다. 가능한 투여 경로는 비경구 투여 (예를 들어, 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하), 폐내 투여 및 비강내 투여를 포함하며, 국부 면역억제 치료용으로 원하는 경우에는 병변내 투여를 포함한다. 또한, 본 발명의 항체는, 예를 들어 항체의 용량을 감소시키면서 펄스 주입에 의해 투여될 수 있다. 바람직하게는, 투여는 부분적으로는 투여가 단기적인지 또는 장기적인지의 여부에 따라 주사, 가장 바람직하게는 정맥내 또는 피하 주사에 의해 제공된다. 투여할 양은 다양한 인자, 예컨대 임상적 증상, 개체의 체중, 다른 약물이 투여되는지의 여부에 따라 결정될 것이다. 당업자는 투여 경로가 치료할 장애 또는 상태에 따라 달라질 것임을 인지할 것이다.
본 발명에 따른 신규 폴리펩티드의 치료 유효량은 주로 특정한 환자 특성, 투여 경로, 및 치료할 장애의 성질에 따라 결정될 것이다. 일반적인 지침은, 예를 들어 국제 조화 회의(International Conference on Harmonization)의 간행물 및 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, chapters 27 and 28, pp. 484-528 (18th ed., Alfonso R. Gennaro, Ed., Easton, Pa.: Mack Pub. Co., 1990)]에서 찾아볼 수 있다. 보다 구체적으로, 치료 유효량은 의약의 독성 및 효능과 같은 인자에 따라 결정될 것이다. 독성은 당업계에 널리 공지되어 있고 상기 참고문헌에서 찾아볼 수 있는 방법을 이용하여 결정될 수 있다. 효능은 하기 실시예에 기재된 방법과 함께 동일한 지침을 활용하여 결정될 수 있다.
진단 방법
FGFR2 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 FGFR2-발현 종양의 존재를 검출하는데 사용할 수 있다. 혈청 및 조직 생검 시편을 비롯한 다양한 생물학적 샘플 내의 FGFR2-함유 세포 또는 박리된 FGFR2의 존재를 FGFR2 항체로 검출할 수 있다. 또한, FGFR2 항체를 99Tc (또는 다른 동위원소) 접합된 항체를 사용한 면역섬광조영과 같은 다양한 영상화 방법에 사용할 수 있다. 예를 들어, 111In 접합된 항-PSMA 항체를 사용하여 최근에 기재된 것과 유사한 영상화 프로토콜을 이용하여 췌장 또는 난소 암종을 검출할 수 있다 (문헌 [Sodee et al., Clin. Nuc. Med. 21: 759-766, 1997]). 이용될 수 있는 또 다른 검출 방법은 본 발명의 항체를 적합한 동위원소와 접합시키는 것에 의한 양전자 방출 단층촬영이다 (문헌 [Herzog et al., J. Nucl. Med. 34:2222-2226, 1993] 참조).
제약 조성물 및 투여
본 발명의 한 실시양태는 염수, 완충 염수, 덱스트로스 및 물을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 임의의 멸균, 생체적합성 제약 담체 중에서 투여될 수 있는, FGFR2 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 단독으로 또는 하나 이상의 다른 작용제, 예컨대 안정화 화합물과 함께 포함하는 제약 조성물이다. 추가 실시양태는 FGFR2 결합 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 및 FGFR2 관련 질환, 예컨대 암을 치료하는데 적합한 추가의 제약 활성 화합물을 포함하는 제약 조성물이다. 임의의 이들 분자는 부형제(들) 또는 제약상 허용되는 담체와 혼합되는 제약 조성물에서 단독으로 또는 다른 작용제, 약물 또는 호르몬과 조합되어 환자에게 투여될 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제약상 허용되는 담체는 제약상 불활성이다.
본 발명은 또한 제약 조성물의 투여에 관한 것이다. 이러한 투여는 경구로 또는 비경구로 달성된다. 비경구 전달 방법은 국소, 동맥내 (종양에 직접), 근육내, 피하, 수질내, 척수강내, 뇌실내, 정맥내, 복강내 또는 비강내 투여를 포함한다. 활성 성분에 더하여, 이들 제약 조성물은 제약상 사용될 수 있는 제제 내로의 활성 화합물의 가공을 용이하게 하는 부형제 및 보조제를 포함하는 적합한 제약상 허용되는 담체를 함유할 수 있다. 제제화 및 투여를 위한 기술에 대한 추가의 상세사항은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences (Ed. Maack Publishing Co, Easton, Pa.)]의 최신판에서 찾아볼 수 있다.
당업계에 널리 공지된 제약상 허용되는 담체를 경구 투여에 적합한 투여량으로 사용하여 경구 투여용 제약 조성물을 제제화할 수 있다. 이러한 담체는 제약 조성물이 환자가 섭취하기 위한 정제, 환제, 당의정, 캡슐, 액체, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁액 등으로 제제화될 수 있게 한다.
활성 화합물을 고체 부형제와 조합하고, 임의로 생성된 혼합물을 분쇄하고, 원하는 경우에 적합한 보조제를 첨가한 후, 과립들의 혼합물을 가공하여 정제 또는 당의정 코어를 수득하는 것을 통해 경구 사용을 위한 제약 제제를 수득할 수 있다. 적합한 부형제는 탄수화물 또는 단백질 충전제, 예컨대 락토스, 수크로스, 만니톨 또는 소르비톨을 비롯한 당; 옥수수, 밀, 벼, 감자 또는 다른 식물로부터의 전분; 셀룰로스, 예컨대 메틸 셀룰로스, 히드록시프로필메틸셀룰로스, 또는 소듐 카르복시메틸 셀룰로스; 및 아라비아 검 및 트라가칸트를 비롯한 검; 및 단백질, 예컨대 젤라틴 및 콜라겐이다. 원하는 경우에, 붕해제 또는 가용화제, 예컨대 가교 폴리비닐 피롤리돈, 한천, 알긴산, 또는 그의 염, 예컨대 알긴산나트륨을 첨가할 수 있다.
당의정 코어는 적합한 코팅, 예컨대 농축된 당 용액과 함께 제공되고, 이는 아라비아 검, 활석, 폴리비닐 피롤리돈, 카르보폴 겔, 폴리에틸렌 글리콜 및/또는 이산화티타늄, 래커 용액, 및 적합한 유기 용매 또는 용매 혼합물을 또한 함유할 수 있다. 제품 확인을 위해, 또는 활성 화합물의 양, 즉 투여량 특성을 표시하기 위해 염료 또는 안료가 정제 또는 당의정 코팅에 첨가될 수 있다.
경구로 사용될 수 있는 제약 제제는 젤라틴으로 제조된 푸쉬-핏(push-fit) 캡슐, 뿐만 아니라 젤라틴 및 코팅, 예컨대 글리세롤 또는 소르비톨로 제조된 연질 밀봉 캡슐을 포함한다. 푸쉬-핏 캡슐은 충전제 또는 결합제, 예컨대 락토스 또는 전분, 윤활제, 예컨대 활석 또는 스테아르산마그네슘, 및 임의로 안정화제와 혼합된 활성 성분을 함유할 수 있다. 연질 캡슐에서는, 활성 화합물이 안정화제와 함께 또는 안정화제 없이 적합한 액체, 예컨대 지방 오일, 액상 파라핀 또는 액체 폴리에틸렌 글리콜 중에 용해 또는 현탁될 수 있다.
비경구 투여용 제약 제제는 활성 화합물의 수용액을 포함한다. 주사용으로, 본 발명의 제약 조성물이 수용액 중에, 바람직하게는 생리학상 상용성인 완충제, 예컨대 행크 용액, 링거 용액 또는 생리학적 완충 염수 중에 제제화될 수 있다. 수성 주사 현탁액은 현탁액의 점도를 증가시키는 물질, 예컨대 소듐 카르복시메틸 셀룰로스, 소르비톨 또는 덱스트란을 함유할 수 있다. 추가로, 활성 화합물의 현탁액은 적절한 유성 주사 현탁액으로 제조될 수 있다. 적합한 친지성 용매 또는 비히클은 지방 오일, 예컨대 참깨 오일, 또는 합성 지방산 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트 또는 트리글리세리드, 또는 리포솜을 포함한다. 임의로, 현탁액은 또한 고도로 농축된 용액의 제조를 허용하도록 적합한 안정화제 또는 화합물의 용해도를 증가시키는 작용제를 함유할 수 있다.
국소 또는 비강 투여를 위해, 투과시킬 특정한 장벽에 적절한 침투제가 제제에 사용된다. 이러한 침투제는 일반적으로 당업계에 공지되어 있다.
키트
본 발명은 추가로 상기 언급된 본 발명의 조성물의 성분 중 하나 이상이 충전된 하나 이상의 용기를 포함하는 제약 팩 및 키트에 관한 것이다. 이러한 용기(들)와 함께, 인간 투여를 위한 제품의 제조, 사용 또는 판매에 대한 정부 당국에 의한 승인을 반영하는, 제약 또는 생물학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 당국에 의해 규정된 형태의 통지서가 있을 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 키트는 본 발명의 항체를 코딩하는 DNA 서열을 함유할 수 있다. 바람직하게는, 이들 항체를 코딩하는 DNA 서열은 숙주 세포 내로의 형질감염 및 숙주 세포에 의한 발현에 적합한 플라스미드 내에 제공된다. 플라스미드는 숙주 세포에서의 DNA의 발현을 조절하기 위한 프로모터 (종종 유도성 프로모터)를 함유할 수 있다. 플라스미드는 또한 다양한 항체를 생산하기 위해 다른 DNA 서열의 플라스미드 내로의 삽입을 용이하게 하기 위한 적절한 제한 부위를 함유할 수 있다. 플라스미드는 또한 코딩되는 단백질의 클로닝 및 발현을 용이하게 하기 위한 다수의 다른 요소를 함유할 수 있다. 이러한 요소는 당업자에게 널리 공지되어 있고, 예를 들어 선택 마커, 개시 코돈, 종결 코돈 등을 포함한다.
제조 및 저장.
본 발명의 제약 조성물은 당업계에 공지된 방식으로, 예를 들어 통상적인 혼합, 용해, 과립화, 당의정-제조, 연화, 유화, 캡슐화, 포획 또는 동결건조 공정에 의해 제조될 수 있다.
제약 조성물은 염으로서 제공될 수 있고, 이는 염산, 황산, 아세트산, 락트산, 타르타르산, 말산, 숙신산 등을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 산과 형성될 수 있다. 염은 상응하는 유리 염기 형태인 수성 또는 다른 양성자성 용매 중에 보다 가용성인 경향이 있다. 다른 경우에, 바람직한 제제는 사용 전에 완충제와 배합되는 pH가 4.5 내지 5.5 범위인 1 mM-50 mM 히스티딘, 0.1%-2% 수크로스, 2%-7% 만니톨 중의 동결건조 분말일 수 있다.
허용되는 담체 중에 제제화된 본 발명의 화합물을 포함하는 제약 조성물을 제조한 후, 이를 적절한 용기에 넣고, 지시된 상태의 치료에 대한 라벨을 붙인다. FGFR2 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 투여에 대해, 이러한 라벨은 투여하는 양, 빈도 및 방법을 포함할 것이다.
치료 유효 용량.
본 발명에 사용하기에 적합한 제약 조성물은 의도된 목적, 즉 FGFR2 발현을 특징으로 하는 특정한 질환 상태의 치료를 달성하기 위한 유효량의 활성 성분이 함유된 조성물을 포함한다. 유효 용량의 결정은 충분히 당업자의 능력 내에 속한다.
임의의 화합물에 대해, 치료 유효 용량을 먼저 세포 배양 검정, 예를 들어 신생물 세포에서, 또는 동물 모델, 통상적으로 마우스, 토끼, 개, 돼지 또는 원숭이에서 추정할 수 있다. 또한, 동물 모델을 사용하여 바람직한 농도 범위 및 투여 경로를 달성한다. 이어서, 이러한 정보를 이용하여 인간에서의 투여에 유용한 용량 및 경로를 결정할 수 있다.
치료 유효 용량은 증상 또는 상태를 개선하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 양을 지칭한다. 이러한 화합물의 치료 효능 및 독성은 세포 배양물 또는 실험 동물에서 표준 제약 절차, 예를 들어 ED50 (집단의 50%에서 치료상 유효한 용량) 및 LD50 (집단의 50%에서 치사성인 용량)에 의해 결정될 수 있다. 치료 및 독성 효과 사이의 용량 비가 치료 지수이고, 이는 ED50/LD50 비로 표현될 수 있다. 큰 치료 지수를 나타내는 제약 조성물이 바람직하다. 세포 배양 검정 및 동물 연구로부터 얻은 데이터는 인간 사용을 위한 투여량의 범위를 확립하는데 사용된다. 이러한 화합물의 투여량은 바람직하게는 독성이 거의 또는 전혀 없이 ED50을 포함하는 순환 농도의 범위 내에 있다. 투여량은 상기 범위 내에서, 사용되는 투여 형태, 환자의 감수성 및 투여 경로에 따라 달라진다.
정확한 투여량은 치료할 환자를 고려하여 개별 의사에 의해 선택된다. 투여량 및 투여는 충분한 수준의 활성 모이어티를 제공하거나 또는 목적 효과를 유지하도록 조정된다. 고려될 수 있는 추가의 인자는 질환 상태의 중증도, 예를 들어 종양 크기 및 위치; 환자의 연령, 체중 및 성별; 식이, 투여 시간 및 빈도, 약물 조합물(들), 반응 감수성, 및 요법에 대한 허용성/반응을 포함한다. 장기간 작용 제약 조성물은 특정한 제제의 반감기 및 클리어런스율에 따라 3 내지 4일마다, 매주, 또는 2주마다 1회 투여될 수 있다.
일반적인 투여량은 투여 경로에 따라 약 2 g 이하의 총 용량으로 0.1 내지 100,000 마이크로그램에서 달라질 수 있다. 특정한 투여량 및 전달 방법에 관한 지침은 문헌에 제공되어 있다. 미국 특허 번호 4,657,760; 5,206,344; 또는 5,225,212를 참조한다. 당업자는 폴리뉴클레오티드에 대해 단백질 또는 그의 억제제에 대한 것과 상이한 제제를 사용할 것이다. 유사하게, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 전달은 특정한 세포, 상태, 위치 등에 대해 특이적일 것이다. 방사성표지된 항체에 대한 바람직한 비활성(specific activity)은 단백질 1 mg당 0.1 내지 10 mCi의 범위일 수 있다 (문헌 [Riva et al., Clin. Cancer Res. 5:3275-3280, 1999; Ulaner et al., 2008 Radiology 246(3):895-902]).
본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 기재된다. 실시예는 단지 구체적 실시양태를 언급함으로써 본 발명을 예시하기 위해 제공된다. 이들 예시는 본 발명의 특정의 구체적 측면을 예시하지만, 개시된 발명의 제한을 나타내거나 그의 범위를 제한하지는 않는다.
상세하게 달리 기재된 경우를 제외하고는, 모든 실시예는 당업자에게 널리 공지되어 있고 일상적인 표준 기술을 이용하여 수행하였다. 하기 실시예의 일상적인 분자 생물학 기술은 표준 실험 설명서, 예컨대 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989]에 기재된 바와 같이 수행할 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시양태는 다음과 같다:
A. FGFR2를 과다발현하는 세포주 SNU16 (ATCC-CRL-5974) 및 MFM223 (ECACC-98050130), 및 돌연변이된 FGFR2를 발현하는 세포주 AN3-CA (DSMZ-ACC 267) 및 MFE-296 (ECACC-98031101)에서, FGFR2에 대한 결합 후에 FGFR2의 세포 표면 발현을 감소시키는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
B. 제A항에 있어서, (서열 63)에 의해 제시된 바와 같은 FGFR2의 세포외 N-말단 에피토프 (1RPSFSLVEDTTLEPE15)에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
C. 제B항에 있어서, 세포외 N-말단 에피토프 (서열 63)에 대한 항체의 결합이 Arg 1, Pro 2, Phe 4, Ser 5, Leu 6 및 Glu 8로 이루어진 잔기의 군으로부터 선택된 1개 이상의 에피토프 잔기에 의해 매개되는 것인 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
D. 제B항 또는 제C항에 있어서, FGFR2의 N-말단 에피토프 (1RPSFSLVEDTTLEPE15) 내의 아미노산 잔기 중 1개 이상을 알라닌으로 변화시킴으로써 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 그의 ELISA 신호 중 50% 초과를 상실하며,
a) 상기 잔기는 군 Pro 2, Leu 6 및 Glu 8로부터 선택되거나, 또는
b) 상기 잔기는 군 Arg 1, Pro 2, Phe 4 및 Ser 5로부터 선택되는 것인
단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E. 제A항 내지 제D항 중 어느 한 항에 있어서, FGFR2에 대한 결합에서 군 "M048-D01", "M047-D08", "M017-B02", "M021-H02", "M054-A05", "M054-D03", "TPP-1397", "TPP-1398", "TPP-1399", "TPP-1400", "TPP-1401", "TPP-1402", "TPP-1403", "TPP-1406", "TPP-1407", "TPP-1408", "TPP-1409", "TPP-1410", "TPP-1411", "TPP-1412" 및 "TPP-1415"로부터 선택된 1종 이상의 항체와 경쟁하는 항체 또는 항원-결합 단편.
