DE69629385T2

DE69629385T2 - Peptide, die den transport über gewebe erhöhen und verfahren zu ihrer identifizierung und verwendung

Info

Publication number: DE69629385T2
Application number: DE69629385T
Authority: DE
Inventors: Joseph Daniel Blackrock O'MAHONY
Original assignee: Elan Corp PLC
Current assignee: Merrion Research Ill Ltd
Priority date: 1995-11-10
Filing date: 1996-11-11
Publication date: 2004-06-09
Anticipated expiration: 2016-11-12
Also published as: WO1997017613A1; AU705816B2; JP2002515967A; ES2203722T3; NZ322174A; NZ322175A; WO1997017614A1; EP0859959B1; AU705688B2; DE69629385D1; DK0859959T3; JP3830525B2; JP4126055B2; CA2234685A1; JP2002504072A; EP1281718A3; AU7585296A; PT859959E; ATE246808T1; AU7585396A

Description

Technisches Gebiet
Die Erfindung betrifft die Identifizierung von Peptidsequenzen, die den Transport von Arzneimitteln, Makromolekülen oder Teilchen wie biozersetzbare Nano- oder Mikroteilchen durch menschliches oder tierisches Gewebe gewähren oder erleichtern. Insbesondere betrifft diese Erfindung die Verwendung von Phagen-Gendatenbanken bei einem Screening-Versuch zur Bestimmung der Identität von Peptidsequenzen, die die Abgabe von Bakteriophagen durch Gewebe, wie epitheliale Zellen, die die lumenale Seite des Magen-Darm-Trakts (gastro-intestinal tract, GIT) auskleiden, erhöhen.
Fachgebiet
Die epithelialen Zellen, die die lumenale Seite des GITs auskleiden, sind eine Hauptschranke für Arzneimittelabgabe nach oraler Verabreichung. Jedoch gibt es vier anerkannte Transportwege, die zum Erleichtern von Arzneimittelabgabe und - transport genutzt werden können: Die transzellulären, parazellulären, Träger-vermittelten und transzytotischen Transportwege. Die Fähigkeit eines herkömmlichen Arzneimittels, Peptids, Proteins, Makromoleküls oder Nano- oder Mikroteilchensystems, mit einem dieser Transportwege „zwischenzuwirken", kann zu einer Erhöhung der Abgabe dieses Arzneimittel oder Teilchens von dem GIT an den eigentlichen Kreislauf führen.
Im Falle von Rezeptor-vermittelten, Träger-vermittelten oder transzytotischen Transportwegen wurden einige der „Aufnahme"-Signale identifiziert. Diese Signale schließen u. a. Folsäure, die mit dem dem Folatrezeptor zwischenwirkt, Mannose und Cetylmannosid, die mit Mannoserezeptor zwischenwirken, und Cobalamin, das mit dem Intrinsic-Faktor zwischenwirken kann, ein. Zudem liegen Peptidsortierungsmuster auf Leucin- und Tyrosin-Basis oder Internalisierungssequenzen wie YSKV, FPHL, YRGV, YQTI, TEQF, TEVM, TSAF, YTRF vor, die die Aufnahme oder das Zielen von Proteinen von der Plasmamembran auf Endosome erleichtern. Phagen-Datengenbanken können unter Verwendung von spezifischen Membranrezeptoren oder Bindungsstellen gescreent werden, um Peptide zu identifizieren, die sich spezifisch an die Rezeptor- oder Bindungsstelle binden. Die Fähigkeit bestimmter Muster oder Domänen von Peptiden oder Proteinen, mit spezifischen Membranrezeptoren zwischenzuwirken, gefolgt von Zellaufnahme des Protein : Rezeptor-Komplexes kann auf die mögliche Anwendung von solchen Mustern bei der Erleichterung der Arzneimittelabgabe hinweisen. Jedoch kann die Identifizierung von Peptiden oder Peptidmustern durch deren Fähigkeit, mit spezifischen Rezeptorstellen oder Trägerstellen wie Stellen, die an der oberen Seite der epithelialen Stellen des GITs exprimiert werden, die Identität von Peptiden, die den Transport eines Wirkstoffs, insbesondere eines Arzneimittel-beladenen Nano- oder Mikroteilchens durch das Gewebe wie epitheliale Auskleidung nicht bestimmen oder zur Bestimmung dessen nicht der wirksamste Weg sein.
Versuche auf Nicht-Rezeptor-Basis zur Entdeckung von bestimmten Liganden wurden ebenso verwendet. Zum Beispiel ist eine Strategie zum Identifizieren von Peptiden, die die Zellfunktion durch Scannen von vollständigen Zellen mit Phagen-Datengenbanken abwandeln, in Fong et al., Drug Development Research 33: 64–70 (1994) offenbart. Jedoch stellt dieses Verfahren, da vollständige Zellen eher als intakte Gewebe- oder polarisierte Zellkulturen zum Screenen von Phagen-Datengenbanken verwendet werden, keine Information im Hinblick auf die Sequenzen bereit, deren primäre Funktion das Bewirken des Transports durch polarisierte Zellschichten ist.
Zudem offenbart Stevenson et al., Pharmaceutical Res. 12(9), S94 (1995) die Verwendung von Caco-2-Monoschichten zum Screenen einer kombinatorischen Genbank aus einem synthetischen Tripeptid für die Durchlässigkeit von Di- oder Tripeptiden betreffende Information. Während sie nützlich ist, bewertet diese Technik nicht die Fähigkeit der offenbarten Di- oder Tripeptide, die Abgabe eines Arzneimittels, insbesondere einer Arzneimittel-beladenen Nano- oder Mikroteilchenformulierung zu erhöhen.
Folglich besteht Bedarf nach einem Verfahren zur Bestimmung von Peptidsequenzen, die beim Transportieren von Arzneimitteln, einschließlich Arzneimittel-beladenen Nano- oder Mikroteilchen durch eine menschliche oder tierische Gewebeschranke besonders wirksam sind.
Offenbarung der Erfindung
Die Erfindung stellt ein Verfahren zum Identifizieren eines Peptids bereit, das den Transport eines Wirkstoffs durch menschliches oder tierisches Gewebe gewährt oder erleichtert. Eine vorbestimmte Menge eines Phagen von einer statistischen Phagen-Genbank wird auf einer ersten Seite, vorzugsweise der oberen Seite einer Gewebe Probe entweder in vitro, in vivo oder in situ oder einer polarisierten Gewebezellkultur abgeschieden oder mit ihr in Kontakt gebracht. Zu einem vorbestimmten Zeitpunkt wird der Phage, der zu einer zu der ersten Seite gegenüberliegenden zweiten Seite des Gewebes, vorzugsweise der unteren Seite transportiert wird, aufgefangen, um die transportierten Phagen zu selektieren. Die transportierten Phagen werden in einem Wirt amplifiziert und dieser Vorgangszyklus (unter Verwendung der in den jüngsten Zyklen produzierten transportierten Phagen) für eine vorbestimmte Anzahl an Zeitpunkten wie null- bis sechsmal wiederholt, um eine selektierte Phagen-Genbank zu erhalten, die den Phagen enthält, der von der ersten Seite zur zweiten Seite transportiert werden kann. Schließlich wird die Sequenz mindestens eines statistischen Peptides, das durch den Phagen in der selektierten Phagen-Genbank kodiert wurde, bestimmt, um ein Peptid zu identifizieren, das den Transport eines Wirkstoffs durch ein menschliches oder tierisches Gewebe gewährt oder erleichtert. Der transportierte Phage kann als Kombination eines Transporterpeptids (das mindestens ein statistisches Peptid, das durch den Phagen kodiert wurde), verbunden mit einer Wirkstoffbeladung (der Phage) betrachtet werden, in welcher das Transporterpeptid den Transport des Wirkstoffs durch das Gewebe erleichtert. Folglich können die statistischen Peptide, die durch den Phagen in der selektierten Phagen-Genbank kodiert wurden, voraussagbar den Transport von anderen Wirkstoffen wie in Nano- oder Mikroteilchen eingekapselte Arzneimittel durch das bestimmte Gewebe erleichtern.
Vorzugsweise wird die Gewebeprobe aus der Duodenum, Jejunum, Ileum, aufsteigendem Kolon, Querkolon, absteigendem Kolon, Sigma, Gefäß-Endothelium, das das Gefäßsystem auskleidet, Gefäß-Endothelium der Blut-Hirn-Schranke, Gefäßglattmuskel, Alveolen, Leber, Niere, Knochenmark, Herz, Milz, Pankreas, Thymus, Hirn, Rückenmark, retinalen Zellen des Auges oder neuronalem Gewebe erhalten. Die Gewebeprobe kann entweder in vitro oder in vivo vorliegen. Stärker bevorzugt umfasst die Gewebeprobe epitheliale Zellen, die die lumenale Seite des GITs auskleiden, wie isolierten Rattenkolon oder kleine Darmsegmente oder epitheliale Zellen, die die lumenale Seite des GITs auskleiden und in einem Tiermodellsystem mit offener oder geschlossener Darmschlinge gefunden wurden. Andere bevorzugte Gewebeproben sind Herz-, Milz-, Bauchspeicheldrüsen-, Thymus- und Hirngewebe.
Vorzugsweise wird die polarisierte Gewebezellkulturprobe aus epithelialen GIT-Schichten, Alveolarzellen, endothelialen Zellen der Blut-Hirn-Schranke oder Gefäßglattmuskelzellen kultiviert. Stärker bevorzugt ist die polarisierte Gewebezellkulturprobe eine polarisierte Caco-2-Zellkultur oder eine polarisierte T-84-Zellkultur.
Vorzugsweise ist der Wirkstoff ein Arzneimittel oder ein Nano- oder Mikroteilchen. Stärker bevorzugt ist der Wirkstoff ein Nano- oder Mikroteilchen, in welches ein Arzneimittel eingekapselt ist oder das mit einem Arzneimittel beladen ist, wie ein biozersetzbares Nano- oder Mikroteilchen, wobei das Peptid auf der Oberfläche des Nano- oder Mikroteilchens physikalisch adsorbiert oder aufgetragen oder kovalent gebunden wie direkt gebunden oder über eine Verbindungseinheit gebunden ist. In einer anderen Ausführungsform kann das Peptid das Nano- oder Mikroteilchen selbst bilden oder direkt an den Wirkstoff konjugiert sein. Solche Konjugationen schließen Kondensationsproteine, in welchen die das Peptid kodierende DNA-Sequenz innerhalb des Gerüsts an das Gen oder eine ein therapeutisches Peptid oder Protein kodierende c-DNA-Sequenz kondensiert ist, so dass die modifizierten Gencodes ein rekombinantes Kondensationsprotein kodiert, in welchem das „Ziel"-Peptid an das therapeutische Peptid oder Protein gebunden ist, wobei das „Ziel"-Peptid die Absorption des Kondensationsproteins aus dem GIT erhöht, ein.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die Phagenausbeute (% Phage, der von dem oberen zu dem unteren Medium transportiert wird) im unteren Medium von polarisierten Caco-2-Zellen, die auf Schnappmulden in den Zyklen 1, 2, 3 und 4 des Schwenkens der X30-Phagen-Gendatenbank gewachsen sind. Für jeden Zyklus wurde das untere Medium sowohl 1 Stunde als auch 24 Stunden nach der Phagenzugabe zu dem oberen Medium erprobt;
2 zeigt die relative Bindung an fixierten Caco-2-Zellen von 100 verschiedenen Phagenisolaten der X30-Phagen-Gendatenbank, die aus dem unteren Medium bei Beendigung von Zyklus 4 (Transport vom oberen zum unteren Medium) des Schwenkens der X30-Phagen-Datengenbank auf Caco-2-Schnappmulden erhalten wurden;
3 zeigt die Bindung des Negativkontrollphagen M13mp18 und der besten zehn Binder, Klone 32, 34, 39, 40, 53, 80, 84, 97, 98 und 100 [jeder rein, bei Verdünnungen von 1 : 25 und 1 : 100], die aus der X30-Genbank nach Zyklus 4 der Auswahl von Caco-2-Schnappmulden an fixierten Caco-2-Zellen erhalten wurden. Zum Beispiel ist die ELISA-Absorptionsskala, die mit fixierten Caco-2-Zellen, die nicht mit Phage behandelt wurden, erhalten wurde, eingeschlossen.
4 zeigt die Bindung des Negativkontrollphagen M13mp18 und der besten zehn Binder, Klone 32, 34, 39, 40, 53, 80, 84, 97, 98 und 100 [jeder rein, bei Verdünnungen von 1 : 25 und 1 : 100], die aus der X30-Genbank nach Zyklus 4 der Auswahl von Caco-2-Schnappmulden an fixierten Caco-2-zellen erhalten wurden, wobei jedoch die hintergründige Absorptionsskala, die nur von den fixierten Caco-2-Zellen, welchen kein Phage zugesetzt wurde, erhalten wurde, subtrahiert wurde; und
5 ist eine graphische Darstellung der Bindung der Phagenklone 39, 97 und 100 und des Negativkontrollphagen M13mp18 unter Verwendung entweder von reinen Phagenproben oder desselben Phagen, der auf 1 : 25 und 1 : 100 verdünnt wurde, an fixierten Caco-2-Zellen.
Durchführungsarten der Erfindung
Überraschenderweise offenbart diese Erfindung ein Verfahren zum Identifizieren von Peptiden, die die Abgabe oder den Transport eines Wirkstoffs wie eines Arzneimittels durch menschliches oder tierisches Gewebe, einschließlich ohne Beschränkung epithelialen GIT-Schichten, Alveolarzellen, endotheliale Zellen der Blut-Hirn-Schranke, Gefäßglattmuskelzellen, endotheliale Gefäßzellen, epitheliale Nierenzellen, M-Zellen des Peyers-Patch und Leberzellen erleichtern können. Weiterhin könnten Abgabesysteme, z. B. Nanoteilchen, Mikroteilchen, Liposome, Mizellen außen mit diesen „Ziel"-Peptiden beschichtet oder an sie gebunden oder aus ihnen zusammengesetzt sein, um gezielte eine Abgabe von eingekapselten Arzneimitteln durch bestimmte Gewebe zu gewähren. Zudem können Kondensationsproteine entweder in vivo oder in vitro synthetisiert werden, wobei das Peptid innerhalb des Gerüsts an einen therapeutischen Peptid- oder Proteinwirkstoff kondensiert wird, so dass das Peptid die Abgabe oder den Transport des therapeutischen Peptids oder Proteins durch das Gewebe erhöht.
Wie hier verwendet, schließt der Begriff menschliches oder tierisches „Gewebe" ohne Beschränkung Duodenum, Jejunum, Ileum, aufsteigenden Kolon, Querkolon, absteigenden Kolon, Sigma, Gefäß-Endothelium, das das Gefäßsystem auskleidet, die endothelialen Gefäß-Zellen, die die Blut-Hirn-Schranke bilden, Gefäßglattmuskel, Alveolen, Leber, Niere, Knochenmark, Herz, Milz, Pankreas, Thymus, Him, Rückenmark, neuronales oder retinales Augengewebe ein.
Wie hier verwendet, bedeutet der Begriff „polarisierte Gewebezellkultur" Zellen, die so kultiviert sind, dass sie polarisierte Zellschichten, einschließlich ohne Beschränkung Zellkulturen, die von epithelialen GIT-Zellen, Alveolarzellen, endothelialen Zellen der Blut-Hirn-Schranke oder Gefäßglattmuskelzellen oder einer beliebigen anderen Zellart, die über Gewebekultivierung polarisiert wird oder morphologische Eigenschaften oder (topologische) Strukturen annimmt, oder für die Zellart in vivo spezifischen Begleitern abgeleitet sind, bilden.
Wie hier verwendet, schließt der Begriff „Wirkstoff ohne Beschränkung ein beliebiges Arzneimittel oder Antigen oder eine beliebige Arzneimittel- oder Antigen-beladene oder Arzneimittel- oder Antigen-einkapselnde Nanoteilchen-, Mikroteilchen-, Liposomen- oder Mizellenformulierung ein, die eine biologische Reaktion in einem Menschen oder Tier hervorrufen kann. Beispiele für Arzneimittel- oder Antigen-beladene oder Arzneimittel- oder Antigen-einkapselnde Formulierungen schließen diejenigen ein, in welchen der Wirkstoff in Nano- oder Mikroteilchen eingekapselt oder diese mit ihm beladen sind, wie biozersetzbare Nano- oder Mikroteilchen, und welche ein Peptid aufweisen, das auf der Oberfläche des Nano- oder Mikroteilchens adsorbiert, aufgetragen oder kovalent gebunden wie direkt gebunden oder über eine Verbindungseinheit gebunden ist, ein. Zudem kann das Peptid das Nano- oder Mikroteilchen selbst bilden oder kann das Peptid kovalent an das Polymer oder die Polymere, die bei der Herstellung der biozersetzbaren Nano- oder Mikroteilchen oder Arzneimittel-beladenen oder Arzneimitteleinkapselnden Nano- oder Mikroteilchen verwendet werden, gebunden werden oder kann das Peptid direkt an den Wirkstoff konjugiert werden. Solche Konjugationen an Wirkstoffe schließen Kondensationsproteine ein, in welchen eine das Peptid kodierende DNA-Sequenz innerhalb des Gerüsts an das Gen oder die ein therapeutisches Peptid oder Protein kodierende cDNA-Sequenz kondensiert ist, so dass das modifizierte Gen für ein rekombinantes Kondensationsprotein kodiert.
Wie hier verwendet, schließt der Begriff „Arzneimittel" ohne Beschränkung jeden pharmazeutischen Wirkstoff ein. Beispielhafte Arzneimittel schließen Peptide oder Proteine, Hormone, Analgetika, Antimigränemittel, Antikoagulanzien, Antiemetika, kardiovaskuläre Mittel, antihypertensive Mittel, Narkoseantagonisten, Chelatbildner, Antianginamittel, Chemotherapeutika, Sedativa, Antineoplastika, Prostaglandine und Antidiuretika ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Typische Arzneimittel schließen Peptide, Proteine oder Hormone wie Insulin, Calcitonin, Calcitoningen-regulierendes Protein, atrielles natriuretisches Protein, kolonstimulierenden Faktor, Betaseron, Erythropoietin (EPO), Interferone wie α-, β- oder γ-Interferon, Somatropin, Somatotropin, Somatostatin, insulinähnlichen Wachstumsfaktor (Somatomedine), das luteinisierende Hormon freisetzendes Hormon (luteinizing hormone releasing hormone, LHRH) Gewebeplasminogenaktivator (tissue plasminogen activator, TPA), das Wachstumshormon freisetzendes Hormon (growth hormon releasing hormone, GHRH) Oxytocin, Estradiol, Wachstumshormone, Leuprolidacetat, Faktor VIII, Interleukine wie Interleukin-2 und Analoge davon, Analgetika wie Fentanyl, Sufentanil, Butorphanol, Buprenorphin, Levorphanol, Morphin, Hydromorphon, Hydrocodon, Oxymorphon, Metha don, Lidocain, Bupivacain, Diclofenac, Naproxen, Paverin und Analoge davon, Antimigränemittel wie Sumatripan, Ergot, Alkaloide und Analoge davon, Antikoagulanzien wie Heparin, Hirudin, und Analoge davon, Antiemetika wie Scopolamin, Ondansetron, Domperidon, Metoclopramid und Analoge davon, kardiovaskuläre Mittel, antihypertensive Mittel und Vasodilatoren wie Diltiazem, Clonidin, Nifedipin, Verapamil, Isosorbid-5-mononitrat, organische Nitrate, Mittel, die bei der Behandlung von Herzstörungen verwendet werden, und Analoge davon, Sedativa wie Benzodiazepine, Phenothiozine und Analoge davon, Narkoseantagonisten wie Naltrexon, Naloxon und Analoge davon, Chelatbildner wie Deferoxamin und Analoge davon, Antidiuretika wie Desmopressin, Vasopressin und Analoge davon, Antianginamittel wie Nitroglycerin und Analoge davon, Antineoplastika wie 5-Fluoruracil, Bleomycin und Analoge davon, Prostaglandine und Analoge davon und Chemotherapeutika wie Vincristin und Analoge davon ein. Beispielhafte Arzneimittel schließen auch Atisensoligonukleotide, Gene, Gen-korrigierende Hybridoligonukleotide, Ribozyme, aptamerische Oligonukleotide, Dreifach-Helix-bildende Oligonukleotide, Hemmstoffe für Signalübertragungswege, Tyrosinkinasehemmstoffe und DNA-modifizierende Mittel ein. Wie hier verwendet, bedeutet der Begriff „Arzneimittel auch ohne Beschränkung Systeme zur Genabgabe und Gentherapeutika, einschließlich virale Systeme zur Genabgabe wie Adenovirus, Adeono-verbundener Virus, Retroviren, Herpes-Simplex-Virus, Sindbusvirus, Liposome, kationische Lipide, Dendrimere, Abbildungsmittel und Enzyme.
Wie hier verwendet, bedeutet der Begriff „vorselektierte Phagen-Genbank" eine Genbank, die aus einem Unterbestand einer Phagen-Datengenbank besteht. Dieser Unterbestand wird durch anfängliches Screenen entweder gegen ein Zielmolekül wie ein Protein, Rezeptor, Enzym, einen Ionenkanal, eine Kinase, einen Wachstumsfaktor oder Wachstumsfaktorrezeptor gebildet, so dass die Selektion eines Unterbestands von Phagen gewährt wird, der sich spezifisch an das Zielmolekül bindet. In einer anderen Ausführungsform kann der Unterbestand durch Screenen gegen eine Zielzelle oder Zielzellart, den Magen-Darm-Trakt, die Blut-Him- Schranke oder anderes Gewebe oder eine andere Gewebeschranke gebildet werden, so dass die Auswahl eines Unterbestands von Phagen gewährt wird, die sich entweder spezifisch an die Zielzelle oder Zielzellart oder das Zielgewebe oder die Zielgewebeschranke binden, oder die sich an die Zielzelle, Zielzellart oder das Zielgewebe oder die Zielgewebeschranke entweder in situ oder in vivo binden und/oder durch sie (oder dazwischen) transportiert werden. Diese vorselektierte Phagen-Genbank oder der vorselektierte Unterbestand von selektierten Phagen kann auch wieder gegen das Zielmolekül oder die -zelle oder das -gewebe gescreent werden, wodurch die weitere Selektion eines Unterbestands von Phagen gewährt wird, die sich an das Zielmolekül oder die Zielzelle, das Zielgewebe oder die Zielgewebeschranke binden oder die sich an die Zielzelle, das Zielgewebe oder die Zielgewebeschranke entweder in situ oder in vivo binden und/oder durch sie transportiert werden. Ein solches Screenen kann null- bis 30-mal mit jeder aufeinanderfolgenden „vorselektierten Phagen-Genbank" wiederholt werden, wodurch zusätzliche vorselektierte Phagen-Genbanken gebildet werden.
Wie hier verwendet, bedeutet der Ausdruck „menschliches oder tierisches Gewebe" tierisches Gewebe, das explizit menschliches Gewebe einschließt.
Es wurde früher gezeigt, dass die Aminosäuresequenz mit endständigem NH₂ der Absorptionsproteine pIII und pVIII, die durch den fadenförmigen Escherichia-coli-Bakteriophagen wie fd durch rekombinante DNA-Technologie modifiziert werden kann, um eine Genbank aus statistischen Peptidsequenzen von definierter Länge einzuschließen (Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6378–6382 (1990)). Folglich kann eine DNA-Genbank von modifizierten Phagen-fd-Sequenzen, die die veränderlichen pIII- oder pVIII-Proteine kodiert, in E. coli gebildet und vermehrt werden.
Diese Erfindung offenbart die Verwendung von Phagen-Datengenbanken wie diejenigen in einem statistischen Screeningzugang oder einer vorselektierten Phagen-Genbank oder eines vorselektierten Unterbestands aus einer Phagen- Datengenbank in einem vorselektierten Screeningzugang zur Bestimmung der Identität von Peptidsequenzen, die die Abgabe des Bakteriophagen entweder von der oberen zur unteren Seite oder von der unteren zur oberen Seite von entweder kultivierten Modellsystemen oder in vitro-, in situ- oder in vivo-Gewebeproben erhöhen. Peptide, die die Abgabe von der oberen zur unteren Seite (z. B. der Darmseite zur Bluteseite) erhöhen, können zur Erhöhung der Abgabe von Wirkstoffen in dieser Richtung verwendet werden. Umgekehrtes gilt für Peptide, die die Abgabe von der unteren Seite zur oberen Seite erhöhen. Zum Beispiel könnte eine Abscheidung auf der unteren Seite Peptide bestimmen, die zum Erhöhen einer Schleimhautimmunreaktion auf ein IV, subkutan, transdermal oder auf ophthalmischem Weg verabreichtes Antigen nützlich sind.
Die Größe der durch die Genbanken kodierten statistischen Peptidsequenzen kann von beliebiger Größe sein. Die Genbanken können zur Bestimmung für lineare Peptide konstruiert sein. In einer anderen Ausführungsform können die Genbanken so konstruiert sein, dass sie Cysteinreste an zwei oder mehreren fixierten Positionen enthalten und somit cyclische Peptide kodieren. Wie hier nachstehend erörtert, ist ein bevorzugter Bakteriophage fd (z. B. von Genbanken L3.6, L3.15, L8.15) ein fadenförmiger Phage mit den Maßen von etwa 7 nm mal 500–900 nm. Auf seiner Oberfläche exprimiert der Phage primär zwei verschiedene Proteine, das Gen-III-Protein, von welchem 3–5 Kopien pro Phagenteilchen vorliegen, und das Gen-VIII-Protein, von welchem etwa 2500 Kopien vorliegen. In dem Phagen-Datensystem wurden die Gene, die entweder Gen III oder Gen-VIII kodieren, zum Kodieren und Exprimieren von statistischen Peptidsequenzen von bestimmter Länge wie 6-mer, 15-mer und 30-mer modifiziert. Zusätzlich können mehrfache Kopien eines DNA-Einsatzes, der z. B. eine statistische 15-mer-Sequenz kodiert, die Herstellung von statistischen Peptidsequenzen, die länger als 15-mer sind, erleichtern. Jede Genbank stellt zwischen 10⁸ und 10⁹ oder mehr statistische Peptidsequenzen dar. Als solche kann die Phagen-Genbank ein Nanoteilchengemisch simulieren, in welchem die Nanoteilchen mit verschiedenen Peptiden von bestimmter Länge beschichtet sind.
Während des Erstellens einer Phagen-Datengenbank ist es möglich, dass mehr als ein DNA-Einsatz (oder teilweisen DNA-Einsätze, die aufgrund der Spaltung an den inneren Beschränkungsstellen in der DNA-Genbank oder im DNA-Einsatz vorkommen) zu den Klonstellen in Gen III oder Gen VIII geklont werden kann, wodurch mehrere DNA-Einsätze in dem erhaltenen Vektorklon erhalten werden können. Solche Klone, die mehrfache DNA-Einsätze enthalten, oder Derivate davon können längere als die erwarteten Peptide aufgrund der Gegenwart von mehrfachen DNA-Einsätzen kodieren, mit der Maßgabe, dass die DNA-Einsätze innerhalb des Gerüsts in Bezug auf das Ablesegerüst von Gen III oder Gen VIII vorliegen, und/oder mit der Maßgabe, dass die Klone innere DNA-Sequenzen enthalten, die für das Verfahren der Ribosomengerüstverschiebung während der Übertragung in vivo anfänglich oder empfänglich sind, was dann wieder das Ablesegerüst des DNA-Einsatzes in Bezug auf das Übertragungsablesegerüst von Gen III oder Gen VIII wiederherstellt, und/oder mit der Maßgabe, dass das durch den DNA-Einsatz kodierte mRNA innerhalb des Gerüsts mit Gen III oder Gen VIII liegt und keinen internen Übertragungsstop oder endständige Übertragungskodone enthält, und/oder mit der Maßgabe, dass jeder beliebige interne Übertragungsstop oder jedes beliebige endständige Kodon bzw. alle beliebigen endständigen Kodone als Ablesekodon(e) durch ein Übertragungssuppressormolekül in vivo abgelesen werden können wie das TAG-Kodon, das durch den SupE-Suppressor in E. coli als GLN-Kodon dekodiert wird, vorliegt bzw. vorliegen.
Die durch dreifache (oder mehrfache) DNA-Einsätze kodierten Peptide können längere und/oder mehr verschiedene Peptide kodieren. Solche längeren Peptide können im Gegensatz zu kürzeren Peptiden wie 15-mer Peptiden stärker sekundäre oder tertiäre Strukturen annehmen. Diese Fähigkeit von Peptiden, definierte sekundäre und/oder tertiäre Strukturen anzunehmen, die durch diejenigen Phagen kodiert wurden, die mehrfache oder dreifache DNA-Einsätze enthalten, können dann wieder für die Auswahl von diesen Phagenarten aus statistischen Phagen- Datengenbanken während den Auswahl- oder Schwenkverfahren verantwortlich sein.
Verschiedene Transportmechanismen funktionieren in epithelialen Zellen. Einige Transportmechanismen sind Träger-vermittelt, wobei sich ein Träger oder Rezeptor an einen Liganden bindet und den gebundenen Liganden in oder durch die epithelialen Zellen transportiert. Andere Transportsysteme funktionieren durch Transzytose, wobei sich eine Träger- oder Rezeptorstelle an einen Liganden bindet, der Träger : Ligand-Komplex von Endozytose aufgenommen wird und folglich einen Liganden (oder ein Arzneimittel) in oder durch die Zelle abgibt. Diese Erfindung gewährt die Entdeckung bestimmter Peptidsequenzen, die sich an solche aktiven Träger oder transzytotischen Transportsysteme binden, um Arzneimittelabgabe zu erleichtern. Jedoch offenbart die Erfindung eher als Fokussieren des Rezeptor/Träger-Systems die Verwendung eines Blind- oder statistischen oder vorselektierten Screeningzugangs, um Peptidsequenzen zu identifizieren, die mit undefinierten oder unbekannten Rezeptor/Trägerstellen in Geweben wie epithelialen Zellen zwischenwirken und die Abgabe eines Bakteriophagen von der oberen zu der unteren Stelle von polarisierten Zellkulturen oder Modellgewebesystemen zu erleichtern. Da diese Peptidsequenzen die Abgabe eines Bakteriophagen erleichtern können, sind sie wahrscheinlich beim Transport von Arzneimitteln und teilchenförmigen Systemen, insbesondere beim Transport von Arzneimittel-beladenen oder -einkapselnden Nano- oder Mikroteilchensystemen nützlich, wenn sie auf der Oberfläche derselben Kondensationsproteine beschichtet sind, wodurch das Peptid an ein therapeutisches Peptid oder Protein kondensiert. Zudem gewährt diese Erfindung die Entdeckung von bestimmten Peptidsequenzen, die tranzelluläre oder parazelluläre Transportwege oder -mechanismen in kultivierten Zellen oder Geweben erkennt und so die Arzneimittelabgabe durch diese Transportwege erleichtert.