F. 제E항에 있어서, 항체 또는 항원-결합 단편의 아미노산 서열이 "M048-D01", "M047-D08", "M017-B02", "M021-H02", "M054-A05", "M054-D03", "TPP-1397", "TPP-1398", "TPP-1399", "TPP-1400", "TPP-1401", "TPP-1402", "TPP-1403", "TPP-1406", "TPP-1407", "TPP-1408", "TPP-1409", "TPP-1410", "TPP-1411", "TPP-1412" 또는 "TPP-1415"의 1개 이상의 CDR 서열과 적어도 50%, 55%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 동일하거나, 또는 "M048-D01", "M047-D08", "M017-B02", "M021-H02", "M054-A05", "M054-D03", "TPP-1397", "TPP-1398", "TPP-1399", "TPP-1400", "TPP-1401", "TPP-1402", "TPP-1403", "TPP-1406", "TPP-1407", "TPP-1408", "TPP-1409", "TPP-1410", "TPP-1411", "TPP-1412" 또는 "TPP-1415"의 VH 또는 VL 서열과 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 92% 또는 95% 동일한 것인 항체 또는 항원-결합 단편.
G. 제E항 또는 제F항에 있어서, 표 9 및 표 10에 나타낸 바와 같은 1개 이상의 CDR 서열 또는 1개 이상의 가변 중쇄 또는 경쇄 서열을 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편.
H. 제A항 내지 제G항 중 어느 한 항에 있어서,
a) 서열 5-7에 의해 제시된 바와 같은 가변 중쇄 CDR 서열 및 서열 8-10에 의해 제시된 가변 경쇄 CDR 서열, 또는
b) 서열 15-17에 의해 제시된 바와 같은 가변 중쇄 CDR 서열 및 서열 18-20에 의해 제시된 가변 경쇄 CDR 서열, 또는
c) 서열 25-27에 의해 제시된 바와 같은 가변 중쇄 CDR 서열 및 서열 28-30에 의해 제시된 가변 경쇄 CDR 서열, 또는
d) 서열 35-37에 의해 제시된 바와 같은 가변 중쇄 CDR 서열 및 서열 38-40에 의해 제시된 가변 경쇄 CDR 서열, 또는
e) 서열 45-47에 의해 제시된 바와 같은 가변 중쇄 CDR 서열 및 서열 48-50에 의해 제시된 가변 경쇄 CDR 서열, 또는
f) 서열 55-57에 의해 제시된 바와 같은 가변 중쇄 CDR 서열 및 서열 58-60에 의해 제시된 가변 경쇄 CDR 서열, 또는
g) 서열 75-77에 의해 제시된 바와 같은 가변 중쇄 CDR 서열 및 서열 78-80에 의해 제시된 가변 경쇄 CDR 서열, 또는
h) 서열 85-87에 의해 제시된 바와 같은 가변 중쇄 CDR 서열 및 서열 88-90에 의해 제시된 가변 경쇄 CDR 서열, 또는
i) 서열 95-97에 의해 제시된 바와 같은 가변 중쇄 CDR 서열 및 서열 98-100에 의해 제시된 가변 경쇄 CDR 서열, 또는
j) 서열 105-107에 의해 제시된 바와 같은 가변 중쇄 CDR 서열 및 서열 108-110에 의해 제시된 가변 경쇄 CDR 서열, 또는
k) 서열 115-117에 의해 제시된 바와 같은 가변 중쇄 CDR 서열 및 서열 118-120에 의해 제시된 가변 경쇄 CDR 서열, 또는
l) 서열 125-127에 의해 제시된 바와 같은 가변 중쇄 CDR 서열 및 서열 128-130에 의해 제시된 가변 경쇄 CDR 서열, 또는
m) 서열 135-137에 의해 제시된 바와 같은 가변 중쇄 CDR 서열 및 서열 138-140에 의해 제시된 가변 경쇄 CDR 서열, 또는
n) 서열 145-147에 의해 제시된 바와 같은 가변 중쇄 CDR 서열 및 서열 148-150에 의해 제시된 가변 경쇄 CDR 서열, 또는
o) 서열 155-157에 의해 제시된 바와 같은 가변 중쇄 CDR 서열 및 서열 158-160에 의해 제시된 가변 경쇄 CDR 서열, 또는
p) 서열 165-167에 의해 제시된 바와 같은 가변 중쇄 CDR 서열 및 서열 168-170에 의해 제시된 가변 경쇄 CDR 서열, 또는
q) 서열 175-177에 의해 제시된 바와 같은 가변 중쇄 CDR 서열 및 서열 178-180에 의해 제시된 가변 경쇄 CDR 서열, 또는
r) 서열 185-187에 의해 제시된 바와 같은 가변 중쇄 CDR 서열 및 서열 188-190에 의해 제시된 가변 경쇄 CDR 서열, 또는
s) 서열 195-197에 의해 제시된 바와 같은 가변 중쇄 CDR 서열 및 서열 198-200에 의해 제시된 가변 경쇄 CDR 서열, 또는
t) 서열 205-207에 의해 제시된 바와 같은 가변 중쇄 CDR 서열 및 서열 208-210에 의해 제시된 가변 경쇄 CDR 서열, 또는
u) 서열 215-217에 의해 제시된 바와 같은 가변 중쇄 CDR 서열 및 서열 218-220에 의해 제시된 가변 경쇄 CDR 서열
을 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편.
I. 제A항 내지 제H항 중 어느 한 항에 있어서,
a) 서열 1에 의해 제시된 바와 같은 가변 중쇄 서열 및 서열 2에 의해 제시된 바와 같은 가변 경쇄 서열, 또는
b) 서열 11에 의해 제시된 바와 같은 가변 중쇄 서열 및 서열 12에 의해 제시된 바와 같은 가변 경쇄 서열, 또는
c) 서열 21에 의해 제시된 바와 같은 가변 중쇄 서열 및 서열 22에 의해 제시된 바와 같은 가변 경쇄 서열, 또는
d) 서열 31에 의해 제시된 바와 같은 가변 중쇄 서열 및 서열 32에 의해 제시된 바와 같은 가변 경쇄 서열, 또는
e) 서열 41에 의해 제시된 바와 같은 가변 중쇄 서열 및 서열 42에 의해 제시된 바와 같은 가변 경쇄 서열, 또는
f) 서열 51에 의해 제시된 바와 같은 가변 중쇄 서열 및 서열 52에 의해 제시된 바와 같은 가변 경쇄 서열, 또는
g) 서열 73에 의해 제시된 바와 같은 가변 중쇄 서열 및 서열 74에 의해 제시된 바와 같은 가변 경쇄 서열, 또는
h) 서열 83에 의해 제시된 바와 같은 가변 중쇄 서열 및 서열 84에 의해 제시된 바와 같은 가변 경쇄 서열, 또는
i) 서열 93에 의해 제시된 바와 같은 가변 중쇄 서열 및 서열 94에 의해 제시된 바와 같은 가변 경쇄 서열, 또는
j) 서열 103에 의해 제시된 바와 같은 가변 중쇄 서열 및 서열 104에 의해 제시된 바와 같은 가변 경쇄 서열, 또는
k) 서열 113에 의해 제시된 바와 같은 가변 중쇄 서열 및 서열 114에 의해 제시된 바와 같은 가변 경쇄 서열, 또는
l) 서열 123에 의해 제시된 바와 같은 가변 중쇄 서열 및 서열 124에 의해 제시된 바와 같은 가변 경쇄 서열, 또는
m) 서열 133에 의해 제시된 바와 같은 가변 중쇄 서열 및 서열 134에 의해 제시된 바와 같은 가변 경쇄 서열, 또는
n) 서열 143에 의해 제시된 바와 같은 가변 중쇄 서열 및 서열 144에 의해 제시된 바와 같은 가변 경쇄 서열, 또는
o) 서열 153에 의해 제시된 바와 같은 가변 중쇄 서열 및 서열 154에 의해 제시된 바와 같은 가변 경쇄 서열, 또는
p) 서열 163에 의해 제시된 바와 같은 가변 중쇄 서열 및 서열 164에 의해 제시된 바와 같은 가변 경쇄 서열, 또는
q) 서열 173에 의해 제시된 바와 같은 가변 중쇄 서열 및 서열 174에 의해 제시된 바와 같은 가변 경쇄 서열, 또는
r) 서열 183에 의해 제시된 바와 같은 가변 중쇄 서열 및 서열 184에 의해 제시된 바와 같은 가변 경쇄 서열, 또는
s) 서열 193에 의해 제시된 바와 같은 가변 중쇄 서열 및 서열 194에 의해 제시된 바와 같은 가변 경쇄 서열, 또는
t) 서열 203에 의해 제시된 바와 같은 가변 중쇄 서열 및 서열 204에 의해 제시된 바와 같은 가변 경쇄 서열, 또는
u) 서열 213에 의해 제시된 바와 같은 가변 중쇄 서열 및 서열 214에 의해 제시된 바와 같은 가변 경쇄 서열
을 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편.
J. 제A항 내지 제I항 중 어느 한 항에 있어서, IgG 항체인 항체.
K. 제A항 내지 제J항 중 어느 한 항에 있어서, scFv, Fab, Fab' 단편 또는 F(ab')2 단편인 항원-결합 단편.
L. 제A항 내지 제K항 중 어느 한 항에 있어서, 모노클로날 항체 또는 항원-결합 단편인 항체 또는 항원-결합 단편.
M. 제A항 내지 제L항 중 어느 한 항에 있어서, 인간, 인간화 또는 키메라 항체 또는 항원-결합 단편인 항체 또는 항원-결합 단편.
N. 제A항 내지 제M항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 항체-약물 접합체.
O. 제A항 내지 제M항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항원-결합 단편을 코딩하는 단리된 핵산 서열.
P. 제O항에 따른 핵산 서열을 포함하는 벡터.
Q. 제A항 내지 제M항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항원-결합 단편을 발현하고/거나, 제O항에 따른 핵산 또는 제P항에 따른 벡터를 포함하는 단리된 세포.
R. 제Q항에 있어서, 원핵 또는 진핵 세포인 단리된 세포.
S. 제R항에 따른 세포의 배양 및 항체 또는 항원-결합 단편의 정제를 포함하는, 제A항 내지 제M항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항원-결합 단편을 생산하는 방법.
T. 의약으로서의 제A항 내지 제M항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항원-결합 단편 또는 제N항에 따른 항체-약물 접합체.
U. 진단제로서의 제A항 내지 제M항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항원-결합 단편.
V. 암의 치료를 위한 의약으로서의 제A항 내지 제M항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항원-결합 단편 또는 제N항에 따른 항체-약물 접합체.
W. 제A항 내지 제M항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항원-결합 단편 또는 제N항에 따른 항체-약물 접합체를 포함하는 제약 조성물.
X. 제W항에 따른 제약 조성물 및 하나 이상의 치료 활성 화합물의 조합물.
Y. FGFR2의 원치 않는 존재와 연관된 장애 또는 상태의 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 제W항에 따른 제약 조성물 또는 제X항에 따른 조합물을 투여하는 것을 포함하는, FGFR2의 원치 않는 존재와 연관된 장애 또는 상태를 치료하는 방법.
실시예
실시예 1: n-CoDeR 라이브러리로부터의 항체 생성
파지 선택에 사용된 도구:
본 발명의 인간 항체의 단리에 사용된 재조합 단백질은 알앤디 시스템즈로부터 입수하였으며, 하기 표 1에 열거되어 있다. 사용된 모든 변이체는 담체 무함유 제제 중에 Fc-융합 단백질로서 존재하였다. hTRAIL-Fc는 Fc 결합제를 회피하기 위한 고갈제로서 작용하였다. 단백질을 대략 2배 몰 과량의 비오틴-LC-NHS (피어스(Pierce); 카탈로그 번호 21347)를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 비오티닐화하고, 제바(Zeba) 탈염 칼럼 (피어스; 카탈로그 번호 89889)을 사용하여 탈염시켰다.
표 1: 파지 선택 및 스크리닝에 사용된 재조합 단백질의 목록
Figure pct00001
세포 상에서의 파지 선택을 위해, 천연 FGFR2를 그의 세포 표면에 디스플레이하는 인간 위 암종 세포주 KATO III (ATCC HTB-103)을 사용하였다.
파지 선택:
본 발명의 인간 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 단리는, 모든 6개의 CDR이 다양화된 Fab 라이브러리인 바이오인벤트 인터내셔널 AB(BioInvent International AB; 스웨덴 룬드; 문헌 [Soederling et al., Nat. Biotech. 2000, 18:853-856]에 기재됨)의 미성숙 Fab 항체 라이브러리 n-CoDeR을 사용하여 파지 디스플레이 기술에 의해 수행하였다. 하기 표 2에 요약된 바와 같이, 본 발명의 항체의 선택을 위해 3가지 상이한 전략을 이용하였다.
표 2: 선택 전략의 개요
Figure pct00002
본 실시예에 사용된 표준 완충제는 다음과 같다:
1x PBS: 시그마로부터의 것 (D5652-50l)
PBST: 0.05% 트윈20(Tween20) (시그마, P7949)으로 보충된 1x PBS
차단 완충제: 3% BSA (시그마 A4503)로 보충된 PBST
침전 완충제: 2.5 M NaCl 중 20% PEG (칼바이오켐(Calbiochem), 528877)
FACS-완충제: 3% FBS (깁코(GIBCO), 10082) 및 0.01% NaN3 (시그마, 71289)으로 보충된 PBS
간략하게, Fab 항체 라이브러리의 분취액을 5분 동안 실온에서 원심분리하고, 생성된 펠릿을 40 ml PBS 중에 재현탁시키고, 침전 완충제를 첨가하고, 이어서 얼음 상에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 원심분리 단계 (4000 rpm에서 1시간)를 수행하여 침전시켰다. 침전된 라이브러리를 후속적으로 1 ml 차단 완충제 중에 재현탁시키고, 30분 동안 실온에서 인큐베이션하였다.
한편, 스트렙타비딘-코팅된 디나비드(Dynabeads) M280 (인비트로젠, 11206D)의 분취액을 엔드-투-엔드(end-to-end) 회전기 상에서 30분 동안 PBS로 3회 세척하여 제조하였다. 그 후, 표 2에 제시된 바와 같이 일부 분취액을 200 nM 비오티닐화 TRAIL-Fc 단백질과 혼합하고, 나머지는 비오티닐화 표적 단백질과 혼합하였다. 혼합물을 30분 동안 엔드-투-엔드 회전기 상에서 실온에서 인큐베이션하고, 후속적으로 1 ml PBS 중에서 3회 세척하였다. 코팅된 비드를 1 ml 차단 완충제 중에 재현탁시키고, 이어서 비드를 수집하고, 상청액을 제거하여 최종적으로 차단하였다.
원치 않는 Fc 결합제의 고갈을 위해, 차단된 라이브러리 (상기 기재됨)를 TRAIL-Fc로 코팅된 차단된 디나비드에 첨가하고, 회전시키면서 30분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 자기 랙 상에서 비드를 수집한 후, 상청액을 표적 단백질로 코팅된 차단된 디나비드와 혼합하였다. 엔드-투-엔드 회전기 상에서 60분 동안 인큐베이션한 후, 샘플을 차단 완충제로 3회 세척하고, 이어서 PBST로 5회 세척하였다. 결합된 파지를 100 μl 트리에탄올아민 용액 (TEA, 100 mM)을 첨가함으로써 용리하였다. 실온에서 10분 동안 인큐베이션한 후, 샘플을 400 μl 1M 트리스-Cl, pH 7.5를 첨가함으로써 중화시켰다.
패닝 전략 I은 표적 단백질의 공급원으로서의 전세포 상에 패닝시키는 2회의 라운드를 포함하였다 (표 2 참조). 상기 목적을 위해, KATO III 세포를 ml당 107개 세포의 밀도로 빙냉 FACS 완충제 중에 재현탁시켰다. 구출된 파지의 분취액을 1 ml 세포 현탁액에 첨가하고, 엔드-오버-엔드(end-over-end) 회전에 의해 4℃에서 인큐베이션하였다. 후속적으로, 세포를 2.5 ml FACS 완충제로 10회 세척하고, 이어서 결합된 파지를 300 μl 76 nM 시트르산 (pH 2.5)으로 용리하였다. 5분 동안 인큐베이션한 후, 세포를 400 g 및 4℃에서 5분 동안 원심분리하고, 상청액을 300 ml 1 M 트리스-Cl, pH 7.5를 첨가함으로써 중화시켰다.
용리된 파지를 증식시키고, 파지 역가를 본질적으로 이전에 기재된 바와 같이 결정하였다 (문헌 [Cicortas Gunnarsson et al., Protein Eng Des Sel 2004; 17 (3): 213-21]). 간략하게, 용출액의 분취액을 적정 실험을 위해 남겨두는 한편, 표 2에 나타낸 전략에 따라 제2, 제3 및 제4 선택 라운드에서 사용되는 새로운 파지 스톡의 제조를 위해 나머지를 사용하여 지수 성장 중인 이. 콜라이 TG1 (스트라타진(Stratagene)으로부터의 것)을 형질전환시켰다. 각각의 선택 라운드에 대해, 투입 및 산출 파지 둘 다를 지수 성장 중인 이. 콜라이 TG1 상에서 적정하고, 파지 ELISA로 분석하기 위해 라운드 2 내지 4로부터 클론을 채집하였다.
효소-결합 면역흡착 검정 (ELISA):
파지 ELISA:
상이한 선택 라운드로부터 선택된 파지를 파지 ELISA를 이용하여 특이성에 대해 분석하였다. 간략하게, 밤새 배양한 배양물 10 μl (100 μg/ml 암피실린 (시그마, A5354), 1% 글루코스로 보충된 LB-배지 중)를 100 μl 새로운 배지 (100 μg/ml 암피실린 및 0.1% 글루코스 (시그마, G8769)로 보충된 LB-배지)에 첨가하고, 0.5의 OD600에 도달할 때까지 96-웰 MTP 내에서 250 rpm 및 37℃에서 진탕시킴으로써 파지 발현을 수행하였다. 후속적으로, 40 μl 헬퍼 파지 M13KO7 (인비트로젠, 420311)을 첨가하고, 샘플을 진탕 없이 37℃에서 추가로 15분 동안 인큐베이션하였다. IPTG (0.5 mM의 최종 농도; 최종 부피 200 μl)를 첨가한 후, 세포를 200 rpm으로 진탕시키면서 30℃에서 밤새 인큐베이션하였다.
스트렙타비딘 (피어스, 15500)으로 사전-코팅된 96-웰 ELISA-플레이트를 1μg/ml 비오티닐화 FGFR2-2β Fc (IIIb) 또는 비오티닐화 TRAIL-Fc로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 다음날, 플레이트를 PBST로 3회 세척하고, 차단 시약으로 처리하고, PBST로 다시 3회 세척하였다. 한편, 파지 배양물을 간략하게 원심분리한 다음, 상청액 125 μl를 제거하여 125 μl 차단 완충제와 혼합하였다. 그 후, 웰당 차단된 파지 100 μl를 옮기고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. PBST로 3회 세척한 후, HRP에 커플링된 M13 항체 (지이 헬스케어, 27-9421-01; PBST 중에 1:2500 희석됨)를 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 50 μl TMB (인비트로젠, 2023)를 첨가함으로써 발색 반응을 일으키고, 5-15분 후에 50 μl H2SO4 (머크(Merck), 1120801000)를 첨가함으로써 정지시켰다. 비색 반응을 플레이트 판독기 (테칸(Tecan))에서 450 nm에서 기록하였다.
ELISA에 의한 sFab의 스크리닝:
가용성 Fab 단편 (sFab)의 생성을 위해, 선택 라운드 3 및 4로부터의 파지미드 DNA를 단리하고, 유전자 III 서열을 제거하기 위해 제공자의 지침에 따라 제한 효소 EagI (퍼멘타스(Fermentas), FD0334) 및 EcoRI (NEB, R0101L)으로 소화시켰다. 생성된 단편을 재-라이게이션시키고, 구축물을 표준 방법을 이용하여 화학적으로 적격인 이. 콜라이 Top10 내로 형질전환시켰다. 단일 클론을 채집하고, LB-배지 (100 μg/ml 암피실린 (시그마, A5354), 1% 글루코스)를 함유하는 96-웰 플레이트로 옮기고, 250 rpm 및 37℃에서 밤새 진탕시켰다. 다음날 아침, 사전-배양물 10 ml를 0.5의 OD600에 도달할 때까지 150 μl 새로운 LB-배지 (100 μg/ml 암피실린 (시그마, A5354), 0.1% 글루코스)로 옮겼다. 그 후, sFab 생산을 IPTG (최종 농도 0.5 mM)를 첨가함으로써 유도하고, 200 rpm으로 진탕시키면서 30℃에서 밤새 인큐베이션을 계속하였다. 다음날 아침, 50 μl BEL-완충제 (24.7 g/l 붕산; 18.7 g/l NaCl; 1.49 g/l EDTA pH 8.0; 2.5 mg/ml 리소자임 (로슈(Roche)))를 각 웰에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 후속적으로, 9% BSA를 함유하는 1/3 부피의 차단 완충제를 첨가하고, 실온에서 추가로 30분 동안 인큐베이션 단계를 수행한 후, 각 웰의 50 μl를, 해당 검출을 HRP에 커플링된 항-hIgG (Fab-특이적) (1:2500 희석됨; 시그마; A 0293)로 수행한 것을 제외하고는 본질적으로 파지에 대해 기재된 바와 같은 ELISA로 표적에 대한 sFab의 결합에 대해 분석하였다.
실시예 2: 가용성 Fab 스크리닝 히트의 소규모 생산
고유의 스크리닝 히트를, FGFR-단백질의 다양한 변이체에 대한 그의 결합의 초기 분석을 위해 소규모로 생산하였다 (실시예 3 참조). LB-배지 (0.1 mg/ml 암피실린 및 0.1% 글루코스로 보충됨) 20-50 ml에, 초기 상태의 pBIF-벡터 내로 클로닝된 고유의 Fab 서열을 함유하지만 유전자 III 서열이 결핍된 각각의 이. 콜라이 Top 10 클론의 사전-배양물을 접종하였다. sFab의 생산을 0.5 mM IPTG (최종 농도)를 첨가함으로써 유도하고, 250 rpm에서 진탕시키면서 30℃에서 밤새 인큐베이션을 계속하였다.
후속적으로, 세포를 원심분리에 의해 수확하고, 20% 수크로스 (w/v), 30 mM 트리스, 1 mM EDTA, pH 8.0, 1 mg/ml 리소자임 (시그마 L-6876) 및 2.5 U/ml 벤조나제 (시그마 E1014)를 함유하는 용해 완충제 중에서 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션함으로써 약하게 용해시키고, 이어서 동일 부피의 PBS를 첨가하였다. 그 후, 투명해진 상청액을 His-태그 단리를 위한 디나비드 (인비트로젠, 101-03D)에 적용시키고, 엔드-오버-엔드 회전기 상에서 4℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 후속적으로, 매트릭스를 완충제 1 (50 mM Na-포스페이트 완충제, pH 7.4, 300 mM NaCl, 5 mM 이미다졸, 0.01% 트윈-20)로 3회 세척하고, 이어서 완충제 2 (0.005% 트윈-20을 함유하는 PBS) 중에서 단일 세척 단계를 수행하였다. 최종적으로, Fab를 완충제 E (10 mM Na-포스페이트 완충제, pH 7.4, 300 mM NaCl, 300 mM 이미다졸)로 용리하고, 비바스핀(Vivaspin) 500 (컷-오프 10000; GE로부터의 것; 28-9322-25)에서 PBS-완충제를 사용하여 농축시켰다. Fab를 SDS-PAGE에 의해 단백질 함량 및 순도에 대해 분석하였다.
실시예 3: 항체의 교차-반응성 프로파일
고유의 스크리닝 히트를 실시예 2에 기재된 바와 같이 소규모로 생산하고, 하기 표 3에 열거된 다양한 FGFR-변이체에의 결합에 대해 ELISA로 시험하였다.
표 3: 결합제의 교차-반응성 프로파일링을 위한 ELISA에 사용된 재조합 단백질의 목록
Figure pct00003
사용된 모든 변이체는 담체 무함유 제제 중에 Fc-융합 단백질로서 존재하였다. 단백질을 대략 2배 몰 과량의 비오틴-LC-NHS (피어스; 카탈로그 번호 21347)를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 비오티닐화하고, 제바 탈염 칼럼 (피어스; 카탈로그 번호 89889)을 사용하여 탈염시켰다.
ELISA를 위해, 스트렙타비딘 (피어스, 15500)으로 사전-코팅된 96-웰 플레이트를 1μg/ml 비오티닐화 단백질로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 웰을 참조물로서 작용한 비오티닐화 TRAIL-Fc로 코팅하였다. 다음날, 플레이트를 PBST로 3회 세척하고, 차단 시약으로 처리하고, PBST로 다시 3회 세척하였다. 정제된 Fab (1 μg/ml) 100 μl를 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. PBST로 3회 세척한 후, HRP에 커플링된 항-hIgG (Fab-특이적) (1:2500 희석됨; 시그마; A 0293)를 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 50 μl TMB (인비트로젠, 2023)를 첨가함으로써 발색 반응을 일으키고, 5-15분 후에 50 μl H2SO4 (머크, 1120801000)를 첨가함으로써 정지시켰다. 비색 반응을 플레이트 판독기 (테칸)에서 450 nm에서 기록하였다. TRAIL-Fc를 함유하는 웰을 백그라운드 값으로 이용하여, 신호 대 백그라운드 비를 하기 표 4에 요약된 바와 같이 계산하였다.
표 4: 항체의 교차-반응성에 대한 ELISA-데이터의 개요
Figure pct00004
표 4에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 항체는 IIIb 및 IIIc 뿐만 아니라 알파 및 베타 스플라이스 형태에 비의존적으로 인간 및 뮤린 FGFR2에 결합한다. 본 발명의 항체는 표 4에 나타낸 바와 같이 FGFR1, FGFR3 및 FGFR4에 결합하지 않는다.
실시예 4: 암 세포주의 세포 표면에 대한 FGFR2 항체의 결합
마우스, 래트 및 인간 암 세포주에 대한 항-FGFR2 항체의 결합 특성을 결정하기 위해, 결합을 세포주의 패널에 대한 유동 세포측정법에 의해 시험하였다. 부착 세포를 PBS (Ca 및 Mg 무함유)로 2회 세척하고, 효소-무함유 PBS 기반 세포 해리 완충제 (인비트로젠)에 의해 분리시켰다. 세포를 FACS 완충제 (3% FCS (바이오크롬(Biochrom))를 함유하는 Ca/Mg 무함유 PBS (바이오크롬)) 중에 대략 105개 세포/웰로 현탁시켰다. 세포를 원심분리 (250g, 5분, 4℃)하고, 상청액을 폐기하였다. 세포를 FACS 완충제 중 관심 항체의 희석물 (달리 나타내지 않는 한, 80μl 중 5μg/ml) 중에 재현탁시키고, 1시간 동안 얼음 상에서 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 100μl 차가운 FACS 완충제로 1회 세척하고, 1:150으로 희석된 80μl 2차 항체 (PE 염소 항-인간 IgG, 디아노바(Dianova) #109-115-098, 또는 PE 염소 항-마우스 IgG, 잭슨 이뮤노 리서치(Jackson Immuno Research) #115-115-164)를 첨가하였다. 얼음 상에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 세포를 차가운 FACS 완충제로 다시 세척하고, 100μl FACS 완충제 중에 재현탁시키고, FACS-어레이 (BD 바이오사이언시스(BD Biosciences))를 사용하여 유동 세포측정법에 의해 분석하였다. 2차 항체 단독으로의 검출에 의한 측정시의 백그라운드 형광이 차감된 관심 항체에 의한 검출의 기하 평균으로서 결과를 계산하였다. 값을 하기 시스템에 따라 점수화하였다:
기하 평균 - 2차 항체 단독의 기하 평균 >10: +, >100: ++, >1000: +++, 10000: ++++, () 안의 카테고리 경계에 근접함.
항체의 교차-반응성 프로파일링에 사용된 세포주의 목록:
Figure pct00005
하기 표 5에 나타낸 바와 같이, 5μg/ml의 농도로 사용된 본 발명의 모든 항 FGFR2 항체는 뮤린 (4T1, EMT6), 래트 (RUCA) 및 인간 (표에 포함된 모든 다른 세포주) 기원의 FGFR2를 발현하는 광범위한 종양 세포에 결합한다.
표 5: FACS 분석의 점수화에 의한 다양한 세포주에 대한 항 FGFR2 항체 5μg/ml의 결합
Figure pct00006
선택된 암 세포주에의 항체의 결합에 대한 EC50 값을 결정하기 위해, 세포를 상기 기재된 바와 같은 FGFR2 항체로 (0.1-100 nM 범위의 다양한 항체 농도로) 염색하였다. EC50 값을 그래프 패드 프리즘(Graph Pad Prism) 소프트웨어를 이용하여 결정하였고, 하기 표 6에 나타내었다. 최고 친화도를 갖는 3종의 항체 (M017-B02-hIgG1, M048-D01-hIgG1, M047-D08-hIgG1)는 인간 (SNU-16, MFM223), 뮤린 (4T1) 및 래트 (Ruca) 세포주에서 나노몰 미만 내지 낮은 나노몰 단위의 EC50 값을 나타내었다. M021-H02-hIgG1, M054-A05-hIgG1 및 M054-D03-hIgG1은 또한 뮤린 및 인간 세포주에서 낮은 nM 단위의 세포 EC50 값을 나타내었다. 따라서, 모든 시험된 항체는 FGFR2를 발현하는 인간, 뮤린 및 래트 세포에 대한 결합에 있어 교차 반응성이다.
표 6: FACS에 의해 분석된 인간 (SNU16, MFM223), 뮤린 (4T1) 및 래트 (RUCA) 기원의 세포주에 결합하는 항 FGFR2 항체의 EC50 값
Figure pct00007
실시예 5: 펩스캔(Pepscan)의 스캐폴드 상에 화학적으로 연결된 펩티드 (CLIPS) 기술에 의한 에피토프 맵핑
발견된 항체의 결합 특성을 결정하기 위해, 펩스캔의 독점적인 스캐폴드 상에 화학적으로 연결된 펩티드 (CLIPS) 기술 (문헌 [Timmerman et al., J. Mol. Recognit. 2007, 20:283-99])에 기반한 집중적 에피토프 맵핑을 수행하였다. 천연 인간 FGFR2 상의 선형, 입체형태적 및 불연속적 에피토프를 포괄하는 15AA 및 30AA 길이의 총 8653개의 다양한 CLIPS 펩티드를 설계하였다. 펩티드를 펩티드 어레이 상에서 합성하였다. 본 발명의 항체를 펩티드 어레이 상에서 인간 IgG1 포맷으로 ELISA-기반 검정으로 시험하였다. 가장 높은 ELISA 값들을 제공하는 펩티드들을 분석하여 공유되는 유사한 아미노산 서열을 확인하였다.
표적 분자의 불연속적 에피토프를 재구축하기 위해, 구조화된 펩티드의 라이브러리를 합성하였다. 이는 펩스캔의 독점적인 스캐폴드 상에 화학적으로 연결된 펩티드 (CLIPS) 기술 (문헌 [Timmerman et al., J. Mol. Recognit. 2007, 20:283-99])을 이용하여 수행하였다. CLIPS 기술은 펩티드가 단일 루프, 이중-루프, 삼중 루프, 시트-유사 폴드, 나선-유사 폴드 및 그의 조합으로 구조화되도록 한다. CLIPS 주형을 시스테인 잔기에 커플링시켰다. 펩티드 내의 다중 시스테인의 측쇄를 1 또는 2개의 CLIPS 주형에 커플링시켰다. 예를 들어, T2 CLIPS 주형 1,3-비스 (브로모메틸) 벤젠의 0.5 mM 용액을 중탄산암모늄 (20 mM, pH 7.9)/아세토니트릴 (1:1(v/v)) 중에 용해시켰다. 상기 용액을 펩티드 어레이 상에 첨가하였다. CLIPS 주형은 펩티드-어레이 (3 μl 웰을 갖는 455 웰 플레이트)의 고체-상 결합된 펩티드에 존재하는 2개의 시스테인의 측쇄에 결합하였다. 펩티드 어레이를 용액 중에 완전히 덮인 채로 30 내지 60분 동안 용액 중에서 약하게 진탕시켰다. 최종적으로, 펩티드 어레이를 과량의 H2O로 충분히 세척하고, PBS (pH 7.2) 중 1 퍼센트 SDS/0.1 퍼센트 베타-메르캅토에탄올을 함유하는 교란-완충제 중에서 30분 동안 70℃에서 초음파처리하고, 이어서 추가로 45분 동안 H2O 중에서 초음파처리하였다. T3 CLIPS 운반 펩티드를 유사한 방법으로, 그러나 여기서는 3개의 시스테인으로 제조하였다.