Kurz gesagt schließt der Screeningzugang im in-vitro-Kontext das In-Kontakt-bringen einer vorbestimmten Menge eines Phagen aus einer statistischen Phagen- Genbank oder einer vorselektierten Phagen-Genbank mit einer ersten Seite einer menschlichen oder tierischen Gewebeprobe oder polarisierten Gewebezellkultur, Auffangen des Phagen, der zu der gegenüberliegenden Seite der Gewebeprobe oder -kultur transportiert wird, um den transportierten Phagen zu selektieren, Amplifizieren des transportierten Phagen in einem Wirt und Identifizieren mindestens eines statistischen Peptids, das von einem transportierten Phagen kodiert wurde, um ein Peptid zu identifizieren, das den Transport eines Wirkstoffs durch ein menschliches oder tierisches Gewebe gewährt oder erleichtert, ein. Falls gewünscht, können die Schritte des In-Kontakt-bringens, Auffangens und Amplifizierens eine vorbestimmt-fache Anzahl unter Verwendung des transportierten Phagen, der in dem vorherigen Zyklus erhalten wurde, wiederholt werden. Zum Beispiel können Phagen unter Verwendung von polarisierten Gewebezellkulturproben wie Caco-2-Zellen oder T-84-Zellen oder Gewebeextrakten wie isolierten Rattenkolonsegmenten auf die obere Seite der kultivierten Zellen oder Zellsegmente abgeschieden werden. Anschließend wird das untere Medium bei einem beliebigen Zeitpunkt, gewöhnlich jedoch nach 1 bis 24 Stunden aseptisch aufgefangen und zum Wiederinfizieren eines Wirts wie männlichen E. coli, der den F^l-Faktor kodiert, verwendet, um Nachkommen zu erzeugen. Der selektierte Phage aus Zyklus 1 kann auf die obere Seite der kultivierten Zellen oder des Gewebesegments aufgetragen werden, und der Phage wird wieder in dem unteren Medium aufgefangen, titriert und amplifiziert. Eine Wiederholung dieses Zyklus' gewährt die Anreicherung des Phagen, der von der oberen zur unteren Seite transportiert werden kann, wobei die %uale Phagenausbeute, die aus dem unteren Medium hervorgeht, sich erhöht, wenn die Anzahl von Zyklen erhöht wird. Nach dem 0- bis 30-fachen, vorzugsweise 3- bis 20-fachem Wiederholen des Zyklus' wird die DNA-Sequenz, die den Bereich mit endständigem NH₂ des pIII- oder pVIII-Proteins des (der) gereinigten, selektierten, amplifizierten Phagen kodiert, bestimmt, um den Abzug der Aminosäuresequenz des (der) modifizierten Phagen zu bestimmen, durch welchen der Vorteil des Transports von der oberen zu der unteren Seite des kultivierten oder Gewebesystems verliehen wird.
Ähnlich zu dem vorstehend angegebenen Screeningzugang in vitro schließt der Screeningzugang im in-vivo-Kontext das In-Kontakt-bringen einer vorbestimmten Menge eines Phagen aus einer statistischen Phagen-Genbank oder einer vorselektierten Phagen-Genbank mit einer ersten Seite einer Gewebeschranke in vivo, Auffangen des Phagen, der zu der gegenüberliegenden Seite der Gewebeschranke transportiert wird, um den transportierten Phagen zu selektieren, Amplifizieren des transportierten Phagen in einem Wirt und Identifizieren mindestens eines statistischen Peptids, das durch einen transportierten Phagen kodiert wurde, um ein Peptid zu identifizieren, das den Transport eines Wirkstoffs durch ein menschliches oder tierisches Gewebe gewährt oder erleichtert, ein. Falls gewünscht, können die Schritte des In-Kontakt-bringens, Auffangens und Amplifizierens eine vorbestimmt-fache Anzahl unter Verwendung des transportierten Phagen, der im vorherigen Zyklus erhalten wurde, wiederholt werden. Zum Beispiel kann die Phagen-Datengenbank entweder durch Polyethylenglycolausfällungen oder Saccharosedichte- oder CsCl-Dichtezentrifugationen gereinigt werden. Die gereinigte Genbank kann dann wie in TBS- oder PBS-Puffer wieder suspendiert werden und auf eine Seite einer Gewebeschranke wie in das Duodenum, Jejunum, Ileum, den Kolon oder eine andere tierische in-vivo-Stelle unter Verwendung z. B. eines Modells mit geschlossener Darmschlinge oder eines Modells mit offener Darmschlinge injiziert aufgebracht werden. Nach der Injektion werden die Proben von Körperflüssigkeiten, die sich um die Gewebeschranke befinden, wie Proben des Portalkreislaufs und/oder systemischen Kreislaufs zu vorbestimmten Zeitpunkten wie 0 bis 90 Minuten und/oder 2 bis 6 Stunden oder mehr entnommen. Ein Aliquot der entnommenen Probe (z. B. Blut) wird zum direkten Infizieren eines Wirts wie E. coli verwendet, um die Gegenwart eines Phagen zu bestimmen. Die übrige Probe wird inkubiert, wie Inkubation über Nacht mit E. coli bei 37°C unter Schütteln. Der amplifizierte Phage, der in der Kultur vorliegt, kann entweder sequentiert werden, um die Identität von Peptiden, die durch den Phagen kodiert wurden zu bestimmen, oder kann, falls weitere Anreicherung gewünscht wird, PEG-gefällt werden, in PBS wieder suspendiert werden und kann entweder weiter PEG-gefällt oder direkt zur Verabreichung an ein anderes tierisches GIT- Modellsystem mit geschlossener oder offener Darmschlinge, gefolgt von Auffangen einer Portal- oder systemischen Blutprobe und anschließender Amplifikation des in solche Kreislaufsysteme transportierten Phagen verwendet werden. Auf diese Weise gewährt die Verabreichung der Phagen-Datengenbank, falls gewünscht, mit wiederholter Verabreichung des amplifizierten Phagen an den GIT des Tiers die Selektion des Phagen, der von dem GIT zu dem Portal- und/oder systemischen Kreislauf des Tiers transportiert wird.
Falls gewünscht, kann der entsprechende Bereich der Gewebeschranke nach Verabreichung des Phagen der Phagen-Datengenbank an die Gewebeschranke (z. B. den GIT) des Tiermodells am Ende der vorstehend angegebenen Prozedur wiedergewonnen werden. Dieses wiedergewonnene Gewebe kann wiederholt in geeigneten Puffern wie PBS enthaltende Proteasehemmstoffen gewaschen und wie in PBS-enthaltenden Proteasehemmstoffen homogenisiert werden. Das Homogenat kann zum Infizieren eines Wirts wie E. coli verwendet werden, womit die Amplifikation von Phagen gewährt wird, die sich eng an die Gewebeschranke (z. B. das Darmgewebe) binden. In einer anderen Ausführungsform kann das wiedergewonnene Gewebe in geeigneten PBS-Puffern homogenisiert und wiederholt gewaschen werden und der in dem endgültigen Gewebehomogenat vorliegende Phage in E. coli amplifiziert werden. Dieser Zugang gewährt die Amplifikation (und anschließende Identifizierung der damit verbundenen Peptide) von Phagen, die sich entweder eng an die Gewebeschranke (z. B. das Darmgewebe) binden oder die von den Zellen der Gewebeschranke (z. B. epitheliale Zellen des Darmgewebes) aufgenommen werden. Dieser Selektionszugang eines Phagen, der sich an Gewebe bindet oder der von einem Gewebe aufgenommen wird, kann wiederholt werden.
Anschließend werden die entsprechenden Peptidsequenzen, die durch die selektierten Phagen kodiert wurden, die durch die vorstehenden Prozeduren erhalten und nach DNA-Sequenzieren der geeigneten Phagengene Gen III oder Gen VIII identifiziert wurden, synthetisiert. Die Bindung und der Transport des syntheti schen Peptids selbst durch die Modellzellkultur oder das isolierte Gewebesystem (wie Kolon) gewährt die direkte Überprüfung der Transporteigenschaften jedes einzelnen Peptids. Zudem gewährt eine Kondensation der selektierten Sequenzen des Peptids bzw. der Peptide mit anderen Peptiden oder Proteinen die direkte Überprüfung des Transports solcher heterozytogenen Proteine oder Peptide durch die Modellsysteme. Solche heterozytogenen Proteine oder Peptide können entweder in vitro oder durch herkömmliche rekombinante Technologieverfahren synthetisiert werden, wobei die cDNA, die das transportierende Peptid kodiert, und die cDNA, die das Arzneimittelpeptid oder -protein kodiert, miteinander innerhalb des Gerüsts verbunden und in einen Exprimierungsvektor geklont werden, die dann wieder Exprimierung im gewünschten Wirt, wobei es sich um prokaryotische Zellen oder eukaryotische Zellen oder transgene Tiere oder transgene Pflanzen handelt, gewähren. Zum Beispiel können die cDNAs, die den Bereich der pIII-Proteine kodieren in die Gene oder cDNAs, die die selektierten Proteinmoleküle (z. B. Calcitoin, Insulin, Interferone, Interleukine, Cytokine, EPO, kolonstimulierende Faktoren usw.) subgeklont werden und diese modifizierten Gene oder cDNAs in E. coli oder geeigneten Säugerzellen oder trangenen Tieren oder trangenen Pflanzen exprimiert werden. Die exprimierten rekombinanten Proteine können gereinigt werden, und deren transzelluläre, Träger-vermittelte, transzytotische und/oder parazelluläre Transport durch menschliches oder tierisches Gewebe kann verifiziert werden. Zudem können die transportierenden Peptide zum Beschichten der Oberfläche von nanoteilchenförmigen oder mikroteilchenförmigen Arzneimittelabgabevehikulen verwendet werden. Solche Beschichtungen können entweder durch direkte Adsorption des Peptids auf der Oberfläche des teilchenförmigen Systems oder in einer anderen Ausführungsform durch kovalentes Kuppeln des Peptids an die Oberfläche des teilchenförmigen Systems, entweder direkt oder über eine Verbindungseinheit oder durch kovalentes Kuppeln des Peptids an die Polymere, die bei der Herstellung von nanoteilchenförmigen oder mikroteilchenförmigen Arzneimittelabgabevehikulen verwendet werden, durchgeführt werden, gefolgt von der Verwendung solcher Peptid : Polymerkonjugate bei der Herstellung von nanoteilchenförmigen oder mikroteilchenförmigen Arzneimittelabgabevehikulen.
Beschreibung und Herstellung von Phagen-Datengenbanken
Drei Phagen-Datengenbanken, hier identifiziert als L3.6, L3.15 und L8.15, wurden von Prof. George P. Smith der Universität von Missouri-Columbia erhalten. Jede Genbank liegt im Vektor fUSE5, der von einem Stammvektor „fd-tet" abgeleitet wurde. In der Genbank L3.6 werden statistische 6-mer Genbanken durch das Gen III des fd-Bakteriophagen exprimiert und von allen 5 Kopien der erhaltenen Proteine pIII-Protein widergegeben. Die Anzahl der amplifizierten Übermittlungsklone beträgt 3,7 × 10¹¹ und die Größe der Phagen-DNA beträgt 9225 Basen. In der Genbank L3.15 werden statistische 15-mer Genbanken durch das Gen III des fd-Bakteriophagen exprimiert und von allen 5 Kopien der erhaltenen Proteine pIII-Protein widergegeben. Die Anzahl der amplifizierten (primäre Amplifikation) Übermittlungsklone beträgt 3,2 × 10¹¹ (sekundäre Amplifikation) 12,1 × 10¹² und die Größe der Phagen-DNA beträgt 9252 Basen. In der Genbank L8.15 weist der Vektor zwei Gene VIII in demselben Genom auf, wobei eines davon von wilder Art ist und das andere die Fremdreste wiedergibt. Die 15-mer-Genbanken werden durch eines der beiden Gene VIII des fd-Bakteriophagen exprimiert und über bis zu etwa 300 Kopien der erhaltenen rekombinanten Protein pVIII-Proteine wiedergegeben. Dieser Vektor wird f88-4 genannt, in welchem das fremde 15-mer über bis zu etwa 300 Kopien von Protein pVIII wiedergegeben wird. Die Anzahl an amplifizierten Übermittlungsklonen beträgt 2,2 × 10¹² und die Größe der Phagen-DNA beträgt 9273 Phagen.
Eine 30-mer-Phagen-Datengenbank X30 wurde von Dr. Jamie S. Scott der Simon-Fraser-Universität erhalten. Die X30-Phagen-Datengenbank kodiert statistische Peptidsequenzen mit der Größe von 30 Resten. Diese Genbank wurde in dem f88-4-Vektor erstellt, der ein Tetracyclin-resistentes Gen trägt und zwei pVIII-Gene, das Gen von wilder Art und ein synthetisches Gen, aufweist. Die f88-4-Genbank weist variable Einsätze auf, die in das synthetische pVIII-Gen des f88-4-Vektors geklont sind.
D38 und DC43 sind statistische Phagen-Datengenbanken, in welchen Gen-III statistische Peptide mit einer Größe von 38 bzw. 43 Resten kodiert. Diese Genbanken sind in McConnel et al., Molecular Diversity 1: 154–176 (1995) und WO 96/09411 beschrieben.
Eine Herstellung in großem Maßstab von jeder der Bakteriophagen-Genbanken wurde in dem E. coli-Wirt Stamm K91Kan durchgeführt. Eine einzelne K91Kan-Kolonie wurde in ein Rohr mit einem Volumen von 50 ml, enthaltend 20 ml LB-Brühe (Hefeextrakt (Gibco) – 1 g; Trypton (Gibco) – 2 g; NaCl – 1 g und destilliertes Wasser 200 ml) zusammen mit Kanamycin (Endkonzentration 100 μg/ml) geimpft und man ließ sie auf Mittellog-Phase unter Rühren mit 200 UpM bei 37°C anwachsen (OD 0,45 bei 600 nm). Man ließ die Zellen unter sanftem Schütteln (100 UpM, 37°C) 5 Min. inkubieren, um gescherte F-Pili wiederzubilden. Die Zellen wurden durch 10-minütige Zentrifugation bei 2200 UpM bei Raumtemperatur in Pellet-Form gebracht, der Überstand entfernt und die Zellen sanft wieder in 20 ml 80 mM NaCl suspendiert und 45 Min. sanft geschüttelt (100 UpM, 37°C). Die Zellen wurden wieder zentrifugiert und das Zellpellet sanft wieder in 1 ml kaltem NAP-Puffer (NaCl (5 M Stammlösung) – 1,6 ml; NH₄H₂PO₄ (0,5 M Stammlösung, pH 7,0) – 10 ml und destilliertes Wasser – 88,4 ml) suspendiert. Die Zellen wurden bei 4°C gelagert und blieben 3–5 Tage infizierbar.
Die primären Genbanken wurden durch Impfen von zwei Kolben mit einem Volumen von 1 l, enthaltend 100 ml fruchtbare Brühe, mit einer Über-Nacht-Kultur von K91Kan-Zellen (gewachsen in LB + 100 μg/ml Kanamycin) amplifiziert. Diese Kultur wurde bei 37°C und 200 UpM inkubiert, bis der OD₆₀₀ einer 1 : 10-Verdünnung 0,2 betrug, und dann weiter 5 Min. bei 37°C und 200 UpM inkubiert, um eine Wiederbildung von gescherten F-Pili zu gewähren. 10 μl der primä ren Genbank wurden jedem Kolben unter kontinuierlichem langsamen 15-minütigem Schütteln zugesetzt, Jede Kultur wurde in einen vorgewärmten Kolben mit einem Volumen von 21, enthaltend 11 LB + 0,22 μg/ml Tetracyclin, gegossen und mit 200 UpM 35 Min. geschüttelt. 1 ml Tetracyclin mit 20 μg/ml wurden zugesetzt und Proben mit einem Volumen von 7 μl aus jedem Kolben entfernt. Die Kolben wurden unter kontinuierlichem Schütteln über Nacht in einen Inkubator gegeben. 200 μl von verschiedenen Reihenverdünnungen (10^–4-, 10^–6-, 10^–8-, 10^–10-Verdünnungen) jeder Kultur wurden auf Platten mit LB + 40 μg/ml Tetracyclin und 100 μg/ml Kanamycin gesprüht und über Nacht inkubiert. Die Kolonien wurden gezählt.