각각의 펩티드에 대한 항체의 결합을 펩스캔-기반 ELISA (문헌 [Slootstra et al., Molecular Diversity 1996, 1: 87-96])로 시험하였다. 펩티드 어레이를 5% 내지 100%-결합 완충제와 함께 사전-인큐베이션 (1시간, 20℃)하였다. 결합 완충제는 1% 트윈-80, 4% 말-혈청, 5% 오브알부민 (w/v)으로 구성되었고, 이를 PBS로 희석하였다. 세척한 후, 펩티드 어레이를 1% 트윈-80을 함유하는 PBS 중 1차 항체 용액 (1 내지 5 ug/ml)과 함께 인큐베이션 (4℃에서 밤새)하였다. 세척한 후, 펩티드 어레이를 항체 퍼옥시다제 접합체 (항-인간)의 100% 결합 완충제 중 1/1000 희석물과 함께 25℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세척한 후, 퍼옥시다제 기질 2,2'-아지노-디-3-에틸벤즈티아졸린 술포네이트 (ABTS) 및 2 마이크로리터/밀리리터의 3 퍼센트 H2O2를 첨가하였다. 1시간 후, 발색을 측정하였다. 발색을 전하 결합 소자 (CCD) - 카메라 및 영상 처리 시스템으로 정량화하였다.
데이터 처리
미가공 데이터는 CCD-카메라에 의해 얻은 광학적 값이다. 값은 표준 96-웰 플레이트 ELISA-판독기와 유사하게 0 내지 3000 mAU의 범위이다. 분석을 위해 결합 값을 추출하였다. 간헐적으로, 웰은 기포를 함유하여 가양성 값을 생성하는데, 카드를 수동으로 조사하여 기포에 의해 유발된 임의의 값을 0으로 점수화하였다.
본 발명의 모든 항체는 FGFR2의 N-말단 잔기 (1RPSFSLVEDTTLEPE15)로 구성된 동일한 에피토프에 결합한다. 1257개의 CLIPS 및 선형 펩티드의 분석은 N-말단 펩티드에 대해 일관되게 높은 ELISA 값을 나타내었다.
N-말단 잔기 (1RPSFSLVEDTTLEPE15)는, IIIb 및 IIIc 이소형을 생성하는 D3에서의 선택적 스플라이싱에 비의존적으로 인간 FGFR2의 모든 스플라이스 변이체에 존재한다 (도 1 참조). 상기 에피토프는 또한 도메인 D1이 전장 FGFR2 (서열 61; FGFR2 알파)로부터 스플라이싱되어 FGFR2의 보다 짧은 베타 형태 (서열 62)를 생성하는 경우에도 존재한다. 상기 경우에, 에피토프는 도메인 D2의 바로 앞쪽에 존재한다 (도 1 참조).
특별히 관심 있는 것은, 상기 N-말단 서열이 인간, 마우스, 래트 및 마카카 물라타에서 보존되어 있다는 점이다. 이는 광범위한 종간 교차 반응성을 가능하게 한다.
상기 새로운 에피토프는 널리 공지된 리간드 결합 부위 및 헤파린 결합 부위 밖에 존재하며 (도 1 참조), 본 발명의 항체의 신규 특징을 생성한다.
실시예 6: 펩티드의 알라닌 스캐닝에 의한 에피토프 정밀 맵핑
본 발명의 항체의 결합 특성을 보다 상세히 규정하기 위해, 알라닌-스캐닝을 수행하였다. 실시예 5에 기재된 바와 같이, 15AA 및 30 AA 길이의 펩티드를 합성하고, 특정 펩티드에 대해 인간 FGFR2 서열의 각각의 아미노산을 알라닌 잔기에 의해 대체하였다. 항체의 결합을 실시예 5에 기재된 바와 같이 분석하였다. 아미노산 잔기의 알라닌으로의 교체가 결합 신호의 유의한 감소를 일으키는 경우에, 상기 잔기를 결합에 결정적인 것으로 간주하였다.
하기 표 7은 본 발명의 항체에 대해 FGFR2의 N-말단 부분 (1RPSFSLVEDTTLEPE15)에서의 결정적 잔기를 보여준다.
표 7: 본 발명의 항체의 결합에 대한 FGFR2의 N-말단 부분 (1RPSFSLVEDTTLEPE15)에서의 결정적 잔기
Figure pct00008
항체 M048-D01 및 M021-H02는 이들이 위치 Ser-5에서의 다양성에 비의존적으로 결합하기 때문에 특별한 관심대상이다. 이는 그들이 인간, 마우스, 래트 및 마카카 물라타 FGFR2 (서열 63) 이외에도 토끼 (서열 64), 돼지 (서열 65) 및 개 (서열 66) FGFR2에 결합할 수 있게 하여, 전임상 개발을 위해 훨씬 더 많은 종을 이용하는 것이 가능하도록 만든다.
실시예 7: 비아코어에 의해 분석된, N-말단 에피토프에 대한 항체의 친화도
에피토프로서 특성화된 N-말단 펩티드에 대한 결합 친화도를 규정하기 위해, 비아코어 표면 플라즈몬 공명 실험을 수행하였다.
항 FGFR2 항체의 결합 친화도를 비아코어 T100 기기 (지이 헬스케어 비아코어, 인크.) 상에서 표면 플라즈몬 공명 분석에 의해 결정하였다. 인간 IgG1으로서의 항체를 간접적 포획 시약인 항-인간 IgG(Fc)를 통해 CM5 센서 칩 상에 고정화시켰다. "인간 항체 포획 키트" (BR-1008-39, 지이 헬스케어 비아코어, 인크.)로부터의 시약을 제조업체에 의해 기재된 바와 같이 사용하였다. 셀당 대략 5000 RU의 모노클로날 마우스 항-인간 IgG (Fc) 항체를 고정화시켰다. 항 FGFR2 항체를 10초 동안 10μl/분으로 5μg/ml의 농도로 주입하였다. 다양한 종의 FGFR2의 처음 15개의 아미노산 (인간, 마우스, 래트, 마카카 물라타 FGFR2 (서열 63), 토끼 (서열 64), 돼지 (서열 65) 및 개 (서열 66))으로부터 유래된, HEPES-EP 완충제 (지이 헬스케어 비아코어, 인크.) 중 다양한 농도 (400 nM, 200 nM, 100 nM, 50 nM, 25 nM, 12.5 nM, 6.25 nM 및 3.12 nM)의 펩티드를 고정화된 항 FGFR2 항체 상에 3분 동안 60 μl/분의 유량으로 주입하고, 5분 동안 해리되도록 하였다. 인-라인 참조 셀 보정에 이어서 완충제 샘플 차감 후에 센소그램을 생성하였다. 비아밸류에이션(Biavaluation) 소프트웨어 (버전 4.0)를 이용하여 1차 1:1 결합 모델로 센소그램을 적합시킴으로써 얻은 회합 (kon) 및 해리 속도 (koff) 상수의 비에 기반하여 해리 평형 상수 (KD)를 계산하였다.
M048-D01-hIgG1 및 M047-D08-hIgG1은 약 100 nM의 KD 값으로 인간, 뮤린, 래트 및 마카카 물라타 FGFR2에 결합하였다 (상세사항에 대해서는 하기 표 8 참조). 알라닌-스캐닝에 의해 지지된 바와 같이, M048-D01은 여러 종으로부터 유래된 모든 펩티드에 대해 거의 동일한 KD 값을 나타내었다 (표 8 참조).
표 8: 15개 아미노산 길이의 펩티드로 비아코어에 의해 측정시의 항체 M048-D01 및 M047-D08의 1가 KD 값.
Figure pct00009
실시예 8: FGFR2 과다발현 세포주 상에서의 항 FGFR2 항체와의 단기간 인큐베이션 후의 P-FGFR2 (인산화 FGFR2) 수준의 자극
단기간 인큐베이션 후의 인산화 FGFR2 (P-FGFR2)의 세포 수준에 대한 항 FGFR2 항체의 효과를 결정하기 위해, P-FGFR2 ELISA를 수행하였다. MFM223 세포를 96웰 플레이트에서 성장 배지 (MEM 얼(Earle) (바이오크롬; F0315) + 10% FCS + 2mM 글루타민) 중에 웰당 7000개 세포로 플레이팅하였다. 플레이팅 24시간 후, 세포를 15분 동안 항체 (10μ/ml)와 함께 인큐베이션하고, 이어서 PBS로 2회의 세척 단계를 수행하고, 50mM Hepes pH 7.2, 150mM NaCl, 1mM MgCl2, 10mM Na4P2O7, 100mM NaF, 10% 글리세린, 1.5% 트리톤(Triton) X-100 및 새로이 첨가된 완전 프로테아제 억제제 칵테일 (로슈 번호 1873580001), 4mM Na3VO4 (pH를 NaOH를 사용하여 7.4로 조정함)로 구성된 차가운 용해 완충제 100μl 중에서 5분 동안 진탕시킴으로써 용해시켰다. 샘플을 급속 결빙시키고, 분석할 때까지 -80℃에 저장하였다. P-FGFR2 수준의 측정을 알앤디 시스템즈로부터의 P-FGFR2 ELISA 키트를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 수행하였다. OD를 백그라운드 보정과 함께 450 nm (테칸 스펙트라, 레인보우(Tecan Spectra, Rainbow))에서 측정하였다. P-FGFR2의 수준을 비처리된 대조군 수준의 %로서 계산하였다. 항체 포맷의 비-특이적 효과를 제어하기 위해, 병행 샘플을 동일한 이소형의 비-세포 결합 대조군 IgG와 함께 인큐베이션하였다.
결과를 도 2에 나타내었으며, 이는 항 FGFR2 항체 M048-D01-hIgG1 및 M047-D08-hIgG1에 의한 P-FGFR2 수준의 명백한 유도를 나타낸다. 대조적으로, 대조군 IgG 항체이든 또는 알앤디로부터 상업적으로 입수가능한 항 FGFR2 항체 (MAB665, MAB684, MAB6843)이든 단기간 인큐베이션 후의 P-FGFR2 수준에 대한 어떠한 유의한 효과도 나타내지 않았다. 이들 결과는 단기간 인큐베이션 후의 FGFR2에 대한 본 발명 내에 기재된 항 FGFR2 항체의 효능작용 효과를 밝혀내었다.
실시예 9: 항 FGFR2 항체와의 장기간 인큐베이션 후의 FGF7에 의한 P-FGFR2의 자극에 대한 FGFR2 과다발현 세포의 탈감작
장기간 인큐베이션 후의 인산화 FGFR2 (P-FGFR2)의 세포 수준에 대한 항 FGFR2 항체의 효과 및 FGFR2 인산화를 유도하는 FGF7의 능력에 대한 항체 처리의 효과를 결정하기 위해, P-FGFR2 ELISA를 수행하였다. MFM223 세포를 96웰 플레이트에서 성장 배지 (MEM 얼 (바이오크롬; F0315) + 10% FCS + 2mM 글루타민) 중에 웰당 7000개 세포로 플레이팅하였다. 플레이팅 24시간 후, 세포를 24분 동안 항체 (10μ/ml)와 함께 인큐베이션하고, 이어서 15분 동안 FGF7 (알앤디 시스템즈, 25ng/ml)의 존재 또는 부재 하에 인큐베이션하였다. 세포를 PBS로 2회 세척하고, (50mM Hepes pH 7.2, 150mM NaCl, 1mM MgCl2, 10mM Na4P2O7, 100mM NaF, 10% 글리세린, 1.5% 트리톤 X-100, 새로이 첨가된 완전 프로테아제 억제제 칵테일 (로슈 번호 1873580001), 4mM Na3VO4, pH를 NaOH를 사용하여 7.4로 조정함)로 구성된 용해 완충제 중에서 실온에서 5분 동안 진탕시킴으로써 용해시켰다. 샘플을 급속 결빙시키고, 알앤디로부터의 P-FGFR2 ELISA에 의해 제조업체의 지침에 따라 분석할 때까지 -80℃에 저장하였다. 광학 밀도를 백그라운드 보정과 함께 450 nm (테칸 스펙트라, 레인보우)에서 측정하였다. P-FGFR2의 수준을 비처리된 대조군 수준의 %로서 계산하였다. 항체 포맷의 비-특이적 효과를 제어하기 위해, 병행 샘플을 동일한 이소형의 비-세포 결합 대조군 IgG와 함께 인큐베이션하였다.
상응하는 결과를 도 3에 나타내었다. 항체 처리 없이 처리된 세포에서 뿐만 아니라 이소형 대조군 IgG로 처리된 세포에서, FGF7로의 자극은 P-FGFR2 수준의 약 4배 증가를 유발하였다. 대조적으로, 24시간 동안 항 FGFR2 항체로 전처리된 샘플에서, FGF7은 P-FGFR2 수준을 단지 1.37-1.4배만큼만 유도하였다.
종합하면, 이들 결과는 세포와 본 발명의 항 FGFR2 항체의 장기간 인큐베이션이 FGF7로의 자극에 대한 탈감작을 유발한다는 것을 나타낸다.
실시예 10: 세포주와 항 FGFR2 항체의 인큐베이션 후의 FGFR2 표면 발현의 하향조절
항 FGFR2 항체로 처리한 후의 FGFR2 표면 발현을 분석하기 위해, FACS 분석을 FGFR2 과다발현 (MFM223, SNU16) 또는 FGFR2 돌연변이 (AN3-CA, MFE-296)를 갖는 다양한 세포주에서 수행하였다. 부착 세포를 PBS (Ca 및 Mg 무함유)로 2회 세척하고, 효소-무함유 PBS 기반 세포 해리 완충제 (인비트로젠)에 의해 분리시켰다. 세포를 80μl 성장 배지 (MFM223, MFE-296: MEM 얼 (바이오크롬; F0315) + 10% FCS + 2mM 글루타민, SNU-16: RPMI 1640 (바이오크롬, FG1215) + 10% FBS; AN3-CA: MEM 얼 (바이오크롬; FG0325) + 10% FCS + 1mM 피루브산나트륨 +1x NEA: 비-필수 아미노산 바이오크롬 K0293) 중에 0.5*105개 세포/웰로 현탁시켰다. 5배 농축된 항체 희석물 20μl를 첨가 (10μg/ml의 최종 농도)하고, 37℃에서 4.5시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 시간 종료 후, 세포를 100μl FACS 완충제로 1회 세척하고, 검출 항체 (5μg/ml, hIgG의 경우에는 마우스 항-FGFR2, mIgG의 경우에는 인간 항-FGFR2)로 4℃에서 45분 동안 염색하고, 이어서 100μl FACS 완충제로 추가로 세척하였다. PE-염색된 2차 항체 (PE 염소 항-인간 IgG, 디아노바 #109-115-098, 또는 PE 염소 항-마우스 IgG, 잭슨 이뮤노 리서치 #115-115-164, 1:150 희석됨)를 80μl 부피로 첨가하고, 4℃에서 45분 동안 인큐베이션하고, FACS 완충제로 추가로 세척한 후, 세포를 FACS 어레이 (BD 바이오사이언시스)를 사용하여 유동 세포측정법에 의해 분석하였다. 대조 실험에서, 관심 항체 및 상응하는 검출 항체와의 병행 인큐베이션에 의해, 중첩되는 에피토프에 대한 항체 경쟁을 배제시켰다. 2차 항체 단독으로 염색한 후에 측정된 기하-평균을 항 FGFR2 항체로 염색한 후에 검출된 피크로부터의 기하-평균에서 차감하였다. 결과를 항체의 존재 없이 4.5시간 동안 인큐베이션한 대조군 세포의 %로서 계산하였다.
결과를 도 4에 나타내었다. 세포와 대조군 IgG의 인큐베이션은 FGFR2 표면 발현의 감소를 전혀 유발하지 않았고, 반면에 항 FGFR2 항체 M048-D01-hIgG1 및 M047-D08-hIgG1은 FGFR2 과다발현 또는 돌연변이에 비의존적으로 모든 4종의 세포주에서 FGFR2 표면 수준을 39-60%만큼 유의하게 하향조절하였다. 대조적으로, 다른 항 FGFR2 항체는 알앤디로부터 상업적으로 입수가능한 것 (MAB665, MAB684, MAB6843)이든 또는 다른 곳에 기재된 것, 예를 들어 (GAL-FR21, GAL-FR22; WO2010/054265 및 문헌 [Zhao et al. (Clin Cancer Res. 2010,16:5750-5758)])이든 FGFR2 과다발현 또는 돌연변이에 비의존적으로 모든 4종의 세포주에서 FGFR2 표면 하향조절을 나타내지 않았다. GAL-FR21은 FGFR2 증폭을 갖는 세포주 (SNU16 및 MFM223)에서 FGFR2 표면 수준을 하향조절하였으나, FGFR2 돌연변이를 갖는 세포주에는 전혀 영향을 미치지 않았다. GAL-FR22는 FGFR2 돌연변이된 세포주 (각각 AN3-CA 및 MFE-296)에서 FGFR2 표면 발현의 73 및 21% 하향조절에 도달하였으나, SNU16 및 MFM223 세포에서의 표면 FGFR2 수준에 대해서는 전혀 유의한 영향을 미치지 않았다. 다시 MAB684 및 MAB6843은 FGFR2 돌연변이된 세포주에서 FGFR2 표면 수준의 약 60% 감소를 유도하였고, FGFR2 과다발현 세포주에 대해서는 주요 효과가 없었다. 마지막으로, MAB665는 FGFR2 표면 수준에 대해 어떠한 영향도 보여주지 않았다.
요약하면, 항 FGFR2 항체 M048-D01-hIgG1 및 M047-D08-hIgG1은 FGFR2 과다발현 또는 돌연변이에 비의존적으로 암 세포주에서 FGFR2 표면 하향조절을 유도하는 유일한 항 FGFR2 항체이다.
실시예 11: 암 세포와 항 FGFR2 항체의 장기간 인큐베이션 후의 전체 FGFR2 수준의 하향조절
항 FGFR2 항체에 의해 유도된 FGFR2 표면 하향조절이 전체 FGFR2 수준의 장기간 감소를 유발하는지의 여부를 분석하기 위해, FGFR2의 전체 단백질 수준을 FGFR2 ELISA에 의해 분석하였다. SNU16 세포를 96웰 플레이트에서 성장 배지 (RPMI 1640 (바이오크롬, FG1215) + 10% FBS) 중에 5000개 세포/웰로 플레이팅하였다. 2시간 후, 세포를 제시된 바와 같은 다양한 농도의 항 FGFR2 항체 또는 상응하는 이소형 대조군 IgG와 함께 인큐베이션하였다. 항체와의 인큐베이션 시작 96시간 후, 세포를 실온에서 300g로 5분 동안 원심분리하고, PBS 중에서 2회 세척하고, 100μl 용해 완충제 (50mM Hepes pH 7.2, 150mM NaCl, 1mM MgCl2, 10mM Na4P2O7, 100mM NaF, 10% 글리세린, 1.5% 트리톤 X-100, 새로이 첨가된 완전 프로테아제 억제제 칵테일 (로슈 번호 1873580001), 4mM Na3VO4, pH를 NaOH를 사용하여 7.4로 조정함)를 첨가하고 실온에서 5분 동안 진탕시킴으로써 용해시켰다. 샘플을 급속 결빙시키고, 전체-FGFR2-ELISA Ki (알앤디 시스템즈)를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 분석할 때까지 -80℃에 저장하였다. 광학 밀도를 백그라운드 보정과 함께 450 nm (테칸 스펙트라, 레인보우)에서 측정하였다. 전체 FGFR2의 절대적 수준을 계산하기 위해, 단리된 FGFR2 단백질을 사용한 표준 곡선을 제조업체의 권고 (알앤디 시스템즈)에 따라 적용시켰다. 결과를 항체의 부재 하에 96시간 동안 인큐베이션한 대조군 세포에서 측정된 FGFR2 수준의 %로서 나타내었다.
결과를 도 5에 나타내었다. 본 발명의 항 FGFR2 항체와의 96시간 동안의 인큐베이션은 전체 FGFR2 수준의 41-55%만큼의 감소를 유발하였다. 절반 최대 감소는 3μg/ml의 항 FGFR2 항체 용량에서 도달되었다. 대조적으로, 이소형 대조군 항체와의 인큐베이션은 전체 FGFR2 수준에 전혀 영향을 미치지 않았다.
종합하면, 이들 결과는 항 FGFR2 항체 M048-D01-hIgG1 및 M047-D08-hIgG1이 표면 FGFR2 수준의 단기간 감소 뿐만 아니라 전체 FGFR2 수준의 장기간 감소도 또한 유발한다는 것을 나타낸다.
실시예 12: 항 FGFR2 항체의 세포로의 내재화
본 발명의 항 FGFR2 항체를, FGFR2 항원에 대한 결합 후에 내재화되는 그의 능력에 대해 분석하였다.
상기 과정을 가시화하기 위해, FGFR2 특이적 항체 M048-D01-hIgG1 및 M047-D08-hIgG1 및 이소형 대조군 항체를 선택하였다. 항체를 pH 8.3에서 2 몰 과량의 CypHer 5E 모노 NHS 에스테르 (배치 357392, 지이 헬스케어)의 존재 하에 접합시켰다. 접합시킨 후, 반응 혼합물을 4℃에서 밤새 투석 (슬라이드-A-라이저(slide-A-Lyser) 투석 카세트 MWCD 10kD, 피어스 제조)하여 과량의 염료를 제거하고 pH-값을 조정하였다. 그 후, 단백질 용액을 농축시켰다 (비바스핀 500, 사르토리우스 스테딤 바이오텍(Sartorius stedim biotec) 제조). pH-의존성 형광 염료 CypHer5E 이외에도 pH-비의존성 염료 알렉사 488을 사용하였다. 항체의 염료 부하를 분광광도계 (나노드롭(NanoDrop) 제조)로 결정하였다. M048-D01-hIgG1 및 M047-D08-hIgG1 및 이소형 대조군 (M014)의 염료 부하는 유사한 범위 내에 있었다. 표지된 항체의 친화도를 세포 결합-검정으로 시험하여 표지가 FGFR2에 대한 결합을 변경하지 않았음을 확실히 하였다. 이들 표지된 항체를 하기 내재화 검정에 사용하였다. 처리 전에, 세포 (2x104개/웰)를 96-MTP (편평, 흑색, 투명 바닥 번호 4308776, 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems) 제조)에서 100μl 배지 중에 시딩하였다. 37℃/5% CO2에서 18시간 동안 인큐베이션한 후, 배지를 교체하고, 표지된 항 FGFR2 항체 M048-D01-hIgG1 및 M047-D08-hIgG1을 다양한 농도 (10, 5, 2.5, 1, 0.3, 0.1μg/ml)로 첨가하였다. 동일한 처리를 이소형 대조군 항체 (음성 대조군)로 수행하였다. 인큐베이션 시간을 0, 5시간, 1시간, 2시간, 3시간, 6시간 및 24시간이 되도록 선택하였다. 형광 측정을 인셀애널라이저(InCellAnalyzer) 1000 (지이 헬스케어 제조)으로 수행하였다. 과립 카운트 및 총 형광 강도를 동역학적 방식으로 측정하였다.
M048-D01-hIgG1 및 M047-D08-hIgG1의 고도로 특이적이고 유의한 내재화가 내인성 FGFR2 발현 암 세포주 SNU16 (위암) 및 SUM52PE (유방암)에서 관찰되었다.
흡수는 단지 항 FGFR2 항체를 사용할 때만 입증될 수 있었고 이소형 대조군으로는 내재화가 전혀 관찰되지 않았으므로, 상기 내재화는 표적 의존성이었다. 처음 6시간 동안 항 FGFR2 항체는 이소형 대조군과 비교시 항체 내재화의 20-40배 증가를 나타내었다. 이소형 대조군은 장기간 노출 (>24시간) 후에 소량의 내재화를 나타내었다.
결합 후의 알렉사 488로 표지된 항 FGFR2 항체의 내재화는 내재화된 항체 중 50% 초과가 세포내이입 경로를 따르는 것으로 보인다는 것을 밝혀내었다.
내인성 FGFR2 발현 세포에 결합한 후의 M048-D01-hIgG1 및 M047-D08-hIgG1의 특이적 내재화의 시간 경과의 현미경 평가를 도 6에 나타내었다. 항체 (2.5 μg/ml)의 내재화를 유방암 세포주 SUM 52PE 상에서 조사하였다. 과립 카운트를 동역학적 방식으로 측정하였다. 신속한 내재화가 M048-D01-hIgG1 및 M047-D08-hIgG1에 대해 관찰될 수 있었고, 반면에 이소형 대조군 hIgG1은 내재화되지 않았다.
트래픽킹 경로의 보다 상세한 평가를 소형 G-단백질의 동시-염색으로 수행하였다. Rab GTPase는 소포 형성, 액틴 및 튜불린 네트워크를 따른 소포 운동 및 막 융합을 비롯한 막 트래픽의 다수의 단계를 조절한다. 상이한 경로를 구별하기 위해, 2종의 Rab 단백질을 염색용으로 선택하였다 - 후기 엔도솜 및 리소솜에서 발현되는 Rab7, 및 초기 및 재활용 엔도솜에서 발현되는 Rab11. 표지된 항체를 6시간 동안 내재화시킨 후, 세포를 메탄올로 고정하고 투과성이 되게 한 후, Rab 7- 및 Rab 11-항체로 염색하였다. 결과를 도 7에 나타내었다.
M048-D01-hIgG1 및 M047-D08-hIgG1은 Rab 7과의 유의한 동시-염색을 보여주었고, 반면에 Rab 11과의 동시-염색은 단지 소량이었다. 이들 결과는 FGFR2의 내재화 후에 복합체가 엔도솜 - 리소솜 경로로 진입한다는 것을 나타낸다.
GAL-FR21 및 GAL-FR22와 같은 다른 기재된 항체 (WO2010/054265 및 문헌 [Zhao et al. (Clin Cancer Res. 2010,16: 5750-5758)])에 대한 염색 패턴은 완전히 상이하게 보였다. 여기서는 Rab7로 염색이 거의 전혀 검출될 수 없었고, 주요 동시-염색은 Rab11로 달성되었다. 이는 이들 항체가 FGFR2 수용체에 결합한 후에 내재화되며 재활용 경로를 선호한다는 것을 나타낸다.
실시예 13: 마우스 모델의 실험적 종양에서의 본 발명의 항 FGFR2 항체의 시험
본 발명의 항 FGFR2 항체의 생체내 효능을, 예를 들어 피하 이종 또는 동종 종양 모델을 통해 시험하였다. 전문가는 혁신적인 항체의 효능을 증명하기 위한 선행 기술 방법을 알고 있다. 예를 들어, 이에 따라 마우스에 표적 FGFR2를 발현하는 종양 세포를 피하로 접종하였다. 그 후, 종양-보유 마우스를 본 발명의 FGFR2-표적화 항체, 비-결합 이소형 대조군 또는 포스페이트-완충 염수 (PBS)로 처리하였다. 항체의 적용은 매주 2회 복강내로 또는 정맥내로 수행하였다. 상가적 항종양 효능을 시험하기 위해, 본 발명의 FGFR2 Ab를 통상의 치료 기준과 조합하고, 단일 작용제 효능과 비교하였다. 종양 성장을 캘리퍼를 통한 종양 면적의 빈번한 측정에 의해 모니터링하였다. 몇 주 동안의 종양 성장 및 처리 후, 종양을 수확하고, 본 발명의 항 FGFR2 항체로 처리된 동물의 종양 중량 또는 종양 크기 (길이 x 너비 공식에 의해 계산된 종양 면적)를 PBS 또는 이소형 대조군 항체로 처리된 것들과 비교하였다. 본 발명의 항 FGFR2 항체로 처리된 마우스는 유의하게 보다 작은 종양을 보여주었다.
FGFR2를 발현하는 인간 또는 뮤린 종양 세포를 면역손상 마우스, 예를 들어 누드- 또는 SCID-마우스의 측면 상에 피하로 접종하였다. 마우스당 25만-1000만개의 세포를 세포 배양 플라스크로부터 분리시키고, 원심분리하고, 각각 100 μl PBS, 50% 배지 / 50% 매트리겔, 또는 100% 매트리겔 중에 현탁시켰다. 이어서, 세포를 마우스의 측면 상에 피부 밑에 피하로 접종하였다. 환자-유래 종양 모델의 경우에는, 위암 환자로부터 수확한 종양을 면역손상 마우스 상에 피하로 계대접종하였다. 항 FGFR2 항체의 효능을 시험하기 위해, 규정된 크기 (2 x 2 mm)의 종양 조각을 마우스의 측면 상에 피하로 이식하였다. 수일 내로 종양이 확립되었다. 종양 면적 (mm2)을 길이 x 너비 공식에 의해 계산하고 종양 부피 (mm3)를 길이 x 너비2 / 2 공식에 의해 계산하여 종양이 20 mm2 (세포주-유래 종양) 또는 100 mm3 (환자-유래 종양)의 크기에 도달한 경우에 가장 먼저 처리를 시작하였다. 항체로의 처리를 복강내로 또는 꼬리 정맥 주사를 통해 정맥내로 수행하였다. 항체를 PBS 또는 50 mM Na-아세테이트, 150 mM NaCl 중에 용해시켰다. 항체를 10 ml/kg의 부피로 적용시켰다. 처리 계획은 항체의 약동학적 거동에 기반하였다. 표준으로서, 항체를 매주 2회 (교대로 매 3일마다 및 매 4일마다) 적용시켰다. 표준으로서, 처리를 대조군이 최대 가능 종양 크기에 도달할 때까지 수행하였다. 다르게는, 처리를 보다 이르게 중단하였다. 표준으로서, 처리군당 8마리의 마우스를 사용하였다. 종양 성장의 보다 큰 다양성이 예상되는 경우에, 처리군당 마우스의 수를 증가시킬 수 있다. 처리군과 병행하여, 대조군을 동일한 처리 계획에 따라 PBS로 처리하였다. 연구 동안, 종양 면적을 캘리퍼를 사용하여 종양의 길이 및 너비를 측정함으로써 빈번하게 평가하였다. 연구 종료시에, 종양을 수확하고, 칭량하였다. 항체-처리된 군의 평균 종양 중량 (T) 및 대조군의 평균 종양 중량 (C)의 비를 T/C로 나타내었다. 처리군 및 대조군이 상이한 시점에 종결되었거나, 또는 종양이 괴사성이 되어 종양 중량을 판독치로서 사용할 수 없게 된 경우에는, T/C 비를 최종 공통 측정 시점의 종양 면적에 기반하여 계산하였다.
50% 배지 / 50% 매트리겔 중 200만개의 인간 위암 SNU-16 세포를 암컷 nodSCID 마우스의 측면 상에 피하로 접종하였다. 종양이 20-30 mm2의 평균 크기에 도달하였을 때 항-FGFR2 항체로의 복강내 처리를 시작하여, 연구 종료시까지 매주 2회 계속하였다. 대조군의 종양이 최대 허용가능 크기에 도달하면, 연구를 종결하고, 종양을 수확하고 칭량하였다.
본 발명의 모든 시험된 항 FGFR2 항체는 대조군과 비교시 종양 성장을 유의하게 감소시켰다. 2 mg/kg 용량의 M017-B02-hIgG1, M021-H02-hIgG1, M048-D01-hIgG1, M054-A05-hIgG1, M054-D03-hIgG1 및 M047-D08-hIgG1로의 처리는 각각 0.19, 0.22, 0.17, 0.19, 0.21 및 0.22의 T/C를 생성하였다 (도 8 내지 13 참조).
2.5 x 105개의 뮤린 4T1 유방암 세포를 NMRI nu/nu 마우스의 측면 상에 100% PBS 중에서 피하로 접종하였다. 인간 IgG 단백질에 대한 중화 항체의 발생을 회피하기 위해 동계 마우스 대신에 면역손상 마우스를 선택하였다. 종양이 24 mm2의 평균 크기에 도달한 시점에 종양의 처리를 시작하였다. M048-D01-hIgG1의 가능한 상가적 항종양 효능을 시험하기 위해, 마우스를 각각 M048-D01-hIgG1, 라파티닙 또는 탁솔 단독으로, 및 M048-D01-hIgG1과 탁솔 또는 라파티닙을 조합하여 처리하였다. 대조군으로서, 마우스를 PBS 단독으로 처리하였다. M048-D01-hIgG1로의 처리는 매주 2회 정맥내로 (i.v.) 수행하고, 라파티닙으로의 처리는 매일 1회 경구로 (p.o.) 수행하고, 탁솔로의 처리는 매주 1회 정맥내로 수행하였다. 모든 처리는 연구 종료시까지 수행하였다. 연구 종료시에 종양이 괴사성이 되었으므로, 종양 세포 접종 후 제13일의 종양 면적을 이용하여 항종양 효능을 결정하였다. 본 연구는 M048-D01-hIgG1과 라파티닙 또는 탁솔의 조합이 상가적 항종양 효능을 달성했음을 밝혀내었다: 라파티닙 및 탁솔로의 단독요법 각각은 비히클 대조군과 비교시 종양의 성장을 유의하게 변화시키지 않은 반면, M048-D01-hIgG1 단독은 비히클과 비교시 0.73의 T/C로 유의한 감소를 일으켰다. 라파티닙 및 탁솔과의 조합은 상기 T/C를 0.58 및 0.52로 감소시켰으며, 둘 다 양쪽 단독요법에 대해 통계적으로 유의하다 (도 14 및 15 참조).