Eine Reinigung im großen Maßstab des Phagen wurde durch gleichmäßiges Aufteilen der Kultur zwischen zwei Zentrifugenröhrchen und 10-minütiges Zentrifugieren mit 5000 UpM bei 4°C erzielt. Die Überstände wurden in frische Röhrchen überführt und mit 8000 UpM 10 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Die endgültigen geklärten Überstände wurden in frische Röhrchen gegossen und das Nettovolumen notiert. 0,15 Vol. PEG/NaCl (PEG 8000 – 100 g NaCl – 116,9 g und destilliertes Wasser – 475 ml) wurden zugesetzt und die Röhrchen sanft durch Umwenden (× 100-fach) gemischt und auf Eis > 4 H (oder über Nacht bei 4°C) gelagert. Nach 40-minütiger Zentrifugation mit 8000 UpM bei 4°C wurde der Überstand abdekantiert, wieder kurz zentrifugiert und der restliche Überstand durch Pipettieren entfernt. 10 ml TBS (Tris-HCl (pH 7,5) – 0,60 g, NaCl – 0,88 g und destilliertes Wasser 100 ml) wurden zugesetzt und das Röhrchen wurde bei 37°C und 200 UpM 30 Min. zum Lösen des Pellets inkubiert. Das Röhrchen wurde kurz zentrifugiert, und die Lösungen aus beiden Röhrchen wurden in ein einzelnes Röhrchen des Typs Oak Ridge übertragen, mit 10–15000 UpM 10 Min. bei 4°C zentrifugiert und der Überstand in ein frisches Röhrchen entfernt. 0,15 Vol. PEG/NaCl wurden zugesetzt, und man ließ den Phagen auf Eis 1 h ausfallen. Die Verfahren der Zugabe von 10 ml TBS wurden wiederholt. In ein tariertes Beckmann^®-Polyallomer-Röhrchen mit einem Volumen von 30 ml wurden 4,83 g CsCl gegeben, das Röhrchen wurde wieder tariert und die Phagenlösung zugesetzt. TBS wurde auf einem Nettogewicht von 10,75 g (Gesamtvolumen 12 ml einer 31%igen G/G Lösung von CsCl, Dichte 1,3 g/ml) zugesetzt. Ein Verhältnis von 31 : 69 G/G ist wichtig. Nach 48-stündiger Zentrifugation in der Ultrazentrifuge bei 20000 UpM und 4°C wurde das Röhrchen von oben mit einer sichtbaren Lichtquelle bestrahlt und der Phagenstreifen identifiziert:
Phagenstreifen – oberer Streifen, etwa 5 mm, schwach, blau, nichtflockenartig
PEG – unterer Streifen, eng, fadenförmig, flockenartig, undurchsichtig, weiß.
Das Fluid wurde auf 2 mm über dem Phagenstreifen abgesaugt und der Phagenstreifen unter Verwendung einer sterilen Übertragungspipette mit breiter Öffnung entnommen und in ein Zentrifugenröhrchen aus Polycarbonat mit einem Volumen von 26 ml gegeben. Das Röhrchen wurde bis zur Schulter mit TBS gefüllt, gemischt und mit 50000 UpM 4 Stunden bei 4°C in dem 60Ti-Rotor (wiederholt) zentrifugiert. Das Pellet wurde in 10 ml TBS durch sanftes Wirbeln gelöst, man ließ es über Nacht in der Kälte erweichen, und es wurde wieder aufgewirbelt. Das Pellet wurde dann in TBS (2 ml pro Liter der ursprünglichen Kultur) durch Aufwirbeln gelöst, man ließe es über Nacht bei 4°C erweichen und es wurde wieder aufgewirbelt. Das Röhrchen wurde kurz zentrifugiert, um die Lösung zum Röhrchenboden zu bringen, und diese in Mikroröhrchen mit einem Volumen von 1,5 ml übertragen. Natriumazid (0,02%) kann zugesetzt werden und die Lösung kann auf 70°C 20 Min. erwärmt werden, um die restlichen Mikroorganismen abzutöten. Nach 1-minütigem Mikrofugieren zum Klären der Lösung wurde der Überstand in sterile Mikroröhrchen übertragen und bei 4°C gelagert. 200 μl einer 1 : 100-Verdünnung wurden von 240–320 nm gescannt, um die Konzentration der physikalischen Teilchen und den Titer 10 μl einer 10^–8-Verdünnung von 10 μl genährten K91Kan-Zellen zu bestimmen. 200 μl der Infektionen wurden auf Platten mit LB (+40 μg/ml Tetracyclin und 100 μg/ml Kanamycin) gesprüht, bei 37°C 24 h inkubiert und die Anzahl an Kolonien gezählt, um den Titer von infektiösen Einheiten in den Phagenstammlösungen zu bestimmen.
Kultivieren von Caco-2-, T-84-Zellen
Die Caco-2-Zellen (ATCC-Bezeichnung: HTB 37, abgeleitet von einer Lungenmetastase eines Kolonkarzinoms eines 72 Jahre alten Mannes) und T-84-Zellen (ATCC-Bezeichnung: CCL 248, isoliert aus einem primären Kolontumor eines 72 Jahre alten kaukasischen Mannes) wurden anfänglich in Kolben mit einem Volumen von 25 cm² kultiviert, bis sie Konfluenz erreichten. Man ließ die T-84-Zellen in einem 1:1-DMEM:Ham's-F12-Medium, enthaltend 2 mM Glutamin, 15 mM HEPES, 10% fötales Kalbserum (FCS), 1% MEM nicht essentielle Aminosäuren und 50 U/ml Penicillin und 50 μg/ml Streptomycin, wachsen. Man ließ Caco-2-Zellen in DMEM + Glutamax-1, enthaltend 10% FCS, 1% MEM nicht essentielle Aminosäuren, 50 U/ml Penicillin und 50 μg/ml Streptomycin wachsen. Alle Zellen wurden bei 37°C in 95% O₂/5%CO₂ inkubiert. Bei Konfluenz wurden die Zellen zum Ankeimen von Schnappmulden verwendet.
Beim Ankeimen von Schnappmulden wurde im Wesentlichen wie für die T-84-Zellen gefolgt (eine Konzentration von 1 × 10⁶ Zellen (1,0 ml Medium ist für jede der Schnappmulden mit einem Volumen von 12 mm erforderlich, ein Konfluenzkolben mit 100% T-84 enthält etwa 8 × 10⁶ Zellen und wäre zum Ankeimen von 8 Schnappmulden ausreichend). Die Kolben wurden trypsinisiert und die Zellen vorsichtig wieder suspendiert, indem sichergestellt wurde, dass keine Klumpen oder Luftblasen vorlagen. 2,6 ml Gewebekulturmedium wurden auf den Boden der Mulden und 0,1 ml auf den Filter gegeben und dies 10 Min. in den Inkubator bei 37°C gegeben. 1,5 ml der Zellsuspension wurde vorsichtig, damit kein Abfall in den Boden der Mulde gelassen wurde, jedem Filter zugesetzt. Der Filter wurde zurück in den Inkubator gegeben und nach 24 Stunden überprüft. Die Zellen wurden routinemäßig auf adäquates TER unter Verwendung eines essstäbchenförmigen epithelialen EVOM-Voltmeters (WPI) überwacht. Im Falle von Caco-2-Zellen war das Ankeimen von Caco-2-Zellen im Wesentlichen dasselbe wie für T- 84-Zellen, außer dass sie eher mit 5 × 10⁵ als mit 1 × 10⁶ Zellen/Schnappmulde angekeimt wurden.
Die anschließende Beibehaltung und Zufuhr der Zellen auf die Schnappmulden war wie folgt: nach dem Zuführen in die Mulden wurde das Medium von der unteren Seite der Schnappmulde zuerst entfernt. Das Medium wurde von der Monoschicht mit einer Pipette entfernt, in dem mit Vorsicht vorgegangen wurde, um den Filter nicht zu berühren, wonach 1 ml Wachstumsmedium auf die obere Seite und 2 ml Wachstumsmedium auf die untere Seite gegeben wurde. Transportverluste von Medium auf den beiden Seiten der Platte außerhalb der Mulde wurden überprüft und gegebenenfalls mit einem Baumwolltupfer, der mit Alkohol befeuchtet war, abgetupft. Nach dem Ankeimen auf den Schnappmulden wurden die Zellen auf täglicher Basis zugeführt und auf den Schnappmulden zwischen 21–30 Tagen kultiviert, wobei sich während dieser Zeit die Zellen spontan differenzierten und polarisiert wurden.
Herstellung von intaktem Schleimhautgewebe des Rattenkolons
Tiere wurden (durch Kohlenmonoxid) getötet, der Bauchraum geöffnet und der Kolon ausfindig gemacht, entfernt und in 1 × Hank's Balanced Salt Puffer (HBSS, Gibco BRL, Kat.-# 14065-031) gewaschen. Das röhrenförmige Segment wurde entlang der Mesenterialgrenze aufgeschnitten, um ein flaches quadratisches Gewebestück zu erhalten. Die Glattmuskelschicht wurde dann durch stumpfes Präparieren entfernt, um ein Epitheliumstück mit etwa 2,5 cm² zu erhalten.
Die isolierte Rattenkolonschleimhaut wurde in Seite-an-Seite-Diffusionskammern des Typs Sweetana-Grass (SG) befestigt. Die befestigte Rattenkolonschleimhaut in den S-G-Kammern wurde in der Analyse für Phagentransport von der oberen zur unteren Seite des Kolongewebes verwendet.
Ausgleichende Seite-an-Seite-Kammern
Man ließ das Wasserbad auf 37°C äquilibrieren. Die Kammern wurden mit HBSS-Puffer (siehe nachstehend) gefüllt und die Elektroden angeschalten. Der Ein-Aus-Kontrollknopf wurde auf 0 eingestellt. Man ließ das System etwa 20 Minuten äquilibrieren, indem sichergestellt wurde, dass die Ablesungen immer bei 0 blieben. Die Elektroden wurden abgeschalten und die HBSS-Lösung wurde entfernt. Filter enthaltende Lagen des Rattenkolonepitheliums wurden auf der Apparatur befestigt, und 10 ml HBSS-Puffer wurden gleichzeitig jeder Seite zugesetzt. Die Gewebe wurden mit 95% O₂/5%CO₂ oxygeniert, und man ließ das System mindestens 30 Minuten äquilibrieren. Die Elektroden wurden angeschalten und die Knöpfe auf Klemmenspannung und Strom gesetzt. Die Spannung wurde so eingestellt, dass eine Stromänderung von etwa 2–3 μA erhalten wurde. Der Timer wurde dann so eingestellt, dass alle 8 Minuten eine Spannung angelegt wurde, und die entsprechende Stromabweichung wurde verwendet, um TER durch Anwenden der folgenden Ohmschen Beziehung zu berechnen: R = V/I. Mit den Aufzeichnungen wurden mindestens 10 Min. vor Zugabe eines Phagen begonnen.
Enzym-gebundener Immuno-Sorbens-Versuch (ELISA) für fd-abgeleiteten Phagen von Caco-2-Zellen
Man ließ Caco-2-Zellen (100 μl) zur Konfluenz in Gewebekulturplatten mit 96 Mulden wachsen (2 × 10⁵ Zellen/Mulde wuchsen 2 Tage in Wachstumsmedium, enthaltend DMEM/Glutamax + 1% Pen/Strep, 1% MEM & 10% FCS). Nach 2-tägigem Wachsen wurden 100 μl 10%iges Formaldehyd [Formaldehyd (38%), steriles destilliertes Wasser (1 : 3 Vol.)] den konfluierten Caco-2-Zellmonoschichten zugesetzt, gefolgt von 15-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur. Die Inhalte der Mikrotitermulden wurde durch Umwenden/Schnippen entleert und die Mulden drei mal mit DPBS (Dulbecco's PBS) gewaschen. Jede Mulde wurde mit 200 μl 0,1%igem Phenylhydrazin-DPBS (0,1% Phenylhydrazin in DPBS) gefüllt und 1 h bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden die Inhalte der Mikrotitermulden durch Umwenden/Schnippen entleert und die Mulden drei mal mit DBPS gewaschen. 200 μl 0,5%iges BSA in DPBS wurden jeder Mulde zugesetzt, gefolgt von 1-stündiger Inkubation bei Raumtemperatur. Jede Mulde wurde als nächstes drei mal in 1%igem BPT (1% BSA, 0,05% Tween^® 20 in DPBS) gewaschen.
Phagenproben (100 μl in 1%igem BPT) (entweder reiner Phage mit 10¹⁰ pfu/ml oder 1 : 25- oder 1 : 100-Verdünnungen davon) wurden den Mulden zugesetzt, gefolgt von 2-stündiger Inkubation bei Raumtemperatur. Die Inhalte der Mikrotitermulden wurden durch Umwenden/Schnippen entfernt und die Mulden fünf mal in 1%igem BPT gewaschen. 100 μl Meerrettichperoxidase (HRP)-Anti-M13-Konjugat (HRP/Anti-M13-Konjugat zu Meerrettichperoxidase konjugiert an Schaf-anti-M13IgG; 1 : 5000 Arbeitslösung in 1% BPT; Pharmacia 27-9402-01) wurde jeder Mulde zugesetzt, gefolgt von 1-stündiger Inkubation bei Raumtemperatur. Die Inhalte aus den Mikrotitermulden wurden wieder durch Umwenden/Schnippen entfernt und die Mulden fünf mal in 1 %igem BPT gewaschen. 200 μl TMB-Substratlösung (3,3',5'S-Tetramethylbenzidin:Mikrowell Peroxidase Substrate System: Kirkegaard & Perry Laboratories CN 50-76-00, hergestellt durch Mischen von gleichen Mengen TMB-Peroxidasesubstrat A und Peroxidaselösung B in einem Glasbehälter direkt vor der Verwendung) wurden jeder Mulde zugesetzt, gefolgt von 20–60-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur. Danach wurden Absorptionsablesungen bei 650 nm von einem Mikrotiterplattenablesegerät abgelesen.
Verarbeiten von Darmgewebe
Zur Verwendung in der hier beschriebenen Ausführungsform in vivo wird die Phagen-Datengenbank entweder durch PEG-Ausfällung oder durch Saccharose- oder CsCl-Dichtezentrifugation gereinigt. Die Phagen-Datengenbank wird wieder in PBS- (oder TBS-) Puffer suspendiert und in die Tierstelle in vivo wie das Duodenum, Jejunum, Ileum, Kolon, aufsteigende Kolon, Querkolon, absteigende Kolon, den Sigma im Tiermodell (Ratten, Kaninchen oder andere Arten) mit geschlossener (oder offener) Darmschlinge injiziert. Nach der Verabreichung der Phagen-Datengenbank in den Magen-Darm-Trakt des Tiermodells und Entnahme von Portal- oder Systemisches Blutproben zu vorbestimmten Zeitpunkten (wie 0 Min., 15 Min., 30 Min., 45 Min., 60 Min. bis zu 6 Stunden) oder Inkubation der verabreichten Phagen-Datengenbank in das Modell mit geschlossener (oder offener) Darmschlinge für eine vorbestimmte Zeitdauer kann der entsprechende Bereich des der Phagen-Datengenbank ausgesetzten oder mit ihr inkubierten GITs am Ende des Versuch wiedergewonnen werden. Nach wiederholtem Waschen des wiedergewonnenen Darmgewebes in geeigneten Puffern wie PBS, enthaltend Proteasehemmstoffe, wird das gewaschene Gewebe in PBS, enthaltend Proteasehemmstoffe, homogenisiert und das Homogenat zum Infizieren von E. coli verwendet, wodurch Amplifikation von Phagen gewährt wird, die sich eng an das Darmgewebe binden können. In einer anderen Ausführungsform kann das wiedergewonnene Darmgewebe in geeigneten PBS-Puffern homogenisiert, wiederholt gewaschen und der in dem endgültigen Gewebehomogenat vorliegende Phage in E. coli homogenisiert werden. Dieser letztere Zugang gewährt auch die Amplifikation von Phagen, die sich entweder eng an das Darmgewebe binden oder die von den epithelialen Zellen des Darmgewebes aufgenommen werden.
Selektion eines Phagen mit verbesserter Fähigkeit, zelluläre Schranken zu durchwandern
A. Behandlung von Gewebekulturzellmonoschichten (Schnappmuldenmodelle) mit Phagen-Datenpopulation
In einer laminierten Fließkammer wurden 100 μl Phagenlösung mit 900 μl Wachstumsmedium ohne Antibiotikum (das vollständige empfohlene Medium für jede Zelllinie, jedoch ohne zugesetzte Antibiotika) in einem Mikrofugenröhrchen gemischt. Der Versuch wurde doppelt durchgeführt und schloss eine Kontrollbehandlung ohne Phagen ein. Das TER wurde für jede Schnappmulde gemessen, indem das Alter der Zellen und die Durchgangsnummer notiert wurden. Nur intakte Monoschichten von empfohlenem Alter wurden verwendet, von welchen TER erwartet wurde. Das untere Medium wurde in die Schnappmulden mit Medium ohne Antibiotikum gegeben und das obere Medium entfernt. Die Phagenlösungen und Kontrolllösungen wurden der oberen Seite der Zellen zugesetzt und die Schnappmuldenkulturen wie gewöhnlich inkubiert. Zu jedem Zeitpunkt des Auffangens (z. B. 1 h, 5 h, 24 h nach Anwendung des Phagen) wurde das Medium von der unteren Seite entfernt und in einem sterilen Schraubdeckelröhrchen mit einem Volumen von 2 ml bei 4°C gelagert. Zu jedem Zeitpunkt, an welchem das untere Medium entfernt wurde, wurde das Medium mit frischem Medium ohne Antibiotikum ersetzt. Als die Versuche beendet waren, wurde das TER gemessen und die Monoschichten wurden mit Vircon-Desinfektionsmittel wie gewöhnlich behandelt.
Der Phage wurde durch Herstellen von genährten Zellen von E. coli K91Kan und Durchführen von Reihenverdünnungen des Phagen in dem vorstehenden Wachstumsmedium in TBS/Gelatine titriert. 10 μl der genährten Zellen und 10 μl der reihenverdünnten Phagenlösung wurden in einem Mikrofugenröhrchen mit einem Volumen von 1,5 ml gemischt. Man ließ den Phagen 10 Min. bei Raumtemperatur infizieren. Im allgemeinen werden die folgenden Verdünnungen verwendet:

Probe Verdünnung

t = 1 h rein oder 10^–1

t = 5 h 10^–1, 10^–3

t = 24 h 10^–1, 10^–3

Oben/amplifiziert 10^–6, 10^–7, 10^–8
1 ml LB-Medium, enthaltend 0,2 μg/ml Tetracyclin, wurde den Phagen/K91Kan-Zell-Gemischen zugesetzt und dies 30 Min. bei 37°C inkubiert. 200 μl des Phagen/K91Kan-Zell-Gemischs wurde auf LB-Agarplatten, enthaltend 40 μg/ml Tetracyclin und 100 μg/ml Kanamycin gesprüht, und man ließ es über Nacht bei 37°C wachsen. Für eine 10^–2-Verdünnung (10 μl in 990 μl) stellen 200 Kolonien auf einer Platte 1 × 10⁷ TU/ml dar.
Folglich kann durch Schätzen des Phagentiters, der in dem unteren Medium vorlag und durch Kennen der Phagenanzahl, die auf die obere Seite aufgetragen wurde, eine Schätzung der %ualen Ausbeute der Phagen, die zum unteren Medium von der oberen Seite transportiert wurden, durchgeführt werden.
Selektierte Phagen, die im unteren Wachstumsmedium vorlagen, wurden durch Zugabe von 150 μl PEG/NaCl pro 1 ml Phagenlösung (Pool des Auffangens von allen drei Zeitpunkten (z. B. 3 × 2 ml = 6 ml)) in einem Oak-Ridge-Röhrchen amplifiziert. Die Lösung wurde sehr gut durch kontinuierliches Umwenden 2–3 Min. gemischt und bei 4°C mindestens 4 h gelagert. Der ausgefällte Phage wurde 15 Min. bei 10000 g (8500 UpM unter Verwendung eines Beckman-JA17-Rotors) in einer präparativen Ultrazentrifuge des Typs Beckman^® J2-MC zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und wieder wie vorstehend 5 Min. zentrifugiert. Das Pellet wurde wieder in 100 μl TBS durch 5-minütiges Stehenlassen bei Raumtemperatur und Aufwirbeln suspendiert (wiederholt durch 15-minütiges Stehenlassen und wieder Aufwirbeln). Die suspendierte Phagenlösung wurde in ein Oak-Ridge-Röhrchen gegeben und 100 μl genährte E. coli K91Kan wurden zugesetzt. Die Phagen/Zelllösung wurde sanft gemischt und bei Raumtemperatur 30 Min. stehengelassen. 20 ml vorgewärmtes LB-Medium, enthaltend Tetracyclin (0,2 μg/ml) und Kanamycin (100 μg/ml) wurden zugesetzt, und dies wurde mit 200 UpM bei 37°C 30 Min. inkubiert. 10 μl Tetracyclinstammlösung (40 mg/ml) wurden dem Medium zugesetzt, und das Röhrchen wurde über Nacht inkubiert. Die Über-Nacht-Kultur wurde 15 Min. mit 3440 g (5000 UpM unter Verwendung eines Beckman^®-JA17-Rotors) in einer präparativen Ultrazentrifuge des Typs Beckman J2-MC zentrifugiert. Der Überstand wurde in ein sauberes (vorzugsweise steriles) Oak-Ridge-Röhrchen gegeben und wieder 10 Minuten bei 13800 g (10.000 UpM) zentrifugiert. Der Überstand wurde in ein sauberes (vorzugsweise steriles) Oak-Ridge-Röhrchen, enthaltend 3 ml PEG/NaCl, gegeben und durch kontinuierliches Umwenden 2–3 Min. gemischt. Nach mindestens 4-stündiger Lagerung bei 4°C wurde das Röhrchen 15 Min. mit 13800 g (10000 unter Verwendung eines Beckman^®-JA17-Rotors) in einer präparativen Ultrazentrifuge des Typs Beckman^® J2-MC zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und wieder wie vorstehend 5 Min. mit 10000 UpM zentrifugiert. So viel Überstand wie möglich wurde mit einer Mikropipette entfernt und das Pellet wieder in 1 ml TBS durch 5-minütiges Stehenlassen bei Raumtemperatur und Aufwirbeln suspendiert. Die Wiedersuspension wurde 15 Min. stehengelassen und wieder aufgewirbelt. Die Phagenlösung wurde in ein Mikrofugenröhrchen mit einem Volumen von 1,5 ml überführt und wieder aufgewirbelt. Die Lösung wurde mit 13000 UpM 30 Sek. in einer Mikrofuge zentrifugiert und der Überstand in ein frisches Mikrofugenröhrchen mit einem Volumen von 1,5 ml, enthaltend 150 μl PEG/NaCl überführt. Das Röhrchen wurde durch Umwenden 2–3 Min. gemischt und bei 4°C mindestens 1 h gelagert. Anschließend wurde das Röhrchen mit 13000 UpM 10 Min. in einer Mikrofuge zentrifugiert und der Überstand entfernt und wieder 5 Min. zentrifugiert. Das Pellet wurde wieder in 100 μl TBS durch 5-minütiges Stehenlassen bei Raumtemperatur und Aufwirbeln suspendiert. Die Wiedersuspension wurde 15 Min. stehengelassen und wieder aufgewirbelt. Diese Wiedersuspension stellt den in Zyklus 1 selektierten Phagen dar. Ein μl sollte entnommen und zum Titrieren verwendet werden, um festzustellen, dass etwa 10⁹ TU vorliegen.
Die Phagenlösung ist nun für eine weitere Selektionsrunde in den kultivierten T-84- und Caco-2-Zellen durch Wiederholen der vorstehenden Schritte unter Verwendung des in das untere Medium transportierten Phagen bereit. Folglich wird der selektierte Phage von Zyklus 1 nun wieder auf die obere Seite der auf Schnappmulden wachsenden Caco-2- oder T-84-Zellen aufgebracht. Im Allgemeinen wird in jedem Zyklus derselbe Phagentiter auf die obere Seite der auf Schnappmulden wachsenden Zellen aufgebracht. Am Ende jedes Zyklus' wird der in dem unteren Medium vorliegende Phagentiter zu jedem Zeitpunkt bestimmt und dieser transportierte Phage wieder amplifiziert und durch die Zellen zurück in den Kreislauf gebracht. Folglich erhöht sich die %uale Phagenausbeute, die sich im unteren Medium befindet, wenn die Anzahl an Zyklen erhöht wird. Am Ende von Zyklus 5 wurden Phagen selektiert, die bevorzugt von der oberen zur unteren Seite der kultivierten Zellen aufgrund der statistischen Peptidsequenzen, die durch die Bakteriophagen-Gen-III oder -GenVIII-Proteinprodukte angezeigt wurden, transportiert wurden.
B. Behandlung von intaktem Rattenkolonschleimhautgewebe mit Phagen-Datenpopulationen
Als das Rattenkolongewebe wie vorstehend beschrieben montiert war, wurden nach Abschalten der Elektroden etwa 1 × 10¹¹ Phagen in HBSS-Puffer auf die Darmseite des Kolongewebes aufgebracht. Anschließend wurden die Montagen unter Spannung gesetzt und amplifiziert, das System abgesetzt, das Medium sowohl auf der Darmseite als auch auf der Bluteseite des Kolongewebes gleichzeitig entfernt und das Medium auf der Bluteseite bei 4°C gesichert. Das auf der Darmseite vorliegende ursprüngliche Medium wurde auf die Darmseite des befestigten Kolongewebes in den S-G-Kammern gegeben. Gleichzeitig wurde frisches HBSS-Puffermedium der Bluteseite zugesetzt, und die Gewebe wurden mit 95%O₂/5%CO₂ oxygeniert. Die Elektroden wurden angeschalten und die Knöpfe auf Klemmenspannung und Strom eingestellt. Die Spannung wurde so eingestellt, dass eine Stromänderung von etwa 2–3 μA erhalten wurde. Der Timer wurde dann so eingestellt, dass eine Spannung alle 8 Min. angelegt wurde, und die entsprechende Stromabweichung wurde zur Berechnung von TER durch Anwenden der folgenden Ohmschen Beziehung berechnet: R = V/I.
Der Phagenposttransfer durch Rattenkolon wurde wie folgt titriert und amplifiziert (Phagenproben wurden vor und nach der Amplifikation titriert). Reihenverdünnungen von Phagen (2 μl Phage + 18 μl TBS/Gelatine) wurden in Mikrotiterplatten durchgeführt, und 10 μl Volumen der erforderlichen Verdünnungen wurden in Mikroröhrchen mit einem Volumen von 1,5 ml überführt. 10 μl genährte K91Kan-Zellen wurden jedem Mikroröhrchen zugesetzt, dies sanft gemischt und bei Raumtemperatur 10 Min. inkubiert. 990 μl LB + 0,2 μg/ml Tetracyclin wurden zugesetzt und die Mikroröhrchen bei 37°C 30 Min. inkubiert. 200 μl der Kultur wurden auf LB- (40 μg/ml Tetracyclin + 100 μg/ml Kanamycin)-Agarplatten gesprüht, bei 37°C über Nacht inkubiert und die Anzahl an Kolonien wurde gezählt.
Der Phage wurde durch Zugabe von 150 μl PEG/NaCl zu 1 ml Phagenlösung (d. h. oberer oder unterer HBSS-Puffer der Kammern) in einem Oak-Ridge-Röhrchen, Mischen durch Umwenden (× 100) und 4-stündiges Inkubieren bei 4°C amplifiziert. Das Röhrchen wurde mit 10000 g 15 Min. (JA17-Rotor, 8500 UpM) zentrifugiert und der Überstand abdekantiert und wieder 5 Min. zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und das Pellet wieder in 100 ul TBS suspendiert (unter 5-minütigem Stehenlassen bei Raumtemperatur, Aufwirbeln, 15-minütigem Stehenlassen bei Raumtemperatur und wieder Aufwirbeln). Eine Probe von 5 μl wurde zur Titration zurückbehalten. 100 μl genährte K91Kan-Zellen wurden zu 95 μl Phagenlösung gegeben, dies sanft gemischt und bei Raumtemperatur 30 Min. inkubiert. 20 ml vorgewärmtes LB + 0,2 μl/ml Tetracyclin wurden zugesetzt, und das Röhrchen wurde bei 37°C und 200 UpM 30 Min. inkubiert. 10 μl Tetracyclin (40 mg/ml Stammlösung) und Kanamycin (Endkonzentration 100 μg/ml) wurden zugesetzt, und das Röhrchen wurde über Nacht bei 37°C und 200 UpM inkubiert. Das Röhrchen wurde dann 15 Min mit 3440 g (JA17-Rotor, 5000 UpM) zentrifugiert, der Überstand einem neuen Oak-Ridge-Röhrchen zugesetzt und mit 13800 g (JA17-Rotor, 10000 UpM) zentrifugiert. Der Überstand wurde in ein neues Oak-Ridge-Röhrchen, enthaltend 3 ml PEG/NaCl überführt, durch Umwenden (× 100) gemischt und bei 4°C 4 h inkubiert. Das Röhrchen wurde dann bei 13800 g zentrifugiert, der Überstand abdekantiert und wieder bei 13800 g 5 Min. zentrifugiert. Das Pellet wurde wieder in 100 μl TBS suspendiert (unter 5-minütigem Stehenlassen bei Raumtemperatur, Aufwirbeln, 15-minütigem Stehenlassen bei Raumtemperatur und wieder Aufwirbeln). Die Phagenlösung wurde in ein Mikroröhrchen, enthaltend 150 μl PEG/NaCl, überführt, durch Umwenden (× 100) gemischt und bei 4°C 1 h inkubiert. Das Röhrchen wurde 1 Min. mikrofugiert, der Überstand entfernt und wieder mikrofugiert. Der Überstand wurde entfernt und das Pellet wieder in 100 μl TBS suspendiert (unter 5-minütigem Stehenlassen bei Raumtemperatur, Aufwirbeln, 15-minütigem Stehenlassen bei Raumtemperatur und wieder Aufwirbeln). 2 μl Phage wurde zur Titration entfernt, während der Rest bei 4°C gelagert wurde.
Die Phagenlösung ist nun für eine weitere Selektionsrunde in dem S-G-befestigten Rattenkolongewebe durch Wiederholen der vorstehenden Schritte unter Verwendung des in das untere Medium transportierten Phagen bereit. Folglich wird der selektierte Phage von Zyklus 1 nun wieder auf die obere oder Darmseite des S-G-befestigten Rattenkolongewebes aufgebracht. Im Allgemeinen wird in jedem Zyklus derselbe Phagentiter auf die Darmeite des Gewebes aufgebracht. Am Ende jedes Zyklus' wird der in dem unteren Medium (Bluteseite) vorliegende Phagentiter zu jedem Zeitpunkt bestimmt und dieser transportierte Phage wieder amplifiziert und durch das Kolongewebe zurück in den Kreislauf gebracht. Folglich erhöht sich die %uale Phagenausbeute, die sich im unteren Medium befindet, wenn die Anzahl an Zyklen erhöht wird. Am Ende von Zyklus 5 oder 6 selektierten wir Phagen, die bevorzugt von der oberen oder Darmseite des Kolongewebes zur Blut- oder unteren Seite des Darmgewebes aufgrund der statistischen Peptidse quenzen, die durch die Bakteriophagen-Gen-III oder -GenVIII-Proteinprodukte angezeigt wurden, transportiert wurden.
C. Behandlung von Tiergewebeschranken in vivo mit Phagen-Datenpopulationen
Die gereinigte Phagen-Datengenbank (statistisch oder vorselektiert) wird auf 500 μl in PBS-Puffer verdünnt und in das Modell (z. B. Ratte, Kaninchen oder andere Art) mit geschlossener (oder offener) Darmschlinge injiziert. Zum Zeitpunkt 0 und zu darauf folgenden Zeitpunkten nach der Injektion wird eine Probe entweder des Portalkreislaufes oder systemischen Kreislaufes entnommen. Ein Aliquot des entnommenen Blutes kann mit E. coli inkubiert werden, gefolgt von Abscheiden von Phagenplaques oder von Übermittlungseinheiten oder von Kolonien, bei welchen die Phage auf Resistenz gegen Antikörper wie Tetracyclin kodiert. Das Restliche der entnommenen Blutprobe (bis zu 150 μl) wird mit 250 μl E. coli und 5 ml LB-Medium oder anderes geeignetes Wachstumsmedium inkubiert. Die E. coli-Kulturen werden über Nacht durch Inkubation bei 37°C auf einer Schüttelplattform inkubiert. Zu anderen Zeitpunkten (wie 15 Min., 30 Min., 45 Min., 60 Min. bis zu 6 Stunden) entnommene Blutproben werden in ähnlicher Weise verarbeitet, wodurch eine Amplifikation von im Portal- oder systemischen Kreislauf in E. coli zu diesen Zeitpunkten vorliegenden Phagen gewährt wird. Nach der Amplifikation wird der amplifizierte Phage durch PEG-Ausfällung wiedergewonnen und in PBS-Puffer oder TBS-Puffer wieder suspendiert. Zusätzlich wird der Titer des amplifizierten Phagen vor und nach der PEG-Ausfällung bestimmt. Der amplifizierte PEG-gefällte Phage wird auf einen bekannten Phagentiter (im Allgemeinen zwischen 10⁸ und 10¹⁰ Phagen-bildende Einheiten pro ml) verdünnt und in den GIT des Tiermodells mit geschlossener (oder offener) Darmschlinge injiziert. Blutproben werden von dem Portal- und/oder Systemischer Kreislauf zu verschiedenen Zeitpunkten entnommen und die in die Blutproben transportierten Phagen in E. coli wie vorstehend für den ersten Zyklus angegeben amplifiziert. Anschlie ßend werden die Phagen PEG-gefällt, wieder suspendiert, titriert, verdünnt und in den GIT des Tiermodells mit geschlossener (oder offener) Darmschlinge injiziert. Dieses Verfahren der Phageninjektion, gefolgt von der Entnahme von Portal- und/oder systemischen Blutproben und Amplifikation von in diese Blutproben transportierten Phagen kann z. B. bis zu 10 mal wiederholt werden, wodurch die Selektion von Phagen gewährt wird, die bevorzugt von dem GIT in den Portal- und/oder systemischen Kreislauf transportiert werden.