면역손상 마우스 상에 계대접종된, 본래는 환자-유래 위 종양인 GC10-0608 및 GC12-0811 (휜 훙(Huynh Hung) 교수, 싱가포르 국립대학교 (NUS))의 2 x 2 mm 조각을 암컷 면역손상 미감작 마우스 상에 피하로 이식하였다. 2차원으로 종양을 측정하는 캘리퍼를 사용하여 종양 크기를 빈번하게 평가하고, 종양 부피를 길이 x 너비2 / 2 공식에 의해 계산하였다. 다양한 용량의 M048-D01-hIgG1로의 처리를 종양이 대략 100 mm3의 평균 크기에 도달한 시점에 시작하였다. 처리를 5, 2 및 1 mg/kg M048-D01-hIgG1의 용량으로 매주 2회 정맥내로 수행하였다. 높은 FGFR2 단백질 발현을 갖는 종양 모델 (GC10-0608)에서는, 모든 3가지 용량이 종양 성장의 유의한 감소를 일으켜 최종 종양 중량 기준 0.55, 0.60 및 0.41의 T/C 값을 생성하였다 (도 16 참조). 현저하게 보다 낮은 FGFR2 단백질 발현을 갖는 모델 (GC12-0811)에서는, 5 및 2 mg/kg의 M048-D01-hIgG1이 종양 중량의 유의한 감소를 일으켜 0.70 및 0.67의 T/C를 생성하였다 (도 17 참조). 보다 낮은 FGFR2 발현에 따라, 1 mg/kg의 M048-D01-hIgG1은 최종 종양 중량의 유의한 감소를 일으키지 않았다. 2종의 다른 종양 모델인 유방암 모델 MFM223 및 결장직장암 모델 NCI-H716 (ATCC-CCL-251)의 처리의 경우에는, 본 발명자들은 종양 성장을 유의하게 감소시키는 적절한 적용 계획을 찾아내지 못했다.
실시예 14: 항 FGFR2 항체로 치료한 후의 이종이식 종양에서의 P-FGFR 및 전체 FGFR2 수준의 하향조절
관찰된 전체 FGFR2 수준의 하향조절 및 P-FGFR2의 동시 감소가 또한 생체내 이종이식 종양에서도 나타나는지의 여부를 분석하기 위해, 항 FGFR2 항체로 처리한 후의 SNU-16 종양을 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다. 종양을 NOD/SCID 마우스에서의 이종이식 실험 종료시에 수집하고, 항 FGFR2 항체 2mg/kg i.p.로 매주 2회 처리하였다 (상세사항에 대해서는 실시예 13 참조). 종양을 항체의 최종 주입 24시간 후에 취하고, 액체 질소 중에서 급속 결빙시키고, 분석할 때까지 -80℃에 저장하였다. 웨스턴 블롯 분석 전에, 결빙된 종양을 약 5mm 직경의 슬라이스로 절단하고, 각각의 슬라이스를 사전냉각된 5mm 스틸 불(steel bull) (퀴아젠(Qiagen)) 및 500μl 용해 완충제 (50mM Hepes pH 7.2, 150mM NaCl, 1mM MgCl2, 10mM Na4P2O7, 100mM NaF, 10% 글리세린, 1.5% 트리톤 X-100, 새로이 첨가된 완전 프로테아제 억제제 칵테일 (로슈 번호 1873580001), 4mM Na3VO4, pH를 NaOH를 사용하여 7.4로 조정함)와 함께 2ml 에펜도르프 튜브에 넣었다. 샘플을 티슈라이저(Tissuelyzer) (퀴아젠)에서 300Hz로 3분 동안 용해시키고, 이어서 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 샘플을 마이크로-원심분리기 (에펜도르프)에서 10분 동안 13000 rpm으로 4℃에서 원심분리하고, 하나의 기원 종양으로부터 유래한 슬라이스로부터의 상청액을 함께 모았다. 종양 용해물 중 단백질 수준을 BCA 단백질 검정 키트 (노바젠(Novagen), H2O 중에 1:50 희석된 용해물)를 사용하여 결정하였다. 샘플을 5mg/ml의 최종 농도로 희석하고, 샘플 50μl를 (10*) 샘플 환원제 7.7 μl 및 19.2μl (4*) NuPAGE 샘플 완충제 (인비트로젠)와 혼합하였다. 단백질 115μg에 상응하는 샘플을 인비트로젠으로부터의 NuPage 4-12% SDS page 겔에 적용시키고, 120V에서 2시간 45분 동안 러닝시켰다. 블롯팅을 아이블롯(iBlot) 시스템 (인비트로젠)에 의해 제조업체의 권고에 따라 수행하였다. 막을 PBST 중 5% 블롯 퀵블로커(BLOT QuickBlocker) (인비트로젠) 중에서 2시간 동안 실온에서 차단하고, 이어서 4℃에서 밤새 1차 항체와 함께 인큐베이션하였다. 1차 항체는 다음과 같았다: P-FGFR: #AF3285, 알앤디 시스템즈, 0.5μg/ml; 전체 FGFR2: M017-B02-hIgG1, PBST 중 3% 블롯 퀵블로커 중 4μg/ml. 다음날, 막을 PBST 중에서 3회 세척하고, 이어서 2차 항체 (퍼옥시다제-접합된 어피니퓨어(AffiniPure) 염소 항-토끼 IgG (H+L) (잭슨 이뮤노리서치 #111-035-003) 또는 퍼옥시다제-접합된 어피니퓨어 염소 항-인간 + IgM (H+L) (잭슨 이뮤노리서치 #109-035-127), 3% 블롯 퀵블로커/PBST 중 1:10000)와 함께 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 후속적으로, 막을 PBST로 10분 동안 4회 세척하고, ECL 시약과 함께 인큐베이션한 후에 신호를 화학발광에 의해 검출하였다. 로딩 대조군을 검출하기 위해, 막을 강한 스트리핑 용액 (밀리포어(Milipore)-H2O 중 1:10)으로 15분 동안 실온에서 진탕시키면서 스트리핑하고, 이어서 차단하고, 3% 퀵블로커/PBST 중 1:1000 항-액틴 항체 #A2066 (시그마)로 검출하였다.
항 FGFR2 항체로 처리한 군당 2마리의 동물로부터의 대표적인 결과를 대조군 IgG로 처리한 동물로부터의 샘플과 나란히 도 18에 나타내었다. P-FGFR 수준 뿐만 아니라 전체 FGFR2 수준이 본 발명의 항 FGFR2 항체로 처리한 후에 강하게 감소되었다. 따라서, 상기 시험관내 연구에 기재된 전체 FGFR2의 하향조절의 작용 방식은 본 발명의 항 FGFR2 항체로 처리한 후의 이종이식 종양에서도 또한 관련이 있다.
실시예 15: 항체 약물 접합체를 사용한 피하 이종이식편 암 모델:
항 FGFR2 항체를 당업계에 공지된 프로토콜 (예를 들어, 문헌 [Liu et al., Proc Natl. Acad. Sci. (1996), 93, 8618-8623])을 이용하여 세포독성 소분자에 접합시킬 수 있다. A431 세포를 10% FBS로 보충된 DMEM 중에서 부착 배양물로서 유지한다. 6-7주령의 NOD SCID 또는 다른 면역손상 마우스에 배지 0.1 ml 중 1-5 x 10e6개 세포를 우측면에 피하로 접종할 것이다. 종양 크기가 약 25 mm2에 도달했을 때, 항체 약물 접합체를 1-10 mg/kg의 용량으로 매 4, 7 또는 10일마다 3회 복강내 투여할 것이다. 대조군 마우스는 PBS 또는 동일한 독성단과 접합된 관련되지 않은 모노클로날 항체로 처리할 것이다. 종양 크기를 슬라이딩 캘리퍼로 매주 2회 측정할 것이다. 항종양 효능을 항 FGFR2 항체 약물 접합체 처리 대 대조군 처리의 종양 크기를 비교함으로써 평가할 것이다.
실시예 16: 개선된 친화도를 갖는 선택된 항체의 성숙 변이체의 생성
하기 표 9에 나타낸 바와 같은 파지 디스플레이에 의해 발견된 본 발명의 항 FGFR2 항체를 친화도 성숙에 의해 추가로 최적화하였다.
표 9: 파지 디스플레이에 의해 발견된 항체의 서열
Figure pct00010
항체 친화도 성숙은 친화도 증가를 일으키는 소수의 돌연변이를 확인하기 위해 포화 돌연변이유발 및 웰-기반 고처리량 스크리닝이 조합된 2-단계 과정이다. 친화도 성숙의 제1 라운드에서, 문헌 [BMC Biotechnology 7: 65, 2007]에 따라 NNK-트리뉴클레오티드 카세트 (여기서, N은 아데닌, 티민, 구아닌 및 시토신 뉴클레오티드 각각의 25% 믹스를 나타내고, K는 티민 및 구아닌 뉴클레오티드 각각의 50% 믹스를 나타냄)를 사용하는 부위-지정 돌연변이유발에 의해 야생형 항체의 위치별 다양화를 도입시켰다. 상기 방식으로, 모든 20개의 아미노산을 개별 아미노산 위치에 도입시켰다. 상기 위치 무작위화는 6개의 상보성 결정 영역 (CDR)에 국한되었다. 친화도 성숙의 제2 라운드에서, 유익한 치환을 재조합하고, 추가의 개선에 대해 스크리닝하였다. 이러한 변이체의 예를 하기 표 10에 나타내었다.
표 10: 각각 M048-D01 및 M047-D08로부터 유래된 변이체 항체의 서열
Figure pct00011
2가지 상이한 유형의 ELISA를 이용하여 돌연변이된 변이체의 결합 개선을 결정하였다:
a) 펩티드 결합 ELISA: 비오티닐화 리신에 C-말단에서 연결된 에피토프의 아미노산 서열을 포함하는 합성 펩티드 RPSFSLVEDTTLEPEG-Ttds-Lys(비오틴) (서열 63으로부터 유래된 펩티드 서열, JPT 펩티드 테크놀로지 게엠베하(JPT Peptide Technology GmbH; 독일 베를린)에 의해 합성됨), 및
b) 재조합 단백질 결합 ELISA: 재조합 인간 FGFR2 (C-말단에서 폴리히스티딘 태그와 융합된 인간 FGFR2 ( NP_000132.3 ) Met 1 - Glu 377의 DNA 서열; # 10824-H08H, 시노 바이올로지칼 인크.(Sino Biological Inc.; 중국 베이징)).
간략하게, ELISA 포맷 둘 다에서 MTP 플레이트 (384웰 맥시소르프(Maxisorp), 눈크(Nunc))를 코팅 완충제 (# 121125 칸도르 바이오사이언스 게엠베하(Candor Bioscience GmbH)) 중 2.2 μg/ml의 항-인간 IgG Fc 특이적 (# I2136; 시그마) 20 μl로 37℃에서 2.5시간 동안 코팅하였다. 50 μl PBST (포스페이트 완충 염수, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7.4, 0.05% 트윈20)를 사용하여 1회의 세척 단계를 수행한 후, 플레이트를 10% 스마트 블록(Smart Block) (# 113500, 칸도르 바이오사이언스 게엠베하) 50 μl로 1시간 동안 20 - 22℃에서 차단하고, 세척 단계를 3회 반복하였다. 항-FGFR2 변이체를, 분석할 포맷 및 변이체에 따라 PBST 중 10% 스마트 블록 중 0.035 μg/ml (펩티드 기반 검정) 또는 0.2 μg/ml (재조합 인간 FGFR2 단백질 기반 검정)의 농도로 20 μl를 1시간 동안 20 - 22℃에서 인큐베이션함으로써 고정화시켰다. 50 μl PBST를 사용하여 1회의 세척 단계를 수행한 후, 100 nM의 최대 농도를 갖는 PBST 중 10% 스마트블록 중 항원 연속 희석물 20 μl 4벌을 첨가하고, 20 - 22℃에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 세척 단계를 3회 반복하였다. 비오티닐화 에피토프 펩티드의 검출을 위해, PBST 중 10% 스마트블록 중에 1:1000 희석된 스트렙타비딘 / POD 접합체 (# S5512, 시그마) 20 μl를 20 - 22℃에서 1시간 동안 적용시켰다. 재조합 FGFR2 단백질의 검출을 위해, PBST 중 10% 스마트블록 중에 1:10000 희석된 항-His / HRP 접합체 (# 71840, 노바젠) 20 μl를 20 - 22℃에서 1시간 동안 적용시켰다. 3회의 세척 단계 후, 50 mM 소듐 히드로겐 포스페이트, pH 7.6 중 10 μM 암플렉스 레드(amplex red) 기질 (# A12222, 인비트로젠) 20 μl를 첨가하고, 형광 신호를 통상의 형광 판독기, 예를 들어 테칸 M1000을 사용하여 검출하였다. EC50 값을 데이터를 적합시킴으로써 평가하였다 (S자형 용량-반응, 가변 경사, 최저치를 백그라운드에 맞춤; 그래프패드 프리즘 소프트웨어).
M048-D01 (TPP-1403)의 중쇄 및 경쇄에서 생성된 아미노산 치환을 갖는 변이체의 여러 예가 표 10에 제공되어 있다. 모든 변이체는 비-CDR 변화 변이체 (표 11)와 비교시, 상이한 항원 형태를 사용하는 2가지 ELISA 포맷으로 평가한 항원 결합에서 강한 개선을 나타내었다.
M047-D08 (TPP-1415)의 중쇄 및 경쇄에서 생성된 아미노산 치환을 갖는 변이체의 여러 예가 표 10에 제공되어 있다. 모든 변이체는 비-CDR 변화 변이체 (표 11)와 비교시, 항원 결합에서 유의한 개선을 나타내었다.
수치적 결과인 EC50 및 개선 지수에 관하여 양쪽 포맷 사이의 차이는 예상치 못한 것이었으나, 펩티드 또는 단백질 형태의 항원의 사용 및 ELISA 샌드위치의 최상부에서의 최종적으로 검출된 효소 접합체의 형성에서의 차이에 의해 설명될 수 있는 가능성이 있다: 항-His-HRP 접합체 및 His-태그부착된 FGFR2의 KD는 공지되어 있지 않으나, 이는 에피토프 펩티드의 검출에 활용된 비오틴 및 스트렙타비딘의 KD (10-15 M)보다 더 높은 자릿수일 가능성이 높다. 결과적으로, 결합된 펩티드에 대한 감수성은 His-태그부착된 단백질에 대한 감수성보다 유의하게 더 높고, 이는 보다 낮은 EC50을 결정하는 잠재력으로 이어진다. 또한 또는 다르게는, 차이는 15개의 아미노산 스트레치에 걸친 동일한 서열에도 불구하고 존재하는 항-FGFR2 항체와 양쪽 항원의 상호작용에서의 편차에 의해 유발될 수 있는데; 첫째로, 분자의 C-말단의 이어지는 부분의 화학은 매우 다양하고, 둘째로 15개의 아미노산은 FGFR2 단백질에서의 상응하는 영역과 동일하지 않은 3D 입체형태를 취할 수 있다. 설명 둘 다는 펩티드 ELISA 포맷에서 보다 낮은 EC50 값을 나타내는 펩티드 및 단백질 기반 ELISA 사이의 차이와 관련이 있을 수 있다.
하기 표 11의 데이터 세트는 M048-D01 (TPP-1403)이 에피토프 펩티드에서 나타난 바와 같이 그의 N-말단 서열에서 FGFR2에 결합한다는 것, 및 CDR에서의 아미노산 치환을 갖는 여러 변이체가 놀랍게도 보다 높은 친화도에도 불구하고 동일하게 거동한다는 것을 명백하게 나타낸다. 주목할 만한 것은, CDR-L1, -L2, -L3, -H2 및/또는 -H3에서의 여러 다른 치환을 동반하는 TPP-1403의 6종의 다른 변이체 중 5종에 치환 N102I가 존재하지만, 놀랍게도 위치 HC-102에서 리신 (K)을 나타내는 TPP-1399에서는 그렇지 않다는 것이다.
표 11의 데이터 세트는 M047-D08 (TPP-1415)이 에피토프 펩티드에서 나타난 바와 같이 그의 N-말단 서열에서 FGFR2에 결합한다는 것, 및 CDR에서의 아미노산 치환을 갖는 여러 변이체가 놀랍게도 보다 높은 친화도에도 불구하고 동일하게 거동한다는 것을 나타낸다. 다중 아미노산 치환을 갖는 M047-D08 (TPP-1415)의 변이체는 대략 4 내지 40배 개선된 결합을 나타내었으며, TPP-1409가 가장 적게 개선되었고 (2.1 nM), TPP-1406 (0.22 nM)이 가장 많이 개선되었다. 주목할 만한 것은, CDR-L1, -L2, -L3, -H1 및/또는 -H3에서의 여러 다른 치환을 동반하는 이들 중 3종 (TPP-1406, -1407 및 -1412)이 G102L 치환을 갖고, 1종 (TPP-1408)이 G102V 치환을 갖는다는 것이다.
표 11: 각각 M048-D01 및 M047-D08로부터 유래된 변이체 항체의 펩티드 결합 ELISA 결과, 단백질 결합 ELISA 결과 및 내재화 효능 데이터
Figure pct00012
또한, 표 11에는 성숙 항 FGFR2 항체의 내재화 효능의 개선이 요약되어 있다. 개선 지수는 성숙 항체의 내재화 및 분해에 의해 달성된 총 과립 강도/세포의 모 항체의 상응하는 값과의 비교에 기반하여 계산하였다. 동일한 발견이 동일한 항체 순위를 생성하는 과립 카운트/세포의 비교에 의해 달성되었다. 실험적 상세사항은 실시예 12에 기재되어 있다. 주목할 만한 것은, M048-D01 (TPP-1403)의 모든 성숙 변이체가 개선된 내재화 효능 (1.9 내지 2.4배)을 나타내었다는 것이다. M047-D08 (TPP-1415)의 경우에는, 변이체 TPP-1412가 1.5배 개선된 내재화 효능을 나타내었다. 내재화는 본 발명의 항체의 중요한 특징이다.
M047-D08 및 M048-D01에 대해 제공된 변이체를 사용하여, 이들 항체의 변이체가 에피토프가 유지되는 경우에 유사하거나 개선된 특성을 가질 수 있다는 것을 분명히 입증할 수 있었다.
실시예 17: 다른 항-FGFR2 항체와의 경쟁의 결정
본 발명에 따른 항-FGFR2 항체와 당업계에서 기재된 항-FGFR2 항체 사이의 경쟁을 분석하기 위해, 다양한 항체를 경쟁적 ELISA 포맷으로 평가하였다:
MTP 플레이트 (384웰 맥시소르프, 눈크)를 코팅 완충제 (# 121125 칸도르 바이오사이언스 게엠베하) 중 2 μg/ml 항-인간 IgG (Fc 특이적) (# I2136; 시그마) 20 μl로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 50 μl PBST (포스페이트 완충 염수, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7.4, 0.05% 트윈20)를 사용하여 1회의 세척 단계를 수행한 후, 플레이트를 100% 스마트 블록 (# 113500, 칸도르 바이오사이언스 게엠베하) 50 μl로 1시간 동안 20 - 22℃에서 차단하고, 세척 단계를 3회 반복하였다. M048-D01-hIgG1을, PBST 중 10% 스마트 블록 중 1 μg/ml의 농도로 20 μl를 1시간 동안 20 - 22℃에서 인큐베이션함으로써 고정화시키고 (표 12에 나타냄; 제2행에서 M048-D01-hIgG1 포획 '예'); M048-D01-hIgG1을 함유하지 않는 대조군 웰을 단독으로 PBST 중 10% 스마트 블록과 함께 인큐베이션하였다 (표 12에 나타냄; 제2행에서 M048-D01-hIgG1 포획 '아니오'). 고정화 단계에 이어서 50 μl PBST를 사용하여 3회의 세척 단계를 수행하였다. PBST 중 10% 스마트블록 중 재조합 인간 FGFR2, 10 nM (#10824-H08H, 시노바이올로지칼) 및 5배 연속 희석된 (1000 내지 0.064 nM) 항-FGFR2 IgG로 구성된 사전-인큐베이션된 (20 - 22℃에서 1시간) 항원 / 항체 믹스 20 μl 4벌을 첨가하고, 20 - 22℃에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 이어서 세척 단계를 3회 반복하였다.
재조합 인간 FGFR2의 검출을 위해, PBST 중 10% 스마트블록 중에 1:10000 희석된 항-His / HRP 접합체 (# 71840, 노바젠) 20 μl를 20 - 22℃에서 1시간 동안 적용시켰다. 3회의 세척 단계 후, 50 mM 소듐 히드로겐 포스페이트, pH 7.6 중 10 μM 암플렉스 레드 기질 (#A12222, 인비트로젠) 20 μl를 첨가하고, 형광 신호를 통상의 형광 판독기, 예를 들어 테칸 M1000을 사용하여 검출하였다.
GAL-FR21, GAL-FR22 및 GAL-FR23 (WO2010/054265 및 문헌 [Zhao et al. (Clin Cancer Res. 2010,16:5750-5758)]에 기재됨)이라 불리는 3종의 상이한 FGFR2 결합 항체는 상이한 도메인 에피토프에 결합하는 것으로 기재된 바 있다. 이들 항체에 의한 차이의 평가를 위해, 경쟁 검정을 수행하였다.
분석되는 항체의 상이한 이소형으로 인해, 경쟁 ELISA 포맷은 상이한 검출 항체의 사용 또는 상이한 IgG-이소형에 대한 단일 검출 항체의 상이한 친화도로 인한 부가 효과의 중첩 없이 동등하게 그리고 직접적으로 비교가능한 경쟁 상황의 검출을 보증하여야 한다. 상기 기재된 ELISA 포맷은 결합된 마우스 또는 인간 IgG1 또는 IgG2a의 검출 대신에 그의 His-태그를 통한 FGFR2 항원의 검출에 의해 상기 기준을 충족시킨다. M048-D01-hIgG1의 고정화는 그의 인간 Fc 부분에 대해 특이적이며, 그렇지 않으면 M048-D01-hIgG1에 의해 공급되지 않은 유의한 양의 FGFR2가 항-인간 IgG (Fc 특이적)로 코팅된 ELISA 플레이트 웰에서 검출될 것이다 (항-인간 IgG (Fc 특이적)에 대한 마우스 항-FGFR2-IgG의 잠재적 결합 및 후속적인 FGFR2의 결합은 검출되지 않음 (표 12, 제8 - 11열)). 추가로, 고정화된 항-인간 IgG (Fc 특이적)에 대한 FGFR2의 유의한 비특이적 결합은 전혀 관찰되지 않았다 (제2열). M048-D01-hIgG1의 "자가-경쟁"은 매우 분명하게 작용하였고 (제6열), 이는 M048-D01-mIgG2a에 대해서도 동일하였다 (제7열). GAL-FR21이든, -FR22이든 또는 -FR23이든 M048-D01-hIgG1 및 M048-D01-mIgG2a가 각각 1.25 및 0.63 nM 및 그 초과의 경쟁 항체 농도에서 >50% 감소된 신호를 나타낸 것과 같이 검출가능한 FGFR2의 용량 의존적 감소를 나타내지 않았다는 관찰 (제3 - 5열)은, M048-D01과 3종의 GAL 항체 사이의 차이를 입증한다. 대조적으로, 단량체 FGFR2 (10 nM)를 GAL-FR22 및 GAL-FR23과 사전-인큐베이션한 후에 검출가능한 FGFR2의 양은 유의하게 증가되는 것으로 나타났지만, GAL-FR21의 경우에는 그렇지 않았다. 웨스턴 분석에 의해 체크시 GAL 항체는 His-태그에 융합되지도 않고 항-인간 IgG (Fc 특이적)에 의해 포획되지도 않았기 때문에, 가장 가능성이 높은 설명은 단량체 FGFR2가 항체와의 사전-인큐베이션에 의해 이량체화되고 이것이 고정화된 M048-D01-hIgG1에 대한 FGFR2의 후속 결합에서의 결합력 효과를 유발할 수 있다는 것이다. FGFR2에 직접적으로 결합되고 이에 의해 매개되어 이량체화 항체 GAL-FR22 및 GAL-FR23에 간접적으로 결합되는 고정화된 M048-D01-hIgG1의 상황은, M048-D01-hIgG1이 GAL 항체와 완전히 상이한 FGFR2 에피토프에 결합한다는 것을 추가로 예시할 것이며, 그렇지 않으면 동시 결합 사건이 발생할 수 없을 것이다. 주목할 만한 것은, GAL-FR21은 검출가능한 FGFR2의 양을 증가시키지 않았다는 것이다. 이 차이는, Gal-FR22는 D2-D3IIIa 내의 에피토프에 결합하고, GAL-FR23은 전부 또는 부분적으로 D1에 위치한 에피토프에 결합하며; 양쪽 영역은 사용된 재조합 인간 FGFR2-IIIc 분자에 나타난다는 WO2010/054265에 기재된 바와 같은 GAL 항체의 보다 구체적인 설명을 고려함으로써 그럴듯하게 해석될 수 있다. 그러나, GAL-FR21의 경우에는 에피토프가 상기 FGFR2-IIIc 이소형에 나타나지 않는 서열 스트레치인 D3-IIIb에 위치하는 것으로 기재되어 있고; 결과적으로 GAL-FR21은 항체에 결합하여 결합력 효과를 매개할 수 없다. 나타낸 바와 같이, 어떠한 검정에서도 M048-D01-hIgG1과 GAL 항체 중 하나 사이의 경쟁은 관찰되지 않았다.
표 12: 항체 경쟁 ELISA. 평균 신호는 보정 시리즈 (제1열)에서 결정된 10 nM FGFR2에 상응하는 값에 관하여 제공되어 있다.
Figure pct00013
상기 기재된 바와 같은 경쟁 실험의 결과는 GAL-FR23 (에피토프가 전부 또는 부분적으로 D1에 위치함)을 비롯한 모든 3종의 GAL 항체가 심지어 적용된 IgG 적정 시리즈에서 가장 높은 농도 (600 nM)에서도 비오티닐화 리신에 C-말단에서 연결된 에피토프의 아미노산 서열을 포함하는 FGFR2의 세포외 N-말단 에피토프 (서열 63)의 합성 펩티드 (1RPSFSLVEDTTLEPE15G-Ttds-Lys(비오틴))에 대한 결합을 나타내지 않았고, 반면에 M048-D01-hIgG1 (항-인간 IgG (Fc 특이적) POD 접합체; # A5175, 시그마에 의해 검출됨) 및 M048-D01-mIgG2a의 강한 결합은 ≤1 nM 범위의 EC50을 생성하였다는 관찰 (상세한 데이터는 제시하지 않음)에 의해 지지된다. 마우스 항체의 검출을 위해, FGFR2-IIIb 알파에 결합된 GAL-FR21, -FR22, -FR23 및 M048-D01-mIgG2a를 검출하는 능력에 대해 양성인 것으로 체크된 항-마우스 IgG (Fc 특이적) POD 접합체 (# 715-35-15, 잭슨)를 사용하였다.
SEQUENCE LISTING <110> Bayer Intellectual Property GmbH <120> Anti-FGFR2 Antibodies and Uses Thereof <130> BHC 11 1 042 <160> 222 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 118 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 1 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Thr Ser 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Ser Pro Gly Tyr Asp Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 2 <211> 110 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 2 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly 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cccccaaact cctcatctat gacaataata agcgaccctc aggggtccct 180 gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccgg 240 tccgaggatg aggctgatta ttactgtgca gcatgggatg acagcctgag tggttgggtg 300 ttcggcggag gaaccaagct gacggtccta 330 <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 5 Phe Arg Thr Ser Gly Met His Trp 1 5 <210> 6 <211> 20 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 6 Val Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly Arg 20 <210> 7 <211> 11 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 7 Ala Arg Glu Ser Pro Gly Tyr Asp Phe Glu Tyr 1 5 10 <210> 8 <211> 13 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 8 Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Thr Val Asn 1 5 10 <210> 9 <211> 7 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 9 Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser 1 5 <210> 10 <211> 12 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 10 Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Ser Gly Trp Val 1 5 10 <210> 11 <211> 117 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 11 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Ser Ser Ser Ala Glu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 12 <211> 110 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 12 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Thr Gly Ser Asn 20 25 30 Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Glu Thr Trp Asp Ser Asn Thr 85 90 95 Arg Gly Val Val 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ggctggagtg ggtggcagtt atatcatatg atggaagtaa taaatactat 180 gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac actgccgtgt attactgtgc gagagaatcc 300 cccggctacg attttgagta ttggggccag ggtaccctgg tcaccgtgag ctca 354 <210> 24 <211> 330 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 24 cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60 tcttgttctg gaagcagctc caacatcgga agtaatactg taaactggta tcagcagctc 120 ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat ggtaacagca atcggccctc aggggtccct 180 gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccgg 240 tccgaggatg aggctgatta ttactgtgca gcatgggatg acagcctgaa tggttgggtg 300 ttcggcggag gaaccaagct gacggtccta 330 <210> 25 <211> 8 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 25 Phe Arg Thr Ser Gly Met His Trp 1 5 <210> 26 <211> 20 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 26 Val Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly Arg 20 <210> 27 <211> 11 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 27 Ala Arg Glu Ser Pro Gly Tyr Asp Phe Glu Tyr 1 5 10 <210> 28 <211> 13 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 28 Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Thr Val Asn 1 5 10 <210> 29 <211> 7 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 29 Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser 1 5 <210> 30 <211> 12 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 30 Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly Trp Val 1 5 10 <210> 31 <211> 122 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 31 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Thr Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Val Arg Tyr Asn Trp Asn His Gly Asp Trp Phe Asp Pro Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 32 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ccctggggcc aaggtaccct ggtcaccgtg 360 agctca 366 <210> 34 <211> 330 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 34 cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60 tcctgctctg gaagcagctc caacattggg aataattatg tatcctggta tcagcagctc 120 ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat gagaattaca accgacccgc aggggtccct 180 gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccgg 240 tccgaggatg aggctgatta ttactgttca tcgtgggatg acagcctgaa ttattgggtg 300 ttcggcggag gaaccaagct gacggtccta 330 <210> 35 <211> 8 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 35 Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp 1 5 <210> 36 <211> 20 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 36 Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Thr Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly Arg 20 <210> 37 <211> 15 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 37 Ala Arg Val Arg Tyr Asn Trp Asn His Gly Asp Trp Phe Asp Pro 1 5 10 15 <210> 38 <211> 13 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 38 Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn Tyr Val Ser 1 5 10 <210> 39 <211> 7 <212> PRT 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tcagcagctc 120 ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat gctaacaaca atcggccctc aggggtccct 180 gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccgg 240 tccgaggatg aggctgatta ttactgtgca gcatggcatg acagcctgag tggttgggtg 300 ttcggcggag gaaccaagct gacggtccta 330 <210> 45 <211> 8 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 45 Phe Ser Asn Tyr Gly Met His Trp 1 5 <210> 46 <211> 20 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 46 Val Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly Arg 20 <210> 47 <211> 11 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 47 Ala Lys Glu Thr Asn Asp Val Pro Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 48 <211> 13 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 48 Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Thr Val Asn 1 5 10 <210> 49 <211> 7 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 49 Ala Asn Asn Asn Arg Pro Ser 1 5 <210> 50 <211> 12 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 50 Cys Ala Ala Trp His Asp Ser Leu Ser Gly Trp Val 1 5 10 <210> 51 <211> 119 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 51 Glu Val Gln Leu Leu 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gacggtccta 330 <210> 55 <211> 8 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 55 Phe Ser Asn Tyr Gly Met Tyr Trp 1 5 <210> 56 <211> 20 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 56 Val Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Thr Asn Lys Tyr Tyr Val Asp Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly Arg 20 <210> 57 <211> 12 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 57 Ala Lys Asp Leu Pro Lys Trp Gly Gly Phe Asp Ser 1 5 10 <210> 58 <211> 13 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 58 Ser Gly Gly Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Tyr Val Tyr 1 5 10 <210> 59 <211> 7 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 59 Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser 1 5 <210> 60 <211> 12 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 60 Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly Val Val 1 5 10 <210> 61 <211> 748 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 61 Arg Pro Ser Phe Ser Leu Val Glu Asp Thr Thr Leu Glu Pro Glu Glu 1 5 10 15 Pro Pro Thr Lys Tyr Gln Ile Ser Gln Pro Glu Val Tyr Val Ala Ala 20 25 30 Pro Gly Glu Ser Leu Glu Val Arg Cys Leu Leu Lys Asp Ala Ala Val 35 40 45 Ile Ser Trp Thr Lys Asp Gly Val His Leu Gly 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Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 <210> 202 <211> 217 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 202 Ala Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly 1 5 10 15 Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asp 20 25 30 Asn Gly Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Glu Ala Ser Glu Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser 85 90 95 Leu Asp Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu 115 120 125 Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe 130 135 140 Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val 145 150 155 160 Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys 165 170 175 Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser 180 185 190 His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu 195 200 205 Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 210 215 <210> 203 <211> 118 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 203 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Met Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Ser 