Beispiel 1: %uale Ausbeute von ϕ in Caco-2-Zellen
Die Genbanken L3.6, L3.15, L8.15 und fUSE2 (Kontrolle) wurden unter Verwendung von Caco-2-Zellen gemäß den vorstehend angegebenen Verfahren gescreent. Die prozentualen Ausbeuten pro Zyklus (1 h, 5 h, 24 h und Gesamtausbeute) und die Veränderung der transepithelialen Resistenz für die Zyklen wurden gemessen. Die TER-Messungen für die Caco-2-Zellen blieben im Bereich von 224–449 Ω/cm² Die Phagenausbeute auf der unteren Seite der Zellkultur ist als Prozentualität des auf die obere Seite aufgebrachten Phagen angegeben. Sechs aufeinanderfolgende Screeningzyklen wurden durchgeführt und Proben nach 1 h, 5 h und 24 h des unteren Puffers wurden aufgefangen. Die prozentualen Ausbeuten von pro Zyklus in den Zyklen 1–6 erhaltenen Phagen sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Nützliche Ausbeuten wurden im Allgemeinen durch den 4. Zyklus erhalten.
Beispiel 2: %uale Ausbeute von ϕ in T-84-Zellen
Die Genbanken L3.6, L3.15, L8.15 und fUSE2 (Kontrolle) wurden unter Verwendung von T-84-Zellen gemäß den vorstehend angegebenen Verfahren gescreent. Die prozentualen Ausbeuten pro Zyklus (1 h, 5 h, 24 h und Gesamtausbeute) und die Veränderung der transepithelialen Resistenz für die Zyklen wurden gemessen. Die TER-Messungen für die T-84-Zellen blieben im Bereich von 224–449 Ω/cm². Die Phagenausbeute auf der unteren Seite der Zellkultur ist als Prozentualität des auf die obere Seite aufgebrachten Phagen angegeben. Vier aufeinanderfolgende Screeningzyklen wurden durchgeführt und Proben nach 1 h, 5 h und 24 h des unteren Puffers wurden aufgefangen. Die prozentualen Ausbeuten von pro Zyklus in den Zyklen 1–4 erhaltenen Phagen sind in Tabelle 2 zusammengefasst. Nützliche Ausbeuten wurden im Allgemeinen durch den 4. Zyklus erhalten.
Beispiel 3: %uale Ausbeute von ϕ in isolierten Kolonsegmenten
Ein Phagengemisch, umfassend die Genbanken L3.6, L3.15 und L8.15 wurden unter Verwendung von isoliertem Rattenkolon gemäß den vorstehend angegebenen Verfahren gescreent. Die Phagenausbeute auf der unteren Seite der Gewebeprobe ist als Prozentualität des auf die obere Seite aufgebrachten Phagen angegeben. Sechs aufeinanderfolgende Screeningzyklen wurden durchgeführt und vier Proben nach 1 h des unteren Puffers wurden aufgefangen. Tabelle 3 gibt die %ualen Ausbeuten von φ in isolierten Kolonsegmenten an.
TABELLE 1: %UALE AUSBEUTE VON ϕ IN CACO-2-ZELLEN Genbank L3.6
Genbank L3.15
Genbank L8.18
Genbank fUSE2 (Kontrolle) in Caco-2-Zellen
TABELLE 2: %UALE AUSBEUTE VON ϕ IN T-84-ZELLEN Genbank L3.6
Genbank L3.15
Genbank L8.18
Genbank fUSE2 (Kontrolle) in T-84-Zellen
TABELLE 3: %UALE AUSBEUTE VON ϕ IN ISOLIERTEN KOLONSEGMENTEN
Beispiel 4: Identifizierung von Peptidsequenzen von transportierten Phagen in Kolongewebesegmenten
36 Klone von statistisch selektierten Phagen aus dem sechsten Screeningzyklus in Rattenkolonsegementen (wie in Beispiel 3 und Tabelle 3 angegeben) wurden entweder unter Verwendung des das Gen-VIII-DNA-sequentierenden Primers ELN71 (SEQ ID NR: 1) oder des Gen-III-DNA-sequentierenden Primers ELN77a (SEQ ID NR: 17). ³⁵S-dATP und dem Sequenzbausatz Sequenase^®-Version 2,0 A (Amersham Life Science, UK) sequentiert. Im Verlauf von Zyklus 1 bis Zyklus 6 gibt es einen Fehler bei der Phagenselektion mit statistischen Peptiden, die durch Gen VIII im Gegensatz zu Gen III kodiert wurden, vielleicht deswegen, weil durch Gen III kodierte Peptide mit zwischen 3–5 Kopien/Phagenteilchen vorliegen, wohingegen die durch das synthetische Gen VIII kodierten Peptide mit rund 300 Kopien pro Phagenteilchen vorliegen. Dieser höhere Exprimierungsgrad kann einen Valenzeffekt und eine Erhöhung der Möglichkeit von Zwischenwirkung mit einer/m Rezeptorstelle/-weg in der Gewebeprobe bereitstellen.
Eine Anzahl von Klonen/DNA-Sequenzen liegen mehr als einmal vor, wodurch einige Arten von bevorzugter Selektion nahegelegt werden. Folglich wurden SEQ ID NR: 2 (eine Klasse von 9 Klonen – 25%ige Gegenwart), SEQ ID NR: 3 (eine Klasse von 5 Klonen – 13,9%ige Gegenwart), SEQ ID NR: 4 (eine Klasse von 3 Klonen – 8,3%ige Gegenwart) aus diesen 36 Klonenproben aus Zyklus 6 bestimmt. Alle dieser Klassen bestehen aus Klonen mit dreifachen DNA-Einsätzen. Einzelne Isolate werden durch SEQ ID NR: 5 bis SEQ ID NR: 9 (dreifache DNA-Einsätze) und SEQ ID NR: 10 (einzelner DNA-Einsatz) erhalten.
Auf der Basis der wiederkehrenden statistischen Peptidsequenzen in diesen Klassen wurden zwei synthetische Oligonukleotide gebildet und zum Screenen von Phagenpopulationen, die die Kolonscreeningzyklen 1–6 darstellen, in einer Reihe von Oligonukleotidhybridisierungsreaktionen verwendet, um zu bestimmen, ob diese Phagen und die entsprechenden Peptide während des Screeningverfahrens selektiert wurden. Folglich entsprechen die Oligonukleotide ELN93 und ELN94 einem teilweisen Kodierungsbereich in den Phagenklonen für SEQ ID NR: 2 bzw. SEQ ID NR: 3. Dieses Auftreten der Reaktivität pro Screeningzyklus ist in nachstehender Tabelle 4 zusammengefasst. Aus den Daten in Tabelle 4 scheint es, dass eine stufenweise Selektion von Phagen stattfindet, die zu Oligonukleotid ELN93 und ELN94 im Verlauf von Zyklus 1 bis Zyklus 6 hybridisieren. Die Sondierungsreaktivität ist als Prozentualität der Gesamtzahl von Kolonien, die pro Phagenpopulation gescreent wurden, ausgedrückt. Als Kontrolle waren auch die unselektierten Ausgangsgenbanken (L3.6, L3.15 und L8.15) eingeschlossen.
TABELLE 4: HYBRIDISIERUNG VON PHAGENPOPULATIONEN (KOLONSCREENINGSZYKLEN 1–6 UND UNSELEKTIERTE GENBANKEN L3.6, L3.15 UND L8.15) MIT OLIGONUKLEOTIDEN ELN93 UND ELN94
Die Phagenpopulationen, die die Caco-2-Screeningszyklen 1–6 und T-84-Screeningszyklen 1–4, wie vorstehend in Beispiel 1, Tabelle 1 bzw. Beispiel 2, Tabelle 2 angegeben, darstellen, wurden ebenso auf Reaktivität zu den Oligonukleotidsondierungen ELN93 und ELN94 untersucht. Das Auftreten von Reaktivität pro Screeningzyklus in Caco-2- und T-84-Zellen wird mit der Reaktivität in Kolongewebe in Tabelle 5 (ELN93) und Tabelle 6 (ELN94) verglichen. In diesen Tabellen wird die Sondierungsreaktivität als Prozentualität der Gesamtzahl von Kolonien, die pro Phagenpolulation gescreent wurden, ausgedrückt. Etwas Reak tivität wurde in Caco-2-selektierten Klonen unter Verwendung von ELN93 nachgewiesen. Die stufenweise Selektion von ELN93-reaktiven Phagen während des Verlaufs der Zyklen 1–6, die für die Phagen-Genbank L3.15B beobachtet wurde, korrelierte mit dem Reaktivitätsmuster, das vorher für Kolon-selektierte Phagen beobachtet wurde, obwohl die erzielte Gesamtreaktivität im Wesentlichen niedriger war. Die ELN94-Reaktivität wurde sowohl in Caco-2- als auch in T-84-selektierten Klonen identifiziert. Zunehmende Reaktivität von Zyklen 1 bis 6 wurde für die Caco-2-selektierten Genbanken L3.6B, L3.15B und L8.15B, sowie für die T-84-selektierte Genbank L3.15A beobachtet. Die Reaktivität der Caco-2-selektierten Genbanken L3.6B und L8.15B bei Zyklus 5 (33,3% bzw. 42,3%) war deutlich ähnlich zu demjenigen des Kolon-A-selektierten Phagen (46,0%)
TABELLE 5: HYBRIDISIERUNG VON PHAGENPOPULATIONEN MIT OLIGONUKLEOTID ELN93 Tabelle 5.a: Caco-2-Screeningszyklen 1–6, Kolonscreeningszyklen 1–6 und T-84-Screeningszyklen 1–6 Tabelle 5.b: Unselektierte Genbanken L3.6, L3.15 & L8.15 TABELLE 5.a
TABELLE 5.b:
TABELLE 6: HYBRIDISIERUNG VON PHAGENPOPULATIONEN MIT OLIGONUKLEOTID ELN94 Tabelle 6.a: Caco-2-Screeningszyklen 1–6, Kolonscreeningszyklen 1–6 und T-84-Screeningszyklen 1–6 Tabelle 6.b: Unselektierte Genbanken L3.6, L3.15 & L8.15 TABELLE 6.a
TABELLE 6.b:
Beispiel 5: Identifizierung von Peptidsequenzen von transportierten Phagen durch Caco-2-Zellproben
Caco-2-Schnappmulden wurden wie vorstehend beschrieben hergestellt und die X30-Genbank wurde unter Verwendung von Caco-2-Zellen gemäß den vorstehend angegebenen Verfahren gescreent. 1 fasst die Phagenausbeute (% Phagen, die vom oberen zum unteren Medium transportiert wurden) in den Zyklen 1, 2, 3 und 4 im unteren Medium von polarisierten Caco-2-Zellen, die auf Schnappmulden gewachsen sind, zusammen. In jedem Zyklus wurde das untere Medium sowohl 1 Stunde als auch 24 Stunden nach der Phagenzugabe zu dem oberen Medium erprobt. Folglich wurde nach der Zugabe der anfänglichen Phagen-Genbank in Zyklus 1 das untere Medium nach 1 Stunde entfernt und mit frischem unteren Medium ersetzt. Anschließend wurde das untere Medium 24 Stunden nach der Zugabe der anfänglichen Phagen-Genbank entfernt. In jedem Fall (1-stündige und 24-stündige untere Mediumproben) wurde die Menge des vorliegenden Phagen durch Titrieren von jedem unteren Medium in Escherichia coli Stamm K91Kan bestimmt. Das übrige untere Medium aus den 1-stündigen und 24-stündigen Erprobungszeitpunkten wurde vereinigt und der vorliegende Phage PEG-gefällt, der gefällte Phage wieder in 100 μl TBS suspendiert und zum Infizieren von Escherichia coli K91Kan verwendet, wodurch die Amplifikation des im unteren Medium vorliegenden Phagen wie vorstehend umrissen gewährt wurde. Nach der Amplifikation wurde der amplifizierte Phage titriert, PEG-gefällt, wieder in TBS suspendiert und titriert. Die Phagensuspension war nun für die nächste Runde einer weiteren Selektion in den kultivierten Caco-2-Zellen durch Wiederholen der vorstehenden Schritte unter Verwendung des in das untere Medium transportierten Phagen wie vorstehend umrissen bereit. Beim Durchlaufen von Zyklus 1 bis Zyklus 4 lag eine 19,2-fache Anreicherung an Phagen vor, die vom oberen zum unteren Medium der in Schnappmulden gewachsenen Caco-2-Zellen transportiert wurden.
2 fasst die relative Bindung von 100 verschiedenen Phagenisolaten an fixierten Caco-2-Zellen zusammen. Die 100 einzelnen Phagen aus der X30-Genbank wurden aus der Zyklus-4-Selektion (Transport vom oberen zum unteren Medium) von auf Schnappmulden gewachsenen Caco-2-Zellen erhalten. Zur ELISA-Analyse ließ man Caco-2-Zellen zur Konfluenz in Gewebekulturplatten mit 96 Mulden wie vorstehend beschrieben wachsen, gefolgt von Fixieren in 10%igem Formaldehyd wie vorstehend beschrieben. Die ELISA-Analyse wurde unter Verwendung des HRP-anti-M13-Konjugats durchgeführt. In dieser Abbildung wird die Bindung jedes Phagenisolats so angeordnet oder lag so vor, dass der Phage mit der „schwächsten" zu dem Phagen mit der „stärksten Bindung" von links nach rechts dargestellt wurden (und nicht die numerische Anzahl des Phagenisolats). Die Bindung des Negativkontroll-Phagen (M13mp18) und die Absorptionsablesungen, die mit unbehandelten fixierten Caco-2-Zellen erhalten wurden, ist jeweils auf der äußersten rechten Seite von 3 dargestellt.
3 fasst die Bindung der zehn besten Binder, der Klone 32, 34, 39, 40, 53, 80, 84, 97, 98 und 100 an fixierte Caco-2-Zellen zusammen mit der Bindung dem Negativkontroll-Phagen M13mp18 an fixierte Caco-2-Zellen zusammen, wobei die Phagenbindung durch ELISA-Analyse wie vorstehend beschrieben aufgezeichnet wurde. Die Bindungsuntersuchungen wurden doppelt und der Verwendung von reinen Phagen- (~10¹⁰ pfu/ml) oder verdünnten Phagenproben (verdünnt mit 1 : 25 und 1 : 100 in jedem Fall) durchgeführt. Als Kontrolle sind die Absorptionsablesungen, die unter Verwvendung von fixierten Caco-2-Zellen, welchen kein Phage zugesetzt wurde, auf der rechten Seite von 3 dargestellt. 4 ist im Wesentlichen dieselbe wie 3, außer dass die Hinter grundsabsorptionsablesungen, die unter Verwendung nur der fixierten Caco-2-Zellen, welchen kein Phage zugesetzt wurde, von den Absorptionsablesungen, die unter Verwendung von fixierten Caco-2-Zellen, welche mit den anfänglichen Phagenklonproben und dem Negativkontroll-Phagen M13mp18 inkubiert wurden, subtrahiert wurde. Die genauen Titer von für jeden Klon verwendetem reinem Phagen sind in Tabelle 7 angegeben.