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gln Pro Gly Tyr Asp Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 204 <211> 110 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 204 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asp Asn 20 25 30 Gly Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Glu Ala Ser Glu Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95 Asp Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 205 <211> 8 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 205 Phe Ser Ser Ser Gly Met His Trp 1 5 <210> 206 <211> 20 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 206 Val Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly Arg 20 <210> 207 <211> 11 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 207 Ala Arg Glu Gln Pro Gly Tyr Asp Phe Glu Tyr 1 5 10 <210> 208 <211> 13 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 208 Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asp Asn Gly Val Asn 1 5 10 <210> 209 <211> 7 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 209 Glu Ala Ser Glu Arg Pro Ser 1 5 <210> 210 <211> 12 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 210 Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asp Gly Trp Val 1 5 10 <210> 211 <211> 447 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 211 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser His Ser 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Ala Pro Leu Tyr Asp Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 <210> 212 <211> 217 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 212 Ala Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly 1 5 10 15 Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asp 20 25 30 Asn Gly Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser 85 90 95 Leu Asp Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu 115 120 125 Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe 130 135 140 Cys Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val 145 150 155 160 Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys 165 170 175 Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser 180 185 190 His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu 195 200 205 Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 210 215 <210> 213 <211> 118 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 213 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser His Ser 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Ala Pro Leu Tyr Asp Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 214 <211> 110 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 214 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asp Asn 20 25 30 Gly Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95 Asp Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 215 <211> 8 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 215 Phe Ser His Ser Gly Met His Trp 1 5 <210> 216 <211> 20 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 216 Val Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly Arg 20 <210> 217 <211> 11 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 217 Ala Arg Glu Ala Pro Leu Tyr Asp Phe Glu Tyr 1 5 10 <210> 218 <211> 13 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 218 Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asp Asn Gly Val Asn 1 5 10 <210> 219 <211> 7 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 219 Gly Ala Ser Asn Arg Pro Ser 1 5 <210> 220 <211> 12 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 220 Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asp Gly Trp Val 1 5 10 <210> 221 <211> 452 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 221 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Thr Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Val Arg Tyr Asn Trp Asn His Gly Asp Trp Phe Asp Pro Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro 115 120 125 Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser 130 135 140 Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160 Leu Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro 165 170 175 Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val 180 185 190 Thr Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His 195 200 205 Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro 210 215 220 Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu 225 230 235 240 Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu 245 250 255 Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 260 265 270 Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu 275 280 285 Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr 290 295 300 Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser 305 310 315 320 Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro 325 330 335 Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln 340 345 350 Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val 355 360 365 Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val 370 375 380 Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu 385 390 395 400 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg 405 410 415 Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val 420 425 430 Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg 435 440 445 Thr Pro Gly Lys 450 <210> 222 <211> 452 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 222 Gln Val Glu Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Thr Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Val Arg Tyr Asn Trp Asn His Gly Asp Trp Phe Asp Pro Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 115 120 125 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 130 135 140 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 165 170 175 Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 180 185 190 Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn 195 200 205 His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser 210 215 220 Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 225 230 235 240 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 245 250 255 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 260 265 270 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 275 280 285 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 290 295 300 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 305 310 315 320 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 325 330 335 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 340 345 350 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val 355 360 365 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 370 375 380 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 385 390 395 400 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 405 410 415 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 420 425 430 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 435 440 445 Ser Pro Gly Lys 450

Claims (25)

  1. FGFR2를 과다발현하는 세포주 SNU16 (ATCC-CRL-5974) 및 MFM223 (ECACC-98050130), 및 돌연변이된 FGFR2를 발현하는 세포주 AN3-CA (DSMZ-ACC 267) 및 MFE-296 (ECACC-98031101)에서, FGFR2에 대한 결합 후에 FGFR2의 세포 표면 발현을 감소시키는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  2. 서열 63에 의해 제시된 바와 같은 FGFR2의 세포외 N-말단 에피토프 (1RPSFSLVEDTTLEPE15)에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  3. 제2항에 있어서, 세포외 N-말단 에피토프 (서열 63)에 대한 항체의 결합이 Arg 1, Pro 2, Phe 4, Ser 5, Leu 6 및 Glu 8로 이루어진 잔기의 군으로부터 선택된 1개 이상의 에피토프 잔기에 의해 매개되는 것인 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, FGFR2의 N-말단 에피토프 (1RPSFSLVEDTTLEPE15) 내의 아미노산 잔기 중 1개 이상을 알라닌으로 변화시킴으로써 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 그의 ELISA 신호 중 50% 초과를 상실하며,
    a. 상기 잔기는 군 Pro 2, Leu 6 및 Glu 8로부터 선택되거나, 또는
    b. 상기 잔기는 군 Arg 1, Pro 2, Phe 4 및 Ser 5로부터 선택되는 것인
    단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, FGFR2에 대한 결합에서 군 "M048-D01", "M047-D08", "M017-B02", "M021-H02", "M054-A05", "M054-D03", "TPP-1397", "TPP-1398", "TPP-1399", "TPP-1400", "TPP-1401", "TPP-1402", "TPP-1403", "TPP-1406", "TPP-1407", "TPP-1408", "TPP-1409", "TPP-1410", "TPP-1411", "TPP-1412" 및 "TPP-1415"로부터 선택된 1종 이상의 항체와 경쟁하는 항체 또는 항원-결합 단편.
  6. 제5항에 있어서, 항체 또는 항원-결합 단편의 아미노산 서열이 "M048-D01", "M047-D08", "M017-B02", "M021-H02", "M054-A05", "M054-D03", "TPP-1397", "TPP-1398", "TPP-1399", "TPP-1400", "TPP-1401", "TPP-1402", "TPP-1403", "TPP-1406", "TPP-1407", "TPP-1408", "TPP-1409", "TPP-1410", "TPP-1411", "TPP-1412" 또는 "TPP-1415"의 1개 이상의 CDR 서열과 적어도 50%, 55%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 동일하거나, 또는 "M048-D01", "M047-D08", "M017-B02", "M021-H02", "M054-A05", "M054-D03", "TPP-1397", "TPP-1398", "TPP-1399", "TPP-1400", "TPP-1401", "TPP-1402", "TPP-1403", "TPP-1406", "TPP-1407", "TPP-1408", "TPP-1409", "TPP-1410", "TPP-1411", "TPP-1412" 또는 "TPP-1415"의 VH 또는 VL 서열과 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 92% 또는 95% 동일한 것인 항체 또는 항원-결합 단편.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서, 표 9 및 표 10에 나타낸 바와 같은 1개 이상의 CDR 서열 또는 1개 이상의 가변 중쇄 또는 경쇄 서열을 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    a. 서열 5-7에 의해 제시된 바와 같은 가변 중쇄 CDR 서열 및 서열 8-10에 의해 제시된 가변 경쇄 CDR 서열, 또는
    b. 서열 15-17에 의해 제시된 바와 같은 가변 중쇄 CDR 서열 및 서열 18-20에 의해 제시된 가변 경쇄 CDR 서열, 또는
    c. 서열 25-27에 의해 제시된 바와 같은 가변 중쇄 CDR 서열 및 서열 28-30에 의해 제시된 가변 경쇄 CDR 서열, 또는
    d. 서열 35-37에 의해 제시된 바와 같은 가변 중쇄 CDR 서열 및 서열 38-40에 의해 제시된 가변 경쇄 CDR 서열, 또는
    e. 서열 45-47에 의해 제시된 바와 같은 가변 중쇄 CDR 서열 및 서열 48-50에 의해 제시된 가변 경쇄 CDR 서열, 또는
    f. 서열 55-57에 의해 제시된 바와 같은 가변 중쇄 CDR 서열 및 서열 58-60에 의해 제시된 가변 경쇄 CDR 서열, 또는
    g. 서열 75-77에 의해 제시된 바와 같은 가변 중쇄 CDR 서열 및 서열 78-80에 의해 제시된 가변 경쇄 CDR 서열, 또는
    h. 서열 85-87에 의해 제시된 바와 같은 가변 중쇄 CDR 서열 및 서열 88-90에 의해 제시된 가변 경쇄 CDR 서열, 또는
    i. 서열 95-97에 의해 제시된 바와 같은 가변 중쇄 CDR 서열 및 서열 98-100에 의해 제시된 가변 경쇄 CDR 서열, 또는
    j. 서열 105-107에 의해 제시된 바와 같은 가변 중쇄 CDR 서열 및 서열 108-110에 의해 제시된 가변 경쇄 CDR 서열, 또는
    k. 서열 115-117에 의해 제시된 바와 같은 가변 중쇄 CDR 서열 및 서열 118-120에 의해 제시된 가변 경쇄 CDR 서열, 또는
    l. 서열 125-127에 의해 제시된 바와 같은 가변 중쇄 CDR 서열 및 서열 128-130에 의해 제시된 가변 경쇄 CDR 서열, 또는
    m. 서열 135-137에 의해 제시된 바와 같은 가변 중쇄 CDR 서열 및 서열 138-140에 의해 제시된 가변 경쇄 CDR 서열, 또는
    n. 서열 145-147에 의해 제시된 바와 같은 가변 중쇄 CDR 서열 및 서열 148-150에 의해 제시된 가변 경쇄 CDR 서열, 또는
    o. 서열 155-157에 의해 제시된 바와 같은 가변 중쇄 CDR 서열 및 서열 158-160에 의해 제시된 가변 경쇄 CDR 서열, 또는
    p. 서열 165-167에 의해 제시된 바와 같은 가변 중쇄 CDR 서열 및 서열 168-170에 의해 제시된 가변 경쇄 CDR 서열, 또는
    q. 서열 175-177에 의해 제시된 바와 같은 가변 중쇄 CDR 서열 및 서열 178-180에 의해 제시된 가변 경쇄 CDR 서열, 또는
    r. 서열 185-187에 의해 제시된 바와 같은 가변 중쇄 CDR 서열 및 서열 188-190에 의해 제시된 가변 경쇄 CDR 서열, 또는
    s. 서열 195-197에 의해 제시된 바와 같은 가변 중쇄 CDR 서열 및 서열 198-200에 의해 제시된 가변 경쇄 CDR 서열, 또는
    t. 서열 205-207에 의해 제시된 바와 같은 가변 중쇄 CDR 서열 및 서열 208-210에 의해 제시된 가변 경쇄 CDR 서열, 또는
    u. 서열 215-217에 의해 제시된 바와 같은 가변 중쇄 CDR 서열 및 서열 218-220에 의해 제시된 가변 경쇄 CDR 서열
    을 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    a. 서열 1에 의해 제시된 바와 같은 가변 중쇄 서열 및 서열 2에 의해 제시된 바와 같은 가변 경쇄 서열, 또는
    b. 서열 11에 의해 제시된 바와 같은 가변 중쇄 서열 및 서열 12에 의해 제시된 바와 같은 가변 경쇄 서열, 또는
    c. 서열 21에 의해 제시된 바와 같은 가변 중쇄 서열 및 서열 22에 의해 제시된 바와 같은 가변 경쇄 서열, 또는
    d. 서열 31에 의해 제시된 바와 같은 가변 중쇄 서열 및 서열 32에 의해 제시된 바와 같은 가변 경쇄 서열, 또는
    e. 서열 41에 의해 제시된 바와 같은 가변 중쇄 서열 및 서열 42에 의해 제시된 바와 같은 가변 경쇄 서열, 또는
    f. 서열 51에 의해 제시된 바와 같은 가변 중쇄 서열 및 서열 52에 의해 제시된 바와 같은 가변 경쇄 서열, 또는
    g. 서열 73에 의해 제시된 바와 같은 가변 중쇄 서열 및 서열 74에 의해 제시된 바와 같은 가변 경쇄 서열, 또는
    h. 서열 83에 의해 제시된 바와 같은 가변 중쇄 서열 및 서열 84에 의해 제시된 바와 같은 가변 경쇄 서열, 또는
    i. 서열 93에 의해 제시된 바와 같은 가변 중쇄 서열 및 서열 94에 의해 제시된 바와 같은 가변 경쇄 서열, 또는
    j. 서열 103에 의해 제시된 바와 같은 가변 중쇄 서열 및 서열 104에 의해 제시된 바와 같은 가변 경쇄 서열, 또는
    k. 서열 113에 의해 제시된 바와 같은 가변 중쇄 서열 및 서열 114에 의해 제시된 바와 같은 가변 경쇄 서열, 또는
    l. 서열 123에 의해 제시된 바와 같은 가변 중쇄 서열 및 서열 124에 의해 제시된 바와 같은 가변 경쇄 서열, 또는
    m. 서열 133에 의해 제시된 바와 같은 가변 중쇄 서열 및 서열 134에 의해 제시된 바와 같은 가변 경쇄 서열, 또는
    n. 서열 143에 의해 제시된 바와 같은 가변 중쇄 서열 및 서열 144에 의해 제시된 바와 같은 가변 경쇄 서열, 또는
    o. 서열 153에 의해 제시된 바와 같은 가변 중쇄 서열 및 서열 154에 의해 제시된 바와 같은 가변 경쇄 서열, 또는
    p. 서열 163에 의해 제시된 바와 같은 가변 중쇄 서열 및 서열 164에 의해 제시된 바와 같은 가변 경쇄 서열, 또는
    q. 서열 173에 의해 제시된 바와 같은 가변 중쇄 서열 및 서열 174에 의해 제시된 바와 같은 가변 경쇄 서열, 또는
    r. 서열 183에 의해 제시된 바와 같은 가변 중쇄 서열 및 서열 184에 의해 제시된 바와 같은 가변 경쇄 서열, 또는
    s. 서열 193에 의해 제시된 바와 같은 가변 중쇄 서열 및 서열 194에 의해 제시된 바와 같은 가변 경쇄 서열, 또는
    t. 서열 203에 의해 제시된 바와 같은 가변 중쇄 서열 및 서열 204에 의해 제시된 바와 같은 가변 경쇄 서열, 또는
    u. 서열 213에 의해 제시된 바와 같은 가변 중쇄 서열 및 서열 214에 의해 제시된 바와 같은 가변 경쇄 서열
    을 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, IgG 항체인 항체.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, scFv, Fab, Fab' 단편 또는 F(ab')2 단편인 항원-결합 단편.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 모노클로날 항체 또는 항원-결합 단편인 항체 또는 항원-결합 단편.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 인간, 인간화 또는 키메라 항체 또는 항원-결합 단편인 항체 또는 항원-결합 단편.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 항체-약물 접합체.
  15. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항원-결합 단편을 코딩하는 단리된 핵산 서열.
  16. 제15항에 따른 핵산 서열을 포함하는 벡터.
  17. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항원-결합 단편을 발현하고/거나, 제15항에 따른 핵산 또는 제16항에 따른 벡터를 포함하는 단리된 세포.
  18. 제17항에 있어서, 원핵 또는 진핵 세포인 단리된 세포.
  19. 제18항에 따른 세포의 배양 및 항체 또는 항원-결합 단편의 정제를 포함하는, 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항원-결합 단편을 생산하는 방법.
  20. 의약으로서의 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항원-결합 단편 또는 제14항에 따른 항체-약물 접합체.
  21. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 진단제로서의 항체 또는 항원-결합 단편.
  22. 암의 치료를 위한 의약으로서의 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항원-결합 단편 또는 제14항에 따른 항체-약물 접합체.
  23. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항원-결합 단편 또는 제14항에 따른 항체-약물 접합체를 포함하는 제약 조성물.
  24. 제23항에 따른 제약 조성물 및 하나 이상의 치료 활성 화합물의 조합물.
  25. FGFR2의 원치 않는 존재와 연관된 장애 또는 상태의 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 제23항에 따른 제약 조성물 또는 제24항에 따른 조합물을 투여하는 것을 포함하는, FGFR2의 원치 않는 존재와 연관된 장애 또는 상태를 치료하는 방법.
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