TABELLE 7: TITER VON REINEN PHAGENPROBEN FÜR DIE BESTEN ZEHN BINDER

KLN	pfu/ml
32	1.19 × 10¹⁰
34	2.87 × 10¹⁰
39	1.34 × 10¹⁰
40	9.09 × 10⁹
53	1.89 × 10¹⁰
80	2.25 × 10¹⁰
84	1.27 × 10¹⁰
87	7.99 × 10⁹
98	1.99 × 10¹⁰
100	8.36 × 10⁹

5 ist eine graphische Darstellung der Bindung der Phagenklone 39, 97 und 100 und des Negativkontroll-Phagen M13mp18, an fixierte Caco-2-Zellen unter Verwendung von entweder reinen Phagenproben (mit ~10¹⁰ pfu/ml) oder desselben mit 1 : 25 und 1 : 100 verdünnten Phagen. Die Phagenbindungsversuche und anschließende ELISA-Analyse wurden wie vorstehend umrissen durchgeführt. Diese Daten zeigen, dass sich die Phagenklone 39, 97 und 100 in dosisansprechender Weise binden, indem die ELISA-Absorptionsablesungen, die nach Verdünnung des Phagen entweder mit 1 : 25 oder 1 : 100 erhalten wurden, reduziert werden. Im Gegensatz dazu bindet sich der Negativkontroll-Phage M13mp18 nicht in dosisansprechender Weise mit unter Verwendung entweder von reinem, 1 : 25- oder 1 : 100-verdünntem Phagen erhaltenen linearen Absorptionsablesungen.
Die besten zehn Binder, die Klone 32, 34, 39, 40, 53, 80, 84, 97, 98 und 100 wurden unter Verwendung von vorstehend umrissenen Phagen sequentiert. Acht dieser Sequenzen waren mit der Sequenz von Klon 97 identisch, wodurch DNA-Sequenz SEQ ID NR: 11 und Peptidsequenz SEQ ID NR: 12 erhalten wurden. Die beiden übrigen Klone (53 und 100) stellten einzelne Isolate DNA SEQ ID NR: 13 und 15 mit den entsprechenden Peptidsequenzen SEQ ID NR: 14 bzw. 16 her. Der Fachmann könnte ohne übermäßiges Experimentieren bestimmen, welche Fragmente dieser Peptide den Transport eines Wirkstoffs durch ein menschliches oder tierisches Gewebe gewähren oder erleichtern. Auf der Basis der Ergebnisse von Beispiel 4 wird erwartet, dass diese Fragmente aus mindestens 6 Aminosäureresten bestehen.
Beispiel 6: Transport von Phagen vom Rattenlumen in den Portal- und systemischen Kreislauf
In dieser Untersuchung wurden Phagen von statistischen Phagen-Datengenbanken sowie Kontrollphagen in das Lumen des Magen-Darm-Trakts einer Ratte (Rattenmodell mit geschlossener Darmschlinge in situ) injiziert. Blut wurde dann entweder vom Systemischer Kreislauf oder Portalkreislauf entnommen und die Anzahl an Phagen, die in den Kreislauf transportiert wurden, durch Titrieren der Blutproben in E. coli bestimmt.
Die in dieser Untersuchung verwendeten Phagen-Datengenbanken waren D38 und DC43, in welchen Gen III statistische 38-mer- bzw. 43-mer-Peptide kodiert. Als Negativkontrolle wurde der identische Phage M13mp18, in welchem Gen III keine „statistische" Peptidsequenz kodiert, verwendet. Beide Genbankenphagen D38 und CD43 wurden von E. coli hergestellt, miteinander vermischt, gegen PBS di alysiert, unter Verwendung von PEG/NaCl ausgefällt und wieder in PBS-Puffer suspendiert. Die M13mp18-Kontrolle wurde in ähnlicher Weise verarbeitet. Der Titer jeder Phagenprobe wurde bestimmt und die Phagenproben wurden in PBS auf etwa dieseleben Titer vor der Injektion in das Rattenmodell mit geschlossener Darmschlinge verdünnt.
Zum Erproben des systemischen Kreislaufs wurden etwa 15 cm des Duodenum von Wistar-Ratten abgebunden (Modell mit geschlossener Darmschlinge), etwa 0,5 ml Phagenlösung wurden in die geschlossene Darmschlinge injiziert und Blut (0,4 ml) aus der hinteren Vene zu verschiedenen Zeitpunkten entnommen. Die verwendeten Zeitpunkte (in Min.) waren 0, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 180, 240 und 300 Min. Zur Entnahme des Portalkreislaufs wurde in die Portalvene ein Katheter gelegt, wurden etwa 15 cm des Duodenum abgebunden (Modell mit geschlossener Darmschlinge), 0,5 ml Phagenlösung in die geschlossene Darmschlinge injiziert und wurde Blut aus dem Portalvenenkatheter zu verschiedenen Zeitpunkten entnommen. Da die Portalentnahme heikel ist, wurden, wenn möglich, die Entnahmezeiten auf 15, 30, 45 und 60 Min. beschränkt. Das Volumen des in jedes Tier injizierten Phagen war wie folgt:

Tiere (15) Volumen von injizierten Phagen

R1–R3 0.50 ml

R4 0.43 ml

R5–R15 0.45 ml
Die geschätzte Anzahl von transportiertem Phagen wurde so eingestellt, dass sie für die Unterschiede im jedem Tier injizierten Volumen (unter Verwendung von 0,5 ml) als Standardvolumen) verantwortlich war.
Um den Transport in den systemischen Kreislauf zu untersuchen, erhielten die Tiere R1, R2 und R3 den Kontrollphagen M13mp18 und die Tiere R4, R5, R6 und R7 das Testphagengemisch D38/DC43. Um den Transport in den Portal kreislauf zu untersuchen, erhielten die Tiere R8, R9 und R10 den Kontrollphagen M13mp18 und die Tiere R11, R12, R13 und R14 das Testphagengemisch D38/DC43. Tier R15* erhielt die vereinigten Phagenproben der Tiere R4–R7 (siehe Tabelle 8), die aus dem systemischen Kreislauf am Tag 1 entnommen wurden, gefolgt von Amplifikation in E. coli, PEG-Ausfällung und wieder Suspendieren in PBS. Bei anschließender Analyse wurde der Titer dieses Phagen als 100 mal größer als derjenige der anderen Phagenproben, die für die Tiere R8–R14 verwendet wurden, befunden. Folglich ist die für Tier R15 in Tabelle 9 dargestellte Angabe niedriger eingestellt.
Etwa 0,4 ml des Blutes wurden zu jedem Zeitpunkt von jedem Modellsystem entnommen. 30 μl des entnommenen Blutes (systemisch) wurden mit 100 μl des präparierten E. coli Stamm K91Kan gemischt, dies bei 37°C 30 Min. inkubiert und zur Plaquebildung unter Verwendung von Top Agarose auf LB-Platten abgeschieden. Verschiedene Negativkontrollen wurden in die Titrierversuche eingeschlossen. Am folgenden Tag wurde die Anzahl von Plaque-bildenden Einheiten (pfus) bestimmt. In ähnlicher Weise wurden 30 μl des entnommenen Blutes (Portal) und Reihenverdünnungen (1 : 100, 1 : 1000) davon mit 100 μl des präparierten E. coli Stamm K91Kan gemischt, dies bei 37°C 30 Min. inkubiert und zur Plaquebildung unter Verwendung von Top Agarose auf LB-Platten abgeschieden. Am folgenden Tag wurde die Anzahl der Plaque-bildenden Einheiten (pfus) bestimmt.
Zudem wurden etwa 300 μl des zu jedem Zeitpunkt entnommenen Blutes (systemisch und Portal) mit 5 ml präparierten E. coli Stamm K91Kan in modifiziertem Wachstumsmedium, enthaltend 5 mM MgCl₂/MgSO₄, das bei 37°C über Nacht unter Schütteln inkubiert wurde, inkubiert (um Phagenamplifikation zu gewähren),. Die Proben wurden zentrifugiert, und das Zellpellet wurde verworfen. Die Proben des Phagenüberstands wurden aufgefangen, reihenmäßig (10^–2, 10^–4, 10^–6, 10^–8) in TBS-Puffer verdünnt und zur Plaquebildung abgeschieden, um die Anzahl an in den amplifizierten Phagenproben vorliegenden pfus zu bestimmen.
Weiterhin wurde ein Phagenaliquot aus den „amplifizierten" Überständen, der aus den Versuchstieren #R4–R7 erhalten wurden (Proben zu jedem Zeitpunkt wurden verwendet), entfernt, vereinigt und 2 Stunden PEG-gefällt. Der ausgefällte Phage wurde wieder in PBS-Puffer suspendiert und in das Modell mit geschlossener Darmschlinge von Tier #R15 injiziert, gefolgt von Portalblutentnahme.
Die Anzahl des von dem Modell mit geschlossener Darmschlinge in den systemischen Kreislauf transportierten Phagen ist in Tabelle 8 dargestellt. Die Anzahl des von dem Modell mit geschlossener Darmschlinge in den Portalkreislauf transportierten Phagen ist in Tabelle 9 dargestellt. Diese Anzahlen sind für den Phageninputunterschied und die Volumeninputunterschiede korrigiert. Deutlich liegen mehr Phagen in den Portalproben als in den systemischen Proben vor, was entweder Leber- oder RES-Beseitigung und/oder Phageninstabilität im systemischen Kreislauf anzeigt. Zudem ist die Aufnahme des Phagen von dem GIT in den Portalkreislauf mit einer wesentlichen Anzahl an Phagen innerhalb von 15 Min. sehr schnell. Die Ergebnisse aus den Portalentnahmeversuchen würden auch anzeigen, dass die Kinetiken der Aufnahme des Phagen aus den D38-/DC43Genbanken schneller ist als die des Kontrollphagen. Folglich besteht eine bevorzugte Aufnahme des Phagen, der statistische Peptidsequenzen kodiert, von dem GIT in den Portalkreislauf. Im Falle der Tiere R13, R14 und R15*, wird die Prozentualität des Phagen, der in die titrierte Blutprobe innerhalb des beschränkten Zeitrahmens (30, 45 bzw. 15 Min.) transportiert wurde als 0,13%, 1,1% bzw. 0,013% geschätzt.
TABELLE 8: PHAGENANZAHL, DIE VON DEM MODELL MIT GESCHLOSSENER DARMSCHLINGE IN DEN SYSTEMISCHEN KREISLAUF TRANSPORTIERT WURDE
Tiere R1, R2 und R3 erhielten den Kontrollphagen M13mp18
Tiere R4, R5, R6 und R7 erhielten das Testphagengemisch D38/DC43
TABELLE 9: PHAGENANZAHL DIE VON DEM MODELL MIT GESCHLOSSENER DARMSCHLINGE IN DEN PORTALKREISLAUF TRANSPORTIERT WURDE
Tiere R8, R9 und R10 erhielten den Kontrollphagen M13mp18
Tiere R11, R12, R13 und R14 erhielten das Testphagengemisch D38/DC43
Tier 15* erhielt die vereinten Phagenproben der Tiere R4–R7 (siehe Tabelle 8) die aus dem systemischen Kreislauf am Tag 1 entnommen wurden, gefolgt von PEG-Ausfällung und wieder Suspension in PBS. Bei einer anschließenden Analyse wurde der Titer dieses Phagen als 100 mal größer als derjenige der anderen Phagenproben, die für die Tiere R8–R14 verwendet wurden, befunden. Folglich ist die für Tier R15* dargestellte Angabe niedriger eingestellt.
Diese Untersuchungen zeigen, dass sowohl der Kontrollphage als auch die D38/DC43-Phagen über einen Zeitraum vom Lumen des GITs in den Portal- und systemischen Kreislauf transportiert werden, wie durch Titrieren des im Blut in E. coli transportierten Phagen gezeigt. Mehr Phagen werden von den Testphagenproben in den Portalkreislauf als die entsprechende Kontrollphagenprobe transportiert. Zudem scheinen die Kinetiken des Transports des Testphagen in den Portalkreislauf diejenigen des Kontrollphagen zu übersteigen. Phagen von den D38/DC43-Genbanken, die im systemischen Kreislauf von verschiedenen Tieren (R4–R7) vorkamen, wurden in Pools aufgefangen, in E. coli amplifiziert, ausgefällt und wieder an dem Lumen des GITs aufgebracht, gefolgt von Auffangen in den Portalkreislauf und Titrieren in E. coli. Diese selektierten Phagen wurden auch vom Lumen des GITs in den Portalkreislauf transportiert. Dieses Darmschlingenmodell in situ kann ein attraktives Screeningmodell darstellen, in wel chem Peptidsequenzen identifiziert werden können, die den Transport von Phagen und Teilchen vom GIT in den Kreislauf erleichtern.
Unter Verwendung dieses Screeningmodellsystems liegen nun eine Anzahl von vorselektierten Phagen-Genbanken vor. Diese sind die eine systemisch passierende Phagen-Genbank der Tiere R4–R7, eine einfach portal passierende Genbank der Tiere R11–R14 und die zwei in schnellem Transport systemisch-portal passierenden Phagen-Genbanken SP-2 des Tiers R15*.
Beispiel 7: Transport von Phagen von vorselektierten Phagen-Genbanken vom Rattenlumen in den Portal- und systemischen Kreislauf
Vier vorselektierte Phagen-Genbanken, GI-D, GI-S, GI-H und GI-P werden durch Poolbildung von Phagen, die durch Screenen von statistischen Phagen-Datengenbanken D38 und DC43 unter Verwendung von vier sich im GIT befindlichen Rezeptor- und Bindungsstellen vorselektiert wurden, gebildet. Ähnlich zu vorstehendem Beispiel 7 werden diese vorselektierten Phagen-Genbanken zusammen mit dem Negativkontroll-Phagen M13mp18 in das Modell mit geschlossener Darmschlinge von Ratten (6 Tiere pro vorselektierte Phagen-Genbank) injiziert, Blut wird über einen Zeitraum aus dem Portalkreislauf über die Portalvene entnommen, am Ende des Versuchs wird eine systemische Blutprobe von der hinteren Vene entnommen und der Darmgewebereich wird von der geschlossenen Darmschlinge entnommen.
Insbesondere wurden Phagen, die in vitro an jeder im GIT befindlichen Rezeptor- oder Bindungsstelle selektiert wurden, in E. coli amplifiziert, PEG-gefällt, wieder in TBS suspendiert und der Titer jeder Phagenprobe durch Plaquebildung in E. coli wie vorstehend beschrieben bestimmt. Anschließend wurde von einer gleichen Anzahl jedes Phagen (8 × 10⁸ Phagen) für jede Rezeptorstelle in einer vorselektierten Phagen-Genbank zusammen mit dem Negativkontroll-Phagen M13mp18 ein Pool gebildet und jede vorselektierte Phagen-Genbank an 6 Wistar-Ratten pro Genbank verabreicht (Ratten 1–6 GI-D, Ratten 7–12 GI-S, Ratten 13– 18, GI-P und Ratten 19–24 GI-H). Unter Verwendung des vorstehend beschriebenen Darmschlingenmodells in situ wurden 0,5 ml der vorselektierten Phagen-Genbanklösung in den abgebundenen Teil des Duodenum/Jejunum injiziert. Blut wurde in Heparin-Röhrchen aus der Portalvene nach 0, 15, 30, 45 und 60 Min. entnommen. Eine Blutprobe wurde aus dem systemischen Kreislauf am Ende des Versuchs entnommen. Ähnlich dazu wurde der für die Phageninjektion verwendete Teil des Duodenum/Jejunum am Ende des Versuchs entnommen.
30 μl des entnommenen Portalblutes (rein und 10^–2-, 10^–4-, 10^–6-Verdünnungen) wurden zu 30 μl E. coli K91Kan-Zellen (Über-Nacht-Kultur) gegeben und dies bei 37°C 10 Min. inkubiert. Anschließend wurden 3 ml Top Agarose zugesetzt und die Proben zur Plaquebildung abgeschieden. 100 μl des entnommenen Portalblutes wurden zu 100 μl der E. coli K91Kan gegeben. 5 ml LB-Medium wurden dann zugesetzt und die Proben bei 37°C über Nacht in einem rotierenden Mikrobeninkubator inkubiert. Die E. coli wurden durch Zentrifugation entfernt und die Proben aus dem amplifizierten Phagenüberstand wurden entweder direkt titriert oder PEG-gefällt, wieder in TBS suspendiert und titriert. Nach Titration der amplifizierten Phagen wurden Phagen enthaltende Proben von jedem Tiersatz kombiniert, indem der Titer jeder Probe auf denselben Titer eingestellt wurde und zur Plaquebildung auf LB-Agarplatten (22 cm² Platten) abgeschieden. Entweder 12000 oder 24000 Phagen schieden sich zur Plaquebildung ab.
30 μl des entnommenen Blutes (rein und 10^–2-, 10^–4-, 10^–6-Verdünnungen) wurden zu E. coli K91Kan-Zellen gegeben und dies bei 37°C 10 Min. inkubiert. 3 ml Top Agarose wurden dann zugesetzt und die Proben zur Plaquebildung abgeschieden. 100 μl des entnommenen Portalblutes wurden zu 100 μl der E. coli K91Kan gegeben. 5 ml LB-Medium wurden dann zugesetzt und die Proben bei 37°C über Nacht in einem rotierenden Mikrobeninkubator inkubiert. Die E. coli wurden durch Zentrifugation entfernt und die Proben aus dem amplifizierten Phagenü berstand wurden entweder direkt titriert oder PEG-gefällt, wieder in TBS suspendiert und titriert. Nach Titration der amplifizierten Phagen wurden Phagen enthaltende Proben von jedem Tiersatz kombiniert, indem der Titer jeder Probe auf denselben Titer eingestellt wurde und zur Plaquebildung auf LB-Agarplatten (22 cm2 Platten) abgeschieden. Entweder 12000 oder 24000 Phagen schieden sich zur Plaquebildung ab.
Der in jeder geschlossenen Darmschlinge verwendete Darmgewebeteil wurde untersucht. Das Gewebe wurde in kleine Segmente geschnitten, gefolgt von 3 Waschungen in sterilen PBS-enthaltenden Proteasehemmstoffen, und in einem Ultra-Thorexhomogenisator homogenisiert (Int-D-Proben). In einer anderen Ausführungsform wurde das Gewebe (in PBS, ergänzt mit Proteasehemmstoffen) in einem Ultra-Thorex-Homogenisator homogenisiert, 3 mal in PBS-enthaltenden Proteasehemmstoffen gewaschen und wieder in PBS-enthaltenden Proteasehemmstoffen suspendiert (int-G-Proben). In jedem Fall wurden Reihenverdünnungen (rein und 10^–2-, 10^–4-, 10^–6-Verdünnungen) des Gewebehomogenats in E. coli titriert. Zudem wurde ein Aliquot (100 μl) des Gewebehomogenats zu 100 μl E. coli K91Kan gegeben, bei 37°C 10 Min. inkubiert, gefolgt von der Zugabe von 5 ml LB-Medium und Inkubation über Nacht bei 37°C in einem rotierenden Mikrobeninkubator.
Der von dem Portalblut, systemischen Blut und Darmgewebe amplifizierte Phage wurde zur Plaquebildung abgeschieden. Die Plaques wurden auf Hybond-N-Nylon-Filter überführt, gefolgt von Denaturierung (1,5 M NaCl, 0,5 M NaOH), Neutralisation (0,5 M Tris-HCl, pH 7,4, 1,5 M NaCl), 2-maligem Waschen in SSC Puffer. Die Filter wurden luftgetrocknet und die DNA mit dem Filter vernetzt (UV-Vernetzung: 2 Min. Hochabstimmung). Die Filter wurden in Prähybridisierungs-Puffer (6 × SSC, 5 × Denhardt-Lösung, 0,1% SDS, 20 μg/ml Hefe-tRNA) bei 40–45°C mindestens 60 Min. inkubiert.
Synthetische Oligonukleotide (22-mer), die für die Bereiche, die die zum Bilden der vorselektierten Phagen-Genbank verwendeten Rezeptor- oder Bindungsstellen kodieren, empfohlen werden, wurden synthetisiert. Die Oligonukleotide (5 pmol) wurden am 5'-Ende mit ³²P-ATP und T4-Polynukleotidkinase markiert, und etwa 2,5 pmol markiertes Oligonukleotid wurden in den Hybridisierungsuntersuchungen verwendet. Die Hybridisierungsuntersuchungen wurden bei 40–45°C über Nacht in Puffer, enthaltend 6 × SSC, 5 × Denhardt-Lösung, 0,1% SDS, 20 μg/ml Hefe-tRNA und das radiomarkierte synthetische Oligonukleotid, durchgeführt, gefolgt von Waschungen (20–30 Min. bei 40–45°C) in den folgenden Puffern: (i) 2 × SSC/0,1% SDS, (ii) 1 × SSC/0,1%SDS, (iii) 0,1 × SSC(0,1%SDS. Die Filter wurden luftgetrocknet und der Autoradiografie 15 Stunden, 24 Stunden oder 72 Stunden ausgesetzt.
TABELLE 10: ZUSAMMENFASSUNG DER HYBRIDISIERUNGSERGEBNISSE
Tabelle 10 fasst die Ergebnisse aus den vorstehend umrissenen Hybridisierungsuntersuchungen zusammen. Getrennt von dem synthetischen Oligonukleotid an HAX9 wurden alle Oligonukleotide anfänglich als radiomarkiert nachgewiesen, wie durch Hybridisierung an dem entsprechenden Phagenziel (z. B. Phage S15, hybridisiert an dem Oligonukleotid S15) bestimmt. Zudem hybridisierte unter den verwendeten Versuchsbedingungen die Oligonukleotide im Wesentlichen nicht an dem Negativkontroll-Phagentemplat M13mp18. Zwei Oligonukleotide wurden am Phagen M13mp18 synthetisiert – (1) ein positives Nukleotid, das an einer bewahrten Sequenz sowohl in M13mp18 als auch jedem der selektierten Phagen der GIT-Rezeptor- oder GIT-Bindungsstelle hybridisiert [bezeichnet als M13 (positiv)] in Tabelle 10 und (2) ein negatives Oligonukleotid, das nur an einer Sequenzeinheit der mehrfachen Klonstelle von Phage M13mp18 hybridisiert und nicht an einem der selektierten Phagen der GIT-Rezeptor- oder GIT-Bindungsstelle hybridisiert.
Im Falle des GI-S-Pools von Phagen werden nur vier Phagen von dem Modell mit geschlossener Darmschlinge in den Portalkreislauf transportiert – Phagen S15, SNI-10, SNI-34 und SNI-38. Die anderen Phagen, S21, S22, SNI-28, SNI-45, SNIAX-2, SNIAX-6 und SNIAX-8 werden nicht vom GIT in den Portalkreislauf transportiert. Zudem wurden die Phagen SNI-10 und Phagen mit einem geringeren Ausmaß S15 und S22 in den Darmproben oder -fraktionen gefunden, wohingegen die anderen Phagen nicht gefunden wurden. Es lag eine sehr geringe Gegenwart (< 0,1%) des Phagen M13mp18 in den Int-G-Proben vor. Diese Ergebnisse zeigen, dass Phagen weiter aus vorselektierten Genbanken selektiert werden können, wodurch die Identifizierung von Phagen, die von der geschlossenen GIT-Darmschlinge in den Portalkreislauf transportiert werden, oder von Phagen, die sich an das Darmgewebe binden oder von ihm verinnerlicht werden, gewährt wird.
Im Falle des GI-D-Pools von Phagen liegt eine Rangordnung vor, durch welche Phagen vom GIT-Modell mit geschlossener Darmschlinge in den Portalkreislauf transportiert werden, wobei die Phagen DCX11 und DAB10 bevorzugt transportiert werden, gefolgt von den Phagen DCS8, DAB30, DAB3 und DAB7. Eine Anzahl von Phagen aus diesem Pool wird nicht in den Portalkreislauf transportiert, einschließlich die Phagen DAB18, DAB24, DAX15, DAX24, DAX27, DCX26, DCX36, DCX39, DCX42, DCX45. Es liegt ein sehr geringer Transportgrad von Phage DAX23 vom GIT in den Portalkreislauf vor. Ähnlich dazu werden nur einige der Phagen in den Darmprobenfraktionen, einschließlich die Phagen DAB30, DCX33, DAB7, DCX11, DCX45, und ein noch geringerer Gehalt an Phagen DAB3, DAB10, DCX8, DCX39, DCX42 gefunden. Einige Phagen werden nicht in den Darmproben gefunden, einschließlich die Phagen DAB18, DAB24, DAX15, DAX24, DCX26 und DCX36. Es lag eine sehr geringe Gegenwart (< 0,1%) des Phagen M13mp 18 in den Int-G-Proben vor. Diese Ergebnisse zeigen, dass Phagen weiter aus vorselektierten Genbanken selektiert werden können, wodurch die Identifizierung von Phagen, die von der geschlossenen GIT-Darmschlinge in den Portalkreislauf transportiert werden, oder von Phagen, die sich an das Darmgewebe binden oder von ihm verinnerlicht werden, gewährt wird.
Im Falle des GI-H-Pools von Phagen liegt eine Rangordnung vor, durch welche Phagen vom GIT-Modell mit geschlossener Darmschlinge in den Portal- oder systemischen Kreislauf transportiert werden, wobei der Phage PAX2 (der mit einer 4-fachen Konzentration in Bezug auf die anderen Phagen in diesem Pool verwendet wurde), gefolgt von dem Phagen HAX 42 im Portal- oder systemischen Kreislauf gefunden wurde. Keiner der Phagen in diesem Pool wurde in den Darmproben oder -fraktionen gefunden. Phage M13mp18 wurde nicht in den Darmfraktionen oder im systemischen Kreislauf mit einem sehr geringen Vorkommen (< 0,001%) im Portalkreislauf gefunden. Diese Ergebnisse zeigen, dass Phagen weiter aus vorselektierten Genbanken selektiert werden können, wodurch die Identifizierung von Phagen, die von der geschlossenen GIT-Darmschlinge in den Portal- und/oder systemischen Kreislauf transportiert werden, oder von Phagen, die sich an das Darmgewebe binden oder von ihm verinnerlicht werden, gewährt wird.
Im Falle des GI-P-Pools von Phagen waren die Phagen PAX2 und H40 auch in diesem Pool eingeschlossen. Eine Anzahl von Phagen aus diesem Pool wurde im Portalkreislauf gefunden, einschließlich die Phagen P31, PAX46, PAX9, H40, PAX17, PAX40, PAX2, PAX14, 5PAX3 und 5PAX12. Eine Anzahl von Phagen wurde nicht im Portalblut gefunden, einschließlich des Negativkontrollphagen M13mp18, PAX15, PAX16, PAX18, PAX35, PAX38, PAX43, PAX45, P90, 5PAX5 und 5PAX7. Die einzigen Phagen, der im systemischen Kreislauf gefunden wurden, waren die Phagen 5PAX5 und P31. Zudem lag eine bevorzugte Bindung von einigen Phagen an den Darm, einschließlich Phagen 5PAX12, 5PAX7, 5PAX3, H40, P31, PAX9 und ein geringerer Gehalt an den Phagen PAX38 und PAX15 vor. Einige Phagen wurden nicht in den Darmproben gefunden, einschließlich der Negativkontroll-Phage M13mp18 und die Phagen PAX2, PAX14, PAX16, PAX18, PAX35, PAX45, PAX46, P90 und 5PAX5. Diese Ergebnisse zeigen, dass Phagen weiter aus vorselektierten Genbanken selektiert werden können, wodurch die Identifizierung von Phagen, die von der geschlossenen GIT- Darmschlinge in den Portal- und/oder systemischen Kreislauf transportiert werden, oder von Phagen, die sich an das Darmgewebe binden oder von ihm verinnerlicht werden, gewährt wird.
SEQUENZLISTE

Claims

Verfahren zum Identifizieren eines Peptids, das den Transport eines Wirkstoffs durch ein menschliches oder tierisches Gewebe gewährt oder erleichtert, umfassend die Schritte (a) In-Kontakt-bringen einer vorbestimmten Menge eines Phagen aus einer statistischen Phagen-Genbank oder einer vorselektierten Phagen-Genbank mit einer ersten Seite einer Gewebeprobe oder polarisierten Gewebezellkultur, (b) zu einem vorbestimmten Zeitpunkt Auffangen des Phagen, der zu einer zweiten Seite der Gewebeprobe oder -kultur transportiert wird, um den transportierten Phagen zu selektieren, wobei die zweite Seite gegenüber der ersten Seite liegt, (c) Amplifikation des transportierten Phagen in einem Wirt, (d) Wiederholen in Reihenfolge des Schritts (a) unter Verwendung des transportierten Phagen, der in Schritt (b) erhalten und in Schritt (c) amplifiziert wurde, und der Schritte (b) und (c) zu einer vorbestimmten Anzahl von Zeitpunkten, um eine selektierte Phagen-Genbank, enthaltend einen Phagen, der von der ersten Seite der Gewebeprobe oder -kultur zu der zweiten Seite transportiert werden kann, zu erhalten und (e) Bestimmen der Identität mindestens eines Peptids, das von einem Phagen in einer selektierten Phagen-Genbank kodiert wurde, um ein Peptid zu identifizieren, das den Transport eines Wirkstoffs durch ein menschliches oder tierisches Gewebe gewährt oder erleichtert.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei Schritt (d) 0 bis 30 mal wiederholt wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei die Gewebeprobe ausgewählt ist aus der Duodenum, Jejunum, Ilium, aufsteigendem Kolon, Querkolon, absteigendem Kolon, Sigma, Gefäß-Endothelium, das das Gefäßsystem auskleidet, Gefäß-Endothelium der Blut-Hirn-Schranke, Gefäßglattmuskel, Alveolen, Leber, Niere, Knochenmark, Herz, Milz, Pankreas, Thymus, Hirn, Rückenmark, neuronalem oder retinalem Augengewebe.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei die Gewebeprobe epitheliale Zellen umfasst, die die lumenale Seite des Magen-Darm-Trakts auskleiden.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Gewebeprobe vom Kolon erhalten wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei die polarisierte Gewebezellkultur aus dem Magen-Darm-Trakt, epithelialen Zellen, Alveolarzellen, endothelialen Zellen der Blut-Hirn-Schranke, Gefäßglattmuskelzellen, Caco-2-Zellen mit der ATCC-Zugangsnummer HTB 37 oder T-84-Zellen mit der ATCC-Zugangsnummer CCL 248 kultiviert wird.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die erste Seite der Gewebeprobe oder -kultur die an der Spitze liegende Seite und die zweite Seite die untere Seite ist.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der Wirkstoff ein Arzneimittel oder Antigen ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei der Wirkstoff ein Nano- oder Mikroteilchen ist.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Peptid auf der Oberfläche des Nano- oder Mikroteilchens aufgetragen oder absorbiert oder kovalent an ihm gebunden ist.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Nano- oder Mikroteilchen aus dem Peptid gebildet wird.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Nano- oder Mikroteilchen ein mit einem Arzneimittel beladenes oder von einem Arzneimittel eingekapseltes Nano- oder Mikroteilchen ist.
Verfahren zum Identifizieren eines Peptids, das den Transport eines Wirkstoffs durch ein menschliches oder tierisches Gewebe gewährt oder erleichtert, nach Anspruch 1, umfassend die Schritte (a) In-Kontakt-bringen einer vorbestimmten Menge eines Phagen aus einer statistischen Phagen-Genbank oder einer vorselektierten Phagen-Genbank mit der oberen Seite einer Gewebeprobe oder polarisierten Gewebezellkultur, (b) zu einem vorbestimmten Zeitpunkt Auffangen des Phagen, der zu der unteren Seite der Gewebeprobe oder -kultur transportiert wird, um den transportierten Phagen zu selektieren, Amplifikation des transportierten Phagen in einem Wirt, (c) Wiederholen in Reihenfolge des Schritts (a) unter Verwendung des transportierten Phagen, der in Schritt (b) erhalten und in Schritt (c) amplifiziert wurde, und der Schritte (b) und (c) zu einer vorbestimmten Anzahl von Zeitpunkten, um eine selektierte Phagen-Genbank, enthaltend einen Phagen, der von der oberen Seite der Gewebeprobe oder -kultur zu der unteren Seite transportiert werden kann, zu erhalten und (d) Bestimmen der Identität von mindestens einem Peptid, das von einem Phagen in einer selektierten Phagen-Genbank kodiert wurde, um ein Peptid zu identifizieren, das den Transport eines Wirkstoffs durch ein menschliches oder tierisches Gewebe gewährt oder erleichtert.
Peptid, bestehend aus SEQ ID NR: 12, oder ein funktionelles Fragment davon, das mindestens 6 Aminosäurereste enthält und den Transport eines Wirkstoffs durch ein menschliches oder tierisches Gewebe gewährt oder erleichtert.
Peptid, bestehend aus SEQ ID NR: 14, oder ein funktionelles Fragment davon, das mindestens 6 Aminosäurereste enthält und den Transport eines Wirkstoffs durch ein menschliches oder tierisches Gewebe gewährt oder erleichtert.
Peptid, bestehend aus SEQ ID NR: 16, oder ein funktionelles Fragment davon, das mindestens 6 Aminosäurereste enthält und den Transport eines Wirkstoffs durch ein menschliches oder tierisches Gewebe gewährt oder erleichtert.
Verfahren zum Identifizieren eines Peptidmusters, das, falls es als Peptid vorliegt, den Transport eines Wirkstoffs durch ein menschliches oder tierisches Gewebe gewährt oder erleichtert, umfassend die Schritte (a) In-Kontakt-bringen einer vorbestimmten Menge eines Phagen aus einer statistischen Phagen-Genbank mit der oberen Seite einer Gewebeprobe oder polarisierten Gewebezellkulturprobe, (b) zu einem vorbestimmten Zeitpunkt Auffangen des Phagen, der zu der unteren Seite des Gewebes transportiert wird, um den modifizierten Phagen zu selektieren, wobei die zweite Seite gegenüber der ersten Seite liegt, (c) Amplifikation des modifizierten Phagen in einem Wirt, (d) Wiederholen in Reihenfolge des Schritts (a) unter Verwendung des modifizierten Phagen, der in Schritt (b) erhalten und in Schritt (c) amplifiziert wurde, und der Schritte (b) und (c) zu einer vorbestimmten Anzahl von Zeitpunkten, um eine selektierte Phagen-Genbank, enthaltend einen Phagen, der von der oberen Seite zu der unteren Seite transportiert werden kann, zu erhalten und (e) Bestimmen der Identität einer Vielzahl von Peptiden, die von einem Phagen in einer selektierten Phagen-Genbank kodiert wurden, um ein Peptidmuster gewöhnlich aus mindestens zwei der Peptide zu identifizieren, das den Transport eines Wirkstoffs durch ein menschliches oder tierisches Gewebe gewährt oder erleichtert.